表面プラズモン共鳴チップ
【課題】チップ面に凹凸を設けることにより検出対象をその寸法の大小により区分けすることが可能であり、しかも、製造が容易かつ安価な表面プラズモン共鳴チップを提供する。
【解決手段】光を透過する光透過性素材によって形成された基板２と、基板２表面に形成された金属膜３と、金属膜３の表面に形成された複数の突起４とを備えており、複数の突起４は、その先端から基板２表面までの距離が、金属膜３に対して基板２側から光を照射したときに発生するエバネッセント光の影響が及ぶ距離よりも長くなるように形成されている。複数の突起４間に物質が侵入し、エバネッセント光の影響が及ぶ領域に到達すると、表面プラズモン共鳴によってその物質の存在を検出することができる。複数の突起４間には、チップ１表面に特別な抗体等を設けなくても、複数の突起４間の距離を調整するだけで所望の検出対象Ｍ１を選んで検出することができる。
【解決手段】光を透過する光透過性素材によって形成された基板２と、基板２表面に形成された金属膜３と、金属膜３の表面に形成された複数の突起４とを備えており、複数の突起４は、その先端から基板２表面までの距離が、金属膜３に対して基板２側から光を照射したときに発生するエバネッセント光の影響が及ぶ距離よりも長くなるように形成されている。複数の突起４間に物質が侵入し、エバネッセント光の影響が及ぶ領域に到達すると、表面プラズモン共鳴によってその物質の存在を検出することができる。複数の突起４間には、チップ１表面に特別な抗体等を設けなくても、複数の突起４間の距離を調整するだけで所望の検出対象Ｍ１を選んで検出することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
まず、表面プラズモン共鳴について簡単に説明する。
表面プラズモン共鳴とは、金属薄膜を蒸着したプリズム等（以下、単にＳＰＲチップという）において、ＳＰＲチップのプリズム側から金属薄膜に対して全反射条件にて入射光を照射したときに生じるエバネッセント波に起因して、金属薄膜に表面プラズモンが共鳴励起される現象である。
この共鳴現象の発生の有無は金属薄膜に入射される入射光の入射角に依存しており、一定の入射角のときに表面プラズモンが共鳴励起されるとともに、金属薄膜から反射される反射光強度が減少する。反射光強度が減少する理由は、金属薄膜に照射した光のエネルギーが表面プラズモンの励起に利用されるからである。
【０００３】
共鳴現象が発生する入射光の入射角はＳＰＲチップにおける金属薄膜の表面上の物質の状態によって変化するので、この性質を利用して、ＳＰＲチップを使用して特定の物質を検出する技術が開発されている。
例えば、ＳＰＲチップにおける金属膜の表面に特定の細胞と結合する生理活性物質等を固定しておき、このチップの表面に検出対象となる試料を配置する。そして、金属薄膜に対して全反射条件にて入射光をその入射角度を変えながら照射する。試料中に目的とする細胞等が存在すれば、細胞等と生理活性物質等とが反応して金属薄膜表面の状態が変化する。すると、試料中に目的とする細胞等が存在しない場合に対して、反射光強度が減少する入射角が変化するので、目的とする細胞等の存在の有無を検出することができる。
【０００４】
かかる表面プラズモン共鳴を利用した測定は、生体分子間の相互作用をリアルタイム、非修飾、高感度で検出できることから、様々な目的に適したＳＰＲチップが開発されている（非特許文献１、特許文献１）。
【０００５】
非特許文献１には、局所プラズモン共鳴を生じさせるＳＰＲチップが開示されている。このＳＰＲチップでは、表面にナノオーダーの金属構造物が周期的に配列されており、金属構造物のサイズや隙間をコントロールすれば、金属構造物に電界を集中してセンシング領域を局在化できるので、環境要因によるノイズを低減することが可能となる旨が記載されている。
【０００６】
また、特許文献１には、検出対象となる溶液を所定時間にわたり表面に保持しておくことができるＳＰＲチップが開示されている。このＳＰＲチップは、基板と基板に積層された表面層とを有しており、検出対象となる溶液と基板との親和性が、溶液と表面層との親和性よりも高くされており、かつ、表面層には基板の表面に達する溝が形成されている。このため、ＳＰＲチップに溶液を滴下すると、溶液が溝に侵入しかつ溝内で親和性の高い基板と接触するので、溶液と表面層との親和性が低くても、表面層上に溶液を安定した状態で保持できる旨の記載がある。
【０００７】
しかるに、上述したＳＰＲチップでは、検出対象となる細胞等を補捉したりまたは検出対象となる細胞等と反応する生理活性物質等を金属層の表面に設けたりしており、かかる生理活性物質等によって検出対象となる細胞を他の物質と判別選択している。
しかし、ＳＰＲチップによって判別選択できる検出対象は、ＳＰＲチップに固定されている生理活性物質等に限定されるので、複数の検出対象の検査を行うには、各検出対象に適した生理活性物質等が金属層の表面に設けられた複数のチップをそれぞれ用意しなければならない。
【０００８】
別のＳＰＲチップの使い方として、通常のフラットな表面を有するＳＰＲチップにおいて、その表面上に何も設けないで溶液のみを滴下し、その場合における反射光強度が減少する入射角（ＳＰＲ角）を測定することも行われている。この場合には、ＳＰＲチップの表面に滴下された溶液の濃度や屈折率に応じて、ＳＰＲ角が変わるので、溶液の濃度測定などに用いることができる。
しかし、かかる方法では、溶液の濃度や屈折率変化は分るが、溶液に含まれる対象物等をその大きさにより分別することはできない。
【０００９】
【特許文献１】特開２００７−１７４３２
【非特許文献１】松下智彦、西川武男、山下英之 「局所ＳＰＲバイオセンサーの研究」ＯＭＲＯＮ ＴＥＣＮＩＣＳ Vol.４７，No.1（通巻155号）2006，ＰＰ２−７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は上記事情に鑑み、表面に凹凸を設けることにより検出対象をその寸法の大小によって区分けすることが可能であり、しかも、製造が容易かつ安価な表面プラズモン共鳴チップを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第１発明の表面プラズモン共鳴チップは、光を透過する光透過性素材によって形成された基板と、該基板表面に形成された金属膜と、該金属膜の表面に形成された複数の突起とを備えており、該複数の突起は、その先端から前記基板表面までの距離が、前記金属膜に対して前記基板側から光を照射したときに発生するエバネッセント光の影響が及ぶ距離よりも長くなるように形成されていることを特徴とする。
第２発明の表面プラズモン共鳴チップは、第１発明において、前記複数の突起は、隣接する突起間の距離が、前記金属膜に向かうに従って変化するように形成されていることを特徴とする。
第３発明の表面プラズモン共鳴チップは、第１または第２発明において、前記複数の突起は、隣接する突起間の距離が、前記金属膜に向かうに従って短くなるように形成されていることを特徴とする。
第４発明の表面プラズモン共鳴チップは、第１、２または第３発明において、特定の物質の通過を阻害する物質が、前記複数の突起間に設けられていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
第１発明によれば、複数の突起間に物質が侵入し、エバネッセント光の影響が及ぶ領域に到達すると、表面プラズモン共鳴によってその物質の存在を検出することができる。しかも、複数の突起間には突起間距離よりも小さい物質しか侵入できないので、チップ表面に特別な抗体等を設けなくても、複数の突起間の距離を調整するだけで所望の検出対象を選んで検出することができる。そして、検出対象の大きさのみによって物質を選択しているので、一つのチップを複数の検出対象に対して使用することもできる。
第２発明によれば、複数の突起間に侵入した物質が時間の経過によって大きさが変化する場合、突起間距離と物質の大きさに応じて、物質と金属膜との距離が変化するから、時間の経過に伴った物質の変化を確認することができる。
第３発明によれば、複数の突起間に侵入した物質が時間の経過によって大きさが変化する場合、突起間距離と物質の大きさに応じて、物質と金属膜との距離が変化するから、時間の経過に伴った物質の変化を確認することができる。
第４発明によれば、目的とする検出対象と近似した形状の大きさを有する物質であって、目的とする検出対象を検出する上で障害となる物質が突起間に侵入することを防ぐことができるので、検査精度を高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
つぎに、本発明の実施形態を図面に基づき説明する。
図１は本実施形態のＳＰＲチップ１の説明図であって、（Ａ）は概略断面図であり、（Ｂ）は概略平面図である。同図に示すように、表面プラズモン共鳴チップ（以下、単にＳＰＲチップ１で示す）は、基板２と、基板２の表面に形成された金属膜３と、この金属膜３の表面に形成された突起４とから構成されている。
【００１４】
基板２は、例えば、ガラスや樹脂材料等のように光を透過する材料によって形成された板状の部材である。この基板２は、その厚さが０．１〜０．５ｍｍ程度であるが、この厚さはとくに限定されない。
なお、基板２は板状の部材に限られず、プリズムや光導波路等でもよい。
【００１５】
金属膜３は、例えば金や銀等の金属を素材とする膜である。この金属膜３は、その厚さが５０ｎｍ程度の場合に、ＳＰＲチップ表面における物質の状態の変化等を検出する感度（ＳＰＲ感度）が良いと一般に知られている。この金属膜３の厚さは、ＳＰＲチップ１に入射された入射光Ｌ１によって発生するエバネッセント光の影響が及ぶしみ出し深さＨ２(以下、距離Ｈ２で示す)よりも十分うすい。
そして、本実施形態のＳＰＲチップ１において、基板２表面から距離Ｈ２の範囲において金属膜３の部分を除いた空間、つまり、金属膜３より上方の空間であって基板２表面から距離Ｈ２の範囲に位置する空間が検査領域となる。
なお、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象を生じさせるためには、一般的に金属膜３の厚さは約５０ｎｍ程度が望ましいとされており、このとき、距離Ｈ２は検出対象の屈折率や入射角度に依存するが、おおよそ数百ｎｍ程度となる。
【００１６】
図１に示すように、金属膜３の表面には、軸方向に沿って延びた複数の突起４が設けられている。この複数の突起４は、隣接する突起４，４同士の間に、幅Ｗ（以下、突起間距離Ｗという）の空間１ｈができるように、互いに平行に配設されている。
各突起４は、その先端から前記基板１表面までの距離Ｈ１(以下、距離Ｈ１で示す)が前記距離Ｈ２よりも長くなるように形成されている。具体的には、距離Ｈ１が、約１〜３μｍとなるように形成されている。
なお、距離Ｈ１は、上記範囲に限定されず、検出対象やこの検出対象を含む溶液の屈折率、突起間距離Ｗ等に応じて適宜調整することができる。
【００１７】
つぎに、本実施形態のＳＰＲチップ１を利用した検出対象Ｍ１を検出する作業を、図１〜３に基づいて説明する。なお、図面が分かり易くなるように、検出対象Ｍ１を含む試料は記載していない。
【００１８】
まず、本実施形態のＳＰＲチップ１として、突起間距離Ｗが検出対象Ｍ１の幅や直径よりも大きいものを準備する。そして、検出対象Ｍ１を含まない液体等の試料をＳＰＲチップ１上に配置した状態で、ＳＰＲチップ１に対して基板２側から全反射条件で入射光Ｌ１を入射する(図１参照)。そして、全反射条件を保ったまま、入射光Ｌ１の入射角を変化させて、反射光Ｌ２の強度が減衰する入射光Ｌ１の入射角θ１（検出対象Ｍ１を含まない試料の共鳴角θ１）を検出する(図３)。
なお、図３において、符号ＲＬ１が、検出対象Ｍ１を含まない試料における入射光Ｌ１の入射角に対する反射光強度を示したものである。
【００１９】
ついで、同じＳＰＲチップ１上に検出対象Ｍ１を含む液体等の試料を配置する。すると、試料に含まれる検出対象Ｍ１は突起間距離Ｗよりも小さいので、突起４，４間の空間１ｈ内に侵入し、検査領域内に到達する（図２（Ａ））。
一方、試料に含まれる他の物質、具体的には、突起間距離Ｗよりも大きい物質Ｍ２は、空間１ｈ内に侵入することができない。つまり、試料に含まれる物質のうち、所望の検出対象Ｍ１のみが選択されて検査領域内に配置される。
【００２０】
上記状態において、ＳＰＲチップ１に対して、基板２側から全反射条件で入射光Ｌ１を入射して、その入射角を変化させていくと、反射光Ｌ２の強度の減衰する入射光Ｌ１の入射角θ２（検出対象Ｍ１を含む試料の共鳴角θ２）を検出することができる(図３)。
なお、図３において、符号ＲＬ２が、検出対象Ｍ１を含む試料における入射光Ｌ１の入射角に対する反射光強度を示したものである。
【００２１】
ここで、反射光Ｌ２の強度の減衰は入射光Ｌ１によって金属膜３表面に発生する表面プラズモン共鳴の影響で生じるのであるが、検出対象Ｍ１が検査領域内に存在すると、この検出対象Ｍ１の影響により、反射光Ｌ２の強度が減衰する角度が変化する（図３）。
【００２２】
このため、共鳴角θ１と共鳴角θ２とを比較すれば、検出対象Ｍ１が試料中に存在するか否かを確認することができる。
しかも、共鳴角θ１と共鳴角θ２との差の度合いから、検出対象Ｍ１の存在の多寡を把握することもできる。
【００２３】
以上のごとく、本実施形態のＳＰＲチップ１によれば、複数の突起４，４間の空間１ｈには、突起間距離Ｗよりも小さい物質しか侵入できないので、ＳＰＲチップ１の表面に特別な抗体等を設けなくても、突起間距離Ｗを調整するだけで所望の検出対象Ｍ１を選んで検出することができる。
【００２４】
例えば、突起間距離Ｗを赤血球よりも僅かに広くしておけば、赤血球単体は空間１ｈに侵入するが、赤血球同士が相互作用をおこしている場合や凝集をおこしている場合は空間１ｈに侵入することができない。このため、血液を本実施形態のＳＰＲチップ１に適用させたときに、赤血球同士の相互作用が少ない血液の場合、空間１ｈに侵入する赤血球が多くなるが、赤血球同士の相互作用が多い場合、空間１ｈに侵入する赤血球が少なくなる。そして、空間１ｈ内の赤血球の量が異なれば共鳴角θ２も異なるから、本実施形態のＳＰＲチップ１を利用して共鳴角θ２を検出すれば、血液の状態を判定することも可能である。
【００２５】
また、本実施形態のＳＰＲチップ１では、突起間距離Ｗだけで検査する対象を選別しているので、ＳＰＲチップ１によって検出できる検出対象Ｍ１の制約が少なく、突起間距離Ｗよりも小さい物質であれば、様々な物質の判別選択に使用することができる。
【００２６】
さらに、本実施形態のＳＰＲチップ１では、複数の突起４，４間の空間１ｈに検出対象となる物質を侵入させるだけであり、ＳＰＲチップ１の表面と検出対象となる物質とが反応するわけではない。すると、検査終了後、ＳＰＲチップ１上の検出対象等を除去すれば、ＳＰＲチップ１を再利用することも可能であるし、再利用が非常に容易になる。
【００２７】
ここで、本実施形態のＳＰＲチップ１では、試料中に検出対象Ｍ１と同等程度の大きさを有する別の物質Ｍ３が存在する場合、物質Ｍ３が空間１ｈに入れば共鳴角θ２に影響を与えるので、検出対象Ｍ１の検出精度が低下する可能性がある。
しかし、図２（Ｂ）に示すように、検出対象Ｍ１は透過できるが、物質Ｍ３は通過することができない通過阻害物質５（例えば、シート状フィルタ等）を空間１ｈを覆うように設けておけば、目的とする検出対象Ｍ１と近似した大きさを有しかつ検出対象Ｍ１の検出の障害となる物質Ｍ３が空間１ｈに侵入することを防ぐことができるので、検出対象Ｍ１の検査精度を高めることができる。
なお、物質Ｍ３が空間１ｈに侵入することを防止する方法は上記方法に限られず、ＳＰＲチップの１の表面に培養した細胞膜を付着させるなどの方法を採用することもできる。
【００２８】
薬物透過試験に使用される細胞株であるCaco-2細胞（ヒト結腸由来）やMDCK細胞（イヌ腎臓由来）を通過阻害物質としてSPRチップの１の表面に付着させておけば、例えば、D-シクロセリン（D-cycloserine：分子量102.19）とマンニトール（Mannitol：分子量182.19）の細胞に対する透過率を評価する場合において、D-シクロセリンは透過するがマンニトールは透過できないので、細胞透過が可能なD-シクロセリンのみを選択的に検出することができる。この原理を利用すれば、新薬開発などに応用することができる。
【００２９】
また、上記ＳＰＲチップ１を利用すれば、細胞等から排出生成される分泌物の排出生成状況も検出することもできる。
例えば、図２おいて、物質Ｍ２が分泌物（検出対象Ｍ１）を放出する細胞である場合、細胞（物質Ｍ２）の幅よりは突起間距離Ｗが狭いが、この細胞（物質Ｍ２）が放出する分泌物（検出対象Ｍ１）の幅よりは突起間距離Ｗが広くなるように、複数の突起４を形成しておく。
すると、細胞（物質Ｍ２）が分泌物（検出対象Ｍ１）を放出すれば、分泌物（検出対象Ｍ１）のみが空間１ｈ内に侵入する。すると、分泌物（検出対象Ｍ１）の存在により共鳴角θ２が共鳴角θ１からずれるので、細胞（物質Ｍ２）が分泌物（検出対象Ｍ１）を排出したことを確認することができる。
しかも、時間連続的に共鳴角θ２の変化を確認すれば、細胞（物質Ｍ２）が排出する分泌物（検出対象Ｍ１）の量の変化や、分泌のタイミングを時系列で測定することができる。
【００３０】
例えば、酵母菌は、刺激を受けると分泌物を排出したり、また、活性が低下して衰弱したり死滅した場合には細胞内容物が溶出したりするのであるが、本実施形態のＳＰＲチップ１によってこの分泌物の量や、細胞内容物の溶出の量を観察すれば、酵母菌の状態の変化を時系列で観察することもできる。
具体的には、ＳＰＲチップ１の突起間距離Ｗを酵母菌の直径よりも狭くしておく。分泌物は酵母菌よりも小さいので、酵母菌は空間１ｈ内に侵入できないが、分泌物は空間１ｈ内に侵入できる。すると、酵母菌の活性の低下や死滅に従って空間１ｈ内に侵入する分泌物の量が増加すれば共鳴角θ２も変化するから、共鳴角θ２の時間変化に基づいて酵母菌の状況を時系列で把握することができる。
【００３１】
とくに、図４（Ａ）に示すように、複数の突起４，４の突起間距離Ｗが金属膜３に向かうに従って短くなるように形成しておけば、細胞（物質Ｍ２）を複数の突起４，４間に保持しておくことができる。具体的には、突起４，４の上端間の距離を、細胞（物質Ｍ２）が空間１ｈに入ってもその下端から基板２表面までの距離Ｄ１が距離Ｈ２より長くなるようにしておく（図４（Ａ））。すると、細胞（物質Ｍ２）が複数の突起４，４間に保持されても、細胞（物質Ｍ２）自体が検査領域に侵入せず、検出対象となる分泌物（検出対象Ｍ１）の測定精度に影響を与えないので、好ましい。
【００３２】
さらに、複数の突起４，４は、突起間距離Ｗが金属膜３に向かうに従って短くなるようになっていれば、複数の突起４，４間の空間に侵入した検出対象Ｍ１が時間の経過によって大きさが変化する場合において、検出対象Ｍ１の大きさの変化に伴って検出対象Ｍ１と金属膜３との距離が変化するから、時間の経過に伴った検出対象Ｍ１の変化を確認することができる。
【００３３】
例えば、検出対象Ｍ１が活性の低下等により大きさが変化する細胞であれば、以下のように検出対象Ｍ１の活性の変化を検出することもできる。
【００３４】
まず、図５に示すように、突起４，４の上端間の距離を、活性が高い状態における検出対象Ｍ１が空間１ｈに入ってもその下端から基板２表面までの距離Ｄ１（以下、単に距離Ｄ１という）が距離Ｈ２より長くなるようにしておく（図５（Ａ））。すると、検出対象Ｍ１の活性が高い場合には、検出対象Ｍ１は検査領域に侵入しないので、共鳴角θ２は変化しない。
【００３５】
しかし、検出対象Ｍ１が衰弱してその直径が小さくなると、検出対象Ｍ１は下方に移動するので、距離Ｄ１が徐々に短くなる。
そして、衰弱が進行すると距離Ｄ１が距離Ｈ２よりも短くなり、検出対象Ｍ１の一部が検査領域に侵入する（図５（Ｂ））。すると、侵入した検出対象Ｍ１の影響により、共鳴角θ２が変化するので、検出対象Ｍ１の活性が低下衰弱していることを確認できる。
【００３６】
検出対象Ｍ１の活性の低下がさらに進行すると、距離Ｄ１はさらに短くなり、検査領域内に存在する検出対象Ｍ１の量が多くなる。すると、共鳴角θ２がさらに変化し、検出対象Ｍ１の衰弱や死滅が進行したことを確認できる。
【００３７】
以上のごとく、複数の突起４，４を、その突起間距離Ｗが金属膜３に向かうに従って短くなるように形成しておけば、検出対象Ｍ１の大きさの変化に伴って検出対象Ｍ１と金属膜３との距離が変化するから、時間の経過に伴った検出対象Ｍ１の変化を確認することができる。
【００３８】
なお、図４（Ｂ）に示すように、複数の突起４，４は、突起間距離Ｗが金属膜３に向かうに従って長くなるようにしてもよい。
【００３９】
さらになお、突起４，４間の空間１ｈを溝状に形成した場合において、その突起間距離Ｗが溝の軸方向に沿って変化するようにしてもよい。例えば、図６（Ａ）に示すように、その突起間距離Ｗが溝の軸方向に沿ってステップ状に変化するようにすれば、領域100、110、120における突起間距離Ｗの突起間距離Ｗがそれぞれ異なることになる。すると、後述するような表面プラズモン共鳴装置により測定を行うときに、領域100、110、120のそれぞれにフォーカスすれば、１枚のＳＰＲチップにより大きさの異なる３種類の検出対象ＭＡ、ＭＢ、ＭＣを検出することも可能である。また、上記例では突起間距離Ｗがステップ状に変化する例を示したが、突起間距離Ｗを変化させる方法は上記のごとき方法に限定されず、図６（Ｂ）に示すように、溝の軸方向に沿って突起間距離Ｗが徐々に変化するよう（テーパ状）に形成してもよい。
【００４０】
さらになお、上記の例では、突起４，４間の空間１ｈが直線状の溝となっているので、球状の検出対象Ｍ１だけでなく縦長な楕円球状の検出対象Ｍ１の検出に適しているが、突起４，４間の空間１ｈの形状は目的に応じて自由に設定できる。例えば、図６（Ｃ）に示すように、空間１ｈが網目状に形成されるように突起４を形成してもよい。
そして、複数の突起４を形成する方法はとくに限定されないが、例えば、金属膜３の表面に突起を形成する物質の層を設けその層をエッチングする等して形成すれば、複数の突起４を簡単かつ安価に形成することができるので、本発明のＳＰＲチップ１も簡単かつ安価に製造することができるし、突起４の形状や配置、突起４，４間に形成される溝の形状や配置を自由に設定することができる。
【実施例１】
【００４１】
本発明のＳＰＲチップによる物質選択効果を確認した。
実験は、純水を、本発明のＳＰＲチップおよび従来の平面ＳＰＲチップ上に２ｍｍ程度の厚さとなるように添加または抽入した状態において、粒子（ポリスチレン球、直径１、１０μｍ）を純水に投入したときにおける共鳴角の変化を確認した。
なお、純水は、各SPRチップ上に設けられるPDMS container内に添加または抽入した（図７参照）。
【００４２】
実験に使用した従来の平面ＳＰＲチップは、ガラス基板（1.6cmx1.6cm、厚さ0.12ｍｍ）の表面に、チタン層（5nm）、金層（45nm）を形成したものを使用した。
本発明のＳＰＲチップは、ガラス基板（1.6cmx1.6cm、厚さ0.3ｍｍ）の表面に、チタン層（5nm）、金層（45nm）を形成し、かつ、金層の表面にクロムによって突起（高さ1.2μm、突起幅約3μm、突起間距離約3μm）を形成したものを使用した。
なお、従来の平面ＳＰＲチップおよび本発明のＳＰＲチップにおいて、チタン層は、ガラス基板と金層の接着強度を向上させるために設けている。
【００４３】
実験には、表面プラズモン共鳴装置（Handy-SPR（NTT−AT社製））を使用した。図７に示すよう、この装置は、光源から放出される光をレンズによって集光してＳＰＲチップに照射するように構成されている。ＳＰＲチップに照射される入射光は、そのＳＰＲチップへの入射角が65°〜75°となるように集光されており、かかる入射光の反射光を測定することによって、入射角65°〜75°の範囲に存在する共鳴角（SPR angle）を一括で測定できるようになっている。
【００４４】
図８および図９に実験結果を示す。
図８（Ａ）は従来のＳＰＲチップ表面に添加または抽入された純水に対して直径１μｍの粒子を純水に投入したときの実験結果である。
この実験では、約2300秒のところで直径１μｍの粒子を純水に加えたが、表面が平面状のチップであるため、粒子を加えるとすぐに共鳴角が大きく変化（0.850deg．）していることが確認できる。
図８（Ｂ）は従来のＳＰＲチップ表面に添加または抽入された純水に対して直径１０μｍの粒子を純水に投入したときの実験結果である。
この実験では、約1500秒のところで直径１０μｍの粒子を純水に加えたが、表面が平面状のチップであるため、粒子を加えるとすぐに共鳴角が変化（約0.051deg．）していることが確認できる。
【００４５】
図９（Ａ）は本発明のＳＰＲチップ表面に添加または抽入された純水に対して直径１μｍの粒子を純水に投入したときの実験結果である。
この実験では、約600秒のところで直径１μｍの粒子を純水に加えたが、従来のＳＰＲチップと同様に、粒子を加えるとすぐに共鳴角が大きく変化（0.899deg．）していることが確認できる。直径１μｍの粒子は突起間距離（約3μm）よりも十分小さいため、スムースに突起間に侵入できたためと考えられる。また、共鳴角の変化量が、従来のＳＰＲチップに直径１μｍの粒子を投入した場合と同程度であることから、突起間距離よりも小さい粒子であれば、従来のＳＰＲチップと同程度の精度で粒子の検出ができると考えられる。
図９（Ｂ）は本発明のＳＰＲチップ表面に添加または抽入された純水に対して直径１０μｍの粒子を純水に投入したときの実験結果である。
この実験では、約3000秒のところで直径１０μｍの粒子を純水に加えたが、時間が経過しても共鳴角の変化が生じていないことが確認できる。これは、本発明のＳＰＲチップでは、その表面に突起が形成されておりかつ突起間距離が約3μmであるので、突起間距離よりも直径が大きい直径１０μｍの粒子が突起間に侵入できなかったためであると考えられる。
【００４６】
以上のごとく、ＳＰＲチップの表面に突起を設けることによって、検出対象をその寸法の大小により区分けすることが可能であり、しかも、突起間距離よりも小さい物質であればフラットな表面のＳＰＲチップと同等の精度で検出できることが確認できた。
【実施例２】
【００４７】
本発明のＳＰＲチップの実際の生体の選択に対する有効性を確認した。
実験は、溶液（リン酸緩衝液）を、本発明のＳＰＲチップおよび従来の平面ＳＰＲチップ上に２ｍｍ程度の厚さとなるように添加または抽入した状態において、酵母菌（直径１０〜２０μｍの球径）の入った溶液を添加（抽入）したときにおける共鳴角の変化を確認した。
なお、溶液は、各SPRチップ上に設けられるPDMS container内に添加または抽入した（図７参照）。
【００４８】
実験に使用した従来の平面ＳＰＲチップおよび本発明のＳＰＲチップ、および実験装置は、実施例１と同じものである。
【００４９】
図１０に実験結果を示す。
従来のＳＰＲチップでは、約1000秒のところで酵母菌を溶液に加えたが、図１０（Ａ）に示すように、表面が平面状のチップであるため、酵母菌を加えるとすぐに共鳴角が大きく変化していることが確認できる。
一方、本発明のＳＰＲチップでは、約1600秒のところで酵母菌を溶液に加えたが、図１０（Ｂ）に示すように、共鳴角の変化が生じていないことが確認できる。これは、本発明のＳＰＲチップでは、その表面に突起が形成されておりかつ突起間距離が約3μmであるので、突起間距離よりも直径が大きい酵母菌は突起間に侵入できなかったからであると考えられる。
以上のごとく、ＳＰＲチップの表面に突起を設ければ、検出対象をその寸法の大小により区分けすることが可能であり、酵母菌等の生体等の検出にも有効であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の表面プラズモン共鳴チップは、検出対象をその大きさで判別選択したり、細胞等のフィルタリング可能な物質からの分泌の量の変化や、分泌のタイミングをリアルタイムで測定することに使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本実施形態のＳＰＲチップ１の説明図であって、（Ａ）は概略断面図であり、（Ｂ）は概略平面図である。
【図２】本実施形態のＳＰＲチップ１により検出対象Ｍ１が選択された状態を示した図である。
【図３】表面プラズモン共鳴現象による共鳴角の変化を説明した図である。
【図４】突起間距離Ｗが金属膜３に向かうに従って変化するように形成されたＳＰＲチップ１を示した図である。
【図５】突起間距離Ｗが金属膜３に向かうに従って変化するＳＰＲチップ１により検出対象Ｍ１の経時変化を検出する方法の説明図である。
【図６】他の形状の突起４の例である。
【図７】実施例の実験装置における装置構成原理の概略説明図である。
【図８】従来のＳＰＲチップの実験結果である。
【図９】本発明のＳＰＲチップによる物質選択効果を確認した実施例である。
【図１０】酵母菌をＳＰＲチップによって確認した実験結果であり、（Ａ）は従来のＳＰＲチップの実験結果であり、（Ｂ）は本発明のＳＰＲチップの実験結果である。
【符号の説明】
【００５２】
１ ＳＰＲチップ
１ｈ 空間
２ 基板
３ 金属膜
４ 突起
５ 透過阻害物質
Ｍ１ 検出対象
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
まず、表面プラズモン共鳴について簡単に説明する。
表面プラズモン共鳴とは、金属薄膜を蒸着したプリズム等（以下、単にＳＰＲチップという）において、ＳＰＲチップのプリズム側から金属薄膜に対して全反射条件にて入射光を照射したときに生じるエバネッセント波に起因して、金属薄膜に表面プラズモンが共鳴励起される現象である。
この共鳴現象の発生の有無は金属薄膜に入射される入射光の入射角に依存しており、一定の入射角のときに表面プラズモンが共鳴励起されるとともに、金属薄膜から反射される反射光強度が減少する。反射光強度が減少する理由は、金属薄膜に照射した光のエネルギーが表面プラズモンの励起に利用されるからである。
【０００３】
共鳴現象が発生する入射光の入射角はＳＰＲチップにおける金属薄膜の表面上の物質の状態によって変化するので、この性質を利用して、ＳＰＲチップを使用して特定の物質を検出する技術が開発されている。
例えば、ＳＰＲチップにおける金属膜の表面に特定の細胞と結合する生理活性物質等を固定しておき、このチップの表面に検出対象となる試料を配置する。そして、金属薄膜に対して全反射条件にて入射光をその入射角度を変えながら照射する。試料中に目的とする細胞等が存在すれば、細胞等と生理活性物質等とが反応して金属薄膜表面の状態が変化する。すると、試料中に目的とする細胞等が存在しない場合に対して、反射光強度が減少する入射角が変化するので、目的とする細胞等の存在の有無を検出することができる。
【０００４】
かかる表面プラズモン共鳴を利用した測定は、生体分子間の相互作用をリアルタイム、非修飾、高感度で検出できることから、様々な目的に適したＳＰＲチップが開発されている（非特許文献１、特許文献１）。
【０００５】
非特許文献１には、局所プラズモン共鳴を生じさせるＳＰＲチップが開示されている。このＳＰＲチップでは、表面にナノオーダーの金属構造物が周期的に配列されており、金属構造物のサイズや隙間をコントロールすれば、金属構造物に電界を集中してセンシング領域を局在化できるので、環境要因によるノイズを低減することが可能となる旨が記載されている。
【０００６】
また、特許文献１には、検出対象となる溶液を所定時間にわたり表面に保持しておくことができるＳＰＲチップが開示されている。このＳＰＲチップは、基板と基板に積層された表面層とを有しており、検出対象となる溶液と基板との親和性が、溶液と表面層との親和性よりも高くされており、かつ、表面層には基板の表面に達する溝が形成されている。このため、ＳＰＲチップに溶液を滴下すると、溶液が溝に侵入しかつ溝内で親和性の高い基板と接触するので、溶液と表面層との親和性が低くても、表面層上に溶液を安定した状態で保持できる旨の記載がある。
【０００７】
しかるに、上述したＳＰＲチップでは、検出対象となる細胞等を補捉したりまたは検出対象となる細胞等と反応する生理活性物質等を金属層の表面に設けたりしており、かかる生理活性物質等によって検出対象となる細胞を他の物質と判別選択している。
しかし、ＳＰＲチップによって判別選択できる検出対象は、ＳＰＲチップに固定されている生理活性物質等に限定されるので、複数の検出対象の検査を行うには、各検出対象に適した生理活性物質等が金属層の表面に設けられた複数のチップをそれぞれ用意しなければならない。
【０００８】
別のＳＰＲチップの使い方として、通常のフラットな表面を有するＳＰＲチップにおいて、その表面上に何も設けないで溶液のみを滴下し、その場合における反射光強度が減少する入射角（ＳＰＲ角）を測定することも行われている。この場合には、ＳＰＲチップの表面に滴下された溶液の濃度や屈折率に応じて、ＳＰＲ角が変わるので、溶液の濃度測定などに用いることができる。
しかし、かかる方法では、溶液の濃度や屈折率変化は分るが、溶液に含まれる対象物等をその大きさにより分別することはできない。
【０００９】
【特許文献１】特開２００７−１７４３２
【非特許文献１】松下智彦、西川武男、山下英之 「局所ＳＰＲバイオセンサーの研究」ＯＭＲＯＮ ＴＥＣＮＩＣＳ Vol.４７，No.1（通巻155号）2006，ＰＰ２−７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は上記事情に鑑み、表面に凹凸を設けることにより検出対象をその寸法の大小によって区分けすることが可能であり、しかも、製造が容易かつ安価な表面プラズモン共鳴チップを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第１発明の表面プラズモン共鳴チップは、光を透過する光透過性素材によって形成された基板と、該基板表面に形成された金属膜と、該金属膜の表面に形成された複数の突起とを備えており、該複数の突起は、その先端から前記基板表面までの距離が、前記金属膜に対して前記基板側から光を照射したときに発生するエバネッセント光の影響が及ぶ距離よりも長くなるように形成されていることを特徴とする。
第２発明の表面プラズモン共鳴チップは、第１発明において、前記複数の突起は、隣接する突起間の距離が、前記金属膜に向かうに従って変化するように形成されていることを特徴とする。
第３発明の表面プラズモン共鳴チップは、第１または第２発明において、前記複数の突起は、隣接する突起間の距離が、前記金属膜に向かうに従って短くなるように形成されていることを特徴とする。
第４発明の表面プラズモン共鳴チップは、第１、２または第３発明において、特定の物質の通過を阻害する物質が、前記複数の突起間に設けられていることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
第１発明によれば、複数の突起間に物質が侵入し、エバネッセント光の影響が及ぶ領域に到達すると、表面プラズモン共鳴によってその物質の存在を検出することができる。しかも、複数の突起間には突起間距離よりも小さい物質しか侵入できないので、チップ表面に特別な抗体等を設けなくても、複数の突起間の距離を調整するだけで所望の検出対象を選んで検出することができる。そして、検出対象の大きさのみによって物質を選択しているので、一つのチップを複数の検出対象に対して使用することもできる。
第２発明によれば、複数の突起間に侵入した物質が時間の経過によって大きさが変化する場合、突起間距離と物質の大きさに応じて、物質と金属膜との距離が変化するから、時間の経過に伴った物質の変化を確認することができる。
第３発明によれば、複数の突起間に侵入した物質が時間の経過によって大きさが変化する場合、突起間距離と物質の大きさに応じて、物質と金属膜との距離が変化するから、時間の経過に伴った物質の変化を確認することができる。
第４発明によれば、目的とする検出対象と近似した形状の大きさを有する物質であって、目的とする検出対象を検出する上で障害となる物質が突起間に侵入することを防ぐことができるので、検査精度を高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
つぎに、本発明の実施形態を図面に基づき説明する。
図１は本実施形態のＳＰＲチップ１の説明図であって、（Ａ）は概略断面図であり、（Ｂ）は概略平面図である。同図に示すように、表面プラズモン共鳴チップ（以下、単にＳＰＲチップ１で示す）は、基板２と、基板２の表面に形成された金属膜３と、この金属膜３の表面に形成された突起４とから構成されている。
【００１４】
基板２は、例えば、ガラスや樹脂材料等のように光を透過する材料によって形成された板状の部材である。この基板２は、その厚さが０．１〜０．５ｍｍ程度であるが、この厚さはとくに限定されない。
なお、基板２は板状の部材に限られず、プリズムや光導波路等でもよい。
【００１５】
金属膜３は、例えば金や銀等の金属を素材とする膜である。この金属膜３は、その厚さが５０ｎｍ程度の場合に、ＳＰＲチップ表面における物質の状態の変化等を検出する感度（ＳＰＲ感度）が良いと一般に知られている。この金属膜３の厚さは、ＳＰＲチップ１に入射された入射光Ｌ１によって発生するエバネッセント光の影響が及ぶしみ出し深さＨ２(以下、距離Ｈ２で示す)よりも十分うすい。
そして、本実施形態のＳＰＲチップ１において、基板２表面から距離Ｈ２の範囲において金属膜３の部分を除いた空間、つまり、金属膜３より上方の空間であって基板２表面から距離Ｈ２の範囲に位置する空間が検査領域となる。
なお、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象を生じさせるためには、一般的に金属膜３の厚さは約５０ｎｍ程度が望ましいとされており、このとき、距離Ｈ２は検出対象の屈折率や入射角度に依存するが、おおよそ数百ｎｍ程度となる。
【００１６】
図１に示すように、金属膜３の表面には、軸方向に沿って延びた複数の突起４が設けられている。この複数の突起４は、隣接する突起４，４同士の間に、幅Ｗ（以下、突起間距離Ｗという）の空間１ｈができるように、互いに平行に配設されている。
各突起４は、その先端から前記基板１表面までの距離Ｈ１(以下、距離Ｈ１で示す)が前記距離Ｈ２よりも長くなるように形成されている。具体的には、距離Ｈ１が、約１〜３μｍとなるように形成されている。
なお、距離Ｈ１は、上記範囲に限定されず、検出対象やこの検出対象を含む溶液の屈折率、突起間距離Ｗ等に応じて適宜調整することができる。
【００１７】
つぎに、本実施形態のＳＰＲチップ１を利用した検出対象Ｍ１を検出する作業を、図１〜３に基づいて説明する。なお、図面が分かり易くなるように、検出対象Ｍ１を含む試料は記載していない。
【００１８】
まず、本実施形態のＳＰＲチップ１として、突起間距離Ｗが検出対象Ｍ１の幅や直径よりも大きいものを準備する。そして、検出対象Ｍ１を含まない液体等の試料をＳＰＲチップ１上に配置した状態で、ＳＰＲチップ１に対して基板２側から全反射条件で入射光Ｌ１を入射する(図１参照)。そして、全反射条件を保ったまま、入射光Ｌ１の入射角を変化させて、反射光Ｌ２の強度が減衰する入射光Ｌ１の入射角θ１（検出対象Ｍ１を含まない試料の共鳴角θ１）を検出する(図３)。
なお、図３において、符号ＲＬ１が、検出対象Ｍ１を含まない試料における入射光Ｌ１の入射角に対する反射光強度を示したものである。
【００１９】
ついで、同じＳＰＲチップ１上に検出対象Ｍ１を含む液体等の試料を配置する。すると、試料に含まれる検出対象Ｍ１は突起間距離Ｗよりも小さいので、突起４，４間の空間１ｈ内に侵入し、検査領域内に到達する（図２（Ａ））。
一方、試料に含まれる他の物質、具体的には、突起間距離Ｗよりも大きい物質Ｍ２は、空間１ｈ内に侵入することができない。つまり、試料に含まれる物質のうち、所望の検出対象Ｍ１のみが選択されて検査領域内に配置される。
【００２０】
上記状態において、ＳＰＲチップ１に対して、基板２側から全反射条件で入射光Ｌ１を入射して、その入射角を変化させていくと、反射光Ｌ２の強度の減衰する入射光Ｌ１の入射角θ２（検出対象Ｍ１を含む試料の共鳴角θ２）を検出することができる(図３)。
なお、図３において、符号ＲＬ２が、検出対象Ｍ１を含む試料における入射光Ｌ１の入射角に対する反射光強度を示したものである。
【００２１】
ここで、反射光Ｌ２の強度の減衰は入射光Ｌ１によって金属膜３表面に発生する表面プラズモン共鳴の影響で生じるのであるが、検出対象Ｍ１が検査領域内に存在すると、この検出対象Ｍ１の影響により、反射光Ｌ２の強度が減衰する角度が変化する（図３）。
【００２２】
このため、共鳴角θ１と共鳴角θ２とを比較すれば、検出対象Ｍ１が試料中に存在するか否かを確認することができる。
しかも、共鳴角θ１と共鳴角θ２との差の度合いから、検出対象Ｍ１の存在の多寡を把握することもできる。
【００２３】
以上のごとく、本実施形態のＳＰＲチップ１によれば、複数の突起４，４間の空間１ｈには、突起間距離Ｗよりも小さい物質しか侵入できないので、ＳＰＲチップ１の表面に特別な抗体等を設けなくても、突起間距離Ｗを調整するだけで所望の検出対象Ｍ１を選んで検出することができる。
【００２４】
例えば、突起間距離Ｗを赤血球よりも僅かに広くしておけば、赤血球単体は空間１ｈに侵入するが、赤血球同士が相互作用をおこしている場合や凝集をおこしている場合は空間１ｈに侵入することができない。このため、血液を本実施形態のＳＰＲチップ１に適用させたときに、赤血球同士の相互作用が少ない血液の場合、空間１ｈに侵入する赤血球が多くなるが、赤血球同士の相互作用が多い場合、空間１ｈに侵入する赤血球が少なくなる。そして、空間１ｈ内の赤血球の量が異なれば共鳴角θ２も異なるから、本実施形態のＳＰＲチップ１を利用して共鳴角θ２を検出すれば、血液の状態を判定することも可能である。
【００２５】
また、本実施形態のＳＰＲチップ１では、突起間距離Ｗだけで検査する対象を選別しているので、ＳＰＲチップ１によって検出できる検出対象Ｍ１の制約が少なく、突起間距離Ｗよりも小さい物質であれば、様々な物質の判別選択に使用することができる。
【００２６】
さらに、本実施形態のＳＰＲチップ１では、複数の突起４，４間の空間１ｈに検出対象となる物質を侵入させるだけであり、ＳＰＲチップ１の表面と検出対象となる物質とが反応するわけではない。すると、検査終了後、ＳＰＲチップ１上の検出対象等を除去すれば、ＳＰＲチップ１を再利用することも可能であるし、再利用が非常に容易になる。
【００２７】
ここで、本実施形態のＳＰＲチップ１では、試料中に検出対象Ｍ１と同等程度の大きさを有する別の物質Ｍ３が存在する場合、物質Ｍ３が空間１ｈに入れば共鳴角θ２に影響を与えるので、検出対象Ｍ１の検出精度が低下する可能性がある。
しかし、図２（Ｂ）に示すように、検出対象Ｍ１は透過できるが、物質Ｍ３は通過することができない通過阻害物質５（例えば、シート状フィルタ等）を空間１ｈを覆うように設けておけば、目的とする検出対象Ｍ１と近似した大きさを有しかつ検出対象Ｍ１の検出の障害となる物質Ｍ３が空間１ｈに侵入することを防ぐことができるので、検出対象Ｍ１の検査精度を高めることができる。
なお、物質Ｍ３が空間１ｈに侵入することを防止する方法は上記方法に限られず、ＳＰＲチップの１の表面に培養した細胞膜を付着させるなどの方法を採用することもできる。
【００２８】
薬物透過試験に使用される細胞株であるCaco-2細胞（ヒト結腸由来）やMDCK細胞（イヌ腎臓由来）を通過阻害物質としてSPRチップの１の表面に付着させておけば、例えば、D-シクロセリン（D-cycloserine：分子量102.19）とマンニトール（Mannitol：分子量182.19）の細胞に対する透過率を評価する場合において、D-シクロセリンは透過するがマンニトールは透過できないので、細胞透過が可能なD-シクロセリンのみを選択的に検出することができる。この原理を利用すれば、新薬開発などに応用することができる。
【００２９】
また、上記ＳＰＲチップ１を利用すれば、細胞等から排出生成される分泌物の排出生成状況も検出することもできる。
例えば、図２おいて、物質Ｍ２が分泌物（検出対象Ｍ１）を放出する細胞である場合、細胞（物質Ｍ２）の幅よりは突起間距離Ｗが狭いが、この細胞（物質Ｍ２）が放出する分泌物（検出対象Ｍ１）の幅よりは突起間距離Ｗが広くなるように、複数の突起４を形成しておく。
すると、細胞（物質Ｍ２）が分泌物（検出対象Ｍ１）を放出すれば、分泌物（検出対象Ｍ１）のみが空間１ｈ内に侵入する。すると、分泌物（検出対象Ｍ１）の存在により共鳴角θ２が共鳴角θ１からずれるので、細胞（物質Ｍ２）が分泌物（検出対象Ｍ１）を排出したことを確認することができる。
しかも、時間連続的に共鳴角θ２の変化を確認すれば、細胞（物質Ｍ２）が排出する分泌物（検出対象Ｍ１）の量の変化や、分泌のタイミングを時系列で測定することができる。
【００３０】
例えば、酵母菌は、刺激を受けると分泌物を排出したり、また、活性が低下して衰弱したり死滅した場合には細胞内容物が溶出したりするのであるが、本実施形態のＳＰＲチップ１によってこの分泌物の量や、細胞内容物の溶出の量を観察すれば、酵母菌の状態の変化を時系列で観察することもできる。
具体的には、ＳＰＲチップ１の突起間距離Ｗを酵母菌の直径よりも狭くしておく。分泌物は酵母菌よりも小さいので、酵母菌は空間１ｈ内に侵入できないが、分泌物は空間１ｈ内に侵入できる。すると、酵母菌の活性の低下や死滅に従って空間１ｈ内に侵入する分泌物の量が増加すれば共鳴角θ２も変化するから、共鳴角θ２の時間変化に基づいて酵母菌の状況を時系列で把握することができる。
【００３１】
とくに、図４（Ａ）に示すように、複数の突起４，４の突起間距離Ｗが金属膜３に向かうに従って短くなるように形成しておけば、細胞（物質Ｍ２）を複数の突起４，４間に保持しておくことができる。具体的には、突起４，４の上端間の距離を、細胞（物質Ｍ２）が空間１ｈに入ってもその下端から基板２表面までの距離Ｄ１が距離Ｈ２より長くなるようにしておく（図４（Ａ））。すると、細胞（物質Ｍ２）が複数の突起４，４間に保持されても、細胞（物質Ｍ２）自体が検査領域に侵入せず、検出対象となる分泌物（検出対象Ｍ１）の測定精度に影響を与えないので、好ましい。
【００３２】
さらに、複数の突起４，４は、突起間距離Ｗが金属膜３に向かうに従って短くなるようになっていれば、複数の突起４，４間の空間に侵入した検出対象Ｍ１が時間の経過によって大きさが変化する場合において、検出対象Ｍ１の大きさの変化に伴って検出対象Ｍ１と金属膜３との距離が変化するから、時間の経過に伴った検出対象Ｍ１の変化を確認することができる。
【００３３】
例えば、検出対象Ｍ１が活性の低下等により大きさが変化する細胞であれば、以下のように検出対象Ｍ１の活性の変化を検出することもできる。
【００３４】
まず、図５に示すように、突起４，４の上端間の距離を、活性が高い状態における検出対象Ｍ１が空間１ｈに入ってもその下端から基板２表面までの距離Ｄ１（以下、単に距離Ｄ１という）が距離Ｈ２より長くなるようにしておく（図５（Ａ））。すると、検出対象Ｍ１の活性が高い場合には、検出対象Ｍ１は検査領域に侵入しないので、共鳴角θ２は変化しない。
【００３５】
しかし、検出対象Ｍ１が衰弱してその直径が小さくなると、検出対象Ｍ１は下方に移動するので、距離Ｄ１が徐々に短くなる。
そして、衰弱が進行すると距離Ｄ１が距離Ｈ２よりも短くなり、検出対象Ｍ１の一部が検査領域に侵入する（図５（Ｂ））。すると、侵入した検出対象Ｍ１の影響により、共鳴角θ２が変化するので、検出対象Ｍ１の活性が低下衰弱していることを確認できる。
【００３６】
検出対象Ｍ１の活性の低下がさらに進行すると、距離Ｄ１はさらに短くなり、検査領域内に存在する検出対象Ｍ１の量が多くなる。すると、共鳴角θ２がさらに変化し、検出対象Ｍ１の衰弱や死滅が進行したことを確認できる。
【００３７】
以上のごとく、複数の突起４，４を、その突起間距離Ｗが金属膜３に向かうに従って短くなるように形成しておけば、検出対象Ｍ１の大きさの変化に伴って検出対象Ｍ１と金属膜３との距離が変化するから、時間の経過に伴った検出対象Ｍ１の変化を確認することができる。
【００３８】
なお、図４（Ｂ）に示すように、複数の突起４，４は、突起間距離Ｗが金属膜３に向かうに従って長くなるようにしてもよい。
【００３９】
さらになお、突起４，４間の空間１ｈを溝状に形成した場合において、その突起間距離Ｗが溝の軸方向に沿って変化するようにしてもよい。例えば、図６（Ａ）に示すように、その突起間距離Ｗが溝の軸方向に沿ってステップ状に変化するようにすれば、領域100、110、120における突起間距離Ｗの突起間距離Ｗがそれぞれ異なることになる。すると、後述するような表面プラズモン共鳴装置により測定を行うときに、領域100、110、120のそれぞれにフォーカスすれば、１枚のＳＰＲチップにより大きさの異なる３種類の検出対象ＭＡ、ＭＢ、ＭＣを検出することも可能である。また、上記例では突起間距離Ｗがステップ状に変化する例を示したが、突起間距離Ｗを変化させる方法は上記のごとき方法に限定されず、図６（Ｂ）に示すように、溝の軸方向に沿って突起間距離Ｗが徐々に変化するよう（テーパ状）に形成してもよい。
【００４０】
さらになお、上記の例では、突起４，４間の空間１ｈが直線状の溝となっているので、球状の検出対象Ｍ１だけでなく縦長な楕円球状の検出対象Ｍ１の検出に適しているが、突起４，４間の空間１ｈの形状は目的に応じて自由に設定できる。例えば、図６（Ｃ）に示すように、空間１ｈが網目状に形成されるように突起４を形成してもよい。
そして、複数の突起４を形成する方法はとくに限定されないが、例えば、金属膜３の表面に突起を形成する物質の層を設けその層をエッチングする等して形成すれば、複数の突起４を簡単かつ安価に形成することができるので、本発明のＳＰＲチップ１も簡単かつ安価に製造することができるし、突起４の形状や配置、突起４，４間に形成される溝の形状や配置を自由に設定することができる。
【実施例１】
【００４１】
本発明のＳＰＲチップによる物質選択効果を確認した。
実験は、純水を、本発明のＳＰＲチップおよび従来の平面ＳＰＲチップ上に２ｍｍ程度の厚さとなるように添加または抽入した状態において、粒子（ポリスチレン球、直径１、１０μｍ）を純水に投入したときにおける共鳴角の変化を確認した。
なお、純水は、各SPRチップ上に設けられるPDMS container内に添加または抽入した（図７参照）。
【００４２】
実験に使用した従来の平面ＳＰＲチップは、ガラス基板（1.6cmx1.6cm、厚さ0.12ｍｍ）の表面に、チタン層（5nm）、金層（45nm）を形成したものを使用した。
本発明のＳＰＲチップは、ガラス基板（1.6cmx1.6cm、厚さ0.3ｍｍ）の表面に、チタン層（5nm）、金層（45nm）を形成し、かつ、金層の表面にクロムによって突起（高さ1.2μm、突起幅約3μm、突起間距離約3μm）を形成したものを使用した。
なお、従来の平面ＳＰＲチップおよび本発明のＳＰＲチップにおいて、チタン層は、ガラス基板と金層の接着強度を向上させるために設けている。
【００４３】
実験には、表面プラズモン共鳴装置（Handy-SPR（NTT−AT社製））を使用した。図７に示すよう、この装置は、光源から放出される光をレンズによって集光してＳＰＲチップに照射するように構成されている。ＳＰＲチップに照射される入射光は、そのＳＰＲチップへの入射角が65°〜75°となるように集光されており、かかる入射光の反射光を測定することによって、入射角65°〜75°の範囲に存在する共鳴角（SPR angle）を一括で測定できるようになっている。
【００４４】
図８および図９に実験結果を示す。
図８（Ａ）は従来のＳＰＲチップ表面に添加または抽入された純水に対して直径１μｍの粒子を純水に投入したときの実験結果である。
この実験では、約2300秒のところで直径１μｍの粒子を純水に加えたが、表面が平面状のチップであるため、粒子を加えるとすぐに共鳴角が大きく変化（0.850deg．）していることが確認できる。
図８（Ｂ）は従来のＳＰＲチップ表面に添加または抽入された純水に対して直径１０μｍの粒子を純水に投入したときの実験結果である。
この実験では、約1500秒のところで直径１０μｍの粒子を純水に加えたが、表面が平面状のチップであるため、粒子を加えるとすぐに共鳴角が変化（約0.051deg．）していることが確認できる。
【００４５】
図９（Ａ）は本発明のＳＰＲチップ表面に添加または抽入された純水に対して直径１μｍの粒子を純水に投入したときの実験結果である。
この実験では、約600秒のところで直径１μｍの粒子を純水に加えたが、従来のＳＰＲチップと同様に、粒子を加えるとすぐに共鳴角が大きく変化（0.899deg．）していることが確認できる。直径１μｍの粒子は突起間距離（約3μm）よりも十分小さいため、スムースに突起間に侵入できたためと考えられる。また、共鳴角の変化量が、従来のＳＰＲチップに直径１μｍの粒子を投入した場合と同程度であることから、突起間距離よりも小さい粒子であれば、従来のＳＰＲチップと同程度の精度で粒子の検出ができると考えられる。
図９（Ｂ）は本発明のＳＰＲチップ表面に添加または抽入された純水に対して直径１０μｍの粒子を純水に投入したときの実験結果である。
この実験では、約3000秒のところで直径１０μｍの粒子を純水に加えたが、時間が経過しても共鳴角の変化が生じていないことが確認できる。これは、本発明のＳＰＲチップでは、その表面に突起が形成されておりかつ突起間距離が約3μmであるので、突起間距離よりも直径が大きい直径１０μｍの粒子が突起間に侵入できなかったためであると考えられる。
【００４６】
以上のごとく、ＳＰＲチップの表面に突起を設けることによって、検出対象をその寸法の大小により区分けすることが可能であり、しかも、突起間距離よりも小さい物質であればフラットな表面のＳＰＲチップと同等の精度で検出できることが確認できた。
【実施例２】
【００４７】
本発明のＳＰＲチップの実際の生体の選択に対する有効性を確認した。
実験は、溶液（リン酸緩衝液）を、本発明のＳＰＲチップおよび従来の平面ＳＰＲチップ上に２ｍｍ程度の厚さとなるように添加または抽入した状態において、酵母菌（直径１０〜２０μｍの球径）の入った溶液を添加（抽入）したときにおける共鳴角の変化を確認した。
なお、溶液は、各SPRチップ上に設けられるPDMS container内に添加または抽入した（図７参照）。
【００４８】
実験に使用した従来の平面ＳＰＲチップおよび本発明のＳＰＲチップ、および実験装置は、実施例１と同じものである。
【００４９】
図１０に実験結果を示す。
従来のＳＰＲチップでは、約1000秒のところで酵母菌を溶液に加えたが、図１０（Ａ）に示すように、表面が平面状のチップであるため、酵母菌を加えるとすぐに共鳴角が大きく変化していることが確認できる。
一方、本発明のＳＰＲチップでは、約1600秒のところで酵母菌を溶液に加えたが、図１０（Ｂ）に示すように、共鳴角の変化が生じていないことが確認できる。これは、本発明のＳＰＲチップでは、その表面に突起が形成されておりかつ突起間距離が約3μmであるので、突起間距離よりも直径が大きい酵母菌は突起間に侵入できなかったからであると考えられる。
以上のごとく、ＳＰＲチップの表面に突起を設ければ、検出対象をその寸法の大小により区分けすることが可能であり、酵母菌等の生体等の検出にも有効であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の表面プラズモン共鳴チップは、検出対象をその大きさで判別選択したり、細胞等のフィルタリング可能な物質からの分泌の量の変化や、分泌のタイミングをリアルタイムで測定することに使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本実施形態のＳＰＲチップ１の説明図であって、（Ａ）は概略断面図であり、（Ｂ）は概略平面図である。
【図２】本実施形態のＳＰＲチップ１により検出対象Ｍ１が選択された状態を示した図である。
【図３】表面プラズモン共鳴現象による共鳴角の変化を説明した図である。
【図４】突起間距離Ｗが金属膜３に向かうに従って変化するように形成されたＳＰＲチップ１を示した図である。
【図５】突起間距離Ｗが金属膜３に向かうに従って変化するＳＰＲチップ１により検出対象Ｍ１の経時変化を検出する方法の説明図である。
【図６】他の形状の突起４の例である。
【図７】実施例の実験装置における装置構成原理の概略説明図である。
【図８】従来のＳＰＲチップの実験結果である。
【図９】本発明のＳＰＲチップによる物質選択効果を確認した実施例である。
【図１０】酵母菌をＳＰＲチップによって確認した実験結果であり、（Ａ）は従来のＳＰＲチップの実験結果であり、（Ｂ）は本発明のＳＰＲチップの実験結果である。
【符号の説明】
【００５２】
１ ＳＰＲチップ
１ｈ 空間
２ 基板
３ 金属膜
４ 突起
５ 透過阻害物質
Ｍ１ 検出対象
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光を透過する光透過性素材によって形成された基板と、
該基板表面に形成された金属膜と、
該金属膜の表面に形成された複数の突起とを備えており、
該複数の突起は、
その先端から前記基板表面までの距離が、前記金属膜に対して前記基板側から光を照射したときに発生するエバネッセント光の影響が及ぶ距離よりも長くなるように形成されている
ことを特徴とする表面プラズモン共鳴チップ。
【請求項２】
前記複数の突起は、
隣接する突起間の距離が、前記金属膜に向かうに従って変化するように形成されている
ことを特徴とする請求項１記載の表面プラズモン共鳴チップ。
【請求項３】
前記複数の突起は、
隣接する突起間の距離が、前記金属膜に向かうに従って短くなるように形成されている
ことを特徴とする請求項１または２記載の表面プラズモン共鳴チップ。
【請求項４】
特定の物質の通過を阻害する物質が、前記複数の突起間に設けられている
ことを特徴とする請求項１、２または３記載の表面プラズモン共鳴チップ。
【請求項１】
光を透過する光透過性素材によって形成された基板と、
該基板表面に形成された金属膜と、
該金属膜の表面に形成された複数の突起とを備えており、
該複数の突起は、
その先端から前記基板表面までの距離が、前記金属膜に対して前記基板側から光を照射したときに発生するエバネッセント光の影響が及ぶ距離よりも長くなるように形成されている
ことを特徴とする表面プラズモン共鳴チップ。
【請求項２】
前記複数の突起は、
隣接する突起間の距離が、前記金属膜に向かうに従って変化するように形成されている
ことを特徴とする請求項１記載の表面プラズモン共鳴チップ。
【請求項３】
前記複数の突起は、
隣接する突起間の距離が、前記金属膜に向かうに従って短くなるように形成されている
ことを特徴とする請求項１または２記載の表面プラズモン共鳴チップ。
【請求項４】
特定の物質の通過を阻害する物質が、前記複数の突起間に設けられている
ことを特徴とする請求項１、２または３記載の表面プラズモン共鳴チップ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図７】
【公開番号】特開２００９−８５８２５（Ｐ２００９−８５８２５Ａ）
【公開日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２５７５４８（Ｐ２００７−２５７５４８）
【出願日】平成１９年１０月１日（２００７．１０．１）
【出願人】（３０４０２８３４６）国立大学法人 香川大学 (285)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月１日（２００７．１０．１）
【出願人】（３０４０２８３４６）国立大学法人 香川大学 (285)
【Ｆターム（参考）】
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