【課題】宿主細胞におけるタンパク質の産生方法の提供、より詳細には、組み込みベクターの複数の組み込まれたコピーを含む宿主細胞の提供。
【解決手段】使用に適した組み込みベクターには、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、トランスポゾンベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターが含まれる。組み込みベクターを高い感染多重度で用いることによって宿主細胞を調製する方法を開発した。宿主細胞は、医薬タンパク質、スクリーニングアッセイに用いるためのタンパク質の変種の産生、および高速スクリーニングにおける直接的な使用に関して有用である。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムが少なくとも2つの組み込まれた組み込みベクター（integrated integrating vector）を含み、該組み込みベクターがプロモーターと機能的に結合した少なくとも1つの外因性遺伝子を含む、該ゲノムを含む宿主細胞。
【請求項２】
組み込みベクターが、外因性遺伝子と機能的に結合した分泌シグナル配列をさらに含む、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項３】
組み込みベクターが、外因性遺伝子と機能的に結合したRNA安定化因子をさらに含む、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項４】
組み込みベクターが少なくとも2つの外因性遺伝子を含む、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項５】
少なくとも2つの外因性遺伝子が多シストロン性配列として配置される、請求項4記載の宿主細胞。
【請求項６】
少なくとも2つの外因性遺伝子が少なくとも1つのリボソーム内部進入部位（internal ribosome entry site）によって隔てられている、請求項5記載の宿主細胞。
【請求項７】
2つの外因性遺伝子が多シストロン性配列として配置される、請求項5記載の宿主細胞。
【請求項８】
2つの外因性遺伝子が免疫グロブリン分子の重鎖および免疫グロブリン分子の軽鎖をコードする、請求項7記載の宿主細胞。
【請求項９】
少なくとも2つの外因性遺伝子の1つが選択マーカーである、請求項4記載の宿主細胞。
【請求項１０】
組み込みベクターがレトロウイルスベクターである、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項１１】
レトロウイルスベクターが偽型のレ（psuedotyped）トロウイルスベクターである、請求項10記載の宿主細胞。
【請求項１２】
偽型のレトロウイルスベクターがG糖タンパク質を含む、請求項11記載の宿主細胞。
【請求項１３】
G糖タンパク質が、水疱性口内炎ウイルス、ピリウイルス、チャンディプラウイルス、コイ春ウイルス血症ウイルス、およびモコラ（Mokola）ウイルスのG糖タンパク質からなる群より選択される、請求項12記載の宿主細胞。
【請求項１４】
レトロウイルスベクターが、MoMLV、MoMuSVおよびMMTVの末端反復配列からなる群より選択される末端反復配列を含む、請求項10記載の宿主細胞。
【請求項１５】
レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項11記載の宿主細胞。
【請求項１６】
レンチウイルスベクターが、HIVおよびウマ伝染性貧血ウイルスの末端反復配列からなる群より選択される末端反復配列を含む、請求項15記載の宿主細胞。
【請求項１７】
インビトロ培養およびインビボ培養からなる群より選択される培養系に存在する、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項１８】
チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎細胞およびウシ乳腺上皮細胞から選択される、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項１９】
クローン由来である、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項２０】
非クローン由来である、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項２１】
ゲノムが10回を上回る継代に対して安定である、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項２２】
ゲノムが50回を上回る継代に対して安定である、請求項21記載の宿主細胞。
【請求項２３】
ゲノムが100回を上回る継代に対して安定である、請求項21記載の宿主細胞。
【請求項２４】
組み込まれた外因性遺伝子が、選択がなされない状態で安定である、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項２５】
プロモーターが、α-ラクトアルブミンプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、およびモロニーマウス白血病ウイルスの末端反復配列からなる群より選択される、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項２６】
少なくとも1つの外因性遺伝子が、抗原結合タンパク質、医薬用タンパク質、キナーゼ、ホスファターゼ、核酸結合タンパク質、膜受容体タンパク質、シグナル伝達タンパク質、イオンチャネルタンパク質および腫瘍性タンパク質をコードする遺伝子からなる群より選択される、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項２７】
ゲノムが少なくとも3つの組み込まれた組み込みベクターを含む、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項２８】
ゲノムが少なくとも4つの組み込まれた組み込みベクターを含む、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項２９】
ゲノムが少なくとも5つの組み込まれた組み込みベクターを含む、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項３０】
ゲノムが少なくとも7つの組み込まれた組み込みベクターを含む、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項３１】
ゲノムが少なくとも10個の組み込まれた組み込みベクターを含む、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項３２】
ゲノムが少なくとも20個の組み込まれた組み込みベクターを含む、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項３３】
ゲノムが少なくとも1000個の組み込まれた組み込みベクターを含む、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項３４】
第1の外因性遺伝子を含む第1の組み込みベクターの少なくとも2つの組み込まれたコピー、および第2の外因性遺伝子を含む第2の組み込みベクターの少なくとも1つの組み込まれたコピーをさらに含む、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項３５】
宿主細胞が1日当たり約10ピコグラムを上回る外因性タンパク質を発現する、請求項1記載の宿主細胞。
【請求項３６】
宿主細胞をトランスフェクトするための方法であって、
1）a）ゲノムを含む宿主細胞、および
b）複数の組み込みベクター
を提供する段階；ならびに
2）少なくとも2つの組み込みベクターが該宿主細胞の該ゲノムに組み込まれる条件下で、該宿主細胞を該複数の組み込みベクターと接触させる段階
を含む方法。
【請求項３７】
条件が、10を上回る感染多重度で宿主を接触させる段階を含む、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
条件が、約10〜1000の感染多重度で宿主を接触させる段階を含む、請求項36記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも3つの組み込みベクターが宿主細胞のゲノムに組み込まれる条件下で、宿主細胞を複数の組み込みベクターと接触させる、請求項36記載の方法。
【請求項４０】
少なくとも4つの組み込みベクターが宿主細胞のゲノムに組み込まれる条件下で、宿主細胞を複数の組み込みベクターと接触させる、請求項36記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも5つの組み込みベクターが宿主細胞のゲノムに組み込まれる条件下で、宿主細胞を複数の組み込みベクターと接触させる、請求項36記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも7つの組み込みベクターが宿主細胞のゲノムに組み込まれる条件下で、宿主細胞を複数の組み込みベクターと接触させる、請求項36記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも10個の組み込みベクターが宿主細胞のゲノムに組み込まれる条件下で、宿主細胞を複数の組み込みベクターと接触させる、請求項36記載の方法。
【請求項４４】
組み込みベクターが、プロモーターと機能的に結合した少なくとも1つの外因性遺伝子を含む、請求項36記載の方法。
【請求項４５】
組み込みベクターが、外因性遺伝子と機能的に結合した分泌シグナルをさらに含む、請求項36記載の方法。
【請求項４６】
組み込みベクターが、外因性遺伝子と機能的に結合したRNA安定化因子をさらに含む、請求項36記載の方法。
【請求項４７】
組み込みベクターが少なくとも2つの外因性遺伝子を含む、請求項36記載の方法。
【請求項４８】
少なくとも2つの外因性遺伝子が多シストロン性配列中に配置される、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
組み込みベクターがレトロウイルスベクターである、請求項36記載の方法。
【請求項５０】
レトロウイルスベクターが偽型のレトロウイルスベクターである、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項49記載の方法。
【請求項５２】
レンチウイルスベクターが、G糖タンパク質を含む偽型のレンチウイルスベクターである、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎細胞、およびウシ乳腺上皮細胞から選択される、請求項36記載の方法。
【請求項５４】
トランスフェクトされた宿主細胞をクローン的に（clonally）選択する段階をさらに含む、請求項36記載の方法。
【請求項５５】
2つの組み込みベクターのそれぞれが異なる外因性遺伝子を含む、少なくとも2つの組み込みベクターを該宿主細胞にトランスフェクトする段階をさらに含む、請求項36記載の方法。
【請求項５６】
関心対象のタンパク質を産生する方法であって、
1）プロモーターと機能的に結合した外因性遺伝子を含む、少なくとも1つの組み込みベクターの少なくとも2つの組み込まれたコピーをゲノムが含み、該外因性遺伝子が関心対象のタンパク質をコードする、該ゲノムを含む宿主細胞を提供する段階、および
2）該関心対象のタンパク質が産生される条件下で、該宿主細胞を培養する段階
を含む方法。
【請求項５７】
組み込みベクターが、外因性遺伝子と機能的に結合した分泌シグナル配列をさらに含む、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
段階3）関心対象のタンパク質を単離する段階
をさらに含む、請求項56記載の方法。
【請求項５９】
条件が、回転瓶培養、灌流培養、流加培養（batch fed culture）およびペトリ皿培養からなる群より選択される、請求項57記載の方法。
【請求項６０】
宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの3つを上回る組み込まれたコピーを含む、請求項56記載の方法。
【請求項６１】
宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの4つを上回る組み込まれたコピーを含む、請求項56記載の方法。
【請求項６２】
宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの5つを上回る組み込まれたコピーを含む、請求項56記載の方法。
【請求項６３】
宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの7つを上回る組み込まれたコピーを含む、請求項56記載の方法。
【請求項６４】
宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの10個を上回る組み込まれたコピーを含む、請求項56記載の方法。
【請求項６５】
宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの約2個〜20個の組み込まれたコピーを含む、請求項56記載の方法。
【請求項６６】
宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの約3個〜10個の組み込まれたコピーを含む、請求項56記載の方法。
【請求項６７】
組み込みベクターがレトロウイルスベクターである、請求項56記載の方法。
【請求項６８】
レトロウイルスベクターが偽型のレトロウイルスベクターである、請求項67記載の方法。
【請求項６９】
レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項67記載の方法。
【請求項７０】
宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎細胞、およびウシ乳腺上皮細胞から選択される、請求項56記載の方法。
【請求項７１】
宿主細胞が、細胞1個当たり1日につき約1ピコグラムを上回る関心対象のタンパク質を合成する、請求項56記載の方法。
【請求項７２】
宿主細胞が、細胞1個当たり1日につき約10ピコグラムを上回る関心対象のタンパク質を合成する、請求項56記載の方法。
【請求項７３】
宿主細胞が、細胞1個当たり1日につき約50ピコグラムを上回る関心対象のタンパク質を合成する、請求項56記載の方法。
【請求項７４】
細胞をクローン的に選択する、請求項56記載の方法。
【請求項７５】
化合物のスクリーニングのための方法であって、
1）a）プロモーターと機能的に結合した外因性遺伝子を含む、少なくとも1つの組み込みベクターの少なくとも2つの組み込まれたコピーをゲノムが含み、該外因性遺伝子が関心対象のタンパク質をコードする、該ゲノムを含む宿主細胞；および
b）1つまたは複数の被験化合物
を提供する段階；
2）該関心対象のタンパク質が発現される条件下で、該宿主細胞を培養する段階；
3）宿主細胞を該1つまたは複数の被験化合物で処理する段階；ならびに
4）該宿主細胞における該被験化合物に対する反応の存在に関してアッセイする段階
を含む方法。
【請求項７６】
外因性遺伝子が、膜受容体タンパク質、核酸結合タンパク質、細胞質受容体タンパク質、イオンチャネルタンパク質、シグナル伝達タンパク質、プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、および癌遺伝子によってコードされるタンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項75記載の方法。
【請求項７７】
宿主細胞がレポーター遺伝子をさらに含む、請求項76記載の方法。
【請求項７８】
レポーター遺伝子が、緑色蛍光性タンパク質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、およびβ-ラクタマーゼからなる群より選択される、請求項77記載の方法。
【請求項７９】
アッセイの段階が、レポーター遺伝子からのシグナルを検出する段階をさらに含む、請求項75記載の方法。
【請求項８０】
宿主のゲノムが少なくとも2つの組み込みベクターを含み、該少なくとも2つの組み込みベクターのそれぞれが、異なる外因性遺伝子を含む、請求項75記載の方法。
【請求項８１】
組み込みベクターが偽型のレトロウイルスベクターである、請求項75記載の方法。
【請求項８２】
宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎細胞、およびウシ乳腺上皮細胞から選択される、請求項75記載の方法。
【請求項８３】
タンパク質の機能を比較するための方法であって、
1）a）第1の外因性遺伝子が第1の関心対象のタンパク質をコードし、該第1の外因性遺伝子と機能的に結合したプロモーターを含む、第1の組み込みベクターを含む第1の宿主細胞、および
b）第2の外因性遺伝子が、第1の関心対象のタンパク質の変種（variant）である第2のタンパク質をコードし、該第2の外因性遺伝子と機能的に結合したプロモーターを含む第2の組み込みベクターを含む、少なくとも第2の宿主細胞
を提供する段階；
2）該第1および第2の関心対象のタンパク質が産生される条件下で、該宿主細胞を培養する段階；ならびに
3）該第1および第2の関心対象のタンパク質の活性を比較する段階
を含む方法。
【請求項８４】
外因性遺伝子が、膜受容体タンパク質、核酸結合タンパク質、細胞質受容体タンパク質、イオンチャネルタンパク質、シグナル伝達タンパク質、プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、細胞周期タンパク質、および癌遺伝子によってコードされるタンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項83記載の方法。
【請求項８５】
第1および第2の関心対象のタンパク質が、単一のヌクレオチド多型により異なる、請求項83記載の方法。
【請求項８６】
第1および第2の関心対象のタンパク質の同一性が95％を上回る、請求項83記載の方法。
【請求項８７】
第1および第2の関心対象のタンパク質の同一性が90％を上回る、請求項83記載の方法。
【請求項８８】
第1および第2の宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの3つを上回る組み込まれたコピーをそれぞれ含む、請求項83記載の方法。
【請求項８９】
第1および第2の宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの4つを上回る組み込まれたコピーをそれぞれ含む、請求項83記載の方法。
【請求項９０】
第1および第2の宿主細胞のゲノムが、組み込みベクターの5つを上回る組み込まれたコピーをそれぞれ含む、請求項83記載の方法。
【請求項９１】
組み込みベクターがレトロウイルスベクターである、請求項83記載の方法。
【請求項９２】
レトロウイルスベクターが偽型のレトロウイルスベクターである、請求項91記載の方法。
【請求項９３】
レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項91記載の方法。
【請求項９４】
1）a）少なくとも1つの組み込まれた外因性遺伝子を含むゲノムを含む、宿主細胞；および
b）複数の組み込みベクター
を提供する段階；ならびに
2）該組み込みベクターの少なくとも2つが該宿主細胞のゲノムに組み込まれる条件下で、該宿主細胞を該複数の組み込みベクターと接触させる段階
を含む方法。
【請求項９５】
組み込まれた外因性遺伝子が組み込みベクターを含む、請求項94記載の方法。
【請求項９６】
宿主細胞をクローン的に選択する、請求項94記載の方法。
【請求項９７】
宿主細胞を非クローン的に選択する、請求項94記載の方法。
【請求項９８】
条件が、10を上回る感染多重度で宿主を接触させる段階を含む、請求項94記載の方法。
【請求項９９】
条件が、約10から1000の感染多重度で宿主を接触させる段階を含む、請求項94記載の方法。
【請求項１００】
少なくとも3つの組み込みベクターが宿主細胞のゲノムに組み込まれる条件下で、宿主細胞を複数の組み込みベクターと接触させる、請求項94記載の方法。
【請求項１０１】
組み込みベクターがレトロウイルスベクターである、請求項94記載の方法。
【請求項１０２】
レトロウイルスベクターが偽型のレトロウイルスベクターである、請求項101記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図９Ａ】

【図９Ｂ】

【図９Ｃ】

【図１０Ａ】

【図１０Ｂ】

【図１０Ｃ】

【図１０Ｄ】

【図１１Ａ】

【図１１Ｂ】

【図１１Ｃ】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ】

【図１３Ａ】

【図１３Ｂ】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１４Ｃ】

【図１５】

【図１６Ａ】

【図１６Ｂ】

【図１６Ｃ】

【図１７】

【図１８】

【図１９Ａ】

【図１９Ｂ】

【図１９Ｃ】

【図１９Ｄ】

【公開番号】特開２０１２−１１５２７２（Ｐ２０１２−１１５２７２Ａ）
【公開日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１１２６（Ｐ２０１２−１１２６）
【出願日】平成２４年１月６日（２０１２．１．６）
【分割の表示】特願２００２−５０７９８０（Ｐ２００２−５０７９８０）の分割
【原出願日】平成１３年６月２９日（２００１．６．２９）
【出願人】（５１０３３７５１７）キャタレント　ファーマ　ソリューションズ　リミテッド　ライアビリティ　カンパニー (2)
【Ｆターム（参考）】