褐藻類の核酸抽出方法、褐藻類の種判別方法および褐藻類核酸抽出キット
【課題】 褐藻類から簡便かつ効率的に高品質な核酸を抽出する方法、抽出した核酸に基づいて褐藻類の種を判別する方法、および褐藻類から核酸を抽出するキットを提供する。
【解決手段】 褐藻類の核酸を抽出する方法であって、海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素を用いて褐藻類が有する粘性多糖類を分解する工程と、キレート剤を用いて褐藻類が有する粘性多糖類のゲル形成を抑制する工程と、タンパク質分解酵素を用いて褐藻類の核酸を抽出する工程とを有する。本発明に係る褐藻類の核酸抽出方法および褐藻類核酸抽出キットによれば、褐藻類から簡便かつ効率的に高品質な核酸を抽出することができる。また、本発明に係る褐藻類の種判別方法によれば、前記抽出した核酸を用いて褐藻類の種を的確に判別することができる。
【解決手段】 褐藻類の核酸を抽出する方法であって、海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素を用いて褐藻類が有する粘性多糖類を分解する工程と、キレート剤を用いて褐藻類が有する粘性多糖類のゲル形成を抑制する工程と、タンパク質分解酵素を用いて褐藻類の核酸を抽出する工程とを有する。本発明に係る褐藻類の核酸抽出方法および褐藻類核酸抽出キットによれば、褐藻類から簡便かつ効率的に高品質な核酸を抽出することができる。また、本発明に係る褐藻類の種判別方法によれば、前記抽出した核酸を用いて褐藻類の種を的確に判別することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、褐藻類の核酸抽出方法、褐藻類の種判別方法および褐藻類核酸抽出キットに関し、特に、海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素とキレート剤とを用いた褐藻類の核酸抽出方法、褐藻類の種判別方法および褐藻類核酸抽出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
コンブ、ワカメ、ハバノリ、モズク、ヒジキなどに代表されるように、日本では古くから多くの褐藻類が食されている。これら褐藻類は、フコキサンチンやアルギン酸、フコイダン、鉄、ヨウ素などの有用成分を含むことから、家畜の飼料、医薬品、化粧品、食品添加物などの原料としても利用されている。また、近年では、バイオエタノールなどのエネルギー資源の原料として、研究開発が進められている。このような褐藻類の利用に際しては、さらなる有用成分の探索や品種作出、選抜育種などが盛んに行われており、これらの場面において遺伝子工学的手法が多く用いられている。
【０００３】
また、コンブなどの食用海藻類については、品種や産地などをブランド化することにより食品としての価値が高められ、販売促進に繋げられている一方、これら品種や産地の表示偽装が問題となっている。これら品種や産地などのブランド化に伴う表示偽装の捜査において、鑑定技術の向上は大変重要な課題であり、特に、遺伝子工学的手法を用いた鑑定技術は最も有効である。昨今、このような事情を背景として、ＤＮＡ分析を用いた食品の品種および産地を鑑定する技術が開発されている（非特許文献１〜３）。
【０００４】
遺伝子工学的手法において、核酸を抽出する技術は重要である。一般的な核酸を抽出する方法として、細断した生体試料をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などで処理して核酸を露出させた後、フェノール抽出、ヨウ化ナトリウム処理、あるいは塩析法を用いてタンパク質の沈殿除去を行い、エタノールあるいはイソプロパノールを加えて核酸を沈殿させる方法が用いられている。
【０００５】
しかしながら、褐藻類の場合、アルギン酸やフコイダンなどの粘性多糖類が多量に含まれているため、エタノールあるいはイソプロパノールを加えて核酸を沈殿させる工程において、アルギン酸やフコイダンなどの粘性多糖類が核酸と共に沈殿し、得られた核酸抽出物中に多量の多糖類が混入することとなる。その結果、核酸の回収率が低下するという問題のみならず、混入した多量の多糖類が、その後の制限酵素反応やＰＣＲ反応などの工程に影響を与えるなど、いくつかの問題を生じている。
【０００６】
従来、褐藻類の核酸抽出においては、核酸の低い回収率を補うために相当量の凍結コンブを破砕処理した上でＣｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ＣＴＡＢ）を用いて核酸を抽出する方法（ＣＴＡＢ法；非特許文献４）や、セルロースを多く含む植物試料を対象とした核酸抽出キット（非特許文献５〜７）、ヒドロキシアパタイトを用いた方法（特許文献１）、アルギン酸リアーゼを併用したＣＴＡＢ法（非特許文献８）などの方法やキットが用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０００−２３６６８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】水産学シリーズ１４９ 水産物の原料・産地判別、恒星社厚生閣社、２００６年
【非特許文献２】食品鑑定技術ハンドブック、サイエンスフォーラム社、第６６−１３５頁、２００５年
【非特許文献３】新・食品分析法II、光琳社、第２３１−４１３頁、１９９６年
【非特許文献４】Ｈｕ Ｙ．Ｊ．ら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｃｏｌ．、第１３巻、第４１５−４２２頁、２００１年
【非特許文献５】Ａｎｔｏｉｎｅ Ｅ．ら、Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．、第８３巻、第７０９−７１３頁、２００３年
【非特許文献６】Ｎ．Ｙｏｔｓｕｋｕｒａら、Ｆｉｓｈ．Ｓｃｉ．、第６７巻、第８５７−８６２頁、２００１年
【非特許文献７】Ｓ．Ｕｗａｉら、Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉａ、第４５巻、第６８７−６９５頁、２００６年
【非特許文献８】神山ら、第１０回マリンバイオテクノロジー学会大会講演要旨集、第１１７頁、２００７年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、非特許文献４〜７に開示されている核酸抽出方法によれば、大量の試料の処理を必要とし、抽出操作に多くの時間と手間を要するため、簡便ないし効率的に核酸を抽出することが極めて困難であり、特に非特許文献５〜７に開示されている核酸抽出方法は、セルロースを多量に含む植物試料を対象とした方法であり、アルギン酸やフコイダンなどの粘性多糖類を多量に含む褐藻類はその対象となり難い。
【００１０】
また、特許文献１に開示されている核酸抽出方法は、硫酸基を有するムコ多糖を含む貝類や藻類をその対象としており、硫酸基を有さないアルギン酸を多量に含む褐藻類は、やはりその対象となり難い。この点、特許文献１には、褐藻類から高品質の核酸を抽出できる旨が記載されているものの、褐藻類についての核酸抽出は実際になされておらず、貝類と紅藻類の核酸抽出がなされているに過ぎない。さらに、この核酸抽出方法は、抽出した核酸を吸着させたヒドロキシアパタイトの洗浄を何度も繰り返す必要があり、多くの時間と手間を要してしまう。
【００１１】
また、非特許文献８に開示されている核酸抽出方法は、アルギン酸リアーゼを含む三種類の多糖類分解酵素液処理した後に、ＣＴＡＢ法を用いて核酸を抽出する方法であるが、アルギン酸リアーゼの由来や、他の二種類の多糖類分解酵素がどのような酵素であるのかが不明であり、さらに、実際に抽出されたヒジキのＤＮＡについて制限酵素処理がされているとの記載があるものの、係るデータの記載はなく、このＤＮＡの純度は明確ではないことから、このＤＮＡがＰＣＲ反応などに使用可能な品質であるか否かは不明である。さらに、褐藻類が有する粘性多糖類のゲル形成を抑制する手段については、何ら講じられていない。
【００１２】
本発明は、前記問題点を解決するためになされたものであって、褐藻類から簡便かつ効率的に高品質な核酸を抽出する方法、前記抽出した核酸に基づいて褐藻類の種を判別する方法、および褐藻類から核酸を抽出するキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
エゾアワビ（Ｈａｌｉｏｔｉｓ ｄｉｓｃｕｓ ｈａｎｎａｉ）の消化液中には、少なくとも二種類のアルギン酸リアーゼが発現していること、およびこれらアルギン酸リアーゼを含む多糖類分解酵素は、エゾアワビの中腸腺から抽出できることが本発明者らにより報告されている。さらに、これら二種類のアルギン酸リアーゼは、エンド型切断様式をもち三糖を生成するアルギン酸リアーゼ（ＨｄＡｌｙ）およびエキソ型切断様式をもち二糖を生成するアルギン酸リアーゼ（ＨｄＡｌｅｘ）であることが本発明者らにより報告されている（Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｅ．ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、第３３８巻、第２８４１−２８５２頁、２００３年、Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｅ．ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、第３４１巻、第１８０９−１８１９頁、２００３年）。
【００１４】
そこで本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、エゾアワビやアメフラシなどの海産軟体動物から抽出した多糖類分解酵素を用いて褐藻類に含まれる粘性多糖類を分解するとともに、キレート剤を用いて褐藻類に含まれる粘性多糖類のゲル形成を抑制することにより、高品質な核酸を簡便かつ効率的に抽出できること、あるいは多量の粘性多糖類が混入した褐藻類の核酸抽出物を得た後、エゾアワビやアメフラシなどの海産軟体動物から抽出した多糖類分解酵素を用いて混入した粘性多糖類を分解するとともに、キレート剤を用いて粘性多糖類のゲル形成を抑制することにより、高品質な核酸を簡便かつ効率的に抽出できること、さらにはこの抽出した核酸を鋳型とする核酸増幅反応を行うことで、褐藻類の種を的確に判別できることを見いだし、下記の各発明を完成した。
【００１５】
（１）褐藻類の核酸を抽出する方法であって、海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素を用いて褐藻類が有する粘性多糖類を分解する工程と、キレート剤を用いて褐藻類が有する粘性多糖類のゲル形成を抑制する工程と、タンパク質分解酵素を用いて褐藻類の核酸を抽出する工程とを有する、前記方法。
【００１６】
（２）海産軟体動物がアワビ属またはアメフラシ属に属する動物である、（１）に記載の方法。
【００１７】
（３）キレート剤がＥＤＴＡである、（１）または（２）に記載の方法。
【００１８】
（４）粘性多糖類がアルギン酸を含有する粘性多糖類である、（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
【００１９】
（５）多糖類分解酵素がアルギン酸リアーゼである、（１）から（４）のいずれかに記載の方法。
【００２０】
（６）アルギン酸リアーゼがＨｄＡｌｙおよび／またはＨｄＡｌｅｘである、（１）から（５）のいずれかに記載の方法。
【００２１】
（７）タンパク質分解酵素がＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫである、（１）から（６）のいずれかに記載の方法。
【００２２】
（８）褐藻類の種を判別する方法であって、海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素を用いて褐藻類が含有する粘性多糖類を分解する工程と、キレート剤を用いて褐藻類が有する粘性多糖類のゲル形成を抑制する工程と、タンパク質分解酵素を用いて褐藻類の核酸を抽出する工程と、
褐藻類から抽出された核酸を鋳型とする核酸増幅反応を行う工程とを有する、前記方法。
【００２３】
（９）海産軟体動物がアワビ属またはアメフラシ属に属する動物である、（８）に記載の方法。
【００２４】
（１０）キレート剤がＥＤＴＡである、（８）または（９）のいずれかに記載の方法。
【００２５】
（１１）粘性多糖類がアルギン酸を含有する粘性多糖類である、（８）から（１０）のいずれかに記載の方法。
【００２６】
（１２）多糖類分解酵素がアルギン酸リアーゼである、（８）から（１１）のいずれかに記載の方法。
【００２７】
（１３）アルギン酸リアーゼがＨｄＡｌｙおよび／またはＨｄＡｌｅｘである、（８）から（１２）のいずれかに記載の方法。
【００２８】
（１４）タンパク質分解酵素がＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫである、（８）から（１３）のいずれかに記載の方法。
【００２９】
（１５）海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素と、キレート剤と、タンパク質分解酵素とを有してなる、褐藻類核酸抽出キット。
【００３０】
（１６）海産軟体動物がアワビ属またはアメフラシ属に属する動物である、（１５）に記載の褐藻類核酸抽出キット。
【００３１】
（１７）キレート剤がＥＤＴＡである、（１５）または（１６）に記載の褐藻類核酸抽出キット。
【００３２】
（１８）多糖類分解酵素がアルギン酸リアーゼである、（１５）から（１７）のいずれかに記載の褐藻類核酸抽出キット。
【００３３】
（１９）アルギン酸リアーゼがＨｄＡｌｙおよび／またはＨｄＡｌｅｘである、（１５）から（１８）のいずれかに記載の褐藻類核酸抽出キット。
【００３４】
（２０）タンパク質分解酵素がＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫである、（１５）から（１９）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００３５】
本発明に係る褐藻類の核酸抽出方法および褐藻類核酸抽出キットによれば、褐藻類から簡便かつ効率的に高品質な核酸を抽出することができる。また、本発明に係る褐藻類の種判別方法によれば、前記抽出した核酸を用いて褐藻類の種を的確に判別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】エゾアワビ消化液から調製した粗抽出液および多糖類分解酵素液について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す図である。図中の矢印はエゾアワビアルギン酸リアーゼを示す。
【図２】生マコンブ酵素処理群、生マコンブ酵素無処理群、乾燥マコンブ酵素処理群および乾燥マコンブ酵素無処理群から抽出したそれぞれのＤＮＡを鋳型として、ミトコンドリア１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ増幅し、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を検出した図である。
【図３】ＤＮＡ抽出液により抽出した、多糖類分解酵素液により処理した群（酵素処理群）と処理しない群（酵素無処理群）のそれぞれのＤＮＡを鋳型として、ミトコンドリア１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ増幅し、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を検出した図である。
【図４】市販ＤＮＡ抽出キットにより抽出した、多糖類分解酵素液により処理した群（酵素処理群）と処理しない群（酵素無処理群）のそれぞれのＤＮＡを鋳型として、ミトコンドリア１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ増幅し、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を検出した図である。
【図５】市販ＤＮＡ抽出キットによりマコンブのＤＮＡ溶液を調製し、これに含まれる粘性多糖類をアメフラシ消化液から調製した多糖類分解酵素液により分解処理した後、このＤＮＡを鋳型としてミトコンドリア１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ増幅し、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を検出した図である。
【図６】市販ＤＮＡ抽出キットによりマコンブのＤＮＡ溶液を調製し、これに含まれる粘性多糖類を市販のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．由来アルギン酸リアーゼにより分解処理した後、このＤＮＡを鋳型として、同じプライマーセットを用いてミトコンドリア１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅を２回繰り返し行い、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を検出した図である。
【図７】様々なタンパク質分解酵素を添加したＤＮＡ抽出液を用いて抽出したマコンブのＤＮＡを鋳型として、ミトコンドリア１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ増幅し、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を検出した図である。
【図８】様々な褐藻類から抽出したＤＮＡを鋳型として、ミトコンドリアＮＡＤ５遺伝子をＰＣＲ増幅し、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を検出した図である。
【図９】様々な褐藻類から抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ増幅したミトコンドリアＮＡＤ５遺伝子の部分領域（約４９０ｂｐ）を、制限酵素ＥｃｏＴ１４IおよびＰｓｔIで消化した結果を示す図である。
【図１０】ガゴメ２８個体から抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ増幅したミトコンドリアＮＡＤ５遺伝子を、制限酵素ＥｃｏＴ１４IおよびＰｓｔIで消化した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、本発明に係る褐藻類の核酸抽出方法、褐藻類の種判別方法および褐藻類核酸抽出キットについて詳細に説明する。
【００３８】
本発明に係る褐藻類の核酸抽出方法は、褐藻類の核酸を抽出する方法であって、
（ｉ）海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素を用いて褐藻類が有する粘性多糖類を分解する工程（粘性多糖類分解工程）
（ｉｉ）キレート剤を用いて褐藻類が有する粘性多糖類のゲル形成を抑制する工程（ゲル形成抑制工程）
（ｉｉｉ）タンパク質分解酵素を用いて褐藻類の核酸を抽出する工程（核酸抽出工程）
以上（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を有する。
【００３９】
本発明において、核酸を抽出する対象となる褐藻類は特に限定されず、例えば、マコンブ、ホソメコンブ、リシリコンブ、オニコンブ、ミツイシコンブ、ナガコンブ、ガッガラコンブ、チヂミコンブ、ガゴメ、トロロコンブ、ゴヘイコンブ、エンドウコンブ、カラフトコンブ、ネコアシコンブ、アナメ、ツルモ、キコナイツルモ、ツルアラメ、チガイソ、スジメ、ワカメ、アイヌワカメ、ハバノリ、セイヨウハバノリ、モズク、ヒジキ、シオミドロ、タワラガタシオミドロ、ナガマツモ、モツキチャソウメン、イシモズク、マツモ、ネバリモ、メワケグサ、キタイワヒゲ、エゾブクロ、ウイキョウモ、オオバハバモドキ、ガサガサハバモドキ、チシマハバモドキ、ハバモドキ、カヤモノリ、フクロノリ、クロモ、ウスカヤモ、ワタモ、ウスバオオギ、ハネグンセンクロガシラ、ツクバネクロガシラ、ミツデクロガシラ、アミジクサ、イトアミジ、フクリンアミジ、エゾヤハズ、コモングサ、ムチモ、ウルシグサ、ケウルシグサ、ヒバマタ、エゾイシゲ、フシスジモク、ウミトラノオ、ミヤベモク、アカモク、ヨレモク、ウガノモク、エゾノネジモク、スギモク、ジョロモクなどを挙げることができる。また、褐藻類に含まれる粘性多糖類は、アルギン酸、フコイダン、ラミナランが主である。
【００４０】
本発明における海産軟体動物は、多糖類分解酵素を分泌し、その抽出が可能な海産軟体動物であり、そのような海産軟体動物としては、海産腹足綱軟体動物（腹足綱；Ｇａｓｔｒｏｐｏｄａ）を挙げることができ、海産腹足綱軟体動物に属する動物としては、例えば、アワビ属、アメフラシ属、リュウテン属、Ｃｈｌｏｒｏｓｔｏｍａ属、Ｌｉｔｔｏｒｉｎａ属、Ｌａｅｍｏｄｏｎｔａ属、Ｏｍｐｈａｌｉｕｓ属などに属する動物を挙げることができる。アワビ属に属する動物としては、例えば、クロアワビ、メガイアワビ、マダカアワビ、エゾアワビ、トコブシ、ミミガイなどを、アメフラシ属に属する動物としては、例えば、アメフラシ、ジャンボアメフラシ、ジャノメアメフラシ、アプリシア・シドニーエンシス、ゾウアメフラシ、ミドリアメフラシ、アマクサアメフラシ、クロヘリアメフラシ、サガミアメフラシ、アプリシア・エクストラオルディナリアなどを、リュウテン属としては、例えば、サザエ、ニシキサザエ、カンギク、スガイなどを、Ｃｈｌｏｒｏｓｔｏｍａ属としては、例えば、クボガイ、ヘソアキクボガイ、クマノコガイなどを、Ｌｉｔｔｏｒｉｎａ属としては、例えば、タマキビガイ、コウダカタマキビ、ヨーロッパタマキビ、アフリカタマキビ、アツタマキビなどを、Ｌａｅｍｏｄｏｎｔａ属としては、例えば、ウスコミミガイ、クリイロコミミガイ、ヘソアキコミミガイなどを、Ｏｍｐｈａｌｉｕｓ属としては、例えば、コシダカガンガラ、オオコシダカガンガラ、ヒメクボガイなどを、それぞれ挙げることができる。なお、本発明において、「海産軟体動物」は、「海洋軟体動物」、「海産無脊椎動物」、「海洋無脊椎動物」のそれぞれと交換可能に用いられる。
【００４１】
本発明において、海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素は、褐藻類に含まれる粘性多糖類を分解する活性を有する酵素であり、そのような酵素としては、例えば、アルギン酸リアーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、フコイダン分解酵素、ラミナラン分解酵素などの酵素、さらにはそれらの任意の組み合わせを挙げることができるが、アルギン酸リアーゼまたは前記組み合わせにアルギン酸リアーゼを含むものが好ましい。また、多糖類分解酵素という場合には、前記酵素やそれらの任意の組み合わせを、例えばリン酸緩衝液に溶解したものなど、溶液の状態のもの（多糖類分解酵素液）が含まれる。
【００４２】
ここで、本発明における多糖類分解酵素は、既報に従い、海産軟体動物から抽出し調製することができる（Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｅ．ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、第３４１巻、第１８０９−１８１９頁、２００３年）他、例えば、海産軟体動物を低温で粉砕し、アセトンで脱脂脱水してアセトン粉末を調製した後、それを液化して有機溶剤で分別沈殿を繰り返し、透析することにより調製することができる。さらには精製してもよく、そのような精製方法としては公知の方法を用いることができ、硫安分画やイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトゲル、ゲル濾過などのカラムクロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて用いることができる。また、抽出する対象の海産軟体動物において多糖類分解酵素の遺伝子を特定した後、この遺伝子のｃＤＮＡをクローニングし、当業者が適宜選択可能なベクターに挿入して適当な細胞に組み込んで発現系を構築し、組み換え酵素として生産したものを用いてもよく、このような方法で調製した多糖類分解酵素を用いることも、本発明の一態様である。
【００４３】
この多糖類分解酵素に含まれる成分の確認は、適宜、常法に従って行うことができるが、例えば、既知の分子量の情報に基づいてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより行うことができ、あるいは、多糖類分解酵素に対する抗体を利用してウエスタンブロッティング法やイムノクロマトグラフィー法などのイムノアッセイにより行うことができる。
【００４４】
この多糖類分解酵素の酵素活性の確認もまた、適宜、常法に従って行うことができるが、例えば、多糖類分解酵素を含む溶液に基質を添加してインキュベートし、基質の分解に伴い変化する吸光度を測定することにより行うことができる。
【００４５】
また、本発明において、キレート剤は特に限定されず、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、酒石酸、フィチン酸、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）などを挙げることができるが、ＥＤＴＡやクエン酸が好ましく、ＥＤＴＡがより好ましい。
【００４６】
（ｉ）粘性多糖類分解工程において、褐藻類に作用させる多糖類分解酵素の使用量、作用温度、作用時間などは特に限定されず、多糖類分解酵素の種類、多糖類分解酵素の濃度、褐藻類の量などに応じて適宜設定することができる。
【００４７】
（ｉｉ）ゲル形成抑制工程において、褐藻類に作用させるキレート剤の使用量、作用温度、作用時間などは特に限定されず、キレート剤の種類、キレート剤の濃度、褐藻類の量などに応じて適宜設定することができる。なお、本発明において、「ゲル形成抑制」は「ゲル形成阻害」と交換可能に用いられる。
【００４８】
（ｉｉｉ）核酸抽出工程において褐藻類の核酸を抽出する方法は、適宜、常法に従って行うことができ、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、ＳＤＳ、メルカプトエタノール、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅを含む核酸抽出液に試料を浸漬し、インキュベートした後、遠心分離を行い回収した上清をフェノールクロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿処理することによって行うことができる。また、この工程において、前処理として褐藻類を細かい断片状にすることが好ましいものの、粉砕を要しないため、簡便に核酸の抽出を行うことができる。
【００４９】
（ｉｉｉ）核酸抽出工程において用いるタンパク質分解酵素は、当業者が適宜選択可能なタンパク質分解酵素を用いることができる。そのようなタンパク質分解酵素としては、酸性Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、中性Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、塩基性Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅのいずれでもよく、例えば、スミチームＭＭＲ、スミチームＡＰ、スミチームＲＰ、スミチームＭＰ、スミチームＬＰ５０、スミチームＬＰＬ、スミチームＰ、スミチームＣＰ、スミチームＴＰ（以上、新日本化学工業社）、オリエンターゼ２０Ａ、オリエンターゼ９０Ｎ、オリエンターゼ１０ＮＬ、ヌクレイシン、オリエンターゼＯＮＳ、オリエンターゼ２２ＢＦ（以上、エイチ・ビイ・アイ社）、ウマミザイム、ニューセラーゼＦ、パパインＷ−４０、パンクレアチンＦ、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＡ−アマノＧ、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＭ−アマノ、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＮ−アマノ、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＳ−アマノ、ブロメラインＦ（以上、天野エンザイム社）、サモアーゼ、プロチンＡ、プロチンＰ、デスキンＣ（以上、大和化成社）、パパイン（メルク社）、α−キモトリプシン（和光純薬工業社）、トリプシン（ロシュ・アプライド・サイエンス社）、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（ニッポンジーン社）などを挙げることができるが、パパインやＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫが好ましく、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫがより好ましい。
【００５０】
（ｉｉｉ）核酸抽出工程においては、当業者により選択可能な公知の、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅを含む核酸抽出キットを用いることができる。そのようなキットとしては、例えば、ＩＳＯＨＡＩＲ（ニッポンジーン社）、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）、ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社）、ＭａｇＰｒｅｐ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｋｉｔ（メルク社）を挙げることができる。
【００５１】
また、（ｉｉｉ）の核酸抽出工程において抽出した核酸の品質を確認する場合は、例えば、抽出した核酸を鋳型として、常法に従ってＰＣＲ法を行い、核酸が増幅されたか否かをアガロースゲル電気泳動により確認する方法や、抽出した核酸に制限酵素を作用させて、核酸が切断されたか否かをアガロースゲル電気泳動により確認する方法などにより行うことができる。
【００５２】
なお、（ｉｉｉ）核酸抽出工程において用いる試薬は適宜、追加、置換および省略が可能である。
【００５３】
本発明に係る褐藻類の核酸抽出方法において、（ｉ）粘性多糖類分解工程、（ｉｉ）ゲル形成抑制工程および（ｉｉｉ）核酸抽出工程は順不同であり、この３つの工程を有していればよく、例えば、（ｉ）粘性多糖類分解工程と（ｉｉ）ゲル形成抑制工程とを同時に行うなどしてもよい。また、各工程を二回以上行ってもよく、例えば、（ｉｉ）ゲル形成抑制工程を行い、続いて（ｉｉｉ）核酸抽出工程を行った後、（ｉ）粘性多糖類分解工程と（ｉｉ）ゲル形成抑制工程とを同時に行うなどしてもよい。なお、タンパク質分解酵素が多糖類分解酵素を分解するおそれがあることから、（ｉｉｉ）核酸抽出工程は（ｉ）粘性多糖類分解工程および（ｉｉ）ゲル形成抑制工程の後に行うことが好ましい。
【００５４】
次に、本発明に係る褐藻類の種判別方法は、褐藻類の種を判別する方法であって、
（ｉ）海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素を用いて褐藻類が含有する粘性多糖類を分解する工程（粘性多糖類分解工程）
（ｉｉ）キレート剤を用いて褐藻類が有する粘性多糖類のゲル形成を抑制する工程（ゲル形成抑制工程）
（ｉｉｉ）タンパク質分解酵素を用いて褐藻類の核酸を抽出する工程（核酸抽出工程）
（ｉｖ）褐藻類から抽出された核酸を鋳型とする核酸増幅反応を行う工程（核酸増幅工程）
以上（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を有する。
【００５５】
（ｉｖ）核酸増幅工程における核酸増幅反応は、適宜、常法に従って行うことができ、例えば、褐藻類の既知の塩基配列を基にプライマーを設計し、これらプライマーと公知の耐熱性ポリメラーゼとを用いてＰＣＲ法により行うことができる。
【００５６】
（ｉｖ）核酸増幅工程において、増幅した核酸に基づく褐藻類の種の判別は、褐藻類の種間で多型の存在する塩基配列を検出する方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、褐藻類の種間で多型の存在する塩基配列をＰＣＲ法で増幅した後、シークエンサーで増幅した配列を決定して種を判別する方法や、褐藻類の種間で多型の存在する部位を含む塩基配列を増幅した後、制限酵素処理を行い、多型部位を検出する方法（ＣＡＰＳ法）などを挙げることができる。
【００５７】
本発明に係る褐藻類の種判別方法において用いるタンパク質分解酵素は、本発明に係る褐藻類の核酸抽出方法（ｉｉｉ）核酸抽出工程におけるタンパク質分解酵素を用いることができる。
【００５８】
次に、本発明に係る褐藻類核酸抽出キットは、海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素と、キレート剤と、タンパク質分解酵素を有してなる。本発明に係る褐藻類核酸抽出キットは、褐藻類から簡便かつ効率的に高品質な核酸を抽出するために用いられる。
【００５９】
本発明に係る褐藻類核酸抽出キットが有するタンパク質分解酵素は、本発明に係る褐藻類の核酸抽出方法（ｉｉｉ）核酸抽出工程におけるタンパク質分解酵素を用いることができる。
【００６０】
なお、本発明に係る褐藻類核酸抽出キットには、その特徴を損なわない限り、あらゆる構成を含んでもよく、例えば、褐藻類の核酸抽出手段の実施に有用な試薬やカラムなどを含んでもよい。
【００６１】
以下、本発明に係る褐藻類の核酸抽出方法、褐藻類の種判別方法および褐藻類核酸抽出キットについて、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００６２】
＜実施例１＞多糖類分解酵素液の調製、分析および活性測定
（１）多糖類分解酵素液の調製
北海道函館市内の市場で生きたエゾアワビ５個体を購入した後、直ちに解体し、ピペットを用いて中腸腺内の消化液を採取したところ、１個体につき約０．８ｍＬ、計約４ｍＬの消化液が得られた。このうち０．０１ｍＬを粗抽出液とし、−２０℃で凍結保存した。一方、残りの消化液について、セルロースチューブ（三光純薬社）を用いて１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８）に透析した後、４℃、１０００００×ｇの条件下で３０分間遠心分離を行い、上清を回収した。続いて、定法に従って８０〜１００％（ｗ／ｗ）硫酸アンモニウム水溶液により硫安分画を行い、沈殿を回収した。得られた沈殿を１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解し、セルロースチューブ（三光純薬社）を用いて１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８）に透析し、６ｍＬの溶液を得た。この溶液を多糖類分解酵素液とし、使用するまで−２０℃で凍結保存した（Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｅ．ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、第３４１巻、第１８０９−１８１９頁、２００３年）。
【００６３】
（２）多糖類分解酵素液に含まれるタンパク質の分析
本実施例（１）で調製した粗抽出液０．０１ｍＬおよび多糖類分解酵素液０．０１ｍＬについて、Ｐｏｒｚｉｏ ＆ Ｐｅａｒｓｏｎの方法（ＰＯＲＺＩＯ，Ｍ．Ａ．，ＰＥＡＲＳＯＮ，Ａ．Ｍ．、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ、第３８４巻、第２３５−２４１頁、１９７５年）に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。タンパク質分子量マーカーは、Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ Ｍａｒｋｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いた。泳動後のゲルは、０．１％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ；ＣＢＢ）、５０％（ｖ／ｖ）メタノールおよび１０％（ｖ／ｖ） 酢酸を含む水溶液で染色し、７％（ｖ／ｖ）酢酸および５％（ｖ／ｖ）メタノールを含む水溶液で脱色した。その結果を図１に示す。
【００６４】
図１に示すように、本実施例（１）で調製した多糖類分解酵素液においては、約２８ｋＤａのバンドが高い強度で確認された。一方、粗抽出液においては、約２７ｋＤａないし約６６ｋＤａの範囲で様々な分子量のバンドが、いずれも中程度の強度で検出された。
【００６５】
続いて、泳動後のゲルを濾紙の上に置き、セロファンを被せて乾燥させた。乾燥させたゲルの画像について、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｖｅｒ．１．４２；Ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／；アメリカ国立衛生研究所）を用いてデンシトメトリーを行い、多糖類分解酵素液に含まれるタンパク質の総質量および検出された約２８ｋＤａのバンドに相当するタンパク質の質量を計測し、この約２８ｋＤａのバンドに相当するタンパク質の濃度（ｗ／ｗ）を算出した。
【００６６】
その結果、この約２８ｋＤａのバンドに相当するタンパク質の濃度は７０％（ｗ／ｗ）であることが明らかになった。
【００６７】
本発明者らは以前に、エゾアワビの消化液中には、三糖を生成するエンド型アルギン酸リアーゼＨｄＡｌｙ（配列番号１；アクセッション番号；ＡＢ１１００９４）および二糖を生成するエキソ型アルギン酸リアーゼＨｄＡｌｅｘ（配列番号２；アクセッション番号；ＢＡＥ８１７８７）の少なくとも２種類が含まれることを報告している。また、ＨｄＡｌｙは約２８ｋＤａの位置に泳動され、ＨｄＡｌｅｘは２８ｋＤａより数ｋＤａ大きい位置に泳動されること、およびエゾアワビにおける含有量はＨｄＡｌｙがＨｄＡｌｅｘに比べてはるかに大きいことを報告している（Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｅ．ら、 Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、第３３８巻、第２８４１−２８５２頁、２００３年，Ｓｕｚｕｋｉ Ｈら、Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．、第３４１巻、第１８０９−１８１９頁、２００３年）。これらのことから、図１に示す、多糖類分解酵素液における約２８ｋＤａのバンドはＨｄＡｌｙおよびＨｄＡｌｅｘであるといえる。よって、本実施例（１）で調製した多糖類分解酵素液にはエゾアワビ由来アルギン酸リアーゼＨｄＡｌｙおよびＨｄＡｌｅｘが約７０％（ｗ／ｗ）含まれることが明らかになった。これに対し、粗抽出液におけるエゾアワビ由来アルギン酸リアーゼＨｄＡｌｙおよびＨｄＡｌｅｘの濃度は７０％には満たず、他の様々な分子量を有するタンパク質が多く含まれることが明らかになった。これらの結果から、本実施例（１）の処理工程によりアルギン酸リアーゼの濃度が高められたことが明らかになった。
【００６８】
（３）多糖類分解酵素液のアルギン酸分解活性の測定
本実施例（１）で調製した多糖類分解酵素液０．０５ｍＬに、リン酸ナトリウム（ｐＨ８）およびアルギン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ社）をそれぞれ１０ｍｍｏｌ／Ｌおよび０．２％（ｗ／ｖ）となるように加え、３０℃でインキュベートした後、２３５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００６９】
アルギン酸ナトリウムの分解に伴い、構成する単糖の第４位の炭素（Ｃ４）と第５位の炭素（Ｃ５）との間に二重結合が生じ、２３５ｎｍにおける吸光度が上昇することから、前記条件下、２３５ｎｍにおける吸光度を１分間に０．０１上昇させる活性（アルギン酸分解活性）を１Ｕと定義し、測定した吸光度に基づいてアルギン酸分解活性を算出した。
【００７０】
その結果、本実施例（１）で調製した多糖類分解酵素液のアルギン酸分解活性は、３０℃で１２９０Ｕ／ｍＬであった。
【００７１】
＜実施例２＞粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害後のＤＮＡ抽出
（１）マコンブの粘性多糖類の分解
北海道函館市沿岸で採取した生マコンブおよび同じ海域で採取した後、天日で乾燥させた乾燥マコンブからそれぞれ約０．０２ｇの組織片をブレードで切り取り、各組織片をさらに細切りにした。続いてこれらを約０．０１ｇずつに分け、生マコンブ酵素処理群、生マコンブ酵素無処理群、乾燥マコンブ酵素処理群および乾燥マコンブ酵素無処理群の４群を設定した。実施例１（１）で調製した多糖類分解酵素液をリン酸緩衝液（ｐＨ８）で１００Ｕ／ｍＬに希釈した後、生マコンブ酵素処理群および乾燥マコンブ酵素処理群にそれぞれ１ｍＬずつ加え、１７℃で４時間、時々振盪しながらインキュベートした。生マコンブ酵素無処理群および乾燥マコンブ酵素無処理群には、リン酸緩衝液（ｐＨ８）を１ｍＬ加えて、同様にインキュベートした。
【００７２】
（２）マコンブの粘性多糖類のゲル形成阻害
本実施例（１）の生マコンブ酵素処理群、生マコンブ酵素無処理群、乾燥マコンブ酵素処理群および乾燥マコンブ酵素無処理群にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）をそれぞれ１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、１７℃で１時間、インキュベートした。
【００７３】
（３）ＤＮＡ抽出液によるマコンブからのＤＮＡ抽出
［３−１］ＤＮＡ抽出液の調製
まず、滅菌水を溶媒として、以下の組成のＤＮＡ抽出液を調製した。
【００７４】
ＤＮＡ抽出液の調製
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（ニッポンジーン社） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＤＴＡ（ニッポンジーン社） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ（ニッポンジーン社） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＳＤＳ（ニッポンジーン社） １％（ｗ／ｗ）
メルカプトエタノール（ニッポンジーン社） ２％（ｗ／ｗ）
ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（ニッポンジーン社） ０．５ｍｇ／ｍＬ
【００７５】
［３−２］ＤＮＡ抽出液によるマコンブからのＤＮＡ抽出
本実施例（２）の生マコンブ酵素処理群、生マコンブ酵素無処理群、乾燥マコンブ酵素処理群および乾燥マコンブ酵素無処理群のそれぞれを２００μＬずつ分取し、本実施例［３−１］で調製したＤＮＡ抽出液のうち８００μＬずつをそれぞれに加え、５５℃で３０分間インキュベートした。その後、室温、１００００×ｇの条件下で１０分間遠心分離を行い、上清を回収した。続いて、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）の等量をそれぞれに添加し、５分間転倒混和した。室温、１１０００×ｇの条件下で１分間遠心分離を行った後、水層を回収し、定法に従いエタノール沈殿を行って沈殿を回収した。これを真空乾燥後、それぞれ２０μＬの滅菌水に溶解し、ＤＮＡ溶液とした。
【００７６】
（４）市販ＤＮＡ抽出キットによるマコンブからのＤＮＡ抽出
本実施例（２）の生マコンブ酵素処理群、生マコンブ酵素無処理群、乾燥マコンブ酵素処理群および乾燥マコンブ酵素無処理群のそれぞれを５００μＬずつ分取し、市販ＤＮＡ抽出キットのＩＳＯＨＡＩＲ（ニッポンジーン社）を用いて、添付のプロトコールに従いＤＮＡの抽出を行った後、それぞれ２０μＬの添付のトリスＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液（ｐＨ８）に溶解し、ＤＮＡ溶液とした。
【００７７】
（５）抽出したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ
マコンブのミトコンドリアＤＮＡに存在する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（アクセッション番号；ＡＰ０１１４９３）の一部分の約８７０ｂｐを増幅するプライマーを設計した。設計したプライマーを以下に示す。
【００７８】
設計したプライマー
フォワードプライマー；５’−ＧＧＧＴＴＣＡＡＡＴＣＣＣＡＣＣＴＴＡＴＣＣ−３’（配列番号３）
リバースプライマー ；５’−ＡＣＡＡＣＣＴＡＡＧＣＣＴＴＣＡＡＴＣＣＣ−３’（配列番号４）
【００７９】
続いて、本実施例（３）［３−２］で抽出した各群のＤＮＡ溶液および本実施例（４）で抽出した各群のＤＮＡ溶液からそれぞれ１μＬずつ分取し、これらを鋳型として、配列番号３のプライマー、配列番号４のプライマーおよびＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社）を用いて、添付のプロトコールに従いＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は９４℃で３０秒、５５℃で２秒、７２℃で３０秒を１サイクルとして、合計３５〜４０サイクル行った。
【００８０】
その後、ＰＣＲ反応液からそれぞれ１０μＬずつ分取し、１倍濃度のトリス酢酸ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝液中で１．５％（ｗ／ｗ）のアガロースゲルを用いてアガロースゲル電気泳動を行った。泳動後のゲルはエチジウムブロマイド溶液に浸漬し、紫外線を照射してＤＮＡを検出した。本実施例（３）［３−２］で抽出した各群の結果を図２に示す。
【００８１】
図２に示すように、本実施例（３）［３−２］で抽出した生マコンブ酵素処理群および乾燥マコンブ酵素処理群の場合には、約８７０ｂｐのＤＮＡの増幅が確認された。一方、生マコンブ酵素無処理群および乾燥マコンブ酵素無処理群の場合には、約８７０ｂｐのＤＮＡは増幅されなかった。また、本実施例（４）で抽出した各群の場合も、これと同様の結果であった。すなわち、本実施例（４）で抽出した生マコンブ酵素処理群および乾燥マコンブ酵素処理群の場合には、約８７０ｂｐのＤＮＡの増幅が確認され、生マコンブ酵素無処理群および乾燥マコンブ酵素無処理群の場合には、約８７０ｂｐのＤＮＡは増幅されなかった。
【００８２】
以上の結果から、粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害を行った後にＤＮＡを抽出することにより、生マコンブからだけでなく乾燥マコンブからも、ＰＣＲの鋳型として使用可能である高品質なＤＮＡを抽出できることが確認された。また、ＤＮＡの抽出には、本実施例（３）で調製したＤＮＡ抽出液のみならず、市販のＤＮＡ抽出キットも使用可能であることが確認された。
【００８３】
＜実施例３＞ゲル形成阻害を行った後の、ＤＮＡ抽出後の粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害
（１）マコンブの粘性多糖類のゲル形成阻害
北海道函館市沿岸で採取した後、天日で乾燥させた乾燥マコンブ１２個体からそれぞれ約０．０１ｇの組織片をブレードで切り取り、各組織片をさらに細切りにして１．５ｍＬチューブに入れ、サンプルとした（サンプルＮｏ．１〜Ｎｏ．１２）。続いて、１２５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ（ｐＨ８）および１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む水溶液０．５ｍＬをそれぞれに添加し、３０分間浸漬した。
【００８４】
（２）マコンブからのＤＮＡ抽出
［２−１］ＤＮＡ抽出液によるマコンブからのＤＮＡ抽出
本実施例（１）のサンプルＮｏ．１〜Ｎｏ．８について、室温、１００００×ｇの条件下で１分間遠心分離を行って上清を除き、実施例２（３）［３−１］に記載の方法により調製したＤＮＡ抽出液４５０μＬずつをそれぞれに加えて、５５℃で３０分間インキュベートした。その後、室温、１００００×ｇの条件下で１０分間遠心分離を行い、上清を回収した。続いて、等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）をそれぞれに添加し、５分間転倒混和した。室温、１１０００×ｇの条件下で１分間遠心分離を行った後、水層を約１００μＬずつ各サンプルにつき２本の１．５ｍＬチューブに分注した。Ｎｏ．１から得られた２本のサンプルをそれぞれＮｏ．１ａおよびＮｏ．１ｂ、Ｎｏ．２から得られた２本のサンプルをそれぞれＮｏ．２ａおよびＮｏ．２ｂとし、以下、Ｎｏ．８ａおよびＮｏ．８ｂまでの計１６本のサンプルをそれぞれ調製した。
【００８５】
［２−２］市販ＤＮＡ抽出キットによるマコンブからのＤＮＡ抽出
本実施例（１）のサンプルＮｏ．９〜Ｎｏ．１２について、市販ＤＮＡ抽出キットのＩＳＯＨＡＩＲ（ニッポンジーン社）を用いて添付のプロトコールに従いＤＮＡの抽出を行い、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール処理を行った後、室温、１１０００×ｇの条件下で１分間遠心分離を行って得られた水層を、約１００μＬずつ各サンプルにつき２本の１．５ｍＬチューブに分注した。Ｎｏ．９から得られた２本のサンプルをそれぞれＮｏ．９ａおよびＮｏ．９ｂ、Ｎｏ．１０から得られた２本のサンプルをそれぞれＮｏ．１０ａおよびＮｏ．１０ｂとし、以下、Ｎｏ．１２ａおよびＮｏ．１２ｂまでの計８本のサンプルをそれぞれ調製した。
【００８６】
（３）マコンブの粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害
本実施例（１）および本実施例（２）で調製したａ標識のサンプルＮｏ．１ａ〜Ｎｏ．１２ａの１２本を酵素処理群とし、本実施例（１）および本実施例（２）で調製したｂ標識のサンプルＮｏ．１ｂ〜Ｎｏ．１２ｂの１２本を酵素無処理群とした。実施例１（１）で調製した多糖類分解酵素液１０Ｕを１２５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ（ｐＨ８）で１００μＬにメスアップして酵素処理群のサンプルＮｏ．１ａ〜Ｎｏ．１２ａにそれぞれ添加した。また、コントロールとして多糖類分解酵素液１０Ｕを１２５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ（ｐＨ８）で２００μＬにメスアップしたサンプルを作成した。酵素無処理群のサンプルＮｏ．１ｂ〜Ｎｏ．１２ｂには１２５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ（ｐＨ８）１００μＬをそれぞれ添加した。その後、すべてのサンプルを３０℃で４時間インキュベートし、さらに９０℃で１０分間インキュベートした。続いて、定法に従いエタノール沈殿を行って得られた沈殿を風乾した後、１００μＬのＴＥ緩衝液｛１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ｝に溶解し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＳＰＩＮ ＫＩＴ（Ｑ−ＢＩＯ ｇｅｎｅ社）を用いて精製した。
【００８７】
（４）抽出したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ
本実施例（３）の各サンプルからそれぞれ５μＬずつ分取し、これらを鋳型として、実施例２（５）に記載の方法によりＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動を行った。サンプルＮｏ．１ａ〜Ｎｏ．８ａおよびサンプルＮｏ．１ｂ〜Ｎｏ．８ｂについての結果を図３に、サンプルＮｏ．９ａ〜Ｎｏ．１２ａおよびサンプルＮｏ．９ｂ〜Ｎｏ．１２ｂについての結果を図４に示す。
【００８８】
図３に示すように、ＤＮＡ抽出液により抽出したＤＮＡを鋳型とした場合、酵素処理群では、サンプルＮｏ．１ａ〜Ｎｏ．８ａのすべてにおいて約８７０ｂｐのＤＮＡの増幅が確認され、増幅性の違いもほとんど見られなかった。一方、酵素無処理群では、サンプルＮｏ．５ｂ、Ｎｏ．６ｂおよびＮｏ．７ｂにおいて約８７０ｂｐのＤＮＡの増幅が確認されず、サンプル間でのＤＮＡ増幅性にも差が見られた。
【００８９】
また、図４に示すように、市販ＤＮＡ抽出キットにより抽出したＤＮＡを鋳型とした場合、酵素処理群では、サンプルＮｏ．９ａ〜Ｎｏ．１２ａのすべてにおいて約８７０ｂｐのＤＮＡの増幅が確認され、増幅性の違いもほとんど見られなかった。一方、酵素無処理群では、サンプルＮｏ．９ｂおよびＮｏ．１０ｂにおいて約８７０ｂｐのＤＮＡの増幅が確認できず、サンプル間でのＤＮＡ増幅性に差が見られた。なお、コントロールでは、ＤＮＡの増幅が確認されなかった。
【００９０】
以上の結果から、マコンブの粘性多糖類のゲル形成阻害を行い、続いてＤＮＡを抽出し、多糖類分解酵素液による処理およびゲル形成阻害を行うことにより、ＰＣＲの鋳型として使用可能である高品質なＤＮＡを、乾燥マコンブから安定的に抽出できることが確認された。また、ＤＮＡの抽出には、実施例２（３）［３−１］に記載の方法により調製したＤＮＡ抽出液のみならず、市販のＤＮＡ抽出キットも使用可能であることが確認された。
【００９１】
＜実施例４＞多糖類分解酵素の検討
（１）アメフラシ由来多糖類分解酵素液の調製
北海道函館市沿岸で生きたアメフラシ２０個体を採取した後、直ちに解体し、ピペットを用いて中腸腺内の消化液を採取したところ、１個体につき約０．５ｍＬ、計約１０ｍＬの消化液が得られた。これを、実施例１（１）に記載の方法により精製し、１２ｍＬの溶液を得た。この溶液をアメフラシ由来多糖類分解酵素液とし、使用するまで−２０℃で凍結保存した。
【００９２】
（２）マコンブの粘性多糖類のゲル形成阻害
北海道函館市沿岸で採取した後、天日で乾燥させた乾燥マコンブ９個体をサンプル（サンプルＮｏ．１３〜Ｎｏ．２１）として、実施例３（１）に記載の方法により、ゲル形成阻害を行った。
【００９３】
（３）市販ＤＮＡ抽出キットによるマコンブからのＤＮＡ抽出
本実施例（２）のサンプルＮｏ．１３〜Ｎｏ．２１について、実施例３［２−２］に記載の方法によりＤＮＡ抽出を行い、ａ標識のサンプルＮｏ．１３ａ〜Ｎｏ．２１ａおよびｂ標識のサンプルＮｏ．１３ｂ〜Ｎｏ．２１ｂの、計１８本のサンプルを調製した。
【００９４】
（４）アメフラシ由来多糖類分解酵素によるマコンブの粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害
本実施例（３）で調製したａ標識のサンプルＮｏ．１３ａ〜Ｎｏ．１６ａの４本について、実施例１（１）の多糖類分解酵素液を本実施例（１）のアメフラシ由来多糖類分解酵素液に代えて、実施例３（３）に記載の方法によりマコンブの粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害を行った。続いて、実施例３（４）に記載の方法により、ａ標識のサンプルＮｏ．１３ａ〜Ｎｏ．１６ａを鋳型としたＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動を行った。その結果を図５に示す。
【００９５】
図５に示すように、サンプルＮｏ．１４ａ、Ｎｏ．１５ａおよびＮｏ．１６ａにおいて約８７０ｂｐのＤＮＡの増幅が確認された。これらの結果から、アメフラシ由来多糖類分解酵素液によりマコンブの粘性多糖類を分解した場合は、ＰＣＲの鋳型として使用可能な高品質なＤＮＡを乾燥マコンブから抽出できることが確認された。
【００９６】
（５）Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．由来アルギン酸リアーゼまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来ペクチナーゼによるマコンブの粘性多糖類の分解
本実施例（３）で調製したａ標識のサンプルＮｏ．１７ａ〜Ｎｏ．２１ａの５本については、実施例１（１）で調製した多糖類分解酵素液を市販のアルギン酸分解酵素（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．由来アルギン酸リアーゼ；ＳＩＧＭＡ社）に代えて、実施例３（３）に記載の方法によりマコンブの粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害を行った。本実施例（３）で調製したｂ標識のサンプルＮｏ．１７ｂ〜Ｎｏ．２１ｂの５本については、実施例１（１）で調製した多糖類分解酵素液を市販の多糖類分解酵素（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来ペクチナーゼ；ＳＩＧＭＡ社）に代えて、実施例３（３）に記載の方法によりマコンブの粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害を行った。
【００９７】
続いて、実施例３（４）に記載の方法により、サンプルＮｏ．１７ａ〜Ｎｏ．２１ａおよびサンプルＮｏ．１７ｂ〜Ｎｏ．２１ｂを鋳型としたＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動を行った。Ｎｏ．１７ａ〜Ｎｏ．２１ａおよびＮｏ．１７ｂ〜Ｎｏ．２１ｂのすべてのサンプルにおいて、１回のＰＣＲではＤＮＡの増幅が全く確認されなかったため、１回目のＰＣＲ産物を鋳型とし、同じプライマーを用いて２回目のＰＣＲを行った。ａ標識のサンプルＮｏ．１７ａ〜Ｎｏ．２１ａにおける２回目のＰＣＲの結果を図６に示す。
【００９８】
図６に示すように、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．由来アルギン酸リアーゼにより粘性多糖類を分解した場合、２回目のＰＣＲで、サンプルＮｏ．１７ａ、Ｎｏ．１８ａおよびＮｏ．２０ａにおいて約８７０ｂｐのＤＮＡの増幅がわずかに確認されたが、サンプルＮｏ．１９ａおよびＮｏ．２１ａでは、ＤＮＡの増幅は確認されなかった。また、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来ペクチナーゼにより粘性多糖類を分解した場合は、２回目のＰＣＲでも、サンプルＮｏ．１７ｂ〜Ｎｏ．２１ｂのすべてにおいてＤＮＡの増幅は確認されなかった。
【００９９】
以上の結果と実施例３の結果との比較から、市販のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．由来アルギン酸リアーゼまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来ペクチナーゼによりマコンブの粘性多糖類を分解した場合は、実施例１（１）で調製した多糖類分解酵素液により粘性多糖類を分解した場合と比較して、抽出されたＤＮＡが少量ないし低品質であることが明らかになった。
【０１００】
＜実施例５＞キレート剤の検討
（１）マコンブの粘性多糖類のゲル形成阻害
北海道函館市沿岸で採取した後、天日で乾燥させた乾燥マコンブ５個体をサンプルＮｏ．２２〜Ｎｏ．２６とし、１個体につき約０．０４ｇずつ組織片をブレードで切り取り、各組織片をさらに細切りにした後、それぞれを約０．０１ｇずつに分けた。Ｎｏ．２２から得られた４本のサンプルをそれぞれＮｏ．２２ａ、Ｎｏ．２２ｂ、Ｎｏ．２２ｃおよびＮｏ．２２ｄ、Ｎｏ．２３から得られた４本のサンプルをそれぞれＮｏ．２３ａ、Ｎｏ．２３ｂ、Ｎｏ，２３ｃおよびＮｏ．２３ｄとし、以下、Ｎｏ．２６ａ、Ｎｏ．２６ｂ、Ｎｏ．２６ｃおよびＮｏ．２６ｄまでの計２０本のサンプルをそれぞれ調製した。
【０１０１】
続いて、調製したａ標識のサンプルＮｏ．２２ａ〜Ｎｏ．２６ａの５本については、１２５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ（ｐＨ８）を１０ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸に代えて、調製したｂ標識のサンプルＮｏ．２２ｂ〜Ｎｏ．２６ｂの５本については、前記ＥＤＴＡを１０ｍｍｏｌ／Ｌのグリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）に代えて、調製したｃ標識のサンプルＮｏ．２２ｃ〜Ｎｏ．２６ｃの５本については、前記ＥＤＴＡを１０ｍｍｏｌ／Ｌの酒石酸に代えて、調製したｄ標識のサンプルＮｏ．２２ｄ〜Ｎｏ．２６ｄの５本については、前記ＥＤＴＡを１０ｍｍｏｌ／Ｌのフィチン酸に代えて、それぞれ、実施例３（１）に記載の方法によりマコンブの粘性多糖類のゲル形成阻害を行った。
【０１０２】
（２）市販ＤＮＡ抽出キットによるマコンブからのＤＮＡ抽出
本実施例（１）のａ標識のサンプルＮｏ．２２ａ〜Ｎｏ．２６ａ、ｂ標識のサンプルＮｏ．２２ｂ〜Ｎｏ．２６ｂ、ｃ標識のサンプルＮｏ．２２ｃ〜Ｎｏ．２６ｃおよびｄ標識のサンプルＮｏ．２２ｄ〜Ｎｏ．２６ｄの全てについて、実施例３（２）［２−２］に記載の方法によりＤＮＡ抽出を行い、各サンプルにつき２本のＤＮＡ溶液を調製した。そのうち各サンプルにつき１本のＤＮＡ溶液を以下の処理に供した。
【０１０３】
（３）マコンブの粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害
本実施例（２）で調製したａ標識のサンプルＮｏ．２２ａ〜Ｎｏ．２６の５本については、１２５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ（ｐＨ８）を１０ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸に代えて、本実施例（２）で調製したｂ標識のサンプルＮｏ．２２ｂ〜Ｎｏ．２６ｂの５本については、前記ＥＤＴＡを１０ｍｍｏｌ／Ｌのグリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）に代えて、調製したｃ標識のサンプルＮｏ．２２ｃ〜Ｎｏ．２６ｃの５本については、前記ＥＤＴＡを１０ｍｍｏｌ／Ｌの酒石酸に代えて、調製したｄ標識のサンプルＮｏ．２２ｄ〜Ｎｏ．２６ｄの５本については、前記ＥＤＴＡを１０ｍｍｏｌ／Ｌのフィチン酸に代えて、それぞれ、実施例３（３）に記載の方法によりマコンブの粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害を行った。
【０１０４】
続いて、実施例３（４）に記載の方法により、ａ標識のサンプルＮｏ．２２ａ〜Ｎｏ．２６ａ、ｂ標識のサンプルＮｏ．２２ｂ〜Ｎｏ．２６ｂ、ｃ標識のサンプルＮｏ．２２ｃ〜Ｎｏ．２６ｃおよびｄ標識のサンプルＮｏ．２２ｄ〜Ｎｏ．２６ｄを鋳型としたＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動をそれぞれ行った。
【０１０５】
その結果、クエン酸を用いたサンプルＮｏ．２２ａ〜Ｎｏ．２６ａでは、そのうちの１つのサンプルで約８７０ｂｐのＤＮＡの増幅が確認されたが、残りの４つのサンプルではＤＮＡの増幅が確認されなかった。ＥＧＴＡを用いたサンプルＮｏ．２２ｂ〜Ｎｏ．２６ｂ、酒石酸を用いたサンプルＮｏ．２２ｃ〜Ｎｏ．２６ｃおよびフィチン酸を用いたサンプルＮｏ．２２ｄ〜Ｎｏ．２６ｄではいずれもＤＮＡの増幅が確認されなかった。
【０１０６】
以上の結果と実施例３の結果との比較から、クエン酸、ＥＧＴＡ、酒石酸またはフィチン酸によりマコンブの粘性多糖類のゲル形成阻害を行った場合は、ＥＤＴＡにより粘性多糖類のゲル形成阻害を行った場合と比較して、抽出されたＤＮＡが少量ないし低品質であることが明らかになった。また、キレート剤を添加しなかったサンプルではＤＮＡの増幅が確認されなかったことから、高品質な核酸の抽出には、ＥＤＴＡなどのキレート剤が必要であることが明らかになった。これは、褐藻類の粘性多糖類に主に含まれるアルギン酸は海水中のカルシウム、マグネシウムおよびストロンチウムなどの２価金属イオンを吸着しゲル化することから、多糖類分解酵素による分解だけでは除去することができず、金属キレート剤によりこのゲル形成を阻害することで分解除去が可能となるためと発明者らは考えている。
【０１０７】
＜実施例６＞タンパク質分解酵素の検討
（１）マコンブの粘性多糖類の分解
北海道函館市沿岸で採取した後、天日で乾燥させた乾燥マコンブから約０．０５ｇの組織片をブレードで切り取り、これをさらに細切りにした後、約０．０１ｇずつに分け、サンプルとした（サンプルＮｏ．２７〜Ｎｏ．３２）。これら５つのサンプルについて、実施例２（１）に記載の方法により、マコンブの粘性多糖類の分解を行った。
【０１０８】
（２）マコンブの粘性多糖類のゲル形成阻害
続いて、本実施例（１）で調製したサンプルＮｏ．２７〜Ｎｏ．３１について、実施例２（２）に記載の方法によりゲル形成阻害を行った。
【０１０９】
（３）ＤＮＡ抽出液によるマコンブからのＤＮＡ抽出
［３−１］ＤＮＡ抽出液の調製
実施例２（３）［３−１］に記載のＤＮＡ抽出液の組成において、以下の１．〜４．の点で異なるＤＮＡ抽出液をそれぞれ調製した。
１．ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを添加しないＤＮＡ抽出液（タンパク質分解酵素無添加ＤＮＡ抽出液）
２．ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫをパパイン（製品名パパイン；メルク社）に代えたＤＮＡ抽出液（パパイン−ＤＮＡ抽出液）
３．ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫをキモトリプシン（製品名α−キモトリプシン；和光純薬工業社）に代えたＤＮＡ抽出液（キモトリプシン−ＤＮＡ抽出液）
４．ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫをトリプシン（製品名トリプシン；ロシュ・アプライド・サイエンス社）に代えたＤＮＡ抽出液（トリプシン−ＤＮＡ抽出液）
【０１１０】
［３−２］各ＤＮＡ抽出液によるマコンブからのＤＮＡ抽出
本実施例（２）で調製したサンプルＮｏ．２７については、実施例２（３）［３−１］で調製したＤＮＡ抽出液を本実施例（３）［３−１］で調製したタンパク質分解酵素無添加ＤＮＡ抽出液に代えて、本実施例（２）で調製したサンプルＮｏ．２８については、実施例２［３−１］で調製したＤＮＡ抽出液を本実施例（３）［３−１］で調製したパパイン−ＤＮＡ抽出液に代えて、本実施例（２）で調製したサンプルＮｏ．２９については、実施例２（３）［３−１］で調製したＤＮＡ抽出液を本実施例（３）［３−１］で調製したキモトリプシン−ＤＮＡ抽出液に代えて、本実施例（２）で調製したサンプルＮｏ．３０については、実施例２（３）［３−１］で調製したＤＮＡ抽出液を本実施例（３）［３−１］で調製したトリプシン−ＤＮＡ抽出液に代えて、本実施例（２）で調製したサンプルＮｏ．３１については、実施例２（３）［３−１］で調製したＤＮＡ抽出液を用いて、それぞれ、実施例２（３）［３−２］に記載の方法によりマコンブからのＤＮＡ抽出を行った。
【０１１１】
続いて、実施例２（５）に記載の方法により、サンプルＮｏ．２７〜Ｎｏ．３１を鋳型としたＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動を行った。その結果を図７に示す。
【０１１２】
図７に示すように、実施例２（３）［３−１］で調製した、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを含むＤＮＡ抽出液を用いたサンプルＮｏ．３１では、約８７０ｂｐのＤＮＡの増幅が明確に確認された。また、パパイン−ＤＮＡ抽出液を用いたサンプルＮｏ．２８においても、約８７０ｂｐのＤＮＡが少量増幅したことが確認された。
【０１１３】
以上の結果から、ＤＮＡ抽出液にタンパク質分解酵素を添加することにより、ＰＣＲの鋳型として使用可能である高品質なＤＮＡをマコンブから抽出できることが明らかになった。
【０１１４】
＜実施例７＞様々なコンブ類からのＤＮＡ抽出
（１）様々な褐藻類の粘性多糖類のゲル形成阻害
コンブ属８種（マコンブ、ホソメコンブ、リシリコンブ、オニコンブ、ミツイシコンブ、ナガコンブ、ガッガラコンブ、チヂミコンブ）、トロロコンブ属２種（ガゴメ、トロロコンブ）、スジメ属１種（スジメ）およびワカメを北海道沿岸で採取した後、天日で乾燥させた。その後、それぞれ乾燥重量で約０．０１ｇの組織片をブレードで切り取り、実施例３（１）に記載の方法により粘性多糖類のゲル形成阻害を行った。
【０１１５】
（２）様々な褐藻類からのＤＮＡ抽出
本実施例（１）の全てのサンプルについて、実施例３（２）［２−１］に記載の方法によりＤＮＡを抽出し、各サンプルにつき２本ずつ、ＤＮＡ溶液を調製した。そのうち、各サンプルにつき１本ずつ、ＤＮＡ溶液を以下の処理に供した。
【０１１６】
（３）様々な褐藻類の粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害
本実施例（２）で調製した各サンプルのＤＮＡ溶液について、実施例３（３）に記載の方法により粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害を行った。また、コントロールのサンプルも同様に作成した。
【０１１７】
（４）抽出したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ
マコンブのミトコンドリアＤＮＡに存在するＮＡＤ５遺伝子（アクセッション番号；ＡＰ０１１４９３）の一部分の約４９０ｂｐを増幅するプライマーを設計した。設計したプライマーを以下に示す。
【０１１８】
設計したプライマー
フォワードプライマー；５’−ＴＣＴＡＴＡＣＧＣＣＴＴＴＴＡＧＣＴＴＴ−３’（配列番号５）
リバースプライマー ；５’−ＣＴＡＡＡＣＴＴＴＣＡＡＴＡＡＧＡＣＣＡＣＧ−３’（配列番号６）
【０１１９】
続いて、本実施例（２）の各サンプルからそれぞれ５μＬずつ分取し、これらを鋳型として、配列番号５のプライマーおよび配列番号６のプライマーを用いて実施例２（５）に記載の方法によりＰＣＲを行った。その結果を図８に示す。
【０１２０】
図８に示すように、用いたすべてのサンプルで約４９０ｂｐのＤＮＡの増幅が確認された。一方、コントロールではＤＮＡの増幅は確認されなかった。この結果から、マコンブからだけでなく、ホソメコンブ、リシリコンブ、オニコンブ、ミツイシコンブ、ナガコンブ、ガッガラコンブ、チヂミコンブ、ガゴメ、トロロコンブ、スジメおよびワカメからも、ＰＣＲの鋳型として使用可能である高品質なＤＮＡを、本実施例の方法を用いて抽出できることが明らかになった。
【０１２１】
＜実施例８＞ＤＮＡ鑑別によるガゴメの識別
実施例７で得たマコンブ、ホソメコンブ、リシリコンブ、オニコンブ、ミツイシコンブ、ナガコンブ、ガッガラコンブ、チヂミコンブ、ガゴメ、トロロコンブコンブおよびスジメの約４９０ｂｐのＰＣＲ産物を、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ Ｋｉｔ（Ｑ−ＢＩＯ ｇｅｎｅ社）を用いてそれぞれ精製した後、制限酵素ＥｃｏＴ１４IおよびＰｓｔIで消化した。
【０１２２】
制限酵素反応終了後の各サンプルについて、実施例２（５）に記載の方法によりアガロースゲル電気泳動を行った。その結果を図９に示す。
【０１２３】
図９に示すように、ガゴメでは９５ｂｐ、１８６ｂｐおよび２０９ｂｐのバンドが検出された一方で、ガゴメ以外では約４９０ｂｐのバンドが検出された。すなわち、ガゴメでは約４９０ｂｐのＤＮＡがＥｃｏＴ１４IおよびＰｓｔIにより切断された一方で、ガゴメ以外では、約４９０ｂｐのＤＮＡがこれらの制限酵素により切断されなかったことが確認された。よって、このアガロースゲル電気泳動パターンの比較により、ガゴメとガゴメ以外のサンプルとは容易に識別可能であることが示された。
【０１２４】
これらの結果から、実施例６の方法により抽出したＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ増幅を行い、これを制限酵素ＥｃｏＴ１４IおよびＰｓｔIで消化して配列内の塩基多型を検出することにより、ガゴメとガゴメ以外の種（マコンブ、ホソメコンブ、リシリコンブ、オニコンブ、ミツイシコンブ、ナガコンブ、ガッガラコンブ、チヂミコンブ、トロロコンブコンブおよびスジメ）とを識別できることが確認された。
【０１２５】
＜実施例９＞ガゴメのＰＣＲ産物の泳動パターンの確認
実施例７に記載の方法により得たガゴメ２８個体の約４９０ｂｐのＰＣＲ産物を、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ Ｋｉｔ（Ｑ−ＢＩＯ ｇｅｎｅ社）を用いてそれぞれ精製した後、各サンプルにつき半量を制限酵素ＥｃｏＴ１４IおよびＰｓｔIで消化した。その後、制限酵素で消化しなかったサンプルと制限酵素で消化したサンプルとを並べて、実施例２（５）に記載の方法により、アガロースゲル電気泳動を行った。その結果を図１０に示す。
【０１２６】
図１０に示すように、２８個体のすべてにおいて、制限酵素で消化しなかった場合は約４９０ｂｐのバンドが検出され、制限酵素で消化した場合は９５ｂｐ、１８６ｂｐおよび２０９ｂｐのバンドが検出された。これらの結果から、実施例６の方法により抽出したＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ増幅を行い、これを制限酵素ＥｃｏＴ１４IおよびＰｓｔIで消化して配列内の塩基多型を検出する場合、多数のガゴメ個体において、安定した泳動パターンが得られることが確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、褐藻類の核酸抽出方法、褐藻類の種判別方法および褐藻類核酸抽出キットに関し、特に、海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素とキレート剤とを用いた褐藻類の核酸抽出方法、褐藻類の種判別方法および褐藻類核酸抽出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
コンブ、ワカメ、ハバノリ、モズク、ヒジキなどに代表されるように、日本では古くから多くの褐藻類が食されている。これら褐藻類は、フコキサンチンやアルギン酸、フコイダン、鉄、ヨウ素などの有用成分を含むことから、家畜の飼料、医薬品、化粧品、食品添加物などの原料としても利用されている。また、近年では、バイオエタノールなどのエネルギー資源の原料として、研究開発が進められている。このような褐藻類の利用に際しては、さらなる有用成分の探索や品種作出、選抜育種などが盛んに行われており、これらの場面において遺伝子工学的手法が多く用いられている。
【０００３】
また、コンブなどの食用海藻類については、品種や産地などをブランド化することにより食品としての価値が高められ、販売促進に繋げられている一方、これら品種や産地の表示偽装が問題となっている。これら品種や産地などのブランド化に伴う表示偽装の捜査において、鑑定技術の向上は大変重要な課題であり、特に、遺伝子工学的手法を用いた鑑定技術は最も有効である。昨今、このような事情を背景として、ＤＮＡ分析を用いた食品の品種および産地を鑑定する技術が開発されている（非特許文献１〜３）。
【０００４】
遺伝子工学的手法において、核酸を抽出する技術は重要である。一般的な核酸を抽出する方法として、細断した生体試料をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などで処理して核酸を露出させた後、フェノール抽出、ヨウ化ナトリウム処理、あるいは塩析法を用いてタンパク質の沈殿除去を行い、エタノールあるいはイソプロパノールを加えて核酸を沈殿させる方法が用いられている。
【０００５】
しかしながら、褐藻類の場合、アルギン酸やフコイダンなどの粘性多糖類が多量に含まれているため、エタノールあるいはイソプロパノールを加えて核酸を沈殿させる工程において、アルギン酸やフコイダンなどの粘性多糖類が核酸と共に沈殿し、得られた核酸抽出物中に多量の多糖類が混入することとなる。その結果、核酸の回収率が低下するという問題のみならず、混入した多量の多糖類が、その後の制限酵素反応やＰＣＲ反応などの工程に影響を与えるなど、いくつかの問題を生じている。
【０００６】
従来、褐藻類の核酸抽出においては、核酸の低い回収率を補うために相当量の凍結コンブを破砕処理した上でＣｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ＣＴＡＢ）を用いて核酸を抽出する方法（ＣＴＡＢ法；非特許文献４）や、セルロースを多く含む植物試料を対象とした核酸抽出キット（非特許文献５〜７）、ヒドロキシアパタイトを用いた方法（特許文献１）、アルギン酸リアーゼを併用したＣＴＡＢ法（非特許文献８）などの方法やキットが用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０００−２３６６８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】水産学シリーズ１４９ 水産物の原料・産地判別、恒星社厚生閣社、２００６年
【非特許文献２】食品鑑定技術ハンドブック、サイエンスフォーラム社、第６６−１３５頁、２００５年
【非特許文献３】新・食品分析法II、光琳社、第２３１−４１３頁、１９９６年
【非特許文献４】Ｈｕ Ｙ．Ｊ．ら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｃｏｌ．、第１３巻、第４１５−４２２頁、２００１年
【非特許文献５】Ａｎｔｏｉｎｅ Ｅ．ら、Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．、第８３巻、第７０９−７１３頁、２００３年
【非特許文献６】Ｎ．Ｙｏｔｓｕｋｕｒａら、Ｆｉｓｈ．Ｓｃｉ．、第６７巻、第８５７−８６２頁、２００１年
【非特許文献７】Ｓ．Ｕｗａｉら、Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉａ、第４５巻、第６８７−６９５頁、２００６年
【非特許文献８】神山ら、第１０回マリンバイオテクノロジー学会大会講演要旨集、第１１７頁、２００７年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、非特許文献４〜７に開示されている核酸抽出方法によれば、大量の試料の処理を必要とし、抽出操作に多くの時間と手間を要するため、簡便ないし効率的に核酸を抽出することが極めて困難であり、特に非特許文献５〜７に開示されている核酸抽出方法は、セルロースを多量に含む植物試料を対象とした方法であり、アルギン酸やフコイダンなどの粘性多糖類を多量に含む褐藻類はその対象となり難い。
【００１０】
また、特許文献１に開示されている核酸抽出方法は、硫酸基を有するムコ多糖を含む貝類や藻類をその対象としており、硫酸基を有さないアルギン酸を多量に含む褐藻類は、やはりその対象となり難い。この点、特許文献１には、褐藻類から高品質の核酸を抽出できる旨が記載されているものの、褐藻類についての核酸抽出は実際になされておらず、貝類と紅藻類の核酸抽出がなされているに過ぎない。さらに、この核酸抽出方法は、抽出した核酸を吸着させたヒドロキシアパタイトの洗浄を何度も繰り返す必要があり、多くの時間と手間を要してしまう。
【００１１】
また、非特許文献８に開示されている核酸抽出方法は、アルギン酸リアーゼを含む三種類の多糖類分解酵素液処理した後に、ＣＴＡＢ法を用いて核酸を抽出する方法であるが、アルギン酸リアーゼの由来や、他の二種類の多糖類分解酵素がどのような酵素であるのかが不明であり、さらに、実際に抽出されたヒジキのＤＮＡについて制限酵素処理がされているとの記載があるものの、係るデータの記載はなく、このＤＮＡの純度は明確ではないことから、このＤＮＡがＰＣＲ反応などに使用可能な品質であるか否かは不明である。さらに、褐藻類が有する粘性多糖類のゲル形成を抑制する手段については、何ら講じられていない。
【００１２】
本発明は、前記問題点を解決するためになされたものであって、褐藻類から簡便かつ効率的に高品質な核酸を抽出する方法、前記抽出した核酸に基づいて褐藻類の種を判別する方法、および褐藻類から核酸を抽出するキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
エゾアワビ（Ｈａｌｉｏｔｉｓ ｄｉｓｃｕｓ ｈａｎｎａｉ）の消化液中には、少なくとも二種類のアルギン酸リアーゼが発現していること、およびこれらアルギン酸リアーゼを含む多糖類分解酵素は、エゾアワビの中腸腺から抽出できることが本発明者らにより報告されている。さらに、これら二種類のアルギン酸リアーゼは、エンド型切断様式をもち三糖を生成するアルギン酸リアーゼ（ＨｄＡｌｙ）およびエキソ型切断様式をもち二糖を生成するアルギン酸リアーゼ（ＨｄＡｌｅｘ）であることが本発明者らにより報告されている（Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｅ．ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、第３３８巻、第２８４１−２８５２頁、２００３年、Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｅ．ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、第３４１巻、第１８０９−１８１９頁、２００３年）。
【００１４】
そこで本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、エゾアワビやアメフラシなどの海産軟体動物から抽出した多糖類分解酵素を用いて褐藻類に含まれる粘性多糖類を分解するとともに、キレート剤を用いて褐藻類に含まれる粘性多糖類のゲル形成を抑制することにより、高品質な核酸を簡便かつ効率的に抽出できること、あるいは多量の粘性多糖類が混入した褐藻類の核酸抽出物を得た後、エゾアワビやアメフラシなどの海産軟体動物から抽出した多糖類分解酵素を用いて混入した粘性多糖類を分解するとともに、キレート剤を用いて粘性多糖類のゲル形成を抑制することにより、高品質な核酸を簡便かつ効率的に抽出できること、さらにはこの抽出した核酸を鋳型とする核酸増幅反応を行うことで、褐藻類の種を的確に判別できることを見いだし、下記の各発明を完成した。
【００１５】
（１）褐藻類の核酸を抽出する方法であって、海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素を用いて褐藻類が有する粘性多糖類を分解する工程と、キレート剤を用いて褐藻類が有する粘性多糖類のゲル形成を抑制する工程と、タンパク質分解酵素を用いて褐藻類の核酸を抽出する工程とを有する、前記方法。
【００１６】
（２）海産軟体動物がアワビ属またはアメフラシ属に属する動物である、（１）に記載の方法。
【００１７】
（３）キレート剤がＥＤＴＡである、（１）または（２）に記載の方法。
【００１８】
（４）粘性多糖類がアルギン酸を含有する粘性多糖類である、（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
【００１９】
（５）多糖類分解酵素がアルギン酸リアーゼである、（１）から（４）のいずれかに記載の方法。
【００２０】
（６）アルギン酸リアーゼがＨｄＡｌｙおよび／またはＨｄＡｌｅｘである、（１）から（５）のいずれかに記載の方法。
【００２１】
（７）タンパク質分解酵素がＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫである、（１）から（６）のいずれかに記載の方法。
【００２２】
（８）褐藻類の種を判別する方法であって、海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素を用いて褐藻類が含有する粘性多糖類を分解する工程と、キレート剤を用いて褐藻類が有する粘性多糖類のゲル形成を抑制する工程と、タンパク質分解酵素を用いて褐藻類の核酸を抽出する工程と、
褐藻類から抽出された核酸を鋳型とする核酸増幅反応を行う工程とを有する、前記方法。
【００２３】
（９）海産軟体動物がアワビ属またはアメフラシ属に属する動物である、（８）に記載の方法。
【００２４】
（１０）キレート剤がＥＤＴＡである、（８）または（９）のいずれかに記載の方法。
【００２５】
（１１）粘性多糖類がアルギン酸を含有する粘性多糖類である、（８）から（１０）のいずれかに記載の方法。
【００２６】
（１２）多糖類分解酵素がアルギン酸リアーゼである、（８）から（１１）のいずれかに記載の方法。
【００２７】
（１３）アルギン酸リアーゼがＨｄＡｌｙおよび／またはＨｄＡｌｅｘである、（８）から（１２）のいずれかに記載の方法。
【００２８】
（１４）タンパク質分解酵素がＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫである、（８）から（１３）のいずれかに記載の方法。
【００２９】
（１５）海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素と、キレート剤と、タンパク質分解酵素とを有してなる、褐藻類核酸抽出キット。
【００３０】
（１６）海産軟体動物がアワビ属またはアメフラシ属に属する動物である、（１５）に記載の褐藻類核酸抽出キット。
【００３１】
（１７）キレート剤がＥＤＴＡである、（１５）または（１６）に記載の褐藻類核酸抽出キット。
【００３２】
（１８）多糖類分解酵素がアルギン酸リアーゼである、（１５）から（１７）のいずれかに記載の褐藻類核酸抽出キット。
【００３３】
（１９）アルギン酸リアーゼがＨｄＡｌｙおよび／またはＨｄＡｌｅｘである、（１５）から（１８）のいずれかに記載の褐藻類核酸抽出キット。
【００３４】
（２０）タンパク質分解酵素がＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫである、（１５）から（１９）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００３５】
本発明に係る褐藻類の核酸抽出方法および褐藻類核酸抽出キットによれば、褐藻類から簡便かつ効率的に高品質な核酸を抽出することができる。また、本発明に係る褐藻類の種判別方法によれば、前記抽出した核酸を用いて褐藻類の種を的確に判別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】エゾアワビ消化液から調製した粗抽出液および多糖類分解酵素液について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す図である。図中の矢印はエゾアワビアルギン酸リアーゼを示す。
【図２】生マコンブ酵素処理群、生マコンブ酵素無処理群、乾燥マコンブ酵素処理群および乾燥マコンブ酵素無処理群から抽出したそれぞれのＤＮＡを鋳型として、ミトコンドリア１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ増幅し、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を検出した図である。
【図３】ＤＮＡ抽出液により抽出した、多糖類分解酵素液により処理した群（酵素処理群）と処理しない群（酵素無処理群）のそれぞれのＤＮＡを鋳型として、ミトコンドリア１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ増幅し、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を検出した図である。
【図４】市販ＤＮＡ抽出キットにより抽出した、多糖類分解酵素液により処理した群（酵素処理群）と処理しない群（酵素無処理群）のそれぞれのＤＮＡを鋳型として、ミトコンドリア１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ増幅し、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を検出した図である。
【図５】市販ＤＮＡ抽出キットによりマコンブのＤＮＡ溶液を調製し、これに含まれる粘性多糖類をアメフラシ消化液から調製した多糖類分解酵素液により分解処理した後、このＤＮＡを鋳型としてミトコンドリア１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ増幅し、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を検出した図である。
【図６】市販ＤＮＡ抽出キットによりマコンブのＤＮＡ溶液を調製し、これに含まれる粘性多糖類を市販のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．由来アルギン酸リアーゼにより分解処理した後、このＤＮＡを鋳型として、同じプライマーセットを用いてミトコンドリア１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅を２回繰り返し行い、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を検出した図である。
【図７】様々なタンパク質分解酵素を添加したＤＮＡ抽出液を用いて抽出したマコンブのＤＮＡを鋳型として、ミトコンドリア１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ増幅し、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を検出した図である。
【図８】様々な褐藻類から抽出したＤＮＡを鋳型として、ミトコンドリアＮＡＤ５遺伝子をＰＣＲ増幅し、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を検出した図である。
【図９】様々な褐藻類から抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ増幅したミトコンドリアＮＡＤ５遺伝子の部分領域（約４９０ｂｐ）を、制限酵素ＥｃｏＴ１４IおよびＰｓｔIで消化した結果を示す図である。
【図１０】ガゴメ２８個体から抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ増幅したミトコンドリアＮＡＤ５遺伝子を、制限酵素ＥｃｏＴ１４IおよびＰｓｔIで消化した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、本発明に係る褐藻類の核酸抽出方法、褐藻類の種判別方法および褐藻類核酸抽出キットについて詳細に説明する。
【００３８】
本発明に係る褐藻類の核酸抽出方法は、褐藻類の核酸を抽出する方法であって、
（ｉ）海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素を用いて褐藻類が有する粘性多糖類を分解する工程（粘性多糖類分解工程）
（ｉｉ）キレート剤を用いて褐藻類が有する粘性多糖類のゲル形成を抑制する工程（ゲル形成抑制工程）
（ｉｉｉ）タンパク質分解酵素を用いて褐藻類の核酸を抽出する工程（核酸抽出工程）
以上（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程を有する。
【００３９】
本発明において、核酸を抽出する対象となる褐藻類は特に限定されず、例えば、マコンブ、ホソメコンブ、リシリコンブ、オニコンブ、ミツイシコンブ、ナガコンブ、ガッガラコンブ、チヂミコンブ、ガゴメ、トロロコンブ、ゴヘイコンブ、エンドウコンブ、カラフトコンブ、ネコアシコンブ、アナメ、ツルモ、キコナイツルモ、ツルアラメ、チガイソ、スジメ、ワカメ、アイヌワカメ、ハバノリ、セイヨウハバノリ、モズク、ヒジキ、シオミドロ、タワラガタシオミドロ、ナガマツモ、モツキチャソウメン、イシモズク、マツモ、ネバリモ、メワケグサ、キタイワヒゲ、エゾブクロ、ウイキョウモ、オオバハバモドキ、ガサガサハバモドキ、チシマハバモドキ、ハバモドキ、カヤモノリ、フクロノリ、クロモ、ウスカヤモ、ワタモ、ウスバオオギ、ハネグンセンクロガシラ、ツクバネクロガシラ、ミツデクロガシラ、アミジクサ、イトアミジ、フクリンアミジ、エゾヤハズ、コモングサ、ムチモ、ウルシグサ、ケウルシグサ、ヒバマタ、エゾイシゲ、フシスジモク、ウミトラノオ、ミヤベモク、アカモク、ヨレモク、ウガノモク、エゾノネジモク、スギモク、ジョロモクなどを挙げることができる。また、褐藻類に含まれる粘性多糖類は、アルギン酸、フコイダン、ラミナランが主である。
【００４０】
本発明における海産軟体動物は、多糖類分解酵素を分泌し、その抽出が可能な海産軟体動物であり、そのような海産軟体動物としては、海産腹足綱軟体動物（腹足綱；Ｇａｓｔｒｏｐｏｄａ）を挙げることができ、海産腹足綱軟体動物に属する動物としては、例えば、アワビ属、アメフラシ属、リュウテン属、Ｃｈｌｏｒｏｓｔｏｍａ属、Ｌｉｔｔｏｒｉｎａ属、Ｌａｅｍｏｄｏｎｔａ属、Ｏｍｐｈａｌｉｕｓ属などに属する動物を挙げることができる。アワビ属に属する動物としては、例えば、クロアワビ、メガイアワビ、マダカアワビ、エゾアワビ、トコブシ、ミミガイなどを、アメフラシ属に属する動物としては、例えば、アメフラシ、ジャンボアメフラシ、ジャノメアメフラシ、アプリシア・シドニーエンシス、ゾウアメフラシ、ミドリアメフラシ、アマクサアメフラシ、クロヘリアメフラシ、サガミアメフラシ、アプリシア・エクストラオルディナリアなどを、リュウテン属としては、例えば、サザエ、ニシキサザエ、カンギク、スガイなどを、Ｃｈｌｏｒｏｓｔｏｍａ属としては、例えば、クボガイ、ヘソアキクボガイ、クマノコガイなどを、Ｌｉｔｔｏｒｉｎａ属としては、例えば、タマキビガイ、コウダカタマキビ、ヨーロッパタマキビ、アフリカタマキビ、アツタマキビなどを、Ｌａｅｍｏｄｏｎｔａ属としては、例えば、ウスコミミガイ、クリイロコミミガイ、ヘソアキコミミガイなどを、Ｏｍｐｈａｌｉｕｓ属としては、例えば、コシダカガンガラ、オオコシダカガンガラ、ヒメクボガイなどを、それぞれ挙げることができる。なお、本発明において、「海産軟体動物」は、「海洋軟体動物」、「海産無脊椎動物」、「海洋無脊椎動物」のそれぞれと交換可能に用いられる。
【００４１】
本発明において、海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素は、褐藻類に含まれる粘性多糖類を分解する活性を有する酵素であり、そのような酵素としては、例えば、アルギン酸リアーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、フコイダン分解酵素、ラミナラン分解酵素などの酵素、さらにはそれらの任意の組み合わせを挙げることができるが、アルギン酸リアーゼまたは前記組み合わせにアルギン酸リアーゼを含むものが好ましい。また、多糖類分解酵素という場合には、前記酵素やそれらの任意の組み合わせを、例えばリン酸緩衝液に溶解したものなど、溶液の状態のもの（多糖類分解酵素液）が含まれる。
【００４２】
ここで、本発明における多糖類分解酵素は、既報に従い、海産軟体動物から抽出し調製することができる（Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｅ．ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、第３４１巻、第１８０９−１８１９頁、２００３年）他、例えば、海産軟体動物を低温で粉砕し、アセトンで脱脂脱水してアセトン粉末を調製した後、それを液化して有機溶剤で分別沈殿を繰り返し、透析することにより調製することができる。さらには精製してもよく、そのような精製方法としては公知の方法を用いることができ、硫安分画やイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトゲル、ゲル濾過などのカラムクロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて用いることができる。また、抽出する対象の海産軟体動物において多糖類分解酵素の遺伝子を特定した後、この遺伝子のｃＤＮＡをクローニングし、当業者が適宜選択可能なベクターに挿入して適当な細胞に組み込んで発現系を構築し、組み換え酵素として生産したものを用いてもよく、このような方法で調製した多糖類分解酵素を用いることも、本発明の一態様である。
【００４３】
この多糖類分解酵素に含まれる成分の確認は、適宜、常法に従って行うことができるが、例えば、既知の分子量の情報に基づいてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより行うことができ、あるいは、多糖類分解酵素に対する抗体を利用してウエスタンブロッティング法やイムノクロマトグラフィー法などのイムノアッセイにより行うことができる。
【００４４】
この多糖類分解酵素の酵素活性の確認もまた、適宜、常法に従って行うことができるが、例えば、多糖類分解酵素を含む溶液に基質を添加してインキュベートし、基質の分解に伴い変化する吸光度を測定することにより行うことができる。
【００４５】
また、本発明において、キレート剤は特に限定されず、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、酒石酸、フィチン酸、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）などを挙げることができるが、ＥＤＴＡやクエン酸が好ましく、ＥＤＴＡがより好ましい。
【００４６】
（ｉ）粘性多糖類分解工程において、褐藻類に作用させる多糖類分解酵素の使用量、作用温度、作用時間などは特に限定されず、多糖類分解酵素の種類、多糖類分解酵素の濃度、褐藻類の量などに応じて適宜設定することができる。
【００４７】
（ｉｉ）ゲル形成抑制工程において、褐藻類に作用させるキレート剤の使用量、作用温度、作用時間などは特に限定されず、キレート剤の種類、キレート剤の濃度、褐藻類の量などに応じて適宜設定することができる。なお、本発明において、「ゲル形成抑制」は「ゲル形成阻害」と交換可能に用いられる。
【００４８】
（ｉｉｉ）核酸抽出工程において褐藻類の核酸を抽出する方法は、適宜、常法に従って行うことができ、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、ＳＤＳ、メルカプトエタノール、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅを含む核酸抽出液に試料を浸漬し、インキュベートした後、遠心分離を行い回収した上清をフェノールクロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿処理することによって行うことができる。また、この工程において、前処理として褐藻類を細かい断片状にすることが好ましいものの、粉砕を要しないため、簡便に核酸の抽出を行うことができる。
【００４９】
（ｉｉｉ）核酸抽出工程において用いるタンパク質分解酵素は、当業者が適宜選択可能なタンパク質分解酵素を用いることができる。そのようなタンパク質分解酵素としては、酸性Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、中性Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ、塩基性Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅのいずれでもよく、例えば、スミチームＭＭＲ、スミチームＡＰ、スミチームＲＰ、スミチームＭＰ、スミチームＬＰ５０、スミチームＬＰＬ、スミチームＰ、スミチームＣＰ、スミチームＴＰ（以上、新日本化学工業社）、オリエンターゼ２０Ａ、オリエンターゼ９０Ｎ、オリエンターゼ１０ＮＬ、ヌクレイシン、オリエンターゼＯＮＳ、オリエンターゼ２２ＢＦ（以上、エイチ・ビイ・アイ社）、ウマミザイム、ニューセラーゼＦ、パパインＷ−４０、パンクレアチンＦ、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＡ−アマノＧ、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＭ−アマノ、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＮ−アマノ、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＳ−アマノ、ブロメラインＦ（以上、天野エンザイム社）、サモアーゼ、プロチンＡ、プロチンＰ、デスキンＣ（以上、大和化成社）、パパイン（メルク社）、α−キモトリプシン（和光純薬工業社）、トリプシン（ロシュ・アプライド・サイエンス社）、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（ニッポンジーン社）などを挙げることができるが、パパインやＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫが好ましく、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫがより好ましい。
【００５０】
（ｉｉｉ）核酸抽出工程においては、当業者により選択可能な公知の、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅを含む核酸抽出キットを用いることができる。そのようなキットとしては、例えば、ＩＳＯＨＡＩＲ（ニッポンジーン社）、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）、ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社）、ＭａｇＰｒｅｐ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｋｉｔ（メルク社）を挙げることができる。
【００５１】
また、（ｉｉｉ）の核酸抽出工程において抽出した核酸の品質を確認する場合は、例えば、抽出した核酸を鋳型として、常法に従ってＰＣＲ法を行い、核酸が増幅されたか否かをアガロースゲル電気泳動により確認する方法や、抽出した核酸に制限酵素を作用させて、核酸が切断されたか否かをアガロースゲル電気泳動により確認する方法などにより行うことができる。
【００５２】
なお、（ｉｉｉ）核酸抽出工程において用いる試薬は適宜、追加、置換および省略が可能である。
【００５３】
本発明に係る褐藻類の核酸抽出方法において、（ｉ）粘性多糖類分解工程、（ｉｉ）ゲル形成抑制工程および（ｉｉｉ）核酸抽出工程は順不同であり、この３つの工程を有していればよく、例えば、（ｉ）粘性多糖類分解工程と（ｉｉ）ゲル形成抑制工程とを同時に行うなどしてもよい。また、各工程を二回以上行ってもよく、例えば、（ｉｉ）ゲル形成抑制工程を行い、続いて（ｉｉｉ）核酸抽出工程を行った後、（ｉ）粘性多糖類分解工程と（ｉｉ）ゲル形成抑制工程とを同時に行うなどしてもよい。なお、タンパク質分解酵素が多糖類分解酵素を分解するおそれがあることから、（ｉｉｉ）核酸抽出工程は（ｉ）粘性多糖類分解工程および（ｉｉ）ゲル形成抑制工程の後に行うことが好ましい。
【００５４】
次に、本発明に係る褐藻類の種判別方法は、褐藻類の種を判別する方法であって、
（ｉ）海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素を用いて褐藻類が含有する粘性多糖類を分解する工程（粘性多糖類分解工程）
（ｉｉ）キレート剤を用いて褐藻類が有する粘性多糖類のゲル形成を抑制する工程（ゲル形成抑制工程）
（ｉｉｉ）タンパク質分解酵素を用いて褐藻類の核酸を抽出する工程（核酸抽出工程）
（ｉｖ）褐藻類から抽出された核酸を鋳型とする核酸増幅反応を行う工程（核酸増幅工程）
以上（ｉ）〜（ｉｖ）の工程を有する。
【００５５】
（ｉｖ）核酸増幅工程における核酸増幅反応は、適宜、常法に従って行うことができ、例えば、褐藻類の既知の塩基配列を基にプライマーを設計し、これらプライマーと公知の耐熱性ポリメラーゼとを用いてＰＣＲ法により行うことができる。
【００５６】
（ｉｖ）核酸増幅工程において、増幅した核酸に基づく褐藻類の種の判別は、褐藻類の種間で多型の存在する塩基配列を検出する方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、褐藻類の種間で多型の存在する塩基配列をＰＣＲ法で増幅した後、シークエンサーで増幅した配列を決定して種を判別する方法や、褐藻類の種間で多型の存在する部位を含む塩基配列を増幅した後、制限酵素処理を行い、多型部位を検出する方法（ＣＡＰＳ法）などを挙げることができる。
【００５７】
本発明に係る褐藻類の種判別方法において用いるタンパク質分解酵素は、本発明に係る褐藻類の核酸抽出方法（ｉｉｉ）核酸抽出工程におけるタンパク質分解酵素を用いることができる。
【００５８】
次に、本発明に係る褐藻類核酸抽出キットは、海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素と、キレート剤と、タンパク質分解酵素を有してなる。本発明に係る褐藻類核酸抽出キットは、褐藻類から簡便かつ効率的に高品質な核酸を抽出するために用いられる。
【００５９】
本発明に係る褐藻類核酸抽出キットが有するタンパク質分解酵素は、本発明に係る褐藻類の核酸抽出方法（ｉｉｉ）核酸抽出工程におけるタンパク質分解酵素を用いることができる。
【００６０】
なお、本発明に係る褐藻類核酸抽出キットには、その特徴を損なわない限り、あらゆる構成を含んでもよく、例えば、褐藻類の核酸抽出手段の実施に有用な試薬やカラムなどを含んでもよい。
【００６１】
以下、本発明に係る褐藻類の核酸抽出方法、褐藻類の種判別方法および褐藻類核酸抽出キットについて、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００６２】
＜実施例１＞多糖類分解酵素液の調製、分析および活性測定
（１）多糖類分解酵素液の調製
北海道函館市内の市場で生きたエゾアワビ５個体を購入した後、直ちに解体し、ピペットを用いて中腸腺内の消化液を採取したところ、１個体につき約０．８ｍＬ、計約４ｍＬの消化液が得られた。このうち０．０１ｍＬを粗抽出液とし、−２０℃で凍結保存した。一方、残りの消化液について、セルロースチューブ（三光純薬社）を用いて１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８）に透析した後、４℃、１０００００×ｇの条件下で３０分間遠心分離を行い、上清を回収した。続いて、定法に従って８０〜１００％（ｗ／ｗ）硫酸アンモニウム水溶液により硫安分画を行い、沈殿を回収した。得られた沈殿を１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解し、セルロースチューブ（三光純薬社）を用いて１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８）に透析し、６ｍＬの溶液を得た。この溶液を多糖類分解酵素液とし、使用するまで−２０℃で凍結保存した（Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｅ．ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、第３４１巻、第１８０９−１８１９頁、２００３年）。
【００６３】
（２）多糖類分解酵素液に含まれるタンパク質の分析
本実施例（１）で調製した粗抽出液０．０１ｍＬおよび多糖類分解酵素液０．０１ｍＬについて、Ｐｏｒｚｉｏ ＆ Ｐｅａｒｓｏｎの方法（ＰＯＲＺＩＯ，Ｍ．Ａ．，ＰＥＡＲＳＯＮ，Ａ．Ｍ．、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ、第３８４巻、第２３５−２４１頁、１９７５年）に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。タンパク質分子量マーカーは、Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ Ｍａｒｋｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いた。泳動後のゲルは、０．１％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ；ＣＢＢ）、５０％（ｖ／ｖ）メタノールおよび１０％（ｖ／ｖ） 酢酸を含む水溶液で染色し、７％（ｖ／ｖ）酢酸および５％（ｖ／ｖ）メタノールを含む水溶液で脱色した。その結果を図１に示す。
【００６４】
図１に示すように、本実施例（１）で調製した多糖類分解酵素液においては、約２８ｋＤａのバンドが高い強度で確認された。一方、粗抽出液においては、約２７ｋＤａないし約６６ｋＤａの範囲で様々な分子量のバンドが、いずれも中程度の強度で検出された。
【００６５】
続いて、泳動後のゲルを濾紙の上に置き、セロファンを被せて乾燥させた。乾燥させたゲルの画像について、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｖｅｒ．１．４２；Ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／；アメリカ国立衛生研究所）を用いてデンシトメトリーを行い、多糖類分解酵素液に含まれるタンパク質の総質量および検出された約２８ｋＤａのバンドに相当するタンパク質の質量を計測し、この約２８ｋＤａのバンドに相当するタンパク質の濃度（ｗ／ｗ）を算出した。
【００６６】
その結果、この約２８ｋＤａのバンドに相当するタンパク質の濃度は７０％（ｗ／ｗ）であることが明らかになった。
【００６７】
本発明者らは以前に、エゾアワビの消化液中には、三糖を生成するエンド型アルギン酸リアーゼＨｄＡｌｙ（配列番号１；アクセッション番号；ＡＢ１１００９４）および二糖を生成するエキソ型アルギン酸リアーゼＨｄＡｌｅｘ（配列番号２；アクセッション番号；ＢＡＥ８１７８７）の少なくとも２種類が含まれることを報告している。また、ＨｄＡｌｙは約２８ｋＤａの位置に泳動され、ＨｄＡｌｅｘは２８ｋＤａより数ｋＤａ大きい位置に泳動されること、およびエゾアワビにおける含有量はＨｄＡｌｙがＨｄＡｌｅｘに比べてはるかに大きいことを報告している（Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｅ．ら、 Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、第３３８巻、第２８４１−２８５２頁、２００３年，Ｓｕｚｕｋｉ Ｈら、Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．、第３４１巻、第１８０９−１８１９頁、２００３年）。これらのことから、図１に示す、多糖類分解酵素液における約２８ｋＤａのバンドはＨｄＡｌｙおよびＨｄＡｌｅｘであるといえる。よって、本実施例（１）で調製した多糖類分解酵素液にはエゾアワビ由来アルギン酸リアーゼＨｄＡｌｙおよびＨｄＡｌｅｘが約７０％（ｗ／ｗ）含まれることが明らかになった。これに対し、粗抽出液におけるエゾアワビ由来アルギン酸リアーゼＨｄＡｌｙおよびＨｄＡｌｅｘの濃度は７０％には満たず、他の様々な分子量を有するタンパク質が多く含まれることが明らかになった。これらの結果から、本実施例（１）の処理工程によりアルギン酸リアーゼの濃度が高められたことが明らかになった。
【００６８】
（３）多糖類分解酵素液のアルギン酸分解活性の測定
本実施例（１）で調製した多糖類分解酵素液０．０５ｍＬに、リン酸ナトリウム（ｐＨ８）およびアルギン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ社）をそれぞれ１０ｍｍｏｌ／Ｌおよび０．２％（ｗ／ｖ）となるように加え、３０℃でインキュベートした後、２３５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００６９】
アルギン酸ナトリウムの分解に伴い、構成する単糖の第４位の炭素（Ｃ４）と第５位の炭素（Ｃ５）との間に二重結合が生じ、２３５ｎｍにおける吸光度が上昇することから、前記条件下、２３５ｎｍにおける吸光度を１分間に０．０１上昇させる活性（アルギン酸分解活性）を１Ｕと定義し、測定した吸光度に基づいてアルギン酸分解活性を算出した。
【００７０】
その結果、本実施例（１）で調製した多糖類分解酵素液のアルギン酸分解活性は、３０℃で１２９０Ｕ／ｍＬであった。
【００７１】
＜実施例２＞粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害後のＤＮＡ抽出
（１）マコンブの粘性多糖類の分解
北海道函館市沿岸で採取した生マコンブおよび同じ海域で採取した後、天日で乾燥させた乾燥マコンブからそれぞれ約０．０２ｇの組織片をブレードで切り取り、各組織片をさらに細切りにした。続いてこれらを約０．０１ｇずつに分け、生マコンブ酵素処理群、生マコンブ酵素無処理群、乾燥マコンブ酵素処理群および乾燥マコンブ酵素無処理群の４群を設定した。実施例１（１）で調製した多糖類分解酵素液をリン酸緩衝液（ｐＨ８）で１００Ｕ／ｍＬに希釈した後、生マコンブ酵素処理群および乾燥マコンブ酵素処理群にそれぞれ１ｍＬずつ加え、１７℃で４時間、時々振盪しながらインキュベートした。生マコンブ酵素無処理群および乾燥マコンブ酵素無処理群には、リン酸緩衝液（ｐＨ８）を１ｍＬ加えて、同様にインキュベートした。
【００７２】
（２）マコンブの粘性多糖類のゲル形成阻害
本実施例（１）の生マコンブ酵素処理群、生マコンブ酵素無処理群、乾燥マコンブ酵素処理群および乾燥マコンブ酵素無処理群にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）をそれぞれ１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、１７℃で１時間、インキュベートした。
【００７３】
（３）ＤＮＡ抽出液によるマコンブからのＤＮＡ抽出
［３−１］ＤＮＡ抽出液の調製
まず、滅菌水を溶媒として、以下の組成のＤＮＡ抽出液を調製した。
【００７４】
ＤＮＡ抽出液の調製
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（ニッポンジーン社） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＤＴＡ（ニッポンジーン社） ２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ（ニッポンジーン社） １００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＳＤＳ（ニッポンジーン社） １％（ｗ／ｗ）
メルカプトエタノール（ニッポンジーン社） ２％（ｗ／ｗ）
ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（ニッポンジーン社） ０．５ｍｇ／ｍＬ
【００７５】
［３−２］ＤＮＡ抽出液によるマコンブからのＤＮＡ抽出
本実施例（２）の生マコンブ酵素処理群、生マコンブ酵素無処理群、乾燥マコンブ酵素処理群および乾燥マコンブ酵素無処理群のそれぞれを２００μＬずつ分取し、本実施例［３−１］で調製したＤＮＡ抽出液のうち８００μＬずつをそれぞれに加え、５５℃で３０分間インキュベートした。その後、室温、１００００×ｇの条件下で１０分間遠心分離を行い、上清を回収した。続いて、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）の等量をそれぞれに添加し、５分間転倒混和した。室温、１１０００×ｇの条件下で１分間遠心分離を行った後、水層を回収し、定法に従いエタノール沈殿を行って沈殿を回収した。これを真空乾燥後、それぞれ２０μＬの滅菌水に溶解し、ＤＮＡ溶液とした。
【００７６】
（４）市販ＤＮＡ抽出キットによるマコンブからのＤＮＡ抽出
本実施例（２）の生マコンブ酵素処理群、生マコンブ酵素無処理群、乾燥マコンブ酵素処理群および乾燥マコンブ酵素無処理群のそれぞれを５００μＬずつ分取し、市販ＤＮＡ抽出キットのＩＳＯＨＡＩＲ（ニッポンジーン社）を用いて、添付のプロトコールに従いＤＮＡの抽出を行った後、それぞれ２０μＬの添付のトリスＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液（ｐＨ８）に溶解し、ＤＮＡ溶液とした。
【００７７】
（５）抽出したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ
マコンブのミトコンドリアＤＮＡに存在する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（アクセッション番号；ＡＰ０１１４９３）の一部分の約８７０ｂｐを増幅するプライマーを設計した。設計したプライマーを以下に示す。
【００７８】
設計したプライマー
フォワードプライマー；５’−ＧＧＧＴＴＣＡＡＡＴＣＣＣＡＣＣＴＴＡＴＣＣ−３’（配列番号３）
リバースプライマー ；５’−ＡＣＡＡＣＣＴＡＡＧＣＣＴＴＣＡＡＴＣＣＣ−３’（配列番号４）
【００７９】
続いて、本実施例（３）［３−２］で抽出した各群のＤＮＡ溶液および本実施例（４）で抽出した各群のＤＮＡ溶液からそれぞれ１μＬずつ分取し、これらを鋳型として、配列番号３のプライマー、配列番号４のプライマーおよびＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社）を用いて、添付のプロトコールに従いＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は９４℃で３０秒、５５℃で２秒、７２℃で３０秒を１サイクルとして、合計３５〜４０サイクル行った。
【００８０】
その後、ＰＣＲ反応液からそれぞれ１０μＬずつ分取し、１倍濃度のトリス酢酸ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）緩衝液中で１．５％（ｗ／ｗ）のアガロースゲルを用いてアガロースゲル電気泳動を行った。泳動後のゲルはエチジウムブロマイド溶液に浸漬し、紫外線を照射してＤＮＡを検出した。本実施例（３）［３−２］で抽出した各群の結果を図２に示す。
【００８１】
図２に示すように、本実施例（３）［３−２］で抽出した生マコンブ酵素処理群および乾燥マコンブ酵素処理群の場合には、約８７０ｂｐのＤＮＡの増幅が確認された。一方、生マコンブ酵素無処理群および乾燥マコンブ酵素無処理群の場合には、約８７０ｂｐのＤＮＡは増幅されなかった。また、本実施例（４）で抽出した各群の場合も、これと同様の結果であった。すなわち、本実施例（４）で抽出した生マコンブ酵素処理群および乾燥マコンブ酵素処理群の場合には、約８７０ｂｐのＤＮＡの増幅が確認され、生マコンブ酵素無処理群および乾燥マコンブ酵素無処理群の場合には、約８７０ｂｐのＤＮＡは増幅されなかった。
【００８２】
以上の結果から、粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害を行った後にＤＮＡを抽出することにより、生マコンブからだけでなく乾燥マコンブからも、ＰＣＲの鋳型として使用可能である高品質なＤＮＡを抽出できることが確認された。また、ＤＮＡの抽出には、本実施例（３）で調製したＤＮＡ抽出液のみならず、市販のＤＮＡ抽出キットも使用可能であることが確認された。
【００８３】
＜実施例３＞ゲル形成阻害を行った後の、ＤＮＡ抽出後の粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害
（１）マコンブの粘性多糖類のゲル形成阻害
北海道函館市沿岸で採取した後、天日で乾燥させた乾燥マコンブ１２個体からそれぞれ約０．０１ｇの組織片をブレードで切り取り、各組織片をさらに細切りにして１．５ｍＬチューブに入れ、サンプルとした（サンプルＮｏ．１〜Ｎｏ．１２）。続いて、１２５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ（ｐＨ８）および１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む水溶液０．５ｍＬをそれぞれに添加し、３０分間浸漬した。
【００８４】
（２）マコンブからのＤＮＡ抽出
［２−１］ＤＮＡ抽出液によるマコンブからのＤＮＡ抽出
本実施例（１）のサンプルＮｏ．１〜Ｎｏ．８について、室温、１００００×ｇの条件下で１分間遠心分離を行って上清を除き、実施例２（３）［３−１］に記載の方法により調製したＤＮＡ抽出液４５０μＬずつをそれぞれに加えて、５５℃で３０分間インキュベートした。その後、室温、１００００×ｇの条件下で１０分間遠心分離を行い、上清を回収した。続いて、等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）をそれぞれに添加し、５分間転倒混和した。室温、１１０００×ｇの条件下で１分間遠心分離を行った後、水層を約１００μＬずつ各サンプルにつき２本の１．５ｍＬチューブに分注した。Ｎｏ．１から得られた２本のサンプルをそれぞれＮｏ．１ａおよびＮｏ．１ｂ、Ｎｏ．２から得られた２本のサンプルをそれぞれＮｏ．２ａおよびＮｏ．２ｂとし、以下、Ｎｏ．８ａおよびＮｏ．８ｂまでの計１６本のサンプルをそれぞれ調製した。
【００８５】
［２−２］市販ＤＮＡ抽出キットによるマコンブからのＤＮＡ抽出
本実施例（１）のサンプルＮｏ．９〜Ｎｏ．１２について、市販ＤＮＡ抽出キットのＩＳＯＨＡＩＲ（ニッポンジーン社）を用いて添付のプロトコールに従いＤＮＡの抽出を行い、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール処理を行った後、室温、１１０００×ｇの条件下で１分間遠心分離を行って得られた水層を、約１００μＬずつ各サンプルにつき２本の１．５ｍＬチューブに分注した。Ｎｏ．９から得られた２本のサンプルをそれぞれＮｏ．９ａおよびＮｏ．９ｂ、Ｎｏ．１０から得られた２本のサンプルをそれぞれＮｏ．１０ａおよびＮｏ．１０ｂとし、以下、Ｎｏ．１２ａおよびＮｏ．１２ｂまでの計８本のサンプルをそれぞれ調製した。
【００８６】
（３）マコンブの粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害
本実施例（１）および本実施例（２）で調製したａ標識のサンプルＮｏ．１ａ〜Ｎｏ．１２ａの１２本を酵素処理群とし、本実施例（１）および本実施例（２）で調製したｂ標識のサンプルＮｏ．１ｂ〜Ｎｏ．１２ｂの１２本を酵素無処理群とした。実施例１（１）で調製した多糖類分解酵素液１０Ｕを１２５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ（ｐＨ８）で１００μＬにメスアップして酵素処理群のサンプルＮｏ．１ａ〜Ｎｏ．１２ａにそれぞれ添加した。また、コントロールとして多糖類分解酵素液１０Ｕを１２５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ（ｐＨ８）で２００μＬにメスアップしたサンプルを作成した。酵素無処理群のサンプルＮｏ．１ｂ〜Ｎｏ．１２ｂには１２５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ（ｐＨ８）１００μＬをそれぞれ添加した。その後、すべてのサンプルを３０℃で４時間インキュベートし、さらに９０℃で１０分間インキュベートした。続いて、定法に従いエタノール沈殿を行って得られた沈殿を風乾した後、１００μＬのＴＥ緩衝液｛１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ｝に溶解し、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＳＰＩＮ ＫＩＴ（Ｑ−ＢＩＯ ｇｅｎｅ社）を用いて精製した。
【００８７】
（４）抽出したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ
本実施例（３）の各サンプルからそれぞれ５μＬずつ分取し、これらを鋳型として、実施例２（５）に記載の方法によりＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動を行った。サンプルＮｏ．１ａ〜Ｎｏ．８ａおよびサンプルＮｏ．１ｂ〜Ｎｏ．８ｂについての結果を図３に、サンプルＮｏ．９ａ〜Ｎｏ．１２ａおよびサンプルＮｏ．９ｂ〜Ｎｏ．１２ｂについての結果を図４に示す。
【００８８】
図３に示すように、ＤＮＡ抽出液により抽出したＤＮＡを鋳型とした場合、酵素処理群では、サンプルＮｏ．１ａ〜Ｎｏ．８ａのすべてにおいて約８７０ｂｐのＤＮＡの増幅が確認され、増幅性の違いもほとんど見られなかった。一方、酵素無処理群では、サンプルＮｏ．５ｂ、Ｎｏ．６ｂおよびＮｏ．７ｂにおいて約８７０ｂｐのＤＮＡの増幅が確認されず、サンプル間でのＤＮＡ増幅性にも差が見られた。
【００８９】
また、図４に示すように、市販ＤＮＡ抽出キットにより抽出したＤＮＡを鋳型とした場合、酵素処理群では、サンプルＮｏ．９ａ〜Ｎｏ．１２ａのすべてにおいて約８７０ｂｐのＤＮＡの増幅が確認され、増幅性の違いもほとんど見られなかった。一方、酵素無処理群では、サンプルＮｏ．９ｂおよびＮｏ．１０ｂにおいて約８７０ｂｐのＤＮＡの増幅が確認できず、サンプル間でのＤＮＡ増幅性に差が見られた。なお、コントロールでは、ＤＮＡの増幅が確認されなかった。
【００９０】
以上の結果から、マコンブの粘性多糖類のゲル形成阻害を行い、続いてＤＮＡを抽出し、多糖類分解酵素液による処理およびゲル形成阻害を行うことにより、ＰＣＲの鋳型として使用可能である高品質なＤＮＡを、乾燥マコンブから安定的に抽出できることが確認された。また、ＤＮＡの抽出には、実施例２（３）［３−１］に記載の方法により調製したＤＮＡ抽出液のみならず、市販のＤＮＡ抽出キットも使用可能であることが確認された。
【００９１】
＜実施例４＞多糖類分解酵素の検討
（１）アメフラシ由来多糖類分解酵素液の調製
北海道函館市沿岸で生きたアメフラシ２０個体を採取した後、直ちに解体し、ピペットを用いて中腸腺内の消化液を採取したところ、１個体につき約０．５ｍＬ、計約１０ｍＬの消化液が得られた。これを、実施例１（１）に記載の方法により精製し、１２ｍＬの溶液を得た。この溶液をアメフラシ由来多糖類分解酵素液とし、使用するまで−２０℃で凍結保存した。
【００９２】
（２）マコンブの粘性多糖類のゲル形成阻害
北海道函館市沿岸で採取した後、天日で乾燥させた乾燥マコンブ９個体をサンプル（サンプルＮｏ．１３〜Ｎｏ．２１）として、実施例３（１）に記載の方法により、ゲル形成阻害を行った。
【００９３】
（３）市販ＤＮＡ抽出キットによるマコンブからのＤＮＡ抽出
本実施例（２）のサンプルＮｏ．１３〜Ｎｏ．２１について、実施例３［２−２］に記載の方法によりＤＮＡ抽出を行い、ａ標識のサンプルＮｏ．１３ａ〜Ｎｏ．２１ａおよびｂ標識のサンプルＮｏ．１３ｂ〜Ｎｏ．２１ｂの、計１８本のサンプルを調製した。
【００９４】
（４）アメフラシ由来多糖類分解酵素によるマコンブの粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害
本実施例（３）で調製したａ標識のサンプルＮｏ．１３ａ〜Ｎｏ．１６ａの４本について、実施例１（１）の多糖類分解酵素液を本実施例（１）のアメフラシ由来多糖類分解酵素液に代えて、実施例３（３）に記載の方法によりマコンブの粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害を行った。続いて、実施例３（４）に記載の方法により、ａ標識のサンプルＮｏ．１３ａ〜Ｎｏ．１６ａを鋳型としたＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動を行った。その結果を図５に示す。
【００９５】
図５に示すように、サンプルＮｏ．１４ａ、Ｎｏ．１５ａおよびＮｏ．１６ａにおいて約８７０ｂｐのＤＮＡの増幅が確認された。これらの結果から、アメフラシ由来多糖類分解酵素液によりマコンブの粘性多糖類を分解した場合は、ＰＣＲの鋳型として使用可能な高品質なＤＮＡを乾燥マコンブから抽出できることが確認された。
【００９６】
（５）Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．由来アルギン酸リアーゼまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来ペクチナーゼによるマコンブの粘性多糖類の分解
本実施例（３）で調製したａ標識のサンプルＮｏ．１７ａ〜Ｎｏ．２１ａの５本については、実施例１（１）で調製した多糖類分解酵素液を市販のアルギン酸分解酵素（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．由来アルギン酸リアーゼ；ＳＩＧＭＡ社）に代えて、実施例３（３）に記載の方法によりマコンブの粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害を行った。本実施例（３）で調製したｂ標識のサンプルＮｏ．１７ｂ〜Ｎｏ．２１ｂの５本については、実施例１（１）で調製した多糖類分解酵素液を市販の多糖類分解酵素（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来ペクチナーゼ；ＳＩＧＭＡ社）に代えて、実施例３（３）に記載の方法によりマコンブの粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害を行った。
【００９７】
続いて、実施例３（４）に記載の方法により、サンプルＮｏ．１７ａ〜Ｎｏ．２１ａおよびサンプルＮｏ．１７ｂ〜Ｎｏ．２１ｂを鋳型としたＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動を行った。Ｎｏ．１７ａ〜Ｎｏ．２１ａおよびＮｏ．１７ｂ〜Ｎｏ．２１ｂのすべてのサンプルにおいて、１回のＰＣＲではＤＮＡの増幅が全く確認されなかったため、１回目のＰＣＲ産物を鋳型とし、同じプライマーを用いて２回目のＰＣＲを行った。ａ標識のサンプルＮｏ．１７ａ〜Ｎｏ．２１ａにおける２回目のＰＣＲの結果を図６に示す。
【００９８】
図６に示すように、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．由来アルギン酸リアーゼにより粘性多糖類を分解した場合、２回目のＰＣＲで、サンプルＮｏ．１７ａ、Ｎｏ．１８ａおよびＮｏ．２０ａにおいて約８７０ｂｐのＤＮＡの増幅がわずかに確認されたが、サンプルＮｏ．１９ａおよびＮｏ．２１ａでは、ＤＮＡの増幅は確認されなかった。また、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来ペクチナーゼにより粘性多糖類を分解した場合は、２回目のＰＣＲでも、サンプルＮｏ．１７ｂ〜Ｎｏ．２１ｂのすべてにおいてＤＮＡの増幅は確認されなかった。
【００９９】
以上の結果と実施例３の結果との比較から、市販のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．由来アルギン酸リアーゼまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来ペクチナーゼによりマコンブの粘性多糖類を分解した場合は、実施例１（１）で調製した多糖類分解酵素液により粘性多糖類を分解した場合と比較して、抽出されたＤＮＡが少量ないし低品質であることが明らかになった。
【０１００】
＜実施例５＞キレート剤の検討
（１）マコンブの粘性多糖類のゲル形成阻害
北海道函館市沿岸で採取した後、天日で乾燥させた乾燥マコンブ５個体をサンプルＮｏ．２２〜Ｎｏ．２６とし、１個体につき約０．０４ｇずつ組織片をブレードで切り取り、各組織片をさらに細切りにした後、それぞれを約０．０１ｇずつに分けた。Ｎｏ．２２から得られた４本のサンプルをそれぞれＮｏ．２２ａ、Ｎｏ．２２ｂ、Ｎｏ．２２ｃおよびＮｏ．２２ｄ、Ｎｏ．２３から得られた４本のサンプルをそれぞれＮｏ．２３ａ、Ｎｏ．２３ｂ、Ｎｏ，２３ｃおよびＮｏ．２３ｄとし、以下、Ｎｏ．２６ａ、Ｎｏ．２６ｂ、Ｎｏ．２６ｃおよびＮｏ．２６ｄまでの計２０本のサンプルをそれぞれ調製した。
【０１０１】
続いて、調製したａ標識のサンプルＮｏ．２２ａ〜Ｎｏ．２６ａの５本については、１２５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ（ｐＨ８）を１０ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸に代えて、調製したｂ標識のサンプルＮｏ．２２ｂ〜Ｎｏ．２６ｂの５本については、前記ＥＤＴＡを１０ｍｍｏｌ／Ｌのグリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）に代えて、調製したｃ標識のサンプルＮｏ．２２ｃ〜Ｎｏ．２６ｃの５本については、前記ＥＤＴＡを１０ｍｍｏｌ／Ｌの酒石酸に代えて、調製したｄ標識のサンプルＮｏ．２２ｄ〜Ｎｏ．２６ｄの５本については、前記ＥＤＴＡを１０ｍｍｏｌ／Ｌのフィチン酸に代えて、それぞれ、実施例３（１）に記載の方法によりマコンブの粘性多糖類のゲル形成阻害を行った。
【０１０２】
（２）市販ＤＮＡ抽出キットによるマコンブからのＤＮＡ抽出
本実施例（１）のａ標識のサンプルＮｏ．２２ａ〜Ｎｏ．２６ａ、ｂ標識のサンプルＮｏ．２２ｂ〜Ｎｏ．２６ｂ、ｃ標識のサンプルＮｏ．２２ｃ〜Ｎｏ．２６ｃおよびｄ標識のサンプルＮｏ．２２ｄ〜Ｎｏ．２６ｄの全てについて、実施例３（２）［２−２］に記載の方法によりＤＮＡ抽出を行い、各サンプルにつき２本のＤＮＡ溶液を調製した。そのうち各サンプルにつき１本のＤＮＡ溶液を以下の処理に供した。
【０１０３】
（３）マコンブの粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害
本実施例（２）で調製したａ標識のサンプルＮｏ．２２ａ〜Ｎｏ．２６の５本については、１２５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ（ｐＨ８）を１０ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸に代えて、本実施例（２）で調製したｂ標識のサンプルＮｏ．２２ｂ〜Ｎｏ．２６ｂの５本については、前記ＥＤＴＡを１０ｍｍｏｌ／Ｌのグリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）に代えて、調製したｃ標識のサンプルＮｏ．２２ｃ〜Ｎｏ．２６ｃの５本については、前記ＥＤＴＡを１０ｍｍｏｌ／Ｌの酒石酸に代えて、調製したｄ標識のサンプルＮｏ．２２ｄ〜Ｎｏ．２６ｄの５本については、前記ＥＤＴＡを１０ｍｍｏｌ／Ｌのフィチン酸に代えて、それぞれ、実施例３（３）に記載の方法によりマコンブの粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害を行った。
【０１０４】
続いて、実施例３（４）に記載の方法により、ａ標識のサンプルＮｏ．２２ａ〜Ｎｏ．２６ａ、ｂ標識のサンプルＮｏ．２２ｂ〜Ｎｏ．２６ｂ、ｃ標識のサンプルＮｏ．２２ｃ〜Ｎｏ．２６ｃおよびｄ標識のサンプルＮｏ．２２ｄ〜Ｎｏ．２６ｄを鋳型としたＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動をそれぞれ行った。
【０１０５】
その結果、クエン酸を用いたサンプルＮｏ．２２ａ〜Ｎｏ．２６ａでは、そのうちの１つのサンプルで約８７０ｂｐのＤＮＡの増幅が確認されたが、残りの４つのサンプルではＤＮＡの増幅が確認されなかった。ＥＧＴＡを用いたサンプルＮｏ．２２ｂ〜Ｎｏ．２６ｂ、酒石酸を用いたサンプルＮｏ．２２ｃ〜Ｎｏ．２６ｃおよびフィチン酸を用いたサンプルＮｏ．２２ｄ〜Ｎｏ．２６ｄではいずれもＤＮＡの増幅が確認されなかった。
【０１０６】
以上の結果と実施例３の結果との比較から、クエン酸、ＥＧＴＡ、酒石酸またはフィチン酸によりマコンブの粘性多糖類のゲル形成阻害を行った場合は、ＥＤＴＡにより粘性多糖類のゲル形成阻害を行った場合と比較して、抽出されたＤＮＡが少量ないし低品質であることが明らかになった。また、キレート剤を添加しなかったサンプルではＤＮＡの増幅が確認されなかったことから、高品質な核酸の抽出には、ＥＤＴＡなどのキレート剤が必要であることが明らかになった。これは、褐藻類の粘性多糖類に主に含まれるアルギン酸は海水中のカルシウム、マグネシウムおよびストロンチウムなどの２価金属イオンを吸着しゲル化することから、多糖類分解酵素による分解だけでは除去することができず、金属キレート剤によりこのゲル形成を阻害することで分解除去が可能となるためと発明者らは考えている。
【０１０７】
＜実施例６＞タンパク質分解酵素の検討
（１）マコンブの粘性多糖類の分解
北海道函館市沿岸で採取した後、天日で乾燥させた乾燥マコンブから約０．０５ｇの組織片をブレードで切り取り、これをさらに細切りにした後、約０．０１ｇずつに分け、サンプルとした（サンプルＮｏ．２７〜Ｎｏ．３２）。これら５つのサンプルについて、実施例２（１）に記載の方法により、マコンブの粘性多糖類の分解を行った。
【０１０８】
（２）マコンブの粘性多糖類のゲル形成阻害
続いて、本実施例（１）で調製したサンプルＮｏ．２７〜Ｎｏ．３１について、実施例２（２）に記載の方法によりゲル形成阻害を行った。
【０１０９】
（３）ＤＮＡ抽出液によるマコンブからのＤＮＡ抽出
［３−１］ＤＮＡ抽出液の調製
実施例２（３）［３−１］に記載のＤＮＡ抽出液の組成において、以下の１．〜４．の点で異なるＤＮＡ抽出液をそれぞれ調製した。
１．ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを添加しないＤＮＡ抽出液（タンパク質分解酵素無添加ＤＮＡ抽出液）
２．ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫをパパイン（製品名パパイン；メルク社）に代えたＤＮＡ抽出液（パパイン−ＤＮＡ抽出液）
３．ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫをキモトリプシン（製品名α−キモトリプシン；和光純薬工業社）に代えたＤＮＡ抽出液（キモトリプシン−ＤＮＡ抽出液）
４．ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫをトリプシン（製品名トリプシン；ロシュ・アプライド・サイエンス社）に代えたＤＮＡ抽出液（トリプシン−ＤＮＡ抽出液）
【０１１０】
［３−２］各ＤＮＡ抽出液によるマコンブからのＤＮＡ抽出
本実施例（２）で調製したサンプルＮｏ．２７については、実施例２（３）［３−１］で調製したＤＮＡ抽出液を本実施例（３）［３−１］で調製したタンパク質分解酵素無添加ＤＮＡ抽出液に代えて、本実施例（２）で調製したサンプルＮｏ．２８については、実施例２［３−１］で調製したＤＮＡ抽出液を本実施例（３）［３−１］で調製したパパイン−ＤＮＡ抽出液に代えて、本実施例（２）で調製したサンプルＮｏ．２９については、実施例２（３）［３−１］で調製したＤＮＡ抽出液を本実施例（３）［３−１］で調製したキモトリプシン−ＤＮＡ抽出液に代えて、本実施例（２）で調製したサンプルＮｏ．３０については、実施例２（３）［３−１］で調製したＤＮＡ抽出液を本実施例（３）［３−１］で調製したトリプシン−ＤＮＡ抽出液に代えて、本実施例（２）で調製したサンプルＮｏ．３１については、実施例２（３）［３−１］で調製したＤＮＡ抽出液を用いて、それぞれ、実施例２（３）［３−２］に記載の方法によりマコンブからのＤＮＡ抽出を行った。
【０１１１】
続いて、実施例２（５）に記載の方法により、サンプルＮｏ．２７〜Ｎｏ．３１を鋳型としたＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動を行った。その結果を図７に示す。
【０１１２】
図７に示すように、実施例２（３）［３−１］で調製した、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを含むＤＮＡ抽出液を用いたサンプルＮｏ．３１では、約８７０ｂｐのＤＮＡの増幅が明確に確認された。また、パパイン−ＤＮＡ抽出液を用いたサンプルＮｏ．２８においても、約８７０ｂｐのＤＮＡが少量増幅したことが確認された。
【０１１３】
以上の結果から、ＤＮＡ抽出液にタンパク質分解酵素を添加することにより、ＰＣＲの鋳型として使用可能である高品質なＤＮＡをマコンブから抽出できることが明らかになった。
【０１１４】
＜実施例７＞様々なコンブ類からのＤＮＡ抽出
（１）様々な褐藻類の粘性多糖類のゲル形成阻害
コンブ属８種（マコンブ、ホソメコンブ、リシリコンブ、オニコンブ、ミツイシコンブ、ナガコンブ、ガッガラコンブ、チヂミコンブ）、トロロコンブ属２種（ガゴメ、トロロコンブ）、スジメ属１種（スジメ）およびワカメを北海道沿岸で採取した後、天日で乾燥させた。その後、それぞれ乾燥重量で約０．０１ｇの組織片をブレードで切り取り、実施例３（１）に記載の方法により粘性多糖類のゲル形成阻害を行った。
【０１１５】
（２）様々な褐藻類からのＤＮＡ抽出
本実施例（１）の全てのサンプルについて、実施例３（２）［２−１］に記載の方法によりＤＮＡを抽出し、各サンプルにつき２本ずつ、ＤＮＡ溶液を調製した。そのうち、各サンプルにつき１本ずつ、ＤＮＡ溶液を以下の処理に供した。
【０１１６】
（３）様々な褐藻類の粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害
本実施例（２）で調製した各サンプルのＤＮＡ溶液について、実施例３（３）に記載の方法により粘性多糖類の分解およびゲル形成阻害を行った。また、コントロールのサンプルも同様に作成した。
【０１１７】
（４）抽出したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ
マコンブのミトコンドリアＤＮＡに存在するＮＡＤ５遺伝子（アクセッション番号；ＡＰ０１１４９３）の一部分の約４９０ｂｐを増幅するプライマーを設計した。設計したプライマーを以下に示す。
【０１１８】
設計したプライマー
フォワードプライマー；５’−ＴＣＴＡＴＡＣＧＣＣＴＴＴＴＡＧＣＴＴＴ−３’（配列番号５）
リバースプライマー ；５’−ＣＴＡＡＡＣＴＴＴＣＡＡＴＡＡＧＡＣＣＡＣＧ−３’（配列番号６）
【０１１９】
続いて、本実施例（２）の各サンプルからそれぞれ５μＬずつ分取し、これらを鋳型として、配列番号５のプライマーおよび配列番号６のプライマーを用いて実施例２（５）に記載の方法によりＰＣＲを行った。その結果を図８に示す。
【０１２０】
図８に示すように、用いたすべてのサンプルで約４９０ｂｐのＤＮＡの増幅が確認された。一方、コントロールではＤＮＡの増幅は確認されなかった。この結果から、マコンブからだけでなく、ホソメコンブ、リシリコンブ、オニコンブ、ミツイシコンブ、ナガコンブ、ガッガラコンブ、チヂミコンブ、ガゴメ、トロロコンブ、スジメおよびワカメからも、ＰＣＲの鋳型として使用可能である高品質なＤＮＡを、本実施例の方法を用いて抽出できることが明らかになった。
【０１２１】
＜実施例８＞ＤＮＡ鑑別によるガゴメの識別
実施例７で得たマコンブ、ホソメコンブ、リシリコンブ、オニコンブ、ミツイシコンブ、ナガコンブ、ガッガラコンブ、チヂミコンブ、ガゴメ、トロロコンブコンブおよびスジメの約４９０ｂｐのＰＣＲ産物を、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ Ｋｉｔ（Ｑ−ＢＩＯ ｇｅｎｅ社）を用いてそれぞれ精製した後、制限酵素ＥｃｏＴ１４IおよびＰｓｔIで消化した。
【０１２２】
制限酵素反応終了後の各サンプルについて、実施例２（５）に記載の方法によりアガロースゲル電気泳動を行った。その結果を図９に示す。
【０１２３】
図９に示すように、ガゴメでは９５ｂｐ、１８６ｂｐおよび２０９ｂｐのバンドが検出された一方で、ガゴメ以外では約４９０ｂｐのバンドが検出された。すなわち、ガゴメでは約４９０ｂｐのＤＮＡがＥｃｏＴ１４IおよびＰｓｔIにより切断された一方で、ガゴメ以外では、約４９０ｂｐのＤＮＡがこれらの制限酵素により切断されなかったことが確認された。よって、このアガロースゲル電気泳動パターンの比較により、ガゴメとガゴメ以外のサンプルとは容易に識別可能であることが示された。
【０１２４】
これらの結果から、実施例６の方法により抽出したＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ増幅を行い、これを制限酵素ＥｃｏＴ１４IおよびＰｓｔIで消化して配列内の塩基多型を検出することにより、ガゴメとガゴメ以外の種（マコンブ、ホソメコンブ、リシリコンブ、オニコンブ、ミツイシコンブ、ナガコンブ、ガッガラコンブ、チヂミコンブ、トロロコンブコンブおよびスジメ）とを識別できることが確認された。
【０１２５】
＜実施例９＞ガゴメのＰＣＲ産物の泳動パターンの確認
実施例７に記載の方法により得たガゴメ２８個体の約４９０ｂｐのＰＣＲ産物を、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ Ｋｉｔ（Ｑ−ＢＩＯ ｇｅｎｅ社）を用いてそれぞれ精製した後、各サンプルにつき半量を制限酵素ＥｃｏＴ１４IおよびＰｓｔIで消化した。その後、制限酵素で消化しなかったサンプルと制限酵素で消化したサンプルとを並べて、実施例２（５）に記載の方法により、アガロースゲル電気泳動を行った。その結果を図１０に示す。
【０１２６】
図１０に示すように、２８個体のすべてにおいて、制限酵素で消化しなかった場合は約４９０ｂｐのバンドが検出され、制限酵素で消化した場合は９５ｂｐ、１８６ｂｐおよび２０９ｂｐのバンドが検出された。これらの結果から、実施例６の方法により抽出したＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ増幅を行い、これを制限酵素ＥｃｏＴ１４IおよびＰｓｔIで消化して配列内の塩基多型を検出する場合、多数のガゴメ個体において、安定した泳動パターンが得られることが確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
褐藻類の核酸を抽出する方法であって、
海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素を用いて褐藻類が有する粘性多糖類を分解する工程と、
キレート剤を用いて褐藻類が有する粘性多糖類のゲル形成を抑制する工程と、
タンパク質分解酵素を用いて褐藻類の核酸を抽出する工程と
を有する、前記方法。
【請求項２】
海産軟体動物がアワビ属またはアメフラシ属に属する動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
キレート剤がＥＤＴＡである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
粘性多糖類がアルギン酸を含有する粘性多糖類である、請求項１から請求項３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
多糖類分解酵素がアルギン酸リアーゼである、請求項１から請求項４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
アルギン酸リアーゼがＨｄＡｌｙおよび／またはＨｄＡｌｅｘである、請求項１から請求項５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
タンパク質分解酵素がＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫである、請求項１から請求項６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
褐藻類の種を判別する方法であって、
海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素を用いて褐藻類が含有する粘性多糖類を分解する工程と、
キレート剤を用いて褐藻類が有する粘性多糖類のゲル形成を抑制する工程と、
タンパク質分解酵素を用いて褐藻類の核酸を抽出する工程と、
褐藻類から抽出された核酸を鋳型とする核酸増幅反応を行う工程と
を有する、前記方法。
【請求項９】
海産軟体動物がアワビ属またはアメフラシ属に属する動物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
キレート剤がＥＤＴＡである、請求項８または請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
粘性多糖類がアルギン酸を含有する粘性多糖類である、請求項８から請求項１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
多糖類分解酵素がアルギン酸リアーゼである、請求項８から請求項１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
アルギン酸リアーゼがＨｄＡｌｙおよび／またはＨｄＡｌｅｘである、請求項８から請求項１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質分解酵素がＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫである、請求項８から請求項１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素と、キレート剤と、タンパク質分解酵素とを有してなる、褐藻類核酸抽出キット。
【請求項１６】
海産軟体動物がアワビ属またはアメフラシ属に属する動物である、請求項１５に記載の褐藻類核酸抽出キット。
【請求項１７】
キレート剤がＥＤＴＡである、請求項１５または請求項１６に記載の褐藻類核酸抽出キット。
【請求項１８】
多糖類分解酵素がアルギン酸リアーゼである、請求項１５から請求項１７のいずれかに記載の褐藻類核酸抽出キット。
【請求項１９】
アルギン酸リアーゼがＨｄＡｌｙおよび／またはＨｄＡｌｅｘである、請求項１５から請求項１８のいずれかに記載の褐藻類核酸抽出キット。
【請求項２０】
タンパク質分解酵素がＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫである、請求項１５から請求項１９のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
褐藻類の核酸を抽出する方法であって、
海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素を用いて褐藻類が有する粘性多糖類を分解する工程と、
キレート剤を用いて褐藻類が有する粘性多糖類のゲル形成を抑制する工程と、
タンパク質分解酵素を用いて褐藻類の核酸を抽出する工程と
を有する、前記方法。
【請求項２】
海産軟体動物がアワビ属またはアメフラシ属に属する動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
キレート剤がＥＤＴＡである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
粘性多糖類がアルギン酸を含有する粘性多糖類である、請求項１から請求項３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
多糖類分解酵素がアルギン酸リアーゼである、請求項１から請求項４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
アルギン酸リアーゼがＨｄＡｌｙおよび／またはＨｄＡｌｅｘである、請求項１から請求項５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
タンパク質分解酵素がＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫである、請求項１から請求項６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
褐藻類の種を判別する方法であって、
海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素を用いて褐藻類が含有する粘性多糖類を分解する工程と、
キレート剤を用いて褐藻類が有する粘性多糖類のゲル形成を抑制する工程と、
タンパク質分解酵素を用いて褐藻類の核酸を抽出する工程と、
褐藻類から抽出された核酸を鋳型とする核酸増幅反応を行う工程と
を有する、前記方法。
【請求項９】
海産軟体動物がアワビ属またはアメフラシ属に属する動物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
キレート剤がＥＤＴＡである、請求項８または請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
粘性多糖類がアルギン酸を含有する粘性多糖類である、請求項８から請求項１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
多糖類分解酵素がアルギン酸リアーゼである、請求項８から請求項１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
アルギン酸リアーゼがＨｄＡｌｙおよび／またはＨｄＡｌｅｘである、請求項８から請求項１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質分解酵素がＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫである、請求項８から請求項１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
海産軟体動物から抽出される多糖類分解酵素と、キレート剤と、タンパク質分解酵素とを有してなる、褐藻類核酸抽出キット。
【請求項１６】
海産軟体動物がアワビ属またはアメフラシ属に属する動物である、請求項１５に記載の褐藻類核酸抽出キット。
【請求項１７】
キレート剤がＥＤＴＡである、請求項１５または請求項１６に記載の褐藻類核酸抽出キット。
【請求項１８】
多糖類分解酵素がアルギン酸リアーゼである、請求項１５から請求項１７のいずれかに記載の褐藻類核酸抽出キット。
【請求項１９】
アルギン酸リアーゼがＨｄＡｌｙおよび／またはＨｄＡｌｅｘである、請求項１５から請求項１８のいずれかに記載の褐藻類核酸抽出キット。
【請求項２０】
タンパク質分解酵素がＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫである、請求項１５から請求項１９のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１１−１６０７５５（Ｐ２０１１−１６０７５５Ａ）
【公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２９１３６（Ｐ２０１０−２９１３６）
【出願日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度、文部科学省、地域科学技術振興事業委託事業「マリン・イノベーションによる地域産業網の形成」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人北海道大学 (971)
【出願人】（０００１７３５１１）公益財団法人函館地域産業振興財団 (32)
【出願人】（３１００１０５７５）地方独立行政法人北海道立総合研究機構 (51)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度、文部科学省、地域科学技術振興事業委託事業「マリン・イノベーションによる地域産業網の形成」、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人北海道大学 (971)
【出願人】（０００１７３５１１）公益財団法人函館地域産業振興財団 (32)
【出願人】（３１００１０５７５）地方独立行政法人北海道立総合研究機構 (51)
【Ｆターム（参考）】
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