被検体増幅とレポーターを用いる生体分子のナノ電子的検出
生体分子の検出法であって、酵素（例えば、ヌクレアーゼ及びポリメラーゼ等）の被検体−誘発作用による標的レポーター及び被検体標的種の増幅法を含む該検出法が開示される。増幅された標的種（例えば、アンプリコン及びレポーター等）は、本発明の観点を有するナノ電子的センサーのいくつかの態様及び別の常套の生体分子検出法によって検出可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノ電子的センサー装置を用いる生体分子用検出システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願のクロス・レファレンス
この出願は、米国特許法３５ＵＳＣ第１１９条（ｅ）による下記の米国仮特許出願に基づく優先権を主張する出願であり、これらの出願の明細書に開示された内容も本願明細書の一部を成すものである：
１）米国仮特許出願第６０／９０１５３８号（出願日：２００７年２月１４日、発明の名称：生体分子検出用電気化学的ナノセンサー）、
２）米国仮特許出願第６０／８５０２１７号（出願日：２００６年１０月６日、発明の名称：生体分子検出用電気化学的ナノセンサー）、及び
３）米国仮特許出願第６０／７８９０２２号（出願日：２００６年４月４日、発明の名称：被検体増幅とレポーター及びポリヌクレオチドとその他の生体分子のナノ電子的検出）。
【０００３】
この出願は、特に下記の米国仮特許出願に基づいて優先権を主張する米国特許出願第１１／３１８３５４号（ＷＯ２００６／０７１８９５に対応する）（出願日：２００５年１２月２３日、発明の名称：ＤＮＡ検出とポリヌクレオチド配列の認識のためのナノ電子的センサー装置）の一部継続出願であって、該出願に基づいて優先権を主張する出願である：
１）米国仮特許出願第６０／７４８８３４号（出願日：２００５年１２月９日）、
２）米国仮特許出願第６０／７３８６９４号（出願日：２００５年１１月２１日）、
３）米国仮特許出願第６０／７３０９０５号（出願日：２００６年１０月２７日）、
４）米国仮特許出願第６０／６６８８７９号（出願日：２００５年４月５日）、
５）米国仮特許出願第６０／６５７２７５号（出願日：２００５年２月２８日）、
６）米国仮特許出願第６０／６３９９５４号（出願日：２００４年１２月２８日）。
【０００４】
この出願は、特に下記の米国仮特許出願に基づいて優先権を主張する米国特許出願第１１／２１２０２６号（ＷＯ２００６／０２４０２３に対応する）（出願日：２００５年８月２４日、発明の名称：ＤＮＡ検出用ナノチューブセンサー装置）の一部継続出願であって、該出願に基づいて優先権を主張する出願である：
１）米国仮特許出願第６０／６２９６０４号（出願日：２００４年１１月１９日）、
２）米国仮特許出願第６０／６０４２９３号（出願日：２００４年８月２４日）。
【０００５】
この出願は、下記の米国仮特許出願に基づいて優先権を主張する米国特許出願第１１／５８８８４５号（出願日：２００６年１０月２６日、発明の名称：麻酔モニター、キャパシタンス・ナノセンサー及び動的検出サンプリング法）の一部継続出願であって、該出願に基づいて優先権を主張する出願である：
１）米国仮特許出願第６０／８５０２１７号（出願日：２００６年１０月６日）、
２）米国仮特許出願第６０／７７３１３８号（出願日：２００６年２月１３日）、
３）米国仮特許出願第６０／７４８８３４号（出願日：２００５年１２月９日）、
４）米国仮特許出願第６０／７３０９０５号（出願日：２００５年１０月２７日）。
【０００６】
この出願は、米国仮出願第６０／７００９５３号（出願日：２００５年７月１９日）に基づいて優先権を主張する米国特許出願第１１／４８８４６５号（公報：２００７／００４５７５６）（出願日：２００６年７月１８日、発明の名称：懸垂状一体化マイクロヒーターを備えたナノ電子的センサー）の一部継続出願であって、該出願に基づいて優先権を主張する出願である
【０００７】
この出願の内容は下記の米国特許出願に関連するものであり、これらの出願の開示内容は本願明細書の一部を成すものである。
１）米国特許出願第１０／７０４０６６号（公報：２００４／０１３０７０）（出願日：２００３年１１月７日、発明の名称：生体分子のナノチューブに基づく電子的検出）、
２）米国特許出願第１０／３８８７０１号（特許：第６９０５６５５）（出願日：２００３年３月１４日、発明の名称：ナノ構造装置アレイ用の検出選択性の修正）、
３）米国特許出願第１０／３４５７８３号（公報：２００３／０１３４４３３）（出願日：２００３年１月１６日、発明の名称：機能化ナノ構造を用いる生物化学的試薬の電子的検出）、
４）米国特許出願第１０／２８０２６５号（特許：第６８９４３５９号）（出願日：２００２年１０月２６日、発明の名称：ナノチューブセンサーのための感度調整）、及び
５）米国特許出願第１０／１７７９２９号（ＷＯ ０４／０４０６７１に対応）（出願日：２００２年６月２１日、発明の名称：基体上でのナノチューブの分散増加）。
【０００８】
従来技術の説明
ポリヌクレオチド中の塩基配列は遺伝情報をコードするので、これらの配列の解読性は生物工学の多くの進歩に寄与している。この研究によって、医療条件に関連する多くの重要な配列が確認されている。例えば、ＢＲＣＡ遺伝子は、通常は乳癌で患う女性の体内に存在する。医療的検査において、このような関連性を利用する目的で、特定の重要な配列が発現するかどうかを調べるために組織試料を走査する多くの技術が開発されている。これらの技術は、コスト高で、遅く、複雑であるために日常的な医療検査に適用するには不適当であるという難点がある。
【０００９】
一般にこれらの技術は、ポリヌクレオチドがハイブリッドを形成するという傾向に依存する。溶液中の短鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の鎖は、ｓｓＤＮＡ中の各々の塩基と対を形成する反対塩基を含む相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）と容易に結合する。この結合の結果、二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）が形成される。ｄｓＤＮＡは加工処理によってｓｓＤＮＡから分離することができる。従って、特定の標的配列を走査するためには、実験者はプローブ（probe）配列として適当なｃＤＮＡを準備する。標的配列が試料中に存在するときには、標的ｓｓＤＮＡはプローブｓｓＤＮＡとハイブリッドを形成してｄｓＤＮＡを生成する。このハイブリッド形成はいくつかの方法によって検出することができる。
【００１０】
現在行われている方法は、色素による蛍光−標識化オリゴヌクレオチド、量子ドット（quantum dot）又はオリゴヌクレオチド−改質金ナノ粒子による吸光度増加を利用することによる主として光学的な検出法に注目が集まっている。例えば、ＤＮＡハイブリッド形成の電気化学的検出法は、電極としてナノ構造体を用いておこなってもよい。しかしながら、電気化学的方法は、標識の電気化学的挙動によって左右される。
【００１１】
この場合の第１の問題点は、このハイブリッド形成を検知するための多くの方法には、ハイブリッド形成前に試料中のｓｓＤＮＡを変性させる過程が含まれるということに起因する。ｓｓＤＮＡに対して蛍光分子を結合させることがしばしばおこなわれている。標識（label）として知られているこのような分子は光学的機器（例えば、顕微鏡及び分光器等）によるｓｓＤＮＡの検知を可能にする。標識化は、ハイブリッド形成後のＤＮＡ試料を検知するために利用されている。標的配列が標識化試料中に存在するときには、標識化されたｓｓＤＮＡは標識化されたｄｓＤＮＡに組み込まれので、該ｄｓＤＮＡは光学的機器を用いて検知することが可能となる。光学的検出法の利用により、上記方法は簡便なものとなるが、ＤＮＡを標識化する化学反応はコスト高で長時間を要する。標識化を必要としない検出法は、日常的な医療検査に対するＤＮＡ走査法の有用性を著しく増大させるであろう。
【００１２】
第２の問題点は、伝統的な検出法の感度が低いことに起因する。この種の方法の一部の方法は低濃度のＤＮＡに対して感度を示すが、該方法においては、絶対数として多数のＤＮＡ分子を必要とする。医療的用途においては、通常は僅かな細胞のみが入手できるにすぎないため、試料中に存在する標的配列のＤＮＡ分子は僅かである。この問題は、標的ＤＮＡの量を百万倍増幅させることができるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の利用によって改良されている。しかしながら、標識化法の場合と同様に、ＰＣＲは複雑な化学反応であるために、検査に要するコストが高くなり、また、時間もかかる。
【００１３】
標的被検体を、一般的には光学的検出法又は蛍光検出法を使用して検出するためのシステムにおいてオリゴヌクレオチドを利用する研究が知られている。例えば、次の特許文献（これらの特許文献も本願明細書の一部を構成するものである）を参照されたい：米国出願公開２００６−００４０２８６；「標的被検体のバイオ−バーコードに基づく検出」、及び米国特許第６７５００１６；「オリゴヌクレオチドが付着したナノ粒子とその使用」。しかしながら、これらの方法は、未変性の標的被検体（例えば、非−ＰＣＲ増幅被検体）に応答する増幅反応をもたらさず、また、電子的検出をもたらさない。
【００１４】
未変性の標的被検体に対する増幅応答について検討した研究も知られている。例えば、次の文献を参照されたい（これらの特許文献も本願明細書の一部を構成するものである）：Ｈ．Ｆ．リー、Ｙ．リ、Ａ．Ｗ．ワーク及びＲ．Ｍ．コーン、「ＤＮＡマイクロアレイのエキソヌクレアーゼIII消化によるＤＮＡの酵素的に増幅されたＳＰＲイメージ化検出」、Analytical Chem. 、第７７巻、第５０９６頁〜第５１００頁（２００５年）、及び米国出願公開２００５−００４８５０１：「ＤＮＡの検出又は同定のための方法と装置」。しかしながら、これらの方法は、電子的検出をもたらさない。
【００１５】
ＤＮＡと共に他の生体分子は、生物学的プロセス及び医学的な診断と治療に関する科学的理解において重要性が増大している。生体分子、例えば、タンパク質、多糖及びＲＮＡ等を検出する必要性がある。タンパク質のような被検体の検出法に関する研究も知られている。例えば、次の特許文献（該文献も本願明細書の一部を成すものである）を参照されたい：米国出願公開２００６−００１４１７２；「アプタマー−ナノ粒子結合体及び標的被検体を検出するための該結合体の用法」。しかしながら、このような方法も、未変性の標的被検体の標的部位の増幅をもたらさず、また、電子的検出をもたらさない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
このため、当該分野においては、特定の標的生体分子を高感度で迅速に検知できる強力な技術が明らかに要請されている。このような技術は、ＰＣＲ又はその他の標的被検体の増幅法を使用せず、かつ被検体種の標識化を必要とせずに操作されるべきである。また、この種の技術は増幅された検出反応と電子的検出をもたらすべきである。さらに、この種の技術は、被検体試料の濃縮及び／又は単一化若しくは精製をもたらすだけでなく、感度と選択性を高めることが望ましい。
【００１７】
被検体種の標識化又は増幅の必要性を回避すると共に電子的信号をもたらす方法を提供する顕著な目的は、簡単化された自動化バイオ検出能を迅速かつ低コストの介護時点での診断的用途に対して適用できるようにすることであり、好ましくは、該方法は非実験室的な臨床的又は家庭的な状況下で行ってもよい。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の観点を有する装置と方法の付加的な説明と概要は、前記の「関連出願のクロス・レファレンス」において例示した共同発明に係る仮出願及び非仮出願の明細書に記載されており、これらの出願明細書の記載内容も本願明細書の一部を成すものである。本願は、これらの出願明細書の開示内容と記載と共に理解されるべきである。特に、これらの出願明細書には、ナノ電子装置及び標識を使用せずにポリヌクレオチドと他の被検体種を検出して同定する方法の多数の代替的な実施態様が記載されている。
【００１９】
ナノ電子的検出装置（nanoelectronic detector device）
ナノ構造体（nanostructure）は、センサーとしての用途においては特有の特性を発揮する。即ち、ナノ構造体は実質的に一次元的であって、電子的摂動に対して著しく高い感度を示すと共に、容易に機能化させることができ、また、多くの半導体製造法に適合させることができる。本発明の観点による実施態様においては、表面上に存在する原子によって大きな影響を受ける特性を有するナノ構造体を使用するので、高感度の電子的検出のための基礎がもたらされる。例示的な実施態様においては、好ましくは１又は複数のカーボンナノチューブを含み、より好ましくは１又は複数の単層カーボンナノチューブ（single-walled carbon nanotube；ＳＷＮＴ）を含む。
【００２０】
別の装置の実施態様には、一般的には、標的被検体との相互作用に対して高い感度を示す電子的特性を有する少なくとも１つのナノ構造体（ナノ構造体素子）を具有する素子が含まれていてもよい。１又は複数の導電性素子はナノ構造体素子と連絡していてもよく、これによって、装置の１又は複数の電子的特性であって、被検体の媒体に曝されたときのナノ構造体素子の応答によって影響を受ける電子的特性を測定するための信号を得ることができる。
【００２１】
一般的には、ナノ構造体素子と導体は支持用基体に隣接して配置される。該基体は、一般的には、少なくとも１つの誘電性表面（又は表面コーティング）を含んでおり、これによって装置素子の電気的絶縁がもたらされる。基板は剛直であってもよく、あるいは可撓性であってもよく、あるいは多孔性若しくは非多孔性であってもよい。一般的には平面状又は平坦状であるが、機能的な形態（例えば、管状形態）を有していてもよい。別の多数の基体の化学的組成としては、酸化ケイ素、窒化ケイ素、酸化アルミニウム、ポリイミド及びポリカーボネート等が例示される。本明細書に記載の多くの実施例において、基体は、酸化ケイ素、ＳｉＯ２、及びＳｉ３Ｎ４等の材料を含む１又は複数の層、フィルム又はコーティングをシリコンウェーハ又はシリコンチップ上に具有する。
【００２２】
ナノチューブネットワーク（nanotube network）装置
ナノセンサー装置の１つの実施態様においては、ナノ構造体素子は、複数のナノ構造体、例えば、集合的構造を形成するように配置されるＳＷＮＴ又はその他のナノチューブ等を含んでいてもよい。ナノセンサー装置の多くの好ましい実施態様においては、ナノ構造体素子は、基体又は基体に隣接して配置されて少なくとも１つの導線と連絡するナノチューブがランダムに相互連結されたネットワーク（ナノチューブネットワーク）を含むことが有利である。
【００２３】
ナノチューブネットワークは、伝統的なリソグラフィーを用いる化学蒸着（ＣＶＤ）法、溶剤懸濁沈着法及び真空蒸着法等によって調製してもよい。この点に関しては、下記の文献を参照されたい：米国特許出願第１０／１７７９２９号明細書（該明細書はＷＯ２００４／０４０６７１に対応する）；同第１０／２８０２６５号明細書；同第１０／８４６０７２号明細書；Ｌ．フーら、ナノ・レターズ（２００４年）、第４巻、第１２号、第２５１３頁〜第２５１７頁（「透明な導電性カーボンナノチューブネットワークにおけるパーコレーション」）。これらの文献の開示内容も本明細書の一部を成すものである。
【００２４】
ナノ構造体素子（例えば、ナノチューブネットワーク）の特性は、１又は複数の接触子（contact）を用いて測定してもよい。接触子は、ナノチューブネットワークのようなナノ構造体素子と電気的に接続するように配置させた導電性素子を含む。例えば、接触子は、基板の表面上へ直接的に配置させてもよく、あるいは、ナノチューブネットワーク上に配置させてもよい。ナノチューブネットワークを流れる電流は、ナノチューブネットワークの特定の領域内において該ネットワークと電気的に接続させた少なくとも２つの接触子を用いて測定してもよい。
【００２５】
トランジスターの実施態様
本発明の一部の実施態様においては、ゲート電極又は対（counter）電極と呼ばれる付加的な導電性素子が配置される。即ち、該導電性素子は、ナノ構造体素子（例えば、少なくとも１つのナノチューブ）とは電気的に接続しないが、ケート電極とナノ構造体素子との間に電気的キャパシタンスが存在するように配置される。
【００２６】
例示的な装置は、トランジスターのチャンネルがナノチューブを含む電界効果トランジスターを具備しているので、該装置はナノチューブ電界効果トランジスター又はＮＴＦＥＴと呼んでもよい。例えば、ゲート電極は、酸化ケイ素の下方の基板内の導電性平面である。あるいは、ゲート電極又は対電極は、ナノ構造体素子に隣接した状態（例えば、下部、上部又は側部に隣接した状態）であって、該素子から電気的に絶縁された状態で配置された導電性層、例えば、可撓性基板上に沈着された導電性ポリマー材料層を含んでいてもよい。ナノチューブの抵抗、インピーダンス、相互コンダクタンス又はその他の特性は、選定されるか又は可変性のゲート電圧の影響下で測定してもよい。
【００２７】
この種のナノチューブ電子装置としては、特に下記の文献に記載されているものが例示される：米国特許出願第１０／６５６８９８号（出願日：２００３年９月５日）及び同第１０／７０４０６６号（出願日：２００３年１１月７日）（該出願は、ＵＳ２００４／０１３２０７０として公開された）。これらの文献の記載内容も本明細書の一部を成すものである。
【００２８】
トランジスター装置は、ゲート電圧（例えば、Ｇ／Ｖｇ信号等）の関数としてのチャンネルの相互コンダクタンスを測定するために役立つ。トランジスターは最大のコンダクタンス、即ち、所定範囲のゲート電圧を用いて測定された最も大きなコンダクタンス、及び最少のコンダクタンス、即ち、所定範囲のゲート電圧を有いて測定された最も小さなカンダクタンスを有する。トランジスターは、最大コンダクタンスと最小コンダクタンスとの比であるオン−オフ比を有する。高感度の化学センサーを製造するためには、ナノチューブトランジスターのオン−オフ比は、好ましくは１．２よりも大きな値であり、より好ましくは２よりも大きな値であり、最も好ましくは１０よりも大きな値である。
【００２９】
被検体の認識
標的種や雑種汚染物等を含む被検体含有媒体と装置素子との相互作用を仲介させるために、ナノ構造体素子（例えば、１又は複数のナノ構造体素子への付着種若しくは付着層又は吸着種若しくは吸着層、基板、及び導体等）に関連して付加的な物質を含めてもよい。このような物質としては、１又は複数の認識層又は分子トランスデューサー（例えば、後述の実施例において説明するｓｓＤＮＡオリゴマープローブ等）、触媒物質、不活性化物質、抑制物質、保護物質、フィルター、被検体吸引剤、濃縮剤及び結合性種等が例示される。この種の物質と素子は、選択性、特異性及び／又は装置の使用特性を改良する機能を果たすことができる。
【００３０】
ポリヌクレオチド種
本発明は、ポリヌクレオチドの特異的な標的配列を検出するための電子センサー装置を提供する。特定の実施態様においては、該センサーは、ポリヌクレオチドと相互作用して検出性素子として作用するナノ構造体素子（例えば、単層及び／又は多層カーボンナノチューブ及び／又は該ナノチューブを含有する相互連結性ネットワーク等）を含有する。以下において詳述する実施例においては、ナノ構造体素子はカーボンナノチューブ、特にランダムに配向したカーボンナノチューブのネットワークを含有する。これらの実施例においては、検出前に、ナノチューブはｓｓＤＮＡプローブ配列の吸着によって改質される。ＤＮＡの標識化は不要である。さらに、本発明は、該センサー装置の使用法を提供する。
【００３１】
本明細書で使用する「ＤＮＡ」という用語はポリヌクレオチドを意味する。ポリヌクレオチドとしては、特に限定的ではないが、デオキシリボ核酸、リボ核酸、メッセンジャーリボ核酸、転移リボ核酸及びペプチド核酸が例示される。ポリヌクレオチドの明確な特徴は、核酸の鎖と塩基の配列であり、各々の塩基は核酸に化学的に結合し、また、各々の塩基は整合性配列（matching sequence）上で適当な塩基と対を形成する。
【００３２】
当業者であれば、これらの明確な特徴を有するポリヌクレオチドのその他の変形誘導体を調製することができる。従って、「単鎖ＤＮＡ」（以下においては、「ｓｓＤＮＡ」で表示する）はデオキシリボ核酸、リボ核酸又はその他の前記のポリヌクレオチドの単鎖であってもよい。「二重鎖ＤＮＡ」（以下においては、「ｄｓＤＮＡ」で表示する）は上記のいずれかのポリヌクレオチドの二重鎖であってもよい。「相補的ＤＮＡ」（以下においては、「ｃＤＮＡ」で表示する）は、既に言及した単鎖配列に対して相補的な単鎖配列である前記のポリヌクレオチドのいずれの鎖であってもよい。
【００３３】
特定のセンサー装置中のｓｓＤＮＡは、特定の標的配列のためのｃＤＮＡになるように選択してもよい。標的配列は、センッサー装置によって検出されるべき塩基配列である。標的配列用のｃＤＮＡは、プローブ（probe）配列として知られている。標的配列が特定されたならば、プローブ配列を有する一定量のＤＮＡを入手しなければならない。特定配列を有するＤＮＡの合成及び所定の配列に対して相補的なＤＮＡの合成に関しては種々の技術が知られている。当業者であれば、これらの技術に関する知識を有している。所望の標的配列に対して特異的なプローブを調製するのに適当なｃＤＮＡ又はその他のポリヌクレオチドは、バイオテクノロジー工業に関連する既知の商業的製造業者から一般的に入手することができる。
【００３４】
センサー装置は、試料ｓｓＤＮＡを含有する溶液にナノチューブネットワークを接触させることによって使用してもよい。ネットワークは、ハイブリッド形成がおこなわれるのに充分に長い時間にわたって該溶液と接触させるべきである。この接触時間は、試料ＤＮＡの濃度、該溶液の量、室内の温度、溶液のｐＨ、及びその他の可変要因によって左右される。当業者であれば、ＤＮＡのハイブリッド形成に対するこれらの可変要因の効果について精通しており、適当な接触時間、溶液の組成、温度及びその他のハイブリッド形成に関連する条件を過度の実験を伴うことなく選定することができる。
【００３５】
前記の全てのセンサーの実施態様におけるポリヌクレオチドのハイブリッド形成の発生、速度及び特異性が種々の条件に左右されることに留意すべきである。各々のハイブリッド形成過程においては、ｄｓＤＮＡの結合エネルギーは緊縮技術（stringency technique）によって測定することができる。このような測定は、温度を増加させるか、又は緩衝液を、例えば、水酸化ナトリウム等に変更することによっておこなうことができる。
【００３６】
付加的な緊縮対照は、ハイブリッド形成媒体の種々のイオン性成分（例えば、ナトリウムイオン又はマグネシウムイオン等）を含有していてもよい。あるいは、又は、さらに、ハイブリッドの形成前、形成中及び／又は形成後において、センサーの素子（例えば、ナノチューブネットワーク）に電圧を印加することによって、ポリヌクレオチドの挙動に影響を及ぼしてもよい。例えば、ｃＤＮＡのようなポリヌクレオチドはホスフェートに基づく骨格を有しており、該骨格は、一般的にはハイブリッド形成媒体中においてはイオン化されており、局在化された負電荷を保有する。選択的に帯電させたセンサー素子は、例えば、対応する完全に整合化した（matched）プローブの対応するハイブリッドに対してＳＮＰ−不整合化（mismatched）プローブのハイブリッドを不安定化させるために、例えば、インキュベーション中又はすすぎ処理中において、牽引性又は反発性の緊縮因子を付与するために使用してもよい。
【００３７】
緊縮因子を変化させることによって、完全または不完全な相補的塩基対と鎖との結合を差別化することが可能である。緊縮過程に応答してナノチューブの電気的特性が変化することによって、特に、単一塩基の不整合（ＳＮＰ）の差別化が可能となる。当業者であれば、標的配列の完全なハイブリッド形成と不完全なハイブリッド形成に対する感度の選択度を得るために、本発明によるセンサーの特定の実施態様の操作を適合させるように、ハイブリッド形成の条件を変化させることができる。
【００３８】
例えば、特定の対立遺伝子に対して同型のＤＮＡ試料を、該対立遺伝子に対して異型の他の比較試料と区別するためのアッセイにおいては、ハイブリッド形成の緊縮条件を、例えば、温度を変化させることにより調整することによって、同型試料と異型試料との間において明確に異なる装置の測定応答が得られるようにしてもよい。
【００３９】
本発明の観点による各々のセンサーの実施態様においては、これらのセンサーはアレイ（array）（例えば、複数の異なる標的ＤＮＡフラグメントに対して機能化されたトランジスターセンサーのアレイ）として構築させてもよい。これに関しては、下記の文献を参照されたい：米国特許出願第１０／３８８７０１号（特許公報２００３−０１７５１６１）（発明の名称：ナノ構造体装置アレイの検出感度の修正）。この文献の記載内容も本明細書の一部を成すものである。
【００４０】
電気化学的検出器の実施態様
本発明の一部の実施態様においては、ナノ構造化素子、例えば、カーボンナノチューブネットワークを含む電極等は、試料中の１種又は複数種の被検体の存在と濃度の測定を可能にするように、本願明細書に記載の被検体標的種及び／又はレポーターの電気化学的相互作用を検出するために使用してもよい。この点に関しては、例えば、本願発明と同時になされた発明に関する次の米国特許出願（発明の名称はいずれも「生体分子検出用電気化学的ナノセンサー」である）の明細書に記載されている検出方法と装置を参照されたい：第６０／９０１５３８号（出願日：２００７年２月１４日）及び第６０／８５０２１７号（出願日：２００６年１０月６日）。これらの特許出願の明細書に記載内容も本願明細書の一部を成すものである。
【００４１】
キャパシタンス検出器の実施態様
本発明の一部の実施態様においては、ナノ構造化容量性素子を含む検出器は、試料中の１種又は複数種の被検体の存在と濃度の測定を可能にするように、本願明細書に記載の被検体標的種及び／又はレポーターの電気化学的相互作用を検出するために使用してもよい。この点に関しては、例えば、本願発明と同時になされた発明（発明の名称：麻酔モニター、キャパシタンスナノセンサー及び動的検出サンプリング法）に関する米国特許出願第１１／５８８８４５号（出願日：２００６年１０月２６日）の明細書に記載されている検出方法と装置を参照されたい。なお、この特許出願は次の米国特許出願に基づく優先権を主張する出願である：第６０／８５０２１７号（出願日：２００６年１０月６日）、第６０／７７３１３８号（出願日：２００６年２月１３日）、第６０／７４８８３４号（出願日：２００５年１２月９日）及び第６０／７３０９０５号（出願日：２００５年１０月２７日）。これらの特許出願の明細書に記載内容も本願明細書の一部を成すものである。
【００４２】
検出のための代替的な方法、標識、マーカー及び装置
詳細に記載された例示的な実施態様においては、科学的又は光学的に活性な標識又はマーカーに左右されない電子的信号によって検出できるという利点を有するレポーターに焦点があてられているが、本発明の技術的思想を逸脱することなく、別の方法を利用することも可能である。
【００４３】
例えば、本願明細書に記載のいずれかの増幅法から誘導されるアンプリコン（amplicon）、種又はレポーターフラグメントは、当該分野において知られている多数の異なるレポーター又は被検体の検出法を実行に移すように設計された特定のマーカー、標識又は検出エンハンサー、例えば、蛍光性マーカー、消光基、質量改変、光学的検出、分光分析、電気泳動的移動度の改変、及びレポーター親和性の改変等を含んでいてもよい。同様に、本発明によるいずれかの増幅法によって誘導されるアンプリコン、種又はレポーターフラグメントは二次的な生体分子反応に関与させることによって、例えば、触媒的効果によるか、又は蛍光性プローブが独立的な酵素的な攻撃若しくは再配置等を受けやすくするように誘発することにより検出可能な効果がもたらされるように設計してもよい。
【００４４】
非−ＰＣＲレポーター増幅
本発明の１つの観点によれば、非常に少量の標的被検体に応答してレポーター分子、例えば、特異的ＤＮＡオリゴマー等を増幅して放出させた後に、該レポーター分子の量を電子的に検出する方法が提供される。本発明による観点を有する特定の実施態様においては、ポリヌクレオチドに対して特異的な活性を有する酵素は、選択された被検体の存在を表示するレポーター部分であって、本発明による観点を有するナノセンサーの使用によって電子的に検出可能な該レポーター部分の非−ＰＣＲ増幅を達成するために使用してもよい。この種の実施態様は、非循環的増幅を行う態様として記載されてもよい。即ち、該実施態様においては、増幅過程においては、例えば、ＰＣＲの場合のように反応条件を循環的に変化させるための複雑な制御システムは不要である。
【００４５】
本発明による観点を有する第１の実施態様においては、プローブ集合体は、１種又は複数種のオリゴヌクレオチドプローブが結合した基体、例えば、磁性ビーズ及び滴定ウェル等を具有する。例えば、ビーズ基体は、ビーズ表面上に区分されて別々に機能する複数のオリゴヌクレオチドプローブを保持することによって、複数のプローブ集合体を形成してもよい。各々のこの種のオリゴヌクレオチドプローブは、ナノコード配列部分と捕獲配列部分を含む。ナノコード配列部分は、レポーターオリゴヌクレオチド上の対応する配列に対して相補的になるように選択される。プローブ集合体の調製に際しては、レポーターオリゴヌクレオチドは、適当な条件下においてハイブリッド形成されてナノコード配列となる。捕獲配列部分は、標的被検体ポリヌクレオチド上の対応する配列（標的配列）に対して相補的になるように選択される。捕獲配列とナノコードを有するオリゴヌクレオチドプローブは、既知の方法によって所定の配列を有するように調製した後、既知の方法によって基体、例えば、磁性ビーズの表面又はその他の不動化表面上へ付着させてもよい。
【００４６】
操作に際しては、各々の標的被検体はプローブと結合して被検体／プローブ複合体を形成する。この場合、過剰のプローブが存在してもよい。例えば、磁性ビーズあたり多くのプローブが存在してもよい。特定の実施態様（例えば、磁性ビーズ又はその他の基体を使用する態様）においては、結合した被検体／プローブ複合体を有する基体の不動化によって、該複合体の精製又すすぎが可能となるので、試料又は溶解混合物を単純化することができる。好ましい実施態様においては、すすぎ後に添加されるエキソヌクレアーゼは、被検体／プローブ複合体のプローブ集合体部分の捕獲配列とナノコードのみを分解させ、標的被検体ポリヌクレオチド又はレポーターオリゴヌクレオチド（又はプリスチンプローブ）は分解させないという特異的な活性を有する。エキソヌクレアーゼ活性により、標的被検体ポリヌクレオチドとレポーターオリゴヌクレオチドの両方が放出されるので、（ａ）被検体ポリヌクレオチドは遊離して付加的なプリスチンプローブと反応し、（ｂ）レポーターオリゴヌクレオチドは反応緩衝液中に高濃度で蓄積する。単純な媒体中に蓄積された（増幅された）レポーターオリゴヌクレオチドは、著しい交差反応性をもたらすことなく、本願明細書に記載のような本発明によるナノ電子的検出器によって電子的に検出してもよい。
【００４７】
以下において説明するレポーターの被検体により誘発された放出に関する第１実施態様
における実施例においては、非突出状３’末端（例えば、平滑又は陥凹３’末端）を有する二重鎖ポリヌクレオチドの分解（例えば、ホスフェート主鎖結合の加水分解）に対して特異的な活性を有するエキソヌクレアーゼを使用する。代替的な装置と方法は、「鏡像」の実施例（この場合は、ポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドの３’と５’は逆に配置されており、エキソヌクレアーゼは５’末端特異性を示す）のようなその他のエキソヌクレアーゼ活性を利用するように設計してもよいことも理解されるべきである。さらに別の代替的な装置と方法も、本発明の技術的思想を逸脱することなく適用することができる。
【００４８】
さらにまた別の実施態様においては、５’反応性エキソヌクレアーゼ、及び付着末端エキソヌクレアーゼ等を使用することができ、また、他の不動化表面（例えば、ポリマー又はＳｉ表面、及び他のタイプのビーズ等）、プローブ間の開裂性リンカー、媒体容量の低減化、及びビーズの濾過等の手段等を使用することができる。
【００４９】
別の実施態様においては、選択的なエキソヌクレアーゼ活性が達成されるように選択された条件下においてその他の酵素を使用してもよい。例えば、ヌクレオチドトリホスフェートを奪う媒体中において種々のタイプのＤＮＡポリメラーゼを使用することによって、ポリメラーゼ活性を犠牲にして「校正（proof-reading）」活性を優先させてヌクレアーゼとして機能させてもよい。
【００５０】
別の実施態様においては、プローブの構成要素は、合成塩基類似体を有するポリヌクレオチド、例えばロックされた核酸（例えば、ＬＮＡオリゴマー又は２’−Ｏ、４’−Ｃメチレンブリッジを含む核酸、例えば、シグマ−アルドリッチ社の市販品）を含んでいてもよい。ＬＮＡオリゴマーは、プローブ分子の選択された部位におけるエキソヌクレアーゼ活性を阻止するか又は制限し、ハイブリッド形成された重複部位の安定性を制御してもよい。
【００５１】
さらに別の実施態様においては、タンパク質、多糖若しくはその他の生体分子標的被検体のための抗体複合プローブ及び／又はアプタマーに基づくプローブを使用することによって、非ポリヌクレオチド被検体の検出を可能にしてもよい。
【００５２】
好ましくは、本発明の観点を含む例示的な検出法と装置には、センサーの応答、感度及び／又は選択性を増大させるための濃縮過程と単純化過程が含まれていてもよい。プローブは、いずれかの固体状支持体又はオリゴマーの結合のために適した基体へ付着させることによって、分離過程又はすすぎ過程のために結合又は不動化させてもよい。適当な基体用材料としては、特に限定的ではないが、ガラス、プラスチック、ポリエチレン、セルロース、ポリメタクリレート、ラテックス、ゴム、フルオロカーボン樹脂及び金属等が例示される。基体材料の形態は、スライド、ウェル若しくはその他のエンクロジャー（enclosure）、又は微小球若しくはマイクロビーズのような粒子等であってもよい。常磁性被覆物によって、ビーズを磁気的に応答するようにすることができる。共役結合性物質又は錯体形成性物質を使用することによって、オリゴヌクレオチド又はその他のプローブ種を基体、例えば、ビオチン又はビオチン誘導体の結合に適したアビジン又はアビジン誘導体等へ結合させてもよい。
【００５３】
磁性ビーズの共役と分離／不動化のための技術は周知であり、このための構成成分と付属品は市販されている。これに関しては、例えば、インビトロゲン・コーポレーション社（旧名称：ダイナル・ビオテク社）（カールスバード、カリフォルニア州）のホームページ（http://www.invitrogen.com）を参照されたい。また、次の特許文献に記載されている分離方法と装置も参照されたい（これらの特許文献の開示内容も本願明細書の一部を成すものである）：
１）米国出願公開第２００５−０１４７８２２（発明の名称：プロセス）、
２）米国特許第５５１２４３９号（発明の名称：オリゴヌクレオチドが結合した磁性粒子とその使用）、
３）米国特許第６９９４９７１号（発明の名称：生体分子の定量化のための粒子分析アッセイ）、及び
４）米国特許第５８５１７７０号（発明の名称：磁性ビーズ担体を用いるレゾルヴェイス開裂によるミスマッチの検出）。
１ミクロン以下の磁性ビーズを入手することができ、該ビーズは結合性成分、例えば、共有結合したストレプタビジン（例えば、アビジンで処理したオリゴヌクレオチドへ結合させるための結合性成分）及び細菌壁（bacterial wall）タンパク質（例えば、抗体へ結合させるための結合性成分）を用いる前処理に付してもよい。
【００５４】
粒状のプローブ基体に対する別の分離／不動化法、例えば、電気泳動的分離法を使用してもよい。正荷電基（例えば、アミノ基）又は負荷電基（例えば、カルボン酸基）を有するビーズ又は粒子は電場の力によって分離させるか、又は不動化させてもよい。さらに別の態様においては、粒子状又はビーズ状の基体は、反応媒体から濾過によって分離させてもよい。
【００５５】
試料中の被検体ポリヌクレオチドの検出方法の１つの実施態様においては、該方法は下記の過程（ａ）〜（ｅ）を含む：
（ａ）下記の要素（i）〜（iv）を含む少なくとも１つの第１プローブ集合体を供給する：
（i）基体；
（ii）隣接位の５’−末端ヌクレオチドと遠位の３’−末端ヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブポリヌクレオチドであって、該隣接位の５’−末端ヌクレオチドが基体に隣接して結合すると共に少なくとも１つのナノコードヌクレオチド配列部分及び被検体ポリヌクレオチドの対応する標的ヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する捕獲ヌクレオチド配列部分を含む該プローブポリヌクレオチド；
（iii）プローブポリヌクレオチドのナノコード配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの第１レポーターポリヌクレオチドであって、ナノコード配列とハイブリッド形成することによってプローブポリヌクレオチドと重複部分を形成する該第１レポーターポリヌクレオチド；
（iv）捕獲ヌクレオチド配列部分と３’−末端ヌクレオチドが第１レポーターポリヌクレオチドの重複部分から遠位へ延びるように設計されたプローブポリヌクレオチド；
（ｂ）被検体ポリヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列をプローブポリヌクレオチドの捕獲ヌクレオチド配列部分と結合させることによって、下記の成分（i）〜（iii）を含有する重複第１プローブ／被検体複合体を形成させるために有効な条件下において、第１プローブ集合体を被検体であるポリヌクレオチドを含有すると推定される試料と接触させる：
（i）第１プローブ集合体；
（ii）少なくとも１種の被検体ポリヌクレオチド；
（iii）遠位へ延びて平滑な遠位の５’−末端（１）又は突出する遠位の５’−末端（２）を形成する被検体ポリヌクレオチド；
（ｃ）第１プローブ／被検体複合体を、二重鎖ＤＮＡへの特異的結合とその後のＤＮＡ重複部の３’−末端ストランドの選択的加水分解を含む３’−対−５’エキソ−デオキシリボヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼと接触させる；
（ｄ）エキソヌクレアーゼを第１プローブ／被検体複合体へ結合させるために有効であると共に、第１プローブ／被検体複合体の遠位の３’−末端ストランドをエキソヌクレアーゼで加水分解させることによってポリヌクレオチド被検体と少なくとも第１レポーターポリヌクレオチドを第１の重複プローブ／被検体複合体から放出させるために有効な条件を維持する；
（ｅ）エキソヌクレアーゼによる加水分解によって放出される少なくとも第１レポーターポリヌクレオチドの存在を検出することによって、試料中のポリヌクレオチド被検体の存在を測定する。
【００５６】
試料中の被検体ポリヌクレオチドの検出法の別の実施態様は、直前の節に記載の方法に対して「鏡像法」の関係にある過程を含む。この場合、３’末端と５’末端は該方法の規定の全体にわたって逆転し、該方法は下記の要件（ａ）〜（ｅ）によって規定される：
（ａ）基体は、プローブポリヌクレオチドの隣接位の３’末端に隣接して結合する。
（ｂ）第１プローブ／被検体複合体の遠位の末端はポリヌクレオチド被検体を含み、該被検体は遠位へ延びて平滑な遠位の３’−末端（１）又は突出する遠位の３’−末端（２）を形成する。
（ｃ）エキソヌクレアーゼは、二重鎖ＤＮＡと特異的に結合した後、ＤＮＡ重複体の５’末端ストランドの選択的加水分解を含む５’−対−３’エキソ−デオキシリボヌクレアーゼ活性を有する。
（ｄ）この方法は、プローブ／被検体の５’末端ストランドを加水分解してポリヌクレオチド被検体と少なくとも第１レポーターポリヌクレオチドを放出するために有効な条件を維持することを含む。
（ｅ）この方法は、エキソヌクレアーゼによる５’−対−３’加水分解によって放出されるレポーターポリヌクレオチドの存在を検出することによって、試料中のポリヌクレオチド被検体の存在を測定することを含む。
【００５７】
指数関数的な非−ＰＣＲ標的増幅
本発明の１つの観点によれば、希薄な試料又は少量の試料被検体の検出範囲を拡張するために標的被検体ポリヌクレオチド関連種を増幅させる方法が提供される。代替的な増幅方法と装置は下記の要素（１）及び／又は（２）を含んでいてもよい：
（１）同族レポーター。試料中に標的被検体ポリヌクレオチドが存在することを示す検出可能種を、アンプリファイア／試薬複合種からエキソヌクレアーゼ−媒介反応を介して、対応する合成標的オリゴヌクレオチドの被検体による誘発化放出によって増幅させる。この場合、放出された合成標的オリゴヌクレオチドは、標的被検体ポリヌクレオチド配列の一部の検出可能なコピー（同族又は準同族のオリゴヌクレオチド類似体）を含有する。
（２）非同族レポーター。試料中に標的被検体ポリヌクレオチドが存在することを示す検出可能種を、アンプリファイア／試薬複合種からエキソヌクレアーゼ−媒介反応を介して、対応する合成標的オリゴヌクレオチドの被検体による誘発化放出によって増幅させる。この場合、放出された合成標的オリゴヌクレオチドは、標的被検体ポリヌクレオチド配列には厳密には類似しない配列（非同族のオリゴヌクレオチド類似体）を含有する。
【００５８】
以下に記載の増幅方法と装置の第１実施態様の実施例においては、非突出状の３’末端（例えば、平滑又は陥凹３’末端）を有する二重鎖ポリヌクレオチドの分解（例えば、ホスフェート主鎖の結合の加水分解による分解）に対して特異的な活性を有するエキソヌクレアーゼを使用する。別のエキソヌクレアーゼ活性、例えば、「鏡像」の実施例を利用できるように別の装置と方法を設計してもよいことを理解すべきである。この場合の実施例においては、ポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドにおける３’と５’の配置が逆転し、エキソヌクレアーゼは５’末端特異性を有する。また、本発明の技術的思想を逸脱することなく、さらに別の実施態様も可能である。
【００５９】
二重標的アンプリファイア
本発明の観点を有する実施態様においては、一重鎖被検体ポリヌクレオチドの２つの異なる部分の配列（便宜上、「標的Ａ」及び「標的Ｂ」で表示する）が選択される。アンプリファイア試薬は、少なくとも下記の２種のアンプリファイアを包含するように配合してもよい：
（１）標的Ｂに対して相補的な第１捕獲配列（捕獲Ｂ’）及び標的Ａに対して相補的な第２捕獲配列（捕獲Ａ’）を有するオリゴヌクレオチドを含むアンプリファイアＡ。
（２）標的Ａに対して相補的な第１捕獲配列（捕獲Ａ’）及び標的Ｂに対して相補的な第２捕獲配列（捕獲Ｂ’）を有するオリゴヌクレオチドを含むアンプリファイアＢ。
【００６０】
コンパニオンを含む重複アンプリファイア
試薬中のプリスチンのアンプリファイアＡ及びアンプリファイアＢの各々は重複又は二重鎖形態を含む。この場合、アンプリファイアオリゴヌクレオチドは、非突出状３’末端を欠く複合体を生成するように設計されたコンパニオンオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成することによって、プリスチン形態におけるエキソヌクレアーゼ活性から保護される。コンパニオンオリゴヌクレオチドは、以下のように、被検体分子の対応する標的配列と類似する配列（合成標的）を含む：
（１）アンプリファイアＡのコンパニオンオリゴヌクレオチドオは、被検体の標的Ａと同一又は類似する合成標的配列（合成標的Ａ''）を含んでおり、該合成標的Ａ'' は、プリスチン試薬中においては、第２捕獲配列（捕獲Ａ’）とハイブリッド形成する。
（２）アンプリファイアＢのコンパニオンオリゴヌクレオチドオは、被検体の標的Ｂと同一又は類似する合成標的配列（合成標的Ｂ''）を含んでおり、該合成標的Ｂ'' は、プリスチン試薬中においては、第２捕獲配列（捕獲Ｂ’）とハイブリッド形成する。
【００６１】
標的とハイブリッド形成するアンプリファイア
アンプリファイアＡ及びアンプリファイアＢの各々は、プリスチン複式形態においては、構成要素である捕獲配列を露出させるような形態を有しているので、該捕獲配列は、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成を促進するために有効な条件下において、被検体ポリヌクレオチドの対応する標的配列とハイブリッド形成することによって、対応するアンプリファイア／被検体複合体を生成してもよい。従って、例えば、
（１）アンプリファイアＡの第１捕獲配列（捕獲Ｂ’）は、被検体の標的配列Ｂと結合し、また、
（２）アンプリファイアＢの第１捕獲配列（捕獲Ａ’）は、被検体の標的配列Ａと結合する。
【００６２】
各々のアンプリファイア／被検体複合体の生成には、アンプリファイアＡとアンプリファイアＢの一方又は両方と各々の被検体ポリヌクレオチドとのハイブリッド形成が含まれていてもよく、この点に留意すべきである。この形成過程は同時に進行させる必要はない。何故ならば、これらのアンプリファイアの種類は、上記の生成過程において、相互に独立して反応するように選定されるからである。
【００６３】
アンプリファイア／被検体複合体の酵素的分解
これらの酵素的分解におけるいずれの場合においても、標的配列の位置及び／又はアンプリファイアの配置の選択によって、アンプリファイアＡ、アンプリファイアＢ又はこれらの両方を含むアンプリファイア／被検体複合体が各々のアンプリファイアオリゴヌクレオチドの露出した非突出状３’末端を含むようにすることができるので、試薬中に存在するか、又は外部から添加されるエキソヌクレアーゼは、アンプリファイアオリゴヌクレオチドの分解を開始させてもよい。アンプリファイアオリゴヌクレオチドの分解が続行すると、両方の捕獲配列が除去されることによって、以下のようにして、アンプリファイアオリゴヌクレオチドから標的被検体が放出されると共に、合成標的配列を有する対応するコンパニオンオリゴヌクレオチドがアンプリファイアオリゴヌクレオチドから放出される：
（１）アンプリファイア／被検体複合体中のアンプリファイアＡのアンプリファイアオリゴヌクレオチドが分解され、被検体の標的配列Ａが放出されると共に、コンパニオンオリゴヌクレオチドの合成標的Ａ''が放出される。
（２）アンプリファイア／被検体複合体中のアンプリファイアＢのアンプリファイアオリゴヌクレオチドが分解され、被検体の標的配列Ｂが放出されると共に、コンパニオンオリゴヌクレオチドの合成標的Ｂ''が放出される。
【００６４】
従って、各々の元の被検体分子に対しては、上記の増幅過程によって、元の非分解被検体ポリヌクレオチド分子（元の標的Ａ及び標的Ｂを含む）、アンプリファイア試薬から誘導される２種の単鎖合成標的（合成標的Ａ及び合成標的Ｂ）及び反応を仲介したエキソヌクレアーゼ酵素が放出される。
【００６５】
放出された標的のその後の増幅
付加的なプリスチンアンプリファイアＡとアンプリファイアＢ及びエキソヌクレアーゼの存在下においては、各々のこれらの標的配列（合成又は未変性被検体）は、前述のような増幅のさらなる過程に関与してもよい。何故ならば、各々のアンプリファイアは、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成を促進するために有効な条件下においては、未変性標的の場合と同じ効果をもたらす合成標的とハイブリッド形成するように設計されているからである：
（１）プリスチンアンプリファイアＡの第１捕獲配列（捕獲Ｂ’）は、予め分解されたアンプリファイアＢの放出されたコンパニオンオリゴヌクレオチドの合成標的Ｂ''と結合して、全てが合成のアンプリファイア／標的複合体を形成し、次いで、該複合体はヌクレアーゼ活性によって分解され、元の合成標的Ｂ''と付加的なコンパニオンオリゴヌクレオチド（合成標的Ａ''を含む）の両方が放出される。
（２）プリスチンアンプリファイアＢの第１捕獲配列（捕獲Ａ’）は、予め分解されたアンプリファイアＡの放出されたコンパニオンオリゴヌクレオチドの合成標的Ａ''と結合して、全てが合成のアンプリファイア／標的複合体を形成し、次いで、該複合体はヌクレアーゼ活性によって分解され、元の合成標的Ａ''と付加的なコンパニオンオリゴヌクレオチド（合成標的Ｂ''を含む）の両方が放出される。
【００６６】
増幅の各々の「サイクル」においては、元の標的と対応する新たな標的が生成して放出され、これらの各標的は付加的な増幅現象を誘発することができる。この結果、連続する増幅過程中において、媒体が十分なアンプリファイア試薬とエキソヌクレアーゼを含有する間は、元の被検体ポリヌクレオチドの数は一定に維持される傾向にあり、一方、合成標的Ａ''と合成標的Ｂ''の数は指数関数的に増大する傾向にある。本明細書において使用する「サイクル」という用語は、温度のような環境条件の特定の周期的な変化を意味するのではなく、ＰＣＲにおいて一般的に使用され、また、媒体の条件は、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成と酵素的分解活性が同時に連続的に促進されるように選択されて調整される。
【００６７】
多段階アンプリファイア
本発明の観点を有する実施態様には、生体分子のテンプレート種を含有する媒体中へのレポーター種の導入方法であって、該テンプレート種に対して結合親和性を有するプローブ集合体から非−ＰＣＲ／テンプレート−誘発化／酵素活性化によって該レポーター種を放出させることを含み、下記の過程（ａ）〜（ｃ）を任意の操作順で含む該導入方法が含まれる：
（ａ）下記の要件（i）〜（iv）を満たす少なくとも１つの第１プローブ集合体を供給する：
（i）テンプレート種の標的部分に対して選択的な結合親和性を付与する捕獲ヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの第１プローブストランドを含む；
（ii）プローブストランドの対応する結合部分とハイブリッド形成するように設計されたポリヌクレオチド配列を有する結合部分を含む少なくとも１つの第１レポーター種を含む；
（iii）第１プローブ集合体は、ポリヌクレオチドの重複プローブ集合体を含むようにハイブリッド形成された少なくとも１つの第１プローブストランドと少なくとも１つの第１レポーター種を含む；
（iv）重複プローブ集合体は、プローブストランドの全部又は一部を分解してプローブ集合体から第１レポーター種を放出させるのに十分なヌクレアーゼ活性を有する選択された酵素の作用を促進するのに適合した少なくとも１つの酵素−開始部位であって、捕獲ヌクレオチド配列がテンプレート種の選択された標的部分の全部又は一部と結合してテンプレート−プローブ複合体を形成するときに形成される該酵素−開始部位を有するように設計された；
（ｂ）テンプレート種の選択された標的部分をプローブポリヌクレオチドの捕獲ヌクレオチド配列部分へ結合させることによって酵素−開始部位を有する第１テンプレート−プローブ複合体を形成させる反応を促進するために有効な条件下において、媒体を少なくとも１つの第１プローブ集合体と接触させる：
（ｃ）酵素−開始部位における酵素のヌクレアーゼ活性を促進するために有効な条件下において、媒体を少なくとも選択された酵素と接触させ、第１テンプレート−プローブ複合体が過程（ｂ）において形成されたときに第１プローブストランドが分解され、第１レポーター種がプローブ集合体から放出される。
【００６８】
この実施態様の増幅は付加的な過程による多段階を含むようにして行ってもよい。この場合、第１レポーター種は、第１レポーター種のテンプレート部分に対して結合親和性を有する第２プローブ集合体から第２レポーター種を少なくとも１つの第２の非ＰＣＲ／テンプレート−誘発／酵素活性化方式で放出させることに対する標的テンプレートとして作用するように設計されたテンプレート部分を含む。この態様は、第３段階又はより上位の段階を含むようにしてさらなるレポーター種が放出されるように拡張してもよい。
【００６９】
生体分子検出法においては、多段階増幅法を使用することによって、被検体、例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質、多糖及びその他の生体分子種を検出してもよい。いくつかの実施態様においては、第１プローブ集合体は、テンプレートの標的配列に対して相補的な捕獲ヌクレオチド配列を含む（例えば、テンプレートはＤＮＡ鎖を含む）。別の実施態様においては、第１プローブ集合体は、捕獲ヌクレオチド配列としてアプタマーを含み、該アプタマーは、テンプレートの標的部分に対する親和性を有する（例えば、テンプレートはポリペプチド又は多糖の標的部分を有する）。
【００７０】
１つの実施態様においては、生体分子のテンプレート種は試料中の被検体種を含み、第１レポーター種は、プローブ集合体から放出されたときに直接的又は間接的に検出可能なように設計され、下記の過程（ｄ）及び（ｅ）がさらに含まれる：
（ｄ）放出される第１レポーター種を直接的又は間接的に検出する；
（ｅ）第１レポーター種の直接的又は間接的な検出に基づいて、試料中の被検体種の少なくとも存在又は濃度を測定する。
【００７１】
例えば、第１レポーター種は、第１プローブ集合体から放出されたときに直接的に検出されるように設計され（一段階検出）、例えば、検出可能なポリヌクレオチド配列又は検出可能な標識基を有する検出部分を含ませる。同様に、第１レポーター種は、第１プローブ集合体から放出されたときに、別のレポーター種が検出可能な付加的な増幅段階を介して間接的に検出できるようにしてもよい。
【００７２】
ヘアピンプローブ集合体（hairpin probe assembly）
本発明の観点を有するさらに別の実施態様においては、プローブ集合体のレポーター部分と個別の捕獲を省略してもよい。１つの実施態様においては、第１プローブ鎖と第１レポーター種は共線的ポリヌクレオチド鎖を含む。この場合、該共線的ポリヌクレオチド鎖の一部は、テンプレート種の標的部分と関連しないときには自己ハイブリッド形成することによって、選択された酵素による分解から保護されるように設計される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７３】
当業者であれば、以下の好ましい実施態様に関する詳細な説明を考慮することによって、本発明の観点を有する装置と方法についてより完全に理解すると共に、これらの付加的な利点を得ると共に、付加的な目的を実現することができるであろう。
【００７４】
添付図面について簡単に説明する。
図１Ａ〜図１Ｈは、本発明の観点を有する装置と方法であって、非常に少量の標的被検体に応答してレポーター分子が増幅して放出された後に、該レポーター分子（例えば、特異的ＤＮＡオリゴマー等）の量を電子的に検出する該装置と方法の実施態様を模式的に示す。
図２Ａ〜図２Ｈは、本発明の観点を有する装置と方法であって、非直線的又は指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす電子的検出用の該装置と方法の実施態様を模式的に示す。
図３Ａ及び図３Ｂは、図２Ａ〜図２Ｈに示す増幅方法の２つの実施例をまとめて模式的に示すもので、一方の実施例においては２種の被検体標的（二重標的）を使用し、他方の実施例においては１種の被検体標的（単一標的）を使用した。
【００７５】
図３Ｃは、表１及び表２に示すデータをプロットしたグラフであり、単一標的スキームと二重標的スキームを使用することによる合成標的の増加又は増幅を示す。
図４Ａ及び図４Ｂは、レポーターの増幅と精製のための別の装置と方法を模式的に示す。
図５Ａ〜図５Ｅは、本発明の観点を有するさらに別の装置と方法であって、予備的な増幅精製過程を含む指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす該装置と方法の実施態様を模式的に示す。
図６Ａ〜図６Ｃは、本発明の観点を有する装置と方法であって、分析用媒体からエキソヌクレアーゼを除去した後で指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす該装置と方法の実施態様を模式的に示す。
【００７６】
図７Ａ〜図７Ｆは、本発明の観点を有するレポータープローブであって、内部阻害基（該内部阻害基は該基の配列位置におけるエキソヌクレアーゼのプロセッシングを停止させる）を含む該レポータープローブの実施例を模式的に示す。
図８Ａ及び図８Ｂは、本発明の観点を有する装置と方法であって、多重型レポーターとマトリックス検出セルを用いる多種被検体アッセイを含む該装置と方法の実施態様を模式的に示す。
図９Ａ〜図９Ｃは、本発明の観点を有する方法であって、生体分子を検出するためのアプタマー部分を含むプローブ集合体を使用する該方法の実施態様を模式的に示す。
図１０ａ〜図１０ｉを含む図１０は、アンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を模式的に示す。
【００７７】
図１１は、図１０に示す方法に対応する実験データをプロットしたグラフである。
図１２Ａ〜図１２Ｃは、アンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の三段階法の実施態様を模式的に示す。
図１３は、図１２Ａ〜図１２Ｃに示す方法に対応する実験データをプロットしたグラフである。
図１４Ａ〜図１４Ｃは、本発明の観点（例えば、図３Ａ参照）を有する単一標的増幅法であって、蛍光検出法を利用する該増幅法の実施態様を模式的に示す。図１４Ａは、アンプリファイア／被検体複合体の模式図である。図１４Ｂは、当該方法による結果と増幅生成物を示す電気泳動ゲルの写真である。図１４Ｃは、図１４Ｂに示す写真の陰画であり、該陰画は特許図面としては適当な写真再現性画像であって、データをより明確に示している。
図１５Ａ〜図１５Ｃは、「ヘアピン」型のプローブ集合体の実施態様を模式的に示す。
【００７８】
以下においては、本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。
本発明は、標的ＤＮＡ配列を検出するナノチューブセンサー装置（nanotube sensor device）を提供する。該装置は、標的ＤＮＡの標識化を必要とせず、標的ＤＮＡの存在に対して電子的に応答する。該装置の実施態様について以下に説明する。
【００７９】
被検体によって誘発されるレポーターの増幅
図１Ａ〜図１Ｈは、本発明の観点を有する装置と方法であって、非常に少量の標的被検体に応答してレポーター分子が増幅して放出された後に、該レポーター分子（例えば、特異的ＤＮＡオリゴマー等）の量を電子的に検出する該装置と方法の実施態様を模式的に示す。本発明の観点を有する特定の実施態様においては、ポリヌクレオチドに対して特異的な活性を有する酵素を使用することによって、選択される被検体の存在を示すレポーター部分であって、本発明の観点を有するナノセンサーの使用によって電子的に検出可能な該レポーター部分のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によらない増幅を達成してもよい。この種の実施態様は、増幅過程において、例えばＰＣＲの場合のような反応条件を周期的に変化させるための複雑な制御システムを必要としない点で非周期的増幅法として記載してもよい。
【００８０】
図１Ａは、試料を捕集して調製する過程１０を模式的に示す図であって、容器１３の内部の溶解緩衝液又は媒体１２を接種して細胞性又はウイルス性物質１４を放出させるための試料アプリケーター（例えば、咽喉用スワブ等）１１が図示される。放出された細胞性又はウイルス性物質は溶解されて試料であるポリヌクレオチド物質１５を放出する。
【００８１】
図１Ｂは、溶解された試料媒体を入口２２へ塗布するためのアプリケーター（例えば、ピペット等）２１を具備する流状系２０の内部において試料を処理する装置を模式的に示す。該入口は導管２４のパターン（例えば、微量流体用カートリッジ等）と連絡し、該導管は閉鎖状のセル又は容器２３と連絡する。
【００８２】
図１Ｃ（i）及び図１Ｃ（ii）は、１又は複数のプローブ集合体（probe assembly）３０を保有する容器２３の内部に収容されたポリヌクレオチド物質１５を含有する試料媒体１６を示し、各々のプローブ集合体は基体３２及び該基体に付着した１又は複数の捕獲プローブ３１を具有する。
【００８３】
図示する実施例に示す基体３２は磁性ビーズを含有するが、その他の粒子状又は非粒子状の捕獲基体（例えば、非磁性粒子、固定プレート、閉鎖壁、及び滴定ウェル等）を使用してもよいことに留意すべきである。例えば、ビーズ状の基体は、複数の別個独立に機能するプローブを該ビーズの表面上に担持してもよく、これによってビーズが中心に位置する多重プローブ集合体が形成される。
【００８４】
図１Ｃ（ii）は、プローブ集合体３０と標的被検体３３を詳細に示す。標的被検体は、３’末端鎖の端部と５’末端鎖の端部との間の標的ヌクレオチド配列Ｘを有する単一鎖ポリヌクレオチドである。プローブ集合体３０は、例えば、ビオチン−ストレプタビジン結合によって基体３２へ結合した捕獲プローブポリヌクレオチド３４を含有する。あるいは、プローブ３０のようなプローブは、相補的な「サンドウィッチ」型のオリゴヌクレオチド構造、例えば、図４Ｂに関連して後述する相補的な「サンドウィッチ」プローブ７９の構造等によって基体へ結合していてもよい。
【００８５】
この実施例においては、プローブポリヌクレオチド３４は近接する５’末端ヌクレオチドに隣接する基体３２に結合し、また、ナノコード配列Ｙと捕獲配列Ｘ’を含む。該捕獲配列は、被検体ポリヌクレオチド３３の標的配列Ｘに対して相補的である。プローブ３１は、相補的配列Ｙ’を有する１又は複数のレポーターオリゴヌクレオチド３５も含み、該相補的配列は、プローブ集合体内においては、プローブポリヌクレオチド３４のナノコード配列Ｙとハイブリッド形成する。図１Ｃ（ii）においては、ナノコード配列Ｙは捕獲配列Ｘ’に関して、基体３２に対して隣接して示されているが、必ずしもこのようにする必要はないことに留意すべきである。
【００８６】
選択された捕獲配列とナノコード配列を有するプローブオリゴヌクレオチド３４及びレポーターオリゴヌクレオチド３５は、例えば、市販されている合成セット一式に用いる既知の方法に従って調製してもよい。同様に、指定された塩基を有するビオチニル化オリゴヌクレオチドは市販品として入手することができ、また、基体は、既知の方法により、ストレプタビジンを用いて処理してもよい。ポリヌクレオチドを基体へ付着させる別の適当な方法、例えば、細胞の表面リガンドを用いる方法等は既知である。レポーター３５は、プローブ集合体３０を形成させるために適当な条件下において、ポリヌクレオチド３４とハイブリッド形成させてもよい。
【００８７】
特定の目的のためにより明確に規定しない限り、本明細書においては、「ポリヌクレオチド」と「オリゴヌクレオチド」という用語は一般的には互換的に使用される。特定の配列の選択される長さは当該分子のハイブリッド形成特性に関連するが、本発明の原理は、本発明の技術的思想を逸脱することなく、広範囲の配列の長さと分子量に対して適用される。文脈又は用法から判断して、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに言及していることが明らかである場合には、このような種（species）は、明確性を失うことなく、「分子」若しくは「種」又は分子の機能、例えば、「被検体（analyte）」又は「レポーター（reporter）」にも関連していてもよい。
【００８８】
この実施例においては、各々のプローブオリゴヌクレオチドはナノコード配列部分と捕獲配列部分を含む。ナノコード配列部分はレポーターオリゴヌクレオチドの対応する配列に対して相補的になるように選択される。プローブ集合体の調製においては、レポーターオリゴヌクレオチドは、適当な条件下において、ナノコード配列とハイブリッド形成する。捕獲配列部分は、標的被検体ポリヌクレオチドの対応する配列（標的配列）に対して相補的になるように選択されて設計される。捕獲配列とナノコード配列を有するプローブオリゴヌクレオチドは既知の方法に従って調製した後、既知の方法によって基体（例えば、磁性ビーズ又はその他の不動化表面等）へ付着させてもよい。
【００８９】
図１Ｄ（i）及び図１Ｄ（ii）は液状系２０の容器又はセル２３を示す。該液状系内においては、標的被検体ポリヌクレオチド３３はプローブ３１のプローブヌクレオチド３４とハイブリッド形成することによって１又は複数のプローブ／被検体複合体３６を形成する。該プローブ／被検体複合体３６は、被検体３３の標的配列Ｘと少なくとも１つのプローブポリヌクレオチド３４の捕獲配列Ｘ’とのハイブリッド形成によって被検体ポリヌクレオチドへ結合したプローブ集合体３０を含む。図１Ｄ（ii）はプローブ／被検体複合体３６を詳細に示しており、標的被検体３３は、プローブポリヌクレオチド３４の遠位３’末端を超えて重なり合う遠位５’末端を有する。
【００９０】
図１Ｅは、１回又は複数回の所望によるすすぎ過程又は洗浄過程が可能となるように不動化又は固定的に配置された１又は複数の基体３２を示す。該すすぎ過程又は洗浄過程においては、未反応種１５を含む試料媒体１６が除去されて反応媒体１７によって置き換えられ、１又は複数のプローブ／被検体複合体３６及び未反応のプローブ又はプローブ集合体が容器２３の内部に残留する。この実施例においては、１又は複数の基体は調整可能な磁石１８によって不動化された磁性ビーズが使用される。
【００９１】
プローブ集合体３０が複数のプローブ３１を含む場合には、複数の被検体３３は、各々のプローブ集合体３０の各プローブ３１と結合してもよい。検出系２０においては、全体として過剰のプローブ３１を有する１又は複数のプローブ集合体３０が存在するようにすることにより、試料中の被検体３３が図１Ｄに示す過程において利用可能な捕獲プローブ３１と効率よく結合するようにすることが有利である。図１Ｅに示すすすぎ／洗浄過程によって非標的ポリヌクレオチド及び最初の試料又は溶解混合物に含まれるその他の汚染物を除去することが有利であり、これによって、検出過程における非特異的結合又は交差反応の可能性又は程度は最小になる。
【００９２】
図１Ｆ（i）〜図１Ｆ（iii）及び図１Ｇ（i）は、プローブ／被検体複合体をエキソヌクレアーゼ３７で処理する状態を模式的に示す。この実施例においては、エキソヌクレアーゼ３７は、露出した平滑状又は陥凹状（非突出状）の３’末端を有するハイブリッド形成されたポリヌクレオチドの重複鎖の分解（例えば、ホスフェート結合の加水分解）に対して特異的活性を示す。この実施例においては、プローブポリヌクレオチド３４の遠位の非突出状３’末端は漸進的に攻撃されて分解される。好ましい実施態様においては、所望によるすすぎ過程の後に添加されるエキソヌクレアーゼの特異的活性は、被検体／プローブ複合体のプローブ集合体部分のナノコードと捕獲配列のみの分解に作用し、標的被検体ポリヌクレオチド３３又はレポーターオリゴヌクレオチド３５あるいはプリスチン若しくは未反応プローブ３１には作用しない。
【００９３】
他の酵素としてのヌクレアーゼは、種類と環境に応じて種々のプロセッシング性（processivity）を示し、連続的な分解過程として図示した好適な態様は、ヌクレアーゼがオリゴヌクレオチド基質へ拡散するとき又は該基質から拡散するときは不連続的又は挿入的であってもよいことも理解すべきである。同様に、ヌクレアーゼは一次活性と二次活性（例えば、エンドヌクレアーゼ活性）を有していてもよく、当業者であれば、所望のエキソヌクレアーゼ活性が優先的におこなわれるように濃度と条件を適宜調節できる。
【００９４】
前述のように、別の実施態様においては、近位及び遠位の末端鎖端部の順位を逆転させたプローブ（５’末端に対する３’末端）を採用し、非突出状５’重複末端に対して特異的な対応する逆活性を有するエキソヌクレアーゼを適用してもよい。同様に、さらに別の実施態様においては、非特異的活性が調節されるか、又は非干渉的である場合には、特異的なエンドヌクレアーゼ以外の多重活性様式を示す酵素系を使用することができる。例えば、ヌクレオチドホスフェートを含有しない媒体中において種々のタイプのＤＮＡポリメラーゼを使用することによって、ポリメラーゼ活性を犠牲にして、「校正」活性を優先させてヌクレアーゼとして機能させてもよい。
【００９５】
図１Ｆ（iii）は、捕獲配列Ｘ’の脱離によって被検体分子３３が放出されるように進行中のプローブ分子３４の分解過程を示す。
図１Ｇ（i）は、ナノコード配列Ｙの脱離によってレポーター分子３５が放出されたプローブ分子３４の完結した分解を示す。
【００９６】
図１Ｆ（iii）に示す過程において放出された被検体分子３３は媒体１７の内部において自由に拡散し、残存する未反応のプローブ（プリスチン）３１とハイブリッド形成することによって付加的なプローブ／被検体複合体３６を生成する。このようにして事後的に形成される複合体３６もエキソヌクレアーゼの分解作用を受けやすく、付加的なレポーターが放出される。過剰のプローブ３１の生成により、有利な増幅過程がもたらされる。この場合、各々の被検体分子３３は、被検体によって刺激される複数の対応するプローブ３１の分解に起因して複数のレポーター分子を逐次的に放出させる。
【００９７】
このようにして、反応緩衝液中においては比較的高濃度のレポーターオリゴヌクレオチドが蓄積され、該レポーターオリゴヌクレオチドは所望によるすすぎ処理によって予め精製するか又は単純化する。この結果、当初は試料中に非常に低濃度で含まれる被検体は、ナノ電子的検出器による顕著な交差反応性を伴うことなく、本明細書に記載のようにして電子的に検出される。
【００９８】
図１Ｇ（ii）は、蓄積したレポーター３５が、本願明細書に記載のようなナノ電子的センサー４０（本願明細書の一部を成す前記の特許出願の明細書に記載のこの種のセンサー及び後述する別の態様のセンサーを参照されたい）を１個又は複数個有する隣接する検出セル２５へ流れる状態を示す。センサー４０は、例えば、レポーター３５の配列の少なくとも一部に対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む検出プローブ４１を１個又は複数個具有することによって、レポータープローブ３５に対して感度を示す。あるいは、センサー４０は反応セル２３の内部に含まれていてもよい。
【００９９】
図１Ｈに示すように、レポーター３５と検出プローブ４１とのハイブリッド形成によって、センサー４０の電子的特性に特異的な検出可能な変化がもたらされ、これに起因して、下記の過程ａ）〜ｄ）を含む測定回路４２の操作によってレポーター３５の存在の測定が可能となる：
ａ）レポーターを検出プローブとハイブリッド形成させる。
ｂ）所望により、反応用緩衝液を、例えば、センサーにおけるヌクレアーゼ活性を抑制するために、測定用緩衝液と交換する。
ｃ）信号（例えば、トランジスター又は容量性特性等）を得る。
ｄ）レポーターを検出する。
【０１００】
所望により、反応媒体１７を除去し（例えば、測定用緩衝液１８と交換する）、次いで、回路４２により信号を得る前に、検出プローブのハイブリッド形成を行う。
【０１０１】
ＰＣＲによらない指数関数的な増幅
図２Ａ〜図２Ｈは、本発明の観点を有する電子的検出のための方法と装置の実施態様を模式的に示す（多数の別の方法においては共通の観点が含まれる）。この実施態様によれば、被検体に対する応答性の非直線的又は指数関数的な増幅がもたらされる（試料中の被検体の存在に応答して、付加的な非試料標的が得られるか、又は出現し、該標的は、例えば、レポーターの放出の誘発に関与する）。図２Ａ〜図２Ｈに示すような方法は、単独で使用してもよく、あるいは図１Ａ〜図１Ｈに示すような方法、即ち、被検体に対する応答性の直線的増幅（例えば、当初の試料中に存在する標的被検体のみがレポーターの放出の誘発に関与する増幅）をもたらすことによって特徴付けられる方法と組み合わせて使用してもよい。
【０１０２】
特定の実施態様においては、被検体に応答して酵素により仲介される初期の反応によって、合成のオリゴヌクレオチド標的（即ち、試料中に存在しない予備調製された天然又は合成されたオリゴヌクレオチド）が放出される。該オリゴヌクレオチド標的は付加的な酵素により仲介される反応に関与し、該反応は別の合成標的をもたらす。合成オリゴヌクレオチド標的は、試料中に被検体ポリヌクレオチドが存在しないときのエキソヌクレアーゼ活性から保護されるような重複形態でもたらされてもよい。
【０１０３】
一部の実施態様においては、合成標的は、標的被検体の疑似天然配列であってもよい。別の実施態様においては、合成標的は完全な非天然配列であってもよく、あるいは、天然配列と非天然配列との組み合わせ配列であってもよい。反応媒体中においてこの種の標的を非直線的又は指数関数的に増加させる方法を使用することによって、例えば、図１Ａ〜図１Ｈに示す方法によるレポータープローブの放出を誘発させてもよい。
【０１０４】
「増幅（amplification）」という用語に関しては、本願明細書においては、ＰＣＲにおける該用語の用い方とは幾分異なる意味で使用する。ＰＣＲアッセイ法の実施例においては、配列の新たなコピーがポリメラーゼ活性を介して創製され、プライマーを試料中の被検体と結合させることによって放出が誘発される。本願明細書に記載の本発明の観点を有する方法と装置の実施例においては、選択された標的配列のコピーは予備合成され、アンプリファイア基、例えば、試薬物質として予備配合される。予備合成標的の放出は、アッセイにおいて該試薬物質を使用するときに被検体によって特異的に誘発される。反応媒体中において放出された当該分子の増加は、被検体の存在を表示する増幅信号を事実上発生させる。
【０１０５】
図２Ａは、標的被検体ポリヌクレオチド５０を含む試料媒体を示す。該ポリヌクレオチドは標的配列Ａ（標的Ａ）と標的配列Ｂ（標的Ｂ）を含む。エキソヌクレアーゼ３７、Ａアンプリファイア５１及びＢアンプリファイア５４を含有する混合物を用いて処理した試料が図示される。本願明細書に記載のようなアンプリファイア処理の前に、所望により、試料媒体を精製処理に付してもよいことに留意すべきである。この実施例においては、エキソヌクレアーゼ３７は、図１Ａ〜図１Ｈに示す実施例の場合と同一又は類似する酵素であって、非突出状３’二重鎖末端に対して特異的な活性を示す該酵素であってもよい（上記の方法に類似する３’／５’逆方向法も可能であることに留意すべきである）。被検体５３は２種の重なり合わない選択された配列、即ち、標的Ａと標的Ｂを含む。
【０１０６】
Ａアンプリファイア５１は合成オリゴヌクレオチド５２を含んでおり、該合成オリゴヌクレオチドは、天然の標的配列Ｂ（標的Ｂ）に対して相補的な配列Ｂ’（捕獲Ｂ’） 及び標的配列Ａ（標的Ａ）に対して相補的な配列Ａ’（捕獲Ａ’）を有する。
【０１０７】
Ａアンプリファイア５１は第２オリゴヌクレオチド５３をさらに含んでおり、該第２オリゴヌクレオチドは、天然標的配列Ａ（標的Ａ）に対して相補的な配列Ａ''（合成標的Ａ''）を有する。第２オリゴヌクレオチド５３はその３’末端に「尾」配列を有するので、該第２オリゴヌクレオチドは突出状３’付着末端（即ち、平滑状又は陥凹状の３’末端を含まない）を有し、その結果、該第２オリゴヌクレオチドは、３’特異的エキソヌクレアーゼ３７に対する攻撃点を形成しない。あるいは、この目的のための「尾」配列の代わりにキャッピング基を既知の方法によって使用してもよい。
【０１０８】
オリゴヌクレオチド５３は、合成標的Ａ''と捕獲Ａ’とのハイブリッド形成によって、オリゴヌクレオチド５２と結合する。Ａアンプリファイア５１もこのように表示されることに留意すべきである。何故ならば、該アンプリファイアは、被検体５０の天然標的配列Ａと同一又は類似する配列（合成標的Ａ''）を発現できるからである。
【０１０９】
逆に、Ｂアンプリファイア５４は合成オリゴヌクレオチド５５を含んでおり、該合成オリゴヌクレオチドは、天然の標的配列Ａ（標的Ａ）に対して相補的な配列Ａ’（捕獲Ａ’） 及び標的配列Ｂ（標的Ｂ）に対して相補的な配列Ｂ’（捕獲Ｂ’）を有する。Ｂアンプリファイア５４は第２オリゴヌクレオチド５６をさらに含んでおり、該第２オリゴヌクレオチドは、天然標的配列Ｂ（標的Ｂ）に対して相補的な配列Ｂ''（合成標的Ｂ''）を有する。第２オリゴヌクレオチド５６はその３’末端に「尾」配列（又はその他のキャッピング基）を有する。オリゴヌクレオチド５６は、合成標的Ｂ''と捕獲Ｂ’とのハイブリッド形成によって、オリゴヌクレオチド５５と結合する。Ｂアンプリファイア５４もこのように表示されることに留意すべきである。何故ならば、該アンプリファイアは、被検体５０の天然標的配列Ｂと同一又は類似する配列（合成標的Ｂ''）を発現できるからである
【０１１０】
この文脈において使用される「天然」及び「合成」という用語は、試料中に存在すると推定される標的被検体又は「天然」ポリヌクレオチド及び例示的なアッセイ法を実施するためのアンプリファイア試薬中に含まれる「合成」オリゴヌクレオチドを区別するためにのみ使用されるということに留意すべきである。試料の標的被検体又は「未変性」ポリヌクレオチドは、多くの場合は天然源に起因するが、必ずしもその必要性はない。試薬アンプリファイアとなるオリゴヌクレオチドは合成的に調製する手法が簡便であるが、必ずしもその必要性はない。
【０１１１】
図２Ｂは図２Ａの要素を示す。この場合、Ａアンプリファイア５１及びＢアンプリファイア５４は被検体５０の標的Ｂ及び標的Ａとそれぞれハイブリッド形成するように反応することによって被検体／アンプリファイア複合体５７を形成する。この態様においては、Ａアンプリファイア５１とＢアンプリファイア５４は単一の被検体分子５０と同時に反応するように図示されているが、必ずしもその必要性はなく、各々のアンプリファイアが関連するように記載されている増幅過程は、各アンプリファイアが他方のアンプリファイアとは無関係に作用するように進行してもよいことに留意すべきである。例えば、各アンプリファイアは別々に被検体分子と結合してもよい。
【０１１２】
図２Ｃは、図２Ｂの被検体／アンプリファイア複合体５７を示す。この場合、Ａアンプリファイア５１のオリゴヌクレオチド５２の非突出状３’末端及びＢアンプリファイア５４のオリゴヌクレオチド５５の対応する非突出状３’末端は一対のエキソヌクレアーゼ３７の作用によって分解を開始している（両方の部位における酵素の作用が同時に行われる必要がないことに留意すべきである）。
【０１１３】
図２Ｄは、図２Ｃの被検体／アンプリファイア複合体５７を示す。この場合、エキソヌクレアーゼ３７の活性は、オリゴヌクレオチド５２の捕獲Ｂ’配列とオリゴヌクレオチド５５の捕獲Ａ’配列の脱離が行われるように作用し、これによって未変性の被検体であるポリヌクレオチド５０が放出される。
【０１１４】
図２Ｅは、図２Ｃの被検体／アンプリファイア複合体５７を示す。この場合、エキソヌクレアーゼ３７の活性は、オリゴヌクレオチド５２の捕獲Ａ’配列とオリゴヌクレオチド５５の捕獲Ｂ’配列の脱離が行われるように作用し、これによって対応するオリゴヌクレオチド５３及び５６が放出され、対応する合成標的Ａ''及び合成標的Ｂ''は単一鎖形態で露出又は発現する。
【０１１５】
図２Ｆは図２Ｅの要素を示す。この場合、放出された未変性被検体ポリヌクレオチド５０及び放出された合成標的ＡとＢ（それぞれ対応する標的Ａ''とＢ''を有するオリゴヌクレオチド５３と５６）は付加的なＡアンプリファイア５１とＢアンプリファイア５４と反応し、これによって、付加的なハイブリッド化重複体並びに付加的なアンプリファイア／被検体複合体５７、合成Ａ標的／アンプリファイア複合体５８及び合成Ｂ標的／アンプリファイア複合体５９が形成される。
【０１１６】
図２Ｇは図２Ｆの要素を示す。この場合、エキソヌクレアーゼ３７のさらなる活性に起因して、複合体５７、５８及び５９の露出された非突出状３’末端の分解が図２Ｄ〜図２Ｅに示すようにして開始され、これによって、付加的な合成標的ＡとＢ、未変性被検体５０及び先に放出された合成標的ＡとＢが放出される。
【０１１７】
図２Ｈは図２Ｇの要素を示す。この場合、最初に蓄積された未変性被検体５０及び蓄積された合成標的ＡとＢは、一般的には図１Ａ〜図１Ｈに例示した方法に関連して記載したものと一般的に類似する捕獲／レポータープローブ集合体を用いて処理した。この特定の実施例においては、２種の異なるプローブ集合体が使用された。第１プローブ集合体は、未変性被検体５０又は合成標的Ａ（５３）の標的配列Ａに対して特異的なプローブ６０を有する。第２プローブ集合体は、未変性被検体５０又は合成標的Ｂ（５６）の標的配列Ｂに対して特異的なプローブ６１を有する。レポーター分子３５を放出させるための方法と装置が示される。
【０１１８】
図３Ａ及び図３Ｂは、増幅過程に関する２つの実施例をまとめたものである。一方の実施例は２種の被検体標的を用いた実施例（図２Ａ〜図２Ｈに示す実施例）であり、他方の実施例は単一の被検体標的を用いた別の実施例である。
【０１１９】
単一標的
図３Ａは、合成標的の放出を誘発させるために単一の被検体捕獲配列を使用する増幅方法の結果を模式的に示す。被検体５０は、単一の選択された標的配列部分Ａ（標的Ａ）を有する。アンプリファイア７５は、図２Ａに示すアンプリファイア５１と類似する。但し、この場合には、両方の捕獲配列が標的Ａに対して相補的である。
【０１２０】
第１段階においては、単一の被検体５０は単一のアンプリファイア７５と反応して被検体／アンプリファイア複合体７６を生成する。エキソヌクレアーゼ３７は複合体７６を分解して被検体５０と合成標的Ａ（５３）を放出する。従って、２種の標的が放出される。
【０１２１】
第２段階においては、被検体５０と合成標的Ａ（５３）は２つの付加的なアンプリファイア７５と反応して被検体／アンプリファイア複合体７６及び合成標的Ａ／アンプリファイア複合体７７を生成する。エキソヌクレアーゼ３７は両方の複合体７６及び複合体７７を分解して被検体５０と３つの合成標的Ａ（５３）を放出する。従って、４種の標的が放出される。
【０１２２】
各々の標的配列が各々の段階において付加的なアンプリファイアとハイブリッド形成し、その結果、放出される標的の量は指数関数的に増加することが理解される。この方法の５つの段階における結果を以下の表１に示す。
【０１２３】
【表１】
【０１２４】
二重標的
図３Ａとは対照的に、図３Ｂは、複数の被検体捕獲配列を用いて合成標的の放出を誘発させる増幅方法の結果を模式的に示す。この実施例においては、増幅方法として、図２Ａ〜図２Ｈに示す方法と同じ方法を使用したが、別の方法を使用することも可能である。例えば、標的Ａと標的Ｂは、試料被検体であるポリヌクレオチド中に存在するように選択する必要はなく、補助被検体（co-analyte）の一部になるように選択してもよい。この場合、増幅された標的応答は試料中に共存する両方の補助被検体によって誘発される。この態様は、例えば、陽性の結果が複数のマーカー（例えば、複数のフラグメント又は分子から誘導されるもの）の存在として定義される選択的アッセイにおいて特に有用である。
【０１２５】
図２Ａ〜図２Ｈにも記載のように、被検体５０は２つの選択された標的配列部分を含んでおり、該標的配列部分は２種の異なるアンプリファイア（５１及び５４）と反応して複合体５７を生成する。次いで、エキソヌクレアーゼ反応によってこれらのアンプリファイアは分解され、被検体５０（２種の標的）と２種の異なる合成標的（５３及び５６）が放出される。各段階においては、放出された標的配列の重複化（doubling）がもたらされるので、増幅も指数関数的に行われることが理解される。この方法の５つの段階における結果を以下の表２に示す。
【０１２６】
【表２】
【０１２７】
図３Ｃは、表１と表２のデータをプロットしたグラフであり、単一標的法と二重標的法による合成標的の増加又は増幅を示す。
【０１２８】
図４Ａ及び図４Ｂは、レポーターの増幅と精製のための装置と方法を示す。
図４Ａは、一般的には、図２Ｈに図示する要素を示すが、この場合は修飾されたレポータープローブ（６１及び６２）を示す。この実施例においては、該レポータープローブは実質的な基体には結合せず、また、レポーターオリゴヌクレオチド３５の３’末端上にキャッピング基７８を有する。２種の異なるプローブを示す。一方のプローブにおいては、相補的レポーター配列３５''の末端上にキャッピング基が存在し、他方のプローブにおいては、短い尾配列の末端上にキャッピング基が存在する。キャッピング基は、当該分野において知られている多数の適当な種であって、エキソヌクレアーゼの付着及び／又はプロセシングに対して耐性を示す該種から選択されるいずれであってもよい（例えば、ヌクレオチド類似体、及び共有結合した種等）。この種のキャッピング基は、常套のオリゴヌクレオチド合成過程中において簡便に導入することができる。修飾されたレポータープローブは、溶液相中において被検体によって誘発されるレポーターの放出のために使用してもよい。
【０１２９】
図４Ｂは、ナノ電子的検出の前に、放出されたレポーター（３５’及び３５''）を精製することによって、検出環境を単純化すると共に感度と選択性を改善する（例えば、ノイズの低減化等）ための本発明の観点を有する方法と装置の別の実施例を示す。検出操作の前に、高分子量のポリヌクレオチドを除去することは有利である。基体は磁性ビーズ又は本願明細書に記載のその他のいずれかの基体を含有している態様が有利である。少なくともレポーター３５’又は３５''に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含む１又は複数の「サンドウィッチ型」プローブ７９は、図１Ａ〜図１Ｈに関連して記載したようにして、例えば、ビオチン／ストレプタビジン結合等によって基体へ結合される。レポーター３５’は、短い尾領域をプローブ７９とハイブリッド形成させた状態で図示されている。レポーター３５'は、プローブ（６０及び６１）のナノコードに対して相補的なレポーター配列の少なくとも一部によってハイブリッド形成された状態で図示されている。
【０１３０】
本願明細書に記載のように、基体に結合したレポーター（３５’及び３５''）をすすぎ処理又は洗浄処理に付すことによって、未結合種を含む酵素反応媒体を除去した後、緩衝液で置き換えてもよく、また、該レポーターはナノ電子的検出操作のために、例えば、ビーズの磁気的不動化等によって最適化させてもよい。プローブ７９は、洗浄過程中のレポーターの安定な結合を可能にすると共にその後の検出用レポーターの放出のための簡便な変性を可能にするように選択されるヌクレオチド配列を有していてもよい。
【０１３１】
図８Ａ及び図８Ｂに関連して後述する多重被検体アッセイとマトリックス検出器の実施態様に留意すべきである。図４Ｂに示すレポーターの精製法においては、レポーター３５の共通の配列部分に対して相補的な「サンドウィッチ型」プローブ７９を用いる態様が簡便である。この場合、該レポーターの配列のその他の部分は複数の被検体の１種に対して特異的である。アッセイ反応においてどのような種類のレポーターが放出されようとも、該レポーターは、マトリックス検出器との接触の前に、集合的に精製処理に付してもよい。
【０１３２】
ＰＣＲによらない標的の指数関数的な増幅とレポーターの累積増幅
図５Ａ〜図５Ｅは、共通の観点を有する多数の別の方法から選択された本発明の観点を有する例示的な方法と装置の実施態様を示す。この実施態様によれば、予備増幅による精製過程を含む被検体に応答する指数関数的な増幅がもたらされる。なお、この実施態様は、図２Ａ〜図２Ｈに示す方法と装置と共通する多くの観点を有しており、また、多くの場合は共通する参照番号が使用されている。図５Ａ〜図５Ｅに示すような方法と装置は独立して使用してもよく、あるいは、本願明細書に記載の別の方法と装置、特に図１Ａ〜図１Ｈによって例示される方法と装置と組み合わせて使用してもよい。
【０１３３】
初期固定化
図５Ａは、標的配列Ａ（標的Ａ）と標的配列Ｂ（標的Ｂ）を含む標的被検体ポリヌクレオチド５０、及び種々の試料汚染物（例えば、被検体でないポリヌクレオチド、干渉性酵素、望ましくない化学的成分及び過剰の希釈剤等）を含有する試料媒体を示す。この試料は、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成が行われるために十分な条件下において、分析系７０と接触させる。該分析系は基体７１及び該基体と、例えばビオチン／ストレプタビジン結合６２によって結合した複数の捕獲プローブ（６０及び６１）を具有する。
【０１３４】
プローブはＡプローブ（６０）とＢプローブ（６１）を含む。これらのＡプローブ及びＢプローブは、図２Ａ〜図２Ｈに示すプローブ６０及び６１と実質上同一であってもよい。Ａプローブ（６０）は、被検体ポリヌクレオチド５０の標的配列Ａに対して相補的な捕獲配列Ａ’を含み、また、Ｂプローブ（６１）は、被検体ポリヌクレオチド５０の標的配列Ｂに対して相補的な捕獲配列Ｂ’を含む。好ましくは、特に試料が非常に少量の被検体種を含有する場合には、分析系７０が、試料中に存在する実質的な量の被検体分子５０と結合するために十分な数のＡプローブ（６０）及び／又はＢプローブ（６１）を含むようにし、これによって、希薄試料に対する感度を最大にする。図２Ａにおいて模式的に示される実施態様においては、全ての被検体５０の分子はプローブ６０又はプローブ６１と結合する。過剰のプローブ６０及び６１は以下に記載の段階のために機能する。
１．過剰のＡレポータープローブ及びＢレポータープローブは大部分の被検体分子と結合する。
２．プローブの種類の空間的分離（例えば、ビーズの分離や基体の固定等）によって、アグルチネーション（aglutination）／架橋が回避されると共に被検体Ａの約半分と標的サイトはハイブリッド形成されない状態で残存する。
【０１３５】
基体７１は粒状であってもよく（例えば、１又は複数のビーズ等）、あるいは、非粒状であってもよい（例えば、ウェル、プレート及びベルト等）。特定の実施態様においては、基体７１は、多重結合被検体であるポリヌクレオチド５０に対するポテンシャルを低減させるように設計される（被検体は、標的Ａ配列と標的Ｂ配列において対応するプローブ６０及び６１とハイブリッド形成する）。図示する実施例においては、この態様は、１又は複数のＡプローブ（６０）とＢプローブ（６１）に対して異なる領域を提供する右手の区域と左手の区域によって別々に表示されているが、多くの別の態様が可能である。例えば、別の装置は異なる種類のビーズ（例えば、所望によりビーズ分離機構を用いてもよい）、固定プレート又はルーメン帯域、可変性の緊縮条件、及び異なる溶融特性／変性特性等を具有していてもよい。さらに別の実施態様においては、基７１は電子的検出器の素子と一体化されていてもよく（この態様に関しては後述する）、あるいは、該検出器から分離して配設させてもよい。
【０１３６】
精製
図５Ｂは図５Ａの要素を示す。この場合、すすぎ及び／又は洗浄過程が行われ、これによって、過剰の試料媒体と汚染物６３が除去されるが、プローブ６０及び６１によって基体へ結合された被検体５０は保持される（不動化／分離技術を使用することによって、系中に存在する粒子状物質は保持される）。
【０１３７】
インキュベーション
図５Ｃは図５Ｂの要素を示す。この場合、エキソヌクレアーゼ３７（例えば、図２Ａ〜図２Ｈに示すような活性を有するエキソヌクレアーゼ等）及びアンプリファイア重複オリゴヌクレオチド（該オリゴヌクレオチドは、図２Ａに示すＡアンプリファイア５１及びＢアンプリファイア５４と実質上同一であってもよい）を含有する緩衝液によって交換されている。
【０１３８】
増幅
図５Ｄは図５Ｃの要素を示す。この場合、ハイブリッド形成と酵素活性に対して適した条件下において、Ａアンプリファイア５１、Ｂアンプリファイア５４及びエキソヌクレアーゼ３７は、図２Ｂ〜図２Ｇに記載のようにして、被検体５０とその後の合成標的と反応することによって、合成Ａ標的５３と合成Ｂ標的５６を緩衝液媒体中へ放出する。
【０１３９】
図示する実施例においては、合成Ａ標的５３と合成Ｂ標的５６は、図５Ａの過程において供給される過剰の複数のプリスチンＡプローブ６０とＢプローブ６１とハイブリッド形成する。あるいは、図５Ｄの過程において、付加的なプローブが提供されてもよい。この反応によって、図２Ｈに記載のようにして、複数の合成標的／プローブ複合体が生成する。特定の実施態様においては、過剰のアンプリファイア５１及び５４が供給され、エキソヌクレアーゼによって仲介される増幅が行われ、これによって十分な量の合成Ａ標的及び合成Ｂ標的の生成反応が続行され、複数のプローブ６０及びプローブ６１はハイブリッド複合体の形成反応を介してそれぞれ飽和される。
【０１４０】
レポーターの放出
図５Ｅは図５Ｄの要素を示す。この場合、エキソヌクレアーゼ３７は、酵素活性に対して適当な条件下において、図２Ｈに記載のようにして、合成標的／プローブ複合体及び未変性被検体／プローブ複合体と反応してプローブ６０と６１を分解させることによって、レポーターオリゴヌクレオチド３５及び標的種を緩衝液媒体中へ放出させる。
【０１４１】
図示する実施例においては、エキソヌクレアーゼは全てのプローブを分解させることによって、検出用のレポーターを放出する。存在するポリヌクレオチドの実質的な母集団は未変性被検体及び被検体の存在に応答して放出される種（合成標的及びレポーター）であり、交差反応性は最小限に抑制されるか、又は回避される。レポーターは、検出器の応答に対して、例えば、大きさ又は組成等の点で最適化させることができる。許容される条件下では、図５Ｅに示す反応は、一般的には図５Ｄに示す反応と同時に進行させてもよいということに留意すべきである。あるいは、緊縮調節及びプローブの分離等を利用してこれらの反応過程を分離してもよい。
【０１４２】
レポーター３５は、図１Ｇ及び図１Ｈに関連して説明したようにして、分離されたナノ電子的検出器４０又は反応領域と連絡する一体化ナノ電子的検出器を介して検出してもよいことに留意すべきである。
【０１４３】
別の特定の実施態様においては、基体７１は、プローブ６０及び６１の分解を直接的に検出するように設計された１又は複数のナノ電子的検出素子を含んでいてもよい。例えば、基体７１は１又は複数のナノ粒子の領域、例えば、電気接点と連絡するカーボンナノチューブ素子等を含んでいてもよい。例えば、プローブの分解に起因する１又は複数のナノチューブの性質の変化は、本願明細書及び本願明細書に組み込まれた特許出願の実施例Ａ〜Ｉに記載のようにして検出可能である。
【０１４４】
さらに別の実施態様においては、基体７１は、１又は複数の電極（例えば、間隔を設けて配置された少なくとも１対のソース電極／ドレイン電極）と接触するカーボンナノチューブのようなナノ粒子の連動ネットワークを含む１又は複数の領域を具有する。ナノ粒子のネットワークはウェファー様基体構造材（例えば、ケイ素、ＳｉＯ２，Ｓｉ３Ｎ４、ＰＥＴ及び対電極材等又はこれらの任意の混合物）によって支持されていてもよい。本願明細書に組み込まれた特許出願の明細書には、この種の装置に関する調製例と操作例が記載されている。プローブ６０及び６１の分解（この分解により残存するリガンド部分６２’が脱離する場合がある）によって、適当な回路（図示せず）によって検出可能なナノ粒子素子の電気的、機械的及び／又は電気化学的な環境における少なくとも１つの変化（例えば、対電極に対するナノ粒子のキャパシタンスの変化、及びゲート電極の影響下でのトランジスター特性の変化等）がもたらされる。
【０１４５】
後続の酵素除去による増幅
図６Ａ〜図６Ｃは、共通の観点を有する多数の別の方法に含まれる本発明による観点を有する１つの例示的な方法と装置の実施態様を示す。この実施態様によれば、被検体に応答する指数関数的な増幅がもたらされた後、分析媒体からエキソヌクレアーゼが除去される。図示する方法と装置は、図２Ａ〜図２Ｈ及び図５Ａ〜図５Ｅに示す方法と装置と比較した場合、多くの共通の観点を有し、多くの共通の参照番号を伴う。
【０１４６】
エキソヌクレアーゼ増幅
図６Ａは、標的配列Ａ（標的Ａ）と標的配列Ｂ（標的Ｂ）を含む標的被検体ポリヌクレオチド５０を含有する試料媒体を示す。試料は、一般的には図５Ａ〜図５Ｄに示す過程と同一又は類似するようにして処理することにより、ハイブリッド形成と酵素活性に対して適当な条件下において、被検体５０をＡアンプリファイア５１、Ｂアンプリファイア５４及びエキソヌクレアーゼ３７と反応させ、これによって複数の合成Ａ標的５３と合成Ｂ標的５６を緩衝液媒体中へ放出させてもよい。
【０１４７】
本発明の観点を有するこの別の実施態様においては、エキソヌクレアーゼによって仲介される増幅をおこなうことによって、１又は複数の変性Ａプローブ８１及び／又は８２並びに１又は複数の変性Ｂプローブ８３及び／又は８４を接触させる。これらの変性プローブは保護性３’尾を有しており、該尾は非突出性３’末端（例えば、平滑状又は陥凹状の３’末端）を脱離させることによって、エキソヌクレアーゼ３７の３’二重特異的活性による分解を防止する。このようにして、図５Ｅに示す反応は防止される。図示する実施例においては、過剰のアンプリファイアは、過剰の合成Ａ標的とＢ標的による変性プローブ８１〜８４の飽和を可能にする。
【０１４８】
第１の別の態様においては、変性Ａプローブ８１及び変性Ｂプローブ８３は、結合した合成Ａ標的及び合成Ｂ標的の隣接部分に対してそれぞれ非相補的な保護性３’尾を有しているので、プローブ／標的ハイブリッド複合体においては、保護性尾は単一鎖３’末端部分を有する。第２の別の態様においては、変性Ａプローブ８２及び変性Ｂプローブ８４は、結合した合成Ａ標的及び合成Ｂ標的の隣接部分に対してそれぞれ相補的な保護性３’尾を有しているので、プローブ／標的ハイブリッド複合体においては、保護性尾は二重鎖３’末端部分を有し、該３’末端部分は各々の合成標的オリゴヌクレオチドの隣接５’末端を超えて突出する（付着３’末端）。
【０１４９】
精製
図６Ｂは図６Ａの要素を示す。この場合、プローブ／標的複合体が形成された後、すすぎ及び／洗浄過程がおこなわれ（例えば、交換用緩衝液を用いて、基体に結合したプローブ／標的複合体からエキソヌクレアーゼ緩衝液をすすぎ流す）、エキソヌクレアーゼ３７を含む過剰の試薬物質は媒体から除去される。交換された媒体は、図１Ｇに示す過程の場合のように、検出操作のために最適化させてもよい（この場合、酵素活性のために適するようにする必要はない）。
【０１５０】
プローブの変性
図６Ｃは図６Ｂのプローブ／標的要素及び基体７１を示す。この場合、例えば、熱、電場又は緊縮調節等を利用して変性過程を行うことによってプローブ／標的複合体を変性させ、これによってレポーター分子３５及び／又は合成標的分子５３及び５６を放出させる。緊縮調節とオリゴヌクレオチド配列の設計に応じて、該変性過程を全体的又は選択的に行ってもよいことに留意すべきである。従って、検出器は、レポーター３５、標的５３、標的５６又はこれらの混合物を検出するように最適化させてもよい（別のプローブにおいては、所望によりレポーター３５を省略してもよい）。
【０１５１】
１又は複数のプローブの骨格種８１’、８２’、８３’及び／又は８４’は基体７１に結合した状態にあってもよい（図示する実施例においては、該骨格種は単一鎖オリゴヌクレオチドである）。図５Ｅに示す実施例の場合のように、基体７１は、本願明細書に記載のようなナノ電子的検出器であって、変性状態を直接的に検出するように設計されたナノ電子的検出器を含んでいてもよい（直接的な基体装置の検出）。例えば、直接的な基体装置の検出には、プリスチンプローブ８１〜８４を含む変性現象（試料中には被検体５０は存在しない）（例えば、変性前、変性中及び変性後の比較）及びプローブ／標的複合体を含む変性現象（被検体５０の存在に応答してもたらされる）との間の差異を検出することが含まれていてもよい。同様に、付加的な実施態様においては、このような直接的な基体装置の検出は、遠隔ナノ検出器（例えば、図１Ｈに記載のような）と組み合わせて行ってもよい。
【０１５２】
内部ヌクレアーゼ耐性ブロック基を有するレポータープローブ
図７Ａ〜図７Ｆは、本発明の観点を有するレポータープローブであって、ブロック基の配列位置におけるエキソヌクレアーゼのプロセシングを停止させる内部ブロック基を含むレポータープローブの実施例を示す。この種のブロック基は当該分野においては既知であって、例えば、天然核酸が共有結合した種の類似体を含んでいてもよい。
【０１５３】
ハイブリッド形成プローブ
図７Ａは、プローブ９０が被検体ポリヌクレオチド５０の標的配列Ａとハイブリッド形成して被検体／プローブ複合体を生成するように、該プローブ９０を用いて処理した被検体ポリヌクレオチド５０を示す。プローブ９０は、連鎖レポーターオリゴヌクレオチド９１及びコンパニオンオリゴヌクレオチド９２を含む。
【０１５４】
連鎖レポーターオリゴヌクレオチド９１は、被検体５０の標的Ａの少なくとも一部に対して相補的な近位捕獲配列部分９４、及びコンパニオンオリゴヌクレオチド９２の少なくとも一部に対して相補的な遠位レポーター配列部分９５を含む。捕獲配列９４及びレポーター配列９５は、介在する耐性連結基９３によって連結される。この実施例における「近位」と「遠位」という用語は、３’末端を近位とし、５’末端を遠位とするように任意的に使用するものであり、「鏡像」オリゴヌクレオチド構造においては、３’対５’の意味は逆転する。
【０１５５】
コンパニオンオリゴヌクレオチド９２は、レポーター配列９５の少なくとも一部に対して相補的な近位アンカー配列９６、及び被検体５０の少なくとも一部に対して相補的な遠位捕獲配列９７を含む。
【０１５６】
特定の実施態様においては、連鎖レポーター９１とコンパニオン９２のハイブリッド複合体を含む集合プローブ９０は、例えば試薬溶液中へ導入し、被検体５０を含む試料と反応させてもよい。別の実施態様においては、単一鎖状の連鎖レポーター９１及び単一鎖状コンパニオン９２を供給して被検体５０と接触させてその場で被検体５０と相互にハイブリッド形成させることによって、図７Ａに示すように、被検体／プローブ複合体が生成する。
【０１５７】
プローブの分解
図７Ｂは図７Ａの要素を示す。この場合、非突出状３’末端を有する二重ポリヌクレオチドを分解させる活性を有するエキソヌクレアーゼ３７が更に付加される。エキｓドヌクレアーゼは、捕獲配列９４を含む連鎖レポーター９１の近位部分へ結合して該近位部分分解を開始させる。
【０１５８】
図７Ｃは図７Ｂの要素を示す。この場合、エキソヌクレアーゼは連鎖レポーター９１の分解を続行し、連鎖レポーター９１の耐性結合９３に近い部分を除去する。
【０１５９】
レポーターの放出
図７Ｄは図７Ｃの要素を示す。この場合、エキソヌクレアーゼ３７は、耐性結合９３に達すると、プローブ／被検体複合体から離脱し、レポーター配列３５は該酵素の影響を受けない。レポーター配列９５は変性され、コンパニオン９２から離脱する。好ましくは、i）反応媒体の条件（温度、ｐＨ、及びイオン組成等）、及びii）レポーター配列３５とコンパニオンアンカー配列９６の対応する相補的部分の長さとヌクレオチド組成の一方又は両方は、残存するレポーター配列９５が、オリゴヌクレオチド９１の近位部分が分解したときに二重形態として一般的に不安定になるように選択してもよい。あるいは、酵素分解後の反応媒体の条件を調整することによって、二重のレポーター９５の変性を促進してもよい。
【０１６０】
特定の実施態様においては、レポーター９５の脱離後、コンパニオン９２は被検体５０に結合した状態を保持するように設計される。別の実施態様においては、コンパニオン９２も変性されて被検体から脱離してもよい。いずれの場合においても、コンパニオン９２は、媒体中の付加的なプリスチンが結合したレポーターオリゴヌクレオチド９１と結合させることによって再循環させ、図７Ａに記載のようにして、付加的なプローブ／被検体複合体を形成させてもよい。
【０１６１】
精製
図７Ｅは、１又は複数の相補的な「サンドウィッチ型」プローブ７９を用いる所望による精製過程を示す。この場合、基体に結合した１又は複数のプローブオリゴヌクレオチドの各々は、例えば、図４Ｂに記載のように、レポーター配列９５に対して相補的な配列を有する。レポーター９５をプローブ７９へ結合させた後、基体３２のすすぎ／洗浄処理を行うことによって、変性によるレポーター９５の放出の際の試料媒体を非常に単純化させることができる。
【０１６２】
検出
図７Ｆは、図１Ｇ〜図１Ｈに関連して記載したような本願発明の観点を有するナノ電子的センサー４２によってレポーター９５を検出する態様を示す。前述のように、本発明による観点を有するレポーターは、常套の光学的方法を含む種々の別の検出手段によって検出してもよい。検出器４２は１又は複数の結合された検出プローブ９８を有しており、該プローブは相補的配列を介してレポーター９５とハイブリッド形成し、これによってセンサーの特性に関して検出可能な変化がもたらされる。例えば、図７Ｅに示す所望による精製過程によるエキソヌクレアーゼ３７の除去又は失活によって、プローブ／レポーター複合体の形態に関連する制約、即ち、センサーに関して遠位の非突出状３’末端が分解されないという制約を排除することができる（センサー４２による迅速な検出によってもこの制約を排除することができる）。あるいは、プローブ９８が、図示するように、遠位の突出状３’末端を有するように設計してもよい。他の検出プローブ９９は遠位の５’末端を有する。図示する実施例においては、耐性結合９３はレポーター９５の３’末端上又は該末端に隣接する位置に存在するので、二重のプローブ／レポーター複合体におけるエンドヌクレアーゼ活性に対して耐性がもたらされる。
【０１６３】
多重レポーターとマトリックス検出セルを用いる多被検体アッセイ
図８Ａと図８Ｂは、多重レポーターとマトリックス検出セルを用いる多被検体アッセイを含む本発明の観点を有する例示的な方法と装置の実施態様を示す。この方法には、複数のプローブを供給することが含まれる。該プローブは、複数の異なる被検体に対応する検出種（例えば、レポーター等）を増幅して供給するように設計される。
【０１６４】
図８Ａは、多重レポータープローブ及び所望による精製過程と多重アンプリファイアを利用する多被検体アッセイを示すフローチャートである。この実施例においては、レポータープローブ及び想定される被検体１、２、３及び４にそれぞれ対応するアンプリファイアを含有する試薬混合物が配合される。被検体２及び４のみを含有する試料媒体を、ハイブリッド形成と酵素活性を促進するために有効な条件下において、該試薬混合物とエキソヌクレアーゼ３７と接触させる。前述のようにして増幅とレポーターの放出が行われた後、被検体１と２に対応するレポーター及び合成標的が放出される。被検体１と３に対応するアンプリファイア及びレポータープローブは未反応状態に保持される。レポータープローブとアンプリファイア及びすすぎ又は精製過程は本願明細書に記載のいずれかの実施態様（例えば、図１〜図７に記載の実施態様）又は本願発明の技術的思想を逸脱することのないいずれかの類似の実施態様であってもよいことに留意すべきである。
【０１６５】
図８Ｂは、包囲壁１０１、１又は複数の出入口１０２及びセンサーのマトリックスを具備する検出セル１００を示す。各センサーは、異なる被検体であるレポーター分子に対応する異なる検出感度を有する。図８Ｂにおいては、４つのセンサー４２ａ、４２ｂ、４２ｃ及び４２ｄが図示されている。これらのセンサーには、本願明細書に記載のいずれかのセンサー及び本願明細書に組み入れられる特許出願の明細書に記載のいずれかのセンサーを含んでいてもよいことに留意すべきである。この実施例においては、各センサー４２は基体（例えば、誘電層１０７を有する共通の基体１０６、例えば、シリコンウェファー、ＳｉＯ２表面層又はポリマーシート等）、基体に隣接して配置されたナノ構造素子１０４（この実施例においては、相互に連絡されたＣＮＴネットワークである）、及び該ナノ構造素子１０４と電気的に接続する少なくとも１つの接点（この実施例においては、相互に組み合わされたソース／ドレイン電極対が図示されている）を具備する。トランジスターの実施例においては、分離したゲート電極を含めてもよく、あるいは、Ｓｉをドープしたウェファーのような基体材料をマトリックス用の共通のゲート電極として使用してもよい。各センサーにおけるナノ構造素子１０４は、アッセイの想定される被検体の１種に対して特異的な異なる認識材料（この実施例においては、被検体１、２、３及び４のそれぞれに対応するレポーターオリゴヌクレオチドから選択される１種に対して相補的なオリゴヌクレオチドプローブである）を用いて感作される。
【０１６６】
検出溶液１０３（この実施例の場合には、図８Ａに示す反応混合物から誘導される精製されたレポーター溶液である）をセル１００に含まれるセンサー４２と接触させる。適当な測定回路（図示せず）によって、対応するレポーターとのハイブリッド形成が発生するセンサー４２ａ〜４２ｄの性質の変化が測定される
【０１６７】
図示する態様のマトリックスセル１００においては、センサー４２は異なるレポーター分子を検出するように設計されているが、本願発明の技術的思想を逸脱することなく、その他の態様を採用することも可能であることに留意すべきである。例えば、センサーは、合成標的又は被検体の分子に対して感度を示すプローブを含んでいてもよい。
【０１６８】
アプタマー／レポーター複合体
図９Ａ〜図９Ｃは、本発明の観点を有する１つの例示的な方法であって、生体分子を含む被検体を検出するためのアプタマー部分を含むプローブ集合体を示す。アプタマー／塩基配列複合体は、アプタマー１１２が被検体１１１と結合したときに正角的変化（conformal change）がもたらされるように選択される。図示する実施例においては、アプタマー／レポーター複合体は、例えば、前述のような方法によってビーズ等の基体上へ固定化される。図９Ｂに示すように、プローブ集合体１１０は、塩基配列１１４へ結合された二重形態のレポーター１１３を含む。プローブ１１０は、一般的には本願明細書に記載のいずれかの実施例に示すものと類似する。図示する実施例においては、プローブ１１０は、一般的には図７Ａ〜図７Ｆに示すものと類似し、塩基配列１１４は被検体５０の場合と同様に作用する。塩基配列は、標的被検体１１１に対して特異的な結合能を示すアプタマー配列１１２と接続される。本発明の観点を有する実施態様においては、被検体は、アプタマー又は類似のポリヌクレオチド構造体（例えば、球状タンパク質及び多糖等）に対して特異的な親和性又は反応性を示す多数の物質から選択されるいずれの物質であってもよい。
【０１６９】
プローブの保護に適合したアプタマー
図９Ａに示すように、アプタマー１１２が被検体１１１と結合しないときには、エンドヌクレアーゼ３７がプローブ１１０を実質上分解させないように該プローブの立体配座は保護される。
【０１７０】
アプタマーの被検体への結合とプローブの暴露
図９Ｂに示すように、アプタマー１１２が被検体１１１に結合すると、結合体の立体配座はプローブ１１０をエンドヌクレアーゼ３７へ暴露させるので、該プローブ１１０はエンドヌクレアーゼ３７によって攻撃される。
【０１７１】
プローブの分解とレポーターの放出
図９Ｃに示すように、酵素３７によってプローブ１１０が分解された後、レポーターが放出されるので、該レポーターは、図１〜図８に示す実施態様に関連して記載した方法によって検出してもよい。
【０１７２】
ポリヌクレオチドの検出用ナノ電子的センサー：実施例Ａ〜Ｉ
本発明の観点を有する付加的な実施態様は、共同で発明された米国特許出願第１１／３１８３５４号（出願日：２００５年１２月２３日）の明細書（ＷＯ２００６−０７１８９５参照）及び米国特許出願第１１／２１２０２６号（出願日：２００５年８月２４日）の明細書（ＷＯ２００６−０２４０２３参照）に開示されている実施例Ａ〜Ｉに記載されており、これらの明細書も本願明細書の一部を成すものである。
【０１７３】
多段階的アンプリファイア [指数法則（power-law）増幅]
図１０〜図１３は、本発明の観点を有する実施態様であって、図２及び図３に関連して先に説明した実施態様の場合と多くの関連性と操作手順の点で類似する方法に従って、被検体に応答して酵素で仲介される増幅をもたらす実施態様を示す。この場合、アンプリファイア試薬種の多段階的シリーズが使用される。
【０１７４】
図１０〜図１３に示す実施態様においては、初期段階のアンプリファイアの被検体に応答する酵素反応による生成物は、第２段階のアンプリファイアの増幅用基体を形成し、その後の酵素反応において第２増幅生成物がもたらされる。付加的な段階を含めてもよい。
【０１７５】
これらの実施例においては、予め選択された被検体の標的配列Ａを用いるハイブリッド形成を介して、増幅の初期段階のみが被検体の存在によって直接的に誘発される。その後の段階のアンプリファイアは増幅生成物によって誘発される。増幅生成物（誘導鎖又はレポーターフラグメント）の蓄積は、逐次的なアンプリファイア段階の数（ｎ＝２、３、......）に基づく指数法則の関係式に従う。
【０１７６】
このような多段階的増幅スキームを採用する検出装置を用いてこの種の増幅生成物（レポーター）の一部又は全部を検出することによって、試料中の生体分子被検体の存在又は濃度の測定が可能となる。このような検出においては、本願明細書に記載のいずれかのナノ電子的装置を使用してもよい。
【０１７７】
本発明の観点を例証するために、図１０〜図１３に示す実施例においては、オリゴヌクレオチド複合体と酵素は、３’−エキソヌクレアーゼによる分解が、１つの鎖上に非突出状３’末端を有する二重ＤＮＡ上において選択的に開始されるように設計され、該分解は、非突出状鎖に沿って３’から５’の方向へ進行する。しかしながら、図２及び図３に関連して先に説明した実施例の場合のように、本発明による技術的思想を逸脱することなく、その他の立体配置を採用することも可能であり、また、その他の酵素（例えば、５’エキソヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ等）を使用し、これに応じてアンプリファイア試薬種を設計してもよい。
【０１７８】
２段階増幅
例えば、図１０及び図１１は２段階法（ｎ＝２）の実施態様を示す。別の実施態様の場合のように、被検体に応答して最初に行われる酵素仲介反応によって、合成標的（即ち、試料中に存在せず、予め調製されて選択された天然の又は合成されたオリゴヌクレオチド）が放出される。該合成標的は、別の合成鎖又はフラグメントの放出をもたらす付加的な酵素仲介反応に関与する。合成オリゴヌクレオチドは、試料中に被検体ポリヌクレオチドが不存在のときのエキソヌクレアーゼ活性から保護されるように設計された二重形態で供給される。
【０１７９】
初期条件
図１０に示す実施例における第１の図（図１０ａ）は、試料測定の初期状態を示す。この初期状態には下記の要件ａ）〜ｄ）を伴う：
ａ）予め選択された配列Ａを有する被検体ポリヌクレオチド鎖１２０は、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成が行われるために十分な条件下において、少なくともアンプリファイアＩを含む試薬／緩衝液へ暴露される。
ｂ）アンプリファイアＩは、捕獲鎖１２１とコンパニオン鎖１２２を含む二重構造を含む。
ｃ）捕獲鎖１２１は、捕獲配列Ａ’（標的Ａの一部又は全部に対して相補的な配列）及び２つの付加的な配列Ｂ’とＣ’を３’から５’の順位で含む。
ｄ）コンパニオン鎖１２２は２つのコンパニオン配列ＣとＢを３’から５’の順序で含む。該配列Ｃ及びＢはそれぞれ捕獲鎖１２１のコンパニオン配列Ｃ’及びＢ’の一部又は全部に対して相補的であって該一部又は全部とハイブリッド形成し、暴露された鎖１２１の捕獲配列Ａ’は残存する。
【０１８０】
段階１
図１０ｂにおいては、アンプリファイアＩは、鎖１２１の捕獲配列Ａ’と被検体鎖１２０の標的配列Ａとのハイブリッド形成による被検体鎖１２０との二重会合状態で示される。エキソヌクレアーゼ種は必要ないずれかの補因子と共に試薬中へ添加するか、又は試薬中に存在させることによって、捕獲配列１２１の３’末端における分解を開始させる。
【０１８１】
図１０ｃにおいては、段階１の酵素分解が完結した状態が示されており、未分解の被検体鎖１２０（原鎖）とコンパニオン鎖１２２（コンパニオンＩ又はＢＣ）は溶液中へ放出される。この時点（段階１の終了時点）においては、１つの原鎖と１つの誘導鎖（例えば、レポーター等）が溶液中に存在する。
【０１８２】
段階２
図１０ｄは当該方法の段階２の開始状態を示す。この場合、段階１の生成物（鎖１２０及び鎖１２２）は、試薬／緩衝液媒体中において、付加的なアンプリファイアＩとアンプリファイアII に暴露される。この段階には下記の要件ａ）〜ｃ）が伴う：
ａ）アンプリファイアII は、捕獲鎖１２３とコンパニオン鎖１２２を含む二重構造を含む。
ｂ）捕獲鎖１２３は、捕獲配列Ｃ''（コンパニオン鎖１２２の配列Ｃの一部又は全部に対して相補的な配列）及び付加的な配列Ｂ''を３’から５’の順位で含む。
ｃ）コンパニオン鎖１２４はコンパニオン配列Ｂ'''を含む。該配列は捕獲鎖１２３のコンパニオン配列Ｂ''の一部又は全部に対して相補的であって該一部又は全部とハイブリッド形成し、暴露された鎖１２３の捕獲配列Ｃ''は残存する。
【０１８３】
図１０ｅにおいては、アンプリファイアII は、鎖１２３の捕獲配列Ｃ''とコンパニオン鎖１２２の配列Ｃとのハイブリッド形成によるコンパニオン鎖１２２との二重会合状態で示される。エキソヌクレアーゼ種は必要ないずれかの補因子と共に試薬中へ添加するか、又は試薬中に存在させることによって、捕獲配列１２３の３’末端における分解を開始させる。同時に、付加的なアンプリファイアＩは、段階１に関して記載したように、被検体鎖１２０との二重会合状態で示される。
【０１８４】
図１０ｆにおいては、段階２の酵素分解が完結した状態が示されており、未分解の被検体鎖１２０（原鎖）、２つのコンパニオン鎖１２２（第１誘導鎖と第２誘導鎖）及びコンパニオン鎖１２４（コンパニオンII 又はＢ）は溶液中へ放出される。この時点（段階２の終了時点）においては、１つの原鎖と３つの誘導鎖（例えば、アンプリコン又はレポーター等）が溶液中に存在する。
【０１８５】
付加的段階（相１及び相２）
図１０ｇは当該方法のその後の段階３の開始状態を示す。段階１の生成物（鎖１２０と鎖１２２）及び段階２の生成物（鎖１２４）は、試薬／緩衝液媒体中において、付加的なアンプリファイアＩ及びアンプリファイアII に暴露される。
【０１８６】
図１０ｈにおいては、アンプリファイアＩは、段階１の被検体鎖１２０との二重会合体として示されており、また、アンプリファイアII は、段階２のコンパニオン鎖１２０との二重会合体として示されている。エキソヌクレアーゼは、被検体の重複部位の捕獲鎖１２０及びコンパニオンＩの各々の重複部位の捕獲鎖１２３の分解を開始させる。
【０１８７】
図１０ｉにおいては、酵素的分解は完結しており、また、未分解の被検体鎖１２０、３つのコンパニオン鎖１２２、及び３つのコンパニオン鎖１２４（１つは段階２から得られたものであり、２つは新たに誘導されたものである）は溶液中へ放出される。この時点（段階３の終了時点）においては、１つの原鎖と６つの誘導鎖（例えば、アンプリコン及びレポーター等）が溶液中に存在する。
【０１８８】
この方法の６つの相又は段階において得られた結果を以下の表３に示す。
【表３】
【０１８９】
図１１は、２段階増幅に関する表３の結果をプロットしたグラフを示す。
【０１９０】
３段階増幅
別の実施例に関する図１２Ａ〜図１２Ｃ及び図１３は、３段階法（ｎ＝３）の実施態様を示す。この実施態様は、多くの点で、図１１〜図１２に示す２段階の実施例の場合と類似する。簡便化のために、以下においては、各々の増幅段階の操作様式のみについて説明する。この実施態様の基礎となる原理と構成は、前述の関連する記載内容に基づけば明らかになる事項である。前述の実施例の場合のように、特定の前駆体標的及び十分な増幅試薬と酵素が存在する場合には、各段階は同時に進行させてもよいことに留意すべきである。
【０１９１】
段階１
図１２Ａは、アンプリファイア＃１の漸進的活性（progressive activity）を示す矢印で連結される３つの部分を示す。この段階には下記の要件ａ）〜ｆ）が含まれる：
ａ）アンプリファイア＃１は、捕獲鎖１２５とコンパニオン鎖１２６を含む二重構造を有する。
ｂ）捕獲鎖１２５は、捕獲配列Ａ’（該配列は、標的Ａの全部又は一部に対して相補的である）及び３つの付加的配列Ｂ’、Ｃ’及びＤ’を３’から５’の順位で含む。
ｃ）コンパニオン鎖１２６は、３つのコンパニオン配列Ｄ、Ｃ及びＢを３’から５’の順位で含むので、捕獲鎖１２５の捕獲配列Ａ’は暴露される。なお、これらの３つのコンパニオン配列Ｄ、Ｃ及びＢは、それぞれ捕獲鎖１２５のコンパニオン配列Ｄ’、Ｃ’及びＢ’の全部又は一部に対して相補的であって該全部又は一部とハイブリッド形成する。
ｄ）予め選択された配列Ａを有する被検体であるポリヌクレオチドの鎖１２０は、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成がおこなわれるために十分な条件下において、少なくともアンプリファイア＃１を含有する試薬／緩衝液に暴露され、これと結合して二重被検体／アンプリファイア＃１複合体を生成する。
ｅ）エキソヌクレアーゼ種をいずれかの必要な補因子と共に試薬へ添加するか、又は試薬中に存在させることによって、捕獲鎖１２５の３’末端における分解を開始させる。
ｆ）酵素的分解反応を完結するまで続行することによって、未分解の被検体鎖１２０及びコンパニオン鎖１２６（コンパニオン＃１又はＢＣＤ）を溶液中へ放出させる。
【０１９２】
段階２
図１２Ｂは、アンプリファイア＃２の漸進的活性を示す矢印で連結される３つの部分を示す。この段階には下記の要件ａ）〜ｆ）が含まれる：
ａ）アンプリファイア＃２は、捕獲鎖１２７とコンパニオン鎖１２８を含む二重構造を有する。
ｂ）捕獲鎖１２７は、捕獲配列Ｃ''（該配列は、鎖１２６の配列Ｃの全部又は一部に対して相補的である）及び２つの付加的配列Ｄ''及びＢ''を３’から５’の順位で含む。
ｃ）コンパニオン鎖１２８は、２つのコンパニオン配列Ｂ'''及びＤ'''を３’から５’の順位で含むので、捕獲鎖１２７の捕獲配列Ｃ''は暴露される。なお、これらの２つのコンパニオン配列Ｂ'''及びＤ'''は、それぞれ捕獲鎖１２７のコンパニオン配列Ｂ''及びＤ''の全部又は一部に対して相補的であって該全部又は一部とハイブリッド形成する。
ｄ）コンパニオン＃１（鎖１２６）は、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成がおこなわれるために十分な条件下において、少なくともアンプリファイア＃２を含有する試薬／緩衝液に暴露され、これと結合して二重コンパニオン＃１／アンプリファイア＃２複合体を生成する。
ｅ）エキソヌクレアーゼ種をいずれかの必要な補因子と共に試薬へ添加するか、又は試薬中に存在させることによって、捕獲鎖１２７の３’末端における分解を開始させる。
ｆ）酵素的分解反応を完結するまで続行することによって、未分解のコンパニオン＃１（１２６）及びコンパニオン鎖１２８（コンパニオン＃２又はＢＤ）を溶液中へ放出させる。
【０１９３】
段階３
図１２Ｃは、アンプリファイア＃３の漸進的活性を示す矢印で連結される３つの部分を示す。この段階には下記の要件ａ）〜ｆ）が含まれる：
ａ）アンプリファイア＃３は、捕獲鎖１２９とコンパニオン鎖１３０を含む二重構造を有する。
ｂ）捕獲鎖１２９は、捕獲配列Ｄ４（該配列は、鎖１２８の配列Ｃ'''の全部又は一部に対して相補的である）及び付加的配列Ｂ４を３’から５’の順位で含む。
ｃ）コンパニオン鎖１３０は、コンパニオン配列Ｂ５含むので、捕獲鎖１２９の捕獲配列Ｄ４は暴露される。なお、該コンパニオン配列は、捕獲鎖１２９のコンパニオン配列Ｂ４の全部又は一部に対して相補的であって該全部又は一部とハイブリッド形成する。
ｄ）コンパニオン＃２（鎖１２８）は、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成がおこなわれるために十分な条件下において、少なくともアンプリファイア＃３を含有する試薬／緩衝液に暴露され、これと結合して二重コンパニオン＃２／アンプリファイア＃３複合体を生成する。
ｅ）エキソヌクレアーゼ種をいずれかの必要な補因子と共に試薬へ添加するか、又は試薬中に存在させることによって、捕獲鎖１２９の３’末端における分解を開始させる。
ｆ）酵素的分解反応を完結するまで続行することによって、未分解のコンパニオン＃２（１２６）及びコンパニオン鎖１３０（コンパニオン＃２又はＢ）を溶液中へ放出させる。
【０１９４】
この方法の６つの相又は段階における結果を以下の表４に示す。
【表４】
【０１９５】
図１３は、３段階増幅に関連する表４のデータをプロットしたグラフを示す。
【０１９６】
相同配列
本願明細書に記載の実施例（特に図１０〜図１３に示す多段階の実施例）に関しては、１種よりも多くの増幅試薬種中に存在する配列に対応する相同配列の個々の指定は、この種の相同配列がヌクレオチドの長さや配列の点、又は全体的な化学的組成の点で同一であるということを必ず意味するものではないということに留意すべきである。この種の相同配列は同一であってもよいが、多くの点で異なっていてもよい。
【０１９７】
例えば、図１２Ｂ及び図１２Ｃにおいては、鎖１２８の配列Ｄ'''は配列Ｄ''（アンプリファイア＃２における鎖１２７）とハイブリッド形成していてもよく、また、配列Ｄ４（アンプリファイア＃３／コンパニオン＃２複合体における鎖１２９）ともハイブリッド形成していてもよい。このような相同配列は、本発明による方法において個々のハイブリッド形成機能を発揮するために有効な程度の相補的特性を有するように設計してもよい。この場合、配列、長さ又は付加的な化学基の組み込みの点で必ずしも同一でなくてもよい。従って、例えば、配列Ｄ''と配列Ｄ４は、ハイブリッド形成の異なる完結度を有するように設計してもよく、あるいは、これらの配列は異なる変性特性又はアニーリング緊縮特性を有していてもよい。同様に、配列Ｄ''とＤ４は、異なる長さ、末端基又は非天然ヌクレオチド等を有するように設計することによって、例えば、所望により酵素活性の開始、停止、特異性又はブロッキング等を調節してもよい。
【０１９８】
別の選択肢においては、アンプリコン又はレポーター種における相同配列（例えば、鎖１２８におけるＢ'''及び鎖１３０におけるＢ５）は異なる標識、マーカー又はその他の検出能増大特性を有するように設計することによって、例えば、明確で個別的な検出（例えば、定量的増幅の追跡における検出）又は異なる装置若しくは方法による検出を可能にしてもよい。特定の実施態様においては、多重及び／又は定量的検出法を採用することによって、例えば、偽陽性の低減化及び類似被検体間の区別等を可能にしてもよい。
【０１９９】
実施例：蛍光検出を用いる単一標的増幅
図１４Ａ〜図１４Ｃは、本発明の観点（例えば、図３Ａ参照）を有する単一標的増幅法であって、該方法の１つの過程において蛍光検出法を採用する該単一標的増幅法の実施例を示す。
【０２００】
この実施例においては、増幅捕獲プローブ配列は被検体／アンプリファイア複合体を形成するように設計され、これによって捕獲鎖は、５’＞＞３’エキソヌクレアーゼ活性による分解作用を受ける非突出状５’末端を有するようになる。この実施例で使用した酵素は、５’＞＞３’エキソヌクレアーゼ活性Ｔ７ポリメラーゼである。
【０２０１】
前述のように、本発明の観点を有する増幅と検出のいくつかの別の実施態様は、３’−エキソヌクレアーゼ、５’−エキソヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ（例えば、校正又はヌクレアーゼ活性を介するポリメラーゼ等）等を含む種々のヌクレオチド酵素を用いて実施してもよい。例えば、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼは、本発明による方法を使用して例証されている。同様に、本発明の観点を有する増幅系においては、適当な酵素の開始部位を有する被検体／アンプリファイア複合体を形成するように設計されている場合には、本発明の技術的思想を逸脱することなく、エンドヌクレアーゼ活性を利用してもよい。
【０２０２】
図１４Ａは、被検体１４１を含む被検体／アンプリファイア系１４０の構成成分を示す模式図である。該被検体は、標的配列Ａ（この実施例の場合には、約５４個の塩基を有する配列である）、捕獲鎖１４２（この実施例の場合には、約１０２個の塩基を有する鎖である）、相補的配列Ａ’、延長配列Ｂ及びレポーター鎖１４７（この実施例の場合には、約１９個の塩基を有する鎖である）を有する。この実施例におけるアンプリファイア／被検体複合体は約１２１個の塩基対を有する。
【０２０３】
レポーター鎖１４７は、相補的配列Ｂ’を有する鎖１４３を含む。該相補的配列は、鎖１４２の延長配列Ｂ’と結合すると共に、この実施例においては、常套法によって鎖１４３へ結合されたＦＡＭ蛍光性基１４４も含んでおり、これによって、光学的方法による簡便な検出が可能となる。
【０２０４】
図１４Ｂと図１４Ｃは、当該方法における種々の反応成分の電気泳動的ゲル分離の結果を示す写真である。図１４Ｂは、分離後の電気泳動的ゲルのポジ写真であり、また、図１４Ｃは、図１４Ｂの写真のネガ写真である。図１４Ｂは、特許明細書に添付する図面として適当な再現性のある無彩色スケールの写真画像におけるデータをより明瞭に示す。当該方法に関する実施例においては、比較の目的のために、反応成分又は試薬成分の種々の組み合わせについて試験した。ゲルは、１０個の平行なチャネルを有するように調製した。各々のチャネル内の緩衝液を以下のリストに示す。
【０２０５】
１：約１０個の塩基対（ｂｐ）単位を有するオリゴマーの校正はしご（「明線」で示す成分は１００ｂｐに対応する）
２：被検体オリゴマー１４１（約５４ｂｐ）
３：捕獲配列１４２（約１０２ｂｐ）とハイブリッド形成された被検体１４１
４：配列１４２とハイブリッド形成された被検体１４１（低濃度の酵素を含む）
５：配列１４２とハイブリッド形成された被検体１４１（高濃度の酵素を含む）
６：被検体オリゴマー１４１
７：アンプリファイア／被検体複合体１４５（約１２１ｂｐ）
８：アンプリファイア／被検体複合体１４５（低濃度の酵素を含む）
９：アンプリファイア／被検体複合体１４５（高濃度の酵素を含む）
１０：オリゴマーの校正はしご
【０２０６】
図１４Ｂと図１４Ｃから理解されるように、酵素による消化生成物であるレポーター１４７は、酵素を含まない複合体に対応するチャネル７の内部においては識別されないが、酵素による消化反応混合物に対応するチャネル８と９の内部における１９量体のレベルにおいては容易に識別される。当業者であれば、酵素の濃度やその他の反応条件を、過度の実験を行うことなく、この種の被検体の簡便で感度と選択性の高い検出を促進するために最適化できることを容易に認識できる。
【０２０７】
ヘアピン型プローブ集合体
本発明の観点を有する別の実施態様においては、プローブ集合体の個々の捕獲部分とレポーター部分を省略してもよい。図１５Ａ〜図１５Ｃは、ヘアピン型プローブ集合体の例を示す。この実施例においては、該プローブ集合体は共線的ポリヌクレオチド鎖１５２を含んでおり、該ポリヌクレオチド鎖は捕獲部分Ａ’（該捕獲部分は、被検体鎖１５１の標的Ａに対して相補的である）とレポーター部分を含む。該レポーター部分は、鎖１５２のいずれかの簡便な部位上に配置されるか、又は該部位に隣接する１又は複数の標識又はその他の検出強化体（例えば、蛍光性マーカー基等）を有していてもよい。この実施例においては、マーカー１５４は鎖１５２の中央部分に配置されているが、その他の部分、例えば３’末端に隣接する部分に配置させてもよい。
【０２０８】
図１５Ａに示すように、鎖１５２は少なくとも１つの付加的部分Ａ''を含んでおり、該付加的部分は、テンプレート種１５１の標的部分Ａと会合しないときに部分Ａ’とＡ''が自己ハイブリッド形成することによって、例えば、ヘアピン様の立体構造体を形成するような程度のハイブリッド形成に対する親和性を有するので、選択された酵素による分解から保護される。この実施例においては、ヘアピン形態の鎖１５２は突出状５’末端を有するので、活性開始のためには非突出状５’末端を有する複合体を必要とする酵素１４６（例えば、エンドヌクレアーゼ等）から保護される。
【０２０９】
図１５Ｂに示すように、プローブ鎖１５２が標的鎖１５１と会合すると、標的Ａに対するＡ’の親和性は、酵素１４６によって攻撃される非突出状５’末端を有するように鎖１５１と鎖１５２が会合した状態の複合体１５０の生成が有意になるように平衡を移動させる。
【０２１０】
図１５Ｃに示すように、酵素分解反応は、短鎖１５２が放出されるまで続行する。次いで、標的１５１はさらなる増幅のために利用される。多段階法においては、放出される鎖１５２’は、適当に設計されたアンプリファイアのためのテンプレートとして利用してもよい。
【０２１１】
以上の記載においては、本発明の好ましい実施態様と方法に関して説明したが、当業者には明らかなように、一定の利点が達成されている。また、本発明の技術的思想の範囲内においてこれらの実施態様の種々の修正、改変及び代替的態様を実行してもよいことは当業者には理解できる事項である。
【図面の簡単な説明】
【０２１２】
【図１Ａ】非常に少量の標的被検体に応答してレポーター分子が増幅して放出された後に、該レポーター分子の量を電子的に検出する装置と方法に係る模式図であり、試料を捕集して調製する過程を示す。
【図１Ｂ】試料媒体を入口へ塗布するためのアプリケーターを具備する液体系の内部において試料を処理する装置の模式図である。
【図１Ｃ（ｉ）】プローブ集合体を保有する容器の内部に収容されたポリヌクレオチド物質を含有する試料媒体の模式図である。
【図１Ｃ（ｉｉ）】プローブ集合体と標的被検体の詳細な模式図である。
【図１Ｄ（ｉ）】プローブ／被検体複合体を形成する液状系を保有する容器又はセルの模式図である。
【図１Ｄ（ｉｉ）】プローブ／被検体の詳細な模式図である。
【図１Ｅ】図１Ｄ（i）に示す容器又はセルの内部において、所望によるすすぎ過程又は洗浄過程が可能となるように、基体が不動化又は固定的に配置された状態を示す模式図である。
【図１Ｆ（ｉ）】容器又はセルの内部において、プローブ／被検体複合体をエキソヌクレアーゼで処理する状態の模式図である。
【図１Ｆ（ｉｉ）】プローブ／被検体複合体にエキソヌクレアーゼが作用する状態の詳細な模式図である。
【図１Ｆ（ｉｉｉ）】捕獲配列の脱離によって被検体分子が放出されるように進行中のプローブ分子の分解過程を示す模式図である。
【図１Ｇ（ｉ）】ナノコード配列の脱離によってレポーター分子が放出されたプローブ分子の完結した分解を示す模式図である。
【図１Ｇ（ｉｉ）】蓄積したレポーター分子が、ナノ電子的センサーを具備する隣接する検出セル内へ流れる状態を示す模式図である。
【図１Ｈ】レポーター分子と検出プローブとのハイブリッド形成に起因するセンサーの電子的特性の変化に基づいてレポーター分子を検出するための測定系の模式図である。
【図２Ａ】標的被検体ポリヌクレオチドを含む試料媒体の模式図である。
【図２Ｂ】図２Ａの構成要素を示す模式図である。
【図２Ｃ】図２Ｂに示す被検体／アンプリファイア複合体へエキソヌクレアーゼが作用する状態を示す模式図である。
【図２Ｄ】図２Ｃに示す被検体／アンプリファ９ア複合体から未変性被検体が放出される状態を示す模式図である。
【図２Ｅ】図２Ｃに示す被検体／アンプリファ９ア複合体からオリゴヌクレオチドが放出される状態を示す模式図である。
【図２Ｆ】図２Ｅの構成要素を示す模式図である。
【図２Ｇ】図２Ｆの構成要素を示す模式図である。
【図２Ｈ】図２Ｇの構成要素を示す模式図である。
【図３Ａ】合成標的の放出を誘発させるために単一の被検体捕獲配列を使用する増幅方法の結果を示す模式図である。
【図３Ｂ】合成標的の放出を誘発させるために複数の被検体捕獲配列を使用する増幅方法の結果を示す模式図である。
【図３Ｃ】表１と表２に示すデータを用いて作製したグラフである。
【図４Ａ】レポーターの増幅と精製のための装置と方法に係る模式図であり、基体に結合しない修飾されたレポータープローブが使用される。
【図４Ｂ】レポーターの増幅と精製のための装置と方法に係る模式図であり、ナノ電子的検出の前に、放出されたレポーターは精製される。
【図５Ａ】予備的増幅精製過程を含む指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす装置と方法に係る模式図であり、初期固定化段階を示す。
【図５Ｂ】予備的増幅精製過程を含む指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす装置と方法に係る模式図であり、精製段階を示す。
【図５Ｃ】予備的増幅精製過程を含む指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす装置と方法に係る模式図であり、インキュベーション段階を示す。
【図５Ｄ】予備的増幅精製過程を含む指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす装置と方法に係る模式図であり、エキソヌクレアーゼ増幅段階を示す。
【図５Ｅ】予備的増幅精製過程を含む指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす装置と方法に係る模式図であり、レポーター放出段階を示す。
【図６Ａ】分析用媒体からエキソヌクレアーゼを除去した後で指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす装置と方法に係る模式図であり、エキソヌクレアーゼ増幅段階を示す。
【図６Ｂ】分析用媒体からエキソヌクレアーゼを除去した後で指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす装置と方法に係る模式図であり、精製段階を示す。
【図６Ｃ】分析用媒体からエキソヌクレアーゼを除去した後で指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす装置と方法に係る模式図であり、プローブ変性段階を示す。
【図７】図７Ａは本発明に係る内部阻害基を含むレポータープローブの模式図である。 図７Ｂは図７Ａの構成要素を示す模式図であり、エキソヌクレアーゼがさらに付加される。 図７Ｃは図７Ｂの構成要素を示す模式図であり、エキソヌクレアーゼは連鎖レポーターの分解を続行する。 図７Ｄは図７Ｃの構成要素を示す模式図であり、エキソヌクレアーゼは、耐性結合に達すると、プローブ／被検体複合体から離脱する。 図７Ｅは相補的なサンドウィッチ型プローブを用いる所望による精製過程に係る模式図である。 図７Ｆはナノ電子的センサーによってレポーターを検出するための装置の模式図である。
【図８Ａ】多重型レポーターとマトリックスと検出器セルを用いる多種被検体アッセイを含む装置と方法に係る模式図であり、多被検体アッセイのフローチャートを示す。
【図８Ｂ】多種被検体アッセイ用のマトリックス検出セルを示す模式図である。
【図９Ａ】生体分子を検出するためのアプタマー部分を含むプローブ集合体を使用する方法に係る模式図であり、プローブの保護に適合したアプタマーを示す。
【図９Ｂ】生体分子を検出するためのアプタマー部分を含むプローブ集合体を使用する方法に係る模式図であり、アプタマーの被検体への結合とプローブの暴露を示す。
【図９Ｃ】生体分子を検出するためのアプタマー部分を含むプローブ集合体を使用する方法に係る模式図であり、プローブの分解とレポーターの放出を示す。
【図１０−１】図１０ａはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、試料測定の初期状態を示す。 図１０ｂはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、アンプリファイアＩは被検体鎖との二重会合状態で示される。 図１０ｃはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、当該方法の段階１の酵素分解が完結した状態を示す。
【図１０−２】図１０ｄはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、当該方法の段階２の開始状態を示す。 図１０ｅはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、アンプリファイアIIはコンパニオン鎖との二重会合状態で示される。 図１０ｆはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、当該方法の段階２の酵素分解が完結した状態を示す。
【図１０−３】図１０ｇはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、当該方法の段階３の開始状態を示す。 図１０ｈはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、アンプリファイアＩは被検体鎖との二重会合状態で示され、また、アンプリファイアIIはコンパニオン鎖との二重会合状態で示される。 図１０ｉはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、当該方法の段階３の酵素分解が完結した状態を示す。
【図１１】図１０ａ〜図１０ｉに示す方法に対応する実験データに基づいて作製したグラフである。
【図１２Ａ】アンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の三段階法の実施態様を示す模式図であり、アンプリファイア＃１の使用状態を示す。
【図１２Ｂ】アンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の三段階法の実施態様を示す模式図であり、アンプリファイア＃２の使用状態を示す。
【図１２Ｃ】アンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の三段階法の実施態様を示す模式図であり、アンプリファイア＃３の使用状態を示す。
【図１３】図１２Ａ〜図１２Ｃに示す方法に対応する実験データに基づいて作製したグラフである。
【図１４】図１４Ａは蛍光検出法を利用する単一標的増幅法の実施態様を示す模式図であり、アンプリファイア／被検体複合体を示す。 図１４Ｂは蛍光検出法を利用する単一標的増幅法による結果と増幅生成物を示す電気泳動ゲルの写真である。 図１４Ｃは図１４Ｂに示す写真の陰画である。
【図１５Ａ】ヘアピン型のプローブ集合体の実施態様を示す模式図であり、プローブ鎖は少なくとも１つの付加的部分を有する。
【図１５Ｂ】ヘアピン型のプローブ集合体の実施態様を示す模式図であり、プローブ鎖は標的鎖と会合する。
【図１５Ｃ】ヘアピン型のプローブ集合体の実施態様を示す模式図であり、酵素分解反応はプローブ鎖が放出されるまで続行する。
【符号の説明】
【０２１３】
１１ 試料アプリケーター
１２ 溶解緩衝液又は媒体
１３ 容器
１４ ウイルス性物質
１５ ポリヌクレオチド物質
１７ 反応媒体
２０ 液状系
２３ 反応セル
２５ 検出セル
３０ プローブ集合体
３２ 基体
３４ プローブポリヌクレオチド
３５ レポーターオリゴヌクレオチド
３６ プローブ／被検体複合体
３７ エキソヌクレアーゼ
４０ ナノ電子的センサー
４１ 検出プローブ
４２ 回路
５０ 被検体ポリヌクレオチド
５１ Ａアンプリファイア
５２ 合成オリゴヌクレオチド
５３ 第２オリゴヌクレオチド
５４ Ｂアンプリファイア
５７ アンプリファイア／被検体複合体
５８ 合成Ａ標的／アンプリファイア複合体
５９ 合成Ｂ標的／アンプリファイア複合体
６１ レポータープローブ
６２ レポータープローブ
７１ 基体
７６ 被検体／アンプリファイア複合体
７７ 合成標的Ａ／アンプリファイア複合体
７９ サンドウィッチ型プローブ
８１ プロスチンプローブ
９０ プローブ
９１ 連鎖レポーターオリゴヌクレオチド
９２ コンパニオンオリゴヌクレオチド
９５ レポーター配列
９６ コンパニオンアンカー配列
１００ 検出セル
１０４ ナノ構造素子
１０６ 基体
１０７ 誘電層
１１０ プローブ集合体
１１１ 被検体
１１２ アプタマー
１１４ 塩基配列
１２０ 被検体ポリヌクレオチド鎖
１２１ 捕獲鎖
１２２ コンパニオン鎖
１２３ 捕獲鎖
１２４ コンパニオン鎖
１２５ 捕獲鎖
１２６ コンパニオン鎖
１２７ 捕獲鎖
１２８ コンパニオン鎖
１２９ 捕獲鎖
１３０ コンパニオン鎖
１４１ 被検体
１４２ 捕獲鎖
１４７ レポーター鎖
１４４ ＦＡＭ蛍光性基
１５１ 標的鎖
１５２ 共線的ポリヌクレオチド鎖
１５４ マーカー
【図１Ａ−１Ｃ（ｉ）】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノ電子的センサー装置を用いる生体分子用検出システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願のクロス・レファレンス
この出願は、米国特許法３５ＵＳＣ第１１９条（ｅ）による下記の米国仮特許出願に基づく優先権を主張する出願であり、これらの出願の明細書に開示された内容も本願明細書の一部を成すものである：
１）米国仮特許出願第６０／９０１５３８号（出願日：２００７年２月１４日、発明の名称：生体分子検出用電気化学的ナノセンサー）、
２）米国仮特許出願第６０／８５０２１７号（出願日：２００６年１０月６日、発明の名称：生体分子検出用電気化学的ナノセンサー）、及び
３）米国仮特許出願第６０／７８９０２２号（出願日：２００６年４月４日、発明の名称：被検体増幅とレポーター及びポリヌクレオチドとその他の生体分子のナノ電子的検出）。
【０００３】
この出願は、特に下記の米国仮特許出願に基づいて優先権を主張する米国特許出願第１１／３１８３５４号（ＷＯ２００６／０７１８９５に対応する）（出願日：２００５年１２月２３日、発明の名称：ＤＮＡ検出とポリヌクレオチド配列の認識のためのナノ電子的センサー装置）の一部継続出願であって、該出願に基づいて優先権を主張する出願である：
１）米国仮特許出願第６０／７４８８３４号（出願日：２００５年１２月９日）、
２）米国仮特許出願第６０／７３８６９４号（出願日：２００５年１１月２１日）、
３）米国仮特許出願第６０／７３０９０５号（出願日：２００６年１０月２７日）、
４）米国仮特許出願第６０／６６８８７９号（出願日：２００５年４月５日）、
５）米国仮特許出願第６０／６５７２７５号（出願日：２００５年２月２８日）、
６）米国仮特許出願第６０／６３９９５４号（出願日：２００４年１２月２８日）。
【０００４】
この出願は、特に下記の米国仮特許出願に基づいて優先権を主張する米国特許出願第１１／２１２０２６号（ＷＯ２００６／０２４０２３に対応する）（出願日：２００５年８月２４日、発明の名称：ＤＮＡ検出用ナノチューブセンサー装置）の一部継続出願であって、該出願に基づいて優先権を主張する出願である：
１）米国仮特許出願第６０／６２９６０４号（出願日：２００４年１１月１９日）、
２）米国仮特許出願第６０／６０４２９３号（出願日：２００４年８月２４日）。
【０００５】
この出願は、下記の米国仮特許出願に基づいて優先権を主張する米国特許出願第１１／５８８８４５号（出願日：２００６年１０月２６日、発明の名称：麻酔モニター、キャパシタンス・ナノセンサー及び動的検出サンプリング法）の一部継続出願であって、該出願に基づいて優先権を主張する出願である：
１）米国仮特許出願第６０／８５０２１７号（出願日：２００６年１０月６日）、
２）米国仮特許出願第６０／７７３１３８号（出願日：２００６年２月１３日）、
３）米国仮特許出願第６０／７４８８３４号（出願日：２００５年１２月９日）、
４）米国仮特許出願第６０／７３０９０５号（出願日：２００５年１０月２７日）。
【０００６】
この出願は、米国仮出願第６０／７００９５３号（出願日：２００５年７月１９日）に基づいて優先権を主張する米国特許出願第１１／４８８４６５号（公報：２００７／００４５７５６）（出願日：２００６年７月１８日、発明の名称：懸垂状一体化マイクロヒーターを備えたナノ電子的センサー）の一部継続出願であって、該出願に基づいて優先権を主張する出願である
【０００７】
この出願の内容は下記の米国特許出願に関連するものであり、これらの出願の開示内容は本願明細書の一部を成すものである。
１）米国特許出願第１０／７０４０６６号（公報：２００４／０１３０７０）（出願日：２００３年１１月７日、発明の名称：生体分子のナノチューブに基づく電子的検出）、
２）米国特許出願第１０／３８８７０１号（特許：第６９０５６５５）（出願日：２００３年３月１４日、発明の名称：ナノ構造装置アレイ用の検出選択性の修正）、
３）米国特許出願第１０／３４５７８３号（公報：２００３／０１３４４３３）（出願日：２００３年１月１６日、発明の名称：機能化ナノ構造を用いる生物化学的試薬の電子的検出）、
４）米国特許出願第１０／２８０２６５号（特許：第６８９４３５９号）（出願日：２００２年１０月２６日、発明の名称：ナノチューブセンサーのための感度調整）、及び
５）米国特許出願第１０／１７７９２９号（ＷＯ ０４／０４０６７１に対応）（出願日：２００２年６月２１日、発明の名称：基体上でのナノチューブの分散増加）。
【０００８】
従来技術の説明
ポリヌクレオチド中の塩基配列は遺伝情報をコードするので、これらの配列の解読性は生物工学の多くの進歩に寄与している。この研究によって、医療条件に関連する多くの重要な配列が確認されている。例えば、ＢＲＣＡ遺伝子は、通常は乳癌で患う女性の体内に存在する。医療的検査において、このような関連性を利用する目的で、特定の重要な配列が発現するかどうかを調べるために組織試料を走査する多くの技術が開発されている。これらの技術は、コスト高で、遅く、複雑であるために日常的な医療検査に適用するには不適当であるという難点がある。
【０００９】
一般にこれらの技術は、ポリヌクレオチドがハイブリッドを形成するという傾向に依存する。溶液中の短鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の鎖は、ｓｓＤＮＡ中の各々の塩基と対を形成する反対塩基を含む相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）と容易に結合する。この結合の結果、二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）が形成される。ｄｓＤＮＡは加工処理によってｓｓＤＮＡから分離することができる。従って、特定の標的配列を走査するためには、実験者はプローブ（probe）配列として適当なｃＤＮＡを準備する。標的配列が試料中に存在するときには、標的ｓｓＤＮＡはプローブｓｓＤＮＡとハイブリッドを形成してｄｓＤＮＡを生成する。このハイブリッド形成はいくつかの方法によって検出することができる。
【００１０】
現在行われている方法は、色素による蛍光−標識化オリゴヌクレオチド、量子ドット（quantum dot）又はオリゴヌクレオチド−改質金ナノ粒子による吸光度増加を利用することによる主として光学的な検出法に注目が集まっている。例えば、ＤＮＡハイブリッド形成の電気化学的検出法は、電極としてナノ構造体を用いておこなってもよい。しかしながら、電気化学的方法は、標識の電気化学的挙動によって左右される。
【００１１】
この場合の第１の問題点は、このハイブリッド形成を検知するための多くの方法には、ハイブリッド形成前に試料中のｓｓＤＮＡを変性させる過程が含まれるということに起因する。ｓｓＤＮＡに対して蛍光分子を結合させることがしばしばおこなわれている。標識（label）として知られているこのような分子は光学的機器（例えば、顕微鏡及び分光器等）によるｓｓＤＮＡの検知を可能にする。標識化は、ハイブリッド形成後のＤＮＡ試料を検知するために利用されている。標的配列が標識化試料中に存在するときには、標識化されたｓｓＤＮＡは標識化されたｄｓＤＮＡに組み込まれので、該ｄｓＤＮＡは光学的機器を用いて検知することが可能となる。光学的検出法の利用により、上記方法は簡便なものとなるが、ＤＮＡを標識化する化学反応はコスト高で長時間を要する。標識化を必要としない検出法は、日常的な医療検査に対するＤＮＡ走査法の有用性を著しく増大させるであろう。
【００１２】
第２の問題点は、伝統的な検出法の感度が低いことに起因する。この種の方法の一部の方法は低濃度のＤＮＡに対して感度を示すが、該方法においては、絶対数として多数のＤＮＡ分子を必要とする。医療的用途においては、通常は僅かな細胞のみが入手できるにすぎないため、試料中に存在する標的配列のＤＮＡ分子は僅かである。この問題は、標的ＤＮＡの量を百万倍増幅させることができるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の利用によって改良されている。しかしながら、標識化法の場合と同様に、ＰＣＲは複雑な化学反応であるために、検査に要するコストが高くなり、また、時間もかかる。
【００１３】
標的被検体を、一般的には光学的検出法又は蛍光検出法を使用して検出するためのシステムにおいてオリゴヌクレオチドを利用する研究が知られている。例えば、次の特許文献（これらの特許文献も本願明細書の一部を構成するものである）を参照されたい：米国出願公開２００６−００４０２８６；「標的被検体のバイオ−バーコードに基づく検出」、及び米国特許第６７５００１６；「オリゴヌクレオチドが付着したナノ粒子とその使用」。しかしながら、これらの方法は、未変性の標的被検体（例えば、非−ＰＣＲ増幅被検体）に応答する増幅反応をもたらさず、また、電子的検出をもたらさない。
【００１４】
未変性の標的被検体に対する増幅応答について検討した研究も知られている。例えば、次の文献を参照されたい（これらの特許文献も本願明細書の一部を構成するものである）：Ｈ．Ｆ．リー、Ｙ．リ、Ａ．Ｗ．ワーク及びＲ．Ｍ．コーン、「ＤＮＡマイクロアレイのエキソヌクレアーゼIII消化によるＤＮＡの酵素的に増幅されたＳＰＲイメージ化検出」、Analytical Chem. 、第７７巻、第５０９６頁〜第５１００頁（２００５年）、及び米国出願公開２００５−００４８５０１：「ＤＮＡの検出又は同定のための方法と装置」。しかしながら、これらの方法は、電子的検出をもたらさない。
【００１５】
ＤＮＡと共に他の生体分子は、生物学的プロセス及び医学的な診断と治療に関する科学的理解において重要性が増大している。生体分子、例えば、タンパク質、多糖及びＲＮＡ等を検出する必要性がある。タンパク質のような被検体の検出法に関する研究も知られている。例えば、次の特許文献（該文献も本願明細書の一部を成すものである）を参照されたい：米国出願公開２００６−００１４１７２；「アプタマー−ナノ粒子結合体及び標的被検体を検出するための該結合体の用法」。しかしながら、このような方法も、未変性の標的被検体の標的部位の増幅をもたらさず、また、電子的検出をもたらさない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
このため、当該分野においては、特定の標的生体分子を高感度で迅速に検知できる強力な技術が明らかに要請されている。このような技術は、ＰＣＲ又はその他の標的被検体の増幅法を使用せず、かつ被検体種の標識化を必要とせずに操作されるべきである。また、この種の技術は増幅された検出反応と電子的検出をもたらすべきである。さらに、この種の技術は、被検体試料の濃縮及び／又は単一化若しくは精製をもたらすだけでなく、感度と選択性を高めることが望ましい。
【００１７】
被検体種の標識化又は増幅の必要性を回避すると共に電子的信号をもたらす方法を提供する顕著な目的は、簡単化された自動化バイオ検出能を迅速かつ低コストの介護時点での診断的用途に対して適用できるようにすることであり、好ましくは、該方法は非実験室的な臨床的又は家庭的な状況下で行ってもよい。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の観点を有する装置と方法の付加的な説明と概要は、前記の「関連出願のクロス・レファレンス」において例示した共同発明に係る仮出願及び非仮出願の明細書に記載されており、これらの出願明細書の記載内容も本願明細書の一部を成すものである。本願は、これらの出願明細書の開示内容と記載と共に理解されるべきである。特に、これらの出願明細書には、ナノ電子装置及び標識を使用せずにポリヌクレオチドと他の被検体種を検出して同定する方法の多数の代替的な実施態様が記載されている。
【００１９】
ナノ電子的検出装置（nanoelectronic detector device）
ナノ構造体（nanostructure）は、センサーとしての用途においては特有の特性を発揮する。即ち、ナノ構造体は実質的に一次元的であって、電子的摂動に対して著しく高い感度を示すと共に、容易に機能化させることができ、また、多くの半導体製造法に適合させることができる。本発明の観点による実施態様においては、表面上に存在する原子によって大きな影響を受ける特性を有するナノ構造体を使用するので、高感度の電子的検出のための基礎がもたらされる。例示的な実施態様においては、好ましくは１又は複数のカーボンナノチューブを含み、より好ましくは１又は複数の単層カーボンナノチューブ（single-walled carbon nanotube；ＳＷＮＴ）を含む。
【００２０】
別の装置の実施態様には、一般的には、標的被検体との相互作用に対して高い感度を示す電子的特性を有する少なくとも１つのナノ構造体（ナノ構造体素子）を具有する素子が含まれていてもよい。１又は複数の導電性素子はナノ構造体素子と連絡していてもよく、これによって、装置の１又は複数の電子的特性であって、被検体の媒体に曝されたときのナノ構造体素子の応答によって影響を受ける電子的特性を測定するための信号を得ることができる。
【００２１】
一般的には、ナノ構造体素子と導体は支持用基体に隣接して配置される。該基体は、一般的には、少なくとも１つの誘電性表面（又は表面コーティング）を含んでおり、これによって装置素子の電気的絶縁がもたらされる。基板は剛直であってもよく、あるいは可撓性であってもよく、あるいは多孔性若しくは非多孔性であってもよい。一般的には平面状又は平坦状であるが、機能的な形態（例えば、管状形態）を有していてもよい。別の多数の基体の化学的組成としては、酸化ケイ素、窒化ケイ素、酸化アルミニウム、ポリイミド及びポリカーボネート等が例示される。本明細書に記載の多くの実施例において、基体は、酸化ケイ素、ＳｉＯ２、及びＳｉ３Ｎ４等の材料を含む１又は複数の層、フィルム又はコーティングをシリコンウェーハ又はシリコンチップ上に具有する。
【００２２】
ナノチューブネットワーク（nanotube network）装置
ナノセンサー装置の１つの実施態様においては、ナノ構造体素子は、複数のナノ構造体、例えば、集合的構造を形成するように配置されるＳＷＮＴ又はその他のナノチューブ等を含んでいてもよい。ナノセンサー装置の多くの好ましい実施態様においては、ナノ構造体素子は、基体又は基体に隣接して配置されて少なくとも１つの導線と連絡するナノチューブがランダムに相互連結されたネットワーク（ナノチューブネットワーク）を含むことが有利である。
【００２３】
ナノチューブネットワークは、伝統的なリソグラフィーを用いる化学蒸着（ＣＶＤ）法、溶剤懸濁沈着法及び真空蒸着法等によって調製してもよい。この点に関しては、下記の文献を参照されたい：米国特許出願第１０／１７７９２９号明細書（該明細書はＷＯ２００４／０４０６７１に対応する）；同第１０／２８０２６５号明細書；同第１０／８４６０７２号明細書；Ｌ．フーら、ナノ・レターズ（２００４年）、第４巻、第１２号、第２５１３頁〜第２５１７頁（「透明な導電性カーボンナノチューブネットワークにおけるパーコレーション」）。これらの文献の開示内容も本明細書の一部を成すものである。
【００２４】
ナノ構造体素子（例えば、ナノチューブネットワーク）の特性は、１又は複数の接触子（contact）を用いて測定してもよい。接触子は、ナノチューブネットワークのようなナノ構造体素子と電気的に接続するように配置させた導電性素子を含む。例えば、接触子は、基板の表面上へ直接的に配置させてもよく、あるいは、ナノチューブネットワーク上に配置させてもよい。ナノチューブネットワークを流れる電流は、ナノチューブネットワークの特定の領域内において該ネットワークと電気的に接続させた少なくとも２つの接触子を用いて測定してもよい。
【００２５】
トランジスターの実施態様
本発明の一部の実施態様においては、ゲート電極又は対（counter）電極と呼ばれる付加的な導電性素子が配置される。即ち、該導電性素子は、ナノ構造体素子（例えば、少なくとも１つのナノチューブ）とは電気的に接続しないが、ケート電極とナノ構造体素子との間に電気的キャパシタンスが存在するように配置される。
【００２６】
例示的な装置は、トランジスターのチャンネルがナノチューブを含む電界効果トランジスターを具備しているので、該装置はナノチューブ電界効果トランジスター又はＮＴＦＥＴと呼んでもよい。例えば、ゲート電極は、酸化ケイ素の下方の基板内の導電性平面である。あるいは、ゲート電極又は対電極は、ナノ構造体素子に隣接した状態（例えば、下部、上部又は側部に隣接した状態）であって、該素子から電気的に絶縁された状態で配置された導電性層、例えば、可撓性基板上に沈着された導電性ポリマー材料層を含んでいてもよい。ナノチューブの抵抗、インピーダンス、相互コンダクタンス又はその他の特性は、選定されるか又は可変性のゲート電圧の影響下で測定してもよい。
【００２７】
この種のナノチューブ電子装置としては、特に下記の文献に記載されているものが例示される：米国特許出願第１０／６５６８９８号（出願日：２００３年９月５日）及び同第１０／７０４０６６号（出願日：２００３年１１月７日）（該出願は、ＵＳ２００４／０１３２０７０として公開された）。これらの文献の記載内容も本明細書の一部を成すものである。
【００２８】
トランジスター装置は、ゲート電圧（例えば、Ｇ／Ｖｇ信号等）の関数としてのチャンネルの相互コンダクタンスを測定するために役立つ。トランジスターは最大のコンダクタンス、即ち、所定範囲のゲート電圧を用いて測定された最も大きなコンダクタンス、及び最少のコンダクタンス、即ち、所定範囲のゲート電圧を有いて測定された最も小さなカンダクタンスを有する。トランジスターは、最大コンダクタンスと最小コンダクタンスとの比であるオン−オフ比を有する。高感度の化学センサーを製造するためには、ナノチューブトランジスターのオン−オフ比は、好ましくは１．２よりも大きな値であり、より好ましくは２よりも大きな値であり、最も好ましくは１０よりも大きな値である。
【００２９】
被検体の認識
標的種や雑種汚染物等を含む被検体含有媒体と装置素子との相互作用を仲介させるために、ナノ構造体素子（例えば、１又は複数のナノ構造体素子への付着種若しくは付着層又は吸着種若しくは吸着層、基板、及び導体等）に関連して付加的な物質を含めてもよい。このような物質としては、１又は複数の認識層又は分子トランスデューサー（例えば、後述の実施例において説明するｓｓＤＮＡオリゴマープローブ等）、触媒物質、不活性化物質、抑制物質、保護物質、フィルター、被検体吸引剤、濃縮剤及び結合性種等が例示される。この種の物質と素子は、選択性、特異性及び／又は装置の使用特性を改良する機能を果たすことができる。
【００３０】
ポリヌクレオチド種
本発明は、ポリヌクレオチドの特異的な標的配列を検出するための電子センサー装置を提供する。特定の実施態様においては、該センサーは、ポリヌクレオチドと相互作用して検出性素子として作用するナノ構造体素子（例えば、単層及び／又は多層カーボンナノチューブ及び／又は該ナノチューブを含有する相互連結性ネットワーク等）を含有する。以下において詳述する実施例においては、ナノ構造体素子はカーボンナノチューブ、特にランダムに配向したカーボンナノチューブのネットワークを含有する。これらの実施例においては、検出前に、ナノチューブはｓｓＤＮＡプローブ配列の吸着によって改質される。ＤＮＡの標識化は不要である。さらに、本発明は、該センサー装置の使用法を提供する。
【００３１】
本明細書で使用する「ＤＮＡ」という用語はポリヌクレオチドを意味する。ポリヌクレオチドとしては、特に限定的ではないが、デオキシリボ核酸、リボ核酸、メッセンジャーリボ核酸、転移リボ核酸及びペプチド核酸が例示される。ポリヌクレオチドの明確な特徴は、核酸の鎖と塩基の配列であり、各々の塩基は核酸に化学的に結合し、また、各々の塩基は整合性配列（matching sequence）上で適当な塩基と対を形成する。
【００３２】
当業者であれば、これらの明確な特徴を有するポリヌクレオチドのその他の変形誘導体を調製することができる。従って、「単鎖ＤＮＡ」（以下においては、「ｓｓＤＮＡ」で表示する）はデオキシリボ核酸、リボ核酸又はその他の前記のポリヌクレオチドの単鎖であってもよい。「二重鎖ＤＮＡ」（以下においては、「ｄｓＤＮＡ」で表示する）は上記のいずれかのポリヌクレオチドの二重鎖であってもよい。「相補的ＤＮＡ」（以下においては、「ｃＤＮＡ」で表示する）は、既に言及した単鎖配列に対して相補的な単鎖配列である前記のポリヌクレオチドのいずれの鎖であってもよい。
【００３３】
特定のセンサー装置中のｓｓＤＮＡは、特定の標的配列のためのｃＤＮＡになるように選択してもよい。標的配列は、センッサー装置によって検出されるべき塩基配列である。標的配列用のｃＤＮＡは、プローブ（probe）配列として知られている。標的配列が特定されたならば、プローブ配列を有する一定量のＤＮＡを入手しなければならない。特定配列を有するＤＮＡの合成及び所定の配列に対して相補的なＤＮＡの合成に関しては種々の技術が知られている。当業者であれば、これらの技術に関する知識を有している。所望の標的配列に対して特異的なプローブを調製するのに適当なｃＤＮＡ又はその他のポリヌクレオチドは、バイオテクノロジー工業に関連する既知の商業的製造業者から一般的に入手することができる。
【００３４】
センサー装置は、試料ｓｓＤＮＡを含有する溶液にナノチューブネットワークを接触させることによって使用してもよい。ネットワークは、ハイブリッド形成がおこなわれるのに充分に長い時間にわたって該溶液と接触させるべきである。この接触時間は、試料ＤＮＡの濃度、該溶液の量、室内の温度、溶液のｐＨ、及びその他の可変要因によって左右される。当業者であれば、ＤＮＡのハイブリッド形成に対するこれらの可変要因の効果について精通しており、適当な接触時間、溶液の組成、温度及びその他のハイブリッド形成に関連する条件を過度の実験を伴うことなく選定することができる。
【００３５】
前記の全てのセンサーの実施態様におけるポリヌクレオチドのハイブリッド形成の発生、速度及び特異性が種々の条件に左右されることに留意すべきである。各々のハイブリッド形成過程においては、ｄｓＤＮＡの結合エネルギーは緊縮技術（stringency technique）によって測定することができる。このような測定は、温度を増加させるか、又は緩衝液を、例えば、水酸化ナトリウム等に変更することによっておこなうことができる。
【００３６】
付加的な緊縮対照は、ハイブリッド形成媒体の種々のイオン性成分（例えば、ナトリウムイオン又はマグネシウムイオン等）を含有していてもよい。あるいは、又は、さらに、ハイブリッドの形成前、形成中及び／又は形成後において、センサーの素子（例えば、ナノチューブネットワーク）に電圧を印加することによって、ポリヌクレオチドの挙動に影響を及ぼしてもよい。例えば、ｃＤＮＡのようなポリヌクレオチドはホスフェートに基づく骨格を有しており、該骨格は、一般的にはハイブリッド形成媒体中においてはイオン化されており、局在化された負電荷を保有する。選択的に帯電させたセンサー素子は、例えば、対応する完全に整合化した（matched）プローブの対応するハイブリッドに対してＳＮＰ−不整合化（mismatched）プローブのハイブリッドを不安定化させるために、例えば、インキュベーション中又はすすぎ処理中において、牽引性又は反発性の緊縮因子を付与するために使用してもよい。
【００３７】
緊縮因子を変化させることによって、完全または不完全な相補的塩基対と鎖との結合を差別化することが可能である。緊縮過程に応答してナノチューブの電気的特性が変化することによって、特に、単一塩基の不整合（ＳＮＰ）の差別化が可能となる。当業者であれば、標的配列の完全なハイブリッド形成と不完全なハイブリッド形成に対する感度の選択度を得るために、本発明によるセンサーの特定の実施態様の操作を適合させるように、ハイブリッド形成の条件を変化させることができる。
【００３８】
例えば、特定の対立遺伝子に対して同型のＤＮＡ試料を、該対立遺伝子に対して異型の他の比較試料と区別するためのアッセイにおいては、ハイブリッド形成の緊縮条件を、例えば、温度を変化させることにより調整することによって、同型試料と異型試料との間において明確に異なる装置の測定応答が得られるようにしてもよい。
【００３９】
本発明の観点による各々のセンサーの実施態様においては、これらのセンサーはアレイ（array）（例えば、複数の異なる標的ＤＮＡフラグメントに対して機能化されたトランジスターセンサーのアレイ）として構築させてもよい。これに関しては、下記の文献を参照されたい：米国特許出願第１０／３８８７０１号（特許公報２００３−０１７５１６１）（発明の名称：ナノ構造体装置アレイの検出感度の修正）。この文献の記載内容も本明細書の一部を成すものである。
【００４０】
電気化学的検出器の実施態様
本発明の一部の実施態様においては、ナノ構造化素子、例えば、カーボンナノチューブネットワークを含む電極等は、試料中の１種又は複数種の被検体の存在と濃度の測定を可能にするように、本願明細書に記載の被検体標的種及び／又はレポーターの電気化学的相互作用を検出するために使用してもよい。この点に関しては、例えば、本願発明と同時になされた発明に関する次の米国特許出願（発明の名称はいずれも「生体分子検出用電気化学的ナノセンサー」である）の明細書に記載されている検出方法と装置を参照されたい：第６０／９０１５３８号（出願日：２００７年２月１４日）及び第６０／８５０２１７号（出願日：２００６年１０月６日）。これらの特許出願の明細書に記載内容も本願明細書の一部を成すものである。
【００４１】
キャパシタンス検出器の実施態様
本発明の一部の実施態様においては、ナノ構造化容量性素子を含む検出器は、試料中の１種又は複数種の被検体の存在と濃度の測定を可能にするように、本願明細書に記載の被検体標的種及び／又はレポーターの電気化学的相互作用を検出するために使用してもよい。この点に関しては、例えば、本願発明と同時になされた発明（発明の名称：麻酔モニター、キャパシタンスナノセンサー及び動的検出サンプリング法）に関する米国特許出願第１１／５８８８４５号（出願日：２００６年１０月２６日）の明細書に記載されている検出方法と装置を参照されたい。なお、この特許出願は次の米国特許出願に基づく優先権を主張する出願である：第６０／８５０２１７号（出願日：２００６年１０月６日）、第６０／７７３１３８号（出願日：２００６年２月１３日）、第６０／７４８８３４号（出願日：２００５年１２月９日）及び第６０／７３０９０５号（出願日：２００５年１０月２７日）。これらの特許出願の明細書に記載内容も本願明細書の一部を成すものである。
【００４２】
検出のための代替的な方法、標識、マーカー及び装置
詳細に記載された例示的な実施態様においては、科学的又は光学的に活性な標識又はマーカーに左右されない電子的信号によって検出できるという利点を有するレポーターに焦点があてられているが、本発明の技術的思想を逸脱することなく、別の方法を利用することも可能である。
【００４３】
例えば、本願明細書に記載のいずれかの増幅法から誘導されるアンプリコン（amplicon）、種又はレポーターフラグメントは、当該分野において知られている多数の異なるレポーター又は被検体の検出法を実行に移すように設計された特定のマーカー、標識又は検出エンハンサー、例えば、蛍光性マーカー、消光基、質量改変、光学的検出、分光分析、電気泳動的移動度の改変、及びレポーター親和性の改変等を含んでいてもよい。同様に、本発明によるいずれかの増幅法によって誘導されるアンプリコン、種又はレポーターフラグメントは二次的な生体分子反応に関与させることによって、例えば、触媒的効果によるか、又は蛍光性プローブが独立的な酵素的な攻撃若しくは再配置等を受けやすくするように誘発することにより検出可能な効果がもたらされるように設計してもよい。
【００４４】
非−ＰＣＲレポーター増幅
本発明の１つの観点によれば、非常に少量の標的被検体に応答してレポーター分子、例えば、特異的ＤＮＡオリゴマー等を増幅して放出させた後に、該レポーター分子の量を電子的に検出する方法が提供される。本発明による観点を有する特定の実施態様においては、ポリヌクレオチドに対して特異的な活性を有する酵素は、選択された被検体の存在を表示するレポーター部分であって、本発明による観点を有するナノセンサーの使用によって電子的に検出可能な該レポーター部分の非−ＰＣＲ増幅を達成するために使用してもよい。この種の実施態様は、非循環的増幅を行う態様として記載されてもよい。即ち、該実施態様においては、増幅過程においては、例えば、ＰＣＲの場合のように反応条件を循環的に変化させるための複雑な制御システムは不要である。
【００４５】
本発明による観点を有する第１の実施態様においては、プローブ集合体は、１種又は複数種のオリゴヌクレオチドプローブが結合した基体、例えば、磁性ビーズ及び滴定ウェル等を具有する。例えば、ビーズ基体は、ビーズ表面上に区分されて別々に機能する複数のオリゴヌクレオチドプローブを保持することによって、複数のプローブ集合体を形成してもよい。各々のこの種のオリゴヌクレオチドプローブは、ナノコード配列部分と捕獲配列部分を含む。ナノコード配列部分は、レポーターオリゴヌクレオチド上の対応する配列に対して相補的になるように選択される。プローブ集合体の調製に際しては、レポーターオリゴヌクレオチドは、適当な条件下においてハイブリッド形成されてナノコード配列となる。捕獲配列部分は、標的被検体ポリヌクレオチド上の対応する配列（標的配列）に対して相補的になるように選択される。捕獲配列とナノコードを有するオリゴヌクレオチドプローブは、既知の方法によって所定の配列を有するように調製した後、既知の方法によって基体、例えば、磁性ビーズの表面又はその他の不動化表面上へ付着させてもよい。
【００４６】
操作に際しては、各々の標的被検体はプローブと結合して被検体／プローブ複合体を形成する。この場合、過剰のプローブが存在してもよい。例えば、磁性ビーズあたり多くのプローブが存在してもよい。特定の実施態様（例えば、磁性ビーズ又はその他の基体を使用する態様）においては、結合した被検体／プローブ複合体を有する基体の不動化によって、該複合体の精製又すすぎが可能となるので、試料又は溶解混合物を単純化することができる。好ましい実施態様においては、すすぎ後に添加されるエキソヌクレアーゼは、被検体／プローブ複合体のプローブ集合体部分の捕獲配列とナノコードのみを分解させ、標的被検体ポリヌクレオチド又はレポーターオリゴヌクレオチド（又はプリスチンプローブ）は分解させないという特異的な活性を有する。エキソヌクレアーゼ活性により、標的被検体ポリヌクレオチドとレポーターオリゴヌクレオチドの両方が放出されるので、（ａ）被検体ポリヌクレオチドは遊離して付加的なプリスチンプローブと反応し、（ｂ）レポーターオリゴヌクレオチドは反応緩衝液中に高濃度で蓄積する。単純な媒体中に蓄積された（増幅された）レポーターオリゴヌクレオチドは、著しい交差反応性をもたらすことなく、本願明細書に記載のような本発明によるナノ電子的検出器によって電子的に検出してもよい。
【００４７】
以下において説明するレポーターの被検体により誘発された放出に関する第１実施態様
における実施例においては、非突出状３’末端（例えば、平滑又は陥凹３’末端）を有する二重鎖ポリヌクレオチドの分解（例えば、ホスフェート主鎖結合の加水分解）に対して特異的な活性を有するエキソヌクレアーゼを使用する。代替的な装置と方法は、「鏡像」の実施例（この場合は、ポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドの３’と５’は逆に配置されており、エキソヌクレアーゼは５’末端特異性を示す）のようなその他のエキソヌクレアーゼ活性を利用するように設計してもよいことも理解されるべきである。さらに別の代替的な装置と方法も、本発明の技術的思想を逸脱することなく適用することができる。
【００４８】
さらにまた別の実施態様においては、５’反応性エキソヌクレアーゼ、及び付着末端エキソヌクレアーゼ等を使用することができ、また、他の不動化表面（例えば、ポリマー又はＳｉ表面、及び他のタイプのビーズ等）、プローブ間の開裂性リンカー、媒体容量の低減化、及びビーズの濾過等の手段等を使用することができる。
【００４９】
別の実施態様においては、選択的なエキソヌクレアーゼ活性が達成されるように選択された条件下においてその他の酵素を使用してもよい。例えば、ヌクレオチドトリホスフェートを奪う媒体中において種々のタイプのＤＮＡポリメラーゼを使用することによって、ポリメラーゼ活性を犠牲にして「校正（proof-reading）」活性を優先させてヌクレアーゼとして機能させてもよい。
【００５０】
別の実施態様においては、プローブの構成要素は、合成塩基類似体を有するポリヌクレオチド、例えばロックされた核酸（例えば、ＬＮＡオリゴマー又は２’−Ｏ、４’−Ｃメチレンブリッジを含む核酸、例えば、シグマ−アルドリッチ社の市販品）を含んでいてもよい。ＬＮＡオリゴマーは、プローブ分子の選択された部位におけるエキソヌクレアーゼ活性を阻止するか又は制限し、ハイブリッド形成された重複部位の安定性を制御してもよい。
【００５１】
さらに別の実施態様においては、タンパク質、多糖若しくはその他の生体分子標的被検体のための抗体複合プローブ及び／又はアプタマーに基づくプローブを使用することによって、非ポリヌクレオチド被検体の検出を可能にしてもよい。
【００５２】
好ましくは、本発明の観点を含む例示的な検出法と装置には、センサーの応答、感度及び／又は選択性を増大させるための濃縮過程と単純化過程が含まれていてもよい。プローブは、いずれかの固体状支持体又はオリゴマーの結合のために適した基体へ付着させることによって、分離過程又はすすぎ過程のために結合又は不動化させてもよい。適当な基体用材料としては、特に限定的ではないが、ガラス、プラスチック、ポリエチレン、セルロース、ポリメタクリレート、ラテックス、ゴム、フルオロカーボン樹脂及び金属等が例示される。基体材料の形態は、スライド、ウェル若しくはその他のエンクロジャー（enclosure）、又は微小球若しくはマイクロビーズのような粒子等であってもよい。常磁性被覆物によって、ビーズを磁気的に応答するようにすることができる。共役結合性物質又は錯体形成性物質を使用することによって、オリゴヌクレオチド又はその他のプローブ種を基体、例えば、ビオチン又はビオチン誘導体の結合に適したアビジン又はアビジン誘導体等へ結合させてもよい。
【００５３】
磁性ビーズの共役と分離／不動化のための技術は周知であり、このための構成成分と付属品は市販されている。これに関しては、例えば、インビトロゲン・コーポレーション社（旧名称：ダイナル・ビオテク社）（カールスバード、カリフォルニア州）のホームページ（http://www.invitrogen.com）を参照されたい。また、次の特許文献に記載されている分離方法と装置も参照されたい（これらの特許文献の開示内容も本願明細書の一部を成すものである）：
１）米国出願公開第２００５−０１４７８２２（発明の名称：プロセス）、
２）米国特許第５５１２４３９号（発明の名称：オリゴヌクレオチドが結合した磁性粒子とその使用）、
３）米国特許第６９９４９７１号（発明の名称：生体分子の定量化のための粒子分析アッセイ）、及び
４）米国特許第５８５１７７０号（発明の名称：磁性ビーズ担体を用いるレゾルヴェイス開裂によるミスマッチの検出）。
１ミクロン以下の磁性ビーズを入手することができ、該ビーズは結合性成分、例えば、共有結合したストレプタビジン（例えば、アビジンで処理したオリゴヌクレオチドへ結合させるための結合性成分）及び細菌壁（bacterial wall）タンパク質（例えば、抗体へ結合させるための結合性成分）を用いる前処理に付してもよい。
【００５４】
粒状のプローブ基体に対する別の分離／不動化法、例えば、電気泳動的分離法を使用してもよい。正荷電基（例えば、アミノ基）又は負荷電基（例えば、カルボン酸基）を有するビーズ又は粒子は電場の力によって分離させるか、又は不動化させてもよい。さらに別の態様においては、粒子状又はビーズ状の基体は、反応媒体から濾過によって分離させてもよい。
【００５５】
試料中の被検体ポリヌクレオチドの検出方法の１つの実施態様においては、該方法は下記の過程（ａ）〜（ｅ）を含む：
（ａ）下記の要素（i）〜（iv）を含む少なくとも１つの第１プローブ集合体を供給する：
（i）基体；
（ii）隣接位の５’−末端ヌクレオチドと遠位の３’−末端ヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブポリヌクレオチドであって、該隣接位の５’−末端ヌクレオチドが基体に隣接して結合すると共に少なくとも１つのナノコードヌクレオチド配列部分及び被検体ポリヌクレオチドの対応する標的ヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する捕獲ヌクレオチド配列部分を含む該プローブポリヌクレオチド；
（iii）プローブポリヌクレオチドのナノコード配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの第１レポーターポリヌクレオチドであって、ナノコード配列とハイブリッド形成することによってプローブポリヌクレオチドと重複部分を形成する該第１レポーターポリヌクレオチド；
（iv）捕獲ヌクレオチド配列部分と３’−末端ヌクレオチドが第１レポーターポリヌクレオチドの重複部分から遠位へ延びるように設計されたプローブポリヌクレオチド；
（ｂ）被検体ポリヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列をプローブポリヌクレオチドの捕獲ヌクレオチド配列部分と結合させることによって、下記の成分（i）〜（iii）を含有する重複第１プローブ／被検体複合体を形成させるために有効な条件下において、第１プローブ集合体を被検体であるポリヌクレオチドを含有すると推定される試料と接触させる：
（i）第１プローブ集合体；
（ii）少なくとも１種の被検体ポリヌクレオチド；
（iii）遠位へ延びて平滑な遠位の５’−末端（１）又は突出する遠位の５’−末端（２）を形成する被検体ポリヌクレオチド；
（ｃ）第１プローブ／被検体複合体を、二重鎖ＤＮＡへの特異的結合とその後のＤＮＡ重複部の３’−末端ストランドの選択的加水分解を含む３’−対−５’エキソ−デオキシリボヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼと接触させる；
（ｄ）エキソヌクレアーゼを第１プローブ／被検体複合体へ結合させるために有効であると共に、第１プローブ／被検体複合体の遠位の３’−末端ストランドをエキソヌクレアーゼで加水分解させることによってポリヌクレオチド被検体と少なくとも第１レポーターポリヌクレオチドを第１の重複プローブ／被検体複合体から放出させるために有効な条件を維持する；
（ｅ）エキソヌクレアーゼによる加水分解によって放出される少なくとも第１レポーターポリヌクレオチドの存在を検出することによって、試料中のポリヌクレオチド被検体の存在を測定する。
【００５６】
試料中の被検体ポリヌクレオチドの検出法の別の実施態様は、直前の節に記載の方法に対して「鏡像法」の関係にある過程を含む。この場合、３’末端と５’末端は該方法の規定の全体にわたって逆転し、該方法は下記の要件（ａ）〜（ｅ）によって規定される：
（ａ）基体は、プローブポリヌクレオチドの隣接位の３’末端に隣接して結合する。
（ｂ）第１プローブ／被検体複合体の遠位の末端はポリヌクレオチド被検体を含み、該被検体は遠位へ延びて平滑な遠位の３’−末端（１）又は突出する遠位の３’−末端（２）を形成する。
（ｃ）エキソヌクレアーゼは、二重鎖ＤＮＡと特異的に結合した後、ＤＮＡ重複体の５’末端ストランドの選択的加水分解を含む５’−対−３’エキソ−デオキシリボヌクレアーゼ活性を有する。
（ｄ）この方法は、プローブ／被検体の５’末端ストランドを加水分解してポリヌクレオチド被検体と少なくとも第１レポーターポリヌクレオチドを放出するために有効な条件を維持することを含む。
（ｅ）この方法は、エキソヌクレアーゼによる５’−対−３’加水分解によって放出されるレポーターポリヌクレオチドの存在を検出することによって、試料中のポリヌクレオチド被検体の存在を測定することを含む。
【００５７】
指数関数的な非−ＰＣＲ標的増幅
本発明の１つの観点によれば、希薄な試料又は少量の試料被検体の検出範囲を拡張するために標的被検体ポリヌクレオチド関連種を増幅させる方法が提供される。代替的な増幅方法と装置は下記の要素（１）及び／又は（２）を含んでいてもよい：
（１）同族レポーター。試料中に標的被検体ポリヌクレオチドが存在することを示す検出可能種を、アンプリファイア／試薬複合種からエキソヌクレアーゼ−媒介反応を介して、対応する合成標的オリゴヌクレオチドの被検体による誘発化放出によって増幅させる。この場合、放出された合成標的オリゴヌクレオチドは、標的被検体ポリヌクレオチド配列の一部の検出可能なコピー（同族又は準同族のオリゴヌクレオチド類似体）を含有する。
（２）非同族レポーター。試料中に標的被検体ポリヌクレオチドが存在することを示す検出可能種を、アンプリファイア／試薬複合種からエキソヌクレアーゼ−媒介反応を介して、対応する合成標的オリゴヌクレオチドの被検体による誘発化放出によって増幅させる。この場合、放出された合成標的オリゴヌクレオチドは、標的被検体ポリヌクレオチド配列には厳密には類似しない配列（非同族のオリゴヌクレオチド類似体）を含有する。
【００５８】
以下に記載の増幅方法と装置の第１実施態様の実施例においては、非突出状の３’末端（例えば、平滑又は陥凹３’末端）を有する二重鎖ポリヌクレオチドの分解（例えば、ホスフェート主鎖の結合の加水分解による分解）に対して特異的な活性を有するエキソヌクレアーゼを使用する。別のエキソヌクレアーゼ活性、例えば、「鏡像」の実施例を利用できるように別の装置と方法を設計してもよいことを理解すべきである。この場合の実施例においては、ポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドにおける３’と５’の配置が逆転し、エキソヌクレアーゼは５’末端特異性を有する。また、本発明の技術的思想を逸脱することなく、さらに別の実施態様も可能である。
【００５９】
二重標的アンプリファイア
本発明の観点を有する実施態様においては、一重鎖被検体ポリヌクレオチドの２つの異なる部分の配列（便宜上、「標的Ａ」及び「標的Ｂ」で表示する）が選択される。アンプリファイア試薬は、少なくとも下記の２種のアンプリファイアを包含するように配合してもよい：
（１）標的Ｂに対して相補的な第１捕獲配列（捕獲Ｂ’）及び標的Ａに対して相補的な第２捕獲配列（捕獲Ａ’）を有するオリゴヌクレオチドを含むアンプリファイアＡ。
（２）標的Ａに対して相補的な第１捕獲配列（捕獲Ａ’）及び標的Ｂに対して相補的な第２捕獲配列（捕獲Ｂ’）を有するオリゴヌクレオチドを含むアンプリファイアＢ。
【００６０】
コンパニオンを含む重複アンプリファイア
試薬中のプリスチンのアンプリファイアＡ及びアンプリファイアＢの各々は重複又は二重鎖形態を含む。この場合、アンプリファイアオリゴヌクレオチドは、非突出状３’末端を欠く複合体を生成するように設計されたコンパニオンオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成することによって、プリスチン形態におけるエキソヌクレアーゼ活性から保護される。コンパニオンオリゴヌクレオチドは、以下のように、被検体分子の対応する標的配列と類似する配列（合成標的）を含む：
（１）アンプリファイアＡのコンパニオンオリゴヌクレオチドオは、被検体の標的Ａと同一又は類似する合成標的配列（合成標的Ａ''）を含んでおり、該合成標的Ａ'' は、プリスチン試薬中においては、第２捕獲配列（捕獲Ａ’）とハイブリッド形成する。
（２）アンプリファイアＢのコンパニオンオリゴヌクレオチドオは、被検体の標的Ｂと同一又は類似する合成標的配列（合成標的Ｂ''）を含んでおり、該合成標的Ｂ'' は、プリスチン試薬中においては、第２捕獲配列（捕獲Ｂ’）とハイブリッド形成する。
【００６１】
標的とハイブリッド形成するアンプリファイア
アンプリファイアＡ及びアンプリファイアＢの各々は、プリスチン複式形態においては、構成要素である捕獲配列を露出させるような形態を有しているので、該捕獲配列は、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成を促進するために有効な条件下において、被検体ポリヌクレオチドの対応する標的配列とハイブリッド形成することによって、対応するアンプリファイア／被検体複合体を生成してもよい。従って、例えば、
（１）アンプリファイアＡの第１捕獲配列（捕獲Ｂ’）は、被検体の標的配列Ｂと結合し、また、
（２）アンプリファイアＢの第１捕獲配列（捕獲Ａ’）は、被検体の標的配列Ａと結合する。
【００６２】
各々のアンプリファイア／被検体複合体の生成には、アンプリファイアＡとアンプリファイアＢの一方又は両方と各々の被検体ポリヌクレオチドとのハイブリッド形成が含まれていてもよく、この点に留意すべきである。この形成過程は同時に進行させる必要はない。何故ならば、これらのアンプリファイアの種類は、上記の生成過程において、相互に独立して反応するように選定されるからである。
【００６３】
アンプリファイア／被検体複合体の酵素的分解
これらの酵素的分解におけるいずれの場合においても、標的配列の位置及び／又はアンプリファイアの配置の選択によって、アンプリファイアＡ、アンプリファイアＢ又はこれらの両方を含むアンプリファイア／被検体複合体が各々のアンプリファイアオリゴヌクレオチドの露出した非突出状３’末端を含むようにすることができるので、試薬中に存在するか、又は外部から添加されるエキソヌクレアーゼは、アンプリファイアオリゴヌクレオチドの分解を開始させてもよい。アンプリファイアオリゴヌクレオチドの分解が続行すると、両方の捕獲配列が除去されることによって、以下のようにして、アンプリファイアオリゴヌクレオチドから標的被検体が放出されると共に、合成標的配列を有する対応するコンパニオンオリゴヌクレオチドがアンプリファイアオリゴヌクレオチドから放出される：
（１）アンプリファイア／被検体複合体中のアンプリファイアＡのアンプリファイアオリゴヌクレオチドが分解され、被検体の標的配列Ａが放出されると共に、コンパニオンオリゴヌクレオチドの合成標的Ａ''が放出される。
（２）アンプリファイア／被検体複合体中のアンプリファイアＢのアンプリファイアオリゴヌクレオチドが分解され、被検体の標的配列Ｂが放出されると共に、コンパニオンオリゴヌクレオチドの合成標的Ｂ''が放出される。
【００６４】
従って、各々の元の被検体分子に対しては、上記の増幅過程によって、元の非分解被検体ポリヌクレオチド分子（元の標的Ａ及び標的Ｂを含む）、アンプリファイア試薬から誘導される２種の単鎖合成標的（合成標的Ａ及び合成標的Ｂ）及び反応を仲介したエキソヌクレアーゼ酵素が放出される。
【００６５】
放出された標的のその後の増幅
付加的なプリスチンアンプリファイアＡとアンプリファイアＢ及びエキソヌクレアーゼの存在下においては、各々のこれらの標的配列（合成又は未変性被検体）は、前述のような増幅のさらなる過程に関与してもよい。何故ならば、各々のアンプリファイアは、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成を促進するために有効な条件下においては、未変性標的の場合と同じ効果をもたらす合成標的とハイブリッド形成するように設計されているからである：
（１）プリスチンアンプリファイアＡの第１捕獲配列（捕獲Ｂ’）は、予め分解されたアンプリファイアＢの放出されたコンパニオンオリゴヌクレオチドの合成標的Ｂ''と結合して、全てが合成のアンプリファイア／標的複合体を形成し、次いで、該複合体はヌクレアーゼ活性によって分解され、元の合成標的Ｂ''と付加的なコンパニオンオリゴヌクレオチド（合成標的Ａ''を含む）の両方が放出される。
（２）プリスチンアンプリファイアＢの第１捕獲配列（捕獲Ａ’）は、予め分解されたアンプリファイアＡの放出されたコンパニオンオリゴヌクレオチドの合成標的Ａ''と結合して、全てが合成のアンプリファイア／標的複合体を形成し、次いで、該複合体はヌクレアーゼ活性によって分解され、元の合成標的Ａ''と付加的なコンパニオンオリゴヌクレオチド（合成標的Ｂ''を含む）の両方が放出される。
【００６６】
増幅の各々の「サイクル」においては、元の標的と対応する新たな標的が生成して放出され、これらの各標的は付加的な増幅現象を誘発することができる。この結果、連続する増幅過程中において、媒体が十分なアンプリファイア試薬とエキソヌクレアーゼを含有する間は、元の被検体ポリヌクレオチドの数は一定に維持される傾向にあり、一方、合成標的Ａ''と合成標的Ｂ''の数は指数関数的に増大する傾向にある。本明細書において使用する「サイクル」という用語は、温度のような環境条件の特定の周期的な変化を意味するのではなく、ＰＣＲにおいて一般的に使用され、また、媒体の条件は、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成と酵素的分解活性が同時に連続的に促進されるように選択されて調整される。
【００６７】
多段階アンプリファイア
本発明の観点を有する実施態様には、生体分子のテンプレート種を含有する媒体中へのレポーター種の導入方法であって、該テンプレート種に対して結合親和性を有するプローブ集合体から非−ＰＣＲ／テンプレート−誘発化／酵素活性化によって該レポーター種を放出させることを含み、下記の過程（ａ）〜（ｃ）を任意の操作順で含む該導入方法が含まれる：
（ａ）下記の要件（i）〜（iv）を満たす少なくとも１つの第１プローブ集合体を供給する：
（i）テンプレート種の標的部分に対して選択的な結合親和性を付与する捕獲ヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの第１プローブストランドを含む；
（ii）プローブストランドの対応する結合部分とハイブリッド形成するように設計されたポリヌクレオチド配列を有する結合部分を含む少なくとも１つの第１レポーター種を含む；
（iii）第１プローブ集合体は、ポリヌクレオチドの重複プローブ集合体を含むようにハイブリッド形成された少なくとも１つの第１プローブストランドと少なくとも１つの第１レポーター種を含む；
（iv）重複プローブ集合体は、プローブストランドの全部又は一部を分解してプローブ集合体から第１レポーター種を放出させるのに十分なヌクレアーゼ活性を有する選択された酵素の作用を促進するのに適合した少なくとも１つの酵素−開始部位であって、捕獲ヌクレオチド配列がテンプレート種の選択された標的部分の全部又は一部と結合してテンプレート−プローブ複合体を形成するときに形成される該酵素−開始部位を有するように設計された；
（ｂ）テンプレート種の選択された標的部分をプローブポリヌクレオチドの捕獲ヌクレオチド配列部分へ結合させることによって酵素−開始部位を有する第１テンプレート−プローブ複合体を形成させる反応を促進するために有効な条件下において、媒体を少なくとも１つの第１プローブ集合体と接触させる：
（ｃ）酵素−開始部位における酵素のヌクレアーゼ活性を促進するために有効な条件下において、媒体を少なくとも選択された酵素と接触させ、第１テンプレート−プローブ複合体が過程（ｂ）において形成されたときに第１プローブストランドが分解され、第１レポーター種がプローブ集合体から放出される。
【００６８】
この実施態様の増幅は付加的な過程による多段階を含むようにして行ってもよい。この場合、第１レポーター種は、第１レポーター種のテンプレート部分に対して結合親和性を有する第２プローブ集合体から第２レポーター種を少なくとも１つの第２の非ＰＣＲ／テンプレート−誘発／酵素活性化方式で放出させることに対する標的テンプレートとして作用するように設計されたテンプレート部分を含む。この態様は、第３段階又はより上位の段階を含むようにしてさらなるレポーター種が放出されるように拡張してもよい。
【００６９】
生体分子検出法においては、多段階増幅法を使用することによって、被検体、例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質、多糖及びその他の生体分子種を検出してもよい。いくつかの実施態様においては、第１プローブ集合体は、テンプレートの標的配列に対して相補的な捕獲ヌクレオチド配列を含む（例えば、テンプレートはＤＮＡ鎖を含む）。別の実施態様においては、第１プローブ集合体は、捕獲ヌクレオチド配列としてアプタマーを含み、該アプタマーは、テンプレートの標的部分に対する親和性を有する（例えば、テンプレートはポリペプチド又は多糖の標的部分を有する）。
【００７０】
１つの実施態様においては、生体分子のテンプレート種は試料中の被検体種を含み、第１レポーター種は、プローブ集合体から放出されたときに直接的又は間接的に検出可能なように設計され、下記の過程（ｄ）及び（ｅ）がさらに含まれる：
（ｄ）放出される第１レポーター種を直接的又は間接的に検出する；
（ｅ）第１レポーター種の直接的又は間接的な検出に基づいて、試料中の被検体種の少なくとも存在又は濃度を測定する。
【００７１】
例えば、第１レポーター種は、第１プローブ集合体から放出されたときに直接的に検出されるように設計され（一段階検出）、例えば、検出可能なポリヌクレオチド配列又は検出可能な標識基を有する検出部分を含ませる。同様に、第１レポーター種は、第１プローブ集合体から放出されたときに、別のレポーター種が検出可能な付加的な増幅段階を介して間接的に検出できるようにしてもよい。
【００７２】
ヘアピンプローブ集合体（hairpin probe assembly）
本発明の観点を有するさらに別の実施態様においては、プローブ集合体のレポーター部分と個別の捕獲を省略してもよい。１つの実施態様においては、第１プローブ鎖と第１レポーター種は共線的ポリヌクレオチド鎖を含む。この場合、該共線的ポリヌクレオチド鎖の一部は、テンプレート種の標的部分と関連しないときには自己ハイブリッド形成することによって、選択された酵素による分解から保護されるように設計される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７３】
当業者であれば、以下の好ましい実施態様に関する詳細な説明を考慮することによって、本発明の観点を有する装置と方法についてより完全に理解すると共に、これらの付加的な利点を得ると共に、付加的な目的を実現することができるであろう。
【００７４】
添付図面について簡単に説明する。
図１Ａ〜図１Ｈは、本発明の観点を有する装置と方法であって、非常に少量の標的被検体に応答してレポーター分子が増幅して放出された後に、該レポーター分子（例えば、特異的ＤＮＡオリゴマー等）の量を電子的に検出する該装置と方法の実施態様を模式的に示す。
図２Ａ〜図２Ｈは、本発明の観点を有する装置と方法であって、非直線的又は指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす電子的検出用の該装置と方法の実施態様を模式的に示す。
図３Ａ及び図３Ｂは、図２Ａ〜図２Ｈに示す増幅方法の２つの実施例をまとめて模式的に示すもので、一方の実施例においては２種の被検体標的（二重標的）を使用し、他方の実施例においては１種の被検体標的（単一標的）を使用した。
【００７５】
図３Ｃは、表１及び表２に示すデータをプロットしたグラフであり、単一標的スキームと二重標的スキームを使用することによる合成標的の増加又は増幅を示す。
図４Ａ及び図４Ｂは、レポーターの増幅と精製のための別の装置と方法を模式的に示す。
図５Ａ〜図５Ｅは、本発明の観点を有するさらに別の装置と方法であって、予備的な増幅精製過程を含む指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす該装置と方法の実施態様を模式的に示す。
図６Ａ〜図６Ｃは、本発明の観点を有する装置と方法であって、分析用媒体からエキソヌクレアーゼを除去した後で指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす該装置と方法の実施態様を模式的に示す。
【００７６】
図７Ａ〜図７Ｆは、本発明の観点を有するレポータープローブであって、内部阻害基（該内部阻害基は該基の配列位置におけるエキソヌクレアーゼのプロセッシングを停止させる）を含む該レポータープローブの実施例を模式的に示す。
図８Ａ及び図８Ｂは、本発明の観点を有する装置と方法であって、多重型レポーターとマトリックス検出セルを用いる多種被検体アッセイを含む該装置と方法の実施態様を模式的に示す。
図９Ａ〜図９Ｃは、本発明の観点を有する方法であって、生体分子を検出するためのアプタマー部分を含むプローブ集合体を使用する該方法の実施態様を模式的に示す。
図１０ａ〜図１０ｉを含む図１０は、アンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を模式的に示す。
【００７７】
図１１は、図１０に示す方法に対応する実験データをプロットしたグラフである。
図１２Ａ〜図１２Ｃは、アンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の三段階法の実施態様を模式的に示す。
図１３は、図１２Ａ〜図１２Ｃに示す方法に対応する実験データをプロットしたグラフである。
図１４Ａ〜図１４Ｃは、本発明の観点（例えば、図３Ａ参照）を有する単一標的増幅法であって、蛍光検出法を利用する該増幅法の実施態様を模式的に示す。図１４Ａは、アンプリファイア／被検体複合体の模式図である。図１４Ｂは、当該方法による結果と増幅生成物を示す電気泳動ゲルの写真である。図１４Ｃは、図１４Ｂに示す写真の陰画であり、該陰画は特許図面としては適当な写真再現性画像であって、データをより明確に示している。
図１５Ａ〜図１５Ｃは、「ヘアピン」型のプローブ集合体の実施態様を模式的に示す。
【００７８】
以下においては、本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。
本発明は、標的ＤＮＡ配列を検出するナノチューブセンサー装置（nanotube sensor device）を提供する。該装置は、標的ＤＮＡの標識化を必要とせず、標的ＤＮＡの存在に対して電子的に応答する。該装置の実施態様について以下に説明する。
【００７９】
被検体によって誘発されるレポーターの増幅
図１Ａ〜図１Ｈは、本発明の観点を有する装置と方法であって、非常に少量の標的被検体に応答してレポーター分子が増幅して放出された後に、該レポーター分子（例えば、特異的ＤＮＡオリゴマー等）の量を電子的に検出する該装置と方法の実施態様を模式的に示す。本発明の観点を有する特定の実施態様においては、ポリヌクレオチドに対して特異的な活性を有する酵素を使用することによって、選択される被検体の存在を示すレポーター部分であって、本発明の観点を有するナノセンサーの使用によって電子的に検出可能な該レポーター部分のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によらない増幅を達成してもよい。この種の実施態様は、増幅過程において、例えばＰＣＲの場合のような反応条件を周期的に変化させるための複雑な制御システムを必要としない点で非周期的増幅法として記載してもよい。
【００８０】
図１Ａは、試料を捕集して調製する過程１０を模式的に示す図であって、容器１３の内部の溶解緩衝液又は媒体１２を接種して細胞性又はウイルス性物質１４を放出させるための試料アプリケーター（例えば、咽喉用スワブ等）１１が図示される。放出された細胞性又はウイルス性物質は溶解されて試料であるポリヌクレオチド物質１５を放出する。
【００８１】
図１Ｂは、溶解された試料媒体を入口２２へ塗布するためのアプリケーター（例えば、ピペット等）２１を具備する流状系２０の内部において試料を処理する装置を模式的に示す。該入口は導管２４のパターン（例えば、微量流体用カートリッジ等）と連絡し、該導管は閉鎖状のセル又は容器２３と連絡する。
【００８２】
図１Ｃ（i）及び図１Ｃ（ii）は、１又は複数のプローブ集合体（probe assembly）３０を保有する容器２３の内部に収容されたポリヌクレオチド物質１５を含有する試料媒体１６を示し、各々のプローブ集合体は基体３２及び該基体に付着した１又は複数の捕獲プローブ３１を具有する。
【００８３】
図示する実施例に示す基体３２は磁性ビーズを含有するが、その他の粒子状又は非粒子状の捕獲基体（例えば、非磁性粒子、固定プレート、閉鎖壁、及び滴定ウェル等）を使用してもよいことに留意すべきである。例えば、ビーズ状の基体は、複数の別個独立に機能するプローブを該ビーズの表面上に担持してもよく、これによってビーズが中心に位置する多重プローブ集合体が形成される。
【００８４】
図１Ｃ（ii）は、プローブ集合体３０と標的被検体３３を詳細に示す。標的被検体は、３’末端鎖の端部と５’末端鎖の端部との間の標的ヌクレオチド配列Ｘを有する単一鎖ポリヌクレオチドである。プローブ集合体３０は、例えば、ビオチン−ストレプタビジン結合によって基体３２へ結合した捕獲プローブポリヌクレオチド３４を含有する。あるいは、プローブ３０のようなプローブは、相補的な「サンドウィッチ」型のオリゴヌクレオチド構造、例えば、図４Ｂに関連して後述する相補的な「サンドウィッチ」プローブ７９の構造等によって基体へ結合していてもよい。
【００８５】
この実施例においては、プローブポリヌクレオチド３４は近接する５’末端ヌクレオチドに隣接する基体３２に結合し、また、ナノコード配列Ｙと捕獲配列Ｘ’を含む。該捕獲配列は、被検体ポリヌクレオチド３３の標的配列Ｘに対して相補的である。プローブ３１は、相補的配列Ｙ’を有する１又は複数のレポーターオリゴヌクレオチド３５も含み、該相補的配列は、プローブ集合体内においては、プローブポリヌクレオチド３４のナノコード配列Ｙとハイブリッド形成する。図１Ｃ（ii）においては、ナノコード配列Ｙは捕獲配列Ｘ’に関して、基体３２に対して隣接して示されているが、必ずしもこのようにする必要はないことに留意すべきである。
【００８６】
選択された捕獲配列とナノコード配列を有するプローブオリゴヌクレオチド３４及びレポーターオリゴヌクレオチド３５は、例えば、市販されている合成セット一式に用いる既知の方法に従って調製してもよい。同様に、指定された塩基を有するビオチニル化オリゴヌクレオチドは市販品として入手することができ、また、基体は、既知の方法により、ストレプタビジンを用いて処理してもよい。ポリヌクレオチドを基体へ付着させる別の適当な方法、例えば、細胞の表面リガンドを用いる方法等は既知である。レポーター３５は、プローブ集合体３０を形成させるために適当な条件下において、ポリヌクレオチド３４とハイブリッド形成させてもよい。
【００８７】
特定の目的のためにより明確に規定しない限り、本明細書においては、「ポリヌクレオチド」と「オリゴヌクレオチド」という用語は一般的には互換的に使用される。特定の配列の選択される長さは当該分子のハイブリッド形成特性に関連するが、本発明の原理は、本発明の技術的思想を逸脱することなく、広範囲の配列の長さと分子量に対して適用される。文脈又は用法から判断して、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに言及していることが明らかである場合には、このような種（species）は、明確性を失うことなく、「分子」若しくは「種」又は分子の機能、例えば、「被検体（analyte）」又は「レポーター（reporter）」にも関連していてもよい。
【００８８】
この実施例においては、各々のプローブオリゴヌクレオチドはナノコード配列部分と捕獲配列部分を含む。ナノコード配列部分はレポーターオリゴヌクレオチドの対応する配列に対して相補的になるように選択される。プローブ集合体の調製においては、レポーターオリゴヌクレオチドは、適当な条件下において、ナノコード配列とハイブリッド形成する。捕獲配列部分は、標的被検体ポリヌクレオチドの対応する配列（標的配列）に対して相補的になるように選択されて設計される。捕獲配列とナノコード配列を有するプローブオリゴヌクレオチドは既知の方法に従って調製した後、既知の方法によって基体（例えば、磁性ビーズ又はその他の不動化表面等）へ付着させてもよい。
【００８９】
図１Ｄ（i）及び図１Ｄ（ii）は液状系２０の容器又はセル２３を示す。該液状系内においては、標的被検体ポリヌクレオチド３３はプローブ３１のプローブヌクレオチド３４とハイブリッド形成することによって１又は複数のプローブ／被検体複合体３６を形成する。該プローブ／被検体複合体３６は、被検体３３の標的配列Ｘと少なくとも１つのプローブポリヌクレオチド３４の捕獲配列Ｘ’とのハイブリッド形成によって被検体ポリヌクレオチドへ結合したプローブ集合体３０を含む。図１Ｄ（ii）はプローブ／被検体複合体３６を詳細に示しており、標的被検体３３は、プローブポリヌクレオチド３４の遠位３’末端を超えて重なり合う遠位５’末端を有する。
【００９０】
図１Ｅは、１回又は複数回の所望によるすすぎ過程又は洗浄過程が可能となるように不動化又は固定的に配置された１又は複数の基体３２を示す。該すすぎ過程又は洗浄過程においては、未反応種１５を含む試料媒体１６が除去されて反応媒体１７によって置き換えられ、１又は複数のプローブ／被検体複合体３６及び未反応のプローブ又はプローブ集合体が容器２３の内部に残留する。この実施例においては、１又は複数の基体は調整可能な磁石１８によって不動化された磁性ビーズが使用される。
【００９１】
プローブ集合体３０が複数のプローブ３１を含む場合には、複数の被検体３３は、各々のプローブ集合体３０の各プローブ３１と結合してもよい。検出系２０においては、全体として過剰のプローブ３１を有する１又は複数のプローブ集合体３０が存在するようにすることにより、試料中の被検体３３が図１Ｄに示す過程において利用可能な捕獲プローブ３１と効率よく結合するようにすることが有利である。図１Ｅに示すすすぎ／洗浄過程によって非標的ポリヌクレオチド及び最初の試料又は溶解混合物に含まれるその他の汚染物を除去することが有利であり、これによって、検出過程における非特異的結合又は交差反応の可能性又は程度は最小になる。
【００９２】
図１Ｆ（i）〜図１Ｆ（iii）及び図１Ｇ（i）は、プローブ／被検体複合体をエキソヌクレアーゼ３７で処理する状態を模式的に示す。この実施例においては、エキソヌクレアーゼ３７は、露出した平滑状又は陥凹状（非突出状）の３’末端を有するハイブリッド形成されたポリヌクレオチドの重複鎖の分解（例えば、ホスフェート結合の加水分解）に対して特異的活性を示す。この実施例においては、プローブポリヌクレオチド３４の遠位の非突出状３’末端は漸進的に攻撃されて分解される。好ましい実施態様においては、所望によるすすぎ過程の後に添加されるエキソヌクレアーゼの特異的活性は、被検体／プローブ複合体のプローブ集合体部分のナノコードと捕獲配列のみの分解に作用し、標的被検体ポリヌクレオチド３３又はレポーターオリゴヌクレオチド３５あるいはプリスチン若しくは未反応プローブ３１には作用しない。
【００９３】
他の酵素としてのヌクレアーゼは、種類と環境に応じて種々のプロセッシング性（processivity）を示し、連続的な分解過程として図示した好適な態様は、ヌクレアーゼがオリゴヌクレオチド基質へ拡散するとき又は該基質から拡散するときは不連続的又は挿入的であってもよいことも理解すべきである。同様に、ヌクレアーゼは一次活性と二次活性（例えば、エンドヌクレアーゼ活性）を有していてもよく、当業者であれば、所望のエキソヌクレアーゼ活性が優先的におこなわれるように濃度と条件を適宜調節できる。
【００９４】
前述のように、別の実施態様においては、近位及び遠位の末端鎖端部の順位を逆転させたプローブ（５’末端に対する３’末端）を採用し、非突出状５’重複末端に対して特異的な対応する逆活性を有するエキソヌクレアーゼを適用してもよい。同様に、さらに別の実施態様においては、非特異的活性が調節されるか、又は非干渉的である場合には、特異的なエンドヌクレアーゼ以外の多重活性様式を示す酵素系を使用することができる。例えば、ヌクレオチドホスフェートを含有しない媒体中において種々のタイプのＤＮＡポリメラーゼを使用することによって、ポリメラーゼ活性を犠牲にして、「校正」活性を優先させてヌクレアーゼとして機能させてもよい。
【００９５】
図１Ｆ（iii）は、捕獲配列Ｘ’の脱離によって被検体分子３３が放出されるように進行中のプローブ分子３４の分解過程を示す。
図１Ｇ（i）は、ナノコード配列Ｙの脱離によってレポーター分子３５が放出されたプローブ分子３４の完結した分解を示す。
【００９６】
図１Ｆ（iii）に示す過程において放出された被検体分子３３は媒体１７の内部において自由に拡散し、残存する未反応のプローブ（プリスチン）３１とハイブリッド形成することによって付加的なプローブ／被検体複合体３６を生成する。このようにして事後的に形成される複合体３６もエキソヌクレアーゼの分解作用を受けやすく、付加的なレポーターが放出される。過剰のプローブ３１の生成により、有利な増幅過程がもたらされる。この場合、各々の被検体分子３３は、被検体によって刺激される複数の対応するプローブ３１の分解に起因して複数のレポーター分子を逐次的に放出させる。
【００９７】
このようにして、反応緩衝液中においては比較的高濃度のレポーターオリゴヌクレオチドが蓄積され、該レポーターオリゴヌクレオチドは所望によるすすぎ処理によって予め精製するか又は単純化する。この結果、当初は試料中に非常に低濃度で含まれる被検体は、ナノ電子的検出器による顕著な交差反応性を伴うことなく、本明細書に記載のようにして電子的に検出される。
【００９８】
図１Ｇ（ii）は、蓄積したレポーター３５が、本願明細書に記載のようなナノ電子的センサー４０（本願明細書の一部を成す前記の特許出願の明細書に記載のこの種のセンサー及び後述する別の態様のセンサーを参照されたい）を１個又は複数個有する隣接する検出セル２５へ流れる状態を示す。センサー４０は、例えば、レポーター３５の配列の少なくとも一部に対して相補的であるオリゴヌクレオチドを含む検出プローブ４１を１個又は複数個具有することによって、レポータープローブ３５に対して感度を示す。あるいは、センサー４０は反応セル２３の内部に含まれていてもよい。
【００９９】
図１Ｈに示すように、レポーター３５と検出プローブ４１とのハイブリッド形成によって、センサー４０の電子的特性に特異的な検出可能な変化がもたらされ、これに起因して、下記の過程ａ）〜ｄ）を含む測定回路４２の操作によってレポーター３５の存在の測定が可能となる：
ａ）レポーターを検出プローブとハイブリッド形成させる。
ｂ）所望により、反応用緩衝液を、例えば、センサーにおけるヌクレアーゼ活性を抑制するために、測定用緩衝液と交換する。
ｃ）信号（例えば、トランジスター又は容量性特性等）を得る。
ｄ）レポーターを検出する。
【０１００】
所望により、反応媒体１７を除去し（例えば、測定用緩衝液１８と交換する）、次いで、回路４２により信号を得る前に、検出プローブのハイブリッド形成を行う。
【０１０１】
ＰＣＲによらない指数関数的な増幅
図２Ａ〜図２Ｈは、本発明の観点を有する電子的検出のための方法と装置の実施態様を模式的に示す（多数の別の方法においては共通の観点が含まれる）。この実施態様によれば、被検体に対する応答性の非直線的又は指数関数的な増幅がもたらされる（試料中の被検体の存在に応答して、付加的な非試料標的が得られるか、又は出現し、該標的は、例えば、レポーターの放出の誘発に関与する）。図２Ａ〜図２Ｈに示すような方法は、単独で使用してもよく、あるいは図１Ａ〜図１Ｈに示すような方法、即ち、被検体に対する応答性の直線的増幅（例えば、当初の試料中に存在する標的被検体のみがレポーターの放出の誘発に関与する増幅）をもたらすことによって特徴付けられる方法と組み合わせて使用してもよい。
【０１０２】
特定の実施態様においては、被検体に応答して酵素により仲介される初期の反応によって、合成のオリゴヌクレオチド標的（即ち、試料中に存在しない予備調製された天然又は合成されたオリゴヌクレオチド）が放出される。該オリゴヌクレオチド標的は付加的な酵素により仲介される反応に関与し、該反応は別の合成標的をもたらす。合成オリゴヌクレオチド標的は、試料中に被検体ポリヌクレオチドが存在しないときのエキソヌクレアーゼ活性から保護されるような重複形態でもたらされてもよい。
【０１０３】
一部の実施態様においては、合成標的は、標的被検体の疑似天然配列であってもよい。別の実施態様においては、合成標的は完全な非天然配列であってもよく、あるいは、天然配列と非天然配列との組み合わせ配列であってもよい。反応媒体中においてこの種の標的を非直線的又は指数関数的に増加させる方法を使用することによって、例えば、図１Ａ〜図１Ｈに示す方法によるレポータープローブの放出を誘発させてもよい。
【０１０４】
「増幅（amplification）」という用語に関しては、本願明細書においては、ＰＣＲにおける該用語の用い方とは幾分異なる意味で使用する。ＰＣＲアッセイ法の実施例においては、配列の新たなコピーがポリメラーゼ活性を介して創製され、プライマーを試料中の被検体と結合させることによって放出が誘発される。本願明細書に記載の本発明の観点を有する方法と装置の実施例においては、選択された標的配列のコピーは予備合成され、アンプリファイア基、例えば、試薬物質として予備配合される。予備合成標的の放出は、アッセイにおいて該試薬物質を使用するときに被検体によって特異的に誘発される。反応媒体中において放出された当該分子の増加は、被検体の存在を表示する増幅信号を事実上発生させる。
【０１０５】
図２Ａは、標的被検体ポリヌクレオチド５０を含む試料媒体を示す。該ポリヌクレオチドは標的配列Ａ（標的Ａ）と標的配列Ｂ（標的Ｂ）を含む。エキソヌクレアーゼ３７、Ａアンプリファイア５１及びＢアンプリファイア５４を含有する混合物を用いて処理した試料が図示される。本願明細書に記載のようなアンプリファイア処理の前に、所望により、試料媒体を精製処理に付してもよいことに留意すべきである。この実施例においては、エキソヌクレアーゼ３７は、図１Ａ〜図１Ｈに示す実施例の場合と同一又は類似する酵素であって、非突出状３’二重鎖末端に対して特異的な活性を示す該酵素であってもよい（上記の方法に類似する３’／５’逆方向法も可能であることに留意すべきである）。被検体５３は２種の重なり合わない選択された配列、即ち、標的Ａと標的Ｂを含む。
【０１０６】
Ａアンプリファイア５１は合成オリゴヌクレオチド５２を含んでおり、該合成オリゴヌクレオチドは、天然の標的配列Ｂ（標的Ｂ）に対して相補的な配列Ｂ’（捕獲Ｂ’） 及び標的配列Ａ（標的Ａ）に対して相補的な配列Ａ’（捕獲Ａ’）を有する。
【０１０７】
Ａアンプリファイア５１は第２オリゴヌクレオチド５３をさらに含んでおり、該第２オリゴヌクレオチドは、天然標的配列Ａ（標的Ａ）に対して相補的な配列Ａ''（合成標的Ａ''）を有する。第２オリゴヌクレオチド５３はその３’末端に「尾」配列を有するので、該第２オリゴヌクレオチドは突出状３’付着末端（即ち、平滑状又は陥凹状の３’末端を含まない）を有し、その結果、該第２オリゴヌクレオチドは、３’特異的エキソヌクレアーゼ３７に対する攻撃点を形成しない。あるいは、この目的のための「尾」配列の代わりにキャッピング基を既知の方法によって使用してもよい。
【０１０８】
オリゴヌクレオチド５３は、合成標的Ａ''と捕獲Ａ’とのハイブリッド形成によって、オリゴヌクレオチド５２と結合する。Ａアンプリファイア５１もこのように表示されることに留意すべきである。何故ならば、該アンプリファイアは、被検体５０の天然標的配列Ａと同一又は類似する配列（合成標的Ａ''）を発現できるからである。
【０１０９】
逆に、Ｂアンプリファイア５４は合成オリゴヌクレオチド５５を含んでおり、該合成オリゴヌクレオチドは、天然の標的配列Ａ（標的Ａ）に対して相補的な配列Ａ’（捕獲Ａ’） 及び標的配列Ｂ（標的Ｂ）に対して相補的な配列Ｂ’（捕獲Ｂ’）を有する。Ｂアンプリファイア５４は第２オリゴヌクレオチド５６をさらに含んでおり、該第２オリゴヌクレオチドは、天然標的配列Ｂ（標的Ｂ）に対して相補的な配列Ｂ''（合成標的Ｂ''）を有する。第２オリゴヌクレオチド５６はその３’末端に「尾」配列（又はその他のキャッピング基）を有する。オリゴヌクレオチド５６は、合成標的Ｂ''と捕獲Ｂ’とのハイブリッド形成によって、オリゴヌクレオチド５５と結合する。Ｂアンプリファイア５４もこのように表示されることに留意すべきである。何故ならば、該アンプリファイアは、被検体５０の天然標的配列Ｂと同一又は類似する配列（合成標的Ｂ''）を発現できるからである
【０１１０】
この文脈において使用される「天然」及び「合成」という用語は、試料中に存在すると推定される標的被検体又は「天然」ポリヌクレオチド及び例示的なアッセイ法を実施するためのアンプリファイア試薬中に含まれる「合成」オリゴヌクレオチドを区別するためにのみ使用されるということに留意すべきである。試料の標的被検体又は「未変性」ポリヌクレオチドは、多くの場合は天然源に起因するが、必ずしもその必要性はない。試薬アンプリファイアとなるオリゴヌクレオチドは合成的に調製する手法が簡便であるが、必ずしもその必要性はない。
【０１１１】
図２Ｂは図２Ａの要素を示す。この場合、Ａアンプリファイア５１及びＢアンプリファイア５４は被検体５０の標的Ｂ及び標的Ａとそれぞれハイブリッド形成するように反応することによって被検体／アンプリファイア複合体５７を形成する。この態様においては、Ａアンプリファイア５１とＢアンプリファイア５４は単一の被検体分子５０と同時に反応するように図示されているが、必ずしもその必要性はなく、各々のアンプリファイアが関連するように記載されている増幅過程は、各アンプリファイアが他方のアンプリファイアとは無関係に作用するように進行してもよいことに留意すべきである。例えば、各アンプリファイアは別々に被検体分子と結合してもよい。
【０１１２】
図２Ｃは、図２Ｂの被検体／アンプリファイア複合体５７を示す。この場合、Ａアンプリファイア５１のオリゴヌクレオチド５２の非突出状３’末端及びＢアンプリファイア５４のオリゴヌクレオチド５５の対応する非突出状３’末端は一対のエキソヌクレアーゼ３７の作用によって分解を開始している（両方の部位における酵素の作用が同時に行われる必要がないことに留意すべきである）。
【０１１３】
図２Ｄは、図２Ｃの被検体／アンプリファイア複合体５７を示す。この場合、エキソヌクレアーゼ３７の活性は、オリゴヌクレオチド５２の捕獲Ｂ’配列とオリゴヌクレオチド５５の捕獲Ａ’配列の脱離が行われるように作用し、これによって未変性の被検体であるポリヌクレオチド５０が放出される。
【０１１４】
図２Ｅは、図２Ｃの被検体／アンプリファイア複合体５７を示す。この場合、エキソヌクレアーゼ３７の活性は、オリゴヌクレオチド５２の捕獲Ａ’配列とオリゴヌクレオチド５５の捕獲Ｂ’配列の脱離が行われるように作用し、これによって対応するオリゴヌクレオチド５３及び５６が放出され、対応する合成標的Ａ''及び合成標的Ｂ''は単一鎖形態で露出又は発現する。
【０１１５】
図２Ｆは図２Ｅの要素を示す。この場合、放出された未変性被検体ポリヌクレオチド５０及び放出された合成標的ＡとＢ（それぞれ対応する標的Ａ''とＢ''を有するオリゴヌクレオチド５３と５６）は付加的なＡアンプリファイア５１とＢアンプリファイア５４と反応し、これによって、付加的なハイブリッド化重複体並びに付加的なアンプリファイア／被検体複合体５７、合成Ａ標的／アンプリファイア複合体５８及び合成Ｂ標的／アンプリファイア複合体５９が形成される。
【０１１６】
図２Ｇは図２Ｆの要素を示す。この場合、エキソヌクレアーゼ３７のさらなる活性に起因して、複合体５７、５８及び５９の露出された非突出状３’末端の分解が図２Ｄ〜図２Ｅに示すようにして開始され、これによって、付加的な合成標的ＡとＢ、未変性被検体５０及び先に放出された合成標的ＡとＢが放出される。
【０１１７】
図２Ｈは図２Ｇの要素を示す。この場合、最初に蓄積された未変性被検体５０及び蓄積された合成標的ＡとＢは、一般的には図１Ａ〜図１Ｈに例示した方法に関連して記載したものと一般的に類似する捕獲／レポータープローブ集合体を用いて処理した。この特定の実施例においては、２種の異なるプローブ集合体が使用された。第１プローブ集合体は、未変性被検体５０又は合成標的Ａ（５３）の標的配列Ａに対して特異的なプローブ６０を有する。第２プローブ集合体は、未変性被検体５０又は合成標的Ｂ（５６）の標的配列Ｂに対して特異的なプローブ６１を有する。レポーター分子３５を放出させるための方法と装置が示される。
【０１１８】
図３Ａ及び図３Ｂは、増幅過程に関する２つの実施例をまとめたものである。一方の実施例は２種の被検体標的を用いた実施例（図２Ａ〜図２Ｈに示す実施例）であり、他方の実施例は単一の被検体標的を用いた別の実施例である。
【０１１９】
単一標的
図３Ａは、合成標的の放出を誘発させるために単一の被検体捕獲配列を使用する増幅方法の結果を模式的に示す。被検体５０は、単一の選択された標的配列部分Ａ（標的Ａ）を有する。アンプリファイア７５は、図２Ａに示すアンプリファイア５１と類似する。但し、この場合には、両方の捕獲配列が標的Ａに対して相補的である。
【０１２０】
第１段階においては、単一の被検体５０は単一のアンプリファイア７５と反応して被検体／アンプリファイア複合体７６を生成する。エキソヌクレアーゼ３７は複合体７６を分解して被検体５０と合成標的Ａ（５３）を放出する。従って、２種の標的が放出される。
【０１２１】
第２段階においては、被検体５０と合成標的Ａ（５３）は２つの付加的なアンプリファイア７５と反応して被検体／アンプリファイア複合体７６及び合成標的Ａ／アンプリファイア複合体７７を生成する。エキソヌクレアーゼ３７は両方の複合体７６及び複合体７７を分解して被検体５０と３つの合成標的Ａ（５３）を放出する。従って、４種の標的が放出される。
【０１２２】
各々の標的配列が各々の段階において付加的なアンプリファイアとハイブリッド形成し、その結果、放出される標的の量は指数関数的に増加することが理解される。この方法の５つの段階における結果を以下の表１に示す。
【０１２３】
【表１】
【０１２４】
二重標的
図３Ａとは対照的に、図３Ｂは、複数の被検体捕獲配列を用いて合成標的の放出を誘発させる増幅方法の結果を模式的に示す。この実施例においては、増幅方法として、図２Ａ〜図２Ｈに示す方法と同じ方法を使用したが、別の方法を使用することも可能である。例えば、標的Ａと標的Ｂは、試料被検体であるポリヌクレオチド中に存在するように選択する必要はなく、補助被検体（co-analyte）の一部になるように選択してもよい。この場合、増幅された標的応答は試料中に共存する両方の補助被検体によって誘発される。この態様は、例えば、陽性の結果が複数のマーカー（例えば、複数のフラグメント又は分子から誘導されるもの）の存在として定義される選択的アッセイにおいて特に有用である。
【０１２５】
図２Ａ〜図２Ｈにも記載のように、被検体５０は２つの選択された標的配列部分を含んでおり、該標的配列部分は２種の異なるアンプリファイア（５１及び５４）と反応して複合体５７を生成する。次いで、エキソヌクレアーゼ反応によってこれらのアンプリファイアは分解され、被検体５０（２種の標的）と２種の異なる合成標的（５３及び５６）が放出される。各段階においては、放出された標的配列の重複化（doubling）がもたらされるので、増幅も指数関数的に行われることが理解される。この方法の５つの段階における結果を以下の表２に示す。
【０１２６】
【表２】
【０１２７】
図３Ｃは、表１と表２のデータをプロットしたグラフであり、単一標的法と二重標的法による合成標的の増加又は増幅を示す。
【０１２８】
図４Ａ及び図４Ｂは、レポーターの増幅と精製のための装置と方法を示す。
図４Ａは、一般的には、図２Ｈに図示する要素を示すが、この場合は修飾されたレポータープローブ（６１及び６２）を示す。この実施例においては、該レポータープローブは実質的な基体には結合せず、また、レポーターオリゴヌクレオチド３５の３’末端上にキャッピング基７８を有する。２種の異なるプローブを示す。一方のプローブにおいては、相補的レポーター配列３５''の末端上にキャッピング基が存在し、他方のプローブにおいては、短い尾配列の末端上にキャッピング基が存在する。キャッピング基は、当該分野において知られている多数の適当な種であって、エキソヌクレアーゼの付着及び／又はプロセシングに対して耐性を示す該種から選択されるいずれであってもよい（例えば、ヌクレオチド類似体、及び共有結合した種等）。この種のキャッピング基は、常套のオリゴヌクレオチド合成過程中において簡便に導入することができる。修飾されたレポータープローブは、溶液相中において被検体によって誘発されるレポーターの放出のために使用してもよい。
【０１２９】
図４Ｂは、ナノ電子的検出の前に、放出されたレポーター（３５’及び３５''）を精製することによって、検出環境を単純化すると共に感度と選択性を改善する（例えば、ノイズの低減化等）ための本発明の観点を有する方法と装置の別の実施例を示す。検出操作の前に、高分子量のポリヌクレオチドを除去することは有利である。基体は磁性ビーズ又は本願明細書に記載のその他のいずれかの基体を含有している態様が有利である。少なくともレポーター３５’又は３５''に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを含む１又は複数の「サンドウィッチ型」プローブ７９は、図１Ａ〜図１Ｈに関連して記載したようにして、例えば、ビオチン／ストレプタビジン結合等によって基体へ結合される。レポーター３５’は、短い尾領域をプローブ７９とハイブリッド形成させた状態で図示されている。レポーター３５'は、プローブ（６０及び６１）のナノコードに対して相補的なレポーター配列の少なくとも一部によってハイブリッド形成された状態で図示されている。
【０１３０】
本願明細書に記載のように、基体に結合したレポーター（３５’及び３５''）をすすぎ処理又は洗浄処理に付すことによって、未結合種を含む酵素反応媒体を除去した後、緩衝液で置き換えてもよく、また、該レポーターはナノ電子的検出操作のために、例えば、ビーズの磁気的不動化等によって最適化させてもよい。プローブ７９は、洗浄過程中のレポーターの安定な結合を可能にすると共にその後の検出用レポーターの放出のための簡便な変性を可能にするように選択されるヌクレオチド配列を有していてもよい。
【０１３１】
図８Ａ及び図８Ｂに関連して後述する多重被検体アッセイとマトリックス検出器の実施態様に留意すべきである。図４Ｂに示すレポーターの精製法においては、レポーター３５の共通の配列部分に対して相補的な「サンドウィッチ型」プローブ７９を用いる態様が簡便である。この場合、該レポーターの配列のその他の部分は複数の被検体の１種に対して特異的である。アッセイ反応においてどのような種類のレポーターが放出されようとも、該レポーターは、マトリックス検出器との接触の前に、集合的に精製処理に付してもよい。
【０１３２】
ＰＣＲによらない標的の指数関数的な増幅とレポーターの累積増幅
図５Ａ〜図５Ｅは、共通の観点を有する多数の別の方法から選択された本発明の観点を有する例示的な方法と装置の実施態様を示す。この実施態様によれば、予備増幅による精製過程を含む被検体に応答する指数関数的な増幅がもたらされる。なお、この実施態様は、図２Ａ〜図２Ｈに示す方法と装置と共通する多くの観点を有しており、また、多くの場合は共通する参照番号が使用されている。図５Ａ〜図５Ｅに示すような方法と装置は独立して使用してもよく、あるいは、本願明細書に記載の別の方法と装置、特に図１Ａ〜図１Ｈによって例示される方法と装置と組み合わせて使用してもよい。
【０１３３】
初期固定化
図５Ａは、標的配列Ａ（標的Ａ）と標的配列Ｂ（標的Ｂ）を含む標的被検体ポリヌクレオチド５０、及び種々の試料汚染物（例えば、被検体でないポリヌクレオチド、干渉性酵素、望ましくない化学的成分及び過剰の希釈剤等）を含有する試料媒体を示す。この試料は、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成が行われるために十分な条件下において、分析系７０と接触させる。該分析系は基体７１及び該基体と、例えばビオチン／ストレプタビジン結合６２によって結合した複数の捕獲プローブ（６０及び６１）を具有する。
【０１３４】
プローブはＡプローブ（６０）とＢプローブ（６１）を含む。これらのＡプローブ及びＢプローブは、図２Ａ〜図２Ｈに示すプローブ６０及び６１と実質上同一であってもよい。Ａプローブ（６０）は、被検体ポリヌクレオチド５０の標的配列Ａに対して相補的な捕獲配列Ａ’を含み、また、Ｂプローブ（６１）は、被検体ポリヌクレオチド５０の標的配列Ｂに対して相補的な捕獲配列Ｂ’を含む。好ましくは、特に試料が非常に少量の被検体種を含有する場合には、分析系７０が、試料中に存在する実質的な量の被検体分子５０と結合するために十分な数のＡプローブ（６０）及び／又はＢプローブ（６１）を含むようにし、これによって、希薄試料に対する感度を最大にする。図２Ａにおいて模式的に示される実施態様においては、全ての被検体５０の分子はプローブ６０又はプローブ６１と結合する。過剰のプローブ６０及び６１は以下に記載の段階のために機能する。
１．過剰のＡレポータープローブ及びＢレポータープローブは大部分の被検体分子と結合する。
２．プローブの種類の空間的分離（例えば、ビーズの分離や基体の固定等）によって、アグルチネーション（aglutination）／架橋が回避されると共に被検体Ａの約半分と標的サイトはハイブリッド形成されない状態で残存する。
【０１３５】
基体７１は粒状であってもよく（例えば、１又は複数のビーズ等）、あるいは、非粒状であってもよい（例えば、ウェル、プレート及びベルト等）。特定の実施態様においては、基体７１は、多重結合被検体であるポリヌクレオチド５０に対するポテンシャルを低減させるように設計される（被検体は、標的Ａ配列と標的Ｂ配列において対応するプローブ６０及び６１とハイブリッド形成する）。図示する実施例においては、この態様は、１又は複数のＡプローブ（６０）とＢプローブ（６１）に対して異なる領域を提供する右手の区域と左手の区域によって別々に表示されているが、多くの別の態様が可能である。例えば、別の装置は異なる種類のビーズ（例えば、所望によりビーズ分離機構を用いてもよい）、固定プレート又はルーメン帯域、可変性の緊縮条件、及び異なる溶融特性／変性特性等を具有していてもよい。さらに別の実施態様においては、基７１は電子的検出器の素子と一体化されていてもよく（この態様に関しては後述する）、あるいは、該検出器から分離して配設させてもよい。
【０１３６】
精製
図５Ｂは図５Ａの要素を示す。この場合、すすぎ及び／又は洗浄過程が行われ、これによって、過剰の試料媒体と汚染物６３が除去されるが、プローブ６０及び６１によって基体へ結合された被検体５０は保持される（不動化／分離技術を使用することによって、系中に存在する粒子状物質は保持される）。
【０１３７】
インキュベーション
図５Ｃは図５Ｂの要素を示す。この場合、エキソヌクレアーゼ３７（例えば、図２Ａ〜図２Ｈに示すような活性を有するエキソヌクレアーゼ等）及びアンプリファイア重複オリゴヌクレオチド（該オリゴヌクレオチドは、図２Ａに示すＡアンプリファイア５１及びＢアンプリファイア５４と実質上同一であってもよい）を含有する緩衝液によって交換されている。
【０１３８】
増幅
図５Ｄは図５Ｃの要素を示す。この場合、ハイブリッド形成と酵素活性に対して適した条件下において、Ａアンプリファイア５１、Ｂアンプリファイア５４及びエキソヌクレアーゼ３７は、図２Ｂ〜図２Ｇに記載のようにして、被検体５０とその後の合成標的と反応することによって、合成Ａ標的５３と合成Ｂ標的５６を緩衝液媒体中へ放出する。
【０１３９】
図示する実施例においては、合成Ａ標的５３と合成Ｂ標的５６は、図５Ａの過程において供給される過剰の複数のプリスチンＡプローブ６０とＢプローブ６１とハイブリッド形成する。あるいは、図５Ｄの過程において、付加的なプローブが提供されてもよい。この反応によって、図２Ｈに記載のようにして、複数の合成標的／プローブ複合体が生成する。特定の実施態様においては、過剰のアンプリファイア５１及び５４が供給され、エキソヌクレアーゼによって仲介される増幅が行われ、これによって十分な量の合成Ａ標的及び合成Ｂ標的の生成反応が続行され、複数のプローブ６０及びプローブ６１はハイブリッド複合体の形成反応を介してそれぞれ飽和される。
【０１４０】
レポーターの放出
図５Ｅは図５Ｄの要素を示す。この場合、エキソヌクレアーゼ３７は、酵素活性に対して適当な条件下において、図２Ｈに記載のようにして、合成標的／プローブ複合体及び未変性被検体／プローブ複合体と反応してプローブ６０と６１を分解させることによって、レポーターオリゴヌクレオチド３５及び標的種を緩衝液媒体中へ放出させる。
【０１４１】
図示する実施例においては、エキソヌクレアーゼは全てのプローブを分解させることによって、検出用のレポーターを放出する。存在するポリヌクレオチドの実質的な母集団は未変性被検体及び被検体の存在に応答して放出される種（合成標的及びレポーター）であり、交差反応性は最小限に抑制されるか、又は回避される。レポーターは、検出器の応答に対して、例えば、大きさ又は組成等の点で最適化させることができる。許容される条件下では、図５Ｅに示す反応は、一般的には図５Ｄに示す反応と同時に進行させてもよいということに留意すべきである。あるいは、緊縮調節及びプローブの分離等を利用してこれらの反応過程を分離してもよい。
【０１４２】
レポーター３５は、図１Ｇ及び図１Ｈに関連して説明したようにして、分離されたナノ電子的検出器４０又は反応領域と連絡する一体化ナノ電子的検出器を介して検出してもよいことに留意すべきである。
【０１４３】
別の特定の実施態様においては、基体７１は、プローブ６０及び６１の分解を直接的に検出するように設計された１又は複数のナノ電子的検出素子を含んでいてもよい。例えば、基体７１は１又は複数のナノ粒子の領域、例えば、電気接点と連絡するカーボンナノチューブ素子等を含んでいてもよい。例えば、プローブの分解に起因する１又は複数のナノチューブの性質の変化は、本願明細書及び本願明細書に組み込まれた特許出願の実施例Ａ〜Ｉに記載のようにして検出可能である。
【０１４４】
さらに別の実施態様においては、基体７１は、１又は複数の電極（例えば、間隔を設けて配置された少なくとも１対のソース電極／ドレイン電極）と接触するカーボンナノチューブのようなナノ粒子の連動ネットワークを含む１又は複数の領域を具有する。ナノ粒子のネットワークはウェファー様基体構造材（例えば、ケイ素、ＳｉＯ２，Ｓｉ３Ｎ４、ＰＥＴ及び対電極材等又はこれらの任意の混合物）によって支持されていてもよい。本願明細書に組み込まれた特許出願の明細書には、この種の装置に関する調製例と操作例が記載されている。プローブ６０及び６１の分解（この分解により残存するリガンド部分６２’が脱離する場合がある）によって、適当な回路（図示せず）によって検出可能なナノ粒子素子の電気的、機械的及び／又は電気化学的な環境における少なくとも１つの変化（例えば、対電極に対するナノ粒子のキャパシタンスの変化、及びゲート電極の影響下でのトランジスター特性の変化等）がもたらされる。
【０１４５】
後続の酵素除去による増幅
図６Ａ〜図６Ｃは、共通の観点を有する多数の別の方法に含まれる本発明による観点を有する１つの例示的な方法と装置の実施態様を示す。この実施態様によれば、被検体に応答する指数関数的な増幅がもたらされた後、分析媒体からエキソヌクレアーゼが除去される。図示する方法と装置は、図２Ａ〜図２Ｈ及び図５Ａ〜図５Ｅに示す方法と装置と比較した場合、多くの共通の観点を有し、多くの共通の参照番号を伴う。
【０１４６】
エキソヌクレアーゼ増幅
図６Ａは、標的配列Ａ（標的Ａ）と標的配列Ｂ（標的Ｂ）を含む標的被検体ポリヌクレオチド５０を含有する試料媒体を示す。試料は、一般的には図５Ａ〜図５Ｄに示す過程と同一又は類似するようにして処理することにより、ハイブリッド形成と酵素活性に対して適当な条件下において、被検体５０をＡアンプリファイア５１、Ｂアンプリファイア５４及びエキソヌクレアーゼ３７と反応させ、これによって複数の合成Ａ標的５３と合成Ｂ標的５６を緩衝液媒体中へ放出させてもよい。
【０１４７】
本発明の観点を有するこの別の実施態様においては、エキソヌクレアーゼによって仲介される増幅をおこなうことによって、１又は複数の変性Ａプローブ８１及び／又は８２並びに１又は複数の変性Ｂプローブ８３及び／又は８４を接触させる。これらの変性プローブは保護性３’尾を有しており、該尾は非突出性３’末端（例えば、平滑状又は陥凹状の３’末端）を脱離させることによって、エキソヌクレアーゼ３７の３’二重特異的活性による分解を防止する。このようにして、図５Ｅに示す反応は防止される。図示する実施例においては、過剰のアンプリファイアは、過剰の合成Ａ標的とＢ標的による変性プローブ８１〜８４の飽和を可能にする。
【０１４８】
第１の別の態様においては、変性Ａプローブ８１及び変性Ｂプローブ８３は、結合した合成Ａ標的及び合成Ｂ標的の隣接部分に対してそれぞれ非相補的な保護性３’尾を有しているので、プローブ／標的ハイブリッド複合体においては、保護性尾は単一鎖３’末端部分を有する。第２の別の態様においては、変性Ａプローブ８２及び変性Ｂプローブ８４は、結合した合成Ａ標的及び合成Ｂ標的の隣接部分に対してそれぞれ相補的な保護性３’尾を有しているので、プローブ／標的ハイブリッド複合体においては、保護性尾は二重鎖３’末端部分を有し、該３’末端部分は各々の合成標的オリゴヌクレオチドの隣接５’末端を超えて突出する（付着３’末端）。
【０１４９】
精製
図６Ｂは図６Ａの要素を示す。この場合、プローブ／標的複合体が形成された後、すすぎ及び／洗浄過程がおこなわれ（例えば、交換用緩衝液を用いて、基体に結合したプローブ／標的複合体からエキソヌクレアーゼ緩衝液をすすぎ流す）、エキソヌクレアーゼ３７を含む過剰の試薬物質は媒体から除去される。交換された媒体は、図１Ｇに示す過程の場合のように、検出操作のために最適化させてもよい（この場合、酵素活性のために適するようにする必要はない）。
【０１５０】
プローブの変性
図６Ｃは図６Ｂのプローブ／標的要素及び基体７１を示す。この場合、例えば、熱、電場又は緊縮調節等を利用して変性過程を行うことによってプローブ／標的複合体を変性させ、これによってレポーター分子３５及び／又は合成標的分子５３及び５６を放出させる。緊縮調節とオリゴヌクレオチド配列の設計に応じて、該変性過程を全体的又は選択的に行ってもよいことに留意すべきである。従って、検出器は、レポーター３５、標的５３、標的５６又はこれらの混合物を検出するように最適化させてもよい（別のプローブにおいては、所望によりレポーター３５を省略してもよい）。
【０１５１】
１又は複数のプローブの骨格種８１’、８２’、８３’及び／又は８４’は基体７１に結合した状態にあってもよい（図示する実施例においては、該骨格種は単一鎖オリゴヌクレオチドである）。図５Ｅに示す実施例の場合のように、基体７１は、本願明細書に記載のようなナノ電子的検出器であって、変性状態を直接的に検出するように設計されたナノ電子的検出器を含んでいてもよい（直接的な基体装置の検出）。例えば、直接的な基体装置の検出には、プリスチンプローブ８１〜８４を含む変性現象（試料中には被検体５０は存在しない）（例えば、変性前、変性中及び変性後の比較）及びプローブ／標的複合体を含む変性現象（被検体５０の存在に応答してもたらされる）との間の差異を検出することが含まれていてもよい。同様に、付加的な実施態様においては、このような直接的な基体装置の検出は、遠隔ナノ検出器（例えば、図１Ｈに記載のような）と組み合わせて行ってもよい。
【０１５２】
内部ヌクレアーゼ耐性ブロック基を有するレポータープローブ
図７Ａ〜図７Ｆは、本発明の観点を有するレポータープローブであって、ブロック基の配列位置におけるエキソヌクレアーゼのプロセシングを停止させる内部ブロック基を含むレポータープローブの実施例を示す。この種のブロック基は当該分野においては既知であって、例えば、天然核酸が共有結合した種の類似体を含んでいてもよい。
【０１５３】
ハイブリッド形成プローブ
図７Ａは、プローブ９０が被検体ポリヌクレオチド５０の標的配列Ａとハイブリッド形成して被検体／プローブ複合体を生成するように、該プローブ９０を用いて処理した被検体ポリヌクレオチド５０を示す。プローブ９０は、連鎖レポーターオリゴヌクレオチド９１及びコンパニオンオリゴヌクレオチド９２を含む。
【０１５４】
連鎖レポーターオリゴヌクレオチド９１は、被検体５０の標的Ａの少なくとも一部に対して相補的な近位捕獲配列部分９４、及びコンパニオンオリゴヌクレオチド９２の少なくとも一部に対して相補的な遠位レポーター配列部分９５を含む。捕獲配列９４及びレポーター配列９５は、介在する耐性連結基９３によって連結される。この実施例における「近位」と「遠位」という用語は、３’末端を近位とし、５’末端を遠位とするように任意的に使用するものであり、「鏡像」オリゴヌクレオチド構造においては、３’対５’の意味は逆転する。
【０１５５】
コンパニオンオリゴヌクレオチド９２は、レポーター配列９５の少なくとも一部に対して相補的な近位アンカー配列９６、及び被検体５０の少なくとも一部に対して相補的な遠位捕獲配列９７を含む。
【０１５６】
特定の実施態様においては、連鎖レポーター９１とコンパニオン９２のハイブリッド複合体を含む集合プローブ９０は、例えば試薬溶液中へ導入し、被検体５０を含む試料と反応させてもよい。別の実施態様においては、単一鎖状の連鎖レポーター９１及び単一鎖状コンパニオン９２を供給して被検体５０と接触させてその場で被検体５０と相互にハイブリッド形成させることによって、図７Ａに示すように、被検体／プローブ複合体が生成する。
【０１５７】
プローブの分解
図７Ｂは図７Ａの要素を示す。この場合、非突出状３’末端を有する二重ポリヌクレオチドを分解させる活性を有するエキソヌクレアーゼ３７が更に付加される。エキｓドヌクレアーゼは、捕獲配列９４を含む連鎖レポーター９１の近位部分へ結合して該近位部分分解を開始させる。
【０１５８】
図７Ｃは図７Ｂの要素を示す。この場合、エキソヌクレアーゼは連鎖レポーター９１の分解を続行し、連鎖レポーター９１の耐性結合９３に近い部分を除去する。
【０１５９】
レポーターの放出
図７Ｄは図７Ｃの要素を示す。この場合、エキソヌクレアーゼ３７は、耐性結合９３に達すると、プローブ／被検体複合体から離脱し、レポーター配列３５は該酵素の影響を受けない。レポーター配列９５は変性され、コンパニオン９２から離脱する。好ましくは、i）反応媒体の条件（温度、ｐＨ、及びイオン組成等）、及びii）レポーター配列３５とコンパニオンアンカー配列９６の対応する相補的部分の長さとヌクレオチド組成の一方又は両方は、残存するレポーター配列９５が、オリゴヌクレオチド９１の近位部分が分解したときに二重形態として一般的に不安定になるように選択してもよい。あるいは、酵素分解後の反応媒体の条件を調整することによって、二重のレポーター９５の変性を促進してもよい。
【０１６０】
特定の実施態様においては、レポーター９５の脱離後、コンパニオン９２は被検体５０に結合した状態を保持するように設計される。別の実施態様においては、コンパニオン９２も変性されて被検体から脱離してもよい。いずれの場合においても、コンパニオン９２は、媒体中の付加的なプリスチンが結合したレポーターオリゴヌクレオチド９１と結合させることによって再循環させ、図７Ａに記載のようにして、付加的なプローブ／被検体複合体を形成させてもよい。
【０１６１】
精製
図７Ｅは、１又は複数の相補的な「サンドウィッチ型」プローブ７９を用いる所望による精製過程を示す。この場合、基体に結合した１又は複数のプローブオリゴヌクレオチドの各々は、例えば、図４Ｂに記載のように、レポーター配列９５に対して相補的な配列を有する。レポーター９５をプローブ７９へ結合させた後、基体３２のすすぎ／洗浄処理を行うことによって、変性によるレポーター９５の放出の際の試料媒体を非常に単純化させることができる。
【０１６２】
検出
図７Ｆは、図１Ｇ〜図１Ｈに関連して記載したような本願発明の観点を有するナノ電子的センサー４２によってレポーター９５を検出する態様を示す。前述のように、本発明による観点を有するレポーターは、常套の光学的方法を含む種々の別の検出手段によって検出してもよい。検出器４２は１又は複数の結合された検出プローブ９８を有しており、該プローブは相補的配列を介してレポーター９５とハイブリッド形成し、これによってセンサーの特性に関して検出可能な変化がもたらされる。例えば、図７Ｅに示す所望による精製過程によるエキソヌクレアーゼ３７の除去又は失活によって、プローブ／レポーター複合体の形態に関連する制約、即ち、センサーに関して遠位の非突出状３’末端が分解されないという制約を排除することができる（センサー４２による迅速な検出によってもこの制約を排除することができる）。あるいは、プローブ９８が、図示するように、遠位の突出状３’末端を有するように設計してもよい。他の検出プローブ９９は遠位の５’末端を有する。図示する実施例においては、耐性結合９３はレポーター９５の３’末端上又は該末端に隣接する位置に存在するので、二重のプローブ／レポーター複合体におけるエンドヌクレアーゼ活性に対して耐性がもたらされる。
【０１６３】
多重レポーターとマトリックス検出セルを用いる多被検体アッセイ
図８Ａと図８Ｂは、多重レポーターとマトリックス検出セルを用いる多被検体アッセイを含む本発明の観点を有する例示的な方法と装置の実施態様を示す。この方法には、複数のプローブを供給することが含まれる。該プローブは、複数の異なる被検体に対応する検出種（例えば、レポーター等）を増幅して供給するように設計される。
【０１６４】
図８Ａは、多重レポータープローブ及び所望による精製過程と多重アンプリファイアを利用する多被検体アッセイを示すフローチャートである。この実施例においては、レポータープローブ及び想定される被検体１、２、３及び４にそれぞれ対応するアンプリファイアを含有する試薬混合物が配合される。被検体２及び４のみを含有する試料媒体を、ハイブリッド形成と酵素活性を促進するために有効な条件下において、該試薬混合物とエキソヌクレアーゼ３７と接触させる。前述のようにして増幅とレポーターの放出が行われた後、被検体１と２に対応するレポーター及び合成標的が放出される。被検体１と３に対応するアンプリファイア及びレポータープローブは未反応状態に保持される。レポータープローブとアンプリファイア及びすすぎ又は精製過程は本願明細書に記載のいずれかの実施態様（例えば、図１〜図７に記載の実施態様）又は本願発明の技術的思想を逸脱することのないいずれかの類似の実施態様であってもよいことに留意すべきである。
【０１６５】
図８Ｂは、包囲壁１０１、１又は複数の出入口１０２及びセンサーのマトリックスを具備する検出セル１００を示す。各センサーは、異なる被検体であるレポーター分子に対応する異なる検出感度を有する。図８Ｂにおいては、４つのセンサー４２ａ、４２ｂ、４２ｃ及び４２ｄが図示されている。これらのセンサーには、本願明細書に記載のいずれかのセンサー及び本願明細書に組み入れられる特許出願の明細書に記載のいずれかのセンサーを含んでいてもよいことに留意すべきである。この実施例においては、各センサー４２は基体（例えば、誘電層１０７を有する共通の基体１０６、例えば、シリコンウェファー、ＳｉＯ２表面層又はポリマーシート等）、基体に隣接して配置されたナノ構造素子１０４（この実施例においては、相互に連絡されたＣＮＴネットワークである）、及び該ナノ構造素子１０４と電気的に接続する少なくとも１つの接点（この実施例においては、相互に組み合わされたソース／ドレイン電極対が図示されている）を具備する。トランジスターの実施例においては、分離したゲート電極を含めてもよく、あるいは、Ｓｉをドープしたウェファーのような基体材料をマトリックス用の共通のゲート電極として使用してもよい。各センサーにおけるナノ構造素子１０４は、アッセイの想定される被検体の１種に対して特異的な異なる認識材料（この実施例においては、被検体１、２、３及び４のそれぞれに対応するレポーターオリゴヌクレオチドから選択される１種に対して相補的なオリゴヌクレオチドプローブである）を用いて感作される。
【０１６６】
検出溶液１０３（この実施例の場合には、図８Ａに示す反応混合物から誘導される精製されたレポーター溶液である）をセル１００に含まれるセンサー４２と接触させる。適当な測定回路（図示せず）によって、対応するレポーターとのハイブリッド形成が発生するセンサー４２ａ〜４２ｄの性質の変化が測定される
【０１６７】
図示する態様のマトリックスセル１００においては、センサー４２は異なるレポーター分子を検出するように設計されているが、本願発明の技術的思想を逸脱することなく、その他の態様を採用することも可能であることに留意すべきである。例えば、センサーは、合成標的又は被検体の分子に対して感度を示すプローブを含んでいてもよい。
【０１６８】
アプタマー／レポーター複合体
図９Ａ〜図９Ｃは、本発明の観点を有する１つの例示的な方法であって、生体分子を含む被検体を検出するためのアプタマー部分を含むプローブ集合体を示す。アプタマー／塩基配列複合体は、アプタマー１１２が被検体１１１と結合したときに正角的変化（conformal change）がもたらされるように選択される。図示する実施例においては、アプタマー／レポーター複合体は、例えば、前述のような方法によってビーズ等の基体上へ固定化される。図９Ｂに示すように、プローブ集合体１１０は、塩基配列１１４へ結合された二重形態のレポーター１１３を含む。プローブ１１０は、一般的には本願明細書に記載のいずれかの実施例に示すものと類似する。図示する実施例においては、プローブ１１０は、一般的には図７Ａ〜図７Ｆに示すものと類似し、塩基配列１１４は被検体５０の場合と同様に作用する。塩基配列は、標的被検体１１１に対して特異的な結合能を示すアプタマー配列１１２と接続される。本発明の観点を有する実施態様においては、被検体は、アプタマー又は類似のポリヌクレオチド構造体（例えば、球状タンパク質及び多糖等）に対して特異的な親和性又は反応性を示す多数の物質から選択されるいずれの物質であってもよい。
【０１６９】
プローブの保護に適合したアプタマー
図９Ａに示すように、アプタマー１１２が被検体１１１と結合しないときには、エンドヌクレアーゼ３７がプローブ１１０を実質上分解させないように該プローブの立体配座は保護される。
【０１７０】
アプタマーの被検体への結合とプローブの暴露
図９Ｂに示すように、アプタマー１１２が被検体１１１に結合すると、結合体の立体配座はプローブ１１０をエンドヌクレアーゼ３７へ暴露させるので、該プローブ１１０はエンドヌクレアーゼ３７によって攻撃される。
【０１７１】
プローブの分解とレポーターの放出
図９Ｃに示すように、酵素３７によってプローブ１１０が分解された後、レポーターが放出されるので、該レポーターは、図１〜図８に示す実施態様に関連して記載した方法によって検出してもよい。
【０１７２】
ポリヌクレオチドの検出用ナノ電子的センサー：実施例Ａ〜Ｉ
本発明の観点を有する付加的な実施態様は、共同で発明された米国特許出願第１１／３１８３５４号（出願日：２００５年１２月２３日）の明細書（ＷＯ２００６−０７１８９５参照）及び米国特許出願第１１／２１２０２６号（出願日：２００５年８月２４日）の明細書（ＷＯ２００６−０２４０２３参照）に開示されている実施例Ａ〜Ｉに記載されており、これらの明細書も本願明細書の一部を成すものである。
【０１７３】
多段階的アンプリファイア [指数法則（power-law）増幅]
図１０〜図１３は、本発明の観点を有する実施態様であって、図２及び図３に関連して先に説明した実施態様の場合と多くの関連性と操作手順の点で類似する方法に従って、被検体に応答して酵素で仲介される増幅をもたらす実施態様を示す。この場合、アンプリファイア試薬種の多段階的シリーズが使用される。
【０１７４】
図１０〜図１３に示す実施態様においては、初期段階のアンプリファイアの被検体に応答する酵素反応による生成物は、第２段階のアンプリファイアの増幅用基体を形成し、その後の酵素反応において第２増幅生成物がもたらされる。付加的な段階を含めてもよい。
【０１７５】
これらの実施例においては、予め選択された被検体の標的配列Ａを用いるハイブリッド形成を介して、増幅の初期段階のみが被検体の存在によって直接的に誘発される。その後の段階のアンプリファイアは増幅生成物によって誘発される。増幅生成物（誘導鎖又はレポーターフラグメント）の蓄積は、逐次的なアンプリファイア段階の数（ｎ＝２、３、......）に基づく指数法則の関係式に従う。
【０１７６】
このような多段階的増幅スキームを採用する検出装置を用いてこの種の増幅生成物（レポーター）の一部又は全部を検出することによって、試料中の生体分子被検体の存在又は濃度の測定が可能となる。このような検出においては、本願明細書に記載のいずれかのナノ電子的装置を使用してもよい。
【０１７７】
本発明の観点を例証するために、図１０〜図１３に示す実施例においては、オリゴヌクレオチド複合体と酵素は、３’−エキソヌクレアーゼによる分解が、１つの鎖上に非突出状３’末端を有する二重ＤＮＡ上において選択的に開始されるように設計され、該分解は、非突出状鎖に沿って３’から５’の方向へ進行する。しかしながら、図２及び図３に関連して先に説明した実施例の場合のように、本発明による技術的思想を逸脱することなく、その他の立体配置を採用することも可能であり、また、その他の酵素（例えば、５’エキソヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ等）を使用し、これに応じてアンプリファイア試薬種を設計してもよい。
【０１７８】
２段階増幅
例えば、図１０及び図１１は２段階法（ｎ＝２）の実施態様を示す。別の実施態様の場合のように、被検体に応答して最初に行われる酵素仲介反応によって、合成標的（即ち、試料中に存在せず、予め調製されて選択された天然の又は合成されたオリゴヌクレオチド）が放出される。該合成標的は、別の合成鎖又はフラグメントの放出をもたらす付加的な酵素仲介反応に関与する。合成オリゴヌクレオチドは、試料中に被検体ポリヌクレオチドが不存在のときのエキソヌクレアーゼ活性から保護されるように設計された二重形態で供給される。
【０１７９】
初期条件
図１０に示す実施例における第１の図（図１０ａ）は、試料測定の初期状態を示す。この初期状態には下記の要件ａ）〜ｄ）を伴う：
ａ）予め選択された配列Ａを有する被検体ポリヌクレオチド鎖１２０は、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成が行われるために十分な条件下において、少なくともアンプリファイアＩを含む試薬／緩衝液へ暴露される。
ｂ）アンプリファイアＩは、捕獲鎖１２１とコンパニオン鎖１２２を含む二重構造を含む。
ｃ）捕獲鎖１２１は、捕獲配列Ａ’（標的Ａの一部又は全部に対して相補的な配列）及び２つの付加的な配列Ｂ’とＣ’を３’から５’の順位で含む。
ｄ）コンパニオン鎖１２２は２つのコンパニオン配列ＣとＢを３’から５’の順序で含む。該配列Ｃ及びＢはそれぞれ捕獲鎖１２１のコンパニオン配列Ｃ’及びＢ’の一部又は全部に対して相補的であって該一部又は全部とハイブリッド形成し、暴露された鎖１２１の捕獲配列Ａ’は残存する。
【０１８０】
段階１
図１０ｂにおいては、アンプリファイアＩは、鎖１２１の捕獲配列Ａ’と被検体鎖１２０の標的配列Ａとのハイブリッド形成による被検体鎖１２０との二重会合状態で示される。エキソヌクレアーゼ種は必要ないずれかの補因子と共に試薬中へ添加するか、又は試薬中に存在させることによって、捕獲配列１２１の３’末端における分解を開始させる。
【０１８１】
図１０ｃにおいては、段階１の酵素分解が完結した状態が示されており、未分解の被検体鎖１２０（原鎖）とコンパニオン鎖１２２（コンパニオンＩ又はＢＣ）は溶液中へ放出される。この時点（段階１の終了時点）においては、１つの原鎖と１つの誘導鎖（例えば、レポーター等）が溶液中に存在する。
【０１８２】
段階２
図１０ｄは当該方法の段階２の開始状態を示す。この場合、段階１の生成物（鎖１２０及び鎖１２２）は、試薬／緩衝液媒体中において、付加的なアンプリファイアＩとアンプリファイアII に暴露される。この段階には下記の要件ａ）〜ｃ）が伴う：
ａ）アンプリファイアII は、捕獲鎖１２３とコンパニオン鎖１２２を含む二重構造を含む。
ｂ）捕獲鎖１２３は、捕獲配列Ｃ''（コンパニオン鎖１２２の配列Ｃの一部又は全部に対して相補的な配列）及び付加的な配列Ｂ''を３’から５’の順位で含む。
ｃ）コンパニオン鎖１２４はコンパニオン配列Ｂ'''を含む。該配列は捕獲鎖１２３のコンパニオン配列Ｂ''の一部又は全部に対して相補的であって該一部又は全部とハイブリッド形成し、暴露された鎖１２３の捕獲配列Ｃ''は残存する。
【０１８３】
図１０ｅにおいては、アンプリファイアII は、鎖１２３の捕獲配列Ｃ''とコンパニオン鎖１２２の配列Ｃとのハイブリッド形成によるコンパニオン鎖１２２との二重会合状態で示される。エキソヌクレアーゼ種は必要ないずれかの補因子と共に試薬中へ添加するか、又は試薬中に存在させることによって、捕獲配列１２３の３’末端における分解を開始させる。同時に、付加的なアンプリファイアＩは、段階１に関して記載したように、被検体鎖１２０との二重会合状態で示される。
【０１８４】
図１０ｆにおいては、段階２の酵素分解が完結した状態が示されており、未分解の被検体鎖１２０（原鎖）、２つのコンパニオン鎖１２２（第１誘導鎖と第２誘導鎖）及びコンパニオン鎖１２４（コンパニオンII 又はＢ）は溶液中へ放出される。この時点（段階２の終了時点）においては、１つの原鎖と３つの誘導鎖（例えば、アンプリコン又はレポーター等）が溶液中に存在する。
【０１８５】
付加的段階（相１及び相２）
図１０ｇは当該方法のその後の段階３の開始状態を示す。段階１の生成物（鎖１２０と鎖１２２）及び段階２の生成物（鎖１２４）は、試薬／緩衝液媒体中において、付加的なアンプリファイアＩ及びアンプリファイアII に暴露される。
【０１８６】
図１０ｈにおいては、アンプリファイアＩは、段階１の被検体鎖１２０との二重会合体として示されており、また、アンプリファイアII は、段階２のコンパニオン鎖１２０との二重会合体として示されている。エキソヌクレアーゼは、被検体の重複部位の捕獲鎖１２０及びコンパニオンＩの各々の重複部位の捕獲鎖１２３の分解を開始させる。
【０１８７】
図１０ｉにおいては、酵素的分解は完結しており、また、未分解の被検体鎖１２０、３つのコンパニオン鎖１２２、及び３つのコンパニオン鎖１２４（１つは段階２から得られたものであり、２つは新たに誘導されたものである）は溶液中へ放出される。この時点（段階３の終了時点）においては、１つの原鎖と６つの誘導鎖（例えば、アンプリコン及びレポーター等）が溶液中に存在する。
【０１８８】
この方法の６つの相又は段階において得られた結果を以下の表３に示す。
【表３】
【０１８９】
図１１は、２段階増幅に関する表３の結果をプロットしたグラフを示す。
【０１９０】
３段階増幅
別の実施例に関する図１２Ａ〜図１２Ｃ及び図１３は、３段階法（ｎ＝３）の実施態様を示す。この実施態様は、多くの点で、図１１〜図１２に示す２段階の実施例の場合と類似する。簡便化のために、以下においては、各々の増幅段階の操作様式のみについて説明する。この実施態様の基礎となる原理と構成は、前述の関連する記載内容に基づけば明らかになる事項である。前述の実施例の場合のように、特定の前駆体標的及び十分な増幅試薬と酵素が存在する場合には、各段階は同時に進行させてもよいことに留意すべきである。
【０１９１】
段階１
図１２Ａは、アンプリファイア＃１の漸進的活性（progressive activity）を示す矢印で連結される３つの部分を示す。この段階には下記の要件ａ）〜ｆ）が含まれる：
ａ）アンプリファイア＃１は、捕獲鎖１２５とコンパニオン鎖１２６を含む二重構造を有する。
ｂ）捕獲鎖１２５は、捕獲配列Ａ’（該配列は、標的Ａの全部又は一部に対して相補的である）及び３つの付加的配列Ｂ’、Ｃ’及びＤ’を３’から５’の順位で含む。
ｃ）コンパニオン鎖１２６は、３つのコンパニオン配列Ｄ、Ｃ及びＢを３’から５’の順位で含むので、捕獲鎖１２５の捕獲配列Ａ’は暴露される。なお、これらの３つのコンパニオン配列Ｄ、Ｃ及びＢは、それぞれ捕獲鎖１２５のコンパニオン配列Ｄ’、Ｃ’及びＢ’の全部又は一部に対して相補的であって該全部又は一部とハイブリッド形成する。
ｄ）予め選択された配列Ａを有する被検体であるポリヌクレオチドの鎖１２０は、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成がおこなわれるために十分な条件下において、少なくともアンプリファイア＃１を含有する試薬／緩衝液に暴露され、これと結合して二重被検体／アンプリファイア＃１複合体を生成する。
ｅ）エキソヌクレアーゼ種をいずれかの必要な補因子と共に試薬へ添加するか、又は試薬中に存在させることによって、捕獲鎖１２５の３’末端における分解を開始させる。
ｆ）酵素的分解反応を完結するまで続行することによって、未分解の被検体鎖１２０及びコンパニオン鎖１２６（コンパニオン＃１又はＢＣＤ）を溶液中へ放出させる。
【０１９２】
段階２
図１２Ｂは、アンプリファイア＃２の漸進的活性を示す矢印で連結される３つの部分を示す。この段階には下記の要件ａ）〜ｆ）が含まれる：
ａ）アンプリファイア＃２は、捕獲鎖１２７とコンパニオン鎖１２８を含む二重構造を有する。
ｂ）捕獲鎖１２７は、捕獲配列Ｃ''（該配列は、鎖１２６の配列Ｃの全部又は一部に対して相補的である）及び２つの付加的配列Ｄ''及びＢ''を３’から５’の順位で含む。
ｃ）コンパニオン鎖１２８は、２つのコンパニオン配列Ｂ'''及びＤ'''を３’から５’の順位で含むので、捕獲鎖１２７の捕獲配列Ｃ''は暴露される。なお、これらの２つのコンパニオン配列Ｂ'''及びＤ'''は、それぞれ捕獲鎖１２７のコンパニオン配列Ｂ''及びＤ''の全部又は一部に対して相補的であって該全部又は一部とハイブリッド形成する。
ｄ）コンパニオン＃１（鎖１２６）は、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成がおこなわれるために十分な条件下において、少なくともアンプリファイア＃２を含有する試薬／緩衝液に暴露され、これと結合して二重コンパニオン＃１／アンプリファイア＃２複合体を生成する。
ｅ）エキソヌクレアーゼ種をいずれかの必要な補因子と共に試薬へ添加するか、又は試薬中に存在させることによって、捕獲鎖１２７の３’末端における分解を開始させる。
ｆ）酵素的分解反応を完結するまで続行することによって、未分解のコンパニオン＃１（１２６）及びコンパニオン鎖１２８（コンパニオン＃２又はＢＤ）を溶液中へ放出させる。
【０１９３】
段階３
図１２Ｃは、アンプリファイア＃３の漸進的活性を示す矢印で連結される３つの部分を示す。この段階には下記の要件ａ）〜ｆ）が含まれる：
ａ）アンプリファイア＃３は、捕獲鎖１２９とコンパニオン鎖１３０を含む二重構造を有する。
ｂ）捕獲鎖１２９は、捕獲配列Ｄ４（該配列は、鎖１２８の配列Ｃ'''の全部又は一部に対して相補的である）及び付加的配列Ｂ４を３’から５’の順位で含む。
ｃ）コンパニオン鎖１３０は、コンパニオン配列Ｂ５含むので、捕獲鎖１２９の捕獲配列Ｄ４は暴露される。なお、該コンパニオン配列は、捕獲鎖１２９のコンパニオン配列Ｂ４の全部又は一部に対して相補的であって該全部又は一部とハイブリッド形成する。
ｄ）コンパニオン＃２（鎖１２８）は、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成がおこなわれるために十分な条件下において、少なくともアンプリファイア＃３を含有する試薬／緩衝液に暴露され、これと結合して二重コンパニオン＃２／アンプリファイア＃３複合体を生成する。
ｅ）エキソヌクレアーゼ種をいずれかの必要な補因子と共に試薬へ添加するか、又は試薬中に存在させることによって、捕獲鎖１２９の３’末端における分解を開始させる。
ｆ）酵素的分解反応を完結するまで続行することによって、未分解のコンパニオン＃２（１２６）及びコンパニオン鎖１３０（コンパニオン＃２又はＢ）を溶液中へ放出させる。
【０１９４】
この方法の６つの相又は段階における結果を以下の表４に示す。
【表４】
【０１９５】
図１３は、３段階増幅に関連する表４のデータをプロットしたグラフを示す。
【０１９６】
相同配列
本願明細書に記載の実施例（特に図１０〜図１３に示す多段階の実施例）に関しては、１種よりも多くの増幅試薬種中に存在する配列に対応する相同配列の個々の指定は、この種の相同配列がヌクレオチドの長さや配列の点、又は全体的な化学的組成の点で同一であるということを必ず意味するものではないということに留意すべきである。この種の相同配列は同一であってもよいが、多くの点で異なっていてもよい。
【０１９７】
例えば、図１２Ｂ及び図１２Ｃにおいては、鎖１２８の配列Ｄ'''は配列Ｄ''（アンプリファイア＃２における鎖１２７）とハイブリッド形成していてもよく、また、配列Ｄ４（アンプリファイア＃３／コンパニオン＃２複合体における鎖１２９）ともハイブリッド形成していてもよい。このような相同配列は、本発明による方法において個々のハイブリッド形成機能を発揮するために有効な程度の相補的特性を有するように設計してもよい。この場合、配列、長さ又は付加的な化学基の組み込みの点で必ずしも同一でなくてもよい。従って、例えば、配列Ｄ''と配列Ｄ４は、ハイブリッド形成の異なる完結度を有するように設計してもよく、あるいは、これらの配列は異なる変性特性又はアニーリング緊縮特性を有していてもよい。同様に、配列Ｄ''とＤ４は、異なる長さ、末端基又は非天然ヌクレオチド等を有するように設計することによって、例えば、所望により酵素活性の開始、停止、特異性又はブロッキング等を調節してもよい。
【０１９８】
別の選択肢においては、アンプリコン又はレポーター種における相同配列（例えば、鎖１２８におけるＢ'''及び鎖１３０におけるＢ５）は異なる標識、マーカー又はその他の検出能増大特性を有するように設計することによって、例えば、明確で個別的な検出（例えば、定量的増幅の追跡における検出）又は異なる装置若しくは方法による検出を可能にしてもよい。特定の実施態様においては、多重及び／又は定量的検出法を採用することによって、例えば、偽陽性の低減化及び類似被検体間の区別等を可能にしてもよい。
【０１９９】
実施例：蛍光検出を用いる単一標的増幅
図１４Ａ〜図１４Ｃは、本発明の観点（例えば、図３Ａ参照）を有する単一標的増幅法であって、該方法の１つの過程において蛍光検出法を採用する該単一標的増幅法の実施例を示す。
【０２００】
この実施例においては、増幅捕獲プローブ配列は被検体／アンプリファイア複合体を形成するように設計され、これによって捕獲鎖は、５’＞＞３’エキソヌクレアーゼ活性による分解作用を受ける非突出状５’末端を有するようになる。この実施例で使用した酵素は、５’＞＞３’エキソヌクレアーゼ活性Ｔ７ポリメラーゼである。
【０２０１】
前述のように、本発明の観点を有する増幅と検出のいくつかの別の実施態様は、３’−エキソヌクレアーゼ、５’−エキソヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ（例えば、校正又はヌクレアーゼ活性を介するポリメラーゼ等）等を含む種々のヌクレオチド酵素を用いて実施してもよい。例えば、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼは、本発明による方法を使用して例証されている。同様に、本発明の観点を有する増幅系においては、適当な酵素の開始部位を有する被検体／アンプリファイア複合体を形成するように設計されている場合には、本発明の技術的思想を逸脱することなく、エンドヌクレアーゼ活性を利用してもよい。
【０２０２】
図１４Ａは、被検体１４１を含む被検体／アンプリファイア系１４０の構成成分を示す模式図である。該被検体は、標的配列Ａ（この実施例の場合には、約５４個の塩基を有する配列である）、捕獲鎖１４２（この実施例の場合には、約１０２個の塩基を有する鎖である）、相補的配列Ａ’、延長配列Ｂ及びレポーター鎖１４７（この実施例の場合には、約１９個の塩基を有する鎖である）を有する。この実施例におけるアンプリファイア／被検体複合体は約１２１個の塩基対を有する。
【０２０３】
レポーター鎖１４７は、相補的配列Ｂ’を有する鎖１４３を含む。該相補的配列は、鎖１４２の延長配列Ｂ’と結合すると共に、この実施例においては、常套法によって鎖１４３へ結合されたＦＡＭ蛍光性基１４４も含んでおり、これによって、光学的方法による簡便な検出が可能となる。
【０２０４】
図１４Ｂと図１４Ｃは、当該方法における種々の反応成分の電気泳動的ゲル分離の結果を示す写真である。図１４Ｂは、分離後の電気泳動的ゲルのポジ写真であり、また、図１４Ｃは、図１４Ｂの写真のネガ写真である。図１４Ｂは、特許明細書に添付する図面として適当な再現性のある無彩色スケールの写真画像におけるデータをより明瞭に示す。当該方法に関する実施例においては、比較の目的のために、反応成分又は試薬成分の種々の組み合わせについて試験した。ゲルは、１０個の平行なチャネルを有するように調製した。各々のチャネル内の緩衝液を以下のリストに示す。
【０２０５】
１：約１０個の塩基対（ｂｐ）単位を有するオリゴマーの校正はしご（「明線」で示す成分は１００ｂｐに対応する）
２：被検体オリゴマー１４１（約５４ｂｐ）
３：捕獲配列１４２（約１０２ｂｐ）とハイブリッド形成された被検体１４１
４：配列１４２とハイブリッド形成された被検体１４１（低濃度の酵素を含む）
５：配列１４２とハイブリッド形成された被検体１４１（高濃度の酵素を含む）
６：被検体オリゴマー１４１
７：アンプリファイア／被検体複合体１４５（約１２１ｂｐ）
８：アンプリファイア／被検体複合体１４５（低濃度の酵素を含む）
９：アンプリファイア／被検体複合体１４５（高濃度の酵素を含む）
１０：オリゴマーの校正はしご
【０２０６】
図１４Ｂと図１４Ｃから理解されるように、酵素による消化生成物であるレポーター１４７は、酵素を含まない複合体に対応するチャネル７の内部においては識別されないが、酵素による消化反応混合物に対応するチャネル８と９の内部における１９量体のレベルにおいては容易に識別される。当業者であれば、酵素の濃度やその他の反応条件を、過度の実験を行うことなく、この種の被検体の簡便で感度と選択性の高い検出を促進するために最適化できることを容易に認識できる。
【０２０７】
ヘアピン型プローブ集合体
本発明の観点を有する別の実施態様においては、プローブ集合体の個々の捕獲部分とレポーター部分を省略してもよい。図１５Ａ〜図１５Ｃは、ヘアピン型プローブ集合体の例を示す。この実施例においては、該プローブ集合体は共線的ポリヌクレオチド鎖１５２を含んでおり、該ポリヌクレオチド鎖は捕獲部分Ａ’（該捕獲部分は、被検体鎖１５１の標的Ａに対して相補的である）とレポーター部分を含む。該レポーター部分は、鎖１５２のいずれかの簡便な部位上に配置されるか、又は該部位に隣接する１又は複数の標識又はその他の検出強化体（例えば、蛍光性マーカー基等）を有していてもよい。この実施例においては、マーカー１５４は鎖１５２の中央部分に配置されているが、その他の部分、例えば３’末端に隣接する部分に配置させてもよい。
【０２０８】
図１５Ａに示すように、鎖１５２は少なくとも１つの付加的部分Ａ''を含んでおり、該付加的部分は、テンプレート種１５１の標的部分Ａと会合しないときに部分Ａ’とＡ''が自己ハイブリッド形成することによって、例えば、ヘアピン様の立体構造体を形成するような程度のハイブリッド形成に対する親和性を有するので、選択された酵素による分解から保護される。この実施例においては、ヘアピン形態の鎖１５２は突出状５’末端を有するので、活性開始のためには非突出状５’末端を有する複合体を必要とする酵素１４６（例えば、エンドヌクレアーゼ等）から保護される。
【０２０９】
図１５Ｂに示すように、プローブ鎖１５２が標的鎖１５１と会合すると、標的Ａに対するＡ’の親和性は、酵素１４６によって攻撃される非突出状５’末端を有するように鎖１５１と鎖１５２が会合した状態の複合体１５０の生成が有意になるように平衡を移動させる。
【０２１０】
図１５Ｃに示すように、酵素分解反応は、短鎖１５２が放出されるまで続行する。次いで、標的１５１はさらなる増幅のために利用される。多段階法においては、放出される鎖１５２’は、適当に設計されたアンプリファイアのためのテンプレートとして利用してもよい。
【０２１１】
以上の記載においては、本発明の好ましい実施態様と方法に関して説明したが、当業者には明らかなように、一定の利点が達成されている。また、本発明の技術的思想の範囲内においてこれらの実施態様の種々の修正、改変及び代替的態様を実行してもよいことは当業者には理解できる事項である。
【図面の簡単な説明】
【０２１２】
【図１Ａ】非常に少量の標的被検体に応答してレポーター分子が増幅して放出された後に、該レポーター分子の量を電子的に検出する装置と方法に係る模式図であり、試料を捕集して調製する過程を示す。
【図１Ｂ】試料媒体を入口へ塗布するためのアプリケーターを具備する液体系の内部において試料を処理する装置の模式図である。
【図１Ｃ（ｉ）】プローブ集合体を保有する容器の内部に収容されたポリヌクレオチド物質を含有する試料媒体の模式図である。
【図１Ｃ（ｉｉ）】プローブ集合体と標的被検体の詳細な模式図である。
【図１Ｄ（ｉ）】プローブ／被検体複合体を形成する液状系を保有する容器又はセルの模式図である。
【図１Ｄ（ｉｉ）】プローブ／被検体の詳細な模式図である。
【図１Ｅ】図１Ｄ（i）に示す容器又はセルの内部において、所望によるすすぎ過程又は洗浄過程が可能となるように、基体が不動化又は固定的に配置された状態を示す模式図である。
【図１Ｆ（ｉ）】容器又はセルの内部において、プローブ／被検体複合体をエキソヌクレアーゼで処理する状態の模式図である。
【図１Ｆ（ｉｉ）】プローブ／被検体複合体にエキソヌクレアーゼが作用する状態の詳細な模式図である。
【図１Ｆ（ｉｉｉ）】捕獲配列の脱離によって被検体分子が放出されるように進行中のプローブ分子の分解過程を示す模式図である。
【図１Ｇ（ｉ）】ナノコード配列の脱離によってレポーター分子が放出されたプローブ分子の完結した分解を示す模式図である。
【図１Ｇ（ｉｉ）】蓄積したレポーター分子が、ナノ電子的センサーを具備する隣接する検出セル内へ流れる状態を示す模式図である。
【図１Ｈ】レポーター分子と検出プローブとのハイブリッド形成に起因するセンサーの電子的特性の変化に基づいてレポーター分子を検出するための測定系の模式図である。
【図２Ａ】標的被検体ポリヌクレオチドを含む試料媒体の模式図である。
【図２Ｂ】図２Ａの構成要素を示す模式図である。
【図２Ｃ】図２Ｂに示す被検体／アンプリファイア複合体へエキソヌクレアーゼが作用する状態を示す模式図である。
【図２Ｄ】図２Ｃに示す被検体／アンプリファ９ア複合体から未変性被検体が放出される状態を示す模式図である。
【図２Ｅ】図２Ｃに示す被検体／アンプリファ９ア複合体からオリゴヌクレオチドが放出される状態を示す模式図である。
【図２Ｆ】図２Ｅの構成要素を示す模式図である。
【図２Ｇ】図２Ｆの構成要素を示す模式図である。
【図２Ｈ】図２Ｇの構成要素を示す模式図である。
【図３Ａ】合成標的の放出を誘発させるために単一の被検体捕獲配列を使用する増幅方法の結果を示す模式図である。
【図３Ｂ】合成標的の放出を誘発させるために複数の被検体捕獲配列を使用する増幅方法の結果を示す模式図である。
【図３Ｃ】表１と表２に示すデータを用いて作製したグラフである。
【図４Ａ】レポーターの増幅と精製のための装置と方法に係る模式図であり、基体に結合しない修飾されたレポータープローブが使用される。
【図４Ｂ】レポーターの増幅と精製のための装置と方法に係る模式図であり、ナノ電子的検出の前に、放出されたレポーターは精製される。
【図５Ａ】予備的増幅精製過程を含む指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす装置と方法に係る模式図であり、初期固定化段階を示す。
【図５Ｂ】予備的増幅精製過程を含む指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす装置と方法に係る模式図であり、精製段階を示す。
【図５Ｃ】予備的増幅精製過程を含む指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす装置と方法に係る模式図であり、インキュベーション段階を示す。
【図５Ｄ】予備的増幅精製過程を含む指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす装置と方法に係る模式図であり、エキソヌクレアーゼ増幅段階を示す。
【図５Ｅ】予備的増幅精製過程を含む指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす装置と方法に係る模式図であり、レポーター放出段階を示す。
【図６Ａ】分析用媒体からエキソヌクレアーゼを除去した後で指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす装置と方法に係る模式図であり、エキソヌクレアーゼ増幅段階を示す。
【図６Ｂ】分析用媒体からエキソヌクレアーゼを除去した後で指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす装置と方法に係る模式図であり、精製段階を示す。
【図６Ｃ】分析用媒体からエキソヌクレアーゼを除去した後で指数関数的な被検体−応答増幅をもたらす装置と方法に係る模式図であり、プローブ変性段階を示す。
【図７】図７Ａは本発明に係る内部阻害基を含むレポータープローブの模式図である。 図７Ｂは図７Ａの構成要素を示す模式図であり、エキソヌクレアーゼがさらに付加される。 図７Ｃは図７Ｂの構成要素を示す模式図であり、エキソヌクレアーゼは連鎖レポーターの分解を続行する。 図７Ｄは図７Ｃの構成要素を示す模式図であり、エキソヌクレアーゼは、耐性結合に達すると、プローブ／被検体複合体から離脱する。 図７Ｅは相補的なサンドウィッチ型プローブを用いる所望による精製過程に係る模式図である。 図７Ｆはナノ電子的センサーによってレポーターを検出するための装置の模式図である。
【図８Ａ】多重型レポーターとマトリックスと検出器セルを用いる多種被検体アッセイを含む装置と方法に係る模式図であり、多被検体アッセイのフローチャートを示す。
【図８Ｂ】多種被検体アッセイ用のマトリックス検出セルを示す模式図である。
【図９Ａ】生体分子を検出するためのアプタマー部分を含むプローブ集合体を使用する方法に係る模式図であり、プローブの保護に適合したアプタマーを示す。
【図９Ｂ】生体分子を検出するためのアプタマー部分を含むプローブ集合体を使用する方法に係る模式図であり、アプタマーの被検体への結合とプローブの暴露を示す。
【図９Ｃ】生体分子を検出するためのアプタマー部分を含むプローブ集合体を使用する方法に係る模式図であり、プローブの分解とレポーターの放出を示す。
【図１０−１】図１０ａはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、試料測定の初期状態を示す。 図１０ｂはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、アンプリファイアＩは被検体鎖との二重会合状態で示される。 図１０ｃはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、当該方法の段階１の酵素分解が完結した状態を示す。
【図１０−２】図１０ｄはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、当該方法の段階２の開始状態を示す。 図１０ｅはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、アンプリファイアIIはコンパニオン鎖との二重会合状態で示される。 図１０ｆはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、当該方法の段階２の酵素分解が完結した状態を示す。
【図１０−３】図１０ｇはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、当該方法の段階３の開始状態を示す。 図１０ｈはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、アンプリファイアＩは被検体鎖との二重会合状態で示され、また、アンプリファイアIIはコンパニオン鎖との二重会合状態で示される。 図１０ｉはアンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の二段階法の実施態様を示す模式図であり、当該方法の段階３の酵素分解が完結した状態を示す。
【図１１】図１０ａ〜図１０ｉに示す方法に対応する実験データに基づいて作製したグラフである。
【図１２Ａ】アンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の三段階法の実施態様を示す模式図であり、アンプリファイア＃１の使用状態を示す。
【図１２Ｂ】アンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の三段階法の実施態様を示す模式図であり、アンプリファイア＃２の使用状態を示す。
【図１２Ｃ】アンプリコン及び／又はレポーター種を生成させるように標的によって開始される増幅の三段階法の実施態様を示す模式図であり、アンプリファイア＃３の使用状態を示す。
【図１３】図１２Ａ〜図１２Ｃに示す方法に対応する実験データに基づいて作製したグラフである。
【図１４】図１４Ａは蛍光検出法を利用する単一標的増幅法の実施態様を示す模式図であり、アンプリファイア／被検体複合体を示す。 図１４Ｂは蛍光検出法を利用する単一標的増幅法による結果と増幅生成物を示す電気泳動ゲルの写真である。 図１４Ｃは図１４Ｂに示す写真の陰画である。
【図１５Ａ】ヘアピン型のプローブ集合体の実施態様を示す模式図であり、プローブ鎖は少なくとも１つの付加的部分を有する。
【図１５Ｂ】ヘアピン型のプローブ集合体の実施態様を示す模式図であり、プローブ鎖は標的鎖と会合する。
【図１５Ｃ】ヘアピン型のプローブ集合体の実施態様を示す模式図であり、酵素分解反応はプローブ鎖が放出されるまで続行する。
【符号の説明】
【０２１３】
１１ 試料アプリケーター
１２ 溶解緩衝液又は媒体
１３ 容器
１４ ウイルス性物質
１５ ポリヌクレオチド物質
１７ 反応媒体
２０ 液状系
２３ 反応セル
２５ 検出セル
３０ プローブ集合体
３２ 基体
３４ プローブポリヌクレオチド
３５ レポーターオリゴヌクレオチド
３６ プローブ／被検体複合体
３７ エキソヌクレアーゼ
４０ ナノ電子的センサー
４１ 検出プローブ
４２ 回路
５０ 被検体ポリヌクレオチド
５１ Ａアンプリファイア
５２ 合成オリゴヌクレオチド
５３ 第２オリゴヌクレオチド
５４ Ｂアンプリファイア
５７ アンプリファイア／被検体複合体
５８ 合成Ａ標的／アンプリファイア複合体
５９ 合成Ｂ標的／アンプリファイア複合体
６１ レポータープローブ
６２ レポータープローブ
７１ 基体
７６ 被検体／アンプリファイア複合体
７７ 合成標的Ａ／アンプリファイア複合体
７９ サンドウィッチ型プローブ
８１ プロスチンプローブ
９０ プローブ
９１ 連鎖レポーターオリゴヌクレオチド
９２ コンパニオンオリゴヌクレオチド
９５ レポーター配列
９６ コンパニオンアンカー配列
１００ 検出セル
１０４ ナノ構造素子
１０６ 基体
１０７ 誘電層
１１０ プローブ集合体
１１１ 被検体
１１２ アプタマー
１１４ 塩基配列
１２０ 被検体ポリヌクレオチド鎖
１２１ 捕獲鎖
１２２ コンパニオン鎖
１２３ 捕獲鎖
１２４ コンパニオン鎖
１２５ 捕獲鎖
１２６ コンパニオン鎖
１２７ 捕獲鎖
１２８ コンパニオン鎖
１２９ 捕獲鎖
１３０ コンパニオン鎖
１４１ 被検体
１４２ 捕獲鎖
１４７ レポーター鎖
１４４ ＦＡＭ蛍光性基
１５１ 標的鎖
１５２ 共線的ポリヌクレオチド鎖
１５４ マーカー
【図１Ａ−１Ｃ（ｉ）】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子のテンプレート種を含有する媒体中へのレポーター種の導入方法であって、該テンプレート種に対して結合親和性を有するプローブ集合体から非−ＰＣＲ／テンプレート−誘発／酵素活性化によって該レポーター種を放出させることを含み、下記の操作過程（ａ）〜（ｃ）を含む該導入方法：
（ａ）下記の要件（i）〜（iv）を満たす第１プローブ集合体を少なくとも１つ供給する：
（i）テンプレート種の標的部分に対して選択的な結合親和性を付与する捕獲ヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの第１プローブ鎖を含む；
（ii）プローブ鎖の対応する結合部分とハイブリッド形成するように設計されたポリヌクレオチド配列を有する結合部分を含む少なくとも１つの第１レポーター種を含む；
（iii）第１プローブ集合体は、ポリヌクレオチド重複プローブ集合体を含むようにハイブリッド形成された少なくとも１つの第１プローブ鎖と少なくとも１つの第１レポーター種を含む；
（iv）重複プローブ集合体は、プローブ鎖の全部又は一部を分解してプローブ集合体から第１レポーター種を放出させるのに十分なヌクレアーゼ活性を有する選択された酵素の作用を促進するのに適合した少なくとも１つの酵素−開始部位であって、捕獲ヌクレオチド配列がテンプレート種の選択された標的部分の全部又は一部と結合してテンプレート−プローブ複合体を形成するときに形成される該酵素−開始部位を有するように設計される；
（ｂ）テンプレート種の選択された標的部分をプローブポリヌクレオチドの捕獲ヌクレオチド配列部分へ結合させることによって酵素−開始部位を有する第１テンプレート−プローブ複合体を形成させる反応を促進するために有効な条件下において、媒体を少なくとも１つの第１プローブ集合体と接触させる：
（ｃ）酵素−開始部位における酵素のヌクレアーゼ活性を促進するために有効な条件下において、媒体を少なくとも選択された酵素と接触させ、第１テンプレート−プローブ複合体が過程（ｂ）において形成されたときに第１プローブ鎖が分解され、第１レポーター種がプローブ集合体から放出される。
【請求項２】
生体分子のテンプレート種が試料中に被検体種を含み、第１レポーター種が、プローブ集合体から放出されたときに直接的又は間接的に検出されるように設計され、下記の過程（ｄ）及び（ｅ）をさらに含む請求項１記載の方法：
（ｄ）放出される第１レポーター種を直接的又は間接的に検出する；
（ｅ）第１レポーター種の直接的又は間接的検出に基づいて、試料中の被検体種の少なくとも存在又は濃度を測定する。
【請求項３】
第１レポーター種が、第１プローブ集合体から放出されたときに直接的に検出されるように設計される請求項２記載の方法。
【請求項４】
第１レポーター種が、少なくとも１つの検出可能なポリヌクレオチド配列又は検出可能な標識基を含む少なくとも１つの検出部分を含む請求項３記載の方法。
【請求項５】
第１レポーター種が、第１プローブ集合体から放出されたときに間接的に検出されるように設計される請求項２記載の方法。
【請求項６】
第１レポーター種が、第１レポーター種のテンプレート部分に対して結合親和性を有する第２プローブ集合体から第２レポーター種を少なくとも１つの第２の非ＰＣＲ／テンプレート−誘導化／酵素活性化方式で放出させることに対する標的テンプレートとして作用するよう設計されたテンプレート部分を含む請求項５記載の方法。
【請求項７】
第２レポーター種が、第２プローブ集合体から放出されたときに直接的に検出されるように設計される請求項６記載の方法。
【請求項８】
第１レポーター種が、第１プローブ集合体から放出されたときに間接的に検出されるような形態を有し、第２レポーター種が、第２レポーター種のテンプレート部分に対して結合親和性を有する第３プローブ集合体から第３レポーター種を少なくとも１つの第３の非ＰＣＲ／テンプレート−誘導化／酵素活性化方式で放出させることに対する標的テンプレートとして作用するような形態を有するテンプレート部分を含む請求項６記載の方法。
【請求項９】
生体分子テンプレート種が少なくとも非ポリヌクレオチド部分を含み、第１プローブ集合体の捕獲ヌクレオチド配列がアプタマーを含み、選択的結合親和性が、アプタマーと少なくとも非ポリヌクレオチドとの結合相互作用を含む請求項１記載の方法。
【請求項１０】
生体分子のテンプレート種が少なくともポリヌクレオチド部分を含み、第１プローブ鎖の捕獲ヌクレオチド配列が、相補的ヌクレオチドのハイブリッド形成によってテンプレート種の標的部分に対して選択的結合親和性を付与する請求項１記載の方法。
【請求項１１】
第１プローブ鎖と第１レポーター種が共直線性ポリヌクレオチド鎖を含み、該共直線性ポリヌクレオチド鎖の複数の部分が、テンプレート種の標的部分と結合せずに選択された酵素による分解から保護されるように自己ハイブリッド形成するような形態を有する請求項１記載の方法。
【請求項１２】
下記の過程（ａ）〜（ｅ）を含む、試料中の被検体であるポリヌクレオチドの検出方法：
（ａ）下記の要件（i）〜（iv）を満たす第１プローブ集合体を少なくとも１つ供給する：
（i）被検体の選択された標的ヌクレオチド部分に対して選択的なハイブリッド形成親和性を付与する捕獲ヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの第１ポリヌクレオチドプローブストランド；
（ii）プローブストランドの対応する結合部分とハイブリッド形成するように設計されたポリヌクレオチド配列を有する結合部分を含む少なくとも１つの第１レポーター鎖を含む；
（iii）第１プローブ集合体は、ポリヌクレオチド重複プローブ集合体を含むようにハイブリッド形成された少なくとも１つの第１プローブ鎖と少なくとも１つの第１レポーターを含む；
（iv）重複プローブ集合体は、プローブ鎖の全部又は一部を分解してプローブ集合体から第１レポーター鎖を放出させるのに十分なヌクレアーゼ活性を有する選択された酵素の作用を促進するのに適合した少なくとも１つの酵素−開始部位であって、捕獲ヌクレオチド配列が被検体の標的ヌクレオチド部分の全部又は一部とハイブリッド形成して重複被検体−プローブ複合体を形成するときに形成される該酵素−開始部位を有するように設計される；
（ｂ）標的ヌクレオチド部分をプローブポリヌクレオチドの捕獲ヌクレオチド配列部分へ結合させることによって酵素−開始部位を有する第１被検体−プローブ複合体を形成させる反応を促進するために有効な条件下において、試料を少なくとも１つの第１プローブ集合体と接触させる；
（ｃ）酵素−開始部位における酵素のヌクレアーゼ活性を促進するために有効な条件下において、試料を少なくとも選択された酵素と接触させ、第１被検体−プローブ複合体が過程（ｂ）において形成されたときに第１プローブ鎖が分解され、第１レポーター鎖がプローブ集合体から放出される；
（ｄ）放出されたレポーター鎖を直接的又は間接的に検出する；
（ｅ）レポーター鎖の直接的又は間接的検出に基づいて、被検体の少なくとも存在又は濃度を測定する。
【請求項１３】
下記の過程（ａ）〜（ｅ）を含む、試料中の被検体であるポリヌクレオチドの検出方法：
（ａ）下記の要素（i）〜（iv）を含む第１プローブ集合体を少なくとも１つ供給する：
（i）基体；
（ii）隣接位の５’−末端ヌクレオチドと遠位の３’−末端ヌクレオチドを含む少なくとも１種のプローブポリヌクレオチドであって、該隣接位の５’−末端ヌクレオチドが基体に隣接して結合すると共に少なくとも１種のナノコードヌクレオチド配列部分及び被検体であるポリヌクレオチドの対応する標的ヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する捕獲ヌクレオチド配列部分を含む該プローブポリヌクレオチド；
（iii）プローブポリヌクレオチドのナノコード配列に対して相補的はヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの第１レポーターポリヌクレオチドであって、ナノコード配列とハイブリッド形成することによってプローブポリヌクレオチドと重複部分を形成する該第１レポーターポリヌクレオチド；
（iv）捕獲ヌクレオチド配列部分と３’−末端ヌクレオチドが第１レポーターポリヌクレオチドの重複部分から遠位へ延びるように配置されたプローブポリヌクレオチド；
（ｂ）被検体であるポリヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列をプローブポリヌクレオチドの捕獲ヌクレオチド配列部分と結合させることによって、下記の成分（i）〜（iii）を含有する重複第１プローブ／被検体複合体を形成させるために有効な条件下において、第１プローブ集合体を被検体であるポリヌクレオチドを含有すると推定される試料と接触させる：
（i）第１プローブ集合体；
（ii）少なくとも１種のポリヌクレオチド被検体；
（iii）遠位へ延びて平滑な遠位の５’−末端（１）又は突出する遠位の５’−末端（２）を形成するポリヌクレオチド被検体；
（ｃ）第１プローブ／被検体複合体を、二重鎖ＤＮＡへの特異的結合とその後のＤＮＡ重複部の３’−末端鎖の選択的加水分解を含む３’−対−５’エキソ−デオキシリボヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼと接触させる；
（ｄ）エキソヌクレアーゼを第１プローブ／被検体複合体へ結合させるために有効であると共に、第１プローブ／被検体複合体の遠位の３’−末端鎖をエキソヌクレアーゼで加水分解させることによってポリヌクレオチド被検体と少なくとも第１レポーターポリヌクレオチドを第１の重複プローブ／被検体複合体から放出させるために有効な条件を維持する；
（ｅ）エキソヌクレアーゼによる加水分解によって放出される少なくとも第１レポーターポリヌクレオチドの存在を検出することによって、試料中のポリヌクレオチド被検体の存在を測定する。
【請求項１４】
下記の過程（ｆ）〜（ｊ）をさらに含む請求項１３記載の方法：
（ｆ）下記の要素（i）〜（iv）を含む第２プローブ集合体を少なくとも１つ供給する；
（i）第１プローブ集合体の場合と同一の基体（１）又は第１プローブ集合体の場合と異なる基体（２）；
（ii）隣接位の５’−末端ヌクレオチドと遠位の３’−末端ヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブポリヌクレオチドであって、該隣接位の５’−末端ヌクレオチドが基体に隣接して結合すると共に少なくとも１つのナノコードヌクレオチド配列部分及び被検体であるポリヌクレオチドの対応する標的ヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する捕獲ヌクレオチド配列部分を含む該プローブポリヌクレオチド；
（iii）プローブポリヌクレオチドのナノコード配列に対して相補的はヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの第２レポーターポリヌクレオチドであって、ナノコード配列とハイブリッド形成することによってプローブポリヌクレオチドと重複部分を形成する該第２レポーターポリヌクレオチド；
（iv）捕獲ヌクレオチド配列部分と３’−末端ヌクレオチドが第２レポーターポリヌクレオチドの重複部分から遠位へ延びるように配置されたプローブポリヌクレオチド；
（ｇ）過程（ｄ）においてポリヌクレオチド被検体を放出させた後、放出されたポリヌクレオチド被検体の標的ヌクレオチド配列を第２プローブ集合体のプローブポリヌクレオチドの捕獲ヌクレオチド配列部分と結合させることによって第２重複プローブ／被検体複合体を形成させるために有効な条件下において、過程（ｄ）で放出されたポリヌクレオチド被検体を含有する試料を第２プローブ集合体と接触させる；
（ｈ）第２プローブ／被検体複合体を、二重鎖ＤＮＡへの特異的結合とその後のＤＮＡ重複部の３’−末端鎖の選択的加水分解を含む３’−対−５’エキソ−デオキシリボヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼと接触させる；
（ｉ）エキソヌクレアーゼを第２プローブ／被検体複合体へ結合させるために有効であると共に、第２プローブ／被検体複合体の遠位の３’−末端ストランドをエキソヌクレアーゼで加水分解させることによってポリヌクレオチド被検体と少なくとも第２レポーターポリヌクレオチドを第２重複プローブ／被検体複合体から放出させるために有効な条件を維持する；
（ｊ）過程（ｅ）の場合のように、第１重複プローブ／被検体複合体から放出された第１レポーターポリヌクレオチド及び第２重複プローブ／被検体複合体から放出された第２レポーターポリヌクレオチドの少なくとも両方の存在を検出することによって、試料中のポリヌクレオチド被検体の存在を測定する。
【請求項１５】
下記の過程（ｋ）及び（ｌ）をさらに含む請求項１４記載の方法：
（ｋ）過程（ｄ）の後に放出されたレポーターポリヌクレオチドの存在量に比べて、放出されたレポーターポリヌクレオチドの存在量が少なくとも約１桁増加するまで請求項２記載の過程（ｆ）〜（ｉ）の操作を反復することによって、増幅された量の放出レポーターポリヌクレオチドを存在させる；
（ｌ）過程（ｅ）の場合のように、増幅された量の放出レポーターポリヌクレオチドの存在を検出することによって、試料中のポリヌクレオチド被検体の存在を測定する。
【請求項１６】
方法が、３’末端と５’末端が請求項１３の定義とは逆転する下記の要件（ａ）〜（ｅ）によって規定される鏡像法である請求項１４記載の方法：
（ａ）基体は、プローブポリヌクレオチドの隣接位の３’末端に隣接して結合する。
（ｂ）第１プローブ／被検体複合体の遠位の末端はポリヌクレオチド被検体を含み、該被検体は遠位へ延びて平滑な遠位の３’−末端（１）又は突出する遠位の３’−末端（２）を形成する。
（ｃ）エキソヌクレアーゼは、二重鎖ＤＮＡと特異的に結合した後、ＤＮＡ重複体の５’末端鎖の選択的加水分解を含む５’−対−３’エキソ−デオキシリボヌクレアーゼ活性を有する。
（ｄ）この方法は、プローブ／被検体の５’末端ストランドを加水分解してポリヌクレオチド被検体と少なくとも第１レポーターポリヌクレオチドを放出するために有効な条件を維持することを含む。
（ｅ）この方法は、エキソヌクレアーゼによる５’−対−３’加水分解によって放出されるレポーターポリヌクレオチドの存在を検出することによって、試料中のポリヌクレオチド被検体の存在を測定することを含む。
【請求項１７】
過程（ｅ）におけるレポーターポリヌクレオチドの検出を、下記の構成要素（ａ）及び（ｂ）を具備する電子的センサーシステムの操作によって行う請求項１３記載の方法：
（ａ）少なくとも１種の電気的特性を有する少なくとも１つのセンサープラットホームであって、下記の構成要素（i）〜（iv）を具備する該センサープラットホーム：
（i）基体、
（ii）該基体に隣接して配設された少なくとも１つの電極、
（iii）該基体に隣接して配設されると共に該電極と電気的に接続する少なくとも１つのナノ構造化素子、及び
（iv）ナノ構造化素子と機能的に連絡する少なくとも１つの検出プローブであって、レポーターポリヌクレオチドの対応するヌクレオチド配列に対して相補的な少なくとも１つのヌクレオチド配列を有すると共に、少なくとも第１レポーターポリヌクレオチドと結合するような構造を有する検出ポリヌクレオチドを含む該検出プローブ、並びに
（ｂ）少なくとも１つの電極に接続されると共に、検出プローブと少なくともレポーターポリヌクレオチドとの結合に起因するセンサープラットホームの少なくとも１つの電気的特性の変化を測定するような構造を有する電子的測定用回路部品。
【請求項１８】
過程（ｂ）における第１プローブ／被検体複合体の形成後の下記の過程をさらに含む請求項１３記載の方法：
（ｍ）第１プローブ／被検体複合体から試料を分離させ、
（ｎ）その後の過程を、試料とは異なる１種又は複数種の媒体中でおこなう。
【請求項１９】
過程（ｎ）における試料の分離後の下記の過程（ｏ）をさらに含む請求項１８記載の方法：
（ｏ）過程（ｐ）の前に、第１プローブ／被検体複合体をすすぐ。
【請求項２０】
過程（ａ）における少なくとも１つの第１プローブ集合体を供給することが複数のプローブ集合体を供給することを含み、
（i）各々のプローブ集合体の基体が、（１）複数のプローブ集合体の別のプローブ集合体と共通の基体であるか、又は（２）複数のプローブ集合体の別のプローブ集合体の基体とは異なる基体であり、
（ii）複数のプローブ集合体が、試料中に存在する被検体であるポリヌクレオチド分子の実質的な量の分子が過程（ｂ）の実施において結合して対応する複数のプローブ／被検体複合体を形成するために十分である。
【請求項２１】
１よりも多い複数のプローブ集合体が共通の基体を含む請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
基体が磁気ビーズを含有し、過程（ｍ）において第１プローブ／被検体複合体から試料を分離させる過程が、該ビーズに磁気的な作用を及ぼすことを含む請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
基体が荷電種を含む粒子を含有し、過程（ｍ）において第１プローブ／被検体複合体から試料を分離させる過程が、該粒子に電気泳動的な作用を及ぼすことを含む請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
基体が選択されたサイズを有する粒子を含有し、過程（ｍ）において第１プローブ／被検体複合体から試料を分離させる過程が、試料から該粒子を濾過することを含む請求項１８記載の方法。
【請求項２５】
基体が表面を有し、過程（ｍ）において第１プローブ／被検体複合体から試料を分離させる過程が、該表面に対して試料を流動させることを含む請求項１８記載の方法。
【請求項２６】
表面が微少量な液状収容物の少なくとも一部を含む請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
第１プローブ集合体が、過程（ｄ）で放出される複数のレポーターポリヌクレオチドを含む請求項１３記載の方法。
【請求項２８】
過程（ｃ）の前に、試料を処理することによって、試料中に含まれるエキソヌクレアーゼを不活性化するか、又は該酵素を除去する過程をさらに含む請求項１３記載の方法。
【請求項２９】
試料中の複数の被検ポリヌクレオチド種を検出して区別する方法であって、下記の過程（ａ）〜（ｅ）を含む該方法：
（ａ）請求項１３に規定された第１プローブ集合体であって、第１型のレポーターポリヌクレオチド及び第１被検ポリヌクレオチド種に対して特異的な標的ヌクレオチド配列に対して相補的な捕獲ヌクレオチド配列を含む該第１プローブ集合体を供給し、
（ｂ）請求項１に規定された第２プローブ集合体であって、第２型のレポーターポリヌクレオチド及び第２被検ポリヌクレオチド種に対して特異的な標的ヌクレオチド配列に対して相補的な捕獲ヌクレオチド配列を含む該第２プローブ集合体を少なくとも１つ供給し、
（ｃ）請求項１記載の過程（ｂ）〜（ｄ）を実行することによって、第１被検体が存在するときには試料中の第１被検ポリヌクレオチド種の存在に応答して第１型のレポーターポリヌクレオチド種を放出させ、第２被検体が存在するときには試料中の第２被検ポリヌクレオチド種の存在に応答して第２型のレポーターポリヌクレオチド種を放出させ、
（ｄ）エキソヌクレアーゼによる加水分解によって放出された第１型のレポーターポリヌクレオチドの存在を検出することにより、試料中の第１被検ポリヌクレオチドの存在を決定し、
（ｅ）過程（ｄ）における第１型のレポーターポリヌクレオチドの検出とは異なる検出であって、エキソヌクレアーゼによる加水分解によって放出された第２型のレポーターポリヌクレオチドの存在の検出により、試料中の第２被検ポリヌクレオチドの存在を決定する。
【請求項３０】
過程（ｄ）及び（ｅ）におけるレポーターポリヌクレオチドの検出を、下記の構成要素１）〜３）を具備する電子的センサーシステムの操作によって行う請求項２９記載の方法：
１）少なくとも１種の電気的特性を有する第１センサープラットホームであって、下記の構成要素（i）〜（iv）を具備する該第１センサープラットホーム：
（i）基体、
（ii）該基体に隣接して配設された少なくとも１つの電極、
（iii）該基体に隣接して配設されると共に該電極と電気的に接続する少なくとも１つのナノ構造化素子、及び
（iv）ナノ構造化素子と機能的に連絡する少なくとも１つの検出プローブであって、第１型のレポーターポリヌクレオチドの対応するヌクレオチド配列に対して相補的な少なくとも１つのヌクレオチド配列を有すると共に、少なくとも第１型のレポーターポリヌクレオチドと結合するような構造を有する第１型の検出ポリヌクレオチドを含む該検出プローブ；
２）少なくとも１種の電気的特性を有する第２センサープラットホームであって、下記の構成要素（i）〜（iv）を具備する該第２センサープラットホーム：
（i）基体であって、（１）第１センサープラットホームと共通の基体又は（２）第１センサープラットホームの基体とは異なる基体である該基体、
（ii）該基体に隣接して配設された少なくとも１つの電極、
（iii）該基体に隣接して配設されると共に該電極と電気的に接続する少なくとも１つのナノ構造化素子、及び
（iv）ナノ構造化素子と機能的に連絡する少なくとも１つの検出プローブであって、第１型のレポーターポリヌクレオチドの対応するヌクレオチド配列に対して相補的な少なくとも１つのヌクレオチド配列を有すると共に、少なくとも第１型のレポーターポリヌクレオチドと結合するような構造を有する第１型の検出ポリヌクレオチドを含む該検出プローブ；
３）第１センサープラットホームと第２センサープラットホームの少なくとも１つの電極に接続されると共に、下記の機能（i）及び（ii）を有するような構造を有する電子的測定用回路部品：
（i）検出プローブと少なくとも第１型のレポーターポリヌクレオチドとの結合に起因する第１センサープラットホームの少なくとも１つの電気的特性の変化の少なくとも第１測定を行う；
（ii）該第１測定とは異なる第２測定であって、検出プローブと少なくとも第２型のレポーターポリヌクレオチドとの結合に起因する第２センサープラットホームの少なくとも１つの電気的特性の変化の第２測定を少なくとも行う。
【請求項３１】
試料中の複数の被検ポリヌクレオチド種を検出して区別する方法であって、下記の過程（ａ）〜（ｅ）を含む該方法：
（ａ）請求項１６に規定された第１プローブ集合体であって、第１型のレポーターポリヌクレオチド及び第１被検ポリヌクレオチド種に対して特異的な標的ヌクレオチド配列に対して相補的な捕獲ヌクレオチド配列を含む該第１プローブ集合体を供給し、
（ｂ）請求項４に規定された第２プローブ集合体であって、第２型のレポーターポリヌクレオチド及び第２被検ポリヌクレオチド種に対して特異的な標的ヌクレオチド配列に対して相補的な捕獲ヌクレオチド配列を含む該第２プローブ集合体を少なくとも１つ供給し、
（ｃ）請求項４記載の過程（ｂ）〜（ｄ）を実行することによって、試料中の第１被検ポリヌクレオチド種の存在に応答して第１型のレポーターポリヌクレオチド種を放出させ、試料中の第２被検ポリヌクレオチド種の存在に応答して第２型のレポーターポリヌクレオチド種を放出させ、
（ｄ）エキソヌクレアーゼによる加水分解によって放出された第１型のレポーターポリヌクレオチドの存在を検出することにより、試料中の第１被検ポリヌクレオチドの存在を決定し、
（ｅ）過程（ｄ）における第１型のレポーターポリヌクレオチドの検出とは異なる検出であって、エキソヌクレアーゼによる加水分解によって放出された第２型のレポーターポリヌクレオチドの存在の検出により、試料中の第２被検ポリヌクレオチドの存在を決定する。
【請求項３２】
過程（ｄ）及び（ｅ）におけるレポーターポリヌクレオチドの検出を、下記の構成要素１）〜３）を具備する電子的センサーシステムの操作によって行う請求項３１記載の方法：
（Ａ）少なくとも１種の電気的特性を有する第１センサープラットホームであって、下記の構成要素（i）〜（iv）を具備する該第１センサープラットホーム：
（i）基体、
（ii）該基体に隣接して配設された少なくとも１つの電極、
（iii）該基体に隣接して配設されると共に該電極と電気的に接続する少なくとも１つのナノ構造化素子、及び
（iv）ナノ構造化素子と機能的に連絡する少なくとも１つの検出プローブであって、第１型のレポーターポリヌクレオチドの対応するヌクレオチド配列に対して相補的な少なくとも１つのヌクレオチド配列を有すると共に、少なくとも第１型のレポーターポリヌクレオチドと結合するような構造を有する第１型の検出ポリヌクレオチドを含む該検出プローブ；
２）少なくとも１種の電気的特性を有する第２センサープラットホームであって、下記の構成要素（i）〜（iv）を具備する該第２センサープラットホーム：
（i）基体であって、（１）第１センサープラットホームと共通の基体又は（２）第１センサープラットホームの基体とは異なる基体である該基体、
（ii）該基体に隣接して配設された少なくとも１つの電極、
（iii）該基体に隣接して配設されると共に該電極と電気的に接続する少なくとも１つのナノ構造化素子、及び
（iv）ナノ構造化素子と機能的に連絡する少なくとも１つの検出プローブであって、第１型のレポーターポリヌクレオチドの対応するヌクレオチド配列に対して相補的な少なくとも１つのヌクレオチド配列を有すると共に、少なくとも第１型のレポーターポリヌクレオチドと結合するような構造を有する第１型の検出ポリヌクレオチドを含む該検出プローブ；
３）第１センサープラットホームと第２センサープラットホームの少なくとも１つの電極に接続されると共に、下記の機能（i）及び（ii）を有するような構造を有する電子的測定用回路部品：
（i）検出プローブと少なくとも第１型のレポーターポリヌクレオチドとの結合に起因する第１センサープラットホームの少なくとも１つの電気的特性の変化の少なくとも第１測定を行う；
（ii）該第１測定とは異なる第２測定であって、検出プローブと少なくとも第２型のレポーターポリヌクレオチドとの結合に起因する第２センサープラットホームの少なくとも１つの電気的特性の変化の第２測定を少なくとも行う。
【請求項３３】
試料中の被検ポリヌクレオチドの存在に応答することによって代表的な標的オリゴヌクレオチドを増幅して検出する方法であって、下記の過程（ａ）〜（ｅ）を含む該方法：
（ａ）被検ポリヌクレオチドの第１標的配列部分とハイブリッド形成するような構造を有すると共に、第１の代表的な標的オリゴヌクレオチド種を含む第１の重複オリゴヌクレオチドアンプリファイア集合体を少なくとも１つ供給し、
（ｂ）被検ポリヌクレオチドの第２標的配列部分とハイブリッド形成するような構造を有すると共に、第２の代表的な標的オリゴヌクレオチド種を含む第２の重複オリゴヌクレオチドアンプリファイア集合体を少なくとも１つ供給し、
（ｃ）配列のハイブリッド形成を促進するために有効な条件下において、第１アンプリファイア集合体と第２アンプリファイア集合体を被検ポリヌクレオチドと接触させることによって、第１アンプリファイア集合体及び第２アンプリファイア集合体の少なくとも一部分をそれぞれ被検ポリヌクレオチドの第１標的配列部分及び第２標的配列部分とハイブリッド形成させることにより、少なくとも１つのアンプリファイア／被検体複合体を形成させ、
（ｄ）ヌクレアーゼ活性を促進するために有効な条件下において、ヌクレアーゼを用いて少なくとも１つのアンプリファイア／被検体複合体を処理することによって、第１及び第２の代表的な標的オリグヌクレオチド種の少なくとも１つを、対応するアンプリファイア集合体とアンプリファイア／被検体複合体から放出させ、
（ｅ）少なくとも放出された代表的な標的オリゴヌクレオチソ種の存在を検出することによって、試料中の被検ポリヌクレオチドの存在を決定する。
【請求項３４】
下記の特徴１）及び２）を有する請求項３３記載の方法：
１）過程（ａ）における第１アンプリファイアポリヌクレオチド集合体が下記の構成要素（i）及び（ii）を含む：
（i）隣接する５’−末端ヌクレオチドと遠位の３’−末端ヌクレオチドを含む少なくとも１つの第１アンプリファイアポリヌクレオチドであって、ａ）被検ポリヌクレオチドの対応する標的配列部分（Ｂ）に対して相補的な少なくとも１つの遠位の捕獲配列部分（Ｂ’）、及びｂ）該捕獲配列部分（Ｂ’）とは異なる隣接する捕獲配列部分（Ａ’）であって、被検ポリヌクレオチドの対応する標的配列部分（Ａ）に対して相補的な少なくとも１つの該隣接捕獲配列部分を含む少なくとも１つの該第１アンプリファイアポリヌクレオチド、及び
（ii）隣接する３’−末端ヌクレオチドと遠位の５’−末端ヌクレオチドを含む第１コンパニオンポリヌクレオチドであって、第１アンプリファイアポリヌクレオチドの隣接捕獲配列部分（Ａ’）に対して相補的であると共に該隣接捕獲部分とハイブリッド形成する少なくとも１つの標的配列部分（Ａ''）を含む少なくとも１つの該第１コンパニオンポリヌクレオチド；
２）過程（ｂ）における第２アンプリファイア集合体が下記の構成要素（i）及び（ii）を含む：
（i）隣接する５’−末端ヌクレオチドと遠位の３’−末端ヌクレオチドを含む第２アンプリファイアポリヌクレオチドであって、ａ）第１アンプリファイアポリヌクレオチドの捕獲配列部分（Ａ’）の配列を実質的に有する少なくとも１つの遠位の捕獲配列部分、及びｂ）該遠位の捕獲配列部分とは異なる隣接する捕獲配列部分であって、第１アンプリファイアポリヌクレオチドの捕獲配列部分を実質的に含む該隣接捕獲配列部分を含む少なくとも１つの該第２アンプリファイアポリヌクレオチド、及び
（ii）隣接する３’−末端ヌクレオチドと遠位の５’−末端ヌクレオチドを含む第２コンパニオンポリヌクレオチドであって、第２アンプリファイアポリヌクレオチドの隣接捕獲配列部分に対して相補的であると共に該隣接捕獲部分とハイブリッド形成する少なくとも１つの標的配列部分（Ｂ''）を含む少なくとも１つの該第２コンパニオンポリヌクレオチド。
【請求項３５】
試料中の複数の被検ポリヌクレオチド種を検出して区別するためのアレイシステムであって、下記の構成要素（ａ）〜（ｄ）を具備する該アレイシステム：
（ａ）レポータープローブ及び／又はアンプリファイアと１種又は複数種の被検体種を含有すると推定される試料とを反応させるために適合した構造を有する反応セル、
（ｂ）レポーター及び／又は合成標的の少なくとも１つを精製するために、該反応セル又は別のセルの内部に配設された少なくとも１つの精製機構、
（ｃ）本願明細書に記載のナノ電子センサーのアレイ又はマトリックスであって、各々のセンサーが、複数の被検体から選択された１種を代表するレポーター又は合成標的に感知する認識材料（例えば、オリゴヌクレオチド相補的オリゴヌクレオチドを含有する検出プローブ）を含む該アレイ又はマトリックス。
（ｄ）試料中に複数の被検体が存在すると推定されたとしても、各々のセンサーに対して得られる信号から測定を行うような構造を有する測定用回路部品。
【請求項３６】
試料中の被検体を検出する方法であって、下記の過程（ａ）〜（ｅ）を含む該方法：
（ａ）選択されたヌクレアーゼを供給し、
（ｂ）被検体の標的部分へ結合するように適合した捕獲オリゴヌクレオチド配列及び被検体を代表するレポーターオリゴヌクレオチド配列を含むプローブ集合体を少なくとも１つ供給し（この場合、レポーターオリゴヌクレオチド配列と捕獲オリゴヌクレオチド配列が二重鎖部分を有する重複形態で供給され、該重複形態が単離においてヌクレアーゼへ提供されたときにヌクレアーゼによる分解に対して比較的高い耐性を示すような構造を有し、また、該重複形態が、捕獲オリゴヌクレオチド配列が被検体の標的部分へ結合して被検体／プローブ複合体を形成する形態中においてヌクレアーゼへ提供されたときにヌクレアーゼによる分解作用を比較的受けやすい構造を有し、さらに、ヌクレアーゼによる分解は、被検体／プローブ複合体から少なくともレポーターオリゴヌクレオチド配列が放出されるように十分に行われる）、
（ｃ）被検体の標的部分への捕獲オリゴヌクレオチド配列の結合を促進するために有効な条件下において、プローブ集合体を被検体と接触させることによって、被検体／プローブ複合体を形成させ、
（ｄ）ヌクレアーゼの活性を促進させるために有効な条件下において、被検体／プローブ複合体を被検体とヌクレアーゼと接触させることによって、プローブ集合体の二重鎖部分を分解させ、これによって、被検体／プローブ複合体から少なくともレポーターオリゴヌクレオチド配列を放出させ、
（ｅ）少なくとも放出されたレポーターオリゴヌクレオチド配列の存在を検出することによって、試料中の被検体の存在を測定する。
【請求項３７】
被検体がポリヌクレオチドを含有し、捕獲配列が、被検体の対応する標的配列に対して相補的な配列を含む請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
被検体が非ヌクレオチド生体分子を含有し、捕獲配列が、被検体の標的部分に対して特異的な結合能を有するアプタマーを含み、生体分子へアダプターを結合させる過程には、プローブ集合体の二重鎖部分をヌクレアーゼによる分解作用に付すことによって、被検体／プローブ複合体から少なくともレポーターオリゴヌクレオチドを放出させるようにアプタマーを変化させることが含まれる請求項３６記載の方法。
【請求項１】
生体分子のテンプレート種を含有する媒体中へのレポーター種の導入方法であって、該テンプレート種に対して結合親和性を有するプローブ集合体から非−ＰＣＲ／テンプレート−誘発／酵素活性化によって該レポーター種を放出させることを含み、下記の操作過程（ａ）〜（ｃ）を含む該導入方法：
（ａ）下記の要件（i）〜（iv）を満たす第１プローブ集合体を少なくとも１つ供給する：
（i）テンプレート種の標的部分に対して選択的な結合親和性を付与する捕獲ヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの第１プローブ鎖を含む；
（ii）プローブ鎖の対応する結合部分とハイブリッド形成するように設計されたポリヌクレオチド配列を有する結合部分を含む少なくとも１つの第１レポーター種を含む；
（iii）第１プローブ集合体は、ポリヌクレオチド重複プローブ集合体を含むようにハイブリッド形成された少なくとも１つの第１プローブ鎖と少なくとも１つの第１レポーター種を含む；
（iv）重複プローブ集合体は、プローブ鎖の全部又は一部を分解してプローブ集合体から第１レポーター種を放出させるのに十分なヌクレアーゼ活性を有する選択された酵素の作用を促進するのに適合した少なくとも１つの酵素−開始部位であって、捕獲ヌクレオチド配列がテンプレート種の選択された標的部分の全部又は一部と結合してテンプレート−プローブ複合体を形成するときに形成される該酵素−開始部位を有するように設計される；
（ｂ）テンプレート種の選択された標的部分をプローブポリヌクレオチドの捕獲ヌクレオチド配列部分へ結合させることによって酵素−開始部位を有する第１テンプレート−プローブ複合体を形成させる反応を促進するために有効な条件下において、媒体を少なくとも１つの第１プローブ集合体と接触させる：
（ｃ）酵素−開始部位における酵素のヌクレアーゼ活性を促進するために有効な条件下において、媒体を少なくとも選択された酵素と接触させ、第１テンプレート−プローブ複合体が過程（ｂ）において形成されたときに第１プローブ鎖が分解され、第１レポーター種がプローブ集合体から放出される。
【請求項２】
生体分子のテンプレート種が試料中に被検体種を含み、第１レポーター種が、プローブ集合体から放出されたときに直接的又は間接的に検出されるように設計され、下記の過程（ｄ）及び（ｅ）をさらに含む請求項１記載の方法：
（ｄ）放出される第１レポーター種を直接的又は間接的に検出する；
（ｅ）第１レポーター種の直接的又は間接的検出に基づいて、試料中の被検体種の少なくとも存在又は濃度を測定する。
【請求項３】
第１レポーター種が、第１プローブ集合体から放出されたときに直接的に検出されるように設計される請求項２記載の方法。
【請求項４】
第１レポーター種が、少なくとも１つの検出可能なポリヌクレオチド配列又は検出可能な標識基を含む少なくとも１つの検出部分を含む請求項３記載の方法。
【請求項５】
第１レポーター種が、第１プローブ集合体から放出されたときに間接的に検出されるように設計される請求項２記載の方法。
【請求項６】
第１レポーター種が、第１レポーター種のテンプレート部分に対して結合親和性を有する第２プローブ集合体から第２レポーター種を少なくとも１つの第２の非ＰＣＲ／テンプレート−誘導化／酵素活性化方式で放出させることに対する標的テンプレートとして作用するよう設計されたテンプレート部分を含む請求項５記載の方法。
【請求項７】
第２レポーター種が、第２プローブ集合体から放出されたときに直接的に検出されるように設計される請求項６記載の方法。
【請求項８】
第１レポーター種が、第１プローブ集合体から放出されたときに間接的に検出されるような形態を有し、第２レポーター種が、第２レポーター種のテンプレート部分に対して結合親和性を有する第３プローブ集合体から第３レポーター種を少なくとも１つの第３の非ＰＣＲ／テンプレート−誘導化／酵素活性化方式で放出させることに対する標的テンプレートとして作用するような形態を有するテンプレート部分を含む請求項６記載の方法。
【請求項９】
生体分子テンプレート種が少なくとも非ポリヌクレオチド部分を含み、第１プローブ集合体の捕獲ヌクレオチド配列がアプタマーを含み、選択的結合親和性が、アプタマーと少なくとも非ポリヌクレオチドとの結合相互作用を含む請求項１記載の方法。
【請求項１０】
生体分子のテンプレート種が少なくともポリヌクレオチド部分を含み、第１プローブ鎖の捕獲ヌクレオチド配列が、相補的ヌクレオチドのハイブリッド形成によってテンプレート種の標的部分に対して選択的結合親和性を付与する請求項１記載の方法。
【請求項１１】
第１プローブ鎖と第１レポーター種が共直線性ポリヌクレオチド鎖を含み、該共直線性ポリヌクレオチド鎖の複数の部分が、テンプレート種の標的部分と結合せずに選択された酵素による分解から保護されるように自己ハイブリッド形成するような形態を有する請求項１記載の方法。
【請求項１２】
下記の過程（ａ）〜（ｅ）を含む、試料中の被検体であるポリヌクレオチドの検出方法：
（ａ）下記の要件（i）〜（iv）を満たす第１プローブ集合体を少なくとも１つ供給する：
（i）被検体の選択された標的ヌクレオチド部分に対して選択的なハイブリッド形成親和性を付与する捕獲ヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの第１ポリヌクレオチドプローブストランド；
（ii）プローブストランドの対応する結合部分とハイブリッド形成するように設計されたポリヌクレオチド配列を有する結合部分を含む少なくとも１つの第１レポーター鎖を含む；
（iii）第１プローブ集合体は、ポリヌクレオチド重複プローブ集合体を含むようにハイブリッド形成された少なくとも１つの第１プローブ鎖と少なくとも１つの第１レポーターを含む；
（iv）重複プローブ集合体は、プローブ鎖の全部又は一部を分解してプローブ集合体から第１レポーター鎖を放出させるのに十分なヌクレアーゼ活性を有する選択された酵素の作用を促進するのに適合した少なくとも１つの酵素−開始部位であって、捕獲ヌクレオチド配列が被検体の標的ヌクレオチド部分の全部又は一部とハイブリッド形成して重複被検体−プローブ複合体を形成するときに形成される該酵素−開始部位を有するように設計される；
（ｂ）標的ヌクレオチド部分をプローブポリヌクレオチドの捕獲ヌクレオチド配列部分へ結合させることによって酵素−開始部位を有する第１被検体−プローブ複合体を形成させる反応を促進するために有効な条件下において、試料を少なくとも１つの第１プローブ集合体と接触させる；
（ｃ）酵素−開始部位における酵素のヌクレアーゼ活性を促進するために有効な条件下において、試料を少なくとも選択された酵素と接触させ、第１被検体−プローブ複合体が過程（ｂ）において形成されたときに第１プローブ鎖が分解され、第１レポーター鎖がプローブ集合体から放出される；
（ｄ）放出されたレポーター鎖を直接的又は間接的に検出する；
（ｅ）レポーター鎖の直接的又は間接的検出に基づいて、被検体の少なくとも存在又は濃度を測定する。
【請求項１３】
下記の過程（ａ）〜（ｅ）を含む、試料中の被検体であるポリヌクレオチドの検出方法：
（ａ）下記の要素（i）〜（iv）を含む第１プローブ集合体を少なくとも１つ供給する：
（i）基体；
（ii）隣接位の５’−末端ヌクレオチドと遠位の３’−末端ヌクレオチドを含む少なくとも１種のプローブポリヌクレオチドであって、該隣接位の５’−末端ヌクレオチドが基体に隣接して結合すると共に少なくとも１種のナノコードヌクレオチド配列部分及び被検体であるポリヌクレオチドの対応する標的ヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する捕獲ヌクレオチド配列部分を含む該プローブポリヌクレオチド；
（iii）プローブポリヌクレオチドのナノコード配列に対して相補的はヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの第１レポーターポリヌクレオチドであって、ナノコード配列とハイブリッド形成することによってプローブポリヌクレオチドと重複部分を形成する該第１レポーターポリヌクレオチド；
（iv）捕獲ヌクレオチド配列部分と３’−末端ヌクレオチドが第１レポーターポリヌクレオチドの重複部分から遠位へ延びるように配置されたプローブポリヌクレオチド；
（ｂ）被検体であるポリヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列をプローブポリヌクレオチドの捕獲ヌクレオチド配列部分と結合させることによって、下記の成分（i）〜（iii）を含有する重複第１プローブ／被検体複合体を形成させるために有効な条件下において、第１プローブ集合体を被検体であるポリヌクレオチドを含有すると推定される試料と接触させる：
（i）第１プローブ集合体；
（ii）少なくとも１種のポリヌクレオチド被検体；
（iii）遠位へ延びて平滑な遠位の５’−末端（１）又は突出する遠位の５’−末端（２）を形成するポリヌクレオチド被検体；
（ｃ）第１プローブ／被検体複合体を、二重鎖ＤＮＡへの特異的結合とその後のＤＮＡ重複部の３’−末端鎖の選択的加水分解を含む３’−対−５’エキソ−デオキシリボヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼと接触させる；
（ｄ）エキソヌクレアーゼを第１プローブ／被検体複合体へ結合させるために有効であると共に、第１プローブ／被検体複合体の遠位の３’−末端鎖をエキソヌクレアーゼで加水分解させることによってポリヌクレオチド被検体と少なくとも第１レポーターポリヌクレオチドを第１の重複プローブ／被検体複合体から放出させるために有効な条件を維持する；
（ｅ）エキソヌクレアーゼによる加水分解によって放出される少なくとも第１レポーターポリヌクレオチドの存在を検出することによって、試料中のポリヌクレオチド被検体の存在を測定する。
【請求項１４】
下記の過程（ｆ）〜（ｊ）をさらに含む請求項１３記載の方法：
（ｆ）下記の要素（i）〜（iv）を含む第２プローブ集合体を少なくとも１つ供給する；
（i）第１プローブ集合体の場合と同一の基体（１）又は第１プローブ集合体の場合と異なる基体（２）；
（ii）隣接位の５’−末端ヌクレオチドと遠位の３’−末端ヌクレオチドを含む少なくとも１つのプローブポリヌクレオチドであって、該隣接位の５’−末端ヌクレオチドが基体に隣接して結合すると共に少なくとも１つのナノコードヌクレオチド配列部分及び被検体であるポリヌクレオチドの対応する標的ヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する捕獲ヌクレオチド配列部分を含む該プローブポリヌクレオチド；
（iii）プローブポリヌクレオチドのナノコード配列に対して相補的はヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの第２レポーターポリヌクレオチドであって、ナノコード配列とハイブリッド形成することによってプローブポリヌクレオチドと重複部分を形成する該第２レポーターポリヌクレオチド；
（iv）捕獲ヌクレオチド配列部分と３’−末端ヌクレオチドが第２レポーターポリヌクレオチドの重複部分から遠位へ延びるように配置されたプローブポリヌクレオチド；
（ｇ）過程（ｄ）においてポリヌクレオチド被検体を放出させた後、放出されたポリヌクレオチド被検体の標的ヌクレオチド配列を第２プローブ集合体のプローブポリヌクレオチドの捕獲ヌクレオチド配列部分と結合させることによって第２重複プローブ／被検体複合体を形成させるために有効な条件下において、過程（ｄ）で放出されたポリヌクレオチド被検体を含有する試料を第２プローブ集合体と接触させる；
（ｈ）第２プローブ／被検体複合体を、二重鎖ＤＮＡへの特異的結合とその後のＤＮＡ重複部の３’−末端鎖の選択的加水分解を含む３’−対−５’エキソ−デオキシリボヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼと接触させる；
（ｉ）エキソヌクレアーゼを第２プローブ／被検体複合体へ結合させるために有効であると共に、第２プローブ／被検体複合体の遠位の３’−末端ストランドをエキソヌクレアーゼで加水分解させることによってポリヌクレオチド被検体と少なくとも第２レポーターポリヌクレオチドを第２重複プローブ／被検体複合体から放出させるために有効な条件を維持する；
（ｊ）過程（ｅ）の場合のように、第１重複プローブ／被検体複合体から放出された第１レポーターポリヌクレオチド及び第２重複プローブ／被検体複合体から放出された第２レポーターポリヌクレオチドの少なくとも両方の存在を検出することによって、試料中のポリヌクレオチド被検体の存在を測定する。
【請求項１５】
下記の過程（ｋ）及び（ｌ）をさらに含む請求項１４記載の方法：
（ｋ）過程（ｄ）の後に放出されたレポーターポリヌクレオチドの存在量に比べて、放出されたレポーターポリヌクレオチドの存在量が少なくとも約１桁増加するまで請求項２記載の過程（ｆ）〜（ｉ）の操作を反復することによって、増幅された量の放出レポーターポリヌクレオチドを存在させる；
（ｌ）過程（ｅ）の場合のように、増幅された量の放出レポーターポリヌクレオチドの存在を検出することによって、試料中のポリヌクレオチド被検体の存在を測定する。
【請求項１６】
方法が、３’末端と５’末端が請求項１３の定義とは逆転する下記の要件（ａ）〜（ｅ）によって規定される鏡像法である請求項１４記載の方法：
（ａ）基体は、プローブポリヌクレオチドの隣接位の３’末端に隣接して結合する。
（ｂ）第１プローブ／被検体複合体の遠位の末端はポリヌクレオチド被検体を含み、該被検体は遠位へ延びて平滑な遠位の３’−末端（１）又は突出する遠位の３’−末端（２）を形成する。
（ｃ）エキソヌクレアーゼは、二重鎖ＤＮＡと特異的に結合した後、ＤＮＡ重複体の５’末端鎖の選択的加水分解を含む５’−対−３’エキソ−デオキシリボヌクレアーゼ活性を有する。
（ｄ）この方法は、プローブ／被検体の５’末端ストランドを加水分解してポリヌクレオチド被検体と少なくとも第１レポーターポリヌクレオチドを放出するために有効な条件を維持することを含む。
（ｅ）この方法は、エキソヌクレアーゼによる５’−対−３’加水分解によって放出されるレポーターポリヌクレオチドの存在を検出することによって、試料中のポリヌクレオチド被検体の存在を測定することを含む。
【請求項１７】
過程（ｅ）におけるレポーターポリヌクレオチドの検出を、下記の構成要素（ａ）及び（ｂ）を具備する電子的センサーシステムの操作によって行う請求項１３記載の方法：
（ａ）少なくとも１種の電気的特性を有する少なくとも１つのセンサープラットホームであって、下記の構成要素（i）〜（iv）を具備する該センサープラットホーム：
（i）基体、
（ii）該基体に隣接して配設された少なくとも１つの電極、
（iii）該基体に隣接して配設されると共に該電極と電気的に接続する少なくとも１つのナノ構造化素子、及び
（iv）ナノ構造化素子と機能的に連絡する少なくとも１つの検出プローブであって、レポーターポリヌクレオチドの対応するヌクレオチド配列に対して相補的な少なくとも１つのヌクレオチド配列を有すると共に、少なくとも第１レポーターポリヌクレオチドと結合するような構造を有する検出ポリヌクレオチドを含む該検出プローブ、並びに
（ｂ）少なくとも１つの電極に接続されると共に、検出プローブと少なくともレポーターポリヌクレオチドとの結合に起因するセンサープラットホームの少なくとも１つの電気的特性の変化を測定するような構造を有する電子的測定用回路部品。
【請求項１８】
過程（ｂ）における第１プローブ／被検体複合体の形成後の下記の過程をさらに含む請求項１３記載の方法：
（ｍ）第１プローブ／被検体複合体から試料を分離させ、
（ｎ）その後の過程を、試料とは異なる１種又は複数種の媒体中でおこなう。
【請求項１９】
過程（ｎ）における試料の分離後の下記の過程（ｏ）をさらに含む請求項１８記載の方法：
（ｏ）過程（ｐ）の前に、第１プローブ／被検体複合体をすすぐ。
【請求項２０】
過程（ａ）における少なくとも１つの第１プローブ集合体を供給することが複数のプローブ集合体を供給することを含み、
（i）各々のプローブ集合体の基体が、（１）複数のプローブ集合体の別のプローブ集合体と共通の基体であるか、又は（２）複数のプローブ集合体の別のプローブ集合体の基体とは異なる基体であり、
（ii）複数のプローブ集合体が、試料中に存在する被検体であるポリヌクレオチド分子の実質的な量の分子が過程（ｂ）の実施において結合して対応する複数のプローブ／被検体複合体を形成するために十分である。
【請求項２１】
１よりも多い複数のプローブ集合体が共通の基体を含む請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
基体が磁気ビーズを含有し、過程（ｍ）において第１プローブ／被検体複合体から試料を分離させる過程が、該ビーズに磁気的な作用を及ぼすことを含む請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
基体が荷電種を含む粒子を含有し、過程（ｍ）において第１プローブ／被検体複合体から試料を分離させる過程が、該粒子に電気泳動的な作用を及ぼすことを含む請求項１８記載の方法。
【請求項２４】
基体が選択されたサイズを有する粒子を含有し、過程（ｍ）において第１プローブ／被検体複合体から試料を分離させる過程が、試料から該粒子を濾過することを含む請求項１８記載の方法。
【請求項２５】
基体が表面を有し、過程（ｍ）において第１プローブ／被検体複合体から試料を分離させる過程が、該表面に対して試料を流動させることを含む請求項１８記載の方法。
【請求項２６】
表面が微少量な液状収容物の少なくとも一部を含む請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
第１プローブ集合体が、過程（ｄ）で放出される複数のレポーターポリヌクレオチドを含む請求項１３記載の方法。
【請求項２８】
過程（ｃ）の前に、試料を処理することによって、試料中に含まれるエキソヌクレアーゼを不活性化するか、又は該酵素を除去する過程をさらに含む請求項１３記載の方法。
【請求項２９】
試料中の複数の被検ポリヌクレオチド種を検出して区別する方法であって、下記の過程（ａ）〜（ｅ）を含む該方法：
（ａ）請求項１３に規定された第１プローブ集合体であって、第１型のレポーターポリヌクレオチド及び第１被検ポリヌクレオチド種に対して特異的な標的ヌクレオチド配列に対して相補的な捕獲ヌクレオチド配列を含む該第１プローブ集合体を供給し、
（ｂ）請求項１に規定された第２プローブ集合体であって、第２型のレポーターポリヌクレオチド及び第２被検ポリヌクレオチド種に対して特異的な標的ヌクレオチド配列に対して相補的な捕獲ヌクレオチド配列を含む該第２プローブ集合体を少なくとも１つ供給し、
（ｃ）請求項１記載の過程（ｂ）〜（ｄ）を実行することによって、第１被検体が存在するときには試料中の第１被検ポリヌクレオチド種の存在に応答して第１型のレポーターポリヌクレオチド種を放出させ、第２被検体が存在するときには試料中の第２被検ポリヌクレオチド種の存在に応答して第２型のレポーターポリヌクレオチド種を放出させ、
（ｄ）エキソヌクレアーゼによる加水分解によって放出された第１型のレポーターポリヌクレオチドの存在を検出することにより、試料中の第１被検ポリヌクレオチドの存在を決定し、
（ｅ）過程（ｄ）における第１型のレポーターポリヌクレオチドの検出とは異なる検出であって、エキソヌクレアーゼによる加水分解によって放出された第２型のレポーターポリヌクレオチドの存在の検出により、試料中の第２被検ポリヌクレオチドの存在を決定する。
【請求項３０】
過程（ｄ）及び（ｅ）におけるレポーターポリヌクレオチドの検出を、下記の構成要素１）〜３）を具備する電子的センサーシステムの操作によって行う請求項２９記載の方法：
１）少なくとも１種の電気的特性を有する第１センサープラットホームであって、下記の構成要素（i）〜（iv）を具備する該第１センサープラットホーム：
（i）基体、
（ii）該基体に隣接して配設された少なくとも１つの電極、
（iii）該基体に隣接して配設されると共に該電極と電気的に接続する少なくとも１つのナノ構造化素子、及び
（iv）ナノ構造化素子と機能的に連絡する少なくとも１つの検出プローブであって、第１型のレポーターポリヌクレオチドの対応するヌクレオチド配列に対して相補的な少なくとも１つのヌクレオチド配列を有すると共に、少なくとも第１型のレポーターポリヌクレオチドと結合するような構造を有する第１型の検出ポリヌクレオチドを含む該検出プローブ；
２）少なくとも１種の電気的特性を有する第２センサープラットホームであって、下記の構成要素（i）〜（iv）を具備する該第２センサープラットホーム：
（i）基体であって、（１）第１センサープラットホームと共通の基体又は（２）第１センサープラットホームの基体とは異なる基体である該基体、
（ii）該基体に隣接して配設された少なくとも１つの電極、
（iii）該基体に隣接して配設されると共に該電極と電気的に接続する少なくとも１つのナノ構造化素子、及び
（iv）ナノ構造化素子と機能的に連絡する少なくとも１つの検出プローブであって、第１型のレポーターポリヌクレオチドの対応するヌクレオチド配列に対して相補的な少なくとも１つのヌクレオチド配列を有すると共に、少なくとも第１型のレポーターポリヌクレオチドと結合するような構造を有する第１型の検出ポリヌクレオチドを含む該検出プローブ；
３）第１センサープラットホームと第２センサープラットホームの少なくとも１つの電極に接続されると共に、下記の機能（i）及び（ii）を有するような構造を有する電子的測定用回路部品：
（i）検出プローブと少なくとも第１型のレポーターポリヌクレオチドとの結合に起因する第１センサープラットホームの少なくとも１つの電気的特性の変化の少なくとも第１測定を行う；
（ii）該第１測定とは異なる第２測定であって、検出プローブと少なくとも第２型のレポーターポリヌクレオチドとの結合に起因する第２センサープラットホームの少なくとも１つの電気的特性の変化の第２測定を少なくとも行う。
【請求項３１】
試料中の複数の被検ポリヌクレオチド種を検出して区別する方法であって、下記の過程（ａ）〜（ｅ）を含む該方法：
（ａ）請求項１６に規定された第１プローブ集合体であって、第１型のレポーターポリヌクレオチド及び第１被検ポリヌクレオチド種に対して特異的な標的ヌクレオチド配列に対して相補的な捕獲ヌクレオチド配列を含む該第１プローブ集合体を供給し、
（ｂ）請求項４に規定された第２プローブ集合体であって、第２型のレポーターポリヌクレオチド及び第２被検ポリヌクレオチド種に対して特異的な標的ヌクレオチド配列に対して相補的な捕獲ヌクレオチド配列を含む該第２プローブ集合体を少なくとも１つ供給し、
（ｃ）請求項４記載の過程（ｂ）〜（ｄ）を実行することによって、試料中の第１被検ポリヌクレオチド種の存在に応答して第１型のレポーターポリヌクレオチド種を放出させ、試料中の第２被検ポリヌクレオチド種の存在に応答して第２型のレポーターポリヌクレオチド種を放出させ、
（ｄ）エキソヌクレアーゼによる加水分解によって放出された第１型のレポーターポリヌクレオチドの存在を検出することにより、試料中の第１被検ポリヌクレオチドの存在を決定し、
（ｅ）過程（ｄ）における第１型のレポーターポリヌクレオチドの検出とは異なる検出であって、エキソヌクレアーゼによる加水分解によって放出された第２型のレポーターポリヌクレオチドの存在の検出により、試料中の第２被検ポリヌクレオチドの存在を決定する。
【請求項３２】
過程（ｄ）及び（ｅ）におけるレポーターポリヌクレオチドの検出を、下記の構成要素１）〜３）を具備する電子的センサーシステムの操作によって行う請求項３１記載の方法：
（Ａ）少なくとも１種の電気的特性を有する第１センサープラットホームであって、下記の構成要素（i）〜（iv）を具備する該第１センサープラットホーム：
（i）基体、
（ii）該基体に隣接して配設された少なくとも１つの電極、
（iii）該基体に隣接して配設されると共に該電極と電気的に接続する少なくとも１つのナノ構造化素子、及び
（iv）ナノ構造化素子と機能的に連絡する少なくとも１つの検出プローブであって、第１型のレポーターポリヌクレオチドの対応するヌクレオチド配列に対して相補的な少なくとも１つのヌクレオチド配列を有すると共に、少なくとも第１型のレポーターポリヌクレオチドと結合するような構造を有する第１型の検出ポリヌクレオチドを含む該検出プローブ；
２）少なくとも１種の電気的特性を有する第２センサープラットホームであって、下記の構成要素（i）〜（iv）を具備する該第２センサープラットホーム：
（i）基体であって、（１）第１センサープラットホームと共通の基体又は（２）第１センサープラットホームの基体とは異なる基体である該基体、
（ii）該基体に隣接して配設された少なくとも１つの電極、
（iii）該基体に隣接して配設されると共に該電極と電気的に接続する少なくとも１つのナノ構造化素子、及び
（iv）ナノ構造化素子と機能的に連絡する少なくとも１つの検出プローブであって、第１型のレポーターポリヌクレオチドの対応するヌクレオチド配列に対して相補的な少なくとも１つのヌクレオチド配列を有すると共に、少なくとも第１型のレポーターポリヌクレオチドと結合するような構造を有する第１型の検出ポリヌクレオチドを含む該検出プローブ；
３）第１センサープラットホームと第２センサープラットホームの少なくとも１つの電極に接続されると共に、下記の機能（i）及び（ii）を有するような構造を有する電子的測定用回路部品：
（i）検出プローブと少なくとも第１型のレポーターポリヌクレオチドとの結合に起因する第１センサープラットホームの少なくとも１つの電気的特性の変化の少なくとも第１測定を行う；
（ii）該第１測定とは異なる第２測定であって、検出プローブと少なくとも第２型のレポーターポリヌクレオチドとの結合に起因する第２センサープラットホームの少なくとも１つの電気的特性の変化の第２測定を少なくとも行う。
【請求項３３】
試料中の被検ポリヌクレオチドの存在に応答することによって代表的な標的オリゴヌクレオチドを増幅して検出する方法であって、下記の過程（ａ）〜（ｅ）を含む該方法：
（ａ）被検ポリヌクレオチドの第１標的配列部分とハイブリッド形成するような構造を有すると共に、第１の代表的な標的オリゴヌクレオチド種を含む第１の重複オリゴヌクレオチドアンプリファイア集合体を少なくとも１つ供給し、
（ｂ）被検ポリヌクレオチドの第２標的配列部分とハイブリッド形成するような構造を有すると共に、第２の代表的な標的オリゴヌクレオチド種を含む第２の重複オリゴヌクレオチドアンプリファイア集合体を少なくとも１つ供給し、
（ｃ）配列のハイブリッド形成を促進するために有効な条件下において、第１アンプリファイア集合体と第２アンプリファイア集合体を被検ポリヌクレオチドと接触させることによって、第１アンプリファイア集合体及び第２アンプリファイア集合体の少なくとも一部分をそれぞれ被検ポリヌクレオチドの第１標的配列部分及び第２標的配列部分とハイブリッド形成させることにより、少なくとも１つのアンプリファイア／被検体複合体を形成させ、
（ｄ）ヌクレアーゼ活性を促進するために有効な条件下において、ヌクレアーゼを用いて少なくとも１つのアンプリファイア／被検体複合体を処理することによって、第１及び第２の代表的な標的オリグヌクレオチド種の少なくとも１つを、対応するアンプリファイア集合体とアンプリファイア／被検体複合体から放出させ、
（ｅ）少なくとも放出された代表的な標的オリゴヌクレオチソ種の存在を検出することによって、試料中の被検ポリヌクレオチドの存在を決定する。
【請求項３４】
下記の特徴１）及び２）を有する請求項３３記載の方法：
１）過程（ａ）における第１アンプリファイアポリヌクレオチド集合体が下記の構成要素（i）及び（ii）を含む：
（i）隣接する５’−末端ヌクレオチドと遠位の３’−末端ヌクレオチドを含む少なくとも１つの第１アンプリファイアポリヌクレオチドであって、ａ）被検ポリヌクレオチドの対応する標的配列部分（Ｂ）に対して相補的な少なくとも１つの遠位の捕獲配列部分（Ｂ’）、及びｂ）該捕獲配列部分（Ｂ’）とは異なる隣接する捕獲配列部分（Ａ’）であって、被検ポリヌクレオチドの対応する標的配列部分（Ａ）に対して相補的な少なくとも１つの該隣接捕獲配列部分を含む少なくとも１つの該第１アンプリファイアポリヌクレオチド、及び
（ii）隣接する３’−末端ヌクレオチドと遠位の５’−末端ヌクレオチドを含む第１コンパニオンポリヌクレオチドであって、第１アンプリファイアポリヌクレオチドの隣接捕獲配列部分（Ａ’）に対して相補的であると共に該隣接捕獲部分とハイブリッド形成する少なくとも１つの標的配列部分（Ａ''）を含む少なくとも１つの該第１コンパニオンポリヌクレオチド；
２）過程（ｂ）における第２アンプリファイア集合体が下記の構成要素（i）及び（ii）を含む：
（i）隣接する５’−末端ヌクレオチドと遠位の３’−末端ヌクレオチドを含む第２アンプリファイアポリヌクレオチドであって、ａ）第１アンプリファイアポリヌクレオチドの捕獲配列部分（Ａ’）の配列を実質的に有する少なくとも１つの遠位の捕獲配列部分、及びｂ）該遠位の捕獲配列部分とは異なる隣接する捕獲配列部分であって、第１アンプリファイアポリヌクレオチドの捕獲配列部分を実質的に含む該隣接捕獲配列部分を含む少なくとも１つの該第２アンプリファイアポリヌクレオチド、及び
（ii）隣接する３’−末端ヌクレオチドと遠位の５’−末端ヌクレオチドを含む第２コンパニオンポリヌクレオチドであって、第２アンプリファイアポリヌクレオチドの隣接捕獲配列部分に対して相補的であると共に該隣接捕獲部分とハイブリッド形成する少なくとも１つの標的配列部分（Ｂ''）を含む少なくとも１つの該第２コンパニオンポリヌクレオチド。
【請求項３５】
試料中の複数の被検ポリヌクレオチド種を検出して区別するためのアレイシステムであって、下記の構成要素（ａ）〜（ｄ）を具備する該アレイシステム：
（ａ）レポータープローブ及び／又はアンプリファイアと１種又は複数種の被検体種を含有すると推定される試料とを反応させるために適合した構造を有する反応セル、
（ｂ）レポーター及び／又は合成標的の少なくとも１つを精製するために、該反応セル又は別のセルの内部に配設された少なくとも１つの精製機構、
（ｃ）本願明細書に記載のナノ電子センサーのアレイ又はマトリックスであって、各々のセンサーが、複数の被検体から選択された１種を代表するレポーター又は合成標的に感知する認識材料（例えば、オリゴヌクレオチド相補的オリゴヌクレオチドを含有する検出プローブ）を含む該アレイ又はマトリックス。
（ｄ）試料中に複数の被検体が存在すると推定されたとしても、各々のセンサーに対して得られる信号から測定を行うような構造を有する測定用回路部品。
【請求項３６】
試料中の被検体を検出する方法であって、下記の過程（ａ）〜（ｅ）を含む該方法：
（ａ）選択されたヌクレアーゼを供給し、
（ｂ）被検体の標的部分へ結合するように適合した捕獲オリゴヌクレオチド配列及び被検体を代表するレポーターオリゴヌクレオチド配列を含むプローブ集合体を少なくとも１つ供給し（この場合、レポーターオリゴヌクレオチド配列と捕獲オリゴヌクレオチド配列が二重鎖部分を有する重複形態で供給され、該重複形態が単離においてヌクレアーゼへ提供されたときにヌクレアーゼによる分解に対して比較的高い耐性を示すような構造を有し、また、該重複形態が、捕獲オリゴヌクレオチド配列が被検体の標的部分へ結合して被検体／プローブ複合体を形成する形態中においてヌクレアーゼへ提供されたときにヌクレアーゼによる分解作用を比較的受けやすい構造を有し、さらに、ヌクレアーゼによる分解は、被検体／プローブ複合体から少なくともレポーターオリゴヌクレオチド配列が放出されるように十分に行われる）、
（ｃ）被検体の標的部分への捕獲オリゴヌクレオチド配列の結合を促進するために有効な条件下において、プローブ集合体を被検体と接触させることによって、被検体／プローブ複合体を形成させ、
（ｄ）ヌクレアーゼの活性を促進させるために有効な条件下において、被検体／プローブ複合体を被検体とヌクレアーゼと接触させることによって、プローブ集合体の二重鎖部分を分解させ、これによって、被検体／プローブ複合体から少なくともレポーターオリゴヌクレオチド配列を放出させ、
（ｅ）少なくとも放出されたレポーターオリゴヌクレオチド配列の存在を検出することによって、試料中の被検体の存在を測定する。
【請求項３７】
被検体がポリヌクレオチドを含有し、捕獲配列が、被検体の対応する標的配列に対して相補的な配列を含む請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
被検体が非ヌクレオチド生体分子を含有し、捕獲配列が、被検体の標的部分に対して特異的な結合能を有するアプタマーを含み、生体分子へアダプターを結合させる過程には、プローブ集合体の二重鎖部分をヌクレアーゼによる分解作用に付すことによって、被検体／プローブ複合体から少なくともレポーターオリゴヌクレオチドを放出させるようにアプタマーを変化させることが含まれる請求項３６記載の方法。
【図１Ｃ（ｉｉ）】
【図１Ｄ（ｉ）】
【図１Ｄ（ｉｉ）】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ（ｉ）】
【図１Ｆ（ｉｉ）】
【図１Ｆ（ｉｉｉ）】
【図１Ｇ（ｉ）】
【図１Ｇ（ｉｉ）】
【図１Ｈ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図２Ｇ】
【図２Ｈ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０−１】
【図１０−２】
【図１０−３】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図１Ｄ（ｉ）】
【図１Ｄ（ｉｉ）】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ（ｉ）】
【図１Ｆ（ｉｉ）】
【図１Ｆ（ｉｉｉ）】
【図１Ｇ（ｉ）】
【図１Ｇ（ｉｉ）】
【図１Ｈ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図２Ｅ】
【図２Ｆ】
【図２Ｇ】
【図２Ｈ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０−１】
【図１０−２】
【図１０−３】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【公表番号】特表２００９−５３２０６４（Ｐ２００９−５３２０６４Ａ）
【公表日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０４２８４（Ｐ２００９−５０４２８４）
【出願日】平成１９年４月３日（２００７．４．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００８４２２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１１４９３１
【国際公開日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【出願人】（５０４４６８４７０）ナノミックス・インコーポレーテッド (12)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月３日（２００７．４．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００８４２２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１１４９３１
【国際公開日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【出願人】（５０４４６８４７０）ナノミックス・インコーポレーテッド (12)
【Ｆターム（参考）】
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