表面に固定された小胞の多層構造
表面上に固定された少なくとも１個のリンカー（４）を含み、前記少なくとも１個のリンカー（４）が、別の小胞（２）に付着した別のリンカー（５）に結合した別のリンカー（５）を場合によっては有していてもよい小胞に付着した少なくとも１個の他のリンカーに結合され、前記表面に固定された多層構造が、リンカー（５）によって互いに結合された少なくとも２個の小胞（２）、又は前記表面（１）上に固定された１個のリンカー（４）に小胞に付着したリンカー（５）によって結合された少なくとも２個の小胞（２）のどちらかを含む、複数の小胞（２）の表面固定多層構造。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、
−表面に固定された複数の無処置の小胞の多層構造、
−かかる多層構造を生成する方法及び手段、
−生物分析センサー用途におけるかかる多層構造の使用
に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、ヌクレオチドハイブリッド形成、抗体−抗原認識、薬物−受容体相互作用などを含めて、生体認識現象の詳細な分析に適合した生物分析センサー概念の改善が強く求められている。一般的な一手法においては、固定受容体（プローブ）によって認識される分析分子（標的）は、例えば、蛍光性化合物又は放射性化合物によって標識される。次第に重要度が増してきた別の手法においては、生体認識現象は、外部標識を導入せずに記録される。非標識検出に対する要求は、（ｉ）複雑な混合物から検出される分子は、迅速で再現性のある均一な方法で標識２５するには複雑であり、（ｉｉ）標識は、実際の生体認識現象を妨害することがあり、（ｉｉｉ）結合動力学からの情報は一般に得ることができず、したがって親和性及び濃度の決定を複雑にするという知見に主に起因する。最近、この方面においてかなりの進展がなされ、様々な生体認識現象の非標識高感度検出が可能になった。かかる分析方法には、ＳＰＳ／ＳＰＲ表面プラズモン分光法／共鳴）、（Ｒｉｃｈ及びＭｙｓｚｋａ ２０００）偏光解析法、ＯＷＬＳ（光導波路分光法）などの光学的方法、（Ｒａｍｓｄｅｎ １９９３）ＱＣＭ（水晶発振子微量天秤）、ＳＡＷ（表面弾性波）などの圧電方法（Ｊａｎｓｈｏｆｆ等 ２０００）及びＳＰＦＳ（表面プラズモン励起蛍光分光法）（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ及びＫｎｏｌｌ ２０００）、蛍光画像処理（Ｎｉｅｍｅｙｅｒ及びＢｌｏｈｍ １９９９）などの蛍光方法がある。これらのうち、ＳＰＲは最も普及した技術である（Ｒｉｃｈ及びＭｙｓｚｋａ ２０００。金表面と液体、一般に水溶液との界面における屈折率の変化を高感度で検出することができる新規光学設計を除いて、この技術は、少量の試料を取扱うマイクロ流体工学、及びパターン化された表面の画像処理に適合する。（Ｊｏｒｄａｎ等 １９９７）また、様々なタイプの生体分子を効率的に固定するように設計された様々な金表面改変プロトコルが成功裏に開発された。
【０００３】
しかし、抗体、多数の酵素などの水溶性タンパク質及びオリゴヌクレオチドを固定するために開発されたプロトコルは、効率的で信頼できることが証明されたが、膜タンパク質は取り扱いがより厄介であることが判明した。固体担体上に支持された細胞膜模倣物は、例えば、光合成、呼吸及び神経生物学の基礎的な機能研究に役立つので、これは、実際に極めて厄介な問題である。
【０００４】
また、膜タンパク質、特に膜貫通タンパク質は、タンパク質の重要なクラスを構成しているので、この難解な問題は、薬物の大多数が膜タンパク質を対象とするからでは全くなく、薬学的応用分野に関しても極めて重要である。膜タンパク質を適正に取扱う際の基本的な障害は、膜タンパク質が、水溶性タンパク質とは対照的に、疎水性膜セグメントを有し、タンパク質がその本来のコンホメーションを維持するために水から遮蔽されなければならないことに起因する。この遮蔽は、タンパク質を水溶液に可溶であるように維持する界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を使用することによって、又は好ましくは、例えば、リポソーム、平面状の支持された二重層などの細胞膜模倣構造中にタンパク質を再構成することによって実施することができる。これは、固定戦略に対して大きな要件となる。組み込まれた膜タンパク質を含めて、固体担体上の脂質二重層構築体の固定化に適合する戦略を開発するために、いくつかの戦略が開発された。最も直接的な戦略は、ＳｉＯ２、ガラス又はマイカ表面の平面状支持二重層への無処置の小胞の自発的な吸着、分解及び融合を利用する（Ｂｒｉａｎ及びＭｃＣｏｎｎｅｌｌ １９８４；Ｂｕｒｇｅｓｓ等 １９９８；Ｇｉｚｅｌｉ等 １９９７；Ｇｒａｎｅｌｉ等 ２００３；Ｇｒｉｔｓｃｈ等 １９９８；Ｈｅｙｓｅ等 １９９８；Ｋａｌｂ及びＴａｍｍ １９９２；Ｌｉｎｄｈｏｌｍ−Ｓｅｔｈｓｏｎ １９９８；Ｓａｌａｆｓｋｙ等 １９９６。しかし、平面状支持二重層に組み込まれた膜タンパク質の水溶性部分は、固体担体と直接相互作用する傾向にあるので、この戦略は、タンパク質の移動度及び活性に悪影響を及ぼすことが判明した（Ｓａｌａｆｓｋｙ等 １９９６）。また、タンパク質が裸で存在すると、実際の二重層形成プロセスを妨害することもある。（Ｇｒａｎｅｌｉ等 ２００３）前者の問題を回避する有望な一方法は、タンパク質と固体担体の間にスペーサー又はクッション（不活性軟質ポリマーであることが多い）を使用すること（Ｎａｕｍａｎｎ等 ２００２；Ｗａｇｎｅｒ及びＴａｍｍ ２０００）及び欧州特許第０７８４７９３９号；或いは表面に小さな空洞を広げる膜を作製することである（Ｓｃｈｍｉｄｔ等 ２０００。しかし、膜の両側に電気的に直接接することが必須ではない場合には３５、固定された無処置の小胞を使用することによって、膜タンパク質の機能に対する固体担体の影響に関わる諸問題を回避することができ（Ｃｏｏｐｅｒ等 ２０００；Ｓｖｅｄｈｅｍ等 ２００３）、実際の二重層形成プロセスに対する膜タンパク質の影響に関わる問題を回避することができる（Ｇｒａｎｅｌｉ等 ２００３）。（ｉ）固体担体（例えば、Ａｕ、ＴｉＯ２、Ｐｔ）との自発的な結合（Ｋｅｌｌｅｒ及びＫａｓｅｍｏ １９９８；Ｒｅｉｍｈｕｌｔ等 ２００２）、（ｉｉ）表面にある機能要素の一タイプに特異的に結合するように設計された小胞（例えば、ストレプトアビジン被覆表面に結合したビオチン改変脂質を含む小胞（Ｊｕｎｇ等 ２０００；Ｍｉｃｈｅｌ等 ２００２）又は抗体−抗原結合を含む小胞（ＭａｃＫｅｎｚｉｅ，１９９７）中の脂質画分、（ｉｉｉ）トランスデューサー表面に固定された疎水性タグ、（Ｃｏｏｐｅｒ等 ２０００）、或いは（ｉｖ）ＤＮＡ改変表面に特異的に結合するためのＤＮＡ改変小胞、（Ｐａｔｏｌｓｋｙ等 ２０００）を利用して小胞をトランスデューサー表面に固定することができる方法も、アレイ形式に適合することが実証された。（Ｓｖｅｄｈｅｍ等 ２００３）
【０００５】
また、平面状支持脂質二重層と比較して、さらには、制御流れ条件下の界面活性剤枯渇を使用して平面状支持脂質二重層における固定膜タンパク質の濃度を増加させる戦略と比較しても、固定小胞を使用すると、単位表面積当たりに固定され得る標的部位（例えば、膜タンパク質）候補数が増加する。（Ｋａｒｌｓｓｏｎ及びＬｏｆａｓ ２００２；Ｋａｒｌｓｓｏｎ及びＬｏｆａｓ ２００２）しかし、大きな親水性ドメインを有する膜タンパク質を高濃度でリポソームに組み込むことは、膜タンパク質が凝集し易く、活性を失い易いので一般に困難である（例えば（Ｒｉｃｈａｒｄ等 １９９０及びその中の参考文献を参照されたい）。
【０００６】
したがって、固定小胞を使用する場合でも、タンパク質の表面濃度は比較的低く維持されなければならないことが多い。したがって、固定膜タンパク質の量をその機能に重大な影響を及ぼさずに増加させる戦略を開発することは極めて重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、溶液中の膜固定化合物（プローブ）と分析化合物（標的）の相互作用部位の数が少ない上述の問題が、一般に、
バイオセンサー用途における低シグナルをもたらし、
効率的な分子フィッシング（ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｆｉｓｈｉｎｇ）用フィルターを生成する部位を過度に少なくし、
これらの問題の両方が、かかる分析化合物に結合することができる表面固定プローブの数を増加させることによって解決し得るという洞察に基づく。
【０００８】
したがって、本発明の一目的は、標識検出又は非標識検出を利用した検出用途において、膜結合性成分と分析物の結合及び／又は膜結合性成分からの分析物の放出の検出感度を改善することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、いくつかの用途に有利であるとされている、表面に近い溶液の捕捉（又は制御）体積を増加させることである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１の一般的な実施態様においては、本発明は、前記表面から十分離隔した複数の小胞を含む生物学的に機能的な表面固定多層構造に関する。これらの小胞は、表面固定リンカーと小胞付着（外側に突出した）リンカーによって前記構造に直接付着し、かかる小胞付着リンカーによって別の小胞に場合によっては直接付着してもよい。これらの小胞は、生物活性化合物を含み、それによってその生物学的機能を有する構造が提供される。
【００１１】
第１の態様においては、多層構造は、２個の小胞が各表面固定リンカーに付着するように、小胞付着リンカーによって表面固定リンカーに直接付着した小胞を有する。ここで、各小胞付着リンカーは、別の小胞付着リンカーではなく、表面固定リンカーに結合するようになされる。
【００１２】
第２の態様においては、小胞は、表面固定リンカー及び小胞付着リンカーによって多層構造に付着し、それによって２個以上の小胞層を含む構造が提供される。したがって、これらの構造は、表面固定リンカーに直接連結された小胞の１層と、小胞付着リンカー間の連結によって形成される小胞−小胞層の１個又はいくつかの後続層とを含む。
【００１３】
第２の一般的な実施態様においては、生物学的に機能的な表面固定多層構造は、表面から十分離隔した複数の小胞を含み、小胞は、小胞付着リンカーによって表面固定リンカーに沿って直接付着し、少なくとも２個の小胞が小胞付着リンカーによって各リンカーに付着する。各小胞付着リンカーは、表面固定リンカーには結合するが、別の小胞付着リンカーには付着しないようになされている。この実施態様によれば、生物学的機能は、小胞付着リンカーに付着していない表面固定リンカーの領域に由来し得る。追加又は相補的な生物学的機能は、前記構造に付着した小胞に含まれる化合物に由来し得る。
【００１４】
第３の実施態様によれば、本発明の複数の小胞を含む生物学的に機能的な表面固定多層構造は、表面固定化によって前記構造に直接付着し、小胞付着リンカーによって別の小胞に直接付着する小胞を有する。少なくとも選択小胞集団は生物活性化合物を含み、それによってその生物学的機能を有する前記構造が提供される。より具体的には、小胞の生物活性化合物は、表面近傍においてそれらの生理活性に障害を生じ、又は悪影響を及ぼし得る。その結果、第１の層、又は表面に最も近い層を、生物活性化合物を含まない小胞で形成させることが望ましい用途もある。或いは、すべての小胞が生物活性剤を含むこともできる。第３の実施態様の一態様においては、多層構造を解釈するために、小胞の表面固定化には、別の小胞付着リンカーに結合可能な少なくとも１個の小胞付着リンカーを有する直接表面付着用の第１の小胞集団が必要である。脂質小胞の直接表面付着は、当業者には十分に確立された技術である。かかる付着を実施する適切な一方法は、Ｃｏｏｐｅｒ等（２０００）に概説された、表面に固定された疎水性表面タグを使用することである。
【００１５】
本発明は、複数の小胞の表面固定多層構造を生成する方法、その構造自体、並びにバイオセンシング、送達及びフィルター用途におけるかかる構造の使用にも関する。
【００１６】
より具体的には、多層構造形成方法は、
（ｉ）少なくとも１個の小胞付着リンカーに結合するようになされ、少なくとも１個の小胞付着リンカーとの結合に利用可能である少なくとも１個の表面固定リンカー、又は１個以上の小胞付着リンカーを各々が備える直接表面固定小胞の第１の層のどちらかを含む表面を用意し、
（ｉｉ）表面固定リンカー又は別の小胞付着リンカーに直接結合するようになされ、表面固定リンカー又は別の小胞付着リンカーとの直接結合に利用可能である少なくとも１個の外側に突出した小胞付着リンカーを各々が含む小胞を用意し、
（ｉｉｉ）表面固定リンカーとの、又は前記構造にすでに固定された小胞付着リンカーとの小胞付着リンカーの直接的結合を促進する条件下で前記小胞の少なくとも１個と前記表面をインキュベートし、その結果
（ｉｖ）別の小胞付着リンカー（５）との結合に利用可能である少なくとも１個の構造固定リンカー及び／又は表面固定リンカーをこの段階の後に含む前記構造に小胞及び小胞結合リンカーが固定され、
（ｖ）小胞（２）の所望の量が前記構造に固定されるまで前の段階又は前の２段階を繰り返す
各段階を含む。
【００１７】
（図１に示す）本発明の方法の一実施態様においては、少なくとも２個の別のリンカーに結合するようになされ、少なくとも２個の別のリンカーとの結合に利用可能であるいくつかのリンカー（表面リンカー）が表面に固定される。別のリンカー（小胞リンカー又は表面リンカー）に結合するようになされ、別のリンカー（小胞リンカー又は表面リンカー）との結合に利用可能である少なくとも１個の外側に突出した小胞付着リンカー（小胞リンカー）が各小胞に付着する。前記小胞と前記表面は、小胞付着リンカーが表面固定リンカーに直接結合し、それによって小胞が前記表面固定リンカー、したがって前記表面に固定される条件下で一緒にインキュベートされる。表面固定リンカーは、異なる部分に対する異なる付着リンカーによって小胞に結合するようにすることができるので、いくつかの小胞は、一段階で固定することができる。
【００１８】
本発明の方法の別の実施態様においては（図２）、別のリンカーに結合するようになされ、別のリンカーとの結合に利用可能である少なくとも１個のリンカー（表面リンカー）が表面に固定される。別のリンカー（小胞リンカー又は表面リンカー）に結合するようになされ、別のリンカー（小胞リンカー又は表面リンカー）との結合に利用可能である少なくとも１個の外側に突出した小胞付着リンカー（小胞リンカー）が各小胞に付着する。前記小胞と前記表面は、小胞リンカーが表面リンカーに結合することができ、結合すると、小胞が前記表面リンカー、したがって前記表面に表面の第１の小胞層として固定される条件下で一緒にインキュベートされる。この手順は繰り返すことができ、新しい小胞、前記表面にすでに固定された小胞に付着したリンカーとリンカーの結合を促進し、したがって前記表面の固定小胞の後続層を形成する条件下で、新しい小胞を前記表面と一緒にインキュベートすることができる。
【００１９】
本発明の方法のさらなる実施態様においては、第１の小胞層は、従来の方法によって表面に直接付着される。かかる第１の層の小胞は、表面付着に適合することができ、又は表面付着に対して官能性を持たせることができ、或いは、表面は、疎水性タグによって適合される。隣接表面が、小胞に含まれ前記構造を生体機能性にする生物学的化合物に障害を与え、又は悪影響を及ぼすと考えられる場合には、この実施態様の一態様においては、第１の層の小胞は、生物学的化合物を含まない第１の小胞集団を構成することができる。この側面によれば、次に続く層は、生物学的薬剤を含む小胞を含む。小胞の後続層は、上で説明された小胞付着リンカーによって形成される。
【００２０】
本発明の一部の実施態様においては、生物学的に又は別の方法では化学的に活性な化合物は小胞の脂質二重層を伴う。この化合物は、例えば、天然若しくは合成タンパク質、ポリペプチド又はペプチドとすることができ、炭水化物とすることができ、設計された脂質とすることができ、特定の細胞又は組織タイプに特徴的な細胞表面タンパク質、病原体、腫瘍細胞、生体細胞（ｖｉｔａｌｌｙ ｃｅｌｌ）などの表面タンパク質などの細胞表面タンパク質とすることができる。小胞は、細胞などによっても産生することができる。
【００２１】
本発明の別の実施態様においては、色素、薬物又は他の生物学的若しくは他の方法においては化学的に活性な化合物が固定小胞の内部体積に含まれる。
【００２２】
さらに好ましい実施態様においては、複数の小胞の表面固定多層構造は、バイオセンサーに使用するようになされている。ここで、
−多層構造の形成がモニターされ、かつ／又は
−前記付随生物活性化合物及び／又は分析物間の相互作用が研究される。
【００２３】
さらに好ましい実施態様においては、膜又は小胞内部に結合した前記生物活性化合物と分析物の相互作用が、前記バイオセンサーによって研究される。
【００２４】
本発明の別の実施態様においては、複数の小胞の表面固定多層構造は、例えば、バイオインフォマティクスにおける薬物送達又は制御放出の別の形式に使用するようになされており、前記放出化合物は、別の固定小胞と反応してもしなくてもよい。
【００２５】
本発明の別の実施態様においては、複数の小胞の表面固定多層構造は、複雑な溶液から化合物を除去又は抽出するようになされている。
【００２６】
本発明による構造は、固定プローブ分子数が、単一脂質二重層又は無処置の小胞の単一層のそれよりもかなり多い利点を有する。３次元に広がる構造を構築することによって、これまで提案された本質的に２次元の構造とは対照的に、機器の検出能力がより良く利用される。すなわち、より多数の固定活性化合物によって、より多数の分析分子が、バイオセンサーによって感知される領域内の生物活性化合物と相互作用することができる。感知される領域内のかかる相互作用の数が多いほど、測定の分解能が向上し、したがって、より弱い相互作用を検出することができ、低分子量の生物活性化合物及び分析物を検出することができる。
【００２７】
各小胞間の結合及び小胞と表面の結合は、好ましくは、ＤＮＡ及びＲＮＡのオリゴ又はポリヌクレオチド、並びにＰＮＡ又は他のいわゆるＤＮＡアナログ間の配列特異的ハイブリッド形成によって媒介することができる。ビオチン改変脂質小胞を使用して固定小胞の多層がストレプトアビジンの中間層を介して形成され得る該ビオチン改変脂質小胞を利用して小胞の多層が作製されたこれまでの戦略と比較して（Ｚａｃｈｅｒ及びＷｉｓｃｈｅｒｈｏｆｆ ２００２）、本発明に利用されるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの設計によって長さを容易に制御することができる効率的スペーサーとして働くことができる。
【００２８】
配列特異的結合戦略は、本発明による異なる構造の部位特異的な形成の機会を広げるものである。異なるオリゴヌクレオチドは異なる小胞に付着することができ、異なる小胞は異なる生物活性化合物に組み込むことができる。異なるオリゴヌクレオチドを表面の異なる位置に固定することによって、異なる機能を有する別個の多層構造を同じ表面に調製することができる。また、異なる小胞は、比較的長い固定一本鎖オリゴヌクレオチド上の異なる位置に固定することができる。
【００２９】
本発明によって生成される小胞の多層においては、下にある支持体からの層当たりの距離が増加し、したがって、小胞中に固定された化合物の活性及び小胞内に閉じ込められた分子の透過性に対する表面による妨害がさらに減少する。本発明の構造は、比較的安定でもあり、生成が容易でもあり、特定の目的及び分析計測手段用に容易にあつらえることもできる。
用語の定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。
【００３０】
本明細書において使用される「小胞」又は「リポソーム」という用語は、脂質膜で組み立てられた実質的に球状の構造（直径５ｎｍから２０μｍ）を一般に意味し、タンパク質、糖脂質、ステロイド又は他の膜関連成分を含んでも含まなくてもよい。
【００３１】
「リポソーム」及び「小胞」という用語は本明細書では区別なく使用される。小胞は、天然に生成することができ（例えば、分子を輸送し、特異的細胞機能を分割する細胞質中にある小胞）、又は合成によって生成することができる（例えば、リポソーム）。「小胞」という用語は、本明細書では、親水性の外部と疎水性の内部を有する、脂質を含む粒子である「ミセル」に対しても使用される。
【００３２】
本明細書において使用される「ヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡなどのあらゆる核酸、及びＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、モルホリノ核酸アナログなど、ただしこれらだけに限定されない核酸アナログを意味する。この用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡの公知の塩基類似体を含むあらゆるヌクレオチドにも関係する。
【００３３】
本明細書において使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、短い一本鎖ポリヌクレオチド鎖を意味する。オリゴヌクレオチドは一般に１００残基長未満であるが、本明細書において使用されるこの用語は、それよりも長いポリヌクレオチドも包含するものとする。この用語は、ヌクレオチドポリマーを形成する、上で定義されたヌクレオチドのすべての組み合せを意味する。
【００３４】
本明細書において使用される「ハイブリッド形成」という用語は、ワトソン−クリック−ハイブリッド形成と称されることが多い実質的に相補的な核酸の対形成、並びにフーグスティーンハイブリッド形成と称されるハイブリッド形成に関連して使用される。
【００３５】
本明細書において使用される「固定化」という用語は、材料の動きを拘束し、ただし必ずしも制限しないような、トランスデューサー表面への材料の化学的な又はそれ以外による付着又は取り込みを意味する。
【００３６】
本明細書において使用される「分析物」という用語は、分析されるあらゆる材料を意味する。
【００３７】
本明細書において使用される「バイオセンサー」という用語は、部分的に又は全体が生物学的分子で構成されたあらゆるセンサー装置を意味する。在来の意味では、この用語は、「生化学シグナルを定量可能な電気信号に変換する適切な変換装置と密着した（酵素、抗体、全細胞、細胞小器官又はそれらの組み合せなどの）固定生物学的材料からなる分析的なツール又はシステム」を意味する（Ｇｒｏｎｏｗ １９８４）。
【００３８】
本明細書において使用される「多層」という用語は、第１の層の上に形成された少なくとも第２の層を含む構造を意味する。個々の層は、相互作用してもしなくてもよい。
【００３９】
本明細書において使用される「生物活性化合物」という用語は、他の材料又は化合物と相互作用することができる生物学的化合物を意味する。かかる生物活性化合物としては、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、脂質、炭水化物、これらの組み合せなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００４０】
本明細書において使用される「膜タンパク質」という用語は、脂質二重層に結合又は挿入されたタンパク質又はポリペプチドを意味する。かかる膜タンパク質は、膜貫通タンパク質、及び脂質層に埋め込まれた部分を有するタンパク質を含む。
【００４１】
本明細書において使用される「外側に突出した化合物」という用語は、表面から突出した部分を有する化合物を意味する。小胞の場合のように表面が実質的に球状表面である場合には、この用語は、化合物が表面から周囲環境に向かって突出していることを意味する。
【００４２】
本明細書において使用される「表面」という用語は、その最も広い意味で使用されるものとする。これは、その上に構造を固定することができる支持手段として使用することができるすべての化合物を包含する。
【００４３】
本明細書において使用される「結合するようになされたリンカー」という用語は、リンカーが、別の化合物に結合する能力を有する化合物を含むことを意味する。
【００４４】
本明細書において使用される「結合に利用可能であるリンカー」という用語は、リンカーが結合するようになされているが、別のリンカーにまだ結合していない、又はリンカーのすべての結合部位がまだ占有されていない状況を意味する。
【００４５】
好ましい本発明の実施態様を、添付の図面を参照してさらに説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
好ましい本発明の実施態様においては、表面１に固定されたリンカー４及び小胞２に付着した外側に突出したリンカー５はオリゴヌクレオチドを含む。少なくとも１個のオリゴヌクレオチドが、多層構造を形成する各小胞２に組み込まれ、隣接する小胞２の相互結合３、及び表面１への小胞２の固定化は、オリゴヌクレオチドによって媒介される。
【００４７】
別の実施態様においては、本発明の構造の生物学的機能を補足し、又は拡張するために、リンカー４、５は、相手に特異的に結合する能力を有する他の化合物又は領域を含むことができる。かかる化合物の例としては、互いに親和性を有するタンパク質対、及び抗体と抗原の対に対して親和性を有するタンパク質対が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００４８】
好ましい本発明の実施態様においては、一般に１から１０００塩基の長さを有し外側に突出したオリゴヌクレオチドが小胞２に付着する。
【００４９】
本発明の好ましい実施態様においては、国際公開第０２／３３０４５号Ａ２に記載されたとおり、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの一端に付着した１個以上の疎水性固着部分を有するオリゴヌクレオチドが組み込まれることによって小胞２に付着する。疎水性固着部分はそれ自体を少なくとも部分的に小胞２の脂質層の疎水性部分に組み入れ、それによって小胞２から外側に突出しているオリゴヌクレオチドの親水性部分を有する小胞中にオリゴヌクレオチドが固着する。疎水性固着部分は、コレステロール、脂肪酸、疎水性ペプチド及び脂質からなる群に属し、ただしこれらだけに限定されない化合物を含むことができる。
【００５０】
別の実施態様においては、前記オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの一端に付着した小胞２に対する反応性基によって小胞２に結合される。反応性基は、小胞の脂質頭部基に結合する。かかる共有結合の例は、欧州特許第０７８４７９３号及び（Ｐａｔｏｌｓｋｙ等 ２０００）に記載されており参照される。外側に突出したオリゴヌクレオチドの組み込みは、多種多様な方法によって実施することができる。オリゴヌクレオチドを小胞に組み入れる上述の方法、及び本明細書に記載されていない他の方法を使用することができる。
【００５１】
一般に、脂質小胞の１層又は平面状の支持された１つの二重層を有し、オリゴヌクレオチドによって官能性を持たせたることができる任意の表面１（固定オリゴヌクレオチドを有する表面）を本発明において使用することができる（すなわち、金属表面、ポリマー表面、多孔質酸化物、半導体、ガラス表面、シリカ表面、脂質構造、石英、タンパク質結晶などの結晶表面など）。しかし、表面１は、本発明に使用される最終面積に応じて選択される。また、オリゴヌクレオチドを表面１に固定する方法は、表面の選択に応じて決まる。オリゴヌクレオチドによって官能性を持たせた表面は、親和性（表面固定ストレプトアビジンによるビオチン化オリゴヌクレオチドの固定など、ただしこれだけに限定されない）又は共有結合（金表面へのオリゴヌクレオチドのチオール固定化、シリカ表面へのオリゴヌクレオチドのシラン固定化など、ただしこれらだけに限定されない）によって固定されたオリゴヌクレオチドを有する表面１とすることができる。
【００５２】
オリゴヌクレオチド官能化表面は、欧州特許第０７８４７９３号、（Ｃｏｏｐｅｒ等 ２０００；Ｊｕｎｇ等 ２０００；Ｋｅｌｌｅｒ ａｎｄ Ｋａｓｅｍｏ １９９８；ＭａｃＫｅｎｚｉｅ等 １９９７；Ｍｉｃｈｅｌ等 ２００２；Ｐａｔｏｌｓｋｙ等 ２０００；Ｒｅｉｍｈｕｌｔ等 ２００２；Ｓｖｅｄｈｅｍ等 ２００３）に記載の方法など、ただしこれらだけに限定されない脂質の固定層を有する表面１とすることもできる。ここで、外側に突出したオリゴヌクレオチドは脂質層又は小胞にそれぞれ組み込まれ、前記オリゴヌクレオチドはハイブリッド形成に利用可能である。
【００５３】
本発明の好ましい実施態様においては、表面１は金属であり、例えば、これらだけに限定されないが、表面固定ストレプトアビジンによるビオチン化オリゴヌクレオチドの固定化によって官能性を持たせた金及び銀である。
【００５４】
本発明の好ましい実施態様においては、表面１に小胞２を固定する前に表面に固定されたリンカー４は、一般に長さが１から１００塩基であり小胞２上のオリゴヌクレオチドに相補的であるいくつかの異なるオリゴヌクレオチドを含む３次元マトリックスを形成する。小胞２は、小胞オリゴヌクレオチドに相補的であるオリゴヌクレオチドを含むマトリックスと小胞付着オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成によってマトリックスに固定される。
【００５５】
本発明の図１に示す実施態様においては、３次元マトリックスは、一般に長さが１００から１００００塩基であり小胞２上のオリゴヌクレオチドに相補的である２個以上の配列鎖（ｓｅｑｕｅｎｅｃｅ ｓｔｒｅｔｃｈ）を有する長い表面固定オリゴヌクレオチド鎖４で構成される。小胞は、小胞オリゴヌクレオチド５に相補的な鎖（ｓｔｒｅｔｃｈ）３における小胞付着オリゴヌクレオチド５と表面固定オリゴヌクレオチド４のハイブリッド形成によって表面１に固定される。異なるオリゴヌクレオチドが付着した異なる小胞は、表面固定オリゴヌクレオチド上の異なる配列鎖においてハイブリッド形成することができる。このことは、多層構造の形成が、別個の段階又は並行した段階において異なる小胞を異なるオリゴヌクレオチドと一緒にインキュベーションすることによって制御できることを意味する。
【００５６】
図２に示す実施態様においては、小胞２を固定する前に表面１に固定されたリンカー４は、一般に長さが１から１００００塩基であり小胞に付着したオリゴヌクレオチドに相補的な１個の配列鎖を有するオリゴヌクレオチドを含む。表面上で小胞の第１の固定層を形成する各小胞は、表面固定オリゴヌクレオチドと少なくとも１個の小胞付着オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成によって固定される。小胞の第２の固定層を形成する小胞２は、ハイブリッド形成に利用可能であり第１の固定層に含まれる小胞に付着したオリゴヌクレオチドと少なくとも１個の小胞付着オリゴヌクレオチド５のハイブリッド形成によって表面１に固定される。第３の小胞層を形成する小胞は、第２の小胞層上に同様に固定される。小胞２への組み込みに使用されるオリゴヌクレオチド及び表面１に固定されたオリゴヌクレオチドの各配列は、最適な多層構造が形成されるように選択される。
【００５７】
図１に示す実施態様においては、小胞２に組み込まれたオリゴヌクレオチドは、表面固定オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する。これは、ある小胞層を形成する小胞に組み込まれたオリゴヌクレオチドが、表面１からある距離に位置する表面固定オリゴヌクレオチドのある領域と特異的にハイブリッド形成することができる配列を有する必要があることを意味する。
【００５８】
図２に示す実施態様においては、第１の層を形成する小胞２に組み込まれたオリゴヌクレオチドは、改変された表面１のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する。このことは、組み込まれた前記オリゴヌクレオチドの配列が、「第１の層」のオリゴヌクレオチドと表面固定オリゴヌクレオチドの特異的ハイブリッド形成が可能なように選択されるべきであることを意味する。また、第２の層を形成する小胞２に組み込まれたオリゴヌクレオチドは、第１の層を形成するオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する。このことは、これらの「第２の層」のオリゴヌクレオチドの配列が、前記「第２の層」のオリゴヌクレオチドと前記「第１の層」のオリゴヌクレオチドの特異的ハイブリッド形成が可能なように選択されるべきであることを意味する。この手法は、所望の数の層が得られるまで繰り返される。また、第１の小胞層は、欧州特許第０７８４７９３及び（Ｃｏｏｐｅｒ等 ２０００；Ｊｕｎｇ等 ２０００；Ｐａｔｏｌｓｋｙ等 ２０００）に公知の方法のいずれかによって固定することができる。所望の数の層は用途によって決まる。
【００５９】
好ましい本発明の実施態様においては、小胞２は、実質的に球状の脂質二分子膜構造を含み、脂質頭部は、疎水性膜層と親水性内部を有する親水性粒子を形成する小胞の外部と内部に面する。しかし、小胞は、親水性粒子を形成する小胞の外部に面する親水性脂質頭部と、小胞の疎水性内部を形成する脂質尾部とを有する実質的に球状の脂質単分子膜（ミセルとしても知られる）も含むことができる。小胞を形成する化合物は、小胞を形成することができる任意の化合物、又はかかる化合物の組み合せとすることができる。かかる化合物は、中でも、リン脂質、スフィンゴミエリン、コレステロール、プラズマトジェン（ｐｌａｓｍａｔｏｇｅｎ）及びカルジオリピド（ｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｄ）とすることができるが、小胞を形成する脂質が脂質自体の重合によって互いに連結された化合物であってもよい。好ましい実施態様においては、小胞の中央値サイズは、５ｎｍから１０μｍ、より好ましくは２５ｎｍから１５０ｎｍである。本発明による複数の小胞の表面固定多層構造が生成される条件（緩衝剤組成、ｐＨ、温度、反応速度など）は、表面材料の選択、小胞組成、オリゴヌクレオチド配列などの様々な因子によって決まる。異なる段階に適切な条件は、当業者が容易に決定することができる。実験条件の例は、実施されたいくつかの実験を記載したときに後述する。
【００６０】
本発明の好ましい実施態様においては、１層を超える小胞を形成するように設計された小胞２は、単一のインキュベーション段階において前記表面固定多層構造を形成するために表面１と同時にインキュベートされる。
【００６１】
別の本発明の好ましい実施態様においては、小胞の単層を形成するように設計された小胞２は、別個の逐次インキュベーション段階において前記表面固定多層構造の各小胞層を形成するために表面１と同時にインキュベートされる。
【００６２】
本発明のいくつかの好ましい実施態様においては、表面固定多層構造を形成する小胞は、膜タンパク質、抗体、機能性脂質、水溶性結合タンパク質など、ただしこれらだけに限定されない生物活性化合物６も含む。本発明の特に好ましい実施態様においては、本発明による多層構造は、小胞２に組み込まれた前記生物活性化合物６と分析物７の相互作用の研究に使用されるように設計される。かかる研究としては、抗体−抗原相互作用、薬物−標的相互作用、タンパク質結合相互作用などが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００６３】
別の実施態様においては、小胞２は、薬物、色素、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、イオンなどの異なる化合物を小胞の内部８に包含することができる。小胞２は、これらの化合物が小胞から放出されるように設計することができる。この放出は、印加電位、浸透応力、又は前記放出を刺激する化合物とのインキュベーションによって引き起こすことができる。前記放出は、とりわけ、局所的薬物送達の研究に使用することができる。
【００６４】
異なる小胞２は、異なるリンカー５を異なる小胞に付着させることによって、本発明による多層構造の異なる層に含まれるように設計することができる。前記異なる小胞は異なる生物活性化合物６を含むことができ、したがって異なる生物活性を多層構造中の異なる層に指定することができる。
【００６５】
特定の実施態様においては、本発明は、表面１に固定することができ、さらにそうするように惹起されたときに表面から放出されるように設計される複数の小胞２の多層構造に関する。この放出は、印加電位、浸透応力、温度変化、又は前記放出を刺激する化合物とのインキュベーションによって引き起こすことができる。
【００６６】
本発明の特に好ましい実施態様においては、複数の小胞の前記表面固定多層構造は、バイオセンサーに使用するのに適切な表面に固定される。したがって、適切な表面のタイプは、上述したように、異なるバイオセンサーで異なる。
【００６７】
本発明のさらに好ましい実施態様においては、本発明による複数の小胞の表面固定多層構造の形成は、バイオセンサーにおいて実施され、前記構造の形成を検出する技術によってモニターされ、さらに好ましい実施態様においては、前記構造の諸性質についてのさらなる研究が前記バイオセンサーにおいて実施される。
【００６８】
上述の実施態様及び以下の実験は、本発明の非限定的な例であり、本発明は他の実施態様も含むことを理解されたい。
実験及び結果
複数の脂質小胞及びタンパク質リポソームは、その後の相補ＤＮＡ改変脂質小胞間のハイブリッド形成を利用して固体基質上に固定された。調製物は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって分析された。表面調製物は、金（表面被覆度９０ｎｇ／ｃｍ２（１４４０ＲＵ）、続いてｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（表面被覆度１３０ｎｇ／ｃｍ２（２０２０ＲＵ））に吸収されたビオチン化アルブミンに基づき、類似のシステムによる以前の結果と良く一致した（Ｊｕｎｇ等 １９９８；Ｊｕｎｇ等 ２０００；Ｓｖｅｄｈｅｍ等 ２００３。次いで、ビオチン化ＤＮＡ（ｂｉｏ−ＤＮＡ）は、ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（表面被覆度１７ｎｇ／ｃｍ２（２６０ＲＵ））と結合され、一本鎖ＤＮＡのカップリングを与えた。次いで、表面固定ＤＮＡに相補的な一本鎖ＤＮＡを有する脂質小胞又はタンパク質リポソームが表面に暴露された。複数の層は、表面上の最外層中の小胞にある未反応ＤＮＡに相補的である一本鎖ＤＮＡを有するリポソーム又はタンパク質リポソームのその後の暴露によって作製された（図３参照）。
実験の詳細
タンパク質及びタンパク質アッセイ：この多層システムのシグナル増強をプローブするために使用される膜タンパク質は、細菌エシェリキア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のプロトン転移ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ（ＴＨ）である。（Ｍｅｕｌｌｅｒ等 １９９７）シグナルの増強を検証するために、いくつかの小胞層が１つの小胞層と比較され、タンパク質の１／３がトリプシン処理によってタンパク質の残りから切断され、（Ｔｏｎｇ等 １９９１）ＳＰＲ測定におけるシグナルの低下、例えば、ＳＰＲによって感知される領域内の質量の減少がもたらされた。
【００６９】
脂質、リポソーム及びタンパク質リポソーム：リポソーム（図３）は脂質ホスファチジルコリンからなり、タンパク質リポソーム（図４）は５０％−４５％−５％の組成の脂質ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルセリンからなる。リポソームは、１００ｎｍフィルターを通した押し出しから作製され（図３）、又は音波ロッド（ｓｏｎｉｃ−ｒｏｄ）超音波処理（約３０分）し、それに続いて溶液を遠心分離して大きな脂質要素を除去することによって作製された（図４）。押し出しによって形成されたリポソームは直径が１３０から１５０ｎｍであり、超音波処理リポソームは直径が２５ｎｍである。一本鎖コレステロール−ＤＮＡ（ｃｈｏｌ−ＤＮＡ）は、押し出し及び超音波処理プロセス中にリポソームに組み込まれた。異なるＤＮＡ鎖は、ＤＮＡ又はｃ−ＤＮＡ（相補ＤＮＡ鎖）と称される。膜タンパク質ＴＨは、界面活性剤によって媒介される再構成によって超音波処理リポソーム中に組み込まれた（Ｇｒａｎｅｌｉ等 ２００３；Ｍｅｕｌｌｅｒ等 １９９７；Ｒｉｃｈａｒｄ等 １９９０）。
【００７０】
表面調製：金表面は、異なる測定間でＳＤＳ及びｕｖ−オゾン処理によって清浄化された。
【００７１】
多層調製：ｃ−ＤＮＡで官能性を持たせたリポソーム又はタンパク質リポソームは、ｂｉｏ−ＤＮＡ改変表面に暴露された。結合が飽和した後に、追加のｃｈｏｌ−ｃ−ＤＮＡが固定リポソームに追加された。次いで、ｃｈｏｌ−ＤＮＡで官能性を持たせたリポソームが表面に暴露された。結合が飽和した後に、このプロセスが繰り返された。ただし、ｃｈｏｌ−ＤＮＡが添加され、続いてｃｈｏｌ−ｃ−ＤＮＡで改変された小胞が添加された）。次いで、これらのシーケンスが、５層のリポソームが固定されるまで繰り返された。
【００７２】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）：表面プラズモン共鳴測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）によって実施された。
結果
金表面上のリポソーム多層の固定についてのＳＰＲ−結果：多層におけるリポソームの固定化は、図３に示すようにＳＰＲによって測定された。表面プラズモンに伴い、表面からの距離に対するＳＰＲ感度も測定するエバネッセント波は、図３に模式的に示されたように、減衰長さ（ｄｅｃａｙ ｌｅｎｇｔｈ）が約４００ｎｍの指数挙動に従う。表面からの距離の増加に伴うエバネッセント波によって感知される体積の減少を考慮して、測定応答単位（ＡＭＲＵ）を式１によって真の応答単位（ＡＲＲＵ）に変換することができる（Ｌｉｅｄｂｅｒｇ等 １９９３）。
【００７３】
ΔＲＲＵ＝ΔＭＲＵ×ｅｚ／ｄｚ （１）
ここで、ｚは（ＱＣＭ−Ｄによって評価された（図３の挿入図参照）吸着層の厚さであり、ｄｚはエバネッセント場の減衰長さであり、この場合４００ｎｍである。
【００７４】
式１及び図３に示すΔＭＲＵを使用すると、吸着脂質の質量は式２によって求めることができる。
【００７５】
Δｍ＝Ｃ×ΔＲＲＵ （２）
ここで、Δｍは結合質量（ｃｏｕｐｌｅｄ ｍａｓｓ）であり、Ｃは１のΔＲＲＵの変化に相当する質量（ｎｇ）／ｃ２である。Ｃは、異なる分子の屈折率を用いてタンパク質に対して０．０６６ｎｇ／ｃｍ２、脂質に対して０．０５９ｎｇ／ｃｍ２と求められた。（Ｌｉｅｄｂｅｒｇ等 １９９３）表面に吸着した脂質質量の計算値を表１に示す。
【００７６】
【表１】
【００７７】
表１の結果によれば、ＡＭＲＵは表面からの距離が増加するにつれ減少するにもかかわらず、各層は実質的に同じ量の脂質小胞で構成される（図３）。したがって、相補ＤＮＡに基づく多層構造中に複数の脂質小胞を作製する本戦略は効率的であり、ほんの数層に限定されないと予想される。
【００７８】
ＴＨのトリプシン切断を含むＴＨ含有タンパク質リポソームの多層構造：タンパク質リポソームの多層を上述した金表面に固定した。固定化プロセスのＳＰＲ結果を図４に示す。タンパク質リポソームの単層の作製も示す。タンパク質の４３ｋＤドメインが除去されるＴＨのトリプシン切断は、リポソームのそれぞれ５層及び１層の飽和形成後に行われた。
【００７９】
図５は５層及び１層の小胞に対するトリプシン切断段階の拡大図であり、かなり多くのＴＨを有する多層構造が、単一小胞層よりもかなり大きな応答を示すことを正確に示している。認められた増幅は予想よりも実際に大きく、第１の小胞層中の膜タンパク質ＴＨが、下にある表面によって実際に影響を受けることを意味し、表面からの距離の増加につれ減少する効果を意味する。
【００８０】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】異なる又は同一の小胞２に付着した同一又は異なるリンカー５が、表面１に固定された同一又は異なるリンカー４に結合３することによって、３次元マトリックスに結合された複数の小胞２が形成される一実施態様を示す図である。小胞は、小胞を形成する脂質二重層に埋め込まれた生物活性化合物６も含み、その周囲環境は、生物活性化合物６との結合に対して場合によっては特異的であってもよい分析物７を含む。
【図２】外側に突出したリンカー５に付着した小胞が表面１に固定されたリンカー４に結合することによって小胞２の多層が形成される実施態様を示す図である。固定小胞に付着した他のリンカーは、小胞の第２の層を、前記小胞の第２の層に付着したリンカー５を介して固定するためにさらに使用される。これらの段階を繰り返すことによって多層が生成される。小胞は、小胞を形成する脂質二重層に埋め込まれた生物活性化合物６も含み、その周囲環境は、生物活性化合物６との結合に対して場合によっては特異的であってもよい分析物７を含む。
【図３】多層調製物のＳＰＲ結果における測定応答単位（ＭＲＵ）を示すグラフである。層の厚さ及びエバネッセント波によって感知される応答割合も示す。リポソームの５層が表面に固定された。
【図４】ＴＨ含有タンパク質リポソームの１層及び５層の固定化を示すグラフである。タンパク質リポソームの固定化後に、トリプシンが添加されてＴＨが切断され、その結果、表面から質量が失われる。
【図５】図４におけるタンパク質リポソームの１層又は５層におけるＴＨのトリプシン切断の詳細を示すグラフである。
【図６】小胞に付着したリンカー５と、小胞を形成する脂質二重層に埋め込まれた生物活性化合物６とを含む小胞２を示す図である。この図は、小胞の内部体積８も示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、
−表面に固定された複数の無処置の小胞の多層構造、
−かかる多層構造を生成する方法及び手段、
−生物分析センサー用途におけるかかる多層構造の使用
に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、ヌクレオチドハイブリッド形成、抗体−抗原認識、薬物−受容体相互作用などを含めて、生体認識現象の詳細な分析に適合した生物分析センサー概念の改善が強く求められている。一般的な一手法においては、固定受容体（プローブ）によって認識される分析分子（標的）は、例えば、蛍光性化合物又は放射性化合物によって標識される。次第に重要度が増してきた別の手法においては、生体認識現象は、外部標識を導入せずに記録される。非標識検出に対する要求は、（ｉ）複雑な混合物から検出される分子は、迅速で再現性のある均一な方法で標識２５するには複雑であり、（ｉｉ）標識は、実際の生体認識現象を妨害することがあり、（ｉｉｉ）結合動力学からの情報は一般に得ることができず、したがって親和性及び濃度の決定を複雑にするという知見に主に起因する。最近、この方面においてかなりの進展がなされ、様々な生体認識現象の非標識高感度検出が可能になった。かかる分析方法には、ＳＰＳ／ＳＰＲ表面プラズモン分光法／共鳴）、（Ｒｉｃｈ及びＭｙｓｚｋａ ２０００）偏光解析法、ＯＷＬＳ（光導波路分光法）などの光学的方法、（Ｒａｍｓｄｅｎ １９９３）ＱＣＭ（水晶発振子微量天秤）、ＳＡＷ（表面弾性波）などの圧電方法（Ｊａｎｓｈｏｆｆ等 ２０００）及びＳＰＦＳ（表面プラズモン励起蛍光分光法）（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ及びＫｎｏｌｌ ２０００）、蛍光画像処理（Ｎｉｅｍｅｙｅｒ及びＢｌｏｈｍ １９９９）などの蛍光方法がある。これらのうち、ＳＰＲは最も普及した技術である（Ｒｉｃｈ及びＭｙｓｚｋａ ２０００。金表面と液体、一般に水溶液との界面における屈折率の変化を高感度で検出することができる新規光学設計を除いて、この技術は、少量の試料を取扱うマイクロ流体工学、及びパターン化された表面の画像処理に適合する。（Ｊｏｒｄａｎ等 １９９７）また、様々なタイプの生体分子を効率的に固定するように設計された様々な金表面改変プロトコルが成功裏に開発された。
【０００３】
しかし、抗体、多数の酵素などの水溶性タンパク質及びオリゴヌクレオチドを固定するために開発されたプロトコルは、効率的で信頼できることが証明されたが、膜タンパク質は取り扱いがより厄介であることが判明した。固体担体上に支持された細胞膜模倣物は、例えば、光合成、呼吸及び神経生物学の基礎的な機能研究に役立つので、これは、実際に極めて厄介な問題である。
【０００４】
また、膜タンパク質、特に膜貫通タンパク質は、タンパク質の重要なクラスを構成しているので、この難解な問題は、薬物の大多数が膜タンパク質を対象とするからでは全くなく、薬学的応用分野に関しても極めて重要である。膜タンパク質を適正に取扱う際の基本的な障害は、膜タンパク質が、水溶性タンパク質とは対照的に、疎水性膜セグメントを有し、タンパク質がその本来のコンホメーションを維持するために水から遮蔽されなければならないことに起因する。この遮蔽は、タンパク質を水溶液に可溶であるように維持する界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を使用することによって、又は好ましくは、例えば、リポソーム、平面状の支持された二重層などの細胞膜模倣構造中にタンパク質を再構成することによって実施することができる。これは、固定戦略に対して大きな要件となる。組み込まれた膜タンパク質を含めて、固体担体上の脂質二重層構築体の固定化に適合する戦略を開発するために、いくつかの戦略が開発された。最も直接的な戦略は、ＳｉＯ２、ガラス又はマイカ表面の平面状支持二重層への無処置の小胞の自発的な吸着、分解及び融合を利用する（Ｂｒｉａｎ及びＭｃＣｏｎｎｅｌｌ １９８４；Ｂｕｒｇｅｓｓ等 １９９８；Ｇｉｚｅｌｉ等 １９９７；Ｇｒａｎｅｌｉ等 ２００３；Ｇｒｉｔｓｃｈ等 １９９８；Ｈｅｙｓｅ等 １９９８；Ｋａｌｂ及びＴａｍｍ １９９２；Ｌｉｎｄｈｏｌｍ−Ｓｅｔｈｓｏｎ １９９８；Ｓａｌａｆｓｋｙ等 １９９６。しかし、平面状支持二重層に組み込まれた膜タンパク質の水溶性部分は、固体担体と直接相互作用する傾向にあるので、この戦略は、タンパク質の移動度及び活性に悪影響を及ぼすことが判明した（Ｓａｌａｆｓｋｙ等 １９９６）。また、タンパク質が裸で存在すると、実際の二重層形成プロセスを妨害することもある。（Ｇｒａｎｅｌｉ等 ２００３）前者の問題を回避する有望な一方法は、タンパク質と固体担体の間にスペーサー又はクッション（不活性軟質ポリマーであることが多い）を使用すること（Ｎａｕｍａｎｎ等 ２００２；Ｗａｇｎｅｒ及びＴａｍｍ ２０００）及び欧州特許第０７８４７９３９号；或いは表面に小さな空洞を広げる膜を作製することである（Ｓｃｈｍｉｄｔ等 ２０００。しかし、膜の両側に電気的に直接接することが必須ではない場合には３５、固定された無処置の小胞を使用することによって、膜タンパク質の機能に対する固体担体の影響に関わる諸問題を回避することができ（Ｃｏｏｐｅｒ等 ２０００；Ｓｖｅｄｈｅｍ等 ２００３）、実際の二重層形成プロセスに対する膜タンパク質の影響に関わる問題を回避することができる（Ｇｒａｎｅｌｉ等 ２００３）。（ｉ）固体担体（例えば、Ａｕ、ＴｉＯ２、Ｐｔ）との自発的な結合（Ｋｅｌｌｅｒ及びＫａｓｅｍｏ １９９８；Ｒｅｉｍｈｕｌｔ等 ２００２）、（ｉｉ）表面にある機能要素の一タイプに特異的に結合するように設計された小胞（例えば、ストレプトアビジン被覆表面に結合したビオチン改変脂質を含む小胞（Ｊｕｎｇ等 ２０００；Ｍｉｃｈｅｌ等 ２００２）又は抗体−抗原結合を含む小胞（ＭａｃＫｅｎｚｉｅ，１９９７）中の脂質画分、（ｉｉｉ）トランスデューサー表面に固定された疎水性タグ、（Ｃｏｏｐｅｒ等 ２０００）、或いは（ｉｖ）ＤＮＡ改変表面に特異的に結合するためのＤＮＡ改変小胞、（Ｐａｔｏｌｓｋｙ等 ２０００）を利用して小胞をトランスデューサー表面に固定することができる方法も、アレイ形式に適合することが実証された。（Ｓｖｅｄｈｅｍ等 ２００３）
【０００５】
また、平面状支持脂質二重層と比較して、さらには、制御流れ条件下の界面活性剤枯渇を使用して平面状支持脂質二重層における固定膜タンパク質の濃度を増加させる戦略と比較しても、固定小胞を使用すると、単位表面積当たりに固定され得る標的部位（例えば、膜タンパク質）候補数が増加する。（Ｋａｒｌｓｓｏｎ及びＬｏｆａｓ ２００２；Ｋａｒｌｓｓｏｎ及びＬｏｆａｓ ２００２）しかし、大きな親水性ドメインを有する膜タンパク質を高濃度でリポソームに組み込むことは、膜タンパク質が凝集し易く、活性を失い易いので一般に困難である（例えば（Ｒｉｃｈａｒｄ等 １９９０及びその中の参考文献を参照されたい）。
【０００６】
したがって、固定小胞を使用する場合でも、タンパク質の表面濃度は比較的低く維持されなければならないことが多い。したがって、固定膜タンパク質の量をその機能に重大な影響を及ぼさずに増加させる戦略を開発することは極めて重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、溶液中の膜固定化合物（プローブ）と分析化合物（標的）の相互作用部位の数が少ない上述の問題が、一般に、
バイオセンサー用途における低シグナルをもたらし、
効率的な分子フィッシング（ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｆｉｓｈｉｎｇ）用フィルターを生成する部位を過度に少なくし、
これらの問題の両方が、かかる分析化合物に結合することができる表面固定プローブの数を増加させることによって解決し得るという洞察に基づく。
【０００８】
したがって、本発明の一目的は、標識検出又は非標識検出を利用した検出用途において、膜結合性成分と分析物の結合及び／又は膜結合性成分からの分析物の放出の検出感度を改善することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、いくつかの用途に有利であるとされている、表面に近い溶液の捕捉（又は制御）体積を増加させることである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１の一般的な実施態様においては、本発明は、前記表面から十分離隔した複数の小胞を含む生物学的に機能的な表面固定多層構造に関する。これらの小胞は、表面固定リンカーと小胞付着（外側に突出した）リンカーによって前記構造に直接付着し、かかる小胞付着リンカーによって別の小胞に場合によっては直接付着してもよい。これらの小胞は、生物活性化合物を含み、それによってその生物学的機能を有する構造が提供される。
【００１１】
第１の態様においては、多層構造は、２個の小胞が各表面固定リンカーに付着するように、小胞付着リンカーによって表面固定リンカーに直接付着した小胞を有する。ここで、各小胞付着リンカーは、別の小胞付着リンカーではなく、表面固定リンカーに結合するようになされる。
【００１２】
第２の態様においては、小胞は、表面固定リンカー及び小胞付着リンカーによって多層構造に付着し、それによって２個以上の小胞層を含む構造が提供される。したがって、これらの構造は、表面固定リンカーに直接連結された小胞の１層と、小胞付着リンカー間の連結によって形成される小胞−小胞層の１個又はいくつかの後続層とを含む。
【００１３】
第２の一般的な実施態様においては、生物学的に機能的な表面固定多層構造は、表面から十分離隔した複数の小胞を含み、小胞は、小胞付着リンカーによって表面固定リンカーに沿って直接付着し、少なくとも２個の小胞が小胞付着リンカーによって各リンカーに付着する。各小胞付着リンカーは、表面固定リンカーには結合するが、別の小胞付着リンカーには付着しないようになされている。この実施態様によれば、生物学的機能は、小胞付着リンカーに付着していない表面固定リンカーの領域に由来し得る。追加又は相補的な生物学的機能は、前記構造に付着した小胞に含まれる化合物に由来し得る。
【００１４】
第３の実施態様によれば、本発明の複数の小胞を含む生物学的に機能的な表面固定多層構造は、表面固定化によって前記構造に直接付着し、小胞付着リンカーによって別の小胞に直接付着する小胞を有する。少なくとも選択小胞集団は生物活性化合物を含み、それによってその生物学的機能を有する前記構造が提供される。より具体的には、小胞の生物活性化合物は、表面近傍においてそれらの生理活性に障害を生じ、又は悪影響を及ぼし得る。その結果、第１の層、又は表面に最も近い層を、生物活性化合物を含まない小胞で形成させることが望ましい用途もある。或いは、すべての小胞が生物活性剤を含むこともできる。第３の実施態様の一態様においては、多層構造を解釈するために、小胞の表面固定化には、別の小胞付着リンカーに結合可能な少なくとも１個の小胞付着リンカーを有する直接表面付着用の第１の小胞集団が必要である。脂質小胞の直接表面付着は、当業者には十分に確立された技術である。かかる付着を実施する適切な一方法は、Ｃｏｏｐｅｒ等（２０００）に概説された、表面に固定された疎水性表面タグを使用することである。
【００１５】
本発明は、複数の小胞の表面固定多層構造を生成する方法、その構造自体、並びにバイオセンシング、送達及びフィルター用途におけるかかる構造の使用にも関する。
【００１６】
より具体的には、多層構造形成方法は、
（ｉ）少なくとも１個の小胞付着リンカーに結合するようになされ、少なくとも１個の小胞付着リンカーとの結合に利用可能である少なくとも１個の表面固定リンカー、又は１個以上の小胞付着リンカーを各々が備える直接表面固定小胞の第１の層のどちらかを含む表面を用意し、
（ｉｉ）表面固定リンカー又は別の小胞付着リンカーに直接結合するようになされ、表面固定リンカー又は別の小胞付着リンカーとの直接結合に利用可能である少なくとも１個の外側に突出した小胞付着リンカーを各々が含む小胞を用意し、
（ｉｉｉ）表面固定リンカーとの、又は前記構造にすでに固定された小胞付着リンカーとの小胞付着リンカーの直接的結合を促進する条件下で前記小胞の少なくとも１個と前記表面をインキュベートし、その結果
（ｉｖ）別の小胞付着リンカー（５）との結合に利用可能である少なくとも１個の構造固定リンカー及び／又は表面固定リンカーをこの段階の後に含む前記構造に小胞及び小胞結合リンカーが固定され、
（ｖ）小胞（２）の所望の量が前記構造に固定されるまで前の段階又は前の２段階を繰り返す
各段階を含む。
【００１７】
（図１に示す）本発明の方法の一実施態様においては、少なくとも２個の別のリンカーに結合するようになされ、少なくとも２個の別のリンカーとの結合に利用可能であるいくつかのリンカー（表面リンカー）が表面に固定される。別のリンカー（小胞リンカー又は表面リンカー）に結合するようになされ、別のリンカー（小胞リンカー又は表面リンカー）との結合に利用可能である少なくとも１個の外側に突出した小胞付着リンカー（小胞リンカー）が各小胞に付着する。前記小胞と前記表面は、小胞付着リンカーが表面固定リンカーに直接結合し、それによって小胞が前記表面固定リンカー、したがって前記表面に固定される条件下で一緒にインキュベートされる。表面固定リンカーは、異なる部分に対する異なる付着リンカーによって小胞に結合するようにすることができるので、いくつかの小胞は、一段階で固定することができる。
【００１８】
本発明の方法の別の実施態様においては（図２）、別のリンカーに結合するようになされ、別のリンカーとの結合に利用可能である少なくとも１個のリンカー（表面リンカー）が表面に固定される。別のリンカー（小胞リンカー又は表面リンカー）に結合するようになされ、別のリンカー（小胞リンカー又は表面リンカー）との結合に利用可能である少なくとも１個の外側に突出した小胞付着リンカー（小胞リンカー）が各小胞に付着する。前記小胞と前記表面は、小胞リンカーが表面リンカーに結合することができ、結合すると、小胞が前記表面リンカー、したがって前記表面に表面の第１の小胞層として固定される条件下で一緒にインキュベートされる。この手順は繰り返すことができ、新しい小胞、前記表面にすでに固定された小胞に付着したリンカーとリンカーの結合を促進し、したがって前記表面の固定小胞の後続層を形成する条件下で、新しい小胞を前記表面と一緒にインキュベートすることができる。
【００１９】
本発明の方法のさらなる実施態様においては、第１の小胞層は、従来の方法によって表面に直接付着される。かかる第１の層の小胞は、表面付着に適合することができ、又は表面付着に対して官能性を持たせることができ、或いは、表面は、疎水性タグによって適合される。隣接表面が、小胞に含まれ前記構造を生体機能性にする生物学的化合物に障害を与え、又は悪影響を及ぼすと考えられる場合には、この実施態様の一態様においては、第１の層の小胞は、生物学的化合物を含まない第１の小胞集団を構成することができる。この側面によれば、次に続く層は、生物学的薬剤を含む小胞を含む。小胞の後続層は、上で説明された小胞付着リンカーによって形成される。
【００２０】
本発明の一部の実施態様においては、生物学的に又は別の方法では化学的に活性な化合物は小胞の脂質二重層を伴う。この化合物は、例えば、天然若しくは合成タンパク質、ポリペプチド又はペプチドとすることができ、炭水化物とすることができ、設計された脂質とすることができ、特定の細胞又は組織タイプに特徴的な細胞表面タンパク質、病原体、腫瘍細胞、生体細胞（ｖｉｔａｌｌｙ ｃｅｌｌ）などの表面タンパク質などの細胞表面タンパク質とすることができる。小胞は、細胞などによっても産生することができる。
【００２１】
本発明の別の実施態様においては、色素、薬物又は他の生物学的若しくは他の方法においては化学的に活性な化合物が固定小胞の内部体積に含まれる。
【００２２】
さらに好ましい実施態様においては、複数の小胞の表面固定多層構造は、バイオセンサーに使用するようになされている。ここで、
−多層構造の形成がモニターされ、かつ／又は
−前記付随生物活性化合物及び／又は分析物間の相互作用が研究される。
【００２３】
さらに好ましい実施態様においては、膜又は小胞内部に結合した前記生物活性化合物と分析物の相互作用が、前記バイオセンサーによって研究される。
【００２４】
本発明の別の実施態様においては、複数の小胞の表面固定多層構造は、例えば、バイオインフォマティクスにおける薬物送達又は制御放出の別の形式に使用するようになされており、前記放出化合物は、別の固定小胞と反応してもしなくてもよい。
【００２５】
本発明の別の実施態様においては、複数の小胞の表面固定多層構造は、複雑な溶液から化合物を除去又は抽出するようになされている。
【００２６】
本発明による構造は、固定プローブ分子数が、単一脂質二重層又は無処置の小胞の単一層のそれよりもかなり多い利点を有する。３次元に広がる構造を構築することによって、これまで提案された本質的に２次元の構造とは対照的に、機器の検出能力がより良く利用される。すなわち、より多数の固定活性化合物によって、より多数の分析分子が、バイオセンサーによって感知される領域内の生物活性化合物と相互作用することができる。感知される領域内のかかる相互作用の数が多いほど、測定の分解能が向上し、したがって、より弱い相互作用を検出することができ、低分子量の生物活性化合物及び分析物を検出することができる。
【００２７】
各小胞間の結合及び小胞と表面の結合は、好ましくは、ＤＮＡ及びＲＮＡのオリゴ又はポリヌクレオチド、並びにＰＮＡ又は他のいわゆるＤＮＡアナログ間の配列特異的ハイブリッド形成によって媒介することができる。ビオチン改変脂質小胞を使用して固定小胞の多層がストレプトアビジンの中間層を介して形成され得る該ビオチン改変脂質小胞を利用して小胞の多層が作製されたこれまでの戦略と比較して（Ｚａｃｈｅｒ及びＷｉｓｃｈｅｒｈｏｆｆ ２００２）、本発明に利用されるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの設計によって長さを容易に制御することができる効率的スペーサーとして働くことができる。
【００２８】
配列特異的結合戦略は、本発明による異なる構造の部位特異的な形成の機会を広げるものである。異なるオリゴヌクレオチドは異なる小胞に付着することができ、異なる小胞は異なる生物活性化合物に組み込むことができる。異なるオリゴヌクレオチドを表面の異なる位置に固定することによって、異なる機能を有する別個の多層構造を同じ表面に調製することができる。また、異なる小胞は、比較的長い固定一本鎖オリゴヌクレオチド上の異なる位置に固定することができる。
【００２９】
本発明によって生成される小胞の多層においては、下にある支持体からの層当たりの距離が増加し、したがって、小胞中に固定された化合物の活性及び小胞内に閉じ込められた分子の透過性に対する表面による妨害がさらに減少する。本発明の構造は、比較的安定でもあり、生成が容易でもあり、特定の目的及び分析計測手段用に容易にあつらえることもできる。
用語の定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。
【００３０】
本明細書において使用される「小胞」又は「リポソーム」という用語は、脂質膜で組み立てられた実質的に球状の構造（直径５ｎｍから２０μｍ）を一般に意味し、タンパク質、糖脂質、ステロイド又は他の膜関連成分を含んでも含まなくてもよい。
【００３１】
「リポソーム」及び「小胞」という用語は本明細書では区別なく使用される。小胞は、天然に生成することができ（例えば、分子を輸送し、特異的細胞機能を分割する細胞質中にある小胞）、又は合成によって生成することができる（例えば、リポソーム）。「小胞」という用語は、本明細書では、親水性の外部と疎水性の内部を有する、脂質を含む粒子である「ミセル」に対しても使用される。
【００３２】
本明細書において使用される「ヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡなどのあらゆる核酸、及びＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、モルホリノ核酸アナログなど、ただしこれらだけに限定されない核酸アナログを意味する。この用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡの公知の塩基類似体を含むあらゆるヌクレオチドにも関係する。
【００３３】
本明細書において使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、短い一本鎖ポリヌクレオチド鎖を意味する。オリゴヌクレオチドは一般に１００残基長未満であるが、本明細書において使用されるこの用語は、それよりも長いポリヌクレオチドも包含するものとする。この用語は、ヌクレオチドポリマーを形成する、上で定義されたヌクレオチドのすべての組み合せを意味する。
【００３４】
本明細書において使用される「ハイブリッド形成」という用語は、ワトソン−クリック−ハイブリッド形成と称されることが多い実質的に相補的な核酸の対形成、並びにフーグスティーンハイブリッド形成と称されるハイブリッド形成に関連して使用される。
【００３５】
本明細書において使用される「固定化」という用語は、材料の動きを拘束し、ただし必ずしも制限しないような、トランスデューサー表面への材料の化学的な又はそれ以外による付着又は取り込みを意味する。
【００３６】
本明細書において使用される「分析物」という用語は、分析されるあらゆる材料を意味する。
【００３７】
本明細書において使用される「バイオセンサー」という用語は、部分的に又は全体が生物学的分子で構成されたあらゆるセンサー装置を意味する。在来の意味では、この用語は、「生化学シグナルを定量可能な電気信号に変換する適切な変換装置と密着した（酵素、抗体、全細胞、細胞小器官又はそれらの組み合せなどの）固定生物学的材料からなる分析的なツール又はシステム」を意味する（Ｇｒｏｎｏｗ １９８４）。
【００３８】
本明細書において使用される「多層」という用語は、第１の層の上に形成された少なくとも第２の層を含む構造を意味する。個々の層は、相互作用してもしなくてもよい。
【００３９】
本明細書において使用される「生物活性化合物」という用語は、他の材料又は化合物と相互作用することができる生物学的化合物を意味する。かかる生物活性化合物としては、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、脂質、炭水化物、これらの組み合せなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００４０】
本明細書において使用される「膜タンパク質」という用語は、脂質二重層に結合又は挿入されたタンパク質又はポリペプチドを意味する。かかる膜タンパク質は、膜貫通タンパク質、及び脂質層に埋め込まれた部分を有するタンパク質を含む。
【００４１】
本明細書において使用される「外側に突出した化合物」という用語は、表面から突出した部分を有する化合物を意味する。小胞の場合のように表面が実質的に球状表面である場合には、この用語は、化合物が表面から周囲環境に向かって突出していることを意味する。
【００４２】
本明細書において使用される「表面」という用語は、その最も広い意味で使用されるものとする。これは、その上に構造を固定することができる支持手段として使用することができるすべての化合物を包含する。
【００４３】
本明細書において使用される「結合するようになされたリンカー」という用語は、リンカーが、別の化合物に結合する能力を有する化合物を含むことを意味する。
【００４４】
本明細書において使用される「結合に利用可能であるリンカー」という用語は、リンカーが結合するようになされているが、別のリンカーにまだ結合していない、又はリンカーのすべての結合部位がまだ占有されていない状況を意味する。
【００４５】
好ましい本発明の実施態様を、添付の図面を参照してさらに説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
好ましい本発明の実施態様においては、表面１に固定されたリンカー４及び小胞２に付着した外側に突出したリンカー５はオリゴヌクレオチドを含む。少なくとも１個のオリゴヌクレオチドが、多層構造を形成する各小胞２に組み込まれ、隣接する小胞２の相互結合３、及び表面１への小胞２の固定化は、オリゴヌクレオチドによって媒介される。
【００４７】
別の実施態様においては、本発明の構造の生物学的機能を補足し、又は拡張するために、リンカー４、５は、相手に特異的に結合する能力を有する他の化合物又は領域を含むことができる。かかる化合物の例としては、互いに親和性を有するタンパク質対、及び抗体と抗原の対に対して親和性を有するタンパク質対が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００４８】
好ましい本発明の実施態様においては、一般に１から１０００塩基の長さを有し外側に突出したオリゴヌクレオチドが小胞２に付着する。
【００４９】
本発明の好ましい実施態様においては、国際公開第０２／３３０４５号Ａ２に記載されたとおり、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの一端に付着した１個以上の疎水性固着部分を有するオリゴヌクレオチドが組み込まれることによって小胞２に付着する。疎水性固着部分はそれ自体を少なくとも部分的に小胞２の脂質層の疎水性部分に組み入れ、それによって小胞２から外側に突出しているオリゴヌクレオチドの親水性部分を有する小胞中にオリゴヌクレオチドが固着する。疎水性固着部分は、コレステロール、脂肪酸、疎水性ペプチド及び脂質からなる群に属し、ただしこれらだけに限定されない化合物を含むことができる。
【００５０】
別の実施態様においては、前記オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの一端に付着した小胞２に対する反応性基によって小胞２に結合される。反応性基は、小胞の脂質頭部基に結合する。かかる共有結合の例は、欧州特許第０７８４７９３号及び（Ｐａｔｏｌｓｋｙ等 ２０００）に記載されており参照される。外側に突出したオリゴヌクレオチドの組み込みは、多種多様な方法によって実施することができる。オリゴヌクレオチドを小胞に組み入れる上述の方法、及び本明細書に記載されていない他の方法を使用することができる。
【００５１】
一般に、脂質小胞の１層又は平面状の支持された１つの二重層を有し、オリゴヌクレオチドによって官能性を持たせたることができる任意の表面１（固定オリゴヌクレオチドを有する表面）を本発明において使用することができる（すなわち、金属表面、ポリマー表面、多孔質酸化物、半導体、ガラス表面、シリカ表面、脂質構造、石英、タンパク質結晶などの結晶表面など）。しかし、表面１は、本発明に使用される最終面積に応じて選択される。また、オリゴヌクレオチドを表面１に固定する方法は、表面の選択に応じて決まる。オリゴヌクレオチドによって官能性を持たせた表面は、親和性（表面固定ストレプトアビジンによるビオチン化オリゴヌクレオチドの固定など、ただしこれだけに限定されない）又は共有結合（金表面へのオリゴヌクレオチドのチオール固定化、シリカ表面へのオリゴヌクレオチドのシラン固定化など、ただしこれらだけに限定されない）によって固定されたオリゴヌクレオチドを有する表面１とすることができる。
【００５２】
オリゴヌクレオチド官能化表面は、欧州特許第０７８４７９３号、（Ｃｏｏｐｅｒ等 ２０００；Ｊｕｎｇ等 ２０００；Ｋｅｌｌｅｒ ａｎｄ Ｋａｓｅｍｏ １９９８；ＭａｃＫｅｎｚｉｅ等 １９９７；Ｍｉｃｈｅｌ等 ２００２；Ｐａｔｏｌｓｋｙ等 ２０００；Ｒｅｉｍｈｕｌｔ等 ２００２；Ｓｖｅｄｈｅｍ等 ２００３）に記載の方法など、ただしこれらだけに限定されない脂質の固定層を有する表面１とすることもできる。ここで、外側に突出したオリゴヌクレオチドは脂質層又は小胞にそれぞれ組み込まれ、前記オリゴヌクレオチドはハイブリッド形成に利用可能である。
【００５３】
本発明の好ましい実施態様においては、表面１は金属であり、例えば、これらだけに限定されないが、表面固定ストレプトアビジンによるビオチン化オリゴヌクレオチドの固定化によって官能性を持たせた金及び銀である。
【００５４】
本発明の好ましい実施態様においては、表面１に小胞２を固定する前に表面に固定されたリンカー４は、一般に長さが１から１００塩基であり小胞２上のオリゴヌクレオチドに相補的であるいくつかの異なるオリゴヌクレオチドを含む３次元マトリックスを形成する。小胞２は、小胞オリゴヌクレオチドに相補的であるオリゴヌクレオチドを含むマトリックスと小胞付着オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成によってマトリックスに固定される。
【００５５】
本発明の図１に示す実施態様においては、３次元マトリックスは、一般に長さが１００から１００００塩基であり小胞２上のオリゴヌクレオチドに相補的である２個以上の配列鎖（ｓｅｑｕｅｎｅｃｅ ｓｔｒｅｔｃｈ）を有する長い表面固定オリゴヌクレオチド鎖４で構成される。小胞は、小胞オリゴヌクレオチド５に相補的な鎖（ｓｔｒｅｔｃｈ）３における小胞付着オリゴヌクレオチド５と表面固定オリゴヌクレオチド４のハイブリッド形成によって表面１に固定される。異なるオリゴヌクレオチドが付着した異なる小胞は、表面固定オリゴヌクレオチド上の異なる配列鎖においてハイブリッド形成することができる。このことは、多層構造の形成が、別個の段階又は並行した段階において異なる小胞を異なるオリゴヌクレオチドと一緒にインキュベーションすることによって制御できることを意味する。
【００５６】
図２に示す実施態様においては、小胞２を固定する前に表面１に固定されたリンカー４は、一般に長さが１から１００００塩基であり小胞に付着したオリゴヌクレオチドに相補的な１個の配列鎖を有するオリゴヌクレオチドを含む。表面上で小胞の第１の固定層を形成する各小胞は、表面固定オリゴヌクレオチドと少なくとも１個の小胞付着オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成によって固定される。小胞の第２の固定層を形成する小胞２は、ハイブリッド形成に利用可能であり第１の固定層に含まれる小胞に付着したオリゴヌクレオチドと少なくとも１個の小胞付着オリゴヌクレオチド５のハイブリッド形成によって表面１に固定される。第３の小胞層を形成する小胞は、第２の小胞層上に同様に固定される。小胞２への組み込みに使用されるオリゴヌクレオチド及び表面１に固定されたオリゴヌクレオチドの各配列は、最適な多層構造が形成されるように選択される。
【００５７】
図１に示す実施態様においては、小胞２に組み込まれたオリゴヌクレオチドは、表面固定オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する。これは、ある小胞層を形成する小胞に組み込まれたオリゴヌクレオチドが、表面１からある距離に位置する表面固定オリゴヌクレオチドのある領域と特異的にハイブリッド形成することができる配列を有する必要があることを意味する。
【００５８】
図２に示す実施態様においては、第１の層を形成する小胞２に組み込まれたオリゴヌクレオチドは、改変された表面１のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する。このことは、組み込まれた前記オリゴヌクレオチドの配列が、「第１の層」のオリゴヌクレオチドと表面固定オリゴヌクレオチドの特異的ハイブリッド形成が可能なように選択されるべきであることを意味する。また、第２の層を形成する小胞２に組み込まれたオリゴヌクレオチドは、第１の層を形成するオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する。このことは、これらの「第２の層」のオリゴヌクレオチドの配列が、前記「第２の層」のオリゴヌクレオチドと前記「第１の層」のオリゴヌクレオチドの特異的ハイブリッド形成が可能なように選択されるべきであることを意味する。この手法は、所望の数の層が得られるまで繰り返される。また、第１の小胞層は、欧州特許第０７８４７９３及び（Ｃｏｏｐｅｒ等 ２０００；Ｊｕｎｇ等 ２０００；Ｐａｔｏｌｓｋｙ等 ２０００）に公知の方法のいずれかによって固定することができる。所望の数の層は用途によって決まる。
【００５９】
好ましい本発明の実施態様においては、小胞２は、実質的に球状の脂質二分子膜構造を含み、脂質頭部は、疎水性膜層と親水性内部を有する親水性粒子を形成する小胞の外部と内部に面する。しかし、小胞は、親水性粒子を形成する小胞の外部に面する親水性脂質頭部と、小胞の疎水性内部を形成する脂質尾部とを有する実質的に球状の脂質単分子膜（ミセルとしても知られる）も含むことができる。小胞を形成する化合物は、小胞を形成することができる任意の化合物、又はかかる化合物の組み合せとすることができる。かかる化合物は、中でも、リン脂質、スフィンゴミエリン、コレステロール、プラズマトジェン（ｐｌａｓｍａｔｏｇｅｎ）及びカルジオリピド（ｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｄ）とすることができるが、小胞を形成する脂質が脂質自体の重合によって互いに連結された化合物であってもよい。好ましい実施態様においては、小胞の中央値サイズは、５ｎｍから１０μｍ、より好ましくは２５ｎｍから１５０ｎｍである。本発明による複数の小胞の表面固定多層構造が生成される条件（緩衝剤組成、ｐＨ、温度、反応速度など）は、表面材料の選択、小胞組成、オリゴヌクレオチド配列などの様々な因子によって決まる。異なる段階に適切な条件は、当業者が容易に決定することができる。実験条件の例は、実施されたいくつかの実験を記載したときに後述する。
【００６０】
本発明の好ましい実施態様においては、１層を超える小胞を形成するように設計された小胞２は、単一のインキュベーション段階において前記表面固定多層構造を形成するために表面１と同時にインキュベートされる。
【００６１】
別の本発明の好ましい実施態様においては、小胞の単層を形成するように設計された小胞２は、別個の逐次インキュベーション段階において前記表面固定多層構造の各小胞層を形成するために表面１と同時にインキュベートされる。
【００６２】
本発明のいくつかの好ましい実施態様においては、表面固定多層構造を形成する小胞は、膜タンパク質、抗体、機能性脂質、水溶性結合タンパク質など、ただしこれらだけに限定されない生物活性化合物６も含む。本発明の特に好ましい実施態様においては、本発明による多層構造は、小胞２に組み込まれた前記生物活性化合物６と分析物７の相互作用の研究に使用されるように設計される。かかる研究としては、抗体−抗原相互作用、薬物−標的相互作用、タンパク質結合相互作用などが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００６３】
別の実施態様においては、小胞２は、薬物、色素、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、イオンなどの異なる化合物を小胞の内部８に包含することができる。小胞２は、これらの化合物が小胞から放出されるように設計することができる。この放出は、印加電位、浸透応力、又は前記放出を刺激する化合物とのインキュベーションによって引き起こすことができる。前記放出は、とりわけ、局所的薬物送達の研究に使用することができる。
【００６４】
異なる小胞２は、異なるリンカー５を異なる小胞に付着させることによって、本発明による多層構造の異なる層に含まれるように設計することができる。前記異なる小胞は異なる生物活性化合物６を含むことができ、したがって異なる生物活性を多層構造中の異なる層に指定することができる。
【００６５】
特定の実施態様においては、本発明は、表面１に固定することができ、さらにそうするように惹起されたときに表面から放出されるように設計される複数の小胞２の多層構造に関する。この放出は、印加電位、浸透応力、温度変化、又は前記放出を刺激する化合物とのインキュベーションによって引き起こすことができる。
【００６６】
本発明の特に好ましい実施態様においては、複数の小胞の前記表面固定多層構造は、バイオセンサーに使用するのに適切な表面に固定される。したがって、適切な表面のタイプは、上述したように、異なるバイオセンサーで異なる。
【００６７】
本発明のさらに好ましい実施態様においては、本発明による複数の小胞の表面固定多層構造の形成は、バイオセンサーにおいて実施され、前記構造の形成を検出する技術によってモニターされ、さらに好ましい実施態様においては、前記構造の諸性質についてのさらなる研究が前記バイオセンサーにおいて実施される。
【００６８】
上述の実施態様及び以下の実験は、本発明の非限定的な例であり、本発明は他の実施態様も含むことを理解されたい。
実験及び結果
複数の脂質小胞及びタンパク質リポソームは、その後の相補ＤＮＡ改変脂質小胞間のハイブリッド形成を利用して固体基質上に固定された。調製物は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって分析された。表面調製物は、金（表面被覆度９０ｎｇ／ｃｍ２（１４４０ＲＵ）、続いてｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（表面被覆度１３０ｎｇ／ｃｍ２（２０２０ＲＵ））に吸収されたビオチン化アルブミンに基づき、類似のシステムによる以前の結果と良く一致した（Ｊｕｎｇ等 １９９８；Ｊｕｎｇ等 ２０００；Ｓｖｅｄｈｅｍ等 ２００３。次いで、ビオチン化ＤＮＡ（ｂｉｏ−ＤＮＡ）は、ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（表面被覆度１７ｎｇ／ｃｍ２（２６０ＲＵ））と結合され、一本鎖ＤＮＡのカップリングを与えた。次いで、表面固定ＤＮＡに相補的な一本鎖ＤＮＡを有する脂質小胞又はタンパク質リポソームが表面に暴露された。複数の層は、表面上の最外層中の小胞にある未反応ＤＮＡに相補的である一本鎖ＤＮＡを有するリポソーム又はタンパク質リポソームのその後の暴露によって作製された（図３参照）。
実験の詳細
タンパク質及びタンパク質アッセイ：この多層システムのシグナル増強をプローブするために使用される膜タンパク質は、細菌エシェリキア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のプロトン転移ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ（ＴＨ）である。（Ｍｅｕｌｌｅｒ等 １９９７）シグナルの増強を検証するために、いくつかの小胞層が１つの小胞層と比較され、タンパク質の１／３がトリプシン処理によってタンパク質の残りから切断され、（Ｔｏｎｇ等 １９９１）ＳＰＲ測定におけるシグナルの低下、例えば、ＳＰＲによって感知される領域内の質量の減少がもたらされた。
【００６９】
脂質、リポソーム及びタンパク質リポソーム：リポソーム（図３）は脂質ホスファチジルコリンからなり、タンパク質リポソーム（図４）は５０％−４５％−５％の組成の脂質ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルセリンからなる。リポソームは、１００ｎｍフィルターを通した押し出しから作製され（図３）、又は音波ロッド（ｓｏｎｉｃ−ｒｏｄ）超音波処理（約３０分）し、それに続いて溶液を遠心分離して大きな脂質要素を除去することによって作製された（図４）。押し出しによって形成されたリポソームは直径が１３０から１５０ｎｍであり、超音波処理リポソームは直径が２５ｎｍである。一本鎖コレステロール−ＤＮＡ（ｃｈｏｌ−ＤＮＡ）は、押し出し及び超音波処理プロセス中にリポソームに組み込まれた。異なるＤＮＡ鎖は、ＤＮＡ又はｃ−ＤＮＡ（相補ＤＮＡ鎖）と称される。膜タンパク質ＴＨは、界面活性剤によって媒介される再構成によって超音波処理リポソーム中に組み込まれた（Ｇｒａｎｅｌｉ等 ２００３；Ｍｅｕｌｌｅｒ等 １９９７；Ｒｉｃｈａｒｄ等 １９９０）。
【００７０】
表面調製：金表面は、異なる測定間でＳＤＳ及びｕｖ−オゾン処理によって清浄化された。
【００７１】
多層調製：ｃ−ＤＮＡで官能性を持たせたリポソーム又はタンパク質リポソームは、ｂｉｏ−ＤＮＡ改変表面に暴露された。結合が飽和した後に、追加のｃｈｏｌ−ｃ−ＤＮＡが固定リポソームに追加された。次いで、ｃｈｏｌ−ＤＮＡで官能性を持たせたリポソームが表面に暴露された。結合が飽和した後に、このプロセスが繰り返された。ただし、ｃｈｏｌ−ＤＮＡが添加され、続いてｃｈｏｌ−ｃ−ＤＮＡで改変された小胞が添加された）。次いで、これらのシーケンスが、５層のリポソームが固定されるまで繰り返された。
【００７２】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）：表面プラズモン共鳴測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）によって実施された。
結果
金表面上のリポソーム多層の固定についてのＳＰＲ−結果：多層におけるリポソームの固定化は、図３に示すようにＳＰＲによって測定された。表面プラズモンに伴い、表面からの距離に対するＳＰＲ感度も測定するエバネッセント波は、図３に模式的に示されたように、減衰長さ（ｄｅｃａｙ ｌｅｎｇｔｈ）が約４００ｎｍの指数挙動に従う。表面からの距離の増加に伴うエバネッセント波によって感知される体積の減少を考慮して、測定応答単位（ＡＭＲＵ）を式１によって真の応答単位（ＡＲＲＵ）に変換することができる（Ｌｉｅｄｂｅｒｇ等 １９９３）。
【００７３】
ΔＲＲＵ＝ΔＭＲＵ×ｅｚ／ｄｚ （１）
ここで、ｚは（ＱＣＭ−Ｄによって評価された（図３の挿入図参照）吸着層の厚さであり、ｄｚはエバネッセント場の減衰長さであり、この場合４００ｎｍである。
【００７４】
式１及び図３に示すΔＭＲＵを使用すると、吸着脂質の質量は式２によって求めることができる。
【００７５】
Δｍ＝Ｃ×ΔＲＲＵ （２）
ここで、Δｍは結合質量（ｃｏｕｐｌｅｄ ｍａｓｓ）であり、Ｃは１のΔＲＲＵの変化に相当する質量（ｎｇ）／ｃ２である。Ｃは、異なる分子の屈折率を用いてタンパク質に対して０．０６６ｎｇ／ｃｍ２、脂質に対して０．０５９ｎｇ／ｃｍ２と求められた。（Ｌｉｅｄｂｅｒｇ等 １９９３）表面に吸着した脂質質量の計算値を表１に示す。
【００７６】
【表１】
【００７７】
表１の結果によれば、ＡＭＲＵは表面からの距離が増加するにつれ減少するにもかかわらず、各層は実質的に同じ量の脂質小胞で構成される（図３）。したがって、相補ＤＮＡに基づく多層構造中に複数の脂質小胞を作製する本戦略は効率的であり、ほんの数層に限定されないと予想される。
【００７８】
ＴＨのトリプシン切断を含むＴＨ含有タンパク質リポソームの多層構造：タンパク質リポソームの多層を上述した金表面に固定した。固定化プロセスのＳＰＲ結果を図４に示す。タンパク質リポソームの単層の作製も示す。タンパク質の４３ｋＤドメインが除去されるＴＨのトリプシン切断は、リポソームのそれぞれ５層及び１層の飽和形成後に行われた。
【００７９】
図５は５層及び１層の小胞に対するトリプシン切断段階の拡大図であり、かなり多くのＴＨを有する多層構造が、単一小胞層よりもかなり大きな応答を示すことを正確に示している。認められた増幅は予想よりも実際に大きく、第１の小胞層中の膜タンパク質ＴＨが、下にある表面によって実際に影響を受けることを意味し、表面からの距離の増加につれ減少する効果を意味する。
【００８０】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】異なる又は同一の小胞２に付着した同一又は異なるリンカー５が、表面１に固定された同一又は異なるリンカー４に結合３することによって、３次元マトリックスに結合された複数の小胞２が形成される一実施態様を示す図である。小胞は、小胞を形成する脂質二重層に埋め込まれた生物活性化合物６も含み、その周囲環境は、生物活性化合物６との結合に対して場合によっては特異的であってもよい分析物７を含む。
【図２】外側に突出したリンカー５に付着した小胞が表面１に固定されたリンカー４に結合することによって小胞２の多層が形成される実施態様を示す図である。固定小胞に付着した他のリンカーは、小胞の第２の層を、前記小胞の第２の層に付着したリンカー５を介して固定するためにさらに使用される。これらの段階を繰り返すことによって多層が生成される。小胞は、小胞を形成する脂質二重層に埋め込まれた生物活性化合物６も含み、その周囲環境は、生物活性化合物６との結合に対して場合によっては特異的であってもよい分析物７を含む。
【図３】多層調製物のＳＰＲ結果における測定応答単位（ＭＲＵ）を示すグラフである。層の厚さ及びエバネッセント波によって感知される応答割合も示す。リポソームの５層が表面に固定された。
【図４】ＴＨ含有タンパク質リポソームの１層及び５層の固定化を示すグラフである。タンパク質リポソームの固定化後に、トリプシンが添加されてＴＨが切断され、その結果、表面から質量が失われる。
【図５】図４におけるタンパク質リポソームの１層又は５層におけるＴＨのトリプシン切断の詳細を示すグラフである。
【図６】小胞に付着したリンカー５と、小胞を形成する脂質二重層に埋め込まれた生物活性化合物６とを含む小胞２を示す図である。この図は、小胞の内部体積８も示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面（１）から十分離隔した複数の小胞（２）を含み、前記小胞は、表面固定リンカー（４）と小胞付着リンカー（５）によって生物学的に機能的な表面固定多層構造に直接付着され、前記小胞は、小胞付着リンカーによって別の小胞に場合によっては直接付着されてもよく、前記小胞は、その生物学的機能を有する前記構造をもたらす生物活性化合物（６）を含む、生物学的に機能的な表面固定多層構造。
【請求項２】
前記小胞が、小胞付着リンカー（５）によって表面固定リンカー（４）に直接付着され、その結果、少なくとも２個の小胞が各リンカー（４）に付着され、各小胞付着リンカーは、前記リンカー（４）には結合するが、別の小胞付着リンカーには結合しないようになされている、請求項１に記載の構造。
【請求項３】
前記構造に２個以上の小胞層を与えるように、前記小胞が、
ａ） 前記表面固定リンカー、及び
ｂ） 小胞付着リンカー
によって前記構造に付着されている、請求項１に記載の構造。
【請求項４】
前記リンカー（４、５）がオリゴヌクレオチドを含み、別のリンカーへのリンカーの前記結合が前記オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成によって媒介される、請求項１から３のいずれか一項に記載の構造。
【請求項５】
前記小胞付着リンカー（５）が、前記リンカー（５）に含まれる疎水性固着部分の少なくとも１個によって前記小胞（２）に付着され、前記リンカー（５）に含まれる官能基によって前記小胞（２）に共有結合する、請求項１又は４のいずれか一項に記載の構造。
【請求項６】
前記小胞（２）が、ポリエチレングリコール、Ｓ層（Ｓ−ｌａｙｅｒ）タンパク質、ペプチド、金属クラスター及びポリマーを含む群から選択される化合物を含む外殻で覆われ、又は脂質自体が重合によって連結されている、請求項１から５のいずれか一項に記載の構造。
【請求項７】
前記小胞（２）の内部体積（８）が、イオン、色素、薬物、抗体、酵素及び他のタンパク質を含む群から選択される化合物を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の構造。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドの前記ハイブリッド形成が実質的に配列特異的である、請求項４から７のいずれか一項に記載の構造。
【請求項９】
前記表面（１）から前記多層構造が放出されるようになされている、請求項１から８のいずれか一項に記載の構造。
【請求項１０】
前記放出が電位、光、浸透応力、又は前記放出を刺激する化合物とのインキュベーションによって引き起こされるように設計されている、請求項９に記載の構造。
【請求項１１】
前記表面から十分離隔した複数の小胞（２）を含み、前記小胞が、小胞付着リンカーによって表面固定リンカー（４）に沿って直接付着されており、それによって少なくとも２個の小胞が各リンカー（４）に付着されている、生物学的に機能的な表面固定多層構造。
【請求項１２】
各小胞付着リンカーが、前記表面固定リンカーには結合するが、別の小胞付着リンカーには結合しないようになされている、請求項１１に記載の構造。
【請求項１３】
前記表面固定リンカー（４）が、生物学的機能を有する少なくとも１個の非リンカー付着領域を含む、請求項１２に記載の構造。
【請求項１４】
前記小胞が、生物学的機能を示す化合物（６）を含む、請求項１２又は１３のいずれか一項に記載の構造。
【請求項１５】
前記非リンカー付着領域が分析物と特異的に結合可能である、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の構造。
【請求項１６】
前記リンカー（４、５）がオリゴヌクレオチドを含み、別のリンカーへのリンカーの前記結合が前記オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成によって媒介される、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の構造。
【請求項１７】
前記小胞付着リンカー（５）が、前記リンカー（５）に含まれる疎水性固着部分の少なくとも１個によって前記小胞（２）に付着されており、前記リンカー（５）に含まれる官能基によって前記小胞（２）に共有結合する、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の構造。
【請求項１８】
前記小胞（２）が、ポリエチレングリコール、Ｓ層タンパク質、ペプチド、金属クラスター及びポリマーを含む群から選択される化合物を含む外殻で覆われており、又は脂質自体が重合によって連結されている、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の構造。
【請求項１９】
前記小胞（２）の内部体積（８）が、イオン、色素、薬物、抗体、酵素及び他のタンパク質を含む群から選択される化合物を含む、請求項１２から１８のいずれか一項に記載の構造。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドの前記ハイブリッド形成が実質的に配列特異的である、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の構造。
【請求項２１】
前記表面（１）から前記多層構造が放出されるようになされている、請求項１２から２０のいずれか一項に記載の構造。
【請求項２２】
前記放出が電位、光、浸透応力、又は前記放出を刺激する化合物とのインキュベーションによって引き起こされるように設計されている、請求項２１に記載の構造。
【請求項２３】
複数の小胞（２）を含み、前記小胞は、表面固定化によって生物学的に機能的な表面固定多層構造に直接付着されており、及び小胞付着リンカー（５）によって別の小胞に直接付着されており、少なくとも前記小胞の選択集団が、その生物学的機能を有する前記構造をもたらす生物活性化合物（６）を含む、生物学的に機能的な表面固定多層構造。
【請求項２４】
小胞の表面固定化が、表面固定リンカー（４）と小胞付着リンカー（５）による前記構造との直接付着を含む、請求項２３に記載の構造。
【請求項２５】
小胞の表面固定化が、別の小胞付着リンカーに結合可能な少なくとも１個の小胞付着リンカー（５）を各々が有する直接表面付着用の第１の小胞集団を含む、請求項２３に記載の構造。
【請求項２６】
前記リンカー（４、５）がオリゴヌクレオチドを含み、別のリンカーへのリンカーの前記結合が前記オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成によって媒介される、請求項２３又は２４のいずれか一項に記載の構造。
【請求項２７】
前記小胞付着リンカー（５）が、前記リンカー（５）に含まれる疎水性固着部分の少なくとも１個によって前記小胞（２）に付着されており、前記リンカー（５）に含まれる官能基によって前記小胞（２）に共有結合している、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の構造。
【請求項２８】
前記小胞（２）が、ポリエチレングリコール、Ｓ層タンパク質、ペプチド、金属クラスター及びポリマーを含む群から選択される化合物を含む外殻で覆われており、又は脂質自体が重合によって連結されている、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の構造。
【請求項２９】
前記小胞（２）の内部体積（８）が、イオン、色素、薬物、抗体、酵素及び他のタンパク質を含む群から選択される化合物を含む、請求項２３から２８のいずれか一項に記載の構造。
【請求項３０】
前記オリゴヌクレオチドの前記ハイブリッド形成が実質的に配列特異的である、請求項２３から２９のいずれか一項に記載の構造。
【請求項３１】
前記表面（１）から前記多層構造が放出されるようになされている、請求項２３から３０のいずれか一項に記載の構造。
【請求項３２】
前記放出が電位、光、浸透応力、又は前記放出を刺激する化合物とのインキュベーションによって引き起こされるように設計されている、請求項３１に記載の構造。
【請求項３３】
（ｉ）少なくとも１個の小胞付着リンカー（５）に結合するようになされ、少なくとも１個の小胞付着リンカー（５）との結合に利用可能である少なくとも１個の表面固定リンカー（４）、又は１個以上の小胞付着リンカー（５）を各々が備える直接表面固定小胞の第１の層のどちらかを含む表面（１）を用意する段階と、
（ｉｉ）表面固定リンカー（４）又は別の小胞付着リンカー（５）に直接結合するようになされ、表面固定リンカー（４）又は別の小胞付着リンカー（５）との直接結合に利用可能である少なくとも１個の外側に突出した小胞付着リンカー（５）を各々が含む小胞（２）を用意する段階と、
（ｉｉｉ）表面固定リンカーへの、又は表面固定多層構造にすでに固定された小胞付着リンカーへの小胞付着リンカーの直接的結合を促進する条件下で、前記小胞（２）の少なくとも１個を前記表面（１）とともにインキュベートする段階と、その結果、
（ｉｖ）別の小胞付着リンカー（５）との結合に利用可能である少なくとも１個の構造固定リンカー及び／又は表面固定リンカーをこの段階の後に含む前記構造に、小胞と小胞に付着されたリンカーとが固定される段階と、
（ｖ）小胞（２）の所望の量が前記構造に固定されるまで前の段階又は前の２段階を繰り返す段階と、
を含む、複数の小胞の表面固定多層構造を生成する方法。
【請求項３４】
前記表面固定リンカー（４）が、小胞付着リンカー（５）の結合用の少なくとも２個の部位を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
各小胞付着リンカー（５）が、前記表面固定リンカー（４）には結合するが、別の小胞付着リンカー（５）には結合しないようになされている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記表面固定リンカー（４）が、小胞付着リンカー（５）の結合用の１個のみの部位を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
各小胞が、少なくとも２個の小胞付着リンカー（５）を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記リンカー（４、５）がオリゴヌクレオチドを含み、別のリンカーへのリンカーの前記結合が前記オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成によって媒介される、請求項３３から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記小胞付着リンカー（５）が、前記リンカーに含まれる疎水性固着部分の少なくとも１個によって前記小胞（２）に付着されており、前記リンカーに含まれる官能基によって前記小胞に共有結合している、請求項３３から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記小胞（２）が、生物学的機能を示す生物活性化合物（６）を含む、請求項３３から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記小胞（２）が、ポリエチレングリコール、Ｓ層タンパク質、ペプチド、金属クラスター及びポリマーを含む群から選択される化合物を含む外殻で覆われた、請求項３３から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記小胞（２）の内部体積が、イオン、色素、薬物、抗体、酵素及び他のタンパク質を含む群から選択される化合物を含む、請求項３３から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記表面（１）が、前記構造用結合マトリックスとして働くいくつかの表面固定小胞を含む、請求項３３から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記インキュベーションが、前記オリゴヌクレオチドの配列特異的ハイブリッド形成を促進する条件下で実施される、請求項３８、又は請求項３８に従属するときには請求項３９から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
小胞（２）から化合物を放出する段階も含む、請求項３３から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記放出が、印加された電位浸透応力、又は前記放出を刺激する化合物とのインキュベーションによって引き起こされる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
請求項３３から４６のいずれか一項に記載の方法と、それに続く前記表面（１）から前記多層構造を放出する段階とを含む、複数の小胞の多層構造を生成する方法。
【請求項４８】
前記放出が、電位、浸透応力、又は前記放出を刺激する化合物とのインキュベーションによって引き起こされる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
請求項１から３２のいずれか一項に記載の構造のバイオセンサーとしての使用、又は請求項３３から４８のいずれか一項によって生成される構造のバイオセンサーとしての使用。
【請求項５０】
請求項１から３２のいずれか一項に記載の構造のバイオセンサーにおける使用、又は請求項３３から４８のいずれか一項によって生成される構造のバイオセンサーにおける使用。
【請求項５１】
前記構造の形成が前記バイオセンサーによってモニターされる、請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
前記バイオセンサーが光学バイオセンサーであり、前記構造が前記光学バイオセンサーの信号を増大させるために使用される、請求項５０又は５１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５３】
前記バイオセンサーが機械的バイオセンサーであり、前記構造が前記機械的バイオセンサーの信号を増大させるために使用される、請求項５０又は５１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５４】
化合物の複雑な溶液から１種類若しくは数種類の化合物（７）を特異的に除去又は抽出するための、請求項１から３２のいずれか一項に記載の構造の使用、又は請求項３３から４８のいずれか一項によって生成される構造の使用。
【請求項５５】
小胞（２）からの化合物の放出を感知するための、請求項１から３２のいずれか一項に記載の構造の使用、又は請求項３３から４８のいずれか一項によって生成される構造の使用。
【請求項５６】
前記放出が、印加された電位、浸透応力、又は前記放出を刺激する化合物とのインキュベーションによって引き起こされる、請求項５５に記載の使用。
【請求項５７】
前記放出が、特異的又は局所的薬物送達に使用される、請求項５５又は５６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５８】
前記放出がバイオセンサーとして使用される、請求項５５又は５６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５９】
いくつかの化合物の同時分析のための、請求項４９から５８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６０】
画像処理のための、請求項１から３２のいずれか一項に記載の構造の使用、又は請求項３３から４８のいずれか一項によって生成される構造の使用。
【請求項６１】
リンカー（４、５）、小胞（２）、前記リンカーを前記小胞に付着させる化合物、及び前記リンカー（４、５）を表面（１）に固定する化合物を含む、請求項１から６０のいずれか一項に記載の複数の小胞の表面固定多層構造の生成に適切な化学組成物を含む部品のキット。
【請求項６２】
生物活性化合物を前記小胞（２）に付着させる化合物の少なくとも１個及び生物活性化合物（６）も含む、請求項６１に記載の部品のキット。
【請求項１】
表面（１）から十分離隔した複数の小胞（２）を含み、前記小胞は、表面固定リンカー（４）と小胞付着リンカー（５）によって生物学的に機能的な表面固定多層構造に直接付着され、前記小胞は、小胞付着リンカーによって別の小胞に場合によっては直接付着されてもよく、前記小胞は、その生物学的機能を有する前記構造をもたらす生物活性化合物（６）を含む、生物学的に機能的な表面固定多層構造。
【請求項２】
前記小胞が、小胞付着リンカー（５）によって表面固定リンカー（４）に直接付着され、その結果、少なくとも２個の小胞が各リンカー（４）に付着され、各小胞付着リンカーは、前記リンカー（４）には結合するが、別の小胞付着リンカーには結合しないようになされている、請求項１に記載の構造。
【請求項３】
前記構造に２個以上の小胞層を与えるように、前記小胞が、
ａ） 前記表面固定リンカー、及び
ｂ） 小胞付着リンカー
によって前記構造に付着されている、請求項１に記載の構造。
【請求項４】
前記リンカー（４、５）がオリゴヌクレオチドを含み、別のリンカーへのリンカーの前記結合が前記オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成によって媒介される、請求項１から３のいずれか一項に記載の構造。
【請求項５】
前記小胞付着リンカー（５）が、前記リンカー（５）に含まれる疎水性固着部分の少なくとも１個によって前記小胞（２）に付着され、前記リンカー（５）に含まれる官能基によって前記小胞（２）に共有結合する、請求項１又は４のいずれか一項に記載の構造。
【請求項６】
前記小胞（２）が、ポリエチレングリコール、Ｓ層（Ｓ−ｌａｙｅｒ）タンパク質、ペプチド、金属クラスター及びポリマーを含む群から選択される化合物を含む外殻で覆われ、又は脂質自体が重合によって連結されている、請求項１から５のいずれか一項に記載の構造。
【請求項７】
前記小胞（２）の内部体積（８）が、イオン、色素、薬物、抗体、酵素及び他のタンパク質を含む群から選択される化合物を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の構造。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドの前記ハイブリッド形成が実質的に配列特異的である、請求項４から７のいずれか一項に記載の構造。
【請求項９】
前記表面（１）から前記多層構造が放出されるようになされている、請求項１から８のいずれか一項に記載の構造。
【請求項１０】
前記放出が電位、光、浸透応力、又は前記放出を刺激する化合物とのインキュベーションによって引き起こされるように設計されている、請求項９に記載の構造。
【請求項１１】
前記表面から十分離隔した複数の小胞（２）を含み、前記小胞が、小胞付着リンカーによって表面固定リンカー（４）に沿って直接付着されており、それによって少なくとも２個の小胞が各リンカー（４）に付着されている、生物学的に機能的な表面固定多層構造。
【請求項１２】
各小胞付着リンカーが、前記表面固定リンカーには結合するが、別の小胞付着リンカーには結合しないようになされている、請求項１１に記載の構造。
【請求項１３】
前記表面固定リンカー（４）が、生物学的機能を有する少なくとも１個の非リンカー付着領域を含む、請求項１２に記載の構造。
【請求項１４】
前記小胞が、生物学的機能を示す化合物（６）を含む、請求項１２又は１３のいずれか一項に記載の構造。
【請求項１５】
前記非リンカー付着領域が分析物と特異的に結合可能である、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の構造。
【請求項１６】
前記リンカー（４、５）がオリゴヌクレオチドを含み、別のリンカーへのリンカーの前記結合が前記オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成によって媒介される、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の構造。
【請求項１７】
前記小胞付着リンカー（５）が、前記リンカー（５）に含まれる疎水性固着部分の少なくとも１個によって前記小胞（２）に付着されており、前記リンカー（５）に含まれる官能基によって前記小胞（２）に共有結合する、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の構造。
【請求項１８】
前記小胞（２）が、ポリエチレングリコール、Ｓ層タンパク質、ペプチド、金属クラスター及びポリマーを含む群から選択される化合物を含む外殻で覆われており、又は脂質自体が重合によって連結されている、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の構造。
【請求項１９】
前記小胞（２）の内部体積（８）が、イオン、色素、薬物、抗体、酵素及び他のタンパク質を含む群から選択される化合物を含む、請求項１２から１８のいずれか一項に記載の構造。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドの前記ハイブリッド形成が実質的に配列特異的である、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の構造。
【請求項２１】
前記表面（１）から前記多層構造が放出されるようになされている、請求項１２から２０のいずれか一項に記載の構造。
【請求項２２】
前記放出が電位、光、浸透応力、又は前記放出を刺激する化合物とのインキュベーションによって引き起こされるように設計されている、請求項２１に記載の構造。
【請求項２３】
複数の小胞（２）を含み、前記小胞は、表面固定化によって生物学的に機能的な表面固定多層構造に直接付着されており、及び小胞付着リンカー（５）によって別の小胞に直接付着されており、少なくとも前記小胞の選択集団が、その生物学的機能を有する前記構造をもたらす生物活性化合物（６）を含む、生物学的に機能的な表面固定多層構造。
【請求項２４】
小胞の表面固定化が、表面固定リンカー（４）と小胞付着リンカー（５）による前記構造との直接付着を含む、請求項２３に記載の構造。
【請求項２５】
小胞の表面固定化が、別の小胞付着リンカーに結合可能な少なくとも１個の小胞付着リンカー（５）を各々が有する直接表面付着用の第１の小胞集団を含む、請求項２３に記載の構造。
【請求項２６】
前記リンカー（４、５）がオリゴヌクレオチドを含み、別のリンカーへのリンカーの前記結合が前記オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成によって媒介される、請求項２３又は２４のいずれか一項に記載の構造。
【請求項２７】
前記小胞付着リンカー（５）が、前記リンカー（５）に含まれる疎水性固着部分の少なくとも１個によって前記小胞（２）に付着されており、前記リンカー（５）に含まれる官能基によって前記小胞（２）に共有結合している、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の構造。
【請求項２８】
前記小胞（２）が、ポリエチレングリコール、Ｓ層タンパク質、ペプチド、金属クラスター及びポリマーを含む群から選択される化合物を含む外殻で覆われており、又は脂質自体が重合によって連結されている、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の構造。
【請求項２９】
前記小胞（２）の内部体積（８）が、イオン、色素、薬物、抗体、酵素及び他のタンパク質を含む群から選択される化合物を含む、請求項２３から２８のいずれか一項に記載の構造。
【請求項３０】
前記オリゴヌクレオチドの前記ハイブリッド形成が実質的に配列特異的である、請求項２３から２９のいずれか一項に記載の構造。
【請求項３１】
前記表面（１）から前記多層構造が放出されるようになされている、請求項２３から３０のいずれか一項に記載の構造。
【請求項３２】
前記放出が電位、光、浸透応力、又は前記放出を刺激する化合物とのインキュベーションによって引き起こされるように設計されている、請求項３１に記載の構造。
【請求項３３】
（ｉ）少なくとも１個の小胞付着リンカー（５）に結合するようになされ、少なくとも１個の小胞付着リンカー（５）との結合に利用可能である少なくとも１個の表面固定リンカー（４）、又は１個以上の小胞付着リンカー（５）を各々が備える直接表面固定小胞の第１の層のどちらかを含む表面（１）を用意する段階と、
（ｉｉ）表面固定リンカー（４）又は別の小胞付着リンカー（５）に直接結合するようになされ、表面固定リンカー（４）又は別の小胞付着リンカー（５）との直接結合に利用可能である少なくとも１個の外側に突出した小胞付着リンカー（５）を各々が含む小胞（２）を用意する段階と、
（ｉｉｉ）表面固定リンカーへの、又は表面固定多層構造にすでに固定された小胞付着リンカーへの小胞付着リンカーの直接的結合を促進する条件下で、前記小胞（２）の少なくとも１個を前記表面（１）とともにインキュベートする段階と、その結果、
（ｉｖ）別の小胞付着リンカー（５）との結合に利用可能である少なくとも１個の構造固定リンカー及び／又は表面固定リンカーをこの段階の後に含む前記構造に、小胞と小胞に付着されたリンカーとが固定される段階と、
（ｖ）小胞（２）の所望の量が前記構造に固定されるまで前の段階又は前の２段階を繰り返す段階と、
を含む、複数の小胞の表面固定多層構造を生成する方法。
【請求項３４】
前記表面固定リンカー（４）が、小胞付着リンカー（５）の結合用の少なくとも２個の部位を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
各小胞付着リンカー（５）が、前記表面固定リンカー（４）には結合するが、別の小胞付着リンカー（５）には結合しないようになされている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記表面固定リンカー（４）が、小胞付着リンカー（５）の結合用の１個のみの部位を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
各小胞が、少なくとも２個の小胞付着リンカー（５）を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記リンカー（４、５）がオリゴヌクレオチドを含み、別のリンカーへのリンカーの前記結合が前記オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成によって媒介される、請求項３３から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記小胞付着リンカー（５）が、前記リンカーに含まれる疎水性固着部分の少なくとも１個によって前記小胞（２）に付着されており、前記リンカーに含まれる官能基によって前記小胞に共有結合している、請求項３３から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記小胞（２）が、生物学的機能を示す生物活性化合物（６）を含む、請求項３３から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記小胞（２）が、ポリエチレングリコール、Ｓ層タンパク質、ペプチド、金属クラスター及びポリマーを含む群から選択される化合物を含む外殻で覆われた、請求項３３から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記小胞（２）の内部体積が、イオン、色素、薬物、抗体、酵素及び他のタンパク質を含む群から選択される化合物を含む、請求項３３から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記表面（１）が、前記構造用結合マトリックスとして働くいくつかの表面固定小胞を含む、請求項３３から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記インキュベーションが、前記オリゴヌクレオチドの配列特異的ハイブリッド形成を促進する条件下で実施される、請求項３８、又は請求項３８に従属するときには請求項３９から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
小胞（２）から化合物を放出する段階も含む、請求項３３から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記放出が、印加された電位浸透応力、又は前記放出を刺激する化合物とのインキュベーションによって引き起こされる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
請求項３３から４６のいずれか一項に記載の方法と、それに続く前記表面（１）から前記多層構造を放出する段階とを含む、複数の小胞の多層構造を生成する方法。
【請求項４８】
前記放出が、電位、浸透応力、又は前記放出を刺激する化合物とのインキュベーションによって引き起こされる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
請求項１から３２のいずれか一項に記載の構造のバイオセンサーとしての使用、又は請求項３３から４８のいずれか一項によって生成される構造のバイオセンサーとしての使用。
【請求項５０】
請求項１から３２のいずれか一項に記載の構造のバイオセンサーにおける使用、又は請求項３３から４８のいずれか一項によって生成される構造のバイオセンサーにおける使用。
【請求項５１】
前記構造の形成が前記バイオセンサーによってモニターされる、請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
前記バイオセンサーが光学バイオセンサーであり、前記構造が前記光学バイオセンサーの信号を増大させるために使用される、請求項５０又は５１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５３】
前記バイオセンサーが機械的バイオセンサーであり、前記構造が前記機械的バイオセンサーの信号を増大させるために使用される、請求項５０又は５１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５４】
化合物の複雑な溶液から１種類若しくは数種類の化合物（７）を特異的に除去又は抽出するための、請求項１から３２のいずれか一項に記載の構造の使用、又は請求項３３から４８のいずれか一項によって生成される構造の使用。
【請求項５５】
小胞（２）からの化合物の放出を感知するための、請求項１から３２のいずれか一項に記載の構造の使用、又は請求項３３から４８のいずれか一項によって生成される構造の使用。
【請求項５６】
前記放出が、印加された電位、浸透応力、又は前記放出を刺激する化合物とのインキュベーションによって引き起こされる、請求項５５に記載の使用。
【請求項５７】
前記放出が、特異的又は局所的薬物送達に使用される、請求項５５又は５６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５８】
前記放出がバイオセンサーとして使用される、請求項５５又は５６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５９】
いくつかの化合物の同時分析のための、請求項４９から５８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６０】
画像処理のための、請求項１から３２のいずれか一項に記載の構造の使用、又は請求項３３から４８のいずれか一項によって生成される構造の使用。
【請求項６１】
リンカー（４、５）、小胞（２）、前記リンカーを前記小胞に付着させる化合物、及び前記リンカー（４、５）を表面（１）に固定する化合物を含む、請求項１から６０のいずれか一項に記載の複数の小胞の表面固定多層構造の生成に適切な化学組成物を含む部品のキット。
【請求項６２】
生物活性化合物を前記小胞（２）に付着させる化合物の少なくとも１個及び生物活性化合物（６）も含む、請求項６１に記載の部品のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００６−５２３８４０（Ｐ２００６−５２３８４０Ａ）
【公表日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０８０１２（Ｐ２００６−５０８０１２）
【出願日】平成１６年４月７日（２００４．４．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００４／０００５５５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９０１６５
【国際公開日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【出願人】（５０５３７５５０６）レイヤーラボ・アクテイエボラーグ (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年４月７日（２００４．４．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＥ２００４／０００５５５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９０１６５
【国際公開日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【出願人】（５０５３７５５０６）レイヤーラボ・アクテイエボラーグ (2)
【Ｆターム（参考）】
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