融合タンパク質及びその製造方法、イオノトロピック型グルタミン酸受容体の製造方法、化合物のスクリーニング方法、並びに、スクリーニング用組成物
【課題】イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物を容易にスクリーニングするための一連の技術を提供する。
【解決手段】イオノトロピック型グルタミン酸受容体のＮ末端側又はＣ末端側に分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットが連結されてなり、かつリガンド結合活性を有することを特徴とする融合タンパク質が提供される。分子シャペロン活性を有するタンパク質の例として、シャペロニン、ＰＰＩａｓｅが挙げられる。当該融合タンパク質を用いるイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物のスクリーニング方法、並びに、当該スクリーニング方法に用いられるスクリーニング用組成物も提供される。
【解決手段】イオノトロピック型グルタミン酸受容体のＮ末端側又はＣ末端側に分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットが連結されてなり、かつリガンド結合活性を有することを特徴とする融合タンパク質が提供される。分子シャペロン活性を有するタンパク質の例として、シャペロニン、ＰＰＩａｓｅが挙げられる。当該融合タンパク質を用いるイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物のスクリーニング方法、並びに、当該スクリーニング方法に用いられるスクリーニング用組成物も提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は融合タンパク質及びその製造方法、イオノトロピック型グルタミン酸受容体の製造方法、化合物のスクリーニング方法、並びに、スクリーニング用組成物に関する。本発明は、イオノトロピック型グルタミン酸受容体を標的とする新規医薬の開発等に有用なものである。
【背景技術】
【０００２】
グルタミン酸は、中枢ニューロンにおいて興奮性シナプス伝達を担うと共に、学習・記憶の基礎となるシナプス伝達の可塑性変化、種々の神経疾患に伴うニューロン死に関わる生理活性機能を有している。グルタミン酸の受容体はイオンチャネル型受容体（イオノトロピックグルタミン酸受容体：ｉＧｌｕＲ）と代謝調節型受容体（メタボトロピックグルタミン酸受容体：ｍＧｌｕＲ）の２種類に大別される。
【０００３】
イオノトロピックグルタミン酸受容体はアゴニストと結合する受容体の部分とチャネルを形成する部分とから成る複合体である。イオノトロピック型グルタミン酸受容体は分子多様性を持って中枢神経系の生理的活動と病態のさまざまな局面で重要な役割を演じているため、創薬研究において極めて重要視されている受容体の一つである。すなわち、イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物はアンタゴニスト又はアゴニストとして薬理活性が期待できる。
【０００４】
イオノトロピック型グルタミン酸受容体には、ＡＭＰＡ型、カイニン酸型、ＮＭＤＡ型の少なくとも３種のサブタイプが知られている（非特許文献１）。ＡＭＰＡ型は、人工アミノ酸であるα-アミノ−３−ヒドロキシ−５−メソオキサゾール−４−プロピオン酸（amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid；ＡＭＰＡ）を選択的にアゴニストとして受容する一群であり、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４のサブユニットが知られている。カイニン酸型は、カイニン酸を強力なアゴニストとして受容する一方でＡＭＰＡに対してほとんど反応しないものとして分類されている。カイニン酸型サブユニットとしては、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７、ＫＡ１、ＫＡ２などが知られている。ＮＭＤＡ型は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（N-methyl-D-aspartic acid；ＮＭＤＡ）をアゴニストとして選択特異的に受容する一群であり、ＮＲ１、ＮＲ２、ＮＲ３Ａなどのサブユニットが知られている。これらのサブユニットはいずれも、Ｎ末端付近の約５００アミノ酸から成る細胞外領域と、膜貫通部分を含む４カ所の疎水性領域とを有する膜タンパク質である。
【０００５】
イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する化合物のスクリーニング方法としては、イオノトロピック型グルタミン酸受容体を発現しているラットなどの動物組織をホモジネートし、そのミクロソームを材料とし、ラジオアイソトープでラベルした既知の化合物をトレーサーとして結合実験を行うのが常法である。しかしながら、この方法は非ヒト動物の受容体を用いた評価結果を指標とするものであり、ヒトへの薬理効果を正しく反映しているとは限らない。むしろ近年、非ヒト動物由来の材料を用いたアッセイ法が、必ずしもヒトへの薬理効果を正しく外挿しないことが明らかになりつつある。このため、ヒト由来のイオノトロピック型グルタミン酸受容体を用いたスクリーニングのニーズが高まっている。ところが、ヒト組織を用いて同様の実験を行うことには倫理上の問題があり、実施は事実上困難である。
【０００６】
一方、イオノトロピック型グルタミン酸受容体を遺伝子工学的に発現させ、創薬活動に利用する試みもある。例えば、受容体の遺伝子をアフリカツメガエルの卵母細胞に導入・発現させ、パッチクランプ法による細胞内の電位の変化により、受容体に結合するアゴニスト、アンタゴニストのスクリーニングを実施する方法が知られている。しかしながら、この方法はハイスループット性に欠けるため、化合物ライブラリーから大規模にスクリーニングすることには不向きである。一方、受容体を精製・回収し、ラジオアイソトープ標識化合物を用いた結合実験に供することも考えられる。しかしながら、受容体の発現量は極めて微量であるため、この方法もハイスループット性に欠け、実用的ではない。
【０００７】
他の膜タンパク質と同様に、イオノトロピック型グルタミン酸受容体についても遺伝子工学的に大量に強制発現させた例はこれまでほとんど報告されていない。非特許文献２には、ＡＭＰＡ型イオノトロピックグルタミン酸受容体の細胞外領域のみを遺伝子工学的に設計し、大腸菌を用いて封入体として発現させる方法が報告されている。しかしながら、この方法では封入体をリフォールディングする必要があり、多大な手間を要する。また、この報告の方法は受容体の全長を大量に発現させるものではない。
【０００８】
膜タンパク質等の難溶性のタンパク質を正しく折り畳まれた可溶性の状態で発現させる技術として、「タンパク質折り畳み因子」と呼ばれるタンパク質の作用を利用する方法が提案されている。タンパク質折り畳み因子は、他のタンパク質の折り畳み反応（フォールディング）を促進する作用を有するタンパク質の総称であり、酵素的に働く「フォールダーゼ」と非酵素的に働く「分子シャペロン」とに分類することができる。例えば、難溶性の目的タンパク質をタンパク質折り畳み因子との融合タンパク質として発現させ、目的タンパク質を正しく折り畳まれた可溶性の状態で取得する方法が提案されている（特許文献１）。しかし、この方法の有効性は目的タンパク質の種類によって異なり、イオノトロピック型グルタミン酸受容体のような４箇所の疎水性領域を有し、かつオリゴマーを形成する受容体に対して有効であるか否かは定かでない。
【特許文献１】国際公開第０２／０５２０２９号パンフレット
【非特許文献１】小澤ら，医学のあゆみ，２００２年，第２０１巻，第１３号 ，ｐ１０６１−
【非特許文献２】GUO-QIANG CHENら，プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・U.S.A.（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.），１９９７年，第９４巻，ｐ１３４３１−
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物を容易にスクリーニングするための一連の技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記した課題を解決するための請求項１に記載の発明は、イオノトロピック型グルタミン酸受容体のＮ末端側又はＣ末端側に分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットが連結されてなり、かつリガンド結合活性を有することを特徴とする融合タンパク質である。
【００１１】
また請求項２に記載の発明は、イオノトロピック型グルタミン酸受容体は、ヒト由来のものであることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質である。
【００１２】
本発明の融合タンパク質は、イオノトロピック型グルタミン酸受容体のＮ末端側又はＣ末端側に分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットが連結されてなるものである。そして、本発明の融合タンパク質は、受容体としての本質的な活性である「リガンド結合活性」を保持している。本発明の融合タンパク質は、リガンド結合活性を有するので、単独分子としてのイオノトロピック型グルタミン酸受容体の代替物質として利用できる。例えば、イオノトロピック型グルタミン酸受容体としてヒト由来のものを採用した融合タンパク質（請求項２）を使用すれば、組織ホモジネートを使用する従来の方法では実施できなかったヒト由来イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対するスクリーニングを行うことができる。さらに、本発明の融合タンパク質は遺伝子工学的に大量取得が可能であるので、イオノトロピック型グルタミン酸受容体の部分を切り出すことによりイオノトロピック型グルタミン酸受容体を高純度で高収率、かつ、容易に製造することができる。
【００１３】
ここで「リガンド結合活性」とは、天然（native）のイオノトロピックグルタミン酸受容体が本質的に有する活性を表現したものであり、具体的には「グルタミン酸に特異的な結合活性」、「イオノトロピックグルタミン酸受容体に対するアゴニストに特異的な結合活性」、及び「イオノトロピックグルタミン酸受容体に対するアンタゴニストに特異的な結合活性」等が例示される。
【００１４】
ここで「分子シャペロン活性」とは、「変性したタンパク質を元の正常型にリフォールディングさせる活性、又は、変性したタンパク質の不可逆的な凝集を抑制する活性」を指すものとする。「分子シャペロン活性を有するタンパク質」の代表例はシャペロニン、スモールヒートショックプロテイン、Ｈｓｐ９０等の「分子シャペロン」に属する一群のタンパク質である。ただし、分子シャペロン以外のタンパク質であっても、上記した「分子シャペロン活性」を有するタンパク質であれば、本発明における「分子シャペロン活性を有するタンパク質」に含まれる。
【００１５】
本発明においてイオノトロピック型グルタミン酸受容体に連結されるタンパク質は、「分子シャペロン活性を有するタンパク質」と「そのサブユニット」のいずれかである。前者は分子シャペロン活性を有するタンパク質が単量体である場合、後者は複数のサブユニットからなる複合タンパク質の場合に該当する。
【００１６】
請求項３に記載の発明は、分子シャペロン活性を有するタンパク質は、シャペロニンであることを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質である。
【００１７】
シャペロニンは分子シャペロンの一種であり、分子量約６万のサブユニット（シャペロニンサブユニット）からなる複合タンパク質ある。代表的なシャペロニンは、シャペロニンサブユニット７〜９個からなるリング状構造体が２個重なった、総分子量８０万〜１００万程度のシリンダー状の巨大な複合タンパク質である。シャペロニンはその内部に他のタンパク質を格納し、正しく折り畳むことができる。そして本発明の融合タンパク質は、分子シャペロン活性を有するタンパク質としてシャペロニンを採用したものである。
【００１８】
請求項４に記載の発明は、シャペロニンを構成するサブユニットの少なくとも２個は、ペプチド結合を介して直列に連結されていることを特徴とする請求項３に記載の融合タンパク質である。
【００１９】
２個以上のシャペロニンサブユニットがペプチド結合を介して直列に連結された人工タンパク質（以下、「シャペロニンサブユニット連結体」と称する。）が知られており、必要に応じて単独分子のシャペロニンサブユニットを補充しながら、天然型シャペロニンと同様にリング状構造体を形成することがわかっている（古谷ら，Protein Science, 2005, 14, 341）。そして本発明の融合タンパク質は、分子シャペロン活性を有するタンパク質としてシャペロニンサブユニット連結体を採用したものである。なお、Ｎ個のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンサブユニット連結体を、以下、「シャペロニンサブユニットＮ回連結体」と呼ぶこととする。
【００２０】
請求項５に記載の発明は、分子シャペロン活性を有するタンパク質は、ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼに属するものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質である。
【００２１】
ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼ（Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase。以下、「ＰＰＩａｓｅ」と略記する。）はフォールダーゼの一種であり、細胞内で折り畳み途上のタンパク質中のアミノ酸のうち、プロリン残基のＮ末端側ペプチド結合のシス−トランス異性化反応を触媒する活性（ＰＰＩａｓｅ活性）を有する酵素である。一部のＰＰＩａｓｅはＰＰＩａｓｅ活性に加えて「分子シャペロン活性」を有することが知られており、本発明の融合タンパク質は、分子シャペロン活性を有するタンパク質として当該ＰＰＩａｓｅを採用したものである。
【００２２】
ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼがトリガーファクタータイプ又は古細菌由来ＦＫＢＰタイプのものである構成が推奨される（請求項６）。
【００２３】
請求項７に記載の発明は、分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットは、ペプチドリンカーを介してイオノトロピック型グルタミン酸受容体のＮ末端側又はＣ末端側に連結されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質である。
【００２４】
本発明の融合タンパク質においては、分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットとイオノトロピック型グルタミン酸受容体とがペプチドリンカーを介して間接的に連結されている。本発明によれば、ペプチドリンカー部分を利用して融合タンパク質に所望の機能を容易に付与することができる。
【００２５】
請求項８に記載の発明は、ペプチドリンカーは、プロテアーゼの認識切断部位を有するものであることを特徴とする請求項７に記載の融合タンパク質である。
【００２６】
かかる構成により、融合タンパク質からイオノトロピック型グルタミン酸受容体を容易に切り出すことができる。
【００２７】
イオノトロピック型グルタミン酸受容体がＡＭＰＡ型受容体である構成（請求項９）、ＮＭＤＡ型受容体である構成（請求項１０）、カイニン酸型受容体である構成（請求項１１）が採用され得る。
【００２８】
請求項１２に記載の発明は、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を製造する方法であって、Ｎ末端側にシグナルペプチドが付加された前記融合タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させ、該宿主細胞のペリプラズム領域又は細胞外に前記融合タンパク質を分泌させる工程を含むことを特徴とする融合タンパク質の製造方法である。
【００２９】
本発明は融合タンパク質の製造方法にかかるものであり、宿主細胞のペリプラズム領域又は細胞外に融合タンパク質を分泌させる工程を含む。本発明では融合タンパク質をペリプラズム領域あるいは細胞外といった酸化的環境に発現・分泌させるので、融合タンパク質が適切なジスルフィド結合を形成しやすい。その結果、融合タンパク質に含まれるイオノトロピック型グルタミン酸受容体は、その立体構造がより安定化されたものとなる。
【００３０】
請求項１３に記載の発明は、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質からイオノトロピック型グルタミン酸受容体を切り出してイオノトロピック型グルタミン酸受容体を取得することを特徴とするイオノトロピック型グルタミン酸受容体の製造方法である。
【００３１】
本発明はイオノトロピック型グルタミン酸受容体の製造方法にかかるものであり、上記した本発明の融合タンパク質からイオノトロピック型グルタミン酸受容体を切り出すことを特徴とする。本発明のイオノトロピック型グルタミン酸受容体の製造方法では、遺伝子工学的に大量取得が可能な融合タンパク質を用いるので、イオノトロピック型グルタミン酸受容体を高収率で取得することができる。さらに、融合タンパク質からイオノトロピック型グルタミン酸受容体を切り出す構成を採用したので、製造が容易に行える。
【００３２】
請求項１４に記載の発明は、融合タンパク質にプロテアーゼを作用させることによってイオノトロピック型グルタミン酸受容体を切り出すことを特徴とする請求項１３に記載のイオノトロピック型グルタミン酸受容体の製造方法である。
【００３３】
かかる構成により、融合タンパク質からイオノトロピック型グルタミン酸受容体をきわめて容易に切り出すことができる。
【００３４】
請求項１５に記載の発明は、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質と被検化合物との結合性を指標として被検化合物のイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングすることを特徴とする化合物のスクリーニング方法である。
【００３５】
本発明は、イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物のスクリーニング方法にかかるものである。本発明のスクリーニング方法では、単独分子のイオノトロピック型グルタミン酸受容体ではなく、本発明の融合タンパク質を用いる。上記したように、本発明の融合タンパク質は、単独分子としてのイオノトロピック型グルタミン酸受容体の代替物質として利用できるものである。本発明のスクリーニング方法では、融合タンパク質としてヒト由来イオノトロピック型グルタミン酸受容体を含むものを使用することができるので、組織ホモジネートを使用する従来の方法では実施できなかったヒト由来イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対するスクリーニングを行うことができる。その結果、イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する化合物を正確にスクリーニングすることができる。
【００３６】
請求項１６に記載の発明は、下記工程：
（１）請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるイオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、イオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質とを遊離させ、遊離したイオノトロピック型グルタミン酸受容体と被検化合物とを溶液中で接触させる工程、
（２）工程（１）でイオノトロピック型グルタミン酸受容体と被検化合物とを接触させた際の被検化合物のイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングする工程、
を包含することを特徴とする化合物のスクリーニング方法である。
【００３７】
本発明のスクリーニング方法では、分子シャペロン活性を有するタンパク質の存在下でイオノトロピック型グルタミン酸受容体と被検化合物とを接触させる。そして、分子シャペロン活性を有するタンパク質とイオノトロピック型グルタミン酸受容体として、本発明の融合タンパク質を切断して遊離させたものを使用する。ここで、被検化合物と接触する遊離のイオノトロピック型グルタミン酸受容体は、溶液中において分子シャペロン活性を有するタンパク質の作用によって正しく折り畳まれた可溶性の状態で存在できる。したがって本発明のスクリーニング方法によれば、イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する化合物を正確にスクリーニングすることができる。
【００３８】
融合タンパク質として前記連結部にプロテアーゼ認識切断部位を有するものを使用し、工程（１）において前記融合タンパク質に当該プロテアーゼを作用させて前記プロテアーゼ認識切断部位を切断する構成が推奨される（請求項１７）。
【００３９】
請求項１８に記載の発明は、イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングするために用いられる組成物であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有することを特徴とするスクリーニング用組成物である。
【００４０】
本発明はイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物のスクリーニング用組成物に係るものであり、本発明の融合タンパク質を含有することを特徴とする。本発明のスクリーニング用組成物を使用すれば、イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物のスクリーニングを簡便に行うことができる。
【００４１】
請求項１９に記載の発明は、イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングするために用いられる組成物であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるイオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、イオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質を遊離させてなるスクリーニング用組成物である。
【００４２】
本発明のスクリーニング用組成物は、本発明の融合タンパク質を溶液中で切断し、イオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質を遊離させてなるものであり、分子シャペロン活性を有するタンパク質とイオノトロピック型グルタミン酸受容体とを含有する。本発明のスクリーニング用組成物を使用すれば、イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物のスクリーニングを簡便に行うことができる。
【発明の効果】
【００４３】
本発明の融合タンパク質は、単独分子としてのイオノトロピック型グルタミン酸受容体の代替物質として利用でき、例えば、イオノトロピック型グルタミン酸受容体としてヒト由来のものを採用することで、組織ホモジネートを使用する従来の方法では実施できなかったヒト由来イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対するスクリーニングを行うことができる。さらに、本発明の融合タンパク質からイオノトロピック型グルタミン酸受容体の部分を切り出すことにより、イオノトロピック型グルタミン酸受容体を高収率かつ容易に製造することができる。
【００４４】
本発明の融合タンパク質の製造方法によれば、立体構造がより安定化されたイオノトロピック型グルタミン酸受容体を含む融合タンパク質を製造することができる。
【００４５】
本発明のイオノトロピック型グルタミン酸受容体の製造方法によれば、イオノトロピック型グルタミン酸受容体を高収率かつ容易に取得することができる。
【００４６】
本発明のスクリーニング方法によれば、イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する化合物を正確にスクリーニングすることができる。
【００４７】
本発明のスクリーニング用組成物によれば、イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する化合物のスクリーニングを容易に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
本発明の融合タンパク質は、イオノトロピック型グルタミン酸受容体のＮ末端側又はＣ末端側に分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットが連結されてなり、かつリガンド結合活性を有する。好ましくは、イオノトロピック型グルタミン酸受容体がヒト由来のものである。
【００４９】
分子シャペロン活性を有するタンパク質の例としては、シャペロニン（Ｈｓｐ６０）、スモールヒートショックプロテイン、プレフォルディン、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、Ｈｓｐ９０、等の分子シャペロンに属するタンパク質が挙げられる。好ましくは、シャペロニンが採用される。
【００５０】
シャペロニンは、グループ１型とグループ２型とに大別される。バクテリアや真核生物のオルガネラに存在するシャペロニンはグループ１型に分類され、いずれも分子量６０ｋＤａからなるシャペロニンサブユニット７つが環状に連なるリング構造を形成し、さらに２つのリングが２層構造を形成する、１４量体のホモオリゴマーを形成する。これらはコシャペロニンと称される分子量約１０ｋＤａのタンパク質の環状７量体を補因子とする。１型シャペロニンの例としては、大腸菌由来のシャペロニンであるＧｒｏＥＬが挙げられる。一方、グループ２型シャペロニンは、真核生物の細胞質や古細菌にみられ、通常８〜９個のシャペロニンサブユニットからなるリングが２層に連なった１６〜１８量体のホモ、またはヘテロオリゴマーを形成している。本発明の融合タンパク質に含まれるシャペロニンは、グループ１型及びグループ２型のいずれでもよい。
【００５１】
好ましい実施形態では、シャペロニンサブユニットの少なくとも２個がペプチド結合を介して連結されている。換言すれば、イオノトロピック型グルタミン酸受容体のＮ末端側又はＣ末端側に「シャペロニンサブユニット連結体」が連結されている。上記したように、シャペロニンサブユニット連結体においても、必要に応じて単独分子のシャペロニンサブユニットを補充しながら、天然型シャペロニンと同様にリング状構造体を形成することがわかっている。また、シャペロニンサブユニットＮ回連結体の連結数（Ｎ）は、そのシャペロニンの由来によって決定される最適数であることが特に好ましく、グループ１型シャペロニンの場合には７個、グループ２型シャペロニンの場合には８又は９個が好ましい。Ｎがこれらの最適数であれば、シャペロニンサブユニット連結体のみでリング状構造体を形成することができ、単独分子のシャペロニンサブユニットを補充する必要がない。
【００５２】
本発明の融合タンパク質においては、リング構造への自己集合能が維持されている限り、天然型のシャペロニンと同様にアミノ酸変異体等の変異型のシャペロニンも採用することができる。
【００５３】
本発明の融合タンパク質においては、分子シャペロンには分類されない「分子シャペロン活性を有するタンパク質」を採用することもできる。好ましくは、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅを採用する。すなわち、一部のＰＰＩａｓｅは、本来のＰＰＩａｓｅ活性に加えて分子シャペロン活性を有する。分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅの例としては、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ；トリガーファクター（ＴＦ）タイプＰＰＩａｓｅ（Huang, Protein Sci., 9, 1254-, 2000年）；ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅ（Arie, Mol. Microbiol. 39, 199-, 2000年）；ＳｌｙＤタイプＰＰＩａｓｅ（Scholz, Biochemistry, 45, 20-, 2006年）；ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ（Bose, Science, 274, 1715-, 1996年）；ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅ（Pirkl, J. Mol. Biol., 308, 795-, 2001年）；ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅ（Behrens, EMBO J. 20, 285-, 2001年）、が挙げられる。
【００５４】
このうち、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、その分子量の違いにより２種類に大別できる。一方は分子量が１６〜１８ｋＤａ程度のショートタイプであり、他方は２６〜３３ｋＤａ程度のロングタイプである。本発明の融合タンパク質においては、ショートタイプ、ロングタイプのいずれの古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅでも採用できるが、一般的に、ショートタイプの方がより強い分子シャペロン活性を有する傾向にあること、タンパク質の分子量が大きくなるにつれて、その組み換えタンパク質の発現量が低下する傾向があること、の２点を考慮すると、ショートタイプの古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを採用することがより好ましい。
【００５５】
さらに、これらのＰＰＩａｓｅの一部のアミノ酸残基を改変したポリペプチドや、これらのＰＰＩａｓｅの一部分を含むポリペプチド等であって、ＰＰＩａｓｅ活性と分子シャペロン活性とを有するポリペプチドも、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとして採用できる。
【００５６】
上記したように、本発明において「分子シャペロン活性」とは、「変性したタンパク質を元の正常型にリフォールディングさせる活性、又は、変性したタンパク質の不可逆的な凝集を抑制する活性」を指す。分子シャペロン活性の評価方法としては、例えば、ロダネーゼ、クエン酸合成酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等をモデル酵素とし（河田，バイオサイエンスとインダストリー,５６,５９３−,１９９８年）、これらを６Ｍ塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤で変性処理後、検定対象物質を含む緩衝液で変性剤を希釈した際に開始する変性タンパク質の再生率や、変性タンパク質の凝集の抑制率をもって、検定対象物の分子シャペロン活性を評価することができる。なお、変性タンパク質の再生率を評価する方法としては、例えばロダネーゼの場合、ホロビッチらの方法（Horowitz, Methods Mol. Biol., 40, 361-, 1995年）が挙げられ、変性タンパク質の凝集抑制を評価する方法としては田口らの方法（Taguchi, J. Biol. Chem., 269, 8529-, 1994年）等が挙げられる。
【００５７】
好ましい実施形態では、分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットは、ペプチドリンカーを介してイオノトロピック型グルタミン酸受容体のＮ末端側又はＣ末端側に連結されている。特に、ペプチドリンカーがプロテアーゼ認識切断部位を有する実施形態によれば、融合タンパク質に当該のプロテアーゼを作用させることにより、イオノトロピック型グルタミン酸受容体を容易に切り出すことができる。当該プロテアーゼの例としては、トロンビン、エンテロキナーゼ、ファクターＸ、プレシジョンプロテアーゼ等が挙げられる。
【００５８】
本発明で採用されるイオノトロピック型受容体のサブタイプとしては特に限定はなく、例えば、ＡＭＰＡ型、カイニン酸型、あるいはＮＭＤＡ型のものが採用可能である。δ型に属するものでもよい。
【００５９】
本発明の融合タンパク質は、例えば、分子シャペロン活性を有するタンパク質をコードする遺伝子とイオノトロピック型グルタミン酸受容体をコードする遺伝子とを連結させた融合遺伝子を発現させることにより製造することができる。例えば、該融合遺伝子を発現ベクターに組み込み、該組換えベクターを適宜の宿主に導入して形質転換体を作製し、該形質転換体内で融合遺伝子を発現させればよい。このときに用いる宿主としては特に限定はないが、培養コストが安価であり、培養日数が短く、培養操作が簡便な点からバクテリア等の微生物が好ましく、特に、大腸菌が取り扱いの容易さの面でより好ましい。
【００６０】
さらに、宿主細胞のペリプラズム領域や細胞外に前記融合タンパク質に分泌発現させることにより、融合タンパク質を効率的に製造することができる。すなわち、本発明の融合タンパク質の製造方法は、Ｎ末端側にシグナルペプチド（シグナル配列）が付加された前記融合タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させ、該宿主細胞のペリプラズム領域又は細胞外に前記融合タンパク質を分泌させる工程を含む。この方法では融合タンパク質を酸化的環境に発現・分泌させるので、融合タンパク質が適切なジスルフィド結合を形成しやすくなり、融合タンパク質に含まれるイオノトロピック型グルタミン酸受容体の立体構造を安定化させることができる。また、発現させたイオノトロピック型グルタミン酸受容体が宿主細胞の細胞膜に組み込まれることにより、受容体の比活性が向上することが期待できる。大腸菌を宿主として用いる場合のシグナル配列としては、ｐｅｌＢ、ｏｍｐＴ、Ｍ１３ファージのｇ３タンパクのシグナル配列、などが挙げられる。
【００６１】
本発明のイオノトロピック型グルタミン酸受容体の製造方法は、本発明の融合タンパク質からイオノトロピック型グルタミン酸受容体を切り出して取得するものである。好ましくは、プロテアーゼ認識切断部位を有するペプチドリンカーを介して分子シャペロン活性を有するタンパク質とイオノトロピック型グルタミン酸受容体とが連結されている融合タンパク質を用い、この融合タンパク質に当該プロテアーゼを作用させて、イオノトロピック型グルタミン酸受容体を切り出す。例えば、トロンビン認識切断部位を有するペプチドリンカーを採用した場合には、融合タンパク質にトロンビンを作用させてトロンビン認識切断部位を切断し、イオノトロピック型グルタミン酸受容体を切り出すことができる。
【００６２】
本発明の化合物のスクリーニング方法の１つの様相では、本発明の融合タンパク質と被検化合物との結合性を指標として被検化合物のイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングする。例えば、非ヒト動物の組織ホモジネートを使用する従来のスクリーニング方法において、組織ホモジネートの代わりに本発明の融合タンパク質を使用することにより、本様相のスクリーニング方法を実施することができる。特に、ヒト由来イオノトロピック型グルタミン酸受容体を含む融合タンパク質を用いる実施形態によれば、組織ホモジネートの使用では実施困難であったヒト由来イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対するスクリーニングを行うことができ、好適である。なお、本様相のスクリーニング方法においては複数種の融合タンパク質を併用してもよく、例えば、「イオノトロピック型グルタミン酸受容体とシャペロニンとの融合タンパク質」と「イオノトロピック型グルタミン酸受容体とＰＰＩａｓｅとの融合タンパク質」の２種を併用することができる。
【００６３】
本発明のスクリーニング用組成物の１つの様相では、本発明の融合タンパク質を含有する。本様相のスクリーニング用組成物を用いることにより、融合タンパク質と被検化合物との結合性を容易に調べることができる。本様相のスクリーニング用組成物は本発明の融合タンパク質を含有しておればよく、その他の成分については特に限定はない。例えば、適宜の緩衝成分や安定化剤を含有していてもよい。組成物の形状についても特に限定はなく、溶液状でもよいし、凍結乾燥品でもよい。
【００６４】
本発明の化合物のスクリーニング方法の他の様相は、２つの工程（１）及び（２）を包含する。工程（１）では、本発明の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるイオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、イオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質とを遊離させる。これにより、イオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との混合物が得られる。この段階で、遊離したイオノトロピック型グルタミン酸受容体と被検化合物とを溶液中で接触させる。接触させるための具体的手順としては、例えば、融合タンパク質の切断処理が終了した溶液に被検化合物を添加することが挙げられる。すなわち、イオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との混合物に被検化合物を添加する。他の例としては、工程（１）開始時の溶液に予め被検化合物を含有させておき、その後、融合タンパク質の切断処理を行うことが挙げられる。すなわち、融合タンパク質と被検化合物とを混合した状態で当該融合タンパク質を切断し、分子シャペロン活性を有するタンパク質の存在下でイオノトロピック型グルタミン酸受容体と被検化合物とを接触させる。
【００６５】
そして工程（２）において、工程（１）でイオノトロピック型グルタミン酸受容体と被検化合物とを接触させた際の被検化合物のイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングする。本様相の化合物のスクリーニング方法においても、ヒト由来イオノトロピック型グルタミン酸受容体を含む融合タンパク質を用いる実施形態によれば、組織ホモジネートの使用では実施困難であったヒト由来イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対するスクリーニングを行うことができる。なお、本様相のスクリーニング方法においても複数種の融合タンパク質を併用することができる。
【００６６】
好ましい実施形態では、融合タンパク質として前記連結部にプロテアーゼ認識切断部位を有するものを使用し、工程（１）において前記融合タンパク質に当該プロテアーゼを作用させて前記プロテアーゼ認識切断部位を切断する。当該プロテアーゼの例としては、上記したトロンビン、エンテロキナーゼ、ファクターＸ、プレシジョンプロテアーゼ等が挙げられる。
【００６７】
本発明のスクリーニング用組成物の他の様相は、本発明の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるイオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、イオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質を遊離させてなるものである。連結部の切断は、例えば、連結部にプロテアーゼ認識切断部位を設けておき、融合タンパク質に当該プロテアーゼを作用させることにより行うことができる。本様相のスクリーニング用組成物を用いることにより、分子シャペロン活性を有するタンパク質の存在下における被検化合物のイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対する結合性を容易に調べることができる。なお本様相のスクリーニング用組成物は、適宜の緩衝成分や安定化剤をさらに含有していてもよいし、組成物の形状は溶液状でも凍結乾燥品でもよい。
【００６８】
以下に実施例を掲げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【００６９】
（１）超好熱性古細菌Thermococcus sp. KS-1由来ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＴｃＦＫＢＰ１８）と融合するための発現ベクター構築
分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅの１つであるＴｃＦＫＢＰ１８（Ideno, Biochem. J., 357, 465-, 2001年）の発現プラスミドｐＥＦＥ１−３（Iida, Gene, 222, 249-, 1998年）を鋳型とし、ＴｃＦｕ―Ｆ１（配列番号１）とＴｃＦｕ―Ｒ２（配列番号２）をプライマー対としてＰＣＲを行い、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号３）を増幅した。このＤＮＡ断片の５’末端と３’末端には、それぞれプライマーに由来するＮｃｏＩサイトとＳｐｅＩサイトが導入された。
【００７０】
さらに、トロンビン認識切断部位を有するペプチドリンカーをコードするＤＮＡ（ペプチドリンカーサイト）、並びに、外来遺伝子を挿入するための種々の制限酵素サイト（クローニングサイト）を含むオリゴＤＮＡを調製した。これらのＤＮＡとＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を含むＤＮＡ断片とをｐＥＴ２１ｄベクター（メルク社）の制限酵素サイトに導入した。この際、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を含むＤＮＡ断片が上流、ペプチドリンカーサイトとクローニングサイトが下流に位置するように導入した。得られたＴｃＦＫＢＰ１８融合タンパク質発現用プラスミドをＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ３とした（図１）。図１中、「Ｐ」はプロモーター、「Ｌａｃ」はラックオペレーター、「ＲＢＳ」はリボゾーム結合部位、「ＴｃＦＫＢＰ１８」はＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子、「Ｔｈｒｂｉｎ」はトロンビン認識切断部位をコードする配列、「Ｈｉｓ」はヒスチジンタグをコードする配列、「Ｔ」はターミネーターを表す。そして、ＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ３のクローニングサイトにイオノトロピック型グルタミン酸受容体遺伝子を挿入することにより、ＴｃＦＫＢＰ１８とイオノトロピック型グルタミン酸受容体との融合タンパク質を発現させることができる。
【００７１】
（２）大腸菌由来トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅ（ＴＦ）と融合するための発現ベクター構築
ＮＣＢＩコード：NP_414970に登録されている塩基配列情報を元に、プライマーＴＦ−Ｆ１（配列番号４）とＴＦ−Ｒ１（配列番号５）を設計した。大腸菌Ｋ１２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＴＦ−Ｆ１とＴＦ−Ｒ１をプライマー対としてＰＣＲを行い、終止コドンを除いたＴＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号６）を増幅した。このＤＮＡ断片の５’末端と３’末端には、それぞれプライマーに由来するＮｃｏＩサイトとＳｐｅＩサイトが導入された。この増幅ＤＮＡ断片をｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターに挿入してシークエンシングを行い、登録情報と相違ないことを確認した。
【００７２】
ＴＦ遺伝子を含む増幅ＤＮＡ断片が挿入されたｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターをＮｃｏＩとＳｐｅＩで処理し、ＴＦ遺伝子を得た。上記（１）で調製したＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ３をＮｃｏＩとＳｐｅＩで処理してＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子の部分を除いた後、得られたＴＦ遺伝子を挿入し、ＴＦ融合タンパク質発現用プラスミドＴＦｆ３を構築した。ＴＦｆ３は、（１）で構築したＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ３のＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子がＴＦ遺伝子に置き換わった構成を有する。すなわち、ＴＦｆ３のクローニングサイトにイオノトロピック型グルタミン酸受容体遺伝子を挿入することにより、ＴＦとイオノトロピック型グルタミン酸受容体との融合タンパク質を発現させることができる。
【００７３】
（３）大腸菌由来シャペロニンＧｒｏＥＬの７回連結体と融合するための発現ベクター構築
大腸菌Ｋ１２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＣＰＮ−Ｆ１（配列番号７）とＣＰＮ−Ｒ１（配列番号８）をプライマー対としてＰＣＲを行い、ＧｒｏＥＬ遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号９）を増幅した。このＤＮＡ断片の５’末端と３’末端には、それぞれプライマーに由来するＳｐｅＩサイトとＸｂａＩサイトが導入された。このＤＮＡ断片７個を直列に連結し、ＧｒｏＥＬ７回連結体遺伝子（（ＧｒｏＥ）７遺伝子）を作製した。ｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクター（アマシャムファルマシア社）のＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに、（ＧｒｏＥ）７遺伝子と他の必要な配列を導入し、発現ベクターｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈを構築した（図２）。図２中、「Ｐ」はｔｒｃプロモーター、「ｇｒｏＥＬ」はＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子、「（ＧｒｏＥ）７」は（ＧｒｏＥ）７遺伝子、「ＰＳ」はペプチドリンカーをコードする配列（ペプチドリンカーサイト）、「ＣＳ」はクローニングサイト、「Ｅｋ」はエンテロキナーゼ翻訳サイト、「Ｈｉｓ」はヒスチジンタグをコードする配列（Ｈｉｓペプチドサイト）、「Ｔ」はターミネーターを示す。すなわち、ｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈは、ｔｒｃプロモーターの下流に（ＧｒｏＥ）７遺伝子、ペプチドリンカーサイト（トロンビン切断認識部位をコードする配列を有する）、クローニングサイト、エンテロキナーゼ翻訳サイト、Ｈｉｓペプチドサイト、終止コドン、及びターミネーターが配置された構成を有している。そして、ｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈのクローニングサイトにイオノトロピック型グルタミン酸受容体遺伝子を挿入することにより、ＧｒｏＥＬ７回連結体とイオノトロピック型グルタミン酸受容体との融合タンパク質を発現させることができる。
【００７４】
（４）ヒトＡＭＰＡ型イオノトロピック型グルタミン酸受容体遺伝子の調製
ヒトｃＤＮＡクローン（インビトロジェン社；ID4215347）を鋳型とし、ＡＭＰＡ−２−Ｆ１（配列番号１０）とＡＭＰＡ−２−Ｒ１（配列番号１１）をプライマー対としてＰＣＲを行い、ヒトＡＭＰＡ型イオノトロピック型グルタミン酸受容体（以下、「ＡＭＰＡ２」と略記することがある。）遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号１２）を増幅した。このＤＮＡ断片の５’末端と３’末端には、それぞれプライマーに由来するＮｄｅＩ／ＳａｌＩ／ＮｏｔＩサイトとＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトが導入された。この増幅ＤＮＡ断片をｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターに挿入してシークエンシングを行い、登録情報と相違ないことを確認した。得られたベクターをｐＴ７−ＡＭＰＡ２＃２とした。
【００７５】
（５）融合タンパク質発現ベクターの構築
上記（４）で構築したｐＴ７−ＡＭＰＡ２＃２をＮｄｅＩとＸｈｏＩで処理し、ＡＭＰＡ２遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を（１）で構築したＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ３のＮｄｅＩ／ＸｈｏＩサイトに導入し、ＴｃＦＫＢＰ１８とＡＭＰＡ２との融合タンパク質を発現するベクターｐＴＦＫ−Ｆ３−ＡＭＰＡ２＃１１を構築した。同様に、このＤＮＡ断片を（２）で構築したＴＦｆ３のＮｄｅＩ／ＸｈｏＩサイトに導入し、ＴＦとＡＭＰＡ２との融合タンパク質を発現するベクターＴＦｆ３−ＴＦｆ３-ＡＭＰＡ２＃９を構築した。
【００７６】
上記（４）で構築したｐＴ７−ＡＭＰＡ２＃２をＮｏｔＩとＸｈｏＩで処理し、ＡＭＰＡ２遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を（３）で構築したｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２ＨのＮｏｔＩ／ＸｈｏＩサイトに導入し、（ＧｒｏＥＬ）７とＡＭＰＡ２との融合タンパク質を発現するベクターｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈ−ＡＭＰＡ２＃３９を構築した。
【００７７】
ＴｃＦＫＢＰ１８とＡＭＰＡ２融合タンパク質発現用プラスミドｐＴＦＫ−Ｆ３−ＡＭＰＡ２＃１１をＸｂａＩ及びＮｃｏＩにより制限酵素処理し、図１に示すＲＢＳを含む領域を除去した。その代わりに、５’側にＸｂａＩを、３’側にＮｃｏＩサイトを含み、且つ、削除した領域と同一の配列を有し、且つ、ＲＢＳ領域の下流に開始コドン、及びｐｅｌＢシグナル配列を有するＤＮＡ断片相補鎖を化学合成した。両相補鎖をアニールし、先にＸｂａＩ及びＮｃｏＩによりＲＢＳを含む領域を除去したｐＴＦＫ−Ｆ３−ＡＭＰＡ２＃１１に導入した。これにより、ＴｃＦＫＢＰ１８とＡＭＰＡ２との融合タンパク質のＮ末端側に、ｐｅｌＢシグナル配列を有する融合タンパク質を発現することができるベクターｐｅｌＢ−ｐＴＦＫ−Ｆ３−ＡＭＰＡ２を構築することができた。
【００７８】
（６）融合タンパク質の製造
上記（５）で構築した４種のベクターを、それぞれ大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３) ｐＲＡＲＥ株に導入し、４種の形質転換体を得た。２リットル容の三角フラスコに７００ｍＬの２×ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌ 酵母エキス、２０ｇ／Ｌ バクトトリプトン、６ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、１００μｇ／ｍＬ アンピシリン、ｐＨ７．５）を仕込み、各形質転換体を２〜３白金耳接種した。ｐＭＡＬ−ｐ２Ｘ−ＡＭＰＡ２＃１７を導入された形質転換体については、さらに培地に０．２％グルコースを添加して用いた。２５℃で４０時間、１１０ｒｐｍで回転培養した後、遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分）にて菌体を回収した。ベクターｐｅｌＢ−ｐＴＦＫ−Ｆ３−ＡＭＰＡ２を導入した形質転換体については、濁度ＯＤ６００が０．５以上となった時点で１ｍＭ ＩＰＴＧを培地中に添加し、融合タンパク質の誘導を施し、継続培養した。得られた菌体を１％プロテアーゼインヒビターカクテル（ナカライテスク社）及び１０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）２０ｍＬに懸濁し、−８０℃にて凍結保存した。
【００７９】
ｐＴＦＫ−Ｆ３−ＡＭＰＡ２＃１１、ＴＦｆ３−ＴＦｆ３−ＡＭＰＡ２＃９、及び、ｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈ−ＡＭＰＡ２＃３９が導入された形質転換体については、凍結した菌体懸濁液を融解して、超音波破砕後、超遠心分離に供し、その上清画分を回収した。さらに上清をニッケルキレートカラム（５ｍＬ）にロードし、５００ｍＭイミダゾール／ＰＢＳによる直線グラジエントにより各融合タンパク質を溶出後、融合タンパク質を含む各画分を濃縮した。その結果、培養液１Ｌ当たり、ＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質が６．５ｍｇ、ＴＦとの融合タンパク質が４．５ｍｇ、シャペロニンサブユニット７回連結体との融合タンパク質が７．６ｍｇそれぞれ回収することができた。
【００８０】
ｐｅｌＢ−ｐＴＦＫ−Ｆ３−ＡＭＰＡ２が導入された形質転換体については、凍結した菌体懸濁液をBug Buster（ノバジェン社）に懸濁し、リゾチームにより菌体を溶解した。菌体破砕液を超遠心分離に供し、上清画分を回収した。上清画分をニッケルキレートカラム（５ｍＬ）にロードし、５００ｍＭイミダゾール／ＰＢＳによる直線グラジエントにより各融合タンパク質を溶出後、融合タンパク質を含む画分を濃縮した。その結果、培養液１Ｌ当たり、ペリプラズム領域に発現させたＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質を０．９ｍｇ回収することができた。
【００８１】
表１に本実施例で用いた各プライマーの塩基配列と制限酵素サイトを示した。
【表１】
【実施例２】
【００８２】
ヒトＡＭＰＡ型イオノトロピック型グルタミン酸受容体の製造とスクリーニング用組成物の調製
実施例１の（６）で精製したＴｃＦＫＢＰ１８とＡＭＰＡ２との融合タンパク質をトロンビンにて２２℃で一昼夜処理し、ＴｃＦＫＢＰ１８とＡＭＰＡ２との間のトロンビン認識切断部位を切断した。これにより、ＴｃＦＫＢＰ１８とＡＭＰＡ２との融合タンパク質からＡＭＰＡ２を切り出し、取得することができた。
【００８３】
さらに、トロンビンにて一昼夜処理した上記反応液を、そのままＴｃＦＫＢＰ１８とＡＭＰＡ２とを含有するスクリーニング用組成物とした。
【実施例３】
【００８４】
ヒトＡＭＰＡ型イオノトロピック型グルタミン酸受容体のリガンド結合特異性評価
実施例１の（６）で調製した融合タンパク質を含む各画分（３種）、並びに、実施例２で調製したＡＭＰＡ２とＴｃＦＫＢＰ１８とを含むトロンビン処理済みの反応液（スクリーニング用組成物）の計４種の試料を、以下の手順によるＡＭＰＡ２のリガンド結合特異性評価に供した。２．５ｍＭＣａＣｌ2、及び、１００ｍＭ ＫＳＣＮを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）にＡＭＰＡ２約５０μｇ相当分の試料を添加し、3Ｈ−ＡＭＰＡ（受容体に対するアゴニスト）をホットトレーサー、コールドのＡＭＰＡを置換体とするリガンド結合特異性評価を行った。反応条件は４℃、６０分間とした。反応終了後、セルハーベスターにより膜受容体をあらかじめポリエチレンイミン処理しておいたガラスフィルター上に吸着させ、フィルターを３ｍＬの上記緩衝液で３回洗浄した。フィルターを測定用バイアルに移し、液体シンチレーター（Atomlight、登録商標）５ｍＬを添加し、液体シンチレーションカウンターにて測定（２分間）した。その結果、（ＧｒｏＥＬ）７と融合させたＡＭＰＡ２では５２９ｄｐｍ、ＴＦと融合させたＡＭＰＡ２では２１５ｄｐｍ、ＴｃＦＫＢＰ１８と融合させたＡＭＰＡ２では２３８ｄｐｍ、ペリプラズムに発現させた場合のＴｃＦＫＢＰ１８と融合させたＡＭＰＡ２では３５４ｄｐｍとそれぞれ特異的な結合活性が確認された。
【００８５】
以上より、ＴｃＦＫＢＰ１８とＡＭＰＡ２との融合タンパク質、ＴＦとＡＭＰＡ２との融合タンパク質、（ＧｒｏＥＬ）７とＡＭＰＡ２との融合タンパク質は、いずれもグルタミン酸受容体に対するアゴニストに特異的な結合活性（リガンド結合活性）を有していた。これにより、これらの融合タンパク質を用いてヒトＡＭＰＡ型イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングできることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】ＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ３の主要部の構成を示す説明図である。
【図２】ｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈの主要部の構成を示す説明図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は融合タンパク質及びその製造方法、イオノトロピック型グルタミン酸受容体の製造方法、化合物のスクリーニング方法、並びに、スクリーニング用組成物に関する。本発明は、イオノトロピック型グルタミン酸受容体を標的とする新規医薬の開発等に有用なものである。
【背景技術】
【０００２】
グルタミン酸は、中枢ニューロンにおいて興奮性シナプス伝達を担うと共に、学習・記憶の基礎となるシナプス伝達の可塑性変化、種々の神経疾患に伴うニューロン死に関わる生理活性機能を有している。グルタミン酸の受容体はイオンチャネル型受容体（イオノトロピックグルタミン酸受容体：ｉＧｌｕＲ）と代謝調節型受容体（メタボトロピックグルタミン酸受容体：ｍＧｌｕＲ）の２種類に大別される。
【０００３】
イオノトロピックグルタミン酸受容体はアゴニストと結合する受容体の部分とチャネルを形成する部分とから成る複合体である。イオノトロピック型グルタミン酸受容体は分子多様性を持って中枢神経系の生理的活動と病態のさまざまな局面で重要な役割を演じているため、創薬研究において極めて重要視されている受容体の一つである。すなわち、イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物はアンタゴニスト又はアゴニストとして薬理活性が期待できる。
【０００４】
イオノトロピック型グルタミン酸受容体には、ＡＭＰＡ型、カイニン酸型、ＮＭＤＡ型の少なくとも３種のサブタイプが知られている（非特許文献１）。ＡＭＰＡ型は、人工アミノ酸であるα-アミノ−３−ヒドロキシ−５−メソオキサゾール−４−プロピオン酸（amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid；ＡＭＰＡ）を選択的にアゴニストとして受容する一群であり、ＧｌｕＲ１、ＧｌｕＲ２、ＧｌｕＲ３、ＧｌｕＲ４のサブユニットが知られている。カイニン酸型は、カイニン酸を強力なアゴニストとして受容する一方でＡＭＰＡに対してほとんど反応しないものとして分類されている。カイニン酸型サブユニットとしては、ＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６、ＧｌｕＲ７、ＫＡ１、ＫＡ２などが知られている。ＮＭＤＡ型は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（N-methyl-D-aspartic acid；ＮＭＤＡ）をアゴニストとして選択特異的に受容する一群であり、ＮＲ１、ＮＲ２、ＮＲ３Ａなどのサブユニットが知られている。これらのサブユニットはいずれも、Ｎ末端付近の約５００アミノ酸から成る細胞外領域と、膜貫通部分を含む４カ所の疎水性領域とを有する膜タンパク質である。
【０００５】
イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する化合物のスクリーニング方法としては、イオノトロピック型グルタミン酸受容体を発現しているラットなどの動物組織をホモジネートし、そのミクロソームを材料とし、ラジオアイソトープでラベルした既知の化合物をトレーサーとして結合実験を行うのが常法である。しかしながら、この方法は非ヒト動物の受容体を用いた評価結果を指標とするものであり、ヒトへの薬理効果を正しく反映しているとは限らない。むしろ近年、非ヒト動物由来の材料を用いたアッセイ法が、必ずしもヒトへの薬理効果を正しく外挿しないことが明らかになりつつある。このため、ヒト由来のイオノトロピック型グルタミン酸受容体を用いたスクリーニングのニーズが高まっている。ところが、ヒト組織を用いて同様の実験を行うことには倫理上の問題があり、実施は事実上困難である。
【０００６】
一方、イオノトロピック型グルタミン酸受容体を遺伝子工学的に発現させ、創薬活動に利用する試みもある。例えば、受容体の遺伝子をアフリカツメガエルの卵母細胞に導入・発現させ、パッチクランプ法による細胞内の電位の変化により、受容体に結合するアゴニスト、アンタゴニストのスクリーニングを実施する方法が知られている。しかしながら、この方法はハイスループット性に欠けるため、化合物ライブラリーから大規模にスクリーニングすることには不向きである。一方、受容体を精製・回収し、ラジオアイソトープ標識化合物を用いた結合実験に供することも考えられる。しかしながら、受容体の発現量は極めて微量であるため、この方法もハイスループット性に欠け、実用的ではない。
【０００７】
他の膜タンパク質と同様に、イオノトロピック型グルタミン酸受容体についても遺伝子工学的に大量に強制発現させた例はこれまでほとんど報告されていない。非特許文献２には、ＡＭＰＡ型イオノトロピックグルタミン酸受容体の細胞外領域のみを遺伝子工学的に設計し、大腸菌を用いて封入体として発現させる方法が報告されている。しかしながら、この方法では封入体をリフォールディングする必要があり、多大な手間を要する。また、この報告の方法は受容体の全長を大量に発現させるものではない。
【０００８】
膜タンパク質等の難溶性のタンパク質を正しく折り畳まれた可溶性の状態で発現させる技術として、「タンパク質折り畳み因子」と呼ばれるタンパク質の作用を利用する方法が提案されている。タンパク質折り畳み因子は、他のタンパク質の折り畳み反応（フォールディング）を促進する作用を有するタンパク質の総称であり、酵素的に働く「フォールダーゼ」と非酵素的に働く「分子シャペロン」とに分類することができる。例えば、難溶性の目的タンパク質をタンパク質折り畳み因子との融合タンパク質として発現させ、目的タンパク質を正しく折り畳まれた可溶性の状態で取得する方法が提案されている（特許文献１）。しかし、この方法の有効性は目的タンパク質の種類によって異なり、イオノトロピック型グルタミン酸受容体のような４箇所の疎水性領域を有し、かつオリゴマーを形成する受容体に対して有効であるか否かは定かでない。
【特許文献１】国際公開第０２／０５２０２９号パンフレット
【非特許文献１】小澤ら，医学のあゆみ，２００２年，第２０１巻，第１３号 ，ｐ１０６１−
【非特許文献２】GUO-QIANG CHENら，プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・U.S.A.（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.），１９９７年，第９４巻，ｐ１３４３１−
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物を容易にスクリーニングするための一連の技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記した課題を解決するための請求項１に記載の発明は、イオノトロピック型グルタミン酸受容体のＮ末端側又はＣ末端側に分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットが連結されてなり、かつリガンド結合活性を有することを特徴とする融合タンパク質である。
【００１１】
また請求項２に記載の発明は、イオノトロピック型グルタミン酸受容体は、ヒト由来のものであることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質である。
【００１２】
本発明の融合タンパク質は、イオノトロピック型グルタミン酸受容体のＮ末端側又はＣ末端側に分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットが連結されてなるものである。そして、本発明の融合タンパク質は、受容体としての本質的な活性である「リガンド結合活性」を保持している。本発明の融合タンパク質は、リガンド結合活性を有するので、単独分子としてのイオノトロピック型グルタミン酸受容体の代替物質として利用できる。例えば、イオノトロピック型グルタミン酸受容体としてヒト由来のものを採用した融合タンパク質（請求項２）を使用すれば、組織ホモジネートを使用する従来の方法では実施できなかったヒト由来イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対するスクリーニングを行うことができる。さらに、本発明の融合タンパク質は遺伝子工学的に大量取得が可能であるので、イオノトロピック型グルタミン酸受容体の部分を切り出すことによりイオノトロピック型グルタミン酸受容体を高純度で高収率、かつ、容易に製造することができる。
【００１３】
ここで「リガンド結合活性」とは、天然（native）のイオノトロピックグルタミン酸受容体が本質的に有する活性を表現したものであり、具体的には「グルタミン酸に特異的な結合活性」、「イオノトロピックグルタミン酸受容体に対するアゴニストに特異的な結合活性」、及び「イオノトロピックグルタミン酸受容体に対するアンタゴニストに特異的な結合活性」等が例示される。
【００１４】
ここで「分子シャペロン活性」とは、「変性したタンパク質を元の正常型にリフォールディングさせる活性、又は、変性したタンパク質の不可逆的な凝集を抑制する活性」を指すものとする。「分子シャペロン活性を有するタンパク質」の代表例はシャペロニン、スモールヒートショックプロテイン、Ｈｓｐ９０等の「分子シャペロン」に属する一群のタンパク質である。ただし、分子シャペロン以外のタンパク質であっても、上記した「分子シャペロン活性」を有するタンパク質であれば、本発明における「分子シャペロン活性を有するタンパク質」に含まれる。
【００１５】
本発明においてイオノトロピック型グルタミン酸受容体に連結されるタンパク質は、「分子シャペロン活性を有するタンパク質」と「そのサブユニット」のいずれかである。前者は分子シャペロン活性を有するタンパク質が単量体である場合、後者は複数のサブユニットからなる複合タンパク質の場合に該当する。
【００１６】
請求項３に記載の発明は、分子シャペロン活性を有するタンパク質は、シャペロニンであることを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質である。
【００１７】
シャペロニンは分子シャペロンの一種であり、分子量約６万のサブユニット（シャペロニンサブユニット）からなる複合タンパク質ある。代表的なシャペロニンは、シャペロニンサブユニット７〜９個からなるリング状構造体が２個重なった、総分子量８０万〜１００万程度のシリンダー状の巨大な複合タンパク質である。シャペロニンはその内部に他のタンパク質を格納し、正しく折り畳むことができる。そして本発明の融合タンパク質は、分子シャペロン活性を有するタンパク質としてシャペロニンを採用したものである。
【００１８】
請求項４に記載の発明は、シャペロニンを構成するサブユニットの少なくとも２個は、ペプチド結合を介して直列に連結されていることを特徴とする請求項３に記載の融合タンパク質である。
【００１９】
２個以上のシャペロニンサブユニットがペプチド結合を介して直列に連結された人工タンパク質（以下、「シャペロニンサブユニット連結体」と称する。）が知られており、必要に応じて単独分子のシャペロニンサブユニットを補充しながら、天然型シャペロニンと同様にリング状構造体を形成することがわかっている（古谷ら，Protein Science, 2005, 14, 341）。そして本発明の融合タンパク質は、分子シャペロン活性を有するタンパク質としてシャペロニンサブユニット連結体を採用したものである。なお、Ｎ個のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンサブユニット連結体を、以下、「シャペロニンサブユニットＮ回連結体」と呼ぶこととする。
【００２０】
請求項５に記載の発明は、分子シャペロン活性を有するタンパク質は、ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼに属するものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質である。
【００２１】
ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼ（Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase。以下、「ＰＰＩａｓｅ」と略記する。）はフォールダーゼの一種であり、細胞内で折り畳み途上のタンパク質中のアミノ酸のうち、プロリン残基のＮ末端側ペプチド結合のシス−トランス異性化反応を触媒する活性（ＰＰＩａｓｅ活性）を有する酵素である。一部のＰＰＩａｓｅはＰＰＩａｓｅ活性に加えて「分子シャペロン活性」を有することが知られており、本発明の融合タンパク質は、分子シャペロン活性を有するタンパク質として当該ＰＰＩａｓｅを採用したものである。
【００２２】
ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼがトリガーファクタータイプ又は古細菌由来ＦＫＢＰタイプのものである構成が推奨される（請求項６）。
【００２３】
請求項７に記載の発明は、分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットは、ペプチドリンカーを介してイオノトロピック型グルタミン酸受容体のＮ末端側又はＣ末端側に連結されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質である。
【００２４】
本発明の融合タンパク質においては、分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットとイオノトロピック型グルタミン酸受容体とがペプチドリンカーを介して間接的に連結されている。本発明によれば、ペプチドリンカー部分を利用して融合タンパク質に所望の機能を容易に付与することができる。
【００２５】
請求項８に記載の発明は、ペプチドリンカーは、プロテアーゼの認識切断部位を有するものであることを特徴とする請求項７に記載の融合タンパク質である。
【００２６】
かかる構成により、融合タンパク質からイオノトロピック型グルタミン酸受容体を容易に切り出すことができる。
【００２７】
イオノトロピック型グルタミン酸受容体がＡＭＰＡ型受容体である構成（請求項９）、ＮＭＤＡ型受容体である構成（請求項１０）、カイニン酸型受容体である構成（請求項１１）が採用され得る。
【００２８】
請求項１２に記載の発明は、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を製造する方法であって、Ｎ末端側にシグナルペプチドが付加された前記融合タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させ、該宿主細胞のペリプラズム領域又は細胞外に前記融合タンパク質を分泌させる工程を含むことを特徴とする融合タンパク質の製造方法である。
【００２９】
本発明は融合タンパク質の製造方法にかかるものであり、宿主細胞のペリプラズム領域又は細胞外に融合タンパク質を分泌させる工程を含む。本発明では融合タンパク質をペリプラズム領域あるいは細胞外といった酸化的環境に発現・分泌させるので、融合タンパク質が適切なジスルフィド結合を形成しやすい。その結果、融合タンパク質に含まれるイオノトロピック型グルタミン酸受容体は、その立体構造がより安定化されたものとなる。
【００３０】
請求項１３に記載の発明は、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質からイオノトロピック型グルタミン酸受容体を切り出してイオノトロピック型グルタミン酸受容体を取得することを特徴とするイオノトロピック型グルタミン酸受容体の製造方法である。
【００３１】
本発明はイオノトロピック型グルタミン酸受容体の製造方法にかかるものであり、上記した本発明の融合タンパク質からイオノトロピック型グルタミン酸受容体を切り出すことを特徴とする。本発明のイオノトロピック型グルタミン酸受容体の製造方法では、遺伝子工学的に大量取得が可能な融合タンパク質を用いるので、イオノトロピック型グルタミン酸受容体を高収率で取得することができる。さらに、融合タンパク質からイオノトロピック型グルタミン酸受容体を切り出す構成を採用したので、製造が容易に行える。
【００３２】
請求項１４に記載の発明は、融合タンパク質にプロテアーゼを作用させることによってイオノトロピック型グルタミン酸受容体を切り出すことを特徴とする請求項１３に記載のイオノトロピック型グルタミン酸受容体の製造方法である。
【００３３】
かかる構成により、融合タンパク質からイオノトロピック型グルタミン酸受容体をきわめて容易に切り出すことができる。
【００３４】
請求項１５に記載の発明は、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質と被検化合物との結合性を指標として被検化合物のイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングすることを特徴とする化合物のスクリーニング方法である。
【００３５】
本発明は、イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物のスクリーニング方法にかかるものである。本発明のスクリーニング方法では、単独分子のイオノトロピック型グルタミン酸受容体ではなく、本発明の融合タンパク質を用いる。上記したように、本発明の融合タンパク質は、単独分子としてのイオノトロピック型グルタミン酸受容体の代替物質として利用できるものである。本発明のスクリーニング方法では、融合タンパク質としてヒト由来イオノトロピック型グルタミン酸受容体を含むものを使用することができるので、組織ホモジネートを使用する従来の方法では実施できなかったヒト由来イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対するスクリーニングを行うことができる。その結果、イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する化合物を正確にスクリーニングすることができる。
【００３６】
請求項１６に記載の発明は、下記工程：
（１）請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるイオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、イオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質とを遊離させ、遊離したイオノトロピック型グルタミン酸受容体と被検化合物とを溶液中で接触させる工程、
（２）工程（１）でイオノトロピック型グルタミン酸受容体と被検化合物とを接触させた際の被検化合物のイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングする工程、
を包含することを特徴とする化合物のスクリーニング方法である。
【００３７】
本発明のスクリーニング方法では、分子シャペロン活性を有するタンパク質の存在下でイオノトロピック型グルタミン酸受容体と被検化合物とを接触させる。そして、分子シャペロン活性を有するタンパク質とイオノトロピック型グルタミン酸受容体として、本発明の融合タンパク質を切断して遊離させたものを使用する。ここで、被検化合物と接触する遊離のイオノトロピック型グルタミン酸受容体は、溶液中において分子シャペロン活性を有するタンパク質の作用によって正しく折り畳まれた可溶性の状態で存在できる。したがって本発明のスクリーニング方法によれば、イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する化合物を正確にスクリーニングすることができる。
【００３８】
融合タンパク質として前記連結部にプロテアーゼ認識切断部位を有するものを使用し、工程（１）において前記融合タンパク質に当該プロテアーゼを作用させて前記プロテアーゼ認識切断部位を切断する構成が推奨される（請求項１７）。
【００３９】
請求項１８に記載の発明は、イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングするために用いられる組成物であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有することを特徴とするスクリーニング用組成物である。
【００４０】
本発明はイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物のスクリーニング用組成物に係るものであり、本発明の融合タンパク質を含有することを特徴とする。本発明のスクリーニング用組成物を使用すれば、イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物のスクリーニングを簡便に行うことができる。
【００４１】
請求項１９に記載の発明は、イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングするために用いられる組成物であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるイオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、イオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質を遊離させてなるスクリーニング用組成物である。
【００４２】
本発明のスクリーニング用組成物は、本発明の融合タンパク質を溶液中で切断し、イオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質を遊離させてなるものであり、分子シャペロン活性を有するタンパク質とイオノトロピック型グルタミン酸受容体とを含有する。本発明のスクリーニング用組成物を使用すれば、イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物のスクリーニングを簡便に行うことができる。
【発明の効果】
【００４３】
本発明の融合タンパク質は、単独分子としてのイオノトロピック型グルタミン酸受容体の代替物質として利用でき、例えば、イオノトロピック型グルタミン酸受容体としてヒト由来のものを採用することで、組織ホモジネートを使用する従来の方法では実施できなかったヒト由来イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対するスクリーニングを行うことができる。さらに、本発明の融合タンパク質からイオノトロピック型グルタミン酸受容体の部分を切り出すことにより、イオノトロピック型グルタミン酸受容体を高収率かつ容易に製造することができる。
【００４４】
本発明の融合タンパク質の製造方法によれば、立体構造がより安定化されたイオノトロピック型グルタミン酸受容体を含む融合タンパク質を製造することができる。
【００４５】
本発明のイオノトロピック型グルタミン酸受容体の製造方法によれば、イオノトロピック型グルタミン酸受容体を高収率かつ容易に取得することができる。
【００４６】
本発明のスクリーニング方法によれば、イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する化合物を正確にスクリーニングすることができる。
【００４７】
本発明のスクリーニング用組成物によれば、イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対するアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する化合物のスクリーニングを容易に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
本発明の融合タンパク質は、イオノトロピック型グルタミン酸受容体のＮ末端側又はＣ末端側に分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットが連結されてなり、かつリガンド結合活性を有する。好ましくは、イオノトロピック型グルタミン酸受容体がヒト由来のものである。
【００４９】
分子シャペロン活性を有するタンパク質の例としては、シャペロニン（Ｈｓｐ６０）、スモールヒートショックプロテイン、プレフォルディン、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ、Ｈｓｐ９０、等の分子シャペロンに属するタンパク質が挙げられる。好ましくは、シャペロニンが採用される。
【００５０】
シャペロニンは、グループ１型とグループ２型とに大別される。バクテリアや真核生物のオルガネラに存在するシャペロニンはグループ１型に分類され、いずれも分子量６０ｋＤａからなるシャペロニンサブユニット７つが環状に連なるリング構造を形成し、さらに２つのリングが２層構造を形成する、１４量体のホモオリゴマーを形成する。これらはコシャペロニンと称される分子量約１０ｋＤａのタンパク質の環状７量体を補因子とする。１型シャペロニンの例としては、大腸菌由来のシャペロニンであるＧｒｏＥＬが挙げられる。一方、グループ２型シャペロニンは、真核生物の細胞質や古細菌にみられ、通常８〜９個のシャペロニンサブユニットからなるリングが２層に連なった１６〜１８量体のホモ、またはヘテロオリゴマーを形成している。本発明の融合タンパク質に含まれるシャペロニンは、グループ１型及びグループ２型のいずれでもよい。
【００５１】
好ましい実施形態では、シャペロニンサブユニットの少なくとも２個がペプチド結合を介して連結されている。換言すれば、イオノトロピック型グルタミン酸受容体のＮ末端側又はＣ末端側に「シャペロニンサブユニット連結体」が連結されている。上記したように、シャペロニンサブユニット連結体においても、必要に応じて単独分子のシャペロニンサブユニットを補充しながら、天然型シャペロニンと同様にリング状構造体を形成することがわかっている。また、シャペロニンサブユニットＮ回連結体の連結数（Ｎ）は、そのシャペロニンの由来によって決定される最適数であることが特に好ましく、グループ１型シャペロニンの場合には７個、グループ２型シャペロニンの場合には８又は９個が好ましい。Ｎがこれらの最適数であれば、シャペロニンサブユニット連結体のみでリング状構造体を形成することができ、単独分子のシャペロニンサブユニットを補充する必要がない。
【００５２】
本発明の融合タンパク質においては、リング構造への自己集合能が維持されている限り、天然型のシャペロニンと同様にアミノ酸変異体等の変異型のシャペロニンも採用することができる。
【００５３】
本発明の融合タンパク質においては、分子シャペロンには分類されない「分子シャペロン活性を有するタンパク質」を採用することもできる。好ましくは、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅを採用する。すなわち、一部のＰＰＩａｓｅは、本来のＰＰＩａｓｅ活性に加えて分子シャペロン活性を有する。分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅの例としては、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ；トリガーファクター（ＴＦ）タイプＰＰＩａｓｅ（Huang, Protein Sci., 9, 1254-, 2000年）；ＦｋｐＡタイプＰＰＩａｓｅ（Arie, Mol. Microbiol. 39, 199-, 2000年）；ＳｌｙＤタイプＰＰＩａｓｅ（Scholz, Biochemistry, 45, 20-, 2006年）；ＦＫＢＰ５２タイプＰＰＩａｓｅ（Bose, Science, 274, 1715-, 1996年）；ＣｙＰ４０タイプＰＰＩａｓｅ（Pirkl, J. Mol. Biol., 308, 795-, 2001年）；ＳｕｒＡタイプＰＰＩａｓｅ（Behrens, EMBO J. 20, 285-, 2001年）、が挙げられる。
【００５４】
このうち、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、その分子量の違いにより２種類に大別できる。一方は分子量が１６〜１８ｋＤａ程度のショートタイプであり、他方は２６〜３３ｋＤａ程度のロングタイプである。本発明の融合タンパク質においては、ショートタイプ、ロングタイプのいずれの古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅでも採用できるが、一般的に、ショートタイプの方がより強い分子シャペロン活性を有する傾向にあること、タンパク質の分子量が大きくなるにつれて、その組み換えタンパク質の発現量が低下する傾向があること、の２点を考慮すると、ショートタイプの古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを採用することがより好ましい。
【００５５】
さらに、これらのＰＰＩａｓｅの一部のアミノ酸残基を改変したポリペプチドや、これらのＰＰＩａｓｅの一部分を含むポリペプチド等であって、ＰＰＩａｓｅ活性と分子シャペロン活性とを有するポリペプチドも、分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅとして採用できる。
【００５６】
上記したように、本発明において「分子シャペロン活性」とは、「変性したタンパク質を元の正常型にリフォールディングさせる活性、又は、変性したタンパク質の不可逆的な凝集を抑制する活性」を指す。分子シャペロン活性の評価方法としては、例えば、ロダネーゼ、クエン酸合成酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等をモデル酵素とし（河田，バイオサイエンスとインダストリー,５６,５９３−,１９９８年）、これらを６Ｍ塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤で変性処理後、検定対象物質を含む緩衝液で変性剤を希釈した際に開始する変性タンパク質の再生率や、変性タンパク質の凝集の抑制率をもって、検定対象物の分子シャペロン活性を評価することができる。なお、変性タンパク質の再生率を評価する方法としては、例えばロダネーゼの場合、ホロビッチらの方法（Horowitz, Methods Mol. Biol., 40, 361-, 1995年）が挙げられ、変性タンパク質の凝集抑制を評価する方法としては田口らの方法（Taguchi, J. Biol. Chem., 269, 8529-, 1994年）等が挙げられる。
【００５７】
好ましい実施形態では、分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットは、ペプチドリンカーを介してイオノトロピック型グルタミン酸受容体のＮ末端側又はＣ末端側に連結されている。特に、ペプチドリンカーがプロテアーゼ認識切断部位を有する実施形態によれば、融合タンパク質に当該のプロテアーゼを作用させることにより、イオノトロピック型グルタミン酸受容体を容易に切り出すことができる。当該プロテアーゼの例としては、トロンビン、エンテロキナーゼ、ファクターＸ、プレシジョンプロテアーゼ等が挙げられる。
【００５８】
本発明で採用されるイオノトロピック型受容体のサブタイプとしては特に限定はなく、例えば、ＡＭＰＡ型、カイニン酸型、あるいはＮＭＤＡ型のものが採用可能である。δ型に属するものでもよい。
【００５９】
本発明の融合タンパク質は、例えば、分子シャペロン活性を有するタンパク質をコードする遺伝子とイオノトロピック型グルタミン酸受容体をコードする遺伝子とを連結させた融合遺伝子を発現させることにより製造することができる。例えば、該融合遺伝子を発現ベクターに組み込み、該組換えベクターを適宜の宿主に導入して形質転換体を作製し、該形質転換体内で融合遺伝子を発現させればよい。このときに用いる宿主としては特に限定はないが、培養コストが安価であり、培養日数が短く、培養操作が簡便な点からバクテリア等の微生物が好ましく、特に、大腸菌が取り扱いの容易さの面でより好ましい。
【００６０】
さらに、宿主細胞のペリプラズム領域や細胞外に前記融合タンパク質に分泌発現させることにより、融合タンパク質を効率的に製造することができる。すなわち、本発明の融合タンパク質の製造方法は、Ｎ末端側にシグナルペプチド（シグナル配列）が付加された前記融合タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させ、該宿主細胞のペリプラズム領域又は細胞外に前記融合タンパク質を分泌させる工程を含む。この方法では融合タンパク質を酸化的環境に発現・分泌させるので、融合タンパク質が適切なジスルフィド結合を形成しやすくなり、融合タンパク質に含まれるイオノトロピック型グルタミン酸受容体の立体構造を安定化させることができる。また、発現させたイオノトロピック型グルタミン酸受容体が宿主細胞の細胞膜に組み込まれることにより、受容体の比活性が向上することが期待できる。大腸菌を宿主として用いる場合のシグナル配列としては、ｐｅｌＢ、ｏｍｐＴ、Ｍ１３ファージのｇ３タンパクのシグナル配列、などが挙げられる。
【００６１】
本発明のイオノトロピック型グルタミン酸受容体の製造方法は、本発明の融合タンパク質からイオノトロピック型グルタミン酸受容体を切り出して取得するものである。好ましくは、プロテアーゼ認識切断部位を有するペプチドリンカーを介して分子シャペロン活性を有するタンパク質とイオノトロピック型グルタミン酸受容体とが連結されている融合タンパク質を用い、この融合タンパク質に当該プロテアーゼを作用させて、イオノトロピック型グルタミン酸受容体を切り出す。例えば、トロンビン認識切断部位を有するペプチドリンカーを採用した場合には、融合タンパク質にトロンビンを作用させてトロンビン認識切断部位を切断し、イオノトロピック型グルタミン酸受容体を切り出すことができる。
【００６２】
本発明の化合物のスクリーニング方法の１つの様相では、本発明の融合タンパク質と被検化合物との結合性を指標として被検化合物のイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングする。例えば、非ヒト動物の組織ホモジネートを使用する従来のスクリーニング方法において、組織ホモジネートの代わりに本発明の融合タンパク質を使用することにより、本様相のスクリーニング方法を実施することができる。特に、ヒト由来イオノトロピック型グルタミン酸受容体を含む融合タンパク質を用いる実施形態によれば、組織ホモジネートの使用では実施困難であったヒト由来イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対するスクリーニングを行うことができ、好適である。なお、本様相のスクリーニング方法においては複数種の融合タンパク質を併用してもよく、例えば、「イオノトロピック型グルタミン酸受容体とシャペロニンとの融合タンパク質」と「イオノトロピック型グルタミン酸受容体とＰＰＩａｓｅとの融合タンパク質」の２種を併用することができる。
【００６３】
本発明のスクリーニング用組成物の１つの様相では、本発明の融合タンパク質を含有する。本様相のスクリーニング用組成物を用いることにより、融合タンパク質と被検化合物との結合性を容易に調べることができる。本様相のスクリーニング用組成物は本発明の融合タンパク質を含有しておればよく、その他の成分については特に限定はない。例えば、適宜の緩衝成分や安定化剤を含有していてもよい。組成物の形状についても特に限定はなく、溶液状でもよいし、凍結乾燥品でもよい。
【００６４】
本発明の化合物のスクリーニング方法の他の様相は、２つの工程（１）及び（２）を包含する。工程（１）では、本発明の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるイオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、イオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質とを遊離させる。これにより、イオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との混合物が得られる。この段階で、遊離したイオノトロピック型グルタミン酸受容体と被検化合物とを溶液中で接触させる。接触させるための具体的手順としては、例えば、融合タンパク質の切断処理が終了した溶液に被検化合物を添加することが挙げられる。すなわち、イオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との混合物に被検化合物を添加する。他の例としては、工程（１）開始時の溶液に予め被検化合物を含有させておき、その後、融合タンパク質の切断処理を行うことが挙げられる。すなわち、融合タンパク質と被検化合物とを混合した状態で当該融合タンパク質を切断し、分子シャペロン活性を有するタンパク質の存在下でイオノトロピック型グルタミン酸受容体と被検化合物とを接触させる。
【００６５】
そして工程（２）において、工程（１）でイオノトロピック型グルタミン酸受容体と被検化合物とを接触させた際の被検化合物のイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングする。本様相の化合物のスクリーニング方法においても、ヒト由来イオノトロピック型グルタミン酸受容体を含む融合タンパク質を用いる実施形態によれば、組織ホモジネートの使用では実施困難であったヒト由来イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対するスクリーニングを行うことができる。なお、本様相のスクリーニング方法においても複数種の融合タンパク質を併用することができる。
【００６６】
好ましい実施形態では、融合タンパク質として前記連結部にプロテアーゼ認識切断部位を有するものを使用し、工程（１）において前記融合タンパク質に当該プロテアーゼを作用させて前記プロテアーゼ認識切断部位を切断する。当該プロテアーゼの例としては、上記したトロンビン、エンテロキナーゼ、ファクターＸ、プレシジョンプロテアーゼ等が挙げられる。
【００６７】
本発明のスクリーニング用組成物の他の様相は、本発明の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるイオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、イオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質を遊離させてなるものである。連結部の切断は、例えば、連結部にプロテアーゼ認識切断部位を設けておき、融合タンパク質に当該プロテアーゼを作用させることにより行うことができる。本様相のスクリーニング用組成物を用いることにより、分子シャペロン活性を有するタンパク質の存在下における被検化合物のイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対する結合性を容易に調べることができる。なお本様相のスクリーニング用組成物は、適宜の緩衝成分や安定化剤をさらに含有していてもよいし、組成物の形状は溶液状でも凍結乾燥品でもよい。
【００６８】
以下に実施例を掲げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【００６９】
（１）超好熱性古細菌Thermococcus sp. KS-1由来ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＴｃＦＫＢＰ１８）と融合するための発現ベクター構築
分子シャペロン活性を有するＰＰＩａｓｅの１つであるＴｃＦＫＢＰ１８（Ideno, Biochem. J., 357, 465-, 2001年）の発現プラスミドｐＥＦＥ１−３（Iida, Gene, 222, 249-, 1998年）を鋳型とし、ＴｃＦｕ―Ｆ１（配列番号１）とＴｃＦｕ―Ｒ２（配列番号２）をプライマー対としてＰＣＲを行い、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号３）を増幅した。このＤＮＡ断片の５’末端と３’末端には、それぞれプライマーに由来するＮｃｏＩサイトとＳｐｅＩサイトが導入された。
【００７０】
さらに、トロンビン認識切断部位を有するペプチドリンカーをコードするＤＮＡ（ペプチドリンカーサイト）、並びに、外来遺伝子を挿入するための種々の制限酵素サイト（クローニングサイト）を含むオリゴＤＮＡを調製した。これらのＤＮＡとＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を含むＤＮＡ断片とをｐＥＴ２１ｄベクター（メルク社）の制限酵素サイトに導入した。この際、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を含むＤＮＡ断片が上流、ペプチドリンカーサイトとクローニングサイトが下流に位置するように導入した。得られたＴｃＦＫＢＰ１８融合タンパク質発現用プラスミドをＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ３とした（図１）。図１中、「Ｐ」はプロモーター、「Ｌａｃ」はラックオペレーター、「ＲＢＳ」はリボゾーム結合部位、「ＴｃＦＫＢＰ１８」はＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子、「Ｔｈｒｂｉｎ」はトロンビン認識切断部位をコードする配列、「Ｈｉｓ」はヒスチジンタグをコードする配列、「Ｔ」はターミネーターを表す。そして、ＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ３のクローニングサイトにイオノトロピック型グルタミン酸受容体遺伝子を挿入することにより、ＴｃＦＫＢＰ１８とイオノトロピック型グルタミン酸受容体との融合タンパク質を発現させることができる。
【００７１】
（２）大腸菌由来トリガーファクタータイプＰＰＩａｓｅ（ＴＦ）と融合するための発現ベクター構築
ＮＣＢＩコード：NP_414970に登録されている塩基配列情報を元に、プライマーＴＦ−Ｆ１（配列番号４）とＴＦ−Ｒ１（配列番号５）を設計した。大腸菌Ｋ１２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＴＦ−Ｆ１とＴＦ−Ｒ１をプライマー対としてＰＣＲを行い、終止コドンを除いたＴＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号６）を増幅した。このＤＮＡ断片の５’末端と３’末端には、それぞれプライマーに由来するＮｃｏＩサイトとＳｐｅＩサイトが導入された。この増幅ＤＮＡ断片をｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターに挿入してシークエンシングを行い、登録情報と相違ないことを確認した。
【００７２】
ＴＦ遺伝子を含む増幅ＤＮＡ断片が挿入されたｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターをＮｃｏＩとＳｐｅＩで処理し、ＴＦ遺伝子を得た。上記（１）で調製したＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ３をＮｃｏＩとＳｐｅＩで処理してＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子の部分を除いた後、得られたＴＦ遺伝子を挿入し、ＴＦ融合タンパク質発現用プラスミドＴＦｆ３を構築した。ＴＦｆ３は、（１）で構築したＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ３のＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子がＴＦ遺伝子に置き換わった構成を有する。すなわち、ＴＦｆ３のクローニングサイトにイオノトロピック型グルタミン酸受容体遺伝子を挿入することにより、ＴＦとイオノトロピック型グルタミン酸受容体との融合タンパク質を発現させることができる。
【００７３】
（３）大腸菌由来シャペロニンＧｒｏＥＬの７回連結体と融合するための発現ベクター構築
大腸菌Ｋ１２株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＣＰＮ−Ｆ１（配列番号７）とＣＰＮ−Ｒ１（配列番号８）をプライマー対としてＰＣＲを行い、ＧｒｏＥＬ遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号９）を増幅した。このＤＮＡ断片の５’末端と３’末端には、それぞれプライマーに由来するＳｐｅＩサイトとＸｂａＩサイトが導入された。このＤＮＡ断片７個を直列に連結し、ＧｒｏＥＬ７回連結体遺伝子（（ＧｒｏＥ）７遺伝子）を作製した。ｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクター（アマシャムファルマシア社）のＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに、（ＧｒｏＥ）７遺伝子と他の必要な配列を導入し、発現ベクターｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈを構築した（図２）。図２中、「Ｐ」はｔｒｃプロモーター、「ｇｒｏＥＬ」はＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子、「（ＧｒｏＥ）７」は（ＧｒｏＥ）７遺伝子、「ＰＳ」はペプチドリンカーをコードする配列（ペプチドリンカーサイト）、「ＣＳ」はクローニングサイト、「Ｅｋ」はエンテロキナーゼ翻訳サイト、「Ｈｉｓ」はヒスチジンタグをコードする配列（Ｈｉｓペプチドサイト）、「Ｔ」はターミネーターを示す。すなわち、ｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈは、ｔｒｃプロモーターの下流に（ＧｒｏＥ）７遺伝子、ペプチドリンカーサイト（トロンビン切断認識部位をコードする配列を有する）、クローニングサイト、エンテロキナーゼ翻訳サイト、Ｈｉｓペプチドサイト、終止コドン、及びターミネーターが配置された構成を有している。そして、ｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈのクローニングサイトにイオノトロピック型グルタミン酸受容体遺伝子を挿入することにより、ＧｒｏＥＬ７回連結体とイオノトロピック型グルタミン酸受容体との融合タンパク質を発現させることができる。
【００７４】
（４）ヒトＡＭＰＡ型イオノトロピック型グルタミン酸受容体遺伝子の調製
ヒトｃＤＮＡクローン（インビトロジェン社；ID4215347）を鋳型とし、ＡＭＰＡ−２−Ｆ１（配列番号１０）とＡＭＰＡ−２−Ｒ１（配列番号１１）をプライマー対としてＰＣＲを行い、ヒトＡＭＰＡ型イオノトロピック型グルタミン酸受容体（以下、「ＡＭＰＡ２」と略記することがある。）遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号１２）を増幅した。このＤＮＡ断片の５’末端と３’末端には、それぞれプライマーに由来するＮｄｅＩ／ＳａｌＩ／ＮｏｔＩサイトとＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトが導入された。この増幅ＤＮＡ断片をｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターに挿入してシークエンシングを行い、登録情報と相違ないことを確認した。得られたベクターをｐＴ７−ＡＭＰＡ２＃２とした。
【００７５】
（５）融合タンパク質発現ベクターの構築
上記（４）で構築したｐＴ７−ＡＭＰＡ２＃２をＮｄｅＩとＸｈｏＩで処理し、ＡＭＰＡ２遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を（１）で構築したＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ３のＮｄｅＩ／ＸｈｏＩサイトに導入し、ＴｃＦＫＢＰ１８とＡＭＰＡ２との融合タンパク質を発現するベクターｐＴＦＫ−Ｆ３−ＡＭＰＡ２＃１１を構築した。同様に、このＤＮＡ断片を（２）で構築したＴＦｆ３のＮｄｅＩ／ＸｈｏＩサイトに導入し、ＴＦとＡＭＰＡ２との融合タンパク質を発現するベクターＴＦｆ３−ＴＦｆ３-ＡＭＰＡ２＃９を構築した。
【００７６】
上記（４）で構築したｐＴ７−ＡＭＰＡ２＃２をＮｏｔＩとＸｈｏＩで処理し、ＡＭＰＡ２遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を（３）で構築したｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２ＨのＮｏｔＩ／ＸｈｏＩサイトに導入し、（ＧｒｏＥＬ）７とＡＭＰＡ２との融合タンパク質を発現するベクターｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈ−ＡＭＰＡ２＃３９を構築した。
【００７７】
ＴｃＦＫＢＰ１８とＡＭＰＡ２融合タンパク質発現用プラスミドｐＴＦＫ−Ｆ３−ＡＭＰＡ２＃１１をＸｂａＩ及びＮｃｏＩにより制限酵素処理し、図１に示すＲＢＳを含む領域を除去した。その代わりに、５’側にＸｂａＩを、３’側にＮｃｏＩサイトを含み、且つ、削除した領域と同一の配列を有し、且つ、ＲＢＳ領域の下流に開始コドン、及びｐｅｌＢシグナル配列を有するＤＮＡ断片相補鎖を化学合成した。両相補鎖をアニールし、先にＸｂａＩ及びＮｃｏＩによりＲＢＳを含む領域を除去したｐＴＦＫ−Ｆ３−ＡＭＰＡ２＃１１に導入した。これにより、ＴｃＦＫＢＰ１８とＡＭＰＡ２との融合タンパク質のＮ末端側に、ｐｅｌＢシグナル配列を有する融合タンパク質を発現することができるベクターｐｅｌＢ−ｐＴＦＫ−Ｆ３−ＡＭＰＡ２を構築することができた。
【００７８】
（６）融合タンパク質の製造
上記（５）で構築した４種のベクターを、それぞれ大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３) ｐＲＡＲＥ株に導入し、４種の形質転換体を得た。２リットル容の三角フラスコに７００ｍＬの２×ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌ 酵母エキス、２０ｇ／Ｌ バクトトリプトン、６ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、１００μｇ／ｍＬ アンピシリン、ｐＨ７．５）を仕込み、各形質転換体を２〜３白金耳接種した。ｐＭＡＬ−ｐ２Ｘ−ＡＭＰＡ２＃１７を導入された形質転換体については、さらに培地に０．２％グルコースを添加して用いた。２５℃で４０時間、１１０ｒｐｍで回転培養した後、遠心分離（５０００ｒｐｍ、１０分）にて菌体を回収した。ベクターｐｅｌＢ−ｐＴＦＫ−Ｆ３−ＡＭＰＡ２を導入した形質転換体については、濁度ＯＤ６００が０．５以上となった時点で１ｍＭ ＩＰＴＧを培地中に添加し、融合タンパク質の誘導を施し、継続培養した。得られた菌体を１％プロテアーゼインヒビターカクテル（ナカライテスク社）及び１０ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）２０ｍＬに懸濁し、−８０℃にて凍結保存した。
【００７９】
ｐＴＦＫ−Ｆ３−ＡＭＰＡ２＃１１、ＴＦｆ３−ＴＦｆ３−ＡＭＰＡ２＃９、及び、ｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈ−ＡＭＰＡ２＃３９が導入された形質転換体については、凍結した菌体懸濁液を融解して、超音波破砕後、超遠心分離に供し、その上清画分を回収した。さらに上清をニッケルキレートカラム（５ｍＬ）にロードし、５００ｍＭイミダゾール／ＰＢＳによる直線グラジエントにより各融合タンパク質を溶出後、融合タンパク質を含む各画分を濃縮した。その結果、培養液１Ｌ当たり、ＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質が６．５ｍｇ、ＴＦとの融合タンパク質が４．５ｍｇ、シャペロニンサブユニット７回連結体との融合タンパク質が７．６ｍｇそれぞれ回収することができた。
【００８０】
ｐｅｌＢ−ｐＴＦＫ−Ｆ３−ＡＭＰＡ２が導入された形質転換体については、凍結した菌体懸濁液をBug Buster（ノバジェン社）に懸濁し、リゾチームにより菌体を溶解した。菌体破砕液を超遠心分離に供し、上清画分を回収した。上清画分をニッケルキレートカラム（５ｍＬ）にロードし、５００ｍＭイミダゾール／ＰＢＳによる直線グラジエントにより各融合タンパク質を溶出後、融合タンパク質を含む画分を濃縮した。その結果、培養液１Ｌ当たり、ペリプラズム領域に発現させたＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質を０．９ｍｇ回収することができた。
【００８１】
表１に本実施例で用いた各プライマーの塩基配列と制限酵素サイトを示した。
【表１】
【実施例２】
【００８２】
ヒトＡＭＰＡ型イオノトロピック型グルタミン酸受容体の製造とスクリーニング用組成物の調製
実施例１の（６）で精製したＴｃＦＫＢＰ１８とＡＭＰＡ２との融合タンパク質をトロンビンにて２２℃で一昼夜処理し、ＴｃＦＫＢＰ１８とＡＭＰＡ２との間のトロンビン認識切断部位を切断した。これにより、ＴｃＦＫＢＰ１８とＡＭＰＡ２との融合タンパク質からＡＭＰＡ２を切り出し、取得することができた。
【００８３】
さらに、トロンビンにて一昼夜処理した上記反応液を、そのままＴｃＦＫＢＰ１８とＡＭＰＡ２とを含有するスクリーニング用組成物とした。
【実施例３】
【００８４】
ヒトＡＭＰＡ型イオノトロピック型グルタミン酸受容体のリガンド結合特異性評価
実施例１の（６）で調製した融合タンパク質を含む各画分（３種）、並びに、実施例２で調製したＡＭＰＡ２とＴｃＦＫＢＰ１８とを含むトロンビン処理済みの反応液（スクリーニング用組成物）の計４種の試料を、以下の手順によるＡＭＰＡ２のリガンド結合特異性評価に供した。２．５ｍＭＣａＣｌ2、及び、１００ｍＭ ＫＳＣＮを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）にＡＭＰＡ２約５０μｇ相当分の試料を添加し、3Ｈ−ＡＭＰＡ（受容体に対するアゴニスト）をホットトレーサー、コールドのＡＭＰＡを置換体とするリガンド結合特異性評価を行った。反応条件は４℃、６０分間とした。反応終了後、セルハーベスターにより膜受容体をあらかじめポリエチレンイミン処理しておいたガラスフィルター上に吸着させ、フィルターを３ｍＬの上記緩衝液で３回洗浄した。フィルターを測定用バイアルに移し、液体シンチレーター（Atomlight、登録商標）５ｍＬを添加し、液体シンチレーションカウンターにて測定（２分間）した。その結果、（ＧｒｏＥＬ）７と融合させたＡＭＰＡ２では５２９ｄｐｍ、ＴＦと融合させたＡＭＰＡ２では２１５ｄｐｍ、ＴｃＦＫＢＰ１８と融合させたＡＭＰＡ２では２３８ｄｐｍ、ペリプラズムに発現させた場合のＴｃＦＫＢＰ１８と融合させたＡＭＰＡ２では３５４ｄｐｍとそれぞれ特異的な結合活性が確認された。
【００８５】
以上より、ＴｃＦＫＢＰ１８とＡＭＰＡ２との融合タンパク質、ＴＦとＡＭＰＡ２との融合タンパク質、（ＧｒｏＥＬ）７とＡＭＰＡ２との融合タンパク質は、いずれもグルタミン酸受容体に対するアゴニストに特異的な結合活性（リガンド結合活性）を有していた。これにより、これらの融合タンパク質を用いてヒトＡＭＰＡ型イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングできることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】ＴｃＦＫｆｕｓｉｏｎ３の主要部の構成を示す説明図である。
【図２】ｐＴｒｃ（ＧＶ）７ＴＣ２Ｈの主要部の構成を示す説明図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオノトロピック型グルタミン酸受容体のＮ末端側又はＣ末端側に分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットが連結されてなり、かつリガンド結合活性を有することを特徴とする融合タンパク質。
【請求項２】
イオノトロピック型グルタミン酸受容体は、ヒト由来のものであることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
分子シャペロン活性を有するタンパク質は、シャペロニンであることを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
シャペロニンを構成するサブユニットの少なくとも２個は、ペプチド結合を介して直列に連結されていることを特徴とする請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
分子シャペロン活性を有するタンパク質は、ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼに属するものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼは、トリガーファクタータイプ又は古細菌由来ＦＫＢＰタイプのものであることを特徴とする請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットは、ペプチドリンカーを介してイオノトロピック型グルタミン酸受容体のＮ末端側又はＣ末端側に連結されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ペプチドリンカーは、プロテアーゼの認識切断部位を有するものであることを特徴とする請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
イオノトロピック型グルタミン酸受容体は、ＡＭＰＡ型受容体であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
イオノトロピック型グルタミン酸受容体は、ＮＭＤＡ型受容体であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
イオノトロピック型グルタミン酸受容体は、カイニン酸型受容体であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を製造する方法であって、Ｎ末端側にシグナルペプチドが付加された前記融合タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させ、該宿主細胞のペリプラズム領域又は細胞外に前記融合タンパク質を分泌させる工程を含むことを特徴とする融合タンパク質の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質からイオノトロピック型グルタミン酸受容体を切り出してイオノトロピック型グルタミン酸受容体を取得することを特徴とするイオノトロピック型グルタミン酸受容体の製造方法。
【請求項１４】
融合タンパク質にプロテアーゼを作用させることによってイオノトロピック型グルタミン酸受容体を切り出すことを特徴とする請求項１３に記載のイオノトロピック型グルタミン酸受容体の製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質と被検化合物との結合性を指標として被検化合物のイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングすることを特徴とする化合物のスクリーニング方法。
【請求項１６】
下記工程：
（１）請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるイオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、イオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質とを遊離させ、遊離したイオノトロピック型グルタミン酸受容体と被検化合物とを溶液中で接触させる工程、
（２）工程（１）でイオノトロピック型グルタミン酸受容体と被検化合物とを接触させた際の被検化合物のイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングする工程、
を包含することを特徴とする化合物のスクリーニング方法。
【請求項１７】
融合タンパク質として前記連結部にプロテアーゼ認識切断部位を有するものを使用し、工程（１）において前記融合タンパク質に当該プロテアーゼを作用させて前記プロテアーゼ認識切断部位を切断することを特徴とする請求項１６に記載の化合物のスクリーニング方法。
【請求項１８】
イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングするために用いられる組成物であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有することを特徴とするスクリーニング用組成物。
【請求項１９】
イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングするために用いられる組成物であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるイオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、イオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質を遊離させてなるスクリーニング用組成物。
【請求項１】
イオノトロピック型グルタミン酸受容体のＮ末端側又はＣ末端側に分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットが連結されてなり、かつリガンド結合活性を有することを特徴とする融合タンパク質。
【請求項２】
イオノトロピック型グルタミン酸受容体は、ヒト由来のものであることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
分子シャペロン活性を有するタンパク質は、シャペロニンであることを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
シャペロニンを構成するサブユニットの少なくとも２個は、ペプチド結合を介して直列に連結されていることを特徴とする請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
分子シャペロン活性を有するタンパク質は、ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼに属するものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
ペプチジル−プロリル・シス−トランス・イソメラーゼは、トリガーファクタータイプ又は古細菌由来ＦＫＢＰタイプのものであることを特徴とする請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
分子シャペロン活性を有するタンパク質又はそのサブユニットは、ペプチドリンカーを介してイオノトロピック型グルタミン酸受容体のＮ末端側又はＣ末端側に連結されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ペプチドリンカーは、プロテアーゼの認識切断部位を有するものであることを特徴とする請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
イオノトロピック型グルタミン酸受容体は、ＡＭＰＡ型受容体であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
イオノトロピック型グルタミン酸受容体は、ＮＭＤＡ型受容体であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
イオノトロピック型グルタミン酸受容体は、カイニン酸型受容体であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を製造する方法であって、Ｎ末端側にシグナルペプチドが付加された前記融合タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞内で発現させ、該宿主細胞のペリプラズム領域又は細胞外に前記融合タンパク質を分泌させる工程を含むことを特徴とする融合タンパク質の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質からイオノトロピック型グルタミン酸受容体を切り出してイオノトロピック型グルタミン酸受容体を取得することを特徴とするイオノトロピック型グルタミン酸受容体の製造方法。
【請求項１４】
融合タンパク質にプロテアーゼを作用させることによってイオノトロピック型グルタミン酸受容体を切り出すことを特徴とする請求項１３に記載のイオノトロピック型グルタミン酸受容体の製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質と被検化合物との結合性を指標として被検化合物のイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングすることを特徴とする化合物のスクリーニング方法。
【請求項１６】
下記工程：
（１）請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるイオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、イオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質とを遊離させ、遊離したイオノトロピック型グルタミン酸受容体と被検化合物とを溶液中で接触させる工程、
（２）工程（１）でイオノトロピック型グルタミン酸受容体と被検化合物とを接触させた際の被検化合物のイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対する結合性を評価し、当該評価結果に基づいてイオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングする工程、
を包含することを特徴とする化合物のスクリーニング方法。
【請求項１７】
融合タンパク質として前記連結部にプロテアーゼ認識切断部位を有するものを使用し、工程（１）において前記融合タンパク質に当該プロテアーゼを作用させて前記プロテアーゼ認識切断部位を切断することを特徴とする請求項１６に記載の化合物のスクリーニング方法。
【請求項１８】
イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングするために用いられる組成物であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有することを特徴とするスクリーニング用組成物。
【請求項１９】
イオノトロピック型グルタミン酸受容体に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングするために用いられる組成物であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含有する溶液中で前記融合タンパク質におけるイオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質との連結部を切断し、イオノトロピック型グルタミン酸受容体と分子シャペロン活性を有するタンパク質を遊離させてなるスクリーニング用組成物。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−２０３１８１（Ｐ２００９−２０３１８１Ａ）
【公開日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−４６３５０（Ｐ２００８−４６３５０）
【出願日】平成２０年２月２７日（２００８．２．２７）
【出願人】（０００００２１７４）積水化学工業株式会社 (5,781)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月２７日（２００８．２．２７）
【出願人】（０００００２１７４）積水化学工業株式会社 (5,781)
【Ｆターム（参考）】
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