親油性イオンを培地添加物として用いる、細胞の膜透過性を変化させるための細胞の電気的操作法
本発明は、細胞の膜透過性を変化させるために、培地添加物として親油性イオンを用いて、電場で細胞を処理する方法に関する。特に、本発明は、培地添加物として親油性イオンを用いる細胞の電気穿孔法および電気融合法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親油性イオンを培地添加物として用いる、細胞の膜透過性を変化させるための、電場により細胞を処理する方法に関する。特に、本発明は、親油性イオンを培地添加物として用いる、細胞の電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）および電気融合法（ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ）に関する。この親油性イオンの添加の結果として、効率、また特に再現性が大きく増大し、その他に、電気穿孔法または電気融合法における相対的に高い変動の範囲が減少する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の電気的形質移入法（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）および電気融合法は、ゲノムおよび細胞質を操作するために、生物工学および生物医学の多くの分野において、日常的に使用されている。両方法とも、高い強度で非常に短時間の電場パルスの使用に基づき、これにより可逆的電気的膜透過（いわゆる電気穿孔）がもたらされる。ホルモン、タンパク質、ＲＮＡおよびＤＮＡといった多くの分子を、電気穿孔法を用いて生細胞に導入することができる。誘電泳動的に（ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃａｌｌｙ）接触した細胞の場合、接触領域における膜透過性は細胞の融合をもたらすが、これはハイブリッド細胞の作製に使用することができる（電気融合）。
【０００３】
哺乳類細胞の電気穿孔法／融合法には、通常、数ｋＶ／ｃｍの場強度および数十μｓ（からｍｓ）のパルス持続時間が用いられる。適用場（ａｐｐｌｉｅｄ ｆｉｅｌｄ）は膜の指数関数的変化をもたらすが、これは、誘導膜内外電圧Ｖｇによって付与される：
【化５】
【０００４】
ここにおいて、ａは細胞の半径、θは適用場Ｅ０の方向に対する極角であり、τｍは膜変化の時定数である。Ｖｇが臨界値Ｖｃ＝１ボルトを越えたときに、膜透過が起こる。
【０００５】
膜変化の時定数τｍは、以下の式を用いて算出される：
【化６】
【０００６】
ここにおいて、Ｃｍ［μＦ／ｃｍ２］は、表面特異的膜キャパシタンスであり、σｉおよびσｅは、細胞質の、および外部または融合培地の特異的伝導率[ｍＳ／ｃｍ]である。
【０００７】
式１において細胞の半径として７μｍという代表値を用いる場合、電極に面した膜領域（θ＝０）における透過性の最小臨界場強度を算出することが可能である（パルス期間が膜の弛緩時間よりもずっと長い条件ｔ＞＞τｍにおいて）：Ｅｋｒｉｔ＝Ｖｃ／（１．５×ａ）≒１ｋＶ／ｃｍ。哺乳類細胞の場合、時定数τｍは、０．１から１μｓの範囲にある（式２：Ｃｍ＝１μＦ／ｃｍ２、σｉ≒５ｍＳ／ｃｍ、σｅ＝０．１−１０ｍＳ／ｃｍ、以下参照）。使用される１０−１００μｓというパルス期間は、それゆえτｍよりもずっと長く、式１はＶｇ＝１．５ａＥ０ｃｏｓθに単純化される。
【０００８】
電気穿孔法および電気融合法の効率は、パルス適用の際に、弱い伝導性の、低張性培地を用いることで大きく増大させることができることが先行技術において既知である［Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ＆ Ｎｅｉｌ， １９９６； Ｓｕｋｈｏｒｕｋｏｖ ｅｔ ａｌ． １９９８］。そのような培地は、主要な浸透圧剤として、様々な糖および糖誘導体を含む。一般に使用される一定の糖には、グルコース、ソルビトール、イノシトールまたはマンニトールといった単量体炭水化物、およびスクロースまたはトレハロースを含む二糖類が含まれる［Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ＆ Ｎｅｉｌ， １９９６］。
【０００９】
浸透圧および伝導率の減少は、電気穿孔法および電気融合法において多くの目的を果たす：
１）誘導される膜電圧は細胞半径に直線的に依存するため（上記式１参照）、細胞の低浸透圧性膨潤が膜透過を促進する。
２）外部伝導率の減少は、細胞膜上の一過的電気変形力（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒｃｅ）ＦＤＥＦのため、電気的注入（ｅｌｅｃｔｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を大きく改善する。
【化７】
【００１０】
σｉ＝σｅのとき、変形力（ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒｃｅ）は無い状態となる：ＦＤ＝０。σｉ＜σｅの条件のもとでは、伸長力（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆｏｒｃｅ）ＦＤが、場方向において細胞膜に作用し、この力の振幅はσｅの減少とともに増加する（式３）。同時に、σｅの減少は、電気的注入された分子の量のかなりの増加をもたらす［Ｓｕｋｈｏｒｕｋｏｖ ｅｔ ａｌ．， １９９８］。
【００１１】
３／４）電気融合法では、低伝導度の培地は必須である。変形力の場合と同様に、細胞の電気分極または誘起細胞双極子（ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｉｐｏｌｅ）μｃ（式４）およびＭＨｚの範囲（１−１０ＭＨｚ）における陽性誘電泳動力（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｆｏｒｃｅ）（式５）は、σｅが減少するにつれて増大する［Ｊｏｎｅｓ，１９９５］：
【化８】
【００１２】
ここにおいて、εｅε０＝８０×８．８５ １０−１２Ｆ／ｍが、水性外部培地の誘電率である。∇Ｅ０２という用語は、場の不均質性を反映する。σｅの減少はまた、双極子／双極子相互作用の増大をもたらし、このことは、融合のパートナーの相互の誘引を促進する。
【００１３】
５）上述した物理的効果に加えて、低浸透圧性膨張は、細胞骨格の分解、細胞膜の平滑化（微絨毛の引っ込み）及び膜成分の移動性の増大により、電気融合を促進する。
【００１４】
電気的形質移入／電気穿孔法および電気融合法の広範な使用にも関わらず、未だ現在、使用される方法には多くの未解決の問題が存在する。例えば：
（１）特に「場−耐性」細胞種の場合における、低い形質移入および融合率、
（２）電気穿孔／融合後の高い細胞死亡率、
（３）形質移入および融合率の、考慮すべき「バッチごとの」ゆらぎ、および
（４）しばしば生じる、電気的注入または融合場に関する再現性のゆらぎ。
【発明の目的】
【００１５】
本発明の１つの目的は、それゆえ、効率および再現性が増大した、新規の改善された細胞の電気的操作法を提供することである。関連する更なる目的は、従来の電気的操作法、特に電気穿孔法および電気融合法を改善する手段を提供することである。
【００１６】
発明者らによる詳細な実験は、驚くべき結果をもたらした。すなわち、処理培地、特に低浸透圧性処理培地に親油性イオンを添加することにより、細胞の電気的操作法（例えば、電気穿孔法および電気融合法など）の効果および再現性を大きく増大させることが可能であり、ならびに、特に電気的操作を施された細胞の収率および生存率を大きく増大させることが可能であることである。
【００１７】
従って、上述した目的は、本発明に従い、請求項１に記載の細胞を電場で処理する方法（ここにおいて処理培地は親油性イオンを含む）および請求項２３に記載のこれらの親油性イオンの使用を提供することにより達成される。本発明の具体的なおよび好ましい実施態様は、従属する請求項の主題である。
【発明の詳細な説明】
【００１８】
本発明の出発点は、多くの細胞、特に哺乳類細胞が、特に、典型的に電気穿孔法／電気融合法の際に存在するような低浸透圧性条件の下で、複雑な体積調節を行うことができるという実験的証拠であった。
【００１９】
近年の実験［Ｒｅｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００４］から、低浸透圧性糖培地において、急速な細胞の初期膨張の後、使用する糖に依存して、ゆっくりとした二次体積増加および細胞の収縮の両方が生じる可能性があることがわかった。ともに、いわゆる体積感受性チャネルを介した、細胞質基質からの電解質の急速な流出をもたらし得る。
【００２０】
オリゴ糖（例えば、トレハロース、スクロースまたはラフィノース）で置換された低浸透圧性穿孔および融合培地では、調節性体積減少（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｖｏｌｕｍｅ ｄｅｃｒｅａｓｅ）（ＲＶＤ）が、近年分析される全てのヒトおよび哺乳類細胞の場合に生じる。このことは、低浸透圧培地における短期の膨張段階（１−３分）の後に、細胞は１５−２０分以内に（連続する低浸透圧ストレスにも関わらず）本来の体積を取り戻すことができることを意味する。
【００２１】
その他の著者による電気生理学的研究は、細胞の最初の膨張は、体積感受性塩素イオンチャネルを活性化し、このことが、細胞からの塩素イオンの流出および細胞膜の脱分極をもたらすようであることを明らかにしている。膜の脱分極は、電圧依存的Ｋ＋チャネルおよびＫ＋流出を活性化する。浸透圧により誘導される水の流出とともに、正味ＫＣｌ流出は、正常（すなわち等張性）細胞体積の回復をもたらすと考えられる［Ｆｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００２； Ｌａｎｇ，１９９８］。
【００２２】
オリゴ糖と対照的に、単量体糖誘導体（例えば、ソルビトール、イノシトールまたはグルコース）の低浸透圧性溶液ではＲＶＤが起こらない［Ｒｅｕｓｓ ｅｔ ａｌ．， ２００４］。ある種の細胞では、細胞の二次的なゆっくりとした膨張さえ観察される。オリゴ糖と単糖との間の違いは、体積感受性チャネル（ＶＳＣ）のサイズ選択性によって説明されるだろう。そのようなチャネルは、哺乳類細胞の膜に遍在する［Ｋｉｒｋ，１９９７；Ｓｔｒａｎｇｅ，１９９４］。
【００２３】
しかしながら、ＲＶＤの起こらない培地（例えば、イノシトールまたはソルビトール置換培地）においてでさえ、低浸透圧ストレスは、電解質のかなりの消失および細胞質基質の伝導率の低下をもたらす（電気的回転スペクトル（ｅｌｅｃｔｒｏｒｏｔａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒａ）による実施例（図７Ａ）により実証される）。
【００２４】
細胞質基質からのイオン消失は、細胞質基質の伝導率σｉを減少させ、その結果として、穿孔および融合関連変形力（式３）、細胞の分極μｃ（式４）および誘電泳動力（式５）を大きく減少させる。さらに、細胞質基質からのイオン流出は、細胞の生命力の相当の消失をもたらす。
【００２５】
これらの効果は、部分的にまたは完全に、電気穿孔／電気融合の低浸透圧培地の陽性効果を相殺し得る。
【００２６】
しかしながら、現在までに、低浸透圧培地における細胞、特に哺乳類細胞の複雑な体積応答および関連するイオン流出について、電気穿孔および電気融合との関連性に関しては文献で議論されていなかった。
【００２７】
本発明は、親油性イオン（特に陰イオン）の処理培地への添加が、この体積調節を特に抑制し、それにより電気穿孔法および電気融合法の効率を大きく増大させることができるという驚くべき実験的証拠に特に基づく。
【００２８】
親油性陰イオンの細胞膜への吸収または取り込みは、おそらく、体積調節に関係するイオンチャネルの阻害をもたらす。あるいは、親油性イオンが直接または間接的に、チャネルの開放確率またはその他の輸送特性を調節する可能性がある。これらの両モデルから、低浸透圧ストレスの際の細胞質基質からのイオン消失は、親油性イオンを使用する際に大きく減少することが導き出せる。一方で、細胞体積は結果的に安定化し、他方で、イオン含有量および細胞質基質の伝導率は高いレベルに保たれる。
【００２９】
作用機構に関する何れかの理論に限定されることを望まず、特定のイオンチャネルのこの阻害は、親油性イオンの膜への吸収および／または取り込みによる、膜電圧に応じた細胞の膜キャパシタンスにおける変化（特に増大）の結果であると、現在のところ考えられる。
【００３０】
本発明者らによる広範な実験により、膜電圧に応じた親油性イオンにより誘導される膜キャパシタンスにおける変化は、通常、特定の関係に従い、および、好ましくは、電圧Ｖｍａｘ（その電圧において、キャパシタンスＣ（Ｖｍａｘ）における増大が最大である）を有した対称的なまたは非対照的な釣鐘状曲線の挙動を有していることがわかった。
【００３１】
釣鐘状曲線のパラメーターは、親油性イオンの化学的性質に依存し、および膜（または細胞の種類）の性質に依存する。親油性イオンの釣鐘状曲線の電圧依存性に基づいて、膜の親油性イオンの分布について結論が出せる。
【００３２】
キャパシタンスの最大の増加が確認される膜電圧において、膜の両面上における親油性イオンの均一な分布が現れるであろう。対照的に、親油性イオンで最も極度な不均一な分布（完全に、膜のサイトゾル側または細胞外側の両方における）は、親油性イオンによるキャパシタンスの増加を測定できない場合に現れる。親油性イオンの不均一な分布は、膜の一方の面における表面電位の有意な減少（ΔＶ〜−４００ｍＶまで）につながらなければならない。これは、通常、膜全体の電位を通した急激な変化をもたらす。この「膜非対称」効果は、さまざまな方法で処理された細胞の電気的操作を容易にすることができる：
１）表面電位の急激な減少は、膜全体の急勾配の電位曲線をもたらし、あまりに急勾配であるために、局所浸透が生じ、または、局所浸透が重ね合わさった外部場（ｓｕｐｅｒｐｏｓｅｄ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｆｉｅｌｄｓ）によって促進される（電気穿孔法、電気融合法）。
２）電位の変化した曲線は、膜における電圧依存的輸送系への影響をもたらす（電圧調節）。
３）「膜非対称」の他に、全体として、細胞の「半球非対称（ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ ａｓｙｍｍｅｔｒｙ）」が生じるだろう。これは、２つのやり方で電気的浸透を促進する。細胞の一方の側面では、浸透のための電位にほとんど既に達しており、外的に適用される浸透電圧は、標準より低く選ぶことができる。細胞のもう一方の側面では、適用される電位勾配は、外的に適用される浸透電圧にとって「好ましくない」。細胞のこの側面は、従って、親油性イオンによって「保護されている」。あるいは、これは、外的な場の振幅の状況または適用場のパルスの長さ／短さに使用することが可能である。両半球は、異なる荷電時間を有するだろう。このことは、この「非対称の」浸透が、細胞において、標準的な浸透よりも非常に穏やかなことを意味する。
【００３３】
この知見は、あらかじめ決定した条件の下で膜キャパシタンスの変化に対するそれらの効果を決定することによって、特に適した親油性イオンを選択することを可能にする。
【００３４】
そのような選択のプロセスは、一般的に以下の工程を含む：
−所定の膜電圧に応じて生物学的細胞の電気的膜キャパシタンスを測定すること、ここにおいて、親油性イオンによって誘導される膜キャパシタンスの電圧依存性は、処理培地中の多くの異なる親油性イオンで測定される、および
−親油性イオンによって誘導される細胞の膜キャパシタンスが、予め決定した選択基準を満たす親油性イオンを同定および選択すること。この選択基準は、例えば、特定の膜電圧における釣鐘状曲線の形状または位置であってよい。
【００３５】
望ましい結果および用途に依存して、膜キャパシタンスが細胞の本来の膜電圧において最小となる（すなわち、釣鐘状曲線の低分極状態（ｈｙｐｏｐｏｌａｒｉｚｅｄ）のまたは高分極（ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚｅｄ）された側面（ｆｌａｎｋ）に位置する）ようなこれらの親油性イオン、または膜キャパシタンスが細胞の本来の膜電圧で最大となるこれらの親油性イオンを選択することが可能である。
【００３６】
本発明の１つの実施態様において、これらの親油性イオンは、膜キャパシタンスが、細胞の本来の膜電圧において、わずかに増加するまたは増加しない値を有するように選択され、すなわち、本来の膜電圧において漸減する側面（ｆｌａｎｋ）を有する特徴的な釣鐘状曲線を有する親油性イオンが選択される。この場合、親油性イオンは、おそらく、本来の膜電圧において不均一に膜を通して分布すると考えられ、上記のような有益な非対称効果を生じると考えられる。このことは、例えば、非常に弱い伝導性の融合培地にさらされる過分極された細胞に関する。
【００３７】
膜キャパシタンスが細胞の本来の膜電圧において最大となる親油性イオンは、高い膜キャパシタンスまたは親油性イオンの均一な分布が有益となる用途に使用することができる。この例の１つとして、不均質な膜構造を有する細胞であって、このようにしてより均一な膜電荷が付与される細胞が含まれ、例えば、負に荷電するホスファチジルセリンが主に原形質膜のサイトゾル側に位置する大部分の哺乳動物細胞が含まれる。
【００３８】
本来の膜電圧（すなわち適用場なしの状態）は、外部の浸漬培地（処理培地）と細胞の内部との間の浸透性イオンのイオン勾配に依存するので、処理培地に塩類を添加することによってこれを調整することができる。適切な可溶性塩類は、例えば、ナトリウム、カリウムまたはバリウムイオンを含んでよいが、これらに限定されない。
【００３９】
膜キャパシタンスの変化は、一方で親油性イオンの選択におよび他方で本来の膜電圧の変化に影響を受け得るため、このことは、非変化膜電圧にてこの電圧で釣鐘状曲線の望ましい形状（例えば側面（ｆｌａｎｋ）または最大値）を有する親油性イオンを選択すること、または、所定のイオンのために釣鐘状曲線の適当な区画に相当する電圧へと本来の膜電圧を最適に変えることのどちらによっても、親油性イオンの望ましい分布が得られることを意味する。
【００４０】
（例えば、細胞周期同期化細胞を用いることにより、適切な塩条件によって膜電位を調整することにより）細胞を特異的な膜電位に調整することの別の長所は、結果のより良い再現性にある。
【００４１】
すでに言及したように、親油性イオンにより誘導される膜キャパシタンスの変化は、低浸透圧培地における細胞の体積調節を完全にまたは部分的にスイッチオフするために使用することができる。上述のように、このことは、電解質の損失のかなりの減少をもたらし、それによって電気穿孔法または電気融合法といった電気的操作法のための枠組みとなる条件を改善する。サイトゾルからのイオンの喪失は、サイトゾルの伝導率σｉを減少させ、その結果、穿孔および融合に関連する変形力（式３）、細胞極性μｃ（式４）ならびに誘電泳動力（式５）が大きく減少する。さらに、サイトゾルからのイオン流出は、細胞の活力のかなりの減少につながる。
【００４２】
これらのネガティブな効果を除去することにより、電気的操作法の効率および再現性を大きく増大させることが可能である。
【００４３】
上記の知見から明らかなように、親油性イオンの存在またはそれによって誘導される膜キャパシタンスの変化は、それでも、非低浸透圧性条件（例えば等張性条件）の下でさえ、電気的操作法にて要求されるまたは必要な膜浸透を大きく促進する膜の変化をもたらし得る。従って、本発明による親油性イオンの使用はまた、非低浸透圧性培地における、電気穿孔法または電気融合法といった電気的操作法のより簡単でより効率的な実施を可能とする。細胞に対する低浸透圧性ストレスの回避には、大きな利点があり、いずれにせよ、操作した細胞の生存率に有利な影響を及ぼす。
【００４４】
本発明による方法の適用または本発明による親油性イオンの使用に適した細胞は、原則として、天然または合成起源の全ての細胞である。合成細胞とは、例えば合成膜被覆小胞（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｃｏｖｅｒｅｄ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）、リポソームまたはミセルであってよい。天然の細胞は、原核細胞、例えば細菌もしくは酵母、または真核細胞、例えば動物または植物細胞を含む。好ましい動物細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。好ましい実施態様の１つにおいて、細胞は生細胞である。
【００４５】
本発明によって使用される親油性イオンは、陽イオン、陰イオンまたは陽イオンと陰イオンとの混合物である。
【００４６】
陽イオンは、特に植物細胞の場合の使用に好ましく、一方で陰イオンは、特に動物細胞、特に哺乳類細胞の場合に好ましい。
【００４７】
本発明によって用いられる陽イオンは、１種から成ってよく、または多くの異なる陽イオンを含んでもよい。一般的に、使用される親油性陽イオンは、親油性の金属複合体、親油性の有機金属化合物および親油性の有機化合物（少なくとも１つの正に荷電する官能基を含む）の陽イオンを含む陽イオンの群に由来する少なくとも１つの物質を含むだろう。特定の例は、レニウムヘキサカルボニル（Ｒｅ（ＣＯ）６）＋、テトラフェニルホスホニウム化合物またはテトラフェニルアルセニウム（ａｒｓｅｎｉｕｍ）化合物である。更に適した化合物は、日常的な実験によって当業者が困難なく決定することができる。
【００４８】
本発明によって使用される陰イオンは、１種から成ってもよく、また多くの異なる陰イオンを含んでもよい。一般的に、使用される親油性陰イオンは、親油性の金属複合体、親油性の有機金属化合物および親油性の有機化合物（少なくとも１つの脱プロトン化できる官能基を含む）の陰イオンを含む陰イオンの群に由来する少なくとも１つの物質を含むだろう。
【００４９】
本発明によって使用することができる陰イオン（特に親油性の金属複合体）の特定の非限定的な例は、以下の式のものを含む。
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【００５０】
好ましくは、親油性陰イオンは、親油性のタングステン複合体（ＬＴＣｓ）、特に親油性のタングステンカルボニル複合体、ジピクリルアミン（ＤＰＡ）およびその誘導体の陰イオン、少なくとも１つのカルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸塩、チオ硫酸塩もしくはチオシアン酸塩基、特にアラキドン酸を含む親油性の有機化合物の陰イオン、置換型または非置換型テトラフェニルホウ酸塩またはフェニルジカルバウンデカンデカボラン（ｐｈｅｎｙｌｄｉｃａｒｂａｕｎｄｅｃａｎｅｄｅｃａｂｏｒａｎｅ）（ＰＣＢ）の陰イオンまたはテトラシアノホウ酸塩もしくはテトラトリフルオロメチルホウ酸塩の陰イオンを含む陰イオンの群から選択される少なくとも１つの物質を含む。
【００５１】
特に好ましくは、親油性陰イオンは、以下の式の陰イオンからなる群から選択される：
【化１３】
【００５２】
ここにおいて、（１）は、［Ｃ１２Ｈ４Ｎ７Ｏ１２］−，２，２’，４，４’，６，６’−ヘキサニトロジフェニルアミド（ジピクリルアミン＝ＤＰＡ）；（２）は、Ｅｔ４Ｎ［Ｗ（ＣＯ）５（ＳＣＮＯＣ６Ｈ４）］，テトラエチルアンモニウムベンゾキサゾリジン−２−チオ−１−イル−ペンタカルボニルタングステンの陰イオン（ＭＷ６０４）（ＷＯと省略）；（３）は、Ｅｔ４Ｎ［Ｗ２（ＣＯ）１０（μ−Ｓ２ＣＨ）］，テトラエチルアンモニウムデカカルボニル−μ−ジチオホルメート（ｄｉｔｈｉｏｆｏｒｍｉａｔｏ）−ジタングステンの陰イオン（ＭＷ７２５）（以降、ＬＴＣ−（「親油性タングステン複合体」）またはＷＷと省略）；（４）は、Ｎａ［Ｂ（Ｃ６Ｈ５）４］，テトラフェニルホウ酸ナトリウムの陰イオン（ＭＷ３４２）である。
【００５３】
同じまたは異なる濃度で、同時にまたは一時的連続的（ｉｎ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｓｕｃｃｅｓｓｉｏｎ）に、多くの異なる性質の親油性イオンを用いることにより、親油性イオンの個々の特性の「重なり（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）」を達成することができる。このことは様々な目的に有利である可能性があり、例えば、干渉により影響を受けにくい、より強力な、すなわち再現性がある方法手順を確実にするために有利である可能性がある。
【００５４】
本発明に用いることができる親油性イオンは、当該分野において周知であり、および商業的に得ることができまたは既知の日常的方法によって作製することができる化合物である。
【００５５】
原則として、適切なイオンには、キャパシタンスの増加が、膜を介した電圧（ｔｒａｎｓ−ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｏｌｔａｇｅ）に応じて対称または非対称の釣鐘状曲線を持つように、膜キャパシタンスを増加させ得る全てのイオンが含まれる。このことは、幾つかのイオン（タングステン化合物、ＤＰＡ、その他）のための例として示される。
【００５６】
本発明の主要な使用の１つは生細胞の電気的操作法であるため、親油性イオンは、この場合、生細胞に生理的適合でなければならない。一部の適用のために、使用する親油性イオンがＵＶ光によって分解可能であり、生細胞に生理的適合である分解生成物を作り出すことが特に好ましい。両方の条件は、例えば上記式３の親油性陰イオンタングステン複合体の場合に理想的に満たされる。同様の有効性、適合性および同様の分解挙動を有する同様の化合物を、困難なく製造できることは、当業者にとって明白である。
【００５７】
本発明によると、親油性イオンは、一般的に、細胞の膜透過性を変えるために電場で細胞を処理する方法において用いられ、当該方法は少なくとも以下の工程を含み：
−処理培地（２）中において少なくとも１つの細胞（１）を提供すること、および
−細胞（１）を少なくとも１つの電気的な電圧パルスにさらすこと、
以下の工程によって特徴付けられる：
−処理培地（２）に親油性イオンを添加すること。
【００５８】
そのような方法は、一般に、細胞の膜透過性を変化させる様々な既知のまたは考えられる電気処理法（この方法において、細胞は電気的電圧パルスにさらされる）、および特に電気的形質移入法／電気穿孔法または電気融合法を含む。
【００５９】
親油性イオンは、一般に、１ｎＭから１００μＭ、好ましくは０．１μＭから６０μＭ、特に好ましくは１μＭから５０μＭの範囲の濃度で処理培地（２）に添加される。
【００６０】
本発明による方法の特定の実施態様の１つにおいて、浸透圧的に活性な物質もまた、少なくとも１つの生物学的細胞（１）に対する低浸透圧ストレスを発生させるために処理培地（２）に添加される。そのような物質は、この目的のために知られる全ての物質を含み、好ましくは単糖および／または二糖、例えばスクロース、トレハロース、グルコース、マンニトール、イノシトール、ソルビトール等を含む。
【００６１】
好ましくは、生物学的細胞（１）を電気的電圧パルスへさらす工程は、浸透圧的に活性な物質の添加の後の遅延時間の後行われ、当該遅延時間は、好ましくは、１５秒から１０分の範囲で選択される。
【００６２】
本発明者らによる実験は、電気的形質移入／穿孔法および電気融合方法の場合、場パルスの適用前の低浸透圧ストレスの期間は、これらの方法の効率に大きく影響を及ぼすことを明らかにした。
【００６３】
生物物理学的実験および容積測定実験に基づいて、電気的操作法プロトコールにおける低浸透圧処理の持続時間をかなり最適化することが可能となった。これらの実験において、表１および２に示される組成を有する低浸透圧性穿孔および融合培地を用いた。適した等張性培地もまた、細胞を洗浄するために使用した。
【００６４】
ａ） 電気融合法：
生ハイブリッド細胞の非常に高い収率は、パルス適用のタイミングを最適化することによって達成することができた。ハイブリッドの収率は、パルス適用前の低浸透圧ストレスの持続時間に強く依存していた。２分（急速に膨潤する相の終わりに相当する）という短い低浸透圧処理は、最も良い結果を与えた。より長いインキュベーション時間（例えば、２０または４０分）は、融合収率を低下させた（データは示していない）。
【００６５】
ｂ） ＧＦＰプラスミドの電気的形質移入：
電気融合法の場合と同様に、短い低浸透圧処理（すなわち、パルス応用前の２分）は、一般に、１０分というより長いインキュベーションの場合よりも、ＧＦＰが形質移入された細胞の非常に高い収率を与えた（表４）。一般に、インキュベーション時間依存的な形質移入収率（ＴＹｓ）は、異なる細胞種に対する細胞サイズ（式１参照）における一時的な変化に非常によく相関した。
【００６６】
より長いインキュベーションは、常に、細胞増殖（ＰＦ、例えばＩｎｏｓｉｔｏｌ１５０におけるＨＥＫ細胞の場合４７から３３％まで）の減少をもたらし、このことは、（電解質の減少による）細胞の生存率の低下を表す。
【００６７】
電気穿孔法／形質移入または電気融合法の効率の低浸透圧ストレスの持続時間に対するこの強い依存性は、低浸透圧ストレスのための時間スパンを最適化することによって、親油性イオンを用いる上記の電気的操作法を更に改善するために使用することができる。すでに、親油性のイオンを用いない場合でさえ、ときとしてこの時間最適化によって非常に高い効率が達成されており、これらの効率は、親油性イオンにより更にわずかに増加できただけであったことに留意すべきである。しかしながら、いずれにせよ親油性イオンの使用は、より強力なプロトコール（即ち、高い効率を達成するための最適時間値の正確な設定に基づかないプロトコール）という付加的な利点をもたらす。これは、これらの方法の産業応用における非常に実用的な利点である。
【００６８】
好ましくは、処理培地（２）への親油性イオンの添加は、これらの親油性イオンで処理しようとする細胞の膜のドーピングを行う電圧パルスの前に、十分な濃度でおよび十分な時間で行われる。この文脈における「ドーピング」という用語は、膜上でのイオンの吸着および／または膜におけるイオンの取り込みを意味する。適切な濃度および持続時間（通常、分の振幅のオーダー）は、本願に開示される知見に基づいて、日常的な実験で当業者によって困難なく決定され得る。
【実施例】
【００６９】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【００７０】
以下の例は、本発明による特定の実施態様を説明するものであるが、これらに本発明が限定されることを意味するものではない。
【００７１】
［例１］親油性陰イオンをドーピングした細胞膜を有する細胞の電気穿孔法／形質移入法
電気的形質移入のために、Ｊｕｒｋａｔ−Ｔ−リンパ球、ＨＥＫ２９３細胞およびマウス線維芽細胞Ｌ９２９細胞を、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のウシ胎児血清を添加した、ＲＭＰＩ完全増殖培地（以下「完全増殖培地」をＣＧＭと省略）にて、５％ＣＯ２下３７℃で培養した。電気的形質移入の前に、ＥＤＴＡのパルス培地への混入を回避するため、接着細胞（すなわちＨＥＫ２９３細胞およびＬ９２９細胞）を、ＥＤＴＡを含まない０．５ｍｇ／ｍｌトリプシンで脱離させた。酵素は、ＣＧＭによる洗浄で除去した。
【００７２】
電気的形質移入法／穿孔法のプロトコールは、以下の工程を含むものとした：
１．細胞を等張性洗浄溶液（ＩＷＳ−Ｐ、表１参照）で洗浄する工程；
２．緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ドイツ、ハイデルベルグ）を１０μｇ／ｍｌで含む低張性パルス溶液（ＨＰＳ，表１参照）に細胞を懸濁する（１０６細胞／ｍｌ）工程；
３．ＨＰＳ中で２から１０分間細胞をインキュベートする工程；
４．Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ドイツ、ハンブルグ）および４ｍｍの間隔で平らなアルミニウム電極を設けたキュベットを用いて、室温（ＲＴ、約２２−２４℃）にて、細胞サンプル（〜８００μｌ）に単一の指数関数的に減少するパルスを適用する工程；
５．続いて、ＲＴで１０分間、パルス培地中で細胞をインキュベートする工程；
６．予め加温した５ｍｌのＣＧＭに細胞を穏やかに移し、最大のＧＦＰ発現を達成するために２日間培養する工程；
７．フローサイトメトリーおよび電気的細胞計数器を用いて分析する工程。
【００７３】
Ｌ９２９細胞は、１００ｍＯｓｍのパルス培地（ＨＰＳ、表１）中にて、３ｋＶ／ｃｍの場強度および１００μｓの持続時間のパルスによって、電気的形質移入した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、１００ｍＯｓｍのＨＰＳ中で、１．２ｋＶ／ｃｍおよび４０μｓで形質移入した。ＨＥＫ細胞は、１５０ｍＯｓｍのＨＰＳパルス培地中で、１．５ｋＶ／ｃｍおよび７０μｓで処理した。
【００７４】
望ましくない電解質の損失を防止または最小化し細胞体積を安定化させることに関する親油性陰イオンの効果を分析するため、上記式３の親油性タングステン複合体（Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ Ｔｕｎｇｓｔｅｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＬＴＣと省略）を１０μＭで異なる穿孔培地に混合した。
【００７５】
表４は、異なる培地組成および低浸透圧ショックの時間条件によって得られた結果を示す。
【００７６】
ＬＴＣの添加は、形質移入効率のかなりの増大をもたらし、特に低張培地でのインキュベーション時間が長い場合ほどそうであった。
【００７７】
形質移入の収率の改善はまた、マーカーとしてのプロピジウムヨウ化物（図８）の電気的注入による付加的な実験にて確認することができた。この場合、パルス培地は、２５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（通常膜透過性でなく、核酸に結合した後強い蛍光を示す陽イオン性色素）を含む。ＰＩは２つの役目を果たし、第１に、生細胞と死細胞との区別（短期活力試験（ｓｈｏｒｔ ｖｉｔａｌｉｔｙ ｔｅｓｔ））を可能にする色素としての役目、および、第２に、一過的に電気的に誘導される膜透過性の指標としての役目である。細胞のＰＩ染色は、フローサイトメトリーによって、パルス適用の後１０−１５分以内に分析した。
【００７８】
［例２］細胞の電気融合法
電気融合法のために、ヒトＢリンパ球を、健常な提供者の末梢血から単離し、２．４μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ−Ｌ）で既知の通りに活性化した。活性化された細胞は、５％に濃縮されたＣＯ２を含む空気中にて、３７℃で培養した。細胞密度が〜５ｘ１０６細胞／ｍｌを上回ったとき、細胞を１ｘ１０６細胞／ｍｌの密度に希釈した。活性化Ｂリンパ球を、標準条件で培養したヒト／マウスヘテロミエローマ細胞株Ｈ７３Ｃ１１（以降、Ｈ７細胞と呼ぶ）と融合させた。
【００７９】
電気融合法のため、Ｂリンパ球およびＨ７細胞をＣＧＭにおいて１：１の比率で混合し、２００ｘｇで１０分間遠心分離してペレットにし、７５または１００ｍＯｓｍの重量モル浸透圧濃度の、低浸透圧性で、糖を添加した融合溶液（ＨＦＳ）に再懸濁した。その後、細胞をＨＦＳで二回洗浄した（続いて、２００ｘｇで１０分間再度遠心分離し再懸濁した）。ＨＦＳ中の細胞懸濁液２００μｌを、２本のプラチナ導線が２００μｍ間隔に巻付けられたパースペックスチューブから成るらせん状チャンバーにピペットで入れた。最終的な細胞密度は、３ｘ１０５細胞／ｍｌであった。この標準的プロトコールによると、細胞を、第１の融合パルスの適用前に、洗浄工程の間、少なくとも２０分間低浸透圧ストレスにさらした。改善されたプロトコールにおいて、低浸透圧ストレスの持続時間は、等張性洗浄溶液（ＩＷＳ−Ｆ表２参照）を用いることにより、有意に減少した。
【００８０】
エッペンドルフＭｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒを、電気融合法のために用いた。細胞は、最初に、４５ＶＰＰ振幅および２ＭＨｚの頻度の交代性場（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ ｆｉｅｌｄ）によって、誘電泳動的に引き合わせた。高周波場をその後停止し、３０Ｖ振幅および１５μｓ持続時間の３つの方形波ＤＣパルスによって融合を開始した。その後、５ＶＰＰ振幅の２ＭＨｚの場を、引き続く融合工程の間、適した位置に細胞を保つために再び適用した。らせん状チャンバーを、次に、何れの干渉もせず、ＲＴで１０分間維持した。チャンバーを、その後、１ｍｌの等張性ＣＧＭで洗浄し、細胞を、２４穴のプレートの４つのウェル（それぞれ等張性ＣＧＭが１ｍｌ満たされている）に移した。２４時間後に、ハイブリドーマ細胞のみが増殖する選択性ＨＡＴ培地をウェルに添加した。ハイブリドーマコロニーを、電気融合の１−３週後に計数した。
【００８１】
親油性陰イオン（例えばＷＷ）の存在は、特に低浸透圧ストレスの持続時間がより長い場合に、電気融合の効率および再現性を大きく増大させた。特に、生き残るハイブリッド細胞の高い収率は、再現性よく得られた。
【００８２】
［例３］膜電圧に応じて、卵母細胞の場合における親油性陰イオンによって誘導される膜キャパシタンス曲線の決定
測定は、ＮＤ９６溶液中で、二電極電圧固定技術（ｔｗｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ｖｏｌｔａｇｅ ｃｌａｍｐ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を用いて、アフリカツメガエルの卵母細胞において行った。親油性陰イオンの存在下および非存在下において、膜キャパシタンスＣｍ（ＵＨ）を算出するため、電圧ランププロトコールを、ソフトウェアＣｌａｍｐｅｘ９．２（登録商標）でプログラムした。このため、まず、電位は定義された値に設定し、次に、電圧ランプ（ｄＵ／ｄｔ）は、定義された電圧まで上げた。（測定は、また、電圧固定なしで本来の膜電圧においても行った）。
【００８３】
ＮＤ９６溶液は、９６ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ Ｈｅｐｅｓを含み、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整した。ＮＤ９６＋２．８ｍＭ ＢａＣｌ２のために、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２および１ｍＭ ＭｇＣｌ２を、２．８ｍＭ ＢａＣｌ２で置き換えた。
【００８４】
測定のために、ＩＶ−ＶＩ段階のコラゲナーゼ処理した卵母細胞を使用した。
【００８５】
３つの異なる親油性陰イオン（化合物１から３）を用いた測定の結果を図４に示した。
【００８６】
１から３のイオンのためのキャパシタンスの増大の電圧依存性（「釣鐘状曲線」）の決定から、ＤＰＡおよびＷＯが、ほとんど同一の釣鐘状曲線を有することがわかる。対照的に、ＷＷ（ＬＴＣ）は、−１３０ｍＶに最大値をもつ大きく移動した釣鐘状曲線となった（対照的に、ＤＰＡおよびＷＯでは、それぞれ−７０ｍＶおよび−８０ｍＶである）。
【００８７】
従って、ＷＯおよびＤＰＡの場合における標準的な細胞電位では、親油性イオンの分布は、均一な分布に近い（ＶＭ＝−３０−−７０ｍＶ）と表されると想定される。対照的に、正常な細胞条件下でのＬＴＣ（ＷＷ）は、サイトゾル側では非均一に蓄積すると考えられる。
【参考文献】
【００８８】
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【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、本発明による方法の模式図を示す。
【図２】図２は、本発明による方法を実施するための実験装置の模式図を示す。
【図３】図３は、適切な親油性イオンを選択する方法の模式図を示す。
【図４Ａ】図４は、３つの異なる親油性陰イオンについての、膜に適用される電圧に応じた、卵母細胞の細胞膜のキャパシタンスにおける変化を示す「釣鐘状曲線」を示す。Ａ：ＤＰＡ（化合物１）；下部の２曲線は、測定系列の開始（四角）および終了（下向き三角形）における、親油性イオンＤＰＡがない場合の対照測定の結果を示す。上部の曲線（むくの円）は、細胞外の５０μＭ ＤＰＡの存在下における結果を示し、この下に位置する曲線（上向き三角形）は、細胞外の５０μＭ ＤＰＡおよび２．８ｍＭ ＢａＣｌ２の存在下における結果を示す。
【図４Ｂ】図４は、３つの異なる親油性陰イオンについての、膜に適用される電圧に応じた、卵母細胞の細胞膜のキャパシタンスにおける変化を示す「釣鐘状曲線」を示す。Ｂ：ＷＯ（化合物２）；下部の２曲線は、測定系列の開始（四角）および終了（下向き三角形）における、親油性イオンＷＯがない場合の対照測定の結果を示す。上部の曲線（上向き三角形）は、細胞外の１０μＭ ＷＯおよび２．８ｍＭ ＢａＣｌ２の存在下における結果を示し、この下に位置する曲線（むくの円）は、細胞外の１０μＭ ＷＯの存在下における結果を示す。
【図４Ｃ】図４は、３つの異なる親油性陰イオンについての、膜に適用される電圧に応じた、卵母細胞の細胞膜のキャパシタンスにおける変化を示す「釣鐘状曲線」を示す。Ｃ：ＷＷ（化合物３；ＬＴＣ）；下部の２曲線は、測定系列の開始（四角）および終了（下向き三角形）における、親油性イオンＷＷがない場合の対照測定の結果を示す。上部の曲線（むくの円）は、細胞外の１０μＭ ＷＷの存在下における結果を示し、この下に位置する曲線（上向き三角形）は、細胞外の１０μＭ ＷＷおよび２．８ｍＭ ＢａＣｌ２の存在下における結果を示す。
【図５】図５は、主な浸透圧薬剤としてソルビトールまたはトレハロースの何れかを含む強力に低浸透圧性の融合培地（７５および１００ｍＯｓｍ）における、活性化Ｂ−リンパ球（Ａ）およびＪｕｒｋａｔ細胞（ＢおよびＣ）の相対的体積の時間曲線を示す。低浸透圧性トレハロース培地（むくの円）において、両細胞種とも、最初の急速な膨潤後にＲＶＤを示した。対照的に、低浸透圧性ソルビトールは、Ｊｕｒｋａｔ細胞においてＲＶＤを無くし（データは示していない）または二次的膨潤を誘導しさえした（Ａ、中空の円）。タングステン複合体ＬＴＣは、Ｂ−リンパ球において部分的に、またはＪｕｒｋａｔ細胞において完全にＲＶＤを阻害した（ＡおよびＢにおける四角）。アラキドン酸は、Ｊｕｒｋａｔ細胞においてＲＶＤを無くした（Ｃ、四角）。
【図６】図６は、異なる、構造的に関連のない親油性イオン（化合物（１）（ＤＰＡ）、（２）（ＷＯ）および（４）（ＴＰＲ））（Ａ−Ｃ）によって、哺乳類細胞において完全にまたは部分的にＲＶＤが阻害されることを示す図である。これとは対照的に、親油性陽イオンであるテトラフェニルホスホニウム（ＴＰＰ、１０−５０μＭ）は、ＲＶＤに影響を与えない（Ｃ、四角）。
【図７】図７は、Ｈ７およびＪｕｒｋａｔ細胞の典型的な回転スペクトルを示す図である（ＡおよびＢ）。Ａ：Ｈ７細胞を、１２０μＳ／ｃｍという同一の伝導率で、等張性または低張性ソルビトール培地（むくおよび中空の円）にて１５−２０分インキュベートした。等張性条件と比較して、低浸透圧ストレスは、サイトゾルのピークｆｃ２のより低い頻度への大きな移動をもたらし、このことは、サイトゾルの伝導率σｉの有意な減少を意味する。Ｂ：未処理のコントロール（中空の円）と比較して、１０μＭ ＬＴＣは、付加的な抗場ピーク（ａｎｔｉ ｆｉｅｌｄ ｐｅａｋ）（ｆＬＴＣ）を引き起こし、また、ｆｃ２をより高い頻度へと移動させた。後者の効果は、サイトゾルからの電解質の消失の減少に起因し得る。
【図８】図８は、ヨウ化プロピジウムの電気的注入におけるＬＴＣの効果を示す図である。電気的に誘導されるＰＩ取り込みの、４０μｓのパルス持続時間での適用される場強度Ｅ０への依存性が示される。データポイントは、３回の独立したフローサイトメトリー定量によって決定した平均ＰＩ取り込み値である。試験した場強度の範囲内において、１０μＭ ＬＴＣ−で処理した細胞のＰＩ取り込み（むくの円）が、コントロール（中空の円）のものよりも大きな値を示した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親油性イオンを培地添加物として用いる、細胞の膜透過性を変化させるための、電場により細胞を処理する方法に関する。特に、本発明は、親油性イオンを培地添加物として用いる、細胞の電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）および電気融合法（ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ）に関する。この親油性イオンの添加の結果として、効率、また特に再現性が大きく増大し、その他に、電気穿孔法または電気融合法における相対的に高い変動の範囲が減少する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の電気的形質移入法（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）および電気融合法は、ゲノムおよび細胞質を操作するために、生物工学および生物医学の多くの分野において、日常的に使用されている。両方法とも、高い強度で非常に短時間の電場パルスの使用に基づき、これにより可逆的電気的膜透過（いわゆる電気穿孔）がもたらされる。ホルモン、タンパク質、ＲＮＡおよびＤＮＡといった多くの分子を、電気穿孔法を用いて生細胞に導入することができる。誘電泳動的に（ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃａｌｌｙ）接触した細胞の場合、接触領域における膜透過性は細胞の融合をもたらすが、これはハイブリッド細胞の作製に使用することができる（電気融合）。
【０００３】
哺乳類細胞の電気穿孔法／融合法には、通常、数ｋＶ／ｃｍの場強度および数十μｓ（からｍｓ）のパルス持続時間が用いられる。適用場（ａｐｐｌｉｅｄ ｆｉｅｌｄ）は膜の指数関数的変化をもたらすが、これは、誘導膜内外電圧Ｖｇによって付与される：
【化５】
【０００４】
ここにおいて、ａは細胞の半径、θは適用場Ｅ０の方向に対する極角であり、τｍは膜変化の時定数である。Ｖｇが臨界値Ｖｃ＝１ボルトを越えたときに、膜透過が起こる。
【０００５】
膜変化の時定数τｍは、以下の式を用いて算出される：
【化６】
【０００６】
ここにおいて、Ｃｍ［μＦ／ｃｍ２］は、表面特異的膜キャパシタンスであり、σｉおよびσｅは、細胞質の、および外部または融合培地の特異的伝導率[ｍＳ／ｃｍ]である。
【０００７】
式１において細胞の半径として７μｍという代表値を用いる場合、電極に面した膜領域（θ＝０）における透過性の最小臨界場強度を算出することが可能である（パルス期間が膜の弛緩時間よりもずっと長い条件ｔ＞＞τｍにおいて）：Ｅｋｒｉｔ＝Ｖｃ／（１．５×ａ）≒１ｋＶ／ｃｍ。哺乳類細胞の場合、時定数τｍは、０．１から１μｓの範囲にある（式２：Ｃｍ＝１μＦ／ｃｍ２、σｉ≒５ｍＳ／ｃｍ、σｅ＝０．１−１０ｍＳ／ｃｍ、以下参照）。使用される１０−１００μｓというパルス期間は、それゆえτｍよりもずっと長く、式１はＶｇ＝１．５ａＥ０ｃｏｓθに単純化される。
【０００８】
電気穿孔法および電気融合法の効率は、パルス適用の際に、弱い伝導性の、低張性培地を用いることで大きく増大させることができることが先行技術において既知である［Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ＆ Ｎｅｉｌ， １９９６； Ｓｕｋｈｏｒｕｋｏｖ ｅｔ ａｌ． １９９８］。そのような培地は、主要な浸透圧剤として、様々な糖および糖誘導体を含む。一般に使用される一定の糖には、グルコース、ソルビトール、イノシトールまたはマンニトールといった単量体炭水化物、およびスクロースまたはトレハロースを含む二糖類が含まれる［Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ＆ Ｎｅｉｌ， １９９６］。
【０００９】
浸透圧および伝導率の減少は、電気穿孔法および電気融合法において多くの目的を果たす：
１）誘導される膜電圧は細胞半径に直線的に依存するため（上記式１参照）、細胞の低浸透圧性膨潤が膜透過を促進する。
２）外部伝導率の減少は、細胞膜上の一過的電気変形力（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒｃｅ）ＦＤＥＦのため、電気的注入（ｅｌｅｃｔｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を大きく改善する。
【化７】
【００１０】
σｉ＝σｅのとき、変形力（ｄｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒｃｅ）は無い状態となる：ＦＤ＝０。σｉ＜σｅの条件のもとでは、伸長力（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆｏｒｃｅ）ＦＤが、場方向において細胞膜に作用し、この力の振幅はσｅの減少とともに増加する（式３）。同時に、σｅの減少は、電気的注入された分子の量のかなりの増加をもたらす［Ｓｕｋｈｏｒｕｋｏｖ ｅｔ ａｌ．， １９９８］。
【００１１】
３／４）電気融合法では、低伝導度の培地は必須である。変形力の場合と同様に、細胞の電気分極または誘起細胞双極子（ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｉｐｏｌｅ）μｃ（式４）およびＭＨｚの範囲（１−１０ＭＨｚ）における陽性誘電泳動力（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｆｏｒｃｅ）（式５）は、σｅが減少するにつれて増大する［Ｊｏｎｅｓ，１９９５］：
【化８】
【００１２】
ここにおいて、εｅε０＝８０×８．８５ １０−１２Ｆ／ｍが、水性外部培地の誘電率である。∇Ｅ０２という用語は、場の不均質性を反映する。σｅの減少はまた、双極子／双極子相互作用の増大をもたらし、このことは、融合のパートナーの相互の誘引を促進する。
【００１３】
５）上述した物理的効果に加えて、低浸透圧性膨張は、細胞骨格の分解、細胞膜の平滑化（微絨毛の引っ込み）及び膜成分の移動性の増大により、電気融合を促進する。
【００１４】
電気的形質移入／電気穿孔法および電気融合法の広範な使用にも関わらず、未だ現在、使用される方法には多くの未解決の問題が存在する。例えば：
（１）特に「場−耐性」細胞種の場合における、低い形質移入および融合率、
（２）電気穿孔／融合後の高い細胞死亡率、
（３）形質移入および融合率の、考慮すべき「バッチごとの」ゆらぎ、および
（４）しばしば生じる、電気的注入または融合場に関する再現性のゆらぎ。
【発明の目的】
【００１５】
本発明の１つの目的は、それゆえ、効率および再現性が増大した、新規の改善された細胞の電気的操作法を提供することである。関連する更なる目的は、従来の電気的操作法、特に電気穿孔法および電気融合法を改善する手段を提供することである。
【００１６】
発明者らによる詳細な実験は、驚くべき結果をもたらした。すなわち、処理培地、特に低浸透圧性処理培地に親油性イオンを添加することにより、細胞の電気的操作法（例えば、電気穿孔法および電気融合法など）の効果および再現性を大きく増大させることが可能であり、ならびに、特に電気的操作を施された細胞の収率および生存率を大きく増大させることが可能であることである。
【００１７】
従って、上述した目的は、本発明に従い、請求項１に記載の細胞を電場で処理する方法（ここにおいて処理培地は親油性イオンを含む）および請求項２３に記載のこれらの親油性イオンの使用を提供することにより達成される。本発明の具体的なおよび好ましい実施態様は、従属する請求項の主題である。
【発明の詳細な説明】
【００１８】
本発明の出発点は、多くの細胞、特に哺乳類細胞が、特に、典型的に電気穿孔法／電気融合法の際に存在するような低浸透圧性条件の下で、複雑な体積調節を行うことができるという実験的証拠であった。
【００１９】
近年の実験［Ｒｅｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００４］から、低浸透圧性糖培地において、急速な細胞の初期膨張の後、使用する糖に依存して、ゆっくりとした二次体積増加および細胞の収縮の両方が生じる可能性があることがわかった。ともに、いわゆる体積感受性チャネルを介した、細胞質基質からの電解質の急速な流出をもたらし得る。
【００２０】
オリゴ糖（例えば、トレハロース、スクロースまたはラフィノース）で置換された低浸透圧性穿孔および融合培地では、調節性体積減少（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｖｏｌｕｍｅ ｄｅｃｒｅａｓｅ）（ＲＶＤ）が、近年分析される全てのヒトおよび哺乳類細胞の場合に生じる。このことは、低浸透圧培地における短期の膨張段階（１−３分）の後に、細胞は１５−２０分以内に（連続する低浸透圧ストレスにも関わらず）本来の体積を取り戻すことができることを意味する。
【００２１】
その他の著者による電気生理学的研究は、細胞の最初の膨張は、体積感受性塩素イオンチャネルを活性化し、このことが、細胞からの塩素イオンの流出および細胞膜の脱分極をもたらすようであることを明らかにしている。膜の脱分極は、電圧依存的Ｋ＋チャネルおよびＫ＋流出を活性化する。浸透圧により誘導される水の流出とともに、正味ＫＣｌ流出は、正常（すなわち等張性）細胞体積の回復をもたらすと考えられる［Ｆｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００２； Ｌａｎｇ，１９９８］。
【００２２】
オリゴ糖と対照的に、単量体糖誘導体（例えば、ソルビトール、イノシトールまたはグルコース）の低浸透圧性溶液ではＲＶＤが起こらない［Ｒｅｕｓｓ ｅｔ ａｌ．， ２００４］。ある種の細胞では、細胞の二次的なゆっくりとした膨張さえ観察される。オリゴ糖と単糖との間の違いは、体積感受性チャネル（ＶＳＣ）のサイズ選択性によって説明されるだろう。そのようなチャネルは、哺乳類細胞の膜に遍在する［Ｋｉｒｋ，１９９７；Ｓｔｒａｎｇｅ，１９９４］。
【００２３】
しかしながら、ＲＶＤの起こらない培地（例えば、イノシトールまたはソルビトール置換培地）においてでさえ、低浸透圧ストレスは、電解質のかなりの消失および細胞質基質の伝導率の低下をもたらす（電気的回転スペクトル（ｅｌｅｃｔｒｏｒｏｔａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒａ）による実施例（図７Ａ）により実証される）。
【００２４】
細胞質基質からのイオン消失は、細胞質基質の伝導率σｉを減少させ、その結果として、穿孔および融合関連変形力（式３）、細胞の分極μｃ（式４）および誘電泳動力（式５）を大きく減少させる。さらに、細胞質基質からのイオン流出は、細胞の生命力の相当の消失をもたらす。
【００２５】
これらの効果は、部分的にまたは完全に、電気穿孔／電気融合の低浸透圧培地の陽性効果を相殺し得る。
【００２６】
しかしながら、現在までに、低浸透圧培地における細胞、特に哺乳類細胞の複雑な体積応答および関連するイオン流出について、電気穿孔および電気融合との関連性に関しては文献で議論されていなかった。
【００２７】
本発明は、親油性イオン（特に陰イオン）の処理培地への添加が、この体積調節を特に抑制し、それにより電気穿孔法および電気融合法の効率を大きく増大させることができるという驚くべき実験的証拠に特に基づく。
【００２８】
親油性陰イオンの細胞膜への吸収または取り込みは、おそらく、体積調節に関係するイオンチャネルの阻害をもたらす。あるいは、親油性イオンが直接または間接的に、チャネルの開放確率またはその他の輸送特性を調節する可能性がある。これらの両モデルから、低浸透圧ストレスの際の細胞質基質からのイオン消失は、親油性イオンを使用する際に大きく減少することが導き出せる。一方で、細胞体積は結果的に安定化し、他方で、イオン含有量および細胞質基質の伝導率は高いレベルに保たれる。
【００２９】
作用機構に関する何れかの理論に限定されることを望まず、特定のイオンチャネルのこの阻害は、親油性イオンの膜への吸収および／または取り込みによる、膜電圧に応じた細胞の膜キャパシタンスにおける変化（特に増大）の結果であると、現在のところ考えられる。
【００３０】
本発明者らによる広範な実験により、膜電圧に応じた親油性イオンにより誘導される膜キャパシタンスにおける変化は、通常、特定の関係に従い、および、好ましくは、電圧Ｖｍａｘ（その電圧において、キャパシタンスＣ（Ｖｍａｘ）における増大が最大である）を有した対称的なまたは非対照的な釣鐘状曲線の挙動を有していることがわかった。
【００３１】
釣鐘状曲線のパラメーターは、親油性イオンの化学的性質に依存し、および膜（または細胞の種類）の性質に依存する。親油性イオンの釣鐘状曲線の電圧依存性に基づいて、膜の親油性イオンの分布について結論が出せる。
【００３２】
キャパシタンスの最大の増加が確認される膜電圧において、膜の両面上における親油性イオンの均一な分布が現れるであろう。対照的に、親油性イオンで最も極度な不均一な分布（完全に、膜のサイトゾル側または細胞外側の両方における）は、親油性イオンによるキャパシタンスの増加を測定できない場合に現れる。親油性イオンの不均一な分布は、膜の一方の面における表面電位の有意な減少（ΔＶ〜−４００ｍＶまで）につながらなければならない。これは、通常、膜全体の電位を通した急激な変化をもたらす。この「膜非対称」効果は、さまざまな方法で処理された細胞の電気的操作を容易にすることができる：
１）表面電位の急激な減少は、膜全体の急勾配の電位曲線をもたらし、あまりに急勾配であるために、局所浸透が生じ、または、局所浸透が重ね合わさった外部場（ｓｕｐｅｒｐｏｓｅｄ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｆｉｅｌｄｓ）によって促進される（電気穿孔法、電気融合法）。
２）電位の変化した曲線は、膜における電圧依存的輸送系への影響をもたらす（電圧調節）。
３）「膜非対称」の他に、全体として、細胞の「半球非対称（ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ ａｓｙｍｍｅｔｒｙ）」が生じるだろう。これは、２つのやり方で電気的浸透を促進する。細胞の一方の側面では、浸透のための電位にほとんど既に達しており、外的に適用される浸透電圧は、標準より低く選ぶことができる。細胞のもう一方の側面では、適用される電位勾配は、外的に適用される浸透電圧にとって「好ましくない」。細胞のこの側面は、従って、親油性イオンによって「保護されている」。あるいは、これは、外的な場の振幅の状況または適用場のパルスの長さ／短さに使用することが可能である。両半球は、異なる荷電時間を有するだろう。このことは、この「非対称の」浸透が、細胞において、標準的な浸透よりも非常に穏やかなことを意味する。
【００３３】
この知見は、あらかじめ決定した条件の下で膜キャパシタンスの変化に対するそれらの効果を決定することによって、特に適した親油性イオンを選択することを可能にする。
【００３４】
そのような選択のプロセスは、一般的に以下の工程を含む：
−所定の膜電圧に応じて生物学的細胞の電気的膜キャパシタンスを測定すること、ここにおいて、親油性イオンによって誘導される膜キャパシタンスの電圧依存性は、処理培地中の多くの異なる親油性イオンで測定される、および
−親油性イオンによって誘導される細胞の膜キャパシタンスが、予め決定した選択基準を満たす親油性イオンを同定および選択すること。この選択基準は、例えば、特定の膜電圧における釣鐘状曲線の形状または位置であってよい。
【００３５】
望ましい結果および用途に依存して、膜キャパシタンスが細胞の本来の膜電圧において最小となる（すなわち、釣鐘状曲線の低分極状態（ｈｙｐｏｐｏｌａｒｉｚｅｄ）のまたは高分極（ｈｙｐｅｒｐｏｌａｒｉｚｅｄ）された側面（ｆｌａｎｋ）に位置する）ようなこれらの親油性イオン、または膜キャパシタンスが細胞の本来の膜電圧で最大となるこれらの親油性イオンを選択することが可能である。
【００３６】
本発明の１つの実施態様において、これらの親油性イオンは、膜キャパシタンスが、細胞の本来の膜電圧において、わずかに増加するまたは増加しない値を有するように選択され、すなわち、本来の膜電圧において漸減する側面（ｆｌａｎｋ）を有する特徴的な釣鐘状曲線を有する親油性イオンが選択される。この場合、親油性イオンは、おそらく、本来の膜電圧において不均一に膜を通して分布すると考えられ、上記のような有益な非対称効果を生じると考えられる。このことは、例えば、非常に弱い伝導性の融合培地にさらされる過分極された細胞に関する。
【００３７】
膜キャパシタンスが細胞の本来の膜電圧において最大となる親油性イオンは、高い膜キャパシタンスまたは親油性イオンの均一な分布が有益となる用途に使用することができる。この例の１つとして、不均質な膜構造を有する細胞であって、このようにしてより均一な膜電荷が付与される細胞が含まれ、例えば、負に荷電するホスファチジルセリンが主に原形質膜のサイトゾル側に位置する大部分の哺乳動物細胞が含まれる。
【００３８】
本来の膜電圧（すなわち適用場なしの状態）は、外部の浸漬培地（処理培地）と細胞の内部との間の浸透性イオンのイオン勾配に依存するので、処理培地に塩類を添加することによってこれを調整することができる。適切な可溶性塩類は、例えば、ナトリウム、カリウムまたはバリウムイオンを含んでよいが、これらに限定されない。
【００３９】
膜キャパシタンスの変化は、一方で親油性イオンの選択におよび他方で本来の膜電圧の変化に影響を受け得るため、このことは、非変化膜電圧にてこの電圧で釣鐘状曲線の望ましい形状（例えば側面（ｆｌａｎｋ）または最大値）を有する親油性イオンを選択すること、または、所定のイオンのために釣鐘状曲線の適当な区画に相当する電圧へと本来の膜電圧を最適に変えることのどちらによっても、親油性イオンの望ましい分布が得られることを意味する。
【００４０】
（例えば、細胞周期同期化細胞を用いることにより、適切な塩条件によって膜電位を調整することにより）細胞を特異的な膜電位に調整することの別の長所は、結果のより良い再現性にある。
【００４１】
すでに言及したように、親油性イオンにより誘導される膜キャパシタンスの変化は、低浸透圧培地における細胞の体積調節を完全にまたは部分的にスイッチオフするために使用することができる。上述のように、このことは、電解質の損失のかなりの減少をもたらし、それによって電気穿孔法または電気融合法といった電気的操作法のための枠組みとなる条件を改善する。サイトゾルからのイオンの喪失は、サイトゾルの伝導率σｉを減少させ、その結果、穿孔および融合に関連する変形力（式３）、細胞極性μｃ（式４）ならびに誘電泳動力（式５）が大きく減少する。さらに、サイトゾルからのイオン流出は、細胞の活力のかなりの減少につながる。
【００４２】
これらのネガティブな効果を除去することにより、電気的操作法の効率および再現性を大きく増大させることが可能である。
【００４３】
上記の知見から明らかなように、親油性イオンの存在またはそれによって誘導される膜キャパシタンスの変化は、それでも、非低浸透圧性条件（例えば等張性条件）の下でさえ、電気的操作法にて要求されるまたは必要な膜浸透を大きく促進する膜の変化をもたらし得る。従って、本発明による親油性イオンの使用はまた、非低浸透圧性培地における、電気穿孔法または電気融合法といった電気的操作法のより簡単でより効率的な実施を可能とする。細胞に対する低浸透圧性ストレスの回避には、大きな利点があり、いずれにせよ、操作した細胞の生存率に有利な影響を及ぼす。
【００４４】
本発明による方法の適用または本発明による親油性イオンの使用に適した細胞は、原則として、天然または合成起源の全ての細胞である。合成細胞とは、例えば合成膜被覆小胞（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｃｏｖｅｒｅｄ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）、リポソームまたはミセルであってよい。天然の細胞は、原核細胞、例えば細菌もしくは酵母、または真核細胞、例えば動物または植物細胞を含む。好ましい動物細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。好ましい実施態様の１つにおいて、細胞は生細胞である。
【００４５】
本発明によって使用される親油性イオンは、陽イオン、陰イオンまたは陽イオンと陰イオンとの混合物である。
【００４６】
陽イオンは、特に植物細胞の場合の使用に好ましく、一方で陰イオンは、特に動物細胞、特に哺乳類細胞の場合に好ましい。
【００４７】
本発明によって用いられる陽イオンは、１種から成ってよく、または多くの異なる陽イオンを含んでもよい。一般的に、使用される親油性陽イオンは、親油性の金属複合体、親油性の有機金属化合物および親油性の有機化合物（少なくとも１つの正に荷電する官能基を含む）の陽イオンを含む陽イオンの群に由来する少なくとも１つの物質を含むだろう。特定の例は、レニウムヘキサカルボニル（Ｒｅ（ＣＯ）６）＋、テトラフェニルホスホニウム化合物またはテトラフェニルアルセニウム（ａｒｓｅｎｉｕｍ）化合物である。更に適した化合物は、日常的な実験によって当業者が困難なく決定することができる。
【００４８】
本発明によって使用される陰イオンは、１種から成ってもよく、また多くの異なる陰イオンを含んでもよい。一般的に、使用される親油性陰イオンは、親油性の金属複合体、親油性の有機金属化合物および親油性の有機化合物（少なくとも１つの脱プロトン化できる官能基を含む）の陰イオンを含む陰イオンの群に由来する少なくとも１つの物質を含むだろう。
【００４９】
本発明によって使用することができる陰イオン（特に親油性の金属複合体）の特定の非限定的な例は、以下の式のものを含む。
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【００５０】
好ましくは、親油性陰イオンは、親油性のタングステン複合体（ＬＴＣｓ）、特に親油性のタングステンカルボニル複合体、ジピクリルアミン（ＤＰＡ）およびその誘導体の陰イオン、少なくとも１つのカルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸塩、チオ硫酸塩もしくはチオシアン酸塩基、特にアラキドン酸を含む親油性の有機化合物の陰イオン、置換型または非置換型テトラフェニルホウ酸塩またはフェニルジカルバウンデカンデカボラン（ｐｈｅｎｙｌｄｉｃａｒｂａｕｎｄｅｃａｎｅｄｅｃａｂｏｒａｎｅ）（ＰＣＢ）の陰イオンまたはテトラシアノホウ酸塩もしくはテトラトリフルオロメチルホウ酸塩の陰イオンを含む陰イオンの群から選択される少なくとも１つの物質を含む。
【００５１】
特に好ましくは、親油性陰イオンは、以下の式の陰イオンからなる群から選択される：
【化１３】
【００５２】
ここにおいて、（１）は、［Ｃ１２Ｈ４Ｎ７Ｏ１２］−，２，２’，４，４’，６，６’−ヘキサニトロジフェニルアミド（ジピクリルアミン＝ＤＰＡ）；（２）は、Ｅｔ４Ｎ［Ｗ（ＣＯ）５（ＳＣＮＯＣ６Ｈ４）］，テトラエチルアンモニウムベンゾキサゾリジン−２−チオ−１−イル−ペンタカルボニルタングステンの陰イオン（ＭＷ６０４）（ＷＯと省略）；（３）は、Ｅｔ４Ｎ［Ｗ２（ＣＯ）１０（μ−Ｓ２ＣＨ）］，テトラエチルアンモニウムデカカルボニル−μ−ジチオホルメート（ｄｉｔｈｉｏｆｏｒｍｉａｔｏ）−ジタングステンの陰イオン（ＭＷ７２５）（以降、ＬＴＣ−（「親油性タングステン複合体」）またはＷＷと省略）；（４）は、Ｎａ［Ｂ（Ｃ６Ｈ５）４］，テトラフェニルホウ酸ナトリウムの陰イオン（ＭＷ３４２）である。
【００５３】
同じまたは異なる濃度で、同時にまたは一時的連続的（ｉｎ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｓｕｃｃｅｓｓｉｏｎ）に、多くの異なる性質の親油性イオンを用いることにより、親油性イオンの個々の特性の「重なり（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）」を達成することができる。このことは様々な目的に有利である可能性があり、例えば、干渉により影響を受けにくい、より強力な、すなわち再現性がある方法手順を確実にするために有利である可能性がある。
【００５４】
本発明に用いることができる親油性イオンは、当該分野において周知であり、および商業的に得ることができまたは既知の日常的方法によって作製することができる化合物である。
【００５５】
原則として、適切なイオンには、キャパシタンスの増加が、膜を介した電圧（ｔｒａｎｓ−ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｏｌｔａｇｅ）に応じて対称または非対称の釣鐘状曲線を持つように、膜キャパシタンスを増加させ得る全てのイオンが含まれる。このことは、幾つかのイオン（タングステン化合物、ＤＰＡ、その他）のための例として示される。
【００５６】
本発明の主要な使用の１つは生細胞の電気的操作法であるため、親油性イオンは、この場合、生細胞に生理的適合でなければならない。一部の適用のために、使用する親油性イオンがＵＶ光によって分解可能であり、生細胞に生理的適合である分解生成物を作り出すことが特に好ましい。両方の条件は、例えば上記式３の親油性陰イオンタングステン複合体の場合に理想的に満たされる。同様の有効性、適合性および同様の分解挙動を有する同様の化合物を、困難なく製造できることは、当業者にとって明白である。
【００５７】
本発明によると、親油性イオンは、一般的に、細胞の膜透過性を変えるために電場で細胞を処理する方法において用いられ、当該方法は少なくとも以下の工程を含み：
−処理培地（２）中において少なくとも１つの細胞（１）を提供すること、および
−細胞（１）を少なくとも１つの電気的な電圧パルスにさらすこと、
以下の工程によって特徴付けられる：
−処理培地（２）に親油性イオンを添加すること。
【００５８】
そのような方法は、一般に、細胞の膜透過性を変化させる様々な既知のまたは考えられる電気処理法（この方法において、細胞は電気的電圧パルスにさらされる）、および特に電気的形質移入法／電気穿孔法または電気融合法を含む。
【００５９】
親油性イオンは、一般に、１ｎＭから１００μＭ、好ましくは０．１μＭから６０μＭ、特に好ましくは１μＭから５０μＭの範囲の濃度で処理培地（２）に添加される。
【００６０】
本発明による方法の特定の実施態様の１つにおいて、浸透圧的に活性な物質もまた、少なくとも１つの生物学的細胞（１）に対する低浸透圧ストレスを発生させるために処理培地（２）に添加される。そのような物質は、この目的のために知られる全ての物質を含み、好ましくは単糖および／または二糖、例えばスクロース、トレハロース、グルコース、マンニトール、イノシトール、ソルビトール等を含む。
【００６１】
好ましくは、生物学的細胞（１）を電気的電圧パルスへさらす工程は、浸透圧的に活性な物質の添加の後の遅延時間の後行われ、当該遅延時間は、好ましくは、１５秒から１０分の範囲で選択される。
【００６２】
本発明者らによる実験は、電気的形質移入／穿孔法および電気融合方法の場合、場パルスの適用前の低浸透圧ストレスの期間は、これらの方法の効率に大きく影響を及ぼすことを明らかにした。
【００６３】
生物物理学的実験および容積測定実験に基づいて、電気的操作法プロトコールにおける低浸透圧処理の持続時間をかなり最適化することが可能となった。これらの実験において、表１および２に示される組成を有する低浸透圧性穿孔および融合培地を用いた。適した等張性培地もまた、細胞を洗浄するために使用した。
【００６４】
ａ） 電気融合法：
生ハイブリッド細胞の非常に高い収率は、パルス適用のタイミングを最適化することによって達成することができた。ハイブリッドの収率は、パルス適用前の低浸透圧ストレスの持続時間に強く依存していた。２分（急速に膨潤する相の終わりに相当する）という短い低浸透圧処理は、最も良い結果を与えた。より長いインキュベーション時間（例えば、２０または４０分）は、融合収率を低下させた（データは示していない）。
【００６５】
ｂ） ＧＦＰプラスミドの電気的形質移入：
電気融合法の場合と同様に、短い低浸透圧処理（すなわち、パルス応用前の２分）は、一般に、１０分というより長いインキュベーションの場合よりも、ＧＦＰが形質移入された細胞の非常に高い収率を与えた（表４）。一般に、インキュベーション時間依存的な形質移入収率（ＴＹｓ）は、異なる細胞種に対する細胞サイズ（式１参照）における一時的な変化に非常によく相関した。
【００６６】
より長いインキュベーションは、常に、細胞増殖（ＰＦ、例えばＩｎｏｓｉｔｏｌ１５０におけるＨＥＫ細胞の場合４７から３３％まで）の減少をもたらし、このことは、（電解質の減少による）細胞の生存率の低下を表す。
【００６７】
電気穿孔法／形質移入または電気融合法の効率の低浸透圧ストレスの持続時間に対するこの強い依存性は、低浸透圧ストレスのための時間スパンを最適化することによって、親油性イオンを用いる上記の電気的操作法を更に改善するために使用することができる。すでに、親油性のイオンを用いない場合でさえ、ときとしてこの時間最適化によって非常に高い効率が達成されており、これらの効率は、親油性イオンにより更にわずかに増加できただけであったことに留意すべきである。しかしながら、いずれにせよ親油性イオンの使用は、より強力なプロトコール（即ち、高い効率を達成するための最適時間値の正確な設定に基づかないプロトコール）という付加的な利点をもたらす。これは、これらの方法の産業応用における非常に実用的な利点である。
【００６８】
好ましくは、処理培地（２）への親油性イオンの添加は、これらの親油性イオンで処理しようとする細胞の膜のドーピングを行う電圧パルスの前に、十分な濃度でおよび十分な時間で行われる。この文脈における「ドーピング」という用語は、膜上でのイオンの吸着および／または膜におけるイオンの取り込みを意味する。適切な濃度および持続時間（通常、分の振幅のオーダー）は、本願に開示される知見に基づいて、日常的な実験で当業者によって困難なく決定され得る。
【実施例】
【００６９】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【００７０】
以下の例は、本発明による特定の実施態様を説明するものであるが、これらに本発明が限定されることを意味するものではない。
【００７１】
［例１］親油性陰イオンをドーピングした細胞膜を有する細胞の電気穿孔法／形質移入法
電気的形質移入のために、Ｊｕｒｋａｔ−Ｔ−リンパ球、ＨＥＫ２９３細胞およびマウス線維芽細胞Ｌ９２９細胞を、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のウシ胎児血清を添加した、ＲＭＰＩ完全増殖培地（以下「完全増殖培地」をＣＧＭと省略）にて、５％ＣＯ２下３７℃で培養した。電気的形質移入の前に、ＥＤＴＡのパルス培地への混入を回避するため、接着細胞（すなわちＨＥＫ２９３細胞およびＬ９２９細胞）を、ＥＤＴＡを含まない０．５ｍｇ／ｍｌトリプシンで脱離させた。酵素は、ＣＧＭによる洗浄で除去した。
【００７２】
電気的形質移入法／穿孔法のプロトコールは、以下の工程を含むものとした：
１．細胞を等張性洗浄溶液（ＩＷＳ−Ｐ、表１参照）で洗浄する工程；
２．緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ドイツ、ハイデルベルグ）を１０μｇ／ｍｌで含む低張性パルス溶液（ＨＰＳ，表１参照）に細胞を懸濁する（１０６細胞／ｍｌ）工程；
３．ＨＰＳ中で２から１０分間細胞をインキュベートする工程；
４．Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ドイツ、ハンブルグ）および４ｍｍの間隔で平らなアルミニウム電極を設けたキュベットを用いて、室温（ＲＴ、約２２−２４℃）にて、細胞サンプル（〜８００μｌ）に単一の指数関数的に減少するパルスを適用する工程；
５．続いて、ＲＴで１０分間、パルス培地中で細胞をインキュベートする工程；
６．予め加温した５ｍｌのＣＧＭに細胞を穏やかに移し、最大のＧＦＰ発現を達成するために２日間培養する工程；
７．フローサイトメトリーおよび電気的細胞計数器を用いて分析する工程。
【００７３】
Ｌ９２９細胞は、１００ｍＯｓｍのパルス培地（ＨＰＳ、表１）中にて、３ｋＶ／ｃｍの場強度および１００μｓの持続時間のパルスによって、電気的形質移入した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、１００ｍＯｓｍのＨＰＳ中で、１．２ｋＶ／ｃｍおよび４０μｓで形質移入した。ＨＥＫ細胞は、１５０ｍＯｓｍのＨＰＳパルス培地中で、１．５ｋＶ／ｃｍおよび７０μｓで処理した。
【００７４】
望ましくない電解質の損失を防止または最小化し細胞体積を安定化させることに関する親油性陰イオンの効果を分析するため、上記式３の親油性タングステン複合体（Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ Ｔｕｎｇｓｔｅｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＬＴＣと省略）を１０μＭで異なる穿孔培地に混合した。
【００７５】
表４は、異なる培地組成および低浸透圧ショックの時間条件によって得られた結果を示す。
【００７６】
ＬＴＣの添加は、形質移入効率のかなりの増大をもたらし、特に低張培地でのインキュベーション時間が長い場合ほどそうであった。
【００７７】
形質移入の収率の改善はまた、マーカーとしてのプロピジウムヨウ化物（図８）の電気的注入による付加的な実験にて確認することができた。この場合、パルス培地は、２５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（通常膜透過性でなく、核酸に結合した後強い蛍光を示す陽イオン性色素）を含む。ＰＩは２つの役目を果たし、第１に、生細胞と死細胞との区別（短期活力試験（ｓｈｏｒｔ ｖｉｔａｌｉｔｙ ｔｅｓｔ））を可能にする色素としての役目、および、第２に、一過的に電気的に誘導される膜透過性の指標としての役目である。細胞のＰＩ染色は、フローサイトメトリーによって、パルス適用の後１０−１５分以内に分析した。
【００７８】
［例２］細胞の電気融合法
電気融合法のために、ヒトＢリンパ球を、健常な提供者の末梢血から単離し、２．４μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ−Ｌ）で既知の通りに活性化した。活性化された細胞は、５％に濃縮されたＣＯ２を含む空気中にて、３７℃で培養した。細胞密度が〜５ｘ１０６細胞／ｍｌを上回ったとき、細胞を１ｘ１０６細胞／ｍｌの密度に希釈した。活性化Ｂリンパ球を、標準条件で培養したヒト／マウスヘテロミエローマ細胞株Ｈ７３Ｃ１１（以降、Ｈ７細胞と呼ぶ）と融合させた。
【００７９】
電気融合法のため、Ｂリンパ球およびＨ７細胞をＣＧＭにおいて１：１の比率で混合し、２００ｘｇで１０分間遠心分離してペレットにし、７５または１００ｍＯｓｍの重量モル浸透圧濃度の、低浸透圧性で、糖を添加した融合溶液（ＨＦＳ）に再懸濁した。その後、細胞をＨＦＳで二回洗浄した（続いて、２００ｘｇで１０分間再度遠心分離し再懸濁した）。ＨＦＳ中の細胞懸濁液２００μｌを、２本のプラチナ導線が２００μｍ間隔に巻付けられたパースペックスチューブから成るらせん状チャンバーにピペットで入れた。最終的な細胞密度は、３ｘ１０５細胞／ｍｌであった。この標準的プロトコールによると、細胞を、第１の融合パルスの適用前に、洗浄工程の間、少なくとも２０分間低浸透圧ストレスにさらした。改善されたプロトコールにおいて、低浸透圧ストレスの持続時間は、等張性洗浄溶液（ＩＷＳ−Ｆ表２参照）を用いることにより、有意に減少した。
【００８０】
エッペンドルフＭｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒを、電気融合法のために用いた。細胞は、最初に、４５ＶＰＰ振幅および２ＭＨｚの頻度の交代性場（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ ｆｉｅｌｄ）によって、誘電泳動的に引き合わせた。高周波場をその後停止し、３０Ｖ振幅および１５μｓ持続時間の３つの方形波ＤＣパルスによって融合を開始した。その後、５ＶＰＰ振幅の２ＭＨｚの場を、引き続く融合工程の間、適した位置に細胞を保つために再び適用した。らせん状チャンバーを、次に、何れの干渉もせず、ＲＴで１０分間維持した。チャンバーを、その後、１ｍｌの等張性ＣＧＭで洗浄し、細胞を、２４穴のプレートの４つのウェル（それぞれ等張性ＣＧＭが１ｍｌ満たされている）に移した。２４時間後に、ハイブリドーマ細胞のみが増殖する選択性ＨＡＴ培地をウェルに添加した。ハイブリドーマコロニーを、電気融合の１−３週後に計数した。
【００８１】
親油性陰イオン（例えばＷＷ）の存在は、特に低浸透圧ストレスの持続時間がより長い場合に、電気融合の効率および再現性を大きく増大させた。特に、生き残るハイブリッド細胞の高い収率は、再現性よく得られた。
【００８２】
［例３］膜電圧に応じて、卵母細胞の場合における親油性陰イオンによって誘導される膜キャパシタンス曲線の決定
測定は、ＮＤ９６溶液中で、二電極電圧固定技術（ｔｗｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ｖｏｌｔａｇｅ ｃｌａｍｐ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を用いて、アフリカツメガエルの卵母細胞において行った。親油性陰イオンの存在下および非存在下において、膜キャパシタンスＣｍ（ＵＨ）を算出するため、電圧ランププロトコールを、ソフトウェアＣｌａｍｐｅｘ９．２（登録商標）でプログラムした。このため、まず、電位は定義された値に設定し、次に、電圧ランプ（ｄＵ／ｄｔ）は、定義された電圧まで上げた。（測定は、また、電圧固定なしで本来の膜電圧においても行った）。
【００８３】
ＮＤ９６溶液は、９６ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ Ｈｅｐｅｓを含み、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整した。ＮＤ９６＋２．８ｍＭ ＢａＣｌ２のために、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２および１ｍＭ ＭｇＣｌ２を、２．８ｍＭ ＢａＣｌ２で置き換えた。
【００８４】
測定のために、ＩＶ−ＶＩ段階のコラゲナーゼ処理した卵母細胞を使用した。
【００８５】
３つの異なる親油性陰イオン（化合物１から３）を用いた測定の結果を図４に示した。
【００８６】
１から３のイオンのためのキャパシタンスの増大の電圧依存性（「釣鐘状曲線」）の決定から、ＤＰＡおよびＷＯが、ほとんど同一の釣鐘状曲線を有することがわかる。対照的に、ＷＷ（ＬＴＣ）は、−１３０ｍＶに最大値をもつ大きく移動した釣鐘状曲線となった（対照的に、ＤＰＡおよびＷＯでは、それぞれ−７０ｍＶおよび−８０ｍＶである）。
【００８７】
従って、ＷＯおよびＤＰＡの場合における標準的な細胞電位では、親油性イオンの分布は、均一な分布に近い（ＶＭ＝−３０−−７０ｍＶ）と表されると想定される。対照的に、正常な細胞条件下でのＬＴＣ（ＷＷ）は、サイトゾル側では非均一に蓄積すると考えられる。
【参考文献】
【００８８】
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【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、本発明による方法の模式図を示す。
【図２】図２は、本発明による方法を実施するための実験装置の模式図を示す。
【図３】図３は、適切な親油性イオンを選択する方法の模式図を示す。
【図４Ａ】図４は、３つの異なる親油性陰イオンについての、膜に適用される電圧に応じた、卵母細胞の細胞膜のキャパシタンスにおける変化を示す「釣鐘状曲線」を示す。Ａ：ＤＰＡ（化合物１）；下部の２曲線は、測定系列の開始（四角）および終了（下向き三角形）における、親油性イオンＤＰＡがない場合の対照測定の結果を示す。上部の曲線（むくの円）は、細胞外の５０μＭ ＤＰＡの存在下における結果を示し、この下に位置する曲線（上向き三角形）は、細胞外の５０μＭ ＤＰＡおよび２．８ｍＭ ＢａＣｌ２の存在下における結果を示す。
【図４Ｂ】図４は、３つの異なる親油性陰イオンについての、膜に適用される電圧に応じた、卵母細胞の細胞膜のキャパシタンスにおける変化を示す「釣鐘状曲線」を示す。Ｂ：ＷＯ（化合物２）；下部の２曲線は、測定系列の開始（四角）および終了（下向き三角形）における、親油性イオンＷＯがない場合の対照測定の結果を示す。上部の曲線（上向き三角形）は、細胞外の１０μＭ ＷＯおよび２．８ｍＭ ＢａＣｌ２の存在下における結果を示し、この下に位置する曲線（むくの円）は、細胞外の１０μＭ ＷＯの存在下における結果を示す。
【図４Ｃ】図４は、３つの異なる親油性陰イオンについての、膜に適用される電圧に応じた、卵母細胞の細胞膜のキャパシタンスにおける変化を示す「釣鐘状曲線」を示す。Ｃ：ＷＷ（化合物３；ＬＴＣ）；下部の２曲線は、測定系列の開始（四角）および終了（下向き三角形）における、親油性イオンＷＷがない場合の対照測定の結果を示す。上部の曲線（むくの円）は、細胞外の１０μＭ ＷＷの存在下における結果を示し、この下に位置する曲線（上向き三角形）は、細胞外の１０μＭ ＷＷおよび２．８ｍＭ ＢａＣｌ２の存在下における結果を示す。
【図５】図５は、主な浸透圧薬剤としてソルビトールまたはトレハロースの何れかを含む強力に低浸透圧性の融合培地（７５および１００ｍＯｓｍ）における、活性化Ｂ−リンパ球（Ａ）およびＪｕｒｋａｔ細胞（ＢおよびＣ）の相対的体積の時間曲線を示す。低浸透圧性トレハロース培地（むくの円）において、両細胞種とも、最初の急速な膨潤後にＲＶＤを示した。対照的に、低浸透圧性ソルビトールは、Ｊｕｒｋａｔ細胞においてＲＶＤを無くし（データは示していない）または二次的膨潤を誘導しさえした（Ａ、中空の円）。タングステン複合体ＬＴＣは、Ｂ−リンパ球において部分的に、またはＪｕｒｋａｔ細胞において完全にＲＶＤを阻害した（ＡおよびＢにおける四角）。アラキドン酸は、Ｊｕｒｋａｔ細胞においてＲＶＤを無くした（Ｃ、四角）。
【図６】図６は、異なる、構造的に関連のない親油性イオン（化合物（１）（ＤＰＡ）、（２）（ＷＯ）および（４）（ＴＰＲ））（Ａ−Ｃ）によって、哺乳類細胞において完全にまたは部分的にＲＶＤが阻害されることを示す図である。これとは対照的に、親油性陽イオンであるテトラフェニルホスホニウム（ＴＰＰ、１０−５０μＭ）は、ＲＶＤに影響を与えない（Ｃ、四角）。
【図７】図７は、Ｈ７およびＪｕｒｋａｔ細胞の典型的な回転スペクトルを示す図である（ＡおよびＢ）。Ａ：Ｈ７細胞を、１２０μＳ／ｃｍという同一の伝導率で、等張性または低張性ソルビトール培地（むくおよび中空の円）にて１５−２０分インキュベートした。等張性条件と比較して、低浸透圧ストレスは、サイトゾルのピークｆｃ２のより低い頻度への大きな移動をもたらし、このことは、サイトゾルの伝導率σｉの有意な減少を意味する。Ｂ：未処理のコントロール（中空の円）と比較して、１０μＭ ＬＴＣは、付加的な抗場ピーク（ａｎｔｉ ｆｉｅｌｄ ｐｅａｋ）（ｆＬＴＣ）を引き起こし、また、ｆｃ２をより高い頻度へと移動させた。後者の効果は、サイトゾルからの電解質の消失の減少に起因し得る。
【図８】図８は、ヨウ化プロピジウムの電気的注入におけるＬＴＣの効果を示す図である。電気的に誘導されるＰＩ取り込みの、４０μｓのパルス持続時間での適用される場強度Ｅ０への依存性が示される。データポイントは、３回の独立したフローサイトメトリー定量によって決定した平均ＰＩ取り込み値である。試験した場強度の範囲内において、１０μＭ ＬＴＣ−で処理した細胞のＰＩ取り込み（むくの円）が、コントロール（中空の円）のものよりも大きな値を示した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の膜透過性を変えるために電場で細胞を処理する方法であって、以下の工程を含み：
−処理培地（２）中において少なくとも１つの細胞（１）を提供すること、および
−前記細胞（１）を少なくとも１つの電気的な電圧パルスにさらすこと、
以下の工程によって特徴付けられる方法：
−前記処理培地（２）に親油性イオンを添加すること。
【請求項２】
前記細胞の電気的処理法、特に電気穿孔法もしくは電気融合法である、またはこれらの方法を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が原核細胞または真核細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が生細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、天然であり、または合成膜被覆小胞、リポソームもしくはミセルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記親油性イオンが、前記処理培地（２）に１ｎＭから１００μＭの範囲の濃度で添加される、請求項１から５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記処理培地（２）への前記親油性イオンの添加が、これらの親油性イオンで処理しようとする前記細胞の膜のドーピングをもたらす、請求項１から６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記親油性イオンが、陽イオン、陰イオンまたは陽イオンおよび陰イオンの混合物である、請求項１から７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記親油性イオンが陰イオンである、請求項１から８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記親油性陰イオンが、少なくとも１つの脱プロトン化できる官能基を含む、親油性の金属複合体、親油性の有機金属化合物および親油性の有機化合物の陰イオンを含む陰イオンの群から選択される少なくとも１つの物質を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記親油性陰イオンが、親油性のタングステン複合体（ＬＴＣｓ）、特に親油性のタングステンカルボニル複合体、ジピクリルアミン（ＤＰＡ）およびその誘導体の陰イオン、少なくとも１つのカルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸塩、チオ硫酸塩もしくはチオシアン酸塩基、特にアラキドン酸を含む親油性の有機化合物の陰イオン、置換型または非置換型テトラフェニルホウ酸塩またはフェニルジカルバウンデカンデカボラン（ＰＣＢ）の陰イオンまたはテトラシアノホウ酸塩[Ｂ（ＣＮ）４]−もしくはテトラトリフルオロメチルホウ酸塩[Ｂ（ＣＦ３）４]−の陰イオンを含む陰イオンの群から選択される少なくとも１つの物質を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記親油性陰イオンが、以下の陰イオンを含む群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【化１】
【請求項１３】
前記親油性陰イオンが、生細胞に生理的適合である、請求項１から１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記親油性イオンが、ＵＶ光によって分解され、生細胞に生理的適合である分解生成物を作り出す、請求項１から１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記親油性イオンが、前記細胞の膜電圧に応じて、前記細胞の膜キャパシタンスＣを増大させる、請求項１から１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記膜電圧の依存性が、キャパシタンスＣ（Ｖｍａｘ）の増大が最大となる電圧Ｖｍａｘを有する対称性のまたは非対称性の釣鐘状曲線の挙動を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
以下の工程を含み、前記親油性イオンが予備的な実験の間に選択される、請求項１から１６の何れか１項に記載の方法：
−適用される膜電圧に応じて生物学的細胞の電気的膜キャパシタンスを測定する工程であって、ここにおいて、親油性イオンによって誘導される前記膜キャパシタンスの電圧依存性は、前記処理培地（２）中の多くの異なる親油性イオンで測定される工程、および
−親油性イオンによって誘導される前記細胞（１）の前記膜キャパシタンスが予め決定した選択基準を満たす、前記親油性イオンを同定および選択する工程。
【請求項１８】
前記膜キャパシタンスが、前記細胞（１）の本来の膜電圧において最小となるように、または請求項１６に定義される前記釣鐘状曲線の下降側面の１つに位置するように、これらの親油性イオンが選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記膜キャパシタンスが前記細胞（１）の本来の膜電圧において最大となるように、これらの親油性イオンが選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
以下の工程を含む、請求項１７から１９の何れか１項に記載される方法：
−前記細胞（１）の本来の膜電圧を調整するために、前記処理培地（２）に塩を添加する工程。
【請求項２１】
以下の工程を含む、請求項１から２０の何れか１項に記載の方法：
−少なくとも１つの生物学的細胞（１）に対する浸透圧ストレスを生じさせるために、前記処理培地（２）に浸透圧的に活性な物質を添加する工程。
【請求項２２】
前記生物学的細胞（１）を前記電気的電圧パルスにさらす工程が、前記浸透圧的に活性な物質を添加した後の遅延時間の後に行われ、前記遅延時間が１５秒から１０分の範囲で選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
処理培地（２）に添加するための親油性イオンの使用であって、当該培地において、細胞が、電気的電圧パルスを含む電場での処理にさらされる使用。
【請求項２４】
前記細胞が原核細胞または真核細胞である、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記細胞が生細胞である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記細胞が、天然であり、または合成膜被覆小胞、リポソームもしくはミセルである、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記電場での処理が、電気穿孔法または電気融合法であり、またはこれらの方法を含む、請求項２３から２６の何れか１項に記載の使用。
【請求項２８】
前記親油性イオンが陰イオンである、請求項２３から２７の何れか１項に記載の使用。
【請求項２９】
前記親油性陰イオンが、少なくとも１つの脱プロトン化できる官能基を含む、親油性の金属複合体、親油性の有機金属化合物および親油性の有機化合物の陰イオンを含む陰イオンの群から選択される少なくとも１つの物質を含む、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記親油性陰イオンが、親油性のタングステン複合体（ＬＴＣｓ）、特に親油性のタングステンカルボニル複合体、ジピクリルアミン（ＤＰＡ）およびその誘導体の陰イオン、少なくとも１つのカルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸塩、チオ硫酸塩もしくはチオシアン酸塩基、特にアラキドン酸を含む親油性の有機化合物の陰イオン、置換型または非置換型テトラフェニルホウ酸塩またはフェニルジカルバウンデカンデカボラン（ＰＣＢ）の陰イオンまたはテトラシアノホウ酸塩[Ｂ（ＣＮ）４]−もしくはテトラトリフルオロメチルホウ酸塩[Ｂ（ＣＦ３）４]−の陰イオンを含む陰イオンの群から選択される少なくとも１つの物質を含む、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記親油性陰イオンが以下の陰イオンを含む群から選択される、請求項３０に記載の使用。
【化２】
【請求項３２】
異なる性質の多くの親油性イオンが、同じまたは異なる濃度で、同時にまたは一時的連続的に使用される、請求項１から３１の何れか１項に記載の方法。
【請求項３３】
以下の群から選択される親油性金属複合体。
【化３】
【化４】
【請求項１】
細胞の膜透過性を変えるために電場で細胞を処理する方法であって、以下の工程を含み：
−処理培地（２）中において少なくとも１つの細胞（１）を提供すること、および
−前記細胞（１）を少なくとも１つの電気的な電圧パルスにさらすこと、
以下の工程によって特徴付けられる方法：
−前記処理培地（２）に親油性イオンを添加すること。
【請求項２】
前記細胞の電気的処理法、特に電気穿孔法もしくは電気融合法である、またはこれらの方法を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が原核細胞または真核細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が生細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、天然であり、または合成膜被覆小胞、リポソームもしくはミセルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記親油性イオンが、前記処理培地（２）に１ｎＭから１００μＭの範囲の濃度で添加される、請求項１から５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記処理培地（２）への前記親油性イオンの添加が、これらの親油性イオンで処理しようとする前記細胞の膜のドーピングをもたらす、請求項１から６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記親油性イオンが、陽イオン、陰イオンまたは陽イオンおよび陰イオンの混合物である、請求項１から７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記親油性イオンが陰イオンである、請求項１から８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記親油性陰イオンが、少なくとも１つの脱プロトン化できる官能基を含む、親油性の金属複合体、親油性の有機金属化合物および親油性の有機化合物の陰イオンを含む陰イオンの群から選択される少なくとも１つの物質を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記親油性陰イオンが、親油性のタングステン複合体（ＬＴＣｓ）、特に親油性のタングステンカルボニル複合体、ジピクリルアミン（ＤＰＡ）およびその誘導体の陰イオン、少なくとも１つのカルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸塩、チオ硫酸塩もしくはチオシアン酸塩基、特にアラキドン酸を含む親油性の有機化合物の陰イオン、置換型または非置換型テトラフェニルホウ酸塩またはフェニルジカルバウンデカンデカボラン（ＰＣＢ）の陰イオンまたはテトラシアノホウ酸塩[Ｂ（ＣＮ）４]−もしくはテトラトリフルオロメチルホウ酸塩[Ｂ（ＣＦ３）４]−の陰イオンを含む陰イオンの群から選択される少なくとも１つの物質を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記親油性陰イオンが、以下の陰イオンを含む群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【化１】
【請求項１３】
前記親油性陰イオンが、生細胞に生理的適合である、請求項１から１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記親油性イオンが、ＵＶ光によって分解され、生細胞に生理的適合である分解生成物を作り出す、請求項１から１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記親油性イオンが、前記細胞の膜電圧に応じて、前記細胞の膜キャパシタンスＣを増大させる、請求項１から１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記膜電圧の依存性が、キャパシタンスＣ（Ｖｍａｘ）の増大が最大となる電圧Ｖｍａｘを有する対称性のまたは非対称性の釣鐘状曲線の挙動を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
以下の工程を含み、前記親油性イオンが予備的な実験の間に選択される、請求項１から１６の何れか１項に記載の方法：
−適用される膜電圧に応じて生物学的細胞の電気的膜キャパシタンスを測定する工程であって、ここにおいて、親油性イオンによって誘導される前記膜キャパシタンスの電圧依存性は、前記処理培地（２）中の多くの異なる親油性イオンで測定される工程、および
−親油性イオンによって誘導される前記細胞（１）の前記膜キャパシタンスが予め決定した選択基準を満たす、前記親油性イオンを同定および選択する工程。
【請求項１８】
前記膜キャパシタンスが、前記細胞（１）の本来の膜電圧において最小となるように、または請求項１６に定義される前記釣鐘状曲線の下降側面の１つに位置するように、これらの親油性イオンが選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記膜キャパシタンスが前記細胞（１）の本来の膜電圧において最大となるように、これらの親油性イオンが選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
以下の工程を含む、請求項１７から１９の何れか１項に記載される方法：
−前記細胞（１）の本来の膜電圧を調整するために、前記処理培地（２）に塩を添加する工程。
【請求項２１】
以下の工程を含む、請求項１から２０の何れか１項に記載の方法：
−少なくとも１つの生物学的細胞（１）に対する浸透圧ストレスを生じさせるために、前記処理培地（２）に浸透圧的に活性な物質を添加する工程。
【請求項２２】
前記生物学的細胞（１）を前記電気的電圧パルスにさらす工程が、前記浸透圧的に活性な物質を添加した後の遅延時間の後に行われ、前記遅延時間が１５秒から１０分の範囲で選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
処理培地（２）に添加するための親油性イオンの使用であって、当該培地において、細胞が、電気的電圧パルスを含む電場での処理にさらされる使用。
【請求項２４】
前記細胞が原核細胞または真核細胞である、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記細胞が生細胞である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記細胞が、天然であり、または合成膜被覆小胞、リポソームもしくはミセルである、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記電場での処理が、電気穿孔法または電気融合法であり、またはこれらの方法を含む、請求項２３から２６の何れか１項に記載の使用。
【請求項２８】
前記親油性イオンが陰イオンである、請求項２３から２７の何れか１項に記載の使用。
【請求項２９】
前記親油性陰イオンが、少なくとも１つの脱プロトン化できる官能基を含む、親油性の金属複合体、親油性の有機金属化合物および親油性の有機化合物の陰イオンを含む陰イオンの群から選択される少なくとも１つの物質を含む、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記親油性陰イオンが、親油性のタングステン複合体（ＬＴＣｓ）、特に親油性のタングステンカルボニル複合体、ジピクリルアミン（ＤＰＡ）およびその誘導体の陰イオン、少なくとも１つのカルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸塩、チオ硫酸塩もしくはチオシアン酸塩基、特にアラキドン酸を含む親油性の有機化合物の陰イオン、置換型または非置換型テトラフェニルホウ酸塩またはフェニルジカルバウンデカンデカボラン（ＰＣＢ）の陰イオンまたはテトラシアノホウ酸塩[Ｂ（ＣＮ）４]−もしくはテトラトリフルオロメチルホウ酸塩[Ｂ（ＣＦ３）４]−の陰イオンを含む陰イオンの群から選択される少なくとも１つの物質を含む、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記親油性陰イオンが以下の陰イオンを含む群から選択される、請求項３０に記載の使用。
【化２】
【請求項３２】
異なる性質の多くの親油性イオンが、同じまたは異なる濃度で、同時にまたは一時的連続的に使用される、請求項１から３１の何れか１項に記載の方法。
【請求項３３】
以下の群から選択される親油性金属複合体。
【化３】
【化４】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００９−５０６７５６（Ｐ２００９−５０６７５６Ａ）
【公表日】平成２１年２月１９日（２００９．２．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２３１５８（Ｐ２００８−５２３１５８）
【出願日】平成１８年６月３０日（２００６．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６３８８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１２３７７
【国際公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【出願人】（５９１１２１６８３）エッペンドルフ アクチエンゲゼルシャフト (23)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年２月１９日（２００９．２．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月３０日（２００６．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００６３８８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１２３７７
【国際公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【出願人】（５９１１２１６８３）エッペンドルフ アクチエンゲゼルシャフト (23)
【Ｆターム（参考）】
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