親脂質性ヘパリン修飾体、その製造方法及び毛髪成長促進剤
【課題】健康な食用獣の肝、肺、腸、脾にあるヘパリンを材料とし、これを修飾して毛髪成長促進剤を提供する。
【解決手段】ヘパリンを過沃素酸で酸化し、次いで水素化硼素で還元して、抗血液凝固活性を実質的に喪失し、細胞増殖因子、サイトカイン類又は細胞接着因子との結合性を保持しているヘパリン修飾体において、その中のヘキスロン酸のジオール部分の炭素間結合を切断するとともに還元して作られた２個の隣接する第一級アルコール基のうち、少なくとも１個の第一級アルコール基を脂肪酸残基でエステル化して親脂質性ヘパリン修飾体を作り、これを有機溶剤含有の水に溶解して毛髪成長促進剤とする。
【解決手段】ヘパリンを過沃素酸で酸化し、次いで水素化硼素で還元して、抗血液凝固活性を実質的に喪失し、細胞増殖因子、サイトカイン類又は細胞接着因子との結合性を保持しているヘパリン修飾体において、その中のヘキスロン酸のジオール部分の炭素間結合を切断するとともに還元して作られた２個の隣接する第一級アルコール基のうち、少なくとも１個の第一級アルコール基を脂肪酸残基でエステル化して親脂質性ヘパリン修飾体を作り、これを有機溶剤含有の水に溶解して毛髪成長促進剤とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、親脂質性ヘパリン修飾体、及びその製造方法に関するものであり、またその親脂質性ヘパリン修飾体含有の毛髪成長促進剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヘパリンはグリコサミノグリカン（ムコ多糖とも言う）類の一種であり、血液凝固阻止作用を持っていることが大きな特徴である。ヘパリンは、健康な食用獣の肝、肺、腸、脾に多く見られ、毛細管周辺の肥満細胞で特異的に産出される。ヘパリンは、種々の程度のＯ−硫酸基、Ｎ−硫酸基又はＮ−アセチル基を持ったグルコサミノグリカンであって、分子量が６，０００〜２０，０００のヘテロ多糖類である。
【０００３】
化学構造式をもって説明すれば、ヘパリンは下記の化学式表１に示すような主として１０種類の二糖の組み合わせで構成されている。
【化１】
【０００４】
ここでＧｌｃＡはＤ−グルクロン酸、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、ＧｌｃＮＳはＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミン、ＧｌｃＡ（２ＯＳ）は２−スルホ−Ｄ−グルクロン酸、ＧｌｃＮＳ（６ＯＳ）はＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミン−６−硫酸、ＧｌｃＮＳ（３，６ｄｌＯＳ）はＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミン−３，６−ジ硫酸、ＩｄＡはＬ−イズロン酸、ＩｄＡ（２ＯＳ）は２−スルホ−Ｌ−イズロン酸である。
【０００５】
ヘパリンは多彩な生物活性を示す。すなわち、ヘパリンは多種類の細胞増殖因子、サイトカイン類、又は細胞接着因子と結合し、またアンチトロンピンIIIを始め多くの血液凝固・線溶系の酵素及び作用因子と結合して、前述のように血液凝固を阻害する。ヘパリンの薬剤としての利用価値をさらに高めるため、ヘパリン分子を切断して低分子ヘパリンとしたり、ヘパリンを化学的に修飾して新しい薬剤として用いることが色々と試みられた。
【０００６】
例えば特開昭５４−３０２７７号公報は、ヘパリンを解重合して分子量が２，０００〜５，０００の低分子ヘパリンにするとともに、化学的に修飾して、これを血栓症治療用薬剤として使用することを提案している。
【０００７】
また、ＷＯ８０／０１３８３号公報は、ヘパリンを亜硝酸で処理したり、過沃素酸により酸化し、次いでアルカリによりβ−脱離反応を行って、抗トロンピン作用を弱め、抗Ｘａ因子の活性を強くして、選択的抗血液凝固活性を持った低分子ヘパリンを得たことを記載している。
【０００８】
米国特許第５，２８０，０１６号は、ヘパリンを解重合することなく、過沃素酸で酸化し、次いで水素化硼素で還元してヘパリン修飾体を作り、これを筋肉細胞増殖阻止のための注射薬として使用することを記載している。
【０００９】
ＷＯ９６／２９９７３号公報は、ヘパリンを亜硝酸により切断して低分子ヘパリンとし、得られた低分子ヘパリンを過沃素酸で酸化し、次いで水素化硼素で還元して、抗血液凝固活性を持たない低分子ヘパリン修飾体を得て、これを血栓生成阻止のための注射薬として使用することを記載している。
【００１０】
また、ＷＯ９８／１４４８１号公報は、ヘパリンを亜硝酸により解重合して低分子ヘパリンとし、次いで低分子ヘパリンを過沃素酸で酸化し、その後に水素化硼素で還元して、抗血液凝固活性を示さない低分子ヘパリン修飾体を得て、これを腎臓、心筋梗塞症等の治療用に使用することを記載している。
【００１１】
このように、ヘパリンはヘパリンそのもの、又はヘパリンを亜硝酸により解重合して得られた低分子ヘパリンを過沃素酸により酸化し、次いで水素化硼素で還元して化学的に修飾し、得られた修飾体を薬剤として使用することが知られているが、その薬剤は主に注射用のものであって、心臓、腎臓などの臓器疾患の治療を目的としたものである。
【００１２】
そのほか、ヘパリンの血液凝固阻止活性と脂血清澄作用の構造と活性の相関を解明することを目的として、ヘパリンに種々の脂質性基を結合させる試みも知られている（長沢金蔵、糖鎖工学、（株）産業調査会のバイオテクノロジー情報センター発行、１９９１年８月、Ｐ３１５−３４２）。その多くはウロン酸（グルクロン酸及びイズロン酸）のカルボキシル基又はグルコサミンのアミノ基に脂質性の基を結合させたものである。
【００１３】
また、ヘパリンに蛍光標識や放射性同位元素標識を与えるために、ヘパリンの水酸基に脂質性基を結合させる試みも知られている（長沢金蔵、小鴨 晃、日本生化学会編・新生化学実験講座３、糖質ＩＩ 山科他編、東京化学同人発行、１９９１年４月、Ｐ２８３−２８６）。この場合には、ヘパリンの水酸基をブロムシアン（ＢｒＣＮ）と反応させてシアン酸エステルを生じさせ、これを隣接する水酸基と反応させてイミドカルボン酸エステルとし、そのイミド基をさらにアミノ基を持った化合物（脂肪族アミン、例えばアミノヘキサデカン）と反応させて、イソ尿素型の化合物を生成させている。このような、ヘパリンの水酸基の修飾は、ヘパリンに親脂質性を賦与するために行われたものではなく、また低分子ヘパリン及び低分子ヘパリン修飾体に適用されたこともない。
【００１４】
ヘパリン又はこれに類似するヘパラン硫酸が、毛髪成長促進剤として有効であることが知られている。これは１９６１年にK. Meyerらによって報告された（Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol.108, 59-63）。彼等は、ヘパリンやヘパラン硫酸の異化に関与するＬ−イズロニダーゼの遺伝的欠損によって生じるHurler病の患者が、多毛を示すことから、この疾患において蓄積するヘパラン硫酸が、多毛を齎すと考えた。事実、剃毛した家兎の背部に種々のグルコサミノグリカンを皮下注射したところ、ヘパラン硫酸が最も強い発毛効果を示し、同じくＬ−イズロン酸を含むコンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸とも言う）が、若干の発毛効果を示した、と報告している。
【００１５】
毛髪は、皮膚表面近くに局在する毛包の底部に存在する毛母細胞によって作られるが、毛包は周期的に退縮と成長とを繰り返す。毛包の成長期には毛母細胞が活発に増殖して毛髪が作られ、退縮期には毛母細胞が活動を停止し、毛髪が作られなくなり、さらに休止期には、古い毛髪が脱落する。休止期から成長期への移行は、肝細胞増殖因子（Hepatocyte growth factor, HGF）や、サイトカインの一種であるインターロイキン６（Interleukinn 6, IL-6）などによって促進される。しかし、これまではヘパリン修飾体が毛髪成長の促進に使用されることはなかった。
【００１６】
本発明者は、ヘパリン修飾体が皮膚潰瘍の治療に卓効を示すことを見出し、これを皮膚潰瘍治療剤として使用することを、特許第３３４２００７号において提案した。その場合のヘパリン修飾体は、ヘパリンを過沃素酸で酸化し、次いで水素化硼素で還元して作られ、抗血液凝固活性を実質的に喪失し、細胞増殖因子、サイトカイン類又は細胞接着因子との結合性を保持しているものである。
【特許文献１】特開昭５４−３０２７７号公報
【特許文献２】ＷＯ８０／０１３８３号公報
【特許文献３】米国特許第５，２８０，０１６号明細書
【特許文献４】ＷＯ９６／２９９７３号公報
【特許文献５】ＷＯ９８／１４４８１号公報
【特許文献６】特許第３３４２００７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明者は、上述のヘパリン修飾体が皮膚潰瘍の治療に卓効を示すことに着目し、ヘパリン修飾体が同じく皮膚に局在する毛母細胞を活性化し、これによって毛髪成長に促進作用を示すのではないかと考え、新たな毛髪成長促進剤を提供しようと企図した。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者は、初めラットを用いて、刈毛した皮膚の一部にヘパリン修飾体、とくに低分子化したヘパリン修飾体を塗布したり、皮下注射したりすることを試みた。ここで用いたヘパリン修飾体は、前述の特許第３３４２００７号に記載したヘパリン修飾体である。その結果、ヘパリン修飾体を皮膚に塗布した場合には顕著な発毛を認めなかったが、皮膚に皮下注射した場合には顕著な発毛を認めた。
【００１９】
このヘパリン修飾体を人に適用する場合に、皮下注射によることは適当ではない。なぜならば、人の場合、発毛が求められるのは頭頂であって、頭頂に皮下注射する場合には著しい疼痛を伴うからである。従って、人用の毛髪成長促進剤としては、塗布によって効果が発揮できる外用薬剤でなければならない。
【００２０】
皮膚自体は脂質に富むものではないが、毛包に付属する皮脂腺からは絶えず脂質が分泌されている。従って、親脂質性物質を皮膚表面に塗布すれば、親脂質性物質は毛包の開口部から毛包内に取り込まれる可能性が高い。よって、本発明者は上述のヘパリン修飾体は、これに脂肪酸残基を導入して親脂質性を持たせれば、これを塗布剤として有効なものにすることができるだろうと考えた。
【００２１】
ヘパリンは、その糖鎖の還元末端に脂質性基を結合させることが可能である。すなわち、通常、ヘパリンは還元末端に反応性の官能基を持たないため、亜硝酸により適当な大きさに低分子化し、生じた還元末端の２，５−アンヒドロマンノースのアルデヒド基に、アミノ基を持つ化合物（脂肪族アミン、例えばアミノヘキサデカンなど）を還元剤（例えばシアノトリヒドロ硼酸ナトリウム、ＮａＢＣＮＨ3）の存在下で結合させて、還元されたSchiff 塩基を生じさせることによって、ヘパリン糖鎖に親脂質性を賦与することができる。しかし、十分な親脂質性を賦与するにはヘパリンをかなり低分子化する必要があるため、ヘパリンの持つ、細胞増殖因子等との結合性が失われるという欠点がある。
【００２２】
ヘパリンから出発してこれを毛髪成長促進用の塗布剤とするには、特許第３３４２００７号が記載しているヘパリン修飾体に親脂質性を付与するのが適している。すなわち、ヘパリンを過沃素酸で酸化し、次いで水素化硼素で還元して作られ、抗血液凝固活性を実質的に喪失していて、しかも細胞増殖因子、サイトカイン類又は細胞接着因子との結合性を保持しているヘパリン修飾体を出発材料として、これに親脂質性を付与するのが適している。この場合のヘパリン修飾体は亜硝酸により解重合されて低分子化されたものであるのが好ましいが、低分子化されていないものであってもよい。
【００２３】
こうして得られた親脂質性のヘパリン修飾体をマウスの皮膚に塗布して、その効果を確かめた。その結果、親脂質性のヘパリン修飾体は一般に毛髪成長促進効果が認められた。その中でも、亜硝酸によりヘパリン又はヘパリン修飾体を解重合して低分子化したヘパリン修飾体に親脂質性を付与したものは、すぐれた毛髪成長促進効果を示すことが判明した。この発明は、このような知見に基いて完成されたものである。
【００２４】
この発明は、親脂質性のヘパリン修飾体を提供するものである。その親脂質性のヘパリン修飾体は、ヘパリンを過沃素酸で酸化し、次いで水素化硼素で還元して作られたものであって、抗血液凝固活性を実質的に喪失していて、しかも細胞増殖因子、サイトカイン類又は細胞接着因子との結合性を保持しているヘパリン修飾体において、その中のヘキスロン酸のジオール部分の炭素間結合を切断するとともに還元して作られた２個の隣接する第一級アルコール基のうち、少なくとも１個の第一級アルコール基を脂肪酸残基でエステル化して親脂質性を付与したものであることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２５】
この発明が提供する親脂質性ヘパリン修飾体は、もともと哺乳動物の体内にあるヘパリンを出発物質とし、これを過沃素酸で酸化し次いで水素化硼素で還元して抗血液凝固活性を実質的に喪失し、細胞増殖因子、サイトカイン類又は細胞接着因子との結合性を保持しているヘパリン修飾体を作り、これを材料としてその中のヘキスロン酸のジオール部分の炭素間結合を切断するとともに還元して作られた２個の隣接する第一級アルコール基のうち、少なくとも１個の第一級アルコール基を脂肪酸残基でエステル化したものであるから、親脂質性を持っており、哺乳動物の皮膚にある皮脂腺から分泌される脂質に溶解する性質を持っている。従って、これを哺乳動物の皮膚に塗布すると、これが脂質に溶解して皮膚に存在する毛包を活性化し、毛髪の成長を促進することとなる。しかも、この発明に係わる親脂質性ヘパリン修飾体は、極めて毒性が低く、長期間哺乳動物の皮膚に塗布しても、全く皮膚を害しない。従って、この発明に係わる親脂質ヘパリン修飾体は、毛髪成長促進剤として実用上の価値の高いものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
ヘパリン修飾体を調製する際には、ヘパリンの抗血液凝固活性を喪失させるために、硫酸化されていないヘキスロン酸を過沃素酸によって酸化する。そのとき、ヘキスロン酸中で隣接した水酸基を持った部分、いわゆるジオール部分が酸化されて、２個のアルデヒド基を生成する。この２個のアルデヒド基は、水素化硼素により還元されて２個の第一級アルコール基となる。この第一級アルコール基は、脂肪酸と容易に反応して下記化学式表２の（Ａ）に示すような３種類のエステルを生じ、ヘパリン修飾体に親脂質性を与えることとなる。すなわち、２個の第一級アルコール基の何れにも脂肪酸の結合したもの、何れか一方のみに脂肪酸が結合したもの２種、合計３種のエステルを生成する。
【００２７】
ヘパリン修飾体には、上述のようにして生成した第一級アルコール基のほかに、グルコサミンの６−位にも第一級アルコール基が存在する。そこで、これに脂肪酸残基をエステル結合させて、ヘパリン修飾体の親脂質性をさらに高めることができる。またヘパリン修飾体はそれを構成しているヘキスロン酸やグルコサミン中に第二級アルコール基を含んでいる。第二級アルコール基は、第一級アルコール基ほど脂肪酸と反応し易いものでないが、それでも第二級アルコール基は脂肪酸残基とエステル結合して、親脂質性を与えるものとなる。これらすべてのアルコール基に脂肪酸残基が結合した状態を化学式表２中に（Ｂ）及び（Ｃ）で示した。
【化２】
【００２８】
この場合、ヘパリン修飾体に脂肪酸残基を効率よく結合させるには工夫を要する。それは、ヘパリン修飾体が水溶性のものであって、有機溶媒に不溶であり、他方、脂肪酸は有機溶媒に可溶であって水に不溶であるため、両者を直接溶液中で反応させることができないからである。両者を効率よく反応させるためには、両者を同じ１つの溶媒に溶解させるようにしなければならない。
【００２９】
そこで、本発明者は、ヘパリン修飾体を有機溶媒に溶解させるべく、種々検討した。その結果、本発明者は、ヘパリン修飾体をピリジニウム塩にすると、この塩がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）やピリジン等の有機溶媒に可溶となることを見出した。そこで、ピリジニウム塩を経由して親脂質性を付与する方法を案出した。
【００３０】
その方法を以下に説明する。ヘパリン修飾体は、通常ナトリウム塩として得られる。そこで、その水溶液をＨ+形の陽イオン交換樹脂（Dowex-50, 100-200 mesh）のカラムに通し、Ｎａ+を除去してこれを遊離酸の形に変える。この水溶液を例えばピリジンで中和すると、ヘパリン修飾体はピリジニウム塩となる。このピリジニウム塩は上述のピリジンやＤＭＳＯに可溶となる。
【００３１】
エステル化は、例えば次のようにして容易に行うことができる。上述のヘパリン修飾体ピリジニウム塩のＤＭＳＯ溶液に脂肪酸を加え、縮合剤として例えばジシクロカルボジイミド（ＤＣＣ）を加え、よく混和してそのまま放置すると、ヘパリン修飾体に脂肪酸残基を効率よくエステル結合させることができる。
【００３２】
上述のエステル化にあたって、ヘパリン修飾体を有機溶媒に可溶とするために用いる化合物はピリジンに限らない。ピリジン以外に、ピヘリジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなど、種々の有機塩基を用いることができる。また、エステル化を行う際の有機溶媒としては、ＤＭＳＯ、ピリジンのほか、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ヘキサメチルスルホンアミドなど種々の極性有機溶媒を用いることができる。
【００３３】
こうして、本発明はヘパリン修飾体に親脂質性を賦与する方法をも提供するものである。この方法は、ヘパリン修飾体の有機塩基塩を作り、この塩を極性有機溶媒に溶解し、この溶液に脂肪酸を加えてヘパリン修飾体に脂肪酸残基をエステル結合させることを特徴とするものである。そのエステル化の際には、縮合剤を加えてエステル化を促進させることが好ましい。
【００３４】
ヘパリン修飾体に結合させる脂肪酸としては、天然の脂肪酸の何れをも用いることができる。その中では、パルミチン酸やオレイン酸を用いることが好ましく、とくにパルミチン酸とオレイン酸との等モル混合物を用いることが好ましい。その理由は、パルミチン酸やオレイン酸は、ヒトの中性脂肪に含まれている主要な脂肪酸であるため、皮膚腺から分泌される脂質に親和性が大きいと考えられるからである。
【００３５】
ヘパリン修飾体に結合させる脂肪酸の量は、毛髪成長促進剤として重要である。毛髪成長促進剤を外用塗布剤として用いるためには、毛髪成長促進剤が７０％エタノール溶媒に溶解することが好ましいため、脂肪酸の結合量が少ないと、ヘパリン修飾体が７０％エタノールに不溶となるので、外用塗布剤として不適格となる。逆に、脂肪酸の結合量が多過ぎると、毛髪成長促進剤としての効力が失われる。実験によれば、ヘパリン修飾体の８糖あたり、０．８〜１．２モルの脂肪酸を結合させたものが、溶解性と毛髪成長促進作用の上で適当である。
【００３６】
本発明の親脂質性ヘパリン修飾体は極めて毒性が低く、長期にわたって投与しても、副作用も毒性も殆ど認められない。従って、本発明の親脂質性ヘパリン修飾体からなる毛髪成長促進剤は、脱毛症治療のために安全に使用することができる。
【００３７】
以下に、参考例と実施例と試験例とを記載して、本発明の詳細を具体的に説明する。ここで、参考例は、本発明で用いる低分子ヘパリン修飾体の製造方法の詳細を説明したものであり、実施例は、参考例で得た低分子ヘパリン修飾体を用いて本発明の毛髪成長促進剤の製造過程を説明したものであり、試験例は本発明の毛髪成長促進剤を実際にマウスに塗布した場合の効果を説明したものである。これら実施例等は単なる例示であって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００３８】
参考例１
ブタ由来のヘパリン１ｇを蒸留水１２．５ｍｌに溶解し、これに室温で５％亜硝酸ナトリウム１．２５ｍｌを加えた。次いで、攪拌しながら３３％酢酸１．２５ｍｌを加え、さらに室温で５０分間攪拌した。反応溶液に１Ｍ炭酸ナトリウム４ｍｌおよび１Ｍ水酸化ナトリウム１ｍｌを順次加え、反応溶液のｐＨを９．０に調整した。これに０．２５Ｍ水素化硼素ナトリウムを含有する０．０１Ｍ水酸化ナトリウム０．３ｍｌを加え、５０℃で３０分間放置した。次いで、氷酢酸を加えて過剰の水素化硼素ナトリウムを分解した後、０．３Ｍ酢酸ナトリウムで平衡化したセファデックスＧ−２５のカラムに通した。得られた高分子画分を減圧下で濃縮した後、エタノールを加えて目的物を沈殿させた。これを濾取し、乾燥した。抗血液凝固活性を有する低分子ヘパリン約０．９ｇを得た。
【００３９】
得られた低分子ヘパリン１ｇを２０ｍｌの０．１Ｍ過沃素酸ナトリウムを含む０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、４℃で暗所に７２時間放置した。反応液に十分量のグリセリンを加えて過剰の過沃素酸を分解した後、透析用半透膜（Spectrum社製、Code Number 530-3518, MW 500cut）を用いて、約５℃の蒸留水で３日間透析した。透析内液を凍結乾燥し、得られた乾燥物を０．２Ｍ水素化硼素ナトリウムを含有する０．２Ｍ炭素水素ナトリウム（ｐＨ９．５）に１０％になるように溶解した。この反応液を４℃で３時間放置した。氷酢酸を加えて過剰の水素化硼素ナトリウムを分解しながら反応液のｐＨを５．０に調整し、３０分間放置した。次いで、反応液を０．１Ｍ水酸化ナトリウムで中和した。得られた反応液は再度透析用半透膜を用いて約５℃の蒸留水で３日間透析した後、凍結乾燥に付し、抗血液凝固活性を有しない低分子ヘパリン修飾体０．７ｇを得た。
【００４０】
同様の手法でウシ由来のヘパリンからも低分子ヘパリンを経て低分子ヘパリン修飾体を得ることができる。
【００４１】
実施例１
参考例１に記載した方法で得た低分子ヘパリン修飾体１ｇを４５ｍｌの蒸留水に溶かし、Ｈ+形のDowex-50 (100-200 mesh)のカラム（6 X 10cm）に通した。洗液と併せて約１１０ｍｌをピリジンで中和してｐＨ６．２とし、凍結乾燥した。約１．１ｇを得た。これを１６ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶かした。
【００４２】
パルミチン酸７４ｍｇとオレイン酸８２ｍｇを２ｍｌのＤＭＳＯに溶かし、一方、縮合剤であるジシクロカルボジイミド（ＤＣＣＤ）１２８ｍｇを１ｍｌのＤＭＳＯに溶かし、これらの溶液を上記低分子ヘパリン修飾体ピリジニウム塩のＤＭＳＯ溶液に加えた。この溶液を遮光して室温で４８時間放置した。反応によって生じたジシクロジヘキシル尿素を濾紙を用いて濾別し、沈殿をＤＭＳＯで洗浄した。濾液と洗液を合わせ、これに約２０ｍｌのエーテルを加え、よく混和した。生じた３層のうち、最上層を除去した後、さらに同量のエーテルを加え、最上層を除去した。さらにベンゼン２０ｍｌを加えると粘質物が器底に生じた。上清を除去し、エタノールを１０−２０ｍｌ加えると粘質物は固化したのでこれを粉砕し濾取した。得られた粉末をエタノールとエーテルでよく洗浄した。約１ｇの粉末が得られた。得られた粉末を２０ｍｌの蒸留水に溶かし、Dowex 50−Ｈ+形（100-200 mesh）のカラム（6 X 10cm）に通した。洗液と併せて約５０ｍｌを２Ｍ水酸化ナトリウムで中和し、凍結乾燥した。親脂質性低分子ヘパリン修飾体０．８ｇを得た。
【００４３】
本実施例では低分子ヘパリン修飾体８糖あたり、１．２分子の脂肪酸を含む親脂質性低分子ヘパリン修飾体の調製法を記したが、結合させる脂肪酸の量を変化させる際には相当する量の脂肪酸とＤＣＣＤを用いる。
【００４４】
試験例１
親脂質性低分子ヘパリン修飾体の０．１％溶液を作製した。溶媒としては、７０％エタノール、１０％プロピレングリコールを含む蒸留水を用いた。
マウス又はラットを用いることができるが、本試験例ではマウスを用いた例を以下に記する。
【００４５】
雌の黒色マウス（C57BL/6）を用いた。このマウスの毛髪は生後１８日までは成長期で、その後３−４日で退縮期となり、２２日頃に休止期に入る。３０日頃から２回目の成長期に入り、４８日頃で再び退縮期になり、約４日後に２回目の休止期に入る。この休止期は長く、約５週間続く。この時期を毛髪成長試験に用いる。これ以後は毛周期が乱れるため本試験には適さない。
【００４６】
７週令のマウスを購入し、通常４、５匹を一群として同じケージで飼育した。１週間動物実験施設で順化した後、８週令になった日に電気バリカンを用いて背部の約３ Ｘ ３ｃｍを刈毛した。この部位に親脂質性低分子ヘパリン修飾体の０．１％溶液５０μｌ−１００μｌを塗布した。毛髪成長は肉眼で観察し、完全に成長した状態を＋１０とし、途中の段階は＋１から順次＋１０までを記録した。対照として、薬剤を含まない溶媒を薬剤と同量塗布した。比較のため毛髪成長促進の基準物質（positive control）であるシクロスポリンＡの１％エタノール溶液２０μｌを塗布した。
【００４７】
シクロスポリンＡの場合、約７−１０日で＋１０の毛髪成長が見られた。親脂質性低分子ヘパリン修飾体を塗布した場合の毛髪成長に見られる効果を図１に例示した。図１において縦軸は毛髪成長の度合い（完全成長を＋１０とする）を示し、横軸は塗布日数を示している。また、○は試料塗布を示し、△は溶媒塗布を示している。（Ａ）は、マウスを１０匹用い低分子ヘパリン修飾体に８糖当たり１モルの脂肪酸を結合させた親脂質性低分子ヘパリン修飾体の０．１％溶液をマウス一匹当たり５０μｌ塗布した場合、（Ｂ）は、マウスを８匹用い、低分子ヘパリン修飾体に８糖当たり１．２モルの脂肪酸を結合させた親脂質低分子ヘパリン修飾体の０．３％溶液をマウス一匹当たり７５μｌ塗布した場合の毛髪成長の度合いを示したものである。試料塗布（−Ｏ−）の場合、（Ａ）、（Ｂ）いずれにおいても塗布後約１０日で明らかな発毛が見られ、４０日後には完全発毛、すなわち、刈毛前の状態に戻った。一方、溶媒のみを塗布した場合は（−△−）、４０日後でも＋３程度の発毛であった。Student t-検定による危険率は（Ａ）、（Ｂ）いずれの場合も、０．０１以下（ｐ＜０．０１）であった。なお、図には示さなかったが、何も塗布しない、いわゆる無処置の場合には、（Ａ）、（Ｂ）いずれの場合も、溶媒のみを塗布した場合と同程度の発毛であった。
【００４８】
因みに、現在、毛髪成長促進剤として汎用されているミノキシジル０．１％含有製剤の場合、塗布後３０日頃に＋５程度の毛髪成長が見られ、＋１０の成長に達するには５０日を要した。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の親脂質性低分子ヘパリン修飾体を毛髪成長促進剤として用いる脱毛症の患者の多くはいわゆる男性型脱毛症と見られるが、その発生頻度は日本人男性の約３０％と報告されている。何らかの毛髪成長促進剤を必要とする患者は５００万人に達すると推定されている。本発明の親脂質性低分子ヘパリン修飾体は極めて毒性が低く、長期投与においても副作用が見られないことから多くの脱毛症患者の救済に役立つものと思われる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】この発明に係わるヘパリン修飾体をマウスに塗布した場合の、毛髪成長の度合いを示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、親脂質性ヘパリン修飾体、及びその製造方法に関するものであり、またその親脂質性ヘパリン修飾体含有の毛髪成長促進剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヘパリンはグリコサミノグリカン（ムコ多糖とも言う）類の一種であり、血液凝固阻止作用を持っていることが大きな特徴である。ヘパリンは、健康な食用獣の肝、肺、腸、脾に多く見られ、毛細管周辺の肥満細胞で特異的に産出される。ヘパリンは、種々の程度のＯ−硫酸基、Ｎ−硫酸基又はＮ−アセチル基を持ったグルコサミノグリカンであって、分子量が６，０００〜２０，０００のヘテロ多糖類である。
【０００３】
化学構造式をもって説明すれば、ヘパリンは下記の化学式表１に示すような主として１０種類の二糖の組み合わせで構成されている。
【化１】
【０００４】
ここでＧｌｃＡはＤ−グルクロン酸、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、ＧｌｃＮＳはＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミン、ＧｌｃＡ（２ＯＳ）は２−スルホ−Ｄ−グルクロン酸、ＧｌｃＮＳ（６ＯＳ）はＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミン−６−硫酸、ＧｌｃＮＳ（３，６ｄｌＯＳ）はＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミン−３，６−ジ硫酸、ＩｄＡはＬ−イズロン酸、ＩｄＡ（２ＯＳ）は２−スルホ−Ｌ−イズロン酸である。
【０００５】
ヘパリンは多彩な生物活性を示す。すなわち、ヘパリンは多種類の細胞増殖因子、サイトカイン類、又は細胞接着因子と結合し、またアンチトロンピンIIIを始め多くの血液凝固・線溶系の酵素及び作用因子と結合して、前述のように血液凝固を阻害する。ヘパリンの薬剤としての利用価値をさらに高めるため、ヘパリン分子を切断して低分子ヘパリンとしたり、ヘパリンを化学的に修飾して新しい薬剤として用いることが色々と試みられた。
【０００６】
例えば特開昭５４−３０２７７号公報は、ヘパリンを解重合して分子量が２，０００〜５，０００の低分子ヘパリンにするとともに、化学的に修飾して、これを血栓症治療用薬剤として使用することを提案している。
【０００７】
また、ＷＯ８０／０１３８３号公報は、ヘパリンを亜硝酸で処理したり、過沃素酸により酸化し、次いでアルカリによりβ−脱離反応を行って、抗トロンピン作用を弱め、抗Ｘａ因子の活性を強くして、選択的抗血液凝固活性を持った低分子ヘパリンを得たことを記載している。
【０００８】
米国特許第５，２８０，０１６号は、ヘパリンを解重合することなく、過沃素酸で酸化し、次いで水素化硼素で還元してヘパリン修飾体を作り、これを筋肉細胞増殖阻止のための注射薬として使用することを記載している。
【０００９】
ＷＯ９６／２９９７３号公報は、ヘパリンを亜硝酸により切断して低分子ヘパリンとし、得られた低分子ヘパリンを過沃素酸で酸化し、次いで水素化硼素で還元して、抗血液凝固活性を持たない低分子ヘパリン修飾体を得て、これを血栓生成阻止のための注射薬として使用することを記載している。
【００１０】
また、ＷＯ９８／１４４８１号公報は、ヘパリンを亜硝酸により解重合して低分子ヘパリンとし、次いで低分子ヘパリンを過沃素酸で酸化し、その後に水素化硼素で還元して、抗血液凝固活性を示さない低分子ヘパリン修飾体を得て、これを腎臓、心筋梗塞症等の治療用に使用することを記載している。
【００１１】
このように、ヘパリンはヘパリンそのもの、又はヘパリンを亜硝酸により解重合して得られた低分子ヘパリンを過沃素酸により酸化し、次いで水素化硼素で還元して化学的に修飾し、得られた修飾体を薬剤として使用することが知られているが、その薬剤は主に注射用のものであって、心臓、腎臓などの臓器疾患の治療を目的としたものである。
【００１２】
そのほか、ヘパリンの血液凝固阻止活性と脂血清澄作用の構造と活性の相関を解明することを目的として、ヘパリンに種々の脂質性基を結合させる試みも知られている（長沢金蔵、糖鎖工学、（株）産業調査会のバイオテクノロジー情報センター発行、１９９１年８月、Ｐ３１５−３４２）。その多くはウロン酸（グルクロン酸及びイズロン酸）のカルボキシル基又はグルコサミンのアミノ基に脂質性の基を結合させたものである。
【００１３】
また、ヘパリンに蛍光標識や放射性同位元素標識を与えるために、ヘパリンの水酸基に脂質性基を結合させる試みも知られている（長沢金蔵、小鴨 晃、日本生化学会編・新生化学実験講座３、糖質ＩＩ 山科他編、東京化学同人発行、１９９１年４月、Ｐ２８３−２８６）。この場合には、ヘパリンの水酸基をブロムシアン（ＢｒＣＮ）と反応させてシアン酸エステルを生じさせ、これを隣接する水酸基と反応させてイミドカルボン酸エステルとし、そのイミド基をさらにアミノ基を持った化合物（脂肪族アミン、例えばアミノヘキサデカン）と反応させて、イソ尿素型の化合物を生成させている。このような、ヘパリンの水酸基の修飾は、ヘパリンに親脂質性を賦与するために行われたものではなく、また低分子ヘパリン及び低分子ヘパリン修飾体に適用されたこともない。
【００１４】
ヘパリン又はこれに類似するヘパラン硫酸が、毛髪成長促進剤として有効であることが知られている。これは１９６１年にK. Meyerらによって報告された（Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol.108, 59-63）。彼等は、ヘパリンやヘパラン硫酸の異化に関与するＬ−イズロニダーゼの遺伝的欠損によって生じるHurler病の患者が、多毛を示すことから、この疾患において蓄積するヘパラン硫酸が、多毛を齎すと考えた。事実、剃毛した家兎の背部に種々のグルコサミノグリカンを皮下注射したところ、ヘパラン硫酸が最も強い発毛効果を示し、同じくＬ−イズロン酸を含むコンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸とも言う）が、若干の発毛効果を示した、と報告している。
【００１５】
毛髪は、皮膚表面近くに局在する毛包の底部に存在する毛母細胞によって作られるが、毛包は周期的に退縮と成長とを繰り返す。毛包の成長期には毛母細胞が活発に増殖して毛髪が作られ、退縮期には毛母細胞が活動を停止し、毛髪が作られなくなり、さらに休止期には、古い毛髪が脱落する。休止期から成長期への移行は、肝細胞増殖因子（Hepatocyte growth factor, HGF）や、サイトカインの一種であるインターロイキン６（Interleukinn 6, IL-6）などによって促進される。しかし、これまではヘパリン修飾体が毛髪成長の促進に使用されることはなかった。
【００１６】
本発明者は、ヘパリン修飾体が皮膚潰瘍の治療に卓効を示すことを見出し、これを皮膚潰瘍治療剤として使用することを、特許第３３４２００７号において提案した。その場合のヘパリン修飾体は、ヘパリンを過沃素酸で酸化し、次いで水素化硼素で還元して作られ、抗血液凝固活性を実質的に喪失し、細胞増殖因子、サイトカイン類又は細胞接着因子との結合性を保持しているものである。
【特許文献１】特開昭５４−３０２７７号公報
【特許文献２】ＷＯ８０／０１３８３号公報
【特許文献３】米国特許第５，２８０，０１６号明細書
【特許文献４】ＷＯ９６／２９９７３号公報
【特許文献５】ＷＯ９８／１４４８１号公報
【特許文献６】特許第３３４２００７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明者は、上述のヘパリン修飾体が皮膚潰瘍の治療に卓効を示すことに着目し、ヘパリン修飾体が同じく皮膚に局在する毛母細胞を活性化し、これによって毛髪成長に促進作用を示すのではないかと考え、新たな毛髪成長促進剤を提供しようと企図した。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者は、初めラットを用いて、刈毛した皮膚の一部にヘパリン修飾体、とくに低分子化したヘパリン修飾体を塗布したり、皮下注射したりすることを試みた。ここで用いたヘパリン修飾体は、前述の特許第３３４２００７号に記載したヘパリン修飾体である。その結果、ヘパリン修飾体を皮膚に塗布した場合には顕著な発毛を認めなかったが、皮膚に皮下注射した場合には顕著な発毛を認めた。
【００１９】
このヘパリン修飾体を人に適用する場合に、皮下注射によることは適当ではない。なぜならば、人の場合、発毛が求められるのは頭頂であって、頭頂に皮下注射する場合には著しい疼痛を伴うからである。従って、人用の毛髪成長促進剤としては、塗布によって効果が発揮できる外用薬剤でなければならない。
【００２０】
皮膚自体は脂質に富むものではないが、毛包に付属する皮脂腺からは絶えず脂質が分泌されている。従って、親脂質性物質を皮膚表面に塗布すれば、親脂質性物質は毛包の開口部から毛包内に取り込まれる可能性が高い。よって、本発明者は上述のヘパリン修飾体は、これに脂肪酸残基を導入して親脂質性を持たせれば、これを塗布剤として有効なものにすることができるだろうと考えた。
【００２１】
ヘパリンは、その糖鎖の還元末端に脂質性基を結合させることが可能である。すなわち、通常、ヘパリンは還元末端に反応性の官能基を持たないため、亜硝酸により適当な大きさに低分子化し、生じた還元末端の２，５−アンヒドロマンノースのアルデヒド基に、アミノ基を持つ化合物（脂肪族アミン、例えばアミノヘキサデカンなど）を還元剤（例えばシアノトリヒドロ硼酸ナトリウム、ＮａＢＣＮＨ3）の存在下で結合させて、還元されたSchiff 塩基を生じさせることによって、ヘパリン糖鎖に親脂質性を賦与することができる。しかし、十分な親脂質性を賦与するにはヘパリンをかなり低分子化する必要があるため、ヘパリンの持つ、細胞増殖因子等との結合性が失われるという欠点がある。
【００２２】
ヘパリンから出発してこれを毛髪成長促進用の塗布剤とするには、特許第３３４２００７号が記載しているヘパリン修飾体に親脂質性を付与するのが適している。すなわち、ヘパリンを過沃素酸で酸化し、次いで水素化硼素で還元して作られ、抗血液凝固活性を実質的に喪失していて、しかも細胞増殖因子、サイトカイン類又は細胞接着因子との結合性を保持しているヘパリン修飾体を出発材料として、これに親脂質性を付与するのが適している。この場合のヘパリン修飾体は亜硝酸により解重合されて低分子化されたものであるのが好ましいが、低分子化されていないものであってもよい。
【００２３】
こうして得られた親脂質性のヘパリン修飾体をマウスの皮膚に塗布して、その効果を確かめた。その結果、親脂質性のヘパリン修飾体は一般に毛髪成長促進効果が認められた。その中でも、亜硝酸によりヘパリン又はヘパリン修飾体を解重合して低分子化したヘパリン修飾体に親脂質性を付与したものは、すぐれた毛髪成長促進効果を示すことが判明した。この発明は、このような知見に基いて完成されたものである。
【００２４】
この発明は、親脂質性のヘパリン修飾体を提供するものである。その親脂質性のヘパリン修飾体は、ヘパリンを過沃素酸で酸化し、次いで水素化硼素で還元して作られたものであって、抗血液凝固活性を実質的に喪失していて、しかも細胞増殖因子、サイトカイン類又は細胞接着因子との結合性を保持しているヘパリン修飾体において、その中のヘキスロン酸のジオール部分の炭素間結合を切断するとともに還元して作られた２個の隣接する第一級アルコール基のうち、少なくとも１個の第一級アルコール基を脂肪酸残基でエステル化して親脂質性を付与したものであることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２５】
この発明が提供する親脂質性ヘパリン修飾体は、もともと哺乳動物の体内にあるヘパリンを出発物質とし、これを過沃素酸で酸化し次いで水素化硼素で還元して抗血液凝固活性を実質的に喪失し、細胞増殖因子、サイトカイン類又は細胞接着因子との結合性を保持しているヘパリン修飾体を作り、これを材料としてその中のヘキスロン酸のジオール部分の炭素間結合を切断するとともに還元して作られた２個の隣接する第一級アルコール基のうち、少なくとも１個の第一級アルコール基を脂肪酸残基でエステル化したものであるから、親脂質性を持っており、哺乳動物の皮膚にある皮脂腺から分泌される脂質に溶解する性質を持っている。従って、これを哺乳動物の皮膚に塗布すると、これが脂質に溶解して皮膚に存在する毛包を活性化し、毛髪の成長を促進することとなる。しかも、この発明に係わる親脂質性ヘパリン修飾体は、極めて毒性が低く、長期間哺乳動物の皮膚に塗布しても、全く皮膚を害しない。従って、この発明に係わる親脂質ヘパリン修飾体は、毛髪成長促進剤として実用上の価値の高いものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
ヘパリン修飾体を調製する際には、ヘパリンの抗血液凝固活性を喪失させるために、硫酸化されていないヘキスロン酸を過沃素酸によって酸化する。そのとき、ヘキスロン酸中で隣接した水酸基を持った部分、いわゆるジオール部分が酸化されて、２個のアルデヒド基を生成する。この２個のアルデヒド基は、水素化硼素により還元されて２個の第一級アルコール基となる。この第一級アルコール基は、脂肪酸と容易に反応して下記化学式表２の（Ａ）に示すような３種類のエステルを生じ、ヘパリン修飾体に親脂質性を与えることとなる。すなわち、２個の第一級アルコール基の何れにも脂肪酸の結合したもの、何れか一方のみに脂肪酸が結合したもの２種、合計３種のエステルを生成する。
【００２７】
ヘパリン修飾体には、上述のようにして生成した第一級アルコール基のほかに、グルコサミンの６−位にも第一級アルコール基が存在する。そこで、これに脂肪酸残基をエステル結合させて、ヘパリン修飾体の親脂質性をさらに高めることができる。またヘパリン修飾体はそれを構成しているヘキスロン酸やグルコサミン中に第二級アルコール基を含んでいる。第二級アルコール基は、第一級アルコール基ほど脂肪酸と反応し易いものでないが、それでも第二級アルコール基は脂肪酸残基とエステル結合して、親脂質性を与えるものとなる。これらすべてのアルコール基に脂肪酸残基が結合した状態を化学式表２中に（Ｂ）及び（Ｃ）で示した。
【化２】
【００２８】
この場合、ヘパリン修飾体に脂肪酸残基を効率よく結合させるには工夫を要する。それは、ヘパリン修飾体が水溶性のものであって、有機溶媒に不溶であり、他方、脂肪酸は有機溶媒に可溶であって水に不溶であるため、両者を直接溶液中で反応させることができないからである。両者を効率よく反応させるためには、両者を同じ１つの溶媒に溶解させるようにしなければならない。
【００２９】
そこで、本発明者は、ヘパリン修飾体を有機溶媒に溶解させるべく、種々検討した。その結果、本発明者は、ヘパリン修飾体をピリジニウム塩にすると、この塩がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）やピリジン等の有機溶媒に可溶となることを見出した。そこで、ピリジニウム塩を経由して親脂質性を付与する方法を案出した。
【００３０】
その方法を以下に説明する。ヘパリン修飾体は、通常ナトリウム塩として得られる。そこで、その水溶液をＨ+形の陽イオン交換樹脂（Dowex-50, 100-200 mesh）のカラムに通し、Ｎａ+を除去してこれを遊離酸の形に変える。この水溶液を例えばピリジンで中和すると、ヘパリン修飾体はピリジニウム塩となる。このピリジニウム塩は上述のピリジンやＤＭＳＯに可溶となる。
【００３１】
エステル化は、例えば次のようにして容易に行うことができる。上述のヘパリン修飾体ピリジニウム塩のＤＭＳＯ溶液に脂肪酸を加え、縮合剤として例えばジシクロカルボジイミド（ＤＣＣ）を加え、よく混和してそのまま放置すると、ヘパリン修飾体に脂肪酸残基を効率よくエステル結合させることができる。
【００３２】
上述のエステル化にあたって、ヘパリン修飾体を有機溶媒に可溶とするために用いる化合物はピリジンに限らない。ピリジン以外に、ピヘリジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなど、種々の有機塩基を用いることができる。また、エステル化を行う際の有機溶媒としては、ＤＭＳＯ、ピリジンのほか、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ヘキサメチルスルホンアミドなど種々の極性有機溶媒を用いることができる。
【００３３】
こうして、本発明はヘパリン修飾体に親脂質性を賦与する方法をも提供するものである。この方法は、ヘパリン修飾体の有機塩基塩を作り、この塩を極性有機溶媒に溶解し、この溶液に脂肪酸を加えてヘパリン修飾体に脂肪酸残基をエステル結合させることを特徴とするものである。そのエステル化の際には、縮合剤を加えてエステル化を促進させることが好ましい。
【００３４】
ヘパリン修飾体に結合させる脂肪酸としては、天然の脂肪酸の何れをも用いることができる。その中では、パルミチン酸やオレイン酸を用いることが好ましく、とくにパルミチン酸とオレイン酸との等モル混合物を用いることが好ましい。その理由は、パルミチン酸やオレイン酸は、ヒトの中性脂肪に含まれている主要な脂肪酸であるため、皮膚腺から分泌される脂質に親和性が大きいと考えられるからである。
【００３５】
ヘパリン修飾体に結合させる脂肪酸の量は、毛髪成長促進剤として重要である。毛髪成長促進剤を外用塗布剤として用いるためには、毛髪成長促進剤が７０％エタノール溶媒に溶解することが好ましいため、脂肪酸の結合量が少ないと、ヘパリン修飾体が７０％エタノールに不溶となるので、外用塗布剤として不適格となる。逆に、脂肪酸の結合量が多過ぎると、毛髪成長促進剤としての効力が失われる。実験によれば、ヘパリン修飾体の８糖あたり、０．８〜１．２モルの脂肪酸を結合させたものが、溶解性と毛髪成長促進作用の上で適当である。
【００３６】
本発明の親脂質性ヘパリン修飾体は極めて毒性が低く、長期にわたって投与しても、副作用も毒性も殆ど認められない。従って、本発明の親脂質性ヘパリン修飾体からなる毛髪成長促進剤は、脱毛症治療のために安全に使用することができる。
【００３７】
以下に、参考例と実施例と試験例とを記載して、本発明の詳細を具体的に説明する。ここで、参考例は、本発明で用いる低分子ヘパリン修飾体の製造方法の詳細を説明したものであり、実施例は、参考例で得た低分子ヘパリン修飾体を用いて本発明の毛髪成長促進剤の製造過程を説明したものであり、試験例は本発明の毛髪成長促進剤を実際にマウスに塗布した場合の効果を説明したものである。これら実施例等は単なる例示であって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００３８】
参考例１
ブタ由来のヘパリン１ｇを蒸留水１２．５ｍｌに溶解し、これに室温で５％亜硝酸ナトリウム１．２５ｍｌを加えた。次いで、攪拌しながら３３％酢酸１．２５ｍｌを加え、さらに室温で５０分間攪拌した。反応溶液に１Ｍ炭酸ナトリウム４ｍｌおよび１Ｍ水酸化ナトリウム１ｍｌを順次加え、反応溶液のｐＨを９．０に調整した。これに０．２５Ｍ水素化硼素ナトリウムを含有する０．０１Ｍ水酸化ナトリウム０．３ｍｌを加え、５０℃で３０分間放置した。次いで、氷酢酸を加えて過剰の水素化硼素ナトリウムを分解した後、０．３Ｍ酢酸ナトリウムで平衡化したセファデックスＧ−２５のカラムに通した。得られた高分子画分を減圧下で濃縮した後、エタノールを加えて目的物を沈殿させた。これを濾取し、乾燥した。抗血液凝固活性を有する低分子ヘパリン約０．９ｇを得た。
【００３９】
得られた低分子ヘパリン１ｇを２０ｍｌの０．１Ｍ過沃素酸ナトリウムを含む０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解し、４℃で暗所に７２時間放置した。反応液に十分量のグリセリンを加えて過剰の過沃素酸を分解した後、透析用半透膜（Spectrum社製、Code Number 530-3518, MW 500cut）を用いて、約５℃の蒸留水で３日間透析した。透析内液を凍結乾燥し、得られた乾燥物を０．２Ｍ水素化硼素ナトリウムを含有する０．２Ｍ炭素水素ナトリウム（ｐＨ９．５）に１０％になるように溶解した。この反応液を４℃で３時間放置した。氷酢酸を加えて過剰の水素化硼素ナトリウムを分解しながら反応液のｐＨを５．０に調整し、３０分間放置した。次いで、反応液を０．１Ｍ水酸化ナトリウムで中和した。得られた反応液は再度透析用半透膜を用いて約５℃の蒸留水で３日間透析した後、凍結乾燥に付し、抗血液凝固活性を有しない低分子ヘパリン修飾体０．７ｇを得た。
【００４０】
同様の手法でウシ由来のヘパリンからも低分子ヘパリンを経て低分子ヘパリン修飾体を得ることができる。
【００４１】
実施例１
参考例１に記載した方法で得た低分子ヘパリン修飾体１ｇを４５ｍｌの蒸留水に溶かし、Ｈ+形のDowex-50 (100-200 mesh)のカラム（6 X 10cm）に通した。洗液と併せて約１１０ｍｌをピリジンで中和してｐＨ６．２とし、凍結乾燥した。約１．１ｇを得た。これを１６ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶かした。
【００４２】
パルミチン酸７４ｍｇとオレイン酸８２ｍｇを２ｍｌのＤＭＳＯに溶かし、一方、縮合剤であるジシクロカルボジイミド（ＤＣＣＤ）１２８ｍｇを１ｍｌのＤＭＳＯに溶かし、これらの溶液を上記低分子ヘパリン修飾体ピリジニウム塩のＤＭＳＯ溶液に加えた。この溶液を遮光して室温で４８時間放置した。反応によって生じたジシクロジヘキシル尿素を濾紙を用いて濾別し、沈殿をＤＭＳＯで洗浄した。濾液と洗液を合わせ、これに約２０ｍｌのエーテルを加え、よく混和した。生じた３層のうち、最上層を除去した後、さらに同量のエーテルを加え、最上層を除去した。さらにベンゼン２０ｍｌを加えると粘質物が器底に生じた。上清を除去し、エタノールを１０−２０ｍｌ加えると粘質物は固化したのでこれを粉砕し濾取した。得られた粉末をエタノールとエーテルでよく洗浄した。約１ｇの粉末が得られた。得られた粉末を２０ｍｌの蒸留水に溶かし、Dowex 50−Ｈ+形（100-200 mesh）のカラム（6 X 10cm）に通した。洗液と併せて約５０ｍｌを２Ｍ水酸化ナトリウムで中和し、凍結乾燥した。親脂質性低分子ヘパリン修飾体０．８ｇを得た。
【００４３】
本実施例では低分子ヘパリン修飾体８糖あたり、１．２分子の脂肪酸を含む親脂質性低分子ヘパリン修飾体の調製法を記したが、結合させる脂肪酸の量を変化させる際には相当する量の脂肪酸とＤＣＣＤを用いる。
【００４４】
試験例１
親脂質性低分子ヘパリン修飾体の０．１％溶液を作製した。溶媒としては、７０％エタノール、１０％プロピレングリコールを含む蒸留水を用いた。
マウス又はラットを用いることができるが、本試験例ではマウスを用いた例を以下に記する。
【００４５】
雌の黒色マウス（C57BL/6）を用いた。このマウスの毛髪は生後１８日までは成長期で、その後３−４日で退縮期となり、２２日頃に休止期に入る。３０日頃から２回目の成長期に入り、４８日頃で再び退縮期になり、約４日後に２回目の休止期に入る。この休止期は長く、約５週間続く。この時期を毛髪成長試験に用いる。これ以後は毛周期が乱れるため本試験には適さない。
【００４６】
７週令のマウスを購入し、通常４、５匹を一群として同じケージで飼育した。１週間動物実験施設で順化した後、８週令になった日に電気バリカンを用いて背部の約３ Ｘ ３ｃｍを刈毛した。この部位に親脂質性低分子ヘパリン修飾体の０．１％溶液５０μｌ−１００μｌを塗布した。毛髪成長は肉眼で観察し、完全に成長した状態を＋１０とし、途中の段階は＋１から順次＋１０までを記録した。対照として、薬剤を含まない溶媒を薬剤と同量塗布した。比較のため毛髪成長促進の基準物質（positive control）であるシクロスポリンＡの１％エタノール溶液２０μｌを塗布した。
【００４７】
シクロスポリンＡの場合、約７−１０日で＋１０の毛髪成長が見られた。親脂質性低分子ヘパリン修飾体を塗布した場合の毛髪成長に見られる効果を図１に例示した。図１において縦軸は毛髪成長の度合い（完全成長を＋１０とする）を示し、横軸は塗布日数を示している。また、○は試料塗布を示し、△は溶媒塗布を示している。（Ａ）は、マウスを１０匹用い低分子ヘパリン修飾体に８糖当たり１モルの脂肪酸を結合させた親脂質性低分子ヘパリン修飾体の０．１％溶液をマウス一匹当たり５０μｌ塗布した場合、（Ｂ）は、マウスを８匹用い、低分子ヘパリン修飾体に８糖当たり１．２モルの脂肪酸を結合させた親脂質低分子ヘパリン修飾体の０．３％溶液をマウス一匹当たり７５μｌ塗布した場合の毛髪成長の度合いを示したものである。試料塗布（−Ｏ−）の場合、（Ａ）、（Ｂ）いずれにおいても塗布後約１０日で明らかな発毛が見られ、４０日後には完全発毛、すなわち、刈毛前の状態に戻った。一方、溶媒のみを塗布した場合は（−△−）、４０日後でも＋３程度の発毛であった。Student t-検定による危険率は（Ａ）、（Ｂ）いずれの場合も、０．０１以下（ｐ＜０．０１）であった。なお、図には示さなかったが、何も塗布しない、いわゆる無処置の場合には、（Ａ）、（Ｂ）いずれの場合も、溶媒のみを塗布した場合と同程度の発毛であった。
【００４８】
因みに、現在、毛髪成長促進剤として汎用されているミノキシジル０．１％含有製剤の場合、塗布後３０日頃に＋５程度の毛髪成長が見られ、＋１０の成長に達するには５０日を要した。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の親脂質性低分子ヘパリン修飾体を毛髪成長促進剤として用いる脱毛症の患者の多くはいわゆる男性型脱毛症と見られるが、その発生頻度は日本人男性の約３０％と報告されている。何らかの毛髪成長促進剤を必要とする患者は５００万人に達すると推定されている。本発明の親脂質性低分子ヘパリン修飾体は極めて毒性が低く、長期投与においても副作用が見られないことから多くの脱毛症患者の救済に役立つものと思われる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】この発明に係わるヘパリン修飾体をマウスに塗布した場合の、毛髪成長の度合いを示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパリンを過沃素酸で酸化し、次いで水素化硼素で還元して作られ、抗血液凝固活性を実質的に喪失し、細胞増殖因子、サイトカイン類又は細胞接着因子との結合性を保持しているヘパリン修飾体において、その中のヘキスロン酸のジオール部分の炭素間結合を切断するとともに還元して作られた２個の隣接する第一級アルコール基のうち、少なくとも１個の第一級アルコール基を脂肪酸残基でエステル化して親脂質性を付与したものであることを特徴とする、親脂質性ヘパリン修飾体。
【請求項２】
前記ヘパリン修飾体が前記過沃素酸による酸化及び水素化硼素による還元の前又は後で、低分子化された低分子ヘパリン修飾体であることを特徴とする、請求項１に記載の親脂質性ヘパリン修飾体。
【請求項３】
前記ヘパリン修飾体において、その中のグルコサミンの６−位にある第一級アルコール基、及び／又はヘキスロン酸及び／又はグルコサミン中の第二級アルコール基の少なくとも一部を、さらに脂肪酸残基とエステル結合していることを特徴とする、請求項１又は２に記載の親脂質性ヘパリン修飾体。
【請求項４】
前記脂肪酸残基の結合量が前記ヘパリン修飾体の８糖あたり０．８〜１．２モルとなっていることを特徴とする、請求項１−３の何れか１つの項に記載の親脂質性ヘパリン修飾体。
【請求項５】
ヘパリンを過沃素酸で酸化し、次いで水素化硼素で還元して作られ、抗血液凝固活性を実質的に喪失し、細胞増殖因子、サイトカイン類又は細胞接着因子との結合性を保持しているヘパリン修飾体に有機塩基を結合させてヘパリン修飾体の塩を作り、この塩を極性有機溶媒に溶解し、この溶液に脂肪酸を加えて、ヘパリン修飾体に脂肪酸残基をエステル結合させることを特徴とする、親脂質性ヘパリン修飾体の製造方法。
【請求項６】
前記ヘパリン修飾体が、過沃素酸による酸化及び水素化硼素による還元の前又は後に亜硝酸により解重合させて低分子化されたものであることを特徴とする、請求項５に記載の親脂質性ヘパリン修飾体の製造方法。
【請求項７】
ヘパリンを過沃素酸で酸化し、次いで水素化硼素で還元して作られ、抗血液凝固活性を実質的に喪失し、細胞増殖因子、サイトカイン類又は細胞接着因子との結合性を保持しているヘパリン修飾体において、その中に含まれているヘキスロン酸のジオール部分を切断するとともに還元して作られた２個の隣接する第一級アルコール基のうち、少なくとも１個の第一級アルコール基を脂肪酸残基とエステル結合させて得られた親脂質性ヘパリン修飾体を有機溶媒含有の水に溶解して溶液としたことを特徴とする、毛髪成長促進剤。
【請求項８】
前記ヘパリン修飾体が過沃素酸による酸化及び水素化硼素による還元の前又は後で低分子化されたものであることを特徴とする、請求項７に記載の毛髪成長促進剤。
【請求項９】
前記有機溶媒含有の水が６０〜８０重量％のエタノールと、０〜１５重量％のプロピレングリコールと、４０〜５重量％の水とを含むものであることを特徴とする、請求項７又は８に記載の毛髪成長促進剤。
【請求項１】
ヘパリンを過沃素酸で酸化し、次いで水素化硼素で還元して作られ、抗血液凝固活性を実質的に喪失し、細胞増殖因子、サイトカイン類又は細胞接着因子との結合性を保持しているヘパリン修飾体において、その中のヘキスロン酸のジオール部分の炭素間結合を切断するとともに還元して作られた２個の隣接する第一級アルコール基のうち、少なくとも１個の第一級アルコール基を脂肪酸残基でエステル化して親脂質性を付与したものであることを特徴とする、親脂質性ヘパリン修飾体。
【請求項２】
前記ヘパリン修飾体が前記過沃素酸による酸化及び水素化硼素による還元の前又は後で、低分子化された低分子ヘパリン修飾体であることを特徴とする、請求項１に記載の親脂質性ヘパリン修飾体。
【請求項３】
前記ヘパリン修飾体において、その中のグルコサミンの６−位にある第一級アルコール基、及び／又はヘキスロン酸及び／又はグルコサミン中の第二級アルコール基の少なくとも一部を、さらに脂肪酸残基とエステル結合していることを特徴とする、請求項１又は２に記載の親脂質性ヘパリン修飾体。
【請求項４】
前記脂肪酸残基の結合量が前記ヘパリン修飾体の８糖あたり０．８〜１．２モルとなっていることを特徴とする、請求項１−３の何れか１つの項に記載の親脂質性ヘパリン修飾体。
【請求項５】
ヘパリンを過沃素酸で酸化し、次いで水素化硼素で還元して作られ、抗血液凝固活性を実質的に喪失し、細胞増殖因子、サイトカイン類又は細胞接着因子との結合性を保持しているヘパリン修飾体に有機塩基を結合させてヘパリン修飾体の塩を作り、この塩を極性有機溶媒に溶解し、この溶液に脂肪酸を加えて、ヘパリン修飾体に脂肪酸残基をエステル結合させることを特徴とする、親脂質性ヘパリン修飾体の製造方法。
【請求項６】
前記ヘパリン修飾体が、過沃素酸による酸化及び水素化硼素による還元の前又は後に亜硝酸により解重合させて低分子化されたものであることを特徴とする、請求項５に記載の親脂質性ヘパリン修飾体の製造方法。
【請求項７】
ヘパリンを過沃素酸で酸化し、次いで水素化硼素で還元して作られ、抗血液凝固活性を実質的に喪失し、細胞増殖因子、サイトカイン類又は細胞接着因子との結合性を保持しているヘパリン修飾体において、その中に含まれているヘキスロン酸のジオール部分を切断するとともに還元して作られた２個の隣接する第一級アルコール基のうち、少なくとも１個の第一級アルコール基を脂肪酸残基とエステル結合させて得られた親脂質性ヘパリン修飾体を有機溶媒含有の水に溶解して溶液としたことを特徴とする、毛髪成長促進剤。
【請求項８】
前記ヘパリン修飾体が過沃素酸による酸化及び水素化硼素による還元の前又は後で低分子化されたものであることを特徴とする、請求項７に記載の毛髪成長促進剤。
【請求項９】
前記有機溶媒含有の水が６０〜８０重量％のエタノールと、０〜１５重量％のプロピレングリコールと、４０〜５重量％の水とを含むものであることを特徴とする、請求項７又は８に記載の毛髪成長促進剤。
【図１】
【公開番号】特開２００８−１５０４４１（Ｐ２００８−１５０４４１Ａ）
【公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３３７７８３（Ｐ２００６−３３７７８３）
【出願日】平成１８年１２月１５日（２００６．１２．１５）
【出願人】（５０６４１６９７２）有限会社応用糖質化学研究所 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月１５日（２００６．１２．１５）
【出願人】（５０６４１６９７２）有限会社応用糖質化学研究所 (1)
【Ｆターム（参考）】
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