農学的価値の高いセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）の二重低含量回復系統を作成する方法
オグラ（ｏｇｕｒａ）型細胞質雄性不稔（ｃｍｓ）のための、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）の二重低含量回復系統を作成する方法であり、該系統は、ダイコンのＰｇｉ−２対立遺伝子が欠失しキャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）のＰｇｉ−２遺伝子と組換えられたＲｆｏ回復遺伝子を有する、ダイコンの遺伝子が導入されており、雌性稔性、高いＲｆｏ伝達率および高い生長力に特徴づけられる高い農学的価値を有するものである。セイヨウアブラナ雑種の種子ならびにその後代を形成する方法。セイヨウアブラナの種子、ならびに、解析のための、ＰＧＩｏｌマーカー、ＰＧＩｕｎｔマーカー、ＰＧＩｉｎｔマーカー、ＢｏｌＪｏｎマーカーおよびＣＰ４１８マーカーの組み合わせの使用。
【選抜図】図２
【選抜図】図２
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オグラ（ｏｇｕｒａ）型細胞質雄性不稔（ｃｍｓ）のための、セイヨウアブラナの二重低含量回復系統を作成する方法に関するものであり、該系統は、ダイコンのＰｇｉ−２対立遺伝子が欠失しキャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）のＰｇｉ−２遺伝子と組換えられたＲｆｏ回復遺伝子を有する、ダイコンの遺伝子が導入されており、「雌性稔性、高いＲｆｏ伝達率および高い生長力に特徴づけられる高い農学的価値を有するものである本発明は、セイヨウアブラナ雑種の種子ならびにその後代を形成する方法および選抜のためのマーカーの使用に関するものでもある。
【背景技術】
【０００２】
アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｌ．）においてＯｇｕ−ＩＮＲＡ型細胞質雄性不稔（ｃｍｓ）の体系についての回復系統を育種することは、過去数年来の主要な目的となっている。それらの雌性稔性を高め、二重低含量回復系統を得るには、多大な戻し交配と系統育種を行うことが必要とされていた。所謂「二重低含量」品種とは、油中のエルカ酸含量が低く、油を抽出した後に残る固体穀粉の中のグルコシノレート含量が低いもののことを言う。しかしながら、ダイコン遺伝子導入のサイズが大きいことから、これらの系統を育種する上で幾つかの難点（導入遺伝子の再構成、望ましくない形質との連鎖の可能性）に直面することがある。
【非特許文献１】Ｄｅｓｌｏｉｒｅｓ Ｓ ｅｔ ａｌ ２００３ ＥＭＢＯ ｒｅｐｏｒｔｓ ４， ６：５８８−５９４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
よって、本発明者等は、農学的価値の高い、新たに改良された二重低含量回復系統を提供することを目標とした。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
この目標は、アブラナにおいて、Ｏｇｕ−ＩＮＲＡ型細胞質雄性不稔（ｃｍｓ）についての組換え二重低含量回復系統を作成する、新たな方法によって実現される。
【０００５】
本発明の第一の目的は、オグラ型細胞質雄性不稔（ｃｍｓ）についての、セイヨウアブラナの二重低含量回復系統を作成する方法に関するものであり、該系統は、ダイコンのＰｇｉ−２対立遺伝子が欠失しキャベツのＰｇｉ−２遺伝子と組換えられたＲｆｏ回復遺伝子を有する、ダイコンの遺伝子が導入されており、雌性稔性、高いＲｆｏ伝達率および高い生長力に特徴づけられる高い農学的価値を有しているものであり、当該方法は以下の手順を含むものである、
ａ）欠失したダイコン遺伝子を挿入した春のセイヨウアブラナの二重低含量ｃｍｓ系統を、春のＤｒａｋｋａｒの二重低含量系統と交配して、セイヨウアブラナの異型接合体の回復植物を形成し、
ｂ）減数分裂前に、手順a)で得られた異型接合体の回復植物に、ガンマ線照射を行い、
ｃ）前記手順ｂ）で得られた花の花粉を、ｃｍｓ二重低含量の春のＷｅｓｒｏｏｎａ系統と交配し、
ｄ）その後代の生長力と雌性稔性、およびｃｍｓ遺伝子の伝達率を試験し、
ｅ）後代系統の選抜を行う。
【０００６】
本発明においては、「（一つまたは複数の）系統」という用語は、基本的に同型接合体で、自己受粉で生殖可能な植物体を意味する。
【０００７】
請求項１に記載の方法においては、手順ｂ）における照射量は６分間に６５グレイである。
【０００８】
本発明の方法に関する一つの好適な実施態様によれば、手順ａ）の春のセイヨウアブラナの二重低含量ｃｍｓ系統は、Ｒ２１１である。
【０００９】
Ｒ２１１は、ＩＮＲＡの春の回復系統である。
【００１０】
Ｄｒａｋｋａｒは、フランス産の春の登録品種である。
【００１１】
Ｗｅｓｒｏｏｎａは、オーストラリア産の春の登録品種である。
【００１２】
本発明の方法に関する一つの好適な実施態様によれば、試験は、ＰＧＩｏｌ、ＰＧＩＵＮＴ、ＰＧＩｉｎｔ、ＢｏｌＪｏｎおよびＣＰ４１８から選択された五つのマーカーの組み合わせによって行われる。
【００１３】
本発明のもう一つの目的は、オグラ型ｃｍｓのための、セイヨウアブラナの二重低含量回復系統に関するものであり、該系統は、ダイコンのＰｇｉ−２対立遺伝子が欠失しキャベツのＰｇｉ−２遺伝子と組換えられたＲｆｏ回復遺伝子を有する、ダイコンの遺伝子が導入されており、雌性稔性、高いＲｆｏ伝達率および高い生長力に特徴づけられる高い農学的価値を有するものである。
【００１４】
一つの好適な実施態様によれば、二重低含量回復系統は、ＰＧＩｏｌ、ＰＧＩＵＮＴ、ＰＧＩｉｎｔ、ＢｏｌＪｏｎおよびＣＰ４１８から選択された五つのマーカーの独自の組み合わせを有している。
【００１５】
本発明のもう一つの目的は、以下の手順を通して、セイヨウアブラナの雑種植物およびその後代を形成する方法に関するものであり、当該方法は、以下の手順によって得られるものである。
ａ）請求項１に従って作成された、同型接合体となるように育種された回復系統を準備し、
ｂ）雑種を作成するフィールドにおいて、前記回復系統を花粉提供植物体として用い、
ｃ）雑種を作成するフィールドにおいて、ｃｍｓ植物を雑種種子作成植物体として用い、そして
ｄ）雄性不稔植物体から、雑種種子を得る。
【００１６】
本発明のもう一つの目的は、本発明の方法によって得られたアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の種子に関するものである。
【００１７】
本発明の更にもう一つの目的は、英国の２３，Ｓｔ Ｍａｃｈａｒ Ｄｒｉｖｅ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＡＢ２４ ３ＲＹに所在の、ＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄ社に２００３年７月４日付けで参照番号ＮＣＩＭＢ４１１８３で寄託された、セイヨウアブラナの種子に関するものである。
【００１８】
本発明のもう一つの目的は、ＰＧＩｏｌ、ＰＧＩｉｎｔ、ＢｏｌＪｏｎおよびＣＰ４１８の少なくとも四つのマーカー、あるいは、それらの、少なくとも一つの多型部位を含むいずれかの部位を用いて、オグラ型ｃｍｓのための、セイヨウアブラナの組換え回復系統を解析することに関するものであり、該系統は、ダイコンのＰｇｉ−２対立遺伝子が欠失しキャベツのＰｇｉ−２遺伝子と組換えられたＲｆｏ回復遺伝子を有する、ダイコンの遺伝子が導入されており、雌性稔性、高いＲｆｏ伝達率および高い生長力に特徴づけられる高い農学的価値を有しているものである。
【００１９】
好ましい実施態様においては、その組み合わせは、ＰＧＩｏｌ、ＰＧＩＵＮＴ、ＰＧＩｉｎｔ、ＢｏｌＪｏｎおよびＣＰ４１８の五つのマーカーからなるものである。
【００２０】
本発明において「少なくとも一つの多型部位を含むいずれかの部位」というのは、少なくともキャベツ型の配列とカブ（Ｂ．ｒａｐａ）型の配列との間の違いを示す配列のいずれかの部分のことを意味する。
【００２１】
そのようなマーカーは、以下の図面とＲ２０００系統について記載されている配列表に示されている。
【００２２】
実施態様の一つの有利な実施態様によれは、本発明は、以下のものに関するものである。
‐プライマーＰＧＩｏｌＵおよびＰＧＩｏｌＬを用いて増幅するマーカーＰＧＩｏｌ：
（ＰＧＩｏｌＵ：５’ＴＣＡＴＴＴＧＡＴＴＧＴＴＧＣＧＣＣＴＧ３’；
ＰＧＩｏｌＬ：５’ＴＧＴＡＣＡＴＣＡＧＡＣＣＣＧＧＴＡＧＡＡＡＡ３’）
‐プライマーＰＧＩｉｎｔＵおよびＰＧＩｉｎｔＬを用いて増幅するマーカーＰＧＩｉｎｔ：
（ＰＧＩｉｎｔＵ：５’ＣＡＧＣＡＣＴＡＡＴＣＴＴＧＣＧＧＴＡＴＧ３’；
ＰＧＩｉｎｔＬ：５’ＣＡＡＴＡＡＣＣＣＴＡＡＡＡＧＣＡＣＣＴＧ３’）
‐プライマーＰＧＩｏｌＵおよびＰＧＩｉｎｔＬを用いて増幅するマーカーＰＧＩＵＮＴ：
（ＰＧＩｏｌＵ：５’ＴＣＡＴＴＴＧＡＴＴＧＴＴＧＣＧＣＣＴＧ３’；
ＰＧＩｉｎｔＬ：５’ＣＡＡＴＡＡＣＣＣＴＡＡＡＡＧＣＡＣＣＴＧ３’）
‐プライマーＢｏｌＪｏｎＵおよびＢｏｌＪｏｎＬを用いて増幅するマーカーＢｏｌＪｏｎ：
（ＢｏｌＪｏｎＵ：５’ＧＡＴＣＣＧＡＴＴＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＴＧ３’；
ＢｏｌＪｏｎＬ：５’ＧＣＣＴＡＣＴＣＣＴＣＡＡＡＴＣＡＣＴＣＴ３’）
‐プライマーＳＧ１２９ＵおよびｐＣＰ４１８Ｌを用いて増幅するマーカーＣＰ４１８：
（ＳＧ１２９Ｕ：ｃｆ Ｇｉａｎｃｏｌａ ｅｔ ａｌ，２００３ Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（ｉｎ ｐｒｅｓｓ）
ｐＣＰ４１８Ｌ：５’ＡＡＴＴＴＣＴＣＣＡＴＣＡＣＡＡＧＧＡＣＣ３’）
【００２３】
本発明のもう一つの目的は、ＰＧＩｏｌ、ＰＧＩＵＮＴ、ＰＧＩｉｎｔ、ＢｏｌＪｏｎおよびＣＰ４１８マーカーに関するものであり、それらマーカーの配列は以下の通りである。
【００２４】
ＰＧＩｏｌ Ｒ２０００マーカー：
【００２５】
【表１】
【００２６】
ＰＧＩＵＮＴ Ｒ２０００マーカー：
【００２７】
【表２】
【００２８】
ＰＧＩｉｎｔ Ｒ２０００マーカー：
【００２９】
【表３】
【００３０】
ＢｏｌＪｏｎ Ｒ２０００マーカー：
【００３１】
【表４】
【００３２】
ＣＰ４１８Ｌ Ｒ２０００マーカー：
【００３３】
【表５】
【００３４】
以下の添付図面において、つぎのような略称を用いる：
【００３５】
【表６】
【００３６】
‐図１は、ガンマ線照射とＦ２の作成とを示すものである。
【００３７】
‐図２は、Ｒ２１１とＲ２０００の結実を示すものである。
【００３８】
‐図３は、様々な系統の莢ごとの種子数を示すものである。
【００３９】
‐図４は、データベースによる、ＰＧＩ配列のセグメントにおけるＰＧＩｏｌプライマーの位置を示すものである。この図においては、
ＰＧＩｏｌ：−プライマーＰＧＩｏｌＵ（ＳＧＡＰでの名称はＢｎＰＧＩｃｈ１Ｕ）
−プライマーＰＧＩｏｌＬ（ＳＧＡＰでの名称はＢｎＰＧＩｃｈ１Ｌ）
ＰＧＩｉｎｔ：−プライマーＰＧＩｉｎｔＵ
−プライマーＰＧＩｉｎｔＬ（これは配列には含まれていない）
【００４０】
‐図５は、ＰＣＲマーカーであるＰＧＩ−２遺伝子（ＰＧＩｏｌ）、およびＲｆｏに近いＰＣＲマーカーであるＳＧ３４の電気泳動ゲルを示すものである。
【００４１】
‐図６は、ＰＧＩｏｌプライマーを用いてＰＣＲで増幅した、ＤＮＡのＰｇｉ−２セグメントを示すものである。
【００４２】
‐図７は、ＰＣＲ産物であるＰＧＩｏｌのＭｓｅｌによる消化を示すものである。
この図においては、
ＳａｍとＤａｒｍには７５ｂｐのバンドがある。
Ｄｒａｋ、Ｒ２１１．ＤＫおよびＲ２０００は、７０ｂｐのバンドを示す（１５％アクリルアミド）。
８は、Ｓａｍｏｕｒａｉに類似している（７５ｂｐ）；Ｄｒａｋｋａｒ（７０ｂｐ）と混合することにより、二本のバンドが視覚化された。
【００４３】
‐図８は、ＰＧＩＵＮＴマーカーの電気泳動のアガロースゲルを示すものである。
この図においては、
ＰＧＩＵＮＴバンド（約９８０ｂｐ）は、キャベツ、カブのＡｓｋｏ品種（Ｂ．ｒａｐａ ｃｖ Ａｓｋｏ）、維持系統および回復系統には存在するが、‘Ｒ２１１’には存在しない。
ダイコンおよびシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）に増幅はみられない。
様々なアブラナ属の遺伝子型において、一本のバンドだけが増幅された。バンドのサイズは類似しているが、配列は異なる。
【００４４】
‐図９は、ＰＧＩｉｎｔ ＰＣＲマーカーの電気泳動ゲルを示すものである。
この図においては、ダイコン系統７のＰＧＩｉｎｔは、およそ９５０ｂｐである。このバンドは、回復系統ＲＲＨ１およびＲ１１３と同じものである。これは、Ｒ２１１では見られない。また、Ｒ２０００でもみられない。しかしながら、ＰＧＩｉｎｔバンドのサイズは、様々なアブラナ属の種において、約８７０ｂｐでほぼ同じであるが、配列は異なる。
【００４５】
‐図１０は、ＢｏｌＪｏｎ ＰＣＲマーカーの電気泳動のアガロースゲルを示すものである。
【００４６】
‐図１１は、ＣＰ４１８マーカーの電気泳動のアガロースゲルを示すものである。
この図においては、（およそ６７０ｂｐの）ＣＰ４１８バンドは、キャベツゲノム特有のものである。これは、キャベツ（Ｂ．ｏｌ）、セイヨウアブラナ（Ｓａｍｏｕｒａｉ、Ｄｒａｋｋａｒ、Ｐａｃｔｏｌおよび異型接合体のＲ２１１１＊Ｄｋ）に存在するものである。これは、回復系統のアブラナ（ＲＲＨ、Ｒ１１３およびＲ２１１）には存在しないものである。同型接合体のＲ２０００には存在する。
【００４７】
‐図１２は、マーカーの概要を示す表である。
【００４８】
‐図１３（１３（ａ）、１３（ｂ））は、シロイヌナズナ属植物、ダイコン、カブ、キャベツおよびＲ２０００の間における、ＰＧＩｏｌマーカーの配列のアラインメントを示すものである。
【００４９】
‐図１４（１４（ａ）、１４（ｂ）、１４（ｃ）、１４（ｄ））は、シロイヌナズナ属植物、ダイコン、カブ、キャベツおよびＲ２０００の間における、ＰＧＩｉｎｔ−ＵＮＴマーカーの配列のアラインメントを示すものである。
【００５０】
‐図１５（１５（ａ）、１５（ｂ）、１５（ｃ））は、シロイヌナズナ属植物、ダイコン、カブ、キャベツおよびＲ２０００の間における、ＣＰ４１８Ｌマーカーの配列のアラインメントを示すものである。
【００５１】
‐図１６（１６および１６ｂｉｓ）は、シロイヌナズナ属植物、ダイコンおよびカブのＢｏｌＪｏｎマーカーを示すものである。
これらは、シロイヌナズナ属植物（ＡＣ００７１９０の末端−ＡＣ０１１０００の開始点）、キャベツのＥＭＢＨ９５９１０２の末端およびＥＭＢＨ４４８３３６の開始点、ならびにセイヨウアブラナにおける（それぞれＤｒａｋｋａｒおよびＳａｍｏｕｒａｉにおける）ＳＧ１２９マーカーのバンド１および２の代表的なコンセンサス配列の、ＤＢ配列とアラインされている。
８３６ｂｐのポイントからは、ＡＣ０７１９０−ＡＣ１１０００およびＧＣＰＡＴｐＢＯＪ配列は、アブラナ属植物の配列とはもはや高度に相同ではなくなる。
ダイコンとカブ（ＧＣＰｃｏｎｓｅｎ ＲｓＲｆＢＯＪおよびＢＲ）の配列は、それぞれ、８５８ｂｐのポイントから９００ｂｐおよび９８１ｂｐのポイントまで、セイヨウアブラナのものと依然として高度に相同である。
ダイコンにおいては、アブラナ属植物の配列の更に下流に部分的な相同が見いだされるに過ぎない。
カブのＡｓｋｏ品種においては、そのＢｏｌＪｏｎ配列の左側を、７８ｂｐを欠失させた後に、セイヨウアブラナにおけるキャベツおよびカブのそれと、１０５７ｂｐのポイントからＢｏｌＪｏｎＬプライマーまで、更にアラインすることができる。
【００５２】
‐図１７（１７および１７ｂｉｓ）は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈ）のＭＪＢ２１．１２配列におけるＰｇｉ−２プライマーの位置を示すものである。
【００５３】
‐図１８は、ｍｉｐｓＡｔｌ６２８５０遺伝子におけるＢｏｌＪｏｎプライマーの位置と、シロイヌナズナのＡＣ００７１９０クローンおよびＡＣ０１１０００クローンの重複領域を示すものである。シロイヌナズナ属植物のＢｏｌＪｏｎのＰＣＲ産物（７４０ｂｐ）とのアラインメントが示されている。
【００５４】
しかし、当然のことながら、ここにおいて示されている例は本発明の対象とするものを示すために挙げられているものであり、限定する趣旨のものではない。
【実施例１】
【００５５】
実施例Ｉ： ダイコンのＰｇｉ−２対立遺伝子が欠失しキャベツのＰｇｉ−２遺伝子と組換えられたＲｆｏ回復遺伝子を有する、ダイコンの遺伝子が導入されており、雌性稔性、高いＲｆｏ伝達率および高い生長力に特徴づけられる高い農学的価値を有する、オグラ型細胞質雄性不稔（ｃｍｓ）のための、セイヨウアブラナの二重低含量回復系統を作成する方法。
【００５６】
材料と方法：
遺伝子型：欠失したダイコン遺伝子を挿入した‘Ｒ２１１’系統を、春の低ＧＬＳアブラナ‘Ｄｒａｋｋａｒ’と交配し、Ｆ１後代（‘Ｒ２１１＊Ｄｋ’）を作成した。その後の交配には、春の低ＧＬＳｃｍｓ系統‘Ｗｅｓｒｏｏｎａ’（オーストラリア原産）を用いた。分子分析における比較対照として、欧州のダイコンの系統７、アジアの回復系統ダイコンＤ８１、セイヨウアブラナ＊野生型ダイコンの雑種、キャベツ、そしてカブのＡｓｋｏ品種、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）と同様に、完全な（‘ＲＲＨ１’）または不完全な（‘Ｒ１１３’）遺伝子導入を有する‘Ｓａｍｏｕｒａｉ’に由来する冬の回復系統を用いた。
【００５７】
ガンマ線照射：管理区域において、開花している植物体の全体をＣｏ６０放射線源からのガンマ線で処理する。致死未満量の６５グレイを減数分裂前に照射した。
【００５８】
検定交雑とＦ２作成：２ｍｍよりも大きいつぼみを取り除いた後に、照射を施した植物を防虫温室に移し替えた。照射を施したＦ１後代を、ｃｍｓ‘Ｗｅｓｒｏｏｎａ’系統の人工授粉に用いた。得られた回復系統のＦ１’植物はＦ２ファミリーを作成することが可能であり、このＦ２ファミリーは、個別に収穫し、照射を行っていないものと同様にフィールド分析において正確に播種した。
【００５９】
表現型の選抜：１２００のＦ２後代に４４の比較対照例を加えたもの（用いられた８２３３０本の植物体）について、フィールド分析において、２年間にわたり以下の三つの視覚的基準について（１から５の段階で）得点を付けた。
１−生長力
２−Ｆ２の分離における稔性／不稔性の植物体の比率の正常性、および
３−雌性稔性（莢の成育と結実）
【００６０】
フィールドまたは温室のどちらかにおいて、自家受粉を繰り返して、選抜したファミリーの後代を得、そして更に分析を行うために、同型接合体系統（Ｆ４）を作成した。
【００６１】
アイソザイム分析をＤｅｌｏｕｒｍｅ Ｒ． ａｎｄ Ｅｂｅｒ Ｆ． １９９２． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ８５： ２２２−２２８に記載されているように行い、マーカーの開発（Ｆｏｕｒｍａｎｎ Ｍ ｅｔ ａｌ ２００２． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ １０５： １１９６−１２０６）に記載されているように行った。ＰＣＲ産物は配列決定によって確認する。
【００６２】
アラインメントは、Ｂｌａｓｔ ＮｃｂｉおよびＵｋ Ｃｒｏｐ Ｎｅｔ Ｂｒａｓｓｉｃａ ＤＢおよびＴｏｕｌｏｕｓｅにあるＩＮＲＡのＭｕｌｔｉａｌｉｎ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて行った。
【００６３】
方法：
導入した遺伝子に欠失がある低ＧＬＳの春の同型接合体の回復系統の一つである‘Ｒ２１１’を選択した（Ｄｅｌｏｕｒｍｅ Ｒ． ａｎｄ Ｅｂｅｒ Ｆ． １９９２． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ８５： ２２２−２２８． Ｄｅｌｏｕｒｍｅ Ｒ． ｅｔ ａｌ １９９８． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ９７： １２９−１３４． Ｄｅｌｏｕｒｍｅ Ｒ． ｅｔ ａｌ １９９９． １０th Ｉｎｔ． Ｒａｐｅｓｅｅｄ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ， Ｃａｎｂｅｒｒａ．）。ｓｐＡＴＣＨＩＡ（Ｆｏｕｒｍａｎｎ Ｍ ｅｔ ａｌ ２００２． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ １０５： １１９６−１２０６）、ｓｐＳＧ９１ （Ｇｉａｎｃｏｌａ Ｓ ｅｔ ａｌ ２００３ Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．（近刊））など、Ｒｆｏの両側でいくつかの分子マーカーが欠けている。‘Ｒ２１１’は、ダイコン遺伝子のＰｇｉ−２対立遺伝子のアイソザイムの発現を失っただけでなく、キャベツゲノムのＰｇｉ−２対立遺伝子のアイソザイム発現も失った（１、２）。
【００６４】
その上、同型接合体の‘Ｒ２１１’は、生長力が低く、結実も良くないというような、連鎖した望ましくない形質を示した。我々は、このような植物体にはアブラナの染色体断片が欠けているものと仮定した。この材料に由来するＦ２後代の稔性の割合は、予想されたものよりも低いものであった（７５％ではなく６４％）。我々は、この‘Ｒ２１１’系統からプログラムを開始し、この欠失した系統の遺伝子を導入したＲｆｏと、二重低含量セイヨウアブラナ系統から得られたアブラナの相同染色体とを、強制的に組換えることを試みた。
【００６５】
イオン化照射は、二本鎖の切断とそれに続く異常な再結合によって、染色体の再構成を誘発することが知られている。染色体の切断を誘発するために、ガンマ線照射を、減数分裂の直前に、‘Ｒ２１１’系統に由来する異型接合体のＦ１に用い、アブラナゲノムにおいて、欠失したダイコンの導入遺伝子を組換えることを目指した。
【００６６】
結果：
試験した１２００のＦ２ファミリーのうち、三つの基準で最高点を獲得したファミリーはほとんどなかった。
【００６７】
ただひとつ、‘Ｒ２０００’だけは、自家受粉して得られた後代ごとに、良好な雌性稔性といった良好な農業形質が安定して回復した正常な比率の稔性植物体を生産し、‘Ｒ２１１’と比較して結実が正常であるということが分かった（図２および３）。このファミリーは、毎時６５グレイの線量で６分間の照射処理をすることから得られたものである。
【００６８】
グルコシノレートの分析によって、それが低含量であることが確認された。
【００６９】
図２（‘Ｒ２１１’および‘Ｒ２０００’における結実）では、Ｒ２０００は、正常な花序と正常な外観的構造を示している。
【００７０】
図３（莢ごとの種子の数）において、以下のものについて評価した：
‐自家受粉および検定交雑における最良の‘Ｒ２０００’Ｆ４ファミリー、
‐アブラナの‘Ｐａｃｔｏｌ’ｃｍｓ系統および‘Ｒ２１１’比較対照。
【実施例２】
【００７１】
実施例ＩＩ：Ｐｇｉ−２遺伝子におけるマーカーの選択
ＰＧＩアイソザイム分析：‘Ｒ２０００’後代は、‘Ｒ２１１’において既に失われている、キャベツゲノムに由来する、アブラナのＰｇｉ−２対立遺伝子を発現した。
【００７２】
Ｒ２０００ファミリーを既知の回復系統アブラナＲＲＨ１およびＲ１１３と比較して解析するために、三つのＰＣＲマーカーを規定した。
１）アブラナ属のゲノムに特異的となるように、アブラナ属のＤＢ配列からＰＧＩｏｌマーカーを開発した。ダイコンにもシロイヌナズナにも増幅はないが、アブラナ属植物にだけ一つの２４８ｂｐのバンドがある。
２）ＰＧＩｉｎｔマーカーがＰｇｉ−２遺伝子の長い部分を増幅したため、それにより、試験した様々な種であるアブラナ属、ダイコン属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）およびシロイヌナズナ属の間を明確に区別することが可能になった。カブおよびキャベツは、アガロースゲルにおけるバンドのサイズでは区別ができなかったが、それらのＰＧＩＮＴバンドの配列では区別された。
３）ＰＧＩＵｎｔマーカーは、ＰＧＩｏｌＵプライマーとＰＧＩｉｎｔＬプライマーとを組み合わせたものである。
【００７３】
このマーカーはＰＧＩｏｌマーカーの特異性を有しているが、ＰＧＩｉｎｔマーカーに関しては、長い部分を増幅する。
【００７４】
ＩＩ．１ ＰＧＩｏｌマーカー
ＰＧＩｏｌプライマーでは‘Ｒ２１１’親系統に増幅は見られないが、一方で、試験した春の系統では２４８ｂｐのバンドが見られた。そのＤＮＡ配列は、アブラナ属の種におけるＣｒｏｐ Ｎｅｔ ＵＫ ＤＢから得られたＰＧＩ−２配列、および我々のグループが行った先の研究で得られたＰＧＩ−２配列（ＳＧＡＰ配列と呼ばれる）と相同である（プライマーＳＧ ＰＧＩ ｃｈｏｕの位置決定、図４）。
【００７５】
それは、シロイヌナズナ属植物における第５染色体上のクローンＭＪＢ２１−１２（３４５４２ｂｐ）のオーソログであった（ＮＣＢＩ ＤＢ）。
【００７６】
同型接合性の試験のためのＰＧＩｏｌとＳＧ３４：
混合のＰＣＲにおいて、二組のプライマー、つまり同型接合体の回復系統の植物体には存在しないＰｇｉ−２遺伝子を標識するＰＧＩｏｌ、およびＲｆｏ遺伝子に非常に近い標識であるＳＧ３４（Ｓ． Ｇｉａｎｃｏｌａ ｅｔ ａｌ， Ｇｉａｎｃｏｌａ Ｓ ｅｔ ａｌ ２００３ Ｔｈｏｒ Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．（近刊）から）を、組み合わせて使用することにより、‘Ｒ２１１’に由来するＦ２後代において分離している稔性植物のうち、異型接合体植物から同型接合体を識別した。ＳＧ３４を用いる代わりに、Ｒｆｏ遺伝子に近い、あるいはＲｆｏ遺伝子中にある、他のあらゆるマーカーを用いてもよい。
【００７７】
ただ一つ、Ｒ２０００ファミリーだけは、同型接合体の後代と異型接合体の後代との間に違いが見られなかった。
Ｐｇｉ−２遺伝子はＲ２０００の同型接合体には存在するが、親の同型接合体のＲ２１１には存在しない。
【００７８】
図５（ＰＧＩｏｌマーカーおよびＳＧ３４ＰＣＲマーカー）では：
同型接合体の‘Ｒ２０００’ファミリーは、ＰＧＩｏｌのバンドを回復した。
【００７９】
バンドのＤＮＡ配列により、既知のシロイヌナズナ属植物およびアブラナ属植物のＰｇｉ−２配列との相同性が裏付けられた。比較対照の遺伝子型（Ｄｒａｋｋａｒ、ＰａｃｔｏｌおよびＳａｍｏｕｒａｉ、Ｄａｒｍｏｒ）も、ゲル上で同様のパターンを示した。この共通のバンドの配列により、一つの塩基置換を除いては殆ど同じである、それらの相同性の高さが確認された。
【００８０】
同型接合体の‘Ｒ２０００’ファミリーは、キャベツ型のＰＧＩｏｌバンドを回復した。それは、Ｓａｍｏｕｒａｉ群の既知の回復とは異なるものである。
【００８１】
Ｐｇｉ−２のこの増幅された部分は非常によく保存されており、様々な遺伝子型の間ではほとんど違いが見られない。Ｐｇｉ−２遺伝子の長い部分を詳しく調べた。
【００８２】
ＩＩ．２ ＰＧＩＵＮＴマーカーおよびＰＧＩｉｎｔマーカー
ＰＣＲ産物の電気泳動パターン：
ＰＧＩＵＮＴマーカー：第二のリバースプライマーであるＰＧＩｉｎｔＬを、Ｐｇｉ−２配列の「更に下流」に設計して、遺伝子の保存領域と同様、可変領域も増幅した。ＰＧＩｏｌＵバンドと共に用いると、それは、アブラナ属ゲノムにおいてのみ９８０ｂｐのバンドを増幅する。
【００８３】
Ｒ２１１にはバンドは一切見られず、同型接合体の‘Ｒ２０００’には、Ｄｒａｋｋａｒの親と同様に、ＰＧＩＵＮＴバンドが見られた。
【００８４】
図８（ＰＧＩＵＮＴマーカー）においては：
ＰＧＩｉｎｔマーカーはＰＧＩＵＮＴのセグメントを増幅した。アッパープライマーＰＧＩｉｎｔは、試験したすべての種において増幅することが可能であり、シロイヌナズナ属、ダイコンおよびアブラナ属を明らかに区別することができる。カブおよびキャベツは、アガロースゲル上のバンドのサイズではなく、それらのＰＧＩｉｎｔの配列によって区別される。‘Ｒ２１１’系統を除いた、全ての試験した回復系統の遺伝子型は、カブのバンドに相同な、ヨーロッパダイコンのバンドおよびアブラナ属植物の一つのバンドを示した。
【００８５】
同型接合体の‘Ｒ２０００’には、欠失した‘Ｒ２１１’親系統におけるように、ダイコンのＰＧＩｉｎｔバンドが見られなかったが、キャベツのバンドと相同な、一つのアブラナ属植物のバンドが見られた。
【００８６】
図９には、ＰＧＩｉｎｔマーカーの電気泳動が示されている。
【００８７】
配列分析：
データベースから得たＰＧＩ配列の比較。
【００８８】
約４９０ｂｐのＰＧＩセグメントが知られている。
【００８９】
様々な遺伝子型（キャベツ、カブ、セイヨウアブラナ）から得られた約４９０ｂｐのセグメントの配列が、我々の研究室のグループによって研究されてきたが、いくつかの配列は、Ｍ．Ｆｏｕｒａｍｎｎ（４）によって、Ｂｒａｓｓｉｃａ Ｃｒｏｐ Ｎｅｔ ＤＢにＥＭＡＦ２５８７５から２５７８８として提供された。これらの配列は、非常に良く保存されている。
【００９０】
カブとキャベツのＰＧＩ配列の比較（図１３および１４）：
キャベツとカブの、試験した遺伝子型から得られたＰＧＩ配列間で比較したところ、それらは、２１の塩基置換によって区別されることが判明した。これらの置換は、カブのＡｓｋｏ品種（ＲＲＨ１およびＲ１１３）またはキャベツ（Ｄｒａｋｋａｒ、Ｒ２１１＊ＤＫのみならずＲ２０００も）のいずれかと相同であるアブラナの他の試験した遺伝子型から、ＰＧＩｉｎｔ配列を区別することを可能にしている。
【実施例３】
【００９１】
実施例ＩＩＩ：Ｒｆｏに近い領域におけるマーカーの選択
Ｒｆｏ遺伝子のクローニングを容易にするために、挿入したダイコン遺伝子におけるＲｆｏ遺伝子を囲むマーカーを決定した（Ｄｅｓｌｏｉｒｅｓ Ｓ ｅｔ ａｌ ２００３ ＥＭＢＯ ｒｅｐｏｒｔｓ ４， ６：５８８−５９４）。これらのうちの一つであるＳＧ１２９ＰＣＲマーカーは、Ｒｆｏに非常に近いところに位置する（Ｇｉａｎｃｏｌａ Ｓ ｅｔ ａｌ ２００３ Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．（近刊））：それにより、セイヨウアブラナのキャベツおよびカブのゲノムにおいて異なったバンドが共増幅されたが、ダイコンのバンドはアガロースゲル上で確認するのは非常に困難であった。
【００９２】
標的であるＳＧ１２９配列は、シロイヌナズナにおけるクローン（ＡＣ０１１０００、Ｆ１６Ｐ１７遺伝子座）のオーソログであった。このクローンは、シロイヌナズナ属の隣接するコンティグクローン（ＡＣ０７１９０）とオーバーラップする。
【００９３】
我々は、Ｂｒａｓｓｉｃａ Ｃｒｏｐ Ｎｅｔ ＤＢから、Ａ０１１０００の開始点でＢＬＡＳＴを行って、一つのキャベツクローン（ＥＭＢＨ４４８３３６、７６４ｂｐ）を見出し、そして、ＡＣ０７１９０の末端でＢＬＡＳＴを行って、シロイヌナズナ属の地図上で約３００ｂｐ離れている二つ目のキャベツクローン（ＥＭＢＨ５３９７１）を見出した。
【００９４】
我々は、二つのキャベツクローンの間で、新しいＰＣＲマーカーである、ＢｏｌＪｏｎを設計した。我々は、それが、ここで比較された様々な遺伝子型における特有のＰＣＲバンドを増幅することが可能であることを確認した。
【００９５】
図１６（ＢｏｌＪｏｎ ＰＣＲ産物の電気泳動ゲル）において：
‐シロイヌナズナ属植物において、コンティグのオーバーラップしているセグメントと相同である、ＢｏｌＪｏｎの８１５ｂｐのバンドが増幅された。
‐アブラナ族（Ｂｒａｓｓｉｃｅａｅ）の二倍体種においては、ＢｏｌＪｏｎマーカーは、異なるバンドを示した。一つはキャベツにおける９５０ｂｐのバンドであり、もう一方は、カブにおける８７０ｂｐのバンドである。このことは、二つのキャベツクローン（ＥＭＢＨ５３９７１とＥＭＢＨ４４８３３６）が、シロイヌナズナ属におけるオーソログ配列がそうであるように、アブラナ属ゲノムにおいて順に連続しているということである。
‐セイヨウアブラナにおいては、これらの二つのバンドは、維持系統であるＳａｍｏｕｒａｉまたはＤｒａｋｋａｒにおいて共増幅される。
‐ダイコンの系統７においては、一つのＢｏｌＪｏｎバンドが約６３０ｂｐの長さで増幅された。回復系統のダイコンであるｃｍｓＲｄ８１のバンドはやや小さかった。
‐全ての回復系統のアブラナにおいて、ＢｏｌＪｏｎバンドの一つがダイコンの系統７と同じ大きさであった。ＢｏｌＪｏｎはダイコン遺伝子導入のマーカーである。
‐同型接合体の回復系統のアブラナである‘ＲＲＨ１’、‘Ｒ１１３’および‘Ｒ２１１’には、カブのバンドと６３０ｂｐのダイコンのバンドが見られたのみであるが、このことは、標的遺伝子のキャベツのオーソログが存在しないということか、あるいは、標的遺伝子のキャベツのオーソログが、染色体のダイコンのセグメントがアブラナのキャベツの構成ゲノムに挿入された際に改変されたことを示している。
【００９６】
‘Ｒ２０００’同型接合体の植物体には、ＰＣＲを行ったダイコンのＢｏｌＪｏｎに加えてアブラナ属の二つのＢｏｌＪｏｎのバンドが見られ、これにおいても、‘Ｒ２１１’およびその他の回復系統において失われていたキャベツのバンドが回復している
【００９７】
我々は、試験した種におけるキャベツゲノムに特有のプライマーであるｐＣＰ４１８Ｌを設計した。ＳＧ１２９Ｕプライマーと共に、それはキャベツにおいて一つだけＰＣＲバンド（６７０ｂｐ）を増幅した。（図１７）
【００９８】
カブにもダイコンにもシロイヌナズナ属植物にも増幅は見られなかったが、セイヨウアブラナの維持系統において明瞭なＣＰ４１８バンドが見られた。その配列は、ＥＭＢＨ４４８３３６の配列と完全に相同であった。このマーカーは、非常によく保存されたＤＮＡ配列にあったため、存在の有無以外に遺伝子型間で多型現象はなかった。
【００９９】
ＲＲＨ１、Ｒ１１３およびＲ２１１にはＣＰ４１８バンドは存在しないが、このことは、前述したように、標的遺伝子のキャベツのオーソログが存在しないか、あるいは、標的遺伝子のキャベツのオーソログが、ダイコン遺伝子が挿入された後に改変されたことを示している。
【０１００】
‘Ｒ２０００’の同型接合の植物体はＣＰ４１８バンドを示し、これにおいても、特異的なキャベツのバンドは回復していた。
【０１０１】
本発明において、雌性稔性に優れた、新たな組換え低ＧＬＳ回復系統が選抜された。‘Ｒ２１１’系統の低い値により、フィールドにおける稀な組換え現象の選択と、‘Ｒ２０００’ファミリーの解析が可能となった。
【０１０２】
同型接合体の‘Ｒ２０００’は、分析したアブラナの回復系統と比較すると、ＰＧＩｏｌマーカー、ＰＧＩＵＮＴマーカー、ＰＧＩｉｎｔマーカーおよびＢｏｌＪｏｎマーカーの特有の組み合わせを示す：ＰＧＩｉｎｔマーカーは、同型接合体の回復系統のアブラナであるＲＲＨ１およびＲ１１３で、ヨーロッパダイコンのバンドに加え、カブゲノムに相同である一つのアブラナ属のバンドが見られることを示す。‘Ｒ２０００’には、その親である欠失したＲ２１１系統と同様に失われているダイコンのバンドは見られないが、キャベツに相同のアブラナ属のバンドが一つ見られた。このカブゲノムにおけるオーソログのＰＧＩｉｎｔ配列は、Ｒ２１１およびＤｒａｋｋａｒの遺伝的背景においては、このマーカーでは増幅されない。
【０１０３】
回復系統ＲＲＨ１およびＲ１１３におけるＰＧＩｏｌマーカーおよびＰＧＩＵＮＴマーカーの配列は、カブのＡｓｋｏ品種のものと相同であった。‘Ｒ２０００’においては、ＰＧＩＵＮＴの配列はキャベツに相同である。そのカブゲノムにおけるオーソログのＰＧＩＵｎｔの配列は、Ｒ２１１およびＤｒａｋｋａｒの遺伝的背景においては、このマーカーでは増幅されない。
【０１０４】
ＢｏｌＪｏｎマーカーは、‘Ｒ２１１’を含む同型接合体の回復系統のアブラナで、ヨーロッパダイコンのバンドに加え、唯一カブのバンドも見られることを示した。‘Ｒ２０００’では、‘Ｒ２１１’の二つのバンドに加え、回復系統のキャベツのＢｏｌＪｏｎバンドも見られる。
【０１０５】
ＣＰ４１８マーカーは、‘Ｒ２０００’が、この保存されたキャベツのセグメントを回復したことを示した。
【０１０６】
我々は、‘Ｒ２０００’植物体を生じさせる花粉母細胞において組換え現象が起こるという仮説を立てた。そして、欠失したダイコンの導入遺伝子は、放射線照射した異型接合体の‘Ｒ２１１＊ＤＫ’に存在するＤｒａｋｋａｒ‘００’ゲノムに恐らく由来するこれらのマーカーによって特徴づけられる、キャベツ型のＰｇｉ−２遺伝子およびＢｏｌＪｏｎ標的配列を有する、正常な相同染色体のセグメントに組み込まれた。
【０１０７】
ＢｏｌＪｏｎで観察されたパターンが示すところによると、組換え現象の結果、一方はダイコン、他方はキャベツに由来する、特殊な二本鎖領域が‘Ｒ２０００’ファミリーに存在する。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】ガンマ線照射とＦ２の作成とを示した図。
【図２】Ｒ２１１とＲ２０００の結実を示した図。
【図３】各系統の莢ごとの種子数を示した図。
【図４】データベースによる、ＰＧＩ配列のセグメントにおけるＰＧＩｏｌプライマーの位置を示した図。
【図５】ＰＧＩ−２遺伝子（ＰＧＩｏｌ）およびＳＧ３４の電気泳動を示した写真。
【図６】ＰＧＩｏｌプライマーを用いてＰＣＲで増幅した、ＤＮＡのＰｇｉ−２セグメントを示した図。
【図７】ＰＣＲ産物であるＰＧＩｏｌのＭｓｅｌによる消化を示した写真。
【図８】ＰＧＩＵＮＴマーカーの電気泳動を示す写真。
【図９】ＰＧＩｉｎｔ ＰＣＲマーカーの電気泳動を示す写真。
【図１０】ＢｏｌＪｏｎ ＰＣＲマーカーの電気泳動を示す写真。
【図１１】ＣＰ４１８マーカーの電気泳動を示す写真。
【図１２】マーカーの概要を示した表。
【図１３】シロイヌナズナ属植物、ダイコン、カブ、キャベツおよびＲ２０００の間における、ＰＧＩｏｌマーカーの配列のアラインメント。
【図１４】シロイヌナズナ属植物、ダイコン、カブ、キャベツおよびＲ２０００の間における、ＰＧＩｉｎｔ−ＵＮＴマーカーの配列のアラインメント。
【図１５】シロイヌナズナ属植物、ダイコン、カブ、キャベツおよびＲ２０００の間における、ＣＰ４１８Ｌマーカーの配列のアラインメント。
【図１６】シロイヌナズナ属植物、ダイコンおよびカブのＢｏｌＪｏｎマーカーを示した図。
【図１７】シロイヌナズナのＭＪＢ２１．１２配列におけるＰｇｉ−２プライマーの位置を示した図。
【図１８】‐図１８は、ｍｉｐｓＡｔｌ６２８５０遺伝子におけるＢｏｌＪｏｎプライマーの位置と、シロイヌナズナのＡＣ００７１９０クローンおよびＡＣ０１１０００クローンの重複領域を示すものである。シロイヌナズナ属植物のＢｏｌＪｏｎのＰＣＲ産物（７４０ｂｐ）とのアラインメントが示されている。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オグラ（ｏｇｕｒａ）型細胞質雄性不稔（ｃｍｓ）のための、セイヨウアブラナの二重低含量回復系統を作成する方法に関するものであり、該系統は、ダイコンのＰｇｉ−２対立遺伝子が欠失しキャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）のＰｇｉ−２遺伝子と組換えられたＲｆｏ回復遺伝子を有する、ダイコンの遺伝子が導入されており、「雌性稔性、高いＲｆｏ伝達率および高い生長力に特徴づけられる高い農学的価値を有するものである本発明は、セイヨウアブラナ雑種の種子ならびにその後代を形成する方法および選抜のためのマーカーの使用に関するものでもある。
【背景技術】
【０００２】
アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ Ｌ．）においてＯｇｕ−ＩＮＲＡ型細胞質雄性不稔（ｃｍｓ）の体系についての回復系統を育種することは、過去数年来の主要な目的となっている。それらの雌性稔性を高め、二重低含量回復系統を得るには、多大な戻し交配と系統育種を行うことが必要とされていた。所謂「二重低含量」品種とは、油中のエルカ酸含量が低く、油を抽出した後に残る固体穀粉の中のグルコシノレート含量が低いもののことを言う。しかしながら、ダイコン遺伝子導入のサイズが大きいことから、これらの系統を育種する上で幾つかの難点（導入遺伝子の再構成、望ましくない形質との連鎖の可能性）に直面することがある。
【非特許文献１】Ｄｅｓｌｏｉｒｅｓ Ｓ ｅｔ ａｌ ２００３ ＥＭＢＯ ｒｅｐｏｒｔｓ ４， ６：５８８−５９４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
よって、本発明者等は、農学的価値の高い、新たに改良された二重低含量回復系統を提供することを目標とした。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
この目標は、アブラナにおいて、Ｏｇｕ−ＩＮＲＡ型細胞質雄性不稔（ｃｍｓ）についての組換え二重低含量回復系統を作成する、新たな方法によって実現される。
【０００５】
本発明の第一の目的は、オグラ型細胞質雄性不稔（ｃｍｓ）についての、セイヨウアブラナの二重低含量回復系統を作成する方法に関するものであり、該系統は、ダイコンのＰｇｉ−２対立遺伝子が欠失しキャベツのＰｇｉ−２遺伝子と組換えられたＲｆｏ回復遺伝子を有する、ダイコンの遺伝子が導入されており、雌性稔性、高いＲｆｏ伝達率および高い生長力に特徴づけられる高い農学的価値を有しているものであり、当該方法は以下の手順を含むものである、
ａ）欠失したダイコン遺伝子を挿入した春のセイヨウアブラナの二重低含量ｃｍｓ系統を、春のＤｒａｋｋａｒの二重低含量系統と交配して、セイヨウアブラナの異型接合体の回復植物を形成し、
ｂ）減数分裂前に、手順a)で得られた異型接合体の回復植物に、ガンマ線照射を行い、
ｃ）前記手順ｂ）で得られた花の花粉を、ｃｍｓ二重低含量の春のＷｅｓｒｏｏｎａ系統と交配し、
ｄ）その後代の生長力と雌性稔性、およびｃｍｓ遺伝子の伝達率を試験し、
ｅ）後代系統の選抜を行う。
【０００６】
本発明においては、「（一つまたは複数の）系統」という用語は、基本的に同型接合体で、自己受粉で生殖可能な植物体を意味する。
【０００７】
請求項１に記載の方法においては、手順ｂ）における照射量は６分間に６５グレイである。
【０００８】
本発明の方法に関する一つの好適な実施態様によれば、手順ａ）の春のセイヨウアブラナの二重低含量ｃｍｓ系統は、Ｒ２１１である。
【０００９】
Ｒ２１１は、ＩＮＲＡの春の回復系統である。
【００１０】
Ｄｒａｋｋａｒは、フランス産の春の登録品種である。
【００１１】
Ｗｅｓｒｏｏｎａは、オーストラリア産の春の登録品種である。
【００１２】
本発明の方法に関する一つの好適な実施態様によれば、試験は、ＰＧＩｏｌ、ＰＧＩＵＮＴ、ＰＧＩｉｎｔ、ＢｏｌＪｏｎおよびＣＰ４１８から選択された五つのマーカーの組み合わせによって行われる。
【００１３】
本発明のもう一つの目的は、オグラ型ｃｍｓのための、セイヨウアブラナの二重低含量回復系統に関するものであり、該系統は、ダイコンのＰｇｉ−２対立遺伝子が欠失しキャベツのＰｇｉ−２遺伝子と組換えられたＲｆｏ回復遺伝子を有する、ダイコンの遺伝子が導入されており、雌性稔性、高いＲｆｏ伝達率および高い生長力に特徴づけられる高い農学的価値を有するものである。
【００１４】
一つの好適な実施態様によれば、二重低含量回復系統は、ＰＧＩｏｌ、ＰＧＩＵＮＴ、ＰＧＩｉｎｔ、ＢｏｌＪｏｎおよびＣＰ４１８から選択された五つのマーカーの独自の組み合わせを有している。
【００１５】
本発明のもう一つの目的は、以下の手順を通して、セイヨウアブラナの雑種植物およびその後代を形成する方法に関するものであり、当該方法は、以下の手順によって得られるものである。
ａ）請求項１に従って作成された、同型接合体となるように育種された回復系統を準備し、
ｂ）雑種を作成するフィールドにおいて、前記回復系統を花粉提供植物体として用い、
ｃ）雑種を作成するフィールドにおいて、ｃｍｓ植物を雑種種子作成植物体として用い、そして
ｄ）雄性不稔植物体から、雑種種子を得る。
【００１６】
本発明のもう一つの目的は、本発明の方法によって得られたアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物の種子に関するものである。
【００１７】
本発明の更にもう一つの目的は、英国の２３，Ｓｔ Ｍａｃｈａｒ Ｄｒｉｖｅ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＡＢ２４ ３ＲＹに所在の、ＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄ社に２００３年７月４日付けで参照番号ＮＣＩＭＢ４１１８３で寄託された、セイヨウアブラナの種子に関するものである。
【００１８】
本発明のもう一つの目的は、ＰＧＩｏｌ、ＰＧＩｉｎｔ、ＢｏｌＪｏｎおよびＣＰ４１８の少なくとも四つのマーカー、あるいは、それらの、少なくとも一つの多型部位を含むいずれかの部位を用いて、オグラ型ｃｍｓのための、セイヨウアブラナの組換え回復系統を解析することに関するものであり、該系統は、ダイコンのＰｇｉ−２対立遺伝子が欠失しキャベツのＰｇｉ−２遺伝子と組換えられたＲｆｏ回復遺伝子を有する、ダイコンの遺伝子が導入されており、雌性稔性、高いＲｆｏ伝達率および高い生長力に特徴づけられる高い農学的価値を有しているものである。
【００１９】
好ましい実施態様においては、その組み合わせは、ＰＧＩｏｌ、ＰＧＩＵＮＴ、ＰＧＩｉｎｔ、ＢｏｌＪｏｎおよびＣＰ４１８の五つのマーカーからなるものである。
【００２０】
本発明において「少なくとも一つの多型部位を含むいずれかの部位」というのは、少なくともキャベツ型の配列とカブ（Ｂ．ｒａｐａ）型の配列との間の違いを示す配列のいずれかの部分のことを意味する。
【００２１】
そのようなマーカーは、以下の図面とＲ２０００系統について記載されている配列表に示されている。
【００２２】
実施態様の一つの有利な実施態様によれは、本発明は、以下のものに関するものである。
‐プライマーＰＧＩｏｌＵおよびＰＧＩｏｌＬを用いて増幅するマーカーＰＧＩｏｌ：
（ＰＧＩｏｌＵ：５’ＴＣＡＴＴＴＧＡＴＴＧＴＴＧＣＧＣＣＴＧ３’；
ＰＧＩｏｌＬ：５’ＴＧＴＡＣＡＴＣＡＧＡＣＣＣＧＧＴＡＧＡＡＡＡ３’）
‐プライマーＰＧＩｉｎｔＵおよびＰＧＩｉｎｔＬを用いて増幅するマーカーＰＧＩｉｎｔ：
（ＰＧＩｉｎｔＵ：５’ＣＡＧＣＡＣＴＡＡＴＣＴＴＧＣＧＧＴＡＴＧ３’；
ＰＧＩｉｎｔＬ：５’ＣＡＡＴＡＡＣＣＣＴＡＡＡＡＧＣＡＣＣＴＧ３’）
‐プライマーＰＧＩｏｌＵおよびＰＧＩｉｎｔＬを用いて増幅するマーカーＰＧＩＵＮＴ：
（ＰＧＩｏｌＵ：５’ＴＣＡＴＴＴＧＡＴＴＧＴＴＧＣＧＣＣＴＧ３’；
ＰＧＩｉｎｔＬ：５’ＣＡＡＴＡＡＣＣＣＴＡＡＡＡＧＣＡＣＣＴＧ３’）
‐プライマーＢｏｌＪｏｎＵおよびＢｏｌＪｏｎＬを用いて増幅するマーカーＢｏｌＪｏｎ：
（ＢｏｌＪｏｎＵ：５’ＧＡＴＣＣＧＡＴＴＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＴＧ３’；
ＢｏｌＪｏｎＬ：５’ＧＣＣＴＡＣＴＣＣＴＣＡＡＡＴＣＡＣＴＣＴ３’）
‐プライマーＳＧ１２９ＵおよびｐＣＰ４１８Ｌを用いて増幅するマーカーＣＰ４１８：
（ＳＧ１２９Ｕ：ｃｆ Ｇｉａｎｃｏｌａ ｅｔ ａｌ，２００３ Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（ｉｎ ｐｒｅｓｓ）
ｐＣＰ４１８Ｌ：５’ＡＡＴＴＴＣＴＣＣＡＴＣＡＣＡＡＧＧＡＣＣ３’）
【００２３】
本発明のもう一つの目的は、ＰＧＩｏｌ、ＰＧＩＵＮＴ、ＰＧＩｉｎｔ、ＢｏｌＪｏｎおよびＣＰ４１８マーカーに関するものであり、それらマーカーの配列は以下の通りである。
【００２４】
ＰＧＩｏｌ Ｒ２０００マーカー：
【００２５】
【表１】
【００２６】
ＰＧＩＵＮＴ Ｒ２０００マーカー：
【００２７】
【表２】
【００２８】
ＰＧＩｉｎｔ Ｒ２０００マーカー：
【００２９】
【表３】
【００３０】
ＢｏｌＪｏｎ Ｒ２０００マーカー：
【００３１】
【表４】
【００３２】
ＣＰ４１８Ｌ Ｒ２０００マーカー：
【００３３】
【表５】
【００３４】
以下の添付図面において、つぎのような略称を用いる：
【００３５】
【表６】
【００３６】
‐図１は、ガンマ線照射とＦ２の作成とを示すものである。
【００３７】
‐図２は、Ｒ２１１とＲ２０００の結実を示すものである。
【００３８】
‐図３は、様々な系統の莢ごとの種子数を示すものである。
【００３９】
‐図４は、データベースによる、ＰＧＩ配列のセグメントにおけるＰＧＩｏｌプライマーの位置を示すものである。この図においては、
ＰＧＩｏｌ：−プライマーＰＧＩｏｌＵ（ＳＧＡＰでの名称はＢｎＰＧＩｃｈ１Ｕ）
−プライマーＰＧＩｏｌＬ（ＳＧＡＰでの名称はＢｎＰＧＩｃｈ１Ｌ）
ＰＧＩｉｎｔ：−プライマーＰＧＩｉｎｔＵ
−プライマーＰＧＩｉｎｔＬ（これは配列には含まれていない）
【００４０】
‐図５は、ＰＣＲマーカーであるＰＧＩ−２遺伝子（ＰＧＩｏｌ）、およびＲｆｏに近いＰＣＲマーカーであるＳＧ３４の電気泳動ゲルを示すものである。
【００４１】
‐図６は、ＰＧＩｏｌプライマーを用いてＰＣＲで増幅した、ＤＮＡのＰｇｉ−２セグメントを示すものである。
【００４２】
‐図７は、ＰＣＲ産物であるＰＧＩｏｌのＭｓｅｌによる消化を示すものである。
この図においては、
ＳａｍとＤａｒｍには７５ｂｐのバンドがある。
Ｄｒａｋ、Ｒ２１１．ＤＫおよびＲ２０００は、７０ｂｐのバンドを示す（１５％アクリルアミド）。
８は、Ｓａｍｏｕｒａｉに類似している（７５ｂｐ）；Ｄｒａｋｋａｒ（７０ｂｐ）と混合することにより、二本のバンドが視覚化された。
【００４３】
‐図８は、ＰＧＩＵＮＴマーカーの電気泳動のアガロースゲルを示すものである。
この図においては、
ＰＧＩＵＮＴバンド（約９８０ｂｐ）は、キャベツ、カブのＡｓｋｏ品種（Ｂ．ｒａｐａ ｃｖ Ａｓｋｏ）、維持系統および回復系統には存在するが、‘Ｒ２１１’には存在しない。
ダイコンおよびシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）に増幅はみられない。
様々なアブラナ属の遺伝子型において、一本のバンドだけが増幅された。バンドのサイズは類似しているが、配列は異なる。
【００４４】
‐図９は、ＰＧＩｉｎｔ ＰＣＲマーカーの電気泳動ゲルを示すものである。
この図においては、ダイコン系統７のＰＧＩｉｎｔは、およそ９５０ｂｐである。このバンドは、回復系統ＲＲＨ１およびＲ１１３と同じものである。これは、Ｒ２１１では見られない。また、Ｒ２０００でもみられない。しかしながら、ＰＧＩｉｎｔバンドのサイズは、様々なアブラナ属の種において、約８７０ｂｐでほぼ同じであるが、配列は異なる。
【００４５】
‐図１０は、ＢｏｌＪｏｎ ＰＣＲマーカーの電気泳動のアガロースゲルを示すものである。
【００４６】
‐図１１は、ＣＰ４１８マーカーの電気泳動のアガロースゲルを示すものである。
この図においては、（およそ６７０ｂｐの）ＣＰ４１８バンドは、キャベツゲノム特有のものである。これは、キャベツ（Ｂ．ｏｌ）、セイヨウアブラナ（Ｓａｍｏｕｒａｉ、Ｄｒａｋｋａｒ、Ｐａｃｔｏｌおよび異型接合体のＲ２１１１＊Ｄｋ）に存在するものである。これは、回復系統のアブラナ（ＲＲＨ、Ｒ１１３およびＲ２１１）には存在しないものである。同型接合体のＲ２０００には存在する。
【００４７】
‐図１２は、マーカーの概要を示す表である。
【００４８】
‐図１３（１３（ａ）、１３（ｂ））は、シロイヌナズナ属植物、ダイコン、カブ、キャベツおよびＲ２０００の間における、ＰＧＩｏｌマーカーの配列のアラインメントを示すものである。
【００４９】
‐図１４（１４（ａ）、１４（ｂ）、１４（ｃ）、１４（ｄ））は、シロイヌナズナ属植物、ダイコン、カブ、キャベツおよびＲ２０００の間における、ＰＧＩｉｎｔ−ＵＮＴマーカーの配列のアラインメントを示すものである。
【００５０】
‐図１５（１５（ａ）、１５（ｂ）、１５（ｃ））は、シロイヌナズナ属植物、ダイコン、カブ、キャベツおよびＲ２０００の間における、ＣＰ４１８Ｌマーカーの配列のアラインメントを示すものである。
【００５１】
‐図１６（１６および１６ｂｉｓ）は、シロイヌナズナ属植物、ダイコンおよびカブのＢｏｌＪｏｎマーカーを示すものである。
これらは、シロイヌナズナ属植物（ＡＣ００７１９０の末端−ＡＣ０１１０００の開始点）、キャベツのＥＭＢＨ９５９１０２の末端およびＥＭＢＨ４４８３３６の開始点、ならびにセイヨウアブラナにおける（それぞれＤｒａｋｋａｒおよびＳａｍｏｕｒａｉにおける）ＳＧ１２９マーカーのバンド１および２の代表的なコンセンサス配列の、ＤＢ配列とアラインされている。
８３６ｂｐのポイントからは、ＡＣ０７１９０−ＡＣ１１０００およびＧＣＰＡＴｐＢＯＪ配列は、アブラナ属植物の配列とはもはや高度に相同ではなくなる。
ダイコンとカブ（ＧＣＰｃｏｎｓｅｎ ＲｓＲｆＢＯＪおよびＢＲ）の配列は、それぞれ、８５８ｂｐのポイントから９００ｂｐおよび９８１ｂｐのポイントまで、セイヨウアブラナのものと依然として高度に相同である。
ダイコンにおいては、アブラナ属植物の配列の更に下流に部分的な相同が見いだされるに過ぎない。
カブのＡｓｋｏ品種においては、そのＢｏｌＪｏｎ配列の左側を、７８ｂｐを欠失させた後に、セイヨウアブラナにおけるキャベツおよびカブのそれと、１０５７ｂｐのポイントからＢｏｌＪｏｎＬプライマーまで、更にアラインすることができる。
【００５２】
‐図１７（１７および１７ｂｉｓ）は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈ）のＭＪＢ２１．１２配列におけるＰｇｉ−２プライマーの位置を示すものである。
【００５３】
‐図１８は、ｍｉｐｓＡｔｌ６２８５０遺伝子におけるＢｏｌＪｏｎプライマーの位置と、シロイヌナズナのＡＣ００７１９０クローンおよびＡＣ０１１０００クローンの重複領域を示すものである。シロイヌナズナ属植物のＢｏｌＪｏｎのＰＣＲ産物（７４０ｂｐ）とのアラインメントが示されている。
【００５４】
しかし、当然のことながら、ここにおいて示されている例は本発明の対象とするものを示すために挙げられているものであり、限定する趣旨のものではない。
【実施例１】
【００５５】
実施例Ｉ： ダイコンのＰｇｉ−２対立遺伝子が欠失しキャベツのＰｇｉ−２遺伝子と組換えられたＲｆｏ回復遺伝子を有する、ダイコンの遺伝子が導入されており、雌性稔性、高いＲｆｏ伝達率および高い生長力に特徴づけられる高い農学的価値を有する、オグラ型細胞質雄性不稔（ｃｍｓ）のための、セイヨウアブラナの二重低含量回復系統を作成する方法。
【００５６】
材料と方法：
遺伝子型：欠失したダイコン遺伝子を挿入した‘Ｒ２１１’系統を、春の低ＧＬＳアブラナ‘Ｄｒａｋｋａｒ’と交配し、Ｆ１後代（‘Ｒ２１１＊Ｄｋ’）を作成した。その後の交配には、春の低ＧＬＳｃｍｓ系統‘Ｗｅｓｒｏｏｎａ’（オーストラリア原産）を用いた。分子分析における比較対照として、欧州のダイコンの系統７、アジアの回復系統ダイコンＤ８１、セイヨウアブラナ＊野生型ダイコンの雑種、キャベツ、そしてカブのＡｓｋｏ品種、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）と同様に、完全な（‘ＲＲＨ１’）または不完全な（‘Ｒ１１３’）遺伝子導入を有する‘Ｓａｍｏｕｒａｉ’に由来する冬の回復系統を用いた。
【００５７】
ガンマ線照射：管理区域において、開花している植物体の全体をＣｏ６０放射線源からのガンマ線で処理する。致死未満量の６５グレイを減数分裂前に照射した。
【００５８】
検定交雑とＦ２作成：２ｍｍよりも大きいつぼみを取り除いた後に、照射を施した植物を防虫温室に移し替えた。照射を施したＦ１後代を、ｃｍｓ‘Ｗｅｓｒｏｏｎａ’系統の人工授粉に用いた。得られた回復系統のＦ１’植物はＦ２ファミリーを作成することが可能であり、このＦ２ファミリーは、個別に収穫し、照射を行っていないものと同様にフィールド分析において正確に播種した。
【００５９】
表現型の選抜：１２００のＦ２後代に４４の比較対照例を加えたもの（用いられた８２３３０本の植物体）について、フィールド分析において、２年間にわたり以下の三つの視覚的基準について（１から５の段階で）得点を付けた。
１−生長力
２−Ｆ２の分離における稔性／不稔性の植物体の比率の正常性、および
３−雌性稔性（莢の成育と結実）
【００６０】
フィールドまたは温室のどちらかにおいて、自家受粉を繰り返して、選抜したファミリーの後代を得、そして更に分析を行うために、同型接合体系統（Ｆ４）を作成した。
【００６１】
アイソザイム分析をＤｅｌｏｕｒｍｅ Ｒ． ａｎｄ Ｅｂｅｒ Ｆ． １９９２． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ８５： ２２２−２２８に記載されているように行い、マーカーの開発（Ｆｏｕｒｍａｎｎ Ｍ ｅｔ ａｌ ２００２． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ １０５： １１９６−１２０６）に記載されているように行った。ＰＣＲ産物は配列決定によって確認する。
【００６２】
アラインメントは、Ｂｌａｓｔ ＮｃｂｉおよびＵｋ Ｃｒｏｐ Ｎｅｔ Ｂｒａｓｓｉｃａ ＤＢおよびＴｏｕｌｏｕｓｅにあるＩＮＲＡのＭｕｌｔｉａｌｉｎ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて行った。
【００６３】
方法：
導入した遺伝子に欠失がある低ＧＬＳの春の同型接合体の回復系統の一つである‘Ｒ２１１’を選択した（Ｄｅｌｏｕｒｍｅ Ｒ． ａｎｄ Ｅｂｅｒ Ｆ． １９９２． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ８５： ２２２−２２８． Ｄｅｌｏｕｒｍｅ Ｒ． ｅｔ ａｌ １９９８． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ ９７： １２９−１３４． Ｄｅｌｏｕｒｍｅ Ｒ． ｅｔ ａｌ １９９９． １０th Ｉｎｔ． Ｒａｐｅｓｅｅｄ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ， Ｃａｎｂｅｒｒａ．）。ｓｐＡＴＣＨＩＡ（Ｆｏｕｒｍａｎｎ Ｍ ｅｔ ａｌ ２００２． Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ １０５： １１９６−１２０６）、ｓｐＳＧ９１ （Ｇｉａｎｃｏｌａ Ｓ ｅｔ ａｌ ２００３ Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．（近刊））など、Ｒｆｏの両側でいくつかの分子マーカーが欠けている。‘Ｒ２１１’は、ダイコン遺伝子のＰｇｉ−２対立遺伝子のアイソザイムの発現を失っただけでなく、キャベツゲノムのＰｇｉ−２対立遺伝子のアイソザイム発現も失った（１、２）。
【００６４】
その上、同型接合体の‘Ｒ２１１’は、生長力が低く、結実も良くないというような、連鎖した望ましくない形質を示した。我々は、このような植物体にはアブラナの染色体断片が欠けているものと仮定した。この材料に由来するＦ２後代の稔性の割合は、予想されたものよりも低いものであった（７５％ではなく６４％）。我々は、この‘Ｒ２１１’系統からプログラムを開始し、この欠失した系統の遺伝子を導入したＲｆｏと、二重低含量セイヨウアブラナ系統から得られたアブラナの相同染色体とを、強制的に組換えることを試みた。
【００６５】
イオン化照射は、二本鎖の切断とそれに続く異常な再結合によって、染色体の再構成を誘発することが知られている。染色体の切断を誘発するために、ガンマ線照射を、減数分裂の直前に、‘Ｒ２１１’系統に由来する異型接合体のＦ１に用い、アブラナゲノムにおいて、欠失したダイコンの導入遺伝子を組換えることを目指した。
【００６６】
結果：
試験した１２００のＦ２ファミリーのうち、三つの基準で最高点を獲得したファミリーはほとんどなかった。
【００６７】
ただひとつ、‘Ｒ２０００’だけは、自家受粉して得られた後代ごとに、良好な雌性稔性といった良好な農業形質が安定して回復した正常な比率の稔性植物体を生産し、‘Ｒ２１１’と比較して結実が正常であるということが分かった（図２および３）。このファミリーは、毎時６５グレイの線量で６分間の照射処理をすることから得られたものである。
【００６８】
グルコシノレートの分析によって、それが低含量であることが確認された。
【００６９】
図２（‘Ｒ２１１’および‘Ｒ２０００’における結実）では、Ｒ２０００は、正常な花序と正常な外観的構造を示している。
【００７０】
図３（莢ごとの種子の数）において、以下のものについて評価した：
‐自家受粉および検定交雑における最良の‘Ｒ２０００’Ｆ４ファミリー、
‐アブラナの‘Ｐａｃｔｏｌ’ｃｍｓ系統および‘Ｒ２１１’比較対照。
【実施例２】
【００７１】
実施例ＩＩ：Ｐｇｉ−２遺伝子におけるマーカーの選択
ＰＧＩアイソザイム分析：‘Ｒ２０００’後代は、‘Ｒ２１１’において既に失われている、キャベツゲノムに由来する、アブラナのＰｇｉ−２対立遺伝子を発現した。
【００７２】
Ｒ２０００ファミリーを既知の回復系統アブラナＲＲＨ１およびＲ１１３と比較して解析するために、三つのＰＣＲマーカーを規定した。
１）アブラナ属のゲノムに特異的となるように、アブラナ属のＤＢ配列からＰＧＩｏｌマーカーを開発した。ダイコンにもシロイヌナズナにも増幅はないが、アブラナ属植物にだけ一つの２４８ｂｐのバンドがある。
２）ＰＧＩｉｎｔマーカーがＰｇｉ−２遺伝子の長い部分を増幅したため、それにより、試験した様々な種であるアブラナ属、ダイコン属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）およびシロイヌナズナ属の間を明確に区別することが可能になった。カブおよびキャベツは、アガロースゲルにおけるバンドのサイズでは区別ができなかったが、それらのＰＧＩＮＴバンドの配列では区別された。
３）ＰＧＩＵｎｔマーカーは、ＰＧＩｏｌＵプライマーとＰＧＩｉｎｔＬプライマーとを組み合わせたものである。
【００７３】
このマーカーはＰＧＩｏｌマーカーの特異性を有しているが、ＰＧＩｉｎｔマーカーに関しては、長い部分を増幅する。
【００７４】
ＩＩ．１ ＰＧＩｏｌマーカー
ＰＧＩｏｌプライマーでは‘Ｒ２１１’親系統に増幅は見られないが、一方で、試験した春の系統では２４８ｂｐのバンドが見られた。そのＤＮＡ配列は、アブラナ属の種におけるＣｒｏｐ Ｎｅｔ ＵＫ ＤＢから得られたＰＧＩ−２配列、および我々のグループが行った先の研究で得られたＰＧＩ−２配列（ＳＧＡＰ配列と呼ばれる）と相同である（プライマーＳＧ ＰＧＩ ｃｈｏｕの位置決定、図４）。
【００７５】
それは、シロイヌナズナ属植物における第５染色体上のクローンＭＪＢ２１−１２（３４５４２ｂｐ）のオーソログであった（ＮＣＢＩ ＤＢ）。
【００７６】
同型接合性の試験のためのＰＧＩｏｌとＳＧ３４：
混合のＰＣＲにおいて、二組のプライマー、つまり同型接合体の回復系統の植物体には存在しないＰｇｉ−２遺伝子を標識するＰＧＩｏｌ、およびＲｆｏ遺伝子に非常に近い標識であるＳＧ３４（Ｓ． Ｇｉａｎｃｏｌａ ｅｔ ａｌ， Ｇｉａｎｃｏｌａ Ｓ ｅｔ ａｌ ２００３ Ｔｈｏｒ Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．（近刊）から）を、組み合わせて使用することにより、‘Ｒ２１１’に由来するＦ２後代において分離している稔性植物のうち、異型接合体植物から同型接合体を識別した。ＳＧ３４を用いる代わりに、Ｒｆｏ遺伝子に近い、あるいはＲｆｏ遺伝子中にある、他のあらゆるマーカーを用いてもよい。
【００７７】
ただ一つ、Ｒ２０００ファミリーだけは、同型接合体の後代と異型接合体の後代との間に違いが見られなかった。
Ｐｇｉ−２遺伝子はＲ２０００の同型接合体には存在するが、親の同型接合体のＲ２１１には存在しない。
【００７８】
図５（ＰＧＩｏｌマーカーおよびＳＧ３４ＰＣＲマーカー）では：
同型接合体の‘Ｒ２０００’ファミリーは、ＰＧＩｏｌのバンドを回復した。
【００７９】
バンドのＤＮＡ配列により、既知のシロイヌナズナ属植物およびアブラナ属植物のＰｇｉ−２配列との相同性が裏付けられた。比較対照の遺伝子型（Ｄｒａｋｋａｒ、ＰａｃｔｏｌおよびＳａｍｏｕｒａｉ、Ｄａｒｍｏｒ）も、ゲル上で同様のパターンを示した。この共通のバンドの配列により、一つの塩基置換を除いては殆ど同じである、それらの相同性の高さが確認された。
【００８０】
同型接合体の‘Ｒ２０００’ファミリーは、キャベツ型のＰＧＩｏｌバンドを回復した。それは、Ｓａｍｏｕｒａｉ群の既知の回復とは異なるものである。
【００８１】
Ｐｇｉ−２のこの増幅された部分は非常によく保存されており、様々な遺伝子型の間ではほとんど違いが見られない。Ｐｇｉ−２遺伝子の長い部分を詳しく調べた。
【００８２】
ＩＩ．２ ＰＧＩＵＮＴマーカーおよびＰＧＩｉｎｔマーカー
ＰＣＲ産物の電気泳動パターン：
ＰＧＩＵＮＴマーカー：第二のリバースプライマーであるＰＧＩｉｎｔＬを、Ｐｇｉ−２配列の「更に下流」に設計して、遺伝子の保存領域と同様、可変領域も増幅した。ＰＧＩｏｌＵバンドと共に用いると、それは、アブラナ属ゲノムにおいてのみ９８０ｂｐのバンドを増幅する。
【００８３】
Ｒ２１１にはバンドは一切見られず、同型接合体の‘Ｒ２０００’には、Ｄｒａｋｋａｒの親と同様に、ＰＧＩＵＮＴバンドが見られた。
【００８４】
図８（ＰＧＩＵＮＴマーカー）においては：
ＰＧＩｉｎｔマーカーはＰＧＩＵＮＴのセグメントを増幅した。アッパープライマーＰＧＩｉｎｔは、試験したすべての種において増幅することが可能であり、シロイヌナズナ属、ダイコンおよびアブラナ属を明らかに区別することができる。カブおよびキャベツは、アガロースゲル上のバンドのサイズではなく、それらのＰＧＩｉｎｔの配列によって区別される。‘Ｒ２１１’系統を除いた、全ての試験した回復系統の遺伝子型は、カブのバンドに相同な、ヨーロッパダイコンのバンドおよびアブラナ属植物の一つのバンドを示した。
【００８５】
同型接合体の‘Ｒ２０００’には、欠失した‘Ｒ２１１’親系統におけるように、ダイコンのＰＧＩｉｎｔバンドが見られなかったが、キャベツのバンドと相同な、一つのアブラナ属植物のバンドが見られた。
【００８６】
図９には、ＰＧＩｉｎｔマーカーの電気泳動が示されている。
【００８７】
配列分析：
データベースから得たＰＧＩ配列の比較。
【００８８】
約４９０ｂｐのＰＧＩセグメントが知られている。
【００８９】
様々な遺伝子型（キャベツ、カブ、セイヨウアブラナ）から得られた約４９０ｂｐのセグメントの配列が、我々の研究室のグループによって研究されてきたが、いくつかの配列は、Ｍ．Ｆｏｕｒａｍｎｎ（４）によって、Ｂｒａｓｓｉｃａ Ｃｒｏｐ Ｎｅｔ ＤＢにＥＭＡＦ２５８７５から２５７８８として提供された。これらの配列は、非常に良く保存されている。
【００９０】
カブとキャベツのＰＧＩ配列の比較（図１３および１４）：
キャベツとカブの、試験した遺伝子型から得られたＰＧＩ配列間で比較したところ、それらは、２１の塩基置換によって区別されることが判明した。これらの置換は、カブのＡｓｋｏ品種（ＲＲＨ１およびＲ１１３）またはキャベツ（Ｄｒａｋｋａｒ、Ｒ２１１＊ＤＫのみならずＲ２０００も）のいずれかと相同であるアブラナの他の試験した遺伝子型から、ＰＧＩｉｎｔ配列を区別することを可能にしている。
【実施例３】
【００９１】
実施例ＩＩＩ：Ｒｆｏに近い領域におけるマーカーの選択
Ｒｆｏ遺伝子のクローニングを容易にするために、挿入したダイコン遺伝子におけるＲｆｏ遺伝子を囲むマーカーを決定した（Ｄｅｓｌｏｉｒｅｓ Ｓ ｅｔ ａｌ ２００３ ＥＭＢＯ ｒｅｐｏｒｔｓ ４， ６：５８８−５９４）。これらのうちの一つであるＳＧ１２９ＰＣＲマーカーは、Ｒｆｏに非常に近いところに位置する（Ｇｉａｎｃｏｌａ Ｓ ｅｔ ａｌ ２００３ Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ．（近刊））：それにより、セイヨウアブラナのキャベツおよびカブのゲノムにおいて異なったバンドが共増幅されたが、ダイコンのバンドはアガロースゲル上で確認するのは非常に困難であった。
【００９２】
標的であるＳＧ１２９配列は、シロイヌナズナにおけるクローン（ＡＣ０１１０００、Ｆ１６Ｐ１７遺伝子座）のオーソログであった。このクローンは、シロイヌナズナ属の隣接するコンティグクローン（ＡＣ０７１９０）とオーバーラップする。
【００９３】
我々は、Ｂｒａｓｓｉｃａ Ｃｒｏｐ Ｎｅｔ ＤＢから、Ａ０１１０００の開始点でＢＬＡＳＴを行って、一つのキャベツクローン（ＥＭＢＨ４４８３３６、７６４ｂｐ）を見出し、そして、ＡＣ０７１９０の末端でＢＬＡＳＴを行って、シロイヌナズナ属の地図上で約３００ｂｐ離れている二つ目のキャベツクローン（ＥＭＢＨ５３９７１）を見出した。
【００９４】
我々は、二つのキャベツクローンの間で、新しいＰＣＲマーカーである、ＢｏｌＪｏｎを設計した。我々は、それが、ここで比較された様々な遺伝子型における特有のＰＣＲバンドを増幅することが可能であることを確認した。
【００９５】
図１６（ＢｏｌＪｏｎ ＰＣＲ産物の電気泳動ゲル）において：
‐シロイヌナズナ属植物において、コンティグのオーバーラップしているセグメントと相同である、ＢｏｌＪｏｎの８１５ｂｐのバンドが増幅された。
‐アブラナ族（Ｂｒａｓｓｉｃｅａｅ）の二倍体種においては、ＢｏｌＪｏｎマーカーは、異なるバンドを示した。一つはキャベツにおける９５０ｂｐのバンドであり、もう一方は、カブにおける８７０ｂｐのバンドである。このことは、二つのキャベツクローン（ＥＭＢＨ５３９７１とＥＭＢＨ４４８３３６）が、シロイヌナズナ属におけるオーソログ配列がそうであるように、アブラナ属ゲノムにおいて順に連続しているということである。
‐セイヨウアブラナにおいては、これらの二つのバンドは、維持系統であるＳａｍｏｕｒａｉまたはＤｒａｋｋａｒにおいて共増幅される。
‐ダイコンの系統７においては、一つのＢｏｌＪｏｎバンドが約６３０ｂｐの長さで増幅された。回復系統のダイコンであるｃｍｓＲｄ８１のバンドはやや小さかった。
‐全ての回復系統のアブラナにおいて、ＢｏｌＪｏｎバンドの一つがダイコンの系統７と同じ大きさであった。ＢｏｌＪｏｎはダイコン遺伝子導入のマーカーである。
‐同型接合体の回復系統のアブラナである‘ＲＲＨ１’、‘Ｒ１１３’および‘Ｒ２１１’には、カブのバンドと６３０ｂｐのダイコンのバンドが見られたのみであるが、このことは、標的遺伝子のキャベツのオーソログが存在しないということか、あるいは、標的遺伝子のキャベツのオーソログが、染色体のダイコンのセグメントがアブラナのキャベツの構成ゲノムに挿入された際に改変されたことを示している。
【００９６】
‘Ｒ２０００’同型接合体の植物体には、ＰＣＲを行ったダイコンのＢｏｌＪｏｎに加えてアブラナ属の二つのＢｏｌＪｏｎのバンドが見られ、これにおいても、‘Ｒ２１１’およびその他の回復系統において失われていたキャベツのバンドが回復している
【００９７】
我々は、試験した種におけるキャベツゲノムに特有のプライマーであるｐＣＰ４１８Ｌを設計した。ＳＧ１２９Ｕプライマーと共に、それはキャベツにおいて一つだけＰＣＲバンド（６７０ｂｐ）を増幅した。（図１７）
【００９８】
カブにもダイコンにもシロイヌナズナ属植物にも増幅は見られなかったが、セイヨウアブラナの維持系統において明瞭なＣＰ４１８バンドが見られた。その配列は、ＥＭＢＨ４４８３３６の配列と完全に相同であった。このマーカーは、非常によく保存されたＤＮＡ配列にあったため、存在の有無以外に遺伝子型間で多型現象はなかった。
【００９９】
ＲＲＨ１、Ｒ１１３およびＲ２１１にはＣＰ４１８バンドは存在しないが、このことは、前述したように、標的遺伝子のキャベツのオーソログが存在しないか、あるいは、標的遺伝子のキャベツのオーソログが、ダイコン遺伝子が挿入された後に改変されたことを示している。
【０１００】
‘Ｒ２０００’の同型接合の植物体はＣＰ４１８バンドを示し、これにおいても、特異的なキャベツのバンドは回復していた。
【０１０１】
本発明において、雌性稔性に優れた、新たな組換え低ＧＬＳ回復系統が選抜された。‘Ｒ２１１’系統の低い値により、フィールドにおける稀な組換え現象の選択と、‘Ｒ２０００’ファミリーの解析が可能となった。
【０１０２】
同型接合体の‘Ｒ２０００’は、分析したアブラナの回復系統と比較すると、ＰＧＩｏｌマーカー、ＰＧＩＵＮＴマーカー、ＰＧＩｉｎｔマーカーおよびＢｏｌＪｏｎマーカーの特有の組み合わせを示す：ＰＧＩｉｎｔマーカーは、同型接合体の回復系統のアブラナであるＲＲＨ１およびＲ１１３で、ヨーロッパダイコンのバンドに加え、カブゲノムに相同である一つのアブラナ属のバンドが見られることを示す。‘Ｒ２０００’には、その親である欠失したＲ２１１系統と同様に失われているダイコンのバンドは見られないが、キャベツに相同のアブラナ属のバンドが一つ見られた。このカブゲノムにおけるオーソログのＰＧＩｉｎｔ配列は、Ｒ２１１およびＤｒａｋｋａｒの遺伝的背景においては、このマーカーでは増幅されない。
【０１０３】
回復系統ＲＲＨ１およびＲ１１３におけるＰＧＩｏｌマーカーおよびＰＧＩＵＮＴマーカーの配列は、カブのＡｓｋｏ品種のものと相同であった。‘Ｒ２０００’においては、ＰＧＩＵＮＴの配列はキャベツに相同である。そのカブゲノムにおけるオーソログのＰＧＩＵｎｔの配列は、Ｒ２１１およびＤｒａｋｋａｒの遺伝的背景においては、このマーカーでは増幅されない。
【０１０４】
ＢｏｌＪｏｎマーカーは、‘Ｒ２１１’を含む同型接合体の回復系統のアブラナで、ヨーロッパダイコンのバンドに加え、唯一カブのバンドも見られることを示した。‘Ｒ２０００’では、‘Ｒ２１１’の二つのバンドに加え、回復系統のキャベツのＢｏｌＪｏｎバンドも見られる。
【０１０５】
ＣＰ４１８マーカーは、‘Ｒ２０００’が、この保存されたキャベツのセグメントを回復したことを示した。
【０１０６】
我々は、‘Ｒ２０００’植物体を生じさせる花粉母細胞において組換え現象が起こるという仮説を立てた。そして、欠失したダイコンの導入遺伝子は、放射線照射した異型接合体の‘Ｒ２１１＊ＤＫ’に存在するＤｒａｋｋａｒ‘００’ゲノムに恐らく由来するこれらのマーカーによって特徴づけられる、キャベツ型のＰｇｉ−２遺伝子およびＢｏｌＪｏｎ標的配列を有する、正常な相同染色体のセグメントに組み込まれた。
【０１０７】
ＢｏｌＪｏｎで観察されたパターンが示すところによると、組換え現象の結果、一方はダイコン、他方はキャベツに由来する、特殊な二本鎖領域が‘Ｒ２０００’ファミリーに存在する。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】ガンマ線照射とＦ２の作成とを示した図。
【図２】Ｒ２１１とＲ２０００の結実を示した図。
【図３】各系統の莢ごとの種子数を示した図。
【図４】データベースによる、ＰＧＩ配列のセグメントにおけるＰＧＩｏｌプライマーの位置を示した図。
【図５】ＰＧＩ−２遺伝子（ＰＧＩｏｌ）およびＳＧ３４の電気泳動を示した写真。
【図６】ＰＧＩｏｌプライマーを用いてＰＣＲで増幅した、ＤＮＡのＰｇｉ−２セグメントを示した図。
【図７】ＰＣＲ産物であるＰＧＩｏｌのＭｓｅｌによる消化を示した写真。
【図８】ＰＧＩＵＮＴマーカーの電気泳動を示す写真。
【図９】ＰＧＩｉｎｔ ＰＣＲマーカーの電気泳動を示す写真。
【図１０】ＢｏｌＪｏｎ ＰＣＲマーカーの電気泳動を示す写真。
【図１１】ＣＰ４１８マーカーの電気泳動を示す写真。
【図１２】マーカーの概要を示した表。
【図１３】シロイヌナズナ属植物、ダイコン、カブ、キャベツおよびＲ２０００の間における、ＰＧＩｏｌマーカーの配列のアラインメント。
【図１４】シロイヌナズナ属植物、ダイコン、カブ、キャベツおよびＲ２０００の間における、ＰＧＩｉｎｔ−ＵＮＴマーカーの配列のアラインメント。
【図１５】シロイヌナズナ属植物、ダイコン、カブ、キャベツおよびＲ２０００の間における、ＣＰ４１８Ｌマーカーの配列のアラインメント。
【図１６】シロイヌナズナ属植物、ダイコンおよびカブのＢｏｌＪｏｎマーカーを示した図。
【図１７】シロイヌナズナのＭＪＢ２１．１２配列におけるＰｇｉ−２プライマーの位置を示した図。
【図１８】‐図１８は、ｍｉｐｓＡｔｌ６２８５０遺伝子におけるＢｏｌＪｏｎプライマーの位置と、シロイヌナズナのＡＣ００７１９０クローンおよびＡＣ０１１０００クローンの重複領域を示すものである。シロイヌナズナ属植物のＢｏｌＪｏｎのＰＣＲ産物（７４０ｂｐ）とのアラインメントが示されている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイコンのＰｇｉ−２対立遺伝子が欠失しキャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）のＰｇｉ−２遺伝子と組換えられたＲｆｏ回復遺伝子を有する、ダイコンの遺伝子が導入されており、「雌性稔性、高いＲｆｏ伝達率および高い生長力に特徴づけられる高い農学的価値を有する、オグラ型細胞質雄性不稔（ｃｍｓ）のための、セイヨウアブラナの二重低含量回復系統を作成する方法であり、以下の手順を含むものである方法。
ａ）欠失したダイコン遺伝子を挿入した春のセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）の二重低含量ｃｍｓ系統を、春のＤｒａｋｋａｒの二重低含量系統と交配して、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）の異型接合体の回復植物を形成し、
ｂ）減数分裂前に、手順a)で得られた異型接合体の回復植物に、ガンマ線照射を行い、
ｃ）前記手順ｂ）で得られた花の花粉を、ｃｍｓ二重低含量の春のＷｅｓｒｏｏｎａ系統と交配し、
ｄ）その後代の生長力と雌性稔性、およびｃｍｓ遺伝子の伝達率を試験し、
ｅ）後代系統の選抜を行う。
【請求項２】
手順ｂ）における照射量が６分間に６５グレイであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
手順ａ）の春のセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）の二重低含量ｃｍｓ系統がＲ２１１であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
手順ｄ）における試験が、ＰＧＩｏｌ、ＰＧＩＵＮＴ、ＰＧＩｉｎｔ、ＢｏｌＪｏｎおよびＣＰ４１８から選択された五つのマーカーの組み合わせによって行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ダイコンのＰｇｉ−２対立遺伝子が欠失しキャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）のＰｇｉ−２遺伝子と組換えられたＲｆｏ遺伝子が挿入されており、雌性稔性、高いＲｆｏ伝達率および高い生長力に特徴づけられる高い農学的価値を有する、オグラ（Ｏｇｕｒａ）型細胞質雄性不稔（ｃｍｓ）のための、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）の二重低含量回復系統。
【請求項６】
ＰＧＩｏｌ、ＰＧＩＵＮＴ、ＰＧＩｉｎｔ、ＢｏｌＪｏｎおよびＣＰ４１８から選択された五つのマーカー独自の組み合わせを有していることを特徴とする、請求項５に記載のセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）の二重低含量回復系統。
【請求項７】
以下の手順によって得られる、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）雑種植物およびその後代。
ａ）請求項１に従って作成された、同型接合体となるように育種された回復系統を準備し、
ｂ）雑種を作成するフィールドにおいて、前記回復系統を花粉提供植物体として用い、
ｃ）雑種を作成するフィールドにおいて、ｃｍｓ植物を雑種種子作成植物体として用い、そして
ｄ）雄性不稔植物体から、雑種種子を得る。
【請求項８】
請求項１から得られるアブラナ属系統から得られることを特徴とする、アブラナ属植物の種子。
【請求項９】
請求項７で得られる、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）の種子。
【請求項１０】
英国の２３，Ｓｔ Ｍａｃｈａｒ Ｄｒｉｖｅ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＡＢ２４３ ＲＹに所在の、ＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄ社に２００３年７月４日付けで参照番号ＮＣＩＭＢ４１１８３で寄託された、請求項１および２から得られたセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）の種子。
【請求項１１】
ダイコンのＰｇｉ−２対立遺伝子が欠失しキャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）のＰｇｉ−２遺伝子と組換えられたＲｆｏ遺伝子が挿入されており、雌性稔性、高いＲｆｏ伝達率および高い生長力に特徴づけられる高い農学的価値を有する、オグラ（ｏｇｕｒａ）型ｃｍｓのための、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）の組換え回復系統を解析するための、ＰＧＩｏｌ、ＰＧＩｉｎｔ、ＢｏｌＪｏｎおよびＣＰ４１８の少なくとも四つのマーカーの組み合わせ、あるいは、それらの少なくとも一つの多型部位を含むいずれかの部位の使用方法。
【請求項１２】
組み合わせが、ＰＧＩｏｌ、ＰＧＩＵＮＴ、ＰＧＩｉｎｔ、ＢｏｌＪｏｎおよびＣＰ４１８の五つのマーカーからなるものであることを特徴とする、請求項１１に記載の用法。
【請求項１３】
‐マーカーＰＧＩｏｌがプライマーＰＧＩｏｌＵおよびＰＧＩｏｌＬを用いて増幅され、
（ＰＧＩｏｌＵ：５’ＴＣＡＴＴＴＧＡＴＴＧＴＴＧＣＧＣＣＴＧ３’；
ＰＧＩｏｌＬ：５’ＴＧＴＡＣＡＴＣＡＧＡＣＣＣＧＧＴＡＧＡＡＡＡ３’）
‐マーカーＰＧＩｉｎｔがプライマーＰＧＩｉｎｔＵおよびＰＧＩｉｎｔＬを用いて増幅され、
（ＰＧＩｉｎｔＵ：５’ＣＡＧＣＡＣＴＡＡＴＣＴＴＧＣＧＧＴＡＴＧ３’；
ＰＧＩｉｎｔＬ：５’ＣＡＡＴＡＡＣＣＣＴＡＡＡＡＧＣＡＣＣＴＧ３’）
‐マーカーＰＧＩＵＮＴがプライマーＰＧＩｏｌＵおよびＰＧＩｉｎｔＬを用いて増幅され、
（ＰＧＩｏｌＵ：５’ＴＣＡＴＴＴＧＡＴＴＧＴＴＧＣＧＣＣＴＧ３’；
ＰＧＩｉｎｔＬ：５’ＣＡＡＴＡＡＣＣＣＴＡＡＡＡＧＣＡＣＣＴＧ３’）
‐マーカーＢｏｌＪｏｎがプライマーＢｏｌＪｏｎＵおよびＢｏｌＪｏｎＬを用いて増幅され、
（ＢｏｌＪｏｎＵ：５’ＧＡＴＣＣＧＡＴＴＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＴＧ３’；
ＢｏｌＪｏｎＬ：５’ＧＣＣＴＡＣＴＣＣＴＣＡＡＡＴＣＡＣＴＣＴ３’）
‐マーカーＣＰ４１８がプライマーＳＧ１２９ＵおよびｐＣＰ４１８Ｌを用いて増幅される
（ＳＧ１２９Ｕ：ｃｆ Ｇｉｎａｃｏｌａ ｅｔ ａｌ （５）；
ｐＣＰ４１８Ｌ：５’ＡＡＴＴＴＣＴＣＣＡＴＣＡＣＡＡＧＧＡＣＣ３’）
ことを特徴とする、請求項１２に記載の用法。
【請求項１４】
以下の配列を有するＰＧＩｏｌマーカー：
【表１】
【請求項１５】
以下の配列を有するＰＧＩＵＮＴマーカー：
【表２】
【請求項１６】
以下の配列を有するＰＧＩｉｎｔマーカー：
【表３】
【請求項１７】
以下の配列を有するＢｏｌＪｏｎマーカー：
【表４】
【請求項１８】
以下の配列を有するＣＰ４１８マーカー：
【表５】
【請求項１】
ダイコンのＰｇｉ−２対立遺伝子が欠失しキャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）のＰｇｉ−２遺伝子と組換えられたＲｆｏ回復遺伝子を有する、ダイコンの遺伝子が導入されており、「雌性稔性、高いＲｆｏ伝達率および高い生長力に特徴づけられる高い農学的価値を有する、オグラ型細胞質雄性不稔（ｃｍｓ）のための、セイヨウアブラナの二重低含量回復系統を作成する方法であり、以下の手順を含むものである方法。
ａ）欠失したダイコン遺伝子を挿入した春のセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）の二重低含量ｃｍｓ系統を、春のＤｒａｋｋａｒの二重低含量系統と交配して、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）の異型接合体の回復植物を形成し、
ｂ）減数分裂前に、手順a)で得られた異型接合体の回復植物に、ガンマ線照射を行い、
ｃ）前記手順ｂ）で得られた花の花粉を、ｃｍｓ二重低含量の春のＷｅｓｒｏｏｎａ系統と交配し、
ｄ）その後代の生長力と雌性稔性、およびｃｍｓ遺伝子の伝達率を試験し、
ｅ）後代系統の選抜を行う。
【請求項２】
手順ｂ）における照射量が６分間に６５グレイであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
手順ａ）の春のセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）の二重低含量ｃｍｓ系統がＲ２１１であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
手順ｄ）における試験が、ＰＧＩｏｌ、ＰＧＩＵＮＴ、ＰＧＩｉｎｔ、ＢｏｌＪｏｎおよびＣＰ４１８から選択された五つのマーカーの組み合わせによって行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ダイコンのＰｇｉ−２対立遺伝子が欠失しキャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）のＰｇｉ−２遺伝子と組換えられたＲｆｏ遺伝子が挿入されており、雌性稔性、高いＲｆｏ伝達率および高い生長力に特徴づけられる高い農学的価値を有する、オグラ（Ｏｇｕｒａ）型細胞質雄性不稔（ｃｍｓ）のための、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）の二重低含量回復系統。
【請求項６】
ＰＧＩｏｌ、ＰＧＩＵＮＴ、ＰＧＩｉｎｔ、ＢｏｌＪｏｎおよびＣＰ４１８から選択された五つのマーカー独自の組み合わせを有していることを特徴とする、請求項５に記載のセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）の二重低含量回復系統。
【請求項７】
以下の手順によって得られる、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）雑種植物およびその後代。
ａ）請求項１に従って作成された、同型接合体となるように育種された回復系統を準備し、
ｂ）雑種を作成するフィールドにおいて、前記回復系統を花粉提供植物体として用い、
ｃ）雑種を作成するフィールドにおいて、ｃｍｓ植物を雑種種子作成植物体として用い、そして
ｄ）雄性不稔植物体から、雑種種子を得る。
【請求項８】
請求項１から得られるアブラナ属系統から得られることを特徴とする、アブラナ属植物の種子。
【請求項９】
請求項７で得られる、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）の種子。
【請求項１０】
英国の２３，Ｓｔ Ｍａｃｈａｒ Ｄｒｉｖｅ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＡＢ２４３ ＲＹに所在の、ＮＣＩＭＢ Ｌｉｍｉｔｅｄ社に２００３年７月４日付けで参照番号ＮＣＩＭＢ４１１８３で寄託された、請求項１および２から得られたセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）の種子。
【請求項１１】
ダイコンのＰｇｉ−２対立遺伝子が欠失しキャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）のＰｇｉ−２遺伝子と組換えられたＲｆｏ遺伝子が挿入されており、雌性稔性、高いＲｆｏ伝達率および高い生長力に特徴づけられる高い農学的価値を有する、オグラ（ｏｇｕｒａ）型ｃｍｓのための、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）の組換え回復系統を解析するための、ＰＧＩｏｌ、ＰＧＩｉｎｔ、ＢｏｌＪｏｎおよびＣＰ４１８の少なくとも四つのマーカーの組み合わせ、あるいは、それらの少なくとも一つの多型部位を含むいずれかの部位の使用方法。
【請求項１２】
組み合わせが、ＰＧＩｏｌ、ＰＧＩＵＮＴ、ＰＧＩｉｎｔ、ＢｏｌＪｏｎおよびＣＰ４１８の五つのマーカーからなるものであることを特徴とする、請求項１１に記載の用法。
【請求項１３】
‐マーカーＰＧＩｏｌがプライマーＰＧＩｏｌＵおよびＰＧＩｏｌＬを用いて増幅され、
（ＰＧＩｏｌＵ：５’ＴＣＡＴＴＴＧＡＴＴＧＴＴＧＣＧＣＣＴＧ３’；
ＰＧＩｏｌＬ：５’ＴＧＴＡＣＡＴＣＡＧＡＣＣＣＧＧＴＡＧＡＡＡＡ３’）
‐マーカーＰＧＩｉｎｔがプライマーＰＧＩｉｎｔＵおよびＰＧＩｉｎｔＬを用いて増幅され、
（ＰＧＩｉｎｔＵ：５’ＣＡＧＣＡＣＴＡＡＴＣＴＴＧＣＧＧＴＡＴＧ３’；
ＰＧＩｉｎｔＬ：５’ＣＡＡＴＡＡＣＣＣＴＡＡＡＡＧＣＡＣＣＴＧ３’）
‐マーカーＰＧＩＵＮＴがプライマーＰＧＩｏｌＵおよびＰＧＩｉｎｔＬを用いて増幅され、
（ＰＧＩｏｌＵ：５’ＴＣＡＴＴＴＧＡＴＴＧＴＴＧＣＧＣＣＴＧ３’；
ＰＧＩｉｎｔＬ：５’ＣＡＡＴＡＡＣＣＣＴＡＡＡＡＧＣＡＣＣＴＧ３’）
‐マーカーＢｏｌＪｏｎがプライマーＢｏｌＪｏｎＵおよびＢｏｌＪｏｎＬを用いて増幅され、
（ＢｏｌＪｏｎＵ：５’ＧＡＴＣＣＧＡＴＴＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＴＧ３’；
ＢｏｌＪｏｎＬ：５’ＧＣＣＴＡＣＴＣＣＴＣＡＡＡＴＣＡＣＴＣＴ３’）
‐マーカーＣＰ４１８がプライマーＳＧ１２９ＵおよびｐＣＰ４１８Ｌを用いて増幅される
（ＳＧ１２９Ｕ：ｃｆ Ｇｉｎａｃｏｌａ ｅｔ ａｌ （５）；
ｐＣＰ４１８Ｌ：５’ＡＡＴＴＴＣＴＣＣＡＴＣＡＣＡＡＧＧＡＣＣ３’）
ことを特徴とする、請求項１２に記載の用法。
【請求項１４】
以下の配列を有するＰＧＩｏｌマーカー：
【表１】
【請求項１５】
以下の配列を有するＰＧＩＵＮＴマーカー：
【表２】
【請求項１６】
以下の配列を有するＰＧＩｉｎｔマーカー：
【表３】
【請求項１７】
以下の配列を有するＢｏｌＪｏｎマーカー：
【表４】
【請求項１８】
以下の配列を有するＣＰ４１８マーカー：
【表５】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１６】
【図１７ａ】
【図１７ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１６】
【図１７ａ】
【図１７ｂ】
【公表番号】特表２００８−５０４８０１（Ｐ２００８−５０４８０１Ａ）
【公表日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１６６０８（Ｐ２００６−５１６６０８）
【出願日】平成１６年７月５日（２００４．７．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００２４９１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００２３２４
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５０３２２５６２９）アンスティテュ ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシュ アグロノミック (3)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＡＧＲＯＮＯＭＩＱＵＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年２月２１日（２００８．２．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月５日（２００４．７．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／００２４９１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００２３２４
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５０３２２５６２９）アンスティテュ ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシュ アグロノミック (3)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＡＧＲＯＮＯＭＩＱＵＥ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]