被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法及びその利用
【課題】 簡便、迅速、高感度かつ高い再現性で、被験物質に対する複数のプローブの結合の競争性を評価する。
【解決手段】 本発明の被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法は、被験物質を含む試料、及び当該被験物質を検出するための複数のプローブを混合する試料調製工程と、蛍光相関分光法によって、上記複数のプローブから発せられる蛍光強度を検出する蛍光検出工程と、を含み、上記複数のプローブは、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有するものであり、上記蛍光相関分光法は、上記複数のプローブを検出するための、それぞれ異なる波長のレーザ光を、試料に照射することで行なう。
【解決手段】 本発明の被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法は、被験物質を含む試料、及び当該被験物質を検出するための複数のプローブを混合する試料調製工程と、蛍光相関分光法によって、上記複数のプローブから発せられる蛍光強度を検出する蛍光検出工程と、を含み、上記複数のプローブは、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有するものであり、上記蛍光相関分光法は、上記複数のプローブを検出するための、それぞれ異なる波長のレーザ光を、試料に照射することで行なう。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法及びその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトや家畜に対して病原性を示す細菌は、宿主細胞内に侵入するか、毒素を産生して宿主を攻撃し、各種の症状を引き起こす。中でも、コレラ毒素やボツリヌス毒素、百日咳毒素といった外毒素は、細胞に対する強い毒性作用を有する。これらの毒素は、細胞表面上に存在するガングリオシドの糖鎖構造を特異的に認識し、細胞内に侵入して様々な経路を経て毒性を発現させる。
【０００３】
ガングリオシドには様々な種類がある。そして、毒素の種類によって、ガングリオシド毎の結合親和性が異なる。例えば、コレラ毒素は、ガングリオシドＧＭ１（以下、「ＧＭ１」と表記する）に対する結合親和性が高く、アシアロガングリオシドＧＭ１（以下、「Ａｓｉａｌｏ ＧＭ１」と表記する）に対する結合親和性が低いことが知られている。この毒素の種類によってガングリオシドに対する結合親和性が異なることを利用すれば、生体試料中にどのような毒素が含まれているか等のタイピングが可能となる。
【０００４】
従来、毒素の、複数種のガングリオシドに対する結合親和性を測定する方法として、表面プラズモン共鳴法等が用いられてきた（非特許文献１）。
【０００５】
また、ヒトや家畜に対して病原性を示すウイルスの一部は、宿主細胞内に侵入する際に、細胞表面に存在する修飾糖鎖構造を特異的に認識し、結合することにより感染を成立させる。
【０００６】
細胞表面の修飾糖鎖構造はガングリオシドである場合もあるし、タンパク質に結合した糖鎖の場合等もありうる。これらの修飾糖鎖構造には様々な種類がある。一部のウイルスは、その種類・型・亜型の違いによって、細胞表面の修飾糖鎖構造に対する結合親和性が異なる。例えば、ヒトに主に感染するインフルエンザウイルス（以下、「ヒトインフルエンザウイルス」と表記する）は、細胞表面の修飾糖鎖構造のうち末端に２−６結合型シアル酸を含むものに対する結合親和性が高く、一方、トリに主に感染するインフルエンザウイルス（以下、「トリインフルエンザウイルス」と表記する）は、細胞表面の修飾糖鎖構造のうち末端に２−３結合型シアル酸を含むものに対する結合親和性が高く、さらに両者ともシアル酸を含まない修飾糖鎖構造に対する結合親和性が低いことが知られている。このウイルスの種類によって細胞表面の修飾糖鎖構造に対する結合親和性が異なることを利用すれば、生体試料中にどのようなウイルスが含まれているか等のタイピングが可能となる。
【０００７】
一方、簡便で高感度かつ迅速に、試料中の分子を検出することができる方法として、蛍光相関分光法(Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、以下「ＦＣＳ」と表記する)が知られている（非特許文献２）。ＦＣＳは、蛍光標識した分子のブラウン運動に由来する、蛍光強度のゆらぎを測定することで、当該分子の数、大きさ等を測定する方法である。ＦＣＳの応用例として、例えば非特許文献１では、互いに異なる蛍光波長を有する蛍光物質で標識した２種類の分子の、分子間相互作用を評価する方法も記載されている。これは、２種類のレーザ光を同時に照射して、２つの分子が、別々に動いているか同時に動いているかを解析するものである。
【０００８】
また、ＦＣＳを利用したウイルスの検出方法も提案されている（特許文献１）。特許文献１では、ウイルス結合性物質を試料に混合してＦＣＳに供して、検出される分子の大きさによって試料中のウイルスの有無を判定する方法が開示されている。つまり、検出される分子の大きさによって、当該分子が、当該ウイルス結合性物質のみか当該ウイルス結合性物質とウイルスとが結合した分子かを判定することで、試料中のウイルスを検出する。
【特許文献１】特開２００７−２０５６５（平成１９年２月１日公開）
【非特許文献１】Kuziemko, G. M. et al., Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Ganglioside Determined by Surface Plasmon Resonance., Biochemistry., 1996, 35, 6375-6384
【非特許文献２】金城政孝，西村吾郎，「蛍光相関分光法」，蛍光分光とイメージングの手法，学会出版センター，２００６年，ｐ．１３３−１６０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
細菌由来の毒素又はウイルスのタイピングを行なうためには、複数のガングリオシド又は糖鎖に対する当該毒素又はウイルスの結合親和性を測定して、当該毒素又はウイルスがどの種類のガングリオシド又は糖鎖に優先的に結合するか等を評価する必要がある。そのためには、毒素等の一つの被験物質に対する、ガングリオシド等の複数のプローブ結合親和性を測定する技術が必要である。しかし、従来、一つの被験物質に対する複数のプローブの結合親和性を、簡便、迅速、高感度かつ高い再現性で測定する方法は存在しなかった。
【００１０】
例えば非特許文献１に記載のＳＰＲ法では、被験物質を基板上に固定する必要があるため煩雑な前処理等を要し、測定にも長時間を要する。
【００１１】
一方、ＦＣＳでは、検査対象の試料にレーザ光を照射して蛍光を検出すればよいため、実時間で迅速に測定することができる。また、測定する領域の溶液は、数フェムトリットルであり極めて微量であるため、少量の試料で測定することができる。生体試料を直接供することも可能であり、生態環境に近い状態で検査を行なうことができる。さらにＦＣＳは個々の分子結合を検出できるため、ＳＰＲに比べて感度も高い。
【００１２】
しかしながら、ＦＣＳは、一つの分子に対する、別の一つの分子の結合を測定するために用いられてきた方法である。例えば、非特許文献２及び特許文献１においても、二つの化合物間における相互作用や、一種類のウイルス結合性物質を用いたウイルスの検出等に用いられている。
【００１３】
そのため、従来のＦＣＳによって被験物質に対する複数のプローブの結合親和性を測定する場合、被験物質に一つのプローブを混合した試料を用いてＦＣＳを行ない、別途、被験物質に異なるプローブを混合して作製した試料を用いてＦＣＳを行なった上で、両者の結果を比較する必要がある。
【００１４】
しかし、これでは被験物質に対して複数のプローブのうちどのプローブが優先的に結合するかを評価することができない。また、上述のようにＦＣＳに供した試料の内、レーザ光が照射される領域は数フェムトリットルという極めて微小な領域である。微小な領域では、温度や、被験物質に吸着する可能性のある夾雑物の影響が大きい。そのため、別々の試料を用いると、ＦＣＳに供する試料毎の温度差や夾雑物濃度の差の影響を大きく受ける。測定時間がずれると外環境の温度の差による影響も大きくなる。そして、これらの影響により、測定結果の再現性も悪くなる。
【００１５】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、簡便、迅速、高感度かつ高い再現性で、被験物質に対する複数のプローブの結合の競争性を評価することが可能な、被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法及びそれに用いる蛍光相関分光装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明に係る被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法は、上記課題を解決するために、被験物質を含む試料、及び当該被験物質を検出するための複数のプローブを混合する試料調製工程と、蛍光相関分光法によって、上記複数のプローブから発せられる蛍光強度を検出する蛍光検出工程と、を含み、上記複数のプローブは、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有するものであり、上記蛍光相関分光法は、上記複数のプローブを検出するための、それぞれ異なる波長のレーザ光を、試料に照射することで行なうことを特徴としている。
【００１７】
本発明に係る被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法は、上記被験物質は、細菌由来の毒素またはウイルスであることがより好ましい。
【００１８】
本発明に係る被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法は、上記被験物質は、コレラ毒素、ボツリヌス毒素、カンピロバクター毒素、ウェルシュ毒素、易熱性エンテロトキシン、志賀毒素、破傷風毒素、ベロ毒素又はヘリコバクター・ピロリ空胞化毒素、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルスであることがより好ましい。
【００１９】
本発明に係る被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法は、上記蛍光検出工程によって検出したそれぞれの蛍光強度から、当該蛍光強度の自己相関関数を算出して、それぞれの自己相関関数同士を比較する解析工程をさらに含むことがより好ましい。
【００２０】
本発明に係る試料中の被験物質を検出する方法は、試料、及び上記被験物質を検出するための複数のプローブを混合する試料調製工程と、蛍光相関分光法によって、上記複数のプローブから発せられる蛍光を検出する蛍光検出工程と、を含み、上記複数のプローブは、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有するものであり、上記蛍光相関分光法は、上記複数のプローブを検出するための、それぞれ異なる波長のレーザ光を、試料に照射することで行なうことを特徴としている。
【００２１】
本発明に係る蛍光相関分光装置は、上記課題を解決するために、蛍光相関分光法を行なうための装置であって、試料を搭載するための試料搭載手段と、上記試料搭載手段に搭載された試料に対して、それぞれ異なる波長のレーザ光を試料に照射する複数のレーザ光照射手段と、上記複数のレーザ光照射手段のうち、上記試料搭載手段に搭載された試料に対してレーザを照射するために用いるレーザ光照射手段を切り替えるための切り替え手段と、を備えることを特徴としている。
【００２２】
本発明に係る蛍光相関分光装置は、上記それぞれ異なる波長のレーザ光が上記試料に照射されることによって、検出されたそれぞれの蛍光強度から、当該蛍光強度の自己相関関数を算出して、それぞれの自己相関関数同士を比較する解析手段を備えてもよい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に係る被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法は、以上のように、被験物質を含む試料、及び当該被験物質を検出するための複数のプローブを混合する試料調製工程と、蛍光相関分光法によって、上記複数のプローブから発せられる蛍光強度を検出する蛍光検出工程と、を含み、上記複数のプローブは、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有するものであり、上記蛍光相関分光法は、上記複数のプローブを検出するための、それぞれ異なる波長のレーザ光を、試料に照射することで行なう。よって、簡便、迅速、高感度かつ高い再現性で、被験物質に対する複数のプローブの結合の競争性を評価することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２５】
＜１．本発明に係る被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法＞
本発明に係る被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法（以下、「結合親和性測定方法」と表記する）は、被験物質を含む試料、及び当該被験物質を検出するための複数のプローブを混合する試料調製工程と、蛍光相関分光法によって、上記複数のプローブから発せられる蛍光強度を検出する蛍光検出工程と、を含めばよく、上記複数のプローブは、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有するものであり、上記蛍光相関分光法は、上記複数のプローブを検出するための、それぞれ異なる波長のレーザ光を、試料に照射して行なえばよい。
【００２６】
本発明によれば、複数のプローブを混合した状態で測定を行なえるため、被験物質に対する複数のプローブの、結合の競争性を評価することができる。例えば、被験物質として毒素を用いた場合、様々なガングリオシドのうち、どのガングリオシドに対して優先的に結合するかを測定することができる。つまり本発明は、複数のプローブの被験物質に対する結合親和性の競争性を測定可能な、競争的ＦＣＳとも呼べる全く新たな方法を提供するものである。以下、被験物質を検出するための、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有する複数のプローブを、試料に混合してＦＣＳを行なう方法を「競争的ＦＣＳ」と表記することもある。
【００２７】
また、本発明に係る結合親和性測定方法では、一つの被験物質に対して、複数のプローブを混合した状態で、ＦＣＳによる測定を行なうことができる。つまり、複数のプローブを別々に混合させた試料を調製する必要がない。そのため、試料毎の温度や夾雑物濃度の差による影響を受けずにＦＣＳを行なうことができる。また、上記被験物質及び複数のプローブを混合した試料に対して、同時に又は速やかに、異なる波長のレーザ光を照射することができるため、外環境の温度差の影響を抑えることができる。よって、簡便、迅速、高感度かつ高い再現性で、被験物質に対する複数のプローブの、結合の競争性を評価することができる。
【００２８】
本発明に係る結合親和性測定方法で利用することができる被験物質とは、特に限定されるものではなく、タンパク質、ペプチド、糖、ウイルス、核酸、脂質や、その他に様々な低分子化学物質を例示することができる。特に、本発明では、被験物質として細菌由来の毒素やウイルスを用いるとよい。つまり、本発明は細菌由来の毒素やウイルスに対する複数のプローブの結合親和性を好適に測定することができる。
【００２９】
ここで、ウイルスとしては、例えば、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ＥＢウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、ＳＡＲＳ、（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ）型肝炎ウイルス、手足口病ウイルス、フラビウイルス（黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス）、トガウイルス、ブタコレラウイルス、ウシ下痢ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ＲＳウイルス、ペストウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス等のインフルエンザウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ラブドウイルス（狂犬病ウイルス、水泡性口内炎ウイルス）、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス）、脳脊髄炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、アレナウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ラサウイルス）、レトロウイルス（ＨＴＬＶ：ヒト成人白血病ウイルス、ＨＩＶ：エイズウイルス、ネコ白血病肉腫ウイルス、牛白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス）、ロタウイルス、エボラウイルス、ポックスウイルス（ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、天然痘ウイルス）、パルボウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ウマヘルペスウイルス、ネコヘルペスウイルス等を例示できる。中でも、本発明は、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス又はアデノウイルスに対する複数のプローブの結合親和性を好適に測定することができる。
【００３０】
また、本発明では、細菌由来の毒素に対する複数のプローブの結合親和性を、簡便、迅速かつ高感度に測定することができる。従来、細菌由来の毒素に対する、複数のプローブの結合親和性を、簡便、迅速かつ高感度に測定可能な方法は報告されていなかった。しかし、本発明によれば、試料から当該毒素を抽出したり、ＳＰＲのように当該毒素を基板に固定したりする必要がないため、簡便かつ迅速に行なうことができる。また、上述のように外環境の温度差や、試料毎の温度及び夾雑物濃度の差による影響を防ぎ、高感度に測定することができる。従って、本発明は毒素に対するプローブの結合親和性を測定する方法として好適に用いることができる。複数のガングリオシドの、毒素に対する結合親和性の差や競争性を測定して網羅しておけば、保有するガングリオシドの種類や量等によるヒトの体質によって当該毒素の影響を受けやすいか否かを判定することも可能となる。
【００３１】
なお、毒素には活性を失いやすいものもあり、素早く、少ない回数で、簡便に測定することが必要となる。しかし、本発明によれば、複数のガングリオシドに対する結合親和性を一度に測定できるため、このような毒素に対しても好適に用いることができる。従来のＦＣＳでは、個々のガングリオシドを用いて測定する必要があるため、素早く、少ない回数で、簡便に、複数のガングリオシドに対する生体親和性を測定することは困難であった。また、生体からの採取試料（鼻汁、胃液、粘膜拭い液、分泌・排泄物、血液等）は、雑多な成分を含むことから非特異的なシグナルが得られやすい。つまり従来のＦＣＳでは、非特異的なシグナルの影響を受けるが、本発明によればこのような非特異的シグナルの影響を抑制して測定することが可能である。
【００３２】
なお、本明細書において「毒素」とは、細菌の代謝産物あるいは構成成分の一つであり、微量でヒト生体に不利な反応を引き起こす物質を意図する。
【００３３】
本発明に係る被験物質として利用可能な毒素としては、特に限定されるものではない。毒素の多くは細胞表面の糖脂質に結合するものであるので、糖脂質結合性毒素を用いてもよい。糖脂質結合性毒素としては、例えば、コレラ毒素、ボツリヌス毒素、カンピロバクター毒素、ウェルシュ毒素、易熱性エンテロトキシン、志賀毒素、破傷風毒素、ベロ毒素及びヘリコバクター・ピロリ空胞化毒素を例示できる。
【００３４】
〔１−１．試料調製工程〕
本発明に係る結合親和性測定方法の試料調整工程は、被験物質を含む試料、及び当該被験物質を検出するための複数のプローブを混合すればよい。つまり、本発明には、上記試料及び上記複数のプローブを混合したものをそのまま用いることができる。なお、これらを混合した後に、ろ過等によって夾雑物等を取り除いてもよい。
【００３５】
上記プローブとしては、被験物質に対する結合親和性を評価する目的の物質を用いればよく、限定されるものではない。例えば、被験物質の種類に応じて、タンパク質、ペプチド、糖、ウイルス、核酸、脂質や、その他に様々な低分子化学物質を、蛍光物質で標識したものをプローブとして使用することができる。中でも特異的抗体、ガングリオシド又は糖鎖をプローブとすることが好ましい。
【００３６】
より具体的には、細菌由来の毒素を検出するためのプローブとしては、当該毒素に特異的に結合するものであれば特に限定されないが、ガングリオシドが好ましい。
【００３７】
また、ウイルスを検出するためのプローブとしては、ウイルスに特異的に結合するものであれば特に限定されず、糖、抗体、タンパク質（糖蛋白を含む）、ペプチド、核酸、糖脂質等の脂質、低分子化学物質などが広く例示される。中でも、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス又はアデノウイルスを検出するためのプローブとしては、これらのウイルスそれぞれに特異的に結合しうる糖鎖構造を含むもの、例えばフェツイン等のタンパク質、ガングリオシドＬｙｓｏＧＭ３等の糖脂質が挙げられる。
【００３８】
なお、蛍光物質による標識が無くても蛍光を発する物質を、そのままプローブとする場合、蛍光物質による標識の手間を省くことができる。
【００３９】
また、上記複数のプローブは、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有するものであればよい。励起波長又は蛍光波長は、特に限定されるものではないが、例えば、３５０ｎｍ以上８００ｎｍ以下の蛍光物質により標識されたものを好適に用いることができる。なお、上記蛍光物質の分子量は特に限定されるものではないが、２００００以下が好ましく、さらに好ましくは１２０以上８０００以下である。
【００４０】
混合するプローブの種類は、複数種であれば特に限定されるものではない。例えば、被験物質に対する、３種類のプローブの結合親和性を比較する場合は、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有する蛍光物質で標識した３種類のプローブを用いればよい。本発明者らは、後述する実施例において、２種類のガングリオシド間でのコレラ毒素に対する結合親和性を比較した。
【００４１】
〔１−２．蛍光検出工程〕
本発明に係る結合親和性測定方法の蛍光検出工程は、蛍光相関分光法によって、上記複数のプローブから発せられる蛍光を検出すればよい。また、上記蛍光相関分光法は、上記複数のプローブを検出するための、それぞれ異なる波長のレーザ光を、試料に照射して行なえばよい。各波長の蛍光強度のゆらぎを検出することで、上記複数のプローブのうち、いずれのプローブが被験物質に結合したかを評価することができる。
【００４２】
本発明に係る結合親和性測定方法の蛍光検出工程では、それぞれ異なる波長のレーザ光を照射する以外は、従来公知の蛍光相関分光法（例えば非特許文献１を参照）に従って行なえばよい。
【００４３】
蛍光相関分光法において、それぞれ異なる波長のレーザ光を照射する方法は、特に限定されるものではない。複数のレーザ光は、試料に同時に照射してもよく、それぞれのレーザ光を順次照射してもよい。例えば、従来公知の蛍光相関分光装置であって、発するレーザ光の波長が異なる複数種類の装置を用意して、上記試料調製工程で得た試料をそれぞれの装置に分注して、測定を行なえばよい。また、後述の本発明に係る蛍光相関分光装置を用いて複数種類のレーザ光を順次照射してもよい。いずれの場合においても、複数のプローブを混合した試料を用いることができるため、試料毎の温度のズレや夾雑物濃度によるプローブの非特異的吸着の影響を抑制して結合親和性の測定を行なうことができる。
【００４４】
〔１−３．解析工程〕
上記蛍光検出工程で検出した蛍光強度から、それぞれのプローブの被験物質に対する結合親和性を評価する方法は、特に限定されるものではないが、検出したそれぞれの蛍光強度の自己相関関数を算出して、それぞれの自己相関関数同士を比較する解析工程を行なうことが好ましい。
【００４５】
例えば、自己相関関数によって描かれる曲線を比較することで、いずれのプローブが優先して被験物質に結合したかを簡便に把握することができる。また、自己相関関数からは並進拡散時間を算出することができるので、複数のプローブの被験物質に対する結合親和性を定量的に測定することができる。さらに、被験物質の濃度と並進拡散時間との関係から解離定数を算出することも可能である。
【００４６】
なお、上記解析工程によらず、例えば、計測時間と蛍光強度との関係から、それぞれの蛍光強度のゆらぎを比較して、結合親和性の大小を定性的に評価してもよい。
【００４７】
〔１−４．２種類のプローブを用いた本発明に係る結合親和性測定方法の例〕
以下に、本発明に係る結合親和性測定方法の一実施形態を、図１に基づいて説明する。図１は、本実施の形態に係る結合親和性測定方法の原理を模式的に示した図であり、被験物質としてコレラ毒素を用い、プローブとして、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘで標識したＧＭ１及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識したａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１を用いた場合について示している（図１では、それぞれ単に「ＧＭ１」及び「ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１」と示している）。また、図１（１）及び（２）に示す、ＧＭ１が嵌合している物質がコレラ毒素を示している。
【００４８】
図１（１）及び（２）に示すように、ＧＭ１は、ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１より優先してコレラ毒素に結合する。よって、図１（１）に示すように、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘの励起波長である５３２ｎｍのレーザ光を照射すると、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘに由来する蛍光強度が検出される。そして、当該蛍光強度の自己相関関数Ｇ（τ）を算出すると図１（３）に示すグラフを作成することができる。
【００４９】
ここで、自己相関関数とは、任意の時間ｔにおける蛍光強度Ｉ（ｔ）を基準として、（τ）時間後の蛍光強度Ｉ（ｔ＋τ）の相関を次式（１）で表したものである。
Ｇ（τ）＝｛Ｉ（ｔ）・Ｉ（ｔ＋τ）｝／｛Ｉ（ｔ）｝２・・・（１）
図１（３）に示すように、τが特定の値になるとＧ（τ）は急激に低下する。本明細書では、Ｇ（τ）が低下し始めるτをτ２、低下し終わるτをτ３とする。そして、（τ２＋τ３）／２であるτ１を並進拡散時間として定義する。並進拡散時間が大きいほど、検出した蛍光強度の蛍光を発した分子が大きいことを意味する。
【００５０】
同様に、図１（２）に示すように、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の励起波長である４７３ｎｍのレーザ光を照射すると、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８に由来する蛍光強度が検出される。当該蛍光強度の自己相関関数Ｇ（τ）を算出すると図１（４）に示すグラフを作成することができる。図１（３）と同様に、図１（４）に示すＧ（τ）もτ２’からτ３’までの間で低下しているので、並進拡散時間τ１’は（τ２’＋τ３’）／２である。
【００５１】
図１（５）に示すように、それぞれの自己相関関数を比較すると、τ１はτ１’より大きいことが分かる。これは、ＧＭ１がコレラ毒素に結合して大きな分子を形成してこれが検出されたことを示し、ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１はコレラ毒素に結合しなかったため、小さい分子として検出されたことを示す。この結果から、ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１よりＧＭ１の方が、コレラ毒素に対する結合親和性に優れていることが確認できる。このように、本発明によれば、複数のプローブの被験物質に対する結合の競争性を測定することができる。
＜２．本発明に係る試料中の被験物質を検出する方法＞
本発明に係る結合親和性測定方法を利用すれば、試料中の被験物質を検出することも可能である。即ち、本発明に係る試料中の被験物質を検出する方法（以下、「被験物質検出方法」という）は、試料、及び上記被験物質を検出するための複数のプローブを混合する試料調製工程と、蛍光相関分光法によって、上記複数のプローブから発せられる蛍光を検出する蛍光検出工程と、を含み、上記複数のプローブは、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有し、上記被験物質に対する結合親和性が既知のものであり、上記蛍光相関分光法は、上記複数のプローブを検出するための、それぞれ異なる波長のレーザ光を、試料に照射して行なえばよい。なお、本実施の形態では、上記本発明に係る結合親和性測定方法と同様の構成については説明を省き、主に、上記本発明に係る結合親和性測定方法との相違点について説明する。
【００５２】
本発明に係る被験物質検出方法では、予め、被験物質に対する結合親和性が既知の複数のプローブを用いる。そして、上述の本発明に係る結合親和性測定方法と同様の操作を行なえば、実際に得られた当該プローブの結合親和性と既知の結合親和性とを比較することで、試料中の被験物質を定性的に又は定量的に検出することができる。本発明者らは、後の実施例で述べるように、インフルエンザウイルスに対して結合性を有するフェツインと、結合性を有さないグルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」と表記する）とを用いて、試料中のインフルエンザウイルスを検出した。
【００５３】
ここで、結合親和性が既知のプローブとは、必ずしも解離定数等の具体的な数値が既知のプローブのみを意図しているものではない。目的とする検出精度に応じて、使用するプローブの結合親和性の被験物質に対する結合親和性が予測できるものを用いればよい。また、上記本発明に係る結合親和性測定方法や、従来公知の結合親和性の測定方法によって、予め被験物質と複数のプローブとの結合親和性を測定する工程を行ない、その後に、本発明に係る被験物質検出方法の試料調製工程や蛍光検出工程を行なってもよい。
【００５４】
本発明に係る被験物質検出方法によれば、複数のプローブを用いて検出することができるので、信頼性が高い検出結果を得ることができる。また、結合親和性が既知であるプローブを複数用いて、当該複数のプローブによる蛍光強度を比較して検出を行なうため、別途ネガティブコントロール等と比較する作業を行なわなくてもよい。そのため従来のＦＣＳで問題となっていた温度条件や夾雑物濃度のズレが除かれた結果を得ることができる。
【００５５】
なお、インフルエンザウイルスの検出を行なう場合に用いるプローブとしては、特に限定されるものではない。インフルエンザウイルスに対する抗体を用いれば、感度が向上するため好ましい。また、後述の実施例のように、フェツインのようなインフルエンザウイルスに結合するタンパク質を用いれば、検出を安価に行なうことができるため好ましい。
＜３．本発明に係る蛍光相関分光装置＞
本発明に係る蛍光相関分光装置の一実施形態について図２を用いて説明する。図２は本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１の概略構成を示す図である。
【００５６】
まず、蛍光相関分光装置１の構成について説明する。蛍光相関分光装置１は、試料搭載部２（試料搭載手段）、対物レンズ３、５３２ｎｍレーザ（レーザ光照射手段）４、４７３ｎｍレーザ５（レーザ光照射手段）、切り替えミラー６（切り替え手段）、ピンホール７、光検出器８、デジタル相関器１２（解析手段）を備えている。なお図１には、蛍光相関分光装置１に供する試料１０、試料１０中に形成される共焦点領域１１をも示している。
【００５７】
試料搭載部２は、試料１０を搭載するための試料搭載手段である。具体的には、レーザ光を通過させることが可能な貫通孔を設けた台座である。試料搭載部２には、スライドガラス等をセットして、当該スライドガラスの上に試料１０を滴下すればよい。
【００５８】
試料１０としては、例えば、上述の本発明に係る結合親和性測定方法や被験物質検出方法で説明した試料に、それぞれ励起波長又は蛍光波長が異なる複数のプローブを混合したものを用いることができる。本実施の形態では、試料１０には、波長が５３２ｎｍのレーザ光で励起されるプローブと波長が４７３ｎｍのレーザ光で励起されるプローブとの、２種類のプローブが混合されているものとして説明する。
【００５９】
対物レンズ３は、後述する５３２ｎｍレーザ４及び４７３ｎｍレーザ５から照射されたレーザの焦点を絞って、試料１０中に共焦点領域１１を形成するものである。
【００６０】
５３２ｎｍレーザ４及び４７３ｎｍレーザ５は、レーザ光照射手段として機能するものであり、それぞれ５３２ｎｍ、４７３ｎｍの波長のレーザ光を照射する。レーザの光源としては特に限定されるものではない。例えば、５３２ｎｍのレーザ光の光源、及び４７３ｎｍのレーザ光の光源としてともに半導体励起固体レーザを用いればよい。
【００６１】
切り替えミラー６は、５３２ｎｍレーザ４及び４７３ｎｍレーザ５のうち、試料１０に照射するレーザ光を選択するための切り替え手段である。切り替えミラー６としては、従来公知のダイクロイックミラー等を用いればよい。また、切り替えミラー６は、５３２ｎｍレーザ４及び４７３ｎｍレーザ５のいずれかから照射されたレーザ光が試料１０に導かれるように、図２に示す矢印方向に回動する。図２に示す実線で示した箇所に切り替えミラー６が位置するときは、５３２ｎｍレーザ４によるレーザ光が試料１０に導かれ、破線の箇所に切り替えミラー６が位置するときは、４７３ｎｍレーザ５によるレーザ光が試料１０に導かれる。
【００６２】
ピンホール７は、試料１０から発せられた蛍光を光検出器８に導くためのものである。また、光検出器８は当該蛍光を検出するためのものである。
【００６３】
デジタル相関器１２は、試料１０から発せられた、それぞれの蛍光強度から、当該蛍光強度の自己相関関数を算出して、それぞれの自己相関関数同士を比較する解析手段である。なお、デジタル相関器１２は、検出された蛍光強度から自己相関関数を算出することが可能なコンピュータ等を外付けして用いてもよい。つまり、本発明に係る蛍光相関分光装置は、上記解析手段を備えることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００６４】
次に、蛍光相関分光装置１の動作について説明する。
【００６５】
試料搭載部２に試料１０を滴下した後、使用者の設定に応じて、５３２ｎｍレーザ４及び４７３ｎｍレーザ５から発せられたレーザ光が試料１０に、順次照射される。ここでは説明の便宜のため、まず、試料１０に対して５３２ｎｍレーザ４によりレーザ光を照射して、次に４７３ｎｍレーザ５によるレーザ光を照射する場合について説明する。
【００６６】
５３２ｎｍレーザ４から発せられたレーザ光は、切り替えミラー６によって試料１０の方向に導かれる。そして当該レーザ光は対物レンズ６によって絞られ、試料中に共焦点領域１１が形成される。共焦点領域１１は、図２に示すように略円柱状の領域となる。なお、共焦点領域１１の容積は、１×１０−１６リットル以上１×１０−１０リットル以下が好ましく使用され、さらに好ましくは１×１０−１６リットル以上１×１０−１３リットル以下である。つまり、蛍光相関分光装置１は、この範囲の共焦点領域を形成可能な対物レンズを備えることが好ましい。
【００６７】
試料中の分子はブラウン運動により動き回っており、共焦点領域１１内を通過した分子が観察の対象となる。つまり、共焦点領域１１内に、波長５３２ｎｍのレーザ光で励起する蛍光物質により標識されたプローブが存在すれば、当該蛍光物質から蛍光が発せられる。そして、当該蛍光はピンホール７を通過して光検出器８によって検出される。
【００６８】
５３２ｎｍレーザ４による検出が終わった後は、切り替えミラー６が回動して、図２に示す破線の箇所に位置する。そして、４７３ｎｍレーザ５によるレーザ光が発せられ、試料１０に導かれる。ここで、共焦点領域１１内に、波長４７３ｎｍのレーザ光で励起される蛍光物質で標識されたプローブが存在すれば、当該蛍光物質から蛍光が光検出器８によって検出される。
【００６９】
光検出器８によって検出されたそれぞれの蛍光強度に基づいて、デジタル相関器１２によって自己相関関数が算出される。それぞれの自己相関関数を比較することによって、試料中の被験物質に対する上記２種類のプローブの結合親和性を測定したり、試料中の被験物質の検出を行なったりすることができる。
【実施例】
【００７０】
〔実施例１：蛍光標識ガングリオシドを用いた競争的ＦＣＳ〕
（装置）
本実施例では、二台の蛍光相関分析装置（ＦＣＳ‐１０１（５３２ｎｍ ｌａｓｅｒ）、ＦＣＳ‐１０１Ｂ（４７３ｎｍ ｌａｓｅｒ）、いずれも東洋紡社製）の一台のコンピュータにつなぎ、同時に測定を行なった。得られた結果を、ＦＣＳ‐１０１に添付のＦＣＳ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。
【００７１】
また、ＦＣＳ‐１０１及びＦＣＳ‐１０１Ｂのセットアップは、付属のマニュアルに従って行なった。具体的には、超純水を用いてステージ位置を調整して、１０ｎＭ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ６Ｇで機器の状態を確認した。また、ＦＣＳ‐１０１では１０ｎＭ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅで標識されたＧＭ１を用いて、ＦＣＳ‐１０１ＢではＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識されたＧＭ１を用いてＦＣＳ相関を測定して、プローブの状態を確認した。なお、上記超純水とは、Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステム（ミリポア社製）を用いて精製した超純水であり、以下「Ｍｉｌｌｉ‐Ｑ水」と表記する。
【００７２】
（コレラ毒素）
コレラ毒素としては、Ｌｉｓｔ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ.より凍結乾燥されたものを購入して用いた。これを、２０ｍＭ ＣＴになるように調製して、２０ｍｌずつ分注して−２０℃で保存した。なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色によって、夾雑蛋白質が存在しないことを確認した。凍結保存したコレラ毒素は、実験ごとに必要に応じて解凍して、Ｍｉｌｌｉ‐Ｑ水で３．７倍希釈して、５．４ｍＭの濃度で使用した。
【００７３】
（ガングリオシド）
本実施例では、ガングリオシドとして、上述したＧＭ１、ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１の他に、ガングリオシドＧＭ２、ガングリオシドＧＭ３、ガングリオシドＧＤ１ａ（以下、それぞれ、「ＧＭ２」、「ＧＭ３」、「ＧＤ１ａ」と表記する）を用いた。ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１はＳＩＧＭＡ‐ＡＬＤＲＩＣＨ社より、残りのガングリオシドはｌｙｓｏ体をＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ Ｉｎｃ．より購入した。ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１のｌｙｓｏ体化は次のようにして行なった。４０ｎｍｏｌのａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１を、５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ(ｐＨ６．０)、４％ ＴＤＣ、１Ｕ／ｍＬ ＳＣＤａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ(ＳＩＧＭＡ社)に混合して、超純水を用いて全量を４０ｍｌとした。さらに、４００ｍｌのｎ‐ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅを重層した。そして、３７℃で２４時間インキュベートした後、ｎ‐ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅを除去した。
【００７４】
（蛍光標識ガングリオシド）
ガングリオシドを標識する蛍光物質として、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘ及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８を用いた。標識は次のようにして行なった。
【００７５】
ｌｙｓｏ体ガングリオシドのＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ１ａを、それぞれ、１０ｍＭのＤＭＦ溶液に溶解した。次に、１０ｍＭ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）、又は１０ｍＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を等量加えた。次に、１％ＴＥＡのＤＭＦ溶液を終濃度０．１％となるように加え、室温、遮光下で２４時間振盪して、蛍光標識体を得た。
【００７６】
ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１では、まず、上述の方法で得たｌｙｓｏ体ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１の溶液に、ＤＭＦを等量加えた後、１％ＴＥＡを終濃度０．１％となるように加えた。次に、ＤＭＦに溶解した５ｍＭ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ‐Ｘ， ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ又は５ｍＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ， ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒを３２μｌ（１６０ｎｍｏｌのａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１に対して４等量）加えて室温、遮光下で２４時間振盪した。これにより、ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１の蛍光標識体を得た。
【００７７】
次に、得られた蛍光標識体を、ＲＰ‐ＨＰＬＣで精製した。測定系には、ＧＩＬＳＯＮ社製のポンプとＵＶ／ＶＩＳ‐１５１検出器を用いた。次に、４．６×１５０‐ｍｍ ＣＯＳＭＯＳＩＬ ＯＤＳ ＡＲ‐IIを用いて、室温で、蛍光標識ガングリオシドを分離した。なお、移動相の溶液Ａとして０．０５％ＴＦＡを含むＭｉｌｌｉ‐Ｑ水を用い、溶液Ｂとして０．０５％ＴＦＡを含むアセトニトリルを用いた。Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ‐Ｘで標識したガングリオシドは、イニシャル条件５０％溶液Ｂから１％／ｍｉｎで３０分間、終濃度８０％までグラジエントをかけて、５７０ｎｍの吸収強度を観測することで分離した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識したガングリオシドは、イニシャル条件１０％溶液Ａから１．３％／ｍｉｎで４０分間、終濃度９０％までグラジエントをかけて、４９５ｎｍの吸収強度を観測することで分離した。
【００７８】
なお、以下、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘで標識したＧＭ１等のガングリオシドを、「Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ１」や「Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ‐ガングリオシド」等と表記し、同様にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識したＧＭ１等のガングリオシドを、「Ａｌｅｘａ ４８８‐ＧＭ１」や「Ａｌｅｘａ４８８‐ガングリオシド」等と表記する。
（コレラ毒素と蛍光標識ガングリオシドによる競争的ＦＣＳ）
各蛍光標識ガングリオシドとコレラ毒素との混合は、次にようにして行なった。まず、４μＭのＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ガングリオシドと４μＭのＡｌｅｘａ４８８‐ガングリオシドとを等量混合した。次に、凝集体を除くためにＵｌｔｒａｆｒｅｅ‐ＭＣ ０．１ｍｍｐｏｒｅ Ｄｕｒａｐｏｒｅ（ミリポア社製）を用いて、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心して濾過を行なった。遠心にはＣＦ‐１５ＲＸＩＩＩ（ＨＩＴＡＣＨＩ社製）を用いた。次に、各蛍光標識ガングリオシドが２０ｎＭとなるように希釈した。次に、５．４μＭ〜５．３ｎＭの範囲で二倍段階希釈した各濃度のコレラ毒素と各蛍光標識ガングリオシドとを等量ずつ混合した。次に、３７℃、遮光条件下で１時間インキュベーションしてＦＣＳ用サンプルとした。
【００７９】
後述するそれぞれの２種類の蛍光標識ガングリオシドによる競争的ＦＣＳは、ＦＣＳ‐１０１、ＦＣＳ‐１０１Ｂに、各サンプルを３０μｌずつアプライして、同時に測定することで行なった。測定時のレーザ強度は、ＦＣＳ‐１０１では１ｍＷ、ＦＣＳ‐１０１Ｂでは０．１００〜０．２７６ｍＷとした。
【００８０】
結果を図３〜７に示す。図３は、Ａｌｅｘａ４８８‐ＧＭ１及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ２を用いて競争的ＦＣＳを行なった結果を示す図である。図４は、Ａｌｅｘａ４８８‐ＧＭ１及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ３を用いて競争的ＦＣＳを行なった結果を示す図である。図５は、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ１及びＡｌｅｘａ４８８‐ＧＭ３を用いて競争的ＦＣＳを行なった結果を示す図である。図６は、Ａｌｅｘａ４８８−ＧＭ１及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１を用いて競争的ＦＣＳ行なった結果を示す図である。図７は、Ａｌｅｘａ ４８８‐ＧＭ２及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ３を用いて競争的ＦＣＳを行なった結果を示す図である。なお、図３〜７において、横軸はコレラ毒素濃度を示し、縦軸は並進拡散時間を示し、丸印はＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘにより標識したガングリオシドの結果を示し、四角印はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８により標識したガングリオシドの結果を示す。
【００８１】
また、図３〜７で示した結果から、それぞれの図に示した２種のガングリオシドの、並進拡散時間の差をグラフにしたものを図８に示す。図８は２種類の蛍光標識ガングリオシにおける並進拡散時間の差を示す図であり、（ａ）はＧＭ１とＧＭ２との差（丸印）、ＧＭ１とＧＭ３との差（四角印）、ＧＭ１とａｓｉａｌｏ−ＧＭ１（三角印）との差を示し、（ｂ）はＧＭ２とＧＭ３との差を示す。
【００８２】
図８（ａ）に示すように、コレラ毒素とＧＭ１との結合に対する阻害の強さは、ａｓｉａｌｏ−ＧＭ１＞ＧＭ２＞ＧＭ３であることが示された。図８（ｂ）に示すように、ＧＭ２及びＧＭ３の、コレラ毒素に対する結合親和性は同程度であることが示された。
【００８３】
以上の結果から、蛍光標識ガングリオシド及びコレラ毒素を用いた競争的ＦＣＳによって、ガングリオシド間のコレラ毒素に対する相対的な結合親和性の差を求めることができた。このように、競争的ＦＣＳを用いることによって、コレラ毒素に対するガングリオシドタイピングが可能であることが示された。また、以上の結果は、ガングリオシドを蛍光標識することで、ＦＣＳにより毒素を検出するためのプローブとして用いることが可能であることや、蛍光標識ガングリオシドを用いたＦＣＳにより毒素を検出することの妥当性も示したといえる。
〔実施例２：２種類の蛍光プローブを用いたウイルスの検出〕
（ウイルス）
本実施例では、インフルエンザウイルスＡ／Ｈｙｏｇｏ／７３／２００２株（兵庫県立健康環境科学研究センター山岡正興氏より分与された。以下、「Ｈｙｏｇｏ株」と表記する）を用いた。Ｈｙｏｇｏ株は、血清を加えていないＤＭＥＭ培地で培養して用いた。
【００８４】
（蛍光プローブの作成）
インフルエンザウイルスには、シアル酸が結合することが知られている。そこで、シアル酸を有するタンパク質であるフェツイン（ＳＩＧＭＡ社製）と、シアル酸を有さないタンパク質であるＧＳＴとを蛍光標識した。フェツインはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識して、ＧＳＴはＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ‐Ｘで標識した。なお、ＧＳＴは大腸菌破砕液から精製した。
【００８５】
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８によるフェツインの標識では、まず、３．７×１０−５Ｍ フェツイン、７４ｍＭ炭酸水素ナトリウム、ＤＭＳＯに溶解した１．９×１０−４Ｍ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を混合した。
【００８６】
ＧＳＴの標識では、まず、１．６×１０−５Ｍ ＧＳＴ、４６ｍＭ 炭酸水素ナトリウム、ＤＭＳＯに溶解した９．０×１０−５Ｍ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を混合した。
【００８７】
次に、それぞれの混合物を遮光、攪拌しながら室温で１時間反応させた。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化されたゲルろ過スピンカラムを用いて未反応蛍光物質の分離を行なった。当該ゲルろ過スピンカラムでは、３０，０００ＭＷ以下の分子を排除することが可能である。次に、遠心式ろ過ユニット（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ＹＭ−３、Ａｍｉｃｏｎ社製、分画分子量 ３，０００Ｄａ ＮＭＷＬ）を用いて濃縮した。
【００８８】
濃縮後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）で分離した後、フルオロ・イメージアナライザー（フジフィルム株式会社製、ＦＬＡ−３０００）を用いて蛍光標識を確認した。以下、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識されたフェツインを「Ａｌｅｘａ ４８８‐フェツイン」と表記し、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ‐Ｘで標識されたＧＳＴを「Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＳＴ」と表記する。
【００８９】
（競争的ＦＣＳ）
血清が含まれていないＤＭＥＭ培地で希釈した１×１０６ＣＩＵ／ｍｌ Ｈｙｏｇｏ株と、ＰＢＳ（−）で希釈して１．４ＭとしたＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＳＴと、上述の方法で得たＡｌｅｘａ ４８８‐フェツインをＰＢＳ（−）で５０倍希釈した溶液とを、容積比２：１：１で混合して、室温で１０分間インキュベーションした。次に、実施例１で用いた２つのＦＣＳ装置（ＦＣＳ‐１０１及びＦＣＳ‐１０１Ｂ）を用いて、同時に測定を行なった。なお、比較のため、ネガティブコントロールとして、血清が含まれていないＤＭＥＭ培地であって、インフルエンザウイルスが含まれていないＤＭＥＭ培地を用いて同様に測定を行なった。ＦＣＳの測定では、ＦＣＳ‐１０１に付属のソフトウェア（浜松ホトニクス社製、ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒ．３．００）を用いた。測定条件は、計測回数を２０回、計測時間３．５秒とした。この結果を図９に示す。図９はＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＳＴ及びＡｌｅｘａ ４８８‐フェツインを用いたＦＣＳの結果から作成した相関曲線を示す図であり、（ａ）はＨｙｏｇｏ株が含まれるＤＭＥＭ培地を供した結果を示し、（ｂ）はＨｙｏｇｏ株が含まれないＤＭＥＭ培地を供した結果を示す。また、実線はＡｌｅｘａ ４８８‐フェツイン由来の蛍光を検出した結果を示し、破線はＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＳＴ由来の蛍光を検出した結果を示す。
【００９０】
図９（ａ）と（ｂ）との比較によって示されるように、インフルエンザウイルスはフェツインと結合するため、Ａｌｅｘａ４８８を検出することが可能な４７３ｎｍのレーザを用いた場合、シグナルは大きく変動する。つまり、Ｈｙｏｇｏ株を含むＤＭＥＭ培地を供した場合、Ｈｙｏｇｏ株を含まないＤＭＥＭ培地を供した結果に比べて、拡散時間が増加する。これは、Ａｌｅｘａ ４８８‐フェツインとＨｙｏｇｏ株とが結合することで分子量が増加して、溶液中での並進拡散速度が低下するからである。
【００９１】
一方、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＳＴを検出可能な５３２ｎｍのレーザを用いた場合では、Ｈｙｏｇｏ株を含むＤＭＥＭ培地の測定を行なってもシグナルはほとんど変化しない。つまり、Ｈｙｏｇｏ株を含まないＤＭＥＭ培地の測定により算出される拡散時間を示す曲線と同じ曲線が得られる。
【００９２】
つまり、Ａｌｅｘａ ４８８‐フェツイン及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＳＴを用いて競争的ＦＣＳを行ない、それぞれの蛍光から得られる拡散時間を示す曲線の差を測定することで、測定条件のブレや非特異的結合を除いた、インフルエンザウイルスの存在を検出することが可能であることが示された。なお、本実施例では説明の便宜のため、ネガティブコントロールを用いて比較を行なったが、ＧＳＴ又はフェツインのインフルエンザウイルスに対する結合性は既知であるため、当該比較を行なわなくても、図９（ａ）に示す結果のみから試料中にインフルエンザウイルスが存在していたことが確認できる。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明によれば、被験物質に対する複数のプローブの、結合の競争性を評価することができる。特に、種々のガングリオシドに対する結合親和性を測定することで、細菌由来の毒素のタイピングを簡便、迅速かつ高感度に行なうことができるため、細菌による感染症の医薬品開発等に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】本発明の一実施形態に係る結合親和性測定方法の原理を模式的に示した図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る蛍光相関分光装置の概略構成を示す図である。
【図３】Ａｌｅｘａ４８８‐ＧＭ１及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ２を用いて競争的ＦＣＳを行なった結果を示す図である。
【図４】Ａｌｅｘａ４８８‐ＧＭ１及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ３を用いて競争的ＦＣＳを行なった結果を示す図である。
【図５】Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ１及びＡｌｅｘａ４８８‐ＧＭ３を用いて競争的ＦＣＳを行なった結果を示す図である。
【図６】Ａｌｅｘａ４８８−ＧＭ１及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１を用いて競争的ＦＣＳ行なった結果を示す図である。
【図７】Ａｌｅｘａ ４８８‐ＧＭ２及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ３を用いて競争的ＦＣＳを行なった結果を示す図である。
【図８】２種類の蛍光標識ガングリオシにおける並進拡散時間の差を示す図である。
【図９】Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＳＴ及びＡｌｅｘａ ４８８‐フェツインを用いたＦＣＳの結果から作成した相関曲線を示す図である。
【符号の説明】
【００９５】
１ 蛍光相関分光装置
２ 試料搭載部（試料搭載手段）
４ ５３２ｎｍレーザ（レーザ光照射手段）
５ ４７３ｎｍレーザ（レーザ光照射手段）
６ 切り替えミラー（切り替え手段）
１０ 試料
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法及びその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトや家畜に対して病原性を示す細菌は、宿主細胞内に侵入するか、毒素を産生して宿主を攻撃し、各種の症状を引き起こす。中でも、コレラ毒素やボツリヌス毒素、百日咳毒素といった外毒素は、細胞に対する強い毒性作用を有する。これらの毒素は、細胞表面上に存在するガングリオシドの糖鎖構造を特異的に認識し、細胞内に侵入して様々な経路を経て毒性を発現させる。
【０００３】
ガングリオシドには様々な種類がある。そして、毒素の種類によって、ガングリオシド毎の結合親和性が異なる。例えば、コレラ毒素は、ガングリオシドＧＭ１（以下、「ＧＭ１」と表記する）に対する結合親和性が高く、アシアロガングリオシドＧＭ１（以下、「Ａｓｉａｌｏ ＧＭ１」と表記する）に対する結合親和性が低いことが知られている。この毒素の種類によってガングリオシドに対する結合親和性が異なることを利用すれば、生体試料中にどのような毒素が含まれているか等のタイピングが可能となる。
【０００４】
従来、毒素の、複数種のガングリオシドに対する結合親和性を測定する方法として、表面プラズモン共鳴法等が用いられてきた（非特許文献１）。
【０００５】
また、ヒトや家畜に対して病原性を示すウイルスの一部は、宿主細胞内に侵入する際に、細胞表面に存在する修飾糖鎖構造を特異的に認識し、結合することにより感染を成立させる。
【０００６】
細胞表面の修飾糖鎖構造はガングリオシドである場合もあるし、タンパク質に結合した糖鎖の場合等もありうる。これらの修飾糖鎖構造には様々な種類がある。一部のウイルスは、その種類・型・亜型の違いによって、細胞表面の修飾糖鎖構造に対する結合親和性が異なる。例えば、ヒトに主に感染するインフルエンザウイルス（以下、「ヒトインフルエンザウイルス」と表記する）は、細胞表面の修飾糖鎖構造のうち末端に２−６結合型シアル酸を含むものに対する結合親和性が高く、一方、トリに主に感染するインフルエンザウイルス（以下、「トリインフルエンザウイルス」と表記する）は、細胞表面の修飾糖鎖構造のうち末端に２−３結合型シアル酸を含むものに対する結合親和性が高く、さらに両者ともシアル酸を含まない修飾糖鎖構造に対する結合親和性が低いことが知られている。このウイルスの種類によって細胞表面の修飾糖鎖構造に対する結合親和性が異なることを利用すれば、生体試料中にどのようなウイルスが含まれているか等のタイピングが可能となる。
【０００７】
一方、簡便で高感度かつ迅速に、試料中の分子を検出することができる方法として、蛍光相関分光法(Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、以下「ＦＣＳ」と表記する)が知られている（非特許文献２）。ＦＣＳは、蛍光標識した分子のブラウン運動に由来する、蛍光強度のゆらぎを測定することで、当該分子の数、大きさ等を測定する方法である。ＦＣＳの応用例として、例えば非特許文献１では、互いに異なる蛍光波長を有する蛍光物質で標識した２種類の分子の、分子間相互作用を評価する方法も記載されている。これは、２種類のレーザ光を同時に照射して、２つの分子が、別々に動いているか同時に動いているかを解析するものである。
【０００８】
また、ＦＣＳを利用したウイルスの検出方法も提案されている（特許文献１）。特許文献１では、ウイルス結合性物質を試料に混合してＦＣＳに供して、検出される分子の大きさによって試料中のウイルスの有無を判定する方法が開示されている。つまり、検出される分子の大きさによって、当該分子が、当該ウイルス結合性物質のみか当該ウイルス結合性物質とウイルスとが結合した分子かを判定することで、試料中のウイルスを検出する。
【特許文献１】特開２００７−２０５６５（平成１９年２月１日公開）
【非特許文献１】Kuziemko, G. M. et al., Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Ganglioside Determined by Surface Plasmon Resonance., Biochemistry., 1996, 35, 6375-6384
【非特許文献２】金城政孝，西村吾郎，「蛍光相関分光法」，蛍光分光とイメージングの手法，学会出版センター，２００６年，ｐ．１３３−１６０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
細菌由来の毒素又はウイルスのタイピングを行なうためには、複数のガングリオシド又は糖鎖に対する当該毒素又はウイルスの結合親和性を測定して、当該毒素又はウイルスがどの種類のガングリオシド又は糖鎖に優先的に結合するか等を評価する必要がある。そのためには、毒素等の一つの被験物質に対する、ガングリオシド等の複数のプローブ結合親和性を測定する技術が必要である。しかし、従来、一つの被験物質に対する複数のプローブの結合親和性を、簡便、迅速、高感度かつ高い再現性で測定する方法は存在しなかった。
【００１０】
例えば非特許文献１に記載のＳＰＲ法では、被験物質を基板上に固定する必要があるため煩雑な前処理等を要し、測定にも長時間を要する。
【００１１】
一方、ＦＣＳでは、検査対象の試料にレーザ光を照射して蛍光を検出すればよいため、実時間で迅速に測定することができる。また、測定する領域の溶液は、数フェムトリットルであり極めて微量であるため、少量の試料で測定することができる。生体試料を直接供することも可能であり、生態環境に近い状態で検査を行なうことができる。さらにＦＣＳは個々の分子結合を検出できるため、ＳＰＲに比べて感度も高い。
【００１２】
しかしながら、ＦＣＳは、一つの分子に対する、別の一つの分子の結合を測定するために用いられてきた方法である。例えば、非特許文献２及び特許文献１においても、二つの化合物間における相互作用や、一種類のウイルス結合性物質を用いたウイルスの検出等に用いられている。
【００１３】
そのため、従来のＦＣＳによって被験物質に対する複数のプローブの結合親和性を測定する場合、被験物質に一つのプローブを混合した試料を用いてＦＣＳを行ない、別途、被験物質に異なるプローブを混合して作製した試料を用いてＦＣＳを行なった上で、両者の結果を比較する必要がある。
【００１４】
しかし、これでは被験物質に対して複数のプローブのうちどのプローブが優先的に結合するかを評価することができない。また、上述のようにＦＣＳに供した試料の内、レーザ光が照射される領域は数フェムトリットルという極めて微小な領域である。微小な領域では、温度や、被験物質に吸着する可能性のある夾雑物の影響が大きい。そのため、別々の試料を用いると、ＦＣＳに供する試料毎の温度差や夾雑物濃度の差の影響を大きく受ける。測定時間がずれると外環境の温度の差による影響も大きくなる。そして、これらの影響により、測定結果の再現性も悪くなる。
【００１５】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、簡便、迅速、高感度かつ高い再現性で、被験物質に対する複数のプローブの結合の競争性を評価することが可能な、被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法及びそれに用いる蛍光相関分光装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明に係る被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法は、上記課題を解決するために、被験物質を含む試料、及び当該被験物質を検出するための複数のプローブを混合する試料調製工程と、蛍光相関分光法によって、上記複数のプローブから発せられる蛍光強度を検出する蛍光検出工程と、を含み、上記複数のプローブは、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有するものであり、上記蛍光相関分光法は、上記複数のプローブを検出するための、それぞれ異なる波長のレーザ光を、試料に照射することで行なうことを特徴としている。
【００１７】
本発明に係る被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法は、上記被験物質は、細菌由来の毒素またはウイルスであることがより好ましい。
【００１８】
本発明に係る被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法は、上記被験物質は、コレラ毒素、ボツリヌス毒素、カンピロバクター毒素、ウェルシュ毒素、易熱性エンテロトキシン、志賀毒素、破傷風毒素、ベロ毒素又はヘリコバクター・ピロリ空胞化毒素、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルスであることがより好ましい。
【００１９】
本発明に係る被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法は、上記蛍光検出工程によって検出したそれぞれの蛍光強度から、当該蛍光強度の自己相関関数を算出して、それぞれの自己相関関数同士を比較する解析工程をさらに含むことがより好ましい。
【００２０】
本発明に係る試料中の被験物質を検出する方法は、試料、及び上記被験物質を検出するための複数のプローブを混合する試料調製工程と、蛍光相関分光法によって、上記複数のプローブから発せられる蛍光を検出する蛍光検出工程と、を含み、上記複数のプローブは、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有するものであり、上記蛍光相関分光法は、上記複数のプローブを検出するための、それぞれ異なる波長のレーザ光を、試料に照射することで行なうことを特徴としている。
【００２１】
本発明に係る蛍光相関分光装置は、上記課題を解決するために、蛍光相関分光法を行なうための装置であって、試料を搭載するための試料搭載手段と、上記試料搭載手段に搭載された試料に対して、それぞれ異なる波長のレーザ光を試料に照射する複数のレーザ光照射手段と、上記複数のレーザ光照射手段のうち、上記試料搭載手段に搭載された試料に対してレーザを照射するために用いるレーザ光照射手段を切り替えるための切り替え手段と、を備えることを特徴としている。
【００２２】
本発明に係る蛍光相関分光装置は、上記それぞれ異なる波長のレーザ光が上記試料に照射されることによって、検出されたそれぞれの蛍光強度から、当該蛍光強度の自己相関関数を算出して、それぞれの自己相関関数同士を比較する解析手段を備えてもよい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に係る被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法は、以上のように、被験物質を含む試料、及び当該被験物質を検出するための複数のプローブを混合する試料調製工程と、蛍光相関分光法によって、上記複数のプローブから発せられる蛍光強度を検出する蛍光検出工程と、を含み、上記複数のプローブは、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有するものであり、上記蛍光相関分光法は、上記複数のプローブを検出するための、それぞれ異なる波長のレーザ光を、試料に照射することで行なう。よって、簡便、迅速、高感度かつ高い再現性で、被験物質に対する複数のプローブの結合の競争性を評価することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２５】
＜１．本発明に係る被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法＞
本発明に係る被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法（以下、「結合親和性測定方法」と表記する）は、被験物質を含む試料、及び当該被験物質を検出するための複数のプローブを混合する試料調製工程と、蛍光相関分光法によって、上記複数のプローブから発せられる蛍光強度を検出する蛍光検出工程と、を含めばよく、上記複数のプローブは、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有するものであり、上記蛍光相関分光法は、上記複数のプローブを検出するための、それぞれ異なる波長のレーザ光を、試料に照射して行なえばよい。
【００２６】
本発明によれば、複数のプローブを混合した状態で測定を行なえるため、被験物質に対する複数のプローブの、結合の競争性を評価することができる。例えば、被験物質として毒素を用いた場合、様々なガングリオシドのうち、どのガングリオシドに対して優先的に結合するかを測定することができる。つまり本発明は、複数のプローブの被験物質に対する結合親和性の競争性を測定可能な、競争的ＦＣＳとも呼べる全く新たな方法を提供するものである。以下、被験物質を検出するための、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有する複数のプローブを、試料に混合してＦＣＳを行なう方法を「競争的ＦＣＳ」と表記することもある。
【００２７】
また、本発明に係る結合親和性測定方法では、一つの被験物質に対して、複数のプローブを混合した状態で、ＦＣＳによる測定を行なうことができる。つまり、複数のプローブを別々に混合させた試料を調製する必要がない。そのため、試料毎の温度や夾雑物濃度の差による影響を受けずにＦＣＳを行なうことができる。また、上記被験物質及び複数のプローブを混合した試料に対して、同時に又は速やかに、異なる波長のレーザ光を照射することができるため、外環境の温度差の影響を抑えることができる。よって、簡便、迅速、高感度かつ高い再現性で、被験物質に対する複数のプローブの、結合の競争性を評価することができる。
【００２８】
本発明に係る結合親和性測定方法で利用することができる被験物質とは、特に限定されるものではなく、タンパク質、ペプチド、糖、ウイルス、核酸、脂質や、その他に様々な低分子化学物質を例示することができる。特に、本発明では、被験物質として細菌由来の毒素やウイルスを用いるとよい。つまり、本発明は細菌由来の毒素やウイルスに対する複数のプローブの結合親和性を好適に測定することができる。
【００２９】
ここで、ウイルスとしては、例えば、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ＥＢウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、ＳＡＲＳ、（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ）型肝炎ウイルス、手足口病ウイルス、フラビウイルス（黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス）、トガウイルス、ブタコレラウイルス、ウシ下痢ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ＲＳウイルス、ペストウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトインフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス等のインフルエンザウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ラブドウイルス（狂犬病ウイルス、水泡性口内炎ウイルス）、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、エンテロウイルス）、脳脊髄炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、アレナウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ラサウイルス）、レトロウイルス（ＨＴＬＶ：ヒト成人白血病ウイルス、ＨＩＶ：エイズウイルス、ネコ白血病肉腫ウイルス、牛白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス）、ロタウイルス、エボラウイルス、ポックスウイルス（ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、天然痘ウイルス）、パルボウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ウマヘルペスウイルス、ネコヘルペスウイルス等を例示できる。中でも、本発明は、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス又はアデノウイルスに対する複数のプローブの結合親和性を好適に測定することができる。
【００３０】
また、本発明では、細菌由来の毒素に対する複数のプローブの結合親和性を、簡便、迅速かつ高感度に測定することができる。従来、細菌由来の毒素に対する、複数のプローブの結合親和性を、簡便、迅速かつ高感度に測定可能な方法は報告されていなかった。しかし、本発明によれば、試料から当該毒素を抽出したり、ＳＰＲのように当該毒素を基板に固定したりする必要がないため、簡便かつ迅速に行なうことができる。また、上述のように外環境の温度差や、試料毎の温度及び夾雑物濃度の差による影響を防ぎ、高感度に測定することができる。従って、本発明は毒素に対するプローブの結合親和性を測定する方法として好適に用いることができる。複数のガングリオシドの、毒素に対する結合親和性の差や競争性を測定して網羅しておけば、保有するガングリオシドの種類や量等によるヒトの体質によって当該毒素の影響を受けやすいか否かを判定することも可能となる。
【００３１】
なお、毒素には活性を失いやすいものもあり、素早く、少ない回数で、簡便に測定することが必要となる。しかし、本発明によれば、複数のガングリオシドに対する結合親和性を一度に測定できるため、このような毒素に対しても好適に用いることができる。従来のＦＣＳでは、個々のガングリオシドを用いて測定する必要があるため、素早く、少ない回数で、簡便に、複数のガングリオシドに対する生体親和性を測定することは困難であった。また、生体からの採取試料（鼻汁、胃液、粘膜拭い液、分泌・排泄物、血液等）は、雑多な成分を含むことから非特異的なシグナルが得られやすい。つまり従来のＦＣＳでは、非特異的なシグナルの影響を受けるが、本発明によればこのような非特異的シグナルの影響を抑制して測定することが可能である。
【００３２】
なお、本明細書において「毒素」とは、細菌の代謝産物あるいは構成成分の一つであり、微量でヒト生体に不利な反応を引き起こす物質を意図する。
【００３３】
本発明に係る被験物質として利用可能な毒素としては、特に限定されるものではない。毒素の多くは細胞表面の糖脂質に結合するものであるので、糖脂質結合性毒素を用いてもよい。糖脂質結合性毒素としては、例えば、コレラ毒素、ボツリヌス毒素、カンピロバクター毒素、ウェルシュ毒素、易熱性エンテロトキシン、志賀毒素、破傷風毒素、ベロ毒素及びヘリコバクター・ピロリ空胞化毒素を例示できる。
【００３４】
〔１−１．試料調製工程〕
本発明に係る結合親和性測定方法の試料調整工程は、被験物質を含む試料、及び当該被験物質を検出するための複数のプローブを混合すればよい。つまり、本発明には、上記試料及び上記複数のプローブを混合したものをそのまま用いることができる。なお、これらを混合した後に、ろ過等によって夾雑物等を取り除いてもよい。
【００３５】
上記プローブとしては、被験物質に対する結合親和性を評価する目的の物質を用いればよく、限定されるものではない。例えば、被験物質の種類に応じて、タンパク質、ペプチド、糖、ウイルス、核酸、脂質や、その他に様々な低分子化学物質を、蛍光物質で標識したものをプローブとして使用することができる。中でも特異的抗体、ガングリオシド又は糖鎖をプローブとすることが好ましい。
【００３６】
より具体的には、細菌由来の毒素を検出するためのプローブとしては、当該毒素に特異的に結合するものであれば特に限定されないが、ガングリオシドが好ましい。
【００３７】
また、ウイルスを検出するためのプローブとしては、ウイルスに特異的に結合するものであれば特に限定されず、糖、抗体、タンパク質（糖蛋白を含む）、ペプチド、核酸、糖脂質等の脂質、低分子化学物質などが広く例示される。中でも、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス又はアデノウイルスを検出するためのプローブとしては、これらのウイルスそれぞれに特異的に結合しうる糖鎖構造を含むもの、例えばフェツイン等のタンパク質、ガングリオシドＬｙｓｏＧＭ３等の糖脂質が挙げられる。
【００３８】
なお、蛍光物質による標識が無くても蛍光を発する物質を、そのままプローブとする場合、蛍光物質による標識の手間を省くことができる。
【００３９】
また、上記複数のプローブは、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有するものであればよい。励起波長又は蛍光波長は、特に限定されるものではないが、例えば、３５０ｎｍ以上８００ｎｍ以下の蛍光物質により標識されたものを好適に用いることができる。なお、上記蛍光物質の分子量は特に限定されるものではないが、２００００以下が好ましく、さらに好ましくは１２０以上８０００以下である。
【００４０】
混合するプローブの種類は、複数種であれば特に限定されるものではない。例えば、被験物質に対する、３種類のプローブの結合親和性を比較する場合は、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有する蛍光物質で標識した３種類のプローブを用いればよい。本発明者らは、後述する実施例において、２種類のガングリオシド間でのコレラ毒素に対する結合親和性を比較した。
【００４１】
〔１−２．蛍光検出工程〕
本発明に係る結合親和性測定方法の蛍光検出工程は、蛍光相関分光法によって、上記複数のプローブから発せられる蛍光を検出すればよい。また、上記蛍光相関分光法は、上記複数のプローブを検出するための、それぞれ異なる波長のレーザ光を、試料に照射して行なえばよい。各波長の蛍光強度のゆらぎを検出することで、上記複数のプローブのうち、いずれのプローブが被験物質に結合したかを評価することができる。
【００４２】
本発明に係る結合親和性測定方法の蛍光検出工程では、それぞれ異なる波長のレーザ光を照射する以外は、従来公知の蛍光相関分光法（例えば非特許文献１を参照）に従って行なえばよい。
【００４３】
蛍光相関分光法において、それぞれ異なる波長のレーザ光を照射する方法は、特に限定されるものではない。複数のレーザ光は、試料に同時に照射してもよく、それぞれのレーザ光を順次照射してもよい。例えば、従来公知の蛍光相関分光装置であって、発するレーザ光の波長が異なる複数種類の装置を用意して、上記試料調製工程で得た試料をそれぞれの装置に分注して、測定を行なえばよい。また、後述の本発明に係る蛍光相関分光装置を用いて複数種類のレーザ光を順次照射してもよい。いずれの場合においても、複数のプローブを混合した試料を用いることができるため、試料毎の温度のズレや夾雑物濃度によるプローブの非特異的吸着の影響を抑制して結合親和性の測定を行なうことができる。
【００４４】
〔１−３．解析工程〕
上記蛍光検出工程で検出した蛍光強度から、それぞれのプローブの被験物質に対する結合親和性を評価する方法は、特に限定されるものではないが、検出したそれぞれの蛍光強度の自己相関関数を算出して、それぞれの自己相関関数同士を比較する解析工程を行なうことが好ましい。
【００４５】
例えば、自己相関関数によって描かれる曲線を比較することで、いずれのプローブが優先して被験物質に結合したかを簡便に把握することができる。また、自己相関関数からは並進拡散時間を算出することができるので、複数のプローブの被験物質に対する結合親和性を定量的に測定することができる。さらに、被験物質の濃度と並進拡散時間との関係から解離定数を算出することも可能である。
【００４６】
なお、上記解析工程によらず、例えば、計測時間と蛍光強度との関係から、それぞれの蛍光強度のゆらぎを比較して、結合親和性の大小を定性的に評価してもよい。
【００４７】
〔１−４．２種類のプローブを用いた本発明に係る結合親和性測定方法の例〕
以下に、本発明に係る結合親和性測定方法の一実施形態を、図１に基づいて説明する。図１は、本実施の形態に係る結合親和性測定方法の原理を模式的に示した図であり、被験物質としてコレラ毒素を用い、プローブとして、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘで標識したＧＭ１及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識したａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１を用いた場合について示している（図１では、それぞれ単に「ＧＭ１」及び「ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１」と示している）。また、図１（１）及び（２）に示す、ＧＭ１が嵌合している物質がコレラ毒素を示している。
【００４８】
図１（１）及び（２）に示すように、ＧＭ１は、ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１より優先してコレラ毒素に結合する。よって、図１（１）に示すように、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘの励起波長である５３２ｎｍのレーザ光を照射すると、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘに由来する蛍光強度が検出される。そして、当該蛍光強度の自己相関関数Ｇ（τ）を算出すると図１（３）に示すグラフを作成することができる。
【００４９】
ここで、自己相関関数とは、任意の時間ｔにおける蛍光強度Ｉ（ｔ）を基準として、（τ）時間後の蛍光強度Ｉ（ｔ＋τ）の相関を次式（１）で表したものである。
Ｇ（τ）＝｛Ｉ（ｔ）・Ｉ（ｔ＋τ）｝／｛Ｉ（ｔ）｝２・・・（１）
図１（３）に示すように、τが特定の値になるとＧ（τ）は急激に低下する。本明細書では、Ｇ（τ）が低下し始めるτをτ２、低下し終わるτをτ３とする。そして、（τ２＋τ３）／２であるτ１を並進拡散時間として定義する。並進拡散時間が大きいほど、検出した蛍光強度の蛍光を発した分子が大きいことを意味する。
【００５０】
同様に、図１（２）に示すように、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の励起波長である４７３ｎｍのレーザ光を照射すると、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８に由来する蛍光強度が検出される。当該蛍光強度の自己相関関数Ｇ（τ）を算出すると図１（４）に示すグラフを作成することができる。図１（３）と同様に、図１（４）に示すＧ（τ）もτ２’からτ３’までの間で低下しているので、並進拡散時間τ１’は（τ２’＋τ３’）／２である。
【００５１】
図１（５）に示すように、それぞれの自己相関関数を比較すると、τ１はτ１’より大きいことが分かる。これは、ＧＭ１がコレラ毒素に結合して大きな分子を形成してこれが検出されたことを示し、ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１はコレラ毒素に結合しなかったため、小さい分子として検出されたことを示す。この結果から、ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１よりＧＭ１の方が、コレラ毒素に対する結合親和性に優れていることが確認できる。このように、本発明によれば、複数のプローブの被験物質に対する結合の競争性を測定することができる。
＜２．本発明に係る試料中の被験物質を検出する方法＞
本発明に係る結合親和性測定方法を利用すれば、試料中の被験物質を検出することも可能である。即ち、本発明に係る試料中の被験物質を検出する方法（以下、「被験物質検出方法」という）は、試料、及び上記被験物質を検出するための複数のプローブを混合する試料調製工程と、蛍光相関分光法によって、上記複数のプローブから発せられる蛍光を検出する蛍光検出工程と、を含み、上記複数のプローブは、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有し、上記被験物質に対する結合親和性が既知のものであり、上記蛍光相関分光法は、上記複数のプローブを検出するための、それぞれ異なる波長のレーザ光を、試料に照射して行なえばよい。なお、本実施の形態では、上記本発明に係る結合親和性測定方法と同様の構成については説明を省き、主に、上記本発明に係る結合親和性測定方法との相違点について説明する。
【００５２】
本発明に係る被験物質検出方法では、予め、被験物質に対する結合親和性が既知の複数のプローブを用いる。そして、上述の本発明に係る結合親和性測定方法と同様の操作を行なえば、実際に得られた当該プローブの結合親和性と既知の結合親和性とを比較することで、試料中の被験物質を定性的に又は定量的に検出することができる。本発明者らは、後の実施例で述べるように、インフルエンザウイルスに対して結合性を有するフェツインと、結合性を有さないグルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」と表記する）とを用いて、試料中のインフルエンザウイルスを検出した。
【００５３】
ここで、結合親和性が既知のプローブとは、必ずしも解離定数等の具体的な数値が既知のプローブのみを意図しているものではない。目的とする検出精度に応じて、使用するプローブの結合親和性の被験物質に対する結合親和性が予測できるものを用いればよい。また、上記本発明に係る結合親和性測定方法や、従来公知の結合親和性の測定方法によって、予め被験物質と複数のプローブとの結合親和性を測定する工程を行ない、その後に、本発明に係る被験物質検出方法の試料調製工程や蛍光検出工程を行なってもよい。
【００５４】
本発明に係る被験物質検出方法によれば、複数のプローブを用いて検出することができるので、信頼性が高い検出結果を得ることができる。また、結合親和性が既知であるプローブを複数用いて、当該複数のプローブによる蛍光強度を比較して検出を行なうため、別途ネガティブコントロール等と比較する作業を行なわなくてもよい。そのため従来のＦＣＳで問題となっていた温度条件や夾雑物濃度のズレが除かれた結果を得ることができる。
【００５５】
なお、インフルエンザウイルスの検出を行なう場合に用いるプローブとしては、特に限定されるものではない。インフルエンザウイルスに対する抗体を用いれば、感度が向上するため好ましい。また、後述の実施例のように、フェツインのようなインフルエンザウイルスに結合するタンパク質を用いれば、検出を安価に行なうことができるため好ましい。
＜３．本発明に係る蛍光相関分光装置＞
本発明に係る蛍光相関分光装置の一実施形態について図２を用いて説明する。図２は本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１の概略構成を示す図である。
【００５６】
まず、蛍光相関分光装置１の構成について説明する。蛍光相関分光装置１は、試料搭載部２（試料搭載手段）、対物レンズ３、５３２ｎｍレーザ（レーザ光照射手段）４、４７３ｎｍレーザ５（レーザ光照射手段）、切り替えミラー６（切り替え手段）、ピンホール７、光検出器８、デジタル相関器１２（解析手段）を備えている。なお図１には、蛍光相関分光装置１に供する試料１０、試料１０中に形成される共焦点領域１１をも示している。
【００５７】
試料搭載部２は、試料１０を搭載するための試料搭載手段である。具体的には、レーザ光を通過させることが可能な貫通孔を設けた台座である。試料搭載部２には、スライドガラス等をセットして、当該スライドガラスの上に試料１０を滴下すればよい。
【００５８】
試料１０としては、例えば、上述の本発明に係る結合親和性測定方法や被験物質検出方法で説明した試料に、それぞれ励起波長又は蛍光波長が異なる複数のプローブを混合したものを用いることができる。本実施の形態では、試料１０には、波長が５３２ｎｍのレーザ光で励起されるプローブと波長が４７３ｎｍのレーザ光で励起されるプローブとの、２種類のプローブが混合されているものとして説明する。
【００５９】
対物レンズ３は、後述する５３２ｎｍレーザ４及び４７３ｎｍレーザ５から照射されたレーザの焦点を絞って、試料１０中に共焦点領域１１を形成するものである。
【００６０】
５３２ｎｍレーザ４及び４７３ｎｍレーザ５は、レーザ光照射手段として機能するものであり、それぞれ５３２ｎｍ、４７３ｎｍの波長のレーザ光を照射する。レーザの光源としては特に限定されるものではない。例えば、５３２ｎｍのレーザ光の光源、及び４７３ｎｍのレーザ光の光源としてともに半導体励起固体レーザを用いればよい。
【００６１】
切り替えミラー６は、５３２ｎｍレーザ４及び４７３ｎｍレーザ５のうち、試料１０に照射するレーザ光を選択するための切り替え手段である。切り替えミラー６としては、従来公知のダイクロイックミラー等を用いればよい。また、切り替えミラー６は、５３２ｎｍレーザ４及び４７３ｎｍレーザ５のいずれかから照射されたレーザ光が試料１０に導かれるように、図２に示す矢印方向に回動する。図２に示す実線で示した箇所に切り替えミラー６が位置するときは、５３２ｎｍレーザ４によるレーザ光が試料１０に導かれ、破線の箇所に切り替えミラー６が位置するときは、４７３ｎｍレーザ５によるレーザ光が試料１０に導かれる。
【００６２】
ピンホール７は、試料１０から発せられた蛍光を光検出器８に導くためのものである。また、光検出器８は当該蛍光を検出するためのものである。
【００６３】
デジタル相関器１２は、試料１０から発せられた、それぞれの蛍光強度から、当該蛍光強度の自己相関関数を算出して、それぞれの自己相関関数同士を比較する解析手段である。なお、デジタル相関器１２は、検出された蛍光強度から自己相関関数を算出することが可能なコンピュータ等を外付けして用いてもよい。つまり、本発明に係る蛍光相関分光装置は、上記解析手段を備えることが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００６４】
次に、蛍光相関分光装置１の動作について説明する。
【００６５】
試料搭載部２に試料１０を滴下した後、使用者の設定に応じて、５３２ｎｍレーザ４及び４７３ｎｍレーザ５から発せられたレーザ光が試料１０に、順次照射される。ここでは説明の便宜のため、まず、試料１０に対して５３２ｎｍレーザ４によりレーザ光を照射して、次に４７３ｎｍレーザ５によるレーザ光を照射する場合について説明する。
【００６６】
５３２ｎｍレーザ４から発せられたレーザ光は、切り替えミラー６によって試料１０の方向に導かれる。そして当該レーザ光は対物レンズ６によって絞られ、試料中に共焦点領域１１が形成される。共焦点領域１１は、図２に示すように略円柱状の領域となる。なお、共焦点領域１１の容積は、１×１０−１６リットル以上１×１０−１０リットル以下が好ましく使用され、さらに好ましくは１×１０−１６リットル以上１×１０−１３リットル以下である。つまり、蛍光相関分光装置１は、この範囲の共焦点領域を形成可能な対物レンズを備えることが好ましい。
【００６７】
試料中の分子はブラウン運動により動き回っており、共焦点領域１１内を通過した分子が観察の対象となる。つまり、共焦点領域１１内に、波長５３２ｎｍのレーザ光で励起する蛍光物質により標識されたプローブが存在すれば、当該蛍光物質から蛍光が発せられる。そして、当該蛍光はピンホール７を通過して光検出器８によって検出される。
【００６８】
５３２ｎｍレーザ４による検出が終わった後は、切り替えミラー６が回動して、図２に示す破線の箇所に位置する。そして、４７３ｎｍレーザ５によるレーザ光が発せられ、試料１０に導かれる。ここで、共焦点領域１１内に、波長４７３ｎｍのレーザ光で励起される蛍光物質で標識されたプローブが存在すれば、当該蛍光物質から蛍光が光検出器８によって検出される。
【００６９】
光検出器８によって検出されたそれぞれの蛍光強度に基づいて、デジタル相関器１２によって自己相関関数が算出される。それぞれの自己相関関数を比較することによって、試料中の被験物質に対する上記２種類のプローブの結合親和性を測定したり、試料中の被験物質の検出を行なったりすることができる。
【実施例】
【００７０】
〔実施例１：蛍光標識ガングリオシドを用いた競争的ＦＣＳ〕
（装置）
本実施例では、二台の蛍光相関分析装置（ＦＣＳ‐１０１（５３２ｎｍ ｌａｓｅｒ）、ＦＣＳ‐１０１Ｂ（４７３ｎｍ ｌａｓｅｒ）、いずれも東洋紡社製）の一台のコンピュータにつなぎ、同時に測定を行なった。得られた結果を、ＦＣＳ‐１０１に添付のＦＣＳ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。
【００７１】
また、ＦＣＳ‐１０１及びＦＣＳ‐１０１Ｂのセットアップは、付属のマニュアルに従って行なった。具体的には、超純水を用いてステージ位置を調整して、１０ｎＭ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ６Ｇで機器の状態を確認した。また、ＦＣＳ‐１０１では１０ｎＭ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅで標識されたＧＭ１を用いて、ＦＣＳ‐１０１ＢではＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識されたＧＭ１を用いてＦＣＳ相関を測定して、プローブの状態を確認した。なお、上記超純水とは、Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステム（ミリポア社製）を用いて精製した超純水であり、以下「Ｍｉｌｌｉ‐Ｑ水」と表記する。
【００７２】
（コレラ毒素）
コレラ毒素としては、Ｌｉｓｔ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ.より凍結乾燥されたものを購入して用いた。これを、２０ｍＭ ＣＴになるように調製して、２０ｍｌずつ分注して−２０℃で保存した。なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色によって、夾雑蛋白質が存在しないことを確認した。凍結保存したコレラ毒素は、実験ごとに必要に応じて解凍して、Ｍｉｌｌｉ‐Ｑ水で３．７倍希釈して、５．４ｍＭの濃度で使用した。
【００７３】
（ガングリオシド）
本実施例では、ガングリオシドとして、上述したＧＭ１、ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１の他に、ガングリオシドＧＭ２、ガングリオシドＧＭ３、ガングリオシドＧＤ１ａ（以下、それぞれ、「ＧＭ２」、「ＧＭ３」、「ＧＤ１ａ」と表記する）を用いた。ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１はＳＩＧＭＡ‐ＡＬＤＲＩＣＨ社より、残りのガングリオシドはｌｙｓｏ体をＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ Ｉｎｃ．より購入した。ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１のｌｙｓｏ体化は次のようにして行なった。４０ｎｍｏｌのａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１を、５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ(ｐＨ６．０)、４％ ＴＤＣ、１Ｕ／ｍＬ ＳＣＤａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ(ＳＩＧＭＡ社)に混合して、超純水を用いて全量を４０ｍｌとした。さらに、４００ｍｌのｎ‐ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅを重層した。そして、３７℃で２４時間インキュベートした後、ｎ‐ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅを除去した。
【００７４】
（蛍光標識ガングリオシド）
ガングリオシドを標識する蛍光物質として、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘ及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８を用いた。標識は次のようにして行なった。
【００７５】
ｌｙｓｏ体ガングリオシドのＧＭ１、ＧＭ２、ＧＭ３、ＧＤ１ａを、それぞれ、１０ｍＭのＤＭＦ溶液に溶解した。次に、１０ｍＭ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）、又は１０ｍＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を等量加えた。次に、１％ＴＥＡのＤＭＦ溶液を終濃度０．１％となるように加え、室温、遮光下で２４時間振盪して、蛍光標識体を得た。
【００７６】
ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１では、まず、上述の方法で得たｌｙｓｏ体ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１の溶液に、ＤＭＦを等量加えた後、１％ＴＥＡを終濃度０．１％となるように加えた。次に、ＤＭＦに溶解した５ｍＭ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ‐Ｘ， ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ又は５ｍＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ， ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒを３２μｌ（１６０ｎｍｏｌのａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１に対して４等量）加えて室温、遮光下で２４時間振盪した。これにより、ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１の蛍光標識体を得た。
【００７７】
次に、得られた蛍光標識体を、ＲＰ‐ＨＰＬＣで精製した。測定系には、ＧＩＬＳＯＮ社製のポンプとＵＶ／ＶＩＳ‐１５１検出器を用いた。次に、４．６×１５０‐ｍｍ ＣＯＳＭＯＳＩＬ ＯＤＳ ＡＲ‐IIを用いて、室温で、蛍光標識ガングリオシドを分離した。なお、移動相の溶液Ａとして０．０５％ＴＦＡを含むＭｉｌｌｉ‐Ｑ水を用い、溶液Ｂとして０．０５％ＴＦＡを含むアセトニトリルを用いた。Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ‐Ｘで標識したガングリオシドは、イニシャル条件５０％溶液Ｂから１％／ｍｉｎで３０分間、終濃度８０％までグラジエントをかけて、５７０ｎｍの吸収強度を観測することで分離した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識したガングリオシドは、イニシャル条件１０％溶液Ａから１．３％／ｍｉｎで４０分間、終濃度９０％までグラジエントをかけて、４９５ｎｍの吸収強度を観測することで分離した。
【００７８】
なお、以下、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘで標識したＧＭ１等のガングリオシドを、「Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ１」や「Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ‐ガングリオシド」等と表記し、同様にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識したＧＭ１等のガングリオシドを、「Ａｌｅｘａ ４８８‐ＧＭ１」や「Ａｌｅｘａ４８８‐ガングリオシド」等と表記する。
（コレラ毒素と蛍光標識ガングリオシドによる競争的ＦＣＳ）
各蛍光標識ガングリオシドとコレラ毒素との混合は、次にようにして行なった。まず、４μＭのＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ガングリオシドと４μＭのＡｌｅｘａ４８８‐ガングリオシドとを等量混合した。次に、凝集体を除くためにＵｌｔｒａｆｒｅｅ‐ＭＣ ０．１ｍｍｐｏｒｅ Ｄｕｒａｐｏｒｅ（ミリポア社製）を用いて、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心して濾過を行なった。遠心にはＣＦ‐１５ＲＸＩＩＩ（ＨＩＴＡＣＨＩ社製）を用いた。次に、各蛍光標識ガングリオシドが２０ｎＭとなるように希釈した。次に、５．４μＭ〜５．３ｎＭの範囲で二倍段階希釈した各濃度のコレラ毒素と各蛍光標識ガングリオシドとを等量ずつ混合した。次に、３７℃、遮光条件下で１時間インキュベーションしてＦＣＳ用サンプルとした。
【００７９】
後述するそれぞれの２種類の蛍光標識ガングリオシドによる競争的ＦＣＳは、ＦＣＳ‐１０１、ＦＣＳ‐１０１Ｂに、各サンプルを３０μｌずつアプライして、同時に測定することで行なった。測定時のレーザ強度は、ＦＣＳ‐１０１では１ｍＷ、ＦＣＳ‐１０１Ｂでは０．１００〜０．２７６ｍＷとした。
【００８０】
結果を図３〜７に示す。図３は、Ａｌｅｘａ４８８‐ＧＭ１及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ２を用いて競争的ＦＣＳを行なった結果を示す図である。図４は、Ａｌｅｘａ４８８‐ＧＭ１及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ３を用いて競争的ＦＣＳを行なった結果を示す図である。図５は、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ１及びＡｌｅｘａ４８８‐ＧＭ３を用いて競争的ＦＣＳを行なった結果を示す図である。図６は、Ａｌｅｘａ４８８−ＧＭ１及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１を用いて競争的ＦＣＳ行なった結果を示す図である。図７は、Ａｌｅｘａ ４８８‐ＧＭ２及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ３を用いて競争的ＦＣＳを行なった結果を示す図である。なお、図３〜７において、横軸はコレラ毒素濃度を示し、縦軸は並進拡散時間を示し、丸印はＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘにより標識したガングリオシドの結果を示し、四角印はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８により標識したガングリオシドの結果を示す。
【００８１】
また、図３〜７で示した結果から、それぞれの図に示した２種のガングリオシドの、並進拡散時間の差をグラフにしたものを図８に示す。図８は２種類の蛍光標識ガングリオシにおける並進拡散時間の差を示す図であり、（ａ）はＧＭ１とＧＭ２との差（丸印）、ＧＭ１とＧＭ３との差（四角印）、ＧＭ１とａｓｉａｌｏ−ＧＭ１（三角印）との差を示し、（ｂ）はＧＭ２とＧＭ３との差を示す。
【００８２】
図８（ａ）に示すように、コレラ毒素とＧＭ１との結合に対する阻害の強さは、ａｓｉａｌｏ−ＧＭ１＞ＧＭ２＞ＧＭ３であることが示された。図８（ｂ）に示すように、ＧＭ２及びＧＭ３の、コレラ毒素に対する結合親和性は同程度であることが示された。
【００８３】
以上の結果から、蛍光標識ガングリオシド及びコレラ毒素を用いた競争的ＦＣＳによって、ガングリオシド間のコレラ毒素に対する相対的な結合親和性の差を求めることができた。このように、競争的ＦＣＳを用いることによって、コレラ毒素に対するガングリオシドタイピングが可能であることが示された。また、以上の結果は、ガングリオシドを蛍光標識することで、ＦＣＳにより毒素を検出するためのプローブとして用いることが可能であることや、蛍光標識ガングリオシドを用いたＦＣＳにより毒素を検出することの妥当性も示したといえる。
〔実施例２：２種類の蛍光プローブを用いたウイルスの検出〕
（ウイルス）
本実施例では、インフルエンザウイルスＡ／Ｈｙｏｇｏ／７３／２００２株（兵庫県立健康環境科学研究センター山岡正興氏より分与された。以下、「Ｈｙｏｇｏ株」と表記する）を用いた。Ｈｙｏｇｏ株は、血清を加えていないＤＭＥＭ培地で培養して用いた。
【００８４】
（蛍光プローブの作成）
インフルエンザウイルスには、シアル酸が結合することが知られている。そこで、シアル酸を有するタンパク質であるフェツイン（ＳＩＧＭＡ社製）と、シアル酸を有さないタンパク質であるＧＳＴとを蛍光標識した。フェツインはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識して、ＧＳＴはＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ‐Ｘで標識した。なお、ＧＳＴは大腸菌破砕液から精製した。
【００８５】
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８によるフェツインの標識では、まず、３．７×１０−５Ｍ フェツイン、７４ｍＭ炭酸水素ナトリウム、ＤＭＳＯに溶解した１．９×１０−４Ｍ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ，ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を混合した。
【００８６】
ＧＳＴの標識では、まず、１．６×１０−５Ｍ ＧＳＴ、４６ｍＭ 炭酸水素ナトリウム、ＤＭＳＯに溶解した９．０×１０−５Ｍ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）を混合した。
【００８７】
次に、それぞれの混合物を遮光、攪拌しながら室温で１時間反応させた。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化されたゲルろ過スピンカラムを用いて未反応蛍光物質の分離を行なった。当該ゲルろ過スピンカラムでは、３０，０００ＭＷ以下の分子を排除することが可能である。次に、遠心式ろ過ユニット（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ＹＭ−３、Ａｍｉｃｏｎ社製、分画分子量 ３，０００Ｄａ ＮＭＷＬ）を用いて濃縮した。
【００８８】
濃縮後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ゲル）で分離した後、フルオロ・イメージアナライザー（フジフィルム株式会社製、ＦＬＡ−３０００）を用いて蛍光標識を確認した。以下、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識されたフェツインを「Ａｌｅｘａ ４８８‐フェツイン」と表記し、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ‐Ｘで標識されたＧＳＴを「Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＳＴ」と表記する。
【００８９】
（競争的ＦＣＳ）
血清が含まれていないＤＭＥＭ培地で希釈した１×１０６ＣＩＵ／ｍｌ Ｈｙｏｇｏ株と、ＰＢＳ（−）で希釈して１．４ＭとしたＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＳＴと、上述の方法で得たＡｌｅｘａ ４８８‐フェツインをＰＢＳ（−）で５０倍希釈した溶液とを、容積比２：１：１で混合して、室温で１０分間インキュベーションした。次に、実施例１で用いた２つのＦＣＳ装置（ＦＣＳ‐１０１及びＦＣＳ‐１０１Ｂ）を用いて、同時に測定を行なった。なお、比較のため、ネガティブコントロールとして、血清が含まれていないＤＭＥＭ培地であって、インフルエンザウイルスが含まれていないＤＭＥＭ培地を用いて同様に測定を行なった。ＦＣＳの測定では、ＦＣＳ‐１０１に付属のソフトウェア（浜松ホトニクス社製、ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖｅｒ．３．００）を用いた。測定条件は、計測回数を２０回、計測時間３．５秒とした。この結果を図９に示す。図９はＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＳＴ及びＡｌｅｘａ ４８８‐フェツインを用いたＦＣＳの結果から作成した相関曲線を示す図であり、（ａ）はＨｙｏｇｏ株が含まれるＤＭＥＭ培地を供した結果を示し、（ｂ）はＨｙｏｇｏ株が含まれないＤＭＥＭ培地を供した結果を示す。また、実線はＡｌｅｘａ ４８８‐フェツイン由来の蛍光を検出した結果を示し、破線はＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＳＴ由来の蛍光を検出した結果を示す。
【００９０】
図９（ａ）と（ｂ）との比較によって示されるように、インフルエンザウイルスはフェツインと結合するため、Ａｌｅｘａ４８８を検出することが可能な４７３ｎｍのレーザを用いた場合、シグナルは大きく変動する。つまり、Ｈｙｏｇｏ株を含むＤＭＥＭ培地を供した場合、Ｈｙｏｇｏ株を含まないＤＭＥＭ培地を供した結果に比べて、拡散時間が増加する。これは、Ａｌｅｘａ ４８８‐フェツインとＨｙｏｇｏ株とが結合することで分子量が増加して、溶液中での並進拡散速度が低下するからである。
【００９１】
一方、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＳＴを検出可能な５３２ｎｍのレーザを用いた場合では、Ｈｙｏｇｏ株を含むＤＭＥＭ培地の測定を行なってもシグナルはほとんど変化しない。つまり、Ｈｙｏｇｏ株を含まないＤＭＥＭ培地の測定により算出される拡散時間を示す曲線と同じ曲線が得られる。
【００９２】
つまり、Ａｌｅｘａ ４８８‐フェツイン及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＳＴを用いて競争的ＦＣＳを行ない、それぞれの蛍光から得られる拡散時間を示す曲線の差を測定することで、測定条件のブレや非特異的結合を除いた、インフルエンザウイルスの存在を検出することが可能であることが示された。なお、本実施例では説明の便宜のため、ネガティブコントロールを用いて比較を行なったが、ＧＳＴ又はフェツインのインフルエンザウイルスに対する結合性は既知であるため、当該比較を行なわなくても、図９（ａ）に示す結果のみから試料中にインフルエンザウイルスが存在していたことが確認できる。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明によれば、被験物質に対する複数のプローブの、結合の競争性を評価することができる。特に、種々のガングリオシドに対する結合親和性を測定することで、細菌由来の毒素のタイピングを簡便、迅速かつ高感度に行なうことができるため、細菌による感染症の医薬品開発等に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】本発明の一実施形態に係る結合親和性測定方法の原理を模式的に示した図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る蛍光相関分光装置の概略構成を示す図である。
【図３】Ａｌｅｘａ４８８‐ＧＭ１及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ２を用いて競争的ＦＣＳを行なった結果を示す図である。
【図４】Ａｌｅｘａ４８８‐ＧＭ１及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ３を用いて競争的ＦＣＳを行なった結果を示す図である。
【図５】Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ１及びＡｌｅｘａ４８８‐ＧＭ３を用いて競争的ＦＣＳを行なった結果を示す図である。
【図６】Ａｌｅｘａ４８８−ＧＭ１及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ａｓｉａｌｏ‐ＧＭ１を用いて競争的ＦＣＳ行なった結果を示す図である。
【図７】Ａｌｅｘａ ４８８‐ＧＭ２及びＲｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＭ３を用いて競争的ＦＣＳを行なった結果を示す図である。
【図８】２種類の蛍光標識ガングリオシにおける並進拡散時間の差を示す図である。
【図９】Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ‐ＧＳＴ及びＡｌｅｘａ ４８８‐フェツインを用いたＦＣＳの結果から作成した相関曲線を示す図である。
【符号の説明】
【００９５】
１ 蛍光相関分光装置
２ 試料搭載部（試料搭載手段）
４ ５３２ｎｍレーザ（レーザ光照射手段）
５ ４７３ｎｍレーザ（レーザ光照射手段）
６ 切り替えミラー（切り替え手段）
１０ 試料
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法であって、
被験物質を含む試料、及び当該被験物質を検出するための複数のプローブを混合する試料調製工程と、
蛍光相関分光法によって、上記複数のプローブから発せられる蛍光強度を検出する蛍光検出工程と、を含み、
上記複数のプローブは、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有するものであり、
上記蛍光相関分光法は、上記複数のプローブを検出するための、それぞれ異なる波長のレーザ光を、試料に照射することで行なうことを特徴とする方法。
【請求項２】
上記被験物質は、細菌由来の毒素またはウイルスであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記被験物質は、コレラ毒素、ボツリヌス毒素、カンピロバクター毒素、ウェルシュ毒素、易熱性エンテロトキシン、志賀毒素、破傷風毒素、ベロ毒素、ヘリコバクター・ピロリ空胞化毒素、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、又はアデノウイルスであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記蛍光検出工程によって検出したそれぞれの蛍光強度から、当該蛍光強度の自己相関関数を算出して、それぞれの自己相関関数同士を比較する解析工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
試料中の被験物質を検出する方法であって、
試料、及び上記被験物質を検出するための複数のプローブを混合する試料調製工程と、
蛍光相関分光法によって、上記複数のプローブから発せられる蛍光を検出する蛍光検出工程と、を含み、
上記複数のプローブは、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有し、上記被験物質に対する結合親和性が既知のものであり、
上記蛍光相関分光法は、上記複数のプローブを検出するための、それぞれ異なる波長のレーザ光を、試料に照射することで行なうことを特徴とする方法。
【請求項６】
蛍光相関分光法を行なうための装置であって、
試料を搭載するための試料搭載手段と、
上記試料搭載手段に搭載された試料に対して、それぞれ異なる波長のレーザ光を試料に照射する複数のレーザ光照射手段と、
上記複数のレーザ光照射手段のうち、上記試料搭載手段に搭載された試料に対してレーザを照射するために用いるレーザ光照射手段を切り替えるための切り替え手段と、を備えることを特徴とする蛍光相関分光装置。
【請求項１】
被験物質に対するプローブの結合親和性を測定する方法であって、
被験物質を含む試料、及び当該被験物質を検出するための複数のプローブを混合する試料調製工程と、
蛍光相関分光法によって、上記複数のプローブから発せられる蛍光強度を検出する蛍光検出工程と、を含み、
上記複数のプローブは、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有するものであり、
上記蛍光相関分光法は、上記複数のプローブを検出するための、それぞれ異なる波長のレーザ光を、試料に照射することで行なうことを特徴とする方法。
【請求項２】
上記被験物質は、細菌由来の毒素またはウイルスであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記被験物質は、コレラ毒素、ボツリヌス毒素、カンピロバクター毒素、ウェルシュ毒素、易熱性エンテロトキシン、志賀毒素、破傷風毒素、ベロ毒素、ヘリコバクター・ピロリ空胞化毒素、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、又はアデノウイルスであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記蛍光検出工程によって検出したそれぞれの蛍光強度から、当該蛍光強度の自己相関関数を算出して、それぞれの自己相関関数同士を比較する解析工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
試料中の被験物質を検出する方法であって、
試料、及び上記被験物質を検出するための複数のプローブを混合する試料調製工程と、
蛍光相関分光法によって、上記複数のプローブから発せられる蛍光を検出する蛍光検出工程と、を含み、
上記複数のプローブは、それぞれ異なる励起波長又は蛍光波長を有し、上記被験物質に対する結合親和性が既知のものであり、
上記蛍光相関分光法は、上記複数のプローブを検出するための、それぞれ異なる波長のレーザ光を、試料に照射することで行なうことを特徴とする方法。
【請求項６】
蛍光相関分光法を行なうための装置であって、
試料を搭載するための試料搭載手段と、
上記試料搭載手段に搭載された試料に対して、それぞれ異なる波長のレーザ光を試料に照射する複数のレーザ光照射手段と、
上記複数のレーザ光照射手段のうち、上記試料搭載手段に搭載された試料に対してレーザを照射するために用いるレーザ光照射手段を切り替えるための切り替え手段と、を備えることを特徴とする蛍光相関分光装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００８−２４９４３３（Ｐ２００８−２４９４３３Ａ）
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−８９８２１（Ｐ２００７−８９８２１）
【出願日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【出願人】（５０３３０３４６６）学校法人関西文理総合学園 (26)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【出願人】（５０３３０３４６６）学校法人関西文理総合学園 (26)
【Ｆターム（参考）】
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