評価試料片の作製方法、評価試料片封入体の作製方法及び多孔体中への細胞侵入性の評価方法
【課題】本発明は、迅速、容易、かつ低コストの評価試料片の作製方法、厚切りした前記評価試料片を用いた評価試料片封入体の作製方法及び厚切りした前記評価試料片を観察可能とする多孔体中への細胞侵入性の評価方法を提供することを課題とする。
【解決手段】多孔体中への細胞侵入性の評価を行うための評価試料片の作製方法であって、基板シート５４の一面５４ａに細胞５５を培養してから、基板シート５４を、細胞５５を培養させた面５４ａを多孔体１３の一面１３ａに接触させて配置して、多孔体１３中に細胞５５を侵入させる評価試料片の作製方法を用いることによって前記課題を解決できる。
【解決手段】多孔体中への細胞侵入性の評価を行うための評価試料片の作製方法であって、基板シート５４の一面５４ａに細胞５５を培養してから、基板シート５４を、細胞５５を培養させた面５４ａを多孔体１３の一面１３ａに接触させて配置して、多孔体１３中に細胞５５を侵入させる評価試料片の作製方法を用いることによって前記課題を解決できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、評価試料片の作製方法、評価試料片封入体の作製方法及び多孔体中への細胞侵入性の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔｉ等の金属からなる多孔体は、既に、人工関節の表面等に医療応用されている。細胞を多孔体の孔に速やかに侵入させることによって、多孔体と骨との接合を速め、その接合を強固にすることができる。
多孔体中への細胞侵入性の評価をどのような方法で行うかは、どのような多孔体材料が細胞を速やかに侵入させるかを知り、どのような材料が医療応用するのに適切な材料であるかを判断するために非常に重要な問題である。
しかし、現在、その評価方法は確立されていない。
【０００３】
図１９は、従来の多孔体内部への細胞侵入性の評価方法の一例を示す工程図である。
この評価方法は、多孔体上部から細胞懸濁液を少量（０．１ｍＬ程度）注ぎ数時間静置（図１９（ａ））、さらに培養液を添加して一定期間培養後（図１９（ｂ））、細胞を多孔体内部表面に固定（図１９（ｃ））してから、脱水・溶媒置換・樹脂包埋・薄切（数十μｍ〜数μｍ）・染色して（図１９（ｄ））、評価試料片を作成した後、評価試料である多孔体内部の細胞を光学顕微鏡で観察する（図１９（ｅ））。例えば、非特許文献１では、コラーゲンスポンジ中への細胞侵入度合いをパラフィン包埋・薄切・染色後光学顕微鏡で観察している。
【０００４】
この評価試料の作製には、図１９（ｃ）〜図１９（ｄ）の固定から染色まで多くの行程を必要とするので、通常、数日以上の長時間を要し、評価試料の作製を迅速に、かつ容易に行うことができないという問題があった。脱パラ工程も含めると手間がかかり、一週間程度の期間を必要としている。
また、多孔体として硬度が大きい金属多孔体を用いた場合、細胞（生体組織）との間の力学的特性の差が大きくなるので、硬度の高い樹脂を用いた包埋を行わなければならないという問題を発生させた。また、この場合、薄切時に生体組織や樹脂に亀裂等の損傷が発生しやすくなる問題も発生させた。
更にまた、この評価方法では、図１９（ｂ）に示すように、多孔体上に細胞懸濁液を配置し、内部に染み込ませるので、多孔体内部に細胞が自発的に移動して侵入したのか、単に細胞懸濁液が重力に従い落下、あるいは多孔体内部に浸透する際に細胞も不随意的に移動したのか、わからないという問題もあった。
【０００５】
図２０は、従来の観察用封入試料の一例を示す図であって、（ａ）は平面図であり、（ｂ）は（ａ）のＢ−Ｂ’線における断面図である。
この観察用封入試料は、スライドグラス１２３上に評価試料１２１を載せ、リン酸緩衝液１２５などを滴下後、カバーガラス１２４を載せ、必要に応じて周囲を封入剤１２６で封入する。そのため、試料が厚過ぎる場合には、封入できず、顕微鏡観察を行うことができない場合があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２３（２００２）２８５５−２８６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、迅速、容易、かつ低コストの評価試料片の作製方法、厚切りした前記評価試料片を用いた評価試料片封入体の作製方法及び厚切りした前記評価試料片を観察可能とする多孔体中への細胞侵入性の評価方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の構成を有する。
（１）多孔体中への細胞侵入性の評価を行うための評価試料片の作製方法であって、基板シートの一面に細胞を培養してから、前記基板シートを、細胞を培養させた面を前記多孔体の一面に接触させて配置して、前記多孔体中に細胞を侵入させることを特徴とする評価試料片の作製方法。
（２）前記基板シートがシリコーンゴムシート、ポリ乳酸フィルム、ポリエチレンフィルム又はコラーゲンスポンジの群から選択される一の材料からなることを特徴とする（１）に記載の評価試料片の作製方法。
（３）前記多孔体の開孔径が５０μｍ〜５００μｍであることを特徴とする（１）又は（２）に記載の評価試料片の作製方法。
（４）前記多孔体が金属、セラミック又は高分子からなることを特徴とする（１）〜（３）のいずれか１項に記載の評価試料片の作製方法。
（５）前記金属がＴｉ又はステンレス鋼であることを特徴とする（４）に記載の評価試料片の作製方法。
（６）多孔体１３中に細胞５５を侵入させた後、前記多孔体中に侵入した細胞を固定することを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載の評価試料片の作製方法。
（７）細胞を固定後、前記多孔体を１ｍｍ以上の幅で切断することを特徴とする請求項６に記載の評価試料片の作製方法。
（８）前記多孔体を切断後、前記多孔体中に固定した細胞を、染色することを特徴とする（７）に記載の評価試料片の作製方法。
（９）細胞培養前に、前記基板シート及び前記多孔体を滅菌処理することを特徴とする（１）〜（８）のいずれかに記載の評価試料片の作製方法。
（１０）（１）〜（９）のいずれかに記載の評価試料片の作製方法を用いて作製した評価試料片を、窓部を有する封入容器の前記窓部上に配置してから、前記評価試料片上にガラスを配置することを特徴とする評価試料片封入体の作製方法。
（１１）前記封入容器が凹部を有し、前記凹部の底面に窓部が設けられていることを特徴とする（１０）に記載の評価試料片封入体の作製方法。
（１２）（１０）又は（１１）に記載の評価試料片封入体を蛍光顕微鏡で観察することを特徴とする多孔体中への細胞侵入性の評価方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の評価試料片の作製方法は、多孔体中への細胞侵入性の評価を行うための評価試料片の作製方法であって、基板シートの一面に細胞を培養してから、前記基板シートを、細胞を培養させた面を前記多孔体の一面に接触させて配置して、前記多孔体中に細胞を侵入させる構成なので、細胞の多孔体内部への自発的な侵入挙動のみを正確に調べる方法を提供することができる。
【００１０】
本発明の評価試料片封入体の作製方法は、先に記載の評価試料片の作製方法を用いて作製した評価試料片を、窓部を有する封入容器の前記窓部上に配置してから、前記評価試料片上にガラスを配置する構成なので、厚切りした前記評価試料片を用いて、評価試料片封入体を、迅速、容易、かつ低コストに作製することができる。
【００１１】
本発明の多孔体中への細胞侵入性の評価方法は、評価試料片封入体を蛍光顕微鏡で観察する評価試料片評価工程と、を有する構成なので、厚切りした前記評価試料片を観察可能な多孔体中への細胞侵入性の評価方法を提供することができ、試料の薄切が不要になるため、迅速、容易、かつ低コストの評価試料片の作製方法の適用が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の多孔体中への細胞侵入性の評価方法を示すフローチャートである。
【図２】評価試料片作製工程を示すフローチャートである。
【図３】前培養工程図である。
【図４】本培養工程図である。
【図５】固定工程図である。
【図６】切断工程図である。
【図７】染色工程図である。
【図８】本発明の評価試料片の作製方法で作製された評価試料片を示す図である。
【図９】評価試料片封入体を示す図である。
【図１０】多孔体中への細胞侵入性の評価工程図である。
【図１１】実施例１の評価試料片封入体のズーム式実体顕微鏡による観察画像であって、それぞれ７日培養のものである。
【図１２】実施例１の評価試料片封入体のズーム式実体顕微鏡による観察画像であって、それぞれ１４日培養のものである。
【図１３】実施例１の評価試料片封入体のズーム式実体顕微鏡による観察画像であって、それぞれ２１日培養のものである。
【図１４】実施例１の評価試料片封入体の共焦点顕微鏡による観察画像である。共焦点レーザー顕微鏡での観察例であり、細胞接触面側の黄色い部分が細胞、水色の部分が金属多孔体である。
【図１５】実施例１〜３の評価試料片封入体の細胞の多孔体内部への侵入距離の測定結果である。グラフ内の数字は多孔体の開孔径である。
【図１６】比較例１の評価試料片の実体蛍光顕微鏡像である。シリコーンシートなしである。
【図１７】比較例２の評価試料片の実体蛍光顕微鏡像である。親水化処理なし、シリコーンシート使用である。
【図１８】実施例４の評価試料片の実体蛍光顕微鏡像である。親水化処理あり、シリコーンシート使用である。
【図１９】従来の多孔体内部への細胞侵入性の評価方法を示す工程図である。
【図２０】従来の観察用封入試料の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、添付図面を参照しながら、本発明の実施形態である評価試料片の作製方法、評価試料片封入体の作製方法及び多孔体中への細胞侵入性の評価方法について説明する。
【００１４】
（本発明の実施形態）
図１は、本発明の実施形態である多孔体中への細胞侵入性の評価方法の一例を示すフローチャートである。
図１に示すように、本発明の実施形態である多孔体中への細胞侵入性の評価方法は、評価試料片作製工程Ｓ１と、評価試料片封入体作製工程Ｓ２と、評価試料片評価工程Ｓ３と、を有する。
【００１５】
＜評価試料片作製工程＞
図２は、評価試料片作製工程Ｓ１の一例を示すフローチャートである。
図２に示すように、評価試料片作製工程Ｓ１は、前処理工程Ｓ１１、培養工程Ｓ１２、固定工程Ｓ１３、切断工程Ｓ１４、染色工程Ｓ１５と、を有する。
【００１６】
＜前処理工程Ｓ１１＞
まず、基体シート及びサポートシートを準備する。
基体シートとしては、滅菌が可能で細胞が順調に増殖し、また試料表面に細胞接着面を接触させることができるものが好ましい。例えば、基体シートとして、シリコーンゴムシート、ポリ乳酸フィルム、ポリエチレンフィルム又はコラーゲンスポンジの群から選択される一の材料を挙げることができる。
【００１７】
基体シートの膜厚は、０．１ｍｍ以下が好ましく、０．０８ｍｍ以下がより好ましく、０．０５ｍｍ以下が更に好ましい。基体シートとして、厚さが０．１ｍｍ以下の柔らかい材料を用いることにより、微細な凹凸のある試料表面への細胞の接触を確実にすることができる。
基体シートの膜厚が、０．１ｍｍ超の場合には、試料表面が細胞レベルで平滑とは限らないので、試料表面に添わせることが困難となる。基体シート等の平面に接着したときの細胞の厚さは、薄い部分では１μｍ以下であり、厚い部分は細胞の種類によるが、数μｍ〜１０μｍ以下である。細胞の大きさは１０−１００μｍ程度であるので、０．１ｍｍ程度の空隙が細胞と試料の間にあると、細胞は試料表面へ移動することはできない。
【００１８】
サポートシートとしては、例えば、テフロン（登録商標）メッシュ、ステンレスメッシュ、アルミニウムメッシュ、ナイロンメッシュ等を用いる。
サポートシートを用いるのは、シリコーンゴムシート等はほぼ透明であり、培養液中で観察が難しいこと、また、しばしば細胞培養用ディスポーザブルディッシュ底面に吸着してしまい、一定期間前培養後に取り外すことが難しいためである。しかし、滅菌可能であり、シリコーンゴムシート等の取り扱いを容易にするものであれば、テフロンメッシュ、ステンレスメッシュ、アルミニウムメッシュ、ナイロンメッシュ等に限ることはない。
【００１９】
次に、基体シート及びサポートシートを滅菌処理する。例えば、オートクレーブ（高圧蒸気）滅菌処理する。しかし、ＥＯＧ（エチレンオキサイドガス）滅菌や、ガンマ線照射による滅菌等の他の滅菌処理法を用いてもよい。ＥＯＧ（エチレンオキサイドガス）滅菌や、ガンマ線照射による滅菌を用いることにより、高圧蒸気滅菌では変形してしまう高分子材料でも、変形させずに滅菌することができる。
【００２０】
次に、基体シートのプラズマ表面処理を行う。これにより、表面を親水化処理することができる。親水化処理により、表面を細胞が接着しやすいようにすることができ、基体シート表面がほぼ細胞で覆われる状態になるように前培養できる。
【００２１】
＜培養工程Ｓ１２＞
本実施形態では、培養工程Ｓ１２は前培養工程と本培養工程とからなる。
（前培養工程）
次に、図３（ａ）に示すように、培養用容器５１内にサポートシート５６を配置してから、基体シート５４をその上に置き、基体シート５４を浸漬するように培養液５３を入れる。培養用容器５１としては、例えば、細胞培養用ディスポーザブルディッシュを用いる。これにより、図３（ｂ）に示すように、基体シート５４上で細胞５５がほぼシートを覆う状態になるよう前培養することができる。細胞がほぼシートを覆う状態にすることより、次工程において、多孔体内部へ細胞を効率的に侵入させることができる。
【００２２】
なお、細胞５５の種類は、目的に応じて変更可能である。
また、培養日数（基体シート上での前培養期間および多孔体試料上での培養期間）は、細胞５５の種類や観察の目的に合わせて変更可能である。
【００２３】
（本培養工程）
次に、別の培養用容器５２内に、滅菌処理した多孔体１３を配置する。滅菌処理は、オートクレーブ滅菌、ＥＯＧ滅菌、ガンマ線滅菌等を用いる。
次に、図４（ａ）に示すように、前培養させた基体シート５４を、細胞５５を培養させた面を多孔体１３側にして、多孔体１３に密着させるように載せる。
【００２４】
細胞５５を多孔体１３の一面１３ａと密着性高く接触させた場合、基体シート５４上は細胞でほぼ覆われている状態なため、図４（ｂ）に示すように、細胞５５は多孔体１３の内部へ自発的に効率よく侵入し、そこで増殖する。これにより、多孔体１３の一面１３ａ側に、細胞５５の侵入領域１１ｃが形成される。
細胞５５は増殖するためにある程度の空間を必要とし、細胞５５の侵入に適した構造の多孔体では、細胞５５の侵入に適していない構造の多孔体よりも細胞１３の侵入量や侵入距離を大きくすることができる。
【００２５】
多孔体１３の材料としては、樹脂包埋等せずに試料そのものの状態で切断が可能な材料であればよい。金属又は合金材料が好ましいが、他の素材、例えば、セラミック、高分子等を用いてもよい。
また、孔構造も、細胞５５の侵入が可能な孔構造であればよい。
【００２６】
開孔径は、５０μｍ〜５００μｍが好ましく、１００μｍ〜４００μｍがより好ましい。開孔径は５０μｍ以上であれば、細胞および光学的手法に対して十分大きいので、後の切断工程で薄切しなくても顕微鏡観察できる。逆に、５０μｍ未満の場合には、細胞および光学的手法に対して小さいので、後の切断工程で薄切しなくては、顕微鏡観察できない。また、５００μｍ超の場合には、原理的には多孔体内部に侵入した細胞を観察することは可能だが、細胞が多孔体内に侵入するための足場が少ないため、効率よく細胞を観察することが難しいという問題が発生する。
多孔体１３として、例えば、開孔径５０μｍ〜５００μｍの純Ｔｉあるいはステンレス鋼製多孔体を用いることができる。
【００２７】
＜固定工程Ｓ１３＞
図５は、固定工程図である。
細胞培養期間終了後、図５（ａ）に示すように、細胞及び試料をリン酸緩衝液等で洗浄後、固定液５７に浸す。これにより、細胞５５を侵入領域１１ｃ内に固定できる。図５（ｂ）では、固定した細胞５５の侵入領域１１ｄを示している。
多孔体試料中の細胞の固定液５７としては、ホルムアルデヒド溶液を挙げることができる。市販の固定液を用いてもよく、細胞の種類や観察目的に応じて様々な固定液を選択できる。
【００２８】
＜切断工程Ｓ１４＞
図６は、切断工程図であって、切断の一例を示す斜視図である。
図６に示すように、多孔体１３を、切断線１４ａ〜１４ｄに沿って、一定の幅で切断する。１ｍｍ以上の幅で切断することが好ましく、２ｍｍ以上３ｍｍ以下の幅で切断することがより好ましい。多孔体試料に適当な強度があれば１ｍｍ以下の幅に切断することも可能だが、通常、１ｍｍ以下の幅では、多孔体試料の形状を保つことができず、樹脂包埋や、そのために必要な脱水・溶媒置換等の行程が必要になる。しかし、１ｍｍ以上の幅にすることにより、上記行程が不要になり、評価試料片を技術的にはるかに容易に作製することができ、そのための製造時間も短縮できる。
なお、多孔体１３の一面１３ａ側には、固定した細胞５５の侵入領域１１ｄが形成されており、他面１３ｂ側には形成されていない。
【００２９】
切断方法としては、金属多孔体の場合には、ダイヤモンド砥石を用いる精密カッターによる切断方法を用いることができる。また、高分子製多孔体などの軟らかい材料の場合には、カッターで容易に切断することができる。これらの方法に限定されず、別の切断方法を用いてもよい。
【００３０】
＜染色工程Ｓ１５＞
図７は染色工程図であって、（ａ）は染色前の側面図であり、（ｂ）は染色後の側面図である。図７（ｂ）に示すように、蛍光試薬を用いて染色することによって、細胞５５の固定された侵入領域１１ｄを、染色され、固定された細胞５５の侵入領域１１ｅとすることができる。
細胞の染色のための蛍光色素としては、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ）を挙げることができる。市販の他の染色剤を用いてもよく、細胞の種類や観察目的に応じて様々な染色剤を選択できる。
以上の工程により、評価試料片２１を作製することができる。
評価試料片２１の作製に必要な時間は、評価試料片の種類にもよるが、数十分〜数時間程度である。
【００３１】
図８は、本発明の評価試料片の作製方法によって作成された評価試料片の一例を示す図であって、（ａ）は平面図であり、（ｂ）は側面図である。
図８に示すように、評価試料片２１は、略板状の多孔体であって、一面側に染色され、固定された細胞５５の侵入領域１１ｅが設けられて構成されている。
なお、染色され、固定された細胞５５の侵入領域１１ｅの大きさは、培養時間、細胞の種類等により決定されるものであり、これに限られるものではない。図８に示す厚さよりも薄い場合や、多孔体全域となる場合もある。また、均一の厚さとなるとは限らず、不均一の厚さで形成される場合もある。
【００３２】
＜評価試料片封入体作製工程＞
次に、評価試料片２１を用いて、評価試料片封入体を作製する。
図９は、評価試料片封入体の一例を示す図であって、（ａ）は平面図であり、（ｂ）は側面図である。
図９に示すように、評価試料片封入体３１は、評価試料片２１と、ガラス２３、２４と、緩衝液２５と、接着剤２６と、封入容器２７と、を有して構成されている。
なお、ガラス２４の外縁部を封入剤で封入してもよい。
【００３３】
封入容器２７は、凹部２７ｄを有し、凹部２７ｄの底面には開口部２７ｅが設けられ、開口部２７ｅを覆うようにガラス２３が接着剤２６により固定されている。これにより、窓部２８が形成されている。
封入容器２７の凹部２７ｄの深さは、試料の厚さに応じた深さとすればよく、例えば、数ｍｍとする。これにより、評価試料片２１を数ｍｍ程度の厚切にしても、容易に、配置・固定できる。
封入容器２７は、金属、ガラス又はプラスチックの材料を用いることができる。
【００３４】
具体的には、封入容器２７としては、底面にカバーガラスを設置したガラスボトムディッシュを用いることができる。この場合、試料観察には、倒立型の顕微鏡を用いる。
なお、正立型の顕微鏡を用いる場合には、対物レンズが試料表面に接近するため、径の大きな封入容器２７を用いるか、壁面の低い封入容器２７を用いることが好ましい。
【００３５】
緩衝液２５としては、例えば、リン酸緩衝液とグリセリンの混液を用いる。
緩衝液２５として、リン酸緩衝液のみを用いても、市販の緩衝液を用いてもよく、細胞の種類や観察目的に応じて様々な緩衝液を選択できる。蛍光色素の退色防止剤を含有させてもよい。
【００３６】
評価試料片封入体３１の作製方法について説明する。
まず、底面の開口部を覆うようにガラス２３が接着剤２６により固定された封入容器２７のガラス２３上に評価試料片２１を配置する。図９では、断面を上にして置き、染色され、固定された細胞５５の侵入領域１１ｅを一側面側として配置しているが、断面を下にして配置してもよい。
次に、リン酸緩衝液等の緩衝液２５を滴下する。
次に、ガラス２４を配置することにより、評価試料片封入体３１を作製できる。
この方法では、スライドグラス上に試料を載せ、リン酸緩衝液などを滴下後、カバーガラスを載せ、必要に応じて周囲を封入剤で封入する通常の方法ではなく、試料の大きさくらいの容器で、試料の厚さ程度の深さのある容器を用いる構成なので、通常の方法では試料が厚過ぎるため封入できない試料であっても、適切なマウント剤を用い、その上にカバーガラスを載せ、その上から顕微鏡観察を行うことができ、厚切（数ｍｍ程度）の試料の蛍光顕微鏡観察をスムーズに行うことができる。
【００３７】
＜評価試料片評価工程＞
次に、評価試料片封入体を用いて、多孔体内部での細胞の状態を観察する。
細胞の観察には、蛍光顕微鏡を用いることができる。
【００３８】
本実施形態の評価方法では、多孔体内部への細胞侵入性だけでなく、通常の播種方法で培養した細胞の状態を簡便に観察することができる。
【００３９】
本発明の実施形態である評価試料片の作製方法は、多孔体１３中への細胞侵入性の評価を行うための評価試料片の作製方法であって、基板シート５４の一面５４ａに細胞５５を培養してから、基板シート５４を、細胞５５を培養させた面を多孔体１３の一面１３ａに接触させて配置して、多孔体１３中に細胞５５を侵入させる構成なので、基板シート５４の細胞５５を培養させた面を多孔体１３の一面１３ａに密着性高く接触させることができ、効率よく多孔体１３中に細胞５５を侵入させることができ、かつ多孔体試料内部への細胞の自発的な侵入のみを正確に評価することができる評価試料片の作製方法を提供することができる。
【００４０】
本発明の実施形態である評価試料片の作製方法は、基板シート５４がシリコーンゴムシート、ポリ乳酸フィルム、ポリエチレンフィルム又はコラーゲンスポンジの群から選択される一の材料からなる構成なので、基板シート５４の細胞５５を培養させた面を多孔体１３の一面１３ａに密着性高く接触させることができ、効率よく多孔体１３中に細胞５５を侵入させることができ、かつ多孔体試料内部への細胞の自発的な侵入のみを正確に評価することができる評価試料片の作製方法を提供することができる。
【００４１】
本発明の実施形態である評価試料片の作製方法は、多孔体１３の開孔径が５０μｍ〜５００μｍである構成なので、試料を薄切する必要がなく、材料内への細胞侵入状態を観察でき、迅速、容易、かつ低コストの評価試料片の作製方法を提供することができる。
【００４２】
本発明の実施形態である評価試料片の作製方法は、多孔体１３が金属、セラミック又は高分子からなる構成なので、いずれの材料製の多孔体試料中への細胞侵入性も評価でき、迅速、容易、かつ低コストの評価試料片の作製方法を提供することができる。
【００４３】
本発明の実施形態である評価試料片の作製方法は、前記金属がＴｉ又はステンレス鋼である構成なので、医用材料として用いられている金属材料についても細胞侵入性を評価でき、迅速、容易、かつ低コストの評価試料片の作製方法を提供することができる。
【００４４】
本発明の実施形態である評価試料片の作製方法は、多孔体１３中に細胞５５を侵入させた後、多孔体１３中に侵入した細胞を固定する構成なので、多孔体内部に侵入した細胞の状態を観察でき、迅速、容易、かつ低コストの評価試料片の作製方法を提供することができる。
【００４５】
本発明の実施形態である評価試料片の作製方法は、細胞５５を固定後、多孔体１３を１ｍｍ以上の幅で切断する構成なので、１ｍｍ以上の厚切の試料を作製することができ、試料を薄切する必要がなく、材料内への細胞侵入状態を観察することができ、迅速、容易、かつ低コストの評価試料片の作製方法を提供することができる。
【００４６】
本発明の実施形態である評価試料片の作製方法は、多孔体１３を切断後、多孔体１３中に固定した細胞５５を、染色する構成なので、多孔体内部に侵入した細胞の状態を適切に観察することができ、迅速、容易、かつ低コストの評価試料片の作製方法を提供することができる。
【００４７】
本発明の実施形態である評価試料片の作製方法は、細胞培養前に、基板シート５４及び多孔体１３を滅菌処理する構成なので、細菌等が混入することなく、多孔体内部に侵入した細胞の状態を正確に観察でき、迅速、容易、かつ低コストの評価試料片の作製方法を提供することができる。
【００４８】
本発明の実施形態である評価試料片封入体の作製方法は、評価試料片２１を、窓部２８を有する封入容器２７の窓部２８上に配置してから、評価試料片２１上にガラス２４を配置する構成なので、迅速、容易、かつ低コストに厚切りした前記評価試料片を用いて評価試料片封入体を作製できる。
【００４９】
本発明の実施形態である評価試料片封入体の作製方法は、封入容器２７が凹部２７ｄを有し、凹部２７ｄの底面に窓部２８が設けられている構成なので、迅速、容易、かつ低コストに評価試料片封入体を作製できる。
【００５０】
本発明の実施形態である多孔体中への細胞侵入性の評価方法は、評価試料片封入体３１を蛍光顕微鏡で観察する評価試料片評価工程Ｓ３と、を有する構成なので、厚い試料についても正立／倒立型蛍光顕微鏡を用いて一定時間安定に蛍光観察ができ、厚切りした前記評価試料片を観察可能な多孔体中への細胞侵入性の評価方法を提供することができる。
【００５１】
本発明の実施形態である評価試料片の作製方法、評価試料片封入体の作製方法及び多孔体中への細胞侵入性の評価方法は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で、種々変更して実施することができる。本実施形態の具体例を以下の実施例で示す。しかし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５２】
（実施例１）
図１０は、多孔体中への細胞侵入性の評価工程図である。
まず、テフロンシートメッシュ上に１５ｍｍ角に切断した厚さ０．０５ｍｍのシリコーンゴムシートを置き、オートクレーブ滅菌した。
次に、前記シリコーンゴムシートをプラズマ処理した。
次に、プラズマ処理したシリコーンゴムシートを細胞培養用ディスポーザブルディッシュ内に静置した。
【００５３】
次に、図１０（ａ）に示すように、シリコーンゴムシートに、ヒト骨肉腫由来細胞Ｓａｏｓ−２を細胞培養液と共に適量播種し、細胞がほぼシート表面を覆う状態になるまで、３−５日間ＣＯ２インキュベータ内で培養した。
【００５４】
次に、図１０（ｂ）に示すように、別の新しい細胞培養用ディスポーザブルディッシュ内に滅菌した多孔体を置き、ヒト骨肉腫由来細胞Ｓａｏｓ−２を培養したシリコーンゴムシートを、細胞が接着している面が多孔体表面と接触するように載せた。
なお、前記多孔体としては、１１ｍｍ角、厚さ２ｍｍに切断した、平均開孔径が１８１μｍのチタン製多孔体であって、オートクレーブ滅菌したものを用いた。
【００５５】
次に、前記細胞培養用ディスポーザブルディッシュ内に細胞培養液を添加し、シリコーンゴムシート及び多孔体を浸漬させた状態で、ＣＯ２インキュベータ内に静置した。
その後、１日置きに培養液を交換して、７−２１日間培養した。
次に、シリコーンゴムシートを取り除き、試料をリン酸緩衝液で洗浄した。
次に、図１０（ｃ）に示すように、ホルムアルデヒド溶液で処理して細胞を固定した。
【００５６】
次に、図１０（ｄ）に示すように、精密カッターで多孔体試料を幅約２ｍｍに切断した。
次に、蛍光色素（テキサスレッド）で細胞を染色して、細胞侵入性評価試料片を作製した。
【００５７】
次に、図１０（ｅ）に示すように、細胞侵入性評価試料片を用いて、評価試料片封入体を作製した。
評価試料片封入体は、ガラスボトムディッシュを用い、ガラスボトム部分に試料を載せ、蛍光色素の退色防止剤を含むリン酸緩衝液とグリセリン混液を滴下後、カバーガラスを試料上部に載せ、封入して、実施例１の評価試料片封入体を作製した。
【００５８】
（実施例２）
開孔径が３２５μｍの多孔体を用いた他は実施例１と同様にして、実施例２の評価試料片封入体を作製した。
【００５９】
（実施例３）
開孔径が５０４μｍの多孔体を用いた他は実施例１と同様にして、実施例３の評価試料片封入体を作製した。
【００６０】
＜評価＞
まず、図１０（ｆ）に示すように、蛍光観察装置を備えたズーム式実体顕微鏡（蛍光顕微鏡）および共焦点顕微鏡で観察した。
【００６１】
図１１〜１３は、実施例１の評価試料片封入体のズーム式実体顕微鏡による観察画像であって、それぞれ７日培養（図１１）、１４日培養（図１２）、２１日培養（図１３）のものである。
また、図１４は、実施例１の評価試料片封入体の共焦点顕微鏡による観察画像である。
いずれの観察法でも、切断面および多孔体孔部分を介して、多孔体内の細胞の位置、形態等の状態を容易かつ明確に観察することができた。
【００６２】
図１５は、実施例１〜３の評価試料片封入体の細胞の多孔体内部への侵入距離の測定結果である。この侵入距離は、最長到達距離であり、ズーム式実体顕微鏡画像を基に算出した。
開孔径の異なるいずれの多孔体試料も、培養期間の増加に伴い、細胞侵入距離が増加した。また、多孔体の孔構造（開孔径）により、同一の培養期間であっても、細胞の侵入距離が異なることが判った。
【００６３】
＜細胞侵入性評価に及ぼす前培養条件の影響の検討＞
（比較例１）
テフロンシートメッシュおよびシリコーンゴムシートは用いず、細胞培養用ディスポーザブルディッシュ底面に直接Ｓａｏｓ−２細胞を細胞培養液と共に適量播種し、細胞がほぼ底面を覆う状態になるまで、３−５日間ＣＯ２インキュベータ内で前培養した。その後、１１ｍｍ角、厚さ２ｍｍに切断した開孔径３２５μｍのチタン製多孔体（オートクレーブ滅菌済み）を細胞の上に載せ、細胞培養液を添加し、１日置きに交換しながら５日間培養した。
その多孔体を、実施例１と同様の手法にて固定・切断・染色後、封入して、比較例１の評価試料片を作成した。
【００６４】
（比較例２）
実施例１と同様に、しかしシリコーンゴムシートのプラズマ処理は行わず前培養を行った。その後、１１ｍｍ角、厚さ２ｍｍに切断した開孔径３２５μｍのチタン製多孔体（オートクレーブ滅菌済み）の上にシリコーンゴムシートを載せ、１日置きに培養液交換を行いながら７日間培養した。
その多孔体を、固定・切断・染色・封入して、比較例２の評価試料片を作成した。
【００６５】
（実施例４）
実施例１と同様にシリコーンゴムシートにプラズマ処理を行い、前培養した。その後、１１ｍｍ角、厚さ２ｍｍに切断した開孔径３２５μｍのチタン製多孔体（オートクレーブ滅菌済み）の上にシリコーンゴムシートを載せ、１日置きに培養液交換を行いながら７日間培養した。
その多孔体を、固定・切断・染色・封入して、実施例４の評価試料片を作成した。
【００６６】
図１６〜１８は、比較例１、２及び実施例４の評価試料片について、実体蛍光顕微鏡にて観察した像である。
図１６〜１８から明らかなように、実施例１の方法を用いた場合のみ、試料表面全面に均質に細胞が侵入していることが観察できた。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明は評価試料片の作製方法及び多孔体中への細胞侵入性の評価方法に関するものであり、多孔体中への細胞侵入性の評価を行うことにより、骨に強固に接合する多孔体を見出すことができ、医療産業等において利用可能性がある。
【符号の説明】
【００６８】
１１ｃ…細胞の侵入領域、１１ｄ…固定された細胞の侵入領域、１１ｅ…染色され、固定された細胞の侵入領域、１３…多孔体、１３ａ…一面、１３ｂ…他面、１４ａ、１４ｂ、１４ｃ、１４ｄ…切断線、２１…評価試料片、２３、２４…ガラス、２５…緩衝液、２６…接着剤、２７…封入容器、２７ｄ…凹部、２７ｅ…開口部、２８…窓部、３１…評価試料片封入体、５１、５２…培養用容器、５３…培養液、５４…基体シート、５５…細胞、５６…サポートシート、５７…固定液、１１１…観察用封入試料、１２３…スライドグラス、１２４…カバーガラス、１２５…緩衝液、１２８…封入剤（接着剤）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、評価試料片の作製方法、評価試料片封入体の作製方法及び多孔体中への細胞侵入性の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔｉ等の金属からなる多孔体は、既に、人工関節の表面等に医療応用されている。細胞を多孔体の孔に速やかに侵入させることによって、多孔体と骨との接合を速め、その接合を強固にすることができる。
多孔体中への細胞侵入性の評価をどのような方法で行うかは、どのような多孔体材料が細胞を速やかに侵入させるかを知り、どのような材料が医療応用するのに適切な材料であるかを判断するために非常に重要な問題である。
しかし、現在、その評価方法は確立されていない。
【０００３】
図１９は、従来の多孔体内部への細胞侵入性の評価方法の一例を示す工程図である。
この評価方法は、多孔体上部から細胞懸濁液を少量（０．１ｍＬ程度）注ぎ数時間静置（図１９（ａ））、さらに培養液を添加して一定期間培養後（図１９（ｂ））、細胞を多孔体内部表面に固定（図１９（ｃ））してから、脱水・溶媒置換・樹脂包埋・薄切（数十μｍ〜数μｍ）・染色して（図１９（ｄ））、評価試料片を作成した後、評価試料である多孔体内部の細胞を光学顕微鏡で観察する（図１９（ｅ））。例えば、非特許文献１では、コラーゲンスポンジ中への細胞侵入度合いをパラフィン包埋・薄切・染色後光学顕微鏡で観察している。
【０００４】
この評価試料の作製には、図１９（ｃ）〜図１９（ｄ）の固定から染色まで多くの行程を必要とするので、通常、数日以上の長時間を要し、評価試料の作製を迅速に、かつ容易に行うことができないという問題があった。脱パラ工程も含めると手間がかかり、一週間程度の期間を必要としている。
また、多孔体として硬度が大きい金属多孔体を用いた場合、細胞（生体組織）との間の力学的特性の差が大きくなるので、硬度の高い樹脂を用いた包埋を行わなければならないという問題を発生させた。また、この場合、薄切時に生体組織や樹脂に亀裂等の損傷が発生しやすくなる問題も発生させた。
更にまた、この評価方法では、図１９（ｂ）に示すように、多孔体上に細胞懸濁液を配置し、内部に染み込ませるので、多孔体内部に細胞が自発的に移動して侵入したのか、単に細胞懸濁液が重力に従い落下、あるいは多孔体内部に浸透する際に細胞も不随意的に移動したのか、わからないという問題もあった。
【０００５】
図２０は、従来の観察用封入試料の一例を示す図であって、（ａ）は平面図であり、（ｂ）は（ａ）のＢ−Ｂ’線における断面図である。
この観察用封入試料は、スライドグラス１２３上に評価試料１２１を載せ、リン酸緩衝液１２５などを滴下後、カバーガラス１２４を載せ、必要に応じて周囲を封入剤１２６で封入する。そのため、試料が厚過ぎる場合には、封入できず、顕微鏡観察を行うことができない場合があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２３（２００２）２８５５−２８６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、迅速、容易、かつ低コストの評価試料片の作製方法、厚切りした前記評価試料片を用いた評価試料片封入体の作製方法及び厚切りした前記評価試料片を観察可能とする多孔体中への細胞侵入性の評価方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の構成を有する。
（１）多孔体中への細胞侵入性の評価を行うための評価試料片の作製方法であって、基板シートの一面に細胞を培養してから、前記基板シートを、細胞を培養させた面を前記多孔体の一面に接触させて配置して、前記多孔体中に細胞を侵入させることを特徴とする評価試料片の作製方法。
（２）前記基板シートがシリコーンゴムシート、ポリ乳酸フィルム、ポリエチレンフィルム又はコラーゲンスポンジの群から選択される一の材料からなることを特徴とする（１）に記載の評価試料片の作製方法。
（３）前記多孔体の開孔径が５０μｍ〜５００μｍであることを特徴とする（１）又は（２）に記載の評価試料片の作製方法。
（４）前記多孔体が金属、セラミック又は高分子からなることを特徴とする（１）〜（３）のいずれか１項に記載の評価試料片の作製方法。
（５）前記金属がＴｉ又はステンレス鋼であることを特徴とする（４）に記載の評価試料片の作製方法。
（６）多孔体１３中に細胞５５を侵入させた後、前記多孔体中に侵入した細胞を固定することを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載の評価試料片の作製方法。
（７）細胞を固定後、前記多孔体を１ｍｍ以上の幅で切断することを特徴とする請求項６に記載の評価試料片の作製方法。
（８）前記多孔体を切断後、前記多孔体中に固定した細胞を、染色することを特徴とする（７）に記載の評価試料片の作製方法。
（９）細胞培養前に、前記基板シート及び前記多孔体を滅菌処理することを特徴とする（１）〜（８）のいずれかに記載の評価試料片の作製方法。
（１０）（１）〜（９）のいずれかに記載の評価試料片の作製方法を用いて作製した評価試料片を、窓部を有する封入容器の前記窓部上に配置してから、前記評価試料片上にガラスを配置することを特徴とする評価試料片封入体の作製方法。
（１１）前記封入容器が凹部を有し、前記凹部の底面に窓部が設けられていることを特徴とする（１０）に記載の評価試料片封入体の作製方法。
（１２）（１０）又は（１１）に記載の評価試料片封入体を蛍光顕微鏡で観察することを特徴とする多孔体中への細胞侵入性の評価方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の評価試料片の作製方法は、多孔体中への細胞侵入性の評価を行うための評価試料片の作製方法であって、基板シートの一面に細胞を培養してから、前記基板シートを、細胞を培養させた面を前記多孔体の一面に接触させて配置して、前記多孔体中に細胞を侵入させる構成なので、細胞の多孔体内部への自発的な侵入挙動のみを正確に調べる方法を提供することができる。
【００１０】
本発明の評価試料片封入体の作製方法は、先に記載の評価試料片の作製方法を用いて作製した評価試料片を、窓部を有する封入容器の前記窓部上に配置してから、前記評価試料片上にガラスを配置する構成なので、厚切りした前記評価試料片を用いて、評価試料片封入体を、迅速、容易、かつ低コストに作製することができる。
【００１１】
本発明の多孔体中への細胞侵入性の評価方法は、評価試料片封入体を蛍光顕微鏡で観察する評価試料片評価工程と、を有する構成なので、厚切りした前記評価試料片を観察可能な多孔体中への細胞侵入性の評価方法を提供することができ、試料の薄切が不要になるため、迅速、容易、かつ低コストの評価試料片の作製方法の適用が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の多孔体中への細胞侵入性の評価方法を示すフローチャートである。
【図２】評価試料片作製工程を示すフローチャートである。
【図３】前培養工程図である。
【図４】本培養工程図である。
【図５】固定工程図である。
【図６】切断工程図である。
【図７】染色工程図である。
【図８】本発明の評価試料片の作製方法で作製された評価試料片を示す図である。
【図９】評価試料片封入体を示す図である。
【図１０】多孔体中への細胞侵入性の評価工程図である。
【図１１】実施例１の評価試料片封入体のズーム式実体顕微鏡による観察画像であって、それぞれ７日培養のものである。
【図１２】実施例１の評価試料片封入体のズーム式実体顕微鏡による観察画像であって、それぞれ１４日培養のものである。
【図１３】実施例１の評価試料片封入体のズーム式実体顕微鏡による観察画像であって、それぞれ２１日培養のものである。
【図１４】実施例１の評価試料片封入体の共焦点顕微鏡による観察画像である。共焦点レーザー顕微鏡での観察例であり、細胞接触面側の黄色い部分が細胞、水色の部分が金属多孔体である。
【図１５】実施例１〜３の評価試料片封入体の細胞の多孔体内部への侵入距離の測定結果である。グラフ内の数字は多孔体の開孔径である。
【図１６】比較例１の評価試料片の実体蛍光顕微鏡像である。シリコーンシートなしである。
【図１７】比較例２の評価試料片の実体蛍光顕微鏡像である。親水化処理なし、シリコーンシート使用である。
【図１８】実施例４の評価試料片の実体蛍光顕微鏡像である。親水化処理あり、シリコーンシート使用である。
【図１９】従来の多孔体内部への細胞侵入性の評価方法を示す工程図である。
【図２０】従来の観察用封入試料の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、添付図面を参照しながら、本発明の実施形態である評価試料片の作製方法、評価試料片封入体の作製方法及び多孔体中への細胞侵入性の評価方法について説明する。
【００１４】
（本発明の実施形態）
図１は、本発明の実施形態である多孔体中への細胞侵入性の評価方法の一例を示すフローチャートである。
図１に示すように、本発明の実施形態である多孔体中への細胞侵入性の評価方法は、評価試料片作製工程Ｓ１と、評価試料片封入体作製工程Ｓ２と、評価試料片評価工程Ｓ３と、を有する。
【００１５】
＜評価試料片作製工程＞
図２は、評価試料片作製工程Ｓ１の一例を示すフローチャートである。
図２に示すように、評価試料片作製工程Ｓ１は、前処理工程Ｓ１１、培養工程Ｓ１２、固定工程Ｓ１３、切断工程Ｓ１４、染色工程Ｓ１５と、を有する。
【００１６】
＜前処理工程Ｓ１１＞
まず、基体シート及びサポートシートを準備する。
基体シートとしては、滅菌が可能で細胞が順調に増殖し、また試料表面に細胞接着面を接触させることができるものが好ましい。例えば、基体シートとして、シリコーンゴムシート、ポリ乳酸フィルム、ポリエチレンフィルム又はコラーゲンスポンジの群から選択される一の材料を挙げることができる。
【００１７】
基体シートの膜厚は、０．１ｍｍ以下が好ましく、０．０８ｍｍ以下がより好ましく、０．０５ｍｍ以下が更に好ましい。基体シートとして、厚さが０．１ｍｍ以下の柔らかい材料を用いることにより、微細な凹凸のある試料表面への細胞の接触を確実にすることができる。
基体シートの膜厚が、０．１ｍｍ超の場合には、試料表面が細胞レベルで平滑とは限らないので、試料表面に添わせることが困難となる。基体シート等の平面に接着したときの細胞の厚さは、薄い部分では１μｍ以下であり、厚い部分は細胞の種類によるが、数μｍ〜１０μｍ以下である。細胞の大きさは１０−１００μｍ程度であるので、０．１ｍｍ程度の空隙が細胞と試料の間にあると、細胞は試料表面へ移動することはできない。
【００１８】
サポートシートとしては、例えば、テフロン（登録商標）メッシュ、ステンレスメッシュ、アルミニウムメッシュ、ナイロンメッシュ等を用いる。
サポートシートを用いるのは、シリコーンゴムシート等はほぼ透明であり、培養液中で観察が難しいこと、また、しばしば細胞培養用ディスポーザブルディッシュ底面に吸着してしまい、一定期間前培養後に取り外すことが難しいためである。しかし、滅菌可能であり、シリコーンゴムシート等の取り扱いを容易にするものであれば、テフロンメッシュ、ステンレスメッシュ、アルミニウムメッシュ、ナイロンメッシュ等に限ることはない。
【００１９】
次に、基体シート及びサポートシートを滅菌処理する。例えば、オートクレーブ（高圧蒸気）滅菌処理する。しかし、ＥＯＧ（エチレンオキサイドガス）滅菌や、ガンマ線照射による滅菌等の他の滅菌処理法を用いてもよい。ＥＯＧ（エチレンオキサイドガス）滅菌や、ガンマ線照射による滅菌を用いることにより、高圧蒸気滅菌では変形してしまう高分子材料でも、変形させずに滅菌することができる。
【００２０】
次に、基体シートのプラズマ表面処理を行う。これにより、表面を親水化処理することができる。親水化処理により、表面を細胞が接着しやすいようにすることができ、基体シート表面がほぼ細胞で覆われる状態になるように前培養できる。
【００２１】
＜培養工程Ｓ１２＞
本実施形態では、培養工程Ｓ１２は前培養工程と本培養工程とからなる。
（前培養工程）
次に、図３（ａ）に示すように、培養用容器５１内にサポートシート５６を配置してから、基体シート５４をその上に置き、基体シート５４を浸漬するように培養液５３を入れる。培養用容器５１としては、例えば、細胞培養用ディスポーザブルディッシュを用いる。これにより、図３（ｂ）に示すように、基体シート５４上で細胞５５がほぼシートを覆う状態になるよう前培養することができる。細胞がほぼシートを覆う状態にすることより、次工程において、多孔体内部へ細胞を効率的に侵入させることができる。
【００２２】
なお、細胞５５の種類は、目的に応じて変更可能である。
また、培養日数（基体シート上での前培養期間および多孔体試料上での培養期間）は、細胞５５の種類や観察の目的に合わせて変更可能である。
【００２３】
（本培養工程）
次に、別の培養用容器５２内に、滅菌処理した多孔体１３を配置する。滅菌処理は、オートクレーブ滅菌、ＥＯＧ滅菌、ガンマ線滅菌等を用いる。
次に、図４（ａ）に示すように、前培養させた基体シート５４を、細胞５５を培養させた面を多孔体１３側にして、多孔体１３に密着させるように載せる。
【００２４】
細胞５５を多孔体１３の一面１３ａと密着性高く接触させた場合、基体シート５４上は細胞でほぼ覆われている状態なため、図４（ｂ）に示すように、細胞５５は多孔体１３の内部へ自発的に効率よく侵入し、そこで増殖する。これにより、多孔体１３の一面１３ａ側に、細胞５５の侵入領域１１ｃが形成される。
細胞５５は増殖するためにある程度の空間を必要とし、細胞５５の侵入に適した構造の多孔体では、細胞５５の侵入に適していない構造の多孔体よりも細胞１３の侵入量や侵入距離を大きくすることができる。
【００２５】
多孔体１３の材料としては、樹脂包埋等せずに試料そのものの状態で切断が可能な材料であればよい。金属又は合金材料が好ましいが、他の素材、例えば、セラミック、高分子等を用いてもよい。
また、孔構造も、細胞５５の侵入が可能な孔構造であればよい。
【００２６】
開孔径は、５０μｍ〜５００μｍが好ましく、１００μｍ〜４００μｍがより好ましい。開孔径は５０μｍ以上であれば、細胞および光学的手法に対して十分大きいので、後の切断工程で薄切しなくても顕微鏡観察できる。逆に、５０μｍ未満の場合には、細胞および光学的手法に対して小さいので、後の切断工程で薄切しなくては、顕微鏡観察できない。また、５００μｍ超の場合には、原理的には多孔体内部に侵入した細胞を観察することは可能だが、細胞が多孔体内に侵入するための足場が少ないため、効率よく細胞を観察することが難しいという問題が発生する。
多孔体１３として、例えば、開孔径５０μｍ〜５００μｍの純Ｔｉあるいはステンレス鋼製多孔体を用いることができる。
【００２７】
＜固定工程Ｓ１３＞
図５は、固定工程図である。
細胞培養期間終了後、図５（ａ）に示すように、細胞及び試料をリン酸緩衝液等で洗浄後、固定液５７に浸す。これにより、細胞５５を侵入領域１１ｃ内に固定できる。図５（ｂ）では、固定した細胞５５の侵入領域１１ｄを示している。
多孔体試料中の細胞の固定液５７としては、ホルムアルデヒド溶液を挙げることができる。市販の固定液を用いてもよく、細胞の種類や観察目的に応じて様々な固定液を選択できる。
【００２８】
＜切断工程Ｓ１４＞
図６は、切断工程図であって、切断の一例を示す斜視図である。
図６に示すように、多孔体１３を、切断線１４ａ〜１４ｄに沿って、一定の幅で切断する。１ｍｍ以上の幅で切断することが好ましく、２ｍｍ以上３ｍｍ以下の幅で切断することがより好ましい。多孔体試料に適当な強度があれば１ｍｍ以下の幅に切断することも可能だが、通常、１ｍｍ以下の幅では、多孔体試料の形状を保つことができず、樹脂包埋や、そのために必要な脱水・溶媒置換等の行程が必要になる。しかし、１ｍｍ以上の幅にすることにより、上記行程が不要になり、評価試料片を技術的にはるかに容易に作製することができ、そのための製造時間も短縮できる。
なお、多孔体１３の一面１３ａ側には、固定した細胞５５の侵入領域１１ｄが形成されており、他面１３ｂ側には形成されていない。
【００２９】
切断方法としては、金属多孔体の場合には、ダイヤモンド砥石を用いる精密カッターによる切断方法を用いることができる。また、高分子製多孔体などの軟らかい材料の場合には、カッターで容易に切断することができる。これらの方法に限定されず、別の切断方法を用いてもよい。
【００３０】
＜染色工程Ｓ１５＞
図７は染色工程図であって、（ａ）は染色前の側面図であり、（ｂ）は染色後の側面図である。図７（ｂ）に示すように、蛍光試薬を用いて染色することによって、細胞５５の固定された侵入領域１１ｄを、染色され、固定された細胞５５の侵入領域１１ｅとすることができる。
細胞の染色のための蛍光色素としては、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ）を挙げることができる。市販の他の染色剤を用いてもよく、細胞の種類や観察目的に応じて様々な染色剤を選択できる。
以上の工程により、評価試料片２１を作製することができる。
評価試料片２１の作製に必要な時間は、評価試料片の種類にもよるが、数十分〜数時間程度である。
【００３１】
図８は、本発明の評価試料片の作製方法によって作成された評価試料片の一例を示す図であって、（ａ）は平面図であり、（ｂ）は側面図である。
図８に示すように、評価試料片２１は、略板状の多孔体であって、一面側に染色され、固定された細胞５５の侵入領域１１ｅが設けられて構成されている。
なお、染色され、固定された細胞５５の侵入領域１１ｅの大きさは、培養時間、細胞の種類等により決定されるものであり、これに限られるものではない。図８に示す厚さよりも薄い場合や、多孔体全域となる場合もある。また、均一の厚さとなるとは限らず、不均一の厚さで形成される場合もある。
【００３２】
＜評価試料片封入体作製工程＞
次に、評価試料片２１を用いて、評価試料片封入体を作製する。
図９は、評価試料片封入体の一例を示す図であって、（ａ）は平面図であり、（ｂ）は側面図である。
図９に示すように、評価試料片封入体３１は、評価試料片２１と、ガラス２３、２４と、緩衝液２５と、接着剤２６と、封入容器２７と、を有して構成されている。
なお、ガラス２４の外縁部を封入剤で封入してもよい。
【００３３】
封入容器２７は、凹部２７ｄを有し、凹部２７ｄの底面には開口部２７ｅが設けられ、開口部２７ｅを覆うようにガラス２３が接着剤２６により固定されている。これにより、窓部２８が形成されている。
封入容器２７の凹部２７ｄの深さは、試料の厚さに応じた深さとすればよく、例えば、数ｍｍとする。これにより、評価試料片２１を数ｍｍ程度の厚切にしても、容易に、配置・固定できる。
封入容器２７は、金属、ガラス又はプラスチックの材料を用いることができる。
【００３４】
具体的には、封入容器２７としては、底面にカバーガラスを設置したガラスボトムディッシュを用いることができる。この場合、試料観察には、倒立型の顕微鏡を用いる。
なお、正立型の顕微鏡を用いる場合には、対物レンズが試料表面に接近するため、径の大きな封入容器２７を用いるか、壁面の低い封入容器２７を用いることが好ましい。
【００３５】
緩衝液２５としては、例えば、リン酸緩衝液とグリセリンの混液を用いる。
緩衝液２５として、リン酸緩衝液のみを用いても、市販の緩衝液を用いてもよく、細胞の種類や観察目的に応じて様々な緩衝液を選択できる。蛍光色素の退色防止剤を含有させてもよい。
【００３６】
評価試料片封入体３１の作製方法について説明する。
まず、底面の開口部を覆うようにガラス２３が接着剤２６により固定された封入容器２７のガラス２３上に評価試料片２１を配置する。図９では、断面を上にして置き、染色され、固定された細胞５５の侵入領域１１ｅを一側面側として配置しているが、断面を下にして配置してもよい。
次に、リン酸緩衝液等の緩衝液２５を滴下する。
次に、ガラス２４を配置することにより、評価試料片封入体３１を作製できる。
この方法では、スライドグラス上に試料を載せ、リン酸緩衝液などを滴下後、カバーガラスを載せ、必要に応じて周囲を封入剤で封入する通常の方法ではなく、試料の大きさくらいの容器で、試料の厚さ程度の深さのある容器を用いる構成なので、通常の方法では試料が厚過ぎるため封入できない試料であっても、適切なマウント剤を用い、その上にカバーガラスを載せ、その上から顕微鏡観察を行うことができ、厚切（数ｍｍ程度）の試料の蛍光顕微鏡観察をスムーズに行うことができる。
【００３７】
＜評価試料片評価工程＞
次に、評価試料片封入体を用いて、多孔体内部での細胞の状態を観察する。
細胞の観察には、蛍光顕微鏡を用いることができる。
【００３８】
本実施形態の評価方法では、多孔体内部への細胞侵入性だけでなく、通常の播種方法で培養した細胞の状態を簡便に観察することができる。
【００３９】
本発明の実施形態である評価試料片の作製方法は、多孔体１３中への細胞侵入性の評価を行うための評価試料片の作製方法であって、基板シート５４の一面５４ａに細胞５５を培養してから、基板シート５４を、細胞５５を培養させた面を多孔体１３の一面１３ａに接触させて配置して、多孔体１３中に細胞５５を侵入させる構成なので、基板シート５４の細胞５５を培養させた面を多孔体１３の一面１３ａに密着性高く接触させることができ、効率よく多孔体１３中に細胞５５を侵入させることができ、かつ多孔体試料内部への細胞の自発的な侵入のみを正確に評価することができる評価試料片の作製方法を提供することができる。
【００４０】
本発明の実施形態である評価試料片の作製方法は、基板シート５４がシリコーンゴムシート、ポリ乳酸フィルム、ポリエチレンフィルム又はコラーゲンスポンジの群から選択される一の材料からなる構成なので、基板シート５４の細胞５５を培養させた面を多孔体１３の一面１３ａに密着性高く接触させることができ、効率よく多孔体１３中に細胞５５を侵入させることができ、かつ多孔体試料内部への細胞の自発的な侵入のみを正確に評価することができる評価試料片の作製方法を提供することができる。
【００４１】
本発明の実施形態である評価試料片の作製方法は、多孔体１３の開孔径が５０μｍ〜５００μｍである構成なので、試料を薄切する必要がなく、材料内への細胞侵入状態を観察でき、迅速、容易、かつ低コストの評価試料片の作製方法を提供することができる。
【００４２】
本発明の実施形態である評価試料片の作製方法は、多孔体１３が金属、セラミック又は高分子からなる構成なので、いずれの材料製の多孔体試料中への細胞侵入性も評価でき、迅速、容易、かつ低コストの評価試料片の作製方法を提供することができる。
【００４３】
本発明の実施形態である評価試料片の作製方法は、前記金属がＴｉ又はステンレス鋼である構成なので、医用材料として用いられている金属材料についても細胞侵入性を評価でき、迅速、容易、かつ低コストの評価試料片の作製方法を提供することができる。
【００４４】
本発明の実施形態である評価試料片の作製方法は、多孔体１３中に細胞５５を侵入させた後、多孔体１３中に侵入した細胞を固定する構成なので、多孔体内部に侵入した細胞の状態を観察でき、迅速、容易、かつ低コストの評価試料片の作製方法を提供することができる。
【００４５】
本発明の実施形態である評価試料片の作製方法は、細胞５５を固定後、多孔体１３を１ｍｍ以上の幅で切断する構成なので、１ｍｍ以上の厚切の試料を作製することができ、試料を薄切する必要がなく、材料内への細胞侵入状態を観察することができ、迅速、容易、かつ低コストの評価試料片の作製方法を提供することができる。
【００４６】
本発明の実施形態である評価試料片の作製方法は、多孔体１３を切断後、多孔体１３中に固定した細胞５５を、染色する構成なので、多孔体内部に侵入した細胞の状態を適切に観察することができ、迅速、容易、かつ低コストの評価試料片の作製方法を提供することができる。
【００４７】
本発明の実施形態である評価試料片の作製方法は、細胞培養前に、基板シート５４及び多孔体１３を滅菌処理する構成なので、細菌等が混入することなく、多孔体内部に侵入した細胞の状態を正確に観察でき、迅速、容易、かつ低コストの評価試料片の作製方法を提供することができる。
【００４８】
本発明の実施形態である評価試料片封入体の作製方法は、評価試料片２１を、窓部２８を有する封入容器２７の窓部２８上に配置してから、評価試料片２１上にガラス２４を配置する構成なので、迅速、容易、かつ低コストに厚切りした前記評価試料片を用いて評価試料片封入体を作製できる。
【００４９】
本発明の実施形態である評価試料片封入体の作製方法は、封入容器２７が凹部２７ｄを有し、凹部２７ｄの底面に窓部２８が設けられている構成なので、迅速、容易、かつ低コストに評価試料片封入体を作製できる。
【００５０】
本発明の実施形態である多孔体中への細胞侵入性の評価方法は、評価試料片封入体３１を蛍光顕微鏡で観察する評価試料片評価工程Ｓ３と、を有する構成なので、厚い試料についても正立／倒立型蛍光顕微鏡を用いて一定時間安定に蛍光観察ができ、厚切りした前記評価試料片を観察可能な多孔体中への細胞侵入性の評価方法を提供することができる。
【００５１】
本発明の実施形態である評価試料片の作製方法、評価試料片封入体の作製方法及び多孔体中への細胞侵入性の評価方法は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で、種々変更して実施することができる。本実施形態の具体例を以下の実施例で示す。しかし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５２】
（実施例１）
図１０は、多孔体中への細胞侵入性の評価工程図である。
まず、テフロンシートメッシュ上に１５ｍｍ角に切断した厚さ０．０５ｍｍのシリコーンゴムシートを置き、オートクレーブ滅菌した。
次に、前記シリコーンゴムシートをプラズマ処理した。
次に、プラズマ処理したシリコーンゴムシートを細胞培養用ディスポーザブルディッシュ内に静置した。
【００５３】
次に、図１０（ａ）に示すように、シリコーンゴムシートに、ヒト骨肉腫由来細胞Ｓａｏｓ−２を細胞培養液と共に適量播種し、細胞がほぼシート表面を覆う状態になるまで、３−５日間ＣＯ２インキュベータ内で培養した。
【００５４】
次に、図１０（ｂ）に示すように、別の新しい細胞培養用ディスポーザブルディッシュ内に滅菌した多孔体を置き、ヒト骨肉腫由来細胞Ｓａｏｓ−２を培養したシリコーンゴムシートを、細胞が接着している面が多孔体表面と接触するように載せた。
なお、前記多孔体としては、１１ｍｍ角、厚さ２ｍｍに切断した、平均開孔径が１８１μｍのチタン製多孔体であって、オートクレーブ滅菌したものを用いた。
【００５５】
次に、前記細胞培養用ディスポーザブルディッシュ内に細胞培養液を添加し、シリコーンゴムシート及び多孔体を浸漬させた状態で、ＣＯ２インキュベータ内に静置した。
その後、１日置きに培養液を交換して、７−２１日間培養した。
次に、シリコーンゴムシートを取り除き、試料をリン酸緩衝液で洗浄した。
次に、図１０（ｃ）に示すように、ホルムアルデヒド溶液で処理して細胞を固定した。
【００５６】
次に、図１０（ｄ）に示すように、精密カッターで多孔体試料を幅約２ｍｍに切断した。
次に、蛍光色素（テキサスレッド）で細胞を染色して、細胞侵入性評価試料片を作製した。
【００５７】
次に、図１０（ｅ）に示すように、細胞侵入性評価試料片を用いて、評価試料片封入体を作製した。
評価試料片封入体は、ガラスボトムディッシュを用い、ガラスボトム部分に試料を載せ、蛍光色素の退色防止剤を含むリン酸緩衝液とグリセリン混液を滴下後、カバーガラスを試料上部に載せ、封入して、実施例１の評価試料片封入体を作製した。
【００５８】
（実施例２）
開孔径が３２５μｍの多孔体を用いた他は実施例１と同様にして、実施例２の評価試料片封入体を作製した。
【００５９】
（実施例３）
開孔径が５０４μｍの多孔体を用いた他は実施例１と同様にして、実施例３の評価試料片封入体を作製した。
【００６０】
＜評価＞
まず、図１０（ｆ）に示すように、蛍光観察装置を備えたズーム式実体顕微鏡（蛍光顕微鏡）および共焦点顕微鏡で観察した。
【００６１】
図１１〜１３は、実施例１の評価試料片封入体のズーム式実体顕微鏡による観察画像であって、それぞれ７日培養（図１１）、１４日培養（図１２）、２１日培養（図１３）のものである。
また、図１４は、実施例１の評価試料片封入体の共焦点顕微鏡による観察画像である。
いずれの観察法でも、切断面および多孔体孔部分を介して、多孔体内の細胞の位置、形態等の状態を容易かつ明確に観察することができた。
【００６２】
図１５は、実施例１〜３の評価試料片封入体の細胞の多孔体内部への侵入距離の測定結果である。この侵入距離は、最長到達距離であり、ズーム式実体顕微鏡画像を基に算出した。
開孔径の異なるいずれの多孔体試料も、培養期間の増加に伴い、細胞侵入距離が増加した。また、多孔体の孔構造（開孔径）により、同一の培養期間であっても、細胞の侵入距離が異なることが判った。
【００６３】
＜細胞侵入性評価に及ぼす前培養条件の影響の検討＞
（比較例１）
テフロンシートメッシュおよびシリコーンゴムシートは用いず、細胞培養用ディスポーザブルディッシュ底面に直接Ｓａｏｓ−２細胞を細胞培養液と共に適量播種し、細胞がほぼ底面を覆う状態になるまで、３−５日間ＣＯ２インキュベータ内で前培養した。その後、１１ｍｍ角、厚さ２ｍｍに切断した開孔径３２５μｍのチタン製多孔体（オートクレーブ滅菌済み）を細胞の上に載せ、細胞培養液を添加し、１日置きに交換しながら５日間培養した。
その多孔体を、実施例１と同様の手法にて固定・切断・染色後、封入して、比較例１の評価試料片を作成した。
【００６４】
（比較例２）
実施例１と同様に、しかしシリコーンゴムシートのプラズマ処理は行わず前培養を行った。その後、１１ｍｍ角、厚さ２ｍｍに切断した開孔径３２５μｍのチタン製多孔体（オートクレーブ滅菌済み）の上にシリコーンゴムシートを載せ、１日置きに培養液交換を行いながら７日間培養した。
その多孔体を、固定・切断・染色・封入して、比較例２の評価試料片を作成した。
【００６５】
（実施例４）
実施例１と同様にシリコーンゴムシートにプラズマ処理を行い、前培養した。その後、１１ｍｍ角、厚さ２ｍｍに切断した開孔径３２５μｍのチタン製多孔体（オートクレーブ滅菌済み）の上にシリコーンゴムシートを載せ、１日置きに培養液交換を行いながら７日間培養した。
その多孔体を、固定・切断・染色・封入して、実施例４の評価試料片を作成した。
【００６６】
図１６〜１８は、比較例１、２及び実施例４の評価試料片について、実体蛍光顕微鏡にて観察した像である。
図１６〜１８から明らかなように、実施例１の方法を用いた場合のみ、試料表面全面に均質に細胞が侵入していることが観察できた。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明は評価試料片の作製方法及び多孔体中への細胞侵入性の評価方法に関するものであり、多孔体中への細胞侵入性の評価を行うことにより、骨に強固に接合する多孔体を見出すことができ、医療産業等において利用可能性がある。
【符号の説明】
【００６８】
１１ｃ…細胞の侵入領域、１１ｄ…固定された細胞の侵入領域、１１ｅ…染色され、固定された細胞の侵入領域、１３…多孔体、１３ａ…一面、１３ｂ…他面、１４ａ、１４ｂ、１４ｃ、１４ｄ…切断線、２１…評価試料片、２３、２４…ガラス、２５…緩衝液、２６…接着剤、２７…封入容器、２７ｄ…凹部、２７ｅ…開口部、２８…窓部、３１…評価試料片封入体、５１、５２…培養用容器、５３…培養液、５４…基体シート、５５…細胞、５６…サポートシート、５７…固定液、１１１…観察用封入試料、１２３…スライドグラス、１２４…カバーガラス、１２５…緩衝液、１２８…封入剤（接着剤）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔体中への細胞侵入性の評価を行うための評価試料片の作製方法であって、
基板シートの一面に細胞を培養してから、前記基板シートを、細胞を培養させた面を前記多孔体の一面に接触させて配置して、前記多孔体中に細胞を侵入させることを特徴とする評価試料片の作製方法。
【請求項２】
前記基板シートがシリコーンゴムシート、ポリ乳酸フィルム、ポリエチレンフィルム又はコラーゲンスポンジの群から選択される一の材料からなることを特徴とする請求項１に記載の評価試料片の作製方法。
【請求項３】
前記多孔体の開孔径が５０μｍ〜５００μｍであることを特徴とする請求項１又は２に記載の評価試料片の作製方法。
【請求項４】
前記多孔体が金属、セラミック又は高分子からなることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の評価試料片の作製方法。
【請求項５】
前記金属がＴｉ又はステンレス鋼であることを特徴とする請求項４に記載の評価試料片の作製方法。
【請求項６】
多孔体１３中に細胞５５を侵入させた後、前記多孔体中に侵入した細胞を固定することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の評価試料片の作製方法。
【請求項７】
細胞を固定後、前記多孔体を１ｍｍ以上の幅で切断することを特徴とする請求項６に記載の評価試料片の作製方法。
【請求項８】
前記多孔体を切断後、前記多孔体中に固定した細胞を、染色することを特徴とする請求項７に記載の評価試料片の作製方法。
【請求項９】
細胞培養前に、前記基板シート及び前記多孔体を滅菌処理することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の評価試料片の作製方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の評価試料片の作製方法を用いて作製した評価試料片を、窓部を有する封入容器の前記窓部上に配置してから、前記評価試料片上にガラスを配置することを特徴とする評価試料片封入体の作製方法。
【請求項１１】
前記封入容器が凹部を有し、前記凹部の底面に窓部が設けられていることを特徴とする請求項１０に記載の評価試料片封入体の作製方法。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の評価試料片封入体を蛍光顕微鏡で観察することを特徴とする多孔体中への細胞侵入性の評価方法。
【請求項１】
多孔体中への細胞侵入性の評価を行うための評価試料片の作製方法であって、
基板シートの一面に細胞を培養してから、前記基板シートを、細胞を培養させた面を前記多孔体の一面に接触させて配置して、前記多孔体中に細胞を侵入させることを特徴とする評価試料片の作製方法。
【請求項２】
前記基板シートがシリコーンゴムシート、ポリ乳酸フィルム、ポリエチレンフィルム又はコラーゲンスポンジの群から選択される一の材料からなることを特徴とする請求項１に記載の評価試料片の作製方法。
【請求項３】
前記多孔体の開孔径が５０μｍ〜５００μｍであることを特徴とする請求項１又は２に記載の評価試料片の作製方法。
【請求項４】
前記多孔体が金属、セラミック又は高分子からなることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の評価試料片の作製方法。
【請求項５】
前記金属がＴｉ又はステンレス鋼であることを特徴とする請求項４に記載の評価試料片の作製方法。
【請求項６】
多孔体１３中に細胞５５を侵入させた後、前記多孔体中に侵入した細胞を固定することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の評価試料片の作製方法。
【請求項７】
細胞を固定後、前記多孔体を１ｍｍ以上の幅で切断することを特徴とする請求項６に記載の評価試料片の作製方法。
【請求項８】
前記多孔体を切断後、前記多孔体中に固定した細胞を、染色することを特徴とする請求項７に記載の評価試料片の作製方法。
【請求項９】
細胞培養前に、前記基板シート及び前記多孔体を滅菌処理することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の評価試料片の作製方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の評価試料片の作製方法を用いて作製した評価試料片を、窓部を有する封入容器の前記窓部上に配置してから、前記評価試料片上にガラスを配置することを特徴とする評価試料片封入体の作製方法。
【請求項１１】
前記封入容器が凹部を有し、前記凹部の底面に窓部が設けられていることを特徴とする請求項１０に記載の評価試料片封入体の作製方法。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の評価試料片封入体を蛍光顕微鏡で観察することを特徴とする多孔体中への細胞侵入性の評価方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公開番号】特開２０１２−２２０２６４（Ｐ２０１２−２２０２６４Ａ）
【公開日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−８４１３０（Ｐ２０１１−８４１３０）
【出願日】平成２３年４月６日（２０１１．４．６）
【出願人】（３０１０２３２３８）独立行政法人物質・材料研究機構 (1,333)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月１２日（２０１２．１１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年４月６日（２０１１．４．６）
【出願人】（３０１０２３２３８）独立行政法人物質・材料研究機構 (1,333)
【Ｆターム（参考）】
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