超解像顕微鏡
【課題】ポンプ光およびイレース光の光源選定を容易にでき、簡単かつ安価な構成で超解像性を確実に発現できる超解像顕微鏡を提供する。
【解決手段】第１の光源２からの第１のコヒーレント光と第２の光源１からの第１のコヒーレント光とを、光学系３，４，９により一部重ね合わせて試料１０に集光して走査手段６，７により走査し、試料１０からの光応答信号を検出手段１６で検出する超解像顕微鏡において、第１のコヒーレント光の波長をλp、第２のコヒーレント光の波長をλe、第１のコヒーレント光の試料面における最大フォトンフラックスをＩp、第２のコヒーレント光の試料面における最大フォトンフラックスをＩe、分子が基底状態から第１電子励起状態に励起するときの吸収断面積をσ01、および蛍光抑制断面積をσdipとするとき、
および
を満足するように構成する。
【解決手段】第１の光源２からの第１のコヒーレント光と第２の光源１からの第１のコヒーレント光とを、光学系３，４，９により一部重ね合わせて試料１０に集光して走査手段６，７により走査し、試料１０からの光応答信号を検出手段１６で検出する超解像顕微鏡において、第１のコヒーレント光の波長をλp、第２のコヒーレント光の波長をλe、第１のコヒーレント光の試料面における最大フォトンフラックスをＩp、第２のコヒーレント光の試料面における最大フォトンフラックスをＩe、分子が基底状態から第１電子励起状態に励起するときの吸収断面積をσ01、および蛍光抑制断面積をσdipとするとき、
および
を満足するように構成する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡、特に染色した試料を機能性の高いレーザ光源からの複数の波長の光により照明して、高い空間分解能を得る高性能かつ高機能の超解像顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプの顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザ技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、さらに高機能の顕微鏡システムが開発されている。
【０００３】
このような背景の中、複数波長の光で試料を照明することにより発する二重共鳴吸収過程を用いて、得られる画像のコントラストの制御のみならず化学分析も可能にした高機能な顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
この顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて特定の分子を選択して、特定の光学遷移に起因する吸収および蛍光を観測するものである。この原理について、図１２〜図１５を参照して説明する。図１２は、試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示すもので、先ず、図１２に示す基底状態（Ｓ０状態）の分子がもつ価電子軌道の電子を波長λ１の光により励起して、図１３に示す第１電子励起状態（Ｓ１状態）とする。次に、別の波長λ２の光により同様に励起して、図１４に示す第２電子励起状態（Ｓ２状態）とする。この励起状態により、分子は蛍光あるいは燐光を発光して、図１５に示すように基底状態に戻る。
【０００５】
二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、図１３の吸収過程や図１５の蛍光や燐光の発光を用いて、吸収像や発光像を観察する。この顕微鏡法では、最初にレーザ光等により共鳴波長λ１の光で図１３のように試料を構成する分子をＳ１状態に励起させるが、この際、単位体積内でのＳ１状態の分子数は、照射する光の強度が増加するに従って増加する。
【０００６】
ここで、線吸収係数は、分子一個当りの吸収断面積と単位体積当たりの分子数との積で与えられるので、図１４のような励起過程においては、続いて照射する共鳴波長λ２に対する線吸収係数は、最初に照射した波長λ１の光の強度に依存することになる。すなわち、波長λ２に対する線吸収係数は、波長λ１の光の強度で制御できることになる。このことは、波長λ１および波長λ２の２波長の光で試料を照射し、波長λ２による透過像を撮影すれば、透過像のコントラストは波長λ１の光で完全に制御できることを示している。
【０００７】
また、図１４の励起状態での蛍光または燐光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強度はＳ１状態にある分子数に比例する。したがって、蛍光顕微鏡として利用する場合にも画像コントラストの制御が可能となる。
【０００８】
さらに、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、上記の画像コントラストの制御のみならず、化学分析も可能にする。すなわち、図１２に示される最外殻価電子軌道は、各々の分子に固有なエネルギー準位を持つので、波長λ１は分子によって異なることになり、同時に波長λ２も分子固有のものとなる。
【０００９】
ここで、従来の単一波長で照明する場合でも、ある程度特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが可能であるが、一般にはいくつかの分子における吸収帯の波長領域は重複するので、試料の化学組成の正確な同定までは不可能である。
【００１０】
これに対し、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、波長λ１および波長λ２の２波長により吸収あるいは発光する分子を限定するので、従来法よりも正確な試料の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルをもつ光のみが強く吸収されるので、波長λ１および波長λ２の偏光方向を決めて吸収または蛍光像を撮影すれば、同じ分子でも配向方向の同定まで可能となる。
【００１１】
また、最近では、二重共鳴吸収過程を用いて回折限界を越える高い空間分解能をもつ蛍光顕微鏡も提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【００１２】
図１６は、分子における二重共鳴吸収過程の概念図で、基底状態Ｓ０の分子が、波長λ１の光で第１電子励起状態であるＳ１に励起され、さらに波長λ２の光で第２電子励起状態であるＳ２に励起されている様子を示している。なお、図１６はある種の分子のＳ２からの蛍光が極めて弱いことを示している。
【００１３】
図１６に示すような光学的性質を持つ分子の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図１７は、図１６と同じく二重共鳴吸収過程の概念図で、横軸のＸ軸は空間的距離の広がりを表わし、波長λ２の光を照射した空間領域Ａ１と波長λ２の光が照射されない空間領域Ａ０とを示している。
【００１４】
図１７において、空間領域Ａ０では波長λ１の光の励起によりＳ１状態の分子が多数生成され、その際に空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見られる。しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の光を照射したため、Ｓ１状態の分子のほとんどが即座に高位のＳ２状態に励起されて、Ｓ１状態の分子は存在しなくなる。このような現象は、幾つかの分子により確認されている。これにより、空間領域Ａ１では、波長λ３の蛍光は完全になくなり、しかもＳ２状態からの蛍光はもともとないので、空間領域Ａ１では完全に蛍光自体が抑制され（蛍光抑制効果）、空間領域Ａ０からのみ蛍光が発することになる。
【００１５】
このことは、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持っている。すなわち、従来の走査型レーザ顕微鏡等では、レーザ光を集光レンズによりマイクロビームに集光して観察試料上を走査するが、その際のマイクロビームのサイズは、集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界となり、原理的にそれ以上の空間分解能は期待できない。
【００１６】
ところが、図１７の場合には、波長λ１と波長λ２との２種類の光を空間的に上手く重ね合わせて、波長λ２の光の照射により蛍光領域を抑制することで、例えば波長λ１の光の照射領域に着目すると、蛍光領域を集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界よりも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能となる。以下、波長λ１の光をポンプ光、波長λ２の光をイレース光と呼ぶ。したがって、この原理を利用することで、回折限界を越える二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡、例えば超解像蛍光顕微鏡を実現することが可能となる。
【特許文献１】特開平８−１８４５５２号公報
【特許文献２】特開２００１−１００１０２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
ところで、超解像蛍光顕微鏡において、その性能を有効に発現させるためには、分子の光学物性を十分に考慮して、ポンプ光とイレース光との照射強度を十分注意して最適化する必要がある。特に、イレース光のレーザ強度は、超解像性の発現に大きく影響を与える。さらに、本発明者らの実験検討によると、超解像顕微鏡で得られる２次元点像分布関数すなわち蛍光スポットの強度プロファイルは、従来の光学顕微鏡のそれとは大きく異なることが判明した。
【００１８】
ここで、光学顕微鏡の光学性能を評価する最も基本的な物理量として、点像分布関数（ＰＳＦ）がある。これが判明すると、顕微鏡の分解能を決定する２点分解能や画質を総合評価するのに不可欠な光学伝達関数（ＯＴＦ）を算出することができる。
【００１９】
一般の顕微鏡システムでは、円形開口をもつレンズや絞り等を組み合わせた光学系が用いられており、このような光学系のＰＳＦは、良く知られた円形開口の場合のフラウンホーファー回折像で与えられる。ここで、光源波長を（λp）、光学系の開口数を（ＮＡ）とすると、光軸からの像面内の距離（ｒ）における強度すなわち点像分布関数（Ｈ(r)）は、下記の式（１）で与えられる。
【００２０】
【数１】
【００２１】
ここで、（Ｊ1(z)）は１次のベッセル関数であり、（Ｃpo）は中心強度、ｋeは光源の波数を示す。大体の顕微鏡システムの場合、式（１）のＰＳＦを基本とした結像理論が構築され、その性能評価が行われている。蛍光顕微鏡の場合にも、試料からの蛍光強度が励起光源の照射強度に比例するものとして、式（１）を用いた同様の評価がなされている。
【００２２】
しかながら、超解像顕微鏡の場合、試料に異なる２波長の光を共鳴吸収させるため、もはや光源の照射強度と蛍光強度との比例関係は成り立たない。
【００２３】
仮に、ポンプ光の照射強度が一定であっても、イレース光の照射強度を増加させると蛍光強度が非線形的に減衰することが報告されている。このような、試料の光応答特性は、当然、ＰＳＦに強い影響を与える。事実、最近の文献（Opt.Express 11(2003)3271）によれば、超解像顕微鏡におけるＰＳＦは、上記式（１）が与える強度分布とは大きく異なったローレンチアン型に近い形状を持っている。一般の光学システムでは、このよう形が現れることは極めて稀である。
【００２４】
このような理由で、従来は、超解像顕微鏡システムを具現化するときのポンプ光およびイレース光の最適な条件が不明であったため、ポンプ光およびイレース光の光源選定が困難となっていた。
【００２５】
したがって、かかる事情に鑑みてなされた本発明の目的は、ポンプ光およびイレース光の光源選定を容易にでき、簡単かつ安価な構成で超解像性を確実に発現できる超解像顕微鏡を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
上記目的を達成する請求項１に係る発明は、少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料に対して、上記分子を基底状態から励起寿命τをもつ第１電子励起状態に励起する第１のコヒーレント光を出射する第１の光源と、
上記分子を上記第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起する第２のコヒーレント光を出射する第２の光源と、
上記第１のコヒーレント光と上記第２のコヒーレント光とを一部重ね合わせて上記試料に集光する光学系と、
上記光学系により集光される光と上記試料とを相対的に移動させて上記試料を走査する走査手段と、
上記光学系からの光照射により上記試料から発生する光応答信号を検出する検出手段とを有する超解像顕微鏡において、
上記第１のコヒーレント光の波長をλp、上記第２のコヒーレント光の波長をλe、上記第１のコヒーレント光の上記試料面における最大フォトンフラックスをＩp、上記第２のコヒーレント光の上記試料面における最大フォトンフラックスをＩe、上記分子が基底状態から上記第１電子励起状態に励起するときの吸収断面積をσ01、および蛍光抑制断面積をσdipとするとき、
を満足するように構成したことを特徴とするものである。
【００２７】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の超解像顕微鏡において、さらに、
を満足するように構成したことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、上記の条件を満たすようにすることで、ポンプ光およびイレース光の光源選定を容易にでき、例えば取り扱いが難しい短パルスレーザ光源を用いることなく、信頼性の高いＣＷレーザを用いることができるなど、簡単かつ安価な構成で超解像性を確実に発現できる超解像顕微鏡を容易に実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明に係る超解像顕微鏡の一実施の形態について説明する。
【００３０】
図１は、本発明の一実施の形態に係る超解像顕微鏡のシステム構成を示す図である。この超解像顕微鏡は、通常のレーザ走査型蛍光顕微鏡を前提としたもので、主に３つの独立したユニット、すなわち、光源ユニット３０、スキャンユニット４０および顕微鏡ユニット５０からなっている。
【００３１】
光源ユニット３０は、第１のコヒーレント光として例えば波長５３２ｎｍのポンプ光を出射する第１の光源であるＬＤ励起型モードロックＮｄ：ＹＡＧレーザ２と、第２のコヒーレント光として例えば波長６４７ｎｍのイレース光を出射する第２の光源であるＫrレーザ１と、イレース光空間変調用の位相板３と、イレース光およびポンプ光を融合させるためのビームコンバイナ４とを有している。位相板３は、図２に示すように、光軸対称の位置で通過したイレース光の位相が反転するように調整された光学薄膜が蒸着されている。図２では、光軸の周りに独立した４領域を有し、イレース光波長に対して４分１ずつ位相が異なっている。この位相板３を通過した光を集光すれば、光軸上で電場が相殺され中空状のイレース光が生成される。
【００３２】
スキャンユニット４０は、光源ユニット３０から供給される同じ光学軸を共有するポンプ光とイレース光とを、ハーフミラー５を通過させた後、走査手段である２枚のガルバノミラー６および７により２次元方向に揺動走査して、後述の顕微鏡ユニット５０に出射するようになっていると共に、顕微鏡ユニット５０で検出された蛍光を、往路と逆の経路を辿ってハーフミラー５で分岐し、その分岐された蛍光を投影レンズ１２、ピンホール１３、ノッチフィルタ１４および１５を経て検出手段である光電子増倍管１６で受光するようになっている。図１では、図面を簡略化するため、ガルバノミラー６，７を同一平面内で揺動可能に示している。なお、ノッチフィルタ１４および１５は、蛍光に混入したポンプ光およびイレース光を除去するものである。また、ピンホール１３は、共焦点光学系を成す重要な光学素子で、観察試料内の特定の断層面で発光した蛍光のみを通過させるものである。
【００３３】
顕微鏡ユニット５０は、いわゆる通常の蛍光顕微鏡で、スキャンユニット４０から入射するポンプ光およびイレース光をハーフミラー８で反射させて、対物レンズ９により少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む観察試料１０上に集光させると共に、観察試料１０で発光した蛍光を、再び対物レンズ９でコリメートしてハーフミラー８で反射させることにより、再び、スキャンユニット４０に戻すと同時に、ハーフミラー８を通過する蛍光の一部を接眼レンズ１１に導いて、蛍光像として目視観察できるようになっている。
【００３４】
ここで、位相板３、ビームコンバイナ４および対物レンズ９は、ポンプ光とイレース光とを一部重ね合わせて観察試料１０に集光する光学系を構成している。
【００３５】
本実施の形態では、図１に示す超解像顕微鏡において、観察試料１０に含まれる分子を基底状態から励起寿命τをもつ第１電子励起状態に励起するポンプ光の波長をλp、上記分子を第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起するイレース光の波長をλe、ポンプ光の観察試料面における最大フォトンフラックスをＩp、イレース光の観察試料面における最大フォトンフラックスをＩe、上記分子が基底状態から第１電子励起状態に励起するときの吸収断面積をσ01、および蛍光抑制断面積をσdipとするとき、
および
さらに好ましくは
を満足するように構成する。
【００３６】
このように構成すれば、観察試料１０の集光点上においてイレース光の強度がゼロとなる光軸近傍以外の蛍光が抑制されて、結果的にポンプ光の広がりより狭い領域（Δ＜０．６１・λ１／ＮＡ、ＮＡは対物レンズ９の開口数）に存在する蛍光ラベラー分子のみが観察されることになり、結果的に超解像性が発現することになる。したがって、ポンプ光およびイレース光をスキャンユニット４０で走査しながら蛍光信号を測定すれば、超解像の２次元蛍光像を得ることができる。
【００３７】
以下、上記のように構成する根拠、すなわち本発明による超解像顕微鏡の原理について説明する。
【００３８】
超解像顕微鏡法におけるＰＳＦは、試料面上におけるポンプ光の強度分布（Ｈ(r)）と、イレース光の強度分布（Ｇ(r)）と、ポンプおよびイレース光の同時照射時における試料の蛍光抑制特性すなわちdip ratio （Ｐ(Ie)）とによって決定される。ここで、Ｉeはイレース光のフォトンフラックスであり、dip ratioとは具体的にはイレース光無照射時と照射時との蛍光強度比を示す。ポンプ光単独照射時の蛍光強度はＨ(r)に比例するので、イレース光同時照射時における蛍光強度プロファイル（Ｆ(r)）は、蛍光抑制特性とポンプ光強度との積すなわち下記の式（２）で与えられる。
【００３９】
【数２】
【００４０】
実際の超解像顕微鏡法では、図３に示すように、イレース光として光軸上で光強度が存在しない中空状のベッセル１次ビームを用いる。ここで、顕微鏡の対物レンズが無収差光学系であれば、ポンプ光の形状Ｈ(r)は式（１）で与えられる。これに対し、イレース光で用いるベッセルビームは、図４に示すように、ビームの断面（瞳面）において、ビームの中心軸に対して周回するように０から２πまで連続的に変化する位相分布を持っている。したがって、すべての動径方向について中心軸に対してπだけ位相が異なっているため、集光すると光軸上で電場強度が相殺され、その強度分布は、ビーム最大強度値（Ｃe0）を用いて、式（３）に示すように表される。
【００４１】
【数３】
【００４２】
ここで、λeおよびｋeは、イレース光の波長および波数である。また、Ｊn(z)は、ｎ次のベッセル関数で、
でｒ2以上の次数を持つため、ｒ＝０でＧ(0)＝０となることが容易に判る。式（３）を、極大値を１とし、λ／ＮＡを１にとってプロットすると、図５に太線で示すようになり、ｒ＝０で強度が０となるイレース光として理想的な中空状のプロファイルが得られる。なお、図５には、比較のために、均一波面のポンプ光を集光したときのビームプロファイルを細線でプロットしてある。図５から明らかなように、イレース光として理想的な中空状のプロファイルが得られれば、中心部分の蛍光強度を損なうことなく、ドーナツの周辺部において効率的に蛍光抑制でき、回折限界より小さい蛍光スポットが形成できる。
【００４３】
イレース光のビーム形状とならんで、dip ratioも超解像効果の発現の程度を決める重要な要素である。これは、分子構造に起因するところの分子固有の光応答特性である。図６に、２波長蛍光Dip分光法の励起ダイヤグラムを示す。一般に、図６に示すように、ポンプ光で基底状態（Ｓ０）の分子を状態Ｓ１に励起すると、分子はＳ１状態より蛍光を発してＳ０状態に緩和する。ここで、イレース光を照射すると、イレース光により分子は高い量子状態（Ｓｎ）に励起されて、Ｓ０やＴｍ３重項状態への無輻射緩和が起こる。もし、イレース光の波長が蛍光波長帯域に重複していれば誘導放出過程も起こる。したがって、イレース光照射時に、この蛍光量が減少し、その変化が窪み（Dip）として観測される。
【００４４】
一般に、蛍光強度は、Ｓ１状態のポピュレーションに比例するので、dip ratioはこのポピュレーションを求めることにより解析することができる。すなわち、ポピュレーションを観測時間（Ｔ）で積分した量が観測された蛍光強度であるので、dip ratio P(Ｉe)は式（４）で与えられる。
【００４５】
【数４】
【００４６】
ここで、ｎ１（ｔ,Ｉe）はＳ１状態のポピュレーションであり、イレース光のフォトンフラックスと観測時間との関数となる。さらに、ｎ１（ｔ,Ｉe）は、Ｓ０状態（ｎ０（ｔ,Ｉe））およびＳｎ状態（ｎ２（ｔ,Ｉe））のポピュレーションを加えた３準位のレート方程式により決定される。
【００４７】
【数５】
【００４８】
ここで、使用した分光パラメータを図６に示す。このレート方程式は、線形の１回の微分方程式であり、一般に下記のような形式の解をもつ。
【００４９】
【数６】
【００５０】
ここで、Ｄnmは初期条件から決まる係数であり、γ1,2,3は式（５）の３×３係数行列の固有値であり、具体的には下記の根をもつ。
【００５１】
【数７】
【００５２】
したがって、式（６）は、以下のように表される。
【００５３】
【数８】
【００５４】
式（８）の指数部の成分は、ポンプ光およびイレース光照射開始直後の過渡的な遷移によるポピュレーションの変化を示し、それ以外のＤn3は光照射が続き定常状態に至った場合の各状態のポピュレーションを示す。ここで、根γ1,2は負の値持ち、下記の関係が成り立つ。
【００５５】
【数９】
【００５６】
ここで、｜γ1,2｜の逆数は過渡期が終了する時間に対応し、大体の分子では１nsec以内で定常状態になる。したがって、多くの場合、ナノ秒のレーザ光源を用いた蛍光抑制過程の場合、式（８）おける指数項を無視でき、以下のように表すことができる。
【００５７】
【数１０】
【００５８】
したがって、Ｓ１状態のポピュレーションは、下記のような具体的な形で表すことができる。
【００５９】
【数１１】
【００６０】
この式（１１）を式（４）に代入すれば、超解像顕微鏡法で重要なdip ratioを算出することができる。
【００６１】
【数１２】
【００６２】
蛍光抑制を効率的に誘起させるためには、式（１２）の分子が分母に対してできるだけ小さい方が良く、Ｓ０からＳ１に励起させるのに要するフォトンフラックスが十分小さい場合には、式（１２）は、さらに簡単な下記の実用的な式（１３）に近似できる。
【００６３】
【数１３】
【００６４】
ここで、式（１３）の分母に注目すると、ｋ20／（ｋ21＋ｋ20）は分子がＳｎ状態よりＳ１状態を迂回して基底状態に緩和する分岐比であることを考えると、σ12ｋ20／（ｋ21＋ｋ20）はＳ１からＳｎへの励起により無輻射過程で緩和する断面積と解釈できる。さらに、下記の式（１４）で定義されるような分光パラメータ（σdip）すなわち「dip断面積」を定義する。この量は、イレース光照射時において蛍光過程以外でＳ１状態から緩和する総断面積であり、τすなわち蛍光寿命と並び、蛍光抑制の発現の程度を決定する大変重要な分光パラメータである。
【００６５】
【数１４】
【００６６】
超解像顕微鏡の光源としては、汎用性の高い商業用のナノ秒パルスレーザを用いる。これらのレーザ光源は、１０nsec前後のパルス幅をもっている。したがって、実用的には、式（１４）のdip ratioの関係式を用いて顕微鏡システムを構築できる。顕微鏡の光学系が無収差であると仮定すれば、理論的に期待できるＰＳＦは、式（１）、（２）、（３）、（１２）、（１３）および（１４）より、下記の式（１５）から求められる。
【００６７】
【数１５】
【００６８】
ここで、εpおよびεeは、ポンプ光およびイレース光の光子エネルギーであり、ポンプ光およびイレース光の照射強度をそれぞれの光子エネルギーで割るとフォトンフラックスとなる。原理的には、ポンプ光とイレース光との照射条件および試料の分子が決まると、式（１５）を用いて超解像顕微鏡法のＰＳＦを決定できる。しかし、実用的には式（１５）を近似して、さらに単純化できる。
【００６９】
図５から明らかなように、ベッセルビームは、空間変調されていない通常の集光ビームと比較すると、倍のサイズに広がっている。加えて、実際の現場では、イレース光の照射による蛍光発光を阻止するために、ポンプ光より長い波長帯域の光をイレース光として用いるので、その集光サイズはさらに大きくなる。したがって、ポンプ光とイレース光とを試料面に同軸で集光すると、ポンプ光の強度分布の大半はイレース光の穴の内側に存在することになる。そこで、式（３）を近似的に光軸近傍でｒのべき乗に展開し、この穴の強度プロファイルを簡単な関数で近似すると、下記の式（１６）が得られる。
【００７０】
【数１６】
【００７１】
式（１４）から明らかなように、第１項と比較してｒ3以上の高次項は無視できる。事実、穴の内側のプロファイルは、図５に示すように、ｒに関する２次関数でほぼ表現できる。この結果を用いれば、式（１５）は下記の式（１７）のように単純化することができる。
【００７２】
【数１７】
【００７３】
ここで、ローレンチアン関数Ｌ(r)を式（１８）で示すように、
【数１８】
とおくと、Ｆ(r)はポンプ光のＰＳＦを、下記の式（１９）で表される半値幅（g）のローレンチアン関数Ｌ(r)で変調したものに他ならない。
【００７４】
【数１９】
【００７５】
式（１５）によれば、超解像顕微鏡法で得られるＰＳＦの半値幅は、イレース光の強度が増すにつれて、式（１７）のようなローレンチアン関数に変化して行くことが分かる。よって、式（１９）で示される蛍光スポットを小さくするための必要条件は、σdipＣe0を大きくすればよいことが分かる。特に、実用性を鑑みると、イレース光の強度はできるだけ小さいことが望ましいので、試料分子としては蛍光寿命τおよびdip 断面積ができるだけ大きいものを選定することが有利であることが分かる。
【００７６】
ここで、式（１２）に立ち戻って考察すると、蛍光抑制を効率的に誘起させるためには、式（１２）において、分子が分母に対してできるだけ小さい方が有利である。一般に、蛍光寿命τは試料分子固有なものであるので、式（１２）において、分子は必然的に、
を満たす必要がある。すなわち、整理すると、下記の式（２０）を満たす必要がある。
【００７７】
【数２０】
【００７８】
また、式（１７）を考察すると、超解像顕微鏡法により分解能の向上が確認できるのは、式（１８）で示される変調関数であるローレンチアン関数の半値幅ｇが、式（１）で与えられるポンプ光の集光ビームサイズの半値幅よりも小さくなることが不可欠である。ここで、ポンプ光の集光ビームサイズの半値幅（Γ）は、一般にレイリーの規範式により、下記の式（２１）で与えられる。
【００７９】
【数２１】
【００８０】
したがって、ｇがΓより小さくなる条件は、式（２１）および（１９）から、下記の式（２２）のようになる。
【００８１】
【数２２】
【００８２】
具体的には、下記の式（２３）を満たすことが条件となる。
【００８３】
【数２３】
【００８４】
さらに、式（１３）の分母は、分子に対してできるだけ大きいことが望ましいことから、イレース光のフォントンフラックスに関しては、τが試料分子固有であることを考えるとdip断面積を用いて下記の式（２４）を満たすようにするのが望ましい。
【００８５】
【数２４】
【００８６】
この式（２３）を整理すると、下記の式（２５）が得られる。
【００８７】
【数２５】
【００８８】
以上の考察から、図１に示す超解像顕微鏡を、式（２０）および（２３）、さらに好ましくは式（２５）を満足するように構成することで、その性能を向上させることができる。
【００８９】
次に、図１に示す構成の超解像顕微鏡において、ポンプ光の波長を５３２ｎｍ、イレース光の波長を５９９ｎｍとして、ローダミン６Ｇ分子を用いた実験結果について考察する。先ず、最初に、式（１３）を用いて、メタノール溶液中のローダミン６Ｇのdip ratioの測定に関する実験データの解析を行なった。
【００９０】
図７は、メタノール溶液中の蛍光寿命τが３．７５nsecのローダミン６Ｇを用いた場合のdip断面積（σdip）をパラメータとするdip ratioとイレース光のフォトンフラックスとの関係を示すものである。図７によれば、σdip を０．７×１０-16ｃｍ2前後に選ぶと、実験結果をほぼ再現できることが分かる。ローダミン６Ｇに関しては、波長５９９ｎｍの領域ではＳ１からＳｎへの吸収断面と誘導放出断面とが重複するので、正確なσdip は不明であるが、Ｓ１からＳｎへの吸収断面積および誘導放出断面積が１０-16ｃｍ2オーダーであることが報告されおり、本解析結果は妥当なものであると判断できる。
【００９１】
次に、本発明者らは、σdipを０．７×１０-16ｃｍ2、τを３．７５nsecと仮定して、式（１５）およびその近似系である式（１７）により超顕微鏡法におけるＰＳＦを求めた。図８は、イレース光のピーク値のフォトンフラックスが２．１×１０25photons／sec／cm2すなわち電場強度にして７ＭＷ／ｃｍ2の場合のＰＳＦを示す。実線の細線および太線は、それぞれ式（１５）および（１７）のＰＳＦであり、近似式ではサイドローブの部分で僅かな解離が見られるが、プロファイルの一致は良い。図８によれば、フォトンフラックスが１０25photons／sec／cm2のオーダーで顕著な超解像性が発現し、本計算の場合には蛍光プロファイルの半値幅は、ポンプ光の回折限界の１／３サイズである２００ｎｍに収縮する。
【００９２】
以上の条件を考察してみると、ポンプ光のフォトンフラックスＩpを１０23photons／cm2／secとすると、これは十分に蛍光発生できる光量である。例えば、E. Sahara and D. Treves, IEEE. J. Quantum Electron. 13, 962 (1977)のデータ、σ01＝４×１０-16cm2およびτ＝３．７５nsecを用いれば、Ｉpσ01τ＝０．１５となり、式（２０）を満たしている。また、Ｉe＝１０25photons／cm2／sec、σdip1＝０．６×１０-16cm2とすれば、Ｉeσdipτ＝２．６となり、式（２３）および（２５）を同時に満たし、請求項の条件を具体的に満たしていることが確認できる。
【００９３】
図９は、直径１７５μｍの蛍光ビーズを用いて同じ条件で超解像顕微鏡法の蛍光スポット像を測定した場合のＰＳＦを示すものである。図９において、太線で示す測定したプロファイルも、理論解析で予想されたようにサイドローブが広がったローレンチアン型をしている。なお、図９において、細線は、図８で得られた理論式によるＰＳＦをビーズサイズでコンボリューションした結果を示す。この理論的計算は、実験結果をほぼ再現している。この結果、近似式（１７）は、ＰＳＦを表現する合理的な関数であると同時に、物理的なモデルがきわめて明快な、実用的な式であることが分かる。
【００９４】
さらに、ローダミン６Ｇを用いた場合のＰＳＦの結像特性を考察するため、式（１７）を用いて、イレース光のフォトンフラックスに関する依存性を計算した。図１０および図１１は、計算したプロファイルおよびその半値幅を示す。図１０および図１１から明らかなように、集光したイレース光の先頭値のフォトンフラックスが５×１０25photons／secとなると、回折限界サイズの１／４まで収縮することが分かる。例えば、開口数１．４の油浸対物レンズを用いた場合、その半値幅は７０ｎｍとなり、従来の光学顕微鏡では不可能あった１００ｎｍを上回る空間分解能が期待できる。その時の、イレース光のエネルギー時間平均強度を計算すると、ほぼ２０ｍＷ程度となる。このことは、低出力のレーザ光源で対応できることを意味しており、取り扱いが難しい短パルスレーザ光源を用いることなく、信頼性の高いＣＷレーザをベースに、複雑な構成をとらない顕微鏡システムが構成できる可能性を示している。このような簡単なレーザを用いてシステムを構成できることは、システムの価格の低減、また本技術特有のレーザ波面の管理といった実用化に伴う発明の効果が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】本発明の一実施の形態に係る超解像顕微鏡のシステム構成を示す図である。
【図２】図１に示す位相板の構成を示す図である。
【図３】イレース光およびポンプ光のビーム形状と、試料面における蛍光領域および蛍光消失領域とを模式的に示す図である。
【図４】イレース光のビーム断面における位相分布を示す図である。
【図５】ポンプ光およびイレース光の試料面上での強度分布を示すグラフである。
【図６】２波長蛍光Dip分光法の励起ダイヤグラムを示す図である。
【図７】ローダミン６Ｇを用いた場合のdip ratioとイレース光のフォトンフラックスとの関係を示すグラフである。
【図８】イレース光のピーク値のフォトンフラックスが２．１×１０25photons／sec／cm2の場合のＰＳＦを示すグラフである。
【図９】直径１７５μｍの蛍光ビーズを用いて超解像顕微鏡法の蛍光スポット像を測定した場合のＰＳＦを示すグラフである。
【図１０】イレース光のフォトンフラックスのプロファイルを示すグラフである。
【図１１】同じく、その半値幅を示すグラフである。
【図１２】試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示す概念図である。
【図１３】図１２の分子の第１励起状態を示す概念図である。
【図１４】同じく、第２励起状態を示す概念図である。
【図１５】同じく、第２励起状態から基底状態に戻る状態を示す概念図である。
【図１６】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１７】同じく、二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【符号の説明】
【００９６】
１ Ｋrレーザ
２ ＬＤ励起型モードロックＮｄ：ＹＡＧレーザ
３ 位相板
４ ビームコンバイナ
５ ハーフミラー
６，７ ガルバノミラー
８ ハーフミラー
９ 対物レンズ
１０ 観察試料
１１ 接眼レンズ
１２ 投影レンズ
１３ ピンホール
１４，１５ ノッチフィルタ
１６ 光電子増倍管
３０ 光源ユニット
４０ スキャンユニット
５０ 顕微鏡ユニット
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡、特に染色した試料を機能性の高いレーザ光源からの複数の波長の光により照明して、高い空間分解能を得る高性能かつ高機能の超解像顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプの顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザ技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、さらに高機能の顕微鏡システムが開発されている。
【０００３】
このような背景の中、複数波長の光で試料を照明することにより発する二重共鳴吸収過程を用いて、得られる画像のコントラストの制御のみならず化学分析も可能にした高機能な顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
この顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて特定の分子を選択して、特定の光学遷移に起因する吸収および蛍光を観測するものである。この原理について、図１２〜図１５を参照して説明する。図１２は、試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示すもので、先ず、図１２に示す基底状態（Ｓ０状態）の分子がもつ価電子軌道の電子を波長λ１の光により励起して、図１３に示す第１電子励起状態（Ｓ１状態）とする。次に、別の波長λ２の光により同様に励起して、図１４に示す第２電子励起状態（Ｓ２状態）とする。この励起状態により、分子は蛍光あるいは燐光を発光して、図１５に示すように基底状態に戻る。
【０００５】
二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、図１３の吸収過程や図１５の蛍光や燐光の発光を用いて、吸収像や発光像を観察する。この顕微鏡法では、最初にレーザ光等により共鳴波長λ１の光で図１３のように試料を構成する分子をＳ１状態に励起させるが、この際、単位体積内でのＳ１状態の分子数は、照射する光の強度が増加するに従って増加する。
【０００６】
ここで、線吸収係数は、分子一個当りの吸収断面積と単位体積当たりの分子数との積で与えられるので、図１４のような励起過程においては、続いて照射する共鳴波長λ２に対する線吸収係数は、最初に照射した波長λ１の光の強度に依存することになる。すなわち、波長λ２に対する線吸収係数は、波長λ１の光の強度で制御できることになる。このことは、波長λ１および波長λ２の２波長の光で試料を照射し、波長λ２による透過像を撮影すれば、透過像のコントラストは波長λ１の光で完全に制御できることを示している。
【０００７】
また、図１４の励起状態での蛍光または燐光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強度はＳ１状態にある分子数に比例する。したがって、蛍光顕微鏡として利用する場合にも画像コントラストの制御が可能となる。
【０００８】
さらに、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、上記の画像コントラストの制御のみならず、化学分析も可能にする。すなわち、図１２に示される最外殻価電子軌道は、各々の分子に固有なエネルギー準位を持つので、波長λ１は分子によって異なることになり、同時に波長λ２も分子固有のものとなる。
【０００９】
ここで、従来の単一波長で照明する場合でも、ある程度特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが可能であるが、一般にはいくつかの分子における吸収帯の波長領域は重複するので、試料の化学組成の正確な同定までは不可能である。
【００１０】
これに対し、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、波長λ１および波長λ２の２波長により吸収あるいは発光する分子を限定するので、従来法よりも正確な試料の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルをもつ光のみが強く吸収されるので、波長λ１および波長λ２の偏光方向を決めて吸収または蛍光像を撮影すれば、同じ分子でも配向方向の同定まで可能となる。
【００１１】
また、最近では、二重共鳴吸収過程を用いて回折限界を越える高い空間分解能をもつ蛍光顕微鏡も提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【００１２】
図１６は、分子における二重共鳴吸収過程の概念図で、基底状態Ｓ０の分子が、波長λ１の光で第１電子励起状態であるＳ１に励起され、さらに波長λ２の光で第２電子励起状態であるＳ２に励起されている様子を示している。なお、図１６はある種の分子のＳ２からの蛍光が極めて弱いことを示している。
【００１３】
図１６に示すような光学的性質を持つ分子の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図１７は、図１６と同じく二重共鳴吸収過程の概念図で、横軸のＸ軸は空間的距離の広がりを表わし、波長λ２の光を照射した空間領域Ａ１と波長λ２の光が照射されない空間領域Ａ０とを示している。
【００１４】
図１７において、空間領域Ａ０では波長λ１の光の励起によりＳ１状態の分子が多数生成され、その際に空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見られる。しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の光を照射したため、Ｓ１状態の分子のほとんどが即座に高位のＳ２状態に励起されて、Ｓ１状態の分子は存在しなくなる。このような現象は、幾つかの分子により確認されている。これにより、空間領域Ａ１では、波長λ３の蛍光は完全になくなり、しかもＳ２状態からの蛍光はもともとないので、空間領域Ａ１では完全に蛍光自体が抑制され（蛍光抑制効果）、空間領域Ａ０からのみ蛍光が発することになる。
【００１５】
このことは、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持っている。すなわち、従来の走査型レーザ顕微鏡等では、レーザ光を集光レンズによりマイクロビームに集光して観察試料上を走査するが、その際のマイクロビームのサイズは、集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界となり、原理的にそれ以上の空間分解能は期待できない。
【００１６】
ところが、図１７の場合には、波長λ１と波長λ２との２種類の光を空間的に上手く重ね合わせて、波長λ２の光の照射により蛍光領域を抑制することで、例えば波長λ１の光の照射領域に着目すると、蛍光領域を集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界よりも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能となる。以下、波長λ１の光をポンプ光、波長λ２の光をイレース光と呼ぶ。したがって、この原理を利用することで、回折限界を越える二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡、例えば超解像蛍光顕微鏡を実現することが可能となる。
【特許文献１】特開平８−１８４５５２号公報
【特許文献２】特開２００１−１００１０２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
ところで、超解像蛍光顕微鏡において、その性能を有効に発現させるためには、分子の光学物性を十分に考慮して、ポンプ光とイレース光との照射強度を十分注意して最適化する必要がある。特に、イレース光のレーザ強度は、超解像性の発現に大きく影響を与える。さらに、本発明者らの実験検討によると、超解像顕微鏡で得られる２次元点像分布関数すなわち蛍光スポットの強度プロファイルは、従来の光学顕微鏡のそれとは大きく異なることが判明した。
【００１８】
ここで、光学顕微鏡の光学性能を評価する最も基本的な物理量として、点像分布関数（ＰＳＦ）がある。これが判明すると、顕微鏡の分解能を決定する２点分解能や画質を総合評価するのに不可欠な光学伝達関数（ＯＴＦ）を算出することができる。
【００１９】
一般の顕微鏡システムでは、円形開口をもつレンズや絞り等を組み合わせた光学系が用いられており、このような光学系のＰＳＦは、良く知られた円形開口の場合のフラウンホーファー回折像で与えられる。ここで、光源波長を（λp）、光学系の開口数を（ＮＡ）とすると、光軸からの像面内の距離（ｒ）における強度すなわち点像分布関数（Ｈ(r)）は、下記の式（１）で与えられる。
【００２０】
【数１】
【００２１】
ここで、（Ｊ1(z)）は１次のベッセル関数であり、（Ｃpo）は中心強度、ｋeは光源の波数を示す。大体の顕微鏡システムの場合、式（１）のＰＳＦを基本とした結像理論が構築され、その性能評価が行われている。蛍光顕微鏡の場合にも、試料からの蛍光強度が励起光源の照射強度に比例するものとして、式（１）を用いた同様の評価がなされている。
【００２２】
しかながら、超解像顕微鏡の場合、試料に異なる２波長の光を共鳴吸収させるため、もはや光源の照射強度と蛍光強度との比例関係は成り立たない。
【００２３】
仮に、ポンプ光の照射強度が一定であっても、イレース光の照射強度を増加させると蛍光強度が非線形的に減衰することが報告されている。このような、試料の光応答特性は、当然、ＰＳＦに強い影響を与える。事実、最近の文献（Opt.Express 11(2003)3271）によれば、超解像顕微鏡におけるＰＳＦは、上記式（１）が与える強度分布とは大きく異なったローレンチアン型に近い形状を持っている。一般の光学システムでは、このよう形が現れることは極めて稀である。
【００２４】
このような理由で、従来は、超解像顕微鏡システムを具現化するときのポンプ光およびイレース光の最適な条件が不明であったため、ポンプ光およびイレース光の光源選定が困難となっていた。
【００２５】
したがって、かかる事情に鑑みてなされた本発明の目的は、ポンプ光およびイレース光の光源選定を容易にでき、簡単かつ安価な構成で超解像性を確実に発現できる超解像顕微鏡を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
上記目的を達成する請求項１に係る発明は、少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料に対して、上記分子を基底状態から励起寿命τをもつ第１電子励起状態に励起する第１のコヒーレント光を出射する第１の光源と、
上記分子を上記第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起する第２のコヒーレント光を出射する第２の光源と、
上記第１のコヒーレント光と上記第２のコヒーレント光とを一部重ね合わせて上記試料に集光する光学系と、
上記光学系により集光される光と上記試料とを相対的に移動させて上記試料を走査する走査手段と、
上記光学系からの光照射により上記試料から発生する光応答信号を検出する検出手段とを有する超解像顕微鏡において、
上記第１のコヒーレント光の波長をλp、上記第２のコヒーレント光の波長をλe、上記第１のコヒーレント光の上記試料面における最大フォトンフラックスをＩp、上記第２のコヒーレント光の上記試料面における最大フォトンフラックスをＩe、上記分子が基底状態から上記第１電子励起状態に励起するときの吸収断面積をσ01、および蛍光抑制断面積をσdipとするとき、
を満足するように構成したことを特徴とするものである。
【００２７】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の超解像顕微鏡において、さらに、
を満足するように構成したことを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、上記の条件を満たすようにすることで、ポンプ光およびイレース光の光源選定を容易にでき、例えば取り扱いが難しい短パルスレーザ光源を用いることなく、信頼性の高いＣＷレーザを用いることができるなど、簡単かつ安価な構成で超解像性を確実に発現できる超解像顕微鏡を容易に実現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明に係る超解像顕微鏡の一実施の形態について説明する。
【００３０】
図１は、本発明の一実施の形態に係る超解像顕微鏡のシステム構成を示す図である。この超解像顕微鏡は、通常のレーザ走査型蛍光顕微鏡を前提としたもので、主に３つの独立したユニット、すなわち、光源ユニット３０、スキャンユニット４０および顕微鏡ユニット５０からなっている。
【００３１】
光源ユニット３０は、第１のコヒーレント光として例えば波長５３２ｎｍのポンプ光を出射する第１の光源であるＬＤ励起型モードロックＮｄ：ＹＡＧレーザ２と、第２のコヒーレント光として例えば波長６４７ｎｍのイレース光を出射する第２の光源であるＫrレーザ１と、イレース光空間変調用の位相板３と、イレース光およびポンプ光を融合させるためのビームコンバイナ４とを有している。位相板３は、図２に示すように、光軸対称の位置で通過したイレース光の位相が反転するように調整された光学薄膜が蒸着されている。図２では、光軸の周りに独立した４領域を有し、イレース光波長に対して４分１ずつ位相が異なっている。この位相板３を通過した光を集光すれば、光軸上で電場が相殺され中空状のイレース光が生成される。
【００３２】
スキャンユニット４０は、光源ユニット３０から供給される同じ光学軸を共有するポンプ光とイレース光とを、ハーフミラー５を通過させた後、走査手段である２枚のガルバノミラー６および７により２次元方向に揺動走査して、後述の顕微鏡ユニット５０に出射するようになっていると共に、顕微鏡ユニット５０で検出された蛍光を、往路と逆の経路を辿ってハーフミラー５で分岐し、その分岐された蛍光を投影レンズ１２、ピンホール１３、ノッチフィルタ１４および１５を経て検出手段である光電子増倍管１６で受光するようになっている。図１では、図面を簡略化するため、ガルバノミラー６，７を同一平面内で揺動可能に示している。なお、ノッチフィルタ１４および１５は、蛍光に混入したポンプ光およびイレース光を除去するものである。また、ピンホール１３は、共焦点光学系を成す重要な光学素子で、観察試料内の特定の断層面で発光した蛍光のみを通過させるものである。
【００３３】
顕微鏡ユニット５０は、いわゆる通常の蛍光顕微鏡で、スキャンユニット４０から入射するポンプ光およびイレース光をハーフミラー８で反射させて、対物レンズ９により少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む観察試料１０上に集光させると共に、観察試料１０で発光した蛍光を、再び対物レンズ９でコリメートしてハーフミラー８で反射させることにより、再び、スキャンユニット４０に戻すと同時に、ハーフミラー８を通過する蛍光の一部を接眼レンズ１１に導いて、蛍光像として目視観察できるようになっている。
【００３４】
ここで、位相板３、ビームコンバイナ４および対物レンズ９は、ポンプ光とイレース光とを一部重ね合わせて観察試料１０に集光する光学系を構成している。
【００３５】
本実施の形態では、図１に示す超解像顕微鏡において、観察試料１０に含まれる分子を基底状態から励起寿命τをもつ第１電子励起状態に励起するポンプ光の波長をλp、上記分子を第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起するイレース光の波長をλe、ポンプ光の観察試料面における最大フォトンフラックスをＩp、イレース光の観察試料面における最大フォトンフラックスをＩe、上記分子が基底状態から第１電子励起状態に励起するときの吸収断面積をσ01、および蛍光抑制断面積をσdipとするとき、
および
さらに好ましくは
を満足するように構成する。
【００３６】
このように構成すれば、観察試料１０の集光点上においてイレース光の強度がゼロとなる光軸近傍以外の蛍光が抑制されて、結果的にポンプ光の広がりより狭い領域（Δ＜０．６１・λ１／ＮＡ、ＮＡは対物レンズ９の開口数）に存在する蛍光ラベラー分子のみが観察されることになり、結果的に超解像性が発現することになる。したがって、ポンプ光およびイレース光をスキャンユニット４０で走査しながら蛍光信号を測定すれば、超解像の２次元蛍光像を得ることができる。
【００３７】
以下、上記のように構成する根拠、すなわち本発明による超解像顕微鏡の原理について説明する。
【００３８】
超解像顕微鏡法におけるＰＳＦは、試料面上におけるポンプ光の強度分布（Ｈ(r)）と、イレース光の強度分布（Ｇ(r)）と、ポンプおよびイレース光の同時照射時における試料の蛍光抑制特性すなわちdip ratio （Ｐ(Ie)）とによって決定される。ここで、Ｉeはイレース光のフォトンフラックスであり、dip ratioとは具体的にはイレース光無照射時と照射時との蛍光強度比を示す。ポンプ光単独照射時の蛍光強度はＨ(r)に比例するので、イレース光同時照射時における蛍光強度プロファイル（Ｆ(r)）は、蛍光抑制特性とポンプ光強度との積すなわち下記の式（２）で与えられる。
【００３９】
【数２】
【００４０】
実際の超解像顕微鏡法では、図３に示すように、イレース光として光軸上で光強度が存在しない中空状のベッセル１次ビームを用いる。ここで、顕微鏡の対物レンズが無収差光学系であれば、ポンプ光の形状Ｈ(r)は式（１）で与えられる。これに対し、イレース光で用いるベッセルビームは、図４に示すように、ビームの断面（瞳面）において、ビームの中心軸に対して周回するように０から２πまで連続的に変化する位相分布を持っている。したがって、すべての動径方向について中心軸に対してπだけ位相が異なっているため、集光すると光軸上で電場強度が相殺され、その強度分布は、ビーム最大強度値（Ｃe0）を用いて、式（３）に示すように表される。
【００４１】
【数３】
【００４２】
ここで、λeおよびｋeは、イレース光の波長および波数である。また、Ｊn(z)は、ｎ次のベッセル関数で、
でｒ2以上の次数を持つため、ｒ＝０でＧ(0)＝０となることが容易に判る。式（３）を、極大値を１とし、λ／ＮＡを１にとってプロットすると、図５に太線で示すようになり、ｒ＝０で強度が０となるイレース光として理想的な中空状のプロファイルが得られる。なお、図５には、比較のために、均一波面のポンプ光を集光したときのビームプロファイルを細線でプロットしてある。図５から明らかなように、イレース光として理想的な中空状のプロファイルが得られれば、中心部分の蛍光強度を損なうことなく、ドーナツの周辺部において効率的に蛍光抑制でき、回折限界より小さい蛍光スポットが形成できる。
【００４３】
イレース光のビーム形状とならんで、dip ratioも超解像効果の発現の程度を決める重要な要素である。これは、分子構造に起因するところの分子固有の光応答特性である。図６に、２波長蛍光Dip分光法の励起ダイヤグラムを示す。一般に、図６に示すように、ポンプ光で基底状態（Ｓ０）の分子を状態Ｓ１に励起すると、分子はＳ１状態より蛍光を発してＳ０状態に緩和する。ここで、イレース光を照射すると、イレース光により分子は高い量子状態（Ｓｎ）に励起されて、Ｓ０やＴｍ３重項状態への無輻射緩和が起こる。もし、イレース光の波長が蛍光波長帯域に重複していれば誘導放出過程も起こる。したがって、イレース光照射時に、この蛍光量が減少し、その変化が窪み（Dip）として観測される。
【００４４】
一般に、蛍光強度は、Ｓ１状態のポピュレーションに比例するので、dip ratioはこのポピュレーションを求めることにより解析することができる。すなわち、ポピュレーションを観測時間（Ｔ）で積分した量が観測された蛍光強度であるので、dip ratio P(Ｉe)は式（４）で与えられる。
【００４５】
【数４】
【００４６】
ここで、ｎ１（ｔ,Ｉe）はＳ１状態のポピュレーションであり、イレース光のフォトンフラックスと観測時間との関数となる。さらに、ｎ１（ｔ,Ｉe）は、Ｓ０状態（ｎ０（ｔ,Ｉe））およびＳｎ状態（ｎ２（ｔ,Ｉe））のポピュレーションを加えた３準位のレート方程式により決定される。
【００４７】
【数５】
【００４８】
ここで、使用した分光パラメータを図６に示す。このレート方程式は、線形の１回の微分方程式であり、一般に下記のような形式の解をもつ。
【００４９】
【数６】
【００５０】
ここで、Ｄnmは初期条件から決まる係数であり、γ1,2,3は式（５）の３×３係数行列の固有値であり、具体的には下記の根をもつ。
【００５１】
【数７】
【００５２】
したがって、式（６）は、以下のように表される。
【００５３】
【数８】
【００５４】
式（８）の指数部の成分は、ポンプ光およびイレース光照射開始直後の過渡的な遷移によるポピュレーションの変化を示し、それ以外のＤn3は光照射が続き定常状態に至った場合の各状態のポピュレーションを示す。ここで、根γ1,2は負の値持ち、下記の関係が成り立つ。
【００５５】
【数９】
【００５６】
ここで、｜γ1,2｜の逆数は過渡期が終了する時間に対応し、大体の分子では１nsec以内で定常状態になる。したがって、多くの場合、ナノ秒のレーザ光源を用いた蛍光抑制過程の場合、式（８）おける指数項を無視でき、以下のように表すことができる。
【００５７】
【数１０】
【００５８】
したがって、Ｓ１状態のポピュレーションは、下記のような具体的な形で表すことができる。
【００５９】
【数１１】
【００６０】
この式（１１）を式（４）に代入すれば、超解像顕微鏡法で重要なdip ratioを算出することができる。
【００６１】
【数１２】
【００６２】
蛍光抑制を効率的に誘起させるためには、式（１２）の分子が分母に対してできるだけ小さい方が良く、Ｓ０からＳ１に励起させるのに要するフォトンフラックスが十分小さい場合には、式（１２）は、さらに簡単な下記の実用的な式（１３）に近似できる。
【００６３】
【数１３】
【００６４】
ここで、式（１３）の分母に注目すると、ｋ20／（ｋ21＋ｋ20）は分子がＳｎ状態よりＳ１状態を迂回して基底状態に緩和する分岐比であることを考えると、σ12ｋ20／（ｋ21＋ｋ20）はＳ１からＳｎへの励起により無輻射過程で緩和する断面積と解釈できる。さらに、下記の式（１４）で定義されるような分光パラメータ（σdip）すなわち「dip断面積」を定義する。この量は、イレース光照射時において蛍光過程以外でＳ１状態から緩和する総断面積であり、τすなわち蛍光寿命と並び、蛍光抑制の発現の程度を決定する大変重要な分光パラメータである。
【００６５】
【数１４】
【００６６】
超解像顕微鏡の光源としては、汎用性の高い商業用のナノ秒パルスレーザを用いる。これらのレーザ光源は、１０nsec前後のパルス幅をもっている。したがって、実用的には、式（１４）のdip ratioの関係式を用いて顕微鏡システムを構築できる。顕微鏡の光学系が無収差であると仮定すれば、理論的に期待できるＰＳＦは、式（１）、（２）、（３）、（１２）、（１３）および（１４）より、下記の式（１５）から求められる。
【００６７】
【数１５】
【００６８】
ここで、εpおよびεeは、ポンプ光およびイレース光の光子エネルギーであり、ポンプ光およびイレース光の照射強度をそれぞれの光子エネルギーで割るとフォトンフラックスとなる。原理的には、ポンプ光とイレース光との照射条件および試料の分子が決まると、式（１５）を用いて超解像顕微鏡法のＰＳＦを決定できる。しかし、実用的には式（１５）を近似して、さらに単純化できる。
【００６９】
図５から明らかなように、ベッセルビームは、空間変調されていない通常の集光ビームと比較すると、倍のサイズに広がっている。加えて、実際の現場では、イレース光の照射による蛍光発光を阻止するために、ポンプ光より長い波長帯域の光をイレース光として用いるので、その集光サイズはさらに大きくなる。したがって、ポンプ光とイレース光とを試料面に同軸で集光すると、ポンプ光の強度分布の大半はイレース光の穴の内側に存在することになる。そこで、式（３）を近似的に光軸近傍でｒのべき乗に展開し、この穴の強度プロファイルを簡単な関数で近似すると、下記の式（１６）が得られる。
【００７０】
【数１６】
【００７１】
式（１４）から明らかなように、第１項と比較してｒ3以上の高次項は無視できる。事実、穴の内側のプロファイルは、図５に示すように、ｒに関する２次関数でほぼ表現できる。この結果を用いれば、式（１５）は下記の式（１７）のように単純化することができる。
【００７２】
【数１７】
【００７３】
ここで、ローレンチアン関数Ｌ(r)を式（１８）で示すように、
【数１８】
とおくと、Ｆ(r)はポンプ光のＰＳＦを、下記の式（１９）で表される半値幅（g）のローレンチアン関数Ｌ(r)で変調したものに他ならない。
【００７４】
【数１９】
【００７５】
式（１５）によれば、超解像顕微鏡法で得られるＰＳＦの半値幅は、イレース光の強度が増すにつれて、式（１７）のようなローレンチアン関数に変化して行くことが分かる。よって、式（１９）で示される蛍光スポットを小さくするための必要条件は、σdipＣe0を大きくすればよいことが分かる。特に、実用性を鑑みると、イレース光の強度はできるだけ小さいことが望ましいので、試料分子としては蛍光寿命τおよびdip 断面積ができるだけ大きいものを選定することが有利であることが分かる。
【００７６】
ここで、式（１２）に立ち戻って考察すると、蛍光抑制を効率的に誘起させるためには、式（１２）において、分子が分母に対してできるだけ小さい方が有利である。一般に、蛍光寿命τは試料分子固有なものであるので、式（１２）において、分子は必然的に、
を満たす必要がある。すなわち、整理すると、下記の式（２０）を満たす必要がある。
【００７７】
【数２０】
【００７８】
また、式（１７）を考察すると、超解像顕微鏡法により分解能の向上が確認できるのは、式（１８）で示される変調関数であるローレンチアン関数の半値幅ｇが、式（１）で与えられるポンプ光の集光ビームサイズの半値幅よりも小さくなることが不可欠である。ここで、ポンプ光の集光ビームサイズの半値幅（Γ）は、一般にレイリーの規範式により、下記の式（２１）で与えられる。
【００７９】
【数２１】
【００８０】
したがって、ｇがΓより小さくなる条件は、式（２１）および（１９）から、下記の式（２２）のようになる。
【００８１】
【数２２】
【００８２】
具体的には、下記の式（２３）を満たすことが条件となる。
【００８３】
【数２３】
【００８４】
さらに、式（１３）の分母は、分子に対してできるだけ大きいことが望ましいことから、イレース光のフォントンフラックスに関しては、τが試料分子固有であることを考えるとdip断面積を用いて下記の式（２４）を満たすようにするのが望ましい。
【００８５】
【数２４】
【００８６】
この式（２３）を整理すると、下記の式（２５）が得られる。
【００８７】
【数２５】
【００８８】
以上の考察から、図１に示す超解像顕微鏡を、式（２０）および（２３）、さらに好ましくは式（２５）を満足するように構成することで、その性能を向上させることができる。
【００８９】
次に、図１に示す構成の超解像顕微鏡において、ポンプ光の波長を５３２ｎｍ、イレース光の波長を５９９ｎｍとして、ローダミン６Ｇ分子を用いた実験結果について考察する。先ず、最初に、式（１３）を用いて、メタノール溶液中のローダミン６Ｇのdip ratioの測定に関する実験データの解析を行なった。
【００９０】
図７は、メタノール溶液中の蛍光寿命τが３．７５nsecのローダミン６Ｇを用いた場合のdip断面積（σdip）をパラメータとするdip ratioとイレース光のフォトンフラックスとの関係を示すものである。図７によれば、σdip を０．７×１０-16ｃｍ2前後に選ぶと、実験結果をほぼ再現できることが分かる。ローダミン６Ｇに関しては、波長５９９ｎｍの領域ではＳ１からＳｎへの吸収断面と誘導放出断面とが重複するので、正確なσdip は不明であるが、Ｓ１からＳｎへの吸収断面積および誘導放出断面積が１０-16ｃｍ2オーダーであることが報告されおり、本解析結果は妥当なものであると判断できる。
【００９１】
次に、本発明者らは、σdipを０．７×１０-16ｃｍ2、τを３．７５nsecと仮定して、式（１５）およびその近似系である式（１７）により超顕微鏡法におけるＰＳＦを求めた。図８は、イレース光のピーク値のフォトンフラックスが２．１×１０25photons／sec／cm2すなわち電場強度にして７ＭＷ／ｃｍ2の場合のＰＳＦを示す。実線の細線および太線は、それぞれ式（１５）および（１７）のＰＳＦであり、近似式ではサイドローブの部分で僅かな解離が見られるが、プロファイルの一致は良い。図８によれば、フォトンフラックスが１０25photons／sec／cm2のオーダーで顕著な超解像性が発現し、本計算の場合には蛍光プロファイルの半値幅は、ポンプ光の回折限界の１／３サイズである２００ｎｍに収縮する。
【００９２】
以上の条件を考察してみると、ポンプ光のフォトンフラックスＩpを１０23photons／cm2／secとすると、これは十分に蛍光発生できる光量である。例えば、E. Sahara and D. Treves, IEEE. J. Quantum Electron. 13, 962 (1977)のデータ、σ01＝４×１０-16cm2およびτ＝３．７５nsecを用いれば、Ｉpσ01τ＝０．１５となり、式（２０）を満たしている。また、Ｉe＝１０25photons／cm2／sec、σdip1＝０．６×１０-16cm2とすれば、Ｉeσdipτ＝２．６となり、式（２３）および（２５）を同時に満たし、請求項の条件を具体的に満たしていることが確認できる。
【００９３】
図９は、直径１７５μｍの蛍光ビーズを用いて同じ条件で超解像顕微鏡法の蛍光スポット像を測定した場合のＰＳＦを示すものである。図９において、太線で示す測定したプロファイルも、理論解析で予想されたようにサイドローブが広がったローレンチアン型をしている。なお、図９において、細線は、図８で得られた理論式によるＰＳＦをビーズサイズでコンボリューションした結果を示す。この理論的計算は、実験結果をほぼ再現している。この結果、近似式（１７）は、ＰＳＦを表現する合理的な関数であると同時に、物理的なモデルがきわめて明快な、実用的な式であることが分かる。
【００９４】
さらに、ローダミン６Ｇを用いた場合のＰＳＦの結像特性を考察するため、式（１７）を用いて、イレース光のフォトンフラックスに関する依存性を計算した。図１０および図１１は、計算したプロファイルおよびその半値幅を示す。図１０および図１１から明らかなように、集光したイレース光の先頭値のフォトンフラックスが５×１０25photons／secとなると、回折限界サイズの１／４まで収縮することが分かる。例えば、開口数１．４の油浸対物レンズを用いた場合、その半値幅は７０ｎｍとなり、従来の光学顕微鏡では不可能あった１００ｎｍを上回る空間分解能が期待できる。その時の、イレース光のエネルギー時間平均強度を計算すると、ほぼ２０ｍＷ程度となる。このことは、低出力のレーザ光源で対応できることを意味しており、取り扱いが難しい短パルスレーザ光源を用いることなく、信頼性の高いＣＷレーザをベースに、複雑な構成をとらない顕微鏡システムが構成できる可能性を示している。このような簡単なレーザを用いてシステムを構成できることは、システムの価格の低減、また本技術特有のレーザ波面の管理といった実用化に伴う発明の効果が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】本発明の一実施の形態に係る超解像顕微鏡のシステム構成を示す図である。
【図２】図１に示す位相板の構成を示す図である。
【図３】イレース光およびポンプ光のビーム形状と、試料面における蛍光領域および蛍光消失領域とを模式的に示す図である。
【図４】イレース光のビーム断面における位相分布を示す図である。
【図５】ポンプ光およびイレース光の試料面上での強度分布を示すグラフである。
【図６】２波長蛍光Dip分光法の励起ダイヤグラムを示す図である。
【図７】ローダミン６Ｇを用いた場合のdip ratioとイレース光のフォトンフラックスとの関係を示すグラフである。
【図８】イレース光のピーク値のフォトンフラックスが２．１×１０25photons／sec／cm2の場合のＰＳＦを示すグラフである。
【図９】直径１７５μｍの蛍光ビーズを用いて超解像顕微鏡法の蛍光スポット像を測定した場合のＰＳＦを示すグラフである。
【図１０】イレース光のフォトンフラックスのプロファイルを示すグラフである。
【図１１】同じく、その半値幅を示すグラフである。
【図１２】試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示す概念図である。
【図１３】図１２の分子の第１励起状態を示す概念図である。
【図１４】同じく、第２励起状態を示す概念図である。
【図１５】同じく、第２励起状態から基底状態に戻る状態を示す概念図である。
【図１６】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１７】同じく、二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【符号の説明】
【００９６】
１ Ｋrレーザ
２ ＬＤ励起型モードロックＮｄ：ＹＡＧレーザ
３ 位相板
４ ビームコンバイナ
５ ハーフミラー
６，７ ガルバノミラー
８ ハーフミラー
９ 対物レンズ
１０ 観察試料
１１ 接眼レンズ
１２ 投影レンズ
１３ ピンホール
１４，１５ ノッチフィルタ
１６ 光電子増倍管
３０ 光源ユニット
４０ スキャンユニット
５０ 顕微鏡ユニット
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料に対して、上記分子を基底状態から励起寿命τをもつ第１電子励起状態に励起する第１のコヒーレント光を出射する第１の光源と、
上記分子を上記第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起する第２のコヒーレント光を出射する第２の光源と、
上記第１のコヒーレント光と上記第２のコヒーレント光とを一部重ね合わせて上記試料に集光する光学系と、
上記光学系により集光される光と上記試料とを相対的に移動させて上記試料を走査する走査手段と、
上記光学系からの光照射により上記試料から発生する光応答信号を検出する検出手段とを有する超解像顕微鏡において、
上記第１のコヒーレント光の波長をλp、上記第２のコヒーレント光の波長をλe、上記第１のコヒーレント光の上記試料面における最大フォトンフラックスをＩp、上記第２のコヒーレント光の上記試料面における最大フォトンフラックスをＩe、上記分子が基底状態から上記第１電子励起状態に励起するときの吸収断面積をσ01、および蛍光抑制断面積をσdipとするとき、
を満足するように構成したことを特徴とする超解像顕微鏡。
【請求項２】
請求項１に記載の超解像顕微鏡において、
さらに、
を満足するように構成したことを特徴とする超解像顕微鏡。
【請求項１】
少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料に対して、上記分子を基底状態から励起寿命τをもつ第１電子励起状態に励起する第１のコヒーレント光を出射する第１の光源と、
上記分子を上記第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起する第２のコヒーレント光を出射する第２の光源と、
上記第１のコヒーレント光と上記第２のコヒーレント光とを一部重ね合わせて上記試料に集光する光学系と、
上記光学系により集光される光と上記試料とを相対的に移動させて上記試料を走査する走査手段と、
上記光学系からの光照射により上記試料から発生する光応答信号を検出する検出手段とを有する超解像顕微鏡において、
上記第１のコヒーレント光の波長をλp、上記第２のコヒーレント光の波長をλe、上記第１のコヒーレント光の上記試料面における最大フォトンフラックスをＩp、上記第２のコヒーレント光の上記試料面における最大フォトンフラックスをＩe、上記分子が基底状態から上記第１電子励起状態に励起するときの吸収断面積をσ01、および蛍光抑制断面積をσdipとするとき、
を満足するように構成したことを特徴とする超解像顕微鏡。
【請求項２】
請求項１に記載の超解像顕微鏡において、
さらに、
を満足するように構成したことを特徴とする超解像顕微鏡。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２００６−４７９１２（Ｐ２００６−４７９１２Ａ）
【公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２３２２３０（Ｐ２００４−２３２２３０）
【出願日】平成１６年８月９日（２００４．８．９）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【出願人】（３０４０２１４１７）国立大学法人東京工業大学 (1,821)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月９日（２００４．８．９）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【出願人】（３０４０２１４１７）国立大学法人東京工業大学 (1,821)
【Ｆターム（参考）】
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