血液―脳隔壁エピトープとその利用
本発明は、膜間領域タンパク質３０Ａ（ＴＭＥＭ３０Ａ）の新たな抗原のアイソフォームの使用による、血液―脳隔壁を通過可能な試剤の同定および抗体の生成の方法を特徴とする。これは血液―脳隔壁を経ての移行の機構の確立に有用である。これらの抗原は他の内皮細胞に比して脳内皮において豊富であり、トランスフェリンおよびインシュリン受容体に比して脳輸送のよりよい選択性および容量を持ちうる。抗原の１つがＴＭＥＭ３０Ａである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜間領域タンパク質３０Ａ（ＴＭＥＭ３０Ａ）の新たな抗原のアイソフォームの使用による、血液―脳隔壁を通過可能な試剤の同定および抗体の生成の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
新たなラマ単一領域抗体、ＦＣ５およびＦＣ４４が同定されている。これらの抗体は脳内皮細胞の表面において抗原に結合し、それから脳内へ移行する。これらの抗体およびエピトープへの親和性を持つ他の接着質は、他の分子（治療、診断の）を脳へと輸送するベクターとして有用である。
血液―脳隔壁を経てトランスサイトーシスを受ける受容体に対する抗体が、脳への薬剤または治療ペプチドを標的とするベクターとして用いられている。生体外でヒト大脳内皮細胞を、生体内で血液―脳隔壁を経て移行する新たな単一領域抗体、ＦＣ５が近来、同定されている。ここで、ＦＣ５の血液―脳隔壁を経るヒト大脳内皮細胞上の、その推定上の受容体へのエンドサイトーシスおよびトランスサイトーシスの可能な機構を、ＦＣ５とその受容体への他の接着質とともに開示する。この受容体は脳標的薬剤配送ベクターを発達させる新たな標的となりうる。
脳毛細管内皮は、薬剤の中枢神経系への侵入に対する強固な隔壁を形成する。大脳内皮細胞（ＣＥＣ）を封鎖する緊密な接合部は、治療薬剤を含む循環化合物が細胞間経路を経て脳に達することを防止する。ＣＥＣの他の特異な特徴としては、開窓の欠如、ピノサイトーシス小胞の数が少ないこと、管腔表面の高い負電化を帯びた糖衣がある。流出ポンプの発現とＣＥＣの高酵素活性が、治療上の脳への配送に対するさらなる隔壁となる。
ペプチド、タンパク質およびオリゴヌクレオチドを含む生物工学製品は、トランスサイトーシスとして知られるＣＥＣを経る小胞輸送による脳への配送を為しうる。これは、配位子とＣＥＣの管腔表面で発現する成分の特異的あるいは非特異的な相互作用を要する過程であり、配位子のエンドサイトーシス小胞への内在化、内皮細胞質を経る移動、およびＣＥＣの外側面でのエキソサイトーシスを開始させる。ＣＥＣにおける異なるエンドサイトーシス経路が述べられている。ａ）マクロピノサイトーシス、大型タンパク質の内在化のランダム経路、ｂ）薬剤／生物工学製品と内皮表面の非特異的で電荷に基づく相互作用を介して開始される吸着媒介エンドサイトーシス（ＡＭＥ）、ｃ）ＣＥＣ上で発現する受容体の特異的な相互作用によって開始される受容体媒介エンドサイトーシス（ＲＭＥ）、である。ＡＭＥおよびＲＭＥは、血液―脳隔壁（ＢＢＢ）を経ての配送のための薬剤輸送ベクターの設計に利用されている。例えば、ＳｙｎＢベクター族等の陽イオン細胞貫通ペプチドは、温度・エネルギー依存ＡＭＥ過程による親水性分子のＢＢＢを経ての配送の能力を持つ（ドリン他、２００３年）。ＢＢＢを経てのＲＭＥおよびトランスサイトーシスを受ける脳内皮抗原に特異的な抗体、特にアンチトランスフェリン受容体抗体（ＯＸ２６）が、抗体に化学的に連結された、または抗体機能化担体（例えばイムノリポソーム）に包まれた生物工学製品の、ＢＢＢを経ての実験動物モデルでの輸送に用いられている。
目下、受容体媒介トランスサイトーシスを受ける、脳内皮細胞上で発現する受容体が少数知られている。インシュリン受容体、低濃度リポタンパク質依存タンパク質受容体（ＬＲＰ）およびアンギオテンシンＩＩ受容体である。このうち、トランスフェリン受容体およびインシュリン受容体は、脳輸送ベクター（すなわち、これらの受容体を認識する抗体）の発達に利用されている。トランスフェリン受容体は他の器官に比して脳内皮において豊富であることが知られているが、トランスフェリン受容体およびインシュリン受容体は他の器官に広く分布しており、したがってこれらの’標的’の使用に選択的に完成された脳は限定される。
以下の文献に含まれるものは、本発明の特許性に関係するものではない。
【非特許文献１】Abulrob A., Zhang J., Tanha J., MacKenzie R. and Stanimirovic D. (2005). Single domain antibodies as blood brain barrier delivery vectors. Intern. Cong. Ser. 1277, 212-223.
【非特許文献２】Dehouck B., Fenart L., Dehouck MP.. Pierce A., Torpier G., and Cecchelli R. (1997) A new function for the LDL receptor: transcytosis of LDL across the blood-brain barrier. J. Cell Biol. 138, 877-889.
【非特許文献３】Demeule M., Poirier J., Jodoin J.. ef a/. (2002) High transcytosis of melanotransferrin(P97) across the blood-brain barrier. J. Neurochem. 83, 924-933.
【非特許文献４】Drin G., Cottin S., Blanc E., Rees A.R. and Temsamani J. (2003). Studies on the internalization mechanism of cationic cell-penetrating peptides. J. Biol. Chem. 278, 31192-31201.
【非特許文献５】Drin G., Rousselle C, Scherrmann J. M., Rees A.R. and Temsamani J. (2002). Peptide delivery to the brain via adsorptive-mediated endocytosis: advances with SynB vectors. AAPS PharmSci. 4, E26.
【非特許文献６】Fillebeen C, Descamps L., Dehouck M. P., Fenart L., Benaissa M., Spik G., Cecchelli R., and Pierce A. (1999) Receptor-mediated transcytosis of lactoferrin through the blood- brain barrier. J. Biol. Chem. 274, 7011-7.
【非特許文献７】Hayes G. R., Enns CA. and Lucas J.J. (1992). Identification of the O-linked glycosylation site of the human transferrin receptor. Glycobiology. 2, 355-359.
【非特許文献８】Moos T. and Morgan E. H. (2001). Restricted transport on anti-transferrin receptor antibody (0X26) through the blood-brain barrier in the rat. J. Neurochem. 79, 119-129.
【非特許文献９】Muruganandam A., Tanha J., Narang S. and Stanimirovic D. (2002). Selection of phage- displayed llama single-domain antibodies that transmigrate across human blood-brain barrier endothelium. FASEB J. 16, 240-242.
【非特許文献１０】Qian Z. M., Li H., Sun H. and Ho K. (2002). Targeted drug delivery via the transferrin receptor-mediated endocytosis pathway. Pharmacol. Rev. 54, 561-587.
【非特許文献１１】Suzuki T., Futaki S., Niwa M., Tanaka S., Ueda K. and Sugiura Y. (2002). Possible existence of common internalization mechanisms among arginine-rich peptides. J.Biol. Chem. 277, 2437-2443.
【非特許文献１２】Tanha J., Muruganadam A. and Stanimirovic D. (2003). Phage display technology for identifying specific antigens on brain endothelial cells. Methods MoI. Med. 89, 435- 449.
【非特許文献１３】Wessel D. and Flugge U.I. (1984). A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal. Biochem. 138, 141-143.
【非特許文献１４】Zhang J., Tanha J., Hirama T., Khieu N. H., To R., Tong-Sevinc H., Stone E., Brisson J. R. and MacKenzie CR. (2004). Pentamerization of single-domain antibodies from phage libraries: a novel strategy for the rapid generation of high-avidity antibody reagents. J. MoI. Biol. 335, 49-56.
【非特許文献１５】Zhang J., Li Q., Nguyen T., Tremblay T., Stone E., Kelly J. and MacKenzie R. (2004). A pentavalent single domain antibody approach to tumor antibody discovery and the development of novel proteomics reagents. J. MoI. Biol. 341 , 161-9.
【発明の開示】
【０００３】
本発明の第一の側面によって、少なくとも７５％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２のヌクレオチドと同定される、精製または分離された核酸分子が提供される。
【０００４】
本発明の第二の側面によって、
少なくとも７５％の同定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３の１から３６１のアミノ酸を含むペプチドと共に試剤をインキュベートすること、および該試剤と該ペプチドとの結合の検出、
少なくとも７５％の同定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４の１から３２５のアミノ酸を含むペプチドと共に試剤をインキュベートすること、および該試剤と該ペプチドとの結合の検出、
少なくとも７５％の同定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５の１から２４２のアミノ酸を含むペプチドと共に試剤をインキュベートすること、および該試剤と該ペプチドとの結合の検出、
少なくとも７５％の同定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６の１から２５７のアミノ酸を含むペプチドと共に試剤をインキュベートすること、および該試剤と該ペプチドとの結合の検出、
少なくとも７５％の同定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７の１から４０のアミノ酸を含むペプチドと共に試剤をインキュベートすること、および該試剤と該ペプチドとの結合の検出、
少なくとも７５％の同定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８の１から１４０のアミノ酸を含むペプチドと共に試剤をインキュベートすること、および該試剤と該ペプチドとの結合の検出、
少なくとも７５％の同定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９の１から１８のアミノ酸を含むペプチドと共に試剤をインキュベートすること、および該試剤と該ペプチドとの結合の検出、
少なくとも７５％の同定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０の１から１１のアミノ酸を含むペプチドと共に試剤をインキュベートすること、および該試剤と該ペプチドとの結合の検出、
少なくとも７５％の同定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１の１から１１のアミノ酸を含むペプチドと共に試剤をインキュベートすること、および該試剤と該ペプチドとの結合の検出、
少なくとも７５％の同定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２の１から１３のアミノ酸を含むペプチドと共に試剤をインキュベートすること、および該試剤と該ペプチドとの結合の検出、
少なくとも７５％の同定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３の１から１３のアミノ酸を含むペプチドと共に試剤をインキュベートすること、および該試剤と該ペプチドとの結合の検出、
少なくとも７５％の同定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４の１から１６のアミノ酸を含むペプチドと共に試剤をインキュベートすること、および該試剤と該ペプチドとの結合の検出、および
少なくとも７５％の同定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５の１から１６のアミノ酸を含むペプチドと共に試剤をインキュベートすること、および該試剤と該ペプチドとの結合の検出、
のいずれかからなる、血液―脳隔壁を経てのＴＭＥＭ３０Ａ媒介トランスサイトーシスが可能な試剤の同定方法が提供される。
【０００５】
本発明の第三の側面によって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５のアミノ酸配列のいずれかの、少なくとも７５％が同定され、精製または分離されたペプチドが提供される。
【０００６】
本発明の第四の側面によって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５のアミノ酸配列のいずれかの、６以上の連続したアミノ酸からなる、精製または分離されたペプチドが提供される。
【０００７】
本発明の第五の側面によって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５のアミノ酸配列のいずれかの、６以上の連続したアミノ酸からなる、精製または分離されたペプチドおよび適当な賦形剤と共に目標物をインキュベートすることによって該ペプチドに対する免疫反応を生じる、血液―脳隔壁を経てのＴＭＥＭ３０Ａ媒介トランスサイトーシスが可能な抗体の生成方法が提供される。好ましくは目標物はヒトではない動物である。当業者に理解されるように、様々な動物を目標物として用いる抗体に対する免疫反応を生じる手段は当該技術分野において既知である。特に、免疫化レジーム、補助剤、抗体回収方法、精製および分離は全て、様々な目標物について既知であり確立されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
細胞生物学、生物化学、免疫化学および分子生物学の手法の組み合わせを用い、血液―脳隔壁に関連する新たな抗原が同定されている。これは血液―脳隔壁を経ての移行の機構を確立するのに有用である。これらの抗原は他の内皮細胞に比して脳内皮細胞において豊富で、トランスフェリンおよびインシュリン受容体に比して選択性および脳への配送能力に優れているかもしれない。
この例において、血液―脳隔壁抗原を認識し血液―脳隔壁を経て移行される単一領域抗体ＦＣ５が検討される。
本発明は特定の機構または作用携帯に限定されず、仮定される機構は一般的関心の元に述べられる。
【０００９】
ＢＢＢを経てのＦＣ５移行の機構：
１． 脳内皮細胞上の推定上の受容体へ結合し、受容体媒介トランスサイトーシスとして知られる機構によってＦＣ５は移行される。
２． ＦＣ５はクラスリン被覆穴において脳内皮に内在化され移行される。
３． ＦＣ５移行はエネルギー依存であり可飽和である。
４． ＦＣ５移行には非損傷細胞骨格ネットワークが必要である。
５． ＦＣ５移行はＰｌ３キナーゼ活性に依存する。
【００１０】
ＦＣ５抗原、ＴＭＥＭ３０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の分離と同定についても述べる。ここで述べるように、ＦＣ５抗原のＴＭＥＭ３０Ａへの結合によって血液―脳隔壁を経てＦＣ５が移行される。
【００１１】
ＦＣ５に認識される抗原：
１． α（２、３）結合シアル酸残余はＦＣ５に認識される抗原エピトープの構成要素である。
２． ＦＣ５に認識される抗原はシアルタンパク質および非シアル脂質（ガングリオシド）である。
３． ＦＣ５の推定上タンパク質抗体上のα（２、３）結合シアル酸残余の認識はＦＣ５の脳内皮細胞を経てのエンドサイトーシスと移行に必要である。
４． α（２、３）結合シアル酸残余は完全なＦＣ５に認識される抗原の単なる構成要素である。
５． トランスフェリン受容体はＦＣ５に認識されない。
６． ＦＣ５に対するファージ表示ヒト脳ｃＤＮＡ発現ライブラリのパニングによってＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１が引き出された。
７． ＴＭＥＭ３０Ａと共に配列されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２を遺伝子が除去する。
８． ＴＭＥＭ３０ＡｍＲＮＡの組織分布は図１１に示される。脳組織において強い発現が示された。
９． ＴＭＥＭ３０ＡｍＲＮＡの細胞分布は図１２に示される。内皮細胞において強い発現が示される。
１０． ＨＥＫ２９３細胞において過剰発現したＴＭＥＭ３０ＡはＦＣ５によって免疫沈降された（図１４）。
【００１２】
よって、ＴＭＥＭ３０Ａに結合する化合物、分子または試剤は血液―脳隔壁を経てのＴＭＥＭ３０Ａ媒介転移が可能であることが示されている。続いて、以下に述べるように、実施例の１つにおいて、関連する試剤の提供と該試剤がＴＭＥＭ３０Ａに結合する場合の定量とを含む、血液―脳隔壁を通過することができる試剤の同定方法が提供される。
【００１３】
他の実施例において、以下で述べる関連する試剤のＴＭＥＭ３０Ａペプチドへの結合の適した条件でのＴＭＥＭ３０Ａペプチドの試剤への暴露と、結合が起こった場合の定量とを含む、血液―脳隔壁を経てのＴＭＥＭ３０Ａの転移が可能な試剤の同定方法が提供される。ここで述べるように、結合または相互作用は様々な方法、例えば以下に述べるようにＴＭＥＭ３０Ａをその上に載せたカラムまたは他の類似の支持上への試剤の保持、またはここで述べる生体外細胞検定または生体内検定を用いる転移の実証によって定量される。これらの検定は例証となる目的のためであることが留意され、関連する試剤とＴＭＥＭ３０Ａとの相互作用の様々な幅広い検出方法があることは当業者に理解できる。
【００１４】
他の実施例において、以下で述べる試剤のＴＭＥＭ３０Ａペプチドへの結合の適した条件でのＴＭＥＭ３０Ａペプチドの関連する試剤への暴露と、その後に結合が起こった場合の定量とを含む、ＴＭＥＭ３０Ａとの相互作用が可能な薬剤を同定する方法が提供される。当業者に評価されるように、このような試剤はここで述べるように様々な目的、例えば膜輸送や画像化等に用いることができる。
【００１５】
当業者に評価されるように、ＴＭＥＭ３０Ａの結合の定量は複数の方法で行うことができる。例えば、高スループット初期スクリーニングを行うことができ、例えばカラムにＴＭＥＭ３０Ａを入れ、関連する試剤を該カラムを通過させる。残留した化合物を溶出しさらに調査し、例えば以下で述べる生体外または生体内での検定を行うことができる。
このような試剤は関連する化合物へ結合、接合、架橋または他の取り付けが可能であり、血液―脳隔壁を経て転移可能な結合を形成することが留意される。
【００１６】
いくつかの実施例において、関連する化合物は検出可能な化合物でありえ、例えば放射性同位元素、同位体、可視または近赤外線蛍光ラベル、レポーター分子、ビオチン等であるがこれらに限定されない。当業者に評価されるように、このような結合を、試剤の転移の確認、画像化または他の類似の目的に用いることができる。
【００１７】
他の実施例において、関連する化合物は小分子、例えば抗がん剤であり、これは例えばパクリタクセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、エトポシド、ドキソルビシン、シクロフォスファミド、クロラムブチル等であるがこれらに限定されない。
【００１８】
他の実施例において、小分子は神経病、例えば脳腫瘍、脳転移、精神分裂病、癲癇、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、脳卒中、肥満症、多発性硬化症等を治療するための治療または薬事の化合物でありうる。
【００１９】
ここで述べるように、ＦＣ５抗体はＴＭＥＭ３０Ａに結合する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３の６以上、７以上、８以上、９以上、または１０以上の連続したアミノ酸を含むペプチドを、ＦＣ５を認識するモノクローナル抗体の生成に用いることができる。いくつかの実施例において、ペプチドはＴＭＥＭ３０Ａの細胞外領域、すなわちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２の６７〜３２３アミノ酸に対し選択的である。同様に、アイソフォーム２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）の細胞外領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４の６７〜２８７アミノ酸に対応し、アイソフォーム３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５の１〜２０４アミノ酸からの細胞外領域を有する。したがって、他の好ましい実施例において、ペプチドはアイソフォーム２および３からのこれらの細胞外領域の範囲に対応する。よって、いくつかの実施例において、関連する試剤はここで述べるＴＭＥＭ３０Ａの免疫抗原性断片に対して配列されるモノクローナル抗体でありうる。当業者には他の適した断片も容易に明白であることが留意される。例えば、グリコシル化サイトを含むＴＭＥＭ３０Ａの範囲からの６以上、７以上、８以上、９以上、または１０以上の連続したアミノ酸を含むペプチド、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に含まれるものをいくつかの実施例において用いることができる。あるいは前記のように、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９〜１５に含まれる、ＴＭＥＭ３０Ａと他の進化的に類似のペプチドとの間で高度に保護された範囲を選択的に用いることもできる。
【００２０】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に含まれるヌクレオチドと同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００２１】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に含まれるヌクレオチド１４１〜１２２６と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。当業者には明らかであるように、このようなヌクレオチド配列はここで述べるＴＭＥＭ３０Ａペプチドの調製のための発現系で用いることができ、あるいはここで述べる標識、プライマー等として用いることができる。
【００２２】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に含まれるヌクレオチド１〜３６１、１〜３２３または６７〜３２３と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００２３】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に含まれるヌクレオチド１〜３２５または６７〜２８７と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００２４】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に含まれるヌクレオチド１〜２４２または１〜２０４と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００２５】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に含まれるヌクレオチド１〜２５７と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００２６】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に含まれるヌクレオチド１〜４０と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００２７】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に含まれるヌクレオチド１〜１４０と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００２８】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に含まれるヌクレオチド１〜１８と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００２９】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に含まれるヌクレオチド１〜１１と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００３０】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に含まれるヌクレオチド１〜１１と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００３１】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に含まれるヌクレオチド１〜１３と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００３２】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に含まれるヌクレオチド１〜１３と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００３３】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に含まれるヌクレオチド１〜１６と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００３４】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に含まれるヌクレオチド１〜１６と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００３５】
ここで述べるように、ＴＭＥＭ３０Ａアイソフォーム１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３は、内部Ｃ末端（アミノ酸１〜４２）、膜間領域（アミノ酸４３〜６６）および外部領域（アミノ酸６７〜３２３）を有する。当業者には明らかなように、膜間領域内での変異が膜連結機能によって保護されなければ、このペプチドは欠損を有するであろう。同様に、Ｃ末端内での追加、削除および置換は細胞外Ｎ末端でよりも許容されうる。個々で述べるように、例えば挿入や削除等の大きい変化が許容されうることを強く示すＴＭＥＭ３０Ａの少なくとも２つの接合変異が存在することが留意される。
【００３６】
ＴＭＥＭ３０Ａアイソフォーム２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４は２つの膜間領域、アミノ酸４４〜６６とアミノ酸２８８〜３１０を有し、アミノ酸６７〜２８７は外部である。
ＴＭＥＭ３０Ａアイソフォーム３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５は１つの膜間領域をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５のアミノ酸２０５〜２２７に有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５のアミノ酸１〜２０４の外部領域を有する。
【００３７】
他の実施例において、上記のペプチドまたはアミノ酸配列のいずれかから導き出されるヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。これらの核酸分子は前記のように、例えば発現のため、標識やプライマー等として用いることができる。
【００３８】
ここで述べる全長配列ＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドに加えて、ＴＭＥＭ３０Ａ変異体を調製することができると考えられる。適当なヌクレオチド変化のＴＭＥＭ３０ＡのＤＮＡへの導入、および／または所望のＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドの合成によって、ＴＭＥＭ３０Ａ変異体を調製することができる。当業者には明らかなように、アミノ酸変化を、ＴＭＥＭ３０Ａの翻訳後処理、例えばグリコシル化サイトの数または位置の変化や膜定着特性の変化へと変更することができる。
【００３９】
加えて、ＴＭＥＭ３０Ａ変異体に１つ以上の他の変位、例えばアミノ酸置換、１つ以上のアミノ酸の挿入、１つ以上のアミノ酸の削除、または化学的変位を行うことが可能である。例えば、本発明によって断片であるＴＭＥＭ３０Ａ変異体が提供される。この実施例の変更において、該断片はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３の残余６７から残余３２３へ延伸するヒトＴＭＥＭ３０Ａの一部分に対応する残余を含有する。
【００４０】
全長配列ＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたはここで述べるＴＭＥＭ３０Ａの様々な領域における変化は、例えば保存的および非保存的突然変異の手法および指針のいずれかを用いて作成することができる。変化はＴＭＥＭ３０Ａをエンコードする１つ以上のコドンの置換、削除または挿入でありえ、これは未変性配列ＴＭＥＭ３０Ａに対するＴＭＥＭ３０Ａのアミノ酸配列の変化になる。変化は任意に少なくとも１つ以上のアミノ酸のＴＭＥＭ３０Ａの１つ以上の領域の他のアミノ酸との置換によるものとできる。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸の類似した構造および／または化学的性質を持つ別のアミノ酸との置き換え、例えばロイシンとセリンとの入れ替えによって行うことができる。挿入または削除は任意に約１から５のアミノ酸の範囲でありうる。
【００４１】
［ＴＭＥＭ３０Ａアンチセンスオリゴヌクレオチド］
本出願で開示されるＴＭＥＭ３０Ａ配列は標識としても用いることができる。ＴＭＥＭ３０Ａ核酸の断片は、標的ＴＭＥＭ３０ＡのｍＲＮＡ（センス）またはＴＭＥＭ３０ＡのＤＮＡ（アンチセンス）配列への結合が可能な単鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含むアンチセンスまたはセンスのオリゴヌクレオチドの設計に有用でありうる。アンチセンスまたはセンスのオリゴヌクレオチドは、前記のようにＴＭＥＭ３０ＡのＤＮＡのコード領域の断片を含む。このような断片は一般的に少なくとも約１４のヌクレオチドを、好ましくは約１４〜３０のヌクレオチドを含む。所定のタンパク質をエンコードするｃＤＮＡ配列に基づいてアンチセンスまたはセンスのオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えば（コーエンＪＳ、オリゴヌクレオチド治療法、トレンドス・イン・バイオテクノロジー誌１９９２年３月号、１０（３）：８７〜９１）において述べられている。アンチセンスまたはセンスのオリゴヌクレオチドの標的ＴＭＥＭ３０Ａ核酸配列への結合によって、二本鎖の増強された分解、翻訳または転写の早発の終了あるいは他の手段を包含するいくつかの手段の１つによりＴＭＥＭ３０Ａ配列の翻訳または転写を妨げる二本鎖の形成がなされる。よってアンチセンスのオリゴヌクレオチドは、脳薬剤配送を調節するであろうＴＭＥＭ３０Ａタンパク質の発現の妨害に用いることができる。アンチセンスまたはセンスのオリゴヌクレオチドはさらに、変異糖ホスホジエステル主鎖を有するオリゴヌクレオチドを含み、このような糖結合は内生ヌクレアーゼに耐性があり生体内での適用により適している。
【００４２】
［抗ＴＭＥＭ３０Ａ抗体への使用］
以下の例は説明のためにのみ提示され、本発明の視野の限定を意図するものではない。
本発明の抗ＴＭＥＭ３０Ａ抗体は様々な効用を持つ。例えば、抗ＴＭＥＭ３０Ａ抗体はＴＭＥＭ３０Ａの診断検定、例えば特定の細胞、組織または血清におけるその発現（およびいくつかの場合においては差次的発現）の検出に用いることができる。当該分野で既知の様々な診断検定手法、例えば競合結合検定、直接または関節サンドイッチ検定、免疫沈降検定等を用いることができる。診断検定に用いられる抗体を検出可能成分によってラベルすることができる。検出可能成分は放射性同位体３２Ｐ、ローダミンやルシフェリン等の蛍光または化学ルミネセンス化合物、またはアルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素でありうる。抗体の検出可能ラベルへの結合の方法は当該分野において既知である。
【００４３】
抗ＴＭＥＭ３０Ａ抗体は組換細胞培養物または天然精製源からのＴＭＥＭ３０Ａの親和精製にも有用である。この処理において、ＴＭＥＭ３０Ａに対する抗体は適当な支持体、例えばセファデックス（登録商標）樹脂等に、当該分野で既知の方法を用いて固定される。それから固定されたＴＭＥＭ３０Ａ抗体を、精製するＴＭＥＭ３０Ａを含有する試料と接触させ、その後に、固定された抗体に結合されたＴＭＥＭ３０Ａ以外の試料内の実質的に全ての物質を除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、精製されたＴＭＥＭ３０Ａを溶出する別の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
【００４４】
［二機能抗体］
二重特異性抗体（モノクローナル、単鎖、単一領域あるいは他の断片）、好ましくはヒトまたはヒト化抗体は、少なくとも２つの異なる抗原への結合特異性を持つ。この場合は該結合特異性の一方はＴＭＥＭ３０Ａであり、もう一方は他の脳抗体であり、好ましくはニューロン細胞表面タンパク質、ニューロン受容体またはニューロン受容体サブユニットである。
【００４５】
［ＴＭＥＭ３０Ａの薬剤スクリーニングへの使用］
本発明は特に、様々な薬剤スクリーニング手法のいずれかによる、ＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたはその断片を用いての化合物のスクリーニングに有用である。このような試験に用いられるＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片は、溶液中で自由とするか、固体支持体に付加するか、あるいは細胞表面に配置してもよい。薬剤スクリーニングの１つの方法は、ＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片を発現する組み替え核酸によって安定して変換される真核または原核の宿主細胞を利用する。競合結合検定においてこのような変換細胞に対し薬剤がスクリーニングされる。生存可能または固定形態のこのような細胞を標準結合検定に用いることができる。例えばＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片と試験される試剤との複合体の形成を測定するか、あるいはＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片への結合に従って試験される試剤の内在化の増強を実験することができる。あるいは、試験される試剤によるＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドのその標的細胞内での内在化の減少を実験することができる。
【００４６】
よって、本発明により、試験される薬剤の細胞内での内在化の増強によるＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたはその断片に作用できる薬剤または他の試剤のスクリーニングの方法が提供される。これらの方法は、当該分野で既知の方法による、試剤のＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片への接触、および試剤とＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片との複合体の存在または細胞内での試剤とＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片との複合体の存在の検定を含む。このような競合結合検定において、試剤またはＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片は典型的にはラベルされる。適当なインキュベートの後で、自由なＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片が結合形態で存在するものから分離され、自由または複合されていないラベルの数によってＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドに結合した特定の試剤を測定する。
【００４７】
また本発明により、ＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドの発現に作用する、または脳血管性疾患に機能することができる薬剤または他の試剤のスクリーニングの方法が提供される。これらの方法は、当該分野で既知の方法による、試剤のＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたはその断片への接触、および試剤とＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片との複合体の存在または細胞内での試剤とＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片との複合体の存在の検定を含む。このような競合結合検定において、試剤またはＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片は典型的にはラベルされる。適当なインキュベートの後で、自由なＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片が結合形態で存在するものから分離され、自由または複合されていないラベルの数によってＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドに結合した特定の試剤を測定する。
【００４８】
他の薬剤スクリーニング手法により、ＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドへの適当な結合親和性を持つ化合物の高スループットスクリーニングが提供される。例えば、異なる小さいペプチド試験化合物が固体基質上で合成される。ＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドへの添加により、ペプチド試験化合物はＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドと反応し、洗浄される。結合したＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドは当該分野で既知の方法によって検出される。精製されたＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドは薬剤スクリーニング手法において用いるプレート上に直接被覆することができる。加えて、ＦＣ５等のＴＭＥＭ３０Ａ非中和抗体をＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片の捕捉と固体支持体への固定に用いることができる。
【００４９】
本発明はまた、ＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドへ特異的に結合可能な中和抗体（例えばＦＣ５）を試験化合物とＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたはその断片への結合において競合させる競合薬剤スクリーニング検定の使用を企図する。この方式において、１つ以上の抗原決定基をＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドと共有するペプチドの存在の検出に抗体を用いることができる。
【００５０】
［合理的な薬剤設計］
合理的な薬剤設計の目標は、生物学的に活性のＴＭＥＭ３０ＡまたはＴＭＥＭ３０Ａと相互作用する小分子の構造類似体、例えばアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の製造である。これらの例は、ＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドのより活性または安定な形態であるかまたは生体内脳薬剤配送を増強する薬剤の形成に用いることができる。
【００５１】
取り組み方の１つにおいて、ＴＭＥＭ３０ＡポリペプチドまたはＴＭＥＭ３０Ａポリペプチド−試剤複合体の三次元構造を、Ｘ線結晶学またはコンピューターモデリングによって定量する。より多くの場合、ＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドの構造に関する有用な情報はＴＭＥＭ３０Ｂ（遺伝子銀行番号００１０１７９７０）等の相同タンパク質に基づくモデリングから得ることができる。いずれの場合も、関連構造情報を、類似性ＴＭＥＭ３０Ａポリペプチド的分子の設計、または安定性または薬剤配送を向上する活性を向上された有効なモジュレーターの同定に用いる。
【００５２】
［ＴＭＥＭ３０Ａ／リガンド相互作用の同定］
受容体／リガンド相互作用の同定のために、ＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片への結合能力について試剤を試験することができる。ＴＭＥＭ３０Ａのリガンドの同定は様々な表示、例えば脳薬剤配送のために受容体を発現することが既知である脳内皮細胞等の細胞への生体活性分子（リガンドまたはＴＭＥＭ３０Ａに結合）のターゲッティング、および同じものを含有すると推測される配合物内でのリガンドまたはＴＭＥＭ３０Ａの存在の検出のための試薬としてのＴＭＥＭ３０Ａまたはリガンドの使用に有用であろう。配合物は、リガンドまたはＴＭＥＭ３０Ａを発現する、ＴＭＥＭ３０Ａまたはリガンドを発現または応答すると知られている細胞の生体活性を調節する、ＴＭＥＭ３０Ａを発現する細胞の薬剤への透過性を調節する、またはＴＭＥＭ３０Ａまたはリガンドに対するアゴニスト、アンタゴニストおよび／または抗体を許容する、と推測される細胞を含みうる。これはＴＭＥＭ３０Ａを発現する細胞の透過性または他の生体活性を調節するであろう。様々な他の表示も当業者には明らかである。例えばポリヒスチジン標識等のエピトープ標的潜在リガンドはＴＭＥＭ３０Ａとの相互作用が可能である。エピトープ標識ペプチド試剤との１時間のインキュベートの後で、ＴＭＥＭ３０Ａはタンパク質Ａビーズによって免疫沈降され、該ビーズは洗浄される。潜在リガンド相互作用は、エピトープ標識への抗体との複合体のウエスタンブロットによって定量される。
【００５３】
よって、本発明の実施例において、荷役物質の血液―脳隔壁を経ての移動を発生または増強する方法が提供される。該方法は以下を含む：
ａ）血液―脳隔壁抗原への親和性を持つ接着質の取得；
ｂ）荷役物質の接着質への機能的連結（例えば表面に接着質を持つリポソームまたは他の適当な包での荷役物質の結合または被包）；
ｃ）接着質と脳内皮細胞との接触の許容。
【００５４】
荷役物質は、医薬品、像形成剤、毒素あるいは他の適当な化合物を含む関連する化合物でありうることは充分に理解されるであろう。
いくつかの例において、血液―脳隔壁の移行の後で接触可能な標的への親和性を持つ１つ以上の分子を含み、荷役物質の特異的ターゲッティングを促進することが望ましい。
受容体を密集させるとともにその移行を刺激する様々なリガンドを顕出させることで、血液―脳隔壁を経ての受容体媒介トランスサイトーシスを受ける受容体（ＦＣ５に認識される抗原等）を薬剤／治療薬の脳への配送に利用することができる。これらは典型的には抗体であるが、ペプチド、オリゴサッカライド等でもありうる。
【実施例】
【００５５】
経血管的脳配送を開発できる新たな抗原−リガンド系を発見するために、ラマ単一領域抗体（ｓｄＡｂ）ファージ像形成ライブラリ（タンハー他、２００２年）をヒト肺と脳微小血管内皮細胞との間の異なる抗原選択に用いた。ｓｄＡｂは自然に生じ軽鎖を欠く重鎖ＩｇＧのＶＨＨ断片であり、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）の半分の大きさ（１３ｋＤａ）である。ＨＣＥＣを選択的に認識するとともに生体外および生体内でＢＢＢを経て移行する２つの新たなｓｄＡｂ、ＦＣ５（遺伝子銀行番号ＡＦ４４１４８６）およびＦＣ４４（遺伝子銀行番号ＡＦ４４１４８７）がこれらの研究で分離された。これらのｓｄＡｂは生物工学製品および担体との結合が可能なように作成された（アブルロブ（Ａｂｕｌｒｏｂ）他、２００５年）。ｓｄＡｂは有望な経血管的脳配送ベクターとして、従来の抗体に対し、その小さいサイズ、高水準でＦｃ受容体を発現する組織（例えば肝臓や脾臓）に対する低い非特異的相互作用、それによる低い免疫原性、および高温、ｐＨ、塩に対する著しい安定性を含むいくつかの利点を持つ。
【００５６】
［例１．ＦＣ５は生体内での静脈内注射の後で脳を標的とする］
Ｆｃ５の生体内分布を調査するために、ＦＣ５をＮＨＳエステル結合を介して近赤外線プローブ、Ｃｙ５．５に結合させ、マウスに尾静脈から注射した。マウスを小動物時間領域エクスプローラーオプティクス（ｅＸｐｌｏｒｅ Ｏｐｔｉｘ）前臨症画像化システムによって画像化した。近赤外線蛍光プローブ、Ｃｙ５．５単独、またはＦＣ５（５０μｇ）または陰性対照抗体ＮＣ１１（５０μｇ）と結合したものを２７ゲージ固定針の０．５ｍｌインシュリン注射器を用いて動物に静脈から注射した。薬剤注射から６時間後に動物をエクスプローラーオプティクスによって画像化した。全ての画像化試験において、繰返し数８０ＭＨｚおよび時間分解能２５０ｐｓ光パルスの６７０ｎｍパルスレーザーダイオードを刺激のために用いた。７００ｎｍの蛍光エミッションを高感受性時間分解能単一光子計数システムによって収集し、３ｍｍオフセットされた高速光電子増倍管を介して拡散光学微細構成再構成のために検出した。それぞれの動物を板の上にうつぶせにし、該板を画像化システム内の加熱台（３６℃）に乗せた。頭部を包囲する二次元中央体走査領域を上面視リアルタイムデジタルカメラで選択した。動物の最適な高さは側面視デジタルカメラで検証された。それから動物が自動的にレーザー走査のために画像化室へ移動される。それからガルバノミラーによって制御されるレーザー刺激ビームを選択されたＲＯＩ上に移動した。レーザーの力とピクセル毎計数時間をそれぞれ３０μＷと０．５ｓに最適化した。これらの値は試験全体において維持された。ラスタ走査間隔は１．５ｍｍとし、それぞれのフレームの獲得の間維持された。１０２４の点を関連する領域（ＲＯＩ）のために走査した。データを一時的点像分布関数（ＴＰＳＦ）として記録し、画像を蛍光分布図として再構成した。
【００５７】
注射から６時間後のエクスプローラーオプティクス小動物画像化システム（６７０ｎｍ刺激レーザー）を用いた光学画像化において、異なる標的に対し同一のライブラリからの陰性対照抗体、ＮＣ１１に比して頭領域でより高いＦＣ５蓄積を示した（図１）。頭部（図１、ＢおよびＤ）を含む様々な領域でのオプティビュー（ＯｐｔｉＶｉｅｗ、登録商標）ソフトウェアを用いた蛍光濃度の定量化によって頭部でのＦＣ５の選択的蓄積が示された。殺および灌流後の動物から取り出した脳の生体外画像化（図１Ｅ）によって、ＦＣ１１を注射した動物に比してＦＣ５を注射した動物の脳の蛍光濃度はより高いことが実証される。
［例２．ＦＣ５は荷役分子を血液―脳隔壁内皮細胞を経て輸送することができる］
【００５８】
ｓｄＡｂは治療成分との結合に利用できる−ＳＨ基を持たないので、ＦＣ５は追加の自由システインを発現するように作成された。よって図２Ａに示すように、ｃｙｓＦＣ５はマレイミド活性反応を用いてマウスＨＲＰ−ＩｇＧ（〜１９０ｋＤａ）と結合した。ＨＲＰ−ＩｇＧまたはＨＲＰ−ＩｇＧ−ｃｙｓＦＣ５はヒトＣＥＣ培養物に取り込まれ、３０分間いずれかの構造に細胞を暴露した後で定量された。ＩｇＧ−ＨＲＰの有効細胞取り込みは分子がｃｙｓＦＣ５と連結された場合にのみ見られる（図２ＢおよびＣ）。同様に、ｃｙｓＦＣ５と連結されたＨＲＰ−ＩｇＧは生体外ＢＢＢモデルの外側面室への有効細胞間移行を表し（図２Ｄ）、ＩｇＧ−ＨＲＰ単独のヒトＣＥＣ単層を経ての輸送は無視できるものだった。
【００５９】
ＦＣ５にベクター化されたＨＲＰ−ＩｇＧのみがヒトＣＥＣに入り生体外ＢＢＢを経て移行されることが表されｓｄＡｂは成功裏に１０倍大きい分子を標的組織内へ、またはこれを経て輸送できることが示唆された。類似の化学結合原理を用い、有望な治療の性質により選択された大分子をｃｙｓＦＣ５に取り付けることができる。ビオチン−アビジンリンカーを含む、全体または単鎖抗体に用いられている他の化学的リンカーの取り組み方もまたｓｄＡｂと用いることができ、適応したスペーサーを抗原結合サイトの立体障害を避けるために用いる。ｓｄＡｂを遺伝子学的に作成可能とすることで、キメラ（融合）タンパク質を含む治療分子への化学的連結の択一的な取り組み方も可能である。
【００６０】
例えばｃｙｓＦＣ５によって達成される自由連結成分を提供するＢＢＢ透過性ｓｄＡｂＦＣ５の作成によって、薬剤担体の文脈における多重結合表示のための択一的な取り組み方が可能になる。例えば、ＩｇＧｓまたはｓｃＦｖｓについて報告されている結合と同様にして、ｃｙｓＦＣ５をナノ粒子配送系の高分子成分またはリポソーム基剤粒子と結合させることができる。これらのｓｄＡｂにベクター化された’コンテナ’を脳への薬剤配送、トランスフェリン受容体を含む既知のＢＢＢ抗原に対する古典的抗体を用いる既に開発されている構想に用いることができる。
【００６１】
［例３．ＦＣ５の内在化および脳内皮細胞を経ての移行の機構］
［ＨＣＥＣを経てのＦＣ５移行は有極であり電荷に対し独立である］
ＦＣ５は非常に高い濃度であっても（１ｍｇ／ｍｌ）ＨＣＥＣに対し毒性ではない。［１４Ｃ］−スクロースの生体外ＢＢＢモデルを経ての透過性には、１０μｇ／ｍｌ ＦＣ５の不在と存在で有意な差はなく［それぞれＰｅ＝（０．８９７±０．１１）×１０−３および（０．８６２±０．１８）×１０−３ｃｍ／ｍｉｎ］、ＦＣ５はＨＣＥＣの細胞間透過性には影響しないことが示唆される。生体外ＢＢＢモデルを経てのＦＣ５のトランスサイトーシスは有極である。ＦＣ５の頂端部から側底部への輸送は側底部から頂端部より１２倍高いことが３０分間のみで観測された（図３Ａ）。これに対し、［１４Ｃ］−スクロース、細胞間拡散のマーカーは、細胞単層膜の頂端部から側底部、側底部から頂端部で等しい（すなわち有極でない）分布を示した。
【００６２】
マクロピノサイトーシスによってＦＣ５が内在化および輸送されるかを調査するために、５００μＭ アミロライド存在下でＦＣ５移行を試験した。アミロライドは被覆穴媒介エンドサイトーシスに影響することなくマクロピノソームの形成を阻害する（ウエスト他、１９８９年）。アミロライドはＦＣ５の内皮透過移動に影響しなかった（図３Ｂ）。
【００６３】
ＡＭＥのＦＣ５トランスサイトーシスへの寄与は、ｓｄＡｂが正に帯電していることによって査定される（ＦＣ５の算出された等電点は〜９．２３）。ＦＣ５の取り込みおよび輸送の査定に先行してＨＣＥＣを高カチオン硫酸プロタミン（４０μｇ／ｍｌ）またはポリ−Ｌ−リジン（３００μＭ）と共に３０分間インキュベートした。これらはいずれもＡＭＥを阻害することが示されている（サイ他、１９９８年）。いずれの化合物もＦＣ５のＨＣＥＣへの取り込み（データは図示しない）および生体外ＢＢＢモデルを経ての輸送（図３Ｂ）に影響せず、ＦＣ５のＨＣＥＣを経ての結合および移行は電荷に対し独立であることが示唆される。
【００６４】
驚いたことに、ＢＢＢ内のＡＭＥを刺激する能力についてこれらの研究中で試験された小麦胚細胞凝集素（ＷＧＡ）は有意にＦＣ５移行を阻害し、これによって内皮糖衣が電荷媒介相互作用ではない機構を介してこの過程に関係することが示される。この可能性は以下で述べる研究においてさらに探求された。
【００６５】
［ＦＣ５のＨＣＥＣを経ての輸送はエネルギー依存である］
ＦＣ５トランスサイトーシスのエネルギー依存の調査のために、ＦＣ５の取り込みおよび輸送を３７℃および４℃で測定した。ｃ−ｍｙｃに続くＦＩＴＣラベル二次抗体により、細胞内ＦＣ５は免疫化学によって検出された。ＦＣ５は早くも１５分間でＨＣＥＣ内に内在化し、３７℃での添加の３０分後に大半の細胞で検出された（図４Ａ）。３７℃に比して、４℃ではＦＣ５の細胞内蓄積（図４Ａ・Ｂ）および内皮間移行（図２Ｃ）の両方において顕著な減少が観測された。［１４Ｃ］−スクロースのＢＢＢモデルを経ての輸送は温度の影響を受けなかった。無グルコース培地でのＨＣＥＣの５ｍＭ アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）および５ｍＭ ２−デオキシグルコースへの３０分間の暴露による呼吸および解糖作用経路の同時阻害によって、ＦＣ５移行はほぼ完全に阻害された（図４Ｃ）。この処理によって他の細胞種の細胞ＡＴＰの完全な涸渇が示されている（ロナー他、１９９９年）。Ｎａ＋，Ｋ＋−ＡＴＰアーゼポンプ阻害剤、ウアバイン（１μＭ）との３０分間の前処理でもＦＣ５のＨＣＥＣを経ての輸送は４０％減少した（図４Ｄ）。
【００６６】
［ＦＣ５トランスサイトーシスはクラスリン被覆小胞を経て起こる］
ＦＣ５移行のための２つの主要なエネルギー依存受容体媒介エンドサイトーシス／トランスサイトーシス経路、クラスリン被覆小胞およびカベオラが、コローカリゼーション研究およびエンドサイトーシス阻害剤を用いて調査された。
【００６７】
５μｇ／ｍｌ ＦＣ５へ３０分間暴露されたＨＣＥＣ内でのカベオリン−１およびＦＣ５の二重免疫細胞化学法は、ＦＣ５免疫蛍光Ａとによってカベオリン−１免疫蛍光Ｂを示さなかった（図５Ｄ〜Ｆ）。これに対し、クラスリン免疫蛍光ＥはほとんどＦＣ５免疫蛍光Ｄとによってコローカリゼーションされた（図５Ａ〜Ｃ）。さらに、密度勾配遠心分離法によるＨＣＥＣ分画の後で、ウエスタンブロット上でのＦＣ５免疫反応によって同じ分画（＃７、８および９）クラスリン免疫反応として見られたが、高カベオリン−１分画（＃２および３）からは見られなかった（図５Ｇ）。
【００６８】
ＦＣ５の取り込みと移行が、クロルプロマジン（５０μｇ／ｍｌ）および低張性Ｋ＋枯渇緩衝剤（０．１４Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ グルコース、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、水で１：１に希釈）を含むクラスリン媒介エンドサイトーシスの薬理学的阻害剤、またはフィリピン（５μｇ／ｍｌ）、ナイスタチン（５μｇ／ｍｌ）およびメチル−β−シクロデキストリン（５ｍＭ）を含むカベオラ媒介エンドサイトーシス阻害剤で３０分間前処理した細胞において実験された。クロルプロマジンはエンドソームからのＡＰ−２の再循環を破壊するとともに、原形質膜上の被覆穴の組み立てを防止するが、Ｋ＋枯渇はクラスリン被覆小胞形成を阻止する。フィリピンおよびナイスタチンはコレステロールに結合し、メチル−βシクロデキストリンは原形質膜からコレステロールを排出し、結果、高コレステロールカベオラ小胞が破壊される。試験されたカベオラ媒介エンドサイトーシス阻害剤は全て、生体外ＢＢＢモデルを経てのＦＣ５移行に影響しなかった（図５Ｈ）。これに対し、クロルプロマジンおよびＫ＋枯渇はそれぞれ５２％、４６％のＦＣ５移行を阻害した（図５Ｈ）。
【００６９】
エンドサイトーシス後のＦＣ５の細胞間移行を調査するため、初期および後期エンドソーム／リソソームのマーカーでコローカリゼーション研究を行った。初期エンドソームのマーカー、テキサスレッド（登録商標）結合トランスフェリン（図６Ａ〜Ｃ）でコローカリゼーションされたＦＣ５はカテプシンＢ（図６Ｄ〜Ｆ）、後期エンドソームのマーカーではコローカリゼーションされなかった。ＢＢＢモデルの側底部室から収集されたトランスサイトーシスされたＦＣ５は、頂端部区画に添加されたＦＣ５とウエスタンブロット上で区別できず（図６Ｇ）、これによってＨＣＥＣを経てのトランスサイトーシスの間、ＦＣ５はリソソームを迂回し非損傷のままであることが示される。同じライブラリからの非選択ｓｄＡｂはモデルの側底部室から検出できず（ムルガナダム（Ｍｕｒｕｇａｎａｄａｍ）他、１９９７年）これによってＦＣ５は細胞間輸送で側底部室に入らないことが示される。
【００７０】
ＦＣ５の輸送はまた、カチオンイオノフォアモネンシンによる細胞内区画の中和に感受性である。モネンシンはエンドソームおよびリソソームの区画内のＮａ＋およびＨ＋勾配を破壊し、エンドサイトーシス小胞のｐＨは５．５から７以上に上がり、これによって受容体の再循環が阻害される。モネンシン（２５μＭ）はＦＣ５のＨＣＥＣを経てのトランスサイトーシスを３４％阻害し（図６Ｈ）、これによって酸性化された細胞内区画およびＦＣ５の推定上受容体の再循環が効率的な内皮透過輸送の維持に重要でありうることが示される。
【００７１】
［通信経路がHCEC内のＦＣ５エンドサイトーシス／トランスサイトーシスに含まれる］
ＦＣ５のトランスサイトーシスにおける細胞骨格機構部分の要求を定量するために、ＨＣＥＣをアクチン解重合剤であるサイトカラシンＤ（０．５μＭ）またはラトランキュリンＡ（０．１μＭ）、あるいは微小管阻害剤であるノコダゾール（２０μＭ）またはコルヒチン（２０μＭ）とともにＨＣＥＣは３０分間インキュベートした。サイトカラシンＤおよびラトランキュリンＡは実質的に（７０〜８０％）ＦＣ５のＨＣＥＣを経ての頂端から側底への輸送を減少させた（図７Ａ）。これに対し、微小管阻害剤はＦＣ５トランスサイトーシスに影響しなかった（図７Ａ）。
【００７２】
通信経路によるＦＣ５トランスサイトーシスの調節を定量するために、ＨＣＥＣを以下のモジュレーターのいずれかと共に３０分間インキュベートした。チロシンキナーゼ阻害剤であるゲニステイン（５０μＭ）；タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤であるビスインドールマレイミド−１（ＢＩＭ−１；５μＭ）；ＰＩ３−キナーゼ阻害剤であるウォルトマニン（０．５μＭ）；およびタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）阻害剤であるジブチリル−ｃＡＭＰ（ｄｂ−ｃＡＭＰ；５００μＭ）である。ＨＣＥＣを経てのＦＣ５トランスサイトーシスはゲニステイン（図７Ｂ）およびｄｂ−ｃＡＭＰ（図７Ｂ）の影響を受けず、ＰＫＣ阻害剤存在下で２５％減少し（図７Ｂ）、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤存在下でほぼ完全に妨げられた（図７Ｂ）。用いられた薬理学試剤はいずれも細胞に対し毒性ではなかった。
【００７３】
［ＦＣ５トランスサイトーシスにおける炭水化物エピトープの役割］
ＦＣ５トランスサイトーシスにおける内皮糖衣の役割は、ＢＢＢでのＡＭＥを刺激すると知られているレクチンであるＷＧＡ（バンクス他、１９９８年）がＨＣＥＣへのＦＣ５取り込み（図８Ａおよび８Ｂ）を阻害することの観察によって示される。
【００７４】
硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖の二糖ユニットの２０〜２００の繰り返しからなる大型の非分岐ポリマーでありＣＥＣ内で豊富に発現するプロテオグリカンが、ＨＣＥＣを経てのＦＣ５トランスサイトーシスを媒介するかどうかを試験するために、膜上で発見されるいくつかの既知の可溶性ＧＡＧによる競合実験を行った。ヘパリン硫酸（５０Ｕ／ｍｌ）、コンドロイチン硫酸Ａ（１０μｇ／ｍｌ）およびコンドロイチン硫酸Ｃ（１０μｇ／ｍｌ）によってＨＣＥＣを前処理することは、生体外でのＢＢＢを経てのＦＣ５トランスサイトーシスに影響しなかった。同様に、マンナン（１ｍｇ／ｍｌ）およびマンノース（５０μＭ）はＦＣ５移行に影響せず、これによって脳の発達においてＢＢＢ輸送に含まれる多機能膜間糖タンパク質であるマンノース６−燐酸／インシュリン類似生育要素２受容体がＦＣ５内在化には含まれないことが示唆される。
【００７５】
ＷＧＡは幅広い範囲のシアロ結合体と相互作用することが知られているため、ＦＣ５の膜内および膜間でのシアル酸残基の重要性を次に試験した。２００μＭ シアル酸、または０．１〜０．２Ｕの、様々な細胞膜糖タンパク質からの全てのシアル酸を放出するコレラ菌由来ノイラミニダーゼ、あるいはα（２，３）結合シアル酸に選択的な腸チフス菌由来α（２，３）ノイラミニダーゼによってＨＣＥＣを前処理した。ＦＣ５取り込み（図８Ｃおよび８Ｄ）およびＦＣ５のＨＣＥＣを経てのトランスサイトーシス（図８Ｅ）はいずれもシアル酸およびノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）に阻害された。ノイラミニダーゼは特にＦＣ５トランスサイトーシスを９１％減少させた（図８Ｅ）。これらの研究によって、外因性シアル酸によるＦＣ５結合についての除去または競合がＦＣ５の取り込みおよびトランスサイトーシスに干渉したことから、シアル酸がＦＣ５に認識されるＨＣＥＣ上の抗原エピトープの必須成分であることが暗示される。
【００７６】
ＦＣ５トランスサイトーシスに含まれるシアロ糖結合体の性質を、細胞をそれぞれ３つのシアル酸結合レクチン、幅広い範囲のシアロ結合体と相互作用する小麦麦芽凝集素（ＷＧＡ；１００μｇ／ｍｌ）、セイヨウニワトコ凝集素（ＳＮＡ；１００μｇ／ｍｌ）およびα（２，６）およびα（２，３）シアリルガラクトシル残基を認識するイヌエンジュ凝集素（ＭＡＡ；１００μｇ／ｍｌ）によって前処理することでさらに試験した。
【００７７】
ＦＣ５認識シアル酸残基が糖脂質に取り付けられるかどうかを調査するために、ＨＣＥＣ細胞を述べられたように（ヴェッセルおよびフリュッゲ、１９８３年）タンパク質および脂質に分画した。ノイラミニダーゼの不在または存在下でのこれらの分画へのＦＣ５結合を酵素結合免疫吸着検定法によって試験した。ＦＣ５のＨＣＥＣ脂質分画への結合は無視できた（図６Ｇ）。ＦＣ５はまた分離された脳ガングリオシドを認識できなかった。これに対し、ノイラミニダーゼに暴露された細胞溶解産物のタンパク質分画においてＦＣ５のＨＣＥＣタンパク質分画への結合は５０％減少した。ＦＣ５はＨＥＫ２９３細胞のタンパク質および脂質分画のいずれとも結合しなかった。正の対照として用いたガラクトシルセラミドが脂質分画にＯ１抗ガラクトシルセラミド抗体に検出される強い信号を生じた。
【００７８】
［トランスフェリン受容体の排除］
トランスフェリン受容体はＣＥＣにおいて豊富であり（ジェフリーズ他、１９８４年）、ＢＢＢを経てのトランスサイトーシスに含まれるとともに（キアン他、２００２年）、高度にグリコシル化されていることから（ヘイズ他、１９９２年）、ＦＣ５の推定上の受容体が実際にヒトトランスフェリン受容体であるかどうかを調査した。抗トランスフェリン受容体抗体ＣＤ７１（図９Ａ・Ｂ）に対し、ＦＣ５およびその高結合力五量体構成Ｐ５（アブルロブ（Ａｂｕｌｒｏｂ）他、２００５年）は酵素結合免疫吸着検定法検定において固定されたヒトトランスフェリン受容体に結合せず（図９Ａ）、ウエスタンブロットにおいて該タンパク質を認識しなかった（図９Ｂ）。加えて、ＦＣ５取り込み（データは図示しない）および内皮透過輸送（図９Ｃ）はホロトランスフェリンの１００倍過多存在下で減少しなかった。
【００７９】
［考察］
この研究にある集合的存在によって、ＦＣ５の取り込みおよびトランスサイトーシスはクラスリン被覆穴を経て起こるとともにノイラミニダーゼ感受性、α（２，３）−シアロ糖結合体の認識に依存する。これらの結論はＦＣ５移行の有極化、温度およびエネルギー依存を示す一連の実験によって補強されるとともに、細胞間拡散、穴形成およびマクロピノサイトーシス経路を排除した。しかし、一般的な仮定に対し、電荷媒介ＢＢＢ選択性を示す膜貫通ペプチドの新たな綱の近来の研究によって、ＲＭＥと同様にＡＭＥも温度およびエネルギー依存でありうることが示された（ドリン他、２００３年）。ＣＥＣ上の負電荷を中和することで正に帯電したＦＣ５の内皮透過輸送を減少させるＡＭＥ阻害剤の欠損により、ＲＭＥの機構がさらに示唆された。ＲＭＥの２つの主要な小胞経路、クラスリン被覆穴およびカベオラが次に試験された。ＦＣ５内在化のクラスリン被覆穴経路はＦＣ５のクラスリンによる強いコローカリゼーションによって示されたが非損傷および分画されたＨＣＥＣの両方におけるカベオラ免疫反応によっては示されず、クラスリン被覆穴形成の阻害を示す前処理によるＦＣ５トランスサイトーシスの阻害によって示された。内在化において、ＦＣ５は初期エンドソームおよび分岐後期エンドソーム／リソソームの標的にされるとともに、エキソサイトーシスによって有効な細胞内劣化なしに外側面区画へと排出された。
【００８０】
ＦＣ５の小胞細胞間輸送は非損傷アクチン重合に強く依存していた。近年の研究によって、Ａｂｐ１ｐ、Ｐａｎ１ｐおよびコータクチンを含むいくつかのタンパク質が同定されており、これらはアクチンフィラメント集合をクラスリン被覆穴内在化と機能的に連結する。
【００８１】
クラスリン被覆穴の往来を制御する信号事象の複雑さは判読が困難なままである。ＦＣ５トランスサイトーシスは本質的にＰｌ３−キナーゼ阻害剤、ウォルトマニンに妨げられ、これはＰＫＣ、ＰＫＡおよびトリプトシンキナーゼ阻害剤を含む他の信号経路にほとんど影響されなかった。Ｐｌ３−キナーゼによるイノシトール脂質のリン酸化はクラスリン被覆穴経路を含む別種の膜輸送事象に関係している。Ｐｌ３Ｋ−Ｃ２アルファはクラスリン被覆小胞の個体数と共精製されるが、ＡＰ−２およびダイナミンを含むこれらの小胞の機能を包含するタンパク質はＰｌ３キナーゼと相互作用する。ＰＫＣおよびＰＫＡは様々な受容体の内在化に関係しているが、いずれもクラスリン媒介エキソサイトーシスに要求されることは見られない。従来からＲＭＥ媒介脳輸送に利用されているインシュリン生育因子（ＩＧＦ）受容体（チャン他、２００２年）を含むいくつかの膜受容体のチロシンキナーゼ活性の阻害によってその内在化が防止される。ＦＣ５トランスサイトーシスにおけるゲニステイン効果の欠損によって、ＦＣ５に認識される受容体はチロシンキナーゼではないらしいことが示唆された。
【００８２】
脳内皮細胞の表面は、細胞−細胞伝達、病原体認識／付着および細胞外マトリクスとの相互作用に関係する複合炭水化物のち密層で覆われている（プリース他、２０００年）。表面糖結合の様々なモジュレーターまたは競合阻害剤を用いた研究によって、ノイラミニダーゼ感受性α（２、３）−シアル酸残基がＦＣ５抗原認識、ＦＣ５内在化およびトランスサイトーシスにおいて重要であることが実証された。糖タンパク質およびガングリオシドの双方に取り付け可能なシアル酸残基はクラスリン被覆穴において豊富である。ＨＣＥＣにおいて発現する主要なガングリオシドはＧＭ３およびシアリルパラグリオシド（ＬＭ１）である。ＦＣ５はＨＣＥＣから抽出された脂質に結合できなかった、または抗原の糖タンパク質性質を含む主要な脳ガングリオシドのいずれをも認識できなかった。シアル酸残基は多くの組織で発現されるため、ＦＣ５の脳内皮細胞への選択性は抗原エピトープのタンパク質成分によるものであろう。
【００８３】
トランスフェリン受容体は脳内皮に豊富な、クラスリン被覆小胞媒介エンドサイトーシスを受ける多重シアル酸残基を持つＮ−およびＯ−グリコシル化経膜タンパク質である。トランスフェリン受容体に対する抗体、ＯＸ２６は、生物学上の脳標的ベクターおよびリポソームとして用いられている。ＦＣ５は分離されたヒトトランスフェリン受容体の認識に失敗し、ホロトランスフェリンはＦＣ５トランスサイトーシスと競合しなかった。これに従って、脱シアル化およびＮ−脱グリコシル化されたトランスフェリン受容体変異体は、未変性トランスフェリン受容体と同様のトランスフェリン結合と内在化特性を示している。トランスフェリン受容体に加えて、メラノトランスフェリン（ｐ９７）を含む他の鉄輸送分子、他の受容体と同様にインシュリン受容体を含むラクトフェリン（チャン他、２００２年）および低濃度リポタンパク質受容体（デホーク（Ｄｅｈｏｕｃｋ）他、１９９７年）が可能性のある脳配送のためのＲＭＥ経路として同定されている。他の研究によって、ＴＮＦβ受容体（オスブルグ他、２００２年）等の病理学的条件において特に上方制御される受容体が脳内皮細胞においてＲＭＥを受けることが示唆された。これらのタンパク質はＦＣ５によって認識される推定上の抗原として選択的に排除されていない。
【００８４】
要約すると、ＦＣ５は脳内皮細胞の管腔表面において発現するα（２，３）−シアロ糖結合体を認識するとともにクラスリン被覆小胞を経てのアクチン及びＰｌ３キナーゼ依存トランスサイトーシスを受ける新たな単一領域抗体である。リンカー成分を提供するために作成されたＦＣ５およびその誘導体（アブルロブ（Ａｂｕｌｒｏｂ）他、２００５年）は、薬剤、生物化学製品およびナノ担体の脳標的ベクターへと発達しうる。生体内での生体内分布研究（ムルガナンダム（Ｍｕｒｕｇａｎａｎｄａｍ）他、２００１年）によって、同様の大きさの他の生物化学製品に典型的な、脳内での有意なＦＣ５蓄積およびその腎臓および肝臓による高速排除が実証された。よって、ＰＥＧ化等の戦略によるＦＣ５薬物動態学の向上は、効率的な生体内脳ターゲッティングの達成に必要であろう。にもかかわらず、ＯＸ２６抗体等の’古典的’抗体ベクターと同様に、内皮透過輸送を受ける細胞特異抗体の認識により、ＢＢＢ標的ｓｄＡｂは（細胞貫通Ｓｙｎ−Ｂペプチドと同様に）ペプチド様サイズであり脳内皮へ高電荷媒介結合する（ドリン他、２００３年）。ｓｄＡｂはペプチドとは異なりプロテアーゼへの著しい耐性を持ち、完全なＩｇＧとは異なり脳からＢＢＢにおけるＦｃ受容体媒介流出系によって搬出されることがない。これらの利点によりｓｄＡｂは、小胞内皮透過輸送の開発によって脳への標的薬剤および生物化学製品と多角的に代替される。
【００８５】
［例４．ＦＣ５に対するファージ表示ヒトｃＤＮＡライブラリのパニングによる抗原同定］
ＦＣ５に認識されるタンパク質抗原の同定のために、ゲノミクスおよびプロテオミクスの方法の組み合わせが用いられた。戦略は概略的に図１０に示される。ゲノミクスの取り組み方は固定されたＦＣ５に対するヒト脳ｃＤＮＡのファージ表示ライブラリ（コーテック）のパニングからなる。４周のパニングの後で、ＦＣ５に認識される最も頻度の高い配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １が同定された。破壊解析によってＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １を、膜間タンパク質３０Ａ（別名：Ｃ６ｏｒｆ６７、ＣＤＣ５０Ａ、細胞サイクル制御タンパク質５０Ａ）のヌクレオチド配列１５９８〜１９７９に沿って配列した。膜間領域タンパク質３０Ａ（ＴＭＥＭ３０Ａ）のコード領域はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２として示される。コードされたタンパク質のスプライシング変異体はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ４およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ５として示される。ＴＭＥＭ３０Ａの細胞外領域はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ６として示される。Ｎ−グリコシル化サイトを含むＴＭＥＭ３０Ａのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ７およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ８として示される。ＴＭＥＭ３０Ｂでのいくつかの小変異でも見られるＴＭＥＭ３０Ａの保護ＣＤＣ５０領域の配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ９〜１５として示される。これらの配列は本出願の全体において詳細に検討されることが留意される。
【００８６】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １］
ＧＡＡ ＴＴＴ ＴＡＴ ＧＧＡ ＧＡＡ ＡＧＧ ＧＡＴ ＴＡＣ ＡＡＧ ＡＴＧ ＴＡＴ ＧＡＧ ＴＡＴ ＡＡＴ ＧＡＣ ＴＴＧ ＣＴＡ ＡＣＣ ＴＴＴ
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この配列はＦＣ５に対するファージ表示ヒトｃＤＮＡライブラリのパニングから得られた。この配列はＴＭＥＭ３０Ａヌクレオチド配列（遺伝子銀行番号０１８２４７）のヌクレオチド配列１５９８〜１９７９に沿って配列され、コーディングされていない。
【００８７】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ２］
ＴＭＥＭ３０Ａのヌクレオチドコーディング領域（１４１〜１２２６）
（別名：膜間タンパク質３０Ａ、ＴＭＥＭ３０Ａ、Ｃ６ｏｒｆ６７、ＣＤＣ５０Ａ、細胞サイクル制御タンパク質５０Ａ）
ａｔｇｇｃｇａｔｇａ ａｃｔａｔａａｃｇｃ ｇａａｇｇａｔｇａａ ｇｔｇｇａｃｇｇｔｇ ｇｇｃｃｃｃｃｇｔｇ ｔｇｃｔｃｃｇｇｇｇ ｇｇｃａｃｃｇｃｇａ ａｇａｃｔｃｇｇａｇ ａｃｃｇｇａｔａａｃ ａｃｇｇｃｃｔｔｃａ ａａｃａｇｃａａｃｇ ｇｃｔｇｃｃａｇｃｔ ｔｇｇｃａｇｃｃｃａ ｔｃｃｔｔａｃｇｇｃ ｔｇｇｃａｃｇｇｔｇ ｃｔａｃｃｔａｔｔｔ ｔｃｔｔｃａｔｃａｔ ｃｇｇｔｃｔｃａｔｃ ｔｔｃａｔｔｃｃｃａ ｔｃｇｇｃａｔｔｇｇ ｃａｔｔｔｔｔｇｔｃ ａｃｃｔｃｃａａｃａ ａｃａｔｃｃｇｃｇａ ｇａｔｃｇａｇａｔｔ ｇａｔｔａｔａｃｃｇ ｇａａｃａｇａｇｃｃ ｔｔｃｃａｇｔｃｃｃ ｔｇｔａａｔａａａｔ ｇｔｔｔａｔｃｔｃｃ ｇｇａｔｇｔｇａｃａ ｃｃｔｔｇｃｔｔｔｔ ｇｔａｃｃａｔｔａａ ｃｔｔｃａｃａｃｔｇ ｇａａａａｇｔｃａｔ ｔｔｇａｇｇｇｃａａ ｃｇｔｇｔｔｔａｔｇ ｔａｔｔａｔｇｇａｃ ｔｇｔｃｔａａｔｔｔ ｃｔａｔｃａａａａｃ ｃａｔｃｇｔｃｇｔｔ ａｃｇｔｇａａａｔｃ ｔｃｇａｇａｔｇａｔ ａｇｔｃａａｃｔａａ ａｔｇｇａｇａｔｔｃ ｔａｇｔｇｃｔｔｔｇ ｃｔｔａａｔｃｃｃａ ｇｔａａｇｇａａｔｇ ｔｇａａｃｃｔｔａｔ ｃｇａａｇａａａｔｇ ａａｇａｃａａａｃｃ ａａｔｔｇｃｔｃｃｔ ｔｇｔｇｇａｇｃｔａ ｔｔｇｃｃａａｃａｇ ｃａｔｇｔｔｔａａｔ ｇａｔａｃａｔｔａｇ ａａｔｔｇｔｔｔｃｔ ｃａｔｔｇｇｃａａｔ ｇａｔｔｃｔｔａｔｃ ｃｔａｔａｃｃｔａｔ ｃｇｃｔｔｔｇａａａ ａａｇａａａｇｇｔａ ｔｔｇｃｔｔｇｇｔｇ ｇａｃａｇａｔａａａ ａａｔｇｔｇａａａｔ ｔｃａｇａａａｔｃｃ ｃｃｃｔｇｇａｇｇａ ｇａｃａａｃｃｔｇｇ ａａｇａａｃｇａｔｔ ｔａａａｇｇｔａｃａ ａｃａａａｇｃｃｔｇ ｔｇａａｃｔｇｇｃｔ ｔａａａｃｃａｇｔｔ ｔａｃａｔｇｃｔｇｇ ａｔｔｃｔｇａｃｃｃ ａｇａｔａａｔａａｔ ｇｇａｔｔｃａｔａａ ａｔｇａｇｇａｔｔｔ ｔａｔｔｇｔｔｔｇｇ ａｔｇｃｇｔａｃｔｇ ｃａｇｃａｔｔａｃｃ ｔａｃｔｔｔｔｃｇｃ ａａｇｔｔｇｔａｔｃ ｇｔｃｔｔａｔａｇａ ａａｇｇａａａａｇｔ ｇａｔｔｔａｃａｔｃ ｃａａｃａｔｔａｃｃ ａｇｃｔｇｇｃｃｇａ ｔａｃｔｃｔｔｔｇａ ａｔｇｔｃａｃａｔａ ｃａａｔｔａｃｃｃｔ ｇｔａｃａｔｔａｔｔ ｔｔｇａｔｇｇａｃｇ ａａａａｃｇｇａｔｇ ａｔｃｔｔｇａｇｃａ ｃｔａｔｔｔｃａｔｇ ｇａｔｇｇｇａｇｇａ ａａａａａｔｃｃａｔ ｔｔｔｔｇｇｇｇａｔ ｔｇｃｔｔａｃａｔｃ ｇｃｔｇｔｔｇｇａｔ ｃｃａｔｃｔｃｃｔｔ ｃｃｔｔｃｔｇｇｇａ ｇｔｔｇｔａｃｔｇｃ ｔａｇｔａａｔｔａａ ｔｃａｔａａａｔａｔ ａｇａａａｃａｇｔａ ｇｔａａｔａｃａｇｃ ｔｇａｃａｔｔａｃｃ ａｔｔｔａａｔｔｔｔ
【００８８】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ３］
［１．アイソフォーム１］
＞ｇｉ｜８９２２７２０｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿０６０７１７．１｜膜間タンパク質３０Ａ［ヒト］
ＭＡＭＮＹＮＡＫＤＥＶＤＧＧＰＰＣＡＰＧＧＴＡＫＴＲＲＰＤＮＴＡＦＫＱＱＲＬＰＡＷＱＰＩＬＴＡＧＴＶＬＰＩＦ ＦＩＩＧＬＩＦＩＰＩＧＩＧＩＦＶＴＳＮＮＩＲＥＩＥＩＤＹＴＧＴＥＰＳＳＰＣＮＫＣＬＳＰＤＶＴＰＣＦＣＴＩＮＦＴＬＥＫＳＦＥ ＧＮＶＦＭＹＹＧＬＳＮＦＹＱＮＨＲＲＹＶＫＳＲＤＤＳＱＬＮＧＤＳＳＡＬＬＮＰＳＫＥＣＥＰＹＲＲＮＥＤＫＰＩ ＡＰＣＧＡＩＡＮＳＭＦＮＤＴＬＥＬＦＬＩＧＮＤＳＹＰＩＰＩＡＬＫＫＫＧＩＡＷＷＴＤＫＮＶＫＦＲＮＰＰＧＧＤＮＬＥ ＥＲＦＫＧＴＴＫＰＶＮＷＬＫＰＶＹＭＬＤＳＤＰＤＮＮＧＦＩＮＥＤＦＩＶＷＭＲＴＡＡＬＰＴＦＲＫＬＹＲＬＩＥＲＫ ＳＤＬＨＰＴＬＰＡＧＲＹＳＬＮＶＴＹＮＹＰＶＨＹＦＤＧＲＫＲＭＩＬＳＴＩＳＷＭＧＧＫＮＰＦＬＧＩＡＹＩＡＶＧＳＩ ＳＦＬＬＧＷＬＬＶＩＮＨＫＹＲＮＳＳＮＴＡＤＩＴＩ
【００８９】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ４］
［２．アイソフォーム２］
＞ｓｐ＿ｖｓ｜Ｑ９ＮＶ９６−２｜Ｑ９ＮＶ９６ Ｑ９ＮＶ９６のアイソフォーム２
ＭＡＭＮＹＮＡＫＤＥＶＤＧＧＰＰＣＡＰＧＧＴＡＫＴＲＲＰＤＮＴＡＦＫＱＱＲＬＰＡＷＱＰＩＬＴＡＧＴＶＬＰＩＦ ＦＩＩＧＬＩＦＩＰＩＧＩＧＩＦＶＴＳＮＮＩＲＥＩＥＧＮＶＦＭＹＹＧＬＳＮＦＹＱＮＨＲＲＹＶＫＳＲＤＤＳＱＬＮＧＤＳＳ ＡＬＬＮＰＳＫＥＣＥＰＹＲＲＮＥＤＫＰＩＡＰＣＧＡＩＡＮＳＭＦＮＤＴＬＥＬＦＬＩＧＮＤＳＹＰＩＰＩＡＬＫＫＫＧＩＡ ＷＷＴＤＫＮＶＫＦＲＮＰＰＧＧＤＮＬＥＥＲＦＫＧＴＴＫＰＶＮＷＬＫＰＶＹＭＬＤＳＤＰＤＮＮＧＦＩＮＥＤＦＩ ＶＷＭＲＴＡＡＬＰＴＦＲＫＬＹＲＬＩＥＲＫＳＤＬＨＰＴＬＰＡＧＲＹＳＬＮＶＴＹＮＹＰＶＨＹＦＤＧＲＫＲＭＩＬＳ ＴＩＳＷＭＧＧＫＮＰＦＬＧＩＡＹＩＡＶＧＳＩＳＦＬＬＧＷＬＬＶＩＮＨＫＹＲＮＳＳＮＴＡＤＩＴＩ
アイソフォーム２は消失アミノ酸７９〜１１４である。
【００９０】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ５］
［３．アイソフォーム３］
＞ｓｐ＿ｖｓ｜Ｑ９ＮＶ９６−３｜Ｑ９ＮＶ９６ Ｑ９ＮＶ９６のアイソフォーム３
ＭＹＹＧＬＳＮＦＹＱＮＨＲＲＹＶＫＳＲＤＤＳＱＬＮＧＤＳＳＡＬＬＮＰＳＫＥＣＥＰＹＲＲＮＥＤＫＰＩＡＰＣＧ ＡＩＡＮＳＭＦＮＤＴＬＥＬＦＬＩＧＮＤＳＹＰＩＰＩＡＬＫＫＫＧＩＡＷＷＴＤＫＮＶＫＦＲＮＰＰＧＧＤＮＬＥＥＲＦＫ ＧＴＴＫＰＶＮＷＬＫＰＶＹＭＬＤＳＤＰＤＮＮＧＦＩＮＥＤＦＩＶＷＭＲＴＡＡＬＰＴＦＲＫＬＹＲＬＩＥＲＫＳＤＬＨ ＰＴＬＰＡＧＲＹＳＬＮＶＴＹＮＹＰＶＨＹＦＤＧＲＫＲＭＩＬＳＴＩＳＷＭＧＧＫＮＰＦＬＧＩＡＹＩＡＶＧＳＩＳＦＬＬ ＧＷＬＬＶＩＮＨＫＹＲＮＳＳＮＴＡＤＩＴＩ
アイソフォーム２は消失アミノ酸１〜１１９である。
ＴＭＥＭ３０Ａの細胞外領域はアミノ酸６７〜３２３を含む。
【００９１】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ６］
ＧＩＦＶＴＳＮＮＩＲＥＩＥＩＤＹＴＧＴＥＰＳＳＰＣＮＫＣＬＳＰＤＶＴＰＣＦＣＴＩＮＦＴＬＥＫＳＦＥＧＮＶＦＭＹＹＧ ＬＳＮＦＹＱＮＨＲＲＹＶＫＳＲＤＤＳＱＬＮＧＤＳＳＡＬＬＮＰＳＫＥＣＥＰＹＲＲＮＥＤＫＰＩＡＰＣＧＡＩＡＮＳ ＭＦＮＤＴＬＥＬＦＬＩＧＮＤＳＹＰＩＰＩＡＬＫＫＫＧＩＡＷＷＴＤＫＮＶＫＦＲＮＰＰＧＧＤＮＬＥＥＲＦＫＧＴＴＫ ＰＶＮＷＬＫＰＶＹＭＬＤＳＤＰＤＮＮＧＦＩＮＥＤＦＩＶＷＭＲＴＡＡＬＰＴＦＲＫＬＹＲＬＩＥＲＫＳＤＬＨＰＴＬＰ ＡＧＲＹＳＬＮＶＴＹＮＹＰＶＨＹＦＤＧＲＫＲＭＩＬＳＴＩＳＷＭＧＧＫＮＰ
【００９２】
［Ｎ−グリコシル化サイトを含むＴＭＥＭ３０Ａのアミノ酸配列］
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ７］
ＲＲＮＥＤＫＰＩＡＰＣＧＡＩＡＮＳＭＦＮＤＴＬＥＬＦＬＩＧＮ ＤＳＹＰＩＰＡＬＫ
（ＴＭＥＭ３０Ａ残基１６０〜２００に見られる）
【００９３】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ８］
ＲＲＮＥＤＫＰＩＡＰ ＣＧＡＩＡＮＳＭＦＮＤＴＬＥＬＦＬＩＧＮ ＤＳＹＰＩＰＩＡＬＫ ＫＫＧＩＡＷＷＴＤＫ ＮＶＫＦＲＮＰＰＧＧ ＤＮＬＥＥＲＦＫＧＴ ＴＫＰＶＮＷＬＫＰＶＹＭＬＤＳＤＰＤＮＮ ＧＦＩＮＥＤＦＩＶＷ ＭＲＴＡＡＬＰＴＦＲ ＫＬＹＲＬＩＥＲＫＳ ＤＬＨＰＴＬＰＡＧＲ ＹＳＬＮＶＴＹＮＹＰ
（ＴＭＥＭ３０Ａ残基１６０〜３００に見られる）
Ｎ−グリコシル化感受性残基：１８０、１９０、２９４
ＴＭＥＭ３０Ｂでのいくつかの小変異でも見られるＴＭＥＭ３０Ａの保護ＣＤＣ５０領域の配列。
【００９４】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ９］
ＮＦＹＱＮＨＲＲＹＶＫＳＲＤＤＳＱＬ
（ＴＭＥＭ３０Ａ残基１２６〜１４４およびＴＭＥＭ３０Ｂ残基１１５〜１３３に見られる）
【００９５】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １０］
ＡＰＣＧＡＩＡＮＳＭＦ
（ＴＭＥＭ３０Ａ残基１６９〜１７９に見られる）
【００９６】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １１］
ＡＰＣＧＡＩＡＮＳＬＦ
（ＴＭＥＭ３０Ｂ残基１６０〜１７０に見られる）
【００９７】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １２］
ＤＦＩＶＷＭＲＴＡＡＬＰＴ
（ＴＭＥＭ３０Ａ残基２５６〜２６９に見られる）
【００９８】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １３］
ＤＦＶＶＷＭＲＴＡＡＬＰＴ
（ＴＭＥＭ３０Ｂ残基２４９〜２６２に見られる）
【００９９】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １４］
ＭＧＧＫＮＰＦＬＧＩＡＹＩＡＶＧ
（ＴＭＥＭ３０Ａ残基２５６〜２６９に見られる）
【０１００】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １５］
ＭＧＧＫＮＰＦＬＧＩＡＹＬＶＶＧ
（ＴＭＥＭ３０Ｂ残基２４９〜２６２に見られる）
【０１０１】
［ＦＣ５抗原の組織分布］
推定上のＦＣ５抗原の組織分布を解析するために、組織を表示するコーテック組織マイクロアレイによって様々な器官、様々な脳領域および様々な細胞系から抽出する。組織マイクロアレイをＴＭＥＭ３０Ａプライマーによってプローブし、ＴＭＥＭ３０Ａ結合をサウザンブロットによって検出した。図１１に様々な脳領域および肺癌腫におけるＦＣ５の高反応性（抗原の豊富さ）が示される。
【０１０２】
［脳でのＴＭＥＭ３０Ａ遺伝子の発現］
異なる細胞系でのＴＭＥＭ３０Ａ遺伝子発現はＲＴ−ＰＣＲおよび正５’ＧＡＡＧＡＣＴＣＧＧＡＧＡＣＣＧＧＡＴＡＡＣＡＣ’３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６）と逆５’ＣＡＧＴＡＣＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧ’３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７）を用いて試験された。図１２にヒト脳内皮細胞（ＨＢＥＣ）でのＴＭＥＭ３０Ａの高発現およびヒト胎児星状細胞での低発現が示される。ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＭＬＣＥ）もまたＴＭＥＭ３０Ａ遺伝子発現を示した。
【０１０３】
［例５．プロテオミクスによる抗原同定］
プロテオミクスによる抗原同定は、ａ）脳内皮細胞（抗原を含む）の原形質膜の抽出；ｂ）該抽出物の、ニッケルマイクロスピンカラムに結合したＦＣ５または負の対照の抗原、ＮＣ１１の通過；ｃ）溶出液のカラムからの回収、０．２Ｕノイラミニダーゼ酵素（シグマ社のコレラ菌より）との処理または不処理、および質量分光測定によるこれらの解析、によってなされる。この取り組み方について以下で述べる。
【０１０４】
［原形質膜タンパク質の抽出］
固定されたラット脳内皮細胞（ＳＶ−ＡＲＢＥＣ）を１６０ｃｍ２ペトリ皿で約１週間培養した。細胞が完全培地変更によって４日後に供給された。細胞が融合状態に達した際に、原形質膜タンパク質を抽出した。８枚の１６０ｃｍ２ペトリ皿を用いた。細胞を氷上に置き、３０ｍｌのＰＢＳで１回および１０ｍｌの緩衝剤Ａ（０．２５Ｍスクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ， ２０ｍＭトリシン、ｐＨ７．８）で２回洗浄した。５ｍｌの緩衝剤Ａ＋（緩衝剤Ａに１：１０００のシグマ社の阻害剤カクテルを加える）を加え、細胞を掻取った。それから細胞を２つの５０ｍｌファルコン（登録商標）チューブに収集し（４皿／チューブ）、４℃、１４００ｘｇで５分間回転させた。細胞ペレットを１ｍｌの緩衝剤Ａ＋に再懸濁した。再懸濁したペレット双方を一緒にし、ガラスチューブとテフロン（登録商標）乳棒（２０ストローク）を用いて均質化した。該ホモジェネートを２つの２ｍｌ遠心チューブに移し、４℃、１０００ｘｇで１０分間回転させた。上澄みを収集した。ペレットを２ｍｌの緩衝剤Ａ＋に再懸濁し、それから均質化した。原形質膜を２０ｍｌの３０％パーコールに加え、４℃、８３０００ｘｇで３０分間回転させた。原形質膜試料を収集し５ｍｌのＰＢＳ＋に再懸濁し、４℃、１１８０００ｘｇで１時間回転させた。タンパク質濃度をＢＣＡキット（ピアス社）を用いて測定した。試料を等分し−８０℃で凍結した。
【０１０５】
［抗原同定のための抗体装填カラム］
アマシャム マイクロスピンＨｉｓ精製モジュールのカラムを抗体の結合に用いた。簡単には、カラムを２００μｇのＦＣ５、ＮＣ１１または単にＰＢＳと共に倒置して室温で１時間インキュベートした。カラムを７３５ｘｇで１分間回転し、それから５００ｕｌのＰＮＩ２０で１回、５００ｕｌのＰＢＳで２回洗浄した。３００μｇの原形質膜タンパク質を各カラムで倒置して４℃で３．５時間インキュベートし、それから倒置して室温で３０分間インキュベートした。それからカラムを７３５ｘｇで１分間回転し、その後５００ｕｌのＰＮＩ２０で４回洗浄し、各洗浄の間に７３５ｘｇで１分間回転した。カラムを２００ｕｌのＰＮＩ４００と共に倒置して室温で１５分間インキュベートし、７３５ｘｇで１分間回転することによって、タンパク質を溶出した。各タンパク質試料から溶出したタンパク質を０．２Ｕノイラミニダーゼで１時間処理し、あるいは処理しなかった。
【０１０６】
［トリプシン消化］
下ろした試料それぞれ（ＦＣ５、ＮＣ１１、ＰＢＳ）を、１０倍の冷アセトンを加え−２０℃で１２時間以上インキュベートすることで沈殿させた。５０００ｘｇ、５分間の遠心分離によりタンパク質をペレットとし、５０μｌ 変性緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、０．１％ＳＤＳ、４ｍＭ ＤＤＴ）に溶解させた。タンパク質を１５分間煮沸し変性させ、２分間冷却した。試料それぞれに５μｇのトリプシン（プロメガ社、カタログ番号Ｖ５２８０）を加え、試料を３７℃で１２時間以上インキュベートした。
【０１０７】
［カチオン変換（ＣＥ）カラムでの精製］
試料それぞれをＣＥ移動相緩衝剤（１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ３．０、２５％アセトニトリル）で２ｍｌに希釈し、ｐＨが３．３以下であることを確認した。試料をカチオン変換カラム（ＰＯＲＯＳ（登録商標）５０ＨＳ、５０μｍ粒子サイズ、４．０ｍｍ ｘ １５ｍｍ，アプライドバイオシステム社、カタログ番号４３２６６９５）で精製した。
【０１０８】
［質量分光測定およびデータベース探索］
複合四重極飛行時間型質量分析測定（Ｑ−ＴＯＦ（登録商標）ウルティマ、ウォーターズ社、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ミルフォード）およびエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）およびオンライン逆相ナノフロー液体クロマトグラフィーカラム（ナノＬＣ、０．３ｍｍ×１５ｃｍ ペプマップ（ＰｅｐＭａｐ、登録商標）Ｃ１８毛管カラム、ダイオネクス社／ＬＣパッキングス社，アメリカ合衆国カリフォルニア州サンフランシスコ）を全ての解析に用いた。用いたナノＬＣカラムの勾配はＣａｐＬＣ ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）ポンプ（ウォーターズ社）によって提供される５０ｍｉｎ、０．３５μｌ／ｍｉｎでの５〜９５％アセトニトリル、０．２％蟻酸である。試料それぞれの解析を２つの手順で行った。第一の手順において、試料の５％をナノＬＣ ＭＳにより測量（ＭＳ専用）モードで行い、試料それぞれに存在するタンパク質全ての強度を定量化した。関連するペプチドは「定量化データ解析」に述べるように決定され、「目標リスト」に含まれた。第二の手順において、試料それぞれを質量分析装置に再注入し（５％）、目標リストに含まれるペプチドのみをナノＬＣ ＭＳ／ＭＳモードで配列決定した。ＭＳ／ＭＳスペクトルは２＋、３＋および４＋イオンのみで得られた。それからこれらをＰＥＡＫＳサーチエンジン（バイオインフォメティクスソリューションズ社、カナダ オンタリオ州）にかけ、ＮＣＢＩ非冗長トリプシン消化（２つの開裂を許容）ヒトデータベースに対して探索した。
【０１０９】
［ＭａｔｃｈＲｘソフトウェアを用いた量的データ解析］
試料それぞれのナノＬＣ ＭＳ生データから、個々のペプチドの存在度に対応するピーク強度を、初期に述べられたように（ハッカーニ他、ＦＡＳＥＢジャーナル、２００５年１１月；１９：１８０９〜２１）抽出した。ＭａｔｃｈＲｘソフトウェアを用いて全ての試料の間でペプチド強度を量的に比較した。ＦＣ５引落しに存在しＮＣ１１およびＰＢＳ引落しに存在しないペプチドは関連した。ＦＣ５から抽出されたプロテオミクスによって同定されたがＮＣ１１抗体カラムからはされなかったペプチドは以下である：
ＳＳＰＣＮＫ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １８）
ＬＩＥＲ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １９）
ＨＳＦＤＧＲＫＲ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ２０）
ＮＹＰＶＨＳＦＤＧＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２１）
これら全てのペプチドはＴＭＥＭ３０Ａタンパク質に属する。
【０１１０】
［例６．ＴＭＥＭ３０Ａの発現およびＦＣ５による認識］
次にＴＭＥＭ３０Ａタンパク質をクローニングし、発現させた。ＴＭＥＭ３０Ａ発現細胞の細胞溶解物内のＴＭＥＭ３０ＡのＦＣ５による認識を用い、ＴＭＥＭ３０ＡのＦＣ５による特異的認識を確認した。
【０１１１】
［ヒトＴＭＥＭ３０Ａ遺伝子のｐＴＴ５ＳＨ８Ｑ２ベクターへのクローニングによる哺乳類細胞内のその目標タンパク質の精製］
Ｃ末端Ｈｉｓ６タグに寄宿するｐＴＴ５ＳＨ８Ｑ２ベクターを、ＴＭＥＭ３０Ａ遺伝子のクローニングに用いた。クローニングのためのＰＣＲに用いたプライマーは以下である：
【０１１２】
［ＴＭＥＭ３０Ａ正］
【化１】
【０１１３】
［ＴＭＥＭ３０Ａ逆］
【化２】
【０１１４】
アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を追加したサークルグロウ（ＣｉｃｕｌｅＧｒｏｗ）液体培地中で生育した大腸菌ＤＨ５α株を用いてプラスミドを増幅し、マキシ／ギガ（Ｍａｘｉ／Ｇｉｇａ）プラスミド精製キット（キアゲン社）を用いて精製した。
【０１１５】
以下のプライマーを用いて配列を確認した：
ＴＭＥＭ３０Ａ−ＳＰ１
５’ ＴＣＴ ＣＧＡ ＴＣＴ ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＧＣ ３’ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ２４）
ＴＭＥＭ３０Ａ−ＳＰ２
５’ ＣＡＴ ＣＣＡ ＡＣＡ ＴＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ３１ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ２５）
ＴＭＥＭ３０Ａ−ＳＰ３
５’ ＣＧＧ ＡＴＧ ＡＴＣ ＴＴＧ ＡＧＣ ＡＣＴ ３’ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ２６）
５０ ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）内での２６０ｎｍの紫外線吸収により、ＤＮＡ濃度を測定した。
【０１１６】
［ＴＭＥＭ３０Ａタンパク質の生産］
０．１％ プルロニック（登録商標）Ｆ−６８、１％ 子ウシ血清（ＢＣＳ）、５０μｇ／ｍｌ ジェネティシン（登録商標）Ｇ４１８、および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを追加した低カルシウムＳＦＭ（ＬＣＳＦＭ、インビトロジェン社、ニューヨーク州グランドアイランド）内において、エプスタイン−バーウイルス核抗原を安定して発現するヒト胚腎臓２９３細胞系（２９３Ｅ）を、浮遊培養として生育した。無血清細胞系ＨＥＫ２９３ ＳＦＥ（２９３ＳＦＥ）もまたＴＭＥＭ３０Ａ生産に用いた。これらの細胞を先に述べられたように（ファム他、２００３年）０．５％ＧＰＮ３を追加したＬＣ−ＳＦＭ内において生育した。全ての細胞経路を２０ｍｌの培地を含む１２５ｍｌエルレンマイアーフラスコ内で慣例的に行った。ＬＣ−ＳＦＭＬＢ、１０μｇ／ｍｌのジェネティシンおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む培養フラスコ内で浮遊する２９３ＳＦＥ細胞は対数期に維持された。培養フラスコを、３７℃、加湿された５％ＣＯ２大気中で１１０ｒｐｍで振動させた。
【０１１７】
［ＴＭＥＭ３０Ａの細胞溶解物内での発現］
図１３に示すように、１％セシト（Ｔｈｅｓｉｔ、登録商標）およびデオキシコールエステルを用いてＴＭＥＭ３０Ａを細胞から抽出した。抗ヒスチジン抗体を検出に用いた。ＴＭＥＭ３０Ａの予想Ｍｗｔは４０Ｋｄａで、約５０Ｋｄａの高タンパク質分子重量サイズはグリコシル化されるはずである。
【０１１８】
［ＴＭＥＭ３０ＡのＦＣ５との相互作用の免疫沈降による調査］
ＴＭＥＭ３０ＡとＦＣ５の相互作用の研究のため、ＴＭＥＭ３０Ａを発現するように転換されたＨＥＫ２９３からの１００μｇの上澄み細胞溶解物を最初に４℃でゆるやかな揺動と共に５０μｌ タンパク質Ａセファロース（５０％スラリー）を２時間インキュベートし、５００ｇで４分間回転することで透明にした。改良結合力を用いたＦＣ５の多重結合形態（改変五量体ＦＣ５）（２５μｇ）を透明にした上澄みに加え、４℃で一晩インキュベートした。タンパク質Ａセファロース（５０μｌ、５０％スラリー）を免疫結合溶解物に加え、４℃で２時間インキュベートした。それから免疫複合体を氷冷ＰＢＳで５回洗浄した。その後スラリーをレムリ緩衝剤中で５分間煮沸することで結合タンパク質を分離し、１４０００ｇで１分間遠心分離して免疫沈降したタンパク質を収集した。沈降したタンパク質を１２％ ＳＤＳアクリルアミドゲル上で分離し、それから銀染色することでバンドを視覚化した。
図１４に示すように、五量体ＦＣ５は分子量約５０のバンドでのみ免疫沈降し、図１３のタンパク質サイズが同定された。ＦＣ５五量体と共にインキュベートされなかった細胞はＴＭＥＭ３０Ａを免疫沈降しなかった。
【０１１９】
［７．ＦＣ５によるＴＭＥＭ３０Ａ媒介輸送の機能的競合］
ラット脳内皮細胞をカバーリップで３日間培養し、それからＦＣ５、五量体ＦＣ５または負対照抗体（ＮＣ１１）の存在下または非存在下で、アバンティ リピッド社から購入した１−パルミトイル−２−〔６−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４基）アミノ］ヘキサノイル〕−ＳＡ７−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−０６：０ ＮＢＤ ＰＣ）（ＤＳＭＯに溶解）によって３７℃で３０分間処理した。それから細胞を広範囲に洗浄し４％ホルムアルデヒドで固定し、その後ＤＡＰＩを加えたダコ蛍光封入剤（１：２０００、２ｍｇ／ｍｌストックから）で処理した。全ての画像はアクシオバート（Ａｘｉｏｖｅｒｔ）２００及び以下の設定を用いて得られた：２０Ｘ対物レンズ、ＤＮＡ−ＤＡＰＩ（青） ８５ｍｓｅｃ、ＮＢＤ−ＦＩＴＣ（緑）２５０ｍｓｅｃである。
図１５に示す結果から、ＦＣ５およびその五量体Ｐ５が、ＮＢＤホスファチジルコリン（ＮＢＤ−ＰＣ）の内在化の減少より測定されるＴＭＥＭ３０Ａ生理機能と競合することが実証される。これに対し、負対照抗体ＮＣ１１はＮＢＤ−ＰＣの内在化を阻害しなかった。
【０１２０】
［材料および方法］
［材料］
細胞培養プラスチックはベクトン ディキンソン社（オンタリオ州ミシソーガ）から得た。ダルベッコ変法イーグル培地をインビトロジェン社（カリフォルニア州カールズバッド）、ＦＢＳをハイクローン社（ユタ州ローガン）、ヒト血清をウィゼント社（ケベック州モントリオール）、内皮細胞生育補給剤をコラボレーティブバイオメディカルプロダクツ社（マサチューセッツ州ベッドフォード）から購入した。抗体は以下の供給元から得た：抗ｃ−Ｍｙｃペルオキシダーゼ抗体をロッシュ社（アメリカ合衆国インディアナ州インディアナポリス）、抗カベオリンおよび抗クラスリン抗体をサンタクルス バイオテクノロジー社（カリフォルニア州サンタクルス）、ＦＩＴＣ結合抗マウスおよびアレクサ５６８結合抗ウサギ二次抗体をモレキュラープローブ社（アメリカ合衆国オレゴン州ユージーン）、テキサスレッド結合トランスフェリンおよびカルセイン−ＡＭをモレキュラープローブ社（アメリカ合衆国オレゴン州ユージーン）から購入した。モネンシンおよびビスインドリルマレイミド−１（ＢＩＭ）はカルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、アメリカ合衆国カリフォルニア州サンディエゴ）から得た。オプティプレップはアキュレイト ケミカル アンド サイエンティフィック社（アメリカ合衆国ニューヨーク州ウェストベリー）から購入した。精製ヒトトランスフェリン受容体およびモノクローナル抗ＣＤ７１（抗トランスフェリン受容体）抗体はリサーチ ディアゴノスティクス社（アメリカ合衆国ニュージャージー州フランダース）から購入した。［１４Ｃ］−スクロースはパーキン エルマー社（アメリカ合衆国マサチューセッツ州ボストン）から購入した。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）／過酸化水素基質システムはＲ＆Ｄシステムズ（ミネソタ州ミネアポリス）から得た。ＥＺリンク硫酸−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチンおよびビシンコニン酸検定（ＢＣＡ）はピアス バイオテクノロジー社（アメリカ合衆国イリノイ州ロックフォード）から購入した。他の全ての化学物質はシグマ社（アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイス）から得た。
【０１２１】
［ＦＣ５ｓｄＡｂのクローニング、発現および精製］
ＦＣ５はラマ重鎖抗体の可変領域（ＶＨＨ）であり、遺伝子銀行のｍＲＮＡおよびアミノ酸配列（それぞれＮｏ．ＡＦ４４１４８６およびＮｏ．ＡＡＬ５８８４６）をエンコードする。ＤＮＡエンコードＦＣ５をプラスミドｐＳＪＦ２のＢｂｓｌ／ＢａｍＨＩサイトへクローニングし、ＦＣ５の発現ベクターを生成した。ＤＮＡ構造は３７３Ａ ＤＮＡシーケンサーストレッチ（ＰＥアプライド バイオシステムズ社）での、プライマーｆｄＴＧＩＩＩ、５’−ＧＴＧＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＣＧＣＡＡＴＴＣＣＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２７）および９６ＧＩＩＩ、５’−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２８）を用いたヌクレオチド配列決定によって確認された。ＦＣ５はＨｉｓ５およびｃ−ｍｙｃタグとの融合で発現し、ハイトラップ キレーティング（ＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ、登録商標）カラムを用いた固定金属親和クロマトグラフィーによる精製、および免疫化学による検出を可能とした。組換え抗体発現バクテリア大腸菌株ＴＧ１の単クローンを用いて１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＭ９培地に接種し、培地を３７℃、２００ｒｐｍで一晩振動させた。５μｇ／ｍｌのビタミンＢ１、０．４％ カザミノ酸および１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＭ９培地（０．２％ グルコース、０．６％ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％ ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ ＮＨ４ＣＩ、０．０５％ ＮａＣＩ、１ ｍＭ ＭｇＣＩ２、０．１ ｍＭ ＣａＣＩ２）１Ｌへ、生育した細胞（２５ｍｌ）を移した。細胞培地を室温、２００ｒｐｍで２４時間振動させ、それから１２％ トリプトン、２４％ 酵母抽出物および４％ グリセロールを含む１０Ｘ誘導培地テリフィックブロス １００ｍｌを加えた。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、１ｍＭ）を加えることでタンパク質発現を誘導した。誘導の後で、培地をさらに２５℃で７２時間振動させ、ペリプラズム分画を浸透圧ショック法（アナンド他、１９９１年）によって抽出した。ハイトラップ キレーティング（ＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ、登録商標）カラム（アマシャム ファーマシア バイオテック社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いた固定金属親和クロマトグラフィーによってＦＣ５断片を分離した。生産されたＦＣ５を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝剤、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中、１０〜５００ｍＭ イミダゾール勾配において溶出し、ピーク分画を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝剤、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４に対し広範囲で透析した。ＦＣ５の分子量は１３．２ｋＤａで、ＦＣ５とｃ−ｍｙｃおよびＨｉｓ５との融合タンパク質の分子量は１５．２ｋＤａである。
【０１２２】
［ｃｙｓＦＣ５のクローニングおよび精製］
ＦＣ５は、薬剤および担体との結合が可能なように、追加の自由システインを加えるために作成された。ｓｄＡｂ ＦＣ５をエンコードするＤＮＡをプラスミドｐＳＪＦ２のＢｂｓｌ／ＢａｍＨＩサイトへクローニングし、単量体ＦＣ５の発現ベクターを生成した。ｃｙｓＦＣ５遺伝子をＦＣ５テンプレートから、Ｈｉｓ５’精製’タグコドンの直後にシステインを追加した正プライマーを用いて標準的ＰＣＲによって生成した。続いてｃｙｓＦＣ５遺伝子を、標準的なクローニング技法を用いてｐＳＪＦ２へクローニングした。クローンされた構造物の完全性は３７３Ａ ＤＮＡシーケンサーストレッチ（ＰＥアプライド バイオシステムズ社、オンタリオ州スツリーツビル）でのヌクレオチドシーケンスによって確認された。ｃｙｓＦＣ５は細菌の大腸菌株ＴＧ１で発現し、固定金属親和クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製された。ｃｙｓＦＣ５と相同であるとＳＤＳ−ＰＡＧＥで判定された分離された分画は蓄積され、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝剤（１５０ｍＭ ＮａＣＩ、３．４ ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に対し広範囲で透析された。タンパク質濃度はビシンコニン酸検定（ＢＣＡ）によって決定された。保存されたＣｙｓ２２−Ｃｙｓ９２内部ジスルフィド結合を損傷することなしに改変されていないシステインの完全な減少を確認するために、ｃｙｓＦＣ５を結合に優先してＧ−２５セファデックスカラムでの高速分離の後で４℃で一晩ＰＢＳ中で５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ（２−カルボキシエチル）塩酸ホスフィンに暴露した。これらの条件は非損傷の細胞の上澄みおよびＣＥＣ単層を経ての移行によって決定されるｃｙｓＦＣ５の抗原結合活性を損傷しなかった。
【０１２３】
［ＨＲＰ−ＩｇＧのｃｙｓＦＣ５への結合］
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）タグマウスＩｇＧとｃｙｓＦＣ５との架橋結合が、架橋結合試剤としてのスルフォスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルフォ−ＳＭＣＣ）によって達成された。スルフォ−ＳＭＣＣはＨＲＰ−ＩｇＧ上のアミン（−ＮＨ２）機能グループとｃｙｓＦＣ５のｓｄＡｂ上のスルフォヒドリル（−ＳＨ）グループとの間に橋を構築する。まず、ＨＲＰ−ＩｇＧをＰＢＳ中の１０モル以上のスルフォ−ＳＭＣＣ溶液と共に室温で３０分間インキュベートすることでマレイミド活性化した。マレイミド試薬をＧ−２５セファデックスカラム（ロッシュ社、インディアナ州インディアナポリス）によって除去した。マレイミド活性化ＨＲＰ−ＩｇＧは減少されたｃｙｓＦＣ５と５：１モル濃度比で室温において１時間混合することで架橋結合された。
【０１２４】
［細胞培養物］
一次性のヒト大脳微少血管細胞（ＨＣＥＣ）培養物は、真性てんかんの影響を受けた脳の病巣周囲の領域から外科的に除去されたヒト側頭皮質から分離された。細胞を既に述べられたようにして分離、培養し特性を決定した（スタニミロビッチ（Ｓｔａｎｉｍｉｒｏｖｉｃ）他、１９９６年；ムルガナンダム（Ｍｕｒｕｇａｎａｎｄａｍ）他、１９９７年）。これらのＨＣＥＣ培養物の形態学、表現型、生化学および機能的特性は既に述べられている（スタニミロビッチ（Ｓｔａｎｉｍｉｒｏｖｉｃ）他、１９９６年；ムルガナンダム他、１９９７年）。ＨＣＥＣの経路２〜６をこの研究の実験に用いている。
【０１２５】
ＦＣ５および様々な薬理学試剤の存在下での生存力を、生体染色カルセインＡＭ放出検定によって先に述べられたように査定した（ワン他、１９９８年）。
ＦＣ５のＨＣＥＣへの取り込みは、５μｇ／ｍｌのＦＣ５を加えた後でエンドサイトーシスの様々な薬理的モジュレーターの不在または存在下において１５〜９０分間試験された。ＦＣ５の細胞分布を視覚化するために、ＦＩＴＣラベル抗マウスＩｇＧとのインキュベート（１：２５０、１時間）の後で細胞を固定、透過性化し、抗ｃ−ｍｙｃ抗体でプローブした（１：１００、１時間）。
【０１２６】
［生体外血液−脳隔壁モデルを経ての輸送］
ＨＣＥＣ（８００００細胞／膜）を１ｍｌの増殖培地中において０．５％ゼラチン被覆ファルコン組織培養インサート（孔径１μｍ；表面積０．８３ｃｍ２）に接種した。インサートアセンブリの底室は、胎児ヒト星状細胞条件基剤を体積比１：１で供給した２ｍｌの増殖培地を含んでいた（ムルガナンダム他、１９９７年）。モデルは分子量１ｋＤａ以上の親水性化合物に対し実質的に不浸透性であった（ムルガナンダム他、１９９７年）。
【０１２７】
輸送研究は既に述べられたようにして接種後に７日間行われた（ムルガナンダム他、１９９７年；ムルガナンダム他、２００２年）。フィルターインサートを輸送緩衝剤［５ｍＭ グルコース、５ｍＭ ＭｇＣＩ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むｐＨ７．４のリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）］でリンスし、３７℃で３０分間平衡させた。実験は、細胞、対照ＨＣＥＣまたは薬理的モジュレーターに３０分間暴露されたＨＣＥＣを除いた０．５％ゼラチン被覆インサートを含むインサートの頂端および側底に１０ｇ／ｍｌのＦＣ５を加えることで開始された。輸送研究は３７℃で、３０〜４０ｒｐｍで攪拌する回転台上のプレートにおいて行われた。部分標本（１００μｌ）を逆の室から様々な時間間隔において（５、１５、３０、６０、９０分）収集し、新しい緩衝剤に移した。空のインサートまたはＨＣＥＣ単層を経て輸送されたＦＣ５の量は酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によって決定された（下を参照）。ＨＣＥＣ膜の完全性の対照および細胞間拡散の評価のために、［１４Ｃ］−スクロースのＦＣ５輸送実験で用いられたものと同じ単層を経ての頂端から側底および側底から頂端のクリアランス率を事実上先に述べられたようにして決定し算出した（ムルガナンダム他、２００２年；ガーバーグ他、２００５年）。５０μｌの部分標本における試料関連放射能をマイクロベータ（登録商標）トリラックス液体シンチレーション計数器（ウォレス社、フィンランド）を用いて測定した。
【０１２８】
クリアランスはＣｌ（ｍｌ）＝ＣＡ／ＣＩｘＶＡとして算出され、ここでＣＩは供与体室の初期トレーサーまたはｓｄＡｂ濃度、ＣＡは受容体室のトレーサーまたはｓｄＡｂ濃度、ＶＡは受容体室の体積である。ＦＣ５のクリアランスは１５分から６０分の間において線形であり、６０分から９０分の間において飽和に達した（ムルガナンダム他、２００２年）。ＦＣ５移行での薬理的モジュレーターの効果は続いて３０分において査定された。ＨＣＥＣ単層は、同一のライブラリまたは同様の分子量の蛍光デキストランから分離された非選択ｓｄＡｂに対し実質的に不浸透性である（ムルガナンダム他、２００２年）。
【０１２９】
［レーザー走査共焦鏡検］
クラスリンまたはカベオリン−１によるＦＣ５のコローカリゼーションは二重免疫蛍光ラベルによって研究された。ＨＣＥＣをまず５μｇ／ｍｌ ＦＣ５と共に３０分間インキュベートし、洗浄し、４％ ホルムアルデヒドによって固定し、０．１％ トライトンＸ−１００により１０分間で透過性化した。それから細胞を４％ ヤギ血清により１時間で閉塞した。閉塞の後で、細胞をまず抗ｃ−Ｍｙｃ単層抗体（１：１００）と共に１時間インキュベートし、広範囲に洗浄し、それからＦＩＴＣ抗マウスＩｇＧ二次抗体（１：２５０）と共に１時間インキュベートした。４％ ヤギ血清での２回目の一晩の閉塞の後で、ＨＣＥＣを抗クラスリン（１：１００）または抗カベオリン−１（１：３００）ポリクローナル抗体と共に１時間インキュベートし、それからアレクサ５６８結合抗ウサギＩｇＧ二次抗体（１：３００）共に１時間インキュベートした。テキサスレッド結合トランスフェリン（１μＭ）およびカテプシン−Ｂモノクローナル抗体（１：２００）をそれぞれ初期および後期エンドソームのマーカーとして用いた。染色細胞のカバーガラスをＨＢＳＳで５回洗浄し、蛍光封入剤（ダコ社、オンタリオ州ミシソーガ）に封入した。
【０１３０】
二重の免疫化学で処理された細胞の画像化を、アルゴン／クリプトンイオンレーザーおよびプラン ネオフルオラ６３Ｘ １．３ＮＡ油浸対物レンズを装備したツァイスＬＳＭ４１０（カールツァイス社、ニューヨーク州ソーンウッド）反転レーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ）を用いて行った。２つのフッ素プローブの共焦画像が４８８および５６８ｎｍ励起レーザー線を用いた連続捕捉と同時に得られ、それぞれＦＩＴＣ（ＢＰ５０５〜５５０エミッション）およびテキサスレッド／アレクサ５６８蛍光（ＬＰ５９０エミッション）を検出した。全ての画像をそれぞれのチャネルについて同一のレーザー力およびピンホールサイズを用いて収集し、同じ方式で処理した。
一次抗体の省略では染色がなされなかった。一次および非対応二次抗体の間では交差反応は観測されなかった。
【０１３１】
［細胞分画］
タンパク質および脂質分画を分離するために、ＨＣＥＣをＰＢＳで洗浄し、掻取り凍結乾燥した。細胞残物をｐＨ７．２、５０ｍＭのトリスに溶解した。ヴェッセルおよびフリュッゲのプロトコルの改良版（ヴェッセル、１９８４年）を用いてクロロホルム−メタノール混合物によりタンパク質を脂質から分離した。窒素ガス流での脂質分画の乾燥の前に、ガラクトシルセラミドを正の対照として加えた。タンパク質および脂質を６Ｍの尿素およびエタノールにそれぞれ溶解した。
【０１３２】
界面活性剤を用いない方法を用いて既に述べられたようにして低濃度膜分画を分離した（アブルロブ（Ａｂｕｌｒｏｂ）他、２００４年）。全ての行程は４℃において行い、全ての緩衝剤はプロテアーゼ阻害剤のカクテル（シグマ社）を追加した。５μｇ／ｍｌ ＦＣ５存在下で３０分間インキュベートした融合ＨＣＥＣの５つの７５ｃｍ２組織培養フラスコから、原形質膜分画を調製した。個々のフラスコを１０ｍｌ 緩衝剤Ａ（０．２５Ｍスクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ， ２０ｍＭトリシン、ｐＨ７．８）で２回洗浄し、それから５ｍｌ 緩衝剤Ａ中で細胞を掻取って収集し、１４００×ｇ、５分間の遠心分離（ベックマンＪ−６８）でペレット化し、１ｍｌの緩衝剤Ａに再懸濁し、テフロングラスホモジナイザーによる２０回の上下動により均質化した。均質化した細胞を１０００×ｇ、１０分間で２回遠心分離し（エッペンドルフ遠心機５４１５Ｃ）、２つの核後上澄み分画を収集し、貯蔵し、緩衝剤Ａ中で２３ｍｌの３０％パーコール溶液に上乗せし、ベックマン（登録商標）６０Ｔｉにおいて８３０００×ｇ、３０分間で超遠心分離した。原形質膜分画を示すペレットを収集し毎秒５０Ｊ／Ｗで６回超音波処理した（フィッシャー ソニック ディスメンブレーター３００）。超音波処理した原形質膜分画を緩衝剤Ｂ（０．２５Ｍ スクロース、６ｍＭ ＥＤＴＡ、１２０ｍＭ トリシン、ｐＨ ７．８）中で５０％ オプティプレップと混合した（オプティプレップの最終濃度２３％）。溶液全体をベックマンＳＷ４１Ｔｉチューブの底に移し、線形２０〜１０％オプティプレップ勾配を上乗せし、ＳＷ４１Ｔｉ（ベックマン インストゥルメンツ社）を用いて５２０００×ｇ、９０分間で遠心分離した。勾配の上の５ｍｌを採取し緩衝剤Ｂ中で５０％ オプティプレップと混合し、ＳＷ４１Ｔｉチューブの底に移し、緩衝剤Ａ中で２ｍｌの５％ オプティプレップを上乗せし、５２０００×ｇ、９０分間で遠心分離した。５％界面の直上の不透明帯が"カベオラ分画"を示した。勾配を１．２５ｍｌ分画に分画した。
【０１３３】
［ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウエスタン免疫ブロット解析］
ＦＣ５、カベオリン−１およびクラスリン重鎖タンパク質の免疫ブロット検出のために、最終オプティプレップ勾配のそれぞれの分画を減少条件においてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に溶解した。分離されたタンパク質を電気泳動によりＰＶＤＦ膜（イモビロンＰ（登録商標）；ミリポア社、オンタリオ州ネピアン）へと移した。５％スキムミルクでの１時間の閉塞の後で、該膜を５％スキムミルクを含むＴＢＳ−トウェイン中でＨＲＰ結合抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（希釈１：１０００）、ポリクローナル抗カベオリン抗体（希釈１：５００）または抗クラスリン抗体（希釈１：５００）でプローブした。ＥＣＬプラスウエスタンブロッティング検出システムを信号検出に用いた。
【０１３４】
［酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）］
生体外ＢＢＢモデルを経て移行されたＦＣ５の量を測定するために、適当な区画から採取した５０μｌの部分標本をＨｉｓＧｒａｂニッケル被覆９６穴プレート（ピアス社）において室温で一晩で固定した。該プレートを２％ ＢＳＡで室温、２時間で閉塞した後、ＨＲＰ結合抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体を希釈１：５０００で１時間加えた。洗浄後、結合したＦＣ５をテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）／過酸化水素基質システムにより検出した。マイクロタイター プレートリーダーにおいて４５０ｎｍで信号を測定した。採取された部分標本のＦＣ５濃度を、既知のＦＣ５濃度を用いて構成された標準曲線から決定した。
【０１３５】
ＨＣＥＣのタンパク質および脂質分画へのＦＣ５結合を測定するために、分離された分画を３７℃、一晩の乾燥によりフレキシブル９６穴ＥＬＩＳＡプレート上に被覆した。該ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中で０．５％ ＢＳＡで２時間閉塞した。それからプレートをＦＣ５抗体またはガラクトシルセラミドに対するＯ１抗体（ドイツ ハイデルベルク大学のＪ．トッター博士より贈与）と共にインキュベートした。ＦＣ５抗体をマウス抗ｍｙｃ抗体９Ｅ１０で検出した。述べたようにこの検定をさらに実行した。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】光学画像化によって同定されたマウスへのｉ．ｖ．インジェクション後の脳内でのＦＣ５抗体の蓄積。 （Ａ）ＦＣ５またはＮＣ１１は赤外線プローブに近いＣｙ５．５へと結合し、それから６時間に渡って動物へと尾静脈によって注入された。頭の画像化によって、ＮＣ１１またはフルオロフォア単独に対しＦＣ５がより高く蓄積されていることが示された。（Ｂ）ＦＣ５、ＮＣ１１またはＣｙ５．５単独の注入後の、平均蛍光濃度の頭範囲の定量化。（Ｃ）ＦＣ５、ＮＣ１１またはＣｙ５．５単独の注入後の、全ての動物の背脳体の画像化。（Ｄ）ＦＣ５、ＮＣ１１またはＣｙ５．５単独の注入後の、平均蛍光濃度の器官範囲の定量化。（Ｅ）殺および潅流により脳内でのＦＣ５蓄積がより高いことを実証した後のＦＣ５、ＮＣ１１またはＣｙ５．５を注入した動物の生体外での脳の画像化。
【図２】血液―脳隔壁浸透性ｓｄＡｂ ＦＣ５と、ホースラディッシュペルオキシダーゼによってタグされたマウスＩｇＧ（ＩｇＧ−ＨＲＰ）との結合、および構造の生体外での機能評価の説明。［材料および方法］で述べるようにして遺伝子工学によって追加のシステイン成分をＦＣ５に加えた。Ａ）示される反応においてｃｙｓＦＣ５がマレイミド活性化ＩｇＧ−ＨＲＰと結合した。Ｂ・Ｃ）培地内のヒト脳内皮細胞内での、ＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｂ）あるいはＦＣ５−ＩｇＧ−ＨＲＰ結合（Ｃ）の取り込み。一方が結合した５μｇ／ｍｌの添加の後で細胞を３０分間固定した。［材料および方法］のＦＩＴＣラベル抗マウス二次抗体を用いて固定された細胞において取り込みが定量される。Ｄ）生体外血液―脳隔壁モデルを経てのＩｇＧ−ＨＲＰ（▲）またはＦＣ５−ＩｇＧ−ＨＲＰ結合（■）の移行。［材料および方法］で述べるようにして輸送実験が行われた。
【図３】Ａ）生体外血液―脳隔壁（ＢＢＢ）モデルを経てのＦＣ５の極性移行。［材料および方法］で述べるようにして輸送実験は１０μｇ／ｍｌ ＦＣ５の頂端部（Ａ→Ｂ）または側底部（Ｂ→Ａ）区画への添加で開始され、反対側の区画でのＦＣ５の量は３０分後に定量された。同じＨＣＥＣ単分子層を経ての１４Ｃスクロースの配送を細胞間輸送の内部制御として用いた。Ｂ）生体外ＢＢＢモデルを経てのＦＣ５移行における吸着媒介エンドサイトーシス（ＡＭＥ）および微小貪喰作用の薬理的阻害剤の効果。［材料および方法］で述べるようにしてＨＣＥＣは、ＡＭＥ阻害剤、硫化プロタミン（４０μｇ／ｍｌ）およびポリリジン（３００μＭ）、または微小貪喰作用阻害剤、アミロライド（５００μＭ）によって３０分間前処理され、ＦＣ５輸送は３０分間に渡って測定された。それぞれの棒は６つの複製膜からの±ｓ．ｄ．を示す。
【図４】ＨＣＥＣへのＦＣ５取り込みおよび生体外ＢＢＢモデルを経ての移行のエネルギー依存。３７℃（Ａ）および４℃（Ｂ）でのＦＣ５のＨＣＥＣへの取り込みの共焦鏡検画像。［材料および方法］で述べるようにして細胞を５μｇ／ｍｌ ＦＣ５に３０分間暴露し、ＦＣ５のｃ−ｍｙｃ標識の二重免疫化学で処理した。Ｃ）３７℃および４℃でのＨＣＥＣを経ての、あるいは無グルコース培地内でのＨＣＥＣの５ｍＭのＮａＮ３および５ｍＭのデオキシグルコース（２ＤＧ）への３０分間の暴露後の、１０μｇ／ｍｌ ＦＣ５の細胞間移行。［材料および方法］で述べるようにしてＦＣ５移行はＨＣＥＣ添加の３０分後に定量された。Ｄ）ＨＣＥＣを経てのＦＣ５の細胞間移行におけるＮａ＋，Ｋ＋−ＡＴＰアーゼ阻害剤、ウアバインの効果。［材料および方法］で述べるようにして細胞は１μＭのウアバインで３０分間前処理された。それぞれの棒は６つの複製膜からの±ｓ．ｄ．を示す。アスタリスクは３７℃または未処理細胞からの有意差を示す（Ｐ＜０．０５；スチューデントｔ−検定）。
【図５】ＨＣＥＣ内のＦＣ５のエンドサイトーシスおよびトランスサイトーシスにおける、クラスリン被覆穴およびカベオラの役割。ＦＣ５（緑蛍光）（Ａ）およびクラスリン（赤蛍光）（Ｂ）のＨＣＥＣ細胞内でのコローカリゼーション。オーバーレイ画像が（Ｃ）に示される。ＦＣ５（緑蛍光）（Ｄ）およびカベオリン１（赤蛍光）（Ｅ）のコローカリゼーション。オーバーレイ画像が（Ｆ）に示される。［材料および方法］で述べるようにして二重の免疫細胞化学のために細胞をＦＣ５に３０分間暴露し、洗浄し処理した。画像は３〜５の別途の実験を示す。Ｇ）ＦＣ５に３０分間暴露したＨＣＥＣから得られた亜細胞分画内の、カベオリン−１、ＦＣ５およびクラスリン重鎖の免疫反応の分布を示すウエスタンブロット。［材料および方法］で述べるようにしてＨＣＥＣ細胞を分画した。ウエスタンブロットは３つの別途の実験を示す。Ｈ）生体外ＢＢＢモデルを経てのＦＣ５の移行における、カベオラ媒介エンドサイトーシスの薬理学的阻害剤、メチル−β−シクロデキストリン（５ｍＭ）、ナイスタチン（５μｇ／ｍｌ）およびフィリピン（５μｇ／ｍｌ）、またはクラスリン被覆穴媒介エンドサイトーシスの阻害剤、クロルプロマジン（５０μｇ／ｍｌ）または無カリウム緩衝剤の効果。［材料および方法］で述べるようにしてヒトＣＥＣは前記阻害剤とともに３０分間前処理され、ＦＣ５輸送は３０分間にわたって測定された。それぞれの棒は６つの複製膜からの±ｓ．ｄ．を示す。アスタリスクは有意差を示す（Ｐ＜０．０５；一要因分散分析、手段間のダネットの多重比較による）。
【図６】エンドソーム内でのＦＣ５処理。ＦＣ５（緑蛍光）（Ａ）およびテキサスレッド（登録商標）結合トランスフェリン（赤蛍光）（Ｂ）のＨＣＥＣ細胞内でのコローカリゼーション。オーバーレイ画像が（Ｃ）に示される。内在化ＦＣ５（緑蛍光）（Ｄ）およびカテプシン−Ｂ（赤蛍光）（Ｅ）のＨＣＥＣ細胞内でのコローカリゼーション。オーバーレイ画像が（Ｆ）に示される。［材料および方法］で述べるようにしてＣＥＣは免疫化学および共焦鏡検のために処理される。Ｇ）ＨＣＥＣ生体外ＢＢＢモデルを経てのトランスサイトーシスの前（上）と後（下）のＦＣ５のウエスタンブロット。Ｈ）２５μＭ モネンシンによって３０分間前処理されたＨＣＥＣを経ての、１０μｇ／ｍｌ ＦＣ５の細胞間移行。［材料および方法］で述べるようにして輸送実験が行われた。
【図７】Ａ）ＨＣＥＣを経てのＦＣ５トランスサイトーシスにおける細胞骨格ネットワークの役割。［材料および方法］で述べるようにして、アクチン微細繊維阻害剤、サイトカラシンＤ（０．５μＭ）またはラトランキュリンＡ（０．１μＭ）、あるいは微小管阻害剤、ノコダゾール（２０μＭ）またはコルヒチン（２０μＭ）とともにＨＣＥＣを３０分間前処理し、生体外ＢＢＢモデルを経てのＦＣ５移行は３０分間にわたって測定された。Ｂ）１０μｇ／ｍｌのＦＣ５を加える３０分前に、ＨＣＥＣに通信経路モジュレーター、ウォルトマニン（０．５μＭ）、ＢＩＭ−１（５μＭ）、ゲニステイン（５０μＭ）またはｄｂｃＡＭＰ（５００μＭ）を加え、生体外ＢＢＢモデルを経てのトランスサイトーシスは３０分間にわたって測定された。それぞれの棒は６つの複製膜からの±ｓ．ｄ．を示す。アスタリスクは対照からの有意差を示す（Ｐ＜０．０５；一要因分散分析、手段間のダネットの多重比較による）。
【図８】ＨＣＥＣに取り込まれＨＣＥＣを経てトランスサイトーシスされるＦＣ５内のオリゴ糖抗原性エピトープの役割。Ａ〜Ｄ）不在（Ａ）または１００μｇ／ｍｌ ＷＧＡ（Ｂ）、２００μＭ シアル酸（Ｃ）あるいは０．１Ｕ ノイラミニダーゼ存在下での、ＨＣＥＣに取り込まれたＦＣ５の蛍光顕微鏡写真。取り込みは３０分間にわたって測定された。Ｅ）３０分間にわたって２００μＭのシアル酸によって前処理された、あるいはノイラミニダーゼ濃度を示されたＨＣＥＣを経ての、１０μｇ／ｍｌ ＦＣ５のトランスサイトーシス。Ｆ）１００μｇ／ｍｌ ＷＧＡ、１００μｇ／ｍｌ セイヨウニワトコ凝集素（ＳＮＡ）または１００μｇ／ｍｌ イヌエンジュ凝集素（ＭＡＡ）によって前処理されたＨＣＥＣを経ての、１０μｇ／ｍｌ ＦＣ５のトランスサイトーシス。［材料および方法］で述べるようにして輸送実験が行われた。Ｇ）酵素結合免疫吸着検定法によって定量されたＨＣＥＣの分離されたタンパク質（黒い棒）および脂質（灰色の棒）の分画とのＦＣ５の結合。分画の前に、溶解した細胞を不在または１Ｕ／ｍｌ ノイラミニダーゼ存在下において３７℃、１時間インキュベートした。［材料および方法］で述べるようにして、分離されたタンパク質および脂質での酵素結合免疫吸着検定法が行われた。それぞれの棒は６つの複製膜からの±ｓ．ｄ．を示す。アスタリスクは対照からの有意差を示す（Ｐ＜０．０５；一要因分散分析、手段間のダネットの多重比較による）。
【図９】生体外ＢＢＢを経てのＦＣ５トランスサイトーシスに伴うトランスフェリン受容体の欠乏。Ａ）アンチトランスフェリン受容体モノクローナル抗体、ＣＤ７１、ＦＣ５、ＦＣ５五量体構成（Ｐ５）または炭水化物抗原、ＣＥＡを認識する同じライブラリからの無関連抗体の、酵素結合免疫吸着検定法プレートに固定されたヒトトランスフェリン受容体への結合。プレートは自動マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍにおいて読み取られた。Ｂ）Ｐ５ではなく抗ＣＤ７１によって免疫的に検出されたヒトトランスフェリン受容体のウエスタンブロット。Ｃ）１０μｇ／ｍｌ ＦＣ５単独または１００倍（１ｍｇ／ｍｌ）のホロトランスフェリン存在下でのＨＣＥＣ単層を経てのトランスサイトーシス。［材料および方法］で述べるようにして輸送は３０分間にわたって測定された。それぞれの棒は６つの複製膜からの±ｓ．ｄ．を示す。
【図１０】ＦＣ５抗原同定に用いるゲノムおよびプロテオーム戦略の組み合わせ。
【図１１】推定のＦＣ５抗原の組織分布。
【図１２】様々な細胞種でのＴＭＥＭ３０Ａ遺伝子発現。
【図１３】ＨＥＫ２９３細胞でのＴＭＥＭ３０Ａ遺伝子発現。
【図１４】ＴＭＥＭ３０Ａ過剰発現細胞の細胞溶解物における、ＦＣ５によるＴＭＥＭ３０Ａの認識。
【図１５】ＦＣ５によるヒト大脳内皮細胞でのホスファチジルコリンのＴＭＥＭ３０Ａ媒介膜間輸送の競合。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜間領域タンパク質３０Ａ（ＴＭＥＭ３０Ａ）の新たな抗原のアイソフォームの使用による、血液―脳隔壁を通過可能な試剤の同定および抗体の生成の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
新たなラマ単一領域抗体、ＦＣ５およびＦＣ４４が同定されている。これらの抗体は脳内皮細胞の表面において抗原に結合し、それから脳内へ移行する。これらの抗体およびエピトープへの親和性を持つ他の接着質は、他の分子（治療、診断の）を脳へと輸送するベクターとして有用である。
血液―脳隔壁を経てトランスサイトーシスを受ける受容体に対する抗体が、脳への薬剤または治療ペプチドを標的とするベクターとして用いられている。生体外でヒト大脳内皮細胞を、生体内で血液―脳隔壁を経て移行する新たな単一領域抗体、ＦＣ５が近来、同定されている。ここで、ＦＣ５の血液―脳隔壁を経るヒト大脳内皮細胞上の、その推定上の受容体へのエンドサイトーシスおよびトランスサイトーシスの可能な機構を、ＦＣ５とその受容体への他の接着質とともに開示する。この受容体は脳標的薬剤配送ベクターを発達させる新たな標的となりうる。
脳毛細管内皮は、薬剤の中枢神経系への侵入に対する強固な隔壁を形成する。大脳内皮細胞（ＣＥＣ）を封鎖する緊密な接合部は、治療薬剤を含む循環化合物が細胞間経路を経て脳に達することを防止する。ＣＥＣの他の特異な特徴としては、開窓の欠如、ピノサイトーシス小胞の数が少ないこと、管腔表面の高い負電化を帯びた糖衣がある。流出ポンプの発現とＣＥＣの高酵素活性が、治療上の脳への配送に対するさらなる隔壁となる。
ペプチド、タンパク質およびオリゴヌクレオチドを含む生物工学製品は、トランスサイトーシスとして知られるＣＥＣを経る小胞輸送による脳への配送を為しうる。これは、配位子とＣＥＣの管腔表面で発現する成分の特異的あるいは非特異的な相互作用を要する過程であり、配位子のエンドサイトーシス小胞への内在化、内皮細胞質を経る移動、およびＣＥＣの外側面でのエキソサイトーシスを開始させる。ＣＥＣにおける異なるエンドサイトーシス経路が述べられている。ａ）マクロピノサイトーシス、大型タンパク質の内在化のランダム経路、ｂ）薬剤／生物工学製品と内皮表面の非特異的で電荷に基づく相互作用を介して開始される吸着媒介エンドサイトーシス（ＡＭＥ）、ｃ）ＣＥＣ上で発現する受容体の特異的な相互作用によって開始される受容体媒介エンドサイトーシス（ＲＭＥ）、である。ＡＭＥおよびＲＭＥは、血液―脳隔壁（ＢＢＢ）を経ての配送のための薬剤輸送ベクターの設計に利用されている。例えば、ＳｙｎＢベクター族等の陽イオン細胞貫通ペプチドは、温度・エネルギー依存ＡＭＥ過程による親水性分子のＢＢＢを経ての配送の能力を持つ（ドリン他、２００３年）。ＢＢＢを経てのＲＭＥおよびトランスサイトーシスを受ける脳内皮抗原に特異的な抗体、特にアンチトランスフェリン受容体抗体（ＯＸ２６）が、抗体に化学的に連結された、または抗体機能化担体（例えばイムノリポソーム）に包まれた生物工学製品の、ＢＢＢを経ての実験動物モデルでの輸送に用いられている。
目下、受容体媒介トランスサイトーシスを受ける、脳内皮細胞上で発現する受容体が少数知られている。インシュリン受容体、低濃度リポタンパク質依存タンパク質受容体（ＬＲＰ）およびアンギオテンシンＩＩ受容体である。このうち、トランスフェリン受容体およびインシュリン受容体は、脳輸送ベクター（すなわち、これらの受容体を認識する抗体）の発達に利用されている。トランスフェリン受容体は他の器官に比して脳内皮において豊富であることが知られているが、トランスフェリン受容体およびインシュリン受容体は他の器官に広く分布しており、したがってこれらの’標的’の使用に選択的に完成された脳は限定される。
以下の文献に含まれるものは、本発明の特許性に関係するものではない。
【非特許文献１】Abulrob A., Zhang J., Tanha J., MacKenzie R. and Stanimirovic D. (2005). Single domain antibodies as blood brain barrier delivery vectors. Intern. Cong. Ser. 1277, 212-223.
【非特許文献２】Dehouck B., Fenart L., Dehouck MP.. Pierce A., Torpier G., and Cecchelli R. (1997) A new function for the LDL receptor: transcytosis of LDL across the blood-brain barrier. J. Cell Biol. 138, 877-889.
【非特許文献３】Demeule M., Poirier J., Jodoin J.. ef a/. (2002) High transcytosis of melanotransferrin(P97) across the blood-brain barrier. J. Neurochem. 83, 924-933.
【非特許文献４】Drin G., Cottin S., Blanc E., Rees A.R. and Temsamani J. (2003). Studies on the internalization mechanism of cationic cell-penetrating peptides. J. Biol. Chem. 278, 31192-31201.
【非特許文献５】Drin G., Rousselle C, Scherrmann J. M., Rees A.R. and Temsamani J. (2002). Peptide delivery to the brain via adsorptive-mediated endocytosis: advances with SynB vectors. AAPS PharmSci. 4, E26.
【非特許文献６】Fillebeen C, Descamps L., Dehouck M. P., Fenart L., Benaissa M., Spik G., Cecchelli R., and Pierce A. (1999) Receptor-mediated transcytosis of lactoferrin through the blood- brain barrier. J. Biol. Chem. 274, 7011-7.
【非特許文献７】Hayes G. R., Enns CA. and Lucas J.J. (1992). Identification of the O-linked glycosylation site of the human transferrin receptor. Glycobiology. 2, 355-359.
【非特許文献８】Moos T. and Morgan E. H. (2001). Restricted transport on anti-transferrin receptor antibody (0X26) through the blood-brain barrier in the rat. J. Neurochem. 79, 119-129.
【非特許文献９】Muruganandam A., Tanha J., Narang S. and Stanimirovic D. (2002). Selection of phage- displayed llama single-domain antibodies that transmigrate across human blood-brain barrier endothelium. FASEB J. 16, 240-242.
【非特許文献１０】Qian Z. M., Li H., Sun H. and Ho K. (2002). Targeted drug delivery via the transferrin receptor-mediated endocytosis pathway. Pharmacol. Rev. 54, 561-587.
【非特許文献１１】Suzuki T., Futaki S., Niwa M., Tanaka S., Ueda K. and Sugiura Y. (2002). Possible existence of common internalization mechanisms among arginine-rich peptides. J.Biol. Chem. 277, 2437-2443.
【非特許文献１２】Tanha J., Muruganadam A. and Stanimirovic D. (2003). Phage display technology for identifying specific antigens on brain endothelial cells. Methods MoI. Med. 89, 435- 449.
【非特許文献１３】Wessel D. and Flugge U.I. (1984). A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal. Biochem. 138, 141-143.
【非特許文献１４】Zhang J., Tanha J., Hirama T., Khieu N. H., To R., Tong-Sevinc H., Stone E., Brisson J. R. and MacKenzie CR. (2004). Pentamerization of single-domain antibodies from phage libraries: a novel strategy for the rapid generation of high-avidity antibody reagents. J. MoI. Biol. 335, 49-56.
【非特許文献１５】Zhang J., Li Q., Nguyen T., Tremblay T., Stone E., Kelly J. and MacKenzie R. (2004). A pentavalent single domain antibody approach to tumor antibody discovery and the development of novel proteomics reagents. J. MoI. Biol. 341 , 161-9.
【発明の開示】
【０００３】
本発明の第一の側面によって、少なくとも７５％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２のヌクレオチドと同定される、精製または分離された核酸分子が提供される。
【０００４】
本発明の第二の側面によって、
少なくとも７５％の同定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３の１から３６１のアミノ酸を含むペプチドと共に試剤をインキュベートすること、および該試剤と該ペプチドとの結合の検出、
少なくとも７５％の同定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４の１から３２５のアミノ酸を含むペプチドと共に試剤をインキュベートすること、および該試剤と該ペプチドとの結合の検出、
少なくとも７５％の同定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５の１から２４２のアミノ酸を含むペプチドと共に試剤をインキュベートすること、および該試剤と該ペプチドとの結合の検出、
少なくとも７５％の同定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６の１から２５７のアミノ酸を含むペプチドと共に試剤をインキュベートすること、および該試剤と該ペプチドとの結合の検出、
少なくとも７５％の同定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７の１から４０のアミノ酸を含むペプチドと共に試剤をインキュベートすること、および該試剤と該ペプチドとの結合の検出、
少なくとも７５％の同定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８の１から１４０のアミノ酸を含むペプチドと共に試剤をインキュベートすること、および該試剤と該ペプチドとの結合の検出、
少なくとも７５％の同定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９の１から１８のアミノ酸を含むペプチドと共に試剤をインキュベートすること、および該試剤と該ペプチドとの結合の検出、
少なくとも７５％の同定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０の１から１１のアミノ酸を含むペプチドと共に試剤をインキュベートすること、および該試剤と該ペプチドとの結合の検出、
少なくとも７５％の同定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１の１から１１のアミノ酸を含むペプチドと共に試剤をインキュベートすること、および該試剤と該ペプチドとの結合の検出、
少なくとも７５％の同定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２の１から１３のアミノ酸を含むペプチドと共に試剤をインキュベートすること、および該試剤と該ペプチドとの結合の検出、
少なくとも７５％の同定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３の１から１３のアミノ酸を含むペプチドと共に試剤をインキュベートすること、および該試剤と該ペプチドとの結合の検出、
少なくとも７５％の同定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４の１から１６のアミノ酸を含むペプチドと共に試剤をインキュベートすること、および該試剤と該ペプチドとの結合の検出、および
少なくとも７５％の同定されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５の１から１６のアミノ酸を含むペプチドと共に試剤をインキュベートすること、および該試剤と該ペプチドとの結合の検出、
のいずれかからなる、血液―脳隔壁を経てのＴＭＥＭ３０Ａ媒介トランスサイトーシスが可能な試剤の同定方法が提供される。
【０００５】
本発明の第三の側面によって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５のアミノ酸配列のいずれかの、少なくとも７５％が同定され、精製または分離されたペプチドが提供される。
【０００６】
本発明の第四の側面によって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５のアミノ酸配列のいずれかの、６以上の連続したアミノ酸からなる、精製または分離されたペプチドが提供される。
【０００７】
本発明の第五の側面によって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５のアミノ酸配列のいずれかの、６以上の連続したアミノ酸からなる、精製または分離されたペプチドおよび適当な賦形剤と共に目標物をインキュベートすることによって該ペプチドに対する免疫反応を生じる、血液―脳隔壁を経てのＴＭＥＭ３０Ａ媒介トランスサイトーシスが可能な抗体の生成方法が提供される。好ましくは目標物はヒトではない動物である。当業者に理解されるように、様々な動物を目標物として用いる抗体に対する免疫反応を生じる手段は当該技術分野において既知である。特に、免疫化レジーム、補助剤、抗体回収方法、精製および分離は全て、様々な目標物について既知であり確立されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
細胞生物学、生物化学、免疫化学および分子生物学の手法の組み合わせを用い、血液―脳隔壁に関連する新たな抗原が同定されている。これは血液―脳隔壁を経ての移行の機構を確立するのに有用である。これらの抗原は他の内皮細胞に比して脳内皮細胞において豊富で、トランスフェリンおよびインシュリン受容体に比して選択性および脳への配送能力に優れているかもしれない。
この例において、血液―脳隔壁抗原を認識し血液―脳隔壁を経て移行される単一領域抗体ＦＣ５が検討される。
本発明は特定の機構または作用携帯に限定されず、仮定される機構は一般的関心の元に述べられる。
【０００９】
ＢＢＢを経てのＦＣ５移行の機構：
１． 脳内皮細胞上の推定上の受容体へ結合し、受容体媒介トランスサイトーシスとして知られる機構によってＦＣ５は移行される。
２． ＦＣ５はクラスリン被覆穴において脳内皮に内在化され移行される。
３． ＦＣ５移行はエネルギー依存であり可飽和である。
４． ＦＣ５移行には非損傷細胞骨格ネットワークが必要である。
５． ＦＣ５移行はＰｌ３キナーゼ活性に依存する。
【００１０】
ＦＣ５抗原、ＴＭＥＭ３０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）の分離と同定についても述べる。ここで述べるように、ＦＣ５抗原のＴＭＥＭ３０Ａへの結合によって血液―脳隔壁を経てＦＣ５が移行される。
【００１１】
ＦＣ５に認識される抗原：
１． α（２、３）結合シアル酸残余はＦＣ５に認識される抗原エピトープの構成要素である。
２． ＦＣ５に認識される抗原はシアルタンパク質および非シアル脂質（ガングリオシド）である。
３． ＦＣ５の推定上タンパク質抗体上のα（２、３）結合シアル酸残余の認識はＦＣ５の脳内皮細胞を経てのエンドサイトーシスと移行に必要である。
４． α（２、３）結合シアル酸残余は完全なＦＣ５に認識される抗原の単なる構成要素である。
５． トランスフェリン受容体はＦＣ５に認識されない。
６． ＦＣ５に対するファージ表示ヒト脳ｃＤＮＡ発現ライブラリのパニングによってＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１が引き出された。
７． ＴＭＥＭ３０Ａと共に配列されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２を遺伝子が除去する。
８． ＴＭＥＭ３０ＡｍＲＮＡの組織分布は図１１に示される。脳組織において強い発現が示された。
９． ＴＭＥＭ３０ＡｍＲＮＡの細胞分布は図１２に示される。内皮細胞において強い発現が示される。
１０． ＨＥＫ２９３細胞において過剰発現したＴＭＥＭ３０ＡはＦＣ５によって免疫沈降された（図１４）。
【００１２】
よって、ＴＭＥＭ３０Ａに結合する化合物、分子または試剤は血液―脳隔壁を経てのＴＭＥＭ３０Ａ媒介転移が可能であることが示されている。続いて、以下に述べるように、実施例の１つにおいて、関連する試剤の提供と該試剤がＴＭＥＭ３０Ａに結合する場合の定量とを含む、血液―脳隔壁を通過することができる試剤の同定方法が提供される。
【００１３】
他の実施例において、以下で述べる関連する試剤のＴＭＥＭ３０Ａペプチドへの結合の適した条件でのＴＭＥＭ３０Ａペプチドの試剤への暴露と、結合が起こった場合の定量とを含む、血液―脳隔壁を経てのＴＭＥＭ３０Ａの転移が可能な試剤の同定方法が提供される。ここで述べるように、結合または相互作用は様々な方法、例えば以下に述べるようにＴＭＥＭ３０Ａをその上に載せたカラムまたは他の類似の支持上への試剤の保持、またはここで述べる生体外細胞検定または生体内検定を用いる転移の実証によって定量される。これらの検定は例証となる目的のためであることが留意され、関連する試剤とＴＭＥＭ３０Ａとの相互作用の様々な幅広い検出方法があることは当業者に理解できる。
【００１４】
他の実施例において、以下で述べる試剤のＴＭＥＭ３０Ａペプチドへの結合の適した条件でのＴＭＥＭ３０Ａペプチドの関連する試剤への暴露と、その後に結合が起こった場合の定量とを含む、ＴＭＥＭ３０Ａとの相互作用が可能な薬剤を同定する方法が提供される。当業者に評価されるように、このような試剤はここで述べるように様々な目的、例えば膜輸送や画像化等に用いることができる。
【００１５】
当業者に評価されるように、ＴＭＥＭ３０Ａの結合の定量は複数の方法で行うことができる。例えば、高スループット初期スクリーニングを行うことができ、例えばカラムにＴＭＥＭ３０Ａを入れ、関連する試剤を該カラムを通過させる。残留した化合物を溶出しさらに調査し、例えば以下で述べる生体外または生体内での検定を行うことができる。
このような試剤は関連する化合物へ結合、接合、架橋または他の取り付けが可能であり、血液―脳隔壁を経て転移可能な結合を形成することが留意される。
【００１６】
いくつかの実施例において、関連する化合物は検出可能な化合物でありえ、例えば放射性同位元素、同位体、可視または近赤外線蛍光ラベル、レポーター分子、ビオチン等であるがこれらに限定されない。当業者に評価されるように、このような結合を、試剤の転移の確認、画像化または他の類似の目的に用いることができる。
【００１７】
他の実施例において、関連する化合物は小分子、例えば抗がん剤であり、これは例えばパクリタクセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、エトポシド、ドキソルビシン、シクロフォスファミド、クロラムブチル等であるがこれらに限定されない。
【００１８】
他の実施例において、小分子は神経病、例えば脳腫瘍、脳転移、精神分裂病、癲癇、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、脳卒中、肥満症、多発性硬化症等を治療するための治療または薬事の化合物でありうる。
【００１９】
ここで述べるように、ＦＣ５抗体はＴＭＥＭ３０Ａに結合する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３の６以上、７以上、８以上、９以上、または１０以上の連続したアミノ酸を含むペプチドを、ＦＣ５を認識するモノクローナル抗体の生成に用いることができる。いくつかの実施例において、ペプチドはＴＭＥＭ３０Ａの細胞外領域、すなわちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２の６７〜３２３アミノ酸に対し選択的である。同様に、アイソフォーム２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）の細胞外領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４の６７〜２８７アミノ酸に対応し、アイソフォーム３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５の１〜２０４アミノ酸からの細胞外領域を有する。したがって、他の好ましい実施例において、ペプチドはアイソフォーム２および３からのこれらの細胞外領域の範囲に対応する。よって、いくつかの実施例において、関連する試剤はここで述べるＴＭＥＭ３０Ａの免疫抗原性断片に対して配列されるモノクローナル抗体でありうる。当業者には他の適した断片も容易に明白であることが留意される。例えば、グリコシル化サイトを含むＴＭＥＭ３０Ａの範囲からの６以上、７以上、８以上、９以上、または１０以上の連続したアミノ酸を含むペプチド、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に含まれるものをいくつかの実施例において用いることができる。あるいは前記のように、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９〜１５に含まれる、ＴＭＥＭ３０Ａと他の進化的に類似のペプチドとの間で高度に保護された範囲を選択的に用いることもできる。
【００２０】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に含まれるヌクレオチドと同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００２１】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に含まれるヌクレオチド１４１〜１２２６と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。当業者には明らかであるように、このようなヌクレオチド配列はここで述べるＴＭＥＭ３０Ａペプチドの調製のための発現系で用いることができ、あるいはここで述べる標識、プライマー等として用いることができる。
【００２２】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に含まれるヌクレオチド１〜３６１、１〜３２３または６７〜３２３と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００２３】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に含まれるヌクレオチド１〜３２５または６７〜２８７と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００２４】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に含まれるヌクレオチド１〜２４２または１〜２０４と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００２５】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に含まれるヌクレオチド１〜２５７と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００２６】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に含まれるヌクレオチド１〜４０と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００２７】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に含まれるヌクレオチド１〜１４０と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００２８】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に含まれるヌクレオチド１〜１８と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００２９】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に含まれるヌクレオチド１〜１１と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００３０】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に含まれるヌクレオチド１〜１１と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００３１】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に含まれるヌクレオチド１〜１３と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００３２】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に含まれるヌクレオチド１〜１３と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００３３】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に含まれるヌクレオチド１〜１６と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００３４】
他の実施例において、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、あるいは少なくとも９９％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に含まれるヌクレオチド１〜１６と同定された、精製または分離されたヌクレオチド配列が提供される。
【００３５】
ここで述べるように、ＴＭＥＭ３０Ａアイソフォーム１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３は、内部Ｃ末端（アミノ酸１〜４２）、膜間領域（アミノ酸４３〜６６）および外部領域（アミノ酸６７〜３２３）を有する。当業者には明らかなように、膜間領域内での変異が膜連結機能によって保護されなければ、このペプチドは欠損を有するであろう。同様に、Ｃ末端内での追加、削除および置換は細胞外Ｎ末端でよりも許容されうる。個々で述べるように、例えば挿入や削除等の大きい変化が許容されうることを強く示すＴＭＥＭ３０Ａの少なくとも２つの接合変異が存在することが留意される。
【００３６】
ＴＭＥＭ３０Ａアイソフォーム２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４は２つの膜間領域、アミノ酸４４〜６６とアミノ酸２８８〜３１０を有し、アミノ酸６７〜２８７は外部である。
ＴＭＥＭ３０Ａアイソフォーム３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５は１つの膜間領域をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５のアミノ酸２０５〜２２７に有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５のアミノ酸１〜２０４の外部領域を有する。
【００３７】
他の実施例において、上記のペプチドまたはアミノ酸配列のいずれかから導き出されるヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。これらの核酸分子は前記のように、例えば発現のため、標識やプライマー等として用いることができる。
【００３８】
ここで述べる全長配列ＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドに加えて、ＴＭＥＭ３０Ａ変異体を調製することができると考えられる。適当なヌクレオチド変化のＴＭＥＭ３０ＡのＤＮＡへの導入、および／または所望のＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドの合成によって、ＴＭＥＭ３０Ａ変異体を調製することができる。当業者には明らかなように、アミノ酸変化を、ＴＭＥＭ３０Ａの翻訳後処理、例えばグリコシル化サイトの数または位置の変化や膜定着特性の変化へと変更することができる。
【００３９】
加えて、ＴＭＥＭ３０Ａ変異体に１つ以上の他の変位、例えばアミノ酸置換、１つ以上のアミノ酸の挿入、１つ以上のアミノ酸の削除、または化学的変位を行うことが可能である。例えば、本発明によって断片であるＴＭＥＭ３０Ａ変異体が提供される。この実施例の変更において、該断片はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３の残余６７から残余３２３へ延伸するヒトＴＭＥＭ３０Ａの一部分に対応する残余を含有する。
【００４０】
全長配列ＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたはここで述べるＴＭＥＭ３０Ａの様々な領域における変化は、例えば保存的および非保存的突然変異の手法および指針のいずれかを用いて作成することができる。変化はＴＭＥＭ３０Ａをエンコードする１つ以上のコドンの置換、削除または挿入でありえ、これは未変性配列ＴＭＥＭ３０Ａに対するＴＭＥＭ３０Ａのアミノ酸配列の変化になる。変化は任意に少なくとも１つ以上のアミノ酸のＴＭＥＭ３０Ａの１つ以上の領域の他のアミノ酸との置換によるものとできる。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸の類似した構造および／または化学的性質を持つ別のアミノ酸との置き換え、例えばロイシンとセリンとの入れ替えによって行うことができる。挿入または削除は任意に約１から５のアミノ酸の範囲でありうる。
【００４１】
［ＴＭＥＭ３０Ａアンチセンスオリゴヌクレオチド］
本出願で開示されるＴＭＥＭ３０Ａ配列は標識としても用いることができる。ＴＭＥＭ３０Ａ核酸の断片は、標的ＴＭＥＭ３０ＡのｍＲＮＡ（センス）またはＴＭＥＭ３０ＡのＤＮＡ（アンチセンス）配列への結合が可能な単鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を含むアンチセンスまたはセンスのオリゴヌクレオチドの設計に有用でありうる。アンチセンスまたはセンスのオリゴヌクレオチドは、前記のようにＴＭＥＭ３０ＡのＤＮＡのコード領域の断片を含む。このような断片は一般的に少なくとも約１４のヌクレオチドを、好ましくは約１４〜３０のヌクレオチドを含む。所定のタンパク質をエンコードするｃＤＮＡ配列に基づいてアンチセンスまたはセンスのオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えば（コーエンＪＳ、オリゴヌクレオチド治療法、トレンドス・イン・バイオテクノロジー誌１９９２年３月号、１０（３）：８７〜９１）において述べられている。アンチセンスまたはセンスのオリゴヌクレオチドの標的ＴＭＥＭ３０Ａ核酸配列への結合によって、二本鎖の増強された分解、翻訳または転写の早発の終了あるいは他の手段を包含するいくつかの手段の１つによりＴＭＥＭ３０Ａ配列の翻訳または転写を妨げる二本鎖の形成がなされる。よってアンチセンスのオリゴヌクレオチドは、脳薬剤配送を調節するであろうＴＭＥＭ３０Ａタンパク質の発現の妨害に用いることができる。アンチセンスまたはセンスのオリゴヌクレオチドはさらに、変異糖ホスホジエステル主鎖を有するオリゴヌクレオチドを含み、このような糖結合は内生ヌクレアーゼに耐性があり生体内での適用により適している。
【００４２】
［抗ＴＭＥＭ３０Ａ抗体への使用］
以下の例は説明のためにのみ提示され、本発明の視野の限定を意図するものではない。
本発明の抗ＴＭＥＭ３０Ａ抗体は様々な効用を持つ。例えば、抗ＴＭＥＭ３０Ａ抗体はＴＭＥＭ３０Ａの診断検定、例えば特定の細胞、組織または血清におけるその発現（およびいくつかの場合においては差次的発現）の検出に用いることができる。当該分野で既知の様々な診断検定手法、例えば競合結合検定、直接または関節サンドイッチ検定、免疫沈降検定等を用いることができる。診断検定に用いられる抗体を検出可能成分によってラベルすることができる。検出可能成分は放射性同位体３２Ｐ、ローダミンやルシフェリン等の蛍光または化学ルミネセンス化合物、またはアルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素でありうる。抗体の検出可能ラベルへの結合の方法は当該分野において既知である。
【００４３】
抗ＴＭＥＭ３０Ａ抗体は組換細胞培養物または天然精製源からのＴＭＥＭ３０Ａの親和精製にも有用である。この処理において、ＴＭＥＭ３０Ａに対する抗体は適当な支持体、例えばセファデックス（登録商標）樹脂等に、当該分野で既知の方法を用いて固定される。それから固定されたＴＭＥＭ３０Ａ抗体を、精製するＴＭＥＭ３０Ａを含有する試料と接触させ、その後に、固定された抗体に結合されたＴＭＥＭ３０Ａ以外の試料内の実質的に全ての物質を除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、精製されたＴＭＥＭ３０Ａを溶出する別の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
【００４４】
［二機能抗体］
二重特異性抗体（モノクローナル、単鎖、単一領域あるいは他の断片）、好ましくはヒトまたはヒト化抗体は、少なくとも２つの異なる抗原への結合特異性を持つ。この場合は該結合特異性の一方はＴＭＥＭ３０Ａであり、もう一方は他の脳抗体であり、好ましくはニューロン細胞表面タンパク質、ニューロン受容体またはニューロン受容体サブユニットである。
【００４５】
［ＴＭＥＭ３０Ａの薬剤スクリーニングへの使用］
本発明は特に、様々な薬剤スクリーニング手法のいずれかによる、ＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたはその断片を用いての化合物のスクリーニングに有用である。このような試験に用いられるＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片は、溶液中で自由とするか、固体支持体に付加するか、あるいは細胞表面に配置してもよい。薬剤スクリーニングの１つの方法は、ＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片を発現する組み替え核酸によって安定して変換される真核または原核の宿主細胞を利用する。競合結合検定においてこのような変換細胞に対し薬剤がスクリーニングされる。生存可能または固定形態のこのような細胞を標準結合検定に用いることができる。例えばＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片と試験される試剤との複合体の形成を測定するか、あるいはＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片への結合に従って試験される試剤の内在化の増強を実験することができる。あるいは、試験される試剤によるＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドのその標的細胞内での内在化の減少を実験することができる。
【００４６】
よって、本発明により、試験される薬剤の細胞内での内在化の増強によるＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたはその断片に作用できる薬剤または他の試剤のスクリーニングの方法が提供される。これらの方法は、当該分野で既知の方法による、試剤のＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片への接触、および試剤とＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片との複合体の存在または細胞内での試剤とＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片との複合体の存在の検定を含む。このような競合結合検定において、試剤またはＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片は典型的にはラベルされる。適当なインキュベートの後で、自由なＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片が結合形態で存在するものから分離され、自由または複合されていないラベルの数によってＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドに結合した特定の試剤を測定する。
【００４７】
また本発明により、ＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドの発現に作用する、または脳血管性疾患に機能することができる薬剤または他の試剤のスクリーニングの方法が提供される。これらの方法は、当該分野で既知の方法による、試剤のＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたはその断片への接触、および試剤とＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片との複合体の存在または細胞内での試剤とＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片との複合体の存在の検定を含む。このような競合結合検定において、試剤またはＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片は典型的にはラベルされる。適当なインキュベートの後で、自由なＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片が結合形態で存在するものから分離され、自由または複合されていないラベルの数によってＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドに結合した特定の試剤を測定する。
【００４８】
他の薬剤スクリーニング手法により、ＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドへの適当な結合親和性を持つ化合物の高スループットスクリーニングが提供される。例えば、異なる小さいペプチド試験化合物が固体基質上で合成される。ＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドへの添加により、ペプチド試験化合物はＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドと反応し、洗浄される。結合したＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドは当該分野で既知の方法によって検出される。精製されたＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドは薬剤スクリーニング手法において用いるプレート上に直接被覆することができる。加えて、ＦＣ５等のＴＭＥＭ３０Ａ非中和抗体をＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片の捕捉と固体支持体への固定に用いることができる。
【００４９】
本発明はまた、ＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドへ特異的に結合可能な中和抗体（例えばＦＣ５）を試験化合物とＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたはその断片への結合において競合させる競合薬剤スクリーニング検定の使用を企図する。この方式において、１つ以上の抗原決定基をＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドと共有するペプチドの存在の検出に抗体を用いることができる。
【００５０】
［合理的な薬剤設計］
合理的な薬剤設計の目標は、生物学的に活性のＴＭＥＭ３０ＡまたはＴＭＥＭ３０Ａと相互作用する小分子の構造類似体、例えばアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の製造である。これらの例は、ＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドのより活性または安定な形態であるかまたは生体内脳薬剤配送を増強する薬剤の形成に用いることができる。
【００５１】
取り組み方の１つにおいて、ＴＭＥＭ３０ＡポリペプチドまたはＴＭＥＭ３０Ａポリペプチド−試剤複合体の三次元構造を、Ｘ線結晶学またはコンピューターモデリングによって定量する。より多くの場合、ＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドの構造に関する有用な情報はＴＭＥＭ３０Ｂ（遺伝子銀行番号００１０１７９７０）等の相同タンパク質に基づくモデリングから得ることができる。いずれの場合も、関連構造情報を、類似性ＴＭＥＭ３０Ａポリペプチド的分子の設計、または安定性または薬剤配送を向上する活性を向上された有効なモジュレーターの同定に用いる。
【００５２】
［ＴＭＥＭ３０Ａ／リガンド相互作用の同定］
受容体／リガンド相互作用の同定のために、ＴＭＥＭ３０Ａポリペプチドまたは断片への結合能力について試剤を試験することができる。ＴＭＥＭ３０Ａのリガンドの同定は様々な表示、例えば脳薬剤配送のために受容体を発現することが既知である脳内皮細胞等の細胞への生体活性分子（リガンドまたはＴＭＥＭ３０Ａに結合）のターゲッティング、および同じものを含有すると推測される配合物内でのリガンドまたはＴＭＥＭ３０Ａの存在の検出のための試薬としてのＴＭＥＭ３０Ａまたはリガンドの使用に有用であろう。配合物は、リガンドまたはＴＭＥＭ３０Ａを発現する、ＴＭＥＭ３０Ａまたはリガンドを発現または応答すると知られている細胞の生体活性を調節する、ＴＭＥＭ３０Ａを発現する細胞の薬剤への透過性を調節する、またはＴＭＥＭ３０Ａまたはリガンドに対するアゴニスト、アンタゴニストおよび／または抗体を許容する、と推測される細胞を含みうる。これはＴＭＥＭ３０Ａを発現する細胞の透過性または他の生体活性を調節するであろう。様々な他の表示も当業者には明らかである。例えばポリヒスチジン標識等のエピトープ標的潜在リガンドはＴＭＥＭ３０Ａとの相互作用が可能である。エピトープ標識ペプチド試剤との１時間のインキュベートの後で、ＴＭＥＭ３０Ａはタンパク質Ａビーズによって免疫沈降され、該ビーズは洗浄される。潜在リガンド相互作用は、エピトープ標識への抗体との複合体のウエスタンブロットによって定量される。
【００５３】
よって、本発明の実施例において、荷役物質の血液―脳隔壁を経ての移動を発生または増強する方法が提供される。該方法は以下を含む：
ａ）血液―脳隔壁抗原への親和性を持つ接着質の取得；
ｂ）荷役物質の接着質への機能的連結（例えば表面に接着質を持つリポソームまたは他の適当な包での荷役物質の結合または被包）；
ｃ）接着質と脳内皮細胞との接触の許容。
【００５４】
荷役物質は、医薬品、像形成剤、毒素あるいは他の適当な化合物を含む関連する化合物でありうることは充分に理解されるであろう。
いくつかの例において、血液―脳隔壁の移行の後で接触可能な標的への親和性を持つ１つ以上の分子を含み、荷役物質の特異的ターゲッティングを促進することが望ましい。
受容体を密集させるとともにその移行を刺激する様々なリガンドを顕出させることで、血液―脳隔壁を経ての受容体媒介トランスサイトーシスを受ける受容体（ＦＣ５に認識される抗原等）を薬剤／治療薬の脳への配送に利用することができる。これらは典型的には抗体であるが、ペプチド、オリゴサッカライド等でもありうる。
【実施例】
【００５５】
経血管的脳配送を開発できる新たな抗原−リガンド系を発見するために、ラマ単一領域抗体（ｓｄＡｂ）ファージ像形成ライブラリ（タンハー他、２００２年）をヒト肺と脳微小血管内皮細胞との間の異なる抗原選択に用いた。ｓｄＡｂは自然に生じ軽鎖を欠く重鎖ＩｇＧのＶＨＨ断片であり、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）の半分の大きさ（１３ｋＤａ）である。ＨＣＥＣを選択的に認識するとともに生体外および生体内でＢＢＢを経て移行する２つの新たなｓｄＡｂ、ＦＣ５（遺伝子銀行番号ＡＦ４４１４８６）およびＦＣ４４（遺伝子銀行番号ＡＦ４４１４８７）がこれらの研究で分離された。これらのｓｄＡｂは生物工学製品および担体との結合が可能なように作成された（アブルロブ（Ａｂｕｌｒｏｂ）他、２００５年）。ｓｄＡｂは有望な経血管的脳配送ベクターとして、従来の抗体に対し、その小さいサイズ、高水準でＦｃ受容体を発現する組織（例えば肝臓や脾臓）に対する低い非特異的相互作用、それによる低い免疫原性、および高温、ｐＨ、塩に対する著しい安定性を含むいくつかの利点を持つ。
【００５６】
［例１．ＦＣ５は生体内での静脈内注射の後で脳を標的とする］
Ｆｃ５の生体内分布を調査するために、ＦＣ５をＮＨＳエステル結合を介して近赤外線プローブ、Ｃｙ５．５に結合させ、マウスに尾静脈から注射した。マウスを小動物時間領域エクスプローラーオプティクス（ｅＸｐｌｏｒｅ Ｏｐｔｉｘ）前臨症画像化システムによって画像化した。近赤外線蛍光プローブ、Ｃｙ５．５単独、またはＦＣ５（５０μｇ）または陰性対照抗体ＮＣ１１（５０μｇ）と結合したものを２７ゲージ固定針の０．５ｍｌインシュリン注射器を用いて動物に静脈から注射した。薬剤注射から６時間後に動物をエクスプローラーオプティクスによって画像化した。全ての画像化試験において、繰返し数８０ＭＨｚおよび時間分解能２５０ｐｓ光パルスの６７０ｎｍパルスレーザーダイオードを刺激のために用いた。７００ｎｍの蛍光エミッションを高感受性時間分解能単一光子計数システムによって収集し、３ｍｍオフセットされた高速光電子増倍管を介して拡散光学微細構成再構成のために検出した。それぞれの動物を板の上にうつぶせにし、該板を画像化システム内の加熱台（３６℃）に乗せた。頭部を包囲する二次元中央体走査領域を上面視リアルタイムデジタルカメラで選択した。動物の最適な高さは側面視デジタルカメラで検証された。それから動物が自動的にレーザー走査のために画像化室へ移動される。それからガルバノミラーによって制御されるレーザー刺激ビームを選択されたＲＯＩ上に移動した。レーザーの力とピクセル毎計数時間をそれぞれ３０μＷと０．５ｓに最適化した。これらの値は試験全体において維持された。ラスタ走査間隔は１．５ｍｍとし、それぞれのフレームの獲得の間維持された。１０２４の点を関連する領域（ＲＯＩ）のために走査した。データを一時的点像分布関数（ＴＰＳＦ）として記録し、画像を蛍光分布図として再構成した。
【００５７】
注射から６時間後のエクスプローラーオプティクス小動物画像化システム（６７０ｎｍ刺激レーザー）を用いた光学画像化において、異なる標的に対し同一のライブラリからの陰性対照抗体、ＮＣ１１に比して頭領域でより高いＦＣ５蓄積を示した（図１）。頭部（図１、ＢおよびＤ）を含む様々な領域でのオプティビュー（ＯｐｔｉＶｉｅｗ、登録商標）ソフトウェアを用いた蛍光濃度の定量化によって頭部でのＦＣ５の選択的蓄積が示された。殺および灌流後の動物から取り出した脳の生体外画像化（図１Ｅ）によって、ＦＣ１１を注射した動物に比してＦＣ５を注射した動物の脳の蛍光濃度はより高いことが実証される。
［例２．ＦＣ５は荷役分子を血液―脳隔壁内皮細胞を経て輸送することができる］
【００５８】
ｓｄＡｂは治療成分との結合に利用できる−ＳＨ基を持たないので、ＦＣ５は追加の自由システインを発現するように作成された。よって図２Ａに示すように、ｃｙｓＦＣ５はマレイミド活性反応を用いてマウスＨＲＰ−ＩｇＧ（〜１９０ｋＤａ）と結合した。ＨＲＰ−ＩｇＧまたはＨＲＰ−ＩｇＧ−ｃｙｓＦＣ５はヒトＣＥＣ培養物に取り込まれ、３０分間いずれかの構造に細胞を暴露した後で定量された。ＩｇＧ−ＨＲＰの有効細胞取り込みは分子がｃｙｓＦＣ５と連結された場合にのみ見られる（図２ＢおよびＣ）。同様に、ｃｙｓＦＣ５と連結されたＨＲＰ−ＩｇＧは生体外ＢＢＢモデルの外側面室への有効細胞間移行を表し（図２Ｄ）、ＩｇＧ−ＨＲＰ単独のヒトＣＥＣ単層を経ての輸送は無視できるものだった。
【００５９】
ＦＣ５にベクター化されたＨＲＰ−ＩｇＧのみがヒトＣＥＣに入り生体外ＢＢＢを経て移行されることが表されｓｄＡｂは成功裏に１０倍大きい分子を標的組織内へ、またはこれを経て輸送できることが示唆された。類似の化学結合原理を用い、有望な治療の性質により選択された大分子をｃｙｓＦＣ５に取り付けることができる。ビオチン−アビジンリンカーを含む、全体または単鎖抗体に用いられている他の化学的リンカーの取り組み方もまたｓｄＡｂと用いることができ、適応したスペーサーを抗原結合サイトの立体障害を避けるために用いる。ｓｄＡｂを遺伝子学的に作成可能とすることで、キメラ（融合）タンパク質を含む治療分子への化学的連結の択一的な取り組み方も可能である。
【００６０】
例えばｃｙｓＦＣ５によって達成される自由連結成分を提供するＢＢＢ透過性ｓｄＡｂＦＣ５の作成によって、薬剤担体の文脈における多重結合表示のための択一的な取り組み方が可能になる。例えば、ＩｇＧｓまたはｓｃＦｖｓについて報告されている結合と同様にして、ｃｙｓＦＣ５をナノ粒子配送系の高分子成分またはリポソーム基剤粒子と結合させることができる。これらのｓｄＡｂにベクター化された’コンテナ’を脳への薬剤配送、トランスフェリン受容体を含む既知のＢＢＢ抗原に対する古典的抗体を用いる既に開発されている構想に用いることができる。
【００６１】
［例３．ＦＣ５の内在化および脳内皮細胞を経ての移行の機構］
［ＨＣＥＣを経てのＦＣ５移行は有極であり電荷に対し独立である］
ＦＣ５は非常に高い濃度であっても（１ｍｇ／ｍｌ）ＨＣＥＣに対し毒性ではない。［１４Ｃ］−スクロースの生体外ＢＢＢモデルを経ての透過性には、１０μｇ／ｍｌ ＦＣ５の不在と存在で有意な差はなく［それぞれＰｅ＝（０．８９７±０．１１）×１０−３および（０．８６２±０．１８）×１０−３ｃｍ／ｍｉｎ］、ＦＣ５はＨＣＥＣの細胞間透過性には影響しないことが示唆される。生体外ＢＢＢモデルを経てのＦＣ５のトランスサイトーシスは有極である。ＦＣ５の頂端部から側底部への輸送は側底部から頂端部より１２倍高いことが３０分間のみで観測された（図３Ａ）。これに対し、［１４Ｃ］−スクロース、細胞間拡散のマーカーは、細胞単層膜の頂端部から側底部、側底部から頂端部で等しい（すなわち有極でない）分布を示した。
【００６２】
マクロピノサイトーシスによってＦＣ５が内在化および輸送されるかを調査するために、５００μＭ アミロライド存在下でＦＣ５移行を試験した。アミロライドは被覆穴媒介エンドサイトーシスに影響することなくマクロピノソームの形成を阻害する（ウエスト他、１９８９年）。アミロライドはＦＣ５の内皮透過移動に影響しなかった（図３Ｂ）。
【００６３】
ＡＭＥのＦＣ５トランスサイトーシスへの寄与は、ｓｄＡｂが正に帯電していることによって査定される（ＦＣ５の算出された等電点は〜９．２３）。ＦＣ５の取り込みおよび輸送の査定に先行してＨＣＥＣを高カチオン硫酸プロタミン（４０μｇ／ｍｌ）またはポリ−Ｌ−リジン（３００μＭ）と共に３０分間インキュベートした。これらはいずれもＡＭＥを阻害することが示されている（サイ他、１９９８年）。いずれの化合物もＦＣ５のＨＣＥＣへの取り込み（データは図示しない）および生体外ＢＢＢモデルを経ての輸送（図３Ｂ）に影響せず、ＦＣ５のＨＣＥＣを経ての結合および移行は電荷に対し独立であることが示唆される。
【００６４】
驚いたことに、ＢＢＢ内のＡＭＥを刺激する能力についてこれらの研究中で試験された小麦胚細胞凝集素（ＷＧＡ）は有意にＦＣ５移行を阻害し、これによって内皮糖衣が電荷媒介相互作用ではない機構を介してこの過程に関係することが示される。この可能性は以下で述べる研究においてさらに探求された。
【００６５】
［ＦＣ５のＨＣＥＣを経ての輸送はエネルギー依存である］
ＦＣ５トランスサイトーシスのエネルギー依存の調査のために、ＦＣ５の取り込みおよび輸送を３７℃および４℃で測定した。ｃ−ｍｙｃに続くＦＩＴＣラベル二次抗体により、細胞内ＦＣ５は免疫化学によって検出された。ＦＣ５は早くも１５分間でＨＣＥＣ内に内在化し、３７℃での添加の３０分後に大半の細胞で検出された（図４Ａ）。３７℃に比して、４℃ではＦＣ５の細胞内蓄積（図４Ａ・Ｂ）および内皮間移行（図２Ｃ）の両方において顕著な減少が観測された。［１４Ｃ］−スクロースのＢＢＢモデルを経ての輸送は温度の影響を受けなかった。無グルコース培地でのＨＣＥＣの５ｍＭ アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）および５ｍＭ ２−デオキシグルコースへの３０分間の暴露による呼吸および解糖作用経路の同時阻害によって、ＦＣ５移行はほぼ完全に阻害された（図４Ｃ）。この処理によって他の細胞種の細胞ＡＴＰの完全な涸渇が示されている（ロナー他、１９９９年）。Ｎａ＋，Ｋ＋−ＡＴＰアーゼポンプ阻害剤、ウアバイン（１μＭ）との３０分間の前処理でもＦＣ５のＨＣＥＣを経ての輸送は４０％減少した（図４Ｄ）。
【００６６】
［ＦＣ５トランスサイトーシスはクラスリン被覆小胞を経て起こる］
ＦＣ５移行のための２つの主要なエネルギー依存受容体媒介エンドサイトーシス／トランスサイトーシス経路、クラスリン被覆小胞およびカベオラが、コローカリゼーション研究およびエンドサイトーシス阻害剤を用いて調査された。
【００６７】
５μｇ／ｍｌ ＦＣ５へ３０分間暴露されたＨＣＥＣ内でのカベオリン−１およびＦＣ５の二重免疫細胞化学法は、ＦＣ５免疫蛍光Ａとによってカベオリン−１免疫蛍光Ｂを示さなかった（図５Ｄ〜Ｆ）。これに対し、クラスリン免疫蛍光ＥはほとんどＦＣ５免疫蛍光Ｄとによってコローカリゼーションされた（図５Ａ〜Ｃ）。さらに、密度勾配遠心分離法によるＨＣＥＣ分画の後で、ウエスタンブロット上でのＦＣ５免疫反応によって同じ分画（＃７、８および９）クラスリン免疫反応として見られたが、高カベオリン−１分画（＃２および３）からは見られなかった（図５Ｇ）。
【００６８】
ＦＣ５の取り込みと移行が、クロルプロマジン（５０μｇ／ｍｌ）および低張性Ｋ＋枯渇緩衝剤（０．１４Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ グルコース、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、水で１：１に希釈）を含むクラスリン媒介エンドサイトーシスの薬理学的阻害剤、またはフィリピン（５μｇ／ｍｌ）、ナイスタチン（５μｇ／ｍｌ）およびメチル−β−シクロデキストリン（５ｍＭ）を含むカベオラ媒介エンドサイトーシス阻害剤で３０分間前処理した細胞において実験された。クロルプロマジンはエンドソームからのＡＰ−２の再循環を破壊するとともに、原形質膜上の被覆穴の組み立てを防止するが、Ｋ＋枯渇はクラスリン被覆小胞形成を阻止する。フィリピンおよびナイスタチンはコレステロールに結合し、メチル−βシクロデキストリンは原形質膜からコレステロールを排出し、結果、高コレステロールカベオラ小胞が破壊される。試験されたカベオラ媒介エンドサイトーシス阻害剤は全て、生体外ＢＢＢモデルを経てのＦＣ５移行に影響しなかった（図５Ｈ）。これに対し、クロルプロマジンおよびＫ＋枯渇はそれぞれ５２％、４６％のＦＣ５移行を阻害した（図５Ｈ）。
【００６９】
エンドサイトーシス後のＦＣ５の細胞間移行を調査するため、初期および後期エンドソーム／リソソームのマーカーでコローカリゼーション研究を行った。初期エンドソームのマーカー、テキサスレッド（登録商標）結合トランスフェリン（図６Ａ〜Ｃ）でコローカリゼーションされたＦＣ５はカテプシンＢ（図６Ｄ〜Ｆ）、後期エンドソームのマーカーではコローカリゼーションされなかった。ＢＢＢモデルの側底部室から収集されたトランスサイトーシスされたＦＣ５は、頂端部区画に添加されたＦＣ５とウエスタンブロット上で区別できず（図６Ｇ）、これによってＨＣＥＣを経てのトランスサイトーシスの間、ＦＣ５はリソソームを迂回し非損傷のままであることが示される。同じライブラリからの非選択ｓｄＡｂはモデルの側底部室から検出できず（ムルガナダム（Ｍｕｒｕｇａｎａｄａｍ）他、１９９７年）これによってＦＣ５は細胞間輸送で側底部室に入らないことが示される。
【００７０】
ＦＣ５の輸送はまた、カチオンイオノフォアモネンシンによる細胞内区画の中和に感受性である。モネンシンはエンドソームおよびリソソームの区画内のＮａ＋およびＨ＋勾配を破壊し、エンドサイトーシス小胞のｐＨは５．５から７以上に上がり、これによって受容体の再循環が阻害される。モネンシン（２５μＭ）はＦＣ５のＨＣＥＣを経てのトランスサイトーシスを３４％阻害し（図６Ｈ）、これによって酸性化された細胞内区画およびＦＣ５の推定上受容体の再循環が効率的な内皮透過輸送の維持に重要でありうることが示される。
【００７１】
［通信経路がHCEC内のＦＣ５エンドサイトーシス／トランスサイトーシスに含まれる］
ＦＣ５のトランスサイトーシスにおける細胞骨格機構部分の要求を定量するために、ＨＣＥＣをアクチン解重合剤であるサイトカラシンＤ（０．５μＭ）またはラトランキュリンＡ（０．１μＭ）、あるいは微小管阻害剤であるノコダゾール（２０μＭ）またはコルヒチン（２０μＭ）とともにＨＣＥＣは３０分間インキュベートした。サイトカラシンＤおよびラトランキュリンＡは実質的に（７０〜８０％）ＦＣ５のＨＣＥＣを経ての頂端から側底への輸送を減少させた（図７Ａ）。これに対し、微小管阻害剤はＦＣ５トランスサイトーシスに影響しなかった（図７Ａ）。
【００７２】
通信経路によるＦＣ５トランスサイトーシスの調節を定量するために、ＨＣＥＣを以下のモジュレーターのいずれかと共に３０分間インキュベートした。チロシンキナーゼ阻害剤であるゲニステイン（５０μＭ）；タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤であるビスインドールマレイミド−１（ＢＩＭ−１；５μＭ）；ＰＩ３−キナーゼ阻害剤であるウォルトマニン（０．５μＭ）；およびタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）阻害剤であるジブチリル−ｃＡＭＰ（ｄｂ−ｃＡＭＰ；５００μＭ）である。ＨＣＥＣを経てのＦＣ５トランスサイトーシスはゲニステイン（図７Ｂ）およびｄｂ−ｃＡＭＰ（図７Ｂ）の影響を受けず、ＰＫＣ阻害剤存在下で２５％減少し（図７Ｂ）、ＰＩ３−キナーゼ阻害剤存在下でほぼ完全に妨げられた（図７Ｂ）。用いられた薬理学試剤はいずれも細胞に対し毒性ではなかった。
【００７３】
［ＦＣ５トランスサイトーシスにおける炭水化物エピトープの役割］
ＦＣ５トランスサイトーシスにおける内皮糖衣の役割は、ＢＢＢでのＡＭＥを刺激すると知られているレクチンであるＷＧＡ（バンクス他、１９９８年）がＨＣＥＣへのＦＣ５取り込み（図８Ａおよび８Ｂ）を阻害することの観察によって示される。
【００７４】
硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖の二糖ユニットの２０〜２００の繰り返しからなる大型の非分岐ポリマーでありＣＥＣ内で豊富に発現するプロテオグリカンが、ＨＣＥＣを経てのＦＣ５トランスサイトーシスを媒介するかどうかを試験するために、膜上で発見されるいくつかの既知の可溶性ＧＡＧによる競合実験を行った。ヘパリン硫酸（５０Ｕ／ｍｌ）、コンドロイチン硫酸Ａ（１０μｇ／ｍｌ）およびコンドロイチン硫酸Ｃ（１０μｇ／ｍｌ）によってＨＣＥＣを前処理することは、生体外でのＢＢＢを経てのＦＣ５トランスサイトーシスに影響しなかった。同様に、マンナン（１ｍｇ／ｍｌ）およびマンノース（５０μＭ）はＦＣ５移行に影響せず、これによって脳の発達においてＢＢＢ輸送に含まれる多機能膜間糖タンパク質であるマンノース６−燐酸／インシュリン類似生育要素２受容体がＦＣ５内在化には含まれないことが示唆される。
【００７５】
ＷＧＡは幅広い範囲のシアロ結合体と相互作用することが知られているため、ＦＣ５の膜内および膜間でのシアル酸残基の重要性を次に試験した。２００μＭ シアル酸、または０．１〜０．２Ｕの、様々な細胞膜糖タンパク質からの全てのシアル酸を放出するコレラ菌由来ノイラミニダーゼ、あるいはα（２，３）結合シアル酸に選択的な腸チフス菌由来α（２，３）ノイラミニダーゼによってＨＣＥＣを前処理した。ＦＣ５取り込み（図８Ｃおよび８Ｄ）およびＦＣ５のＨＣＥＣを経てのトランスサイトーシス（図８Ｅ）はいずれもシアル酸およびノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）に阻害された。ノイラミニダーゼは特にＦＣ５トランスサイトーシスを９１％減少させた（図８Ｅ）。これらの研究によって、外因性シアル酸によるＦＣ５結合についての除去または競合がＦＣ５の取り込みおよびトランスサイトーシスに干渉したことから、シアル酸がＦＣ５に認識されるＨＣＥＣ上の抗原エピトープの必須成分であることが暗示される。
【００７６】
ＦＣ５トランスサイトーシスに含まれるシアロ糖結合体の性質を、細胞をそれぞれ３つのシアル酸結合レクチン、幅広い範囲のシアロ結合体と相互作用する小麦麦芽凝集素（ＷＧＡ；１００μｇ／ｍｌ）、セイヨウニワトコ凝集素（ＳＮＡ；１００μｇ／ｍｌ）およびα（２，６）およびα（２，３）シアリルガラクトシル残基を認識するイヌエンジュ凝集素（ＭＡＡ；１００μｇ／ｍｌ）によって前処理することでさらに試験した。
【００７７】
ＦＣ５認識シアル酸残基が糖脂質に取り付けられるかどうかを調査するために、ＨＣＥＣ細胞を述べられたように（ヴェッセルおよびフリュッゲ、１９８３年）タンパク質および脂質に分画した。ノイラミニダーゼの不在または存在下でのこれらの分画へのＦＣ５結合を酵素結合免疫吸着検定法によって試験した。ＦＣ５のＨＣＥＣ脂質分画への結合は無視できた（図６Ｇ）。ＦＣ５はまた分離された脳ガングリオシドを認識できなかった。これに対し、ノイラミニダーゼに暴露された細胞溶解産物のタンパク質分画においてＦＣ５のＨＣＥＣタンパク質分画への結合は５０％減少した。ＦＣ５はＨＥＫ２９３細胞のタンパク質および脂質分画のいずれとも結合しなかった。正の対照として用いたガラクトシルセラミドが脂質分画にＯ１抗ガラクトシルセラミド抗体に検出される強い信号を生じた。
【００７８】
［トランスフェリン受容体の排除］
トランスフェリン受容体はＣＥＣにおいて豊富であり（ジェフリーズ他、１９８４年）、ＢＢＢを経てのトランスサイトーシスに含まれるとともに（キアン他、２００２年）、高度にグリコシル化されていることから（ヘイズ他、１９９２年）、ＦＣ５の推定上の受容体が実際にヒトトランスフェリン受容体であるかどうかを調査した。抗トランスフェリン受容体抗体ＣＤ７１（図９Ａ・Ｂ）に対し、ＦＣ５およびその高結合力五量体構成Ｐ５（アブルロブ（Ａｂｕｌｒｏｂ）他、２００５年）は酵素結合免疫吸着検定法検定において固定されたヒトトランスフェリン受容体に結合せず（図９Ａ）、ウエスタンブロットにおいて該タンパク質を認識しなかった（図９Ｂ）。加えて、ＦＣ５取り込み（データは図示しない）および内皮透過輸送（図９Ｃ）はホロトランスフェリンの１００倍過多存在下で減少しなかった。
【００７９】
［考察］
この研究にある集合的存在によって、ＦＣ５の取り込みおよびトランスサイトーシスはクラスリン被覆穴を経て起こるとともにノイラミニダーゼ感受性、α（２，３）−シアロ糖結合体の認識に依存する。これらの結論はＦＣ５移行の有極化、温度およびエネルギー依存を示す一連の実験によって補強されるとともに、細胞間拡散、穴形成およびマクロピノサイトーシス経路を排除した。しかし、一般的な仮定に対し、電荷媒介ＢＢＢ選択性を示す膜貫通ペプチドの新たな綱の近来の研究によって、ＲＭＥと同様にＡＭＥも温度およびエネルギー依存でありうることが示された（ドリン他、２００３年）。ＣＥＣ上の負電荷を中和することで正に帯電したＦＣ５の内皮透過輸送を減少させるＡＭＥ阻害剤の欠損により、ＲＭＥの機構がさらに示唆された。ＲＭＥの２つの主要な小胞経路、クラスリン被覆穴およびカベオラが次に試験された。ＦＣ５内在化のクラスリン被覆穴経路はＦＣ５のクラスリンによる強いコローカリゼーションによって示されたが非損傷および分画されたＨＣＥＣの両方におけるカベオラ免疫反応によっては示されず、クラスリン被覆穴形成の阻害を示す前処理によるＦＣ５トランスサイトーシスの阻害によって示された。内在化において、ＦＣ５は初期エンドソームおよび分岐後期エンドソーム／リソソームの標的にされるとともに、エキソサイトーシスによって有効な細胞内劣化なしに外側面区画へと排出された。
【００８０】
ＦＣ５の小胞細胞間輸送は非損傷アクチン重合に強く依存していた。近年の研究によって、Ａｂｐ１ｐ、Ｐａｎ１ｐおよびコータクチンを含むいくつかのタンパク質が同定されており、これらはアクチンフィラメント集合をクラスリン被覆穴内在化と機能的に連結する。
【００８１】
クラスリン被覆穴の往来を制御する信号事象の複雑さは判読が困難なままである。ＦＣ５トランスサイトーシスは本質的にＰｌ３−キナーゼ阻害剤、ウォルトマニンに妨げられ、これはＰＫＣ、ＰＫＡおよびトリプトシンキナーゼ阻害剤を含む他の信号経路にほとんど影響されなかった。Ｐｌ３−キナーゼによるイノシトール脂質のリン酸化はクラスリン被覆穴経路を含む別種の膜輸送事象に関係している。Ｐｌ３Ｋ−Ｃ２アルファはクラスリン被覆小胞の個体数と共精製されるが、ＡＰ−２およびダイナミンを含むこれらの小胞の機能を包含するタンパク質はＰｌ３キナーゼと相互作用する。ＰＫＣおよびＰＫＡは様々な受容体の内在化に関係しているが、いずれもクラスリン媒介エキソサイトーシスに要求されることは見られない。従来からＲＭＥ媒介脳輸送に利用されているインシュリン生育因子（ＩＧＦ）受容体（チャン他、２００２年）を含むいくつかの膜受容体のチロシンキナーゼ活性の阻害によってその内在化が防止される。ＦＣ５トランスサイトーシスにおけるゲニステイン効果の欠損によって、ＦＣ５に認識される受容体はチロシンキナーゼではないらしいことが示唆された。
【００８２】
脳内皮細胞の表面は、細胞−細胞伝達、病原体認識／付着および細胞外マトリクスとの相互作用に関係する複合炭水化物のち密層で覆われている（プリース他、２０００年）。表面糖結合の様々なモジュレーターまたは競合阻害剤を用いた研究によって、ノイラミニダーゼ感受性α（２、３）−シアル酸残基がＦＣ５抗原認識、ＦＣ５内在化およびトランスサイトーシスにおいて重要であることが実証された。糖タンパク質およびガングリオシドの双方に取り付け可能なシアル酸残基はクラスリン被覆穴において豊富である。ＨＣＥＣにおいて発現する主要なガングリオシドはＧＭ３およびシアリルパラグリオシド（ＬＭ１）である。ＦＣ５はＨＣＥＣから抽出された脂質に結合できなかった、または抗原の糖タンパク質性質を含む主要な脳ガングリオシドのいずれをも認識できなかった。シアル酸残基は多くの組織で発現されるため、ＦＣ５の脳内皮細胞への選択性は抗原エピトープのタンパク質成分によるものであろう。
【００８３】
トランスフェリン受容体は脳内皮に豊富な、クラスリン被覆小胞媒介エンドサイトーシスを受ける多重シアル酸残基を持つＮ−およびＯ−グリコシル化経膜タンパク質である。トランスフェリン受容体に対する抗体、ＯＸ２６は、生物学上の脳標的ベクターおよびリポソームとして用いられている。ＦＣ５は分離されたヒトトランスフェリン受容体の認識に失敗し、ホロトランスフェリンはＦＣ５トランスサイトーシスと競合しなかった。これに従って、脱シアル化およびＮ−脱グリコシル化されたトランスフェリン受容体変異体は、未変性トランスフェリン受容体と同様のトランスフェリン結合と内在化特性を示している。トランスフェリン受容体に加えて、メラノトランスフェリン（ｐ９７）を含む他の鉄輸送分子、他の受容体と同様にインシュリン受容体を含むラクトフェリン（チャン他、２００２年）および低濃度リポタンパク質受容体（デホーク（Ｄｅｈｏｕｃｋ）他、１９９７年）が可能性のある脳配送のためのＲＭＥ経路として同定されている。他の研究によって、ＴＮＦβ受容体（オスブルグ他、２００２年）等の病理学的条件において特に上方制御される受容体が脳内皮細胞においてＲＭＥを受けることが示唆された。これらのタンパク質はＦＣ５によって認識される推定上の抗原として選択的に排除されていない。
【００８４】
要約すると、ＦＣ５は脳内皮細胞の管腔表面において発現するα（２，３）−シアロ糖結合体を認識するとともにクラスリン被覆小胞を経てのアクチン及びＰｌ３キナーゼ依存トランスサイトーシスを受ける新たな単一領域抗体である。リンカー成分を提供するために作成されたＦＣ５およびその誘導体（アブルロブ（Ａｂｕｌｒｏｂ）他、２００５年）は、薬剤、生物化学製品およびナノ担体の脳標的ベクターへと発達しうる。生体内での生体内分布研究（ムルガナンダム（Ｍｕｒｕｇａｎａｎｄａｍ）他、２００１年）によって、同様の大きさの他の生物化学製品に典型的な、脳内での有意なＦＣ５蓄積およびその腎臓および肝臓による高速排除が実証された。よって、ＰＥＧ化等の戦略によるＦＣ５薬物動態学の向上は、効率的な生体内脳ターゲッティングの達成に必要であろう。にもかかわらず、ＯＸ２６抗体等の’古典的’抗体ベクターと同様に、内皮透過輸送を受ける細胞特異抗体の認識により、ＢＢＢ標的ｓｄＡｂは（細胞貫通Ｓｙｎ−Ｂペプチドと同様に）ペプチド様サイズであり脳内皮へ高電荷媒介結合する（ドリン他、２００３年）。ｓｄＡｂはペプチドとは異なりプロテアーゼへの著しい耐性を持ち、完全なＩｇＧとは異なり脳からＢＢＢにおけるＦｃ受容体媒介流出系によって搬出されることがない。これらの利点によりｓｄＡｂは、小胞内皮透過輸送の開発によって脳への標的薬剤および生物化学製品と多角的に代替される。
【００８５】
［例４．ＦＣ５に対するファージ表示ヒトｃＤＮＡライブラリのパニングによる抗原同定］
ＦＣ５に認識されるタンパク質抗原の同定のために、ゲノミクスおよびプロテオミクスの方法の組み合わせが用いられた。戦略は概略的に図１０に示される。ゲノミクスの取り組み方は固定されたＦＣ５に対するヒト脳ｃＤＮＡのファージ表示ライブラリ（コーテック）のパニングからなる。４周のパニングの後で、ＦＣ５に認識される最も頻度の高い配列、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １が同定された。破壊解析によってＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ １を、膜間タンパク質３０Ａ（別名：Ｃ６ｏｒｆ６７、ＣＤＣ５０Ａ、細胞サイクル制御タンパク質５０Ａ）のヌクレオチド配列１５９８〜１９７９に沿って配列した。膜間領域タンパク質３０Ａ（ＴＭＥＭ３０Ａ）のコード領域はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ２として示される。コードされたタンパク質のスプライシング変異体はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ４およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ５として示される。ＴＭＥＭ３０Ａの細胞外領域はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ６として示される。Ｎ−グリコシル化サイトを含むＴＭＥＭ３０Ａのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ７およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ８として示される。ＴＭＥＭ３０Ｂでのいくつかの小変異でも見られるＴＭＥＭ３０Ａの保護ＣＤＣ５０領域の配列はＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ ９〜１５として示される。これらの配列は本出願の全体において詳細に検討されることが留意される。
【００８６】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １］
ＧＡＡ ＴＴＴ ＴＡＴ ＧＧＡ ＧＡＡ ＡＧＧ ＧＡＴ ＴＡＣ ＡＡＧ ＡＴＧ ＴＡＴ ＧＡＧ ＴＡＴ ＡＡＴ ＧＡＣ ＴＴＧ ＣＴＡ ＡＣＣ ＴＴＴ
ＣＡＧ ＧＡＴ ＴＣＡ ＧＡＧ ＡＡＡ ＧＡＴ ＧＡＡ ＧＡＡ ＡＧＡ ＣＣＡ ＴＡＴ ＣＴＡ ＡＡＴ ＡＡＴ ＡＣＡ ＣＴＴ ＣＡＴ ＣＡＴ ＴＴＴ ＣＡＴ ＧＴＧ ＴＡＴ ＡＡＡ ＴＧＣ ＴＴＡ ＡＡＧ ＴＡＣ ＣＡＴ ＣＴＴ ＴＧＴ ＴＧＡ ＧＧＴ ＧＧＴ ＴＣＡ ＴＧＴ ＡＴＣ ＣＡＧ ＴＴＴ ＡＴＣ ＣＡＧ ＴＡＣ ＡＧＴ ＴＡＴ ＴＴＧ ＴＣＡ ＡＧＣ ＴＴＡ ＧＣＴ ＴＴＧ ＡＴＴ ＴＣＡ ＡＡＧ ＧＡＣ ＡＣＧ ＣＴＴ ＡＣＣ ＴＴＧ ＴＣＴ ＧＧＣ ＡＴＡ ＡＧＡ ＡＴＴ ＡＡＴ ＧＣＴ ＣＡＴ ＧＴＣ ＴＧＣ ＡＧＴ ＧＧＴ ＴＧＧ ＧＴＡ ＧＧＴ ＣＣＴ ＧＣＴ ＴＡＧ ＧＡＧ ＡＡＴ ＴＡＡ ＡＡＡ ＡＴＴ ＣＣＴ ＣＴＴ ＴＣＣ ＧＴＴ ＴＧＧ ＴＴＧ ＡＡＴ ＧＴＴ ＧＣＡ ＧＴＣ ＡＧＧ ＡＡＣ ＣＣＣ ＡＡＣ ＴＣＡ ＣＴＴ ＧＧＡ ＡＴＧ ＴＴＴ ＴＣＡ ＴＡＴ ＧＴＡ ＡＴＣ ＡＴＴ ＴＣＣ ＣＴＴ ＧＡＡ ＧＣＴ ＴＡＴ
この配列はＦＣ５に対するファージ表示ヒトｃＤＮＡライブラリのパニングから得られた。この配列はＴＭＥＭ３０Ａヌクレオチド配列（遺伝子銀行番号０１８２４７）のヌクレオチド配列１５９８〜１９７９に沿って配列され、コーディングされていない。
【００８７】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ２］
ＴＭＥＭ３０Ａのヌクレオチドコーディング領域（１４１〜１２２６）
（別名：膜間タンパク質３０Ａ、ＴＭＥＭ３０Ａ、Ｃ６ｏｒｆ６７、ＣＤＣ５０Ａ、細胞サイクル制御タンパク質５０Ａ）
ａｔｇｇｃｇａｔｇａ ａｃｔａｔａａｃｇｃ ｇａａｇｇａｔｇａａ ｇｔｇｇａｃｇｇｔｇ ｇｇｃｃｃｃｃｇｔｇ ｔｇｃｔｃｃｇｇｇｇ ｇｇｃａｃｃｇｃｇａ ａｇａｃｔｃｇｇａｇ ａｃｃｇｇａｔａａｃ ａｃｇｇｃｃｔｔｃａ ａａｃａｇｃａａｃｇ ｇｃｔｇｃｃａｇｃｔ ｔｇｇｃａｇｃｃｃａ ｔｃｃｔｔａｃｇｇｃ ｔｇｇｃａｃｇｇｔｇ ｃｔａｃｃｔａｔｔｔ ｔｃｔｔｃａｔｃａｔ ｃｇｇｔｃｔｃａｔｃ ｔｔｃａｔｔｃｃｃａ ｔｃｇｇｃａｔｔｇｇ ｃａｔｔｔｔｔｇｔｃ ａｃｃｔｃｃａａｃａ ａｃａｔｃｃｇｃｇａ ｇａｔｃｇａｇａｔｔ ｇａｔｔａｔａｃｃｇ ｇａａｃａｇａｇｃｃ ｔｔｃｃａｇｔｃｃｃ ｔｇｔａａｔａａａｔ ｇｔｔｔａｔｃｔｃｃ ｇｇａｔｇｔｇａｃａ ｃｃｔｔｇｃｔｔｔｔ ｇｔａｃｃａｔｔａａ ｃｔｔｃａｃａｃｔｇ ｇａａａａｇｔｃａｔ ｔｔｇａｇｇｇｃａａ ｃｇｔｇｔｔｔａｔｇ ｔａｔｔａｔｇｇａｃ ｔｇｔｃｔａａｔｔｔ ｃｔａｔｃａａａａｃ ｃａｔｃｇｔｃｇｔｔ ａｃｇｔｇａａａｔｃ ｔｃｇａｇａｔｇａｔ ａｇｔｃａａｃｔａａ ａｔｇｇａｇａｔｔｃ ｔａｇｔｇｃｔｔｔｇ ｃｔｔａａｔｃｃｃａ ｇｔａａｇｇａａｔｇ ｔｇａａｃｃｔｔａｔ ｃｇａａｇａａａｔｇ ａａｇａｃａａａｃｃ ａａｔｔｇｃｔｃｃｔ ｔｇｔｇｇａｇｃｔａ ｔｔｇｃｃａａｃａｇ ｃａｔｇｔｔｔａａｔ ｇａｔａｃａｔｔａｇ ａａｔｔｇｔｔｔｃｔ ｃａｔｔｇｇｃａａｔ ｇａｔｔｃｔｔａｔｃ ｃｔａｔａｃｃｔａｔ ｃｇｃｔｔｔｇａａａ ａａｇａａａｇｇｔａ ｔｔｇｃｔｔｇｇｔｇ ｇａｃａｇａｔａａａ ａａｔｇｔｇａａａｔ ｔｃａｇａａａｔｃｃ ｃｃｃｔｇｇａｇｇａ ｇａｃａａｃｃｔｇｇ ａａｇａａｃｇａｔｔ ｔａａａｇｇｔａｃａ ａｃａａａｇｃｃｔｇ ｔｇａａｃｔｇｇｃｔ ｔａａａｃｃａｇｔｔ ｔａｃａｔｇｃｔｇｇ ａｔｔｃｔｇａｃｃｃ ａｇａｔａａｔａａｔ ｇｇａｔｔｃａｔａａ ａｔｇａｇｇａｔｔｔ ｔａｔｔｇｔｔｔｇｇ ａｔｇｃｇｔａｃｔｇ ｃａｇｃａｔｔａｃｃ ｔａｃｔｔｔｔｃｇｃ ａａｇｔｔｇｔａｔｃ ｇｔｃｔｔａｔａｇａ ａａｇｇａａａａｇｔ ｇａｔｔｔａｃａｔｃ ｃａａｃａｔｔａｃｃ ａｇｃｔｇｇｃｃｇａ ｔａｃｔｃｔｔｔｇａ ａｔｇｔｃａｃａｔａ ｃａａｔｔａｃｃｃｔ ｇｔａｃａｔｔａｔｔ ｔｔｇａｔｇｇａｃｇ ａａａａｃｇｇａｔｇ ａｔｃｔｔｇａｇｃａ ｃｔａｔｔｔｃａｔｇ ｇａｔｇｇｇａｇｇａ ａａａａａｔｃｃａｔ ｔｔｔｔｇｇｇｇａｔ ｔｇｃｔｔａｃａｔｃ ｇｃｔｇｔｔｇｇａｔ ｃｃａｔｃｔｃｃｔｔ ｃｃｔｔｃｔｇｇｇａ ｇｔｔｇｔａｃｔｇｃ ｔａｇｔａａｔｔａａ ｔｃａｔａａａｔａｔ ａｇａａａｃａｇｔａ ｇｔａａｔａｃａｇｃ ｔｇａｃａｔｔａｃｃ ａｔｔｔａａｔｔｔｔ
【００８８】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ３］
［１．アイソフォーム１］
＞ｇｉ｜８９２２７２０｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿０６０７１７．１｜膜間タンパク質３０Ａ［ヒト］
ＭＡＭＮＹＮＡＫＤＥＶＤＧＧＰＰＣＡＰＧＧＴＡＫＴＲＲＰＤＮＴＡＦＫＱＱＲＬＰＡＷＱＰＩＬＴＡＧＴＶＬＰＩＦ ＦＩＩＧＬＩＦＩＰＩＧＩＧＩＦＶＴＳＮＮＩＲＥＩＥＩＤＹＴＧＴＥＰＳＳＰＣＮＫＣＬＳＰＤＶＴＰＣＦＣＴＩＮＦＴＬＥＫＳＦＥ ＧＮＶＦＭＹＹＧＬＳＮＦＹＱＮＨＲＲＹＶＫＳＲＤＤＳＱＬＮＧＤＳＳＡＬＬＮＰＳＫＥＣＥＰＹＲＲＮＥＤＫＰＩ ＡＰＣＧＡＩＡＮＳＭＦＮＤＴＬＥＬＦＬＩＧＮＤＳＹＰＩＰＩＡＬＫＫＫＧＩＡＷＷＴＤＫＮＶＫＦＲＮＰＰＧＧＤＮＬＥ ＥＲＦＫＧＴＴＫＰＶＮＷＬＫＰＶＹＭＬＤＳＤＰＤＮＮＧＦＩＮＥＤＦＩＶＷＭＲＴＡＡＬＰＴＦＲＫＬＹＲＬＩＥＲＫ ＳＤＬＨＰＴＬＰＡＧＲＹＳＬＮＶＴＹＮＹＰＶＨＹＦＤＧＲＫＲＭＩＬＳＴＩＳＷＭＧＧＫＮＰＦＬＧＩＡＹＩＡＶＧＳＩ ＳＦＬＬＧＷＬＬＶＩＮＨＫＹＲＮＳＳＮＴＡＤＩＴＩ
【００８９】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ４］
［２．アイソフォーム２］
＞ｓｐ＿ｖｓ｜Ｑ９ＮＶ９６−２｜Ｑ９ＮＶ９６ Ｑ９ＮＶ９６のアイソフォーム２
ＭＡＭＮＹＮＡＫＤＥＶＤＧＧＰＰＣＡＰＧＧＴＡＫＴＲＲＰＤＮＴＡＦＫＱＱＲＬＰＡＷＱＰＩＬＴＡＧＴＶＬＰＩＦ ＦＩＩＧＬＩＦＩＰＩＧＩＧＩＦＶＴＳＮＮＩＲＥＩＥＧＮＶＦＭＹＹＧＬＳＮＦＹＱＮＨＲＲＹＶＫＳＲＤＤＳＱＬＮＧＤＳＳ ＡＬＬＮＰＳＫＥＣＥＰＹＲＲＮＥＤＫＰＩＡＰＣＧＡＩＡＮＳＭＦＮＤＴＬＥＬＦＬＩＧＮＤＳＹＰＩＰＩＡＬＫＫＫＧＩＡ ＷＷＴＤＫＮＶＫＦＲＮＰＰＧＧＤＮＬＥＥＲＦＫＧＴＴＫＰＶＮＷＬＫＰＶＹＭＬＤＳＤＰＤＮＮＧＦＩＮＥＤＦＩ ＶＷＭＲＴＡＡＬＰＴＦＲＫＬＹＲＬＩＥＲＫＳＤＬＨＰＴＬＰＡＧＲＹＳＬＮＶＴＹＮＹＰＶＨＹＦＤＧＲＫＲＭＩＬＳ ＴＩＳＷＭＧＧＫＮＰＦＬＧＩＡＹＩＡＶＧＳＩＳＦＬＬＧＷＬＬＶＩＮＨＫＹＲＮＳＳＮＴＡＤＩＴＩ
アイソフォーム２は消失アミノ酸７９〜１１４である。
【００９０】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ５］
［３．アイソフォーム３］
＞ｓｐ＿ｖｓ｜Ｑ９ＮＶ９６−３｜Ｑ９ＮＶ９６ Ｑ９ＮＶ９６のアイソフォーム３
ＭＹＹＧＬＳＮＦＹＱＮＨＲＲＹＶＫＳＲＤＤＳＱＬＮＧＤＳＳＡＬＬＮＰＳＫＥＣＥＰＹＲＲＮＥＤＫＰＩＡＰＣＧ ＡＩＡＮＳＭＦＮＤＴＬＥＬＦＬＩＧＮＤＳＹＰＩＰＩＡＬＫＫＫＧＩＡＷＷＴＤＫＮＶＫＦＲＮＰＰＧＧＤＮＬＥＥＲＦＫ ＧＴＴＫＰＶＮＷＬＫＰＶＹＭＬＤＳＤＰＤＮＮＧＦＩＮＥＤＦＩＶＷＭＲＴＡＡＬＰＴＦＲＫＬＹＲＬＩＥＲＫＳＤＬＨ ＰＴＬＰＡＧＲＹＳＬＮＶＴＹＮＹＰＶＨＹＦＤＧＲＫＲＭＩＬＳＴＩＳＷＭＧＧＫＮＰＦＬＧＩＡＹＩＡＶＧＳＩＳＦＬＬ ＧＷＬＬＶＩＮＨＫＹＲＮＳＳＮＴＡＤＩＴＩ
アイソフォーム２は消失アミノ酸１〜１１９である。
ＴＭＥＭ３０Ａの細胞外領域はアミノ酸６７〜３２３を含む。
【００９１】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ６］
ＧＩＦＶＴＳＮＮＩＲＥＩＥＩＤＹＴＧＴＥＰＳＳＰＣＮＫＣＬＳＰＤＶＴＰＣＦＣＴＩＮＦＴＬＥＫＳＦＥＧＮＶＦＭＹＹＧ ＬＳＮＦＹＱＮＨＲＲＹＶＫＳＲＤＤＳＱＬＮＧＤＳＳＡＬＬＮＰＳＫＥＣＥＰＹＲＲＮＥＤＫＰＩＡＰＣＧＡＩＡＮＳ ＭＦＮＤＴＬＥＬＦＬＩＧＮＤＳＹＰＩＰＩＡＬＫＫＫＧＩＡＷＷＴＤＫＮＶＫＦＲＮＰＰＧＧＤＮＬＥＥＲＦＫＧＴＴＫ ＰＶＮＷＬＫＰＶＹＭＬＤＳＤＰＤＮＮＧＦＩＮＥＤＦＩＶＷＭＲＴＡＡＬＰＴＦＲＫＬＹＲＬＩＥＲＫＳＤＬＨＰＴＬＰ ＡＧＲＹＳＬＮＶＴＹＮＹＰＶＨＹＦＤＧＲＫＲＭＩＬＳＴＩＳＷＭＧＧＫＮＰ
【００９２】
［Ｎ−グリコシル化サイトを含むＴＭＥＭ３０Ａのアミノ酸配列］
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ７］
ＲＲＮＥＤＫＰＩＡＰＣＧＡＩＡＮＳＭＦＮＤＴＬＥＬＦＬＩＧＮ ＤＳＹＰＩＰＡＬＫ
（ＴＭＥＭ３０Ａ残基１６０〜２００に見られる）
【００９３】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ８］
ＲＲＮＥＤＫＰＩＡＰ ＣＧＡＩＡＮＳＭＦＮＤＴＬＥＬＦＬＩＧＮ ＤＳＹＰＩＰＩＡＬＫ ＫＫＧＩＡＷＷＴＤＫ ＮＶＫＦＲＮＰＰＧＧ ＤＮＬＥＥＲＦＫＧＴ ＴＫＰＶＮＷＬＫＰＶＹＭＬＤＳＤＰＤＮＮ ＧＦＩＮＥＤＦＩＶＷ ＭＲＴＡＡＬＰＴＦＲ ＫＬＹＲＬＩＥＲＫＳ ＤＬＨＰＴＬＰＡＧＲ ＹＳＬＮＶＴＹＮＹＰ
（ＴＭＥＭ３０Ａ残基１６０〜３００に見られる）
Ｎ−グリコシル化感受性残基：１８０、１９０、２９４
ＴＭＥＭ３０Ｂでのいくつかの小変異でも見られるＴＭＥＭ３０Ａの保護ＣＤＣ５０領域の配列。
【００９４】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ９］
ＮＦＹＱＮＨＲＲＹＶＫＳＲＤＤＳＱＬ
（ＴＭＥＭ３０Ａ残基１２６〜１４４およびＴＭＥＭ３０Ｂ残基１１５〜１３３に見られる）
【００９５】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １０］
ＡＰＣＧＡＩＡＮＳＭＦ
（ＴＭＥＭ３０Ａ残基１６９〜１７９に見られる）
【００９６】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １１］
ＡＰＣＧＡＩＡＮＳＬＦ
（ＴＭＥＭ３０Ｂ残基１６０〜１７０に見られる）
【００９７】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １２］
ＤＦＩＶＷＭＲＴＡＡＬＰＴ
（ＴＭＥＭ３０Ａ残基２５６〜２６９に見られる）
【００９８】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １３］
ＤＦＶＶＷＭＲＴＡＡＬＰＴ
（ＴＭＥＭ３０Ｂ残基２４９〜２６２に見られる）
【００９９】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １４］
ＭＧＧＫＮＰＦＬＧＩＡＹＩＡＶＧ
（ＴＭＥＭ３０Ａ残基２５６〜２６９に見られる）
【０１００】
［ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １５］
ＭＧＧＫＮＰＦＬＧＩＡＹＬＶＶＧ
（ＴＭＥＭ３０Ｂ残基２４９〜２６２に見られる）
【０１０１】
［ＦＣ５抗原の組織分布］
推定上のＦＣ５抗原の組織分布を解析するために、組織を表示するコーテック組織マイクロアレイによって様々な器官、様々な脳領域および様々な細胞系から抽出する。組織マイクロアレイをＴＭＥＭ３０Ａプライマーによってプローブし、ＴＭＥＭ３０Ａ結合をサウザンブロットによって検出した。図１１に様々な脳領域および肺癌腫におけるＦＣ５の高反応性（抗原の豊富さ）が示される。
【０１０２】
［脳でのＴＭＥＭ３０Ａ遺伝子の発現］
異なる細胞系でのＴＭＥＭ３０Ａ遺伝子発現はＲＴ−ＰＣＲおよび正５’ＧＡＡＧＡＣＴＣＧＧＡＧＡＣＣＧＧＡＴＡＡＣＡＣ’３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６）と逆５’ＣＡＧＴＡＣＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧ’３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７）を用いて試験された。図１２にヒト脳内皮細胞（ＨＢＥＣ）でのＴＭＥＭ３０Ａの高発現およびヒト胎児星状細胞での低発現が示される。ヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＭＬＣＥ）もまたＴＭＥＭ３０Ａ遺伝子発現を示した。
【０１０３】
［例５．プロテオミクスによる抗原同定］
プロテオミクスによる抗原同定は、ａ）脳内皮細胞（抗原を含む）の原形質膜の抽出；ｂ）該抽出物の、ニッケルマイクロスピンカラムに結合したＦＣ５または負の対照の抗原、ＮＣ１１の通過；ｃ）溶出液のカラムからの回収、０．２Ｕノイラミニダーゼ酵素（シグマ社のコレラ菌より）との処理または不処理、および質量分光測定によるこれらの解析、によってなされる。この取り組み方について以下で述べる。
【０１０４】
［原形質膜タンパク質の抽出］
固定されたラット脳内皮細胞（ＳＶ−ＡＲＢＥＣ）を１６０ｃｍ２ペトリ皿で約１週間培養した。細胞が完全培地変更によって４日後に供給された。細胞が融合状態に達した際に、原形質膜タンパク質を抽出した。８枚の１６０ｃｍ２ペトリ皿を用いた。細胞を氷上に置き、３０ｍｌのＰＢＳで１回および１０ｍｌの緩衝剤Ａ（０．２５Ｍスクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ， ２０ｍＭトリシン、ｐＨ７．８）で２回洗浄した。５ｍｌの緩衝剤Ａ＋（緩衝剤Ａに１：１０００のシグマ社の阻害剤カクテルを加える）を加え、細胞を掻取った。それから細胞を２つの５０ｍｌファルコン（登録商標）チューブに収集し（４皿／チューブ）、４℃、１４００ｘｇで５分間回転させた。細胞ペレットを１ｍｌの緩衝剤Ａ＋に再懸濁した。再懸濁したペレット双方を一緒にし、ガラスチューブとテフロン（登録商標）乳棒（２０ストローク）を用いて均質化した。該ホモジェネートを２つの２ｍｌ遠心チューブに移し、４℃、１０００ｘｇで１０分間回転させた。上澄みを収集した。ペレットを２ｍｌの緩衝剤Ａ＋に再懸濁し、それから均質化した。原形質膜を２０ｍｌの３０％パーコールに加え、４℃、８３０００ｘｇで３０分間回転させた。原形質膜試料を収集し５ｍｌのＰＢＳ＋に再懸濁し、４℃、１１８０００ｘｇで１時間回転させた。タンパク質濃度をＢＣＡキット（ピアス社）を用いて測定した。試料を等分し−８０℃で凍結した。
【０１０５】
［抗原同定のための抗体装填カラム］
アマシャム マイクロスピンＨｉｓ精製モジュールのカラムを抗体の結合に用いた。簡単には、カラムを２００μｇのＦＣ５、ＮＣ１１または単にＰＢＳと共に倒置して室温で１時間インキュベートした。カラムを７３５ｘｇで１分間回転し、それから５００ｕｌのＰＮＩ２０で１回、５００ｕｌのＰＢＳで２回洗浄した。３００μｇの原形質膜タンパク質を各カラムで倒置して４℃で３．５時間インキュベートし、それから倒置して室温で３０分間インキュベートした。それからカラムを７３５ｘｇで１分間回転し、その後５００ｕｌのＰＮＩ２０で４回洗浄し、各洗浄の間に７３５ｘｇで１分間回転した。カラムを２００ｕｌのＰＮＩ４００と共に倒置して室温で１５分間インキュベートし、７３５ｘｇで１分間回転することによって、タンパク質を溶出した。各タンパク質試料から溶出したタンパク質を０．２Ｕノイラミニダーゼで１時間処理し、あるいは処理しなかった。
【０１０６】
［トリプシン消化］
下ろした試料それぞれ（ＦＣ５、ＮＣ１１、ＰＢＳ）を、１０倍の冷アセトンを加え−２０℃で１２時間以上インキュベートすることで沈殿させた。５０００ｘｇ、５分間の遠心分離によりタンパク質をペレットとし、５０μｌ 変性緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、０．１％ＳＤＳ、４ｍＭ ＤＤＴ）に溶解させた。タンパク質を１５分間煮沸し変性させ、２分間冷却した。試料それぞれに５μｇのトリプシン（プロメガ社、カタログ番号Ｖ５２８０）を加え、試料を３７℃で１２時間以上インキュベートした。
【０１０７】
［カチオン変換（ＣＥ）カラムでの精製］
試料それぞれをＣＥ移動相緩衝剤（１０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ３．０、２５％アセトニトリル）で２ｍｌに希釈し、ｐＨが３．３以下であることを確認した。試料をカチオン変換カラム（ＰＯＲＯＳ（登録商標）５０ＨＳ、５０μｍ粒子サイズ、４．０ｍｍ ｘ １５ｍｍ，アプライドバイオシステム社、カタログ番号４３２６６９５）で精製した。
【０１０８】
［質量分光測定およびデータベース探索］
複合四重極飛行時間型質量分析測定（Ｑ−ＴＯＦ（登録商標）ウルティマ、ウォーターズ社、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ミルフォード）およびエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）およびオンライン逆相ナノフロー液体クロマトグラフィーカラム（ナノＬＣ、０．３ｍｍ×１５ｃｍ ペプマップ（ＰｅｐＭａｐ、登録商標）Ｃ１８毛管カラム、ダイオネクス社／ＬＣパッキングス社，アメリカ合衆国カリフォルニア州サンフランシスコ）を全ての解析に用いた。用いたナノＬＣカラムの勾配はＣａｐＬＣ ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）ポンプ（ウォーターズ社）によって提供される５０ｍｉｎ、０．３５μｌ／ｍｉｎでの５〜９５％アセトニトリル、０．２％蟻酸である。試料それぞれの解析を２つの手順で行った。第一の手順において、試料の５％をナノＬＣ ＭＳにより測量（ＭＳ専用）モードで行い、試料それぞれに存在するタンパク質全ての強度を定量化した。関連するペプチドは「定量化データ解析」に述べるように決定され、「目標リスト」に含まれた。第二の手順において、試料それぞれを質量分析装置に再注入し（５％）、目標リストに含まれるペプチドのみをナノＬＣ ＭＳ／ＭＳモードで配列決定した。ＭＳ／ＭＳスペクトルは２＋、３＋および４＋イオンのみで得られた。それからこれらをＰＥＡＫＳサーチエンジン（バイオインフォメティクスソリューションズ社、カナダ オンタリオ州）にかけ、ＮＣＢＩ非冗長トリプシン消化（２つの開裂を許容）ヒトデータベースに対して探索した。
【０１０９】
［ＭａｔｃｈＲｘソフトウェアを用いた量的データ解析］
試料それぞれのナノＬＣ ＭＳ生データから、個々のペプチドの存在度に対応するピーク強度を、初期に述べられたように（ハッカーニ他、ＦＡＳＥＢジャーナル、２００５年１１月；１９：１８０９〜２１）抽出した。ＭａｔｃｈＲｘソフトウェアを用いて全ての試料の間でペプチド強度を量的に比較した。ＦＣ５引落しに存在しＮＣ１１およびＰＢＳ引落しに存在しないペプチドは関連した。ＦＣ５から抽出されたプロテオミクスによって同定されたがＮＣ１１抗体カラムからはされなかったペプチドは以下である：
ＳＳＰＣＮＫ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １８）
ＬＩＥＲ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １９）
ＨＳＦＤＧＲＫＲ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ２０）
ＮＹＰＶＨＳＦＤＧＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２１）
これら全てのペプチドはＴＭＥＭ３０Ａタンパク質に属する。
【０１１０】
［例６．ＴＭＥＭ３０Ａの発現およびＦＣ５による認識］
次にＴＭＥＭ３０Ａタンパク質をクローニングし、発現させた。ＴＭＥＭ３０Ａ発現細胞の細胞溶解物内のＴＭＥＭ３０ＡのＦＣ５による認識を用い、ＴＭＥＭ３０ＡのＦＣ５による特異的認識を確認した。
【０１１１】
［ヒトＴＭＥＭ３０Ａ遺伝子のｐＴＴ５ＳＨ８Ｑ２ベクターへのクローニングによる哺乳類細胞内のその目標タンパク質の精製］
Ｃ末端Ｈｉｓ６タグに寄宿するｐＴＴ５ＳＨ８Ｑ２ベクターを、ＴＭＥＭ３０Ａ遺伝子のクローニングに用いた。クローニングのためのＰＣＲに用いたプライマーは以下である：
【０１１２】
［ＴＭＥＭ３０Ａ正］
【化１】
【０１１３】
［ＴＭＥＭ３０Ａ逆］
【化２】
【０１１４】
アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を追加したサークルグロウ（ＣｉｃｕｌｅＧｒｏｗ）液体培地中で生育した大腸菌ＤＨ５α株を用いてプラスミドを増幅し、マキシ／ギガ（Ｍａｘｉ／Ｇｉｇａ）プラスミド精製キット（キアゲン社）を用いて精製した。
【０１１５】
以下のプライマーを用いて配列を確認した：
ＴＭＥＭ３０Ａ−ＳＰ１
５’ ＴＣＴ ＣＧＡ ＴＣＴ ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＧＣ ３’ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ２４）
ＴＭＥＭ３０Ａ−ＳＰ２
５’ ＣＡＴ ＣＣＡ ＡＣＡ ＴＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ３１ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ２５）
ＴＭＥＭ３０Ａ−ＳＰ３
５’ ＣＧＧ ＡＴＧ ＡＴＣ ＴＴＧ ＡＧＣ ＡＣＴ ３’ （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ２６）
５０ ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）内での２６０ｎｍの紫外線吸収により、ＤＮＡ濃度を測定した。
【０１１６】
［ＴＭＥＭ３０Ａタンパク質の生産］
０．１％ プルロニック（登録商標）Ｆ−６８、１％ 子ウシ血清（ＢＣＳ）、５０μｇ／ｍｌ ジェネティシン（登録商標）Ｇ４１８、および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを追加した低カルシウムＳＦＭ（ＬＣＳＦＭ、インビトロジェン社、ニューヨーク州グランドアイランド）内において、エプスタイン−バーウイルス核抗原を安定して発現するヒト胚腎臓２９３細胞系（２９３Ｅ）を、浮遊培養として生育した。無血清細胞系ＨＥＫ２９３ ＳＦＥ（２９３ＳＦＥ）もまたＴＭＥＭ３０Ａ生産に用いた。これらの細胞を先に述べられたように（ファム他、２００３年）０．５％ＧＰＮ３を追加したＬＣ−ＳＦＭ内において生育した。全ての細胞経路を２０ｍｌの培地を含む１２５ｍｌエルレンマイアーフラスコ内で慣例的に行った。ＬＣ−ＳＦＭＬＢ、１０μｇ／ｍｌのジェネティシンおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む培養フラスコ内で浮遊する２９３ＳＦＥ細胞は対数期に維持された。培養フラスコを、３７℃、加湿された５％ＣＯ２大気中で１１０ｒｐｍで振動させた。
【０１１７】
［ＴＭＥＭ３０Ａの細胞溶解物内での発現］
図１３に示すように、１％セシト（Ｔｈｅｓｉｔ、登録商標）およびデオキシコールエステルを用いてＴＭＥＭ３０Ａを細胞から抽出した。抗ヒスチジン抗体を検出に用いた。ＴＭＥＭ３０Ａの予想Ｍｗｔは４０Ｋｄａで、約５０Ｋｄａの高タンパク質分子重量サイズはグリコシル化されるはずである。
【０１１８】
［ＴＭＥＭ３０ＡのＦＣ５との相互作用の免疫沈降による調査］
ＴＭＥＭ３０ＡとＦＣ５の相互作用の研究のため、ＴＭＥＭ３０Ａを発現するように転換されたＨＥＫ２９３からの１００μｇの上澄み細胞溶解物を最初に４℃でゆるやかな揺動と共に５０μｌ タンパク質Ａセファロース（５０％スラリー）を２時間インキュベートし、５００ｇで４分間回転することで透明にした。改良結合力を用いたＦＣ５の多重結合形態（改変五量体ＦＣ５）（２５μｇ）を透明にした上澄みに加え、４℃で一晩インキュベートした。タンパク質Ａセファロース（５０μｌ、５０％スラリー）を免疫結合溶解物に加え、４℃で２時間インキュベートした。それから免疫複合体を氷冷ＰＢＳで５回洗浄した。その後スラリーをレムリ緩衝剤中で５分間煮沸することで結合タンパク質を分離し、１４０００ｇで１分間遠心分離して免疫沈降したタンパク質を収集した。沈降したタンパク質を１２％ ＳＤＳアクリルアミドゲル上で分離し、それから銀染色することでバンドを視覚化した。
図１４に示すように、五量体ＦＣ５は分子量約５０のバンドでのみ免疫沈降し、図１３のタンパク質サイズが同定された。ＦＣ５五量体と共にインキュベートされなかった細胞はＴＭＥＭ３０Ａを免疫沈降しなかった。
【０１１９】
［７．ＦＣ５によるＴＭＥＭ３０Ａ媒介輸送の機能的競合］
ラット脳内皮細胞をカバーリップで３日間培養し、それからＦＣ５、五量体ＦＣ５または負対照抗体（ＮＣ１１）の存在下または非存在下で、アバンティ リピッド社から購入した１−パルミトイル−２−〔６−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４基）アミノ］ヘキサノイル〕−ＳＡ７−グリセロ−３−ホスホコリン（１６：０−０６：０ ＮＢＤ ＰＣ）（ＤＳＭＯに溶解）によって３７℃で３０分間処理した。それから細胞を広範囲に洗浄し４％ホルムアルデヒドで固定し、その後ＤＡＰＩを加えたダコ蛍光封入剤（１：２０００、２ｍｇ／ｍｌストックから）で処理した。全ての画像はアクシオバート（Ａｘｉｏｖｅｒｔ）２００及び以下の設定を用いて得られた：２０Ｘ対物レンズ、ＤＮＡ−ＤＡＰＩ（青） ８５ｍｓｅｃ、ＮＢＤ−ＦＩＴＣ（緑）２５０ｍｓｅｃである。
図１５に示す結果から、ＦＣ５およびその五量体Ｐ５が、ＮＢＤホスファチジルコリン（ＮＢＤ−ＰＣ）の内在化の減少より測定されるＴＭＥＭ３０Ａ生理機能と競合することが実証される。これに対し、負対照抗体ＮＣ１１はＮＢＤ−ＰＣの内在化を阻害しなかった。
【０１２０】
［材料および方法］
［材料］
細胞培養プラスチックはベクトン ディキンソン社（オンタリオ州ミシソーガ）から得た。ダルベッコ変法イーグル培地をインビトロジェン社（カリフォルニア州カールズバッド）、ＦＢＳをハイクローン社（ユタ州ローガン）、ヒト血清をウィゼント社（ケベック州モントリオール）、内皮細胞生育補給剤をコラボレーティブバイオメディカルプロダクツ社（マサチューセッツ州ベッドフォード）から購入した。抗体は以下の供給元から得た：抗ｃ−Ｍｙｃペルオキシダーゼ抗体をロッシュ社（アメリカ合衆国インディアナ州インディアナポリス）、抗カベオリンおよび抗クラスリン抗体をサンタクルス バイオテクノロジー社（カリフォルニア州サンタクルス）、ＦＩＴＣ結合抗マウスおよびアレクサ５６８結合抗ウサギ二次抗体をモレキュラープローブ社（アメリカ合衆国オレゴン州ユージーン）、テキサスレッド結合トランスフェリンおよびカルセイン−ＡＭをモレキュラープローブ社（アメリカ合衆国オレゴン州ユージーン）から購入した。モネンシンおよびビスインドリルマレイミド−１（ＢＩＭ）はカルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、アメリカ合衆国カリフォルニア州サンディエゴ）から得た。オプティプレップはアキュレイト ケミカル アンド サイエンティフィック社（アメリカ合衆国ニューヨーク州ウェストベリー）から購入した。精製ヒトトランスフェリン受容体およびモノクローナル抗ＣＤ７１（抗トランスフェリン受容体）抗体はリサーチ ディアゴノスティクス社（アメリカ合衆国ニュージャージー州フランダース）から購入した。［１４Ｃ］−スクロースはパーキン エルマー社（アメリカ合衆国マサチューセッツ州ボストン）から購入した。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）／過酸化水素基質システムはＲ＆Ｄシステムズ（ミネソタ州ミネアポリス）から得た。ＥＺリンク硫酸−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチンおよびビシンコニン酸検定（ＢＣＡ）はピアス バイオテクノロジー社（アメリカ合衆国イリノイ州ロックフォード）から購入した。他の全ての化学物質はシグマ社（アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイス）から得た。
【０１２１】
［ＦＣ５ｓｄＡｂのクローニング、発現および精製］
ＦＣ５はラマ重鎖抗体の可変領域（ＶＨＨ）であり、遺伝子銀行のｍＲＮＡおよびアミノ酸配列（それぞれＮｏ．ＡＦ４４１４８６およびＮｏ．ＡＡＬ５８８４６）をエンコードする。ＤＮＡエンコードＦＣ５をプラスミドｐＳＪＦ２のＢｂｓｌ／ＢａｍＨＩサイトへクローニングし、ＦＣ５の発現ベクターを生成した。ＤＮＡ構造は３７３Ａ ＤＮＡシーケンサーストレッチ（ＰＥアプライド バイオシステムズ社）での、プライマーｆｄＴＧＩＩＩ、５’−ＧＴＧＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＣＧＣＡＡＴＴＣＣＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２７）および９６ＧＩＩＩ、５’−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２８）を用いたヌクレオチド配列決定によって確認された。ＦＣ５はＨｉｓ５およびｃ−ｍｙｃタグとの融合で発現し、ハイトラップ キレーティング（ＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ、登録商標）カラムを用いた固定金属親和クロマトグラフィーによる精製、および免疫化学による検出を可能とした。組換え抗体発現バクテリア大腸菌株ＴＧ１の単クローンを用いて１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＭ９培地に接種し、培地を３７℃、２００ｒｐｍで一晩振動させた。５μｇ／ｍｌのビタミンＢ１、０．４％ カザミノ酸および１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＭ９培地（０．２％ グルコース、０．６％ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％ ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ ＮＨ４ＣＩ、０．０５％ ＮａＣＩ、１ ｍＭ ＭｇＣＩ２、０．１ ｍＭ ＣａＣＩ２）１Ｌへ、生育した細胞（２５ｍｌ）を移した。細胞培地を室温、２００ｒｐｍで２４時間振動させ、それから１２％ トリプトン、２４％ 酵母抽出物および４％ グリセロールを含む１０Ｘ誘導培地テリフィックブロス １００ｍｌを加えた。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、１ｍＭ）を加えることでタンパク質発現を誘導した。誘導の後で、培地をさらに２５℃で７２時間振動させ、ペリプラズム分画を浸透圧ショック法（アナンド他、１９９１年）によって抽出した。ハイトラップ キレーティング（ＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ、登録商標）カラム（アマシャム ファーマシア バイオテック社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いた固定金属親和クロマトグラフィーによってＦＣ５断片を分離した。生産されたＦＣ５を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝剤、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中、１０〜５００ｍＭ イミダゾール勾配において溶出し、ピーク分画を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝剤、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４に対し広範囲で透析した。ＦＣ５の分子量は１３．２ｋＤａで、ＦＣ５とｃ−ｍｙｃおよびＨｉｓ５との融合タンパク質の分子量は１５．２ｋＤａである。
【０１２２】
［ｃｙｓＦＣ５のクローニングおよび精製］
ＦＣ５は、薬剤および担体との結合が可能なように、追加の自由システインを加えるために作成された。ｓｄＡｂ ＦＣ５をエンコードするＤＮＡをプラスミドｐＳＪＦ２のＢｂｓｌ／ＢａｍＨＩサイトへクローニングし、単量体ＦＣ５の発現ベクターを生成した。ｃｙｓＦＣ５遺伝子をＦＣ５テンプレートから、Ｈｉｓ５’精製’タグコドンの直後にシステインを追加した正プライマーを用いて標準的ＰＣＲによって生成した。続いてｃｙｓＦＣ５遺伝子を、標準的なクローニング技法を用いてｐＳＪＦ２へクローニングした。クローンされた構造物の完全性は３７３Ａ ＤＮＡシーケンサーストレッチ（ＰＥアプライド バイオシステムズ社、オンタリオ州スツリーツビル）でのヌクレオチドシーケンスによって確認された。ｃｙｓＦＣ５は細菌の大腸菌株ＴＧ１で発現し、固定金属親和クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製された。ｃｙｓＦＣ５と相同であるとＳＤＳ−ＰＡＧＥで判定された分離された分画は蓄積され、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝剤（１５０ｍＭ ＮａＣＩ、３．４ ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に対し広範囲で透析された。タンパク質濃度はビシンコニン酸検定（ＢＣＡ）によって決定された。保存されたＣｙｓ２２−Ｃｙｓ９２内部ジスルフィド結合を損傷することなしに改変されていないシステインの完全な減少を確認するために、ｃｙｓＦＣ５を結合に優先してＧ−２５セファデックスカラムでの高速分離の後で４℃で一晩ＰＢＳ中で５ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ（２−カルボキシエチル）塩酸ホスフィンに暴露した。これらの条件は非損傷の細胞の上澄みおよびＣＥＣ単層を経ての移行によって決定されるｃｙｓＦＣ５の抗原結合活性を損傷しなかった。
【０１２３】
［ＨＲＰ−ＩｇＧのｃｙｓＦＣ５への結合］
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）タグマウスＩｇＧとｃｙｓＦＣ５との架橋結合が、架橋結合試剤としてのスルフォスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルフォ−ＳＭＣＣ）によって達成された。スルフォ−ＳＭＣＣはＨＲＰ−ＩｇＧ上のアミン（−ＮＨ２）機能グループとｃｙｓＦＣ５のｓｄＡｂ上のスルフォヒドリル（−ＳＨ）グループとの間に橋を構築する。まず、ＨＲＰ−ＩｇＧをＰＢＳ中の１０モル以上のスルフォ−ＳＭＣＣ溶液と共に室温で３０分間インキュベートすることでマレイミド活性化した。マレイミド試薬をＧ−２５セファデックスカラム（ロッシュ社、インディアナ州インディアナポリス）によって除去した。マレイミド活性化ＨＲＰ−ＩｇＧは減少されたｃｙｓＦＣ５と５：１モル濃度比で室温において１時間混合することで架橋結合された。
【０１２４】
［細胞培養物］
一次性のヒト大脳微少血管細胞（ＨＣＥＣ）培養物は、真性てんかんの影響を受けた脳の病巣周囲の領域から外科的に除去されたヒト側頭皮質から分離された。細胞を既に述べられたようにして分離、培養し特性を決定した（スタニミロビッチ（Ｓｔａｎｉｍｉｒｏｖｉｃ）他、１９９６年；ムルガナンダム（Ｍｕｒｕｇａｎａｎｄａｍ）他、１９９７年）。これらのＨＣＥＣ培養物の形態学、表現型、生化学および機能的特性は既に述べられている（スタニミロビッチ（Ｓｔａｎｉｍｉｒｏｖｉｃ）他、１９９６年；ムルガナンダム他、１９９７年）。ＨＣＥＣの経路２〜６をこの研究の実験に用いている。
【０１２５】
ＦＣ５および様々な薬理学試剤の存在下での生存力を、生体染色カルセインＡＭ放出検定によって先に述べられたように査定した（ワン他、１９９８年）。
ＦＣ５のＨＣＥＣへの取り込みは、５μｇ／ｍｌのＦＣ５を加えた後でエンドサイトーシスの様々な薬理的モジュレーターの不在または存在下において１５〜９０分間試験された。ＦＣ５の細胞分布を視覚化するために、ＦＩＴＣラベル抗マウスＩｇＧとのインキュベート（１：２５０、１時間）の後で細胞を固定、透過性化し、抗ｃ−ｍｙｃ抗体でプローブした（１：１００、１時間）。
【０１２６】
［生体外血液−脳隔壁モデルを経ての輸送］
ＨＣＥＣ（８００００細胞／膜）を１ｍｌの増殖培地中において０．５％ゼラチン被覆ファルコン組織培養インサート（孔径１μｍ；表面積０．８３ｃｍ２）に接種した。インサートアセンブリの底室は、胎児ヒト星状細胞条件基剤を体積比１：１で供給した２ｍｌの増殖培地を含んでいた（ムルガナンダム他、１９９７年）。モデルは分子量１ｋＤａ以上の親水性化合物に対し実質的に不浸透性であった（ムルガナンダム他、１９９７年）。
【０１２７】
輸送研究は既に述べられたようにして接種後に７日間行われた（ムルガナンダム他、１９９７年；ムルガナンダム他、２００２年）。フィルターインサートを輸送緩衝剤［５ｍＭ グルコース、５ｍＭ ＭｇＣＩ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むｐＨ７．４のリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）］でリンスし、３７℃で３０分間平衡させた。実験は、細胞、対照ＨＣＥＣまたは薬理的モジュレーターに３０分間暴露されたＨＣＥＣを除いた０．５％ゼラチン被覆インサートを含むインサートの頂端および側底に１０ｇ／ｍｌのＦＣ５を加えることで開始された。輸送研究は３７℃で、３０〜４０ｒｐｍで攪拌する回転台上のプレートにおいて行われた。部分標本（１００μｌ）を逆の室から様々な時間間隔において（５、１５、３０、６０、９０分）収集し、新しい緩衝剤に移した。空のインサートまたはＨＣＥＣ単層を経て輸送されたＦＣ５の量は酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によって決定された（下を参照）。ＨＣＥＣ膜の完全性の対照および細胞間拡散の評価のために、［１４Ｃ］−スクロースのＦＣ５輸送実験で用いられたものと同じ単層を経ての頂端から側底および側底から頂端のクリアランス率を事実上先に述べられたようにして決定し算出した（ムルガナンダム他、２００２年；ガーバーグ他、２００５年）。５０μｌの部分標本における試料関連放射能をマイクロベータ（登録商標）トリラックス液体シンチレーション計数器（ウォレス社、フィンランド）を用いて測定した。
【０１２８】
クリアランスはＣｌ（ｍｌ）＝ＣＡ／ＣＩｘＶＡとして算出され、ここでＣＩは供与体室の初期トレーサーまたはｓｄＡｂ濃度、ＣＡは受容体室のトレーサーまたはｓｄＡｂ濃度、ＶＡは受容体室の体積である。ＦＣ５のクリアランスは１５分から６０分の間において線形であり、６０分から９０分の間において飽和に達した（ムルガナンダム他、２００２年）。ＦＣ５移行での薬理的モジュレーターの効果は続いて３０分において査定された。ＨＣＥＣ単層は、同一のライブラリまたは同様の分子量の蛍光デキストランから分離された非選択ｓｄＡｂに対し実質的に不浸透性である（ムルガナンダム他、２００２年）。
【０１２９】
［レーザー走査共焦鏡検］
クラスリンまたはカベオリン−１によるＦＣ５のコローカリゼーションは二重免疫蛍光ラベルによって研究された。ＨＣＥＣをまず５μｇ／ｍｌ ＦＣ５と共に３０分間インキュベートし、洗浄し、４％ ホルムアルデヒドによって固定し、０．１％ トライトンＸ−１００により１０分間で透過性化した。それから細胞を４％ ヤギ血清により１時間で閉塞した。閉塞の後で、細胞をまず抗ｃ−Ｍｙｃ単層抗体（１：１００）と共に１時間インキュベートし、広範囲に洗浄し、それからＦＩＴＣ抗マウスＩｇＧ二次抗体（１：２５０）と共に１時間インキュベートした。４％ ヤギ血清での２回目の一晩の閉塞の後で、ＨＣＥＣを抗クラスリン（１：１００）または抗カベオリン−１（１：３００）ポリクローナル抗体と共に１時間インキュベートし、それからアレクサ５６８結合抗ウサギＩｇＧ二次抗体（１：３００）共に１時間インキュベートした。テキサスレッド結合トランスフェリン（１μＭ）およびカテプシン−Ｂモノクローナル抗体（１：２００）をそれぞれ初期および後期エンドソームのマーカーとして用いた。染色細胞のカバーガラスをＨＢＳＳで５回洗浄し、蛍光封入剤（ダコ社、オンタリオ州ミシソーガ）に封入した。
【０１３０】
二重の免疫化学で処理された細胞の画像化を、アルゴン／クリプトンイオンレーザーおよびプラン ネオフルオラ６３Ｘ １．３ＮＡ油浸対物レンズを装備したツァイスＬＳＭ４１０（カールツァイス社、ニューヨーク州ソーンウッド）反転レーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ）を用いて行った。２つのフッ素プローブの共焦画像が４８８および５６８ｎｍ励起レーザー線を用いた連続捕捉と同時に得られ、それぞれＦＩＴＣ（ＢＰ５０５〜５５０エミッション）およびテキサスレッド／アレクサ５６８蛍光（ＬＰ５９０エミッション）を検出した。全ての画像をそれぞれのチャネルについて同一のレーザー力およびピンホールサイズを用いて収集し、同じ方式で処理した。
一次抗体の省略では染色がなされなかった。一次および非対応二次抗体の間では交差反応は観測されなかった。
【０１３１】
［細胞分画］
タンパク質および脂質分画を分離するために、ＨＣＥＣをＰＢＳで洗浄し、掻取り凍結乾燥した。細胞残物をｐＨ７．２、５０ｍＭのトリスに溶解した。ヴェッセルおよびフリュッゲのプロトコルの改良版（ヴェッセル、１９８４年）を用いてクロロホルム−メタノール混合物によりタンパク質を脂質から分離した。窒素ガス流での脂質分画の乾燥の前に、ガラクトシルセラミドを正の対照として加えた。タンパク質および脂質を６Ｍの尿素およびエタノールにそれぞれ溶解した。
【０１３２】
界面活性剤を用いない方法を用いて既に述べられたようにして低濃度膜分画を分離した（アブルロブ（Ａｂｕｌｒｏｂ）他、２００４年）。全ての行程は４℃において行い、全ての緩衝剤はプロテアーゼ阻害剤のカクテル（シグマ社）を追加した。５μｇ／ｍｌ ＦＣ５存在下で３０分間インキュベートした融合ＨＣＥＣの５つの７５ｃｍ２組織培養フラスコから、原形質膜分画を調製した。個々のフラスコを１０ｍｌ 緩衝剤Ａ（０．２５Ｍスクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ， ２０ｍＭトリシン、ｐＨ７．８）で２回洗浄し、それから５ｍｌ 緩衝剤Ａ中で細胞を掻取って収集し、１４００×ｇ、５分間の遠心分離（ベックマンＪ−６８）でペレット化し、１ｍｌの緩衝剤Ａに再懸濁し、テフロングラスホモジナイザーによる２０回の上下動により均質化した。均質化した細胞を１０００×ｇ、１０分間で２回遠心分離し（エッペンドルフ遠心機５４１５Ｃ）、２つの核後上澄み分画を収集し、貯蔵し、緩衝剤Ａ中で２３ｍｌの３０％パーコール溶液に上乗せし、ベックマン（登録商標）６０Ｔｉにおいて８３０００×ｇ、３０分間で超遠心分離した。原形質膜分画を示すペレットを収集し毎秒５０Ｊ／Ｗで６回超音波処理した（フィッシャー ソニック ディスメンブレーター３００）。超音波処理した原形質膜分画を緩衝剤Ｂ（０．２５Ｍ スクロース、６ｍＭ ＥＤＴＡ、１２０ｍＭ トリシン、ｐＨ ７．８）中で５０％ オプティプレップと混合した（オプティプレップの最終濃度２３％）。溶液全体をベックマンＳＷ４１Ｔｉチューブの底に移し、線形２０〜１０％オプティプレップ勾配を上乗せし、ＳＷ４１Ｔｉ（ベックマン インストゥルメンツ社）を用いて５２０００×ｇ、９０分間で遠心分離した。勾配の上の５ｍｌを採取し緩衝剤Ｂ中で５０％ オプティプレップと混合し、ＳＷ４１Ｔｉチューブの底に移し、緩衝剤Ａ中で２ｍｌの５％ オプティプレップを上乗せし、５２０００×ｇ、９０分間で遠心分離した。５％界面の直上の不透明帯が"カベオラ分画"を示した。勾配を１．２５ｍｌ分画に分画した。
【０１３３】
［ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウエスタン免疫ブロット解析］
ＦＣ５、カベオリン−１およびクラスリン重鎖タンパク質の免疫ブロット検出のために、最終オプティプレップ勾配のそれぞれの分画を減少条件においてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に溶解した。分離されたタンパク質を電気泳動によりＰＶＤＦ膜（イモビロンＰ（登録商標）；ミリポア社、オンタリオ州ネピアン）へと移した。５％スキムミルクでの１時間の閉塞の後で、該膜を５％スキムミルクを含むＴＢＳ−トウェイン中でＨＲＰ結合抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（希釈１：１０００）、ポリクローナル抗カベオリン抗体（希釈１：５００）または抗クラスリン抗体（希釈１：５００）でプローブした。ＥＣＬプラスウエスタンブロッティング検出システムを信号検出に用いた。
【０１３４】
［酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）］
生体外ＢＢＢモデルを経て移行されたＦＣ５の量を測定するために、適当な区画から採取した５０μｌの部分標本をＨｉｓＧｒａｂニッケル被覆９６穴プレート（ピアス社）において室温で一晩で固定した。該プレートを２％ ＢＳＡで室温、２時間で閉塞した後、ＨＲＰ結合抗ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体を希釈１：５０００で１時間加えた。洗浄後、結合したＦＣ５をテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）／過酸化水素基質システムにより検出した。マイクロタイター プレートリーダーにおいて４５０ｎｍで信号を測定した。採取された部分標本のＦＣ５濃度を、既知のＦＣ５濃度を用いて構成された標準曲線から決定した。
【０１３５】
ＨＣＥＣのタンパク質および脂質分画へのＦＣ５結合を測定するために、分離された分画を３７℃、一晩の乾燥によりフレキシブル９６穴ＥＬＩＳＡプレート上に被覆した。該ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中で０．５％ ＢＳＡで２時間閉塞した。それからプレートをＦＣ５抗体またはガラクトシルセラミドに対するＯ１抗体（ドイツ ハイデルベルク大学のＪ．トッター博士より贈与）と共にインキュベートした。ＦＣ５抗体をマウス抗ｍｙｃ抗体９Ｅ１０で検出した。述べたようにこの検定をさらに実行した。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】光学画像化によって同定されたマウスへのｉ．ｖ．インジェクション後の脳内でのＦＣ５抗体の蓄積。 （Ａ）ＦＣ５またはＮＣ１１は赤外線プローブに近いＣｙ５．５へと結合し、それから６時間に渡って動物へと尾静脈によって注入された。頭の画像化によって、ＮＣ１１またはフルオロフォア単独に対しＦＣ５がより高く蓄積されていることが示された。（Ｂ）ＦＣ５、ＮＣ１１またはＣｙ５．５単独の注入後の、平均蛍光濃度の頭範囲の定量化。（Ｃ）ＦＣ５、ＮＣ１１またはＣｙ５．５単独の注入後の、全ての動物の背脳体の画像化。（Ｄ）ＦＣ５、ＮＣ１１またはＣｙ５．５単独の注入後の、平均蛍光濃度の器官範囲の定量化。（Ｅ）殺および潅流により脳内でのＦＣ５蓄積がより高いことを実証した後のＦＣ５、ＮＣ１１またはＣｙ５．５を注入した動物の生体外での脳の画像化。
【図２】血液―脳隔壁浸透性ｓｄＡｂ ＦＣ５と、ホースラディッシュペルオキシダーゼによってタグされたマウスＩｇＧ（ＩｇＧ−ＨＲＰ）との結合、および構造の生体外での機能評価の説明。［材料および方法］で述べるようにして遺伝子工学によって追加のシステイン成分をＦＣ５に加えた。Ａ）示される反応においてｃｙｓＦＣ５がマレイミド活性化ＩｇＧ−ＨＲＰと結合した。Ｂ・Ｃ）培地内のヒト脳内皮細胞内での、ＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｂ）あるいはＦＣ５−ＩｇＧ−ＨＲＰ結合（Ｃ）の取り込み。一方が結合した５μｇ／ｍｌの添加の後で細胞を３０分間固定した。［材料および方法］のＦＩＴＣラベル抗マウス二次抗体を用いて固定された細胞において取り込みが定量される。Ｄ）生体外血液―脳隔壁モデルを経てのＩｇＧ−ＨＲＰ（▲）またはＦＣ５−ＩｇＧ−ＨＲＰ結合（■）の移行。［材料および方法］で述べるようにして輸送実験が行われた。
【図３】Ａ）生体外血液―脳隔壁（ＢＢＢ）モデルを経てのＦＣ５の極性移行。［材料および方法］で述べるようにして輸送実験は１０μｇ／ｍｌ ＦＣ５の頂端部（Ａ→Ｂ）または側底部（Ｂ→Ａ）区画への添加で開始され、反対側の区画でのＦＣ５の量は３０分後に定量された。同じＨＣＥＣ単分子層を経ての１４Ｃスクロースの配送を細胞間輸送の内部制御として用いた。Ｂ）生体外ＢＢＢモデルを経てのＦＣ５移行における吸着媒介エンドサイトーシス（ＡＭＥ）および微小貪喰作用の薬理的阻害剤の効果。［材料および方法］で述べるようにしてＨＣＥＣは、ＡＭＥ阻害剤、硫化プロタミン（４０μｇ／ｍｌ）およびポリリジン（３００μＭ）、または微小貪喰作用阻害剤、アミロライド（５００μＭ）によって３０分間前処理され、ＦＣ５輸送は３０分間に渡って測定された。それぞれの棒は６つの複製膜からの±ｓ．ｄ．を示す。
【図４】ＨＣＥＣへのＦＣ５取り込みおよび生体外ＢＢＢモデルを経ての移行のエネルギー依存。３７℃（Ａ）および４℃（Ｂ）でのＦＣ５のＨＣＥＣへの取り込みの共焦鏡検画像。［材料および方法］で述べるようにして細胞を５μｇ／ｍｌ ＦＣ５に３０分間暴露し、ＦＣ５のｃ−ｍｙｃ標識の二重免疫化学で処理した。Ｃ）３７℃および４℃でのＨＣＥＣを経ての、あるいは無グルコース培地内でのＨＣＥＣの５ｍＭのＮａＮ３および５ｍＭのデオキシグルコース（２ＤＧ）への３０分間の暴露後の、１０μｇ／ｍｌ ＦＣ５の細胞間移行。［材料および方法］で述べるようにしてＦＣ５移行はＨＣＥＣ添加の３０分後に定量された。Ｄ）ＨＣＥＣを経てのＦＣ５の細胞間移行におけるＮａ＋，Ｋ＋−ＡＴＰアーゼ阻害剤、ウアバインの効果。［材料および方法］で述べるようにして細胞は１μＭのウアバインで３０分間前処理された。それぞれの棒は６つの複製膜からの±ｓ．ｄ．を示す。アスタリスクは３７℃または未処理細胞からの有意差を示す（Ｐ＜０．０５；スチューデントｔ−検定）。
【図５】ＨＣＥＣ内のＦＣ５のエンドサイトーシスおよびトランスサイトーシスにおける、クラスリン被覆穴およびカベオラの役割。ＦＣ５（緑蛍光）（Ａ）およびクラスリン（赤蛍光）（Ｂ）のＨＣＥＣ細胞内でのコローカリゼーション。オーバーレイ画像が（Ｃ）に示される。ＦＣ５（緑蛍光）（Ｄ）およびカベオリン１（赤蛍光）（Ｅ）のコローカリゼーション。オーバーレイ画像が（Ｆ）に示される。［材料および方法］で述べるようにして二重の免疫細胞化学のために細胞をＦＣ５に３０分間暴露し、洗浄し処理した。画像は３〜５の別途の実験を示す。Ｇ）ＦＣ５に３０分間暴露したＨＣＥＣから得られた亜細胞分画内の、カベオリン−１、ＦＣ５およびクラスリン重鎖の免疫反応の分布を示すウエスタンブロット。［材料および方法］で述べるようにしてＨＣＥＣ細胞を分画した。ウエスタンブロットは３つの別途の実験を示す。Ｈ）生体外ＢＢＢモデルを経てのＦＣ５の移行における、カベオラ媒介エンドサイトーシスの薬理学的阻害剤、メチル−β−シクロデキストリン（５ｍＭ）、ナイスタチン（５μｇ／ｍｌ）およびフィリピン（５μｇ／ｍｌ）、またはクラスリン被覆穴媒介エンドサイトーシスの阻害剤、クロルプロマジン（５０μｇ／ｍｌ）または無カリウム緩衝剤の効果。［材料および方法］で述べるようにしてヒトＣＥＣは前記阻害剤とともに３０分間前処理され、ＦＣ５輸送は３０分間にわたって測定された。それぞれの棒は６つの複製膜からの±ｓ．ｄ．を示す。アスタリスクは有意差を示す（Ｐ＜０．０５；一要因分散分析、手段間のダネットの多重比較による）。
【図６】エンドソーム内でのＦＣ５処理。ＦＣ５（緑蛍光）（Ａ）およびテキサスレッド（登録商標）結合トランスフェリン（赤蛍光）（Ｂ）のＨＣＥＣ細胞内でのコローカリゼーション。オーバーレイ画像が（Ｃ）に示される。内在化ＦＣ５（緑蛍光）（Ｄ）およびカテプシン−Ｂ（赤蛍光）（Ｅ）のＨＣＥＣ細胞内でのコローカリゼーション。オーバーレイ画像が（Ｆ）に示される。［材料および方法］で述べるようにしてＣＥＣは免疫化学および共焦鏡検のために処理される。Ｇ）ＨＣＥＣ生体外ＢＢＢモデルを経てのトランスサイトーシスの前（上）と後（下）のＦＣ５のウエスタンブロット。Ｈ）２５μＭ モネンシンによって３０分間前処理されたＨＣＥＣを経ての、１０μｇ／ｍｌ ＦＣ５の細胞間移行。［材料および方法］で述べるようにして輸送実験が行われた。
【図７】Ａ）ＨＣＥＣを経てのＦＣ５トランスサイトーシスにおける細胞骨格ネットワークの役割。［材料および方法］で述べるようにして、アクチン微細繊維阻害剤、サイトカラシンＤ（０．５μＭ）またはラトランキュリンＡ（０．１μＭ）、あるいは微小管阻害剤、ノコダゾール（２０μＭ）またはコルヒチン（２０μＭ）とともにＨＣＥＣを３０分間前処理し、生体外ＢＢＢモデルを経てのＦＣ５移行は３０分間にわたって測定された。Ｂ）１０μｇ／ｍｌのＦＣ５を加える３０分前に、ＨＣＥＣに通信経路モジュレーター、ウォルトマニン（０．５μＭ）、ＢＩＭ−１（５μＭ）、ゲニステイン（５０μＭ）またはｄｂｃＡＭＰ（５００μＭ）を加え、生体外ＢＢＢモデルを経てのトランスサイトーシスは３０分間にわたって測定された。それぞれの棒は６つの複製膜からの±ｓ．ｄ．を示す。アスタリスクは対照からの有意差を示す（Ｐ＜０．０５；一要因分散分析、手段間のダネットの多重比較による）。
【図８】ＨＣＥＣに取り込まれＨＣＥＣを経てトランスサイトーシスされるＦＣ５内のオリゴ糖抗原性エピトープの役割。Ａ〜Ｄ）不在（Ａ）または１００μｇ／ｍｌ ＷＧＡ（Ｂ）、２００μＭ シアル酸（Ｃ）あるいは０．１Ｕ ノイラミニダーゼ存在下での、ＨＣＥＣに取り込まれたＦＣ５の蛍光顕微鏡写真。取り込みは３０分間にわたって測定された。Ｅ）３０分間にわたって２００μＭのシアル酸によって前処理された、あるいはノイラミニダーゼ濃度を示されたＨＣＥＣを経ての、１０μｇ／ｍｌ ＦＣ５のトランスサイトーシス。Ｆ）１００μｇ／ｍｌ ＷＧＡ、１００μｇ／ｍｌ セイヨウニワトコ凝集素（ＳＮＡ）または１００μｇ／ｍｌ イヌエンジュ凝集素（ＭＡＡ）によって前処理されたＨＣＥＣを経ての、１０μｇ／ｍｌ ＦＣ５のトランスサイトーシス。［材料および方法］で述べるようにして輸送実験が行われた。Ｇ）酵素結合免疫吸着検定法によって定量されたＨＣＥＣの分離されたタンパク質（黒い棒）および脂質（灰色の棒）の分画とのＦＣ５の結合。分画の前に、溶解した細胞を不在または１Ｕ／ｍｌ ノイラミニダーゼ存在下において３７℃、１時間インキュベートした。［材料および方法］で述べるようにして、分離されたタンパク質および脂質での酵素結合免疫吸着検定法が行われた。それぞれの棒は６つの複製膜からの±ｓ．ｄ．を示す。アスタリスクは対照からの有意差を示す（Ｐ＜０．０５；一要因分散分析、手段間のダネットの多重比較による）。
【図９】生体外ＢＢＢを経てのＦＣ５トランスサイトーシスに伴うトランスフェリン受容体の欠乏。Ａ）アンチトランスフェリン受容体モノクローナル抗体、ＣＤ７１、ＦＣ５、ＦＣ５五量体構成（Ｐ５）または炭水化物抗原、ＣＥＡを認識する同じライブラリからの無関連抗体の、酵素結合免疫吸着検定法プレートに固定されたヒトトランスフェリン受容体への結合。プレートは自動マイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍにおいて読み取られた。Ｂ）Ｐ５ではなく抗ＣＤ７１によって免疫的に検出されたヒトトランスフェリン受容体のウエスタンブロット。Ｃ）１０μｇ／ｍｌ ＦＣ５単独または１００倍（１ｍｇ／ｍｌ）のホロトランスフェリン存在下でのＨＣＥＣ単層を経てのトランスサイトーシス。［材料および方法］で述べるようにして輸送は３０分間にわたって測定された。それぞれの棒は６つの複製膜からの±ｓ．ｄ．を示す。
【図１０】ＦＣ５抗原同定に用いるゲノムおよびプロテオーム戦略の組み合わせ。
【図１１】推定のＦＣ５抗原の組織分布。
【図１２】様々な細胞種でのＴＭＥＭ３０Ａ遺伝子発現。
【図１３】ＨＥＫ２９３細胞でのＴＭＥＭ３０Ａ遺伝子発現。
【図１４】ＴＭＥＭ３０Ａ過剰発現細胞の細胞溶解物における、ＦＣ５によるＴＭＥＭ３０Ａの認識。
【図１５】ＦＣ５によるヒト大脳内皮細胞でのホスファチジルコリンのＴＭＥＭ３０Ａ媒介膜間輸送の競合。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液―脳隔壁を経てのＴＭＥＭ３０Ａ媒介移行が可能な試剤の識別方法であって、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のアミノ酸６７〜３２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４のアミノ酸６７〜２８７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５のアミノ酸１〜２０４からなる集団から選択された、少なくとも７５％のアミノ酸配列が同定されたペプチドを有する試剤のインキュベート、および
該試剤と該ペプチドとの間の結合の検出からなることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記試剤は抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試剤は単一領域抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試剤は単鎖抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試剤はペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記試剤は低分子であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドは少なくとも７５％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のアミノ酸６７〜３２３と同定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも７５％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のアミノ酸６７〜３２３と同定されることを特徴とする、精製または分離されたペプチド。
【請求項９】
少なくとも７５％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のアミノ酸１〜３６１と同定されることを特徴とする、請求項６に記載のペプチド。
【請求項１０】
少なくとも７５％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２のアミノ酸１４１〜１２２６と同定されることを特徴とする、精製または分離された核酸分子。
【請求項１１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のアミノ酸６７〜３２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４のアミノ酸６７〜２８７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５のアミノ酸１〜２０４からなる集団から選択されたアミノ酸配列の連続した６以上のアミノ酸からなることを特徴とする、精製または分離されたペプチド。
【請求項１２】
前記アミノ酸はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のアミノ酸６７〜３２３であることを特徴とする、請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
血液―脳隔壁を経てのＴＭＥＭ３０Ａ媒介移行が可能な抗体の生成方法であって、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のアミノ酸６７〜３２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４のアミノ酸６７〜２８７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５のアミノ酸１〜２０４からなる集団から選択された、連続した６以上のアミノ酸からなる精製または分離されたペプチドと、目標物とのインキュベート、
該ペプチドに対する免疫反応を該目標物において生成する適当な賦形剤、および
該目標物からの抗体の回収からなることを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記目標物はヒトではない動物であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＴＭＥＭ３０Ａとの相互作用が可能な試剤の同定方法であって、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のアミノ酸６７〜３２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４のアミノ酸６７〜２８７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５のアミノ酸１〜２０４からなる集団から選択された、少なくとも７５％のアミノ酸配列が同定されたペプチドと、関連する試剤とのインキュベート、および
該試剤と該ペプチドとの間の結合の検出からなることを特徴とする方法。
【請求項１】
血液―脳隔壁を経てのＴＭＥＭ３０Ａ媒介移行が可能な試剤の識別方法であって、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のアミノ酸６７〜３２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４のアミノ酸６７〜２８７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５のアミノ酸１〜２０４からなる集団から選択された、少なくとも７５％のアミノ酸配列が同定されたペプチドを有する試剤のインキュベート、および
該試剤と該ペプチドとの間の結合の検出からなることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記試剤は抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試剤は単一領域抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試剤は単鎖抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試剤はペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記試剤は低分子であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドは少なくとも７５％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のアミノ酸６７〜３２３と同定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも７５％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のアミノ酸６７〜３２３と同定されることを特徴とする、精製または分離されたペプチド。
【請求項９】
少なくとも７５％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のアミノ酸１〜３６１と同定されることを特徴とする、請求項６に記載のペプチド。
【請求項１０】
少なくとも７５％がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２のアミノ酸１４１〜１２２６と同定されることを特徴とする、精製または分離された核酸分子。
【請求項１１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のアミノ酸６７〜３２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４のアミノ酸６７〜２８７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５のアミノ酸１〜２０４からなる集団から選択されたアミノ酸配列の連続した６以上のアミノ酸からなることを特徴とする、精製または分離されたペプチド。
【請求項１２】
前記アミノ酸はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のアミノ酸６７〜３２３であることを特徴とする、請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
血液―脳隔壁を経てのＴＭＥＭ３０Ａ媒介移行が可能な抗体の生成方法であって、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のアミノ酸６７〜３２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４のアミノ酸６７〜２８７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５のアミノ酸１〜２０４からなる集団から選択された、連続した６以上のアミノ酸からなる精製または分離されたペプチドと、目標物とのインキュベート、
該ペプチドに対する免疫反応を該目標物において生成する適当な賦形剤、および
該目標物からの抗体の回収からなることを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記目標物はヒトではない動物であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＴＭＥＭ３０Ａとの相互作用が可能な試剤の同定方法であって、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３のアミノ酸６７〜３２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４のアミノ酸６７〜２８７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５のアミノ酸１〜２０４からなる集団から選択された、少なくとも７５％のアミノ酸配列が同定されたペプチドと、関連する試剤とのインキュベート、および
該試剤と該ペプチドとの間の結合の検出からなることを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２００９−５０９５０３（Ｐ２００９−５０９５０３Ａ）
【公表日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３１４９３（Ｐ２００８−５３１４９３）
【出願日】平成１８年９月１５日（２００６．９．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００６／００１５２２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３６０２１
【国際公開日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【出願人】（５０８０９０７２３）ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月１５日（２００６．９．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００６／００１５２２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３６０２１
【国際公開日】平成１９年４月５日（２００７．４．５）
【出願人】（５０８０９０７２３）ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ (1)
【Ｆターム（参考）】
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