血栓症治療において有用な抗凝固剤
【課題】抗血液凝固因子モノクローナル抗体に由来する免疫グロブリンＨ鎖またはＬ鎖相補性決定領域のアミノ酸配列またはその領域をコードする核酸分子を提供する。
【解決手段】免疫グロブリンＨ鎖相補性決定領域の３つの可変領域よりなる群より選択されるアミノ酸配列および該免疫グロブリン相補性決定領域をコードする核酸分子、ならびに免疫グロブリンＬ鎖相補性決定領域の３つの可変領域からなる群より選択されるアミノ酸配列および該免疫グロブリン相補性決定領域をコードする核酸分子。
【解決手段】免疫グロブリンＨ鎖相補性決定領域の３つの可変領域よりなる群より選択されるアミノ酸配列および該免疫グロブリン相補性決定領域をコードする核酸分子、ならびに免疫グロブリンＬ鎖相補性決定領域の３つの可変領域からなる群より選択されるアミノ酸配列および該免疫グロブリン相補性決定領域をコードする核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンＨ鎖またはＬ鎖相補性決定領域のアミノ酸配列またはその領域をコードする核酸分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
通常の環境下では、それが小さくても大きくても外傷は、血管の裏打ちをしている血管内皮細胞に対して、通常、凝固「カスケード」といわれる一連の事象を介する止血反応の引き金を引く。カスケードは、可溶性フィブリノーゲンを不溶性のフィブリンに変換し、それは血小板と一緒になって、血液成分の溢出を妨げる限局在化された血餅あるいは血栓を形成する。ついで、創傷治癒が起こり、続いて血餅の消滅および血管の完全性および血流の回復が起こる。
【０００３】
外傷および血餅形成の間に起こる事象は注意深く調節され連結した一連の反応である。略言すれば、不活性形プロ酵素形態での多数の血漿凝固タンパク質および補因子が血液内を循環する。活性形の酵素複合体が外傷部位で組み立てられ、引き続いてセリンプロテアーゼに活性化され、各順次のセリンプロテアーゼは次のプロ酵素をプロテアーゼ活性化へ触媒する。この酵素的カスケードの結果、各ステップは続いて起こるステップの効果を拡大する。凝固カスケードの概観については「Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ」、Ｊ．ＬｏｓｃａｌｚｏおよびＡ．Ｓｃｈａｆｅｒ，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９４）の第一章を参照されたい。
【０００４】
効率のいい血餅形成が外傷部位での失血を制限している一方、静脈または動脈での不適当な血栓の形成は障害および死の普通の原因である。異常な血餅形成活性は、心筋梗塞、不安定なアンギナ、心房細動、発作、腎障害、経皮的経管的冠状動脈形成、汎発性血管内凝固症候群、敗血症、肺動脈塞栓症および深静脈血栓のごとき病理または治療という結果になり、かつ／あるいはその結果生じる。また、人工心臓弁のごとき人工器官、シャントおよびプロテーゼの外来表面における血餅の形成も問題となる。
【０００５】
これらの病理および他の血栓性および塞栓性の障害の治療に最近用いられる承認された抗凝固剤は、硫酸化複多糖類ヘパリンおよび低分子量（ＬＭＷ）ヘパリンを含む。これらの薬剤は非経口的に投与され、トロンビン阻害剤、アンチトロンビンＩＩＩの活性化およびすべての凝固因子の不活性化により迅速かつ完全な凝固阻害を起こす。
【０００６】
しかしながら、その能力のため、ヘパリンおよびＬＭＷヘパリンには欠点がある。動作およびそれに伴う物理的物体との接触または外科手術部位での単純なストレスの結果としての制御されない出血が主要な合併症であり、連続輸液を受けている患者の１ないし７％および間欠性のボーラス量を与えられている患者の８ないし１４％に見られる。このリスクを最小限にするために、生体外で凝固時間を連続的にモニターすることができるように、試料を連続的に引き抜くが、このことが、実質的に治療コストおよび患者の不便さの一因となっている。
【０００７】
さらに、患者に出血のリスクなしに所望のレベルの効能に達する治療標的範囲は狭い。治療範囲は約１ないし３μｇヘパリン／ｍｌ血漿より少なく、結果、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイ時間、約３５ないし約１００秒となる。ヘパリン濃度を３μｇ／ｍｌに増加させると、標的範囲を超え、４μｇ／ｍｌを超える濃度では凝固活性は検出できない。従って、患者の血漿濃度を治療範囲内に保つには多大な注意をしなければならない。
【０００８】
緩速かつ持続的な効果を有するもう一つの承認された抗凝固剤はクマリン誘導体であるワルファリンである。ワルファリンは、プロトロンビンのビタミンＫ依存性翻訳後修飾および他のビタミンＫ−依存性凝固因子と競合することによって作用する。
【非特許文献１】「Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ」、Ｊ．ＬｏｓｃａｌｚｏおよびＡ．Ｓｃｈａｆｅｒ，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
治療範囲よりわずかにでも高濃度では血液が非−凝固になるという抗凝固剤作用の一般的パターンは、ワルファリンならびにヘパリンおよびＬＭＷヘパリンに見られる。明らかに、血栓および塞栓障害の制御において効能があり、制御されない出血またはその可能性を起こさない抗凝固剤が必要性とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、本発明の１の態様は、有効量の自己−制限的な中和活性を有する抗凝固因子モノクローナル抗体を投与することを含む、動物における血栓症の阻害の方法である。
【００１１】
本発明のもう一つの態様は、凝固因子に対する自己−制限的な中和活性を有する抗凝固因子モノクローナル抗体である。
【００１２】
本発明のもう一つの態様は、ＳＢ２４９４１３、ＳＢ２４９４１５、ＳＢ２４９４１６、ＳＢ２４９４１７、ＳＢ２５７７３１、ＳＢ２５７７３２、９Ｅ４（２）Ｆ４または１１Ｇ４（１）Ｂ９の同定特徴を有するモノクローナル抗体である。
【００１３】
本発明のもう一つの態様は、９Ｅ４（２）Ｆ４または１１Ｇ４（１）Ｂ９の同定特徴を有するハイブリドーマ細胞系である。
【００１４】
本発明のもう一つの態様は、本発明のモノクローナル抗体のＦｃ領域を欠失せさせることにより生産された、その中和Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片である。
【００１５】
本発明のもう一つの態様は、本発明のモノクローナル抗体のＦｄ Ｈ鎖がマウスＬ鎖糸状ファージＦａｂディスプレイライブラリー中で発現されることによる鎖シャッフリングにより生産された、その中和Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片である。
【００１６】
本発明のもう一つの態様は本発明のモノクローナル抗体のＬ鎖がマウスＨ鎖糸状ファージＦａｂディスプレイライブラリー中で発現されることによる鎖シャッフリングにより生産されたその中和Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片である。
【００１７】
本発明のもう一つの態様は、配列番号：８、９および１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＨ鎖相補性決定領域である。
【００１８】
本発明のもう一つの態様は配列番号１２、１３および１４よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン相補性決定領域である。
【００１９】
本発明のもう一つの態様は、ＨおよびＬ鎖の骨格領域がが少なくとも一つの選択される抗体から由来し、各該鎖の相補性決定領域のアミノ酸配列が凝固因子に対し自己−制限的な中和活性を有する抗−凝固因子モノクローナル抗体から由来するＨ鎖およびＬ鎖を含む改変された抗体である。
【００２０】
本発明のもう一つの態様は、Ｈ鎖およびＬ鎖を含むキメラの抗体であり、該抗体は、固有または共通の経路の凝固因子の機能を、血栓症が阻害かつ制限され、該ＨおよびＬ鎖の定常領域が少なくとも一つの選択される抗体から由来し、各該鎖の可変領域のアミノ酸配列が凝固因子に対して自己−制限的な中和活性を有する抗−凝固因子モノクローナル抗体から由来する凝固の変調が生じる自己−制限的な様式で阻害することにより特徴付けられる。
【００２１】
本発明のさらにもう一つの態様は、本発明のヒト化抗体またはキメラ抗体および医薬上許容される担体を含む医薬組成物である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、自己−制限的な中和活性により特徴付けられる、凝固因子に向けられた種々の抗体、改変された抗体およびその断片を提供する。好ましくは、凝固因子は固有または共通の凝固経路由来である。最も好ましくは、抗−凝固因子抗体は抗−第ＩＸ因子、抗−第ＩＸａ因子、抗−第Ｘ因子、抗−第Ｘａ因子、抗−第ＸＩ因子、抗−第ＸＩａ因子、抗−第ＶＩＩＩ因子、抗−第ＶＩＩＩａ因子、抗−第Ｖ因子、抗−第Ｖａ因子、抗−第ＶＩＩ因子、抗−第ＶＩＩａ因子または抗−トロンビンである。抗−第ＩＸ因子抗体は特に好ましい。例示的な抗−凝固因子抗体はヒト第ＩＸ因子に対するヒト化モノクローナル抗体、ＳＢ２４９４１３、ＳＢ２４９４１５、ＳＢ２４９４１６、ＳＢ２４９４１７、ＳＢ２５７７３１およびＳＢ２５７７３２、ヒト第ＩＸ因子に対するキメラモノクローナル抗体ｃｈαＦＩＸ、ヒト第ＩＸ因子および／または第ＩＸａ因子に対するネズミモノクローナル抗体ＢＣ１、ＢＣ２、９Ｅ４（２）Ｆ４および１１Ｇ４（１）Ｂ９またはそれぞれヒト第ＸおよびＸＩ因子に対するネズミモノクローナル抗体ＨＦＸＬＣおよびＨＦＸＩである。抗−ヒト第ＩＸ因子モノクローナル抗体ＳＢ２４９４１７が特に好ましい。
【００２３】
本発明の抗体は、慣用的なハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ組合せライブラリー、免疫グロブリン鎖シャッフリングおよびヒト化技術により、調製でき、新規な自己−制限的な中和抗体を生ずる。また、自己−制限的な中和活性を有するヒトｍＡｂも十分に含む。これらの生成物は心筋梗塞、不安定なアンギナ、心房細動、発作、腎障害、肺動脈塞栓症、深静脈血栓、経皮的経管的冠状動脈形成、汎発性血管内凝固症候群、敗血症、人工器官、シャントまたはプロテーゼに関連した血栓および塞栓障害に対する治療および医薬組成物において有用である。
【００２４】
本明細書中にて使用されたごとく、「自己−制限的な中和活性」なる語は、好ましくは、第ＩＸ／ＩＸａ、Ｘ／Ｘａ、ＸＩ／ＸＩａ、ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａおよびＶ／Ｖａ、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子およびトロンビンを含む固有かつ共通の経路由来のヒト凝固因子に結合し、凝固の制限された変調が生じるごとき様式で血栓症を阻害する活性をいう。「凝固の制限された変調」は、モノクローナル抗体の濃度の増加にも拘わらず最大値に到達するａＰＴＴで血漿が凝固可能である活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）の延長により測定される凝固時間の増加と定義される。この凝固の制限される変調は、凝固不可能にされ、増加する濃度のヘパリン存在下、無限のａＰＴＴを示す血漿とは対照的である。好ましくは、本発明の方法の最大ａＰＴＴ値はヘパリン治療範囲内である。最も好ましくは、最大ａＰＴＴ値は正常なコントロールａＰＴＴ値の約１．５倍ないし３．５倍に相当する約３５秒ないし１００秒の範囲内にある。本発明のある具体例において、ａＰＴＴはプロトロンビン時間（ＰＴ）の有意な延長なしに延長される。
【００２５】
「改変された抗体」とは、選択された宿主細胞内での発現により得られる改変された免疫グロブリンコーディング領域によりコードされるタンパク質をいう。かかる改変された抗体は作成された抗体（例えば、キメラまたはヒト化抗体）または免疫グロブリンの定常領域のすべてまたは一部を欠失した抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２などである。
【００２６】
「改変された免疫グロブリンコーディング領域」とは本発明の改変された抗体をコードする核酸配列をいう。改変された抗体がＣＤＲ−移植またはヒト化抗体である場合は、非−ヒト免疫グロブリンからの相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする配列が、ヒト可変骨格配列を含む第一の免疫グロブリンパートナー中に挿入される。所望により、第一の免疫グロブリンパートナーは第二の免疫グロブリンパートナーへ作動可能に結合されてもよい。
【００２７】
「第一の免疫グロブリンパートナー」とは、本来の（または天然の）ＣＤＲ−コーディング領域が供与体の抗体のＣＤＲ−コーディング領域により置換されたヒト骨格またはヒト免疫グロブリン可変領域をコードする核酸配列をいう。ヒト可変領域は免疫グロブリンＨ鎖、Ｌ鎖（または両鎖）、その類似体または機能的断片であってもよい。抗体（免疫グロブリン）の可変領域内に位置するかかるＣＤＲ領域は当該分野で知られている方法により決定できる。例えば、Ｋａｂａｔら．，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｇ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｓｔ」，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７）にＣＤＲを位置づける法則を開示する。加えて、ＣＤＲ領域／構造を同定するに有用であるコンピュータープログラムが公知である。
【００２８】
「第二の免疫グロブリンパートナー」とは、第一の免疫グロブリンパートナーがフレーム内に、または所望の慣用的なリンカー配列（すなわち作動可能に結合される）によって融合されるタンパク質またはペプチドをコードする別の核酸配列をいう。好ましくは、それは免疫グロブリン遺伝子である。第二の免疫グロブリンパートナーは、同じものの定常領域全体をコードする核酸配列（すなわち、相同な、第一および第二の改変された抗体は同源由来である）、または付加的な（すなわち、異種の）抗体を含む。それは免疫グロブリンＨ鎖またはＬ鎖（または単一のポリペプチドの一部として両鎖）であってもよい。第二の免疫グロブリンパートナーは、特定の免疫グロブリンクラスまたはイソタイプに限定されない。加えて、第二の免疫グロブリンパートナーは、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２（すなわち、適当なヒト定常領域または骨格領域の不連続部分）に見出されるごとき免疫グロブリン定常領域の一部を含んでいてもよい。また、かかる第二の免疫グロブリンパートナーは、宿主細胞の外表面上に露出している必須の膜タンパク質をコードする配列、例えば、ファージディスプレーライブラリーの一部、または分析学的または診断学的検出用タンパク質をコードする配列、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどを含んでもよい。
【００２９】
Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ）’２なる語は、その標準的な意味で使用される。例えば、Ｈａｒｌｏｗら．，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｕｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照されたい。
【００３０】
本明細書中にて使用されるごとく、「作成された抗体」は、選択された受容体抗体のＬおよび／またはＨ鎖可変ドメインの一部が選択されたエピトープにつき特異性を有する一種以上の供与体抗体からの類似した部分によって置換されたある種の改変された抗体、すなわち全長合成抗体（例えば、抗体断片に対するキメラまたはヒト化抗体）をいう。例えば、かかる分子は、非修飾Ｌ鎖（またはキメラＬ鎖）に関連したヒト化Ｈ鎖またはその逆により特徴付けられる抗体を含んでもよい。また、作成された抗体は、供与体抗体結合特異性を保持するために、受容体抗体Ｌおよび／またはＨ可変ドメイン骨格領域をコードする核酸配列の改変によっても特徴付けられる。これら抗体は、本明細書中に記載された供与体抗体由来のＣＤＲを有する受容体抗体から一つ以上のＣＤＲ（好ましくはすべて）の置換を含んでもよい。
【００３１】
「キメラ抗体」は、受容体抗体由来のＬおよびＨ鎖定常領域に関連した供与体抗体由来の天然の可変領域（Ｌ鎖およびＨ鎖）を含むある種の作成された抗体をいう。
【００３２】
「ヒト化抗体」なる語は、ＣＤＲが非−ヒト供与体免疫グロブリン由来であり、分子の免疫グロブリン−由来の残る部分が一種以上のヒト免疫グロブリン由来であるある種の作成された抗体をいう。加えて、骨格支持残基は保存された結合親和性に改変されてもよい。例えば、Ｑｕｅｅｎら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８６，１００２９−１００３２（１９８９）、Ｈｏｄｇｓｏｎら．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９，４２１（１９９１）を参照されたい。
【００３３】
「供与体抗体」なる語は、改変された免疫グロブリンコーディング領域および供与体抗体に特徴的な抗原特異性および中和活性を有する得られた発現された改変抗体を供するために、可変領域の核酸配列、ＣＤＲまたは他の機能的断片またはその類似体を第一の免疫グロブリンパートナーに与えるモノクローナルまたは組換え抗体をいう。本発明における使用に適当な供与体抗体は、ＢＣ２といわれるネズミ自己−制限的な中和モノクローナル抗体である。他の適当な供与体抗体は、ＢＣ１、９Ｅ４（２）Ｆ４、１１Ｇ４（１）Ｂ９、ＨＦＸＬＣおよびＨＦＸＩといわれるネズミ自己−制限的な中和モノクローナル抗体を含む。
【００３４】
「受容体抗体」なる語は、供与体抗体とは異種の、Ｈおよび／またはＬ鎖骨格領域および／またはＨおよび／またはＬ鎖定常領域をコードする核酸配列の全て、または一部を第一の免疫グロブリンパートナーに与えるモノクローナルまたは組換え抗体をいう。好ましくは、ヒト抗体は受容体抗体である。
【００３５】
「ＣＤＲ」は、免疫グロブリンＨおよびＬ鎖の超可変領域である抗体の相補性決定領域アミノ酸配列と定義される。例えば、Ｋａｂａｔら．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７）を参照されたい。免疫グロブリンの可変領域には３個のＨ鎖および３個のＬ鎖ＣＤＲまたはＣＤＲ領域がある。従って、本明細書中にて使用される「ＣＤＲ」は、適当な場合には、３個のＨ鎖ＣＤＲ全て、または３個のＬ鎖ＣＤＲ全て、またはＨおよびＬ両鎖ＣＤＲの全てをいう。
【００３６】
ＣＤＲは抗体の抗原またはエピトープへの結合につき大部分の定常残基を供する。本発明の関心事であるＣＤＲは、供与体抗体可変ＨおよびＬ鎖配列由来であり、類似体は、また、由来した供与体抗体と同一の抗原結合特異性および／または中和力も共有あるいは保持する天然のＣＤＲの類似体を含む。
【００３７】
「抗原結合特異性または中和力を有すること」は、例えば、ｍＡｂ ＢＣ２があるレベルの自己−制限的な中和活性により特徴付けられるけれども、適当な構造環境中でＢＣ２の核酸配列によりコードされるＣＤＲがより低い、あるいはより高い活性を有し得るということを意味する。それにも関わらず、かかる環境中でのＢＣ２のＣＤＲはＢＣ２と同一のエピトープを認識するであろうと期待される。
【００３８】
「機能的断片」は、断片が由来した抗体と同一の抗原結合特異性および／または中和力を保持する部分的なＨまたはＬ鎖可変配列（例えば、免疫グロブリン可変領域のアミノまたはカルボキシ末端の小さい欠失）である。
【００３９】
「類似体」は、修飾が化学的または数個のアミノ酸（すなわち１０個より少ない）の置換または転移であってもよい少なくとも１個のアミノ酸により修飾されたアミノ酸配列であり、修飾は、アミノ酸配列に生物学的特徴、例えば、非修飾配列の抗原特異性および高親和性を保持させる。例示的な類似体は、ＣＤＲ−コーディング領域内またはその周辺である種のエンドヌクレアーゼ制限部位を作る置換を介して構築できるサイレント変異を含む。
【００４０】
また、類似体は対立遺伝子変異も生じる。「対立遺伝子変異または修飾」は本発明のアミノ酸またはペプチド配列をコードする核酸配列の改変である。かかる変異または修飾は遺伝暗号の縮重によってもよく、あるいは、所望の特徴を供するように計画的に作成されてもよい。これら変異または修飾の結果、いずれかのコード化アミノ酸配列における改変を生じても生じなくてもよい。
【００４１】
「エフェクター剤」なる語は、改変された抗体および／または供与体抗体の天然または合成ＬまたはＨ鎖または供与体抗体の他の断片へ、慣用的な手法によって結合できる非−タンパク質担体分子をいう。かかる非−タンパク質担体は診断分野で使用される慣用的な担体、例えば、ポリスチレンまたは他のプラスチックビーズ、多糖類、例えば、バイアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））系、または、医学分野で有用で、ヒトおよび動物への投与が安全である他の非−タンパク質物質を含んでもよい。他のエフェクター剤は重金属原子または放射性同位元素をキレートする大環状体を含んでもよい。かかるエフェクター剤、例えば、ポリエチレングリコールはまた、改変された抗体の半減期を増加するにも有用である。
【００４２】
本発明の抗体、改変された抗体および断片の構築における使用につき、ウシ、ヒツジ、サル、ニワトリ、齧歯類（例えば、ネズミおよびラット）のごとき非−ヒト種がヒト凝固因子、好ましくは第ＩＸ／ＩＸａ、Ｘ／Ｘａ、ＸＩ／ＸＩａ、ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ、Ｖ／Ｖａ、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、またはトロンビン、またはそれから由来するペプチドエピトープでの記述上所望の免疫グロブリンを生ずるに用いられ得る。慣用的なハイブリドーマ技術が、非−ヒトｍＡｂを各凝固因子へ分泌するハイブリドーマ細胞系を供するに用いられる。ついで、かかるハイブリドーマは、９６穴プレートにコートされ、実施例セクションに記載されたごとく、第ＩＸ／ＩＸａ、Ｘ／Ｘａ、ＸＩ／ＸＩａ、ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ、Ｖ／Ｖａ、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、またはトロンビンを用いて結合につき、あるいはストレプトアビジン−コートされたプレートに結合したビオチン化された第ＩＸ／ＩＸａ、Ｘ／Ｘａ、ＸＩ／ＸＩａ、ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ、Ｖ／Ｖａ、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、またはトロンビンでスクリーニングされる。あるいは、十分にヒトｍＡｂが当業者に知られた技術により生じ得、本発明において使用される。
【００４３】
本発明のある例示的な、自己−制限的な中和ｍＡｂはｍＡｂ ＢＣ２、キメラまたはヒト化分子の開発に使用できるネズミ抗体である。ＢＣ２ｍＡｂは凝固時間に対する自己−制限的な阻害活性により特徴付けられる。ａＰＴＴアッセイにより測定される、凝固時間に対するＢＣ２ ｍＡｂの効果は最大値約１００秒を示す。また、ＢＣ２ ｍＡｂは第ＩＸａ因子とも結合し、第ＩＸ因子のＩＸａへの変換をも阻害し、かつ第ＩＸａ因子活性も阻害する。二価金属共因子が活性に必要であり、ｍＡｂはＭｎ２＋よりもＣａ２＋の方により選択性を示す。ａＰＴＴアッセイで測定されたＩＣ５０は約５０ｎＭである。ＢＣ２ ｍＡｂはラットと種交差−反応性を示しアイソタイプＩｇＧ２ａである。
【００４４】
他の望ましい供与体抗体はネズミｍＡｂ、ＢＣ１、９Ｅ４（２）Ｆ４および１１Ｇ４（１）Ｂ９である。これらｍＡｂは、凝固時間に対する自己−制限的な阻害活性により特徴付けられる。ａＰＴＴアッセイにより測定されたごとく、これらｍＡｂの凝固時間に対する効果は９Ｅ４（２）Ｆ４で約９０ないし１００秒および１１Ｇ４（１）Ｂ９で約８０秒の最大値を示す。また、ＢＣ１ ｍＡｂは、第ＩＸａ因子に結合し、第ＩＸａ因子活性も阻害するが、第ＩＸ因子のＩＸａへの変換は阻害しない。金属共因子はその活性には必要ではない。ａＰＴＴアッセイで測定されたＢＣ１のＩＣ５０は約３５ｎＭである。ＢＣ１ ｍＡｂはイソタイプＩｇＧである。
【００４５】
凝固時間において、自己／制限的な阻害活性により特徴付けられるさらにもう一つの所望の供与体抗体はネズミｍＡｂＨＦＸＬＣである。ａＰＴＴアッセイで測定された凝固時間に対するＨＦＸＬＣｍＡｂの効果は最大値約５０ないし６０秒を示す。ＨＦＸＬＣｍＡｂは因子Ｘ Ｌ鎖と結合し、第Ｘ／Ｘａ因子活性を阻害するａＰＴＴアッセイで測定されたＩＣ５０は約２０ｎＭである。
【００４６】
凝固時間において自己−制限的な阻害活性により特徴付けられるさらに別の望ましい供与体抗体は、ネズミｍＡｂ、ＨＦＸＩである。ａＰＴＴアッセイにより測定された、凝固時間に対するＨＦＸＩｍＡｂの効果は最大値約１００秒を示す。ＨＦＸＬＣ ｍＡｂ第ＸＩ因子と結合し、第ＸＩ／ＸＩａ因子活性を阻害する。ａＰＴＴアッセイで測定されたＩＣ５０は約３０ｎＭである。
【００４７】
作用の機構を考慮するいずれの各理論に結びつける意図はないとはいえ、これらｍＡｂは、部分的な阻害のみを達成することにより非−競合的またはアロステリックな機構によって凝固を制御するようである。
【００４８】
本発明は、ＢＣ１、ＢＣ２、９Ｅ４（２）Ｆ４、１１Ｇ４（１）Ｂ９、ＨＦＸＬＣ、ＨＦＸＩまたはその超可変（すなわちＣＤＲ）配列の使用を限定しない。従って、自己−制限的な中和活性および対応するＣＤＲにより特徴付けられるいずれの他の適当な高親和性抗体が置換されてもよい。ＢＣ１、ＢＣ２、９Ｅ４（２）Ｆ４、１１Ｇ４（１）Ｂ９、ＨＦＸＬＣまたはＨＦＸＩと以下に記載の供与体抗体の同定は、例示および記載の簡単のためにのみなされる。
【００４９】
また、本発明は、適当なヒト凝固因子または共因子に対するｍＡｂ由来のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片の使用も含む。これら断片は、凝固因子、好ましくは第ＩＸ／ＩＸａ、Ｘ／Ｘａ、ＸＩ／ＸＩａ、ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ、Ｖ／Ｖａ、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子またはトロンビンに対し自己−制限的な中和活性を有する薬剤として有用である。Ｆａｂ断片は、Ｌ鎖全体およびＨ鎖のアミノ末端部分を含む。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ジスルフィド結合により結合した２個のＦａｂ断片より形成される断片である。ｍＡｂ ＢＣ１、ＢＣ２、９Ｅ４（２）Ｆ４、１１Ｇ４（１）Ｂ９、ＨＦＸＬＣおよびＨＦＸＩおよび他の同様の高親和性抗体は、慣用的方法、例えば、適当なタンパク質分解酵素、パパインおよび／またはペプシンでのｍＡｂの分解あるいは組換え方法により得られるＦａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片の源を供する。これらＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、それ自体で、治療的、予防的または診断的薬剤として、および本明細書中に記載の組換えまたはヒト化抗体の形成において有用な可変領域およびＣＤＲ配列を含む配列の供与体として有用である。
【００５０】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、組合せファージライブラリーを介して（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）を参照されたい）、あるいは免疫グロブリン鎖シャッフリングを介して（例えば、Ｍａｒｋｓら．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２）を参照されたい）構築でき、ここに、両文献は本明細書によってことごとく参考文献に取り込まれ、ここに、選択される抗体（例えば、ＢＣ２）由来のＦｄまたはｖＨ免疫グロブリンが、新規なＦａｂを形成するＬ鎖免疫グロブリン、ｖＬ（またはｖＫ）のレパートリーと結合させられる。逆に、選択される抗体由来のＬ鎖免疫グロブリンは、新規なＦａｂを形成するＨ鎖免疫グロブリン、ｖＨ（またはＦｄ）のレパートリーと結合させられてもよい。自己−制限的な中和する第ＩＸ因子Ｆａｂは、ｍＡｂ ＢＣ２のＦｄをＬ鎖のレパートリーと結合させることにより得られる。従って、誰でも鎖シャッフリング技術から特有の配列（ヌクレオチドおよびアミノ酸）で中和Ｆａｂを回収できる。
【００５１】
上記に記載のｍＡｂ ＢＣ２または他の抗体は、供与体抗体の抗原結合特異性により特徴付けされる種々の改変された抗体の設計および獲得に有用な可変Ｈおよび／またはＬ鎖ペプチド配列、骨格配列、ＣＤＲ配列、機能的断片およびその類似体、およびそれらをコードする核酸配列のごとき配列を与えることができる。
【００５２】
また、可変Ｌ鎖およびＨ鎖ペプチド配列をコードする本発明の核酸配列またはその断片は、ＣＤＲまたは骨格領域をコードする核酸配列内での特異的変異の導入にも、得られた修飾または融合核酸配列を発現用プラスミドに組み込むにも有用である。例えば、骨格およびＣＤＲ−コーディング領域の核酸配列内のサイレント置換は、変異源化されたＣＤＲおよび／または骨格領域の挿入を促進する制限酵素部位を作成するにも利用できる。これらＣＤＲ−コーディング領域は、本発明のヒト化抗体の構築において使用できる。
【００５３】
ＢＣ２ Ｈ鎖可変領域の核酸およびアミノ酸配列は、配列番号：５および７に載せられている。この領域由来のＣＤＲ配列は配列番号８、９および１０に載せられている。
【００５４】
ＢＣ２ Ｌ鎖可変領域の核酸およびアミノ酸配列は、配列番号：６および１１に載せられている。この領域由来のＣＤＲ配列は配列番号１２、１３および１４に載せられている。
【００５５】
遺伝暗号の縮重を考慮にいれると、本発明の可変ＨおよびＬ鎖アミノ酸配列およびＣＤＲ配列ならびに供与体抗体の抗原特異性を有する機能的断片およびその類似体をコードする種々のコード配列が構築できる。可変鎖ペプチド配列またはＣＤＲをコードする本発明の単離された核酸配列またはその断片は、作動可能に第二の免疫グロブリンパートナーと結合した場合、改変された抗体、例えば、キメラまたはヒト化抗体あるいは本発明の他の作成された抗体を生産するに使用できる。
【００５６】
本明細書中に記載された改変された抗体および抗体の部分をコードする単離された核酸配列に加えて、本来のＣＤＲ−コード配列と相補的な、またはＣＤＲ−コーディング領域の周辺の修飾されたヒト骨格領域に相補的な配列のごとき他のかかる核酸配列が本発明に含まれることに注意すべきである。有用なＤＮＡ配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下ＤＮＡ配列とハイブリダイズするこれら配列を含む。Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）ｐｐ．３８７−３８９を参照されたい。かかるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、６５℃にて４ｘＳＳＣ、しかる後、１時間６５℃にて０．１ｘＳＳＣで洗浄するハイブリダイゼーションである。あるいは、例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は４２℃にて５０％ホルムアミド、４ｘＳＳＣである。好ましくは、これらのハイブリダイズするＤＮＡ配列は少なくとも長さ１８ヌクレオチド、すなわち約ＣＤＲの大きさである。
【００５７】
改変された免疫グロブリン分子はキメラ抗体およびヒト化抗体のごとき作成された抗体を含む改変された抗体をコードできる。所望の改変された免疫グロブリンコーディング領域は、第ＩＸ／ＩＸａ、Ｘ／Ｘａ、ＸＩ／ＸＩａ、ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ、Ｖ／Ｖａ、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子またはトロンビン抗体、好ましくは本発明に提供されるヒト骨格またはヒト免疫グロブリン可変領域のごとき第一の免疫グロブリンパートナーへ挿入された高親和性抗体の抗原特異性を有するペプチドをコードするＣＤＲ−コーディング領域を含む。
【００５８】
好ましくは、第一の免疫グロブリンパートナーは作動可能に、第二の免疫グロブリンパートナーと結合される。第二の免疫グロブリンパートナーは上記に定義され、その第二の抗体領域、例えばＦｃ領域をコードする配列を含んでもよい。また、第二の免疫グロブリンパートナーは、ＬまたはＨ鎖定常領域がフレーム内に、またはリンカー配列の方法により融合されたもう一つの免疫グロブリンをコードする配列も含んでよい。凝固因子の機能的断片または類似体に向けられた作成された抗体は、同一の抗体との結合の促進を引き出すように設計されてもよい。
【００５９】
また、第二の免疫グロブリンパートナーは、第二の免疫グロブリンパートナーが作動可能に慣用的方法により結合する非−タンパク質担体分子を含む上記に定義されたエフェクター剤と結合してもよい。
【００６０】
第二の免疫グロブリンパートナー、例えば、抗体配列およびエフェクター剤間の融合または結合は、いずれの適当な方法、例えば、慣用的な共有またはイオン結合、タンパク質融合、あるいはヘテロ−二官能性架橋剤、例えばカルボジイミド、グルタルアルデヒドなどによってもよい。かかる方法は当該分野では知られており、慣用的化学および生化学の教科書に記載されている。
【００６１】
さらに、単に、第二の免疫グロブリンパートナーおよびエフェクター剤間の所望の広さの空間を供する慣用的なリンカー配列もまた、改変された免疫グロブリンコーディング領域へ構築されてよい。かかるリンカーの設計は当業者にはよく知られている。
【００６２】
さらに、本発明の分子のシグナル配列は発現を促進するために当業者に知られた方法により修飾される。
【００６３】
好ましい改変された抗体は、ｍＡｂ ＢＣ２、例えばｖＨおよびｖＬ鎖の抗原特異性を有する可変Ｈおよび／またはＬ鎖ペプチドまたはタンパク質配列を含む。本発明のさらにもう一つの所望の改変された抗体は、少なくとも１個、好ましくは全ての、残りの配列はヒト源由来のネズミ抗体分子ＢＣ２ Ｈおよび／またはＬ鎖の可変領域のＣＤＲ、またはその機能的断片または類似体を含むアミノ酸配列により特徴付けられる。
【００６４】
さらなる具体例において、本発明の改変された抗体は、付加的薬剤に結合していてもよい。例えば、組換えＤＮＡ技術は、完全な抗体分子のＦｃ断片またはＣＨ２ ＣＨ３ドメインが酵素または他の検出可能な分子（すなわち、ポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子）により置換されている本発明の改変された抗体を生産するに使用されてもよい。
【００６５】
また、第二の免疫グロブリンパートナーは、凝固因子、好ましくは第ＩＸ／ＩＸａ、Ｘ／Ｘａ、ＸＩ／ＸＩａ、ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ、Ｖ／Ｖａ、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子またはトロンビンに対する抗原特異性を有するＣＤＲを含む配列と異種である非−免疫グロブリンペプチド、タンパク質またはその断片と作動可能に結合されてもよい。得られたタンパク質は、発現時に非−免疫グロブリンの抗原特異性および特徴の両方を示してもよい。その融合パートナーの特徴は、例えば、もう一つの結合またはレセプタードメインのごとき機能特徴的、あるいは融合パートナー自体が治療的タンパク質または付加的な抗原特徴的である場合は治療特徴的であってよい。
【００６６】
本発明のもう一つの所望のタンパク質は、ＨおよびＬ鎖全長またはＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片のごときいずれのその必須の断片、Ｈ鎖二量体、またはＦｖまたは単鎖抗体（ＳＣＡ）のごときその最小限の組換え断片、または選択される供与体、例えば、ｍＡｂ ＢＣ１、ＢＣ２、９Ｅ４（２）Ｆ４、１１Ｇ４（１）Ｂ９、ＨＦＸＬＣまたはＨＦＸＩと同一の特異性を有するいずれの他の分子を有する完全な抗体分子を含んでもよい。かかるタンパク質は改変された抗体の形態で使用できるか、あるいはその非融合形態で使用できる。
【００６７】
第二の免疫グロブリンが供与体抗体、例えば、いずれのアイソタイプまたはクラスの免疫グロブリン骨格または定常領域と異なる抗体由来である場合はいつでも、作成された抗体が結果として生じる。作成された抗体は、ある源、例えば、受容体抗体、および供与体由来の１個以上の（好ましくは全ての）ＣＤＲ、例えば、本明細書中に記載の抗第ＩＸ／ＩＸａ、Ｘ／Ｘａ、ＸＩ／ＸＩａ、ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ、Ｖ／Ｖａ、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子またはトロンビン抗体由来の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域および可変骨格領域を含み得る。さらに、核酸またはアミノ酸レベルでの受容体ｍＡｂＬおよび／またはＨ可変部位骨格領域または供与体ＣＤＲ領域の改変、例えば、欠失、置換、または付加は供与体抗体抗原結合特異性を保持するためになされる。
【００６８】
かかる作成された抗体は、凝固因子ｍＡｂ（所望により記載されたごとく修飾される）の可変Ｈおよび／またはＬ鎖の一つ（または両方）または１個以上のＨまたはＬ鎖のＣＤＲを使用するように設計されてもよい。本発明の作成された抗体は自己−制限的な中和活性を示す。
【００６９】
かかる作成された抗体は、選択されるヒト免疫グロブリンまたはサブタイプの骨格領域を含むヒト化抗体あるいは凝固因子抗体機能的断片と融合したヒトＨおよびＬ鎖定常領域を含むキメラ抗体を含んでもよい。適当なヒト（または他の動物）受容体抗体は、慣用的なデータベース、例えば、カバト（ＫＡＢＡＴ）データベース、ロス・アラモス（Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ）データベースおよびスイス・プロテイン（Ｓｗｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ）データベースから、供与体抗体のヌクレオチドおよび核酸配列との相同性により選択できるものであってよい。供与体抗体の骨格領域との相同性（アミノ酸ベースで）により特徴付けられるヒト抗体は、供与体ＣＤＲの挿入のＨ鎖可変骨格領域を供するに適当であり得る。Ｌ鎖可変骨格領域を供与できる適当な受容体抗体は同様にして選択できる。受容体抗体ＨおよびＬ鎖は同一の受容体抗体由来の必要がないことは注意すべきである。
【００７０】
好ましくは、異種の骨格および定常領域は、ＩｇＧ（サブタイプ１ないし４）、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥのごときヒト免疫グロブリンクラスおよびアイソタイプから選択される。しかしながら、受容体抗体はヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む必要はない。例えば、ある遺伝子はヒト免疫グロブリン鎖の部分をコードするＤＮＡ配列がポリペプチドエフェクターまたはレセプター分子のごとき非−ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に融合して構築できる。
【００７１】
特に好ましいヒト化抗体は、選択されるヒト抗体配列の骨格領域に挿入されるＢＣ２のＣＤＲを含む。ヒト化抗体の中和のために、因子ＩＸ抗体Ｈ鎖および／またはＬ鎖可変領域由来の１、２または好ましくは３個のＣＤＲが、後者の抗体の本来のＣＤＲを置き換えて選択されるヒト化抗体配列の骨格領域に挿入される。
【００７２】
好ましくはヒト化抗体において、ヒトＨおよびＬ鎖両鎖の可変ドメインは１個以上のＣＤＲ置換により作成されている。６個のＣＤＲ全て、または６個より少ないＣＤＲを種々の組み合わせで使用することが可能である。好ましくは、６個のＣＤＲ全てが置き換わる。ヒト受容体抗体由来の非修飾Ｌ鎖をＬ鎖として用い、ヒトＨ鎖のみでＣＤＲを置き換えることができる。さらに、別法として、適合するＬ鎖が、もう一つのヒト抗体から、慣用的な抗体データベースにより選択できる。作成された抗体の残りは適当ないずれの受容体ヒト免疫グロブリン由来であってもよい。
【００７３】
従って好ましくは、作成されたヒト化抗体は天然のヒト抗体またはその断片の構造を有し、効果的な治療上使用、例えば、ヒトにおける血栓および塞栓疾病の治療に必要な組み合わされた性質を有する。
【００７４】
最も好ましくは、ヒト化抗体は配列番号：３１、５２または８９に示されるＨ鎖アミノ酸配列を有する。また、配列番号：４４、５７、６２、７４、７８または９９に示されるＬ鎖アミノ酸配列を有するヒト化抗体も最も好ましい。Ｈ鎖が配列番号：３１に示されるアミノ酸配列を有しＬ鎖が配列番号：４４に示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体ＳＢ２４９４１３が特に好ましい。また、Ｈ鎖が配列番号：５２に示されるアミノ酸配列を有しＬ鎖が配列番号：５７に示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体ＳＢ２４９４１５も特に好ましい。また、Ｈ鎖が配列番号：５２に示されるアミノ酸配列を有しＬ鎖が配列番号：６２に示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体ＳＢ２４９４１６も特に好ましい。また、Ｈ鎖が配列番号：５２に示されるアミノ酸配列を有しＬ鎖が配列番号：７４に示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体ＳＢ２４９４１７も特に好ましい。また、Ｈ鎖が配列番号：５２に示されるアミノ酸配列を有しＬ鎖が配列番号：７８に示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体ＳＢ２５７７３１も特に好ましい。また、Ｈ鎖が配列番号：８９に示されるアミノ酸配列を有しＬ鎖が配列番号：９９に示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体ＳＢ２５７７３２も特に好ましい。
【００７５】
当業者により、作成された抗体はさらに、供与体抗体の特異性および高親和性に必ずしも影響することなく可変部位アミノ酸における変化（すなわち類似体）によりさらに修飾できると理解されるであろう。ＨおよびＬ鎖アミノ酸は可変部位骨格またはＣＤＲまたは両者のいずれかにおいて、他のアミノ酸と置換できると期待される。これら置換は供与体抗体またはあるサブグループ由来のコンセンサス配列により供給できる。
【００７６】
さらに、定常領域は、本発明の分子の選択的性質を高めるか、あるいは減じるために変異させられる。例えば、二量体化、Ｆｃレセプターとの結合、または補体と結合活性化する能力（例えば、Ａｎｇａｌら．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，３０，１０５−１０８（１９９３）、Ｘｕら．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６９，３４６９−３４７４（１９９４）、Ｗｉｎｔｅｒら．，ＥＰ３０７４３４Ｂを参照されたい）。
【００７７】
キメラ抗体である改変された抗体は、ヒト免疫グロブリン定常領域と両鎖で関連して、骨格領域を含む非−ヒト供与体抗体Ｈ鎖およびＬ鎖可変領域全体を供することにより上記に記載されたヒト化抗体と異なる。本発明のヒト化抗体に対して付加的な非−ヒト配列を保持するキメラ抗体がヒトにおける重大な免疫反応を引き出せることが期待される。
【００７８】
かかる抗体は以下に記載の血栓および塞栓疾患の予防および治療に有用である。
【００７９】
好ましくは可変Ｌおよび／またはＨ鎖配列およびｍＡＢ ＢＣ２または他の適当な供与体ｍＡｂ、例えば、ＢＣ１、９Ｅ４（２）Ｆ４、１１Ｇ４（１）Ｂ９、ＨＦＸＬＣ、ＨＦＸＩおよびそのコードする核酸配列のＣＤＲが、以下の製法により、本発明の改変された抗体、好ましくはヒト化抗体の構築において利用される。また、同一または同様の技術が本発明の他の具体例を生じるにも用いられる。
【００８０】
選択される供与体ｍＡｂ、例えば、ネズミ抗体ＢＣ２を生産するハイブリドーマは都合よくは、クローニングされ、そのＨおよびＬ鎖可変領域のＤＮＡは当業者に知られた技術、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）記載の技術により得られる。少なくとも、供与体ｍＡｂ結合特異性を保持するに必要な受容体ｍＡｂ Ｌおよび／またはＨ可変部位骨格領域ならびに保持されるヒト免疫グロブリン由来の抗体鎖の免疫グロブリン−由来部分のＣＤＲ−コーディング領域およびその部分を含むＢＣ２の可変ＨおよびＬ領域は、ポリヌクレオチドプライマーおよび逆転写酵素を用いて得られる。ＣＤＲ−コーディング領域は公知のデータベースを用い、他の抗体との比較により同定される。
【００８１】
ついで、マウス／ヒトキメラ抗体が調製され、結合能がアッセイされる。かかるキメラ抗体は、両鎖のヒトＩｇ定常領域に関して、非−ヒト供与対抗体ｖＨおよびｖＬ領域全体を含む。
【００８２】
ヒト抗体由来のＨ鎖可変領域の相同な骨格領域はコンピューター化されたデータベース、例えば、ＫＡＢＡＴ（登録商標）を用いて同定され、ＢＣ２と相同性を有するヒト抗体が受容体抗体として選択される。ヒト抗体骨格内にＢＣ２ ＣＤＲ−コーディング領域を含む合成Ｈ可変領域の配列は、制限部位を組み込む骨格領域内での所望のヌクレオチド置換で設計される。ついで、この設計された配列は長い合成オリゴマーを用いて合成される。あるいは、設計された配列は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）で増幅され間違いを正された重複するオリゴヌクレオチドにより合成できる。適当なＬ鎖可変骨格領域は同様に設計できる。
【００８３】
ヒト化抗体はキメラ抗体から由来してもよく、あるいは好ましくは、ＨおよびＬ鎖由来の供与体ｍＡｂＣＤＲ−コーディング領域を適当に、選択されるＨおよびＬ鎖骨格内に挿入することにより合成的に作られる。あるいは、本発明のヒト化抗体は、標準的な突然変異誘発技術を用いて調製できる。従って、得られたヒト化抗体はヒト骨格領域および供与体ｍＡｂＣＤＲ−コーディング領域を含む。骨格領域が続いて操作されることもある。得られたヒト化抗体は組換え宿主細胞、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯまたはミエローマ細胞内で発現できる。他のヒト化抗体は、他の適当な因子ＩＸ−特異的または他の凝固因子−特異的、自己−制限的な、中和する、高親和性の非−ヒト抗体における技術を用いて調製できる。
【００８４】
慣用的な発現ベクターまたは組換えプラスミドは、宿主細胞内での複製および発現および／または宿主細胞からの分泌を制御する能力のある慣用的な制御配列と作動可能に関連して、これらのコーディング配列を改変された抗体と置換することにより生産できる。制御配列はプロモーター配列、例えば、ＣＭＶプロモーター、および他の公知の抗体由来であってもよいシグナル配列を含む。同様に、相補的な抗体ＬまたはＨ鎖をコードするＤＮＡ配列を有する第二次発現ベクターが生産できる。好ましくは、この第二次発現ベクターは、できる限り各ポリペプチド鎖が機能的に発現されることを保証するためのコーディング配列および選択的マーカーの点以外は第一次ベクターと同一である。あるいは、改変された抗体のＨおよびＬ鎖コーディング配列は単一ベクター上に存在してもよい。
【００８５】
選択される宿主細胞は慣用的手法により第一次および第二次ベクターの両方とともにコトランスフェクトされ（あるいは、単一ベクターにより単にトランスフェクトされ）、組み換えまたは合成ＬおよびＨ鎖の両方を含む本発明のトランスフェクトされた宿主細胞を作り出す。トランスフェクトされた細胞はついで、慣用的手法により培養され、本発明の作成された抗体を生産する。組み換えＨ鎖および／またはＬ鎖の両方の合同体を含むヒト化抗体はＥＬＩＳＡまたはＲＩＡのごとき適当なアッセイによって培養液からスクリーニングされる。同様な慣用的な手法が本発明の他の改変された抗体および分子を構築するに用いられる。
【００８６】
該方法で用いられるクローニングおよびサブクローニング行程に適当なベクターおよび本発明の組成物の構築は当業者により選択できる。アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）またはファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のごとき供給会社から商業的に手に入る例えば、ｐＵＣ１９のごときクローニングベクターｐＵＣシリーズが使用できる。さらに、迅速に複製する能力があり、多数のクローニング部位および選択遺伝子（例えば、抗生物質耐性）を有し、簡単に操作されるいずれのベクターもクローニング用に使用できる。従って、クローニングベクターの選択は本発明の制限因子とはならない。
【００８７】
同様に、本発明によって作成された抗体の発現に用いられるベクターはいずれの慣用的ベクターからも当業者により選択できる。また、ベクターは、選択された宿主細胞内での異種のＤＮＡ配列の複製および発現に向いた（ＣＭＶプロモーターのごとき）選択される制御配列も含む。これらベクターは、作成されたまたは改変された免疫グロブリンコーディング領域をコードする上記記載のＤＮＡ配列を含む。さらに、ベクターは、迅速な操作のための所望の制限部位の挿入により修飾された選択された免疫グロブリンを組み込める。
【００８８】
また、発現ベクターは、異種ＤＮＡ配列、例えば哺乳動物ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）の発現を増幅するに適当な遺伝子によっても特徴付けられる。他の好ましいベクター配列は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）およびベータグロビンプロモーター配列（ｂｅｔａｇｌｏｐｒｏ）のごときポリＡシグナル配列を含む。本明細書中にて有用な発現ベクターは当業者によく知られた手法により合成できる。
【００８９】
かかるベクター、例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、シグナル配列などの成分は、選択された宿主内で組換えＤＮＡの産物の発現および／または分泌を指示する使用につき、商業的または天然の源から得られるか、あるいは公知の方法により合成できる。また、哺乳動物、細菌、昆虫、酵母および真菌発現につき当該分野で知られている多数のタイプの他の適当な発現ベクターもこの目的に選択できる。
【００９０】
また、本発明は、作成された抗体またはその改変された免疫グロブリン分子のコーディング配列を含む組み換えプラスミドでトランスフェクトされた細胞系も含む。また、クローニングおよびこれらクローニングベクターの他の操作に有用な宿主細胞も慣用的である。しかしながら、最も望ましくは、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の種々の株由来の細胞がクローニングベクターの複製および本発明の改変された抗体の構築の他の工程に使用される。
【００９１】
本発明の作成された抗体または改変された抗体の発現に適当な宿主細胞または細胞系は好ましくはＣＨＯ、ＣＯＳ、繊維芽細胞（例えば、３Ｔ３）および骨髄細胞のごとき哺乳動物細胞、より好ましくはＣＨＯまたは骨髄細胞である。ヒト細胞用いられ、従って、分子をヒトグリコシル化パターンで修飾できる。あるいは、他の真核細胞系が用いられてもよい。適当な哺乳宿主細胞および形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび産物生産および精製の方法の選択は当該分野では公知である。例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋら．，を参照されたい。
【００９２】
細菌細胞は本発明の組換えＦａｂの発現に適当な宿主細胞として有用であると証明できる（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１３０，１５１−１８８（１９９２）を参照されたい）。しかしながら、細菌細胞内で発現されたタンパク質が折り畳まれていない、あるいは不適当に折り畳まれた形態で、あるいは非−グリコシル化形態である傾向があるため、細菌細胞内で生産されたいずれの組換えＦａｂも抗原結合能の保持につきスクリーニングされたであろう。細菌細胞によって発現された分子が適当に折り畳まれた形態で生産されていたならば、その細菌細胞は所望の宿主であったであろう。例えば、発現に用いられたイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の種々の株はバイオテクノロジーの分野では宿主細胞としてよく知られる。ビー・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、他の細菌などの種々の株もまた用いられる。
【００９３】
所望の場合は、当業者に知られる酵母細胞の株ならびに昆虫細胞、例えば、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）およびレピドプテラ（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）およびウィルス発現系もまた宿主細胞として有用である。例えば、Ｍｉｌｌｅｒら．，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８，２７７−２９８，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）およびそこに引用された参考文献を参照されたい。
【００９４】
本発明のベクターによる一般的な方法が構築され、本発明の宿主細胞を生産するに必要なトランスフェクション方法およびかかる宿主細胞から本発明の改変された抗体を生産するに必要な培養方法は全て慣用的手法である。同様に、いったん生産されると、本発明の改変された抗体は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む当該分野で標準的な方法により細胞培養液から精製できる。かかる手法は当業者の範囲内であり本発明を限定しない。
【００９５】
ヒト化抗体のさらにもう一つの発現方法は米国特許第４，８７３，３１６号に記載のごときトランスジェニック動物における発現を利用してもよい。これは、トランスジェニックに動物に組み込まれた場合、メスが所望の組換えタンパク質をその乳の中に生産する動物のカゼインプロモーターを用いる発現系に関する。
【００９６】
いったん所望の方法により発現されると、ついで、作成された抗体は、適当なアッセイの使用によりインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での活性を調べられる。現在、慣用的なＥＬＩＳＡアッセイ形式が因子ＩＸまたは他の適当な凝固因子に対して作成された抗体の定性的および定量的結合を評価するに用いられる。さらに、他のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）アッセイもまた、引き続く、通常の除去機構の代わりに体内での作成された抗体の耐性を評価するに行われるヒト臨床試験に先立ち、中和能を実証するに用いられる。
【００９７】
ＢＣ２から調製されるヒト化抗体につき記載の方法に従い、当業者もまた、本明細書中に記載の他の供与体抗体、可変配列およびＣＤＲペプチドからヒト化抗体を構築できる。作成された抗体は、作成された抗体の受容者により潜在的に「自己」として認識される可変領域骨格配列を有して生産できる。可変領域骨格に対するわずかな修飾が、受容者にとってかなり増加した免疫原性なしで抗原結合を大きく増加させられる。かかる作成された抗体は、効果的にヒトの凝固因子−介在疾患を治療できる。
【００９８】
本発明はまた、有効量の自己制限的な中和活性を有する抗−凝固因子モノクローナル抗体を投与することを含む動物、特にヒトの血栓の阻害方法にも関する。好ましくは、凝固因子は固有のまたは共通の凝固経路由来である。最も好ましくは、抗−凝固因子モノクローナル抗体は、抗−第ＩＸ因子、抗−第ＩＸａ因子、抗−第Ｘ因子、抗−第Ｘａ因子、抗−第ＸＩ因子、抗−第ＸＩａ因子、抗−第ＶＩＩＩ因子、抗−第ＶＩＩＩａ因子、抗−第Ｖ因子、抗−第Ｖａ因子、抗−第ＶＩＩ因子、抗−第ＶＩＩａ因子または抗−トロンビンである。ｍＡｂは、本明細書中に記載の１個以上の作成された抗体または改変された抗体またはその断片を含む。
【００９９】
あるいは、アセチルサリチル酸が抗−凝固因子モノクローナル抗体と組み合わされて投与できる。ある場合には、組合せ治療が抗−凝固因子モノクローナル抗体の治療的有効量を減じる。
【０１００】
本発明の分子の使用により誘導された治療反応は、各凝固因子との結合および引き続く自己制限的な凝固カスケードの阻害により生じる。従って、本発明の分子は、治療利用に適当な製剤および処方における場合は、心筋梗塞、不安定アンギナ、心棒房細動、発作、腎障害、肺塞栓症、深静脈血栓および人工器官およびプロテーゼ移植に関連するが、それに限定されない異常な凝固活性の疑いまたは経験のある患者にかなり望ましい。
【０１０１】
本発明の改変された抗体、その抗体および断片もまた、本発明の作成された抗体に対する疾患の原因である他のマーカー（エピトープ）と反応する他の抗体、特にヒトｍＡｂと共に用いられる。
【０１０２】
本発明の治療薬は、約１日ないし約３週間または必要に応じて異常な凝固疾患の治療に望ましいと信じられる。このことは、最近使用された抗凝固剤ヘパリンおよびワルファリンよりかなりの進歩を表す。治療の量および期間はヒト循環における本発明の分子の相対期間に関し、患者の治療されるべき疾患および一般的な健康状態に依存して当業者により調整できる。
【０１０３】
本発明の治療薬の投与形式は薬剤を宿主に送達するいずれの適当な経路でもよい。本発明の改変された抗体、抗体、作成された抗体およびその断片および医薬組成物は特に非経口投与、すなわち、皮下、筋肉内、静脈内または経鼻的投与に有用である。
【０１０４】
本発明の治療薬は、医薬上許容される担体内に有効成分として有効量の本発明の作成された（例えばヒト化）抗体を含む医薬組成物として調製できる。あるいは、本発明の医薬組成物はまた、アセチルサリチル酸も含む。本発明の予防薬において、作成された抗体を含む好ましくは生理学的ｐＨに緩衝された注射用に用意された形態の水溶性懸濁液または水溶液が好ましい。非経口投与用の組成物は、通常、本発明の作成された抗体の溶液または医薬上許容される担体、好ましくは水溶性担体に溶解したそのカクテルを含むであろう。例えば、０．４％セーライン、０．３％グリシンなどの種々の水溶性担体が用いられる。これらの溶液は滅菌され一般に粒子物質がない。これら溶液は、慣用的なよく知られた滅菌手法（例えば、濾過）により滅菌される。組成物は、ｐＨ調整および緩衝液などのごときおおよその生理的条件に必要な医薬上許容される補助物質を含む。かかる医薬処方における本発明の抗体濃度は、広範囲に、すなわち、体重につき約０．５％未満から、通常は体重につき１％または少なくとも１％、１５または２０％まで変化し、選択される投与様式に従って、まず溶液体積、粘度などに基づき選択されるであろう。
【０１０５】
従って、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝液、および約１ｎｇないし約１００ｍｇの間、例えば、約５０ｎｇないし３０ｍｇ以上、好ましくは約５ｍｇないし約２５ｍｇの本発明の作成された抗体を含むように調製される。同様に、静脈内点滴用の本発明の医薬組成物は、約２５０ｍｌの滅菌リンゲル液、および約１ｍｇないし約３０ｍｇ、好ましくは５ｍｇないし約２５ｍｇの本発明の作成された抗体を含むように作られる。非経口投与される組成物の実際の調製方法は良く知られているか、あるいは当業者には明らかであり、詳細には、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」，１５ｔｈｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａに記載される。
【０１０６】
医薬製剤の形態の場合、本発明の治療薬剤は単位投薬形で存在することが好まれる。適当な治療有効量は、当業者により迅速に決定できる。ヒトまたは他の動物における血栓または塞栓障害を効果的に治療するために、ｋｇ体重あたり一回用量約０．１ｍｇないし約２０ｍｇの本発明のタンパク質または抗体が非経口的に、好ましくは静脈内または筋肉内投与されるべきである。必要であれば、かかる用量が血栓反応の期間、医師により適当に選択された適当な時間間隔で繰り返される。
【０１０７】
本明細書中に記載の抗体、改変された抗体またはその断片は貯蔵のため凍結乾燥でき使用前に適当な担体中に復元できる。この手法は、慣用的な免疫グロブリンとともに効果的であり、当該分野で知られた凍結乾燥および復元手法が用いられる。
【０１０８】
今回、本発明は以下の具体的、非−制限的な実施例の記載と共に記載されるであろう。
【実施例１】
【０１０９】
抗−第ＩＸ因子モノクローナル抗体の調製およびスクリーニング
メスＢａｌｂ／Ｃマウスに、Ｊｅｎｎｙ，Ｒ．ら．，Ｐｒｅｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６，２２７−２４５（１９８６）に記載の精製されたヒト第ＩＸ因子を注射した。典型的には、各マウスは、リン酸−緩衝セーライン（ＰＢＳ）０．１５ｍｌに溶解し、フロイントの完全アジュバンド０．１５ｍｌと混合したタンパク質１００ｕｇを初期注射された。フロイントの不完全アジュバンド０．１５ｍｌと共にＰＢＳ０．１５ｍｌ中のタンパク質５０ｕｇのブースター免疫化が２−３ヶ月間に渡り約隔週でなされた。最終ブースト後、マウスは、脾臓／骨髄細胞融合前に３日ＰＢＳ中因子ＩＸ ５０ｕｇを受けた。脾臓細胞を免疫化マウスから単離し、Ｏｉ，Ｖ．Ｔ．ら，「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｍｉｃｈｅｌｌ，Ｂ．Ｂ．およびＳｈｉｇｉｉ，Ｓ．Ｍ．，ｅｄｓ．，Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏに記載のポリエチレングリコールを用いてＮＳ−１骨髄細胞と融合した（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ら．，Ｅｕｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，２９２−２９５（１９７６））。融合に続き、細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、アリコートを腹膜洗浄細胞−調整培地を含む２４−穴プレート４枚の各穴に置いた。翌日、各穴に１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地中２ｘ１０−４Ｍヒポキサンチン、８ｘ１０−７Ｍアミノプテリンおよび３．２ｘ１０−５Ｍチミジン１．０ｍｌを加えた。細胞は、３−４日毎に培地の半分を除去し、１ｘ１０−４Ｍヒポキサンチンおよび１．６ｘ１０−５Ｍチミジンを含む新鮮培地と交換することにより培養した。
【０１１０】
約２週後、各穴からハイブリドーマ培地１．０ｍｌを除去し、Ｊｅｎｎｙ，Ｒ．Ｊら．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２２，４００−４１６（１９９３）に記載のＥＬＩＳＡアッセイを用いて抗−第ＩＸ因子抗体を試験した。簡単には、第ＩＸ因子を９６−穴マイクロプレートのプラスチック穴に固定した。次いで、ハイブリドーマ上清または精製抗体の希釈液を穴内で培養した。穴を洗浄し、抗体−抗原複合体の存在を、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよび色素物質ｏ−ジアニシジンを包合したヤギ抗−マウス免疫グロブリン第二抗体で検出した。
【０１１１】
抗−第ＩＸ因子抗体を含む穴を制限希釈によりサブクローニングし、９６−穴プレート内で生育させた。クローン化されたハイブリドーマ細胞培養液からの上清を上記に記載のＥＬＩＳＡアッセイにより第ＩＸ因子に対する抗体をスクリーニングし、陽性ハイブリドーマからの細胞を膨張させ、凍結し、液体窒素中に貯蔵し、次いでマウス腹水癌として生育させた。
【実施例２】
【０１１２】
凝固における抗−凝固因子抗体の自己−制限的効果
ヒト血漿の活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）に対する抗−凝固因子抗体の増加する濃度の効果をフィブロメーター（ｆｉｂｒｏｍｅｔｅｒ）（メリーランド州、コッキスビル、ベクトン−ディキンソン・マイクロバイオロジー・システムズ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｏｋｅｙｓｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）で、バクスター（Ｂａｘｔｅｒ）参照方法ＬＩＢ０２９３−Ｊ、３／９３改訂（ニュージャージー州、エジソン、バクスター・サイエンティフィック（Ｂａｘｔｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を用いて測定した。
【０１１３】
実験開始前に、５ｍｌ管中の０．０２Ｍ ＣａＣｌ２ ２ないし３ｍｌをフィブロメーターの加熱したチャンバー内に置いた。ヒト血漿試料を新しく引き抜き氷上に置くか、あるいは、ヘモスタシス・レファランス・プラズマ（Ｈｅｍｏｓｉｔａｓｉｓ Ｒｅｆｅｒｎｃｅ Ｐｌａｓｍａ）（コネチカット州、グリーンウィック、アメリカン・ダイアグノスティクス（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，Ｃｏｎｎｅｔｉｃｕｔ））の製造者推奨により復元した。
【０１１４】
ブタ腸粘膜からの非分画ヘパリン（ミズーリ州、セント・ルイス、シグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ））、ブタ腸粘膜からの低分子量ヘパリン（ロベノックス（Ｌｏｖｅｎｏｘ（登録商標））、エノキサパリンナトリウム、ペンシルバニア州、コレゲビル、ローン−プーレンク・ローラー・ファーマシューティカルズ（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃｏｌｌｅｇｅｖｉｌｌｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ））またはｍＡｂ抗凝固剤を約５０ｕＭスットク溶液として調製し、供試血漿中に直接連続希釈した。抗凝固剤なしの血漿を含むブランクを参照として含んだ。
【０１１５】
２個のフィブロチューブ（ｆｉｂｒｏＴｕｂｅ（登録商標））フィブロメーター（ｆｉｂｒｏｍｅｔｅｒ）カップを供試血漿１００ｕｌまたは抗凝固剤入りの供試血漿１００ｕｌおよびアクチン活性化ケファロプラスチン試薬（アクチン試薬、エラグ酸中のウサギ脳ケファリンから、バクスター・サイエンティフィック（Ｂａｘｔｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から入手できる）でそれぞれ満たし、３７℃にてフィブロメーター（ｆｉｂｒｏｍｅｔｅｒ）の穴に置いた。
【０１１６】
１分後、アクチン試薬１００ｕｌを血漿を含むカップに移し、中身をピペットで数回混合した。３分インキュベーション後、あらかじめ３７℃で加温したＣａＣｌ２ １００ｕｌをオートマチックピペット／タイマー−トリガー（Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｐｏｐｅｔｔｅ／Ｔｉｍｅｒ−ｔｒｉｇｇｅｒ）（ベクトン−ディクソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｓｏｎ））を用いて、血漿−アクチン試薬混合液に添加した。凝固時間に注意し、図１の結果が総アッセイ体積３００ｕｌ中抗凝固剤の最終濃度の関数の凝固時間として示される。アッセイにおける第ＩＸ因子の名目濃度は３０−４０ｎＭである。
【０１１７】
図１に示される結果はマウス抗−第ＩＸ因子ｍＡｂ ＢＣ１およびＢＣ２の増加する濃度のａＰＴＴ凝固時間に対する効果を示す。両ｍＡｂはａＰＴＴを延長することにより凝固を阻害し、両ｍＡｂはａＰＴＴに対し、最終飽和効果に達する。ＩＣ５０値はＢＣ１およびＢＣ２それぞれにつき同様な〜３５ｎＭおよび５０ｎＭであるが、２個の抗体に対する最大反応の違いが特色付けられる。ＢＣ１の飽和濃度はａＰＴＴ時間を約５０％、〜４０秒まで増加する。他方、ＢＣ２はａＰＴＴ時間を３．５倍、約９０秒まで増加する。ヘパリンを用いる抗凝固治療において使用される治療標的ゾーンが強調される。この結果は、２個のｍＡｂがヘパリン治療ａＰＴＴ範囲の限界幅を確定することを示す。
【０１１８】
ｍＡｂ ＢＣ１およびＢＣ２の性質は表Ｉに要約する。各ＢＣ ｍＡｂは、チモーゲン、第ＩＸ因子ならびに活性プロテアーゼ、第ＩＸａ因子、を認識するが、ＢＣ２だけは、チモーゲン活性化ならびにプロテアーゼ活性の両者を阻害できる。ＢＣ１およびＢＣ２はカニクイザル第ＩＸ因子と交差反応することが分かった。さらに、ＢＣ２もまた、ラット第ＩＸ因子と交差反応した。
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
図２に示された結果は、抗−第ＩＸ因子ｍＡｂ ９Ｅ４（２）Ｆ４および１１Ｇ４（１）Ｂ９の増加する濃度のａＰＴＴ凝固時間に対する効果を示す。アッセイ用の血漿は、通常濃度の二分の一に希釈し、初期ａＰＴＴ、４５秒とした。両ｍＡｂはａＰＴＴの延長により凝固を阻害し、両ｍＡｂはａＰＴＴに対する最終飽和効果に達する。９Ｅ４（２）Ｆ４および１１Ｇ４（１）Ｂ９の飽和濃度は、ａＰＴＴを９Ｅ４（２）Ｆ４で〜９０ないし１００秒および１１Ｇ４（１）Ｂ９で〜８０秒に増加する。この結果は、２個のｍＡｂはヘパリン治療ａＰＴＴ範囲の上限であることを示す。
【０１２１】
図３に示された結果は、抗−第Ｘ因子ｍＡｂ ＨＦＸＬＣ（対Ｌ鎖エピトープ）、ＨＦＸＨＣ（対Ｈ鎖エピトープ）および抗−第ＸＩ因子ｍＡｂ ＨＦＸＩの増加する濃度のａＰＴＴ凝固時間に対する効果を示す。これらｍＡｂはエンザイム・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ）（インディアナ州、サウス・ベンド（Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ，ＩＮ））から得た。ｍＡｂＨＦＸＬＣおよびＨＦＸＩはａＰＴＴの延長により凝固を阻害し、両ｍＡｂはａＰＴＴに対する最終飽和効果に達する。ＨＦＸＬＣのＩＣ５０値は〜４０ｎＭ；飽和濃度は、ａＰＴＴを６０秒まで増加させる。ＨＦＸＩのＩＣ５０値は〜２０ｎＭ；飽和濃度は、ａＰＴＴを１００秒まで増加させる。この結果はＨＦＸＬＣはヘパリン治療ａＰＴＴ範囲内にある一方ＨＦＸＩはヘパリン治療範囲の上限に下がることを示す。ｍＡｂ ＨＦＸＨＣはａＰＴＴ凝固時間に何の影響も与えない。
【０１２２】
ａＰＴＴの自己−制限的な延長もまた、第ＶＩＩＩ因子に対する抗体、第ＩＸａ因子に対する共因子に観察される。例えば、抗−ヒト第ＶＩＩＩ因子抗体、アフィニティー・バイオロジカルズ・インク（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）から購入したＳＡＦ８Ｃ−ＩＧはａＰＴＴを最大約６５秒まで増加させた。ａＰＴＴの最大延長の二分の一は約１００ｎＭの抗体で達成された。
【実施例３】
【０１２３】
ラット血栓モデルにおけるネズミ第ＩＸ因子ｍＡｂの能力
動脈血栓予防における抗−第ＩＸ因子抗体の能力を評価するために、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら．，Ｊ．Ｃａｒｄｉｏ．Ｐｈａｒｍ．２２，５２６−５３３（１９９３）に報告されたラット冠動脈血栓モデルを採用した。このモデルは、冠動脈表面にＦｅＣｌ３溶液を適用することにより生じる酸素ラジカルによる冠動脈内皮の分節傷害から成る。
【０１２４】
簡単には、ラットを、ペントバルビトンナトリウムで麻酔し、頚静脈に静脈注射のカニューレを挿入し、左大腿動脈に血圧および心拍数モニターのカニューレを挿入した。冠動脈は外科的切開術という無菌的手法により首で単離し、血流測定用マグネチックフロープローブ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｌｏｗ ｐｒｏｂｅ）を装備した。安定化期間後、ベースラインパラメーターを以下の変数により確立した：冠動脈血流、動脈圧、心拍数、活性部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）およびプロトロンビン時間（ＰＴ）。しかる後に、５０％ＦｅＣｌ３溶液に浸したあらかじめ測定したワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）濾紙を内皮細胞を完全に傷害するため１５分間冠動脈においた。ＦｅＣｌ３に浸した濾紙を除去後、６０分以上放置して実験は完了した。実験の終わりに、動脈血栓を動脈から抽出し、重さを量った。
【０１２５】
冠動脈傷害の着手に先立ち、全薬剤を１５分投与した。以下の処理を試験し、第ＩＸ因子ｍＡｂ ＢＣ２と比較した。
【０１２６】
１．ヘパリン：１５、３０、６０または１２０Ｕ／ｋｇボーラス、その後、それぞれ０．５、１、２または４Ｕ／ｋｇ／分、６０分以上の注入
２．アセチルサリチル酸（ＡＳＡ、アスピリン）：５ｍｇ／ｋｇボーラス
３．抗−第ＩＸ因子ｍＡｂ ＢＣ２：１、３または６ｍｇ／ｋｇボーラス、その後、それぞれ０．３、１、または２ｕｇ／ｋｇ／分、６０分以上の注入
４．ヘパリン：３０Ｕ／ｋｇボーラス＋１Ｕ／ｋｇ／分＋５ｍｇ／ｋｇＡＳＡ
５．抗−第ＩＸ因子ｍＡｂ ＢＣ２：１ｍｇ／ｋｇ＋０．３Ｕｇ／ｋｇ／分＋５ｍｇ／ｋｇＡＳＡ
【０１２７】
図４および５は、ヘパリン、ＡＳＡおよび抗−第ＩＸ因子ｍＡｂ ＢＣ２のａＰＴＴに対する（図４）およびＰＴに対する（図５）効果を示すことにより抗−凝固因子／血栓レジメの比較薬理学を示す。
【０１２８】
出血素因、ａＰＴＴの鍵となる指標は、能力評価の一次判定基準対研究に用いられた抗−凝固／血栓薬剤の出血傾向として用いられた。図４の結果は、試験限界を超えて２種のより高い用量で、凝固時間の最大延長でヘパリンによるａＰＴＴの用量依存性延長を示す。ＡＳＡ単独では、有意にａＰＴＴを増加させないが、ヘパリンと組み合わせると特色付けられた相乗効果が見られた。第ＩＸ因子ｍＡｂは高用量においてさえ、ａＰＴＴに対する効果があまり大きくなく、凝固時間の増加は、臨床的に行われた標準的な抗−凝固剤の３倍を超えなかった。とりわけ、ＡＳＡと組み合わされた低用量の第ＩＸ因子ｍＡｂ ＢＣ２はａＰＴＴを変化させなかった。
【０１２９】
図５では、データはＰＴもまた２種の高用量で、有意にヘパリンにより、およびＡＳＡ−ヘパリンの組み合わせによって、延長されるが、いずれの第ＩＸ因子ｍＡｂ 用量単独、またはＡＳＡとの組み合わせでは延長されなかったことを示す。
【０１３０】
ヘパリン、ＡＳＡおよび第ＩＸ因子ｍＡｂの冠動脈閉塞に対する効果が図６に示される。結果は、傷害に反応して全ての担体−処理動物の冠動脈が閉塞することを示す。ヘパリンは、依存的に冠動脈塞栓を阻害する。最高用量では、ヘパリンは完全に冠動脈塞栓を阻害する；しかしながら、この量では、凝固は開始し得なかった。ＡＳＡ単独では、冠動脈塞栓にはわずかな効果しかなかった。ヘパリンと組み合わせたＡＳＡもまた完全には冠動脈塞栓を阻害できなかった。第ＩＸ因子ｍＡｂは、臨床的に所望の標的より凝固を延長しない２種の高用量で完全に冠動脈塞栓を阻害した。主として、開存性のみを保証できない低用量の第ＩＸ因子ｍＡｂでは、ＡＳＡと組み合わせて投与した場合、冠動脈塞栓の完全阻害を示した。
【０１３１】
ヘパリン、ＡＳＡおよび第ＩＸ因子ｍＡｂの血栓重量に対する効果を図７に示す。ヘパリンは用量−依存的に冠動脈の血栓量を減じた。しかしながら、いく分かの残存する血栓が、まだ凝固の完全阻害の代わりに冠動脈において見つけられた。ＡＳＡ単独またはヘパリンとの組み合わせでは（３０Ｕ／ｋｇレジメ）血栓重量には部分的効果しかなかった。第ＩＸ因子ｍＡｂは血栓量を用量−依存的に減じ、高用量は実質的には完全に血栓形成を阻害した。さらに、低用量の抗−第ＩＸ因子ｍＡｂおよびＡＳＡの組み合わせ、凝固指標に有害な影響を与えずに冠動脈塞栓を完全に阻害したレジメは、完全に血栓形成を阻害した。
【０１３２】
ラット冠動脈血栓モデルにおいてなされた研究は明らかに、高度に血栓のできた動脈傷害モデルにおける血栓の阻害における第ＩＸ因子ｍＡｂの能力を示す。とりわけ、第ＩＸ因子ｍＡｂの能力はａＰＴＴにより定義される所望の治療的抗凝固剤標的内で示された。さらに、ヘパリン、最近の標準的な抗凝固剤は、非−凝固血を生成する程度まで厳しく凝固を妥協させる量でのみ第ＩＸ因子ｍＡｂと同等の能力に達した。興味深いことに、ヘパリンとのＡＳＡ結合処理により得られた相乗作用および共力作用もまた、ＡＳＡが抗−第ＩＸ因子ｍＡｂと与えられた場合にも示された。しかしながら、結果、抗−血栓および抗−凝固の両効果の相乗作用が生じたヘパリンおよびＡＳＡの組み合わせとは異なり、第ＩＸ因子ｍＡｂおよびＡＳＡの組み合わせは、エキソビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で血液凝固パラメーターに矛盾のない効果を与えないで抗−血栓能力の相乗作用を生じた。まとめると、データはヘパリン、ＡＳＡまたはヘパリンおよびＡＳＡの組み合わせと比較して第ＩＸ因子ｍＡｂのすぐれた抗血栓能力を示す。
【実施例４】
【０１３３】
ラット血栓モデルの走査型電子顕微鏡
ラット冠動脈の分節を、模擬の、塩化鉄のみ、および塩化鉄＋６ｍｇ／ｋｇ第ＩＸ因子抗体、３／群、塩化鉄適用１５分後から集めた。動脈をホルムアルデヒド潅流により固定し、外傷面の上部および下部を結合した。固定した動脈を脱水し、ヘキサメチルジシラザン中でインキュベートし、デシケーター中で乾燥した。乾燥した動脈を縦に開き、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）スタブ上に置き、金でスパッタリングコートした。
【０１３４】
模擬動脈のＳＥＭは、稀にしか散乱しない血小板内の正常な内皮を本質的に示した。おそらく外科的処理の間の機械的な損傷の結果の内皮に２−３の破壊があり、底にある基底膜が血小板の広がりにより覆われていた。模擬ラットには血栓形成の証拠は何も見られなかった。
【０１３５】
塩化鉄処理した動脈のＳＥＭは、管の内腔の大部分を占める大きな壁在性血栓を示した。血栓は、凝集した血小板、赤血球および無定形、原線維のタンパク様物質から成った。タンパク様物質はフィブリンと調和した。動脈内皮はほぼ大きな血栓に覆い隠された。見えるところは、塩化鉄処理された領域の上にある内皮が多数の吸着血小板および無定形タンパク様物質で覆われた。
【０１３６】
第ＩＸ因子抗体でも処理されたラット由来の塩化鉄処理した動脈のＳＥＭは、主として血栓のない管面を示した。塩化鉄処理した領域の上にある内皮は、広範な損傷を示し、吸着血小板および血小板凝集で覆われた面もあったが、タンパク様物質はほとんどまたは全くなかった。
【実施例５】
【０１３７】
抗−第ＩＸ因子ｍＡｂ ＢＣ２ ＨおよびＬ鎖ｃＤＮＡ配列分析
トリリエージェント（ＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ）（オハイオ州、シンシナティー、モレキュラー・リサーチ・センター・インク（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ））を用いて、製造者のプロトコルにより総ＲＮＡを精製した。ＲＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、０．５％ＳＤＳに溶解し、０．５Ｍ ＮａＣｌに調整した。ポリＡ＋ＲＮＡをダイナビーズ・オリゴ（ｄＴ）２５（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｏｌｏｇｏ （ｄＴ）２５）（ニューヨーク州、レイクサクセス、ダイナル・エー・エス（Ｄｙｎａｌ Ａ．Ｓ．，Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ））で、製造者プロトコルにより単離した。ポリＡ＋ＲＮＡをビーズから溶出し、ＴＥ緩衝液に再懸濁した。ＲＮＡ１００ｎｇのアリコート１２個を製造者説明書（ボーアリンジャー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）カタログ番号１４８３−１８８）によって、ｄＴオリゴをプライマーとして用い、ＲＴ−ＰＣＲキットで逆転写した。Ｈ鎖は６個のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＰＣＲ増幅を、ネズミＩｇＧ２ａヒンジプライマー（配列番号：１）およびＨ鎖シグナル配列プライマー（配列番号：２）を用いて２５サイクルで行った。同様に、Ｌ鎖は、ネズミカッパプライマー（配列番号：３）および変質したＬ鎖シグナル配列プライマー（配列番号：４）を用いて２５サイクルで行われた。１２個の増幅の各々からのＰＣＲ産物はＰＣＲ２０００ベクター（ティーエークローニングキット（ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ）インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号Ｋ２０００−０１）に連結した。組み換えクローンのコロニーをランダムに取り、プラスミドＤＮＡのミニ調製をＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７，１５１３（１９７９）に記載のアルカリ抽出法を用いて行った。単離されたプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、０．８％アガロースゲル上分析した。適当な大きさ、すなわち、Ｈ鎖で〜７００ｂｐおよびＬ鎖で〜７００ｂｐの二本鎖ｃＤＮＡインサートをサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）法の修飾法で配列決定した。１２個のＨおよびＬ鎖全ての配列を比較し、コンセンサスＢＣ２Ｈ可変領域配列（配列番号：５）およびコンセンサスＢＣ２Ｌ鎖可変領域配列（配列番号：６）が生じた。
【０１３８】
ＢＣ２Ｈ鎖可変領域ｃＤＮＡの配列分析により、１２１個のアミノ酸配列（配列番号：７）をコードする３６３個のヌクレオチドのオープンリーディングフレームが示された。Ｈ鎖ＣＤＲ１、２および３配列をそれぞれ、配列番号：８、９および１０に載せた。
【０１３９】
ＢＣ２Ｌ鎖可変領域ｃＤＮＡの配列分析を１０７個のアミノ酸配列（配列番号：１１）をコードする３２１個のヌクレオチドのオープンリーディングフレームを示した。Ｌ鎖ＣＤＲ１、２および３配列をそれぞれ、配列番号：１２、１３および１４に載せた。
【実施例６】
【０１４０】
ヒト化抗体
ＳＢ２４９４１３、ＳＢ２４９４１５、ＳＢ２４９４１６、ＳＢ２４９４１７、ＳＢ２５７７３１およびＳＢ２５７７３２に設計された６個のヒト化抗体をヒト抗体骨格に上記に記載のマウスＣＤＲを含むように設計した。
【０１４１】
ＳＢ２４９４１３
ＳＢ２４９４１６はＨ鎖Ｆ９ＨＺＨＣ１−０およびＬ鎖Ｆ９ＨＺＨＣ１−０を含む。合成可変領域ヒト化Ｈ鎖Ｆ９ＨＺＨＣ１−０を、免疫グロブリンＲＦ−ＴＳ３’ＣＬ（カバト（Ｋａｂａｔ）データベースにＫａｂｐｒｏ：Ｈｈｃ１０ｗと同定されたＣａｐｒａ，Ｊ．Ｄ．ら．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８６，１３２０−１３２８（１９９０））および上記記載のＢＣ２Ｈ鎖ＣＤＲから得られたＨ鎖の最初の３個の骨格領域を用いて設計した。ＣＤＲ提示に影響するような骨格アミノ酸置換はなかった。４個の重複する合成オリゴヌクレオチドが生じ（配列番号：１５、１６、１７および１８）、それは、アニールし、伸長すると、Ｈ鎖可変領域全体を表しＣＤＲ３を含むアミノ酸（配列番号：１９および２０）をコードする。次いで、この合成遺伝子をＰＣＲプライマー（配列番号：２１および２２）を用いて増幅し、ｐＣＲ２０００ベクター（ティーエークローニングキット（ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ）、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号Ｋ２０００−０１）に連結し、Ｓｐｅ Ｉ、Ｋｐｎ Ｉ制限消化から単離した。可変領域の最初の５個のアミノ酸を含むキャンパスシグナル配列（配列番号：２３および２４）をコードする第二ＤＮＡ断片を、２個のプライマー（配列番号：２６および２７）によるヒト化抗−呼吸系シンシチウムウィルスＨ鎖（配列番号：２５）をコードする構築物の適当な領域をＰＣＲ増幅および制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ、Ｓｐｅ Ｉでの切断により作った。生じた２個の断片を、ヒトコンセンサス骨格４およびＩｇＧ１定常領域の残りを含むＥｃｏ ＲＩ、Ｋｐｎ Ｉで切断したｐＦＨＺＨＣ２−６ｐＣＤ哺乳動物細胞発現ベクターに連結した。ベクターは、公開された国際出願第９４／０５６９０号に記載のｐＦＨＺＨＣ２−３ｐＣＤの単一のアミノ酸変異を含んだ。骨格２の最後の残基（残基４９）が、Ｘｂａ ＩおよびＥｃｏ Ｒ５によるｐＦＨＺＨＣ２−３ｐＣＤの切断および２個の合成オリゴヌクレオチド（配列番号２８および２９）から生じるリンカーの挿入によりＳｅｒからＡｌａに変異した。Ｆ９ＨＺＨＣ １−０インサートの配列は配列番号：３０および３１に示す。
【０１４２】
合成可変領域ヒト化Ｌ鎖Ｆ９ＨＺＬＣ １−０は、免疫グロブリンＬＳ８’ＣＬ（Ｃａｒｍａｃｋら．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９，１６３１−１６４３（１９８９） カバト（Ｋａｂａｔ）データベースにＫａｂｐｒｏ：Ｈｋｌ３１８と同定された）および上記記載のＢＣ２Ｌ鎖ＣＤＲから得られたヒトＬ鎖の骨格領域を用いて切断された。ＣＤＲ提示に影響するような骨格アミノ酸置換はなかった。２個の重複する合成オリゴヌクレオチドが生じ（配列番号：３２および３３）、それは、アニールし、伸長すると、Ｌ鎖可変領域を表すアミノ酸（配列番号：３４および３５）をコードする。次いで、この合成遺伝子をＰＣＲプライマー（配列番号：３６および３７）を用いて増幅し、ｐＣＲ２０００ベクター（ティーエークローニングキット（ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ）、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号Ｋ２０００−０１）に連結し、Ｓｃａ Ｉ、Ｓａｃ ＩＩ制限消化から単離した。可変領域の最初の２個のアミノ酸を含むキャンパスシグナル配列をコードする第二ＤＮＡ断片（配列番号：３８および３９）を、２個のプライマー（配列番号：２６および４０）によるヒト化抗−呼吸系シンシチウムウィルスＨ鎖（配列番号：２５）をコードする構築物の適当な領域のＰＣＲ増幅および制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ、Ｓｃａ Ｉでの切断により作った。生じた２個の断片を、ヒト骨格４およびカッパ定常領域の残りを含むＥｃｏ ＲＩ、Ｓａｃ ＩＩで切断したｐＦＨｚＬＣ１−２ｐＣＮ哺乳動物細胞発現ベクターに連結した。ベクターは、公開された国際出願第９４／０５６９０号に記載のｐＦＨＺＬＣ１−１ｐＣＮの単一のアミノ酸変異を含んだ。骨格２の残基が、Ｓｍａ ＩおよびＫｐｎ ＩによるｐＦＨＺＬＣ１−２ｐＣＮの切断および２個の合成オリゴヌクレオチド（配列番号４１および４２）から生じるリンカーの挿入によりＳｅｒからＰｒｏに変異した。Ｆ９ＨＺＨＣ １−０インサートの配列は配列番号：４３および４４に示す。
【０１４３】
ＳＢ２４９４１５
ＳＢ２４９４１５はＨ鎖Ｆ９ＨＺＨＣ１−１およびＬ鎖Ｆ９ＨＺＬＣ１−１を含む。これらＨおよびＬ鎖はそれぞれ、Ｆ９ＨＺＨＣ１−０およびＦ９ＨＺＬＣ１−０に基づくが、ＣＤＲ提示に影響する骨格アミノ酸置換を有する。
【０１４４】
Ｈ鎖Ｆ９ＨＺＨＣ１−１は、ＣＤＲ提示に影響するような骨格アミノ酸置換を有する。２個の重複する合成オリゴヌクレオチドが生じ（配列番号：４５および４６）、それは、アニールし、伸長すると、改変されたＨ鎖可変領域改変部分を表すアミノ酸（配列番号：４７および４８）をコードする。次いで、この合成遺伝子をＰＣＲプライマー（配列番号：４９および５０）を用いて増幅し、ｐＣＲ２０００ベクター（ティーエークローニングキット（ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ）、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号Ｋ２０００−０１）に連結し、Ｅｃｏ ＮＩ、Ｋｐｎ Ｉ制限消化から単離した。この断片をＥｃｏ ＮＩ、Ｋｐｎ Ｉ 消化したＦ９ＨＺＨＣ１−０（配列番号：３０）ベクターに連結した。Ｆ９ＨＺＨＣ１−１インサートの配列は配列番号：５１および５２に示す。
【０１４５】
Ｆ９ＨＺＬＣ １−１は、ＣＤＲ提示に影響するような４個の骨格アミノ酸置換を有する。２個の重複する合成オリゴヌクレオチドが生じ（配列番号：５３および５４）、それは、アニールすると、Ｋｐｎ ＩおよびＢａｍ ＨＩ粘着末端を有し、Ｌ鎖可変領域の改変部分を表すアミノ酸（配列番号：５５）をコードする。Ｆ９ＨＺＬＣ１−０（配列番号：４３）を制限酵素Ｋｐｎ ＩおよびＢａｍ ＨＩで消化し、合成ＤＮＡに連結した。Ｆ９ＨＺＨＣ １−１インサートの配列は配列番号：５６および５７に示す。
【０１４６】
ＳＢ２４９４１６
ＳＢ２４９４１６はＨ鎖Ｆ９ＨＺＨＣ１−１（上記記載）（配列番号：５２）およびＬ鎖Ｆ９ＨＺＬＣ１−２を含む。Ｌ鎖構築物は、Ｆ９ＨＺＬＣ１−１に基づくが、ＣＤＲ提示に影響する１個の付加的骨格アミノ酸置換を有する。
【０１４７】
２個の合成オリゴヌクレオチドが生じ（配列番号：５８および５９）、それは、アニールすると、Ｂａｍ ＨＩおよびＸｂａ Ｉ粘着末端を有し、Ｌ鎖可変領域変異部分を表すアミノ酸（配列番号：６０）をコードする。Ｆ９ＨＺＬＣ１−１（配列番号：５６）ベクターを制限酵素Ｂａｍ ＨＩおよびＸｂａ Ｉで消化し、合成ＤＮＡに連結した。Ｆ９ＨＺＬＣ １−２インサートの配列は配列番号：６１および６２に示す。
【０１４８】
ＳＢ２４９４１７
ＳＢ２４９４１７はＨ鎖Ｆ９ＨＺＨＣ１−１（上記記載）（配列番号：５２）およびＬ鎖Ｆ９ＨＺＬＣ２−０を含む。Ｆ９ＨＺＬＣ２−０合成可変領域ヒト化Ｌ鎖は、免疫グロブリンＲＥＩ（ＰａｌｍおよびＨｉｌｓｃｈｍａｎｎ，Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３５４，１６５１−１６５４（１９７３）、カバト（Ｋａｂａｔ）データーベースにＫａｂｐｒｏ：ＨＫＬ１１１と同定）および上記に記載のＢＣ２Ｌ鎖ＣＤＲから得られたヒトＬ鎖の骨格領域を用いて設計された。５個のアミノ酸コンセンサスヒト置換が導入された。ＣＤＲ提示に影響できる６個の骨格アミノ酸ネズミ置換が作られた。２個の重複する合成オリゴヌクレオチドが生じ（配列番号：６３および６４）、それは、アニールし、伸長すると、Ｌ鎖可変領域を表すアミノ酸（配列番号：６５および６６）をコードする。次いで、この合成遺伝子をＰＣＲプライマー（配列番号：６７および６８）を用いて増幅し、ｐＣＲ２０００ベクター（ティーエークローニングキット（ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ）、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号Ｋ２０００−０１）に連結し、Ｓｃａ Ｉ、Ｓａｃ ＩＩ制限消化から単離した。可変領域の最初の２個のアミノ酸を含むキャンパスシグナル配列をコードする第二ＤＮＡ断片（配列番号：３８）を、２個のプライマー（配列番号：２６および６９）によるヒト化抗−呼吸系シンシチウムウィルスＨ鎖（配列番号：２５）をコードする構築物の適当な領域のＰＣＲ増幅および制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ、Ｓｃａ Ｉでの切断により作った。ヒト骨格４（配列番号：７０）の残りをコードし、Ｓａｃ ＩＩおよびＮａｒ Ｉ粘着末端を有する第三ＤＮＡ断片が２個の合成オリゴヌクレオチド（配列番号：７０および７２）をアニールすることにより生じた。Ｆ９ＨＺＬＣ １−０（配列番号：４３）を制限酵素Ｅｃｏ ＲＩおよびＮａｒ Ｉで消化し、３個のＤＮＡ断片に連結した。Ｆ９ＨＺＬＣ ２−０インサートの配列は配列番号：７３および７４に示す。
【０１４９】
ＳＢ２５７７３１
ＳＢ２５７７３１はＨ鎖Ｆ９ＨＺＨＣ１−１（配列番号：５２）およびＬ鎖Ｆ９ＨＺＬＣ１−３、Ｆ９ＨＸＬＣ１−２（配列番号：６２）の単一アミノ酸変異を含む。Ｆ９ＨＺＬＣ１−２を２個のプライマー（配列番号：２６および６９）を用いて増幅し、制限酵素Ｅｃｏ ＲＩおよびＳｃａ Ｉで消化した。９４ｂｐの断片（配列番号：７５および７６）が単離された。断片をＥｃｏ ＲＩ、Ｓｃａ Ｉで消化したＦ９ＨＺＬＣ１−２ベクターに連結しＬ鎖構築物Ｆ９ＨＺＬＣ１−３が生じた。Ｆ９ＨＺＬＣ １−３インサートの配列は配列番号：７７および７８に示す。
【０１５０】
ＳＢ２５７７３２
ＳＢ２５７７３２は合成可変領域ヒト化Ｈ鎖Ｆ９ＨＺＨＣ３−０およびＬ鎖Ｆ９ＨＺＬＣ３−０を含む。４個の重複する合成オリゴヌクレオチドが生じ（配列番号：７９、８０、８１および８２）、それは、アニールし、伸長すると、改変したＨ鎖可変領域を表すアミノ酸（配列番号：８３および８４）をコードする。次いで、この合成遺伝子をＰＣＲプライマー（配列番号：８５および８６）を用いて増幅し、ｐＣＲ２０００ベクター（ティーエークローニングキット（ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ）、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号Ｋ２０００−０１）に連結し、Ｓｔｕ Ｉ、Ｋｐｎ Ｉ制限消化から単離した。単離した断片をＳｔｕ Ｉ、Ｋｐｎ Ｉで消化したＦ９ＨＺＨＣ１−１（配列番号：５２）に連結した。次いで、シグナル配列を除去するため、このベクターをＥｃｏ ＲＩ、Ｓｐｅ Ｉで消化した。可変領域の最初の５個のアミノ酸を含むキャンパスシグナル配列をコードするＤＮＡ断片（配列番号：２３）を、２個のプライマー（配列番号：２６および８７）でのＦ９ＨＺＨＣ１−０のＰＣＲ増幅および制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ、Ｓｐｅ Ｉでの切断により作った。生じた断片をベクターに連結した。Ｆ９ＨＺＨＣ ３−０インサートの配列は配列番号：８８および８９に示す。
【０１５１】
４個の重複する合成オリゴヌクレオチドが生じ（配列番号：９０、９１、９２および９３）、それは、アニールし、伸長すると、Ｌ鎖可変領域を表すアミノ酸（配列番号：９４および９５）をコードする。次いで、この合成遺伝子はＰＣＲプライマー（配列番号：９６および９７）を用いて増幅し、ｐＣＲ２０００ベクター（ティーエークローニングキット（ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ）、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号Ｋ２０００−０１）に連結し、Ｓｃａ Ｉ、Ｎａｒ Ｉ制限消化から単離した。単離したＤＮＡ断片を、Ｓｃａ Ｉ、Ｎａｒ Ｉ制限消化したＦ９ＨＺＬＣ１−３（配列番号：７７）ベクターに連結した。Ｆ９ＨＺＬＣ ３−０インサートの配列は配列番号：９８および９９に示す。
【０１５２】
ヒト化抗−第ＩＸ因子 ｍＡｂはＣＨＯ細胞内で発現された。血漿−フリー培地中での懸濁生育に採用されたＤＧ−４４細胞系は、２５０ｍｌの使い捨ての滅菌エーレンマイヤーフラスコ（コーニング（Ｃｏｒｉｎｇ））内で１ｘヌクレオシドおよび０．０５％Ｆ６８を含むタンパク質−フリー培地 １００ｍｌ中、イノーバ２１００（Ｉｎｎｏｖａ ２１００）プラットフォーム・シェイカー（ニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））で１５０ｒｐｍ、３７℃にて５％ＣＯ２、９５％空気湿潤インキュベーターで生育した。これら細胞を４ｘ１０５細胞／ｍｌで週に二回、移し変えた。ｐＣＮ−Ｌｃ−Ｌ鎖およびｐＣＤ−Ｈｃ−Ｈ鎖ベクター各１５ｕｇをＮｏｔ Ｉ消化により直鎖化し、滅菌条件下共沈殿させ、１Ｘ ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）５０ｕｌに再懸濁した。バイオ−ラッド・ジーン・パルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）（バイオ−ラッド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、Ｈｅｎｓｌｅｙら．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２３９４９−２３９５８（１９９４）の方法を用いてＤＮＡをＡｃｃ−０９８細胞内へエレクトロポレートした。１．２Ｘ１０７細胞を氷冷ピービースクロース（ＰＢＳｕｃｒｏｓｅ）（ＰＢＳ、２７２ｍＭ スクロース、７ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ７．４、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）で一度洗浄し、ＰＢＳ ０．８ｍｌに再懸濁し、ＤＮＡ溶液５０ｕｌに添加し、氷上１５分間インキュベートした。細胞は３８０Ｖ、２５マイクロファラッドでパルスし、次いで氷上で１０分間インキュベートした。選択に先立ち、２４時間保持培地中に５ｘ１０５細胞／プレートで細胞を９６穴培養プレートに平板化した。保持培地中、細胞を４００ｕｇ／ｍｌ Ｇ４１８（ゲネチシン、ライフ・テクノロジーズ、インク（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ））耐性につき選択した。アッセイ前２４時間、細胞を保持培地１５０ｕｌで生育させた。
【０１５３】
個々のコロニーからの調整培地をオリゲン・アナライザー（Ｏｒｉｇｅｎ ａｎａｌｙｚｅｒ）（アイ・ジー・イー・エヌ、インク（ＩＧＥＮ，Ｉｎｃ．））でエレクトロケミルミネセンス（ＥＣＬ）検出法を用いてアッセイした。Ｙａｎｇら．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２，１９３−１９４（１９９４） を参照されたい。
【０１５４】
アッセイを行い（アッセイ緩衝液）、アナライザーを操作する（細胞クリーナー）に必要なあらゆる溶液は、アイ・ジー・イー・エヌ（ＩＧＥＮ）から得た。抗体（抗−ヒトＩｇＧ（ｇ−鎖特異的）、シグマ・ケミカルズ（Ｓｉｇｎａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）およびＦ（ａｂ’）２、ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するＦ（ａｂ’）２断片、カーケガード・アンド・ペリー・ラボラトリーズ・インク（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．））をＴＡＧ：タンパク質 ７：１モル比にてＴＡＧ−ＮＨＳ−エステル（アイ・ジー・イー・エヌ（ＩＧＥＮ））で標識したが、一方タンパク質Ａ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））をビオチン：タンパク質、２０：１のモル比にてビオチン−ＬＣ−スルフォ−ＮＨＳ−エステル（アイ・ジー・イー・エヌ、インク（ＩＧＥＮ，Ｉｎｃ．））で標識した。両方法ともアイ・ジー・イー・エヌ（ＩＧＥＮ）の推奨によった。ステプタビジン−コートしたマグネチックビーズ（Ｍ−２８０）はダイナル（Ｄｙｎａｌ）から得た。
【０１５５】
イムノアッセイは以下のプロトコルで行った：試料につき、ステプタビジン−コートビーズ５０ｕｌ（ＰＢＳで希釈した最終濃度６００ｕｇ／ｍｌ、ｐＨ７．８、１．２５％Ｔｗｅｅｎ）を、ビオチン−タンパク質Ａ（ＰＢＳで希釈した最終濃度１ｕｇ／ｍｌ、ｐＨ７．８、１．２５％Ｔｗｅｅｎ）と混合し、室温にて撹拌しながら１５分間インキュベートし、ＴＡＧ抗体５０ｕｌ（１．２５％Ｔｗｅｅｎと、ＰＢＳで希釈した最終濃度１．２５ｕｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するＦ（ａｂ’）２断片および０．２５ｕｇ／ｍｌの抗−ヒトＩｇＧ（ｇ−鎖特異的））を添加し、次いで、溶液を調整培地５０ｕｌに添加し、室温にて撹拌しながら１時間インキュベートした。アッセイ緩衝液２００ｕｌを反応混合物に添加し、試料をオリゲンＩ（Ｏｒｉｇｅｎ Ｉ）アナライザーで分析しＥＣＬを測定した。結果、アッセイしたコロニーの約２０−３７％が１５ｎｇ／ｍｌを越える抗体を分泌し、平均発現は約１５０ｎｇ／ｍｌであることが示された。
【０１５６】
プロセップＡ（Ｐｒｏｃｅｐ Ａ）捕獲段階、続きＤＮＡ荷重を減じるイオン−交換クロマトグラフィーを用いてヒト化抗−第ＩＸ因子ｍＡｂを調整培地から精製した。プロセップＡ（Ｐｒｏｃｅｐ Ａ）ソーベント物質（イギリス、ダラム、バイオプロセシング・エルティーディー（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｌｔｄ．，Ｄｕｒｈａｍ，Ｅｎｇｌａｎｄ））を用い、直径対高さ比１：１のカラムを調製した。澄んだ調整培地を約１５０ｃｍ／時間でカラムにロードした。カラムを連続的にリン酸緩衝セーライン（ＰＢＳ）、１Ｍ ＮａＣｌを含むＰＢＳ、最終的にはＰＢＳで洗浄した。結合した物質は０．１Ｍ酢酸溶液で回収した。溶出液をｐＨ５．５に調整し、水で（１：４）希釈した。希釈溶液を２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、８０ｃｍ／時間であらかじめ平衡化したＳ−セファロースカラム（２．５ｘ１３ｃｍ）にロードした。安定したベースラインが得られるまで、カラムを酢酸緩衝液で洗浄し、結合タンパク質が２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、２５ｃｍ／時間で溶出した。溶出した物質を０．４ミクロンメンブレンで濾過し４℃にて貯蔵した。
【実施例７】
【０１５７】
マウス−ヒトキメラ抗体
製造者説明書（ボーアリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）カタログ番号１４８３−１８８）により、プライマーとしてｄＴオリゴを用いてＲＴ−ＰＣＲキットでＢＣ２ＲＮＡ １００ｎｇを逆転写し、合成Ｓｃａ Ｉ（配列番号：１００）およびＮａｒ Ｉ（配列番号：１０１）プライマーでＰＣＲ増幅し、Ｓｃａ １、Ｎａｒ １末端を有するＢＣ２Ｌ鎖可変領域（配列番号１０２および１０３）を生産した。ＤＮＡをＳｃａ Ｉ、Ｎａｒ Ｉ消化したＦ９ＨＺＨＣ１−３（配列番号７７）に連結し、Ｓｃａ Ｉ、Ｎａｒ Ｉで消化しマウス−ヒトキメラＬ鎖Ｆ９ＣＨＬＣ（配列番号：１０４および１０５）が生じた。
【０１５８】
製造者説明書（ボーアリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｎｇｅｒ Ｍｎｎｈｅｉｍ）カタログ番号１４８３−１８８）により、プライマーとしてｄＴオリゴを用いてＲＴ−ＰＣＲキットでＢＣ２ＲＮＡ １００ｎｇを逆転写し、合成Ｓｐｅ Ｉ（配列番号：１０６）およびＮｈｅ Ｉ（配列番号：１０７）プライマーでＰＣＲ増幅し、Ｓｐｅ Ｉ、Ｎｈｅ Ｉ末端を有するＢＣ２ Ｈ鎖可変領域（配列番号：１０８および１０９）を生産した。キャンパスシグナル配列をＥｃｏ ＲＩ（配列番号２６）およびＳｐｅ Ｉ（配列番号８７）プライマーでＲＳＶＨＺ１９Ｈ鎖（配列番号：２５）からＰＣＲ増幅した。これら２個のＤＮＡ断片をＥｃｏ ＲＩ、Ｎｈｅ Ｉ消化した公開された国際出願第９５／０７３０１号に記載のＩＬ４ＣＨＨＣｐｃｄベクターに連結し、ＩＬ４可変領域をＢＣ２第ＩＸ因子マウス可変領域に置き換え、マウス−ヒトキメラＨ鎖Ｆ９ＣＨＨＣ（配列番号：１１０および１１１）が生じた。
【０１５９】
マウス−ヒトキメラ抗体ｃｈαＦＩＸのコトランスフェクションおよび精製はヒト化構築物につき上記に記載のごとく行われた。
【実施例８】
【０１６０】
ラット血栓モデルにおけるヒト化第ＩＸ因子ｍＡｂの能力
動脈血栓の阻害においてヒト化抗−第ＩＸ因子抗体の能力を評価するために、実施例３に記載のラット冠動脈血栓モデルを用いた。冠動脈血流、動脈圧、心拍数、管開存性および活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）につきベースラインパラメーターを確立した。１５分後、冠動脈傷害を１０分間行った。冠動脈傷害を始めた後６０分パラメーターを測定した。冠動脈血栓もまた、冠動脈から抽出し重さを量った。
【０１６１】
あらゆる試薬は冠動脈傷害を始める１５分前に静脈内に投与した。抗−第ＩＸ因子 ｍＡｂ ＢＣ２に対する以下の処理を調査、比較した。
【０１６２】
１．担体
２．ｃｈαＦＩＸ：３ｍｇ／ｋｇ ボーラス
３．ＳＢ ２４９４１３：３ｍｇ／ｋｇ ボーラス
４．ＳＢ ２４９４１５：３ｍｇ／ｋｇ ボーラス
５．ＳＢ ２４９４１６：３ｍｇ／ｋｇ ボーラス
６．ＳＢ ２４９４１７：３ｍｇ／ｋｇ ボーラス
７．ＳＢ ２５７７３１：３ｍｇ／ｋｇ ボーラス
８．ヘパリン：６０単位／ｋｇ ボーラス＋２単位／ｋｇ／分注入
【０１６３】
研究に用いた抗−凝固剤／血栓剤の能力対出血傾向の評価の一次的判断基準としてａＰＴＴが用いられた。図８の結果は、ヒト化第ＩＸ因子 ｍＡｂ ＳＢ ２４９４１３、ＳＢ ２４９４１５、ＳＢ ２４９４１６、ＳＢ２４９４１７およびＳＢ ２５７７３１が臨床的に許容される範囲内である３．０ｍｇ／ｋｇでａＰＴＴに適度な効果を有することを示す。
【０１６４】
第ＩＸ因子ｍＡｂの血栓質量に対する効果を図９に示す。結果は全てのヒト化ｍＡｂが血栓質量を減じるに等しく効果的であることを示す。
【０１６５】
ラット冠動脈血栓モデルにおいて行われた研究によ利明らかに高度にトロンボゲン形成の冠動脈傷害モデルにおける血栓阻害におけるヒト化第ＩＸ因子ｍＡｂの能力が示された。とりわけ、全てのヒト化第ＩＸ因子ｍＡｂの能力がａＰＴＴに定義される所望の治療抗凝固標的内に示された。
【実施例９】
【０１６６】
抗体の生化学的および生物物理学的性質
ＳＢ２４９４１７の分子量はＭＡＬＤ−ＭＳにより１４８，０００Ｄａと測定された。ＳＢ２４９４１７の分析学的超遠心は同一の値であった。第ＩＸ因子プラスＣａ２＋の存在下では、ＢＣ２由来抗体はｍＡｂおよび因子ＩＸの２個の分子の組み合わされた質量に対応する２４８，０００Ｄａの質量で沈降した。第ＩＸ因子の存在または不存在でも、高度の凝集の証拠は観察されなかった。
【０１６７】
ＳＢ２４９４１７に結合する第ＩＸ因子の動力学は、固定したタンパク質Ａ表面に結合した抗体でのバイアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）分析により評価される。４９ｎＭにおける組み換えヒト第ＩＸ因子（ｒｈＦＩＸ、ジェニティクス・インスティテュート（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））が用いられ、５ｍＭＣａ２＋存在下で測定を行った。相互作用は、速い会合により特徴付けられ、ｋａｓｓ＝２．０ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１、比較的ゆっくりなオフレート、ｋｄｉｓｓ＝４．１ｘ１０−４ｓ−１であった。第ＩＸ因子結合につき算出されたＫｄは１．９ｎＭであった。
【０１６８】
表１にＳＢ２４９４１７の生物物理学的性質を要約する。
表１
Ｂ２４９４１７の生物物理学的性質の概要
【０１６９】
【表２】
【０１７０】
表２には本発明のｍＡｂの因子ＩＸ結合性質を要約する。算出された解離定数は、実験誤差内で本質的に同一であった。
表２
抗−第ＩＸ因子ｍＡｂに対する第ＩＸ因子結合の動力学
【０１７１】
【表３】
【０１７２】
ｒｈＦＩＸおよびＳＢ２４９４１７間、ＢＣ２および他のヒト化構築物間の相互作用は、結合の固有熱からの溶液内での結合相互作用を測定するティトレーション・マイクロカロリーメトリーにより特徴付けられる。１０６ｕＭ ＦＩＸの９回の注射が２ｕＭ ｍＡｂ ＳＢ２４９４１７を含むカロリーメーターへなされた。最初の４回の注射は発熱として結合が検出された。最後の５回の注射では、ｍＡｂの結合部位がＦＩＸで飽和し、バックグラウンドの混合熱が観測された。結果は、期待されたとおり、モル結合比２付近ＦＩＸ対ｍＡｂで平衡点となることを示した。データのノンリニア・リースト・スクエア・アナリシス（ｎｏｎｌｅｎｅａｒ ｌｅａｓｔ ｓｑｕａｒｅｓ ａｎａｌｙｓｉｓ）により結合親和性が算出された。
【０１７３】
ｍＡｂのｒｈＦＩＸ親和性は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中に、３４−４４℃の温度範囲にわたり測定された。これらデータは３７℃における親和性は直接測定され、２５℃における親和性はファント・ホッフ（ｖａｎ’ｔ Ｈｏｆｆ）式から算出された。表３のデータは、ＳＢ２４９４１７、ＢＣ２およびその他のヒト化構築物の親和性が誤差範囲内（２の因子）で同じであることを示す。
【０１７４】
表３
抗−ＦＩＸｍＡｂのティトレーションカロリーメトリー結果
【０１７５】
【表４】
【０１７６】
ｍＡｂ ＳＢ２４９４１３、ＳＢ２４９４１５、ＳＢ２４９４１７およびＳＢ２５７７３２は全て、示差走査熱量計により非常に類似した熱安定性を示した。それらの折り畳まれていないＴｍｓは７０−７５℃の範囲であり、熱誘導変性に対し高い安定性を示した。
【実施例１０】
【０１７７】
第ＩＸ因子の抗体−介在阻害機構
相同性のあるタンパク質第ＶＩＩ因子の骨格に第ＩＸ因子をスプライスした配列から成るキメラ構築物のライブラリーを構築し、第ＩＸ因子ＢＣ２ｍＡｂのエピトープをマッピングするに用いた。Ｃｈｅｕｎｇら．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．８０，４１９−４２７（１９９５）を参照されたい。バイアコア（ＢｉａＣｏｒｅ）２０００表面プラスモン共鳴デバイスを用いて、結合を測定した。ＢＣ２抗体はＮＨＳ／ＥＤＣ反応を用いてチップと直接カップリングさせた。接触時間２分、２５ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２中の２００ｎＭの各構築物で結合を測定した。タンパク質の含まれない同一の緩衝液を用いて３分間解離をモニターした。５０ｍＭ ＥＤＴＡ存在下、野生型の構築物では結合は検出されなかった。データを表４に示す。
【０１７８】
表４
ＢＣ２抗体に対する第ＩＸ因子構築物の結合の概要
【０１７９】
【表５】
【０１８０】
これらデータは第ＩＸ因子 Ｌ鎖および第ＶＩＩ因子 Ｈ鎖（ＩＸ ＬＣ／ＶＩＩ ＨＣ）；第ＩＸ因子ｇｌａおよび芳香族スタックドメイン（ＩＸ−Ａ／ＶＩＩ）；第ＶＩＩ因子ｇｌａドメイン内の第ＩＸ因子ｇｌａドメインの残基３−１１（ＶＩＩ ｇｌａ（ＩＸ３−１１）／ＩＸ）；および残基５でリジンからアラニンへの置換を有する第ＩＸ因子（ＩＸ Ｋ５Ａ）を含む構築物はＢＣ２との結合を表すことを示す。ＶＩＩ ｇｌａ（ＩＸ ３−１１）／ＩＸ構築物は野生型第ＩＸ因子（血漿ＩＸａおよびｒ−ＩＸ）と等価なＢＣ２結合を表した。従って、ＢＣ２抗体は第ＩＸ因子ｇｌａドメインの残基３−１１内に含まれたエピトープと結合する。
【０１８１】
本発明は、その精神または本質的な特性から離れることなしに他の具体的形態に具体化でき、従って、本発明の範囲を示す前記の明細書よりも後記の請求の範囲を参照するべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】ネズミ抗−第ＩＸ因子ｍＡｂ ＢＣ１およびＢＣ２での正常なヒト血漿の力価を測定する実験結果のグラフである。
【図２】ネズミ抗−第ＩＸ因子ｍＡｂ ９Ｅ４（２）Ｆ４および１１Ｇ４（１）Ｂ９での正常なヒト血漿の力価を測定する実験結果のグラフである。
【図３】ネズミ抗−第Ｘ因子ｍＡｂ ＨＦＸＨＣおよびＨＦＸＬＣおよびネズミ抗−第ＸＩ因子ｍＡｂ ＨＦＸＩでの正常なヒト血漿の力価を測定する実験結果のグラフである。
【図４】ラット冠動脈血栓モデルにおける６０分での活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）に対するヘパリン、アセチルサリチル酸およびネズミ第ＩＸ因子ｍａｂの効果を測定する実験結果のヒストグラムである。
【図５】ラット冠動脈血栓モデルにおける６０分でのプロトロンビン時間に対する、ヘパリン、アセチルサリチル酸、およびネズミ第ＩＸ因子 ｍａｂの効果を測定する実験結果のヒストグラムである。
【図６】ラット冠動脈血栓モデルにおける冠動脈血流の閉塞に対するヘパリン、アセチルサリチル酸およびネズミ第ＩＸ因子ｍａｂの効果を測定する実験結果のヒストグラムである。
【図７】ラット冠動脈血栓モデルにおける血栓重量に対するヘパリン、アセチルサリチル酸およびネズミ第ＩＸ因子ｍａｂの効果を測定する実験結果のヒストグラムである。
【図８】ラット冠動脈血栓モデルにおける６０分でのａＰＴＴに対する、ヘパリン、ネズミ第ＩＸ因子ｍａｂ ＢＣ２、キメラ第ＩＸ因子 ｍａｂ およびヒト化第ＩＸ因子 ｍＡｂの効果を測定する実験結果のヒストグラムである。
【図９】ラット冠動脈血栓モデルにおける血栓重量に対するヘパリン、ネズミ第ＩＸ因子ｍａｂ ＢＣ２、キメラ第ＩＸ因子ｍａｂおよびヒト化第ＩＸ因子ｍＡｂの効果を測定する実験結果のヒストグラムである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンＨ鎖またはＬ鎖相補性決定領域のアミノ酸配列またはその領域をコードする核酸分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
通常の環境下では、それが小さくても大きくても外傷は、血管の裏打ちをしている血管内皮細胞に対して、通常、凝固「カスケード」といわれる一連の事象を介する止血反応の引き金を引く。カスケードは、可溶性フィブリノーゲンを不溶性のフィブリンに変換し、それは血小板と一緒になって、血液成分の溢出を妨げる限局在化された血餅あるいは血栓を形成する。ついで、創傷治癒が起こり、続いて血餅の消滅および血管の完全性および血流の回復が起こる。
【０００３】
外傷および血餅形成の間に起こる事象は注意深く調節され連結した一連の反応である。略言すれば、不活性形プロ酵素形態での多数の血漿凝固タンパク質および補因子が血液内を循環する。活性形の酵素複合体が外傷部位で組み立てられ、引き続いてセリンプロテアーゼに活性化され、各順次のセリンプロテアーゼは次のプロ酵素をプロテアーゼ活性化へ触媒する。この酵素的カスケードの結果、各ステップは続いて起こるステップの効果を拡大する。凝固カスケードの概観については「Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ」、Ｊ．ＬｏｓｃａｌｚｏおよびＡ．Ｓｃｈａｆｅｒ，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９４）の第一章を参照されたい。
【０００４】
効率のいい血餅形成が外傷部位での失血を制限している一方、静脈または動脈での不適当な血栓の形成は障害および死の普通の原因である。異常な血餅形成活性は、心筋梗塞、不安定なアンギナ、心房細動、発作、腎障害、経皮的経管的冠状動脈形成、汎発性血管内凝固症候群、敗血症、肺動脈塞栓症および深静脈血栓のごとき病理または治療という結果になり、かつ／あるいはその結果生じる。また、人工心臓弁のごとき人工器官、シャントおよびプロテーゼの外来表面における血餅の形成も問題となる。
【０００５】
これらの病理および他の血栓性および塞栓性の障害の治療に最近用いられる承認された抗凝固剤は、硫酸化複多糖類ヘパリンおよび低分子量（ＬＭＷ）ヘパリンを含む。これらの薬剤は非経口的に投与され、トロンビン阻害剤、アンチトロンビンＩＩＩの活性化およびすべての凝固因子の不活性化により迅速かつ完全な凝固阻害を起こす。
【０００６】
しかしながら、その能力のため、ヘパリンおよびＬＭＷヘパリンには欠点がある。動作およびそれに伴う物理的物体との接触または外科手術部位での単純なストレスの結果としての制御されない出血が主要な合併症であり、連続輸液を受けている患者の１ないし７％および間欠性のボーラス量を与えられている患者の８ないし１４％に見られる。このリスクを最小限にするために、生体外で凝固時間を連続的にモニターすることができるように、試料を連続的に引き抜くが、このことが、実質的に治療コストおよび患者の不便さの一因となっている。
【０００７】
さらに、患者に出血のリスクなしに所望のレベルの効能に達する治療標的範囲は狭い。治療範囲は約１ないし３μｇヘパリン／ｍｌ血漿より少なく、結果、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイ時間、約３５ないし約１００秒となる。ヘパリン濃度を３μｇ／ｍｌに増加させると、標的範囲を超え、４μｇ／ｍｌを超える濃度では凝固活性は検出できない。従って、患者の血漿濃度を治療範囲内に保つには多大な注意をしなければならない。
【０００８】
緩速かつ持続的な効果を有するもう一つの承認された抗凝固剤はクマリン誘導体であるワルファリンである。ワルファリンは、プロトロンビンのビタミンＫ依存性翻訳後修飾および他のビタミンＫ−依存性凝固因子と競合することによって作用する。
【非特許文献１】「Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ」、Ｊ．ＬｏｓｃａｌｚｏおよびＡ．Ｓｃｈａｆｅｒ，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
治療範囲よりわずかにでも高濃度では血液が非−凝固になるという抗凝固剤作用の一般的パターンは、ワルファリンならびにヘパリンおよびＬＭＷヘパリンに見られる。明らかに、血栓および塞栓障害の制御において効能があり、制御されない出血またはその可能性を起こさない抗凝固剤が必要性とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、本発明の１の態様は、有効量の自己−制限的な中和活性を有する抗凝固因子モノクローナル抗体を投与することを含む、動物における血栓症の阻害の方法である。
【００１１】
本発明のもう一つの態様は、凝固因子に対する自己−制限的な中和活性を有する抗凝固因子モノクローナル抗体である。
【００１２】
本発明のもう一つの態様は、ＳＢ２４９４１３、ＳＢ２４９４１５、ＳＢ２４９４１６、ＳＢ２４９４１７、ＳＢ２５７７３１、ＳＢ２５７７３２、９Ｅ４（２）Ｆ４または１１Ｇ４（１）Ｂ９の同定特徴を有するモノクローナル抗体である。
【００１３】
本発明のもう一つの態様は、９Ｅ４（２）Ｆ４または１１Ｇ４（１）Ｂ９の同定特徴を有するハイブリドーマ細胞系である。
【００１４】
本発明のもう一つの態様は、本発明のモノクローナル抗体のＦｃ領域を欠失せさせることにより生産された、その中和Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片である。
【００１５】
本発明のもう一つの態様は、本発明のモノクローナル抗体のＦｄ Ｈ鎖がマウスＬ鎖糸状ファージＦａｂディスプレイライブラリー中で発現されることによる鎖シャッフリングにより生産された、その中和Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片である。
【００１６】
本発明のもう一つの態様は本発明のモノクローナル抗体のＬ鎖がマウスＨ鎖糸状ファージＦａｂディスプレイライブラリー中で発現されることによる鎖シャッフリングにより生産されたその中和Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片である。
【００１７】
本発明のもう一つの態様は、配列番号：８、９および１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリンＨ鎖相補性決定領域である。
【００１８】
本発明のもう一つの態様は配列番号１２、１３および１４よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン相補性決定領域である。
【００１９】
本発明のもう一つの態様は、ＨおよびＬ鎖の骨格領域がが少なくとも一つの選択される抗体から由来し、各該鎖の相補性決定領域のアミノ酸配列が凝固因子に対し自己−制限的な中和活性を有する抗−凝固因子モノクローナル抗体から由来するＨ鎖およびＬ鎖を含む改変された抗体である。
【００２０】
本発明のもう一つの態様は、Ｈ鎖およびＬ鎖を含むキメラの抗体であり、該抗体は、固有または共通の経路の凝固因子の機能を、血栓症が阻害かつ制限され、該ＨおよびＬ鎖の定常領域が少なくとも一つの選択される抗体から由来し、各該鎖の可変領域のアミノ酸配列が凝固因子に対して自己−制限的な中和活性を有する抗−凝固因子モノクローナル抗体から由来する凝固の変調が生じる自己−制限的な様式で阻害することにより特徴付けられる。
【００２１】
本発明のさらにもう一つの態様は、本発明のヒト化抗体またはキメラ抗体および医薬上許容される担体を含む医薬組成物である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、自己−制限的な中和活性により特徴付けられる、凝固因子に向けられた種々の抗体、改変された抗体およびその断片を提供する。好ましくは、凝固因子は固有または共通の凝固経路由来である。最も好ましくは、抗−凝固因子抗体は抗−第ＩＸ因子、抗−第ＩＸａ因子、抗−第Ｘ因子、抗−第Ｘａ因子、抗−第ＸＩ因子、抗−第ＸＩａ因子、抗−第ＶＩＩＩ因子、抗−第ＶＩＩＩａ因子、抗−第Ｖ因子、抗−第Ｖａ因子、抗−第ＶＩＩ因子、抗−第ＶＩＩａ因子または抗−トロンビンである。抗−第ＩＸ因子抗体は特に好ましい。例示的な抗−凝固因子抗体はヒト第ＩＸ因子に対するヒト化モノクローナル抗体、ＳＢ２４９４１３、ＳＢ２４９４１５、ＳＢ２４９４１６、ＳＢ２４９４１７、ＳＢ２５７７３１およびＳＢ２５７７３２、ヒト第ＩＸ因子に対するキメラモノクローナル抗体ｃｈαＦＩＸ、ヒト第ＩＸ因子および／または第ＩＸａ因子に対するネズミモノクローナル抗体ＢＣ１、ＢＣ２、９Ｅ４（２）Ｆ４および１１Ｇ４（１）Ｂ９またはそれぞれヒト第ＸおよびＸＩ因子に対するネズミモノクローナル抗体ＨＦＸＬＣおよびＨＦＸＩである。抗−ヒト第ＩＸ因子モノクローナル抗体ＳＢ２４９４１７が特に好ましい。
【００２３】
本発明の抗体は、慣用的なハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ組合せライブラリー、免疫グロブリン鎖シャッフリングおよびヒト化技術により、調製でき、新規な自己−制限的な中和抗体を生ずる。また、自己−制限的な中和活性を有するヒトｍＡｂも十分に含む。これらの生成物は心筋梗塞、不安定なアンギナ、心房細動、発作、腎障害、肺動脈塞栓症、深静脈血栓、経皮的経管的冠状動脈形成、汎発性血管内凝固症候群、敗血症、人工器官、シャントまたはプロテーゼに関連した血栓および塞栓障害に対する治療および医薬組成物において有用である。
【００２４】
本明細書中にて使用されたごとく、「自己−制限的な中和活性」なる語は、好ましくは、第ＩＸ／ＩＸａ、Ｘ／Ｘａ、ＸＩ／ＸＩａ、ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａおよびＶ／Ｖａ、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子およびトロンビンを含む固有かつ共通の経路由来のヒト凝固因子に結合し、凝固の制限された変調が生じるごとき様式で血栓症を阻害する活性をいう。「凝固の制限された変調」は、モノクローナル抗体の濃度の増加にも拘わらず最大値に到達するａＰＴＴで血漿が凝固可能である活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）の延長により測定される凝固時間の増加と定義される。この凝固の制限される変調は、凝固不可能にされ、増加する濃度のヘパリン存在下、無限のａＰＴＴを示す血漿とは対照的である。好ましくは、本発明の方法の最大ａＰＴＴ値はヘパリン治療範囲内である。最も好ましくは、最大ａＰＴＴ値は正常なコントロールａＰＴＴ値の約１．５倍ないし３．５倍に相当する約３５秒ないし１００秒の範囲内にある。本発明のある具体例において、ａＰＴＴはプロトロンビン時間（ＰＴ）の有意な延長なしに延長される。
【００２５】
「改変された抗体」とは、選択された宿主細胞内での発現により得られる改変された免疫グロブリンコーディング領域によりコードされるタンパク質をいう。かかる改変された抗体は作成された抗体（例えば、キメラまたはヒト化抗体）または免疫グロブリンの定常領域のすべてまたは一部を欠失した抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２などである。
【００２６】
「改変された免疫グロブリンコーディング領域」とは本発明の改変された抗体をコードする核酸配列をいう。改変された抗体がＣＤＲ−移植またはヒト化抗体である場合は、非−ヒト免疫グロブリンからの相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする配列が、ヒト可変骨格配列を含む第一の免疫グロブリンパートナー中に挿入される。所望により、第一の免疫グロブリンパートナーは第二の免疫グロブリンパートナーへ作動可能に結合されてもよい。
【００２７】
「第一の免疫グロブリンパートナー」とは、本来の（または天然の）ＣＤＲ−コーディング領域が供与体の抗体のＣＤＲ−コーディング領域により置換されたヒト骨格またはヒト免疫グロブリン可変領域をコードする核酸配列をいう。ヒト可変領域は免疫グロブリンＨ鎖、Ｌ鎖（または両鎖）、その類似体または機能的断片であってもよい。抗体（免疫グロブリン）の可変領域内に位置するかかるＣＤＲ領域は当該分野で知られている方法により決定できる。例えば、Ｋａｂａｔら．，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｇ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｓｔ」，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７）にＣＤＲを位置づける法則を開示する。加えて、ＣＤＲ領域／構造を同定するに有用であるコンピュータープログラムが公知である。
【００２８】
「第二の免疫グロブリンパートナー」とは、第一の免疫グロブリンパートナーがフレーム内に、または所望の慣用的なリンカー配列（すなわち作動可能に結合される）によって融合されるタンパク質またはペプチドをコードする別の核酸配列をいう。好ましくは、それは免疫グロブリン遺伝子である。第二の免疫グロブリンパートナーは、同じものの定常領域全体をコードする核酸配列（すなわち、相同な、第一および第二の改変された抗体は同源由来である）、または付加的な（すなわち、異種の）抗体を含む。それは免疫グロブリンＨ鎖またはＬ鎖（または単一のポリペプチドの一部として両鎖）であってもよい。第二の免疫グロブリンパートナーは、特定の免疫グロブリンクラスまたはイソタイプに限定されない。加えて、第二の免疫グロブリンパートナーは、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２（すなわち、適当なヒト定常領域または骨格領域の不連続部分）に見出されるごとき免疫グロブリン定常領域の一部を含んでいてもよい。また、かかる第二の免疫グロブリンパートナーは、宿主細胞の外表面上に露出している必須の膜タンパク質をコードする配列、例えば、ファージディスプレーライブラリーの一部、または分析学的または診断学的検出用タンパク質をコードする配列、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどを含んでもよい。
【００２９】
Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ）’２なる語は、その標準的な意味で使用される。例えば、Ｈａｒｌｏｗら．，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｕｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照されたい。
【００３０】
本明細書中にて使用されるごとく、「作成された抗体」は、選択された受容体抗体のＬおよび／またはＨ鎖可変ドメインの一部が選択されたエピトープにつき特異性を有する一種以上の供与体抗体からの類似した部分によって置換されたある種の改変された抗体、すなわち全長合成抗体（例えば、抗体断片に対するキメラまたはヒト化抗体）をいう。例えば、かかる分子は、非修飾Ｌ鎖（またはキメラＬ鎖）に関連したヒト化Ｈ鎖またはその逆により特徴付けられる抗体を含んでもよい。また、作成された抗体は、供与体抗体結合特異性を保持するために、受容体抗体Ｌおよび／またはＨ可変ドメイン骨格領域をコードする核酸配列の改変によっても特徴付けられる。これら抗体は、本明細書中に記載された供与体抗体由来のＣＤＲを有する受容体抗体から一つ以上のＣＤＲ（好ましくはすべて）の置換を含んでもよい。
【００３１】
「キメラ抗体」は、受容体抗体由来のＬおよびＨ鎖定常領域に関連した供与体抗体由来の天然の可変領域（Ｌ鎖およびＨ鎖）を含むある種の作成された抗体をいう。
【００３２】
「ヒト化抗体」なる語は、ＣＤＲが非−ヒト供与体免疫グロブリン由来であり、分子の免疫グロブリン−由来の残る部分が一種以上のヒト免疫グロブリン由来であるある種の作成された抗体をいう。加えて、骨格支持残基は保存された結合親和性に改変されてもよい。例えば、Ｑｕｅｅｎら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８６，１００２９−１００３２（１９８９）、Ｈｏｄｇｓｏｎら．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９，４２１（１９９１）を参照されたい。
【００３３】
「供与体抗体」なる語は、改変された免疫グロブリンコーディング領域および供与体抗体に特徴的な抗原特異性および中和活性を有する得られた発現された改変抗体を供するために、可変領域の核酸配列、ＣＤＲまたは他の機能的断片またはその類似体を第一の免疫グロブリンパートナーに与えるモノクローナルまたは組換え抗体をいう。本発明における使用に適当な供与体抗体は、ＢＣ２といわれるネズミ自己−制限的な中和モノクローナル抗体である。他の適当な供与体抗体は、ＢＣ１、９Ｅ４（２）Ｆ４、１１Ｇ４（１）Ｂ９、ＨＦＸＬＣおよびＨＦＸＩといわれるネズミ自己−制限的な中和モノクローナル抗体を含む。
【００３４】
「受容体抗体」なる語は、供与体抗体とは異種の、Ｈおよび／またはＬ鎖骨格領域および／またはＨおよび／またはＬ鎖定常領域をコードする核酸配列の全て、または一部を第一の免疫グロブリンパートナーに与えるモノクローナルまたは組換え抗体をいう。好ましくは、ヒト抗体は受容体抗体である。
【００３５】
「ＣＤＲ」は、免疫グロブリンＨおよびＬ鎖の超可変領域である抗体の相補性決定領域アミノ酸配列と定義される。例えば、Ｋａｂａｔら．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７）を参照されたい。免疫グロブリンの可変領域には３個のＨ鎖および３個のＬ鎖ＣＤＲまたはＣＤＲ領域がある。従って、本明細書中にて使用される「ＣＤＲ」は、適当な場合には、３個のＨ鎖ＣＤＲ全て、または３個のＬ鎖ＣＤＲ全て、またはＨおよびＬ両鎖ＣＤＲの全てをいう。
【００３６】
ＣＤＲは抗体の抗原またはエピトープへの結合につき大部分の定常残基を供する。本発明の関心事であるＣＤＲは、供与体抗体可変ＨおよびＬ鎖配列由来であり、類似体は、また、由来した供与体抗体と同一の抗原結合特異性および／または中和力も共有あるいは保持する天然のＣＤＲの類似体を含む。
【００３７】
「抗原結合特異性または中和力を有すること」は、例えば、ｍＡｂ ＢＣ２があるレベルの自己−制限的な中和活性により特徴付けられるけれども、適当な構造環境中でＢＣ２の核酸配列によりコードされるＣＤＲがより低い、あるいはより高い活性を有し得るということを意味する。それにも関わらず、かかる環境中でのＢＣ２のＣＤＲはＢＣ２と同一のエピトープを認識するであろうと期待される。
【００３８】
「機能的断片」は、断片が由来した抗体と同一の抗原結合特異性および／または中和力を保持する部分的なＨまたはＬ鎖可変配列（例えば、免疫グロブリン可変領域のアミノまたはカルボキシ末端の小さい欠失）である。
【００３９】
「類似体」は、修飾が化学的または数個のアミノ酸（すなわち１０個より少ない）の置換または転移であってもよい少なくとも１個のアミノ酸により修飾されたアミノ酸配列であり、修飾は、アミノ酸配列に生物学的特徴、例えば、非修飾配列の抗原特異性および高親和性を保持させる。例示的な類似体は、ＣＤＲ−コーディング領域内またはその周辺である種のエンドヌクレアーゼ制限部位を作る置換を介して構築できるサイレント変異を含む。
【００４０】
また、類似体は対立遺伝子変異も生じる。「対立遺伝子変異または修飾」は本発明のアミノ酸またはペプチド配列をコードする核酸配列の改変である。かかる変異または修飾は遺伝暗号の縮重によってもよく、あるいは、所望の特徴を供するように計画的に作成されてもよい。これら変異または修飾の結果、いずれかのコード化アミノ酸配列における改変を生じても生じなくてもよい。
【００４１】
「エフェクター剤」なる語は、改変された抗体および／または供与体抗体の天然または合成ＬまたはＨ鎖または供与体抗体の他の断片へ、慣用的な手法によって結合できる非−タンパク質担体分子をいう。かかる非−タンパク質担体は診断分野で使用される慣用的な担体、例えば、ポリスチレンまたは他のプラスチックビーズ、多糖類、例えば、バイアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））系、または、医学分野で有用で、ヒトおよび動物への投与が安全である他の非−タンパク質物質を含んでもよい。他のエフェクター剤は重金属原子または放射性同位元素をキレートする大環状体を含んでもよい。かかるエフェクター剤、例えば、ポリエチレングリコールはまた、改変された抗体の半減期を増加するにも有用である。
【００４２】
本発明の抗体、改変された抗体および断片の構築における使用につき、ウシ、ヒツジ、サル、ニワトリ、齧歯類（例えば、ネズミおよびラット）のごとき非−ヒト種がヒト凝固因子、好ましくは第ＩＸ／ＩＸａ、Ｘ／Ｘａ、ＸＩ／ＸＩａ、ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ、Ｖ／Ｖａ、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、またはトロンビン、またはそれから由来するペプチドエピトープでの記述上所望の免疫グロブリンを生ずるに用いられ得る。慣用的なハイブリドーマ技術が、非−ヒトｍＡｂを各凝固因子へ分泌するハイブリドーマ細胞系を供するに用いられる。ついで、かかるハイブリドーマは、９６穴プレートにコートされ、実施例セクションに記載されたごとく、第ＩＸ／ＩＸａ、Ｘ／Ｘａ、ＸＩ／ＸＩａ、ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ、Ｖ／Ｖａ、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、またはトロンビンを用いて結合につき、あるいはストレプトアビジン−コートされたプレートに結合したビオチン化された第ＩＸ／ＩＸａ、Ｘ／Ｘａ、ＸＩ／ＸＩａ、ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ、Ｖ／Ｖａ、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、またはトロンビンでスクリーニングされる。あるいは、十分にヒトｍＡｂが当業者に知られた技術により生じ得、本発明において使用される。
【００４３】
本発明のある例示的な、自己−制限的な中和ｍＡｂはｍＡｂ ＢＣ２、キメラまたはヒト化分子の開発に使用できるネズミ抗体である。ＢＣ２ｍＡｂは凝固時間に対する自己−制限的な阻害活性により特徴付けられる。ａＰＴＴアッセイにより測定される、凝固時間に対するＢＣ２ ｍＡｂの効果は最大値約１００秒を示す。また、ＢＣ２ ｍＡｂは第ＩＸａ因子とも結合し、第ＩＸ因子のＩＸａへの変換をも阻害し、かつ第ＩＸａ因子活性も阻害する。二価金属共因子が活性に必要であり、ｍＡｂはＭｎ２＋よりもＣａ２＋の方により選択性を示す。ａＰＴＴアッセイで測定されたＩＣ５０は約５０ｎＭである。ＢＣ２ ｍＡｂはラットと種交差−反応性を示しアイソタイプＩｇＧ２ａである。
【００４４】
他の望ましい供与体抗体はネズミｍＡｂ、ＢＣ１、９Ｅ４（２）Ｆ４および１１Ｇ４（１）Ｂ９である。これらｍＡｂは、凝固時間に対する自己−制限的な阻害活性により特徴付けられる。ａＰＴＴアッセイにより測定されたごとく、これらｍＡｂの凝固時間に対する効果は９Ｅ４（２）Ｆ４で約９０ないし１００秒および１１Ｇ４（１）Ｂ９で約８０秒の最大値を示す。また、ＢＣ１ ｍＡｂは、第ＩＸａ因子に結合し、第ＩＸａ因子活性も阻害するが、第ＩＸ因子のＩＸａへの変換は阻害しない。金属共因子はその活性には必要ではない。ａＰＴＴアッセイで測定されたＢＣ１のＩＣ５０は約３５ｎＭである。ＢＣ１ ｍＡｂはイソタイプＩｇＧである。
【００４５】
凝固時間において、自己／制限的な阻害活性により特徴付けられるさらにもう一つの所望の供与体抗体はネズミｍＡｂＨＦＸＬＣである。ａＰＴＴアッセイで測定された凝固時間に対するＨＦＸＬＣｍＡｂの効果は最大値約５０ないし６０秒を示す。ＨＦＸＬＣｍＡｂは因子Ｘ Ｌ鎖と結合し、第Ｘ／Ｘａ因子活性を阻害するａＰＴＴアッセイで測定されたＩＣ５０は約２０ｎＭである。
【００４６】
凝固時間において自己−制限的な阻害活性により特徴付けられるさらに別の望ましい供与体抗体は、ネズミｍＡｂ、ＨＦＸＩである。ａＰＴＴアッセイにより測定された、凝固時間に対するＨＦＸＩｍＡｂの効果は最大値約１００秒を示す。ＨＦＸＬＣ ｍＡｂ第ＸＩ因子と結合し、第ＸＩ／ＸＩａ因子活性を阻害する。ａＰＴＴアッセイで測定されたＩＣ５０は約３０ｎＭである。
【００４７】
作用の機構を考慮するいずれの各理論に結びつける意図はないとはいえ、これらｍＡｂは、部分的な阻害のみを達成することにより非−競合的またはアロステリックな機構によって凝固を制御するようである。
【００４８】
本発明は、ＢＣ１、ＢＣ２、９Ｅ４（２）Ｆ４、１１Ｇ４（１）Ｂ９、ＨＦＸＬＣ、ＨＦＸＩまたはその超可変（すなわちＣＤＲ）配列の使用を限定しない。従って、自己−制限的な中和活性および対応するＣＤＲにより特徴付けられるいずれの他の適当な高親和性抗体が置換されてもよい。ＢＣ１、ＢＣ２、９Ｅ４（２）Ｆ４、１１Ｇ４（１）Ｂ９、ＨＦＸＬＣまたはＨＦＸＩと以下に記載の供与体抗体の同定は、例示および記載の簡単のためにのみなされる。
【００４９】
また、本発明は、適当なヒト凝固因子または共因子に対するｍＡｂ由来のＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片の使用も含む。これら断片は、凝固因子、好ましくは第ＩＸ／ＩＸａ、Ｘ／Ｘａ、ＸＩ／ＸＩａ、ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ、Ｖ／Ｖａ、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子またはトロンビンに対し自己−制限的な中和活性を有する薬剤として有用である。Ｆａｂ断片は、Ｌ鎖全体およびＨ鎖のアミノ末端部分を含む。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ジスルフィド結合により結合した２個のＦａｂ断片より形成される断片である。ｍＡｂ ＢＣ１、ＢＣ２、９Ｅ４（２）Ｆ４、１１Ｇ４（１）Ｂ９、ＨＦＸＬＣおよびＨＦＸＩおよび他の同様の高親和性抗体は、慣用的方法、例えば、適当なタンパク質分解酵素、パパインおよび／またはペプシンでのｍＡｂの分解あるいは組換え方法により得られるＦａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片の源を供する。これらＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、それ自体で、治療的、予防的または診断的薬剤として、および本明細書中に記載の組換えまたはヒト化抗体の形成において有用な可変領域およびＣＤＲ配列を含む配列の供与体として有用である。
【００５０】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、組合せファージライブラリーを介して（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）を参照されたい）、あるいは免疫グロブリン鎖シャッフリングを介して（例えば、Ｍａｒｋｓら．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２）を参照されたい）構築でき、ここに、両文献は本明細書によってことごとく参考文献に取り込まれ、ここに、選択される抗体（例えば、ＢＣ２）由来のＦｄまたはｖＨ免疫グロブリンが、新規なＦａｂを形成するＬ鎖免疫グロブリン、ｖＬ（またはｖＫ）のレパートリーと結合させられる。逆に、選択される抗体由来のＬ鎖免疫グロブリンは、新規なＦａｂを形成するＨ鎖免疫グロブリン、ｖＨ（またはＦｄ）のレパートリーと結合させられてもよい。自己−制限的な中和する第ＩＸ因子Ｆａｂは、ｍＡｂ ＢＣ２のＦｄをＬ鎖のレパートリーと結合させることにより得られる。従って、誰でも鎖シャッフリング技術から特有の配列（ヌクレオチドおよびアミノ酸）で中和Ｆａｂを回収できる。
【００５１】
上記に記載のｍＡｂ ＢＣ２または他の抗体は、供与体抗体の抗原結合特異性により特徴付けされる種々の改変された抗体の設計および獲得に有用な可変Ｈおよび／またはＬ鎖ペプチド配列、骨格配列、ＣＤＲ配列、機能的断片およびその類似体、およびそれらをコードする核酸配列のごとき配列を与えることができる。
【００５２】
また、可変Ｌ鎖およびＨ鎖ペプチド配列をコードする本発明の核酸配列またはその断片は、ＣＤＲまたは骨格領域をコードする核酸配列内での特異的変異の導入にも、得られた修飾または融合核酸配列を発現用プラスミドに組み込むにも有用である。例えば、骨格およびＣＤＲ−コーディング領域の核酸配列内のサイレント置換は、変異源化されたＣＤＲおよび／または骨格領域の挿入を促進する制限酵素部位を作成するにも利用できる。これらＣＤＲ−コーディング領域は、本発明のヒト化抗体の構築において使用できる。
【００５３】
ＢＣ２ Ｈ鎖可変領域の核酸およびアミノ酸配列は、配列番号：５および７に載せられている。この領域由来のＣＤＲ配列は配列番号８、９および１０に載せられている。
【００５４】
ＢＣ２ Ｌ鎖可変領域の核酸およびアミノ酸配列は、配列番号：６および１１に載せられている。この領域由来のＣＤＲ配列は配列番号１２、１３および１４に載せられている。
【００５５】
遺伝暗号の縮重を考慮にいれると、本発明の可変ＨおよびＬ鎖アミノ酸配列およびＣＤＲ配列ならびに供与体抗体の抗原特異性を有する機能的断片およびその類似体をコードする種々のコード配列が構築できる。可変鎖ペプチド配列またはＣＤＲをコードする本発明の単離された核酸配列またはその断片は、作動可能に第二の免疫グロブリンパートナーと結合した場合、改変された抗体、例えば、キメラまたはヒト化抗体あるいは本発明の他の作成された抗体を生産するに使用できる。
【００５６】
本明細書中に記載された改変された抗体および抗体の部分をコードする単離された核酸配列に加えて、本来のＣＤＲ−コード配列と相補的な、またはＣＤＲ−コーディング領域の周辺の修飾されたヒト骨格領域に相補的な配列のごとき他のかかる核酸配列が本発明に含まれることに注意すべきである。有用なＤＮＡ配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下ＤＮＡ配列とハイブリダイズするこれら配列を含む。Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓら．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）ｐｐ．３８７−３８９を参照されたい。かかるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、６５℃にて４ｘＳＳＣ、しかる後、１時間６５℃にて０．１ｘＳＳＣで洗浄するハイブリダイゼーションである。あるいは、例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は４２℃にて５０％ホルムアミド、４ｘＳＳＣである。好ましくは、これらのハイブリダイズするＤＮＡ配列は少なくとも長さ１８ヌクレオチド、すなわち約ＣＤＲの大きさである。
【００５７】
改変された免疫グロブリン分子はキメラ抗体およびヒト化抗体のごとき作成された抗体を含む改変された抗体をコードできる。所望の改変された免疫グロブリンコーディング領域は、第ＩＸ／ＩＸａ、Ｘ／Ｘａ、ＸＩ／ＸＩａ、ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ、Ｖ／Ｖａ、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子またはトロンビン抗体、好ましくは本発明に提供されるヒト骨格またはヒト免疫グロブリン可変領域のごとき第一の免疫グロブリンパートナーへ挿入された高親和性抗体の抗原特異性を有するペプチドをコードするＣＤＲ−コーディング領域を含む。
【００５８】
好ましくは、第一の免疫グロブリンパートナーは作動可能に、第二の免疫グロブリンパートナーと結合される。第二の免疫グロブリンパートナーは上記に定義され、その第二の抗体領域、例えばＦｃ領域をコードする配列を含んでもよい。また、第二の免疫グロブリンパートナーは、ＬまたはＨ鎖定常領域がフレーム内に、またはリンカー配列の方法により融合されたもう一つの免疫グロブリンをコードする配列も含んでよい。凝固因子の機能的断片または類似体に向けられた作成された抗体は、同一の抗体との結合の促進を引き出すように設計されてもよい。
【００５９】
また、第二の免疫グロブリンパートナーは、第二の免疫グロブリンパートナーが作動可能に慣用的方法により結合する非−タンパク質担体分子を含む上記に定義されたエフェクター剤と結合してもよい。
【００６０】
第二の免疫グロブリンパートナー、例えば、抗体配列およびエフェクター剤間の融合または結合は、いずれの適当な方法、例えば、慣用的な共有またはイオン結合、タンパク質融合、あるいはヘテロ−二官能性架橋剤、例えばカルボジイミド、グルタルアルデヒドなどによってもよい。かかる方法は当該分野では知られており、慣用的化学および生化学の教科書に記載されている。
【００６１】
さらに、単に、第二の免疫グロブリンパートナーおよびエフェクター剤間の所望の広さの空間を供する慣用的なリンカー配列もまた、改変された免疫グロブリンコーディング領域へ構築されてよい。かかるリンカーの設計は当業者にはよく知られている。
【００６２】
さらに、本発明の分子のシグナル配列は発現を促進するために当業者に知られた方法により修飾される。
【００６３】
好ましい改変された抗体は、ｍＡｂ ＢＣ２、例えばｖＨおよびｖＬ鎖の抗原特異性を有する可変Ｈおよび／またはＬ鎖ペプチドまたはタンパク質配列を含む。本発明のさらにもう一つの所望の改変された抗体は、少なくとも１個、好ましくは全ての、残りの配列はヒト源由来のネズミ抗体分子ＢＣ２ Ｈおよび／またはＬ鎖の可変領域のＣＤＲ、またはその機能的断片または類似体を含むアミノ酸配列により特徴付けられる。
【００６４】
さらなる具体例において、本発明の改変された抗体は、付加的薬剤に結合していてもよい。例えば、組換えＤＮＡ技術は、完全な抗体分子のＦｃ断片またはＣＨ２ ＣＨ３ドメインが酵素または他の検出可能な分子（すなわち、ポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子）により置換されている本発明の改変された抗体を生産するに使用されてもよい。
【００６５】
また、第二の免疫グロブリンパートナーは、凝固因子、好ましくは第ＩＸ／ＩＸａ、Ｘ／Ｘａ、ＸＩ／ＸＩａ、ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ、Ｖ／Ｖａ、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子またはトロンビンに対する抗原特異性を有するＣＤＲを含む配列と異種である非−免疫グロブリンペプチド、タンパク質またはその断片と作動可能に結合されてもよい。得られたタンパク質は、発現時に非−免疫グロブリンの抗原特異性および特徴の両方を示してもよい。その融合パートナーの特徴は、例えば、もう一つの結合またはレセプタードメインのごとき機能特徴的、あるいは融合パートナー自体が治療的タンパク質または付加的な抗原特徴的である場合は治療特徴的であってよい。
【００６６】
本発明のもう一つの所望のタンパク質は、ＨおよびＬ鎖全長またはＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片のごときいずれのその必須の断片、Ｈ鎖二量体、またはＦｖまたは単鎖抗体（ＳＣＡ）のごときその最小限の組換え断片、または選択される供与体、例えば、ｍＡｂ ＢＣ１、ＢＣ２、９Ｅ４（２）Ｆ４、１１Ｇ４（１）Ｂ９、ＨＦＸＬＣまたはＨＦＸＩと同一の特異性を有するいずれの他の分子を有する完全な抗体分子を含んでもよい。かかるタンパク質は改変された抗体の形態で使用できるか、あるいはその非融合形態で使用できる。
【００６７】
第二の免疫グロブリンが供与体抗体、例えば、いずれのアイソタイプまたはクラスの免疫グロブリン骨格または定常領域と異なる抗体由来である場合はいつでも、作成された抗体が結果として生じる。作成された抗体は、ある源、例えば、受容体抗体、および供与体由来の１個以上の（好ましくは全ての）ＣＤＲ、例えば、本明細書中に記載の抗第ＩＸ／ＩＸａ、Ｘ／Ｘａ、ＸＩ／ＸＩａ、ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ、Ｖ／Ｖａ、ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子またはトロンビン抗体由来の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域および可変骨格領域を含み得る。さらに、核酸またはアミノ酸レベルでの受容体ｍＡｂＬおよび／またはＨ可変部位骨格領域または供与体ＣＤＲ領域の改変、例えば、欠失、置換、または付加は供与体抗体抗原結合特異性を保持するためになされる。
【００６８】
かかる作成された抗体は、凝固因子ｍＡｂ（所望により記載されたごとく修飾される）の可変Ｈおよび／またはＬ鎖の一つ（または両方）または１個以上のＨまたはＬ鎖のＣＤＲを使用するように設計されてもよい。本発明の作成された抗体は自己−制限的な中和活性を示す。
【００６９】
かかる作成された抗体は、選択されるヒト免疫グロブリンまたはサブタイプの骨格領域を含むヒト化抗体あるいは凝固因子抗体機能的断片と融合したヒトＨおよびＬ鎖定常領域を含むキメラ抗体を含んでもよい。適当なヒト（または他の動物）受容体抗体は、慣用的なデータベース、例えば、カバト（ＫＡＢＡＴ）データベース、ロス・アラモス（Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ）データベースおよびスイス・プロテイン（Ｓｗｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ）データベースから、供与体抗体のヌクレオチドおよび核酸配列との相同性により選択できるものであってよい。供与体抗体の骨格領域との相同性（アミノ酸ベースで）により特徴付けられるヒト抗体は、供与体ＣＤＲの挿入のＨ鎖可変骨格領域を供するに適当であり得る。Ｌ鎖可変骨格領域を供与できる適当な受容体抗体は同様にして選択できる。受容体抗体ＨおよびＬ鎖は同一の受容体抗体由来の必要がないことは注意すべきである。
【００７０】
好ましくは、異種の骨格および定常領域は、ＩｇＧ（サブタイプ１ないし４）、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥのごときヒト免疫グロブリンクラスおよびアイソタイプから選択される。しかしながら、受容体抗体はヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む必要はない。例えば、ある遺伝子はヒト免疫グロブリン鎖の部分をコードするＤＮＡ配列がポリペプチドエフェクターまたはレセプター分子のごとき非−ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に融合して構築できる。
【００７１】
特に好ましいヒト化抗体は、選択されるヒト抗体配列の骨格領域に挿入されるＢＣ２のＣＤＲを含む。ヒト化抗体の中和のために、因子ＩＸ抗体Ｈ鎖および／またはＬ鎖可変領域由来の１、２または好ましくは３個のＣＤＲが、後者の抗体の本来のＣＤＲを置き換えて選択されるヒト化抗体配列の骨格領域に挿入される。
【００７２】
好ましくはヒト化抗体において、ヒトＨおよびＬ鎖両鎖の可変ドメインは１個以上のＣＤＲ置換により作成されている。６個のＣＤＲ全て、または６個より少ないＣＤＲを種々の組み合わせで使用することが可能である。好ましくは、６個のＣＤＲ全てが置き換わる。ヒト受容体抗体由来の非修飾Ｌ鎖をＬ鎖として用い、ヒトＨ鎖のみでＣＤＲを置き換えることができる。さらに、別法として、適合するＬ鎖が、もう一つのヒト抗体から、慣用的な抗体データベースにより選択できる。作成された抗体の残りは適当ないずれの受容体ヒト免疫グロブリン由来であってもよい。
【００７３】
従って好ましくは、作成されたヒト化抗体は天然のヒト抗体またはその断片の構造を有し、効果的な治療上使用、例えば、ヒトにおける血栓および塞栓疾病の治療に必要な組み合わされた性質を有する。
【００７４】
最も好ましくは、ヒト化抗体は配列番号：３１、５２または８９に示されるＨ鎖アミノ酸配列を有する。また、配列番号：４４、５７、６２、７４、７８または９９に示されるＬ鎖アミノ酸配列を有するヒト化抗体も最も好ましい。Ｈ鎖が配列番号：３１に示されるアミノ酸配列を有しＬ鎖が配列番号：４４に示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体ＳＢ２４９４１３が特に好ましい。また、Ｈ鎖が配列番号：５２に示されるアミノ酸配列を有しＬ鎖が配列番号：５７に示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体ＳＢ２４９４１５も特に好ましい。また、Ｈ鎖が配列番号：５２に示されるアミノ酸配列を有しＬ鎖が配列番号：６２に示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体ＳＢ２４９４１６も特に好ましい。また、Ｈ鎖が配列番号：５２に示されるアミノ酸配列を有しＬ鎖が配列番号：７４に示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体ＳＢ２４９４１７も特に好ましい。また、Ｈ鎖が配列番号：５２に示されるアミノ酸配列を有しＬ鎖が配列番号：７８に示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体ＳＢ２５７７３１も特に好ましい。また、Ｈ鎖が配列番号：８９に示されるアミノ酸配列を有しＬ鎖が配列番号：９９に示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗体ＳＢ２５７７３２も特に好ましい。
【００７５】
当業者により、作成された抗体はさらに、供与体抗体の特異性および高親和性に必ずしも影響することなく可変部位アミノ酸における変化（すなわち類似体）によりさらに修飾できると理解されるであろう。ＨおよびＬ鎖アミノ酸は可変部位骨格またはＣＤＲまたは両者のいずれかにおいて、他のアミノ酸と置換できると期待される。これら置換は供与体抗体またはあるサブグループ由来のコンセンサス配列により供給できる。
【００７６】
さらに、定常領域は、本発明の分子の選択的性質を高めるか、あるいは減じるために変異させられる。例えば、二量体化、Ｆｃレセプターとの結合、または補体と結合活性化する能力（例えば、Ａｎｇａｌら．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，３０，１０５−１０８（１９９３）、Ｘｕら．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６９，３４６９−３４７４（１９９４）、Ｗｉｎｔｅｒら．，ＥＰ３０７４３４Ｂを参照されたい）。
【００７７】
キメラ抗体である改変された抗体は、ヒト免疫グロブリン定常領域と両鎖で関連して、骨格領域を含む非−ヒト供与体抗体Ｈ鎖およびＬ鎖可変領域全体を供することにより上記に記載されたヒト化抗体と異なる。本発明のヒト化抗体に対して付加的な非−ヒト配列を保持するキメラ抗体がヒトにおける重大な免疫反応を引き出せることが期待される。
【００７８】
かかる抗体は以下に記載の血栓および塞栓疾患の予防および治療に有用である。
【００７９】
好ましくは可変Ｌおよび／またはＨ鎖配列およびｍＡＢ ＢＣ２または他の適当な供与体ｍＡｂ、例えば、ＢＣ１、９Ｅ４（２）Ｆ４、１１Ｇ４（１）Ｂ９、ＨＦＸＬＣ、ＨＦＸＩおよびそのコードする核酸配列のＣＤＲが、以下の製法により、本発明の改変された抗体、好ましくはヒト化抗体の構築において利用される。また、同一または同様の技術が本発明の他の具体例を生じるにも用いられる。
【００８０】
選択される供与体ｍＡｂ、例えば、ネズミ抗体ＢＣ２を生産するハイブリドーマは都合よくは、クローニングされ、そのＨおよびＬ鎖可変領域のＤＮＡは当業者に知られた技術、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）記載の技術により得られる。少なくとも、供与体ｍＡｂ結合特異性を保持するに必要な受容体ｍＡｂ Ｌおよび／またはＨ可変部位骨格領域ならびに保持されるヒト免疫グロブリン由来の抗体鎖の免疫グロブリン−由来部分のＣＤＲ−コーディング領域およびその部分を含むＢＣ２の可変ＨおよびＬ領域は、ポリヌクレオチドプライマーおよび逆転写酵素を用いて得られる。ＣＤＲ−コーディング領域は公知のデータベースを用い、他の抗体との比較により同定される。
【００８１】
ついで、マウス／ヒトキメラ抗体が調製され、結合能がアッセイされる。かかるキメラ抗体は、両鎖のヒトＩｇ定常領域に関して、非−ヒト供与対抗体ｖＨおよびｖＬ領域全体を含む。
【００８２】
ヒト抗体由来のＨ鎖可変領域の相同な骨格領域はコンピューター化されたデータベース、例えば、ＫＡＢＡＴ（登録商標）を用いて同定され、ＢＣ２と相同性を有するヒト抗体が受容体抗体として選択される。ヒト抗体骨格内にＢＣ２ ＣＤＲ−コーディング領域を含む合成Ｈ可変領域の配列は、制限部位を組み込む骨格領域内での所望のヌクレオチド置換で設計される。ついで、この設計された配列は長い合成オリゴマーを用いて合成される。あるいは、設計された配列は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）で増幅され間違いを正された重複するオリゴヌクレオチドにより合成できる。適当なＬ鎖可変骨格領域は同様に設計できる。
【００８３】
ヒト化抗体はキメラ抗体から由来してもよく、あるいは好ましくは、ＨおよびＬ鎖由来の供与体ｍＡｂＣＤＲ−コーディング領域を適当に、選択されるＨおよびＬ鎖骨格内に挿入することにより合成的に作られる。あるいは、本発明のヒト化抗体は、標準的な突然変異誘発技術を用いて調製できる。従って、得られたヒト化抗体はヒト骨格領域および供与体ｍＡｂＣＤＲ−コーディング領域を含む。骨格領域が続いて操作されることもある。得られたヒト化抗体は組換え宿主細胞、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯまたはミエローマ細胞内で発現できる。他のヒト化抗体は、他の適当な因子ＩＸ−特異的または他の凝固因子−特異的、自己−制限的な、中和する、高親和性の非−ヒト抗体における技術を用いて調製できる。
【００８４】
慣用的な発現ベクターまたは組換えプラスミドは、宿主細胞内での複製および発現および／または宿主細胞からの分泌を制御する能力のある慣用的な制御配列と作動可能に関連して、これらのコーディング配列を改変された抗体と置換することにより生産できる。制御配列はプロモーター配列、例えば、ＣＭＶプロモーター、および他の公知の抗体由来であってもよいシグナル配列を含む。同様に、相補的な抗体ＬまたはＨ鎖をコードするＤＮＡ配列を有する第二次発現ベクターが生産できる。好ましくは、この第二次発現ベクターは、できる限り各ポリペプチド鎖が機能的に発現されることを保証するためのコーディング配列および選択的マーカーの点以外は第一次ベクターと同一である。あるいは、改変された抗体のＨおよびＬ鎖コーディング配列は単一ベクター上に存在してもよい。
【００８５】
選択される宿主細胞は慣用的手法により第一次および第二次ベクターの両方とともにコトランスフェクトされ（あるいは、単一ベクターにより単にトランスフェクトされ）、組み換えまたは合成ＬおよびＨ鎖の両方を含む本発明のトランスフェクトされた宿主細胞を作り出す。トランスフェクトされた細胞はついで、慣用的手法により培養され、本発明の作成された抗体を生産する。組み換えＨ鎖および／またはＬ鎖の両方の合同体を含むヒト化抗体はＥＬＩＳＡまたはＲＩＡのごとき適当なアッセイによって培養液からスクリーニングされる。同様な慣用的な手法が本発明の他の改変された抗体および分子を構築するに用いられる。
【００８６】
該方法で用いられるクローニングおよびサブクローニング行程に適当なベクターおよび本発明の組成物の構築は当業者により選択できる。アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）またはファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のごとき供給会社から商業的に手に入る例えば、ｐＵＣ１９のごときクローニングベクターｐＵＣシリーズが使用できる。さらに、迅速に複製する能力があり、多数のクローニング部位および選択遺伝子（例えば、抗生物質耐性）を有し、簡単に操作されるいずれのベクターもクローニング用に使用できる。従って、クローニングベクターの選択は本発明の制限因子とはならない。
【００８７】
同様に、本発明によって作成された抗体の発現に用いられるベクターはいずれの慣用的ベクターからも当業者により選択できる。また、ベクターは、選択された宿主細胞内での異種のＤＮＡ配列の複製および発現に向いた（ＣＭＶプロモーターのごとき）選択される制御配列も含む。これらベクターは、作成されたまたは改変された免疫グロブリンコーディング領域をコードする上記記載のＤＮＡ配列を含む。さらに、ベクターは、迅速な操作のための所望の制限部位の挿入により修飾された選択された免疫グロブリンを組み込める。
【００８８】
また、発現ベクターは、異種ＤＮＡ配列、例えば哺乳動物ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）の発現を増幅するに適当な遺伝子によっても特徴付けられる。他の好ましいベクター配列は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）およびベータグロビンプロモーター配列（ｂｅｔａｇｌｏｐｒｏ）のごときポリＡシグナル配列を含む。本明細書中にて有用な発現ベクターは当業者によく知られた手法により合成できる。
【００８９】
かかるベクター、例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、シグナル配列などの成分は、選択された宿主内で組換えＤＮＡの産物の発現および／または分泌を指示する使用につき、商業的または天然の源から得られるか、あるいは公知の方法により合成できる。また、哺乳動物、細菌、昆虫、酵母および真菌発現につき当該分野で知られている多数のタイプの他の適当な発現ベクターもこの目的に選択できる。
【００９０】
また、本発明は、作成された抗体またはその改変された免疫グロブリン分子のコーディング配列を含む組み換えプラスミドでトランスフェクトされた細胞系も含む。また、クローニングおよびこれらクローニングベクターの他の操作に有用な宿主細胞も慣用的である。しかしながら、最も望ましくは、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の種々の株由来の細胞がクローニングベクターの複製および本発明の改変された抗体の構築の他の工程に使用される。
【００９１】
本発明の作成された抗体または改変された抗体の発現に適当な宿主細胞または細胞系は好ましくはＣＨＯ、ＣＯＳ、繊維芽細胞（例えば、３Ｔ３）および骨髄細胞のごとき哺乳動物細胞、より好ましくはＣＨＯまたは骨髄細胞である。ヒト細胞用いられ、従って、分子をヒトグリコシル化パターンで修飾できる。あるいは、他の真核細胞系が用いられてもよい。適当な哺乳宿主細胞および形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび産物生産および精製の方法の選択は当該分野では公知である。例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋら．，を参照されたい。
【００９２】
細菌細胞は本発明の組換えＦａｂの発現に適当な宿主細胞として有用であると証明できる（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１３０，１５１−１８８（１９９２）を参照されたい）。しかしながら、細菌細胞内で発現されたタンパク質が折り畳まれていない、あるいは不適当に折り畳まれた形態で、あるいは非−グリコシル化形態である傾向があるため、細菌細胞内で生産されたいずれの組換えＦａｂも抗原結合能の保持につきスクリーニングされたであろう。細菌細胞によって発現された分子が適当に折り畳まれた形態で生産されていたならば、その細菌細胞は所望の宿主であったであろう。例えば、発現に用いられたイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の種々の株はバイオテクノロジーの分野では宿主細胞としてよく知られる。ビー・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、他の細菌などの種々の株もまた用いられる。
【００９３】
所望の場合は、当業者に知られる酵母細胞の株ならびに昆虫細胞、例えば、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）およびレピドプテラ（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）およびウィルス発現系もまた宿主細胞として有用である。例えば、Ｍｉｌｌｅｒら．，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８，２７７−２９８，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）およびそこに引用された参考文献を参照されたい。
【００９４】
本発明のベクターによる一般的な方法が構築され、本発明の宿主細胞を生産するに必要なトランスフェクション方法およびかかる宿主細胞から本発明の改変された抗体を生産するに必要な培養方法は全て慣用的手法である。同様に、いったん生産されると、本発明の改変された抗体は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む当該分野で標準的な方法により細胞培養液から精製できる。かかる手法は当業者の範囲内であり本発明を限定しない。
【００９５】
ヒト化抗体のさらにもう一つの発現方法は米国特許第４，８７３，３１６号に記載のごときトランスジェニック動物における発現を利用してもよい。これは、トランスジェニックに動物に組み込まれた場合、メスが所望の組換えタンパク質をその乳の中に生産する動物のカゼインプロモーターを用いる発現系に関する。
【００９６】
いったん所望の方法により発現されると、ついで、作成された抗体は、適当なアッセイの使用によりインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での活性を調べられる。現在、慣用的なＥＬＩＳＡアッセイ形式が因子ＩＸまたは他の適当な凝固因子に対して作成された抗体の定性的および定量的結合を評価するに用いられる。さらに、他のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）アッセイもまた、引き続く、通常の除去機構の代わりに体内での作成された抗体の耐性を評価するに行われるヒト臨床試験に先立ち、中和能を実証するに用いられる。
【００９７】
ＢＣ２から調製されるヒト化抗体につき記載の方法に従い、当業者もまた、本明細書中に記載の他の供与体抗体、可変配列およびＣＤＲペプチドからヒト化抗体を構築できる。作成された抗体は、作成された抗体の受容者により潜在的に「自己」として認識される可変領域骨格配列を有して生産できる。可変領域骨格に対するわずかな修飾が、受容者にとってかなり増加した免疫原性なしで抗原結合を大きく増加させられる。かかる作成された抗体は、効果的にヒトの凝固因子−介在疾患を治療できる。
【００９８】
本発明はまた、有効量の自己制限的な中和活性を有する抗−凝固因子モノクローナル抗体を投与することを含む動物、特にヒトの血栓の阻害方法にも関する。好ましくは、凝固因子は固有のまたは共通の凝固経路由来である。最も好ましくは、抗−凝固因子モノクローナル抗体は、抗−第ＩＸ因子、抗−第ＩＸａ因子、抗−第Ｘ因子、抗−第Ｘａ因子、抗−第ＸＩ因子、抗−第ＸＩａ因子、抗−第ＶＩＩＩ因子、抗−第ＶＩＩＩａ因子、抗−第Ｖ因子、抗−第Ｖａ因子、抗−第ＶＩＩ因子、抗−第ＶＩＩａ因子または抗−トロンビンである。ｍＡｂは、本明細書中に記載の１個以上の作成された抗体または改変された抗体またはその断片を含む。
【００９９】
あるいは、アセチルサリチル酸が抗−凝固因子モノクローナル抗体と組み合わされて投与できる。ある場合には、組合せ治療が抗−凝固因子モノクローナル抗体の治療的有効量を減じる。
【０１００】
本発明の分子の使用により誘導された治療反応は、各凝固因子との結合および引き続く自己制限的な凝固カスケードの阻害により生じる。従って、本発明の分子は、治療利用に適当な製剤および処方における場合は、心筋梗塞、不安定アンギナ、心棒房細動、発作、腎障害、肺塞栓症、深静脈血栓および人工器官およびプロテーゼ移植に関連するが、それに限定されない異常な凝固活性の疑いまたは経験のある患者にかなり望ましい。
【０１０１】
本発明の改変された抗体、その抗体および断片もまた、本発明の作成された抗体に対する疾患の原因である他のマーカー（エピトープ）と反応する他の抗体、特にヒトｍＡｂと共に用いられる。
【０１０２】
本発明の治療薬は、約１日ないし約３週間または必要に応じて異常な凝固疾患の治療に望ましいと信じられる。このことは、最近使用された抗凝固剤ヘパリンおよびワルファリンよりかなりの進歩を表す。治療の量および期間はヒト循環における本発明の分子の相対期間に関し、患者の治療されるべき疾患および一般的な健康状態に依存して当業者により調整できる。
【０１０３】
本発明の治療薬の投与形式は薬剤を宿主に送達するいずれの適当な経路でもよい。本発明の改変された抗体、抗体、作成された抗体およびその断片および医薬組成物は特に非経口投与、すなわち、皮下、筋肉内、静脈内または経鼻的投与に有用である。
【０１０４】
本発明の治療薬は、医薬上許容される担体内に有効成分として有効量の本発明の作成された（例えばヒト化）抗体を含む医薬組成物として調製できる。あるいは、本発明の医薬組成物はまた、アセチルサリチル酸も含む。本発明の予防薬において、作成された抗体を含む好ましくは生理学的ｐＨに緩衝された注射用に用意された形態の水溶性懸濁液または水溶液が好ましい。非経口投与用の組成物は、通常、本発明の作成された抗体の溶液または医薬上許容される担体、好ましくは水溶性担体に溶解したそのカクテルを含むであろう。例えば、０．４％セーライン、０．３％グリシンなどの種々の水溶性担体が用いられる。これらの溶液は滅菌され一般に粒子物質がない。これら溶液は、慣用的なよく知られた滅菌手法（例えば、濾過）により滅菌される。組成物は、ｐＨ調整および緩衝液などのごときおおよその生理的条件に必要な医薬上許容される補助物質を含む。かかる医薬処方における本発明の抗体濃度は、広範囲に、すなわち、体重につき約０．５％未満から、通常は体重につき１％または少なくとも１％、１５または２０％まで変化し、選択される投与様式に従って、まず溶液体積、粘度などに基づき選択されるであろう。
【０１０５】
従って、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝液、および約１ｎｇないし約１００ｍｇの間、例えば、約５０ｎｇないし３０ｍｇ以上、好ましくは約５ｍｇないし約２５ｍｇの本発明の作成された抗体を含むように調製される。同様に、静脈内点滴用の本発明の医薬組成物は、約２５０ｍｌの滅菌リンゲル液、および約１ｍｇないし約３０ｍｇ、好ましくは５ｍｇないし約２５ｍｇの本発明の作成された抗体を含むように作られる。非経口投与される組成物の実際の調製方法は良く知られているか、あるいは当業者には明らかであり、詳細には、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」，１５ｔｈｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａに記載される。
【０１０６】
医薬製剤の形態の場合、本発明の治療薬剤は単位投薬形で存在することが好まれる。適当な治療有効量は、当業者により迅速に決定できる。ヒトまたは他の動物における血栓または塞栓障害を効果的に治療するために、ｋｇ体重あたり一回用量約０．１ｍｇないし約２０ｍｇの本発明のタンパク質または抗体が非経口的に、好ましくは静脈内または筋肉内投与されるべきである。必要であれば、かかる用量が血栓反応の期間、医師により適当に選択された適当な時間間隔で繰り返される。
【０１０７】
本明細書中に記載の抗体、改変された抗体またはその断片は貯蔵のため凍結乾燥でき使用前に適当な担体中に復元できる。この手法は、慣用的な免疫グロブリンとともに効果的であり、当該分野で知られた凍結乾燥および復元手法が用いられる。
【０１０８】
今回、本発明は以下の具体的、非−制限的な実施例の記載と共に記載されるであろう。
【実施例１】
【０１０９】
抗−第ＩＸ因子モノクローナル抗体の調製およびスクリーニング
メスＢａｌｂ／Ｃマウスに、Ｊｅｎｎｙ，Ｒ．ら．，Ｐｒｅｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６，２２７−２４５（１９８６）に記載の精製されたヒト第ＩＸ因子を注射した。典型的には、各マウスは、リン酸−緩衝セーライン（ＰＢＳ）０．１５ｍｌに溶解し、フロイントの完全アジュバンド０．１５ｍｌと混合したタンパク質１００ｕｇを初期注射された。フロイントの不完全アジュバンド０．１５ｍｌと共にＰＢＳ０．１５ｍｌ中のタンパク質５０ｕｇのブースター免疫化が２−３ヶ月間に渡り約隔週でなされた。最終ブースト後、マウスは、脾臓／骨髄細胞融合前に３日ＰＢＳ中因子ＩＸ ５０ｕｇを受けた。脾臓細胞を免疫化マウスから単離し、Ｏｉ，Ｖ．Ｔ．ら，「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｍｉｃｈｅｌｌ，Ｂ．Ｂ．およびＳｈｉｇｉｉ，Ｓ．Ｍ．，ｅｄｓ．，Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏに記載のポリエチレングリコールを用いてＮＳ−１骨髄細胞と融合した（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ら．，Ｅｕｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，２９２−２９５（１９７６））。融合に続き、細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、アリコートを腹膜洗浄細胞−調整培地を含む２４−穴プレート４枚の各穴に置いた。翌日、各穴に１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地中２ｘ１０−４Ｍヒポキサンチン、８ｘ１０−７Ｍアミノプテリンおよび３．２ｘ１０−５Ｍチミジン１．０ｍｌを加えた。細胞は、３−４日毎に培地の半分を除去し、１ｘ１０−４Ｍヒポキサンチンおよび１．６ｘ１０−５Ｍチミジンを含む新鮮培地と交換することにより培養した。
【０１１０】
約２週後、各穴からハイブリドーマ培地１．０ｍｌを除去し、Ｊｅｎｎｙ，Ｒ．Ｊら．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２２，４００−４１６（１９９３）に記載のＥＬＩＳＡアッセイを用いて抗−第ＩＸ因子抗体を試験した。簡単には、第ＩＸ因子を９６−穴マイクロプレートのプラスチック穴に固定した。次いで、ハイブリドーマ上清または精製抗体の希釈液を穴内で培養した。穴を洗浄し、抗体−抗原複合体の存在を、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよび色素物質ｏ−ジアニシジンを包合したヤギ抗−マウス免疫グロブリン第二抗体で検出した。
【０１１１】
抗−第ＩＸ因子抗体を含む穴を制限希釈によりサブクローニングし、９６−穴プレート内で生育させた。クローン化されたハイブリドーマ細胞培養液からの上清を上記に記載のＥＬＩＳＡアッセイにより第ＩＸ因子に対する抗体をスクリーニングし、陽性ハイブリドーマからの細胞を膨張させ、凍結し、液体窒素中に貯蔵し、次いでマウス腹水癌として生育させた。
【実施例２】
【０１１２】
凝固における抗−凝固因子抗体の自己−制限的効果
ヒト血漿の活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）に対する抗−凝固因子抗体の増加する濃度の効果をフィブロメーター（ｆｉｂｒｏｍｅｔｅｒ）（メリーランド州、コッキスビル、ベクトン−ディキンソン・マイクロバイオロジー・システムズ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｏｋｅｙｓｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）で、バクスター（Ｂａｘｔｅｒ）参照方法ＬＩＢ０２９３−Ｊ、３／９３改訂（ニュージャージー州、エジソン、バクスター・サイエンティフィック（Ｂａｘｔｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を用いて測定した。
【０１１３】
実験開始前に、５ｍｌ管中の０．０２Ｍ ＣａＣｌ２ ２ないし３ｍｌをフィブロメーターの加熱したチャンバー内に置いた。ヒト血漿試料を新しく引き抜き氷上に置くか、あるいは、ヘモスタシス・レファランス・プラズマ（Ｈｅｍｏｓｉｔａｓｉｓ Ｒｅｆｅｒｎｃｅ Ｐｌａｓｍａ）（コネチカット州、グリーンウィック、アメリカン・ダイアグノスティクス（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，Ｃｏｎｎｅｔｉｃｕｔ））の製造者推奨により復元した。
【０１１４】
ブタ腸粘膜からの非分画ヘパリン（ミズーリ州、セント・ルイス、シグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ））、ブタ腸粘膜からの低分子量ヘパリン（ロベノックス（Ｌｏｖｅｎｏｘ（登録商標））、エノキサパリンナトリウム、ペンシルバニア州、コレゲビル、ローン−プーレンク・ローラー・ファーマシューティカルズ（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃｏｌｌｅｇｅｖｉｌｌｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ））またはｍＡｂ抗凝固剤を約５０ｕＭスットク溶液として調製し、供試血漿中に直接連続希釈した。抗凝固剤なしの血漿を含むブランクを参照として含んだ。
【０１１５】
２個のフィブロチューブ（ｆｉｂｒｏＴｕｂｅ（登録商標））フィブロメーター（ｆｉｂｒｏｍｅｔｅｒ）カップを供試血漿１００ｕｌまたは抗凝固剤入りの供試血漿１００ｕｌおよびアクチン活性化ケファロプラスチン試薬（アクチン試薬、エラグ酸中のウサギ脳ケファリンから、バクスター・サイエンティフィック（Ｂａｘｔｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から入手できる）でそれぞれ満たし、３７℃にてフィブロメーター（ｆｉｂｒｏｍｅｔｅｒ）の穴に置いた。
【０１１６】
１分後、アクチン試薬１００ｕｌを血漿を含むカップに移し、中身をピペットで数回混合した。３分インキュベーション後、あらかじめ３７℃で加温したＣａＣｌ２ １００ｕｌをオートマチックピペット／タイマー−トリガー（Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｐｏｐｅｔｔｅ／Ｔｉｍｅｒ−ｔｒｉｇｇｅｒ）（ベクトン−ディクソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｓｏｎ））を用いて、血漿−アクチン試薬混合液に添加した。凝固時間に注意し、図１の結果が総アッセイ体積３００ｕｌ中抗凝固剤の最終濃度の関数の凝固時間として示される。アッセイにおける第ＩＸ因子の名目濃度は３０−４０ｎＭである。
【０１１７】
図１に示される結果はマウス抗−第ＩＸ因子ｍＡｂ ＢＣ１およびＢＣ２の増加する濃度のａＰＴＴ凝固時間に対する効果を示す。両ｍＡｂはａＰＴＴを延長することにより凝固を阻害し、両ｍＡｂはａＰＴＴに対し、最終飽和効果に達する。ＩＣ５０値はＢＣ１およびＢＣ２それぞれにつき同様な〜３５ｎＭおよび５０ｎＭであるが、２個の抗体に対する最大反応の違いが特色付けられる。ＢＣ１の飽和濃度はａＰＴＴ時間を約５０％、〜４０秒まで増加する。他方、ＢＣ２はａＰＴＴ時間を３．５倍、約９０秒まで増加する。ヘパリンを用いる抗凝固治療において使用される治療標的ゾーンが強調される。この結果は、２個のｍＡｂがヘパリン治療ａＰＴＴ範囲の限界幅を確定することを示す。
【０１１８】
ｍＡｂ ＢＣ１およびＢＣ２の性質は表Ｉに要約する。各ＢＣ ｍＡｂは、チモーゲン、第ＩＸ因子ならびに活性プロテアーゼ、第ＩＸａ因子、を認識するが、ＢＣ２だけは、チモーゲン活性化ならびにプロテアーゼ活性の両者を阻害できる。ＢＣ１およびＢＣ２はカニクイザル第ＩＸ因子と交差反応することが分かった。さらに、ＢＣ２もまた、ラット第ＩＸ因子と交差反応した。
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
図２に示された結果は、抗−第ＩＸ因子ｍＡｂ ９Ｅ４（２）Ｆ４および１１Ｇ４（１）Ｂ９の増加する濃度のａＰＴＴ凝固時間に対する効果を示す。アッセイ用の血漿は、通常濃度の二分の一に希釈し、初期ａＰＴＴ、４５秒とした。両ｍＡｂはａＰＴＴの延長により凝固を阻害し、両ｍＡｂはａＰＴＴに対する最終飽和効果に達する。９Ｅ４（２）Ｆ４および１１Ｇ４（１）Ｂ９の飽和濃度は、ａＰＴＴを９Ｅ４（２）Ｆ４で〜９０ないし１００秒および１１Ｇ４（１）Ｂ９で〜８０秒に増加する。この結果は、２個のｍＡｂはヘパリン治療ａＰＴＴ範囲の上限であることを示す。
【０１２１】
図３に示された結果は、抗−第Ｘ因子ｍＡｂ ＨＦＸＬＣ（対Ｌ鎖エピトープ）、ＨＦＸＨＣ（対Ｈ鎖エピトープ）および抗−第ＸＩ因子ｍＡｂ ＨＦＸＩの増加する濃度のａＰＴＴ凝固時間に対する効果を示す。これらｍＡｂはエンザイム・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ）（インディアナ州、サウス・ベンド（Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ，ＩＮ））から得た。ｍＡｂＨＦＸＬＣおよびＨＦＸＩはａＰＴＴの延長により凝固を阻害し、両ｍＡｂはａＰＴＴに対する最終飽和効果に達する。ＨＦＸＬＣのＩＣ５０値は〜４０ｎＭ；飽和濃度は、ａＰＴＴを６０秒まで増加させる。ＨＦＸＩのＩＣ５０値は〜２０ｎＭ；飽和濃度は、ａＰＴＴを１００秒まで増加させる。この結果はＨＦＸＬＣはヘパリン治療ａＰＴＴ範囲内にある一方ＨＦＸＩはヘパリン治療範囲の上限に下がることを示す。ｍＡｂ ＨＦＸＨＣはａＰＴＴ凝固時間に何の影響も与えない。
【０１２２】
ａＰＴＴの自己−制限的な延長もまた、第ＶＩＩＩ因子に対する抗体、第ＩＸａ因子に対する共因子に観察される。例えば、抗−ヒト第ＶＩＩＩ因子抗体、アフィニティー・バイオロジカルズ・インク（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）から購入したＳＡＦ８Ｃ−ＩＧはａＰＴＴを最大約６５秒まで増加させた。ａＰＴＴの最大延長の二分の一は約１００ｎＭの抗体で達成された。
【実施例３】
【０１２３】
ラット血栓モデルにおけるネズミ第ＩＸ因子ｍＡｂの能力
動脈血栓予防における抗−第ＩＸ因子抗体の能力を評価するために、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら．，Ｊ．Ｃａｒｄｉｏ．Ｐｈａｒｍ．２２，５２６−５３３（１９９３）に報告されたラット冠動脈血栓モデルを採用した。このモデルは、冠動脈表面にＦｅＣｌ３溶液を適用することにより生じる酸素ラジカルによる冠動脈内皮の分節傷害から成る。
【０１２４】
簡単には、ラットを、ペントバルビトンナトリウムで麻酔し、頚静脈に静脈注射のカニューレを挿入し、左大腿動脈に血圧および心拍数モニターのカニューレを挿入した。冠動脈は外科的切開術という無菌的手法により首で単離し、血流測定用マグネチックフロープローブ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｌｏｗ ｐｒｏｂｅ）を装備した。安定化期間後、ベースラインパラメーターを以下の変数により確立した：冠動脈血流、動脈圧、心拍数、活性部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）およびプロトロンビン時間（ＰＴ）。しかる後に、５０％ＦｅＣｌ３溶液に浸したあらかじめ測定したワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）濾紙を内皮細胞を完全に傷害するため１５分間冠動脈においた。ＦｅＣｌ３に浸した濾紙を除去後、６０分以上放置して実験は完了した。実験の終わりに、動脈血栓を動脈から抽出し、重さを量った。
【０１２５】
冠動脈傷害の着手に先立ち、全薬剤を１５分投与した。以下の処理を試験し、第ＩＸ因子ｍＡｂ ＢＣ２と比較した。
【０１２６】
１．ヘパリン：１５、３０、６０または１２０Ｕ／ｋｇボーラス、その後、それぞれ０．５、１、２または４Ｕ／ｋｇ／分、６０分以上の注入
２．アセチルサリチル酸（ＡＳＡ、アスピリン）：５ｍｇ／ｋｇボーラス
３．抗−第ＩＸ因子ｍＡｂ ＢＣ２：１、３または６ｍｇ／ｋｇボーラス、その後、それぞれ０．３、１、または２ｕｇ／ｋｇ／分、６０分以上の注入
４．ヘパリン：３０Ｕ／ｋｇボーラス＋１Ｕ／ｋｇ／分＋５ｍｇ／ｋｇＡＳＡ
５．抗−第ＩＸ因子ｍＡｂ ＢＣ２：１ｍｇ／ｋｇ＋０．３Ｕｇ／ｋｇ／分＋５ｍｇ／ｋｇＡＳＡ
【０１２７】
図４および５は、ヘパリン、ＡＳＡおよび抗−第ＩＸ因子ｍＡｂ ＢＣ２のａＰＴＴに対する（図４）およびＰＴに対する（図５）効果を示すことにより抗−凝固因子／血栓レジメの比較薬理学を示す。
【０１２８】
出血素因、ａＰＴＴの鍵となる指標は、能力評価の一次判定基準対研究に用いられた抗−凝固／血栓薬剤の出血傾向として用いられた。図４の結果は、試験限界を超えて２種のより高い用量で、凝固時間の最大延長でヘパリンによるａＰＴＴの用量依存性延長を示す。ＡＳＡ単独では、有意にａＰＴＴを増加させないが、ヘパリンと組み合わせると特色付けられた相乗効果が見られた。第ＩＸ因子ｍＡｂは高用量においてさえ、ａＰＴＴに対する効果があまり大きくなく、凝固時間の増加は、臨床的に行われた標準的な抗−凝固剤の３倍を超えなかった。とりわけ、ＡＳＡと組み合わされた低用量の第ＩＸ因子ｍＡｂ ＢＣ２はａＰＴＴを変化させなかった。
【０１２９】
図５では、データはＰＴもまた２種の高用量で、有意にヘパリンにより、およびＡＳＡ−ヘパリンの組み合わせによって、延長されるが、いずれの第ＩＸ因子ｍＡｂ 用量単独、またはＡＳＡとの組み合わせでは延長されなかったことを示す。
【０１３０】
ヘパリン、ＡＳＡおよび第ＩＸ因子ｍＡｂの冠動脈閉塞に対する効果が図６に示される。結果は、傷害に反応して全ての担体−処理動物の冠動脈が閉塞することを示す。ヘパリンは、依存的に冠動脈塞栓を阻害する。最高用量では、ヘパリンは完全に冠動脈塞栓を阻害する；しかしながら、この量では、凝固は開始し得なかった。ＡＳＡ単独では、冠動脈塞栓にはわずかな効果しかなかった。ヘパリンと組み合わせたＡＳＡもまた完全には冠動脈塞栓を阻害できなかった。第ＩＸ因子ｍＡｂは、臨床的に所望の標的より凝固を延長しない２種の高用量で完全に冠動脈塞栓を阻害した。主として、開存性のみを保証できない低用量の第ＩＸ因子ｍＡｂでは、ＡＳＡと組み合わせて投与した場合、冠動脈塞栓の完全阻害を示した。
【０１３１】
ヘパリン、ＡＳＡおよび第ＩＸ因子ｍＡｂの血栓重量に対する効果を図７に示す。ヘパリンは用量−依存的に冠動脈の血栓量を減じた。しかしながら、いく分かの残存する血栓が、まだ凝固の完全阻害の代わりに冠動脈において見つけられた。ＡＳＡ単独またはヘパリンとの組み合わせでは（３０Ｕ／ｋｇレジメ）血栓重量には部分的効果しかなかった。第ＩＸ因子ｍＡｂは血栓量を用量−依存的に減じ、高用量は実質的には完全に血栓形成を阻害した。さらに、低用量の抗−第ＩＸ因子ｍＡｂおよびＡＳＡの組み合わせ、凝固指標に有害な影響を与えずに冠動脈塞栓を完全に阻害したレジメは、完全に血栓形成を阻害した。
【０１３２】
ラット冠動脈血栓モデルにおいてなされた研究は明らかに、高度に血栓のできた動脈傷害モデルにおける血栓の阻害における第ＩＸ因子ｍＡｂの能力を示す。とりわけ、第ＩＸ因子ｍＡｂの能力はａＰＴＴにより定義される所望の治療的抗凝固剤標的内で示された。さらに、ヘパリン、最近の標準的な抗凝固剤は、非−凝固血を生成する程度まで厳しく凝固を妥協させる量でのみ第ＩＸ因子ｍＡｂと同等の能力に達した。興味深いことに、ヘパリンとのＡＳＡ結合処理により得られた相乗作用および共力作用もまた、ＡＳＡが抗−第ＩＸ因子ｍＡｂと与えられた場合にも示された。しかしながら、結果、抗−血栓および抗−凝固の両効果の相乗作用が生じたヘパリンおよびＡＳＡの組み合わせとは異なり、第ＩＸ因子ｍＡｂおよびＡＳＡの組み合わせは、エキソビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で血液凝固パラメーターに矛盾のない効果を与えないで抗−血栓能力の相乗作用を生じた。まとめると、データはヘパリン、ＡＳＡまたはヘパリンおよびＡＳＡの組み合わせと比較して第ＩＸ因子ｍＡｂのすぐれた抗血栓能力を示す。
【実施例４】
【０１３３】
ラット血栓モデルの走査型電子顕微鏡
ラット冠動脈の分節を、模擬の、塩化鉄のみ、および塩化鉄＋６ｍｇ／ｋｇ第ＩＸ因子抗体、３／群、塩化鉄適用１５分後から集めた。動脈をホルムアルデヒド潅流により固定し、外傷面の上部および下部を結合した。固定した動脈を脱水し、ヘキサメチルジシラザン中でインキュベートし、デシケーター中で乾燥した。乾燥した動脈を縦に開き、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）スタブ上に置き、金でスパッタリングコートした。
【０１３４】
模擬動脈のＳＥＭは、稀にしか散乱しない血小板内の正常な内皮を本質的に示した。おそらく外科的処理の間の機械的な損傷の結果の内皮に２−３の破壊があり、底にある基底膜が血小板の広がりにより覆われていた。模擬ラットには血栓形成の証拠は何も見られなかった。
【０１３５】
塩化鉄処理した動脈のＳＥＭは、管の内腔の大部分を占める大きな壁在性血栓を示した。血栓は、凝集した血小板、赤血球および無定形、原線維のタンパク様物質から成った。タンパク様物質はフィブリンと調和した。動脈内皮はほぼ大きな血栓に覆い隠された。見えるところは、塩化鉄処理された領域の上にある内皮が多数の吸着血小板および無定形タンパク様物質で覆われた。
【０１３６】
第ＩＸ因子抗体でも処理されたラット由来の塩化鉄処理した動脈のＳＥＭは、主として血栓のない管面を示した。塩化鉄処理した領域の上にある内皮は、広範な損傷を示し、吸着血小板および血小板凝集で覆われた面もあったが、タンパク様物質はほとんどまたは全くなかった。
【実施例５】
【０１３７】
抗−第ＩＸ因子ｍＡｂ ＢＣ２ ＨおよびＬ鎖ｃＤＮＡ配列分析
トリリエージェント（ＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ）（オハイオ州、シンシナティー、モレキュラー・リサーチ・センター・インク（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ））を用いて、製造者のプロトコルにより総ＲＮＡを精製した。ＲＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、０．５％ＳＤＳに溶解し、０．５Ｍ ＮａＣｌに調整した。ポリＡ＋ＲＮＡをダイナビーズ・オリゴ（ｄＴ）２５（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｏｌｏｇｏ （ｄＴ）２５）（ニューヨーク州、レイクサクセス、ダイナル・エー・エス（Ｄｙｎａｌ Ａ．Ｓ．，Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ））で、製造者プロトコルにより単離した。ポリＡ＋ＲＮＡをビーズから溶出し、ＴＥ緩衝液に再懸濁した。ＲＮＡ１００ｎｇのアリコート１２個を製造者説明書（ボーアリンジャー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）カタログ番号１４８３−１８８）によって、ｄＴオリゴをプライマーとして用い、ＲＴ−ＰＣＲキットで逆転写した。Ｈ鎖は６個のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＰＣＲ増幅を、ネズミＩｇＧ２ａヒンジプライマー（配列番号：１）およびＨ鎖シグナル配列プライマー（配列番号：２）を用いて２５サイクルで行った。同様に、Ｌ鎖は、ネズミカッパプライマー（配列番号：３）および変質したＬ鎖シグナル配列プライマー（配列番号：４）を用いて２５サイクルで行われた。１２個の増幅の各々からのＰＣＲ産物はＰＣＲ２０００ベクター（ティーエークローニングキット（ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ）インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号Ｋ２０００−０１）に連結した。組み換えクローンのコロニーをランダムに取り、プラスミドＤＮＡのミニ調製をＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７，１５１３（１９７９）に記載のアルカリ抽出法を用いて行った。単離されたプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し、０．８％アガロースゲル上分析した。適当な大きさ、すなわち、Ｈ鎖で〜７００ｂｐおよびＬ鎖で〜７００ｂｐの二本鎖ｃＤＮＡインサートをサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）法の修飾法で配列決定した。１２個のＨおよびＬ鎖全ての配列を比較し、コンセンサスＢＣ２Ｈ可変領域配列（配列番号：５）およびコンセンサスＢＣ２Ｌ鎖可変領域配列（配列番号：６）が生じた。
【０１３８】
ＢＣ２Ｈ鎖可変領域ｃＤＮＡの配列分析により、１２１個のアミノ酸配列（配列番号：７）をコードする３６３個のヌクレオチドのオープンリーディングフレームが示された。Ｈ鎖ＣＤＲ１、２および３配列をそれぞれ、配列番号：８、９および１０に載せた。
【０１３９】
ＢＣ２Ｌ鎖可変領域ｃＤＮＡの配列分析を１０７個のアミノ酸配列（配列番号：１１）をコードする３２１個のヌクレオチドのオープンリーディングフレームを示した。Ｌ鎖ＣＤＲ１、２および３配列をそれぞれ、配列番号：１２、１３および１４に載せた。
【実施例６】
【０１４０】
ヒト化抗体
ＳＢ２４９４１３、ＳＢ２４９４１５、ＳＢ２４９４１６、ＳＢ２４９４１７、ＳＢ２５７７３１およびＳＢ２５７７３２に設計された６個のヒト化抗体をヒト抗体骨格に上記に記載のマウスＣＤＲを含むように設計した。
【０１４１】
ＳＢ２４９４１３
ＳＢ２４９４１６はＨ鎖Ｆ９ＨＺＨＣ１−０およびＬ鎖Ｆ９ＨＺＨＣ１−０を含む。合成可変領域ヒト化Ｈ鎖Ｆ９ＨＺＨＣ１−０を、免疫グロブリンＲＦ−ＴＳ３’ＣＬ（カバト（Ｋａｂａｔ）データベースにＫａｂｐｒｏ：Ｈｈｃ１０ｗと同定されたＣａｐｒａ，Ｊ．Ｄ．ら．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８６，１３２０−１３２８（１９９０））および上記記載のＢＣ２Ｈ鎖ＣＤＲから得られたＨ鎖の最初の３個の骨格領域を用いて設計した。ＣＤＲ提示に影響するような骨格アミノ酸置換はなかった。４個の重複する合成オリゴヌクレオチドが生じ（配列番号：１５、１６、１７および１８）、それは、アニールし、伸長すると、Ｈ鎖可変領域全体を表しＣＤＲ３を含むアミノ酸（配列番号：１９および２０）をコードする。次いで、この合成遺伝子をＰＣＲプライマー（配列番号：２１および２２）を用いて増幅し、ｐＣＲ２０００ベクター（ティーエークローニングキット（ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ）、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号Ｋ２０００−０１）に連結し、Ｓｐｅ Ｉ、Ｋｐｎ Ｉ制限消化から単離した。可変領域の最初の５個のアミノ酸を含むキャンパスシグナル配列（配列番号：２３および２４）をコードする第二ＤＮＡ断片を、２個のプライマー（配列番号：２６および２７）によるヒト化抗−呼吸系シンシチウムウィルスＨ鎖（配列番号：２５）をコードする構築物の適当な領域をＰＣＲ増幅および制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ、Ｓｐｅ Ｉでの切断により作った。生じた２個の断片を、ヒトコンセンサス骨格４およびＩｇＧ１定常領域の残りを含むＥｃｏ ＲＩ、Ｋｐｎ Ｉで切断したｐＦＨＺＨＣ２−６ｐＣＤ哺乳動物細胞発現ベクターに連結した。ベクターは、公開された国際出願第９４／０５６９０号に記載のｐＦＨＺＨＣ２−３ｐＣＤの単一のアミノ酸変異を含んだ。骨格２の最後の残基（残基４９）が、Ｘｂａ ＩおよびＥｃｏ Ｒ５によるｐＦＨＺＨＣ２−３ｐＣＤの切断および２個の合成オリゴヌクレオチド（配列番号２８および２９）から生じるリンカーの挿入によりＳｅｒからＡｌａに変異した。Ｆ９ＨＺＨＣ １−０インサートの配列は配列番号：３０および３１に示す。
【０１４２】
合成可変領域ヒト化Ｌ鎖Ｆ９ＨＺＬＣ １−０は、免疫グロブリンＬＳ８’ＣＬ（Ｃａｒｍａｃｋら．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９，１６３１−１６４３（１９８９） カバト（Ｋａｂａｔ）データベースにＫａｂｐｒｏ：Ｈｋｌ３１８と同定された）および上記記載のＢＣ２Ｌ鎖ＣＤＲから得られたヒトＬ鎖の骨格領域を用いて切断された。ＣＤＲ提示に影響するような骨格アミノ酸置換はなかった。２個の重複する合成オリゴヌクレオチドが生じ（配列番号：３２および３３）、それは、アニールし、伸長すると、Ｌ鎖可変領域を表すアミノ酸（配列番号：３４および３５）をコードする。次いで、この合成遺伝子をＰＣＲプライマー（配列番号：３６および３７）を用いて増幅し、ｐＣＲ２０００ベクター（ティーエークローニングキット（ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ）、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号Ｋ２０００−０１）に連結し、Ｓｃａ Ｉ、Ｓａｃ ＩＩ制限消化から単離した。可変領域の最初の２個のアミノ酸を含むキャンパスシグナル配列をコードする第二ＤＮＡ断片（配列番号：３８および３９）を、２個のプライマー（配列番号：２６および４０）によるヒト化抗−呼吸系シンシチウムウィルスＨ鎖（配列番号：２５）をコードする構築物の適当な領域のＰＣＲ増幅および制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ、Ｓｃａ Ｉでの切断により作った。生じた２個の断片を、ヒト骨格４およびカッパ定常領域の残りを含むＥｃｏ ＲＩ、Ｓａｃ ＩＩで切断したｐＦＨｚＬＣ１−２ｐＣＮ哺乳動物細胞発現ベクターに連結した。ベクターは、公開された国際出願第９４／０５６９０号に記載のｐＦＨＺＬＣ１−１ｐＣＮの単一のアミノ酸変異を含んだ。骨格２の残基が、Ｓｍａ ＩおよびＫｐｎ ＩによるｐＦＨＺＬＣ１−２ｐＣＮの切断および２個の合成オリゴヌクレオチド（配列番号４１および４２）から生じるリンカーの挿入によりＳｅｒからＰｒｏに変異した。Ｆ９ＨＺＨＣ １−０インサートの配列は配列番号：４３および４４に示す。
【０１４３】
ＳＢ２４９４１５
ＳＢ２４９４１５はＨ鎖Ｆ９ＨＺＨＣ１−１およびＬ鎖Ｆ９ＨＺＬＣ１−１を含む。これらＨおよびＬ鎖はそれぞれ、Ｆ９ＨＺＨＣ１−０およびＦ９ＨＺＬＣ１−０に基づくが、ＣＤＲ提示に影響する骨格アミノ酸置換を有する。
【０１４４】
Ｈ鎖Ｆ９ＨＺＨＣ１−１は、ＣＤＲ提示に影響するような骨格アミノ酸置換を有する。２個の重複する合成オリゴヌクレオチドが生じ（配列番号：４５および４６）、それは、アニールし、伸長すると、改変されたＨ鎖可変領域改変部分を表すアミノ酸（配列番号：４７および４８）をコードする。次いで、この合成遺伝子をＰＣＲプライマー（配列番号：４９および５０）を用いて増幅し、ｐＣＲ２０００ベクター（ティーエークローニングキット（ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ）、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号Ｋ２０００−０１）に連結し、Ｅｃｏ ＮＩ、Ｋｐｎ Ｉ制限消化から単離した。この断片をＥｃｏ ＮＩ、Ｋｐｎ Ｉ 消化したＦ９ＨＺＨＣ１−０（配列番号：３０）ベクターに連結した。Ｆ９ＨＺＨＣ１−１インサートの配列は配列番号：５１および５２に示す。
【０１４５】
Ｆ９ＨＺＬＣ １−１は、ＣＤＲ提示に影響するような４個の骨格アミノ酸置換を有する。２個の重複する合成オリゴヌクレオチドが生じ（配列番号：５３および５４）、それは、アニールすると、Ｋｐｎ ＩおよびＢａｍ ＨＩ粘着末端を有し、Ｌ鎖可変領域の改変部分を表すアミノ酸（配列番号：５５）をコードする。Ｆ９ＨＺＬＣ１−０（配列番号：４３）を制限酵素Ｋｐｎ ＩおよびＢａｍ ＨＩで消化し、合成ＤＮＡに連結した。Ｆ９ＨＺＨＣ １−１インサートの配列は配列番号：５６および５７に示す。
【０１４６】
ＳＢ２４９４１６
ＳＢ２４９４１６はＨ鎖Ｆ９ＨＺＨＣ１−１（上記記載）（配列番号：５２）およびＬ鎖Ｆ９ＨＺＬＣ１−２を含む。Ｌ鎖構築物は、Ｆ９ＨＺＬＣ１−１に基づくが、ＣＤＲ提示に影響する１個の付加的骨格アミノ酸置換を有する。
【０１４７】
２個の合成オリゴヌクレオチドが生じ（配列番号：５８および５９）、それは、アニールすると、Ｂａｍ ＨＩおよびＸｂａ Ｉ粘着末端を有し、Ｌ鎖可変領域変異部分を表すアミノ酸（配列番号：６０）をコードする。Ｆ９ＨＺＬＣ１−１（配列番号：５６）ベクターを制限酵素Ｂａｍ ＨＩおよびＸｂａ Ｉで消化し、合成ＤＮＡに連結した。Ｆ９ＨＺＬＣ １−２インサートの配列は配列番号：６１および６２に示す。
【０１４８】
ＳＢ２４９４１７
ＳＢ２４９４１７はＨ鎖Ｆ９ＨＺＨＣ１−１（上記記載）（配列番号：５２）およびＬ鎖Ｆ９ＨＺＬＣ２−０を含む。Ｆ９ＨＺＬＣ２−０合成可変領域ヒト化Ｌ鎖は、免疫グロブリンＲＥＩ（ＰａｌｍおよびＨｉｌｓｃｈｍａｎｎ，Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３５４，１６５１−１６５４（１９７３）、カバト（Ｋａｂａｔ）データーベースにＫａｂｐｒｏ：ＨＫＬ１１１と同定）および上記に記載のＢＣ２Ｌ鎖ＣＤＲから得られたヒトＬ鎖の骨格領域を用いて設計された。５個のアミノ酸コンセンサスヒト置換が導入された。ＣＤＲ提示に影響できる６個の骨格アミノ酸ネズミ置換が作られた。２個の重複する合成オリゴヌクレオチドが生じ（配列番号：６３および６４）、それは、アニールし、伸長すると、Ｌ鎖可変領域を表すアミノ酸（配列番号：６５および６６）をコードする。次いで、この合成遺伝子をＰＣＲプライマー（配列番号：６７および６８）を用いて増幅し、ｐＣＲ２０００ベクター（ティーエークローニングキット（ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ）、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号Ｋ２０００−０１）に連結し、Ｓｃａ Ｉ、Ｓａｃ ＩＩ制限消化から単離した。可変領域の最初の２個のアミノ酸を含むキャンパスシグナル配列をコードする第二ＤＮＡ断片（配列番号：３８）を、２個のプライマー（配列番号：２６および６９）によるヒト化抗−呼吸系シンシチウムウィルスＨ鎖（配列番号：２５）をコードする構築物の適当な領域のＰＣＲ増幅および制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ、Ｓｃａ Ｉでの切断により作った。ヒト骨格４（配列番号：７０）の残りをコードし、Ｓａｃ ＩＩおよびＮａｒ Ｉ粘着末端を有する第三ＤＮＡ断片が２個の合成オリゴヌクレオチド（配列番号：７０および７２）をアニールすることにより生じた。Ｆ９ＨＺＬＣ １−０（配列番号：４３）を制限酵素Ｅｃｏ ＲＩおよびＮａｒ Ｉで消化し、３個のＤＮＡ断片に連結した。Ｆ９ＨＺＬＣ ２−０インサートの配列は配列番号：７３および７４に示す。
【０１４９】
ＳＢ２５７７３１
ＳＢ２５７７３１はＨ鎖Ｆ９ＨＺＨＣ１−１（配列番号：５２）およびＬ鎖Ｆ９ＨＺＬＣ１−３、Ｆ９ＨＸＬＣ１−２（配列番号：６２）の単一アミノ酸変異を含む。Ｆ９ＨＺＬＣ１−２を２個のプライマー（配列番号：２６および６９）を用いて増幅し、制限酵素Ｅｃｏ ＲＩおよびＳｃａ Ｉで消化した。９４ｂｐの断片（配列番号：７５および７６）が単離された。断片をＥｃｏ ＲＩ、Ｓｃａ Ｉで消化したＦ９ＨＺＬＣ１−２ベクターに連結しＬ鎖構築物Ｆ９ＨＺＬＣ１−３が生じた。Ｆ９ＨＺＬＣ １−３インサートの配列は配列番号：７７および７８に示す。
【０１５０】
ＳＢ２５７７３２
ＳＢ２５７７３２は合成可変領域ヒト化Ｈ鎖Ｆ９ＨＺＨＣ３−０およびＬ鎖Ｆ９ＨＺＬＣ３−０を含む。４個の重複する合成オリゴヌクレオチドが生じ（配列番号：７９、８０、８１および８２）、それは、アニールし、伸長すると、改変したＨ鎖可変領域を表すアミノ酸（配列番号：８３および８４）をコードする。次いで、この合成遺伝子をＰＣＲプライマー（配列番号：８５および８６）を用いて増幅し、ｐＣＲ２０００ベクター（ティーエークローニングキット（ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ）、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号Ｋ２０００−０１）に連結し、Ｓｔｕ Ｉ、Ｋｐｎ Ｉ制限消化から単離した。単離した断片をＳｔｕ Ｉ、Ｋｐｎ Ｉで消化したＦ９ＨＺＨＣ１−１（配列番号：５２）に連結した。次いで、シグナル配列を除去するため、このベクターをＥｃｏ ＲＩ、Ｓｐｅ Ｉで消化した。可変領域の最初の５個のアミノ酸を含むキャンパスシグナル配列をコードするＤＮＡ断片（配列番号：２３）を、２個のプライマー（配列番号：２６および８７）でのＦ９ＨＺＨＣ１−０のＰＣＲ増幅および制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ、Ｓｐｅ Ｉでの切断により作った。生じた断片をベクターに連結した。Ｆ９ＨＺＨＣ ３−０インサートの配列は配列番号：８８および８９に示す。
【０１５１】
４個の重複する合成オリゴヌクレオチドが生じ（配列番号：９０、９１、９２および９３）、それは、アニールし、伸長すると、Ｌ鎖可変領域を表すアミノ酸（配列番号：９４および９５）をコードする。次いで、この合成遺伝子はＰＣＲプライマー（配列番号：９６および９７）を用いて増幅し、ｐＣＲ２０００ベクター（ティーエークローニングキット（ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ）、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号Ｋ２０００−０１）に連結し、Ｓｃａ Ｉ、Ｎａｒ Ｉ制限消化から単離した。単離したＤＮＡ断片を、Ｓｃａ Ｉ、Ｎａｒ Ｉ制限消化したＦ９ＨＺＬＣ１−３（配列番号：７７）ベクターに連結した。Ｆ９ＨＺＬＣ ３−０インサートの配列は配列番号：９８および９９に示す。
【０１５２】
ヒト化抗−第ＩＸ因子 ｍＡｂはＣＨＯ細胞内で発現された。血漿−フリー培地中での懸濁生育に採用されたＤＧ−４４細胞系は、２５０ｍｌの使い捨ての滅菌エーレンマイヤーフラスコ（コーニング（Ｃｏｒｉｎｇ））内で１ｘヌクレオシドおよび０．０５％Ｆ６８を含むタンパク質−フリー培地 １００ｍｌ中、イノーバ２１００（Ｉｎｎｏｖａ ２１００）プラットフォーム・シェイカー（ニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））で１５０ｒｐｍ、３７℃にて５％ＣＯ２、９５％空気湿潤インキュベーターで生育した。これら細胞を４ｘ１０５細胞／ｍｌで週に二回、移し変えた。ｐＣＮ−Ｌｃ−Ｌ鎖およびｐＣＤ−Ｈｃ−Ｈ鎖ベクター各１５ｕｇをＮｏｔ Ｉ消化により直鎖化し、滅菌条件下共沈殿させ、１Ｘ ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）５０ｕｌに再懸濁した。バイオ−ラッド・ジーン・パルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ）（バイオ−ラッド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、Ｈｅｎｓｌｅｙら．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２３９４９−２３９５８（１９９４）の方法を用いてＤＮＡをＡｃｃ−０９８細胞内へエレクトロポレートした。１．２Ｘ１０７細胞を氷冷ピービースクロース（ＰＢＳｕｃｒｏｓｅ）（ＰＢＳ、２７２ｍＭ スクロース、７ｍＭリン酸ナトリウム ｐＨ７．４、１ｍＭ ＭｇＣｌ２）で一度洗浄し、ＰＢＳ ０．８ｍｌに再懸濁し、ＤＮＡ溶液５０ｕｌに添加し、氷上１５分間インキュベートした。細胞は３８０Ｖ、２５マイクロファラッドでパルスし、次いで氷上で１０分間インキュベートした。選択に先立ち、２４時間保持培地中に５ｘ１０５細胞／プレートで細胞を９６穴培養プレートに平板化した。保持培地中、細胞を４００ｕｇ／ｍｌ Ｇ４１８（ゲネチシン、ライフ・テクノロジーズ、インク（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ））耐性につき選択した。アッセイ前２４時間、細胞を保持培地１５０ｕｌで生育させた。
【０１５３】
個々のコロニーからの調整培地をオリゲン・アナライザー（Ｏｒｉｇｅｎ ａｎａｌｙｚｅｒ）（アイ・ジー・イー・エヌ、インク（ＩＧＥＮ，Ｉｎｃ．））でエレクトロケミルミネセンス（ＥＣＬ）検出法を用いてアッセイした。Ｙａｎｇら．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２，１９３−１９４（１９９４） を参照されたい。
【０１５４】
アッセイを行い（アッセイ緩衝液）、アナライザーを操作する（細胞クリーナー）に必要なあらゆる溶液は、アイ・ジー・イー・エヌ（ＩＧＥＮ）から得た。抗体（抗−ヒトＩｇＧ（ｇ−鎖特異的）、シグマ・ケミカルズ（Ｓｉｇｎａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）およびＦ（ａｂ’）２、ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するＦ（ａｂ’）２断片、カーケガード・アンド・ペリー・ラボラトリーズ・インク（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．））をＴＡＧ：タンパク質 ７：１モル比にてＴＡＧ−ＮＨＳ−エステル（アイ・ジー・イー・エヌ（ＩＧＥＮ））で標識したが、一方タンパク質Ａ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））をビオチン：タンパク質、２０：１のモル比にてビオチン−ＬＣ−スルフォ−ＮＨＳ−エステル（アイ・ジー・イー・エヌ、インク（ＩＧＥＮ，Ｉｎｃ．））で標識した。両方法ともアイ・ジー・イー・エヌ（ＩＧＥＮ）の推奨によった。ステプタビジン−コートしたマグネチックビーズ（Ｍ−２８０）はダイナル（Ｄｙｎａｌ）から得た。
【０１５５】
イムノアッセイは以下のプロトコルで行った：試料につき、ステプタビジン−コートビーズ５０ｕｌ（ＰＢＳで希釈した最終濃度６００ｕｇ／ｍｌ、ｐＨ７．８、１．２５％Ｔｗｅｅｎ）を、ビオチン−タンパク質Ａ（ＰＢＳで希釈した最終濃度１ｕｇ／ｍｌ、ｐＨ７．８、１．２５％Ｔｗｅｅｎ）と混合し、室温にて撹拌しながら１５分間インキュベートし、ＴＡＧ抗体５０ｕｌ（１．２５％Ｔｗｅｅｎと、ＰＢＳで希釈した最終濃度１．２５ｕｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するＦ（ａｂ’）２断片および０．２５ｕｇ／ｍｌの抗−ヒトＩｇＧ（ｇ−鎖特異的））を添加し、次いで、溶液を調整培地５０ｕｌに添加し、室温にて撹拌しながら１時間インキュベートした。アッセイ緩衝液２００ｕｌを反応混合物に添加し、試料をオリゲンＩ（Ｏｒｉｇｅｎ Ｉ）アナライザーで分析しＥＣＬを測定した。結果、アッセイしたコロニーの約２０−３７％が１５ｎｇ／ｍｌを越える抗体を分泌し、平均発現は約１５０ｎｇ／ｍｌであることが示された。
【０１５６】
プロセップＡ（Ｐｒｏｃｅｐ Ａ）捕獲段階、続きＤＮＡ荷重を減じるイオン−交換クロマトグラフィーを用いてヒト化抗−第ＩＸ因子ｍＡｂを調整培地から精製した。プロセップＡ（Ｐｒｏｃｅｐ Ａ）ソーベント物質（イギリス、ダラム、バイオプロセシング・エルティーディー（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｌｔｄ．，Ｄｕｒｈａｍ，Ｅｎｇｌａｎｄ））を用い、直径対高さ比１：１のカラムを調製した。澄んだ調整培地を約１５０ｃｍ／時間でカラムにロードした。カラムを連続的にリン酸緩衝セーライン（ＰＢＳ）、１Ｍ ＮａＣｌを含むＰＢＳ、最終的にはＰＢＳで洗浄した。結合した物質は０．１Ｍ酢酸溶液で回収した。溶出液をｐＨ５．５に調整し、水で（１：４）希釈した。希釈溶液を２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、８０ｃｍ／時間であらかじめ平衡化したＳ−セファロースカラム（２．５ｘ１３ｃｍ）にロードした。安定したベースラインが得られるまで、カラムを酢酸緩衝液で洗浄し、結合タンパク質が２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、２５ｃｍ／時間で溶出した。溶出した物質を０．４ミクロンメンブレンで濾過し４℃にて貯蔵した。
【実施例７】
【０１５７】
マウス−ヒトキメラ抗体
製造者説明書（ボーアリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）カタログ番号１４８３−１８８）により、プライマーとしてｄＴオリゴを用いてＲＴ−ＰＣＲキットでＢＣ２ＲＮＡ １００ｎｇを逆転写し、合成Ｓｃａ Ｉ（配列番号：１００）およびＮａｒ Ｉ（配列番号：１０１）プライマーでＰＣＲ増幅し、Ｓｃａ １、Ｎａｒ １末端を有するＢＣ２Ｌ鎖可変領域（配列番号１０２および１０３）を生産した。ＤＮＡをＳｃａ Ｉ、Ｎａｒ Ｉ消化したＦ９ＨＺＨＣ１−３（配列番号７７）に連結し、Ｓｃａ Ｉ、Ｎａｒ Ｉで消化しマウス−ヒトキメラＬ鎖Ｆ９ＣＨＬＣ（配列番号：１０４および１０５）が生じた。
【０１５８】
製造者説明書（ボーアリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｎｇｅｒ Ｍｎｎｈｅｉｍ）カタログ番号１４８３−１８８）により、プライマーとしてｄＴオリゴを用いてＲＴ−ＰＣＲキットでＢＣ２ＲＮＡ １００ｎｇを逆転写し、合成Ｓｐｅ Ｉ（配列番号：１０６）およびＮｈｅ Ｉ（配列番号：１０７）プライマーでＰＣＲ増幅し、Ｓｐｅ Ｉ、Ｎｈｅ Ｉ末端を有するＢＣ２ Ｈ鎖可変領域（配列番号：１０８および１０９）を生産した。キャンパスシグナル配列をＥｃｏ ＲＩ（配列番号２６）およびＳｐｅ Ｉ（配列番号８７）プライマーでＲＳＶＨＺ１９Ｈ鎖（配列番号：２５）からＰＣＲ増幅した。これら２個のＤＮＡ断片をＥｃｏ ＲＩ、Ｎｈｅ Ｉ消化した公開された国際出願第９５／０７３０１号に記載のＩＬ４ＣＨＨＣｐｃｄベクターに連結し、ＩＬ４可変領域をＢＣ２第ＩＸ因子マウス可変領域に置き換え、マウス−ヒトキメラＨ鎖Ｆ９ＣＨＨＣ（配列番号：１１０および１１１）が生じた。
【０１５９】
マウス−ヒトキメラ抗体ｃｈαＦＩＸのコトランスフェクションおよび精製はヒト化構築物につき上記に記載のごとく行われた。
【実施例８】
【０１６０】
ラット血栓モデルにおけるヒト化第ＩＸ因子ｍＡｂの能力
動脈血栓の阻害においてヒト化抗−第ＩＸ因子抗体の能力を評価するために、実施例３に記載のラット冠動脈血栓モデルを用いた。冠動脈血流、動脈圧、心拍数、管開存性および活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）につきベースラインパラメーターを確立した。１５分後、冠動脈傷害を１０分間行った。冠動脈傷害を始めた後６０分パラメーターを測定した。冠動脈血栓もまた、冠動脈から抽出し重さを量った。
【０１６１】
あらゆる試薬は冠動脈傷害を始める１５分前に静脈内に投与した。抗−第ＩＸ因子 ｍＡｂ ＢＣ２に対する以下の処理を調査、比較した。
【０１６２】
１．担体
２．ｃｈαＦＩＸ：３ｍｇ／ｋｇ ボーラス
３．ＳＢ ２４９４１３：３ｍｇ／ｋｇ ボーラス
４．ＳＢ ２４９４１５：３ｍｇ／ｋｇ ボーラス
５．ＳＢ ２４９４１６：３ｍｇ／ｋｇ ボーラス
６．ＳＢ ２４９４１７：３ｍｇ／ｋｇ ボーラス
７．ＳＢ ２５７７３１：３ｍｇ／ｋｇ ボーラス
８．ヘパリン：６０単位／ｋｇ ボーラス＋２単位／ｋｇ／分注入
【０１６３】
研究に用いた抗−凝固剤／血栓剤の能力対出血傾向の評価の一次的判断基準としてａＰＴＴが用いられた。図８の結果は、ヒト化第ＩＸ因子 ｍＡｂ ＳＢ ２４９４１３、ＳＢ ２４９４１５、ＳＢ ２４９４１６、ＳＢ２４９４１７およびＳＢ ２５７７３１が臨床的に許容される範囲内である３．０ｍｇ／ｋｇでａＰＴＴに適度な効果を有することを示す。
【０１６４】
第ＩＸ因子ｍＡｂの血栓質量に対する効果を図９に示す。結果は全てのヒト化ｍＡｂが血栓質量を減じるに等しく効果的であることを示す。
【０１６５】
ラット冠動脈血栓モデルにおいて行われた研究によ利明らかに高度にトロンボゲン形成の冠動脈傷害モデルにおける血栓阻害におけるヒト化第ＩＸ因子ｍＡｂの能力が示された。とりわけ、全てのヒト化第ＩＸ因子ｍＡｂの能力がａＰＴＴに定義される所望の治療抗凝固標的内に示された。
【実施例９】
【０１６６】
抗体の生化学的および生物物理学的性質
ＳＢ２４９４１７の分子量はＭＡＬＤ−ＭＳにより１４８，０００Ｄａと測定された。ＳＢ２４９４１７の分析学的超遠心は同一の値であった。第ＩＸ因子プラスＣａ２＋の存在下では、ＢＣ２由来抗体はｍＡｂおよび因子ＩＸの２個の分子の組み合わされた質量に対応する２４８，０００Ｄａの質量で沈降した。第ＩＸ因子の存在または不存在でも、高度の凝集の証拠は観察されなかった。
【０１６７】
ＳＢ２４９４１７に結合する第ＩＸ因子の動力学は、固定したタンパク質Ａ表面に結合した抗体でのバイアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）分析により評価される。４９ｎＭにおける組み換えヒト第ＩＸ因子（ｒｈＦＩＸ、ジェニティクス・インスティテュート（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））が用いられ、５ｍＭＣａ２＋存在下で測定を行った。相互作用は、速い会合により特徴付けられ、ｋａｓｓ＝２．０ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１、比較的ゆっくりなオフレート、ｋｄｉｓｓ＝４．１ｘ１０−４ｓ−１であった。第ＩＸ因子結合につき算出されたＫｄは１．９ｎＭであった。
【０１６８】
表１にＳＢ２４９４１７の生物物理学的性質を要約する。
表１
Ｂ２４９４１７の生物物理学的性質の概要
【０１６９】
【表２】
【０１７０】
表２には本発明のｍＡｂの因子ＩＸ結合性質を要約する。算出された解離定数は、実験誤差内で本質的に同一であった。
表２
抗−第ＩＸ因子ｍＡｂに対する第ＩＸ因子結合の動力学
【０１７１】
【表３】
【０１７２】
ｒｈＦＩＸおよびＳＢ２４９４１７間、ＢＣ２および他のヒト化構築物間の相互作用は、結合の固有熱からの溶液内での結合相互作用を測定するティトレーション・マイクロカロリーメトリーにより特徴付けられる。１０６ｕＭ ＦＩＸの９回の注射が２ｕＭ ｍＡｂ ＳＢ２４９４１７を含むカロリーメーターへなされた。最初の４回の注射は発熱として結合が検出された。最後の５回の注射では、ｍＡｂの結合部位がＦＩＸで飽和し、バックグラウンドの混合熱が観測された。結果は、期待されたとおり、モル結合比２付近ＦＩＸ対ｍＡｂで平衡点となることを示した。データのノンリニア・リースト・スクエア・アナリシス（ｎｏｎｌｅｎｅａｒ ｌｅａｓｔ ｓｑｕａｒｅｓ ａｎａｌｙｓｉｓ）により結合親和性が算出された。
【０１７３】
ｍＡｂのｒｈＦＩＸ親和性は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中に、３４−４４℃の温度範囲にわたり測定された。これらデータは３７℃における親和性は直接測定され、２５℃における親和性はファント・ホッフ（ｖａｎ’ｔ Ｈｏｆｆ）式から算出された。表３のデータは、ＳＢ２４９４１７、ＢＣ２およびその他のヒト化構築物の親和性が誤差範囲内（２の因子）で同じであることを示す。
【０１７４】
表３
抗−ＦＩＸｍＡｂのティトレーションカロリーメトリー結果
【０１７５】
【表４】
【０１７６】
ｍＡｂ ＳＢ２４９４１３、ＳＢ２４９４１５、ＳＢ２４９４１７およびＳＢ２５７７３２は全て、示差走査熱量計により非常に類似した熱安定性を示した。それらの折り畳まれていないＴｍｓは７０−７５℃の範囲であり、熱誘導変性に対し高い安定性を示した。
【実施例１０】
【０１７７】
第ＩＸ因子の抗体−介在阻害機構
相同性のあるタンパク質第ＶＩＩ因子の骨格に第ＩＸ因子をスプライスした配列から成るキメラ構築物のライブラリーを構築し、第ＩＸ因子ＢＣ２ｍＡｂのエピトープをマッピングするに用いた。Ｃｈｅｕｎｇら．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．８０，４１９−４２７（１９９５）を参照されたい。バイアコア（ＢｉａＣｏｒｅ）２０００表面プラスモン共鳴デバイスを用いて、結合を測定した。ＢＣ２抗体はＮＨＳ／ＥＤＣ反応を用いてチップと直接カップリングさせた。接触時間２分、２５ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２中の２００ｎＭの各構築物で結合を測定した。タンパク質の含まれない同一の緩衝液を用いて３分間解離をモニターした。５０ｍＭ ＥＤＴＡ存在下、野生型の構築物では結合は検出されなかった。データを表４に示す。
【０１７８】
表４
ＢＣ２抗体に対する第ＩＸ因子構築物の結合の概要
【０１７９】
【表５】
【０１８０】
これらデータは第ＩＸ因子 Ｌ鎖および第ＶＩＩ因子 Ｈ鎖（ＩＸ ＬＣ／ＶＩＩ ＨＣ）；第ＩＸ因子ｇｌａおよび芳香族スタックドメイン（ＩＸ−Ａ／ＶＩＩ）；第ＶＩＩ因子ｇｌａドメイン内の第ＩＸ因子ｇｌａドメインの残基３−１１（ＶＩＩ ｇｌａ（ＩＸ３−１１）／ＩＸ）；および残基５でリジンからアラニンへの置換を有する第ＩＸ因子（ＩＸ Ｋ５Ａ）を含む構築物はＢＣ２との結合を表すことを示す。ＶＩＩ ｇｌａ（ＩＸ ３−１１）／ＩＸ構築物は野生型第ＩＸ因子（血漿ＩＸａおよびｒ−ＩＸ）と等価なＢＣ２結合を表した。従って、ＢＣ２抗体は第ＩＸ因子ｇｌａドメインの残基３−１１内に含まれたエピトープと結合する。
【０１８１】
本発明は、その精神または本質的な特性から離れることなしに他の具体的形態に具体化でき、従って、本発明の範囲を示す前記の明細書よりも後記の請求の範囲を参照するべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】ネズミ抗−第ＩＸ因子ｍＡｂ ＢＣ１およびＢＣ２での正常なヒト血漿の力価を測定する実験結果のグラフである。
【図２】ネズミ抗−第ＩＸ因子ｍＡｂ ９Ｅ４（２）Ｆ４および１１Ｇ４（１）Ｂ９での正常なヒト血漿の力価を測定する実験結果のグラフである。
【図３】ネズミ抗−第Ｘ因子ｍＡｂ ＨＦＸＨＣおよびＨＦＸＬＣおよびネズミ抗−第ＸＩ因子ｍＡｂ ＨＦＸＩでの正常なヒト血漿の力価を測定する実験結果のグラフである。
【図４】ラット冠動脈血栓モデルにおける６０分での活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）に対するヘパリン、アセチルサリチル酸およびネズミ第ＩＸ因子ｍａｂの効果を測定する実験結果のヒストグラムである。
【図５】ラット冠動脈血栓モデルにおける６０分でのプロトロンビン時間に対する、ヘパリン、アセチルサリチル酸、およびネズミ第ＩＸ因子 ｍａｂの効果を測定する実験結果のヒストグラムである。
【図６】ラット冠動脈血栓モデルにおける冠動脈血流の閉塞に対するヘパリン、アセチルサリチル酸およびネズミ第ＩＸ因子ｍａｂの効果を測定する実験結果のヒストグラムである。
【図７】ラット冠動脈血栓モデルにおける血栓重量に対するヘパリン、アセチルサリチル酸およびネズミ第ＩＸ因子ｍａｂの効果を測定する実験結果のヒストグラムである。
【図８】ラット冠動脈血栓モデルにおける６０分でのａＰＴＴに対する、ヘパリン、ネズミ第ＩＸ因子ｍａｂ ＢＣ２、キメラ第ＩＸ因子 ｍａｂ およびヒト化第ＩＸ因子 ｍＡｂの効果を測定する実験結果のヒストグラムである。
【図９】ラット冠動脈血栓モデルにおける血栓重量に対するヘパリン、ネズミ第ＩＸ因子ｍａｂ ＢＣ２、キメラ第ＩＸ因子ｍａｂおよびヒト化第ＩＸ因子ｍＡｂの効果を測定する実験結果のヒストグラムである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリンＨ鎖相補性決定領域、配列番号：８、９および１０よりなる群より選択されるアミノ酸配列。
【請求項２】
請求項１記載の免疫グロブリン相補性決定領域をコードする核酸分子。
【請求項３】
免疫グロブリンＬ鎖相補性決定領域、配列番号：１２、１３および１４からなる群より選択されるアミノ酸配列。
【請求項４】
請求項３記載の免疫グロブリン相補性決定領域をコードする核酸分子。
【請求項１】
免疫グロブリンＨ鎖相補性決定領域、配列番号：８、９および１０よりなる群より選択されるアミノ酸配列。
【請求項２】
請求項１記載の免疫グロブリン相補性決定領域をコードする核酸分子。
【請求項３】
免疫グロブリンＬ鎖相補性決定領域、配列番号：１２、１３および１４からなる群より選択されるアミノ酸配列。
【請求項４】
請求項３記載の免疫グロブリン相補性決定領域をコードする核酸分子。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００７−３２５６０２（Ｐ２００７−３２５６０２Ａ）
【公開日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２０４０１２（Ｐ２００７−２０４０１２）
【出願日】平成１９年８月６日（２００７．８．６）
【分割の表示】特願平９−５２６２０７の分割
【原出願日】平成９年１月１７日（１９９７．１．１７）
【出願人】（５９１００２９５７）スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション (341)
【氏名又は名称原語表記】ＳＭＩＴＨＫＬＩＮＥ ＢＥＥＣＨＡＭ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【出願人】（５０７２６４８６０）ユニバーシティ・オブ・バーモント・アンド・ステイト・アグリカルチュラル・カレッジ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＶＥＲＭＯＮＴ ＡＮＤ ＳＴＡＴＥ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＣＯＬＬＥＧＥ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月６日（２００７．８．６）
【分割の表示】特願平９−５２６２０７の分割
【原出願日】平成９年１月１７日（１９９７．１．１７）
【出願人】（５９１００２９５７）スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション (341)
【氏名又は名称原語表記】ＳＭＩＴＨＫＬＩＮＥ ＢＥＥＣＨＡＭ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【出願人】（５０７２６４８６０）ユニバーシティ・オブ・バーモント・アンド・ステイト・アグリカルチュラル・カレッジ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＶＥＲＭＯＮＴ ＡＮＤ ＳＴＡＴＥ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＣＯＬＬＥＧＥ
【Ｆターム（参考）】
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