血小板の産生方法
本発明は、成熟巨核球から血小板を産生する方法に関するものである。より具体的には、本発明は、成熟巨核球から生体外で血小板を産生する方法に関する。この血小板産生方法は、ヴォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）でコートされた固相上において、或いは、ＧＰＩｂと結合するＶＷＦ断片、その変異体またはその類似体でコートされた固相上において、少なくとも６００ｓ-1のずり速度で成熟巨核球懸濁液を流動させるステップを含んでいる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成熟巨核球から血小板を産生する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
巨核細胞（ＭＫ）の分化は、一連のステップを特徴とする連続的なプロセスである。ＭＫの倍数性は、細胞サイズの平行した増加を伴って核内分裂によって増加する。貯蔵オルガネラおよび細胞膜の合成が促進され、結果として分離膜が形成される。細胞膜の成熟は、ＭＫサイズの顕著な増加と関連している。最終的に、成熟ＭＫは、微小管が関与して細胞骨格が完全に再編成され、血小板前駆体に相当する仮足の伸長が起こる（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．、２００５ａ；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、２００５）。血小板は、すべての血小板オルガネラを含むこれら血小板前駆体の先端から放出される。
【０００３】
循環血小板は、血管壁への粘着による血栓形成、および内皮下基質へ接着した血小板の第一層上での凝集による血栓形成に関与している（Ｒｕｇｇｅｒｉ、２００３）。ヴォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）は、血管の内部表面を形成する内皮細胞の主要成分である。ＶＷＦは、高ずり速度（＞１０００ｓ-1）条件下で循環血小板を捕らえることができる唯一のタンパク質である。捕らえられた血小板は、ＶＷＦのＡ１ドメインへのＧＰＩｂ（別名ＣＤ４２ｂ）の結合を介して、固定されたマトリックスＶＷＦ上を移動する（Ｈｕｉｚｉｎｇａ ｅｔ ａｌ．、２００２）。血小板が一時的に捕らえられている間に連続的に起こるαＩＩｂβ３インテグリン（別名ＣＤ４１ａ／ＣＤ６１）の活性化により、ＧＰＩｂ介在性のシグナル伝達が引き起こされ、ＶＷＦのＲＧＤ配列へのαＩＩｂβ３の結合が可能となる。ベルナール・スーリエ症候群（ＢＳＳ）は、重篤な血小板減少症および巨大血小板を特徴とする出血性疾患である（Ｎｕｒｄｅｎ、２００５）。このベルナール・スーリエ症候群は、ＧＰＩｂ‐ＩＸ‐Ｖ複合体、具体的にはＶＷＦ結合部位を含むＧＰＩｂサブユニットの量的異常または質的異常を原因としている。ＢＳＳ患者の骨髄中のＭＫの数は正常であるため、上述のよう観察した場合の巨大血小板性血小板減少症は、ＭＫから欠陥血小板が形成されていることと関係があることを示唆している。
【０００４】
髄腔においてＭＫの血小板への断片化があまり観察されないということは、ＭＫは骨髄毛細血管中に移動しているということを示している（Ｔａｖａｓｓｏｌｉ ａｎｄ Ａｏｋｉ、１９８１）。血小板前駆体からの血小板の分離はフロー条件について記載がないまま説明されてきた。興味深いことに、トロンボポエチン（ＴＰＯ）存在下で培養されたＭＫから分離される血小板の収量は、至適成熟条件において期待される収量をはるかに下回る（Ｎｏｒｏｌ ｅｔ ａｌ．、１９９８）。血小板分離の多くのステップはいまだ解明されていない。特に血小板形成において、ずり応力がどういう役割をもつのかについては、これまで解明されていない。ＭＫの成熟時にはＭＫ表面にＶＷＦ受容体であるＧＰＩｂおよびαＩＩｂβ３が発現する（Ｄｅｂｉｌｉ ｅｔ ａｌ．、１９９０）が、成熟ＭＫは、循環血液中ではほとんど確認されておらず（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、１９７８；Ｔａｖａｓｓｏｌｉ ａｎｄ Ａｏｋｉ、１９８１）、内皮細胞の管腔側のＶＷＦに捕らえられている。
【０００５】
さらに、興味深いことには、至適ＭＫ培養条件において、生体外の分離血小板収量は、生体内での大量の日常血小板産生量から期待される収量をはるかに下回っていた。したがって、血小板産生の優れたシステムの必要性は非常に大きかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
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【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、生体外で成熟巨核球から血小板を産生する方法に関する。この方法は、成熟巨核球の懸濁液を、ヴォン・ヴィレブランド因子でコートされた固相上において、少なくとも６００ｓ-1のずり速度で流動させるステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】高ずり速度における血小板前駆体形成、阻害剤の影響、および接着性表面の定量化を示した図である。
【図１Ｂ】高ずり速度における血小板前駆体形成、阻害剤の影響、および接着性表面の定量化を示した図である。
【図２】ずり条件下および静置条件下でＶＷＦコートカバースリップに接着した臍帯血ＭＫの光学顕微鏡観察を示した図である。
【図３Ａ】ずり惹起血小板前駆体形成における微小管の役割を示した図である。
【図３Ｂ】ずり惹起血小板前駆体形成における微小管の役割を示した図である。
【図３Ｃ】ずり惹起血小板前駆体形成における微小管の役割を示した図である。
【図４】高ずり速度で流動させて、血小板形成を引き起こした状態のＭＫの超微細構造を示した図である。
【図５Ａ】血小板前駆体形成に対するＶＷＦおよび高ずり速度の特異性を示した図である。
【図５Ｂ】血小板前駆体形成に対するＶＷＦおよび高ずり速度の特異性を示した図である。
【図５Ｃ】血小板前駆体形成に対するＶＷＦおよび高ずり速度の特異性を示した図である。
【図６】高ずり速度にさらされたＭＫから得られた血小板はトロンビンにより活性化され得ることを示した図である。
【図７】トロンビンにより活性化された放出血小板はＰ‐セレクチンを発現することを示した図である。
【図８】トロンビン活性化によるＭＫ由来血小板の超微細構造変化を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［用語の定義］
本明細書において、用語「血小板」は、血餅形成を引き起こす一次止血の細胞機構に関与する細胞に由来する無核細胞質体を意味する。
【００１０】
本明細書において、用語「血小板前駆体」は、巨核球、または血小板形成を引き起こし得る細胞質連結血小板様粒子などの巨核球断片の、任意の構造形態を意味する。この構造形態には、これらに限定されるものではないが、例えば小結節および水疱など種々の形成ステージの血小板体を包含する膨張部を含む、長い細胞質の伸長、突起、または仮足を有する細胞が含まれる。
【００１１】
本明細書において、用語「巨核球」は、正常止血に必要な血液血小板の産生に関与する骨髄細胞を意味する。巨核球は骨髄中の造血幹細胞に由来する。巨核球産生のための第一シグナルは、トロンボポエチン（ＴＰＯ）である。ＴＰＯは、骨髄中の前駆体細胞の最終的な巨核球表現型への分化を誘導するために必要である。巨核球分化のためのその他の分子シグナルには、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐３、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１１、およびエリスロポエチンが含まれる。
【００１２】
本明細書において、用語「成熟巨核球」は、表面マーカーであるＧＰＩｂおよびαＩＩｂβ３を安定的に発現する巨核球集団を意味する。本明細書において、表面マーカーの「安定的な発現」は、ある細胞集団において、少なくとも７０％の細胞がこれらの表面マーカーを発現することを意味する。
【００１３】
本明細書において、用語「ずり速度」は、層流を特徴づけるために使用されるパラメーターをいう。管内において、層流は、隣接する流動層の流速が管腔軸において最大となるように増加するという放物線流速プロファイルを有する。隣接する層における半径方向速度の増加率がずり速度として定義される。平行板チャンバーにおいて、ずり速度は、式（γ）で表わされ、流動物質における速度勾配に相当する。測定ずり速度のＳＩ単位はｓ-1であり、「レシプローカル秒（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｓｅｃｏｎｄ）」または「インバース秒（ｉｎｖｅｒｓｅ ｓｅｃｏｎｄ）」として表される。ずり速度（γ）の式：
γ＝ｆ（ｋ）６Ｑ／ａｂ2
上式において、γはずり速度（ｓ-1）、Ｑは流速（ｍＬ／ｓ）、ａはスリット幅（ｃｍ）、ｂはスリット高さ（ｃｍ）、ｆ（ｋ）は系の物理的パラメーターの関数である。例えば、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ社のフローチャンバーを用いた場合（（Ｌｅｇｅｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ．、２００６）に記載）、＞１００ｓ-1のずり速度に対して、ｆ（ｋ）は１．０３である。したがって、ずり速度は流速とチャンバーのスリット高さとを調節することによって調整することができる。
【００１４】
ヒト循環血液では、ずり速度は、大動脈の３０〜４０ｓ-1から微小循環の５０００ｓ-1まで様々である。
【００１５】
本明細書において、用語「ヴォン・ヴィレブランド因子」または「ＶＷＦ」は、止血に関与する数個のモノマーから成る多量体タンパク質を意味する。ヒトのヴォン・ヴィレブランド因子の例示的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＰｅｐｔデータベースに受入番号ＡＡＢ５９４５８として見られる。好ましくは、本発明に係るヴォン・ヴィレブランド因子は、哺乳類のヴォン・ヴィレブランド因子であり、より好ましくはマウスの因子または霊長類の因子であり、より好ましくはヒトのヴォン・ヴィレブランド因子である。用語「ＶＷＦ」は、霊長類ＶＷＦなどの任意の哺乳類起源のＶＷＦ、好ましくはヒトＶＷＦを包含する。ＶＷＦは、組換えＶＷＦであってもよい。当業者であれば、本技術分野の標準的な手法にしたがって容易に組換えＶＷＦを産生することができる。
【００１６】
本発明において、ＶＷＦ因子は、組換えＶＷＦであっても天然ＶＷＦであってもよい。天然フォームでは、ＶＷＦは精製されていても他の成分を含む組成物中（例えば、細胞外マトリックス中）に含まれていてもよい。
【００１７】
ＶＷＦ断片、ＶＷＦ変異体、およびＶＷＦ類似体を用いたものも本発明の範囲内であり、これら断片、変異体、および類似体はＧＰＩｂへの結合能を有する。ＶＷＦの断片、変異体、および類似体には、ＶＷＦの５２／４８ｋＤａトリプシン断片（Ｆｕｊｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．、１９８６）；黄色ブドウ球菌Ｖ‐８プロテアーゼ消化ＶＷＦ（Ｇｉｒｍａ ｅｔ ａｌ．、１９８６ａ；Ｇｉｒｍａ ｅｔ ａｌ．、１９８６ｂ）；Ｈａｅｍａｔｅ‐Ｐ／Ｈｕｍａｔｅ‐Ｐ（Ｂｅｈｒｉｎｇ社）、Ｗｉｌｆａｃｔｉｎ（（ＬＦＢ社）、（Ｇｏｕｄｅｍａｎｄ ｅｔ ａｌ．、２００５）参照）、およびＩｍｍｕｎａｔｅ（Ｂａｘｔｅｒ社、ウイーン、オーストリア）などの治療用途のＶＷＦ濃縮物（Ｆｅｄｅｒｉｃｉ、２００５；Ｇｏｕｄｅｍａｎｄ ｅｔ ａｌ、２００５；Ｈｏｕｄｉｊｋ ｅｔ ａｌ．，１９８６）；および２Ｎ型ヴォン・ヴィレブランド病の原因であるＶＷＦ変異体（第ＶＩＩＩ因子の欠損）が含まれ得るがこれらに限定されるものではない。
【００１８】
本明細書において、用語「血小板数減少性疾患」は、低濃度の血小板の原因となる血小板産生の疾患または血小板分解の増加、あるいは正常範囲内の血小板の機能異常による疾患を意味する。本明細書において、「低濃度の血小板」は、１ｍｍ3あたり１５００００個未満の血小板濃度を意味する。本発明によれば、血小板数減少性疾患には、これらに限定されないが、自己免疫性血小板減少症、産生低下と関連した血小板減少症（中枢起源）、および任意の成因の破壊増加と関連した血小板減少症（末梢起源）が含まれる。
【００１９】
本明細書において、用語「対象」は、げっ歯類、ネコ、イヌ、および霊長類などの哺乳類を意味する。好ましくは本発明の対象はヒトである。
【００２０】
［血小板産生のための方法および装置］
本発明は、成熟巨核球の懸濁液を、ヴォン・ヴィレブランド因子でコートされた固相（solid phase）上において、少なくとも６００ｓ-1のずり速度で流動させるステップを含む、生体外での血小板産生方法に関する。
【００２１】
好ましい実施態様では、流動のずり速度は少なくとも８００ｓ-1であり、好ましくは少なくとも１０００ｓ-1であり、好ましくは少なくとも１２００ｓ-1であり、好ましくは少なくとも１４００ｓ-1であり、さらに好ましくは少なくとも１６００ｓ-1であり、少なくとも１８００ｓ-1であり、または少なくとも２０００ｓ-1である。
【００２２】
一般的に、血小板が生体内で受け得る生理的ずり速度以下のずり速度で流動させる。一般的に、このずり速度は６０００ｓ-1以下であり、好ましくは４０００ｓ-1以下、より好ましくは３０００ｓ-1以下である。
【００２３】
ある実施態様では、成熟巨核球の懸濁液は、１ｍＬあたり０．５×１０6〜４×１０6個、好ましくは１ｍＬあたり少なくとも１×１０6個、好ましくは１ｍＬあたり少なくとも２×１０6個、より好ましくは１ｍＬあたり少なくとも４×１０6個を含む細胞濃度を示す。
【００２４】
一般的に、成熟巨核球の懸濁液は、適切な細胞培養培地中に懸濁した巨核球集団を含む。ある実施態様では、細胞培養培地は、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）である。
【００２５】
成熟巨核球の懸濁液は、血液サンプルまたは骨髄サンプルから単離後に得ることができる。あるいは、ＤＡＭＩ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、１９８８）、Ｍｅｇ‐０１（Ｉｓａｋａｒｉ ｅｔ ａｌ．、２００９）、ＵＴ７／ＴＰＯ（Ｂａｒｒｏｇａ ｅｔ ａｌ．、２００８）などの巨核球安定細胞株の懸濁液を適切な条件で用いてもよい。本発明によれば、血小板産生に十分な暴露時間だけ、成熟巨核球の懸濁液を、少なくとも６００ｓ-1のずり速度で流動させる。一般的に、この暴露時間は、１０分〜２時間、一般的に１５分〜１時間、さらにより好ましくは１５〜３０分を含み得る。好ましい態様では、暴露時間はおよそ２０分である。
【００２６】
ある実施態様では、固相は、ヴォン・ヴィレブランド因子の溶液、あるいはその断片または変異体もしくは類似体の溶液とインキュベートすることによりコートされる。
【００２７】
一般的に、固相のコーティングに使用されるＶＷＦの濃度は、５〜１００μｇ／ｍＬである。好ましい実施態様では、ＶＷＦ濃度は２０μｇ／ｍＬである。
【００２８】
ある実施態様では、固相は、ＶＷＦの５２／４８ｋＤａトリプシン断片、黄色ブドウ球菌Ｖ‐８プロテアーゼ消化ＶＷＦ、治療用途のＶＷＦ濃縮物、および組換え野生型ＶＷＦまたは２Ｎ型ヴォン・ヴィレブランド病の原因であるＶＷＦ変異体からなる群より選択される断片または変異体もしくは類似体でコートされる。
【００２９】
成熟巨核球から血小板を産生する方法は、好ましくはフローチャンバーで実行することができ、このフローチャンバーはＶＷＦあるいはその断片または変異体もしくは類似体でコートされた底壁を含む。この断片または変異体もしくは類似体はＧＰＩｂと結合するものである。
【００３０】
本発明はまた、成熟巨核球から血小板を産生する装置に関し、この装置は、ＶＷＦあるいはその断片または変異体もしくは類似体でコートされた底壁を含むフローチャンバーを含み、この断片または変異体もしくは類似体はＧＰＩｂと結合する。
【００３１】
好ましい実施態様では、フローチャンバーは矩形の空洞から成る。
【００３２】
別の実施態様では、フローチャンバーの底面は、本発明に係る因子でコートされたガラスカバースリップである。
【００３３】
別の実施態様では、血小板の産生に用いられるフローチャンバーは、Ｍｅｋｒａｃｈｅ ｅｔ ａｌ．、２００２、およびＬｅｇｅｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ．、２００６に記載のチャンバーであってもよい。
【００３４】
他の実施態様では、フローチャンバーは、ガラスマイクロキャピラリーチューブ（Ｋａｕｓｋｏｔ ｅｔ ａｌ．、２００７）などのマイクロ流体フローシステム、またはマイクロ流体バイオチップおよびマイクロ流体フローセンサー（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、２００８；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．、２００２）、あるいは任意の他の種類のマイクロ流体フローシステム（例えば、Ｃｏｎａｎｔ ｅｔ ａｌ．、２００９参照）である。
【００３５】
本発明に適した一部のフローチャンバーは、無菌条件下で機能させることが有利である（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．、２００２およびＣｏｎａｎｔ ｅｔ ａｌ．、２００９参照）。好ましい実施態様では、フローチャンバーは無菌である。
【００３６】
別の実施形態では、ずり速度はフローチャンバー中の電動ポンプにより調整される。
【００３７】
［血小板および医薬組成物］
他の目的では、本発明は前述の方法により得られる血小板に関する。
【００３８】
本発明の別の目的では、前述の方法により得られる血小板は医薬組成物の調製に用いてもよい。
【００３９】
したがって、本発明には、本発明に係る血小板を含む医薬組成物をも含まれる。医薬組成物は、一般に、１つまたは複数の薬剤的に許容可能なおよび／または認可された、キャリア、添加剤、抗菌剤、保存剤、アジュバント、希釈剤、および／または安定剤を含んでいてもよい。このような補助物質は、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝物質などであってよい。適したキャリアは、一般的に、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、多量体アミノ酸、アミノ酸コポリマー、または脂質凝集物など、ゆっくり代謝される高分子である。この医薬組成は、マンニトール、デキストラン、糖質、グリセリン、乳糖もしくはポリビニルピロリドンなどの追加の添加剤、あるいは抗酸化剤もしくは不活性ガス、安定剤または生体内投与に適した組換えタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）などのその他の添加剤を含んでいてもよい。
【００４０】
本明細書において、用語「薬剤的に許容可能」とは、必要に応じて、哺乳類、特にヒトに投与した場合、副作用、アレルギー性作用またはその他の有害な作用を引き起こさない分子的実体および組成物をいう。薬剤的に許容可能なキャリアまたは賦形剤とは、無毒の固体、半固体、液体のフィラー、希釈剤、カプセル化材料または任意の種類の補助的製剤をいう。
【００４１】
さらに、本発明に係る血小板および本発明に係る医薬組成物は、血小板数減少性疾患、具体的には血小板減少症および血小板症の治療に使用してもよい。例えば、本発明に係る方法により得られる血小板を、有効量で血小板産生疾患を患っている対象に輸血してもよい。
【００４２】
好ましい実施態様では、血小板数減少性疾患は、自己免疫性血小板減少症、産生低下と関連した血小板減少症（中枢起源）、および任意の成因の破壊増加と関連した血小板減少症（末梢起源）からなる群から選択してもよい。
【００４３】
本発明に関連する態様は、血小板数減少性疾患を患っている対象を治療する方法に関し、この方法は、対象に有効量の本発明に係る血小板（または本発明に係る血小板の集団もしくは本発明に係る血小板の医薬組成物）を投与するステップを含む。
【００４４】
本発明において、本明細書における用語「治療する」または「治療」は、病状の発症を遅らせるまたは阻害すること、病状の兆候の進行、悪化、または増悪を、回復、緩和、抑制、鈍化または停止すること、病状の兆候を改善すること、および／または病状を治癒することを目的とした方法をいう。
【００４５】
本明細書において、用語「有効量」は、所望の目的を達成するのに十分な、本発明に係る血小板（または本発明に係る血小板の集団もしくは本発明に係る血小板の医薬組成物）の任意の量をいう。
【００４６】
有効用量および投与計画は、対象の病状の性質に基づく適切な医療行為により容易に決定することができ、これらに限定されないが、病状の兆候の程度および所望の組織もしくは器官の損傷または変性の程度、ならびに対象の特徴（例えば、年齢、体重、性別、および全身状態など）を含む多数の要因に依存することがある。
【００４７】
治療のために、本発明に係る血小板および医療組成物を静脈内投与により全身投与してもよい。当業者は、投与用量および投与回数を既知の方法で最適化し得る。
【００４８】
さらに、本発明に係る血小板を診断目的に用いてもよい。本発明に係る血小板を、血小板機能を標準化するための正常コントロールとして用いてもよい。
【００４９】
血小板機能検査には、正常な個人および病気の個人からの、天然機能状態の新鮮な血小板が必要とされる。ヴォン・ヴィレブランド病は、出血性疾患の最も一般的な単一原因である。さらに、最大で５０％の皮膚粘膜出血性疾患が、血小板機能障害により引き起こされる。血小板機能検査の標準化には、検査室は、実施される血小板機能検査のバッチごとに正常コントロールを実施することが必要とされる。しかし、静脈穿刺による連続的な標準的血液サンプリングにより、いくつかの健康問題および倫理的問題が生じる。血小板機能の検査室評価には、光透過凝集ＡＴＰ放出アッセイ、糖タンパク質アッセイ、電子顕微鏡、凝血原機能検査、遺伝子検査（Ｐａｉ ａｎｄ Ｈａｙｗａｒｄ、２００９）が含まれる。
【００５０】
したがって、本発明は、血小板機能を標準化するために本発明に係る血小板を使用するステップを含む、血小板疾患を診断するための方法に関する。
【００５１】
本発明に係る血小板は、健康なドナーの末梢血由来の成熟巨核から、または前述の巨核球株化細胞由来の成熟巨核球から得られる。本発明に係る血小板は、後の生体外検査において血小板機能を標準化するために用いられる。すなわち、本発明に係る血小板は、血小板機能を測定するための生体外での診断検査において、ポジティブコントロールとして用いられる。
【００５２】
本発明を、以下の実施例、図面、および表によってさらに例示する。
【００５３】
［図面］
図１Ａ、図１Ｂは、高ずり速度で流動させた場合における血小板前駆体形成阻害剤の影響、および接着性表面の定量化を示す図である。ＩＭＤＭに懸濁した細胞をＶＷＦ上で１８００ｓ-1、１０分間灌流し、その後、ＩＭＤＭのみを１０分間灌流した。接着により大きく細胞の形状が変化し、血小板前駆体が形成された。パネルＡ（図３Ａ）は、未変形のＭＫ（ステージ１）と比較した、血小板前駆体放出および血小板放出の前のずり条件下での２ステージのＭＫ変形を示す。初期の変形は、細胞質の伸長を特徴とし（ステージ２）、ステージ３は、細胞極または細胞両端での細胞骨格の再編成を伴うＭＫの後期の変形（連続的な「数珠玉」状の長くて薄いフィラメント）を含み、その後、細胞が薄い領域に切断される。さらに流動させると、長い細胞質の糸とまだ結合している血小板、または一対の血小板および円形の血小板が産生された。パネルＢ（図３Ｂ）に定量化を示す。（ａ）ＭＫの形状変化を、（１）移動しているＭＫ、（２）球形を失った初期変形ＭＫ、（３）後期変形ＭＫおよび血小板前駆体の伸長、（４）血小板前駆体の断片化および血小板の形成、の４つのカテゴリーに分類した。図１Ｂのパネルｂ〜ｆは１０視野において測定された細胞総数に対する各カテゴリーの細胞の、還流時間に応じた分布である。阻害剤非存在下で、ＶＷＦ上で灌流した臍帯血ＭＫ（図１Ｂのｂ）または骨髄ＭＫ（図１Ｂのｃ）の変形の分布。ＧＰＩｂ‐ＶＷＦ相互作用阻害剤であるグリコカリシン遮断抗体（図１Ｂのｄ）、または抗ＶＷＦ ＭｏＡｂ（図１Ｂのｅ）の存在下で、ＶＷＦ上で灌流した臍帯血ＭＫにより、ＭＫのＶＷＦ上への接触および以降のステップが主に抑制されて、血小板前駆体の形成が消失することが示唆された。αＩＩｂβ３のＶＷＦとの相互作用を遮断するアブシキシマブ（Ａｂｃｉｘｉｍａｂ）は、血小板前駆体および血小板の形成を阻害した（図１Ｂのｆ）。１５回の実験の代表を示す。バーは１０μｍを示す。
【００５４】
図２は、ずり条件下および静置条件下でＶＷＦコートカバースリップに接着した臍帯血ＭＫの光学顕微鏡観察を示す。カバースリップをフローチャンバーから取り外し、ＰＢＳでリンスした後、氷冷メタノールで固定し、続いてロマノフスキー染色を行った。２０分間高ずり速度で流動させた後、多数のＭＫが、その流動方向に対して平行に血小板前駆体の長くて薄い伸長を示した。一本の単極の長い血小板前駆体が、先端に出芽を有する細胞コアからシャフトに沿って伸長している（左のパネル）。高ずり速度の効果のコントロールとして、ＭＫをＶＷＦ上に播種して静置条件下で２０分間インキュベートし、未接着細胞を除去した後、カバースリップをＩＭＤＭでリンスした。細胞は、血小板前駆体の伸長のない、球形の形状を示した（右のパネル）。倍率は５００倍である。
【００５５】
図３は、ずり惹起血小板前駆体形成における微小管の役割を示す。
パネルＡ（図３Ａ）：血小板前駆体形成および血小板形成を示す、抗チューブリン抗体を用いた間接的免疫蛍光標識。ＶＷＦでコートされた表面上において、１８００ｓ-1のずり速度で流動させたＭＫを固定して、ファロイジン（左のパネル）および抗チューブリン抗体（右のパネル）で染色した。画像は共焦点顕微鏡で分析した。アクチンとチューブリンの共局在は見られない。
パネルＢ（図３Ｂ）：血小板を分離中のＭＫは、血小板サイズの膨張した先端を有する長くて薄い血小板前駆体を伸ばしている。血小板前駆体のシャフト全体およびその末端は、チューブリンで標識されている。２つの離れた細胞断片は、ダンベル状の血小板前駆体の輪郭を描き中心が狭くなっているが、血小板サイズの断片は円形の標識パターンを示すという、特徴的なチューブリン標識を示す。
パネルＣ（図３Ｃ）：血小板前駆体に対する微小管阻害剤の影響。血小板前駆体伸長の破たんは、チューブリンの崩壊によって特徴付けられる。
【００５６】
図４は、高ずり速度で流動させたＭＫの血小板形成を引き起こす際の超微細構造を示す。溶出細胞懸濁液を灌流チャンバーの出口から直接固定液に回収し、「方法」欄に記載のように電子顕微鏡用に処理した。成熟ＭＫは、伸長し、平行な長手方向微小管を含む細胞質の長い糸状仮足を伸ばしていた（挿入図）。これらの血小板前駆体は、細胞質オルガネラを含む規則的な膨張を示した。恐らく分離した血小板前駆体（ｐｐ）である大きな球状の細胞質断片が近くに位置していた（パネルａ）。凝縮クロマチンを含む核分葉（Ｎ）は、伸長して細胞の一方の極に局在していた。卵型の裸の核と、通常ＭＫ培養物には存在しない凝集クロマチンを含む核分葉とが、溶出液中に回収された（パネルｂ）。細胞質オルガネラで満たされた血小板前駆体（ｐｐ）が、大きな細胞質断片であり、核を欠き、およそ球状、ダンベル型、または細長い先端を有する伸長形状として現れた（パネルｃおよびｄ）。数個の分離した血小板サイズの断片（Ｐ）が観察された（パネルｅ）。バーは２μｍを示す。
【００５７】
図５は、血小板前駆体形成に対するＶＷＦおよび高ずり速度の特異性を示す。
【００５８】
パネルＡ（図５Ａ）：静置条件（上のパネル）および高ずり速度（下のパネル）における、ＶＷＦコートカバースリップ上の血小板前駆体形成ＭＫの位相差像である。静置条件では、血小板前駆体は１４時間で形成されて１６時間で最大になったが、流動時は、わずか１０分しかかからなかった。
パネルＢ（図５Ｂ）：ＨＵＶＥＣ単層は刺激非存在下においてもＭＫの接着を支持したが（上のパネル）、血小板前駆体の形成はＨＵＶＥＣ活性化後に見られた（下のパネル）。
パネルＣ（図５Ｃ）：フィブリノーゲン、フィブロネクチン、およびコラーゲンで示されるように、非ＶＷＦ表面上でのＭＫの変形および血小板前駆体形成は、ずり条件において最小となった。
【００５９】
図６は、高ずり速度で流動させたＭＫから得られた血小板はトロンビンにより活性化され得ることを示す。高ずり速度に置かれたＭＫのフロースルー中の細胞溶出液を、静置条件でフィブリノーゲン接着アッセイした後、アクチンを可視化するファロイジン‐Ａｌｅｘａ５４６とαＩＩｂβ３を可視化するＡｌｅｘａ４８８とを用いた細胞染色により共焦点顕微鏡で分析した。剪断力を与えることにより産生したＭＫ由来血小板（上のパネル）は、トロンビン非存在下（左のパネル）またはトロンビン存在下（右のパネル）で、フィブリノーゲンに接着した。非活性化細胞は、拡散したアクチン染色を示し、αＩＩｂβの膜への局在化を示す。トロンビンによる活性化により、アクチンフィラメントがストレスファイバーとして構築された。これらは、剪断状態にさらさない別のアッセイで調整した洗浄血液血小板と同様の細胞骨格構成を示す（下のパネル）。バーは１０μｍを示す。
【００６０】
図７は、トロンビンにより活性化された放出血小板はＰ‐セレクチンを発現することを示す。図６の説明文に記載したように、細胞溶出液をトロンビンで活性化して、またはトロンビンで活性化しないで、フローサイトメトリーアッセイで分析した。試料を抗ＣＤ６２Ｐ‐ＦＩＴＣ（ＦＬ１、Ｐ‐セレクチン）、および抗ＣＤ４１‐ＰＥ（ＦＬ２、αＩＩｂ）で標識した。洗浄血小板のＦＳＣ‐ＳＳＣプロファイル設定をフロースルー細胞の分析に用いた（上の左パネルのＭＫ：剪断状態にさらしたもの、下の左パネル：洗浄血小板）。トロンビン非存在下（空白のバー）またはトロンビン存在下（塗りつぶしバー）で、ドットプロットにより得られたＲ１領域、Ｒ２領域、およびＲ３領域における、ＣＤ６２Ｐ・ＣＤ４１ダブルポジティブ細胞のヒストグラム。トロンビンで活性化した試料のみがＣＤ６２Ｐポジティブ細胞を含んでいたが、すべての試料がＣＤ４１ａポジティブであった（上の右パネル）。トロンビン存在下で、非免疫ＩｇＧ（細線、灰色の背景）、抗ＣＤ６２Ｐ、または抗ＣＤ４１ａ（太線）で標識された、フロースルー中の活性化血小板（Ｒ１）のヒストグラムプロット（下の右パネル）。
【００６１】
図８は、トロンビン活性化によるＭＫ由来血小板の超微細構造変化を示す。細胞溶出液をトロンビンで活性化して、または活性化しないで、電子顕微鏡で観察した。トロンビン非存在下では、血小板サイズの断片は滑らかな表面を示し、細胞質中に点在したいくつかのアルファ粒子（Ａ）、および不連続なＳＣＣＳ槽を含んでいた（パネルａ）。トロンビン存在下では、血小板サイズの断片は活性化血小板に特徴的な形状変化、すなわち、球状の形状、表面の偽足（ｐ）、拡張したＳＣＣＳ槽内の高密度物質を示し、細胞質内に造粒が見られず、中心に微小管の束を示しており、活性化された血液血小板とよく似ている（パネルｂ）。バーは２μｍを示す。
【実施例】
【００６２】
［材料と方法］
≪タンパク質≫
ＶＷＦは、フランス分留生物工学研究所（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ ｆｒａｃｔｉｏｎｎｅｍｅｎｔ ｅｔ ｄｅｓ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（フランス、リール）からの贈与である。フィブリノーゲンは、Ｈｙｐｈｅｎ ＢｉｏＭｅｄ社（フランス、ヌーヴィル シュル オワーズ）から入手した。ヒトＶＷＦおよびフィブリノーゲンは、精製し、それぞれ混入フィブロネクチンならびにフィブリノーゲンおよびＶＷＦを除去した（Ｌｅｇｅｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ．、２００６）。ウマ腱コラーゲンは、Ｎｙｃｏｍｅｄ社（ドイツ、ミュンヘン）から入手し、ヒトフィブロネクチンはＶＷＲ社（フランス、フォントネー スー ボワ）から入手した。野生型組換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）および変異（Ｖ１３１６Ｍ ２Ｂ型）組換えＶＷＦは、他に記載のようにして得た（Ａｊｚｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、２０００）。
【００６３】
≪抗体≫
リストセチン存在下でＶＷＦのＧＰＩｂαへの結合を遮断するモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）７１３は、ＪＰ Ｇｒｉｍａ博士（仏国立医学研究所（ＩＮＳＥＲＭ）ユニット７７０、フランス、ル クルムラン‐ビセートル）から善意で贈与されたものである（Ａｊｚｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、２０００）。ＶＷＦ結合部位を含むＧＰＩｂα細胞外ドメインであるポリクローナル抗グリコカリシン抗体は、ＭＣ Ｂｅｒｎｄｔ博士（モナッシュ大学、オーストラリア、メルボルン）からの善意で贈与されたものである（Ｃｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９１）。フィコエリトリン（ＰＥ）複合化抗ＣＤ６２Ｐ（Ｐ‐セレクチン）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）複合化抗ＣＤ４１ａ（αＩＩｂ）、抗ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）、および非免疫抗体は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社（フランス、ヴィルパント）から入手した。抗αチューブリンＭｏＡｂおよび抗βチューブリンＭｏＡｂは、Ａｍｅｒｓｈａｍ社（フランス、オルセー）から入手した。抗β３インテグリンＰ３７ＭｏＡｂは、Ｇｏｎｚａｌｅｚ‐Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ博士（ＣＳＩＣ、スペイン、マドリード）から贈与されたものである（Ｃａｌｖｅｔｅ ｅｔ ａｌ．、１９９１）。抗αＩＩｂβ３Ｆａｂ（Ｃ７Ｅ３）アブシキシマブ（レオプロ（登録商標））は、Ｌｉｌｌｙ社（フランス、シュレンヌ）から入手した。
【００６４】
≪ヒト巨核球≫
本研究で使用されるヒトＭＫは、臍帯血または骨髄から単離した前駆細胞から培養した。ヒト骨髄試料（臀部の手術時に回収）、および臍帯血試料は、当研究所の倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｅｔｈｉｃ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（パリ国立大学病院（Ａｓｓｉｓｔａｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｑｕｅ ｄｅｓ Ｈｏｐｉｔａｕｘ ｄｅ
Ｐａｒｉｓ））に従ったインフォームド・コンセントおよびヘルシンキ宣言に基づいて得た。ヒト臍帯血および骨髄のＣＤ３４＋細胞は、前述の通り（Ｆｉｃｈｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９９９）、免疫磁気法（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、フランス、グルノーブル）により分離した。１５％のＢＩＴ９５００血清代替物（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）および２０ｎｍｏｌ／ＬのＴＰＯペプチドアゴニストＡＦ１３９４８（Ｇｅｎｏｓｙｓ‐Ｓｉｇｍａ社、フランス、サン カンタン ファラヴィエ）を補充したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｇｉｂｃｏ‐Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、フランス、セルジー ポントワーズ）中で細胞を培養した。１０ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ）（Ａｍｇｅｎ社、フランス、ヌイイ シュル セーヌ）を、培養の初日に一回添加した。ＴＰＯ存在下で１０〜１６日間培養したＭＫは、完全に成熟しており血小板生合成に対応していた（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．、２００５ａ）。細胞のＧＰＩｂおよびαＩＩｂβ３の発現（６０〜７０％のポジティブ細胞）は、フローサイトメトリーにより示した。ずり実験のためには、細胞を１０〜１６日目で使用した。
【００６５】
≪ヒト血小板≫
事前の２週間薬物を摂取していない健康な個人から血液を得た。１５％（ｖ／ｖ）のクエン酸デキストロース（ＡＣＤ）（ｐＨ５．８）中に血液を採取した。アピラーゼ（１Ｕ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ社）およびＡＣＤ（４０ｍＬにつき１ｍＬ）の存在下で、単離した多血小板血漿（ＰＲＰ）から洗浄血小板を調製した（Ａｊｚｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、２０００）。すなわち、洗浄後、０．１５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．５）（Ｈｅｐｅｓ（Ｎ‐［２‐ヒドロキシエチル］ピペラジン‐Ｎ’‐［エタンスルホン酸］）（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＮａＣｌ（１３６ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＫＣｌ（２．７ｍｍｏｌ／Ｌ）、およびＭｇＣｌ2（２ｍｍｏｌ／Ｌ））に血小板を懸濁した。血小板は、電子パーティクルカウンタ（モデルＺ１、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社、フランス、マルジャンシー）で測定し、１ｍＬあたり１．５×１０8個の血小板の濃度に調整した。
【００６６】
≪マウス巨核球および血小板≫
野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、６〜８週齢で使用した。動物の世話および手順は、研究所のガイドラインに従った。巨核球はフラッシュした骨髄から拡張および分離した。すなわち、免疫磁気的に分離したＬｉｎ-細胞を、ＴＰＯペプチド存在下で適切な巨核球分化培地中で培養した。培養６日後、成熟巨核球を小型化フローチャンバーに導入し（Ｃｏｎａｎｔ ｅｔ ａｌ．、２００９）、高ずり速度で、固定化マウス組換えＶＷＦ上で灌流した（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．、２００８）。
【００６７】
≪灌流試験≫
灌流試験は、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ社のすでに確立されたフローチャンバーを用いて実施した（Ｌｅｇｅｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ．、２００６）。フローチャンバーは、プレキシグラスブロックに彫られた、高さ０．０５ｍｍ、長さ２９ｍｍ、幅５ｍｍの矩形の空洞からなる。チャンバーの底面には、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）、ＮａＣｌ（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ））中に希釈されたＶＷＦ（２０μｇ／ｍＬ）で４℃で一晩コートしたカバースリップを敷いた。一部の実験では、その他の精製タンパク質（フィブロネクチン、フィブリノーゲン、コラーゲン、または２Ｂ型‐ｒＶＷＦ）を試験した。ＩＭＤＭ（２ｍＬ）に０．８〜１×１０6細胞／ｍＬで懸濁したＭＫを、エクステンションセット（Ｓｔｅｒｉｔｅｘ、Ｃｏｄａｎ社、ドイツ、レンスアーン）を有するチャンバーに接続した５ｍＬガラス気密性マイクロシリンジ（Ｅｘａｍｉｎｅ、伊藤製作所、日本、富士）中に吸引した。１８００ｓ-1のずり速度を生じる２２５μＬ／分のフロー速度を電気ポンプで負荷した。細胞を１０分間灌流した後、同じずり速度でＩＭＤＭで１０分間灌流した。すべての実験は、Ｍｉｎｉｔｕｂ加熱システム（Ｍｉｎｉｔｕｂ Ａｂｆｕｌｌ ｕｎｄ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ社、ドイツ、ティーフェンバッハ）を用いて維持した３７℃において行った。一部の実験では、灌流前に１０分間、細胞またはカバースリップを抗体とともに予備インキュベーションを行った。灌流完了後、カバースリップを氷冷メタノールで５分間固定し、滅菌水で洗浄して乾燥し、染色した。トロンビン活性化を含む追加試験のため、チェンバー出口で溶出液を回収した。
【００６８】
≪ビデオ顕微鏡システム≫
灌流チャンバーを倒立顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ １３５、Ｚｅｉｓｓ社、ドイツ）のステージに設置した。ＣＣＤカメラ（ソニー、日本、東京）を使用して、２０倍ホフマンモジュレーションコントラスト対物レンズを用いて細胞を可視化した。ビデオタイマー（ＶＴＧ、日本、東京）に接続したデジタル画像レコーダー（Ｒｅｐｌａｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、フランス）を用いて連続記録を行った。画像フレームは、ＨｉｓｔｏｌａｂまたはＶｉｄｅｏｍｅｔ定量化ソフトウエア（Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて分析した。
【００６９】
≪細胞活性化試験およびフローサイトメトリー≫
溶出細胞懸濁液を回収し、ＥＤＴＡ（０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）存在下において、１８００ｒｐｍで１２分間遠心分離し、ペレットをＩＭＤＭに再懸濁した。一定分量をトロンビン非存在下またはトロンビン存在下（５Ｕ／ｍＬ）において、３７℃で１０分間インキュベートした。ＦＩＴＣ‐抗ＣＤ６２ＰおよびＰＥ‐抗ＣＤ４１ａ（それぞれ５μＬ）、または非免疫複合化コントロール抗体とともに懸濁細胞（１００μＬ）を室温で２０分間インキュベートした後、３００μＬのＰＢＳを添加した。その後、細胞をＦＡＣＳｏｒｔフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ‐Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、ル・ポン ド クレ）を用いて、未刺激の洗浄血小板を用いた別の実験で決定した直角散乱光（ＳＳＣ）と前方散乱光（ＦＳＣ）のプロットに関する特徴的なプロファイルにより同定された血小板領域に対する設定で１００００事象を獲得して分析した。
【００７０】
≪共焦点免疫蛍光法≫
未活性化細胞およびトロンビン活性化細胞の一定分量（１５０μＬ）を、静置条件で３０分間インキュベートしたフィブリノーゲンコートガラスＬａｂ‐Ｔｅｋチャンバースライド（Ｎｕｎｃ社、ニューヨーク州、ロチェスター）に添加した。未接着細胞を除去し、スライドをＰＢＳで三回洗浄した後、ＰＢＳ中の２％パラフォルムアルデヒド（Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ社、フランス、ヴァル ド ルイユ）で３０分間固定し、４℃で保存した。免疫蛍光染色のために、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００で５分間細胞を透過処理し、その後、抗β３ Ｐ３７ ＭｏＡｂ（ＰＢＳ中に１０μｇ／ｍＬ）とともに３０分間インキュベートし、洗浄して、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州、ユージーン）と複合化した２０μｇ／ｍＬの二次抗体とともにインキュベートした。ネガティブコントロールには、マウス腹水から精製したＩｇＧを同じタンパク質濃度で用いた。アクチン染色のために、透過処理した細胞を、３％ＢＳＡを含むＰＢＳ中の５０μＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５４６ ファロイジン（３０ｎｍｏｌ／Ｌ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）とともに室温で３０分間インキュベートした。その後、カバースリップを二回洗浄し、ＴＯＴＯ３およびＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、英国、ピーターバラ）を含むマウント溶液中にマウントした。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８／ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６染色は、Ｌｅｉｃａ社のＴＣＳ ＳＰ２ ＡＯＢＳ共焦点顕微鏡で分析した。
【００７１】
≪電子顕微鏡≫
溶出細胞懸濁液を、種々のマトリックスを通過させた後、灌流チャンバーの出口でグルタルアルデヒド固定液（リン酸緩衝液中（ｐＨ７．４）に最終濃度１．５％）中に直接回収し、その後、前述の通りに電子顕微鏡用に処理した（Ｃｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９７）。一部の試料は前述のように最初にトロンビンで活性化し、さらに電子顕微鏡用に処理した。Ｊｅｏｌ １０‐１１（日本電子株式会社、日本、東京）電子顕微鏡で検査を行った。
【００７２】
≪統計≫
統計解析には、スチューデントｔ検定を用い、０．０５未満のＰ値を有意と見なした。エラーバーは、標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【００７３】
［結果］
≪ＭＫとＶＷＦとの動的相互作用≫
臍帯血成熟ＭＫは、精製ＶＷＦでコートした表面を様々なずり速度で灌流した。１８００ｓ-1で、ＭＫはＶＷＦと一過的に相互作用を確立し、ＶＷＦ上を回転するＭＫの速度が低下し、最終的にＭＫから血小板を分離させる顕著な形態変化を次第に引き起こす。血小板形成の種々のステップを図１Ａに示す。このプロセスは、おおよそ球状のＭＫから始まり、その後、細胞周辺部が変形し、接着ＭＫ上に偽足が出現する（ステージ２）。その後、細胞体の後方および／または前方で、流動方向に沿って構築された細胞質の伸長が起こる（ステージ３）。特徴的な数珠玉状の外観を有する中間的な膨張が現れ始める。２１μｍ／分の速度（静置条件で報告されている（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．、２００５ｂ）２５倍の速さ）で、急速に伸長が起こった。興味深いことに、これら伸長部の先端だけではなく膨張部の間、特に薄い狭窄部においても断片化が起き、種々の大きさの断片が放出され、ほとんどの場合、それぞれの数珠玉は互いに繋がったままであるが主要な細胞体を欠いていた（図１Ａ）。最終的に、これらの断片は、血小板の大きさである、より小さな粒子にさらに分解され、後期時点において明確に視認された（図１Ａ）。高ずり速度条件下では、１５〜２０分以内に血小板前駆体の断片化が急速に起こった。臍帯血由来ＭＫまた骨髄由来ＭＫを用いて、同様の結果が得られた。対照的に、流動の無い状態または低いずり速度（１０００ｓ-1未満）で流動させた状態は、ＭＫがＶＷＦと接触している２０分間において、血小板前駆体および血小板の放出は見られなかった。９日以下培養した未成熟ＭＫをずり速度にさらしても、移動および断片化しなかった。
【００７４】
≪血小板形成におけるＶＷＦのＭＫ受容体との相互作用の特異性≫
ずり速度にさらされる間の形態変化を定量化するため、４つの細胞カテゴリー、すなわち、（１）移動ＭＫ、（２）球形を失った初期の変形ＭＫ、（３）血小板前駆体を伸長している後期の変形ＭＫ、および（４）血小板前駆体の断片化および血小板の放出を定義した。（図１Ｂ、パネルａ）。伸長細胞ならびに血小板前駆体および血小板の集団が徐々に増え、２０分で２７．６±４．９％の細胞に達した。この増加は、移動細胞が５分で２８．２±６．５％から２０分で３．６±１．６％に減少し、初期の変形ＭＫが減少したことを反映していた（図１Ｂ、パネルｂ）。高ずり速度にさらされた骨髄ＭＫの分布を計測すると、臍帯血ＭＫで記載された結果と同様の結果が得られた（図１Ｂ、パネルｃ）。ＭＫの移動および血小板前駆体形成と血小板の放出とを含むその後のステップは、グリコカリシンに対する抗体またはＶＷＦのＧＰＩｂ結合ドメインに対する抗体の存在下で完全に消失し（図１Ｂ、パネルｄおよびパネルｅ）、ＶＷＦとＧＰＩｂとの相互作用の重大な重要性が実証された。αＩＩｂβ３阻害剤であるアブシキシマブの存在下では、血小板前駆体以外の細胞集団（未変形ＭＫおよび初期の変形ＭＫ）は時間に対して一定のままであったが、血小板前駆体の伸長が大きく減少して血小板形成がほぼ完全に消失した（図１Ｂ、パネルｆ）。この非効率的な血小板前駆体形成は、ＶＷＦ表面との緩い接触によるものであった（未掲載データ）。
【００７５】
≪高ずり速度にさらされたＭＫにより誘導される血小板形成の特徴づけ≫
成熟ＭＫに付与されたずり応力により、ＶＷＦ上で細胞を２０分間静置条件でインキュベートしたコントロールと比較して特異的な形態変化が誘導されたが、ＭＫの形態はＶＷＦと接触する以前の細胞の形態に対しては変化しないままであった（図２）。対照的に、ＭＫの灌流の２０分後に予備固定して染色したＶＷＦコートカバースリップでは、ＭＫがその先端部に長い糸状仮足を伸ばして、シャフトに沿って数珠玉状の血小板様スパイク、およびより大きな細胞質断片が形成されることが示された（図２）。血小板前駆体の伸長には、α１チューブリンおよびβ１チューブリンで染色される重複微小管がスライドすることが必要とされる（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．、２００５ｂ）。発明者らはＭＫの伸長部が、アクチンと異なった領域において抗チューブリン抗体により染色されることを見出しており、これらの伸長部が、Ｉｔａｌｉａｎｏらの研究（Ｉｔａｌｉａｎｏ ｅｔ ａｌ、２００３；Ｉｔａｌｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．、１９９９；Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．、２００５ａ；Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．、２００５ｂ）により血小板前駆体形成ＭＫにおいて確認されたものと同様の染色を示すことが確認された。すなわち、チューブリン標識は、伸長したＭＫでは血小板前駆体のシャフトに沿っており、球状のＭＫ、血小板前駆体、および血小板ではリング状のパターンを示した（図３Ｂ）。ずり惹起血小板前駆体形成における微小管の重要性は、微小管集合の阻害剤であり流動条件においてＭＫの伸長および血小板前駆体形成を完全に阻害するノコダゾールとの予備インキュベーションにより確認された（未掲載データ）。ノコダゾールが細胞懸濁液中にあらかじめ形成された血小板に対して作用しないことを実証するため、伸長後に微小管阻害剤を添加した。すなわち、リアルタイムで可視化された効果により、プロセスが起きた後にノコダゾールを添加した場合、ノコダゾールはずり惹起伸長を戻すことができることが示された。逆戻りの特異性は、チューブリン染色により確認された。興味深いことに、２５分でノコダゾールを添加した後、血小板前駆体および血小板においてチューブリンがもはや構築されないことが確認され、伸長プロセスはテザーとは異なることが示唆された（図３Ｃ）。実際、膜テザーは、流動の影響下において小さく局在化した接着接触部から伸びる動的な構造であり、ＶＷＦとＧＰＩｂとの相互作用により誘導されるものであるが、チューブリン染色を示さない（Ｄｏｐｈｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．、２００２）。
【００７６】
電子顕微鏡により、細胞コアから伸び、平行な微小管の束を含み、時に細胞質オルガネラで膨張した、長い細胞質シャフトが示された（図４、パネルａ）。凝集ヘテロクロマチンを有する分葉核は、細胞の一方の極に局在し、裸の核がしばしば観察された（図４、パネルｂ）。核を欠く大きな細胞質断片は、およそ球状、ダンベル型、または細長い先端を有する伸長形状であった（図４、パネルｃおよびパネルｄ）。血小板様断片もまた視認された（図４、パネルｅ）。
【００７７】
≪血小板前駆体形成は高ずり速度およびＶＷＦにより促進される≫
接着性タンパク質が血小板前駆体形成の制御、具体的には静置条件でＭＫをＶＷＦ上にプレーティングした１６時間後に起こる血小板前駆体形成に関与していることが近年実証された（Ｂａｌｄｕｉｎｉ ｅｔ ａｌ．、２００８）。図５Ａに示すように、同様の結果が得られた。対照的に、高ずり速度存在下では、２０分以内に、７０％の臍帯血ＭＫおよび８０％の骨髄ＭＫが血小板前駆体を形成しており、このプロセスが非常に迅速に起こった。この効果は、ずり速度の程度（６００〜２４００ｓ-1）と細胞濃度（０．５〜２×１０6／ｍＬ）とに依存していた。内皮細胞は、低い割合で絶えず放出され炎症状態で増加する高分子量のＶＷＦ多量体を含んでいる（Ｒｏｎｄａｉｊ ｅｔ ａｌ．、２００６）。したがって、内皮細胞マトリックスから放出されるＶＷＦがＭＫの接着と血小板前駆体形成とを支持するかについて評価した。ＭＫは未刺激ＨＵＶＥＣ上を回転して接着したが、血小板前駆体形成は刺激したＨＵＶＥＣ上で起こった（図５Ｂ）。血小板形成は、内皮細胞の下にありこれら内皮細胞が除去された際に存在する内皮細胞マトリックス上でも起きた。さらに、変異型の２Ｂ型ｒＶＷＦでコートされた表面上で灌流したＭＫからの血小板前駆体形成について試験した。明確に定義された突然変異であり、軽度の血小板減少症と巨大血小板とを示し血小板ＧＰＩｂへのＶＷＦの結合が促進されることを特徴とするＶ１３１６Ｍ置換を選択した（Ａｊｚｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、２０００；Ｍｉｕｒａ ｅｔ ａｌ．、２０００）。２Ｂ型ｒＶＷＦ上でのＭＫ移動の平均速度（４．６±０．３μｍ／ｓ）が、野生型（ｗｔ）ｒＶＷＦの移動の平均速度（３３．６±２．５μｍ／ｓ、ｐ＜０．０００１）より非常に低いことが分かった。高ずり速度にさらされたＭＫによる血小板形成のすべてのステップが、２Ｂ‐ｒＶＷＦにおいてｗｔ‐ｒＶＷＦより遅く、血小板産生が減少し血小板前駆体の蓄積が増大した（未掲載データ）。最終的に、血小板前駆体形成の制御における接着性表面の特異性をさらに立証するため、高ずり速度において、フィブリノーゲン、コラーゲン、またはフィブロネクチン上で灌流したＭＫによる血小板前駆体形成の程度について調べた。これらの表面においては、血小板前駆体は形成されず、唯一の変化はフィブリノーゲン上での軽度の初期のＭＫ変形であった（図５Ｃ）。
【００７８】
≪ＭＫに剪断力を与えることにより産生した血小板は機能的である≫
αＩＩｂβ３インテグリンを介した血小板のフィブリノーゲンへの接着は活性化なしで起こり、トロンビンによるこの受容体の活性化により強化される。ＭＫに剪断力を与えることにより産生した血小板が、構造的および機能的に血液血小板と同様であることを確認するため、フロースルー中で回収した細胞を、フィブリノーゲンへの静置接着アッセイ（Ｍａｚｈａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．、２００７）で単離血液血小板と比較した。トロンビン非存在下で細胞はフィブリノーゲンとしっかりと接着し、ずり惹起血小板および血小板前駆体においてαＩＩｂβ３が機能的であることが実証された。非活性化成分は、アクチンの拡散した染色およびαＩＩｂβ３の膜への局在化を示した。トロンビンによる活性化により、有核成分と無核成分の両方においてアクチンフィラメントが再構築され、葉状仮足および糸状仮足の形成が示され、インテグリン膜が染色された（図６）。ＭＫに剪断力を与えることにより産生したこれらＭＫ由来血小板は、別のアッセイでずり速度にさらさないで調製した洗浄血液血小板と同様の細胞骨格構成を示した（図６）。
【００７９】
ずり速度にさらされた細胞のフローサイトメトリー分析により、その大きさによりＣＤ４１ポジティブ細胞の３つの集団が示された。最も大きが小さい集団は血液血小板集団と重複していたが、中間の集団は血小板前駆体および裸の核を含むより大きな成分に相当していた（図７）。したがって、ずり速度にさらされることにより産生した血小板集団は、末梢血から単離された血小板と比較して、中間サイズの血小板集団をより多く含んでいる。ずり速度にさらされたＭＫは、ずり速度にさらされていないＭＫと同じ大きさの大きい集団に属していた。トロンビン刺激に応答して、ずり由来血小板の表面でＰ‐セレクチン（ＣＤ６２Ｐ）の発現上昇が見られた（未活性化血小板の６．２±０．９％と比較して１１．８±１．８％、ｐ＝０．０００５）。単離した血液血小板との類似性を超微細構造のデータにより確認した（図８）。トロンビン非存在下では、血小板様断片は滑らかな表面、細胞質中に点在したいくつかのアルファ粒子、および不連続な表面結合小管系（ｓｕｒｆａｃｅ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ ｃａｎａｌｉｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍ）（ＳＣＣＳ）を示した（図８）。トロンビンによる活性化に続き、これらの細胞は活性化血小板に特有の形態変化、すなわち、球状の形態、表面の偽足、中心に集まり拡張したＳＣＣＳ槽を示し、細胞質の造粒が見られず、中心に微小管の束を示した。最終的に、血小板サイズの成分が、剪断力を与えることにより産生され、単に成熟細胞のＭＫ懸濁液から産生されたものではないことを確認するため、裸の核の存在により、フローチャンバーでの灌流の前後で溶出液を比較した。ずり速度にさらした細胞の非接着フロースルーは、それらを欠く静置条件の細胞と比較してより多くの裸の核を含んでいた（未掲載データ）。
【００８０】
≪マウス巨核球および血小板≫
マウス成熟巨核球に対し、マウスＶＷＦ上で高ずり速度の剪断力を与えると、効率的に血小板が形成された。一連の実験において、６〜８匹の動物から骨髄由来細胞を抽出することにより、少なくとも６〜８×１０6個の成熟巨核球が産生された。これらの細胞を１８００ｓ-1のずり速度に９０分間さらし、血小板サイズに相当する小さな成分に完全に変換した。マウス血小板を共焦点免疫蛍光法により特徴づけることにより、血小板サイズの成分における特異的なチューブリンのリングが明らかになった。これら血小板のアゴニストに応答した凝集特性は、血小板凝集計で標準手法により証明される。
【００８１】
≪本発明に係る血小板を血小板減少マウスへ注入することにより出血表現型がレスキューされる≫
この実験は、上述のように高ずり応力により産生されたドナーマウスの血小板を注入することにより、血小板減少レシピエントマウスの出血表現型をレスキューすることを目的とする。
【００８２】
プールしたドナーマウスから得た骨髄の成熟巨核球に剪断力を与えることにより得られた血小板を、レシピエントマウスの尻尾の静脈へ注入した。血小板減少マウスは、低濃度の抗ＧＰＩＩｂ‐ＩＩＩａ抗体を投与することにより得られる（Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ ｅｔ ａｌ．、２０００）。標準的な実験において、２〜３回の抗ＧＰＩＩｂ抗体の注入により循環血小板が８０％減少した。検出およびクリアランス試験のため、血小板減少マウスに注入する前にこれらの血小板を蛍光標識した。注入されたマウスにおける血小板数の補正、自然出血、出血時間を測定する。これらの循環断片は、血小板数を増やし生体内誘導出血モデルにおける血液減少を補正するので、活性のある血小板である。炎症部位に限定された大量出血を引き起こす、刺激性接触皮膚炎モデルを使用する（Ｇｏｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．、２００８）。血小板減少マウスにおける皮膚出血を、ずりにより産生した血小板の投与前後で比較する。新たに形成された血小板の機能もまた、塩化第二鉄障害血栓症モデルを用いて生体内顕微鏡により生体内で評価する（Ｄｅｎｉｓ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ、２００７）。この方法により、単一血小板の接着、血栓成長速度、血栓安定性、塞栓サイズおよび血管を閉塞するための時間を含む、血栓プロセスの種々のステップの詳細な情報が提供される（Ｄｅｎｉｓ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ、２００７）。リアルタイム血栓形成および血栓中への血小板の取り込みを、血小板減少マウスへの血小板投与の前後で比較する。
【００８３】
［結論］
結論として、流動状態での成熟ＭＫのＶＷＦとの相互作用がヒト／マウス血小板前駆体形成を促進するという発見により、毛細血管や細動脈で起こっているうであろう血小板形成の理解において大きな進展が示された。血小板産生が減少した疾患の探索は、巨核球からの血小板分離をさらに理解する上で大いに役に立つであろう。最後に、発明者らの結果により、診断目的または治療目的ための血小板産生方法が提供される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成熟巨核球から血小板を産生する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
巨核細胞（ＭＫ）の分化は、一連のステップを特徴とする連続的なプロセスである。ＭＫの倍数性は、細胞サイズの平行した増加を伴って核内分裂によって増加する。貯蔵オルガネラおよび細胞膜の合成が促進され、結果として分離膜が形成される。細胞膜の成熟は、ＭＫサイズの顕著な増加と関連している。最終的に、成熟ＭＫは、微小管が関与して細胞骨格が完全に再編成され、血小板前駆体に相当する仮足の伸長が起こる（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．、２００５ａ；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、２００５）。血小板は、すべての血小板オルガネラを含むこれら血小板前駆体の先端から放出される。
【０００３】
循環血小板は、血管壁への粘着による血栓形成、および内皮下基質へ接着した血小板の第一層上での凝集による血栓形成に関与している（Ｒｕｇｇｅｒｉ、２００３）。ヴォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）は、血管の内部表面を形成する内皮細胞の主要成分である。ＶＷＦは、高ずり速度（＞１０００ｓ-1）条件下で循環血小板を捕らえることができる唯一のタンパク質である。捕らえられた血小板は、ＶＷＦのＡ１ドメインへのＧＰＩｂ（別名ＣＤ４２ｂ）の結合を介して、固定されたマトリックスＶＷＦ上を移動する（Ｈｕｉｚｉｎｇａ ｅｔ ａｌ．、２００２）。血小板が一時的に捕らえられている間に連続的に起こるαＩＩｂβ３インテグリン（別名ＣＤ４１ａ／ＣＤ６１）の活性化により、ＧＰＩｂ介在性のシグナル伝達が引き起こされ、ＶＷＦのＲＧＤ配列へのαＩＩｂβ３の結合が可能となる。ベルナール・スーリエ症候群（ＢＳＳ）は、重篤な血小板減少症および巨大血小板を特徴とする出血性疾患である（Ｎｕｒｄｅｎ、２００５）。このベルナール・スーリエ症候群は、ＧＰＩｂ‐ＩＸ‐Ｖ複合体、具体的にはＶＷＦ結合部位を含むＧＰＩｂサブユニットの量的異常または質的異常を原因としている。ＢＳＳ患者の骨髄中のＭＫの数は正常であるため、上述のよう観察した場合の巨大血小板性血小板減少症は、ＭＫから欠陥血小板が形成されていることと関係があることを示唆している。
【０００４】
髄腔においてＭＫの血小板への断片化があまり観察されないということは、ＭＫは骨髄毛細血管中に移動しているということを示している（Ｔａｖａｓｓｏｌｉ ａｎｄ Ａｏｋｉ、１９８１）。血小板前駆体からの血小板の分離はフロー条件について記載がないまま説明されてきた。興味深いことに、トロンボポエチン（ＴＰＯ）存在下で培養されたＭＫから分離される血小板の収量は、至適成熟条件において期待される収量をはるかに下回る（Ｎｏｒｏｌ ｅｔ ａｌ．、１９９８）。血小板分離の多くのステップはいまだ解明されていない。特に血小板形成において、ずり応力がどういう役割をもつのかについては、これまで解明されていない。ＭＫの成熟時にはＭＫ表面にＶＷＦ受容体であるＧＰＩｂおよびαＩＩｂβ３が発現する（Ｄｅｂｉｌｉ ｅｔ ａｌ．、１９９０）が、成熟ＭＫは、循環血液中ではほとんど確認されておらず（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、１９７８；Ｔａｖａｓｓｏｌｉ ａｎｄ Ａｏｋｉ、１９８１）、内皮細胞の管腔側のＶＷＦに捕らえられている。
【０００５】
さらに、興味深いことには、至適ＭＫ培養条件において、生体外の分離血小板収量は、生体内での大量の日常血小板産生量から期待される収量をはるかに下回っていた。したがって、血小板産生の優れたシステムの必要性は非常に大きかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
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【非特許文献２】Balduini, A., I. Pallotta, A. Malara, P. Lova, A. Pecci, G. Viarengo, C.L. Balduini, and M. Torti. 2008. Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes. J Thromb Haemost. 6:1900-1907.
【非特許文献３】Barroga, C.F., H. Pham, and K. Kaushansky. 2008. Thrombopoietin regulates c-Myb expression by modulating micro RNA 150 expression. Experimental Hematology. 36:1585-1592.
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【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、生体外で成熟巨核球から血小板を産生する方法に関する。この方法は、成熟巨核球の懸濁液を、ヴォン・ヴィレブランド因子でコートされた固相上において、少なくとも６００ｓ-1のずり速度で流動させるステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】高ずり速度における血小板前駆体形成、阻害剤の影響、および接着性表面の定量化を示した図である。
【図１Ｂ】高ずり速度における血小板前駆体形成、阻害剤の影響、および接着性表面の定量化を示した図である。
【図２】ずり条件下および静置条件下でＶＷＦコートカバースリップに接着した臍帯血ＭＫの光学顕微鏡観察を示した図である。
【図３Ａ】ずり惹起血小板前駆体形成における微小管の役割を示した図である。
【図３Ｂ】ずり惹起血小板前駆体形成における微小管の役割を示した図である。
【図３Ｃ】ずり惹起血小板前駆体形成における微小管の役割を示した図である。
【図４】高ずり速度で流動させて、血小板形成を引き起こした状態のＭＫの超微細構造を示した図である。
【図５Ａ】血小板前駆体形成に対するＶＷＦおよび高ずり速度の特異性を示した図である。
【図５Ｂ】血小板前駆体形成に対するＶＷＦおよび高ずり速度の特異性を示した図である。
【図５Ｃ】血小板前駆体形成に対するＶＷＦおよび高ずり速度の特異性を示した図である。
【図６】高ずり速度にさらされたＭＫから得られた血小板はトロンビンにより活性化され得ることを示した図である。
【図７】トロンビンにより活性化された放出血小板はＰ‐セレクチンを発現することを示した図である。
【図８】トロンビン活性化によるＭＫ由来血小板の超微細構造変化を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［用語の定義］
本明細書において、用語「血小板」は、血餅形成を引き起こす一次止血の細胞機構に関与する細胞に由来する無核細胞質体を意味する。
【００１０】
本明細書において、用語「血小板前駆体」は、巨核球、または血小板形成を引き起こし得る細胞質連結血小板様粒子などの巨核球断片の、任意の構造形態を意味する。この構造形態には、これらに限定されるものではないが、例えば小結節および水疱など種々の形成ステージの血小板体を包含する膨張部を含む、長い細胞質の伸長、突起、または仮足を有する細胞が含まれる。
【００１１】
本明細書において、用語「巨核球」は、正常止血に必要な血液血小板の産生に関与する骨髄細胞を意味する。巨核球は骨髄中の造血幹細胞に由来する。巨核球産生のための第一シグナルは、トロンボポエチン（ＴＰＯ）である。ＴＰＯは、骨髄中の前駆体細胞の最終的な巨核球表現型への分化を誘導するために必要である。巨核球分化のためのその他の分子シグナルには、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐３、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１１、およびエリスロポエチンが含まれる。
【００１２】
本明細書において、用語「成熟巨核球」は、表面マーカーであるＧＰＩｂおよびαＩＩｂβ３を安定的に発現する巨核球集団を意味する。本明細書において、表面マーカーの「安定的な発現」は、ある細胞集団において、少なくとも７０％の細胞がこれらの表面マーカーを発現することを意味する。
【００１３】
本明細書において、用語「ずり速度」は、層流を特徴づけるために使用されるパラメーターをいう。管内において、層流は、隣接する流動層の流速が管腔軸において最大となるように増加するという放物線流速プロファイルを有する。隣接する層における半径方向速度の増加率がずり速度として定義される。平行板チャンバーにおいて、ずり速度は、式（γ）で表わされ、流動物質における速度勾配に相当する。測定ずり速度のＳＩ単位はｓ-1であり、「レシプローカル秒（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｓｅｃｏｎｄ）」または「インバース秒（ｉｎｖｅｒｓｅ ｓｅｃｏｎｄ）」として表される。ずり速度（γ）の式：
γ＝ｆ（ｋ）６Ｑ／ａｂ2
上式において、γはずり速度（ｓ-1）、Ｑは流速（ｍＬ／ｓ）、ａはスリット幅（ｃｍ）、ｂはスリット高さ（ｃｍ）、ｆ（ｋ）は系の物理的パラメーターの関数である。例えば、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ社のフローチャンバーを用いた場合（（Ｌｅｇｅｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ．、２００６）に記載）、＞１００ｓ-1のずり速度に対して、ｆ（ｋ）は１．０３である。したがって、ずり速度は流速とチャンバーのスリット高さとを調節することによって調整することができる。
【００１４】
ヒト循環血液では、ずり速度は、大動脈の３０〜４０ｓ-1から微小循環の５０００ｓ-1まで様々である。
【００１５】
本明細書において、用語「ヴォン・ヴィレブランド因子」または「ＶＷＦ」は、止血に関与する数個のモノマーから成る多量体タンパク質を意味する。ヒトのヴォン・ヴィレブランド因子の例示的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＰｅｐｔデータベースに受入番号ＡＡＢ５９４５８として見られる。好ましくは、本発明に係るヴォン・ヴィレブランド因子は、哺乳類のヴォン・ヴィレブランド因子であり、より好ましくはマウスの因子または霊長類の因子であり、より好ましくはヒトのヴォン・ヴィレブランド因子である。用語「ＶＷＦ」は、霊長類ＶＷＦなどの任意の哺乳類起源のＶＷＦ、好ましくはヒトＶＷＦを包含する。ＶＷＦは、組換えＶＷＦであってもよい。当業者であれば、本技術分野の標準的な手法にしたがって容易に組換えＶＷＦを産生することができる。
【００１６】
本発明において、ＶＷＦ因子は、組換えＶＷＦであっても天然ＶＷＦであってもよい。天然フォームでは、ＶＷＦは精製されていても他の成分を含む組成物中（例えば、細胞外マトリックス中）に含まれていてもよい。
【００１７】
ＶＷＦ断片、ＶＷＦ変異体、およびＶＷＦ類似体を用いたものも本発明の範囲内であり、これら断片、変異体、および類似体はＧＰＩｂへの結合能を有する。ＶＷＦの断片、変異体、および類似体には、ＶＷＦの５２／４８ｋＤａトリプシン断片（Ｆｕｊｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．、１９８６）；黄色ブドウ球菌Ｖ‐８プロテアーゼ消化ＶＷＦ（Ｇｉｒｍａ ｅｔ ａｌ．、１９８６ａ；Ｇｉｒｍａ ｅｔ ａｌ．、１９８６ｂ）；Ｈａｅｍａｔｅ‐Ｐ／Ｈｕｍａｔｅ‐Ｐ（Ｂｅｈｒｉｎｇ社）、Ｗｉｌｆａｃｔｉｎ（（ＬＦＢ社）、（Ｇｏｕｄｅｍａｎｄ ｅｔ ａｌ．、２００５）参照）、およびＩｍｍｕｎａｔｅ（Ｂａｘｔｅｒ社、ウイーン、オーストリア）などの治療用途のＶＷＦ濃縮物（Ｆｅｄｅｒｉｃｉ、２００５；Ｇｏｕｄｅｍａｎｄ ｅｔ ａｌ、２００５；Ｈｏｕｄｉｊｋ ｅｔ ａｌ．，１９８６）；および２Ｎ型ヴォン・ヴィレブランド病の原因であるＶＷＦ変異体（第ＶＩＩＩ因子の欠損）が含まれ得るがこれらに限定されるものではない。
【００１８】
本明細書において、用語「血小板数減少性疾患」は、低濃度の血小板の原因となる血小板産生の疾患または血小板分解の増加、あるいは正常範囲内の血小板の機能異常による疾患を意味する。本明細書において、「低濃度の血小板」は、１ｍｍ3あたり１５００００個未満の血小板濃度を意味する。本発明によれば、血小板数減少性疾患には、これらに限定されないが、自己免疫性血小板減少症、産生低下と関連した血小板減少症（中枢起源）、および任意の成因の破壊増加と関連した血小板減少症（末梢起源）が含まれる。
【００１９】
本明細書において、用語「対象」は、げっ歯類、ネコ、イヌ、および霊長類などの哺乳類を意味する。好ましくは本発明の対象はヒトである。
【００２０】
［血小板産生のための方法および装置］
本発明は、成熟巨核球の懸濁液を、ヴォン・ヴィレブランド因子でコートされた固相（solid phase）上において、少なくとも６００ｓ-1のずり速度で流動させるステップを含む、生体外での血小板産生方法に関する。
【００２１】
好ましい実施態様では、流動のずり速度は少なくとも８００ｓ-1であり、好ましくは少なくとも１０００ｓ-1であり、好ましくは少なくとも１２００ｓ-1であり、好ましくは少なくとも１４００ｓ-1であり、さらに好ましくは少なくとも１６００ｓ-1であり、少なくとも１８００ｓ-1であり、または少なくとも２０００ｓ-1である。
【００２２】
一般的に、血小板が生体内で受け得る生理的ずり速度以下のずり速度で流動させる。一般的に、このずり速度は６０００ｓ-1以下であり、好ましくは４０００ｓ-1以下、より好ましくは３０００ｓ-1以下である。
【００２３】
ある実施態様では、成熟巨核球の懸濁液は、１ｍＬあたり０．５×１０6〜４×１０6個、好ましくは１ｍＬあたり少なくとも１×１０6個、好ましくは１ｍＬあたり少なくとも２×１０6個、より好ましくは１ｍＬあたり少なくとも４×１０6個を含む細胞濃度を示す。
【００２４】
一般的に、成熟巨核球の懸濁液は、適切な細胞培養培地中に懸濁した巨核球集団を含む。ある実施態様では、細胞培養培地は、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）である。
【００２５】
成熟巨核球の懸濁液は、血液サンプルまたは骨髄サンプルから単離後に得ることができる。あるいは、ＤＡＭＩ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、１９８８）、Ｍｅｇ‐０１（Ｉｓａｋａｒｉ ｅｔ ａｌ．、２００９）、ＵＴ７／ＴＰＯ（Ｂａｒｒｏｇａ ｅｔ ａｌ．、２００８）などの巨核球安定細胞株の懸濁液を適切な条件で用いてもよい。本発明によれば、血小板産生に十分な暴露時間だけ、成熟巨核球の懸濁液を、少なくとも６００ｓ-1のずり速度で流動させる。一般的に、この暴露時間は、１０分〜２時間、一般的に１５分〜１時間、さらにより好ましくは１５〜３０分を含み得る。好ましい態様では、暴露時間はおよそ２０分である。
【００２６】
ある実施態様では、固相は、ヴォン・ヴィレブランド因子の溶液、あるいはその断片または変異体もしくは類似体の溶液とインキュベートすることによりコートされる。
【００２７】
一般的に、固相のコーティングに使用されるＶＷＦの濃度は、５〜１００μｇ／ｍＬである。好ましい実施態様では、ＶＷＦ濃度は２０μｇ／ｍＬである。
【００２８】
ある実施態様では、固相は、ＶＷＦの５２／４８ｋＤａトリプシン断片、黄色ブドウ球菌Ｖ‐８プロテアーゼ消化ＶＷＦ、治療用途のＶＷＦ濃縮物、および組換え野生型ＶＷＦまたは２Ｎ型ヴォン・ヴィレブランド病の原因であるＶＷＦ変異体からなる群より選択される断片または変異体もしくは類似体でコートされる。
【００２９】
成熟巨核球から血小板を産生する方法は、好ましくはフローチャンバーで実行することができ、このフローチャンバーはＶＷＦあるいはその断片または変異体もしくは類似体でコートされた底壁を含む。この断片または変異体もしくは類似体はＧＰＩｂと結合するものである。
【００３０】
本発明はまた、成熟巨核球から血小板を産生する装置に関し、この装置は、ＶＷＦあるいはその断片または変異体もしくは類似体でコートされた底壁を含むフローチャンバーを含み、この断片または変異体もしくは類似体はＧＰＩｂと結合する。
【００３１】
好ましい実施態様では、フローチャンバーは矩形の空洞から成る。
【００３２】
別の実施態様では、フローチャンバーの底面は、本発明に係る因子でコートされたガラスカバースリップである。
【００３３】
別の実施態様では、血小板の産生に用いられるフローチャンバーは、Ｍｅｋｒａｃｈｅ ｅｔ ａｌ．、２００２、およびＬｅｇｅｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ．、２００６に記載のチャンバーであってもよい。
【００３４】
他の実施態様では、フローチャンバーは、ガラスマイクロキャピラリーチューブ（Ｋａｕｓｋｏｔ ｅｔ ａｌ．、２００７）などのマイクロ流体フローシステム、またはマイクロ流体バイオチップおよびマイクロ流体フローセンサー（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、２００８；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．、２００２）、あるいは任意の他の種類のマイクロ流体フローシステム（例えば、Ｃｏｎａｎｔ ｅｔ ａｌ．、２００９参照）である。
【００３５】
本発明に適した一部のフローチャンバーは、無菌条件下で機能させることが有利である（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．、２００２およびＣｏｎａｎｔ ｅｔ ａｌ．、２００９参照）。好ましい実施態様では、フローチャンバーは無菌である。
【００３６】
別の実施形態では、ずり速度はフローチャンバー中の電動ポンプにより調整される。
【００３７】
［血小板および医薬組成物］
他の目的では、本発明は前述の方法により得られる血小板に関する。
【００３８】
本発明の別の目的では、前述の方法により得られる血小板は医薬組成物の調製に用いてもよい。
【００３９】
したがって、本発明には、本発明に係る血小板を含む医薬組成物をも含まれる。医薬組成物は、一般に、１つまたは複数の薬剤的に許容可能なおよび／または認可された、キャリア、添加剤、抗菌剤、保存剤、アジュバント、希釈剤、および／または安定剤を含んでいてもよい。このような補助物質は、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝物質などであってよい。適したキャリアは、一般的に、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、多量体アミノ酸、アミノ酸コポリマー、または脂質凝集物など、ゆっくり代謝される高分子である。この医薬組成は、マンニトール、デキストラン、糖質、グリセリン、乳糖もしくはポリビニルピロリドンなどの追加の添加剤、あるいは抗酸化剤もしくは不活性ガス、安定剤または生体内投与に適した組換えタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）などのその他の添加剤を含んでいてもよい。
【００４０】
本明細書において、用語「薬剤的に許容可能」とは、必要に応じて、哺乳類、特にヒトに投与した場合、副作用、アレルギー性作用またはその他の有害な作用を引き起こさない分子的実体および組成物をいう。薬剤的に許容可能なキャリアまたは賦形剤とは、無毒の固体、半固体、液体のフィラー、希釈剤、カプセル化材料または任意の種類の補助的製剤をいう。
【００４１】
さらに、本発明に係る血小板および本発明に係る医薬組成物は、血小板数減少性疾患、具体的には血小板減少症および血小板症の治療に使用してもよい。例えば、本発明に係る方法により得られる血小板を、有効量で血小板産生疾患を患っている対象に輸血してもよい。
【００４２】
好ましい実施態様では、血小板数減少性疾患は、自己免疫性血小板減少症、産生低下と関連した血小板減少症（中枢起源）、および任意の成因の破壊増加と関連した血小板減少症（末梢起源）からなる群から選択してもよい。
【００４３】
本発明に関連する態様は、血小板数減少性疾患を患っている対象を治療する方法に関し、この方法は、対象に有効量の本発明に係る血小板（または本発明に係る血小板の集団もしくは本発明に係る血小板の医薬組成物）を投与するステップを含む。
【００４４】
本発明において、本明細書における用語「治療する」または「治療」は、病状の発症を遅らせるまたは阻害すること、病状の兆候の進行、悪化、または増悪を、回復、緩和、抑制、鈍化または停止すること、病状の兆候を改善すること、および／または病状を治癒することを目的とした方法をいう。
【００４５】
本明細書において、用語「有効量」は、所望の目的を達成するのに十分な、本発明に係る血小板（または本発明に係る血小板の集団もしくは本発明に係る血小板の医薬組成物）の任意の量をいう。
【００４６】
有効用量および投与計画は、対象の病状の性質に基づく適切な医療行為により容易に決定することができ、これらに限定されないが、病状の兆候の程度および所望の組織もしくは器官の損傷または変性の程度、ならびに対象の特徴（例えば、年齢、体重、性別、および全身状態など）を含む多数の要因に依存することがある。
【００４７】
治療のために、本発明に係る血小板および医療組成物を静脈内投与により全身投与してもよい。当業者は、投与用量および投与回数を既知の方法で最適化し得る。
【００４８】
さらに、本発明に係る血小板を診断目的に用いてもよい。本発明に係る血小板を、血小板機能を標準化するための正常コントロールとして用いてもよい。
【００４９】
血小板機能検査には、正常な個人および病気の個人からの、天然機能状態の新鮮な血小板が必要とされる。ヴォン・ヴィレブランド病は、出血性疾患の最も一般的な単一原因である。さらに、最大で５０％の皮膚粘膜出血性疾患が、血小板機能障害により引き起こされる。血小板機能検査の標準化には、検査室は、実施される血小板機能検査のバッチごとに正常コントロールを実施することが必要とされる。しかし、静脈穿刺による連続的な標準的血液サンプリングにより、いくつかの健康問題および倫理的問題が生じる。血小板機能の検査室評価には、光透過凝集ＡＴＰ放出アッセイ、糖タンパク質アッセイ、電子顕微鏡、凝血原機能検査、遺伝子検査（Ｐａｉ ａｎｄ Ｈａｙｗａｒｄ、２００９）が含まれる。
【００５０】
したがって、本発明は、血小板機能を標準化するために本発明に係る血小板を使用するステップを含む、血小板疾患を診断するための方法に関する。
【００５１】
本発明に係る血小板は、健康なドナーの末梢血由来の成熟巨核から、または前述の巨核球株化細胞由来の成熟巨核球から得られる。本発明に係る血小板は、後の生体外検査において血小板機能を標準化するために用いられる。すなわち、本発明に係る血小板は、血小板機能を測定するための生体外での診断検査において、ポジティブコントロールとして用いられる。
【００５２】
本発明を、以下の実施例、図面、および表によってさらに例示する。
【００５３】
［図面］
図１Ａ、図１Ｂは、高ずり速度で流動させた場合における血小板前駆体形成阻害剤の影響、および接着性表面の定量化を示す図である。ＩＭＤＭに懸濁した細胞をＶＷＦ上で１８００ｓ-1、１０分間灌流し、その後、ＩＭＤＭのみを１０分間灌流した。接着により大きく細胞の形状が変化し、血小板前駆体が形成された。パネルＡ（図３Ａ）は、未変形のＭＫ（ステージ１）と比較した、血小板前駆体放出および血小板放出の前のずり条件下での２ステージのＭＫ変形を示す。初期の変形は、細胞質の伸長を特徴とし（ステージ２）、ステージ３は、細胞極または細胞両端での細胞骨格の再編成を伴うＭＫの後期の変形（連続的な「数珠玉」状の長くて薄いフィラメント）を含み、その後、細胞が薄い領域に切断される。さらに流動させると、長い細胞質の糸とまだ結合している血小板、または一対の血小板および円形の血小板が産生された。パネルＢ（図３Ｂ）に定量化を示す。（ａ）ＭＫの形状変化を、（１）移動しているＭＫ、（２）球形を失った初期変形ＭＫ、（３）後期変形ＭＫおよび血小板前駆体の伸長、（４）血小板前駆体の断片化および血小板の形成、の４つのカテゴリーに分類した。図１Ｂのパネルｂ〜ｆは１０視野において測定された細胞総数に対する各カテゴリーの細胞の、還流時間に応じた分布である。阻害剤非存在下で、ＶＷＦ上で灌流した臍帯血ＭＫ（図１Ｂのｂ）または骨髄ＭＫ（図１Ｂのｃ）の変形の分布。ＧＰＩｂ‐ＶＷＦ相互作用阻害剤であるグリコカリシン遮断抗体（図１Ｂのｄ）、または抗ＶＷＦ ＭｏＡｂ（図１Ｂのｅ）の存在下で、ＶＷＦ上で灌流した臍帯血ＭＫにより、ＭＫのＶＷＦ上への接触および以降のステップが主に抑制されて、血小板前駆体の形成が消失することが示唆された。αＩＩｂβ３のＶＷＦとの相互作用を遮断するアブシキシマブ（Ａｂｃｉｘｉｍａｂ）は、血小板前駆体および血小板の形成を阻害した（図１Ｂのｆ）。１５回の実験の代表を示す。バーは１０μｍを示す。
【００５４】
図２は、ずり条件下および静置条件下でＶＷＦコートカバースリップに接着した臍帯血ＭＫの光学顕微鏡観察を示す。カバースリップをフローチャンバーから取り外し、ＰＢＳでリンスした後、氷冷メタノールで固定し、続いてロマノフスキー染色を行った。２０分間高ずり速度で流動させた後、多数のＭＫが、その流動方向に対して平行に血小板前駆体の長くて薄い伸長を示した。一本の単極の長い血小板前駆体が、先端に出芽を有する細胞コアからシャフトに沿って伸長している（左のパネル）。高ずり速度の効果のコントロールとして、ＭＫをＶＷＦ上に播種して静置条件下で２０分間インキュベートし、未接着細胞を除去した後、カバースリップをＩＭＤＭでリンスした。細胞は、血小板前駆体の伸長のない、球形の形状を示した（右のパネル）。倍率は５００倍である。
【００５５】
図３は、ずり惹起血小板前駆体形成における微小管の役割を示す。
パネルＡ（図３Ａ）：血小板前駆体形成および血小板形成を示す、抗チューブリン抗体を用いた間接的免疫蛍光標識。ＶＷＦでコートされた表面上において、１８００ｓ-1のずり速度で流動させたＭＫを固定して、ファロイジン（左のパネル）および抗チューブリン抗体（右のパネル）で染色した。画像は共焦点顕微鏡で分析した。アクチンとチューブリンの共局在は見られない。
パネルＢ（図３Ｂ）：血小板を分離中のＭＫは、血小板サイズの膨張した先端を有する長くて薄い血小板前駆体を伸ばしている。血小板前駆体のシャフト全体およびその末端は、チューブリンで標識されている。２つの離れた細胞断片は、ダンベル状の血小板前駆体の輪郭を描き中心が狭くなっているが、血小板サイズの断片は円形の標識パターンを示すという、特徴的なチューブリン標識を示す。
パネルＣ（図３Ｃ）：血小板前駆体に対する微小管阻害剤の影響。血小板前駆体伸長の破たんは、チューブリンの崩壊によって特徴付けられる。
【００５６】
図４は、高ずり速度で流動させたＭＫの血小板形成を引き起こす際の超微細構造を示す。溶出細胞懸濁液を灌流チャンバーの出口から直接固定液に回収し、「方法」欄に記載のように電子顕微鏡用に処理した。成熟ＭＫは、伸長し、平行な長手方向微小管を含む細胞質の長い糸状仮足を伸ばしていた（挿入図）。これらの血小板前駆体は、細胞質オルガネラを含む規則的な膨張を示した。恐らく分離した血小板前駆体（ｐｐ）である大きな球状の細胞質断片が近くに位置していた（パネルａ）。凝縮クロマチンを含む核分葉（Ｎ）は、伸長して細胞の一方の極に局在していた。卵型の裸の核と、通常ＭＫ培養物には存在しない凝集クロマチンを含む核分葉とが、溶出液中に回収された（パネルｂ）。細胞質オルガネラで満たされた血小板前駆体（ｐｐ）が、大きな細胞質断片であり、核を欠き、およそ球状、ダンベル型、または細長い先端を有する伸長形状として現れた（パネルｃおよびｄ）。数個の分離した血小板サイズの断片（Ｐ）が観察された（パネルｅ）。バーは２μｍを示す。
【００５７】
図５は、血小板前駆体形成に対するＶＷＦおよび高ずり速度の特異性を示す。
【００５８】
パネルＡ（図５Ａ）：静置条件（上のパネル）および高ずり速度（下のパネル）における、ＶＷＦコートカバースリップ上の血小板前駆体形成ＭＫの位相差像である。静置条件では、血小板前駆体は１４時間で形成されて１６時間で最大になったが、流動時は、わずか１０分しかかからなかった。
パネルＢ（図５Ｂ）：ＨＵＶＥＣ単層は刺激非存在下においてもＭＫの接着を支持したが（上のパネル）、血小板前駆体の形成はＨＵＶＥＣ活性化後に見られた（下のパネル）。
パネルＣ（図５Ｃ）：フィブリノーゲン、フィブロネクチン、およびコラーゲンで示されるように、非ＶＷＦ表面上でのＭＫの変形および血小板前駆体形成は、ずり条件において最小となった。
【００５９】
図６は、高ずり速度で流動させたＭＫから得られた血小板はトロンビンにより活性化され得ることを示す。高ずり速度に置かれたＭＫのフロースルー中の細胞溶出液を、静置条件でフィブリノーゲン接着アッセイした後、アクチンを可視化するファロイジン‐Ａｌｅｘａ５４６とαＩＩｂβ３を可視化するＡｌｅｘａ４８８とを用いた細胞染色により共焦点顕微鏡で分析した。剪断力を与えることにより産生したＭＫ由来血小板（上のパネル）は、トロンビン非存在下（左のパネル）またはトロンビン存在下（右のパネル）で、フィブリノーゲンに接着した。非活性化細胞は、拡散したアクチン染色を示し、αＩＩｂβの膜への局在化を示す。トロンビンによる活性化により、アクチンフィラメントがストレスファイバーとして構築された。これらは、剪断状態にさらさない別のアッセイで調整した洗浄血液血小板と同様の細胞骨格構成を示す（下のパネル）。バーは１０μｍを示す。
【００６０】
図７は、トロンビンにより活性化された放出血小板はＰ‐セレクチンを発現することを示す。図６の説明文に記載したように、細胞溶出液をトロンビンで活性化して、またはトロンビンで活性化しないで、フローサイトメトリーアッセイで分析した。試料を抗ＣＤ６２Ｐ‐ＦＩＴＣ（ＦＬ１、Ｐ‐セレクチン）、および抗ＣＤ４１‐ＰＥ（ＦＬ２、αＩＩｂ）で標識した。洗浄血小板のＦＳＣ‐ＳＳＣプロファイル設定をフロースルー細胞の分析に用いた（上の左パネルのＭＫ：剪断状態にさらしたもの、下の左パネル：洗浄血小板）。トロンビン非存在下（空白のバー）またはトロンビン存在下（塗りつぶしバー）で、ドットプロットにより得られたＲ１領域、Ｒ２領域、およびＲ３領域における、ＣＤ６２Ｐ・ＣＤ４１ダブルポジティブ細胞のヒストグラム。トロンビンで活性化した試料のみがＣＤ６２Ｐポジティブ細胞を含んでいたが、すべての試料がＣＤ４１ａポジティブであった（上の右パネル）。トロンビン存在下で、非免疫ＩｇＧ（細線、灰色の背景）、抗ＣＤ６２Ｐ、または抗ＣＤ４１ａ（太線）で標識された、フロースルー中の活性化血小板（Ｒ１）のヒストグラムプロット（下の右パネル）。
【００６１】
図８は、トロンビン活性化によるＭＫ由来血小板の超微細構造変化を示す。細胞溶出液をトロンビンで活性化して、または活性化しないで、電子顕微鏡で観察した。トロンビン非存在下では、血小板サイズの断片は滑らかな表面を示し、細胞質中に点在したいくつかのアルファ粒子（Ａ）、および不連続なＳＣＣＳ槽を含んでいた（パネルａ）。トロンビン存在下では、血小板サイズの断片は活性化血小板に特徴的な形状変化、すなわち、球状の形状、表面の偽足（ｐ）、拡張したＳＣＣＳ槽内の高密度物質を示し、細胞質内に造粒が見られず、中心に微小管の束を示しており、活性化された血液血小板とよく似ている（パネルｂ）。バーは２μｍを示す。
【実施例】
【００６２】
［材料と方法］
≪タンパク質≫
ＶＷＦは、フランス分留生物工学研究所（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ ｆｒａｃｔｉｏｎｎｅｍｅｎｔ ｅｔ ｄｅｓ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（フランス、リール）からの贈与である。フィブリノーゲンは、Ｈｙｐｈｅｎ ＢｉｏＭｅｄ社（フランス、ヌーヴィル シュル オワーズ）から入手した。ヒトＶＷＦおよびフィブリノーゲンは、精製し、それぞれ混入フィブロネクチンならびにフィブリノーゲンおよびＶＷＦを除去した（Ｌｅｇｅｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ．、２００６）。ウマ腱コラーゲンは、Ｎｙｃｏｍｅｄ社（ドイツ、ミュンヘン）から入手し、ヒトフィブロネクチンはＶＷＲ社（フランス、フォントネー スー ボワ）から入手した。野生型組換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）および変異（Ｖ１３１６Ｍ ２Ｂ型）組換えＶＷＦは、他に記載のようにして得た（Ａｊｚｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、２０００）。
【００６３】
≪抗体≫
リストセチン存在下でＶＷＦのＧＰＩｂαへの結合を遮断するモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）７１３は、ＪＰ Ｇｒｉｍａ博士（仏国立医学研究所（ＩＮＳＥＲＭ）ユニット７７０、フランス、ル クルムラン‐ビセートル）から善意で贈与されたものである（Ａｊｚｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、２０００）。ＶＷＦ結合部位を含むＧＰＩｂα細胞外ドメインであるポリクローナル抗グリコカリシン抗体は、ＭＣ Ｂｅｒｎｄｔ博士（モナッシュ大学、オーストラリア、メルボルン）からの善意で贈与されたものである（Ｃｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９１）。フィコエリトリン（ＰＥ）複合化抗ＣＤ６２Ｐ（Ｐ‐セレクチン）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）複合化抗ＣＤ４１ａ（αＩＩｂ）、抗ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）、および非免疫抗体は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社（フランス、ヴィルパント）から入手した。抗αチューブリンＭｏＡｂおよび抗βチューブリンＭｏＡｂは、Ａｍｅｒｓｈａｍ社（フランス、オルセー）から入手した。抗β３インテグリンＰ３７ＭｏＡｂは、Ｇｏｎｚａｌｅｚ‐Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ博士（ＣＳＩＣ、スペイン、マドリード）から贈与されたものである（Ｃａｌｖｅｔｅ ｅｔ ａｌ．、１９９１）。抗αＩＩｂβ３Ｆａｂ（Ｃ７Ｅ３）アブシキシマブ（レオプロ（登録商標））は、Ｌｉｌｌｙ社（フランス、シュレンヌ）から入手した。
【００６４】
≪ヒト巨核球≫
本研究で使用されるヒトＭＫは、臍帯血または骨髄から単離した前駆細胞から培養した。ヒト骨髄試料（臀部の手術時に回収）、および臍帯血試料は、当研究所の倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｅｔｈｉｃ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（パリ国立大学病院（Ａｓｓｉｓｔａｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｑｕｅ ｄｅｓ Ｈｏｐｉｔａｕｘ ｄｅ
Ｐａｒｉｓ））に従ったインフォームド・コンセントおよびヘルシンキ宣言に基づいて得た。ヒト臍帯血および骨髄のＣＤ３４＋細胞は、前述の通り（Ｆｉｃｈｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９９９）、免疫磁気法（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、フランス、グルノーブル）により分離した。１５％のＢＩＴ９５００血清代替物（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）および２０ｎｍｏｌ／ＬのＴＰＯペプチドアゴニストＡＦ１３９４８（Ｇｅｎｏｓｙｓ‐Ｓｉｇｍａ社、フランス、サン カンタン ファラヴィエ）を補充したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｇｉｂｃｏ‐Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、フランス、セルジー ポントワーズ）中で細胞を培養した。１０ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ）（Ａｍｇｅｎ社、フランス、ヌイイ シュル セーヌ）を、培養の初日に一回添加した。ＴＰＯ存在下で１０〜１６日間培養したＭＫは、完全に成熟しており血小板生合成に対応していた（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．、２００５ａ）。細胞のＧＰＩｂおよびαＩＩｂβ３の発現（６０〜７０％のポジティブ細胞）は、フローサイトメトリーにより示した。ずり実験のためには、細胞を１０〜１６日目で使用した。
【００６５】
≪ヒト血小板≫
事前の２週間薬物を摂取していない健康な個人から血液を得た。１５％（ｖ／ｖ）のクエン酸デキストロース（ＡＣＤ）（ｐＨ５．８）中に血液を採取した。アピラーゼ（１Ｕ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ社）およびＡＣＤ（４０ｍＬにつき１ｍＬ）の存在下で、単離した多血小板血漿（ＰＲＰ）から洗浄血小板を調製した（Ａｊｚｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、２０００）。すなわち、洗浄後、０．１５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．５）（Ｈｅｐｅｓ（Ｎ‐［２‐ヒドロキシエチル］ピペラジン‐Ｎ’‐［エタンスルホン酸］）（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＮａＣｌ（１３６ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＫＣｌ（２．７ｍｍｏｌ／Ｌ）、およびＭｇＣｌ2（２ｍｍｏｌ／Ｌ））に血小板を懸濁した。血小板は、電子パーティクルカウンタ（モデルＺ１、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社、フランス、マルジャンシー）で測定し、１ｍＬあたり１．５×１０8個の血小板の濃度に調整した。
【００６６】
≪マウス巨核球および血小板≫
野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、６〜８週齢で使用した。動物の世話および手順は、研究所のガイドラインに従った。巨核球はフラッシュした骨髄から拡張および分離した。すなわち、免疫磁気的に分離したＬｉｎ-細胞を、ＴＰＯペプチド存在下で適切な巨核球分化培地中で培養した。培養６日後、成熟巨核球を小型化フローチャンバーに導入し（Ｃｏｎａｎｔ ｅｔ ａｌ．、２００９）、高ずり速度で、固定化マウス組換えＶＷＦ上で灌流した（Ｍａｒｘ ｅｔ ａｌ．、２００８）。
【００６７】
≪灌流試験≫
灌流試験は、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ社のすでに確立されたフローチャンバーを用いて実施した（Ｌｅｇｅｎｄｒｅ ｅｔ ａｌ．、２００６）。フローチャンバーは、プレキシグラスブロックに彫られた、高さ０．０５ｍｍ、長さ２９ｍｍ、幅５ｍｍの矩形の空洞からなる。チャンバーの底面には、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．４）、ＮａＣｌ（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ））中に希釈されたＶＷＦ（２０μｇ／ｍＬ）で４℃で一晩コートしたカバースリップを敷いた。一部の実験では、その他の精製タンパク質（フィブロネクチン、フィブリノーゲン、コラーゲン、または２Ｂ型‐ｒＶＷＦ）を試験した。ＩＭＤＭ（２ｍＬ）に０．８〜１×１０6細胞／ｍＬで懸濁したＭＫを、エクステンションセット（Ｓｔｅｒｉｔｅｘ、Ｃｏｄａｎ社、ドイツ、レンスアーン）を有するチャンバーに接続した５ｍＬガラス気密性マイクロシリンジ（Ｅｘａｍｉｎｅ、伊藤製作所、日本、富士）中に吸引した。１８００ｓ-1のずり速度を生じる２２５μＬ／分のフロー速度を電気ポンプで負荷した。細胞を１０分間灌流した後、同じずり速度でＩＭＤＭで１０分間灌流した。すべての実験は、Ｍｉｎｉｔｕｂ加熱システム（Ｍｉｎｉｔｕｂ Ａｂｆｕｌｌ ｕｎｄ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ社、ドイツ、ティーフェンバッハ）を用いて維持した３７℃において行った。一部の実験では、灌流前に１０分間、細胞またはカバースリップを抗体とともに予備インキュベーションを行った。灌流完了後、カバースリップを氷冷メタノールで５分間固定し、滅菌水で洗浄して乾燥し、染色した。トロンビン活性化を含む追加試験のため、チェンバー出口で溶出液を回収した。
【００６８】
≪ビデオ顕微鏡システム≫
灌流チャンバーを倒立顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ １３５、Ｚｅｉｓｓ社、ドイツ）のステージに設置した。ＣＣＤカメラ（ソニー、日本、東京）を使用して、２０倍ホフマンモジュレーションコントラスト対物レンズを用いて細胞を可視化した。ビデオタイマー（ＶＴＧ、日本、東京）に接続したデジタル画像レコーダー（Ｒｅｐｌａｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、フランス）を用いて連続記録を行った。画像フレームは、ＨｉｓｔｏｌａｂまたはＶｉｄｅｏｍｅｔ定量化ソフトウエア（Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて分析した。
【００６９】
≪細胞活性化試験およびフローサイトメトリー≫
溶出細胞懸濁液を回収し、ＥＤＴＡ（０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）存在下において、１８００ｒｐｍで１２分間遠心分離し、ペレットをＩＭＤＭに再懸濁した。一定分量をトロンビン非存在下またはトロンビン存在下（５Ｕ／ｍＬ）において、３７℃で１０分間インキュベートした。ＦＩＴＣ‐抗ＣＤ６２ＰおよびＰＥ‐抗ＣＤ４１ａ（それぞれ５μＬ）、または非免疫複合化コントロール抗体とともに懸濁細胞（１００μＬ）を室温で２０分間インキュベートした後、３００μＬのＰＢＳを添加した。その後、細胞をＦＡＣＳｏｒｔフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ‐Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、ル・ポン ド クレ）を用いて、未刺激の洗浄血小板を用いた別の実験で決定した直角散乱光（ＳＳＣ）と前方散乱光（ＦＳＣ）のプロットに関する特徴的なプロファイルにより同定された血小板領域に対する設定で１００００事象を獲得して分析した。
【００７０】
≪共焦点免疫蛍光法≫
未活性化細胞およびトロンビン活性化細胞の一定分量（１５０μＬ）を、静置条件で３０分間インキュベートしたフィブリノーゲンコートガラスＬａｂ‐Ｔｅｋチャンバースライド（Ｎｕｎｃ社、ニューヨーク州、ロチェスター）に添加した。未接着細胞を除去し、スライドをＰＢＳで三回洗浄した後、ＰＢＳ中の２％パラフォルムアルデヒド（Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ社、フランス、ヴァル ド ルイユ）で３０分間固定し、４℃で保存した。免疫蛍光染色のために、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００で５分間細胞を透過処理し、その後、抗β３ Ｐ３７ ＭｏＡｂ（ＰＢＳ中に１０μｇ／ｍＬ）とともに３０分間インキュベートし、洗浄して、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、オレゴン州、ユージーン）と複合化した２０μｇ／ｍＬの二次抗体とともにインキュベートした。ネガティブコントロールには、マウス腹水から精製したＩｇＧを同じタンパク質濃度で用いた。アクチン染色のために、透過処理した細胞を、３％ＢＳＡを含むＰＢＳ中の５０μＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５４６ ファロイジン（３０ｎｍｏｌ／Ｌ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）とともに室温で３０分間インキュベートした。その後、カバースリップを二回洗浄し、ＴＯＴＯ３およびＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、英国、ピーターバラ）を含むマウント溶液中にマウントした。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８／ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６染色は、Ｌｅｉｃａ社のＴＣＳ ＳＰ２ ＡＯＢＳ共焦点顕微鏡で分析した。
【００７１】
≪電子顕微鏡≫
溶出細胞懸濁液を、種々のマトリックスを通過させた後、灌流チャンバーの出口でグルタルアルデヒド固定液（リン酸緩衝液中（ｐＨ７．４）に最終濃度１．５％）中に直接回収し、その後、前述の通りに電子顕微鏡用に処理した（Ｃｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９７）。一部の試料は前述のように最初にトロンビンで活性化し、さらに電子顕微鏡用に処理した。Ｊｅｏｌ １０‐１１（日本電子株式会社、日本、東京）電子顕微鏡で検査を行った。
【００７２】
≪統計≫
統計解析には、スチューデントｔ検定を用い、０．０５未満のＰ値を有意と見なした。エラーバーは、標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【００７３】
［結果］
≪ＭＫとＶＷＦとの動的相互作用≫
臍帯血成熟ＭＫは、精製ＶＷＦでコートした表面を様々なずり速度で灌流した。１８００ｓ-1で、ＭＫはＶＷＦと一過的に相互作用を確立し、ＶＷＦ上を回転するＭＫの速度が低下し、最終的にＭＫから血小板を分離させる顕著な形態変化を次第に引き起こす。血小板形成の種々のステップを図１Ａに示す。このプロセスは、おおよそ球状のＭＫから始まり、その後、細胞周辺部が変形し、接着ＭＫ上に偽足が出現する（ステージ２）。その後、細胞体の後方および／または前方で、流動方向に沿って構築された細胞質の伸長が起こる（ステージ３）。特徴的な数珠玉状の外観を有する中間的な膨張が現れ始める。２１μｍ／分の速度（静置条件で報告されている（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．、２００５ｂ）２５倍の速さ）で、急速に伸長が起こった。興味深いことに、これら伸長部の先端だけではなく膨張部の間、特に薄い狭窄部においても断片化が起き、種々の大きさの断片が放出され、ほとんどの場合、それぞれの数珠玉は互いに繋がったままであるが主要な細胞体を欠いていた（図１Ａ）。最終的に、これらの断片は、血小板の大きさである、より小さな粒子にさらに分解され、後期時点において明確に視認された（図１Ａ）。高ずり速度条件下では、１５〜２０分以内に血小板前駆体の断片化が急速に起こった。臍帯血由来ＭＫまた骨髄由来ＭＫを用いて、同様の結果が得られた。対照的に、流動の無い状態または低いずり速度（１０００ｓ-1未満）で流動させた状態は、ＭＫがＶＷＦと接触している２０分間において、血小板前駆体および血小板の放出は見られなかった。９日以下培養した未成熟ＭＫをずり速度にさらしても、移動および断片化しなかった。
【００７４】
≪血小板形成におけるＶＷＦのＭＫ受容体との相互作用の特異性≫
ずり速度にさらされる間の形態変化を定量化するため、４つの細胞カテゴリー、すなわち、（１）移動ＭＫ、（２）球形を失った初期の変形ＭＫ、（３）血小板前駆体を伸長している後期の変形ＭＫ、および（４）血小板前駆体の断片化および血小板の放出を定義した。（図１Ｂ、パネルａ）。伸長細胞ならびに血小板前駆体および血小板の集団が徐々に増え、２０分で２７．６±４．９％の細胞に達した。この増加は、移動細胞が５分で２８．２±６．５％から２０分で３．６±１．６％に減少し、初期の変形ＭＫが減少したことを反映していた（図１Ｂ、パネルｂ）。高ずり速度にさらされた骨髄ＭＫの分布を計測すると、臍帯血ＭＫで記載された結果と同様の結果が得られた（図１Ｂ、パネルｃ）。ＭＫの移動および血小板前駆体形成と血小板の放出とを含むその後のステップは、グリコカリシンに対する抗体またはＶＷＦのＧＰＩｂ結合ドメインに対する抗体の存在下で完全に消失し（図１Ｂ、パネルｄおよびパネルｅ）、ＶＷＦとＧＰＩｂとの相互作用の重大な重要性が実証された。αＩＩｂβ３阻害剤であるアブシキシマブの存在下では、血小板前駆体以外の細胞集団（未変形ＭＫおよび初期の変形ＭＫ）は時間に対して一定のままであったが、血小板前駆体の伸長が大きく減少して血小板形成がほぼ完全に消失した（図１Ｂ、パネルｆ）。この非効率的な血小板前駆体形成は、ＶＷＦ表面との緩い接触によるものであった（未掲載データ）。
【００７５】
≪高ずり速度にさらされたＭＫにより誘導される血小板形成の特徴づけ≫
成熟ＭＫに付与されたずり応力により、ＶＷＦ上で細胞を２０分間静置条件でインキュベートしたコントロールと比較して特異的な形態変化が誘導されたが、ＭＫの形態はＶＷＦと接触する以前の細胞の形態に対しては変化しないままであった（図２）。対照的に、ＭＫの灌流の２０分後に予備固定して染色したＶＷＦコートカバースリップでは、ＭＫがその先端部に長い糸状仮足を伸ばして、シャフトに沿って数珠玉状の血小板様スパイク、およびより大きな細胞質断片が形成されることが示された（図２）。血小板前駆体の伸長には、α１チューブリンおよびβ１チューブリンで染色される重複微小管がスライドすることが必要とされる（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．、２００５ｂ）。発明者らはＭＫの伸長部が、アクチンと異なった領域において抗チューブリン抗体により染色されることを見出しており、これらの伸長部が、Ｉｔａｌｉａｎｏらの研究（Ｉｔａｌｉａｎｏ ｅｔ ａｌ、２００３；Ｉｔａｌｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．、１９９９；Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．、２００５ａ；Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．、２００５ｂ）により血小板前駆体形成ＭＫにおいて確認されたものと同様の染色を示すことが確認された。すなわち、チューブリン標識は、伸長したＭＫでは血小板前駆体のシャフトに沿っており、球状のＭＫ、血小板前駆体、および血小板ではリング状のパターンを示した（図３Ｂ）。ずり惹起血小板前駆体形成における微小管の重要性は、微小管集合の阻害剤であり流動条件においてＭＫの伸長および血小板前駆体形成を完全に阻害するノコダゾールとの予備インキュベーションにより確認された（未掲載データ）。ノコダゾールが細胞懸濁液中にあらかじめ形成された血小板に対して作用しないことを実証するため、伸長後に微小管阻害剤を添加した。すなわち、リアルタイムで可視化された効果により、プロセスが起きた後にノコダゾールを添加した場合、ノコダゾールはずり惹起伸長を戻すことができることが示された。逆戻りの特異性は、チューブリン染色により確認された。興味深いことに、２５分でノコダゾールを添加した後、血小板前駆体および血小板においてチューブリンがもはや構築されないことが確認され、伸長プロセスはテザーとは異なることが示唆された（図３Ｃ）。実際、膜テザーは、流動の影響下において小さく局在化した接着接触部から伸びる動的な構造であり、ＶＷＦとＧＰＩｂとの相互作用により誘導されるものであるが、チューブリン染色を示さない（Ｄｏｐｈｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ．、２００２）。
【００７６】
電子顕微鏡により、細胞コアから伸び、平行な微小管の束を含み、時に細胞質オルガネラで膨張した、長い細胞質シャフトが示された（図４、パネルａ）。凝集ヘテロクロマチンを有する分葉核は、細胞の一方の極に局在し、裸の核がしばしば観察された（図４、パネルｂ）。核を欠く大きな細胞質断片は、およそ球状、ダンベル型、または細長い先端を有する伸長形状であった（図４、パネルｃおよびパネルｄ）。血小板様断片もまた視認された（図４、パネルｅ）。
【００７７】
≪血小板前駆体形成は高ずり速度およびＶＷＦにより促進される≫
接着性タンパク質が血小板前駆体形成の制御、具体的には静置条件でＭＫをＶＷＦ上にプレーティングした１６時間後に起こる血小板前駆体形成に関与していることが近年実証された（Ｂａｌｄｕｉｎｉ ｅｔ ａｌ．、２００８）。図５Ａに示すように、同様の結果が得られた。対照的に、高ずり速度存在下では、２０分以内に、７０％の臍帯血ＭＫおよび８０％の骨髄ＭＫが血小板前駆体を形成しており、このプロセスが非常に迅速に起こった。この効果は、ずり速度の程度（６００〜２４００ｓ-1）と細胞濃度（０．５〜２×１０6／ｍＬ）とに依存していた。内皮細胞は、低い割合で絶えず放出され炎症状態で増加する高分子量のＶＷＦ多量体を含んでいる（Ｒｏｎｄａｉｊ ｅｔ ａｌ．、２００６）。したがって、内皮細胞マトリックスから放出されるＶＷＦがＭＫの接着と血小板前駆体形成とを支持するかについて評価した。ＭＫは未刺激ＨＵＶＥＣ上を回転して接着したが、血小板前駆体形成は刺激したＨＵＶＥＣ上で起こった（図５Ｂ）。血小板形成は、内皮細胞の下にありこれら内皮細胞が除去された際に存在する内皮細胞マトリックス上でも起きた。さらに、変異型の２Ｂ型ｒＶＷＦでコートされた表面上で灌流したＭＫからの血小板前駆体形成について試験した。明確に定義された突然変異であり、軽度の血小板減少症と巨大血小板とを示し血小板ＧＰＩｂへのＶＷＦの結合が促進されることを特徴とするＶ１３１６Ｍ置換を選択した（Ａｊｚｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、２０００；Ｍｉｕｒａ ｅｔ ａｌ．、２０００）。２Ｂ型ｒＶＷＦ上でのＭＫ移動の平均速度（４．６±０．３μｍ／ｓ）が、野生型（ｗｔ）ｒＶＷＦの移動の平均速度（３３．６±２．５μｍ／ｓ、ｐ＜０．０００１）より非常に低いことが分かった。高ずり速度にさらされたＭＫによる血小板形成のすべてのステップが、２Ｂ‐ｒＶＷＦにおいてｗｔ‐ｒＶＷＦより遅く、血小板産生が減少し血小板前駆体の蓄積が増大した（未掲載データ）。最終的に、血小板前駆体形成の制御における接着性表面の特異性をさらに立証するため、高ずり速度において、フィブリノーゲン、コラーゲン、またはフィブロネクチン上で灌流したＭＫによる血小板前駆体形成の程度について調べた。これらの表面においては、血小板前駆体は形成されず、唯一の変化はフィブリノーゲン上での軽度の初期のＭＫ変形であった（図５Ｃ）。
【００７８】
≪ＭＫに剪断力を与えることにより産生した血小板は機能的である≫
αＩＩｂβ３インテグリンを介した血小板のフィブリノーゲンへの接着は活性化なしで起こり、トロンビンによるこの受容体の活性化により強化される。ＭＫに剪断力を与えることにより産生した血小板が、構造的および機能的に血液血小板と同様であることを確認するため、フロースルー中で回収した細胞を、フィブリノーゲンへの静置接着アッセイ（Ｍａｚｈａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．、２００７）で単離血液血小板と比較した。トロンビン非存在下で細胞はフィブリノーゲンとしっかりと接着し、ずり惹起血小板および血小板前駆体においてαＩＩｂβ３が機能的であることが実証された。非活性化成分は、アクチンの拡散した染色およびαＩＩｂβ３の膜への局在化を示した。トロンビンによる活性化により、有核成分と無核成分の両方においてアクチンフィラメントが再構築され、葉状仮足および糸状仮足の形成が示され、インテグリン膜が染色された（図６）。ＭＫに剪断力を与えることにより産生したこれらＭＫ由来血小板は、別のアッセイでずり速度にさらさないで調製した洗浄血液血小板と同様の細胞骨格構成を示した（図６）。
【００７９】
ずり速度にさらされた細胞のフローサイトメトリー分析により、その大きさによりＣＤ４１ポジティブ細胞の３つの集団が示された。最も大きが小さい集団は血液血小板集団と重複していたが、中間の集団は血小板前駆体および裸の核を含むより大きな成分に相当していた（図７）。したがって、ずり速度にさらされることにより産生した血小板集団は、末梢血から単離された血小板と比較して、中間サイズの血小板集団をより多く含んでいる。ずり速度にさらされたＭＫは、ずり速度にさらされていないＭＫと同じ大きさの大きい集団に属していた。トロンビン刺激に応答して、ずり由来血小板の表面でＰ‐セレクチン（ＣＤ６２Ｐ）の発現上昇が見られた（未活性化血小板の６．２±０．９％と比較して１１．８±１．８％、ｐ＝０．０００５）。単離した血液血小板との類似性を超微細構造のデータにより確認した（図８）。トロンビン非存在下では、血小板様断片は滑らかな表面、細胞質中に点在したいくつかのアルファ粒子、および不連続な表面結合小管系（ｓｕｒｆａｃｅ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ ｃａｎａｌｉｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍ）（ＳＣＣＳ）を示した（図８）。トロンビンによる活性化に続き、これらの細胞は活性化血小板に特有の形態変化、すなわち、球状の形態、表面の偽足、中心に集まり拡張したＳＣＣＳ槽を示し、細胞質の造粒が見られず、中心に微小管の束を示した。最終的に、血小板サイズの成分が、剪断力を与えることにより産生され、単に成熟細胞のＭＫ懸濁液から産生されたものではないことを確認するため、裸の核の存在により、フローチャンバーでの灌流の前後で溶出液を比較した。ずり速度にさらした細胞の非接着フロースルーは、それらを欠く静置条件の細胞と比較してより多くの裸の核を含んでいた（未掲載データ）。
【００８０】
≪マウス巨核球および血小板≫
マウス成熟巨核球に対し、マウスＶＷＦ上で高ずり速度の剪断力を与えると、効率的に血小板が形成された。一連の実験において、６〜８匹の動物から骨髄由来細胞を抽出することにより、少なくとも６〜８×１０6個の成熟巨核球が産生された。これらの細胞を１８００ｓ-1のずり速度に９０分間さらし、血小板サイズに相当する小さな成分に完全に変換した。マウス血小板を共焦点免疫蛍光法により特徴づけることにより、血小板サイズの成分における特異的なチューブリンのリングが明らかになった。これら血小板のアゴニストに応答した凝集特性は、血小板凝集計で標準手法により証明される。
【００８１】
≪本発明に係る血小板を血小板減少マウスへ注入することにより出血表現型がレスキューされる≫
この実験は、上述のように高ずり応力により産生されたドナーマウスの血小板を注入することにより、血小板減少レシピエントマウスの出血表現型をレスキューすることを目的とする。
【００８２】
プールしたドナーマウスから得た骨髄の成熟巨核球に剪断力を与えることにより得られた血小板を、レシピエントマウスの尻尾の静脈へ注入した。血小板減少マウスは、低濃度の抗ＧＰＩＩｂ‐ＩＩＩａ抗体を投与することにより得られる（Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ ｅｔ ａｌ．、２０００）。標準的な実験において、２〜３回の抗ＧＰＩＩｂ抗体の注入により循環血小板が８０％減少した。検出およびクリアランス試験のため、血小板減少マウスに注入する前にこれらの血小板を蛍光標識した。注入されたマウスにおける血小板数の補正、自然出血、出血時間を測定する。これらの循環断片は、血小板数を増やし生体内誘導出血モデルにおける血液減少を補正するので、活性のある血小板である。炎症部位に限定された大量出血を引き起こす、刺激性接触皮膚炎モデルを使用する（Ｇｏｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．、２００８）。血小板減少マウスにおける皮膚出血を、ずりにより産生した血小板の投与前後で比較する。新たに形成された血小板の機能もまた、塩化第二鉄障害血栓症モデルを用いて生体内顕微鏡により生体内で評価する（Ｄｅｎｉｓ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ、２００７）。この方法により、単一血小板の接着、血栓成長速度、血栓安定性、塞栓サイズおよび血管を閉塞するための時間を含む、血栓プロセスの種々のステップの詳細な情報が提供される（Ｄｅｎｉｓ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ、２００７）。リアルタイム血栓形成および血栓中への血小板の取り込みを、血小板減少マウスへの血小板投与の前後で比較する。
【００８３】
［結論］
結論として、流動状態での成熟ＭＫのＶＷＦとの相互作用がヒト／マウス血小板前駆体形成を促進するという発見により、毛細血管や細動脈で起こっているうであろう血小板形成の理解において大きな進展が示された。血小板産生が減少した疾患の探索は、巨核球からの血小板分離をさらに理解する上で大いに役に立つであろう。最後に、発明者らの結果により、診断目的または治療目的ための血小板産生方法が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヴォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）でコートされた固相上において、或いは、ＧＰＩｂと結合するＶＷＦ断片、その変異体またはその類似体でコートされた固相上において、少なくとも６００ｓ-1のずり速度で成熟巨核球懸濁液を流動させるステップを含む、生体外での血小板産生方法。
【請求項２】
前記ＶＷＦ断片、その変異体またはその類似体が、ＶＷＦの５２／４８ｋＤａトリプシン断片、黄色ブドウ球菌Ｖ‐８プロテアーゼ消化ＶＷＦ、治療用途のＶＷＦ濃縮物、および２Ｎ型ヴォン・ヴィレブランド病の原因であるＶＷＦ変異体からなる群から選択される、請求項１に記載の血小板産生方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２の血小板産生方法により得られる血小板。
【請求項４】
治療に使用される、請求項３に記載の血小板。
【請求項５】
血小板数減少性疾患の治療に使用される、請求項３または４に記載の血小板。
【請求項６】
前記血小板数減少性疾患が、自己免疫性血小板減少症、産生低下と関連した血小板減少症、および破壊増加と関連した血小板減少症からなる群から選択される、請求項５に記載の血小板。
【請求項７】
血小板機能を標準化するために請求項３に記載の血小板を使用するステップを含む、血小板疾患の診断方法。
【請求項８】
ＶＷＦでコートされた固相、あるいはＧＰＩｂと結合するＶＷＦ断片または変異体もしくは類似体でコートされた固相を含むフローチャンバーを含む、血小板産生装置。
【請求項１】
ヴォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）でコートされた固相上において、或いは、ＧＰＩｂと結合するＶＷＦ断片、その変異体またはその類似体でコートされた固相上において、少なくとも６００ｓ-1のずり速度で成熟巨核球懸濁液を流動させるステップを含む、生体外での血小板産生方法。
【請求項２】
前記ＶＷＦ断片、その変異体またはその類似体が、ＶＷＦの５２／４８ｋＤａトリプシン断片、黄色ブドウ球菌Ｖ‐８プロテアーゼ消化ＶＷＦ、治療用途のＶＷＦ濃縮物、および２Ｎ型ヴォン・ヴィレブランド病の原因であるＶＷＦ変異体からなる群から選択される、請求項１に記載の血小板産生方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２の血小板産生方法により得られる血小板。
【請求項４】
治療に使用される、請求項３に記載の血小板。
【請求項５】
血小板数減少性疾患の治療に使用される、請求項３または４に記載の血小板。
【請求項６】
前記血小板数減少性疾患が、自己免疫性血小板減少症、産生低下と関連した血小板減少症、および破壊増加と関連した血小板減少症からなる群から選択される、請求項５に記載の血小板。
【請求項７】
血小板機能を標準化するために請求項３に記載の血小板を使用するステップを含む、血小板疾患の診断方法。
【請求項８】
ＶＷＦでコートされた固相、あるいはＧＰＩｂと結合するＶＷＦ断片または変異体もしくは類似体でコートされた固相を含むフローチャンバーを含む、血小板産生装置。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１２−５１０８０４（Ｐ２０１２−５１０８０４Ａ）
【公表日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３９０３６（Ｐ２０１１−５３９０３６）
【出願日】平成２１年１２月４日（２００９．１２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６６４０１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６３８２３
【国際公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【出願人】（５１１１３３７５０）インセルム （アンスティテュ・ナショナル・ドゥ・ラ・サント・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル） (1)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＥＲＭ （Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ ｌａ Ｓａｎｔｅ ｅｔ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌｅ）
【住所又は居所原語表記】１０１， ｒｕｅ ｄｅ Ｔｏｌｂｉａｃ， ７５０１３， Ｐａｒｉｓ Ｆｒａｎｃｅ
【出願人】（５１１１３３０９３）ユニヴェルシテ・パリ・デカルト (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ ＤＥＳＣＡＲＴＥＳ
【住所又は居所原語表記】１２， ｒｕｅ ｄｅ ｌ’Ｅｃｏｌｅ ｄｅ Ｍｅｄｅｃｉｎｅ， ７５００６ Ｐａｒｉｓ ６， Ｆｒａｎｃｅ
【出願人】（５１１１３３１０７）
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＳＩＳＴＡＮＣＥ ＰＵＢＬＩＱＵＥ ＨＯＰＩＴＡＵＸ ＤＥ ＰＡＲＩＳ
【住所又は居所原語表記】３ Ａｖｅｎｕｅ Ｖｉｃｔｏｒｉａ， Ｆ−７５００４ Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ
【出願人】（５１１１３３７６１）ユニヴェルシテ・ドゥ・ヴェルサイユ・サン−クァンタン−アン−イヴェリーヌ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＶＥＲＳＡＩＬＬＥＳ ＳＡＩＮＴ−ＱＵＥＮＴＩＮ−ＥＮ−ＹＶＥＬＩＮＥＳ
【住所又は居所原語表記】５５ ａｖｎｕｅ ｄｅ Ｐａｒｉｓ， ７８０００ Ｖｅｒｓａｉｌｌｅｓ， Ｆｒａｎｃｅ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年５月１７日（２０１２．５．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月４日（２００９．１２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０６６４０１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６３８２３
【国際公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【出願人】（５１１１３３７５０）インセルム （アンスティテュ・ナショナル・ドゥ・ラ・サント・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル） (1)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＥＲＭ （Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ ｌａ Ｓａｎｔｅ ｅｔ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌｅ）
【住所又は居所原語表記】１０１， ｒｕｅ ｄｅ Ｔｏｌｂｉａｃ， ７５０１３， Ｐａｒｉｓ Ｆｒａｎｃｅ
【出願人】（５１１１３３０９３）ユニヴェルシテ・パリ・デカルト (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ ＤＥＳＣＡＲＴＥＳ
【住所又は居所原語表記】１２， ｒｕｅ ｄｅ ｌ’Ｅｃｏｌｅ ｄｅ Ｍｅｄｅｃｉｎｅ， ７５００６ Ｐａｒｉｓ ６， Ｆｒａｎｃｅ
【出願人】（５１１１３３１０７）
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＳＩＳＴＡＮＣＥ ＰＵＢＬＩＱＵＥ ＨＯＰＩＴＡＵＸ ＤＥ ＰＡＲＩＳ
【住所又は居所原語表記】３ Ａｖｅｎｕｅ Ｖｉｃｔｏｒｉａ， Ｆ−７５００４ Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ
【出願人】（５１１１３３７６１）ユニヴェルシテ・ドゥ・ヴェルサイユ・サン−クァンタン−アン−イヴェリーヌ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＶＥＲＳＡＩＬＬＥＳ ＳＡＩＮＴ−ＱＵＥＮＴＩＮ−ＥＮ−ＹＶＥＬＩＮＥＳ
【住所又は居所原語表記】５５ ａｖｎｕｅ ｄｅ Ｐａｒｉｓ， ７８０００ Ｖｅｒｓａｉｌｌｅｓ， Ｆｒａｎｃｅ
【Ｆターム（参考）】
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