記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法
【課題】カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIV（ＣａＭＫIV）をターゲットとした、記憶能力の減退に対する治療薬のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】（１）第１の蛍光物質で標識されたカルモジュリンと、第２の蛍光物質で標識されたＣａＭＫIVと、前記被検化合物と、を溶液中で接触させ、第１の蛍光物質と、第２の蛍光物質との接近に基づく蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定する、または、（２）第１および第２の蛍光物質で標識されたＣａＭＫIVと、前記被検化合物と、を溶液中で相互作用させ、ＣａＭＫIVの立体構造が変化することに基づく、第１の蛍光物質と第２の蛍光物質の蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定する。
【解決手段】（１）第１の蛍光物質で標識されたカルモジュリンと、第２の蛍光物質で標識されたＣａＭＫIVと、前記被検化合物と、を溶液中で接触させ、第１の蛍光物質と、第２の蛍光物質との接近に基づく蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定する、または、（２）第１および第２の蛍光物質で標識されたＣａＭＫIVと、前記被検化合物と、を溶液中で相互作用させ、ＣａＭＫIVの立体構造が変化することに基づく、第１の蛍光物質と第２の蛍光物質の蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用した、記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
老化に伴う記憶能力の減退は、人類共通の悩みであり、高齢化社会を迎える我が国においても切実な問題である。また、認知症やパーキンソン病などに記憶能力の減退と関連する疾患は多い。このような記憶能力の減退に対する治療法の開発や創薬のターゲットとなる遺伝子を発見することが望まれている。
【０００３】
記憶障害を改善させるためのターゲットとなる遺伝子は、真に記憶制御に関わる遺伝子でなければならない。実際には、その働きを強めれば記憶能力が向上し、逆に、弱めれば記憶能力が減退する遺伝子こそが記憶能力を正に制御しているといえる。
【０００４】
しかしながら、現在までに、記憶能力が高まった遺伝子変異マウスは報告されているものの、個体レベルで遺伝子制御の強弱に応じた記憶能力の変化が明確にされた例はほとんどない。
【０００５】
本発明者らは、記憶形成の過程において、遺伝子発現が誘導されることに着目し、Ｃａ２＋情報伝達経路がこの遺伝子発現に重要であることを示してきた（非特許文献１）。また、この情報伝達経路に存在するリン酸化酵素であるカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIV（以下、「ＣａＭＫIV」という）は、この機能が弱まると記憶形成能力が重篤な障害を受けることが共同研究中のグループより報告されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Satoshi Kida, SheenaA. Josselyn, Sandra Pena de Ortiz, Jeffrey H. Kogan, Itzamarie Chevere, ShoichiMasushige, and Alcino J. Silva. CREB required for the stability of new andreactivated fear memories. Nature. Neuroscience. USA, NPG New York 1stApr, 2002, volume 5, number 4, pp348-355
【非特許文献２】Feng Wei, Chang-Shen Qiu, Jason Liauw,Daphne A. Robinson, Nga Ho, Talal Chatila & Min ZhuoCalucium-calmodulin-dependent protein kinase IV is required for fear memory.Nature Neuroscience., USA, NPG New York, 1st May, 2002,volume 5,number 5, pp573-579.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
先に述べたように、わが国では認知症やパーキンソン病などに記憶能力の減退と関連する疾患が多いため、記憶能力の減退に対する治療法の開発や創薬のターゲットとなる遺伝子を発見することが望まれている。
【０００８】
本発明者らは、ＣａＭＫIVの働きを高めると記憶能力が向上するのではないかと仮説を立てて、脳内でＣａＭＫIVを過剰に発現する遺伝子操作マウスを開発し、この遺伝子操作マウスの解析を行った。
【０００９】
その結果、脳内でＣａＭＫIVを過剰に発現する遺伝子操作マウスでは野生型（普通の）マウスの約１．７倍量のＣａＭＫIVが記憶形成の中枢である海馬に存在しており、この酵素の働きが強まっていること、細胞レベルにおける記憶形成のモデルと考えられている長期増強（ＬＴＰ）が強まっていることが明らかとなった。さらに、記憶能力テストの結果、複数の課題において、この変異型マウスの記憶能力が顕著に向上していることが明らかとなった。
【００１０】
以上のように、ＣａＭＫIVの働きが弱まると記憶能力が低下し、強まると記憶能力が向上することから、ＣａＭＫIVは記憶能力の正の制御因子として働いていると結論した。従って、ＣａＭＫIVをターゲットとして、記憶能力の減退に対する被検化合物の効果を検討すれば、新薬の開発につながるものと思われる。
【００１１】
しかしながら、従来、新薬の効果を検証するには、一般的に、新薬を動物に直接注射して、in vivoでその効果を検証するが、そのような手法では膨大な数の動物、労力及びコストが必要になる。これは記憶能力の減退に対する被検化合物の新薬の効果を検証する場合も同様である。
【００１２】
そこで本発明は、かかる知見に基づき、ＣａＭＫIVをターゲットとした、記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は上記課題を解決するために、（１）記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法であって、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる第１の蛍光物質で標識されたカルモジュリンと、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー受容体となる第２の蛍光物質で標識されたカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVと、前記被検化合物と、を溶液中で接触させ、前記カルモジュリンがカルシウムイオンと結合した時に形成されるカルシウムイオン／カルモジュリン複合体と、前記カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVとが相互作用した時の、前記第１の蛍光物質と、前記第２の蛍光物質との接近に基づく、前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質の蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定し、測定された蛍光値と、前記被検化合物の非存在下で同様に測定した蛍光値とを比較することを特徴とする、記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法を提供するものである。
【００１４】
また、本発明は、（２）記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法であって、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる第１の蛍光物質および蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー受容体となる第２の蛍光物質とで標識されたカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVと、カルモジュリンと、前記被検化合物と、を溶液中で接触させ、前記カルモジュリンがカルシウムイオンと結合した時に形成されるカルシウムイオン／カルモジュリン複合体と、前記カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVとが相互作用した時の、前記カルモジュリン依存性キナーゼIVの立体構造が変化することに基づく、前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質の蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定し、測定された蛍光値と、前記被検化合物の非存在下で同様に測定した蛍光値とを比較することを特徴とする、記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
記憶能力の正の制御因子として働いているＣａＭＫIVをターゲットとした、本発明のスクリーニング方法によれば、試験管レベル（in vitro）で新薬の効果を評価することができるため、新薬開発にかかる労力とコストの問題を解消することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明のスクリーニング方法の概要を説明するための図である。
【図２】第１の蛍光物質としてＣＦＰを使用し、第２の蛍光物質としてＹＦＰを使用した場合のスクリーニング方法の概要を説明した図である。
【図３】発現ベクターを細胞に導入して融合タンパク質群発現細胞を得るために使用する融合タンパク質群をコードする遺伝子を示す図である。
【図４】図３で得られたタンパク質を用いてＣａＭＫIVの活性を検出する原理を説明するための図である。
【図５】被検化合物として、イオノマイシンのみを添加した場合とKN-93を同時添加した場合とで、ＣａＭＫIVの蛍光強度が変化する様子を蛍光顕微鏡で経時的に観察した結果を示す図である。
【図６】図５における蛍光強度の比を経時的に測定した結果を示す図である。
【図７】細胞内カルシウムイオン濃度増加前と増加5分後において蛍光エネルギー移動値を測定した結果を示す図である。
【図８】発現ベクターを細胞に導入して融合タンパク質群発現細胞を得るために使用する融合タンパク質群をコードする遺伝子を示す図である。
【図９】図８で得られたタンパク質を用いてＣａＭＫIVの活性を検出する原理を説明するための図である。
【図１０】被検化合物として、イオノマイシンのみを添加した場合とKN-93を同時添加した場合とで、細胞内カルシウムイオン濃度増加後にＣａＭＫIVの構造変化により蛍光強度が変化する様子を蛍光顕微鏡で経時的に観察した結果を示す図である。
【図１１】図１０における蛍光強度の比を経時的に測定した結果を示す図である。
【図１２】細胞内カルシウムイオン濃度増加前と増加5分後において蛍光エネルギー移動値を測定した結果を示す図である。
【図１３】YFP-CaMKIV発現ベクターを示す図である。
【図１４】CFP-CaM発現ベクターを示す図である。
【図１５】YFP-CaMKIV-CFP発現ベクターを示す図である。
【図１６】カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIV（ＣａＭＫIV）が活性化するメカニズムを説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本実施形態の記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法について説明する。図１６は、カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIV（ＣａＭＫIV）が活性化するメカニズムを説明するための図である。
【００１８】
ＣａＭＫIVは記憶形成の中枢である海馬の興奮性ニューロンに存在するタンパク質であり、転写因子CREBを中心として記憶形成に必要なタンパク質群をリン酸化する役割を有している。脳の中で長期的な記憶が形成される際、海馬興奮性ニューロン内のカルシウムイオン（Ｃａ２＋）濃度が上昇する。そして、カルシウムイオンがカルシウムイオン結合タンパク質であるカルモジュリン（ＣａＭ）に結合して、カルシウムイオン／カルモジュリン（Ｃａ２＋／ＣａＭ）複合体が形成される。
【００１９】
ＣａＭＫIVは普段、不活性型で存在しているが、カルシウムイオン／カルモジュリン（Ｃａ２＋／ＣａＭ）がＣａＭＫIVに相互作用すると、ＣａＭＫIVの立体構造が変化して活性型に変化する。その後、カルシウムイオン濃度が低下して、ＣａＭＫIVからＣａ２＋／ＣａＭが離れるとＣａＭＫIVは不活性型に戻る。
【００２０】
また、カルシウムイオンの高濃度が維持されるような場合には、ＣａＭＫIVはカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ（ＣａＭＫＫ）によって２００番目のトレオニン残基(Ｔ２００)がリン酸化されることが知られており、このリン酸化によってＣａ２＋／ＣａＭが離れた後もＣａＭＫIVは活性型として維持される。
【００２１】
このＴ２００のリン酸化によって、Ｃａ２＋／ＣａＭが結合した場合と同様な構造変化が維持され、ＣａＭＫIVの活性化状態が維持されると考えられている。また、この場合には脱リン酸化酵素が働いて、ＣａＭＫIVが脱リン酸化を受けることで不活性化型に戻る。
【００２２】
図１は本発明のスクリーニング方法の概要を説明するための図である。ＣａＭＫIVが活性型か不活性型かを判断する指標は２つある。１つには、図１（Ａ）に示すように、ＣａＭＫIVとカルシウムイオン／カルモジュリン（Ｃａ２＋／ＣａＭ）の相互作用を検出するスクリーニング系である。すなわち、ＹＦＰ−ＣａＭＫIVとＣＦＰ−ＣａＭ間の相互作用によりＣＦＰとＹＦＰ間の距離が短くなり、４３３ｎｍの波長を励起すると、ＣＦＰからの発光が蛍光エネルギー移動によりＹＦＰに吸収され、４７５ｎｍ（水色）ではなく５２７ｎｍ（黄色）の発光波長が観察されるため、これを検出するものである。
【００２３】
２つには、図１（Ｂ）に示すように、ＣａＭＫIVの立体構造の変化を検出するスクリーニング系である。すなわち、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）／カルモジュリンとの相互作用やT200のリン酸化によってＣａＭＫIVの構造変化を誘導すると、ＣＦＰからＹＦＰへの蛍光エネルギー移動が起こらなくなり、ＣＦＰからの発光が強く観察されるため、これを検出するものである。
【００２４】
従って、本実施形態のスクリーニング方法は、「ＣａＭＫIVとカルシウムイオン／カルモジュリン（Ｃａ２＋／ＣａＭ）との相互作用を利用するスクリーニング方法」と、「ＣａＭＫIVの立体構造が変化することを利用するスクリーニング方法」に分類される。但し、それらは各々単独で使用してもよく、両者を組み合わせて使用してもよい。
【００２５】
１．ＣａＭＫIVの相互作用を利用するスクリーニング方法
本実施形態のスクリーニング方法は、記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法であって、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる第１の蛍光物質で標識されたカルモジュリンと、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー受容体となる第２の蛍光物質で標識されたカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVと、前記被検化合物と、を溶液中で接触させ、前記カルモジュリンがカルシウムイオンと結合した時に形成されるカルシウムイオン／カルモジュリン複合体と、前記カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVとが相互作用した時の、前記第１の蛍光物質と、前記第２の蛍光物質との接近に基づく、前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質の蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定し、測定された蛍光値と、前記被検化合物の非存在下で同様に測定した蛍光値とを比較するものである。
【００２６】
本実施形態に使用される、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体（ドナー）となる第１の蛍光物質および蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー受容体となる第２の蛍光物質（アクセプター）としては、蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescent Resonance
Energy Transfer：ＦＲＥＴ）を起こす組み合わせである限り、その種類を問わない。
【００２７】
蛍光物質の具体例としては、例えば、ＣＦＰ（cyan fluorescent protein）、ＹＦＰ（yellow fluorescent protein）、ＧＦＰ（green fluorescent protein）、ＲＦＰ（red fluorescent protein）、ＢＦＰ（Blue fluorescent protein）、フルオロセイン（ＦＩＴＣ）、ローダミン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、テキサスレッド、アクリジンオレンジ、サイバーグリーン、Ｃｙ３等、ならびにこれらの誘導体を含む公知のあらゆる蛍光物質が挙げられる。
【００２８】
第１の蛍光物質（ドナー）と第２の蛍光物質（アクセプター）との組み合わせの例としては、例えば、ＣＦＰとＹＦＰ、ＧＦＰとＲＦＰ、ＢＦＰとＧＦＰ、フルオロセインとＣＦＰ、フルオロセインとローダミン、Ｃｙ５とＣｙ５．５など多様な組み合わせが挙げられる。
【００２９】
また、用いる蛍光物質は、可視光域内（３５０〜７００ｎｍ付近）に励起波長を有し、さらに可視光域内に発光波長を有するものが好ましく、水溶液中での蛍光強度が強いものが特に好ましい。
【００３０】
蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体（ドナー）となる蛍光物質およびエネルギー移動のエネルギー受容体（アクセプター）となる蛍光物質は、エネルギー受容体となる物質の励起スペクトルがエネルギー供与体となる物質の放射スペクトルと重複するように選択すればよい。それぞれの蛍光物質の励起波長および蛍光波長は公知であり、また容易に測定することができる。この蛍光物質に固有の励起波長および蛍光波長に基づいて蛍光物質の組合わせを適宜選択することができる。
【００３１】
本実施形態において、相互作用が生じたときにエネルギー供与体とエネルギー受容体が蛍光共鳴エネルギー移動を起こすのに適切な配向を保つ相対的位置に存在するように蛍光物質をカルモジュリン及びＣａＭＫIVに含ませる必要がある。
【００３２】
このためには、カルモジュリンにおいてはN末端側にCFPを遺伝子工学的に融合した融合タンパク質(CFP-CaM)（配列番号：１）を作製すればよい。CFP-CaMのアミノ酸配列のうち、1〜239番のアミノ酸配列がCFP、240〜241番のアミノ酸配列が連結部位、242〜390番のアミノ酸配列がカルモジュリン（CaM）であり、CFP-CaMは一続きのタンパク質（融合タンパク質）として発現させる。
【００３３】
一方、ＣａＭＫIVにおいてはN末端側にYFPを遺伝子工学的に融合した融合タンパク質(YFP-CaMKIV)（配列番号：２）を作製すればよい。YFP-CaMKIVのアミノ酸配列のうち、1〜239番のアミノ酸配列がYFP、240〜243番のアミノ酸配列が連結部位、244〜716番のアミノ酸配列がＣａＭＫIVである。
【００３４】
なお、本実施形態では上記の方法以外にも例えば、他の蛍光タンパク質群の組み合わせを用いたり、有機化学的に他の蛍光物質を付加することも可能である。
【００３５】
本実施形態において「記憶能力の減退に対する被検化合物」とは、例えば、認知症、パーキンソン病、ダウン症、統合失調症、またはこれらに類似する疾病など記憶障害を伴う疾患、さらには、加齢に伴う記憶能力の減退を治療又は改善する化合物を意味する。
【００３６】
標識されたカルモジュリン及びCaMKIVと前記被検化合物を接触させるためには培養細胞等の生細胞内で発現ベクターを用いて融合タンパク質群CFP-CaM及びYFP-CaMKIVを発現させればよく、また、大腸菌で生産させた融合タンパク質群、あるいは、in vitroの反応系を用いて合成した融合タンパク質群を用いて溶液中で両者間の結合を検出することもできる。
【００３７】
本実施形態において、「相互作用」とは、通常は、タンパク質と標的分子間のイオン結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合及び静電力による結合のうち少なくとも１つから生じる分子間に働く力による作用を示すが、この用語は最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含有される。
【００３８】
励起光の光源としては特に制限はなく、例えば、ブロードな紫外光や可視光をフィルターや分光器を用いて所望の波長範囲とした光源を用いてもよいし、レーザー等の単色光を用いてもよい。レーザー光源を使う場合は、ヘリウムカドミウムレーザー（４４２ｎｍ）、ブルーダイオードレーザー（４０５ｎｍ）、Arレーザー（４５７ｎｍ）、ＬＤ励起固体レーザー（４３０ｎｍ）等を用いてもよい。二光子励起法であれば８００ｎｍ付近のパルスレーザーを用いてもよい。
【００３９】
本実施形態においては、第１の蛍光物質で標識されたカルモジュリン（ＣａＭ）がカルシウムイオン（Ｃａ２＋）と結合しカルシウムイオン／カルモジュリン（Ｃａ２＋／ＣａＭ）が形成されると、さらにこれが第２の蛍光物質で標識されたＣａＭＫIVと相互作用し、ＣａＭＫIVが活性型に変化する。このとき、第１の蛍光物質と第２の蛍光物質との接近により、第１の蛍光物質から第２の蛍光物質に蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescent Resonance Energy Transfer：ＦＲＥＴ）が起こり、第２の蛍光物質が発色する。すなわち、ＣａＭＫIVが活性型で存在している状態では、第２の蛍光物質の蛍光強度が増加し、第１の蛍光強度が低下する。
【００４０】
一方、ＣａＭＫIVが不活性型で存在している状態では、第１の蛍光物質と第２の蛍光物質との間で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は起こらないか、蛍光共鳴エネルギー移動の効率が低いため、第１の蛍光物質の蛍光強度は高いままであり、第２の蛍光物質の蛍光強度は低いままである。
【００４１】
なお、測定においては、エネルギー供与体である第１の蛍光物質またはエネルギー受容体である第２の蛍光物質の両方またはいずれかの物質からの蛍光を測定すればよい。
【００４２】
蛍光強度の測定は、所定の波長を単波長で測定してもよいし、一定の範囲の波長について蛍光スペクトルを測定してもよい。エネルギー受容体またはエネルギー供与体からの蛍光の増加と減少の程度を測定することにより、ＣａＭＫIVの活性を検出することができる。
【００４３】
この際、第１の蛍光物質からの蛍光強度と第２の蛍光物質からの蛍光強度の比を測定し、比から蛍光共鳴エネルギー移動が起きたかどうかを判断することもできる。また、蛍光の測定は、強光によりアクセプター（第２の蛍光物質）を選択的に褪色させて、ドナー（第１の蛍光物質）の蛍光回復程度を計測することで蛍光共鳴エネルギー移動の効率を算出するフォトブリーチング法で行うことも（第２の蛍光物質をブリーチングする前後の第１の蛍光物質の蛍光強度をそれぞれFb、FaとするとFRET効率=1-(Fb/Fa)で表される）、定常光励起発光を測定する方法で行うことも、時間分解蛍光測定法により行うこともできる。蛍光測定は、通常用いられている蛍光分光光度計により行うことができる。また、市販の蛍光共鳴エネルギー移動解析装置を用いてもよい。
【００４４】
このような性質を利用して、記憶能力の減退に対する被検化合物を添加し、測定された蛍光値と、被検化合物の非存在下で同様に測定した蛍光値とを比較すれば、被検化合物がＣａＭＫIVの活性に及ぼす効果を測定することが可能になるため、かかる被検化合物のスクリーニングに有用である。
【００４５】
２．ＣａＭＫIVの立体構造が変化することを利用するスクリーニング方法
本実施形態のスクリーニング方法は、記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法であって、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる第１の蛍光物質および蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー受容体となる第２の蛍光物質とで標識されたカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVと、カルモジュリンと、前記被検化合物と、を溶液中で接触させ、前記カルモジュリンがカルシウムイオンと結合した時に形成されるカルシウムイオン／カルモジュリン複合体と、前記カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVとが相互作用した時の、前記カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVの立体構造が変化することに基づく、前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質の蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定し、測定された蛍光値と、前記被検化合物の非存在下で同様に測定した蛍光値とを比較するものである。また、前記被検化合物存在下で、カルシウムイオン／カルモジュリンとは非依存的に、前記カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVの立体構造が変化することに基づく、前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質の蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定してもよい。
【００４６】
すなわち、本実施形態では、ＣａＭＫIV中に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のエネルギー供与体（ドナー）となる蛍光物質と、エネルギー移動のエネルギー受容体（アクセプター）となる蛍光物質の２種類の蛍光物質を含んでいる点が、先述した実施形態とは異なる。
【００４７】
本実施形態に使用される、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体（ドナー）となる第１の蛍光物質および蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー受容体となる第２の蛍光物質（アクセプター）としては、蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescent Resonance
Energy Transfer：ＦＲＥＴ）を起こす組み合わせである限り、その種類を問わない。
【００４８】
蛍光物質の具体例としては、例えば、ＣＦＰ（cyan fluorescent protein）、ＹＦＰ（yellow fluorescent
protein）、ＧＦＰ（green fluorescent protein）、ＲＦＰ（red fluorescent protein）、ＢＦＰ（Blue fluorescent protein）、フルオロセイン（ＦＩＴＣ）、ローダミン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、テキサスレッド、アクリジンオレンジ、サイバーグリーン、Ｃｙ３等、ならびにこれらの誘導体を含む公知のあらゆる蛍光物質が挙げられる。
【００４９】
第１の蛍光物質（ドナー）と第２の蛍光物質（アクセプター）との組み合わせの例としては、例えば、ＣＦＰとＹＦＰ、ＧＦＰとＲＦＰ、ＢＦＰとＧＦＰ、フルオロセインとＣＦＰ、フルオロセインとローダミン、Ｃｙ５とＣｙ５．５など多様な組み合わせが挙げられる。
【００５０】
また、用いる蛍光物質は、可視光域内（３５０〜７００ｎｍ付近）に励起波長を有し、さらに可視光域内に発光波長を有するものが好ましく、水溶液中での蛍光強度が強いものが特に好ましい。
【００５１】
蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体（ドナー）となる蛍光物質およびエネルギー移動のエネルギー受容体（アクセプター）となる蛍光物質は、エネルギー受容体となる物質の励起スペクトルがエネルギー供与体となる物質の放射スペクトルと重複するように選択すればよい。それぞれの蛍光物質の励起波長および蛍光波長は公知であり、また容易に測定することができる。この蛍光物質に固有の励起波長および蛍光波長に基づいて蛍光物質の組合わせを適宜選択することができる。
【００５２】
本実施形態において、構造変化が起こっていないときにエネルギー供与体とエネルギー受容体が蛍光共鳴エネルギー移動を起こすのに適切な配向を保つ相対的位置に存在するようにＣａＭＫIVに含ませる必要がある。
【００５３】
このためには、カルモジュリンにおいてはN末端側にYFPを、C末端側にCFPをそれぞれ遺伝子工学的に融合した融合タンパク質(YFP-CaMKIV-CFP)（配列番号：３）を作製すればよい。YFP-CaMKIV-CFPのアミノ酸配列のうち、1〜239番のアミノ酸配列がYFP、240〜243番のアミノ酸配列が連結部位、244〜716番のアミノ酸配列がＣａＭＫIV、717〜718番のアミノ酸配列が連結部位、719〜963番のアミノ酸配列がCFPを示し、YFP-CaMKIV-CFPを一続きの融合タンパク質として発現させる。
【００５４】
なお、本実施形態では上記の方法以外にも例えば、他の蛍光タンパク質群の組み合わせを用いたり、有機化学的に他の蛍光物質を付加することも可能である。
【００５５】
本実施形態において「記憶能力の減退に対する被検化合物」とは、例えば、認知症、パーキンソン病、ダウン症、統合失調症、またはこれらに類似する疾病など記憶障害を伴う疾患、さらには、加齢に伴う記憶能力の減退を治療又は改善する化合物を意味する。
【００５６】
標識されたCaMKIVと前記被検化合物を接触させるためには培養細胞等の生細胞内で発現ベクターを用いて融合タンパク質YFP-CaMKIV-CFPを発現させればよく、また、大腸菌で生産させた融合タンパク質、あるいは、in vitroの反応系を用いて合成した融合タンパク質を用いて溶液中で両者間の結合を検出することもできる。
【００５７】
第１及び第２の蛍光物質で標識されたＣａＭＫIVは、カルシウムイオン／カルモジュリン（Ｃａ２＋／ＣａＭ）と相互作用することができ、カルシウムイオン／カルモジュリン（Ｃａ２＋／ＣａＭ）と相互作用すると、立体構造が変化する。この立体構造が変化することにより、エネルギー供与体である第１の蛍光物質とエネルギー受容体である第２の蛍光物質の立体的な位置が変動し、両者の距離および配向が変化し両者の間で起こる蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化する。
【００５８】
ここで、「立体構造が変化する」とは、カルシウムイオン／カルモジュリン（Ｃａ２＋／ＣａＭ）がＣａＭＫIVと相互作用し、ＣａＭＫIVの活性部位が露出して、相手側のタンパク質をリン酸化できるようになる状態をいう。この場合、カルシウムイオン／カルモジュリン（Ｃａ２＋／ＣａＭ）と相互作用していない状態では、ＣａＭＫIVはＮ末端とＣ末端が近づいた「閉じた」状態であるが、カルシウムイオン／カルモジュリン（Ｃａ２＋／ＣａＭ）と相互作用すると、Ｎ末端とＣ末端の距離が離れて「開いた」状態となり、活性部位が露出する。
【００５９】
励起光の光源としては特に制限はなく、例えば、ブロードな紫外光や可視光をフィルターや分光器を用いて所望の波長範囲とした光源を用いてもよいし、レーザー等の単色光を用いてもよい。レーザー光源を使う場合は、ヘリウムカドミウムレーザー（４４２ｎｍ）が一般的であるが、ブルーダイオードレーザー（４０５ｎｍ）、Arレーザー（４５７ｎｍ）、ＬＤ励起固体レーザー（４３０ｎｍ）等を用いてもよい。二光子励起法であれば８００ｎｍ付近のパルスレーザーを用いてもよい。
【００６０】
本実施形態においては、第１及び第２の蛍光物質で標識されたＣａＭＫIVが不活性型で存在する場合は、第１の蛍光物質と第２の蛍光物質とが接近していることにより、第１の蛍光物質から第２の蛍光物質に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が起こり、第２の蛍光物質が発色する。すなわち、ＣａＭＫIVが不活性型で存在している状態では、第２の蛍光物質の蛍光強度は高いままであり、第１の蛍光強度は低いままである。
【００６１】
一方、第１及び第２の蛍光物質で標識されたＣａＭＫIVがカルシウムイオン／カルモジュリン（Ｃａ２＋／ＣａＭ）と相互作用すると、ＣａＭＫIVが活性型に変化する。このとき、ＣａＭＫIVの立体構造が変化するため、第１の蛍光物質から第２の蛍光物質に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が起こらなくなるか、蛍光共鳴エネルギー移動の効率が低下するため、第１の蛍光物質の蛍光強度が増加し、第２の蛍光物質の蛍光強度が低下する。
【００６２】
なお、測定においては、エネルギー供与体である第１の蛍光物質またはエネルギー受容体である第２の蛍光物質の両方またはいずれかの物質からの蛍光を測定すればよい。
【００６３】
蛍光強度の測定は、所定の波長を単波長で測定してもよいし、一定の範囲の波長について蛍光スペクトルを測定してもよい。エネルギー受容体またはエネルギー供与体からの蛍光の増加と減少の程度を測定することにより、ＣａＭＫIVの活性を検出することができる。
【００６４】
この際、第１の蛍光物質からの蛍光強度と第２の蛍光物質からの蛍光強度の比を測定し、比から蛍光共鳴エネルギー移動が起きたかどうかを判断することもできる。また、蛍光の測定は、強光によりアクセプター（第２の蛍光物質）を選択的に褪色させて、ドナー（第１の蛍光物質）の蛍光回復程度を計測することで蛍光共鳴エネルギー移動の効率を算出するフォトブリーチング法で行うことも（第２の蛍光物質をブリーチングする前後の第１の蛍光物質の蛍光強度をそれぞれFb、FaとするとFRET効率=1-(Fb/Fa)で表される）、定常光励起発光を測定する方法で行うことも、時間分解蛍光測定法により行うこともできる。蛍光測定は、通常用いられている蛍光分光光度計により行うことができる。また、市販の蛍光共鳴エネルギー移動解析装置を用いてもよい。
【００６５】
このような性質を利用して、記憶能力の減退に対する被検化合物を添加し、測定された蛍光値と、被検化合物の非存在下で同様に測定した蛍光値とを比較すれば、被検化合物がＣａＭＫIVの活性に及ぼす効果を測定することが可能になるため、かかる被検化合物のスクリーニングに有用である。
【実施例】
【００６６】
１）蛍光物質の標識（融合タンパク質群の発現ベクターの概略）
ヒト由来のCaMKIV cDNAのオープンリーディングフレームの5’末端側にTCC GGA GGC GGC配列を付加し、3’末端側にAGATCT配列を導入し、pEYFP-C1 Vector（クロンテック社）のBspEIとBglIIの制限酵素サイトに導入して、YFP-CaMKIV発現ベクターを構築した（図１３）。
【００６７】
マウス由来のCaM cDNAのオープンリーディングフレームの5’末端側にTCC GGA配列を付加し、3’末端側にGAA TTC配列を導入し、pECFP-C1 Vector（クロンテック社）のBspEIとEcoRIの制限酵素サイトに導入して、CFP-CaM発現ベクターを構築した（図１４）。
【００６８】
ヒト由来のCaMKIV cDNAのオープンリーディングフレームの5’末端側にTCC GGA GGC GGC配列を付加し、3’末端の終止コドンTAAの代わりにGGTACCを導入し、pEYFP-C1 Vector（クロンテック社）のBspEIとKpnIの制限酵素サイトに導入し、その後、このKpnIとBamHIのサイトにオープンリーディングフレームの5’末端側にGGTACCを導入したCFP cDNAを導入して、YFP-CaMKIV-CFP発現ベクターを構築した（図１５）。
【００６９】
２）細胞への遺伝子導入（Transfection）
100μlのFBS free DMEM (Nissui社製, 05915)にYFP-αCaMKIV-CFP、あるいはYFP-CaMKIVとCFP-CaMの発現Vectorをそれぞれ2μgとPLUS（商標）Reagent (invitrogen社製, 11514-015)を2μl加え、15分間室温で放置した。その後Lipofectamine（商標）Reagent (invitrogen社製, 18324-012)を2μl加えた100μlのFBS free DMEMを加え、更に15分間室温で放置した後にFBS free DMEMを800μl加え、全量を5×105個のHela細胞を播種したDishに添加した。CO2インキュベーター (37℃, 5% CO2) で2時間培養した後に10% FBS contain DMEMを1ml加え、CO2インキュベーター (37℃, 5% CO2) で48時間培養した後にImagingを行った。
【００７０】
３）蛍光値の測定
Transfectionから48時間後に培地をHBSS buffer (5mM KCl，0.4mM KH2PO4，137mM NaCl，4mM NaHCO3，0.3mM Na2HPO4，pH 7.4) 1.95mlに交換し、CO2インキュベーター (37℃, 5% CO2) で30分培養後にImagingを行った。細胞の観察には倒立顕微鏡IX70 (OLYMPUS社製) を用いた。YFPの励起用フィルターとして500AF25 (OMEGA OPTICAL社製) 、蛍光検出用のフィルターとして535DF25 (OMEGA OPTICAL社製) を用いた。また、CFPの励起用フィルターとして440DF21 (OMEGA OPTICAL社製) 、蛍光検出用のフィルターとして480DF30（OMEGA OPTICAL社製）を用いた。
【００７１】
経時的に蛍光強度の比を測定する場合には、観察開始から30秒毎に440DF21でCFP (Donor社製) を励起した際のCFPの蛍光画像を480DF30で取得し、YFPの蛍光画像を535DF25で取得した。2つの蛍光検出用フィルターの切り替えはフィルターホイールをコンピュータ制御下で回転させて行った。取得した蛍光画像の取り込みはDouble-View system (浜松ホトニクス社製) を介して冷却CCDカメラ：ORCA-ER (浜松ホトニクス社製) で行った。観察する細胞は、本実験で使用するFRETシステムで蛍光強度が1000〜3000付近のものを選んだ。imaging開始から5分後に薬剤添加を行い、その後20分間観察を行った。取得した画像はAQUACOSMOS (浜松ホトニクス社製) を用いて解析し、Emission Ratio (CFP励起のYFPの蛍光/CFP励起のCFPの蛍光) を算出した。
【００７２】
フォトブリーチング法を用いてFRET発生効率を求める場合には、前記同様に蛍光強度が1000〜3000付近の細胞を選んだ。始めに440DF21でCFPを励起した際のCFPの蛍光画像を480DF30で取得し、500AF25でYFPを励起した場合のYFPの蛍光画像を535DF25で取得した。YFPとCFPの蛍光画像を取得した後、535nmの光を細胞に1分間照射し、YFPを退色させた(Acceptor bleaching)。その後、CFPの蛍光画像とYFPの蛍光画像を再び取得した。取得した画像はAQUACOSMOSを用いて解析し、Acceptor bleachingによってYFPの退色が観察された場合、FRET efficiency (1-Acceptor bleaching後のCFPの蛍光強度/ Acceptor bleaching前のCFPの蛍光強度) を算出した。薬剤添加を行う場合は、添加5分後に前述と同様の方法でAcceptor bleachingを行った。
【００７３】
１．相互作用（アクティブの時に蛍光する）を利用したスクリーニング方法
（１）概要の説明
図２は、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる第１の蛍光物質としてＣＦＰを使用し、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー受容体となる第２の蛍光物質としてＹＦＰを使用した場合のスクリーニング方法の概要を説明した図である。
【００７４】
（２）蛍光物質の標識
図３は、カルモジュリンとＣａＭＫIVとの結合を指標にして、細胞内あるいは試験管内においてスクリーニングを実施するための蛍光物質を融合したタンパク質群の構造を示す図である。図３（Ａ）はＣＦＰとカルモジュリン（ＣａＭ）をコードする遺伝子、図３（Ｂ）はＹＦＰとＣａＭＫIVをコードする遺伝子を示す。
【００７５】
（３）スクリーニング方法の説明
図４は、上記（２）で得られたタンパク質を用いてＣａＭＫIVの活性を検出する原理を説明するための図である。CFP-CaMとYFP-CaMKIVが相互作用していない状態では、CFPを励起する波長の光を照射するとCFPからの発光波長が検出されるが、両者が相互作用した状態では、CFPを励起する波長の光を照射するとCFPからの発光がYFPに吸収される蛍光共鳴エネルギー移動が起こり、YFPからの発光波長が検出されるようになる。
【００７６】
図５は、被検化合物として、イオノマイシンのみを添加した場合とKN-93を同時添加した場合とで、ＣａＭＫIVの蛍光強度が変化する様子を蛍光顕微鏡で経時的に観察した結果を示す図である。細胞内カルシウムイオン濃度増加後にＣａＭＫIVとカルモジュリンの相互作用により蛍光強度の比が増加する様子を経時的に蛍光顕微鏡で観察した結果を示したのが上図であり、CaMKIVの活性化を阻害するKN-93によってこの結合を妨げた結果を示したのが下図である。
【００７７】
図６は、図５における蛍光強度の比を経時的に測定した結果を示す図である。図面の上線がイオノマイシンのみを添加した結果、下線がKN-93を同時添加した結果を示す。細胞内カルシウムイオン濃度を増加させるイオノマイシンは測定開始後１分で細胞培養上清に添加した。イオノマイシンのみを添加した場合に蛍光強度の比が増加して、蛍光共鳴エネルギー移動が起こっており、CaMKIVとCaMとの相互作用が起こったことが示された。
【００７８】
図７は、フォトブリーチング法を用いて、細胞内カルシウムイオン濃度を増加させるイオノマイシン添加前と添加5分後においてそれぞれ蛍光共鳴エネルギー移動効率を測定した結果を示す図である。イオノマイシン添加５分後において蛍光エネルギー移動効率の増加が観察され、CaMとCaMKIVが相互作用したことが示され、一方、KN93を同時添加した場合には、蛍光エネルギー移動効率の増加は観察されず、CaMとCaMKIVの相互作用は認められなかった。
【００７９】
２．立体構造の変化（アクティブの時に蛍光しない）を利用したスクリーニング方法の説明
（１）蛍光物質の標識
図８は、発現ベクターを細胞に導入して融合タンパク質群発現細胞を得るために使用する融合タンパク質をコードする遺伝子を示す図であり、ＹＦＰ、ＣａＭＫIVとＣＦＰをコードする遺伝子を示す。
【００８０】
（２）スクリーニング方法の説明
図９は、上記（１）で得られたタンパク質を用いてＣａＭＫIVの活性を検出する原理を説明するための図である。YFP-CaMKIV-CFPが構造変化していない状態では、CFPとYFPとの距離が近いため、CFPを励起する波長の光を照射するとCFPからの発光がYFPに吸収される蛍光共鳴エネルギー移動が起こり、YFPからの発光波長が検出される。一方、CaMKIVが活性化型となり、YFP-CaMKIV-CFPの構造変化が起こると、CFPとYFPの間の距離が長くなるため、CFPを励起する波長の光を照射するとCFPからの発光波長が強く検出されるようになる。
【００８１】
図１０は、被検化合物として、イオノマイシンのみを添加した場合とKN-93を同時添加した場合とで、ＣａＭＫIVの蛍光強度が変化する様子を蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。細胞内カルシウムイオン濃度増加後にＣａＭＫIVの構造変化により蛍光強度の比が低下する様子を経時的に蛍光顕微鏡で観察した結果を示したのが上図であり、CaMKIVの活性化を阻害するKN-93によってこの構造変化を妨げた結果を示したのが下図である。
【００８２】
図１１は、図１０における蛍光値を経時的に測定した結果を示す図である。図面の下線がイオノマイシンのみを添加した結果、上線がKN-93を同時添加した結果を示す。細胞内カルシウムイオン濃度を増加させるイオノマイシンは測定開始後１分で細胞培養上清に添加した。イオノマイシンのみを添加した場合に蛍光強度の比が低下して、蛍光共鳴エネルギー移動が起こらなくなったこと、つまり、CaMKIVの構造変化が起こったことが示された。
【００８３】
図１２は、フォトブリーチング法を用いて、細胞内カルシウムイオン濃度を増加させるイオノマイシン添加前と添加５分後においてそれぞれ蛍光共鳴エネルギー移動効率を測定した結果を示す図である。イオノマイシン添加５分後において蛍光エネルギー移動効率の低下が観察され、CaMKIVが構造変化したことが示され、一方、KN93を同時添加した場合には、蛍光エネルギー移動効率の低下は観察されず、CaMとCaMKIVの相互作用は認められなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用した、記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
老化に伴う記憶能力の減退は、人類共通の悩みであり、高齢化社会を迎える我が国においても切実な問題である。また、認知症やパーキンソン病などに記憶能力の減退と関連する疾患は多い。このような記憶能力の減退に対する治療法の開発や創薬のターゲットとなる遺伝子を発見することが望まれている。
【０００３】
記憶障害を改善させるためのターゲットとなる遺伝子は、真に記憶制御に関わる遺伝子でなければならない。実際には、その働きを強めれば記憶能力が向上し、逆に、弱めれば記憶能力が減退する遺伝子こそが記憶能力を正に制御しているといえる。
【０００４】
しかしながら、現在までに、記憶能力が高まった遺伝子変異マウスは報告されているものの、個体レベルで遺伝子制御の強弱に応じた記憶能力の変化が明確にされた例はほとんどない。
【０００５】
本発明者らは、記憶形成の過程において、遺伝子発現が誘導されることに着目し、Ｃａ２＋情報伝達経路がこの遺伝子発現に重要であることを示してきた（非特許文献１）。また、この情報伝達経路に存在するリン酸化酵素であるカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIV（以下、「ＣａＭＫIV」という）は、この機能が弱まると記憶形成能力が重篤な障害を受けることが共同研究中のグループより報告されている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Satoshi Kida, SheenaA. Josselyn, Sandra Pena de Ortiz, Jeffrey H. Kogan, Itzamarie Chevere, ShoichiMasushige, and Alcino J. Silva. CREB required for the stability of new andreactivated fear memories. Nature. Neuroscience. USA, NPG New York 1stApr, 2002, volume 5, number 4, pp348-355
【非特許文献２】Feng Wei, Chang-Shen Qiu, Jason Liauw,Daphne A. Robinson, Nga Ho, Talal Chatila & Min ZhuoCalucium-calmodulin-dependent protein kinase IV is required for fear memory.Nature Neuroscience., USA, NPG New York, 1st May, 2002,volume 5,number 5, pp573-579.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
先に述べたように、わが国では認知症やパーキンソン病などに記憶能力の減退と関連する疾患が多いため、記憶能力の減退に対する治療法の開発や創薬のターゲットとなる遺伝子を発見することが望まれている。
【０００８】
本発明者らは、ＣａＭＫIVの働きを高めると記憶能力が向上するのではないかと仮説を立てて、脳内でＣａＭＫIVを過剰に発現する遺伝子操作マウスを開発し、この遺伝子操作マウスの解析を行った。
【０００９】
その結果、脳内でＣａＭＫIVを過剰に発現する遺伝子操作マウスでは野生型（普通の）マウスの約１．７倍量のＣａＭＫIVが記憶形成の中枢である海馬に存在しており、この酵素の働きが強まっていること、細胞レベルにおける記憶形成のモデルと考えられている長期増強（ＬＴＰ）が強まっていることが明らかとなった。さらに、記憶能力テストの結果、複数の課題において、この変異型マウスの記憶能力が顕著に向上していることが明らかとなった。
【００１０】
以上のように、ＣａＭＫIVの働きが弱まると記憶能力が低下し、強まると記憶能力が向上することから、ＣａＭＫIVは記憶能力の正の制御因子として働いていると結論した。従って、ＣａＭＫIVをターゲットとして、記憶能力の減退に対する被検化合物の効果を検討すれば、新薬の開発につながるものと思われる。
【００１１】
しかしながら、従来、新薬の効果を検証するには、一般的に、新薬を動物に直接注射して、in vivoでその効果を検証するが、そのような手法では膨大な数の動物、労力及びコストが必要になる。これは記憶能力の減退に対する被検化合物の新薬の効果を検証する場合も同様である。
【００１２】
そこで本発明は、かかる知見に基づき、ＣａＭＫIVをターゲットとした、記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は上記課題を解決するために、（１）記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法であって、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる第１の蛍光物質で標識されたカルモジュリンと、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー受容体となる第２の蛍光物質で標識されたカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVと、前記被検化合物と、を溶液中で接触させ、前記カルモジュリンがカルシウムイオンと結合した時に形成されるカルシウムイオン／カルモジュリン複合体と、前記カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVとが相互作用した時の、前記第１の蛍光物質と、前記第２の蛍光物質との接近に基づく、前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質の蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定し、測定された蛍光値と、前記被検化合物の非存在下で同様に測定した蛍光値とを比較することを特徴とする、記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法を提供するものである。
【００１４】
また、本発明は、（２）記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法であって、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる第１の蛍光物質および蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー受容体となる第２の蛍光物質とで標識されたカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVと、カルモジュリンと、前記被検化合物と、を溶液中で接触させ、前記カルモジュリンがカルシウムイオンと結合した時に形成されるカルシウムイオン／カルモジュリン複合体と、前記カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVとが相互作用した時の、前記カルモジュリン依存性キナーゼIVの立体構造が変化することに基づく、前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質の蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定し、測定された蛍光値と、前記被検化合物の非存在下で同様に測定した蛍光値とを比較することを特徴とする、記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
記憶能力の正の制御因子として働いているＣａＭＫIVをターゲットとした、本発明のスクリーニング方法によれば、試験管レベル（in vitro）で新薬の効果を評価することができるため、新薬開発にかかる労力とコストの問題を解消することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明のスクリーニング方法の概要を説明するための図である。
【図２】第１の蛍光物質としてＣＦＰを使用し、第２の蛍光物質としてＹＦＰを使用した場合のスクリーニング方法の概要を説明した図である。
【図３】発現ベクターを細胞に導入して融合タンパク質群発現細胞を得るために使用する融合タンパク質群をコードする遺伝子を示す図である。
【図４】図３で得られたタンパク質を用いてＣａＭＫIVの活性を検出する原理を説明するための図である。
【図５】被検化合物として、イオノマイシンのみを添加した場合とKN-93を同時添加した場合とで、ＣａＭＫIVの蛍光強度が変化する様子を蛍光顕微鏡で経時的に観察した結果を示す図である。
【図６】図５における蛍光強度の比を経時的に測定した結果を示す図である。
【図７】細胞内カルシウムイオン濃度増加前と増加5分後において蛍光エネルギー移動値を測定した結果を示す図である。
【図８】発現ベクターを細胞に導入して融合タンパク質群発現細胞を得るために使用する融合タンパク質群をコードする遺伝子を示す図である。
【図９】図８で得られたタンパク質を用いてＣａＭＫIVの活性を検出する原理を説明するための図である。
【図１０】被検化合物として、イオノマイシンのみを添加した場合とKN-93を同時添加した場合とで、細胞内カルシウムイオン濃度増加後にＣａＭＫIVの構造変化により蛍光強度が変化する様子を蛍光顕微鏡で経時的に観察した結果を示す図である。
【図１１】図１０における蛍光強度の比を経時的に測定した結果を示す図である。
【図１２】細胞内カルシウムイオン濃度増加前と増加5分後において蛍光エネルギー移動値を測定した結果を示す図である。
【図１３】YFP-CaMKIV発現ベクターを示す図である。
【図１４】CFP-CaM発現ベクターを示す図である。
【図１５】YFP-CaMKIV-CFP発現ベクターを示す図である。
【図１６】カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIV（ＣａＭＫIV）が活性化するメカニズムを説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本実施形態の記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法について説明する。図１６は、カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIV（ＣａＭＫIV）が活性化するメカニズムを説明するための図である。
【００１８】
ＣａＭＫIVは記憶形成の中枢である海馬の興奮性ニューロンに存在するタンパク質であり、転写因子CREBを中心として記憶形成に必要なタンパク質群をリン酸化する役割を有している。脳の中で長期的な記憶が形成される際、海馬興奮性ニューロン内のカルシウムイオン（Ｃａ２＋）濃度が上昇する。そして、カルシウムイオンがカルシウムイオン結合タンパク質であるカルモジュリン（ＣａＭ）に結合して、カルシウムイオン／カルモジュリン（Ｃａ２＋／ＣａＭ）複合体が形成される。
【００１９】
ＣａＭＫIVは普段、不活性型で存在しているが、カルシウムイオン／カルモジュリン（Ｃａ２＋／ＣａＭ）がＣａＭＫIVに相互作用すると、ＣａＭＫIVの立体構造が変化して活性型に変化する。その後、カルシウムイオン濃度が低下して、ＣａＭＫIVからＣａ２＋／ＣａＭが離れるとＣａＭＫIVは不活性型に戻る。
【００２０】
また、カルシウムイオンの高濃度が維持されるような場合には、ＣａＭＫIVはカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼキナーゼ（ＣａＭＫＫ）によって２００番目のトレオニン残基(Ｔ２００)がリン酸化されることが知られており、このリン酸化によってＣａ２＋／ＣａＭが離れた後もＣａＭＫIVは活性型として維持される。
【００２１】
このＴ２００のリン酸化によって、Ｃａ２＋／ＣａＭが結合した場合と同様な構造変化が維持され、ＣａＭＫIVの活性化状態が維持されると考えられている。また、この場合には脱リン酸化酵素が働いて、ＣａＭＫIVが脱リン酸化を受けることで不活性化型に戻る。
【００２２】
図１は本発明のスクリーニング方法の概要を説明するための図である。ＣａＭＫIVが活性型か不活性型かを判断する指標は２つある。１つには、図１（Ａ）に示すように、ＣａＭＫIVとカルシウムイオン／カルモジュリン（Ｃａ２＋／ＣａＭ）の相互作用を検出するスクリーニング系である。すなわち、ＹＦＰ−ＣａＭＫIVとＣＦＰ−ＣａＭ間の相互作用によりＣＦＰとＹＦＰ間の距離が短くなり、４３３ｎｍの波長を励起すると、ＣＦＰからの発光が蛍光エネルギー移動によりＹＦＰに吸収され、４７５ｎｍ（水色）ではなく５２７ｎｍ（黄色）の発光波長が観察されるため、これを検出するものである。
【００２３】
２つには、図１（Ｂ）に示すように、ＣａＭＫIVの立体構造の変化を検出するスクリーニング系である。すなわち、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）／カルモジュリンとの相互作用やT200のリン酸化によってＣａＭＫIVの構造変化を誘導すると、ＣＦＰからＹＦＰへの蛍光エネルギー移動が起こらなくなり、ＣＦＰからの発光が強く観察されるため、これを検出するものである。
【００２４】
従って、本実施形態のスクリーニング方法は、「ＣａＭＫIVとカルシウムイオン／カルモジュリン（Ｃａ２＋／ＣａＭ）との相互作用を利用するスクリーニング方法」と、「ＣａＭＫIVの立体構造が変化することを利用するスクリーニング方法」に分類される。但し、それらは各々単独で使用してもよく、両者を組み合わせて使用してもよい。
【００２５】
１．ＣａＭＫIVの相互作用を利用するスクリーニング方法
本実施形態のスクリーニング方法は、記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法であって、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる第１の蛍光物質で標識されたカルモジュリンと、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー受容体となる第２の蛍光物質で標識されたカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVと、前記被検化合物と、を溶液中で接触させ、前記カルモジュリンがカルシウムイオンと結合した時に形成されるカルシウムイオン／カルモジュリン複合体と、前記カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVとが相互作用した時の、前記第１の蛍光物質と、前記第２の蛍光物質との接近に基づく、前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質の蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定し、測定された蛍光値と、前記被検化合物の非存在下で同様に測定した蛍光値とを比較するものである。
【００２６】
本実施形態に使用される、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体（ドナー）となる第１の蛍光物質および蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー受容体となる第２の蛍光物質（アクセプター）としては、蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescent Resonance
Energy Transfer：ＦＲＥＴ）を起こす組み合わせである限り、その種類を問わない。
【００２７】
蛍光物質の具体例としては、例えば、ＣＦＰ（cyan fluorescent protein）、ＹＦＰ（yellow fluorescent protein）、ＧＦＰ（green fluorescent protein）、ＲＦＰ（red fluorescent protein）、ＢＦＰ（Blue fluorescent protein）、フルオロセイン（ＦＩＴＣ）、ローダミン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、テキサスレッド、アクリジンオレンジ、サイバーグリーン、Ｃｙ３等、ならびにこれらの誘導体を含む公知のあらゆる蛍光物質が挙げられる。
【００２８】
第１の蛍光物質（ドナー）と第２の蛍光物質（アクセプター）との組み合わせの例としては、例えば、ＣＦＰとＹＦＰ、ＧＦＰとＲＦＰ、ＢＦＰとＧＦＰ、フルオロセインとＣＦＰ、フルオロセインとローダミン、Ｃｙ５とＣｙ５．５など多様な組み合わせが挙げられる。
【００２９】
また、用いる蛍光物質は、可視光域内（３５０〜７００ｎｍ付近）に励起波長を有し、さらに可視光域内に発光波長を有するものが好ましく、水溶液中での蛍光強度が強いものが特に好ましい。
【００３０】
蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体（ドナー）となる蛍光物質およびエネルギー移動のエネルギー受容体（アクセプター）となる蛍光物質は、エネルギー受容体となる物質の励起スペクトルがエネルギー供与体となる物質の放射スペクトルと重複するように選択すればよい。それぞれの蛍光物質の励起波長および蛍光波長は公知であり、また容易に測定することができる。この蛍光物質に固有の励起波長および蛍光波長に基づいて蛍光物質の組合わせを適宜選択することができる。
【００３１】
本実施形態において、相互作用が生じたときにエネルギー供与体とエネルギー受容体が蛍光共鳴エネルギー移動を起こすのに適切な配向を保つ相対的位置に存在するように蛍光物質をカルモジュリン及びＣａＭＫIVに含ませる必要がある。
【００３２】
このためには、カルモジュリンにおいてはN末端側にCFPを遺伝子工学的に融合した融合タンパク質(CFP-CaM)（配列番号：１）を作製すればよい。CFP-CaMのアミノ酸配列のうち、1〜239番のアミノ酸配列がCFP、240〜241番のアミノ酸配列が連結部位、242〜390番のアミノ酸配列がカルモジュリン（CaM）であり、CFP-CaMは一続きのタンパク質（融合タンパク質）として発現させる。
【００３３】
一方、ＣａＭＫIVにおいてはN末端側にYFPを遺伝子工学的に融合した融合タンパク質(YFP-CaMKIV)（配列番号：２）を作製すればよい。YFP-CaMKIVのアミノ酸配列のうち、1〜239番のアミノ酸配列がYFP、240〜243番のアミノ酸配列が連結部位、244〜716番のアミノ酸配列がＣａＭＫIVである。
【００３４】
なお、本実施形態では上記の方法以外にも例えば、他の蛍光タンパク質群の組み合わせを用いたり、有機化学的に他の蛍光物質を付加することも可能である。
【００３５】
本実施形態において「記憶能力の減退に対する被検化合物」とは、例えば、認知症、パーキンソン病、ダウン症、統合失調症、またはこれらに類似する疾病など記憶障害を伴う疾患、さらには、加齢に伴う記憶能力の減退を治療又は改善する化合物を意味する。
【００３６】
標識されたカルモジュリン及びCaMKIVと前記被検化合物を接触させるためには培養細胞等の生細胞内で発現ベクターを用いて融合タンパク質群CFP-CaM及びYFP-CaMKIVを発現させればよく、また、大腸菌で生産させた融合タンパク質群、あるいは、in vitroの反応系を用いて合成した融合タンパク質群を用いて溶液中で両者間の結合を検出することもできる。
【００３７】
本実施形態において、「相互作用」とは、通常は、タンパク質と標的分子間のイオン結合、疎水結合、水素結合、ファンデルワールス結合及び静電力による結合のうち少なくとも１つから生じる分子間に働く力による作用を示すが、この用語は最も広義に解釈すべきであり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。静電力による結合とは、静電結合の他、電気的反発も含有する。また、上記作用の結果生じる結合反応、合成反応、分解反応も相互作用に含有される。
【００３８】
励起光の光源としては特に制限はなく、例えば、ブロードな紫外光や可視光をフィルターや分光器を用いて所望の波長範囲とした光源を用いてもよいし、レーザー等の単色光を用いてもよい。レーザー光源を使う場合は、ヘリウムカドミウムレーザー（４４２ｎｍ）、ブルーダイオードレーザー（４０５ｎｍ）、Arレーザー（４５７ｎｍ）、ＬＤ励起固体レーザー（４３０ｎｍ）等を用いてもよい。二光子励起法であれば８００ｎｍ付近のパルスレーザーを用いてもよい。
【００３９】
本実施形態においては、第１の蛍光物質で標識されたカルモジュリン（ＣａＭ）がカルシウムイオン（Ｃａ２＋）と結合しカルシウムイオン／カルモジュリン（Ｃａ２＋／ＣａＭ）が形成されると、さらにこれが第２の蛍光物質で標識されたＣａＭＫIVと相互作用し、ＣａＭＫIVが活性型に変化する。このとき、第１の蛍光物質と第２の蛍光物質との接近により、第１の蛍光物質から第２の蛍光物質に蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescent Resonance Energy Transfer：ＦＲＥＴ）が起こり、第２の蛍光物質が発色する。すなわち、ＣａＭＫIVが活性型で存在している状態では、第２の蛍光物質の蛍光強度が増加し、第１の蛍光強度が低下する。
【００４０】
一方、ＣａＭＫIVが不活性型で存在している状態では、第１の蛍光物質と第２の蛍光物質との間で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は起こらないか、蛍光共鳴エネルギー移動の効率が低いため、第１の蛍光物質の蛍光強度は高いままであり、第２の蛍光物質の蛍光強度は低いままである。
【００４１】
なお、測定においては、エネルギー供与体である第１の蛍光物質またはエネルギー受容体である第２の蛍光物質の両方またはいずれかの物質からの蛍光を測定すればよい。
【００４２】
蛍光強度の測定は、所定の波長を単波長で測定してもよいし、一定の範囲の波長について蛍光スペクトルを測定してもよい。エネルギー受容体またはエネルギー供与体からの蛍光の増加と減少の程度を測定することにより、ＣａＭＫIVの活性を検出することができる。
【００４３】
この際、第１の蛍光物質からの蛍光強度と第２の蛍光物質からの蛍光強度の比を測定し、比から蛍光共鳴エネルギー移動が起きたかどうかを判断することもできる。また、蛍光の測定は、強光によりアクセプター（第２の蛍光物質）を選択的に褪色させて、ドナー（第１の蛍光物質）の蛍光回復程度を計測することで蛍光共鳴エネルギー移動の効率を算出するフォトブリーチング法で行うことも（第２の蛍光物質をブリーチングする前後の第１の蛍光物質の蛍光強度をそれぞれFb、FaとするとFRET効率=1-(Fb/Fa)で表される）、定常光励起発光を測定する方法で行うことも、時間分解蛍光測定法により行うこともできる。蛍光測定は、通常用いられている蛍光分光光度計により行うことができる。また、市販の蛍光共鳴エネルギー移動解析装置を用いてもよい。
【００４４】
このような性質を利用して、記憶能力の減退に対する被検化合物を添加し、測定された蛍光値と、被検化合物の非存在下で同様に測定した蛍光値とを比較すれば、被検化合物がＣａＭＫIVの活性に及ぼす効果を測定することが可能になるため、かかる被検化合物のスクリーニングに有用である。
【００４５】
２．ＣａＭＫIVの立体構造が変化することを利用するスクリーニング方法
本実施形態のスクリーニング方法は、記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法であって、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる第１の蛍光物質および蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー受容体となる第２の蛍光物質とで標識されたカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVと、カルモジュリンと、前記被検化合物と、を溶液中で接触させ、前記カルモジュリンがカルシウムイオンと結合した時に形成されるカルシウムイオン／カルモジュリン複合体と、前記カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVとが相互作用した時の、前記カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVの立体構造が変化することに基づく、前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質の蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定し、測定された蛍光値と、前記被検化合物の非存在下で同様に測定した蛍光値とを比較するものである。また、前記被検化合物存在下で、カルシウムイオン／カルモジュリンとは非依存的に、前記カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVの立体構造が変化することに基づく、前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質の蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定してもよい。
【００４６】
すなわち、本実施形態では、ＣａＭＫIV中に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のエネルギー供与体（ドナー）となる蛍光物質と、エネルギー移動のエネルギー受容体（アクセプター）となる蛍光物質の２種類の蛍光物質を含んでいる点が、先述した実施形態とは異なる。
【００４７】
本実施形態に使用される、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体（ドナー）となる第１の蛍光物質および蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー受容体となる第２の蛍光物質（アクセプター）としては、蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescent Resonance
Energy Transfer：ＦＲＥＴ）を起こす組み合わせである限り、その種類を問わない。
【００４８】
蛍光物質の具体例としては、例えば、ＣＦＰ（cyan fluorescent protein）、ＹＦＰ（yellow fluorescent
protein）、ＧＦＰ（green fluorescent protein）、ＲＦＰ（red fluorescent protein）、ＢＦＰ（Blue fluorescent protein）、フルオロセイン（ＦＩＴＣ）、ローダミン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、テキサスレッド、アクリジンオレンジ、サイバーグリーン、Ｃｙ３等、ならびにこれらの誘導体を含む公知のあらゆる蛍光物質が挙げられる。
【００４９】
第１の蛍光物質（ドナー）と第２の蛍光物質（アクセプター）との組み合わせの例としては、例えば、ＣＦＰとＹＦＰ、ＧＦＰとＲＦＰ、ＢＦＰとＧＦＰ、フルオロセインとＣＦＰ、フルオロセインとローダミン、Ｃｙ５とＣｙ５．５など多様な組み合わせが挙げられる。
【００５０】
また、用いる蛍光物質は、可視光域内（３５０〜７００ｎｍ付近）に励起波長を有し、さらに可視光域内に発光波長を有するものが好ましく、水溶液中での蛍光強度が強いものが特に好ましい。
【００５１】
蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体（ドナー）となる蛍光物質およびエネルギー移動のエネルギー受容体（アクセプター）となる蛍光物質は、エネルギー受容体となる物質の励起スペクトルがエネルギー供与体となる物質の放射スペクトルと重複するように選択すればよい。それぞれの蛍光物質の励起波長および蛍光波長は公知であり、また容易に測定することができる。この蛍光物質に固有の励起波長および蛍光波長に基づいて蛍光物質の組合わせを適宜選択することができる。
【００５２】
本実施形態において、構造変化が起こっていないときにエネルギー供与体とエネルギー受容体が蛍光共鳴エネルギー移動を起こすのに適切な配向を保つ相対的位置に存在するようにＣａＭＫIVに含ませる必要がある。
【００５３】
このためには、カルモジュリンにおいてはN末端側にYFPを、C末端側にCFPをそれぞれ遺伝子工学的に融合した融合タンパク質(YFP-CaMKIV-CFP)（配列番号：３）を作製すればよい。YFP-CaMKIV-CFPのアミノ酸配列のうち、1〜239番のアミノ酸配列がYFP、240〜243番のアミノ酸配列が連結部位、244〜716番のアミノ酸配列がＣａＭＫIV、717〜718番のアミノ酸配列が連結部位、719〜963番のアミノ酸配列がCFPを示し、YFP-CaMKIV-CFPを一続きの融合タンパク質として発現させる。
【００５４】
なお、本実施形態では上記の方法以外にも例えば、他の蛍光タンパク質群の組み合わせを用いたり、有機化学的に他の蛍光物質を付加することも可能である。
【００５５】
本実施形態において「記憶能力の減退に対する被検化合物」とは、例えば、認知症、パーキンソン病、ダウン症、統合失調症、またはこれらに類似する疾病など記憶障害を伴う疾患、さらには、加齢に伴う記憶能力の減退を治療又は改善する化合物を意味する。
【００５６】
標識されたCaMKIVと前記被検化合物を接触させるためには培養細胞等の生細胞内で発現ベクターを用いて融合タンパク質YFP-CaMKIV-CFPを発現させればよく、また、大腸菌で生産させた融合タンパク質、あるいは、in vitroの反応系を用いて合成した融合タンパク質を用いて溶液中で両者間の結合を検出することもできる。
【００５７】
第１及び第２の蛍光物質で標識されたＣａＭＫIVは、カルシウムイオン／カルモジュリン（Ｃａ２＋／ＣａＭ）と相互作用することができ、カルシウムイオン／カルモジュリン（Ｃａ２＋／ＣａＭ）と相互作用すると、立体構造が変化する。この立体構造が変化することにより、エネルギー供与体である第１の蛍光物質とエネルギー受容体である第２の蛍光物質の立体的な位置が変動し、両者の距離および配向が変化し両者の間で起こる蛍光共鳴エネルギー移動の効率が変化する。
【００５８】
ここで、「立体構造が変化する」とは、カルシウムイオン／カルモジュリン（Ｃａ２＋／ＣａＭ）がＣａＭＫIVと相互作用し、ＣａＭＫIVの活性部位が露出して、相手側のタンパク質をリン酸化できるようになる状態をいう。この場合、カルシウムイオン／カルモジュリン（Ｃａ２＋／ＣａＭ）と相互作用していない状態では、ＣａＭＫIVはＮ末端とＣ末端が近づいた「閉じた」状態であるが、カルシウムイオン／カルモジュリン（Ｃａ２＋／ＣａＭ）と相互作用すると、Ｎ末端とＣ末端の距離が離れて「開いた」状態となり、活性部位が露出する。
【００５９】
励起光の光源としては特に制限はなく、例えば、ブロードな紫外光や可視光をフィルターや分光器を用いて所望の波長範囲とした光源を用いてもよいし、レーザー等の単色光を用いてもよい。レーザー光源を使う場合は、ヘリウムカドミウムレーザー（４４２ｎｍ）が一般的であるが、ブルーダイオードレーザー（４０５ｎｍ）、Arレーザー（４５７ｎｍ）、ＬＤ励起固体レーザー（４３０ｎｍ）等を用いてもよい。二光子励起法であれば８００ｎｍ付近のパルスレーザーを用いてもよい。
【００６０】
本実施形態においては、第１及び第２の蛍光物質で標識されたＣａＭＫIVが不活性型で存在する場合は、第１の蛍光物質と第２の蛍光物質とが接近していることにより、第１の蛍光物質から第２の蛍光物質に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が起こり、第２の蛍光物質が発色する。すなわち、ＣａＭＫIVが不活性型で存在している状態では、第２の蛍光物質の蛍光強度は高いままであり、第１の蛍光強度は低いままである。
【００６１】
一方、第１及び第２の蛍光物質で標識されたＣａＭＫIVがカルシウムイオン／カルモジュリン（Ｃａ２＋／ＣａＭ）と相互作用すると、ＣａＭＫIVが活性型に変化する。このとき、ＣａＭＫIVの立体構造が変化するため、第１の蛍光物質から第２の蛍光物質に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が起こらなくなるか、蛍光共鳴エネルギー移動の効率が低下するため、第１の蛍光物質の蛍光強度が増加し、第２の蛍光物質の蛍光強度が低下する。
【００６２】
なお、測定においては、エネルギー供与体である第１の蛍光物質またはエネルギー受容体である第２の蛍光物質の両方またはいずれかの物質からの蛍光を測定すればよい。
【００６３】
蛍光強度の測定は、所定の波長を単波長で測定してもよいし、一定の範囲の波長について蛍光スペクトルを測定してもよい。エネルギー受容体またはエネルギー供与体からの蛍光の増加と減少の程度を測定することにより、ＣａＭＫIVの活性を検出することができる。
【００６４】
この際、第１の蛍光物質からの蛍光強度と第２の蛍光物質からの蛍光強度の比を測定し、比から蛍光共鳴エネルギー移動が起きたかどうかを判断することもできる。また、蛍光の測定は、強光によりアクセプター（第２の蛍光物質）を選択的に褪色させて、ドナー（第１の蛍光物質）の蛍光回復程度を計測することで蛍光共鳴エネルギー移動の効率を算出するフォトブリーチング法で行うことも（第２の蛍光物質をブリーチングする前後の第１の蛍光物質の蛍光強度をそれぞれFb、FaとするとFRET効率=1-(Fb/Fa)で表される）、定常光励起発光を測定する方法で行うことも、時間分解蛍光測定法により行うこともできる。蛍光測定は、通常用いられている蛍光分光光度計により行うことができる。また、市販の蛍光共鳴エネルギー移動解析装置を用いてもよい。
【００６５】
このような性質を利用して、記憶能力の減退に対する被検化合物を添加し、測定された蛍光値と、被検化合物の非存在下で同様に測定した蛍光値とを比較すれば、被検化合物がＣａＭＫIVの活性に及ぼす効果を測定することが可能になるため、かかる被検化合物のスクリーニングに有用である。
【実施例】
【００６６】
１）蛍光物質の標識（融合タンパク質群の発現ベクターの概略）
ヒト由来のCaMKIV cDNAのオープンリーディングフレームの5’末端側にTCC GGA GGC GGC配列を付加し、3’末端側にAGATCT配列を導入し、pEYFP-C1 Vector（クロンテック社）のBspEIとBglIIの制限酵素サイトに導入して、YFP-CaMKIV発現ベクターを構築した（図１３）。
【００６７】
マウス由来のCaM cDNAのオープンリーディングフレームの5’末端側にTCC GGA配列を付加し、3’末端側にGAA TTC配列を導入し、pECFP-C1 Vector（クロンテック社）のBspEIとEcoRIの制限酵素サイトに導入して、CFP-CaM発現ベクターを構築した（図１４）。
【００６８】
ヒト由来のCaMKIV cDNAのオープンリーディングフレームの5’末端側にTCC GGA GGC GGC配列を付加し、3’末端の終止コドンTAAの代わりにGGTACCを導入し、pEYFP-C1 Vector（クロンテック社）のBspEIとKpnIの制限酵素サイトに導入し、その後、このKpnIとBamHIのサイトにオープンリーディングフレームの5’末端側にGGTACCを導入したCFP cDNAを導入して、YFP-CaMKIV-CFP発現ベクターを構築した（図１５）。
【００６９】
２）細胞への遺伝子導入（Transfection）
100μlのFBS free DMEM (Nissui社製, 05915)にYFP-αCaMKIV-CFP、あるいはYFP-CaMKIVとCFP-CaMの発現Vectorをそれぞれ2μgとPLUS（商標）Reagent (invitrogen社製, 11514-015)を2μl加え、15分間室温で放置した。その後Lipofectamine（商標）Reagent (invitrogen社製, 18324-012)を2μl加えた100μlのFBS free DMEMを加え、更に15分間室温で放置した後にFBS free DMEMを800μl加え、全量を5×105個のHela細胞を播種したDishに添加した。CO2インキュベーター (37℃, 5% CO2) で2時間培養した後に10% FBS contain DMEMを1ml加え、CO2インキュベーター (37℃, 5% CO2) で48時間培養した後にImagingを行った。
【００７０】
３）蛍光値の測定
Transfectionから48時間後に培地をHBSS buffer (5mM KCl，0.4mM KH2PO4，137mM NaCl，4mM NaHCO3，0.3mM Na2HPO4，pH 7.4) 1.95mlに交換し、CO2インキュベーター (37℃, 5% CO2) で30分培養後にImagingを行った。細胞の観察には倒立顕微鏡IX70 (OLYMPUS社製) を用いた。YFPの励起用フィルターとして500AF25 (OMEGA OPTICAL社製) 、蛍光検出用のフィルターとして535DF25 (OMEGA OPTICAL社製) を用いた。また、CFPの励起用フィルターとして440DF21 (OMEGA OPTICAL社製) 、蛍光検出用のフィルターとして480DF30（OMEGA OPTICAL社製）を用いた。
【００７１】
経時的に蛍光強度の比を測定する場合には、観察開始から30秒毎に440DF21でCFP (Donor社製) を励起した際のCFPの蛍光画像を480DF30で取得し、YFPの蛍光画像を535DF25で取得した。2つの蛍光検出用フィルターの切り替えはフィルターホイールをコンピュータ制御下で回転させて行った。取得した蛍光画像の取り込みはDouble-View system (浜松ホトニクス社製) を介して冷却CCDカメラ：ORCA-ER (浜松ホトニクス社製) で行った。観察する細胞は、本実験で使用するFRETシステムで蛍光強度が1000〜3000付近のものを選んだ。imaging開始から5分後に薬剤添加を行い、その後20分間観察を行った。取得した画像はAQUACOSMOS (浜松ホトニクス社製) を用いて解析し、Emission Ratio (CFP励起のYFPの蛍光/CFP励起のCFPの蛍光) を算出した。
【００７２】
フォトブリーチング法を用いてFRET発生効率を求める場合には、前記同様に蛍光強度が1000〜3000付近の細胞を選んだ。始めに440DF21でCFPを励起した際のCFPの蛍光画像を480DF30で取得し、500AF25でYFPを励起した場合のYFPの蛍光画像を535DF25で取得した。YFPとCFPの蛍光画像を取得した後、535nmの光を細胞に1分間照射し、YFPを退色させた(Acceptor bleaching)。その後、CFPの蛍光画像とYFPの蛍光画像を再び取得した。取得した画像はAQUACOSMOSを用いて解析し、Acceptor bleachingによってYFPの退色が観察された場合、FRET efficiency (1-Acceptor bleaching後のCFPの蛍光強度/ Acceptor bleaching前のCFPの蛍光強度) を算出した。薬剤添加を行う場合は、添加5分後に前述と同様の方法でAcceptor bleachingを行った。
【００７３】
１．相互作用（アクティブの時に蛍光する）を利用したスクリーニング方法
（１）概要の説明
図２は、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる第１の蛍光物質としてＣＦＰを使用し、蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー受容体となる第２の蛍光物質としてＹＦＰを使用した場合のスクリーニング方法の概要を説明した図である。
【００７４】
（２）蛍光物質の標識
図３は、カルモジュリンとＣａＭＫIVとの結合を指標にして、細胞内あるいは試験管内においてスクリーニングを実施するための蛍光物質を融合したタンパク質群の構造を示す図である。図３（Ａ）はＣＦＰとカルモジュリン（ＣａＭ）をコードする遺伝子、図３（Ｂ）はＹＦＰとＣａＭＫIVをコードする遺伝子を示す。
【００７５】
（３）スクリーニング方法の説明
図４は、上記（２）で得られたタンパク質を用いてＣａＭＫIVの活性を検出する原理を説明するための図である。CFP-CaMとYFP-CaMKIVが相互作用していない状態では、CFPを励起する波長の光を照射するとCFPからの発光波長が検出されるが、両者が相互作用した状態では、CFPを励起する波長の光を照射するとCFPからの発光がYFPに吸収される蛍光共鳴エネルギー移動が起こり、YFPからの発光波長が検出されるようになる。
【００７６】
図５は、被検化合物として、イオノマイシンのみを添加した場合とKN-93を同時添加した場合とで、ＣａＭＫIVの蛍光強度が変化する様子を蛍光顕微鏡で経時的に観察した結果を示す図である。細胞内カルシウムイオン濃度増加後にＣａＭＫIVとカルモジュリンの相互作用により蛍光強度の比が増加する様子を経時的に蛍光顕微鏡で観察した結果を示したのが上図であり、CaMKIVの活性化を阻害するKN-93によってこの結合を妨げた結果を示したのが下図である。
【００７７】
図６は、図５における蛍光強度の比を経時的に測定した結果を示す図である。図面の上線がイオノマイシンのみを添加した結果、下線がKN-93を同時添加した結果を示す。細胞内カルシウムイオン濃度を増加させるイオノマイシンは測定開始後１分で細胞培養上清に添加した。イオノマイシンのみを添加した場合に蛍光強度の比が増加して、蛍光共鳴エネルギー移動が起こっており、CaMKIVとCaMとの相互作用が起こったことが示された。
【００７８】
図７は、フォトブリーチング法を用いて、細胞内カルシウムイオン濃度を増加させるイオノマイシン添加前と添加5分後においてそれぞれ蛍光共鳴エネルギー移動効率を測定した結果を示す図である。イオノマイシン添加５分後において蛍光エネルギー移動効率の増加が観察され、CaMとCaMKIVが相互作用したことが示され、一方、KN93を同時添加した場合には、蛍光エネルギー移動効率の増加は観察されず、CaMとCaMKIVの相互作用は認められなかった。
【００７９】
２．立体構造の変化（アクティブの時に蛍光しない）を利用したスクリーニング方法の説明
（１）蛍光物質の標識
図８は、発現ベクターを細胞に導入して融合タンパク質群発現細胞を得るために使用する融合タンパク質をコードする遺伝子を示す図であり、ＹＦＰ、ＣａＭＫIVとＣＦＰをコードする遺伝子を示す。
【００８０】
（２）スクリーニング方法の説明
図９は、上記（１）で得られたタンパク質を用いてＣａＭＫIVの活性を検出する原理を説明するための図である。YFP-CaMKIV-CFPが構造変化していない状態では、CFPとYFPとの距離が近いため、CFPを励起する波長の光を照射するとCFPからの発光がYFPに吸収される蛍光共鳴エネルギー移動が起こり、YFPからの発光波長が検出される。一方、CaMKIVが活性化型となり、YFP-CaMKIV-CFPの構造変化が起こると、CFPとYFPの間の距離が長くなるため、CFPを励起する波長の光を照射するとCFPからの発光波長が強く検出されるようになる。
【００８１】
図１０は、被検化合物として、イオノマイシンのみを添加した場合とKN-93を同時添加した場合とで、ＣａＭＫIVの蛍光強度が変化する様子を蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。細胞内カルシウムイオン濃度増加後にＣａＭＫIVの構造変化により蛍光強度の比が低下する様子を経時的に蛍光顕微鏡で観察した結果を示したのが上図であり、CaMKIVの活性化を阻害するKN-93によってこの構造変化を妨げた結果を示したのが下図である。
【００８２】
図１１は、図１０における蛍光値を経時的に測定した結果を示す図である。図面の下線がイオノマイシンのみを添加した結果、上線がKN-93を同時添加した結果を示す。細胞内カルシウムイオン濃度を増加させるイオノマイシンは測定開始後１分で細胞培養上清に添加した。イオノマイシンのみを添加した場合に蛍光強度の比が低下して、蛍光共鳴エネルギー移動が起こらなくなったこと、つまり、CaMKIVの構造変化が起こったことが示された。
【００８３】
図１２は、フォトブリーチング法を用いて、細胞内カルシウムイオン濃度を増加させるイオノマイシン添加前と添加５分後においてそれぞれ蛍光共鳴エネルギー移動効率を測定した結果を示す図である。イオノマイシン添加５分後において蛍光エネルギー移動効率の低下が観察され、CaMKIVが構造変化したことが示され、一方、KN93を同時添加した場合には、蛍光エネルギー移動効率の低下は観察されず、CaMとCaMKIVの相互作用は認められなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法であって、
蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる第１の蛍光物質で標識されたカルモジュリンと、
蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー受容体となる第２の蛍光物質で標識されたカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVと、
前記被検化合物と、を溶液中で接触させ、
前記カルモジュリンがカルシウムイオンと結合した時に形成されるカルシウムイオン／カルモジュリン複合体と、前記カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVとが相互作用した時の、前記第１の蛍光物質と、前記第２の蛍光物質との接近に基づく、前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質の蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定し、
測定された蛍光値と、前記被検化合物の非存在下で同様に測定した蛍光値とを比較することを特徴とする、
記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法。
【請求項２】
記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法であって、
蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる第１の蛍光物質および蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー受容体となる第２の蛍光物質とで標識されたカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVと、
カルモジュリンと、
前記被検化合物と、を溶液中で接触させ、
前記カルモジュリンがカルシウムイオンと結合した時に形成されるカルシウムイオン／カルモジュリン複合体と、前記カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVとが相互作用した時の、前記カルモジュリン依存性キナーゼIVの立体構造が変化することに基づく、前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質の蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定し、
測定された蛍光値と、前記被検化合物の非存在下で同様に測定した蛍光値とを比較することを特徴とする、
記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法。
【請求項１】
記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法であって、
蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる第１の蛍光物質で標識されたカルモジュリンと、
蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー受容体となる第２の蛍光物質で標識されたカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVと、
前記被検化合物と、を溶液中で接触させ、
前記カルモジュリンがカルシウムイオンと結合した時に形成されるカルシウムイオン／カルモジュリン複合体と、前記カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVとが相互作用した時の、前記第１の蛍光物質と、前記第２の蛍光物質との接近に基づく、前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質の蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定し、
測定された蛍光値と、前記被検化合物の非存在下で同様に測定した蛍光値とを比較することを特徴とする、
記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法。
【請求項２】
記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法であって、
蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー供与体となる第１の蛍光物質および蛍光共鳴エネルギー移動のエネルギー受容体となる第２の蛍光物質とで標識されたカルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVと、
カルモジュリンと、
前記被検化合物と、を溶液中で接触させ、
前記カルモジュリンがカルシウムイオンと結合した時に形成されるカルシウムイオン／カルモジュリン複合体と、前記カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼIVとが相互作用した時の、前記カルモジュリン依存性キナーゼIVの立体構造が変化することに基づく、前記第１の蛍光物質と前記第２の蛍光物質の蛍光共鳴エネルギー移動による蛍光値を測定し、
測定された蛍光値と、前記被検化合物の非存在下で同様に測定した蛍光値とを比較することを特徴とする、
記憶能力の減退に対する被検化合物のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２０１０−２２６９９６（Ｐ２０１０−２２６９９６Ａ）
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−７７５９２（Ｐ２００９−７７５９２）
【出願日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，”Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｌｃｉｕｍ／Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ＩＶ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｍｅｍｏｒｙ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｃｕｅｓ Ｍｅｍｏｒｙ Ｌｏｓｓ ｗｉｔｈ Ａｇｉｎｇ”，２００８年１０月１日，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｎｅｕｒｏｓｃｉ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｈｏｒｔ／２８／４０／９９１０
【出願人】（５９８０９６９９１）学校法人東京農業大学 (85)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月２６日（２００９．３．２６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，”Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｌｃｉｕｍ／Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ＩＶ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｍｅｍｏｒｙ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｃｕｅｓ Ｍｅｍｏｒｙ Ｌｏｓｓ ｗｉｔｈ Ａｇｉｎｇ”，２００８年１０月１日，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｎｅｕｒｏｓｃｉ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｈｏｒｔ／２８／４０／９９１０
【出願人】（５９８０９６９９１）学校法人東京農業大学 (85)
【Ｆターム（参考）】
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