観察装置
【課題】確実に、観察対象の観察を行うことができるようにする。
【解決手段】観察装置では、全域観察（Ｓ１３）により順次取得される低倍画像から、細胞の形態や蛍光信号の有無、細胞コロニーの大きさ、あるいは周辺の状況などの細胞特定条件（Ｓ１１）に一致する細胞や細胞コロニー等の観察対象の認識が行われ（Ｓ１４，Ｓ１５）、認識された観察対象（Ｓ１６）ごとに、観察対象と、その観察対象の周辺が、観察対象ごとに設定される細胞観察条件（Ｓ１７）に従って特定域観察（Ｓ１８）され、観察対象ごとの高倍画像が取得されるので、時間の経過によって観察対象として新たに追加すべき細胞や細胞コロニーが出てきた場合でも、その細胞等を確実に観察できる。本発明は、例えば、生体試料の観察を行う観察装置に適用することができる。
【解決手段】観察装置では、全域観察（Ｓ１３）により順次取得される低倍画像から、細胞の形態や蛍光信号の有無、細胞コロニーの大きさ、あるいは周辺の状況などの細胞特定条件（Ｓ１１）に一致する細胞や細胞コロニー等の観察対象の認識が行われ（Ｓ１４，Ｓ１５）、認識された観察対象（Ｓ１６）ごとに、観察対象と、その観察対象の周辺が、観察対象ごとに設定される細胞観察条件（Ｓ１７）に従って特定域観察（Ｓ１８）され、観察対象ごとの高倍画像が取得されるので、時間の経過によって観察対象として新たに追加すべき細胞や細胞コロニーが出てきた場合でも、その細胞等を確実に観察できる。本発明は、例えば、生体試料の観察を行う観察装置に適用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、観察装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、生体試料を培養しながら、培養している生体試料の成長過程の観察を行う観察装置が知られている。この種の観察装置では、培養容器内を全域観察して得られる観察画像から、細胞や細胞コロニー等の観察対象を、観察者が目視で判断することにより、観察位置の特定を行うのが一般的である。
【０００３】
また、低解像度の顕微鏡画像から、所定の条件にしたがって、高倍の対物レンズを用いた撮像を行う対象を決定する手法が提案されている（例えば特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】２００７−１２１８３７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、被検物の経時変化を見ながら、観察者の判断によりタイムラプス等の観察対象位置の設定してゆく場合、時間の経過によって新たに追加すべき観察対象が順次出現してくる。そのため、観察対象が新たに出現する度に、その都度、観察者が観察対象位置を追加する必要がある。また、特許文献１に開示されている手法であると、新たに追加すべき観察対象が出てきた場合には、高倍の対物レンズを用いた撮像を行う対象とすることができない。
【０００６】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、時間の経過によって新たに追加すべき観察対象が出てきた場合に、その観察対象を確実に観察することができるようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の観察装置は、生体試料の経時的な変化を観察する観察装置において、あらかじめ設定される所定の繰り返し時間間隔で、前記生体試料を収容した容器内の全域を任意の倍率で撮影して、低倍画像を取得する低倍画像取得手段と、前記低倍画像が取得された場合、観察対象を特定するための第１の条件に基づいて、前記低倍画像に含まれる前記観察対象を特定する特定手段と、特定された前記観察対象の位置ごとの観察条件を設定するための第２の条件に基づいて、特定された前記観察対象を前記任意の倍率よりも高倍率で撮影して、高倍画像を取得する高倍画像取得手段とを備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、確実に、観察対象の観察を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明を適用した観察装置の全体の構成を示す図である。
【図２】観察ユニットの詳細な構成例を示す図である。
【図３】観察装置により実行される観察処理を説明するフローチャートである。
【図４】観察スケジュールに基づいた全域観察と特定域観察の具体例を示す図である。
【図５】表示装置に表示される観察結果を模式的に示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。
【００１１】
図１は、本発明を適用した観察装置の全体の構成を示す図である。
【００１２】
なお、図１において、実線は外観に表れる部位の構造を示し、破線は外観に表れない内部の部位の構造を示している。
【００１３】
図１に示すように、観察装置１は、生体試料の培養を行う第１筐体１１と、制御装置を構成する第２筐体１２とを有する。第１筐体１１は、第２筐体１２の上に載せられた状態で使用される。
【００１４】
第１筐体１１の内部には、断熱材で覆われた恒温室２１が形成されている。この恒温室２１は、第１筐体１１の正面に形成された正面開口２３（正面扉２２）と、第１筐体１１の正面からみて左側面に形成された搬出入口２４とによって外部と連絡している。
【００１５】
恒温室２１には、例えば、ペルチェ素子が用いられる温度調節装置等からなる温度制御機構、霧を噴出する噴霧装置等からなる湿度制御機構、外部の二酸化炭素ボンベに接続されるガス導入部等からなるガス制御機構、内部空間における生体試料の培養環境を検出する環境センサ等（いずれも不図示）が設けられている。これにより、恒温室２１の中は、生体試料の培養中、生体試料の培養環境を維持するために密封され、例えば空気を循環させることにより一定の温度に保たれることで、温度３７℃、湿度９０％、二酸化炭素濃度５％等に維持される。
【００１６】
また、第１筐体１１の恒温室２１内には、ストッカ２５、容器搬送機構２６、及び観察ユニット２７が収納されている。
【００１７】
ストッカ２５は、複数の棚で上下に区画されており、培養容器１５（図２）を水平に収納できる。容器搬送機構２６には、ホルダを支持する搬送アーム部や、培養容器１５を搬送するための各種の機構（不図示）が設けられている。
【００１８】
次に、図２を参照して、観察ユニット２７について説明する。観察ユニット２７は、容器搬送機構２６によって搬送されてくる培養容器１５に収容された生体試料を観察するための装置であって、細胞のような透明な物体を透過する光の位相差を利用して細胞等を観察する位相差観察と、生体試料に標識した蛍光色素又は蛍光タンパク質そのものの蛍光により細胞等を観察する蛍光観察の２つの観察方法により生体試料の観察を行う。
【００１９】
図２の右側には観察ユニット２７の正面図が示されており、図２の左側には観察ユニット２７の側面図が示されている。図２に示すように、観察ユニット２７は、位相差観察で用いられる透過光照明部４１、蛍光観察で用いられる蛍光落射照明部４２、試料台４３、及び観察部４４から構成される。
【００２０】
透過光照明部４１は、試料台４３の側部から上方向に延びた後に、試料台４３に載置される培養容器１５の上部に延びるようなアーム状に形成される。透過光照明部４１の内部には、透過光用LED（Light Emitting Diode）５１と透過光用光学系５２が収納される。透過光用LED５１は、所定の波長域の光を発光する。透過光用LED５１からの光は、透過光用光学系５２を介して、試料台４３に載置される培養容器１５に上側から照射される。
【００２１】
蛍光落射照明部４２は、蛍光用LED５３ａ乃至蛍光用LED５３ｃ及び蛍光用光学系５４から構成される。蛍光用LED５３ａ乃至蛍光用LED５３ｃ（以下、単に、蛍光用LED５３）は、それぞれ異なる波長の光、すなわち、培養容器１５内に収容された生体試料に含まれる蛍光物質に応じた所定の波長の光（励起光）を発光する。蛍光用LED５３からの励起光は、蛍光用光学系５４及び対物レンズ５５を介して、試料台４３に載置される培養容器１５に下側から照射される。
【００２２】
試料台４３は、透光性の材質により構成されており、位相差観察時における透過光照明部４１からの光や、蛍光観察時における蛍光落射照明部４２からの光により励起した蛍光物質から発せられる光（蛍光）が、観察部４４に導入される。試料台４３にはまた、観察部４４に導入される光を集光する対物レンズ５５や、生体試料の所定の箇所を撮影するために培養容器１５を垂直方向又は水平方向に移動させるステージ５６などが設けられる。なお、対物レンズ５５は、倍率（例えば、２×，４×，１０×，２０×，４０×，・・・等）の異なる複数の対物レンズから構成されており、観察状況に応じて適宜観察倍率を切り替えることが可能である。
【００２３】
観察部４４は、撮影部５７及び画像処理部５８から構成される。撮影部５７は、CCD（Charge Coupled Device）等の撮像素子を有している。この撮像素子の撮像面には、位相差観察時における透過光照明部４１からの光による像や、蛍光観察時における蛍光落射照明部４２からの光により励起した蛍光物質から発せられる光（蛍光）による像が、結像光学系により結像される。撮像素子は、結像光学系を介して入射する光を受光して光電変換を行い、（光の）受光量に応じた電気信号としてのアナログ画像信号を、画像処理部５８に供給する。
【００２４】
画像処理部５８は、撮影部５７からのアナログ画像信号に所定のアナログ信号処理を適用した後、A/D（Analog/Digital）変換して得られるデジタル信号の画像データを、制御ユニット３１に供給する。
【００２５】
図１に戻り、第１筐体１１が載せられた第２筐体１２の内部には、上述した観察ユニット２７の一部の他に、制御ユニット３１も収納される。
【００２６】
制御ユニット３１は、観察装置１の各部の動作を制御する。具体的には、制御ユニット３１は、観察スケジュール又は観察者の操作による直接の指示にしたがって、恒温室２１内の環境条件の調整、恒温室２１内外への培養容器１５の搬出入、培養容器１５内の生体試料の観察、恒温室２１内での培養容器１５の搬送などを実行する。
【００２７】
観察スケジュールは、例えば、制御ユニット３１で処理された各種の情報を表示する表示パネル３２に表示される設定画面により設定が可能であり、制御ユニット３１に接続されたキーボード等の入力手段により入力される。これにより、サンプルごとの観察位置や観察倍率、撮影スケジュール等が設定される。
【００２８】
また、制御ユニット３１内には、観察情報記憶部３３、画像解析部３４、及び観察制御部３５が設けられる。観察情報記憶部３３は、画像処理部５８から供給される画像データを格納し、蓄積する。観察情報記憶部３３に格納される画像データは、例えば培養容器１５の識別情報と撮影日時とを含むインデックス情報が対応付けて記録される。また、観察情報記憶部３３には、生体試料の観察に関する各種の情報や、恒温室２１内での環境条件（温度、湿度、二酸化炭素濃度等）の変化履歴等も記録できる。
【００２９】
画像解析部３４は、観察情報記憶部３３に蓄積されている画像データに対し、所定の画像解析処理を施して画像解析を行う。観察制御部３５は、観察スケジュール又は観察者の操作による直接の指示にしたがって、培養容器１５内の生体試料の観察を行っている観察ユニット２７の動作を制御する。
【００３０】
なお、制御ユニット３１は、所定の無線又は有線の通信規格に準拠した通信手段（図不示）を備えており、ネットワークを介して外部のパーソナルコンピュータ等の機器とのデータ送受信を行うことが可能である。これにより、ネットワークを利用して、離れた場所にあるパーソナルコンピュータからでも、生体試料の観察、撮影条件の設定変更、恒温室２１内の環境や観察画像の確認が可能となる。
【００３１】
以上のようにして構成される、観察装置１においては、所定の繰り返し間隔で、タイムラプス撮影が行われて、時系列の画像データが取得されるが、このタイムラプス観察としては、全域観察と特定域観察の２種類の観察が行われる。
【００３２】
ここで、全域観察とは、対物レンズ５５として、生体試料の広範囲な領域に対応する画像データを取得可能な低倍率（例えば、２×，４×）の対物レンズを用いた観察である。以下、全域観察で得られた画像データを、低倍画像と称する。また、特定域観察とは、観察対象となる特定の細胞や細胞コロニー等に対して行われる、全域観察で用いた対物レンズの倍率よりも高倍率（例えば、４×，１０×，２０×，４０×）の対物レンズを用いた観察である。以下、特定域観察で得られた画像データを、高倍画像と称する。
【００３３】
すなわち、観察ユニット２７では、生体試料の広範囲な領域の観察を行う場合には、複数の対物レンズ５５のうち、任意の倍率（低倍率）の対物レンズが、培養容器１５内の生体試料の光の光路上に配置され、全域観察が行われる。一方、生体試料の特定の範囲の領域（細胞や細胞コロニー）の観察を行う場合には、複数の対物レンズ５５のうち、全域観察で用いられた対物レンズの任意の倍率よりも高倍率の対物レンズが、培養容器１５内の生体試料の光の光路上に配置され、特定域観察が行われる。そして、全域観察と特定域観察が行われることで、観察情報記憶部３３には、画像データとして、観察倍率の異なる低倍画像と高倍画像が順次蓄積されることになる。
【００３４】
次に、図３のフローチャートを参照して、培養している生体試料の経時的な変化の観察として、全域観察と特定域観察を行う観察装置１の動作について説明する。
【００３５】
ステップＳ１１において、観察者の入力操作による指示に基づいて、観察対象（細胞や細胞コロニー）を特定するための観察条件（以下、細胞特定条件という）が設定される。
【００３６】
この細胞特定条件としては、例えば、下記の（Ａ）乃至（Ｄ）の条件が設定される。
【００３７】
（Ａ）位相差観察を用いた細胞の形態情報又は除外する細胞の形態情報
（Ｂ）位相差観察を用いた細胞コロニーの大きさに関する情報
（Ｃ）蛍光観察に用いた蛍光発現に関する情報
（Ｄ）周辺に他の細胞が存在しない単一の細胞に関する情報
【００３８】
すなわち、先に述べた位相差観察では、例えば透明な細胞の微細構造や外部形態を可視化して観察できるので、画像解析部３４は、観察ユニット２７による位相差観察で得られた低倍画像に対して、所定の画像解析処理を施し、可視化された細胞を検出することで、細胞コロニー等の特定の細胞を認識することが可能となる。つまり、位相差観察により細胞の形態に関する情報が得られるため、（Ａ）の条件が指定されることで、特定の形態の細胞のみを観察対象として認識させることとなり、（Ｂ）の条件が指定されることで、特定の大きさを有する細胞コロニーのみを観察対象として認識させることとなる。
【００３９】
また、先に述べた蛍光観察では、例えば発現した細胞が発する蛍光を観察できるので、画像解析部３４は、観察ユニット２７による蛍光観察で得られた低倍画像に対して、所定の画像解析処理を施し、蛍光信号を検出することで、例えば細胞コロニーの中から発現細胞を認識することが可能となる。つまり、蛍光観察により蛍光発現に関する情報が得られるため、（Ｃ）の条件が指定されることで、蛍光発現している細胞を認識させることとなる。
【００４０】
さらに、観察方法によっては、周辺に他の細胞が存在しない細胞の観察を行いたいという要望があるため、（Ｄ）の条件が指定されることで、位相差観察や蛍光観察により得られる情報を用いて、単一の細胞のみを認識させることとなる。
【００４１】
なお、上述した（Ａ）乃至（Ｄ）の条件は、細胞特定条件の一例であり、位相差観察や蛍光観察により得られる情報に対して指定できる条件であれば、観察対象を特定するための条件として、他の条件を指定することが可能である。
【００４２】
細胞特定条件の設定が終了すると、ステップＳ１２において、観察者の入力操作による指示に基づいて、全域観察の観察スケジュール条件の設定が行われる。この設定では、例えば、Ｎ回目の全域観察と、Ｎ＋１回目の全域観察の繰り返し時間間隔（インターバル期間）や、全域観察の観察期間内に取得可能な高倍画像の枚数（観察枚数）に関する情報などが設定される。
【００４３】
そして、細胞特定条件と観察スケジュール条件の設定が終了すると、処理は、ステップＳ１３に進む。ステップＳ１３において、観察ユニット２７は、設定された観察スケジュールに基づいた観察制御部３５の制御にしたがって、生体試料の全域観察を行う。全域観察により得られた低倍画像は、観察情報記憶部３３に蓄積される。
【００４４】
ステップＳ１４において、画像解析部３４は、観察情報記憶部３３に蓄積された低倍画像に対して、設定された細胞特定条件に応じた所定の画像解析処理を施すことにより、細胞特定条件に一致する細胞や細胞コロニーを認識して特定する。そして、細胞や細胞コロニーが特定された場合（ステップＳ１５の「Yes」）、その細胞や細胞コロニーの位置を記憶する。そして、次の処理は、ステップＳ１６に進む。
【００４５】
観察制御部３５は、特定された細胞や細胞コロニーを観察対象に追加する（ステップＳ１６の処理）とともに、追加された観察対象ごとに設定される観察条件（以下、細胞観察条件という）を、観察スケジュールに設定する（ステップＳ１７の処理）。
【００４６】
この細胞観察条件は、１又は複数の観察対象ごとに設定される条件であって、例えば、下記の（Ｅ）乃至（Ｈ）の条件が設定される。
【００４７】
（Ｅ）観察対象の観察間隔
（Ｆ）観察対象の観察倍率
（Ｇ）観察対象の励起波長
（Ｈ）観察対象の大きさに応じた高倍画像の枚数に関する情報
【００４８】
すなわち、細胞観察条件は、観察対象（細胞や細胞コロニー）を特定した後に設定される、その観察対象をどのような観察条件で観察するかを指定するための条件である。それを観察対象位置ごとにそれぞれ指定する。そのため、（Ｅ）乃至（Ｇ）の条件が指定されることで、観察対象の観察間隔や観察倍率、励起波長などの条件が、観察の目的に応じて設定されることとなる。例えば、特定されたある細胞コロニーについて、観察間隔には、あらかじめ設定された所定の繰り返し時間間隔（インターバル期間）が設定され、観察倍率には最高倍率の対物レンズ５５による観察が設定され、励起波長には、複数種類の波長の中から観察対象となった蛍光物質に応じた所定の波長の光（励起光）が選択されるようにする。
【００４９】
また、観察対象が、対物レンズ５５の１視野分の高倍画像に収まらない場合、複数枚の高倍画像を画像タイリングして、観察対象が収まった１枚の観察画像とすることになるが、ここでは、観察対象を含む高倍画像だけでなく、その観察対象の周辺を撮影することで得られる高倍画像を取得し、それらの高倍画像を画像タイリングして、１枚の観察画像を得るようにする。すなわち、（Ｈ）の条件が指定されることで、観察対象を含む高倍画像と、その観察対象の周辺を撮影することで得られる高倍画像を画像タイリングして１枚の観察画像を得るために必要となる高倍画像の画像枚数が設定されることとなる。
【００５０】
この画像枚数の設定方法としては、例えば、先に述べたように、位相差観察で得られた低倍画像からは観察対象の大きさに関する情報を得ることができるため、その情報を用いて、観察対象の大きさに応じて高倍画像の枚数を決定することができる。例えば、観察対象が大きければ、その分だけ画像枚数が増えることになる。また、特定された観察位置から移動する細胞や、大きくなる細胞コロニーなど、観察対象によっては、時間の経過とともにその位置や形態が変化するものが存在する。そのような細胞や細胞コロニーを観察する場合には、観察対象の周辺をより広域に撮影させるために、画像枚数が通常よりも多く設定されるようにする。
【００５１】
なお、上述した（Ｅ）乃至（Ｈ）の条件は、細胞観察条件の一例であり、特定された観察対象ごとに指定される観察条件であれば、他の条件を指定することができる。
【００５２】
そして、細胞観察条件の設定が終了するか、あるいは、細胞等が特定されなかった場合（ステップＳ１５の「No」）、処理は、ステップＳ１８に進む。ステップＳ１８において、観察ユニット２７は、観察スケジュール（設定された細胞観察条件に基づいた観察スケジュール）に基づいた観察制御部３５の制御にしたがって、生体試料の特定域観察を行う。この特定域観察では、観察対象とその観察対象の周辺の特定域観察が行われる。特定域観察により得られた高倍画像は、観察情報記憶部３３に蓄積される。なお、細胞等の観察対象が特定されずに細胞観察条件が設定されていない場合には、特定域観察（ステップＳ１８の処理）は行われないことになる。
【００５３】
ステップＳ１９において、観察制御部３５は、観察スケジュールに基づいて、Ｎ回目の全域観察が終了したか否かを判定する。ステップＳ１９において、Ｎ回目の全域観察、すなわち、設定された回数分の全域観察が終了していないと判定された場合、処理は、ステップＳ１３に戻り、上述したステップＳ１３乃至Ｓ１９の処理が繰り返される。
【００５４】
すなわち、上述したステップＳ１３乃至Ｓ１９が繰り返されることで、全域観察が行われるごとに、その全域観察で得られた低倍画像から細胞特定条件に一致する細胞や細胞コロニーが観察対象として特定され、特定された観察対象の観察対象位置ごとに設定される細胞観察条件にしたがって、特定域観察が行われ、観察対象ごとに、観察対象とその観察対象の周辺の高倍画像が取得される。
【００５５】
ここで、以上のようにして行われる全域観察と特定域観察の詳細について、図４を参照しながら説明する。
【００５６】
図４には、２つの時間軸（図中上から下が時間の方向とされる）が示されているが、図中左側の時間軸は、最初に設定される観察スケジュールＳ、その右側の時間軸は、観察開始後、ある程度の時間が経過した観察スケジュールＳ’の時間軸をそれぞれ示している。
【００５７】
観察スケジュールＳを設定する段階では、まだ、観察対象は特定されていないため、観察当初は、この観察スケジュールＳ（ステップＳ１２の処理により設定された全域観察のインターバル間隔や観察枚数）にしたがって、１回目の全体観察、２回目の全体観察、３回目の全体観察、・・・、Ｎ回目の全体観察が順次行われる。
【００５８】
全体観察が行われると低倍画像が順次取得され、その低倍画像から細胞特定条件に一致する細胞や細胞コロニーの特定が行われ、例えば、１回目の全体観察Ｌ１では、細胞特定条件に一致する細胞等として、蛍光を発している細胞が認識されたため、その蛍光信号の位置を示す地点Ａが、観察対象位置として追加される。すなわち、観察スケジュールＳ’には、全体観察Ｌ１の後に、地点Ａの特定域観察ＨＡ−１が追加される。この特定域観察ＨＡ−１では、蛍光信号の位置を示す地点Ａを含んだ高倍画像と、その地点Ａの周辺を観察することで得られる高倍画像を取得するための領域（特定域観察ＨＡ−１の枠内の地点Ａの細胞に重畳された点線の四角で示す３×３の視野に対応する領域）が観察されることになる。つまり、特定域観察ＨＡ−１では、細胞観察条件として、高倍画像の画像枚数が９枚（３×３枚）に設定されており、この画像枚数に応じて９枚の高倍画像が１回の特定域観察で取得される。なお、この地点Ａの培養容器１５内での位置を図示すれば、観察画像ＩＡのようになる。
【００５９】
続いて、２回目の全体観察が行われ、その低倍画像から細胞特定条件に一致する細胞コロニーが認識されたため、その位置を示す地点Ｂが、観察対象として追加される。すなわち、観察スケジュールＳ’では、全体観察Ｌ２の後に、地点Ａの２回目の特定域観察ＨＡ−２が行われ、その特定域観察ＨＡ−２の後に、地点Ｂの特定域観察ＨＢ−１が追加される。この特定域観察ＨＢ−１では、認識された細胞コロニーの位置を示す地点Ｂを含んだ高倍画像と、その地点Ｂの周辺を観察することで得られる高倍画像を取得するための領域（特定域観察ＨＢ−１の枠内の地点Ｂの細胞コロニーに重畳された点線の四角で示す３×３の視野に対応する領域）が観察されることになる。つまり、特定域観察ＨＢ−１では、細胞観察条件として、高倍画像の画像枚数が９枚に設定されている。なお、この地点Ｂの培養容器１５内での位置を図示すれば、観察画像ＩＢのようになる。
【００６０】
続いて、３回目の全体観察が行われ、その低倍画像から地点Ｂの細胞コロニーとは別の細胞コロニーが認識されたため、その位置を示す地点Ｃが、観察対象として追加される。すなわち、観察スケジュールＳ’では、全体観察Ｌ３の後に、地点Ａの３回目の特定域観察ＨＡ−３と、地点Ｂの２回目の特定域観察ＨＢ−２が行われ、その特定域観察ＨＢ−２の後に、地点Ｃの特定域観察ＨＣ−１が追加される。この特定域観察ＨＣ−１では、認識された細胞コロニーの位置を示す地点Ｃを含んだ高倍画像と、その地点Ｃの周辺を観察することで得られる高倍画像を取得するための領域（特定域観察ＨＣ−１の枠内の地点Ｃの細胞コロニーに重畳された点線の四角で示す４×４の視野に対応する領域）が観察されることになる。つまり、特定域観察ＨＣ−１では、細胞観察条件として、高倍画像の画像枚数が１６枚（４×４枚）に設定されている。なお、この地点Ｃの培養容器１５内での位置を図示すれば、観察画像Ｉｃのようになる。
【００６１】
その後、４回目以降の全体観察も同様に行われ、順次取得される低倍画像から細胞特定条件に一致する細胞や細胞コロニーが特定された場合、その地点（例えば地点Ｄ、Ｅ、Ｆ、・・・）が観察対象として順次追加され、その観察対象ごとに細胞観察条件が設定され、特定域観察が行われる。
【００６２】
このように、全体観察により順次取得される低倍画像から細胞特定条件に一致する細胞や細胞コロニーの位置が、観察対象として順次追加されて特定域観察されるため、時間の経過によって新たに観察対象に追加すべき細胞等が出てきたとしても、観察者の操作を介することなく、その細胞等が観察対象として追加される。これにより、観察者が新たに観察対象に追加すべき細胞等を見逃すといったこともなくなり、確実に観察対象の観察を行うことができる。
【００６３】
また、図４において、特定域観察ＨＡ−１乃至特定域観察ＨＡ−３の枠内に示すように、地点Ａで認識された観察対象の細胞が時間の経過とともに移動する場合でも（この例の場合、観察対象となる細胞が地点Ａから右上方向に移動している）、地点Ａを中心とした周辺の領域も観察できるようにしているため、細胞が視野から外れることなく、細胞の形態変化を時系列で確実に観察することができる。また、特定域観察ＨＢ−１乃至特定域観察ＨＢ−２の枠内に示すように、地点Ｂで認識された細胞コロニーが時間の経過とともに大きくなる場合でも、地点Ｂを中心とした周辺の領域も観察できるようにしているため、その大きくなった細胞が視野から外れることなく、細胞コロニーの形態変化を時系列で確実に観察することができる。さらに、特定域観察Ｈｃ−１の枠内に示すように、地点Ｃで認識された細胞コロニーが認識時に既に大きいものであっても、取得する高倍画像の画像枚数を増やして、観察する領域を拡大することで、細胞や細胞コロニーの形態変化を時系列で確実に観察することができる。
【００６４】
図３のフローチャートに戻り、ステップＳ１９において、Ｎ回目の全域観察が終了したと判定された場合、観察ユニット２７での生体試料の観察は終了し、処理は、ステップＳ２０に進む。ステップＳ２０において、観察制御部３５は、観察結果を、表示パネル３２などの表示装置に表示させる。
【００６５】
図５は、表示装置に表示される観察結果を模式的に示した図である。
【００６６】
図５に示すように、低倍画像に相当する観察画像ＩＤには、特定域観察において認識された観察対象の位置を示す地点Ａ乃至地点Ｄが、培養容器１５内の対応する位置に重畳されている。これらの地点Ａ乃至地点Ｄのいずれかが観察者により指示された場合、指示された地点に対応する観察対象について取得された複数枚の高倍画像が画像タイリングされ、それにより得られる観察画像が表示される。例えば、地点Ａが指示された場合、観察画像ＨＡに示すように、特定域観察ＨＡ−１乃至特定域観察ＨＡ−ｉ（ｉ：地点Ａの特定域観察の回数）のそれぞれを行うことで、各特定域観察位置ごとに取得される９枚の高倍画像を画像タイリングして得られる観察画像により、例えば細胞の位相差や細胞発現のタイムラプス画像が表示されることになる。また、例えば、地点Ｂが指示された場合、観察画像ＨＢに示すように、特定域観察ＨＢ−１乃至特定域観察ＨＢ−ｊ（ｊ：地点Ｂの特定域観察の回数）のそれぞれを行うことで、各特定域観察ごとに取得される９枚の高倍画像を画像タイリングして得られる観察画像により、例えば細胞コロニーの位相差、蛍光発現のタイムラプス画像、細胞コロニーの大きさ変化などの形態情報が表示されることになる。
【００６７】
このように、培養容器１５全体を示した観察画像ＩＤ内に、全体観察により順次取得される低倍画像から認識された細胞特定条件に一致する観察対象の位置が表示され、その観察対象の位置が指示されると、指示された観察対象についての特定域観察により取得された複数の高倍画像を画像タイリングして得られる観察画像が、タイムラプス画像として表示されることになる。このタイムラプス画像としては、位相差観察によるタイムラプス画像、蛍光観察によるタイムラプス画像、あるいは、位相差観察と蛍光観察により得られた画像を重ね合わせたタイムラプス画像が表示可能とされる。また、これらのタイムラプス画像を表示するに際し、例えば、観察対象の大きさなどの属性情報や環境条件などを表示したユーザインターフェースを提供することができる。
【００６８】
以上のように、所定の繰り返し間隔で行われる全域観察により順次取得される低倍画像から、細胞の形態や蛍光信号の有無、細胞コロニーの大きさ、あるいは周辺の状況などの細胞特定条件（第１の条件）に一致する細胞や細胞コロニーが観察対象として特定されるため、新たに観察対象に追加すべき細胞や細胞コロニーが出てきたとしても、観察者の操作を介することなく、その細胞等が観察対象として追加されることになる。これにより、観察者が新たに観察対象に追加すべき細胞や細胞コロニーを見逃すといったこともなくなり、確実に観察対象の観察を行うことができる。
【００６９】
また、認識された観察対象ごとに、観察対象とその観察対象の周辺が、観察対象ごとに設定される細胞観察条件（第２の条件）に従って特定域観察され、それにより観察対象ごとに複数の高倍画像が取得されるので、培養容器１５全体を特定域観察して、高倍画像を取得する必要がなくなり、観察処理を高速化することが可能となる。また、培養容器１５全体の高倍画像を取得する必要がなくなることから、画像容量を低減することが可能となる。
【００７０】
なお、以上の説明では、細胞観察条件は、観察の目的に応じてあらかじめ設定される情報や観察により得られた情報を基に設定されるとして説明したが、その設定画面を表示パネル３２等の表示装置に表示させることで、観察者の入力操作により細胞観察条件を設定できるようにしてもよい。
【００７１】
また、図３のフローチャートに記述されたステップは、記載された順序に沿って時系列的に行われる処理はもちろん、必ずしも時系列的に処理されなくとも、並列的あるいは個別に実行される処理をも含むものである。
【００７２】
また、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【００７３】
１ 観察装置， １１ 第１筐体， １２ 第２筐体， １５ 培養容器， ２１ 恒温室， ２２ 正面扉， ２３ 正面開口， ２４ 搬出入口， ２５ ストッカ， ２６ 容器搬送機構， ２７ 観察ユニット， ３１ 制御ユニット， ３２ 表示パネル， ３３ 観察情報記憶部， ３４ 画像解析部， ３５ 観察制御部， ４１ 透過光照明部， ４２ 蛍光落射照明部， ４３ 試料台， ４４ 観察部， ５１ 透過光用LED， ５２ 透過光用光学系， ５３ａ乃至５３ｃ 蛍光用LED， ５４ 蛍光用光学系， ５５ 対物レンズ， ５６ ステージ， ５７ 撮影部， ５８ 画像処理部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、観察装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、生体試料を培養しながら、培養している生体試料の成長過程の観察を行う観察装置が知られている。この種の観察装置では、培養容器内を全域観察して得られる観察画像から、細胞や細胞コロニー等の観察対象を、観察者が目視で判断することにより、観察位置の特定を行うのが一般的である。
【０００３】
また、低解像度の顕微鏡画像から、所定の条件にしたがって、高倍の対物レンズを用いた撮像を行う対象を決定する手法が提案されている（例えば特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】２００７−１２１８３７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、被検物の経時変化を見ながら、観察者の判断によりタイムラプス等の観察対象位置の設定してゆく場合、時間の経過によって新たに追加すべき観察対象が順次出現してくる。そのため、観察対象が新たに出現する度に、その都度、観察者が観察対象位置を追加する必要がある。また、特許文献１に開示されている手法であると、新たに追加すべき観察対象が出てきた場合には、高倍の対物レンズを用いた撮像を行う対象とすることができない。
【０００６】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、時間の経過によって新たに追加すべき観察対象が出てきた場合に、その観察対象を確実に観察することができるようにするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の観察装置は、生体試料の経時的な変化を観察する観察装置において、あらかじめ設定される所定の繰り返し時間間隔で、前記生体試料を収容した容器内の全域を任意の倍率で撮影して、低倍画像を取得する低倍画像取得手段と、前記低倍画像が取得された場合、観察対象を特定するための第１の条件に基づいて、前記低倍画像に含まれる前記観察対象を特定する特定手段と、特定された前記観察対象の位置ごとの観察条件を設定するための第２の条件に基づいて、特定された前記観察対象を前記任意の倍率よりも高倍率で撮影して、高倍画像を取得する高倍画像取得手段とを備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、確実に、観察対象の観察を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明を適用した観察装置の全体の構成を示す図である。
【図２】観察ユニットの詳細な構成例を示す図である。
【図３】観察装置により実行される観察処理を説明するフローチャートである。
【図４】観察スケジュールに基づいた全域観察と特定域観察の具体例を示す図である。
【図５】表示装置に表示される観察結果を模式的に示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。
【００１１】
図１は、本発明を適用した観察装置の全体の構成を示す図である。
【００１２】
なお、図１において、実線は外観に表れる部位の構造を示し、破線は外観に表れない内部の部位の構造を示している。
【００１３】
図１に示すように、観察装置１は、生体試料の培養を行う第１筐体１１と、制御装置を構成する第２筐体１２とを有する。第１筐体１１は、第２筐体１２の上に載せられた状態で使用される。
【００１４】
第１筐体１１の内部には、断熱材で覆われた恒温室２１が形成されている。この恒温室２１は、第１筐体１１の正面に形成された正面開口２３（正面扉２２）と、第１筐体１１の正面からみて左側面に形成された搬出入口２４とによって外部と連絡している。
【００１５】
恒温室２１には、例えば、ペルチェ素子が用いられる温度調節装置等からなる温度制御機構、霧を噴出する噴霧装置等からなる湿度制御機構、外部の二酸化炭素ボンベに接続されるガス導入部等からなるガス制御機構、内部空間における生体試料の培養環境を検出する環境センサ等（いずれも不図示）が設けられている。これにより、恒温室２１の中は、生体試料の培養中、生体試料の培養環境を維持するために密封され、例えば空気を循環させることにより一定の温度に保たれることで、温度３７℃、湿度９０％、二酸化炭素濃度５％等に維持される。
【００１６】
また、第１筐体１１の恒温室２１内には、ストッカ２５、容器搬送機構２６、及び観察ユニット２７が収納されている。
【００１７】
ストッカ２５は、複数の棚で上下に区画されており、培養容器１５（図２）を水平に収納できる。容器搬送機構２６には、ホルダを支持する搬送アーム部や、培養容器１５を搬送するための各種の機構（不図示）が設けられている。
【００１８】
次に、図２を参照して、観察ユニット２７について説明する。観察ユニット２７は、容器搬送機構２６によって搬送されてくる培養容器１５に収容された生体試料を観察するための装置であって、細胞のような透明な物体を透過する光の位相差を利用して細胞等を観察する位相差観察と、生体試料に標識した蛍光色素又は蛍光タンパク質そのものの蛍光により細胞等を観察する蛍光観察の２つの観察方法により生体試料の観察を行う。
【００１９】
図２の右側には観察ユニット２７の正面図が示されており、図２の左側には観察ユニット２７の側面図が示されている。図２に示すように、観察ユニット２７は、位相差観察で用いられる透過光照明部４１、蛍光観察で用いられる蛍光落射照明部４２、試料台４３、及び観察部４４から構成される。
【００２０】
透過光照明部４１は、試料台４３の側部から上方向に延びた後に、試料台４３に載置される培養容器１５の上部に延びるようなアーム状に形成される。透過光照明部４１の内部には、透過光用LED（Light Emitting Diode）５１と透過光用光学系５２が収納される。透過光用LED５１は、所定の波長域の光を発光する。透過光用LED５１からの光は、透過光用光学系５２を介して、試料台４３に載置される培養容器１５に上側から照射される。
【００２１】
蛍光落射照明部４２は、蛍光用LED５３ａ乃至蛍光用LED５３ｃ及び蛍光用光学系５４から構成される。蛍光用LED５３ａ乃至蛍光用LED５３ｃ（以下、単に、蛍光用LED５３）は、それぞれ異なる波長の光、すなわち、培養容器１５内に収容された生体試料に含まれる蛍光物質に応じた所定の波長の光（励起光）を発光する。蛍光用LED５３からの励起光は、蛍光用光学系５４及び対物レンズ５５を介して、試料台４３に載置される培養容器１５に下側から照射される。
【００２２】
試料台４３は、透光性の材質により構成されており、位相差観察時における透過光照明部４１からの光や、蛍光観察時における蛍光落射照明部４２からの光により励起した蛍光物質から発せられる光（蛍光）が、観察部４４に導入される。試料台４３にはまた、観察部４４に導入される光を集光する対物レンズ５５や、生体試料の所定の箇所を撮影するために培養容器１５を垂直方向又は水平方向に移動させるステージ５６などが設けられる。なお、対物レンズ５５は、倍率（例えば、２×，４×，１０×，２０×，４０×，・・・等）の異なる複数の対物レンズから構成されており、観察状況に応じて適宜観察倍率を切り替えることが可能である。
【００２３】
観察部４４は、撮影部５７及び画像処理部５８から構成される。撮影部５７は、CCD（Charge Coupled Device）等の撮像素子を有している。この撮像素子の撮像面には、位相差観察時における透過光照明部４１からの光による像や、蛍光観察時における蛍光落射照明部４２からの光により励起した蛍光物質から発せられる光（蛍光）による像が、結像光学系により結像される。撮像素子は、結像光学系を介して入射する光を受光して光電変換を行い、（光の）受光量に応じた電気信号としてのアナログ画像信号を、画像処理部５８に供給する。
【００２４】
画像処理部５８は、撮影部５７からのアナログ画像信号に所定のアナログ信号処理を適用した後、A/D（Analog/Digital）変換して得られるデジタル信号の画像データを、制御ユニット３１に供給する。
【００２５】
図１に戻り、第１筐体１１が載せられた第２筐体１２の内部には、上述した観察ユニット２７の一部の他に、制御ユニット３１も収納される。
【００２６】
制御ユニット３１は、観察装置１の各部の動作を制御する。具体的には、制御ユニット３１は、観察スケジュール又は観察者の操作による直接の指示にしたがって、恒温室２１内の環境条件の調整、恒温室２１内外への培養容器１５の搬出入、培養容器１５内の生体試料の観察、恒温室２１内での培養容器１５の搬送などを実行する。
【００２７】
観察スケジュールは、例えば、制御ユニット３１で処理された各種の情報を表示する表示パネル３２に表示される設定画面により設定が可能であり、制御ユニット３１に接続されたキーボード等の入力手段により入力される。これにより、サンプルごとの観察位置や観察倍率、撮影スケジュール等が設定される。
【００２８】
また、制御ユニット３１内には、観察情報記憶部３３、画像解析部３４、及び観察制御部３５が設けられる。観察情報記憶部３３は、画像処理部５８から供給される画像データを格納し、蓄積する。観察情報記憶部３３に格納される画像データは、例えば培養容器１５の識別情報と撮影日時とを含むインデックス情報が対応付けて記録される。また、観察情報記憶部３３には、生体試料の観察に関する各種の情報や、恒温室２１内での環境条件（温度、湿度、二酸化炭素濃度等）の変化履歴等も記録できる。
【００２９】
画像解析部３４は、観察情報記憶部３３に蓄積されている画像データに対し、所定の画像解析処理を施して画像解析を行う。観察制御部３５は、観察スケジュール又は観察者の操作による直接の指示にしたがって、培養容器１５内の生体試料の観察を行っている観察ユニット２７の動作を制御する。
【００３０】
なお、制御ユニット３１は、所定の無線又は有線の通信規格に準拠した通信手段（図不示）を備えており、ネットワークを介して外部のパーソナルコンピュータ等の機器とのデータ送受信を行うことが可能である。これにより、ネットワークを利用して、離れた場所にあるパーソナルコンピュータからでも、生体試料の観察、撮影条件の設定変更、恒温室２１内の環境や観察画像の確認が可能となる。
【００３１】
以上のようにして構成される、観察装置１においては、所定の繰り返し間隔で、タイムラプス撮影が行われて、時系列の画像データが取得されるが、このタイムラプス観察としては、全域観察と特定域観察の２種類の観察が行われる。
【００３２】
ここで、全域観察とは、対物レンズ５５として、生体試料の広範囲な領域に対応する画像データを取得可能な低倍率（例えば、２×，４×）の対物レンズを用いた観察である。以下、全域観察で得られた画像データを、低倍画像と称する。また、特定域観察とは、観察対象となる特定の細胞や細胞コロニー等に対して行われる、全域観察で用いた対物レンズの倍率よりも高倍率（例えば、４×，１０×，２０×，４０×）の対物レンズを用いた観察である。以下、特定域観察で得られた画像データを、高倍画像と称する。
【００３３】
すなわち、観察ユニット２７では、生体試料の広範囲な領域の観察を行う場合には、複数の対物レンズ５５のうち、任意の倍率（低倍率）の対物レンズが、培養容器１５内の生体試料の光の光路上に配置され、全域観察が行われる。一方、生体試料の特定の範囲の領域（細胞や細胞コロニー）の観察を行う場合には、複数の対物レンズ５５のうち、全域観察で用いられた対物レンズの任意の倍率よりも高倍率の対物レンズが、培養容器１５内の生体試料の光の光路上に配置され、特定域観察が行われる。そして、全域観察と特定域観察が行われることで、観察情報記憶部３３には、画像データとして、観察倍率の異なる低倍画像と高倍画像が順次蓄積されることになる。
【００３４】
次に、図３のフローチャートを参照して、培養している生体試料の経時的な変化の観察として、全域観察と特定域観察を行う観察装置１の動作について説明する。
【００３５】
ステップＳ１１において、観察者の入力操作による指示に基づいて、観察対象（細胞や細胞コロニー）を特定するための観察条件（以下、細胞特定条件という）が設定される。
【００３６】
この細胞特定条件としては、例えば、下記の（Ａ）乃至（Ｄ）の条件が設定される。
【００３７】
（Ａ）位相差観察を用いた細胞の形態情報又は除外する細胞の形態情報
（Ｂ）位相差観察を用いた細胞コロニーの大きさに関する情報
（Ｃ）蛍光観察に用いた蛍光発現に関する情報
（Ｄ）周辺に他の細胞が存在しない単一の細胞に関する情報
【００３８】
すなわち、先に述べた位相差観察では、例えば透明な細胞の微細構造や外部形態を可視化して観察できるので、画像解析部３４は、観察ユニット２７による位相差観察で得られた低倍画像に対して、所定の画像解析処理を施し、可視化された細胞を検出することで、細胞コロニー等の特定の細胞を認識することが可能となる。つまり、位相差観察により細胞の形態に関する情報が得られるため、（Ａ）の条件が指定されることで、特定の形態の細胞のみを観察対象として認識させることとなり、（Ｂ）の条件が指定されることで、特定の大きさを有する細胞コロニーのみを観察対象として認識させることとなる。
【００３９】
また、先に述べた蛍光観察では、例えば発現した細胞が発する蛍光を観察できるので、画像解析部３４は、観察ユニット２７による蛍光観察で得られた低倍画像に対して、所定の画像解析処理を施し、蛍光信号を検出することで、例えば細胞コロニーの中から発現細胞を認識することが可能となる。つまり、蛍光観察により蛍光発現に関する情報が得られるため、（Ｃ）の条件が指定されることで、蛍光発現している細胞を認識させることとなる。
【００４０】
さらに、観察方法によっては、周辺に他の細胞が存在しない細胞の観察を行いたいという要望があるため、（Ｄ）の条件が指定されることで、位相差観察や蛍光観察により得られる情報を用いて、単一の細胞のみを認識させることとなる。
【００４１】
なお、上述した（Ａ）乃至（Ｄ）の条件は、細胞特定条件の一例であり、位相差観察や蛍光観察により得られる情報に対して指定できる条件であれば、観察対象を特定するための条件として、他の条件を指定することが可能である。
【００４２】
細胞特定条件の設定が終了すると、ステップＳ１２において、観察者の入力操作による指示に基づいて、全域観察の観察スケジュール条件の設定が行われる。この設定では、例えば、Ｎ回目の全域観察と、Ｎ＋１回目の全域観察の繰り返し時間間隔（インターバル期間）や、全域観察の観察期間内に取得可能な高倍画像の枚数（観察枚数）に関する情報などが設定される。
【００４３】
そして、細胞特定条件と観察スケジュール条件の設定が終了すると、処理は、ステップＳ１３に進む。ステップＳ１３において、観察ユニット２７は、設定された観察スケジュールに基づいた観察制御部３５の制御にしたがって、生体試料の全域観察を行う。全域観察により得られた低倍画像は、観察情報記憶部３３に蓄積される。
【００４４】
ステップＳ１４において、画像解析部３４は、観察情報記憶部３３に蓄積された低倍画像に対して、設定された細胞特定条件に応じた所定の画像解析処理を施すことにより、細胞特定条件に一致する細胞や細胞コロニーを認識して特定する。そして、細胞や細胞コロニーが特定された場合（ステップＳ１５の「Yes」）、その細胞や細胞コロニーの位置を記憶する。そして、次の処理は、ステップＳ１６に進む。
【００４５】
観察制御部３５は、特定された細胞や細胞コロニーを観察対象に追加する（ステップＳ１６の処理）とともに、追加された観察対象ごとに設定される観察条件（以下、細胞観察条件という）を、観察スケジュールに設定する（ステップＳ１７の処理）。
【００４６】
この細胞観察条件は、１又は複数の観察対象ごとに設定される条件であって、例えば、下記の（Ｅ）乃至（Ｈ）の条件が設定される。
【００４７】
（Ｅ）観察対象の観察間隔
（Ｆ）観察対象の観察倍率
（Ｇ）観察対象の励起波長
（Ｈ）観察対象の大きさに応じた高倍画像の枚数に関する情報
【００４８】
すなわち、細胞観察条件は、観察対象（細胞や細胞コロニー）を特定した後に設定される、その観察対象をどのような観察条件で観察するかを指定するための条件である。それを観察対象位置ごとにそれぞれ指定する。そのため、（Ｅ）乃至（Ｇ）の条件が指定されることで、観察対象の観察間隔や観察倍率、励起波長などの条件が、観察の目的に応じて設定されることとなる。例えば、特定されたある細胞コロニーについて、観察間隔には、あらかじめ設定された所定の繰り返し時間間隔（インターバル期間）が設定され、観察倍率には最高倍率の対物レンズ５５による観察が設定され、励起波長には、複数種類の波長の中から観察対象となった蛍光物質に応じた所定の波長の光（励起光）が選択されるようにする。
【００４９】
また、観察対象が、対物レンズ５５の１視野分の高倍画像に収まらない場合、複数枚の高倍画像を画像タイリングして、観察対象が収まった１枚の観察画像とすることになるが、ここでは、観察対象を含む高倍画像だけでなく、その観察対象の周辺を撮影することで得られる高倍画像を取得し、それらの高倍画像を画像タイリングして、１枚の観察画像を得るようにする。すなわち、（Ｈ）の条件が指定されることで、観察対象を含む高倍画像と、その観察対象の周辺を撮影することで得られる高倍画像を画像タイリングして１枚の観察画像を得るために必要となる高倍画像の画像枚数が設定されることとなる。
【００５０】
この画像枚数の設定方法としては、例えば、先に述べたように、位相差観察で得られた低倍画像からは観察対象の大きさに関する情報を得ることができるため、その情報を用いて、観察対象の大きさに応じて高倍画像の枚数を決定することができる。例えば、観察対象が大きければ、その分だけ画像枚数が増えることになる。また、特定された観察位置から移動する細胞や、大きくなる細胞コロニーなど、観察対象によっては、時間の経過とともにその位置や形態が変化するものが存在する。そのような細胞や細胞コロニーを観察する場合には、観察対象の周辺をより広域に撮影させるために、画像枚数が通常よりも多く設定されるようにする。
【００５１】
なお、上述した（Ｅ）乃至（Ｈ）の条件は、細胞観察条件の一例であり、特定された観察対象ごとに指定される観察条件であれば、他の条件を指定することができる。
【００５２】
そして、細胞観察条件の設定が終了するか、あるいは、細胞等が特定されなかった場合（ステップＳ１５の「No」）、処理は、ステップＳ１８に進む。ステップＳ１８において、観察ユニット２７は、観察スケジュール（設定された細胞観察条件に基づいた観察スケジュール）に基づいた観察制御部３５の制御にしたがって、生体試料の特定域観察を行う。この特定域観察では、観察対象とその観察対象の周辺の特定域観察が行われる。特定域観察により得られた高倍画像は、観察情報記憶部３３に蓄積される。なお、細胞等の観察対象が特定されずに細胞観察条件が設定されていない場合には、特定域観察（ステップＳ１８の処理）は行われないことになる。
【００５３】
ステップＳ１９において、観察制御部３５は、観察スケジュールに基づいて、Ｎ回目の全域観察が終了したか否かを判定する。ステップＳ１９において、Ｎ回目の全域観察、すなわち、設定された回数分の全域観察が終了していないと判定された場合、処理は、ステップＳ１３に戻り、上述したステップＳ１３乃至Ｓ１９の処理が繰り返される。
【００５４】
すなわち、上述したステップＳ１３乃至Ｓ１９が繰り返されることで、全域観察が行われるごとに、その全域観察で得られた低倍画像から細胞特定条件に一致する細胞や細胞コロニーが観察対象として特定され、特定された観察対象の観察対象位置ごとに設定される細胞観察条件にしたがって、特定域観察が行われ、観察対象ごとに、観察対象とその観察対象の周辺の高倍画像が取得される。
【００５５】
ここで、以上のようにして行われる全域観察と特定域観察の詳細について、図４を参照しながら説明する。
【００５６】
図４には、２つの時間軸（図中上から下が時間の方向とされる）が示されているが、図中左側の時間軸は、最初に設定される観察スケジュールＳ、その右側の時間軸は、観察開始後、ある程度の時間が経過した観察スケジュールＳ’の時間軸をそれぞれ示している。
【００５７】
観察スケジュールＳを設定する段階では、まだ、観察対象は特定されていないため、観察当初は、この観察スケジュールＳ（ステップＳ１２の処理により設定された全域観察のインターバル間隔や観察枚数）にしたがって、１回目の全体観察、２回目の全体観察、３回目の全体観察、・・・、Ｎ回目の全体観察が順次行われる。
【００５８】
全体観察が行われると低倍画像が順次取得され、その低倍画像から細胞特定条件に一致する細胞や細胞コロニーの特定が行われ、例えば、１回目の全体観察Ｌ１では、細胞特定条件に一致する細胞等として、蛍光を発している細胞が認識されたため、その蛍光信号の位置を示す地点Ａが、観察対象位置として追加される。すなわち、観察スケジュールＳ’には、全体観察Ｌ１の後に、地点Ａの特定域観察ＨＡ−１が追加される。この特定域観察ＨＡ−１では、蛍光信号の位置を示す地点Ａを含んだ高倍画像と、その地点Ａの周辺を観察することで得られる高倍画像を取得するための領域（特定域観察ＨＡ−１の枠内の地点Ａの細胞に重畳された点線の四角で示す３×３の視野に対応する領域）が観察されることになる。つまり、特定域観察ＨＡ−１では、細胞観察条件として、高倍画像の画像枚数が９枚（３×３枚）に設定されており、この画像枚数に応じて９枚の高倍画像が１回の特定域観察で取得される。なお、この地点Ａの培養容器１５内での位置を図示すれば、観察画像ＩＡのようになる。
【００５９】
続いて、２回目の全体観察が行われ、その低倍画像から細胞特定条件に一致する細胞コロニーが認識されたため、その位置を示す地点Ｂが、観察対象として追加される。すなわち、観察スケジュールＳ’では、全体観察Ｌ２の後に、地点Ａの２回目の特定域観察ＨＡ−２が行われ、その特定域観察ＨＡ−２の後に、地点Ｂの特定域観察ＨＢ−１が追加される。この特定域観察ＨＢ−１では、認識された細胞コロニーの位置を示す地点Ｂを含んだ高倍画像と、その地点Ｂの周辺を観察することで得られる高倍画像を取得するための領域（特定域観察ＨＢ−１の枠内の地点Ｂの細胞コロニーに重畳された点線の四角で示す３×３の視野に対応する領域）が観察されることになる。つまり、特定域観察ＨＢ−１では、細胞観察条件として、高倍画像の画像枚数が９枚に設定されている。なお、この地点Ｂの培養容器１５内での位置を図示すれば、観察画像ＩＢのようになる。
【００６０】
続いて、３回目の全体観察が行われ、その低倍画像から地点Ｂの細胞コロニーとは別の細胞コロニーが認識されたため、その位置を示す地点Ｃが、観察対象として追加される。すなわち、観察スケジュールＳ’では、全体観察Ｌ３の後に、地点Ａの３回目の特定域観察ＨＡ−３と、地点Ｂの２回目の特定域観察ＨＢ−２が行われ、その特定域観察ＨＢ−２の後に、地点Ｃの特定域観察ＨＣ−１が追加される。この特定域観察ＨＣ−１では、認識された細胞コロニーの位置を示す地点Ｃを含んだ高倍画像と、その地点Ｃの周辺を観察することで得られる高倍画像を取得するための領域（特定域観察ＨＣ−１の枠内の地点Ｃの細胞コロニーに重畳された点線の四角で示す４×４の視野に対応する領域）が観察されることになる。つまり、特定域観察ＨＣ−１では、細胞観察条件として、高倍画像の画像枚数が１６枚（４×４枚）に設定されている。なお、この地点Ｃの培養容器１５内での位置を図示すれば、観察画像Ｉｃのようになる。
【００６１】
その後、４回目以降の全体観察も同様に行われ、順次取得される低倍画像から細胞特定条件に一致する細胞や細胞コロニーが特定された場合、その地点（例えば地点Ｄ、Ｅ、Ｆ、・・・）が観察対象として順次追加され、その観察対象ごとに細胞観察条件が設定され、特定域観察が行われる。
【００６２】
このように、全体観察により順次取得される低倍画像から細胞特定条件に一致する細胞や細胞コロニーの位置が、観察対象として順次追加されて特定域観察されるため、時間の経過によって新たに観察対象に追加すべき細胞等が出てきたとしても、観察者の操作を介することなく、その細胞等が観察対象として追加される。これにより、観察者が新たに観察対象に追加すべき細胞等を見逃すといったこともなくなり、確実に観察対象の観察を行うことができる。
【００６３】
また、図４において、特定域観察ＨＡ−１乃至特定域観察ＨＡ−３の枠内に示すように、地点Ａで認識された観察対象の細胞が時間の経過とともに移動する場合でも（この例の場合、観察対象となる細胞が地点Ａから右上方向に移動している）、地点Ａを中心とした周辺の領域も観察できるようにしているため、細胞が視野から外れることなく、細胞の形態変化を時系列で確実に観察することができる。また、特定域観察ＨＢ−１乃至特定域観察ＨＢ−２の枠内に示すように、地点Ｂで認識された細胞コロニーが時間の経過とともに大きくなる場合でも、地点Ｂを中心とした周辺の領域も観察できるようにしているため、その大きくなった細胞が視野から外れることなく、細胞コロニーの形態変化を時系列で確実に観察することができる。さらに、特定域観察Ｈｃ−１の枠内に示すように、地点Ｃで認識された細胞コロニーが認識時に既に大きいものであっても、取得する高倍画像の画像枚数を増やして、観察する領域を拡大することで、細胞や細胞コロニーの形態変化を時系列で確実に観察することができる。
【００６４】
図３のフローチャートに戻り、ステップＳ１９において、Ｎ回目の全域観察が終了したと判定された場合、観察ユニット２７での生体試料の観察は終了し、処理は、ステップＳ２０に進む。ステップＳ２０において、観察制御部３５は、観察結果を、表示パネル３２などの表示装置に表示させる。
【００６５】
図５は、表示装置に表示される観察結果を模式的に示した図である。
【００６６】
図５に示すように、低倍画像に相当する観察画像ＩＤには、特定域観察において認識された観察対象の位置を示す地点Ａ乃至地点Ｄが、培養容器１５内の対応する位置に重畳されている。これらの地点Ａ乃至地点Ｄのいずれかが観察者により指示された場合、指示された地点に対応する観察対象について取得された複数枚の高倍画像が画像タイリングされ、それにより得られる観察画像が表示される。例えば、地点Ａが指示された場合、観察画像ＨＡに示すように、特定域観察ＨＡ−１乃至特定域観察ＨＡ−ｉ（ｉ：地点Ａの特定域観察の回数）のそれぞれを行うことで、各特定域観察位置ごとに取得される９枚の高倍画像を画像タイリングして得られる観察画像により、例えば細胞の位相差や細胞発現のタイムラプス画像が表示されることになる。また、例えば、地点Ｂが指示された場合、観察画像ＨＢに示すように、特定域観察ＨＢ−１乃至特定域観察ＨＢ−ｊ（ｊ：地点Ｂの特定域観察の回数）のそれぞれを行うことで、各特定域観察ごとに取得される９枚の高倍画像を画像タイリングして得られる観察画像により、例えば細胞コロニーの位相差、蛍光発現のタイムラプス画像、細胞コロニーの大きさ変化などの形態情報が表示されることになる。
【００６７】
このように、培養容器１５全体を示した観察画像ＩＤ内に、全体観察により順次取得される低倍画像から認識された細胞特定条件に一致する観察対象の位置が表示され、その観察対象の位置が指示されると、指示された観察対象についての特定域観察により取得された複数の高倍画像を画像タイリングして得られる観察画像が、タイムラプス画像として表示されることになる。このタイムラプス画像としては、位相差観察によるタイムラプス画像、蛍光観察によるタイムラプス画像、あるいは、位相差観察と蛍光観察により得られた画像を重ね合わせたタイムラプス画像が表示可能とされる。また、これらのタイムラプス画像を表示するに際し、例えば、観察対象の大きさなどの属性情報や環境条件などを表示したユーザインターフェースを提供することができる。
【００６８】
以上のように、所定の繰り返し間隔で行われる全域観察により順次取得される低倍画像から、細胞の形態や蛍光信号の有無、細胞コロニーの大きさ、あるいは周辺の状況などの細胞特定条件（第１の条件）に一致する細胞や細胞コロニーが観察対象として特定されるため、新たに観察対象に追加すべき細胞や細胞コロニーが出てきたとしても、観察者の操作を介することなく、その細胞等が観察対象として追加されることになる。これにより、観察者が新たに観察対象に追加すべき細胞や細胞コロニーを見逃すといったこともなくなり、確実に観察対象の観察を行うことができる。
【００６９】
また、認識された観察対象ごとに、観察対象とその観察対象の周辺が、観察対象ごとに設定される細胞観察条件（第２の条件）に従って特定域観察され、それにより観察対象ごとに複数の高倍画像が取得されるので、培養容器１５全体を特定域観察して、高倍画像を取得する必要がなくなり、観察処理を高速化することが可能となる。また、培養容器１５全体の高倍画像を取得する必要がなくなることから、画像容量を低減することが可能となる。
【００７０】
なお、以上の説明では、細胞観察条件は、観察の目的に応じてあらかじめ設定される情報や観察により得られた情報を基に設定されるとして説明したが、その設定画面を表示パネル３２等の表示装置に表示させることで、観察者の入力操作により細胞観察条件を設定できるようにしてもよい。
【００７１】
また、図３のフローチャートに記述されたステップは、記載された順序に沿って時系列的に行われる処理はもちろん、必ずしも時系列的に処理されなくとも、並列的あるいは個別に実行される処理をも含むものである。
【００７２】
また、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【符号の説明】
【００７３】
１ 観察装置， １１ 第１筐体， １２ 第２筐体， １５ 培養容器， ２１ 恒温室， ２２ 正面扉， ２３ 正面開口， ２４ 搬出入口， ２５ ストッカ， ２６ 容器搬送機構， ２７ 観察ユニット， ３１ 制御ユニット， ３２ 表示パネル， ３３ 観察情報記憶部， ３４ 画像解析部， ３５ 観察制御部， ４１ 透過光照明部， ４２ 蛍光落射照明部， ４３ 試料台， ４４ 観察部， ５１ 透過光用LED， ５２ 透過光用光学系， ５３ａ乃至５３ｃ 蛍光用LED， ５４ 蛍光用光学系， ５５ 対物レンズ， ５６ ステージ， ５７ 撮影部， ５８ 画像処理部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料の経時的な変化を観察する観察装置において、
あらかじめ設定される所定の繰り返し時間間隔で、前記生体試料を収容した容器内の全域を任意の倍率で撮影して、低倍画像を取得する低倍画像取得手段と、
前記低倍画像が取得された場合、観察対象を特定するための第１の条件に基づいて、前記低倍画像に含まれる前記観察対象を特定する特定手段と、
特定された前記観察対象の位置ごとの観察条件を設定するための第２の条件に基づいて、特定された前記観察対象を前記任意の倍率よりも高倍率で撮影して、高倍画像を取得する高倍画像取得手段と
を備えることを特徴とする観察装置。
【請求項２】
前記高倍画像取得手段は、特定された前記観察対象の位置ごとに異なる前記第２の条件に基づいて、特定された前記観察対象の位置ごとに、所定の繰り返し時間間隔でタイムラプス撮影して、複数の高倍画像を取得する
ことを特徴とする請求項１に記載の観察装置。
【請求項３】
前記第２の条件には、前記観察対象を含む高倍画像と、前記観察対象の周辺を撮影することで得られる高倍画像を画像タイリングして１枚の観察画像を得るために必要となる前記高倍画像の画像枚数であって、取得された前記低倍画像から得られる前記観察対象の大きさに対応した前記画像枚数が条件として含まれており、
前記高倍画像取得手段は、前記第２の条件に含まれる前記画像枚数に基づいて、複数の高倍画像を取得する
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の観察装置。
【請求項４】
前記低倍画像上の特定された前記観察対象に対応する位置に、前記観察対象を示す位置情報が重畳された観察画像を表示させる表示制御手段をさらに備え、
前記表示制御手段は、観察者により前記低倍画像に重畳された前記位置情報が指示された場合、指示された前記位置情報に対応する前記観察対象について取得された前記複数の高倍画像を画像タイリングして得られる観察画像を表示させる
ことを特徴とする請求項３に記載の観察装置。
【請求項１】
生体試料の経時的な変化を観察する観察装置において、
あらかじめ設定される所定の繰り返し時間間隔で、前記生体試料を収容した容器内の全域を任意の倍率で撮影して、低倍画像を取得する低倍画像取得手段と、
前記低倍画像が取得された場合、観察対象を特定するための第１の条件に基づいて、前記低倍画像に含まれる前記観察対象を特定する特定手段と、
特定された前記観察対象の位置ごとの観察条件を設定するための第２の条件に基づいて、特定された前記観察対象を前記任意の倍率よりも高倍率で撮影して、高倍画像を取得する高倍画像取得手段と
を備えることを特徴とする観察装置。
【請求項２】
前記高倍画像取得手段は、特定された前記観察対象の位置ごとに異なる前記第２の条件に基づいて、特定された前記観察対象の位置ごとに、所定の繰り返し時間間隔でタイムラプス撮影して、複数の高倍画像を取得する
ことを特徴とする請求項１に記載の観察装置。
【請求項３】
前記第２の条件には、前記観察対象を含む高倍画像と、前記観察対象の周辺を撮影することで得られる高倍画像を画像タイリングして１枚の観察画像を得るために必要となる前記高倍画像の画像枚数であって、取得された前記低倍画像から得られる前記観察対象の大きさに対応した前記画像枚数が条件として含まれており、
前記高倍画像取得手段は、前記第２の条件に含まれる前記画像枚数に基づいて、複数の高倍画像を取得する
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の観察装置。
【請求項４】
前記低倍画像上の特定された前記観察対象に対応する位置に、前記観察対象を示す位置情報が重畳された観察画像を表示させる表示制御手段をさらに備え、
前記表示制御手段は、観察者により前記低倍画像に重畳された前記位置情報が指示された場合、指示された前記位置情報に対応する前記観察対象について取得された前記複数の高倍画像を画像タイリングして得られる観察画像を表示させる
ことを特徴とする請求項３に記載の観察装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−２９４９（Ｐ２０１２−２９４９Ａ）
【公開日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１３６４９２（Ｐ２０１０−１３６４９２）
【出願日】平成２２年６月１５日（２０１０．６．１５）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月１５日（２０１０．６．１５）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
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