運動ニューロン栄養因子の遺伝子配列
本発明は、哺乳動物のニューロンの生存、成長、増殖または維持を促進する運動ニューロン栄養因子をコードする配列に関連した核酸、その配列によってコードされるポリペプチドおよびその配列を検出するためのアッセイに関する。また、具体的には、本発明は、配列番号１を含む配列；配列番号２を含む配列；ならびに配列番号の相補体および配列番号２の相補体からなる群より選択される、単離されたＭＮＴＦ関連ポリヌクレオチドを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００３年１１月７日に提出した米国仮出願番号６０／５１８，５８１（それら全てを本明細書において参考として援用する）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、ニューロンの成長、維持、生存、および選択された集団の機能的能力を促進する特殊なタンパク質グループをコードするヒト遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ニューロン栄養因子（Ｎｅｕｒｏｎｏｔｒｏｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）（ＮＴＦ）は、ニューロンの生存、成長、維持、およびニューロンの選択された集団の機能的能力を促進する機能がある特殊なグループのタンパク質である。近年の研究において、脊椎動物の神経系の神経細胞死は成長と発生のある期間の間に生じることが証明された。しかしながら、関連する標的組織からの可溶性ニューロン栄養因子の増加は、この神経細胞死の現象を軽減する役目を果たす。次の引用はニューロン栄養因子について議論したものであり、それらの開示を本明細書において参考として援用する：非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；および非特許文献６。
【０００４】
脊椎動物の神経筋系において、胚性運動ニューロンの生存は、その関連した発生している骨格筋から生じる特定の栄養性物質に依存していることが見出されていた。骨格筋は、胚性運動ニューロンを分解および後に生じる自然細胞死から防ぐことにより、運動ニューロンの生存および発生の機能を高める能力がある物質を生成することがインビボおよびインビトロの両方の研究によって示されている。非特許文献７；非特許文献８（それらの開示を本明細書において参考として援用する）を参照のこと。同様に、ヒナおよびラットの骨格筋は、インビボとインビトロの両方において、胚性運動ニューロンの自然細胞死を防ぐことができる特定の栄養因子を持っていることが、数名の研究者により報告された。非特許文献９；非特許文献１０；および非特許文献１１（それらの開示を本明細書において参考として援用する）を参照のこと。
【０００５】
加えて、ポリペプチドがラットの骨格筋から単離され、このポリペプチドはインビボで胚性のヒナ運動ニューロンの生存、同様にこれらの運動ニューロン内でのコリンアセチルトランスフェラーゼの活性を選択的に高めることが見出された。このポリペプチドは、コリンアセチルトランスフェラーゼ発生因子（Ｃｈｏｌｉｎｅ Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｆａｃｔｏｒ）（ＣＤＦ）と命名されており、その生物学的機能は、他の栄養因子、例えば神経成長因子（ＮＧＦ）、毛様体神経節神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、および網膜神経節神経栄養因子（ＲＧＮＴＦ）とは異なっていることが証明された。非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５（それらの開示を本明細書において参考として援用する）を参照のこと。
【０００６】
ラットの筋組織由来の３５ｋＤおよび２２ｋＤの見かけの分子量をもつ２つの運動ニューロン栄養因子（ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）の単離と特定が報告されていた。非特許文献１６を参照のこと。その３５ｋＤのタンパク質は、運動ニューロン栄養因子１（ＭＮＴＦ１）として定義され、その見かけの２２ｋＤのタンパク質は運動ニューロン栄養因子２（ＭＮＴＦ２）として定義された。これら２つの栄養因子は、単離された前角運動ニューロンとラット腰椎脊髄の脊髄外植片の両方の成長および／または再生を支援することがインビトロで証明された。
【０００７】
次いで、その２つの栄養因子（ＭＮＴＦ１とＭＮＴＦ２）のクローニングおよびヒト網膜芽細胞腫ｃＤＮＡライブラリーからのヒトＭＮＴＦ１遺伝子断片のクローニングが報告された。特許文献１を参照のこと。ヒトＭＮＴＦ１ ｃＤＮＡ断片は発現ベクターへサブクローニングされ、発現した融合タンパク質に含まれるＭＮＴＦ１ポリペプチド断片は、インビトロにおけるラット前角運動ニューロンの成長を支援するという点で、「天然の」ＭＮＴＦ１タンパク質の生物学的活性とよく似た活性を示した。
【０００８】
ＭＮＴＦ１の様々な生物学的側面が決定されＭＮＴＦ活性があるペプチドをコードしているｃＤＮＡ断片が報告されてきたが、ヒトＭＮＴＦ１の全長ｃＤＮＡは開示されていなかった。したがって、依然としてさらなるＭＮＴＦ ｃＤＮＡの配列（これはＭＮＴＦ遺伝子をヒト染色体ＤＮＡの特定の領域内にマッピングするために使用され得る）
を決定する必要性がある。
【特許文献１】米国特許第６，３０９，８７７号明細書
【非特許文献１】Ｃｈａｕ，Ｒ．Ｍ．Ｗら，「Ｎｅｕｒｏｎｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ，６」，Ｃｈｉｎ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏａｎａｔｏｍｙ，１２９，１９９０年
【非特許文献２】Ｋｕｎｏ，Ｍ．，「Ｔａｒｇｅｔ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎａｌ Ｓｕｖｉｖａｌ」，Ｔｈｅ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ，９，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．１５５，１９９０年
【非特許文献３】Ｂａｒｄ，Ｙ．Ａ．，「Ｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｓｕｖｉｖａｌ」，２，Ｎｅｕｒｏｎ，１５２５，１９８９年
【非特許文献４】Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｒ．Ｗ．，「Ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎ Ｄｅａｔｈ」，１２，ＴＩＮＳ，２５２，１９８９年
【非特許文献５】Ｂａｒｄ，Ｙ．Ａ．，「Ｗｈａｔ，Ｉｆ Ａｎｙｔｈｉｎｇ，ｉｓ ａ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ？」，１１，ＴＩＮＳ，３４３，１９８８年
【非特許文献６】Ｔｈｏｅｎｅｎ，Ｈ．，およびＥｄｇａｒ，Ｄ．，「Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ」，２２９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８，１９８５年
【非特許文献７】Ｏ’Ｂｒｉａｎ，Ｒ．Ｊ．およびＦｉｓｃｈｂａｃｈ，Ｇ．Ｄ．，「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｃｈｉｃｋ Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ」，６，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３２６５，１９８６年
【非特許文献８】Ｈｏｌｌｙｄａｙ，Ｍ．およびＨａｍｂｕｒｇｅｒ，Ｖ．，「Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ Ｌｏｓｓ ｂｙ Ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ」，１７０，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．３１１，１９７６年
【非特許文献９】ＭｃＭａｎａｍａｎ，Ｊ．Ｌら、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｗｈｉｃｈ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ Ｃｈｏｌｉｎｅ Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｎｅｕｒｏｎｓ」，２６３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５８９０，１９８８年
【非特許文献１０】Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｒ．Ｗら，「Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎ Ｄｅａｔｈ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ｂｙ ａ Ｔａｒｇｅｔ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ」，２４０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，９１９，１９８８年
【非特許文献１１】Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｇら，「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ」，６，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４３９，１９８６年
【非特許文献１２】Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ，Ｒ．，「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ」，５，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３４１，１９８２年
【非特許文献１３】Ｖａｒｏｎ，Ｓら，「Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ」，Ｉｎ：Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４７：Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｗａｘｍａｎ，Ｓ．Ｇ．（ｅｄ．），Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．４９３−５２１，１９８８年
【非特許文献１４】Ｂａｒｄｅ，Ｙ．Ａ．，「Ｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ」，２，Ｎｅｕｒｏｎ，１５２５，１９８９年
【非特許文献１５】Ｃｈａｕ，Ｒ．Ｍ．Ｗら，「Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ ３０ｋＤ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｔｅｃｔａｌ Ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｒａｔ ｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ」，３４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ，Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ，９０８，１９９１年
【非特許文献１６】Ｃｈａｕ，Ｒ．Ｍ．Ｗら，「Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｕｒｏｎｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ Ａｎｔｅｒｉｏｒ Ｈｏｒｎ Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ ｏｆ Ｒａｔ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ」，Ｉｎ：Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５，Ｐｅｅｔｅｒｓ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ，ｐｐ．８９−９４，１９９２年
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、運動ニューロン栄養因子（特にＭＮＴＦ１関連ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列（それは染色体１６ｑ２２内にマッピングされている）を提示し、同じ上流調節配列（すなわち、ＭＮＴＦ１のプロモーターおよび／または転写開始点配列）を持つＭＮＴＦ関連ポリペプチドも提示する。本発明はまた新規のＤＮＡ配列も提示する。その新規ＤＮＡ配列は、様々なオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡを含み、少なくとも１つの運動ニューロン栄養因子、ＭＮＴＦ遺伝子と一致するヒト染色体ＤＮＡ、これらの新規ＤＮＡ配列を含むベクター、これらの新規ＤＮＡ配列を含む発現系および関連宿主、合成ＭＮＴＦペプチドおよび前述の発現系によって生成された新規組み換えヒトＭＮＴＦ１タンパク質を含む。本発明のさらなる側面として、ハイブリッド形成処置に用いるＭＮＴＦ関連プライマーおよびプローブ、ならびにそのようなアッセイに用いる構成物、キットおよびパネルも含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、栄養および刺激効果を運動ニューロンにおいて働かせるための能力をもつニューロン栄養因子ファミリー、ならびにニューロン栄養因子をコードする遺伝子に関連する。単離された因子、組換え因子および化学的に合成されたポリペプチド因子は運動ニューロンの生存能力の継続および軸策突起の伸長を誘導できることが証明された。例えば、米国特許第６，３０９，８７７号及び２００３年１月２１日出願の国際ＰＣＴ特許出願、「ＭＮＴＦ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｕｓｅ」（米国仮出願番号６０／４４１，７７２号（２００３年１月２１日出願の利益を主張する）（それら全てを本明細書において参考として援用する）を参照のこと。それゆえに、これらの因子は「運動ニューロン栄養因子（ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）」または「ＭＮＴＦ」として分類した。さらにＭＮＴＦは抗瘢痕効果および抗炎症効果を示し、さらに神経障害、神経障害性の疼痛、糖尿病性神経障害および糖尿病性神経障害性の疼痛の処置で適用されている。本発明は、ヒトの脳組織、下垂体組織および胎盤組織の供給源から単離される新しいｃＤＮＡ配列、およびヒト１６番染色体に由来する対応するＤＮＡ配列を含む。
【００１１】
便宜上、ＭＮＴＦ１をコードしている配列および／またはＭＮＴＦ１遺伝子全長（その配列は１６番染色体上に位置する（配列番号２））を含む核酸の付加的な隣接する核酸配列は、ＭＮＴＦ関連核酸、ＭＮＴＦ関連ポリヌクレオチド、またはＭＮＴＦ関連オリゴヌクレオチドとして本明細書において言及された。同様に、ＭＮＴＦ１遺伝子全長内で見出されるオープンリーディングフレームによってコードされている他のポリペプチドは、ＭＮＴＦ関連タンパク質、ＭＮＴＦ関連ポリペプチドまたはＭＮＴＦ関連ペプチドとして本明細書において言及された。
【００１２】
（Ｉ．ＭＮＴＦ１ 生物学的活性）
ＭＮＴＦは、ラットとヒト両方の供給源から単離され、それらの生物学的活性は、インビボおよびインビトロの両方で試験された。例えば、それらの潜在的な生物学的活性は、外科的な軸索切断した動物および遺伝病に罹患した動物の両方で試験した。米国特許第６，３０９，８７７号を参照のこと。
【００１３】
さらに近年、合成ＭＮＴＦが抹消神経の再生を強めることを示したインビボでの研究において、ＭＮＴＦの栄養効果を確認した。ラット坐骨神経内の８ｍｍの囲まれた裂孔内に、ＭＮＴＦを含む９０％ビトロジェン（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を満たした。そのＭＮＴＦ濃度（モル希釈）と、１ヶ月で、Ｆｌｕｏｒｏ Ｇｏｌｄにより遠位断端から標識される裂孔を横断する得られた運動ニューロンの数は、生理食塩水コントロール、５４０；１０−７Ｍ、６７８；１０−６Ｍ、７６５；１０−５Ｍ、８７３；１０−４Ｍ、１１１１；１０−３Ｍ、１１３０であった。
【００１４】
さらに、ＭＮＴＦの刺激効果もまたインビボでの最近の研究で確認した。それから、１０−４Ｍの最適濃度のＭＮＴＦ中に、または生理食塩水中に３週間、横断および縫合されたラットの大腿神経を浸した。大腿筋及び皮枝を２重標識することによって再生を評価した（Ｂｒｕｓｈａｒｔ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２２（１４）：６６３１−６６３８、２００２（方法論について、本明細書において参考として援用される）を参照のこと）。生理食塩水での処理後、平均１００の運動ニューロンが正確に筋肉に突き出し、平均８７の運動ニューロンが不正確に皮膚に突き出し、平均５１の運動ニューロンが二重標識された。ＭＮＴＦ処理後、正確に筋肉に尽きだしている運動ニューロンの平均数は、１７３（ｐ＝０．０００８）に増加し、平均５９の運動ニューロンが皮膚に突き出し、４７の運動ニューロンが２重標識された。ＭＮＴＦは、感覚ニューロンへの突出のパターンに、有意な影響はなかった。
【００１５】
（ＩＩ．ＭＮＴＦ遺伝子の配列の発現とクローニング）
運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）は、もとは、網膜芽細胞腫ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、３週齢のラットからの筋肉抽出物に対する抗体でスクリーニングを行うことにより、３３アミノ酸のペプチドとして単離された（米国特許第６，３０９，８７７号（本明細書において参考として援用する））。そのＭＮＴＦ遺伝子９２７ｂｐ断片をクローニングし、その核酸配列を決定した（米国特許第６，３０９，８７７号で配列号番号２として開示される）。
【００１６】
図１は、ＭＮＴＦをコードする配列を含むｍＲＮＡが、胎児の胸腺、下垂体、肝臓、腎臓、および８〜９週の胎盤において強く発現し、胎児筋での発現は弱いことを示す。わずかな発現が成体の筋肉に見られる。
【００１７】
さらなるクローニング実験および配列決定実験により、次に述べるようなＭＮＴＦ配列の改善をもたらした。
【００１８】
脳ｃＤＮＡの部分配列は、９２７ｂｐ断片の出発点から上流にさらなる配列（配列番号１の核酸残基１〜５８２）を含んだ。
【００１９】
約１．８ｋｂの比較的豊富なｃＤＮＡを下垂体組織から単離した。その配列を標準的なＰＣＲとＲＡＣＥによって増幅し、得られた１８５９ｂｐのｃＤＮＡ配列を決定した（配列番号１を参照のこと）。配列番号１は、９２７ｂｐ断片の出発点から上流の脳ｃＤＮＡの部分配列と同一である５’配列を含む。さらに配列番号１は、その９２７ｂｐ断片の配列１〜２３６と完全同一の部分を含む（配列番号１の核酸残基５８３〜７５７）。しかし、表１にまとめたように、配列番号１は、９２７ｂｐ断片からの多くのバリエーションを含む。
【００２０】
【表１】
したがって、配列番号１の核酸残基７５８〜１４７３とはじめに開示された９２７ｂｐ配列の対応する領域には、正確に適合しない。さらに、ＭＮＴＦ転写物のさらに下流の残基の配列（すなわち、配列番号１の残基番号１４７４〜１８５９）は、これまで開示されていなかった。
【００２１】
ｃＤＮＡライブラリー（標準化したヒト胎盤から調製された）を、別の組織源からの別のＭＮＴＦ ｃＤＮＡの、単離と配列決定にも利用した。その胎盤のｃＤＮＡ配列は、配列番号１の配列と一致する。
【００２２】
したがって、本発明は、ＭＮＴＦをコードする核酸そして／またはＭＮＴＦ関連核酸（すなわち、配列番号１、配列番号１の相補配列およびその一部または断片）の配列情報の向上をもたらした。さらに、好ましい実施形態は、以前に開示された９２７ｂｐ断片の一部と厳密には一致しない配列番号１の一部（配列番号１の核酸残基７５８〜１４７３以外）を含む。
【００２３】
（ＩＩＩ．染色体ＤＮＡ上のＭＮＴＦ遺伝子配列）
ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を対応する配列番号１の配列と比較するため、配列の包括的なアライメントは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ワールドワイドウェブ ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ上）を通して公に入手可能なＢＬＡＳＴプログラムを用いて行い得る。包括的なアライメントを行う前に、配列番号１はＧｅｎＢａｎｋへ提出され得る。そのＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎが提供するデフォルトパラメーターは包括的なアライメントに用いられ得る。
【００２４】
データベース（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖまたはｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）を用いたＤＮＡ解析は、配列番号１を含む遺伝子が、１６番染色体（染色体バンド：１６ｑ２２）上に位置することを示す。その染色体バンドの跡は、分解能８００バンドで、ギムザ染色された染色体上で見られたバンドのおおよその位置を表す。Ｂａｒｂａｒａ Ｔｒａｓｋ，Ｖｉｖｉａｎ Ｃｈｅｕｎｇ，Ｎｏｒｍａ ＮｏｗａｋおよびＢＡＣ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍのその他の人々は、染色体上の大きなゲノムクローンについての細胞遺伝位置の決定に、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いた。
【００２５】
ＢＡＣ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍについてのさらなる情報については、「Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｌａｎｄｍａｒｋｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｄｒａｆｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ」Ｎａｔｕｒｅ，４０９：９５３〜９５８，Ｆｅｂ．２００１と同時にウェブサイト Ｈｕｍａｎ ＢＡＣ Ｒｅｓｏｕｒｃｅを参照のこと。
【００２６】
ＧｅｎＢａｎｋで、その座は、ＡＣ０９２３８３、アクセッション番号ＡＰ００１５８８、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ １６番染色体、クローンＲＰ１１−７８７Ｄ１１である。クローンＲＰ１１−７８７Ｄ１１内での配列番号１の位置は、８０２４４から８０７３０の間である。
【００２７】
そのＭＮＴＦの１８５９ｂｐ ｃＤＮＡ配列（配列番号１）は、ＮＩＮ２８３遺伝子（染色体１６ｑ２２の７４８１３５４８から７４９０７０２２に位置する（ＵＣＳＣ ｇｅｎｏｍｅ ｂｌａｔ使用））のイントロン内にマッピングされている。その１６番染色体上のＭＮＴＦ ｃＤＮＡ配列の前にあるあらゆる上流調節配列の位置を決定するため、染色体１６ｑ２２の７４８１３５４８から７４９０７０２２の領域内（ＵＣＳＣ ｇｅｎｏｍｅ ｂｌａｔ使用）の潜在的なプロモーターおよび／または転写開始部位を同定するため、コンピューター分析による理論上のモデリングを行った。
【００２８】
配列番号２は、１６番染色体からの４３５９ｂｐ配列（ＵＣＳＣ ｇｅｎｏｍｅ ｂｌａｔ使用して、７４８１８５９６から７４８１４２３８に対応）を示す。その配列は、ＭＮＴＦ ｃＤＮＡ配列から上流のゲノム配列を含み、そのｃＤＮＡ配列は、推定第１プロモーター部位（配列番号２の核酸残基８６２〜９１１）、推定第２プロモーター部位（配列番号２の核酸残基２３１５〜２３６４）、そして潜在的な転写開始配列（配列番号２の核酸残基２３５５〜２５０１）を含む。配列番号２はまたＭＮＴＦ ｃＤＮＡ（核酸残基２５０１〜４３５９）を含み、このｃＤＮＡは、ＭＮＴＦ活性を有することが公知の２１アミノ酸のペプチド（配列番号２９）をコードする領域（核酸残基３０５８〜３１２０）を含む。
【００２９】
図５は、下垂体組織からのＭＮＴＦ ｃＤＮＡと１６番染色体配列のアライメントを示す。そのＭＮＴＦ ｃＤＮＡ配列は、２箇所において１６番染色体配列とは異なった。図６は、ＤＮＡ配列決定により、１６番染色体上の配列と比較して、ｃＤＮＡ配列の２箇所でバリエーションがあることを示す。
【００３０】
したがって、本発明のさらなる実施形態は、配列番号２、配列番号２の相補的配列、および配列番号２の一部または断片を含む。好ましい断片は、少なくとも１つの推定プロモーターおよび／または潜在的な開始配列を含む。
【００３１】
（ＩＶ．ＭＮＴＦ関連ポリペプチド）
ｃＤＮＡ配列に由来する３つのリーディングフレームの解析により、そのＭＮＴＦ ｃＤＡＮ配列（配列番号１）内にいくつかのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在していることが示される。以下の表２に示したアミノ酸配列は、それぞれのリーディングフレーム中にコードされる推定ペプチド配列であり、その配列は、メチオニン（Ｍ）の開始コドン（ＡＴＧ）で始まり、終止コドンで終わる。
【００３２】
【表２】
配列番号２９は、米国特許第６，３０９，８７７号において配列番号４として開示される３３アミノ酸のうちの２１アミノ酸を含む。その２１アミノ酸は、ＭＮＴＦ活性をもつことが示された。興味深いことに、配列番号２９は、そのＭＮＴＦ ｍＲＮＡの第１オープンリーディングフレームにコードされていない。どの推定ペプチド残基の前にも明確なコザック（Ｋｏｚａｋ）配列はないようである。そのことは、ＭＮＴＦのコード配列の上流のさらなるＯＲＦの存在が、ＭＮＴＦおよび／またはＭＮＴＦ関連ポリペプチド発現に対する翻訳制御における代替メカニズムを提供し得ることを示唆する。
【００３３】
さらなる実施形態は、本明細書において開示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、生物学的活性のある哺乳動物のポリペプチド（例えば、インビトロで単離されるもの、インビトロで発現されるもの、または化学的に合成されるものを含む）と、哺乳動物のニューロンの生存、成長、増殖または維持および神経幹細胞のニューロンへの分化を促進するためにそのポリペプチドを用いる方法を含む。代替的実施形態において、本発明は、本明細書に開示される推定ペプチド配列の、少なくとも１０の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５の連続したアミノ酸残基、少なくとも２０の連続したアミノ酸残基、少なくとも２５の連続したアミノ酸残基、または少なくとも３０の連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドを包含する。
【００３４】
本発明の範囲内のＭＮＴＦ関連ポリペプチドはまた、異種タンパク質に結合された、配列番号１のオープンリーディングフレームを含む融合タンパク質であり得る。異種タンパク質には、ＭＮＴＦ関連ポリペプチドに実質的には類似していないアミノ酸配列を有する。その異種タンパク質は、そのＭＮＴＦ関連ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。融合タンパク質としては、酵素の融合タンパク質（例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ融合物、ポリ−Ｈｉｓ融合物、ＭＹＣ−タグ化融合物およびＩｇ融合物）が挙げられ得るが、これらに限定されない。そのような融合タンパク質（特にポリ−Ｈｉｓ融合物）は組換え型ＭＮＴＦ関連ポリペプチドの精製を容易にし得る。
【００３５】
融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。例えば、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２つの連結した遺伝子断片間で相補的な突出部を生じるアンカープライマーを用いて行い得る。その断片は、キメラ遺伝子配列を生成するためにアニーリングおよび再増幅され得る（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９２）。そのキメラ遺伝子は、適切な宿主細胞内で発現され得る。あるいは、ＭＮＴＦ関連ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を、既に異種タンパク質を含む市販の発現ベクターにクローニングし得る。その結果として、その異種タンパク質へインフレームで融合されたＭＮＴＦ関連タンパク質が生じる。
【００３６】
（Ｖ．発現ベクター）
本発明のもう１つのバージョンは、本明細書において記載されるオープンリーディングフレーム配列のうちの１以上をコードするＭＮＴＦ関連ポリペプチドを含むベクターを提供する。そのベクターは、核酸分子を維持するためのクローニングベクター、または発現ベクターであり得る。種々のクローニングベクターおよび発現ベクターは、当業者に周知である。例としては、プラスミドベクター、１本鎖もしくは２本鎖のファージベクター、１本鎖もしくは２本鎖のＤＮＡウイルスベクターもしくはＲＮＡウイルスベクター、または人工染色体（例えば、ＢＡＣおよびＹＡＣ）が挙げられる。発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結した、本明細書において記載されるＭＮＴＦ関連ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。種々の原核生物および真核生物の宿主細胞において転写および翻訳を制御するために適切なプロモーター、ターミネーターおよび他の調節領域は、当該分野で周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）。
【００３７】
本発明のさらに他のバージョンにおいて、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。その宿主細胞は、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母および他の心筋または細菌であり得る。様々な発現ベクターに適した宿主細胞は、当業者に周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）。
【００３８】
発現ベクターは、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、陽イオン脂質媒介性トランスフェクション、電気穿孔法、形質導入、リポフェクションのような技術、および当業者に周知の他の技術により、適切な宿主細胞へ導入され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）。
【００３９】
（ＶＩ．核酸の検出）
本明細書に開示される核酸配列は、ＭＮＴＦ関連タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの発現を指向することにおける用途に加えて、様々な他の用途がある。例えば、核酸ハイブリダイゼーションに伴う実施形態において、それらはプローブまたはプライマーとして有用である。したがって、発明の別の側面は、ＭＮＴＦタンパク質またはその誘導体をコードするヌクレオチド配列と患者の生物学的試料内のヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを検出することによって、ＭＮＴＦ関連転写物の発現を検出するための代替方法を含む。
【００４０】
ヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ（ハイブリダイゼーション条件下で、患者の生物学的試料由来の核酸を本発明のＭＮＴＦ関連ポリヌクレオチドへ接触させるという手段）を用いて、そのハイブリダイゼーション産物を検出する。その方法はＭＮＴＦ関連ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡを検出するために用いられ得る。ノザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ、またはＰＣＲおよびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）をアッセイの基礎として用い得る。これらの技術は、当業者に周知である。ＰＣＲおよびＬＣＲ技術は当該分野で広く利用し得る。例えば、その基礎的なＰＣＲ技術は、米国特許第４,６８３，２０２号、同第４,６８３，１９５号、同第４,８００，１５９号、および同第４,９６５，１８８に記載されている。その基礎的なＬＣＲ技術は、ＥＰＡ−３２０，３０８、ＥＰＡ−４３９，１８２、ＥＰＡ−３３６，７３１、ＷＯ８９／０９８３５、ＷＯ８９／１２６９６およびＷＯ９０／０１０６９に記載されている。
【００４１】
オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、好ましくは、比較されるＭＮＴＦ関連核酸配列の長さに沿って、相同性が少なくとも６０％で、少なくとも１０の連続したヌクレオチドまたは少なくとも３０の連続したヌクレオチドを含む。そのようなプローブ／プライマーの例およびＭＮＴＦ関連核酸を検出するためにＰＣＲを行う方法は、実施例１および実施例３に記載される。
【００４２】
したがって、本発明のヌクレオチド配列は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの相補的な範囲と選択的に二重鎖分子を形成する能力、または試料由来のＤＮＡもしくはＲＮＡの増幅のためプライマーを提供する能力のために用いられ得る。表３にはプローブまたはプライマーとして利用し得る多数の典型的なＭＮＴＦ関連核酸配列を表す（実施例１および実施例３に、さらに詳細に記載される）。
【００４３】
【表３】
想定される適用に依存して、標的配列に対するプローブまたはプライマーの様々な選択性の程度を達成するために、種々のハイブリダイゼーション条件を使用することが望まれる。
【００４４】
高い選択性を必要とする適用については、代表的には、ハイブリッドを形成するために、比較的高いストリンジェンシーの条件が使用され得る。例えば、約５０℃から７０℃の温度で、約０．０２Ｍから約０．１０Ｍ ＮａＣｌにより提供されるような比較的低い塩および／または高い温度の条件。そのような高ストリンジェンシー条件は、プローブまたはプライマーと、鋳型または標的鎖との間に、あるとしても、ほとんどミスマッチを許容せず、特定の遺伝子を単離するか、または特定のｍＲＮＡ転写物を検出するために特に適している。一般的には、さらにホルムアミドの量の増加により、条件をよりストリンジェントにし得ることが理解される。
【００４５】
別の適用、例えば、部位指向性変異誘発については、より低いストリンジェンシー条件が好ましいことが理解される。これらの条件下では、ハイブリダイズしようとしている鎖の配列が完全には相補的でなくても、ハイブリダイゼーションは生じうるが、１以上の位置にミスマッチがある。塩濃度の増加および／または温度の低下により、より低いストリンジェンシー条件にし得る。
【００４６】
特定の実施形態において、例えば、ハイブリダイゼーションを測定するための標識のような、適切な方法と組み合わせて、本発明の規定される核酸配列を使用することは有利である。検出能がある広範な種々のインジケーター手段が当該分野で公知であり、その手段としては、蛍光、放射性、酵素、または他のリガンド（例えば、アビジン／ビオチン）が挙げられる。
【００４７】
一般的に、本明細書に記載されるプローブまたはプライマーは、溶相ハイブリダイゼーションにおける試薬、ＰＣＲＴＭにおける試薬、一致する遺伝子の発現を検出するための試薬、ならびに固相を採用する実施形態における試薬として有用であることが予測される。固相を含む実施形態においては、その試験ＤＮＡまたはＲＮＡを、選択したマトリックスまたは表面に吸着するか、または別のやり方ではりつける。次いで、この固定した１本鎖の核酸を、望ましい条件下で選択されたプローブとのハイブリダイゼーションに供する。この特定の適用におけるハイブリダイゼーション条件の最適化は、当業者に周知である。非特異的に結合したプローブ分子を取り除くため、ハイブリダイズした分子を洗浄した後、ハイブリダイゼーションを、結合した標識の量を決定することにより、検出および／または定量する。
【００４８】
標準的な方法論（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に従って、増幅のため鋳型として使用される核酸は、細胞、組織、または他のサンプルから単離され得る。特定の実施形態において、その鋳型核酸を実質的に精製せずに、全細胞または組織のホモジネート、または生物学的液体のサンプルで解析を行う。その核酸は、ゲノムＤＮＡ、または分画したＲＮＡまたは全細胞ＲＮＡである。ＲＮＡを用いる場合、まず、ＲＮＡから相補的ＤＮＡへの転換が望まれ得る。
【００４９】
本明細書で用いられる用語「プライマー」は、鋳型依存のプロセスにおいて、新生核酸の合成を促進する能力のあるあらゆる核酸を包含することを意味する。代表的なプライマーは、長さが１０から２０および／または３０塩基対のオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列も使用されうる。
【００５０】
配列番号１または配列番号２の一部と一致する核酸へ選択的にハイブリダイズするように設計されたプライマー対は、選択的なハイブリダイゼーションを可能にする鋳型核酸と接触される。一旦、ハイブリダイズされると、鋳型−プライマー複合体は、鋳型依存の核酸合成を促進する１以上の酵素と接触される。複数回の増幅（サイクルともいわれる）を、十分な量の増幅産物が生成されるまで行う。
【００５１】
その増幅産物を、検出または定量する。特定の適用において、その検出は視覚的手段で行われ得る。あるいは、その検出は、化学発光、取り込まれた放射性標識を用いた放射性シンチグラフィー、または蛍光標識によるか、あるいは電気的および／または熱のインパルスシグナルを用いた系（Ａｆｆｙｍａｘ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｌｌｕｓ、１９９４年）による、その産物の間接的な検出方法を含み得る。
【００５２】
あらゆる増幅に続き、鋳型および／または過剰なプライマーから増幅産物を分離することが望ましい。ひとつの実施形態において、増幅産物は、標準的な方法を使用して、アガロース、アガロースアクリルアミド、またはポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）により分離される。核酸の分離は、当該分野で公知のクロマトグラフィー技術（例えば、吸着、分配、イオン交換、ヒドロキシアパタイト、分子ふるい、逆相、カラム、ペーパー、薄層およびガスクロマトグラフィー、ならびにＨＰＬＣ）によっても達成される。
【００５３】
（ＶＩＩ．アッセイキット、試薬およびパネル）
ヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイのためのアッセイキットも含まれる。このキットは、ＭＮＴＦ関連核酸またはそれらの誘導体に特異的なプローブおよび／またはプライマーを含む。そのキットはまた、サンプル調製試薬、洗浄試薬、検出試薬およびシグナル生成試薬を含む。
【実施例】
【００５４】
（実施例１）
どの組織がＭＮＴＦの最も高い発現を示すかを特定するために、多数の異なる組織源より得られたｃＤＮＡからＰＣＲ産物を増幅した。種々の組織由来の成体または胎児のｃＤＮＡパネルを注文し（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、染色体マッピング実験に基づいて遺伝子特異的プライマーを合成した（以下を参照）。
【００５５】
次のプライマーセットを使用した：
【００５６】
【化１】
予期されるＰＣＲ産物の長さは５４１塩基対であった。
【００５７】
Ａ．ＰＣＲプロトコル
１．マスターミックスＰＣＲ１×
３５μｌ 水
５μｌ １０×緩衝液
１．５μｌ ＭｇＣｌ２（５０ｍｍｏｌ)
１μｌ ｄＮＴＰ
１μｌ 各プライマー
２Ｕ Ｔａｑ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ポリメラーゼ酵素
５μｌ テンプレートＤＮＡ。
【００５８】
２．ＰＣＲ サイクリング
５分 ９５℃。
以下を３８サイクル：
３０秒 ９５℃
３０秒 ５３℃ アニーリング
４５秒 ７２℃ 伸長。
５分 ７２℃ 最終伸長。
【００５９】
Ｂ．結果
図１は、ＭＮＴＦの成体組織における発現が、当該発現が低かった脳と骨格筋を除いた全ての組織においてだいたい同じであったことを示している。図１を参照すると、プライマーを使用してＭＮＴＦ１の５４１ｂｐの産物を増幅し（上のパネル）、この産物をＧ３ＰＤＨハウスキーピング遺伝子発現により標準化した（下のパネル）。レーン内のサンプルは、両方のゲルで一貫している。左から右へ：レーン１、マーカー：レーン２、脳：レーン３、肺；レーン４、胸腺；レーン５、骨格筋；レーン６、腎臓；レーン７、心臓；レーン８、肝臓；レーン９、胎盤；そしてレーン１０、ネガティブＨ２Ｏコントロール。
【００６０】
図２は、ＭＮＴＦの胎児の組織における発現が、胸腺、腎臓、肝臓において最も高く、骨格筋では最も低かったことを示している。図２の上のパネルを参照すると、レーン１、マーカー：レーン２、脳：レーン３、肺；レーン４、胸腺；レーン５、骨格筋；レーン６、脾臓；レーン７、腎臓；レーン８、心臓；レーン９、肝臓；そしてレーン１０、ネガティブＨ２Ｏコントロール。
【００６１】
この実験は、胸腺、腎臓、肝臓組織において、胎児と成体両方のＭＮＴＦの発現が比較的高いレベルであることを決定した。
【００６２】
（実施例２）
総ＲＮＡを、次の組織：海馬、胎盤、脳（胎児の脳と成体の脳の両方）、網膜、下垂体、心臓、胎児筋からＲＩＳＯ ＲＮＡ単離法（Ｃａｔ＃０６−２００）（Ｇｅｎｅｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）によって抽出した。この方法は、ＲＮＡ分解の速度を遅延させるため、ＲＮａｓｅ、チオシアン酸グアニジン（ＧＴＣ）そしてベータ−メルカプトエタノールの公知の強力なインヒビターを併用する。この方法はまた、核タンパク質複合体を壊し、ＲＮＡを液体中に放出させ、そしてタンパク質夾雑物を含まずに単離させる。この最終総ＲＮＡを、酸性フェノールとクロロホルム抽出によって夾雑からさらに精製し、そしてイソプロパノール沈殿によって濃縮する。さらなる精製を、エタノール沈殿といかなる残存タンパク質も夾雑する塩を取り除くための洗浄によって行った。
【００６３】
この組織サンプルから抽出された総ＲＮＡの純度と量を、ゲル電気泳動によって決定し、Ａ２６０／Ａ２８０の比によって示した。１ｇの組織から約３．５ｍｇの総ＲＮＡを単離し；このＡ２６０／Ａ２８０の比は１．６５で、このＡ２６０／Ａ２３０の比は１．２０であった。
【００６４】
図３は異なるヒト組織のサンプル１０ｍｇから単離された総ＲＮＡの解析を示している。１．２％アガロースホルムアルデヒドゲルのレーン毎に、ＲＮＡを３ミクログラムずつ流した。レーン１〜６は、それぞれ下垂体、胎盤、脳、網膜、心臓、そして胎児筋からの総ＲＮＡを示す。レーンＭは０．２４〜９．７ｋｂＲＮＡラダーを示す。
【００６５】
ｃＤＮＡをＧｅｎｅｍｅｄ ｃＤＮＡ調製技術（係属中の特許）を用いてｍＲＮＡから調整した。このｍＲＮＡのいくつかは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）から購入した。ｍＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡにコピーすること、その後、ベクターライゲーションのために末端を調製することに関する酵素によって、代表的なｃＤＮＡライブラリーを構築した。第１鎖をニワトリ骨芽球症ウイルス逆転写酵素とランダムヘキサマープライマーにより合成した。第２鎖を、ＲＮａｓｅ ＨとＤＮＡポリメラーゼＩにより合成した。末端を平滑にするためにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理した後、２本鎖ｃＤＮＡ分子を、アダプターライゲーションによってクローニングするために調製した。
【００６６】
（実施例３）
配列決定のため、標準的ＤＮＡ精製キットを用いてＤＮＡの準備をした。Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）によって開発されたジデオキシ法を用いてＤＮＡ配列決定を行った。その方法は、ＤＮＡポリメラーゼが２’，３’−ジデオキシヌクレオチドを基質として組み込むことができることを利用する。ＤＮＡポリメラーゼにより伸長鎖へヌクレオチドを付加することによって、１本鎖鋳型ＤＮＡを複製した。鎖伸長は、プライマー（すなわち、その鋳型にアニールするオリゴヌクレオチド）が３’末端で生じる。鋳型への塩基対マッチングによって、伸長産物に付加されデオキシヌクレオチドが選択される。伸長産物は、プライマーの伸長末端である３’ヒドロキシル基と、結合してくるジデオキシヌクレオチドの５’リン酸基との間のホスホジエステル架橋の形成によって伸長する。伸長は５’から３’方向である。ＤＮＡポリメラーゼはまた、ヌクレオチド塩基のアナログを組み込み得る。伸長鎖の３’末端にジデオキシヌクレオチドアナログが組み込まれた時、鎖伸長は、その鎖の３’ヒドロキシル基の欠失によって、選択的にＡ、Ｃ、ＧまたはＴで終結する。
【００６７】
配列決定プロセスのために、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＡＢＩ ３７７シークエンサーを使用した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの自動蛍光配列決定法では、５’に色素標識されたプライマー（色素プライマー）または３’に色素標識されたジデオキシヌクレオチド三リン酸（色素ターミネーター）を用いて、蛍光色素標識をＤＮＡ伸長産物へと組み込む。ＤＮＡシークエンサーは、Ａの伸長反応、Ｃの伸長反応、Ｇの伸長反応、そしてＴの伸長反応を識別するために用いた４つの異なる色素からの蛍光を検出する。それぞれの色素は、アルゴンイオンレーザーによって励起されると異なる波長の光を発し、４つの塩基を示す４つの色がゲル内で検出および識別され得る。
【００６８】
(実施例３）
このＭＮＴＦ遺伝子の単離とスクリーニングのために、２つの異なる戦略（すなわち、標準的なＰＣＲと５’−ＲＡＣＥ）を用いた。
【００６９】
Ａ．標準的なＰＣＲ
その最初の戦略は、異なるプライマーセットを用いてこの遺伝子をスクリーニングすることである。その目的は、標的となるｃＤＮＡライブラリー中に全長ＭＮＴＦが存在しているかどうかを見つけることである。次のオリゴヌクレオチド配列は、ＭＮＴＦ配列の標準的なＰＣＲ増幅に用いるためのプライマー対の例である。
【００７０】
【化２】
標準的なＰＣＲ法を用いて、異なる組織から調製されたｃＤＮＡのスクリーニングを行った。海馬組織、胎児の脳組織、胎盤組織、網膜組織、下垂体組織、胎児筋の組織、または心臓組織からｃＤＮＡライブラリーを増幅するために、それぞれのプライマー対を用いた。
【００７１】
増幅条件は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＫＣｌ、３．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．８ｍＭ ｄＮＴＰ、ぞれぞれのプライマー１００ｐｍｏｌ、そしてＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ２．５ｕから成った。以下：９４℃、１分；５５℃、２分；７２℃、３分、を３５サイクル行った。
【００７２】
ＤＮＡ増幅産物を、電気泳動によって分離し、ＵＶ下で検出した。目に見えて増幅されたバンドがあったときは、そのバンドを低量の融解アガロースゲルで単離し、フェノール抽出し、エタノール沈殿させた。その増幅されたバンドをクローニングのために調製した。１つの部分的なＰＣＲ断片を単離し、その配列を決定した。１つの部分的なＤＮＡ配列（長さは約７００塩基対）（配列番号１の核酸残基１〜７１３と一致）を、脳組織から調製されたｃＤＮＡから増幅した。
【００７３】
Ｂ．５’−ＲＡＣＥ増幅
５’−ＲＡＣＥは、このＭＮＴＦ遺伝子の５’−末端を見出すために用いられる別の戦略である。５’ＲＡＣＥまたはアンカーＰＣＲは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）からのＭＮＴＦ ５’末端の単離および特徴づけを容易にする。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）のためのＲＡＣＥシステムを改変し、そのＭＮＴＦ ｃＤＮＡを得るために用いた。そのＲＡＣＥ手順を、このＭＮＴＦ ｍＲＮＡの規定した内側部分と３’末端または５’末端のどちらかの未知の配列との間の総ｍＲＮＡからｃＤＮＡ配列を増幅するために用いた。異なる組織からｍＲＮＡを単離後、第１鎖ｃＤＮＡの合成を遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてプライムする。これは、ＭＮＴＦ特異的ｍＲＮＡ（およびＭＮＴＦに関連したｍＲＮＡのファミリー）をｃＤＮＡに転換することを可能にし、メッセージの５’末端への完全な伸長のための可能性を最大限にする。ｃＤＮＡ合成の後、組み込まれなかったｄＮＴＰおよびＭＮＴＦプライマーから第１鎖産物を精製する。ｃＤＮＡの３’末端にホモポリマーテールを付加するために、ＴｄＴ（ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）を用いる。次いでネスト化（ｎｅｓｔｅｄ）遺伝子特異的プライマーと、相補的なホモポリマーを含むアンカープライマーとホモポリマーテールからの増幅を可能にする、対応するアダプタープライマーとの組合わせの混合物を用いたＰＣＲによって、その末端ｃＤＮＡを増幅する。これはＭＮＴＦ特異的プライマー配列とｍＲＮＡの５’末端との間の未知の配列の増幅を可能にする。
【００７４】
図４は、そのＲＡＣＥ手順から生成したＤＮＡ断片を示している。この反応に約０．１μｇのｍＲＮＡを用いた。図４に示したその結果は、１μｌのＲＡＣＥ反応を用いることにより得られた。その反応温度は９４℃で２分間；９４℃で５０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で３分間を３０サイクル；そして最後に７２℃で１０分間であった。図４のレーン１〜６はそれぞれ、下垂体、胎盤、脳（胎児の脳と成体の脳の両方）、網膜、心臓、ならびに胎児筋からの総ＲＮＡを示す。ＤＮＡ分子重量マーカーはＭと名称をつける。約１．８ｋｂの比較的大量のＲＡＣＥ産物が下垂体ＲＮＡから生成された。
【００７５】
ＲＡＣＥ手順を用いてＭＮＴＦ配列を増幅するためのプライマーとして次のオリゴヌクレオチド配列が、使用され得る。
【００７６】
【化３】
このＭＮＴＦ遺伝子に対するｃＤＮＡを、ＲＡＣＥによって下垂体組織から単離した。配列番号１に示した配列は、いくつかのＤＮＡシークエンシングランから構築した整理した。その配列はＭＮＴＦ ｍＲＮＡに対応する１８５９の連続した塩基を含んでいた（シークエンシングランごとの平均の長さは９１９塩基である）。
【００７７】
(実施例４）
標準化したヒト胎盤（８〜９週）から調製されたスーパースクリプトｃＤＮＡライブラリーを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カタログ番号ＳＬ．２ＮＢＨＰ８９Ｗを参照のこと）から購入した。５’−ｃＤＮＡ末端と３’−ｃＤＮＡ末端からのＭＮＴＦ遺伝子の増幅およびクローニングを容易にするために、ポリメラーゼ鎖反応に基づくＲＡＣＥ技術およびＲＡＣＥプロトコルを用いた。
【００７８】
ＭＮＴＦ ｃＤＮＡを、そのｃＤＮＡライブラリーから単離した。その５’−末端配列を５’−末端ＲＡＣＥを用いて同定し、その３’−末端配列を３’−末端ＲＡＣＥを用いて同定した。遺伝子を単離する方法を、ＤＮＡ ＲＡＣＥキットの手引書に従って行った。その行程の詳細は、製造会社：Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸによって説明されている。次いで、遺伝子の同一性確認のために、その単離された遺伝子を配列決定した。
【００７９】
ＭＮＴＦ ｃＤＮＡを、ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ ベクター）へサブクローニングした。５’−末端配列と３’−末端配列との両方の連結をＤＮＡ配列決定反応で確認した。
【００８０】
その胎盤ｃＤＮＡの全体のＤＮＡ配列は、下垂体からのＭＮＴＦ関連ｃＤＮＡと一致する（配列番号１)。
【００８１】
（実施例５）
ＮＩＮ２８３として同定された遺伝子もまた染色体１６ｑ２２上に位置する。ＮＩＮ２８３は神経損傷に反応して発現する（登録番号ＮＭ０３２２６８、４６３３ｂｐ ｍＲＮＡ配列）。ＮＩＮ２８３の公開された遺伝子配列は、染色体１６ｑ２２の７４８１２４６９から７４８１３５４７、それから７４９０７０２３から７４９０７１８８、７４９１８２３５から７５９１８３４０、７４９１９９３３から７４９００２２、そして７４９２１１８４から７４９２４４４５上に位置する。そのＭＮＴＦ １８５９ｂｐ ｃＤＮＡ配列は、染色体１６ｑ２２の７４８１４２３８から７４８１６０９６上に位置する（ＵＣＳＣ ｇｅｎｏｍｅ ｂｌａｔ使用）。この２つのヌクレオチド配列には、重複も一致もないが、そのＭＮＴＦ遺伝子配列はその第１断片（またはエキソン）と第２断片（またはエキソン）との間（ＮＩＮ２８３遺伝子のイントロン領域内）に位置する。
【００８２】
実際に、そのＭＮＴＦ遺伝子がＮＩＮ２８３と関係がなく、記載されていないスプライス型におけるＮＩＮ２８３のエキソンではないことを確実するために、骨格筋からのポリＡ（＋）ＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。３つのプライマーセットを作製した。１つめは、ＮＩＮ２８３の第１エキソン内の正方向プライマーおよびＭＮＴＦコーディング領域内の逆方向プライマー、そして２つめは、ＭＮＴＦコーディング領域内の正方向プライマーおよびＮＩＮ２８３の第４エキソン内の逆方向プライマーである。スプライス型がＮＩＮ２８３のエキソンとしてＭＮＴＦとともに存在した場合、ＰＣＲ産物を見出すことが予期される。しかしながら、意味のあるＰＣＲ産物はいかなるＰＣＲ反応においても生成されなかった。これらのＲＴ−ＰＣＲ反応の結果により、ＭＮＴＦとＮＩＮ２８３が関係しているという可能性は非常に低い。
【００８３】
本発明は、その特定の明らかに好ましい形態を参照してかなり詳細に記載されてきたが、他の形態も可能である。例えば、組織特異的および／または発生段階でのｍＲＮＡ転写で使用する転写開始部位のバリエーションは、他の人によって記載されている。それゆえに、ＭＮＴＦに関連するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの５’末端は、組織、細胞、発生段階ごとに位存して付加的な核酸残基、この核酸残基は配列番号２の選択された部分（例えば、推定の転写開始部位）をみ得る。加えて、ハイブリダイゼーションアッセイおよび／または増幅アッセイで使用される対応するＭＮＴＦ関連オリゴヌクレオチドは、本発明の局面に従って、そのようなバリエーションのさらに明確な発現プロフィールを提供する有用性を有する。それゆえに、本発明の趣旨および範囲は、添付の特許請求の範囲内において特徴付けられ、その中に含まれる好ましいバリエーションの記載に制限されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
本発明は、よりよく理解され、添付の図面を参照することによって、当業者によりその利点が認められ得る。
【図１】図１は、成体ヒトＭＴＣパネル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）内でのＭＮＴＦ１遺伝子の発現パターンを示す。
【図２】図２は、胎児ＭＴＣパネル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）内でのＭＮＴＦ１遺伝子の発現パターンを示す。
【図３】図３は、６つの異なるヒト組織、下垂体（レーン１）、胎盤（レーン２）、脳（レーン３）、網膜（レーン４）、心臓（レーン５）、胎児筋（レーン６）から単離した総ＲＮＡのアガロースゲル電気泳動による解析結果を示す。
【図４】図４は、下垂体（レーン１）、胎盤（レーン２）、胎児と成体の脳（レーン３）、網膜（レーン４）、心臓（レーン５）、および胎児筋（レーン４）からの総ＲＮＡを用いたＲＡＣＥ手順により生成されたＤＮＡ断片を示す。
【図５】図５は、下垂体組織由来のＭＮＴＦ ｃＤＮＡと１６番染色体配列とのアライメントを示す。
【図６】図６は、ＤＮＡ配列決定により、１６番染色体上の配列と比較してそのｃＤＮＡには２つの位置でバリエーションがあることを証明する。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００３年１１月７日に提出した米国仮出願番号６０／５１８，５８１（それら全てを本明細書において参考として援用する）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、ニューロンの成長、維持、生存、および選択された集団の機能的能力を促進する特殊なタンパク質グループをコードするヒト遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ニューロン栄養因子（Ｎｅｕｒｏｎｏｔｒｏｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）（ＮＴＦ）は、ニューロンの生存、成長、維持、およびニューロンの選択された集団の機能的能力を促進する機能がある特殊なグループのタンパク質である。近年の研究において、脊椎動物の神経系の神経細胞死は成長と発生のある期間の間に生じることが証明された。しかしながら、関連する標的組織からの可溶性ニューロン栄養因子の増加は、この神経細胞死の現象を軽減する役目を果たす。次の引用はニューロン栄養因子について議論したものであり、それらの開示を本明細書において参考として援用する：非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；および非特許文献６。
【０００４】
脊椎動物の神経筋系において、胚性運動ニューロンの生存は、その関連した発生している骨格筋から生じる特定の栄養性物質に依存していることが見出されていた。骨格筋は、胚性運動ニューロンを分解および後に生じる自然細胞死から防ぐことにより、運動ニューロンの生存および発生の機能を高める能力がある物質を生成することがインビボおよびインビトロの両方の研究によって示されている。非特許文献７；非特許文献８（それらの開示を本明細書において参考として援用する）を参照のこと。同様に、ヒナおよびラットの骨格筋は、インビボとインビトロの両方において、胚性運動ニューロンの自然細胞死を防ぐことができる特定の栄養因子を持っていることが、数名の研究者により報告された。非特許文献９；非特許文献１０；および非特許文献１１（それらの開示を本明細書において参考として援用する）を参照のこと。
【０００５】
加えて、ポリペプチドがラットの骨格筋から単離され、このポリペプチドはインビボで胚性のヒナ運動ニューロンの生存、同様にこれらの運動ニューロン内でのコリンアセチルトランスフェラーゼの活性を選択的に高めることが見出された。このポリペプチドは、コリンアセチルトランスフェラーゼ発生因子（Ｃｈｏｌｉｎｅ Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｆａｃｔｏｒ）（ＣＤＦ）と命名されており、その生物学的機能は、他の栄養因子、例えば神経成長因子（ＮＧＦ）、毛様体神経節神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、および網膜神経節神経栄養因子（ＲＧＮＴＦ）とは異なっていることが証明された。非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５（それらの開示を本明細書において参考として援用する）を参照のこと。
【０００６】
ラットの筋組織由来の３５ｋＤおよび２２ｋＤの見かけの分子量をもつ２つの運動ニューロン栄養因子（ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）の単離と特定が報告されていた。非特許文献１６を参照のこと。その３５ｋＤのタンパク質は、運動ニューロン栄養因子１（ＭＮＴＦ１）として定義され、その見かけの２２ｋＤのタンパク質は運動ニューロン栄養因子２（ＭＮＴＦ２）として定義された。これら２つの栄養因子は、単離された前角運動ニューロンとラット腰椎脊髄の脊髄外植片の両方の成長および／または再生を支援することがインビトロで証明された。
【０００７】
次いで、その２つの栄養因子（ＭＮＴＦ１とＭＮＴＦ２）のクローニングおよびヒト網膜芽細胞腫ｃＤＮＡライブラリーからのヒトＭＮＴＦ１遺伝子断片のクローニングが報告された。特許文献１を参照のこと。ヒトＭＮＴＦ１ ｃＤＮＡ断片は発現ベクターへサブクローニングされ、発現した融合タンパク質に含まれるＭＮＴＦ１ポリペプチド断片は、インビトロにおけるラット前角運動ニューロンの成長を支援するという点で、「天然の」ＭＮＴＦ１タンパク質の生物学的活性とよく似た活性を示した。
【０００８】
ＭＮＴＦ１の様々な生物学的側面が決定されＭＮＴＦ活性があるペプチドをコードしているｃＤＮＡ断片が報告されてきたが、ヒトＭＮＴＦ１の全長ｃＤＮＡは開示されていなかった。したがって、依然としてさらなるＭＮＴＦ ｃＤＮＡの配列（これはＭＮＴＦ遺伝子をヒト染色体ＤＮＡの特定の領域内にマッピングするために使用され得る）
を決定する必要性がある。
【特許文献１】米国特許第６，３０９，８７７号明細書
【非特許文献１】Ｃｈａｕ，Ｒ．Ｍ．Ｗら，「Ｎｅｕｒｏｎｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ，６」，Ｃｈｉｎ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏａｎａｔｏｍｙ，１２９，１９９０年
【非特許文献２】Ｋｕｎｏ，Ｍ．，「Ｔａｒｇｅｔ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎａｌ Ｓｕｖｉｖａｌ」，Ｔｈｅ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ，９，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．１５５，１９９０年
【非特許文献３】Ｂａｒｄ，Ｙ．Ａ．，「Ｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｓｕｖｉｖａｌ」，２，Ｎｅｕｒｏｎ，１５２５，１９８９年
【非特許文献４】Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｒ．Ｗ．，「Ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎ Ｄｅａｔｈ」，１２，ＴＩＮＳ，２５２，１９８９年
【非特許文献５】Ｂａｒｄ，Ｙ．Ａ．，「Ｗｈａｔ，Ｉｆ Ａｎｙｔｈｉｎｇ，ｉｓ ａ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ？」，１１，ＴＩＮＳ，３４３，１９８８年
【非特許文献６】Ｔｈｏｅｎｅｎ，Ｈ．，およびＥｄｇａｒ，Ｄ．，「Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ」，２２９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８，１９８５年
【非特許文献７】Ｏ’Ｂｒｉａｎ，Ｒ．Ｊ．およびＦｉｓｃｈｂａｃｈ，Ｇ．Ｄ．，「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｃｈｉｃｋ Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ」，６，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３２６５，１９８６年
【非特許文献８】Ｈｏｌｌｙｄａｙ，Ｍ．およびＨａｍｂｕｒｇｅｒ，Ｖ．，「Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ Ｌｏｓｓ ｂｙ Ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｅｒｉｐｈｅｒｙ」，１７０，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．３１１，１９７６年
【非特許文献９】ＭｃＭａｎａｍａｎ，Ｊ．Ｌら、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｗｈｉｃｈ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ Ｃｈｏｌｉｎｅ Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｎｅｕｒｏｎｓ」，２６３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５８９０，１９８８年
【非特許文献１０】Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｒ．Ｗら，「Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌｌｙ Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎ Ｄｅａｔｈ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ｂｙ ａ Ｔａｒｇｅｔ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ」，２４０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，９１９，１９８８年
【非特許文献１１】Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｇら，「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ」，６，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４３９，１９８６年
【非特許文献１２】Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ，Ｒ．，「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ」，５，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３４１，１９８２年
【非特許文献１３】Ｖａｒｏｎ，Ｓら，「Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ」，Ｉｎ：Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４７：Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｗａｘｍａｎ，Ｓ．Ｇ．（ｅｄ．），Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．４９３−５２１，１９８８年
【非特許文献１４】Ｂａｒｄｅ，Ｙ．Ａ．，「Ｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ」，２，Ｎｅｕｒｏｎ，１５２５，１９８９年
【非特許文献１５】Ｃｈａｕ，Ｒ．Ｍ．Ｗら，「Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ ３０ｋＤ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｔｅｃｔａｌ Ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ Ｒａｔ ｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｎｅｕｒｏｎｓ」，３４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ，Ｓｅｒｉｅｓ Ｂ，９０８，１９９１年
【非特許文献１６】Ｃｈａｕ，Ｒ．Ｍ．Ｗら，「Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｕｒｏｎｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ Ａｎｔｅｒｉｏｒ Ｈｏｒｎ Ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ ｏｆ Ｒａｔ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ」，Ｉｎ：Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５，Ｐｅｅｔｅｒｓ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ，ｐｐ．８９−９４，１９９２年
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、運動ニューロン栄養因子（特にＭＮＴＦ１関連ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列（それは染色体１６ｑ２２内にマッピングされている）を提示し、同じ上流調節配列（すなわち、ＭＮＴＦ１のプロモーターおよび／または転写開始点配列）を持つＭＮＴＦ関連ポリペプチドも提示する。本発明はまた新規のＤＮＡ配列も提示する。その新規ＤＮＡ配列は、様々なオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡを含み、少なくとも１つの運動ニューロン栄養因子、ＭＮＴＦ遺伝子と一致するヒト染色体ＤＮＡ、これらの新規ＤＮＡ配列を含むベクター、これらの新規ＤＮＡ配列を含む発現系および関連宿主、合成ＭＮＴＦペプチドおよび前述の発現系によって生成された新規組み換えヒトＭＮＴＦ１タンパク質を含む。本発明のさらなる側面として、ハイブリッド形成処置に用いるＭＮＴＦ関連プライマーおよびプローブ、ならびにそのようなアッセイに用いる構成物、キットおよびパネルも含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、栄養および刺激効果を運動ニューロンにおいて働かせるための能力をもつニューロン栄養因子ファミリー、ならびにニューロン栄養因子をコードする遺伝子に関連する。単離された因子、組換え因子および化学的に合成されたポリペプチド因子は運動ニューロンの生存能力の継続および軸策突起の伸長を誘導できることが証明された。例えば、米国特許第６，３０９，８７７号及び２００３年１月２１日出願の国際ＰＣＴ特許出願、「ＭＮＴＦ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｕｓｅ」（米国仮出願番号６０／４４１，７７２号（２００３年１月２１日出願の利益を主張する）（それら全てを本明細書において参考として援用する）を参照のこと。それゆえに、これらの因子は「運動ニューロン栄養因子（ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）」または「ＭＮＴＦ」として分類した。さらにＭＮＴＦは抗瘢痕効果および抗炎症効果を示し、さらに神経障害、神経障害性の疼痛、糖尿病性神経障害および糖尿病性神経障害性の疼痛の処置で適用されている。本発明は、ヒトの脳組織、下垂体組織および胎盤組織の供給源から単離される新しいｃＤＮＡ配列、およびヒト１６番染色体に由来する対応するＤＮＡ配列を含む。
【００１１】
便宜上、ＭＮＴＦ１をコードしている配列および／またはＭＮＴＦ１遺伝子全長（その配列は１６番染色体上に位置する（配列番号２））を含む核酸の付加的な隣接する核酸配列は、ＭＮＴＦ関連核酸、ＭＮＴＦ関連ポリヌクレオチド、またはＭＮＴＦ関連オリゴヌクレオチドとして本明細書において言及された。同様に、ＭＮＴＦ１遺伝子全長内で見出されるオープンリーディングフレームによってコードされている他のポリペプチドは、ＭＮＴＦ関連タンパク質、ＭＮＴＦ関連ポリペプチドまたはＭＮＴＦ関連ペプチドとして本明細書において言及された。
【００１２】
（Ｉ．ＭＮＴＦ１ 生物学的活性）
ＭＮＴＦは、ラットとヒト両方の供給源から単離され、それらの生物学的活性は、インビボおよびインビトロの両方で試験された。例えば、それらの潜在的な生物学的活性は、外科的な軸索切断した動物および遺伝病に罹患した動物の両方で試験した。米国特許第６，３０９，８７７号を参照のこと。
【００１３】
さらに近年、合成ＭＮＴＦが抹消神経の再生を強めることを示したインビボでの研究において、ＭＮＴＦの栄養効果を確認した。ラット坐骨神経内の８ｍｍの囲まれた裂孔内に、ＭＮＴＦを含む９０％ビトロジェン（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を満たした。そのＭＮＴＦ濃度（モル希釈）と、１ヶ月で、Ｆｌｕｏｒｏ Ｇｏｌｄにより遠位断端から標識される裂孔を横断する得られた運動ニューロンの数は、生理食塩水コントロール、５４０；１０−７Ｍ、６７８；１０−６Ｍ、７６５；１０−５Ｍ、８７３；１０−４Ｍ、１１１１；１０−３Ｍ、１１３０であった。
【００１４】
さらに、ＭＮＴＦの刺激効果もまたインビボでの最近の研究で確認した。それから、１０−４Ｍの最適濃度のＭＮＴＦ中に、または生理食塩水中に３週間、横断および縫合されたラットの大腿神経を浸した。大腿筋及び皮枝を２重標識することによって再生を評価した（Ｂｒｕｓｈａｒｔ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２２（１４）：６６３１−６６３８、２００２（方法論について、本明細書において参考として援用される）を参照のこと）。生理食塩水での処理後、平均１００の運動ニューロンが正確に筋肉に突き出し、平均８７の運動ニューロンが不正確に皮膚に突き出し、平均５１の運動ニューロンが二重標識された。ＭＮＴＦ処理後、正確に筋肉に尽きだしている運動ニューロンの平均数は、１７３（ｐ＝０．０００８）に増加し、平均５９の運動ニューロンが皮膚に突き出し、４７の運動ニューロンが２重標識された。ＭＮＴＦは、感覚ニューロンへの突出のパターンに、有意な影響はなかった。
【００１５】
（ＩＩ．ＭＮＴＦ遺伝子の配列の発現とクローニング）
運動ニューロン栄養因子（ＭＮＴＦ）は、もとは、網膜芽細胞腫ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、３週齢のラットからの筋肉抽出物に対する抗体でスクリーニングを行うことにより、３３アミノ酸のペプチドとして単離された（米国特許第６，３０９，８７７号（本明細書において参考として援用する））。そのＭＮＴＦ遺伝子９２７ｂｐ断片をクローニングし、その核酸配列を決定した（米国特許第６，３０９，８７７号で配列号番号２として開示される）。
【００１６】
図１は、ＭＮＴＦをコードする配列を含むｍＲＮＡが、胎児の胸腺、下垂体、肝臓、腎臓、および８〜９週の胎盤において強く発現し、胎児筋での発現は弱いことを示す。わずかな発現が成体の筋肉に見られる。
【００１７】
さらなるクローニング実験および配列決定実験により、次に述べるようなＭＮＴＦ配列の改善をもたらした。
【００１８】
脳ｃＤＮＡの部分配列は、９２７ｂｐ断片の出発点から上流にさらなる配列（配列番号１の核酸残基１〜５８２）を含んだ。
【００１９】
約１．８ｋｂの比較的豊富なｃＤＮＡを下垂体組織から単離した。その配列を標準的なＰＣＲとＲＡＣＥによって増幅し、得られた１８５９ｂｐのｃＤＮＡ配列を決定した（配列番号１を参照のこと）。配列番号１は、９２７ｂｐ断片の出発点から上流の脳ｃＤＮＡの部分配列と同一である５’配列を含む。さらに配列番号１は、その９２７ｂｐ断片の配列１〜２３６と完全同一の部分を含む（配列番号１の核酸残基５８３〜７５７）。しかし、表１にまとめたように、配列番号１は、９２７ｂｐ断片からの多くのバリエーションを含む。
【００２０】
【表１】
したがって、配列番号１の核酸残基７５８〜１４７３とはじめに開示された９２７ｂｐ配列の対応する領域には、正確に適合しない。さらに、ＭＮＴＦ転写物のさらに下流の残基の配列（すなわち、配列番号１の残基番号１４７４〜１８５９）は、これまで開示されていなかった。
【００２１】
ｃＤＮＡライブラリー（標準化したヒト胎盤から調製された）を、別の組織源からの別のＭＮＴＦ ｃＤＮＡの、単離と配列決定にも利用した。その胎盤のｃＤＮＡ配列は、配列番号１の配列と一致する。
【００２２】
したがって、本発明は、ＭＮＴＦをコードする核酸そして／またはＭＮＴＦ関連核酸（すなわち、配列番号１、配列番号１の相補配列およびその一部または断片）の配列情報の向上をもたらした。さらに、好ましい実施形態は、以前に開示された９２７ｂｐ断片の一部と厳密には一致しない配列番号１の一部（配列番号１の核酸残基７５８〜１４７３以外）を含む。
【００２３】
（ＩＩＩ．染色体ＤＮＡ上のＭＮＴＦ遺伝子配列）
ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を対応する配列番号１の配列と比較するため、配列の包括的なアライメントは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ワールドワイドウェブ ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ上）を通して公に入手可能なＢＬＡＳＴプログラムを用いて行い得る。包括的なアライメントを行う前に、配列番号１はＧｅｎＢａｎｋへ提出され得る。そのＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎが提供するデフォルトパラメーターは包括的なアライメントに用いられ得る。
【００２４】
データベース（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖまたはｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）を用いたＤＮＡ解析は、配列番号１を含む遺伝子が、１６番染色体（染色体バンド：１６ｑ２２）上に位置することを示す。その染色体バンドの跡は、分解能８００バンドで、ギムザ染色された染色体上で見られたバンドのおおよその位置を表す。Ｂａｒｂａｒａ Ｔｒａｓｋ，Ｖｉｖｉａｎ Ｃｈｅｕｎｇ，Ｎｏｒｍａ ＮｏｗａｋおよびＢＡＣ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍのその他の人々は、染色体上の大きなゲノムクローンについての細胞遺伝位置の決定に、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いた。
【００２５】
ＢＡＣ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍについてのさらなる情報については、「Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｌａｎｄｍａｒｋｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｄｒａｆｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ」Ｎａｔｕｒｅ，４０９：９５３〜９５８，Ｆｅｂ．２００１と同時にウェブサイト Ｈｕｍａｎ ＢＡＣ Ｒｅｓｏｕｒｃｅを参照のこと。
【００２６】
ＧｅｎＢａｎｋで、その座は、ＡＣ０９２３８３、アクセッション番号ＡＰ００１５８８、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ １６番染色体、クローンＲＰ１１−７８７Ｄ１１である。クローンＲＰ１１−７８７Ｄ１１内での配列番号１の位置は、８０２４４から８０７３０の間である。
【００２７】
そのＭＮＴＦの１８５９ｂｐ ｃＤＮＡ配列（配列番号１）は、ＮＩＮ２８３遺伝子（染色体１６ｑ２２の７４８１３５４８から７４９０７０２２に位置する（ＵＣＳＣ ｇｅｎｏｍｅ ｂｌａｔ使用））のイントロン内にマッピングされている。その１６番染色体上のＭＮＴＦ ｃＤＮＡ配列の前にあるあらゆる上流調節配列の位置を決定するため、染色体１６ｑ２２の７４８１３５４８から７４９０７０２２の領域内（ＵＣＳＣ ｇｅｎｏｍｅ ｂｌａｔ使用）の潜在的なプロモーターおよび／または転写開始部位を同定するため、コンピューター分析による理論上のモデリングを行った。
【００２８】
配列番号２は、１６番染色体からの４３５９ｂｐ配列（ＵＣＳＣ ｇｅｎｏｍｅ ｂｌａｔ使用して、７４８１８５９６から７４８１４２３８に対応）を示す。その配列は、ＭＮＴＦ ｃＤＮＡ配列から上流のゲノム配列を含み、そのｃＤＮＡ配列は、推定第１プロモーター部位（配列番号２の核酸残基８６２〜９１１）、推定第２プロモーター部位（配列番号２の核酸残基２３１５〜２３６４）、そして潜在的な転写開始配列（配列番号２の核酸残基２３５５〜２５０１）を含む。配列番号２はまたＭＮＴＦ ｃＤＮＡ（核酸残基２５０１〜４３５９）を含み、このｃＤＮＡは、ＭＮＴＦ活性を有することが公知の２１アミノ酸のペプチド（配列番号２９）をコードする領域（核酸残基３０５８〜３１２０）を含む。
【００２９】
図５は、下垂体組織からのＭＮＴＦ ｃＤＮＡと１６番染色体配列のアライメントを示す。そのＭＮＴＦ ｃＤＮＡ配列は、２箇所において１６番染色体配列とは異なった。図６は、ＤＮＡ配列決定により、１６番染色体上の配列と比較して、ｃＤＮＡ配列の２箇所でバリエーションがあることを示す。
【００３０】
したがって、本発明のさらなる実施形態は、配列番号２、配列番号２の相補的配列、および配列番号２の一部または断片を含む。好ましい断片は、少なくとも１つの推定プロモーターおよび／または潜在的な開始配列を含む。
【００３１】
（ＩＶ．ＭＮＴＦ関連ポリペプチド）
ｃＤＮＡ配列に由来する３つのリーディングフレームの解析により、そのＭＮＴＦ ｃＤＡＮ配列（配列番号１）内にいくつかのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在していることが示される。以下の表２に示したアミノ酸配列は、それぞれのリーディングフレーム中にコードされる推定ペプチド配列であり、その配列は、メチオニン（Ｍ）の開始コドン（ＡＴＧ）で始まり、終止コドンで終わる。
【００３２】
【表２】
配列番号２９は、米国特許第６，３０９，８７７号において配列番号４として開示される３３アミノ酸のうちの２１アミノ酸を含む。その２１アミノ酸は、ＭＮＴＦ活性をもつことが示された。興味深いことに、配列番号２９は、そのＭＮＴＦ ｍＲＮＡの第１オープンリーディングフレームにコードされていない。どの推定ペプチド残基の前にも明確なコザック（Ｋｏｚａｋ）配列はないようである。そのことは、ＭＮＴＦのコード配列の上流のさらなるＯＲＦの存在が、ＭＮＴＦおよび／またはＭＮＴＦ関連ポリペプチド発現に対する翻訳制御における代替メカニズムを提供し得ることを示唆する。
【００３３】
さらなる実施形態は、本明細書において開示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む、生物学的活性のある哺乳動物のポリペプチド（例えば、インビトロで単離されるもの、インビトロで発現されるもの、または化学的に合成されるものを含む）と、哺乳動物のニューロンの生存、成長、増殖または維持および神経幹細胞のニューロンへの分化を促進するためにそのポリペプチドを用いる方法を含む。代替的実施形態において、本発明は、本明細書に開示される推定ペプチド配列の、少なくとも１０の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５の連続したアミノ酸残基、少なくとも２０の連続したアミノ酸残基、少なくとも２５の連続したアミノ酸残基、または少なくとも３０の連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドを包含する。
【００３４】
本発明の範囲内のＭＮＴＦ関連ポリペプチドはまた、異種タンパク質に結合された、配列番号１のオープンリーディングフレームを含む融合タンパク質であり得る。異種タンパク質には、ＭＮＴＦ関連ポリペプチドに実質的には類似していないアミノ酸配列を有する。その異種タンパク質は、そのＭＮＴＦ関連ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。融合タンパク質としては、酵素の融合タンパク質（例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ融合物、ポリ−Ｈｉｓ融合物、ＭＹＣ−タグ化融合物およびＩｇ融合物）が挙げられ得るが、これらに限定されない。そのような融合タンパク質（特にポリ−Ｈｉｓ融合物）は組換え型ＭＮＴＦ関連ポリペプチドの精製を容易にし得る。
【００３５】
融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。例えば、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２つの連結した遺伝子断片間で相補的な突出部を生じるアンカープライマーを用いて行い得る。その断片は、キメラ遺伝子配列を生成するためにアニーリングおよび再増幅され得る（Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９２）。そのキメラ遺伝子は、適切な宿主細胞内で発現され得る。あるいは、ＭＮＴＦ関連ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を、既に異種タンパク質を含む市販の発現ベクターにクローニングし得る。その結果として、その異種タンパク質へインフレームで融合されたＭＮＴＦ関連タンパク質が生じる。
【００３６】
（Ｖ．発現ベクター）
本発明のもう１つのバージョンは、本明細書において記載されるオープンリーディングフレーム配列のうちの１以上をコードするＭＮＴＦ関連ポリペプチドを含むベクターを提供する。そのベクターは、核酸分子を維持するためのクローニングベクター、または発現ベクターであり得る。種々のクローニングベクターおよび発現ベクターは、当業者に周知である。例としては、プラスミドベクター、１本鎖もしくは２本鎖のファージベクター、１本鎖もしくは２本鎖のＤＮＡウイルスベクターもしくはＲＮＡウイルスベクター、または人工染色体（例えば、ＢＡＣおよびＹＡＣ）が挙げられる。発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結した、本明細書において記載されるＭＮＴＦ関連ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。種々の原核生物および真核生物の宿主細胞において転写および翻訳を制御するために適切なプロモーター、ターミネーターおよび他の調節領域は、当該分野で周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）。
【００３７】
本発明のさらに他のバージョンにおいて、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。その宿主細胞は、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母および他の心筋または細菌であり得る。様々な発現ベクターに適した宿主細胞は、当業者に周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）。
【００３８】
発現ベクターは、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、陽イオン脂質媒介性トランスフェクション、電気穿孔法、形質導入、リポフェクションのような技術、および当業者に周知の他の技術により、適切な宿主細胞へ導入され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）。
【００３９】
（ＶＩ．核酸の検出）
本明細書に開示される核酸配列は、ＭＮＴＦ関連タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの発現を指向することにおける用途に加えて、様々な他の用途がある。例えば、核酸ハイブリダイゼーションに伴う実施形態において、それらはプローブまたはプライマーとして有用である。したがって、発明の別の側面は、ＭＮＴＦタンパク質またはその誘導体をコードするヌクレオチド配列と患者の生物学的試料内のヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを検出することによって、ＭＮＴＦ関連転写物の発現を検出するための代替方法を含む。
【００４０】
ヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ（ハイブリダイゼーション条件下で、患者の生物学的試料由来の核酸を本発明のＭＮＴＦ関連ポリヌクレオチドへ接触させるという手段）を用いて、そのハイブリダイゼーション産物を検出する。その方法はＭＮＴＦ関連ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡを検出するために用いられ得る。ノザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ、またはＰＣＲおよびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）をアッセイの基礎として用い得る。これらの技術は、当業者に周知である。ＰＣＲおよびＬＣＲ技術は当該分野で広く利用し得る。例えば、その基礎的なＰＣＲ技術は、米国特許第４,６８３，２０２号、同第４,６８３，１９５号、同第４,８００，１５９号、および同第４,９６５，１８８に記載されている。その基礎的なＬＣＲ技術は、ＥＰＡ−３２０，３０８、ＥＰＡ−４３９，１８２、ＥＰＡ−３３６，７３１、ＷＯ８９／０９８３５、ＷＯ８９／１２６９６およびＷＯ９０／０１０６９に記載されている。
【００４１】
オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、好ましくは、比較されるＭＮＴＦ関連核酸配列の長さに沿って、相同性が少なくとも６０％で、少なくとも１０の連続したヌクレオチドまたは少なくとも３０の連続したヌクレオチドを含む。そのようなプローブ／プライマーの例およびＭＮＴＦ関連核酸を検出するためにＰＣＲを行う方法は、実施例１および実施例３に記載される。
【００４２】
したがって、本発明のヌクレオチド配列は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの相補的な範囲と選択的に二重鎖分子を形成する能力、または試料由来のＤＮＡもしくはＲＮＡの増幅のためプライマーを提供する能力のために用いられ得る。表３にはプローブまたはプライマーとして利用し得る多数の典型的なＭＮＴＦ関連核酸配列を表す（実施例１および実施例３に、さらに詳細に記載される）。
【００４３】
【表３】
想定される適用に依存して、標的配列に対するプローブまたはプライマーの様々な選択性の程度を達成するために、種々のハイブリダイゼーション条件を使用することが望まれる。
【００４４】
高い選択性を必要とする適用については、代表的には、ハイブリッドを形成するために、比較的高いストリンジェンシーの条件が使用され得る。例えば、約５０℃から７０℃の温度で、約０．０２Ｍから約０．１０Ｍ ＮａＣｌにより提供されるような比較的低い塩および／または高い温度の条件。そのような高ストリンジェンシー条件は、プローブまたはプライマーと、鋳型または標的鎖との間に、あるとしても、ほとんどミスマッチを許容せず、特定の遺伝子を単離するか、または特定のｍＲＮＡ転写物を検出するために特に適している。一般的には、さらにホルムアミドの量の増加により、条件をよりストリンジェントにし得ることが理解される。
【００４５】
別の適用、例えば、部位指向性変異誘発については、より低いストリンジェンシー条件が好ましいことが理解される。これらの条件下では、ハイブリダイズしようとしている鎖の配列が完全には相補的でなくても、ハイブリダイゼーションは生じうるが、１以上の位置にミスマッチがある。塩濃度の増加および／または温度の低下により、より低いストリンジェンシー条件にし得る。
【００４６】
特定の実施形態において、例えば、ハイブリダイゼーションを測定するための標識のような、適切な方法と組み合わせて、本発明の規定される核酸配列を使用することは有利である。検出能がある広範な種々のインジケーター手段が当該分野で公知であり、その手段としては、蛍光、放射性、酵素、または他のリガンド（例えば、アビジン／ビオチン）が挙げられる。
【００４７】
一般的に、本明細書に記載されるプローブまたはプライマーは、溶相ハイブリダイゼーションにおける試薬、ＰＣＲＴＭにおける試薬、一致する遺伝子の発現を検出するための試薬、ならびに固相を採用する実施形態における試薬として有用であることが予測される。固相を含む実施形態においては、その試験ＤＮＡまたはＲＮＡを、選択したマトリックスまたは表面に吸着するか、または別のやり方ではりつける。次いで、この固定した１本鎖の核酸を、望ましい条件下で選択されたプローブとのハイブリダイゼーションに供する。この特定の適用におけるハイブリダイゼーション条件の最適化は、当業者に周知である。非特異的に結合したプローブ分子を取り除くため、ハイブリダイズした分子を洗浄した後、ハイブリダイゼーションを、結合した標識の量を決定することにより、検出および／または定量する。
【００４８】
標準的な方法論（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に従って、増幅のため鋳型として使用される核酸は、細胞、組織、または他のサンプルから単離され得る。特定の実施形態において、その鋳型核酸を実質的に精製せずに、全細胞または組織のホモジネート、または生物学的液体のサンプルで解析を行う。その核酸は、ゲノムＤＮＡ、または分画したＲＮＡまたは全細胞ＲＮＡである。ＲＮＡを用いる場合、まず、ＲＮＡから相補的ＤＮＡへの転換が望まれ得る。
【００４９】
本明細書で用いられる用語「プライマー」は、鋳型依存のプロセスにおいて、新生核酸の合成を促進する能力のあるあらゆる核酸を包含することを意味する。代表的なプライマーは、長さが１０から２０および／または３０塩基対のオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列も使用されうる。
【００５０】
配列番号１または配列番号２の一部と一致する核酸へ選択的にハイブリダイズするように設計されたプライマー対は、選択的なハイブリダイゼーションを可能にする鋳型核酸と接触される。一旦、ハイブリダイズされると、鋳型−プライマー複合体は、鋳型依存の核酸合成を促進する１以上の酵素と接触される。複数回の増幅（サイクルともいわれる）を、十分な量の増幅産物が生成されるまで行う。
【００５１】
その増幅産物を、検出または定量する。特定の適用において、その検出は視覚的手段で行われ得る。あるいは、その検出は、化学発光、取り込まれた放射性標識を用いた放射性シンチグラフィー、または蛍光標識によるか、あるいは電気的および／または熱のインパルスシグナルを用いた系（Ａｆｆｙｍａｘ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｌｌｕｓ、１９９４年）による、その産物の間接的な検出方法を含み得る。
【００５２】
あらゆる増幅に続き、鋳型および／または過剰なプライマーから増幅産物を分離することが望ましい。ひとつの実施形態において、増幅産物は、標準的な方法を使用して、アガロース、アガロースアクリルアミド、またはポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）により分離される。核酸の分離は、当該分野で公知のクロマトグラフィー技術（例えば、吸着、分配、イオン交換、ヒドロキシアパタイト、分子ふるい、逆相、カラム、ペーパー、薄層およびガスクロマトグラフィー、ならびにＨＰＬＣ）によっても達成される。
【００５３】
（ＶＩＩ．アッセイキット、試薬およびパネル）
ヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイのためのアッセイキットも含まれる。このキットは、ＭＮＴＦ関連核酸またはそれらの誘導体に特異的なプローブおよび／またはプライマーを含む。そのキットはまた、サンプル調製試薬、洗浄試薬、検出試薬およびシグナル生成試薬を含む。
【実施例】
【００５４】
（実施例１）
どの組織がＭＮＴＦの最も高い発現を示すかを特定するために、多数の異なる組織源より得られたｃＤＮＡからＰＣＲ産物を増幅した。種々の組織由来の成体または胎児のｃＤＮＡパネルを注文し（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、染色体マッピング実験に基づいて遺伝子特異的プライマーを合成した（以下を参照）。
【００５５】
次のプライマーセットを使用した：
【００５６】
【化１】
予期されるＰＣＲ産物の長さは５４１塩基対であった。
【００５７】
Ａ．ＰＣＲプロトコル
１．マスターミックスＰＣＲ１×
３５μｌ 水
５μｌ １０×緩衝液
１．５μｌ ＭｇＣｌ２（５０ｍｍｏｌ)
１μｌ ｄＮＴＰ
１μｌ 各プライマー
２Ｕ Ｔａｑ Ｐｌａｔｉｎｕｍ ポリメラーゼ酵素
５μｌ テンプレートＤＮＡ。
【００５８】
２．ＰＣＲ サイクリング
５分 ９５℃。
以下を３８サイクル：
３０秒 ９５℃
３０秒 ５３℃ アニーリング
４５秒 ７２℃ 伸長。
５分 ７２℃ 最終伸長。
【００５９】
Ｂ．結果
図１は、ＭＮＴＦの成体組織における発現が、当該発現が低かった脳と骨格筋を除いた全ての組織においてだいたい同じであったことを示している。図１を参照すると、プライマーを使用してＭＮＴＦ１の５４１ｂｐの産物を増幅し（上のパネル）、この産物をＧ３ＰＤＨハウスキーピング遺伝子発現により標準化した（下のパネル）。レーン内のサンプルは、両方のゲルで一貫している。左から右へ：レーン１、マーカー：レーン２、脳：レーン３、肺；レーン４、胸腺；レーン５、骨格筋；レーン６、腎臓；レーン７、心臓；レーン８、肝臓；レーン９、胎盤；そしてレーン１０、ネガティブＨ２Ｏコントロール。
【００６０】
図２は、ＭＮＴＦの胎児の組織における発現が、胸腺、腎臓、肝臓において最も高く、骨格筋では最も低かったことを示している。図２の上のパネルを参照すると、レーン１、マーカー：レーン２、脳：レーン３、肺；レーン４、胸腺；レーン５、骨格筋；レーン６、脾臓；レーン７、腎臓；レーン８、心臓；レーン９、肝臓；そしてレーン１０、ネガティブＨ２Ｏコントロール。
【００６１】
この実験は、胸腺、腎臓、肝臓組織において、胎児と成体両方のＭＮＴＦの発現が比較的高いレベルであることを決定した。
【００６２】
（実施例２）
総ＲＮＡを、次の組織：海馬、胎盤、脳（胎児の脳と成体の脳の両方）、網膜、下垂体、心臓、胎児筋からＲＩＳＯ ＲＮＡ単離法（Ｃａｔ＃０６−２００）（Ｇｅｎｅｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）によって抽出した。この方法は、ＲＮＡ分解の速度を遅延させるため、ＲＮａｓｅ、チオシアン酸グアニジン（ＧＴＣ）そしてベータ−メルカプトエタノールの公知の強力なインヒビターを併用する。この方法はまた、核タンパク質複合体を壊し、ＲＮＡを液体中に放出させ、そしてタンパク質夾雑物を含まずに単離させる。この最終総ＲＮＡを、酸性フェノールとクロロホルム抽出によって夾雑からさらに精製し、そしてイソプロパノール沈殿によって濃縮する。さらなる精製を、エタノール沈殿といかなる残存タンパク質も夾雑する塩を取り除くための洗浄によって行った。
【００６３】
この組織サンプルから抽出された総ＲＮＡの純度と量を、ゲル電気泳動によって決定し、Ａ２６０／Ａ２８０の比によって示した。１ｇの組織から約３．５ｍｇの総ＲＮＡを単離し；このＡ２６０／Ａ２８０の比は１．６５で、このＡ２６０／Ａ２３０の比は１．２０であった。
【００６４】
図３は異なるヒト組織のサンプル１０ｍｇから単離された総ＲＮＡの解析を示している。１．２％アガロースホルムアルデヒドゲルのレーン毎に、ＲＮＡを３ミクログラムずつ流した。レーン１〜６は、それぞれ下垂体、胎盤、脳、網膜、心臓、そして胎児筋からの総ＲＮＡを示す。レーンＭは０．２４〜９．７ｋｂＲＮＡラダーを示す。
【００６５】
ｃＤＮＡをＧｅｎｅｍｅｄ ｃＤＮＡ調製技術（係属中の特許）を用いてｍＲＮＡから調整した。このｍＲＮＡのいくつかは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）から購入した。ｍＲＮＡを二本鎖ｃＤＮＡにコピーすること、その後、ベクターライゲーションのために末端を調製することに関する酵素によって、代表的なｃＤＮＡライブラリーを構築した。第１鎖をニワトリ骨芽球症ウイルス逆転写酵素とランダムヘキサマープライマーにより合成した。第２鎖を、ＲＮａｓｅ ＨとＤＮＡポリメラーゼＩにより合成した。末端を平滑にするためにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理した後、２本鎖ｃＤＮＡ分子を、アダプターライゲーションによってクローニングするために調製した。
【００６６】
（実施例３）
配列決定のため、標準的ＤＮＡ精製キットを用いてＤＮＡの準備をした。Ｓａｎｇｅｒら（１９７７）によって開発されたジデオキシ法を用いてＤＮＡ配列決定を行った。その方法は、ＤＮＡポリメラーゼが２’，３’−ジデオキシヌクレオチドを基質として組み込むことができることを利用する。ＤＮＡポリメラーゼにより伸長鎖へヌクレオチドを付加することによって、１本鎖鋳型ＤＮＡを複製した。鎖伸長は、プライマー（すなわち、その鋳型にアニールするオリゴヌクレオチド）が３’末端で生じる。鋳型への塩基対マッチングによって、伸長産物に付加されデオキシヌクレオチドが選択される。伸長産物は、プライマーの伸長末端である３’ヒドロキシル基と、結合してくるジデオキシヌクレオチドの５’リン酸基との間のホスホジエステル架橋の形成によって伸長する。伸長は５’から３’方向である。ＤＮＡポリメラーゼはまた、ヌクレオチド塩基のアナログを組み込み得る。伸長鎖の３’末端にジデオキシヌクレオチドアナログが組み込まれた時、鎖伸長は、その鎖の３’ヒドロキシル基の欠失によって、選択的にＡ、Ｃ、ＧまたはＴで終結する。
【００６７】
配列決定プロセスのために、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＡＢＩ ３７７シークエンサーを使用した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの自動蛍光配列決定法では、５’に色素標識されたプライマー（色素プライマー）または３’に色素標識されたジデオキシヌクレオチド三リン酸（色素ターミネーター）を用いて、蛍光色素標識をＤＮＡ伸長産物へと組み込む。ＤＮＡシークエンサーは、Ａの伸長反応、Ｃの伸長反応、Ｇの伸長反応、そしてＴの伸長反応を識別するために用いた４つの異なる色素からの蛍光を検出する。それぞれの色素は、アルゴンイオンレーザーによって励起されると異なる波長の光を発し、４つの塩基を示す４つの色がゲル内で検出および識別され得る。
【００６８】
(実施例３）
このＭＮＴＦ遺伝子の単離とスクリーニングのために、２つの異なる戦略（すなわち、標準的なＰＣＲと５’−ＲＡＣＥ）を用いた。
【００６９】
Ａ．標準的なＰＣＲ
その最初の戦略は、異なるプライマーセットを用いてこの遺伝子をスクリーニングすることである。その目的は、標的となるｃＤＮＡライブラリー中に全長ＭＮＴＦが存在しているかどうかを見つけることである。次のオリゴヌクレオチド配列は、ＭＮＴＦ配列の標準的なＰＣＲ増幅に用いるためのプライマー対の例である。
【００７０】
【化２】
標準的なＰＣＲ法を用いて、異なる組織から調製されたｃＤＮＡのスクリーニングを行った。海馬組織、胎児の脳組織、胎盤組織、網膜組織、下垂体組織、胎児筋の組織、または心臓組織からｃＤＮＡライブラリーを増幅するために、それぞれのプライマー対を用いた。
【００７１】
増幅条件は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＫＣｌ、３．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．８ｍＭ ｄＮＴＰ、ぞれぞれのプライマー１００ｐｍｏｌ、そしてＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ２．５ｕから成った。以下：９４℃、１分；５５℃、２分；７２℃、３分、を３５サイクル行った。
【００７２】
ＤＮＡ増幅産物を、電気泳動によって分離し、ＵＶ下で検出した。目に見えて増幅されたバンドがあったときは、そのバンドを低量の融解アガロースゲルで単離し、フェノール抽出し、エタノール沈殿させた。その増幅されたバンドをクローニングのために調製した。１つの部分的なＰＣＲ断片を単離し、その配列を決定した。１つの部分的なＤＮＡ配列（長さは約７００塩基対）（配列番号１の核酸残基１〜７１３と一致）を、脳組織から調製されたｃＤＮＡから増幅した。
【００７３】
Ｂ．５’−ＲＡＣＥ増幅
５’−ＲＡＣＥは、このＭＮＴＦ遺伝子の５’−末端を見出すために用いられる別の戦略である。５’ＲＡＣＥまたはアンカーＰＣＲは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）からのＭＮＴＦ ５’末端の単離および特徴づけを容易にする。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）のためのＲＡＣＥシステムを改変し、そのＭＮＴＦ ｃＤＮＡを得るために用いた。そのＲＡＣＥ手順を、このＭＮＴＦ ｍＲＮＡの規定した内側部分と３’末端または５’末端のどちらかの未知の配列との間の総ｍＲＮＡからｃＤＮＡ配列を増幅するために用いた。異なる組織からｍＲＮＡを単離後、第１鎖ｃＤＮＡの合成を遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてプライムする。これは、ＭＮＴＦ特異的ｍＲＮＡ（およびＭＮＴＦに関連したｍＲＮＡのファミリー）をｃＤＮＡに転換することを可能にし、メッセージの５’末端への完全な伸長のための可能性を最大限にする。ｃＤＮＡ合成の後、組み込まれなかったｄＮＴＰおよびＭＮＴＦプライマーから第１鎖産物を精製する。ｃＤＮＡの３’末端にホモポリマーテールを付加するために、ＴｄＴ（ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）を用いる。次いでネスト化（ｎｅｓｔｅｄ）遺伝子特異的プライマーと、相補的なホモポリマーを含むアンカープライマーとホモポリマーテールからの増幅を可能にする、対応するアダプタープライマーとの組合わせの混合物を用いたＰＣＲによって、その末端ｃＤＮＡを増幅する。これはＭＮＴＦ特異的プライマー配列とｍＲＮＡの５’末端との間の未知の配列の増幅を可能にする。
【００７４】
図４は、そのＲＡＣＥ手順から生成したＤＮＡ断片を示している。この反応に約０．１μｇのｍＲＮＡを用いた。図４に示したその結果は、１μｌのＲＡＣＥ反応を用いることにより得られた。その反応温度は９４℃で２分間；９４℃で５０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で３分間を３０サイクル；そして最後に７２℃で１０分間であった。図４のレーン１〜６はそれぞれ、下垂体、胎盤、脳（胎児の脳と成体の脳の両方）、網膜、心臓、ならびに胎児筋からの総ＲＮＡを示す。ＤＮＡ分子重量マーカーはＭと名称をつける。約１．８ｋｂの比較的大量のＲＡＣＥ産物が下垂体ＲＮＡから生成された。
【００７５】
ＲＡＣＥ手順を用いてＭＮＴＦ配列を増幅するためのプライマーとして次のオリゴヌクレオチド配列が、使用され得る。
【００７６】
【化３】
このＭＮＴＦ遺伝子に対するｃＤＮＡを、ＲＡＣＥによって下垂体組織から単離した。配列番号１に示した配列は、いくつかのＤＮＡシークエンシングランから構築した整理した。その配列はＭＮＴＦ ｍＲＮＡに対応する１８５９の連続した塩基を含んでいた（シークエンシングランごとの平均の長さは９１９塩基である）。
【００７７】
(実施例４）
標準化したヒト胎盤（８〜９週）から調製されたスーパースクリプトｃＤＮＡライブラリーを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カタログ番号ＳＬ．２ＮＢＨＰ８９Ｗを参照のこと）から購入した。５’−ｃＤＮＡ末端と３’−ｃＤＮＡ末端からのＭＮＴＦ遺伝子の増幅およびクローニングを容易にするために、ポリメラーゼ鎖反応に基づくＲＡＣＥ技術およびＲＡＣＥプロトコルを用いた。
【００７８】
ＭＮＴＦ ｃＤＮＡを、そのｃＤＮＡライブラリーから単離した。その５’−末端配列を５’−末端ＲＡＣＥを用いて同定し、その３’−末端配列を３’−末端ＲＡＣＥを用いて同定した。遺伝子を単離する方法を、ＤＮＡ ＲＡＣＥキットの手引書に従って行った。その行程の詳細は、製造会社：Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸによって説明されている。次いで、遺伝子の同一性確認のために、その単離された遺伝子を配列決定した。
【００７９】
ＭＮＴＦ ｃＤＮＡを、ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ ベクター）へサブクローニングした。５’−末端配列と３’−末端配列との両方の連結をＤＮＡ配列決定反応で確認した。
【００８０】
その胎盤ｃＤＮＡの全体のＤＮＡ配列は、下垂体からのＭＮＴＦ関連ｃＤＮＡと一致する（配列番号１)。
【００８１】
（実施例５）
ＮＩＮ２８３として同定された遺伝子もまた染色体１６ｑ２２上に位置する。ＮＩＮ２８３は神経損傷に反応して発現する（登録番号ＮＭ０３２２６８、４６３３ｂｐ ｍＲＮＡ配列）。ＮＩＮ２８３の公開された遺伝子配列は、染色体１６ｑ２２の７４８１２４６９から７４８１３５４７、それから７４９０７０２３から７４９０７１８８、７４９１８２３５から７５９１８３４０、７４９１９９３３から７４９００２２、そして７４９２１１８４から７４９２４４４５上に位置する。そのＭＮＴＦ １８５９ｂｐ ｃＤＮＡ配列は、染色体１６ｑ２２の７４８１４２３８から７４８１６０９６上に位置する（ＵＣＳＣ ｇｅｎｏｍｅ ｂｌａｔ使用）。この２つのヌクレオチド配列には、重複も一致もないが、そのＭＮＴＦ遺伝子配列はその第１断片（またはエキソン）と第２断片（またはエキソン）との間（ＮＩＮ２８３遺伝子のイントロン領域内）に位置する。
【００８２】
実際に、そのＭＮＴＦ遺伝子がＮＩＮ２８３と関係がなく、記載されていないスプライス型におけるＮＩＮ２８３のエキソンではないことを確実するために、骨格筋からのポリＡ（＋）ＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。３つのプライマーセットを作製した。１つめは、ＮＩＮ２８３の第１エキソン内の正方向プライマーおよびＭＮＴＦコーディング領域内の逆方向プライマー、そして２つめは、ＭＮＴＦコーディング領域内の正方向プライマーおよびＮＩＮ２８３の第４エキソン内の逆方向プライマーである。スプライス型がＮＩＮ２８３のエキソンとしてＭＮＴＦとともに存在した場合、ＰＣＲ産物を見出すことが予期される。しかしながら、意味のあるＰＣＲ産物はいかなるＰＣＲ反応においても生成されなかった。これらのＲＴ−ＰＣＲ反応の結果により、ＭＮＴＦとＮＩＮ２８３が関係しているという可能性は非常に低い。
【００８３】
本発明は、その特定の明らかに好ましい形態を参照してかなり詳細に記載されてきたが、他の形態も可能である。例えば、組織特異的および／または発生段階でのｍＲＮＡ転写で使用する転写開始部位のバリエーションは、他の人によって記載されている。それゆえに、ＭＮＴＦに関連するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの５’末端は、組織、細胞、発生段階ごとに位存して付加的な核酸残基、この核酸残基は配列番号２の選択された部分（例えば、推定の転写開始部位）をみ得る。加えて、ハイブリダイゼーションアッセイおよび／または増幅アッセイで使用される対応するＭＮＴＦ関連オリゴヌクレオチドは、本発明の局面に従って、そのようなバリエーションのさらに明確な発現プロフィールを提供する有用性を有する。それゆえに、本発明の趣旨および範囲は、添付の特許請求の範囲内において特徴付けられ、その中に含まれる好ましいバリエーションの記載に制限されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
本発明は、よりよく理解され、添付の図面を参照することによって、当業者によりその利点が認められ得る。
【図１】図１は、成体ヒトＭＴＣパネル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）内でのＭＮＴＦ１遺伝子の発現パターンを示す。
【図２】図２は、胎児ＭＴＣパネル（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）内でのＭＮＴＦ１遺伝子の発現パターンを示す。
【図３】図３は、６つの異なるヒト組織、下垂体（レーン１）、胎盤（レーン２）、脳（レーン３）、網膜（レーン４）、心臓（レーン５）、胎児筋（レーン６）から単離した総ＲＮＡのアガロースゲル電気泳動による解析結果を示す。
【図４】図４は、下垂体（レーン１）、胎盤（レーン２）、胎児と成体の脳（レーン３）、網膜（レーン４）、心臓（レーン５）、および胎児筋（レーン４）からの総ＲＮＡを用いたＲＡＣＥ手順により生成されたＤＮＡ断片を示す。
【図５】図５は、下垂体組織由来のＭＮＴＦ ｃＤＮＡと１６番染色体配列とのアライメントを示す。
【図６】図６は、ＤＮＡ配列決定により、１６番染色体上の配列と比較してそのｃＤＮＡには２つの位置でバリエーションがあることを証明する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１を含む配列；配列番号２を含む配列；ならびに配列番号の相補体および配列番号２の相補体からなる群より選択される、単離されたＭＮＴＦ関連ポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１の断片を含む、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、該断片は、ｉ）配列番号１の残基１〜１８４９から選択される５’末端、およびｉｉ）該５’末端および３’末端を含む、配列番号１の少なくとも１０の連続した核酸残基であって、ここで該断片の３’末端は、配列番号１の残基１０〜１８５９から選択される、核酸残基、を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１の断片を含む単離されたポリヌクレオチドであって、ただし該断片のヌクレオチド配列は、配列番号１の以下の残基：
残基１〜５８２；
残基７５８〜７６５；
残基８８６〜８９２；
残基１１０４〜１１０８；
残基１１２６〜１１２９；
残基１１６５〜１１７３；
残基１１７４〜１１８２；
残基１１８３〜１１９２；
残基１１９２〜１１９８；
残基１２２４〜１２２５；
残基１２６７；
残基１２８９；
残基１３２１〜１３２３；
残基１３３４〜１３３６；
残基１３３９〜１３４１；
残基１３４６〜１３４９；
残基１３６４〜１３７２；
残基１４０３〜１４０６；
残基１４５０〜１４５２；
残基１４６７〜１４７３；および
残基１４７４〜１８５９、
のいずれかから選択される、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１の断片を含む、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、該断片は、以下：
ａ）配列番号３；
ｂ）配列番号５；
ｃ）配列番号６；および
ｄ）配列番号１０；
からなる群より選択される、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１に完全に相補的な核酸配列を有する断片を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子であって、該断片は、以下：
ａ）配列番号４；
ｂ）配列番号７；
ｃ）配列番号８；
ｄ）配列番号１１；および
ｅ）配列番号１２、
からなる群より選択される、単離された核酸分子。
【請求項６】
前記請求項１の断片は、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む、請求項３に記載の単離されたポリヌクレオチド断片。
【請求項７】
前記少なくとも１つのオープンリーディングフレームは、以下：
ａ）配列番号１３；
ｂ）配列番号１４；
ｃ）配列番号１５；
ｄ）配列番号１６；
ｅ）配列番号１７；
ｆ）配列番号１８；
ｇ）配列番号１９；
ｈ）配列番号２０；
ｉ）配列番号２１；
ａ）配列番号２２；
ｂ）配列番号２３；
ｃ）配列番号２４；
ｄ）配列番号２５；
ｅ）配列番号２６；
ｆ）配列番号２７；
ｇ）配列番号２８；
ｈ）配列番号２９；
ｉ）配列番号３０；
ｊ）配列番号３１；および
ｋ）配列番号３２、
からなる群より選択されるポリペプチドをコードする、請求項６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
第１のポリヌクレオチドおよび請求項７に記載の第２のポリヌクレオチドを含む組成物であって、ここで該第１のポリヌクレオチドは、配列番号２９をコードするオープンリーディングフレームを含む、組成物。
【請求項９】
配列番号２の断片は、少なくとも１つの推定ＭＮＴＦプロモーター配列および少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む、請求項３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記推定ＭＮＴＦプロモーター配列は、以下：
ａ）配列番号２の残基８６２〜９１１；および
ｂ）配列番号２の残基２３１５〜２３６４、
からなる群より選択される、請求項９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号２の前記断片は、配列番号２の残基２５０１〜４３５９を含む潜在的転写開始配列を含む、請求項１０に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのオープンリーディングフレームは、以下：
ａ） 配列番号１３；
ｂ） 配列番号１４；
ｃ） 配列番号１５；
ｄ） 配列番号１６；
ｅ） 配列番号１７；
ｆ） 配列番号１８；
ｇ） 配列番号１９；
ｈ） 配列番号２０；
ｉ） 配列番号２１；
ｊ） 配列番号２２；
ｋ） 配列番号２３；
ｌ） 配列番号２４；
ｍ） 配列番号２５；
ｎ） 配列番号２６；
ｏ） 配列番号２７；
ｐ） 配列番号２８；
ｑ） 配列番号２９；
ｒ） 配列番号３０；
ｓ） 配列番号３１；および
ｔ） 配列番号３２、
からなる群より選択されるポリペプチドをコードする、請求項９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号１のオープンリーディングフレームにコードされる、単離されたＭＮＴＦ関連ポリペプリヂド。
【請求項１４】
異種のタンパク質に連結された、配列番号１のオープンリーディングフレームによりコードされるＭＮＴＦ関連ポリペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドに作動可能に連結された発現ベクターであって、ここで少なくとも１つのオープンリーディングフレームは、望ましい宿主ベクターと適合性の制御配列に作動可能に連結されている、発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の発現ベクターで形質転換された、単離された宿主細胞。
【請求項１７】
媒体中におけるＭＮＴＦ関連ポリヌクレオチドの存在を決定するための方法であって、以下の工程：
ＭＮＴＦ関連核酸配列を含み得る該媒体を、合成されかつ単離されたオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該合成されかつ単離されたオリゴヌクレオチドは、該媒体内で、前もって選択されたハイブリダイゼーション条件下で該ＭＮＴＦ関連核酸配列とハイブリダイズするが、該ＭＮＴＦ関連核酸配列以外の核酸配列とはハイブリダイズしない、工程；および
該前もって選択されたハイブリダイゼーション条件下において、該ＭＮＴＦ関連核酸配列の存在を検出する工程、
を包含する方法。
【請求項１８】
異なるサンプルにおけるＭＮＴＦ関連発現産物の相対量を比較する方法であって、以下：
第一のサンプルおよび第二のサンプルを得る工程であって、ここで該第一のサンプルは該第二サンプルと異なる、工程；
該第一のサンプルおよび該第二のサンプルについて、ＭＮＴＦ関連発現産物を検出する工程；ならびに
該第一のサンプルおよび該第二のサンプルの該ＭＮＴＦ関連発現産物の相対量を比較する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
ＭＮＴＦ ＲＮＡが前記発現産物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＭＮＴＦ関連ポリペプチドが前記発現産物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも配列番号２９を有するポリペプチドが前記発現産物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記比較する工程が、前記ＲＮＡと相補的な核酸プローブとのハイブリダイゼーションを含む工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
ハイブリダイゼーションアッセイにおける使用のためのパネルであって、固相支持体の表面に安定して結合している、２つ以上の請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むパネル。
【請求項２５】
配列番号１または配列番号２の断片を含む単離されたポリヌクレオチドであって、ただし該断片のヌクレオチド配列は、米国特許第６，３０９，８７７号における配列番号２に完全には一致しない、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２６】
配列番号１または配列番号２の断片を含む単離されたポリヌクレオチドであって、ただし該断片のヌクレオチド配列は、米国特許第６，３０９，８７７号における配列番号５に完全には一致しない、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１】
配列番号１を含む配列；配列番号２を含む配列；ならびに配列番号の相補体および配列番号２の相補体からなる群より選択される、単離されたＭＮＴＦ関連ポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１の断片を含む、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、該断片は、ｉ）配列番号１の残基１〜１８４９から選択される５’末端、およびｉｉ）該５’末端および３’末端を含む、配列番号１の少なくとも１０の連続した核酸残基であって、ここで該断片の３’末端は、配列番号１の残基１０〜１８５９から選択される、核酸残基、を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１の断片を含む単離されたポリヌクレオチドであって、ただし該断片のヌクレオチド配列は、配列番号１の以下の残基：
残基１〜５８２；
残基７５８〜７６５；
残基８８６〜８９２；
残基１１０４〜１１０８；
残基１１２６〜１１２９；
残基１１６５〜１１７３；
残基１１７４〜１１８２；
残基１１８３〜１１９２；
残基１１９２〜１１９８；
残基１２２４〜１２２５；
残基１２６７；
残基１２８９；
残基１３２１〜１３２３；
残基１３３４〜１３３６；
残基１３３９〜１３４１；
残基１３４６〜１３４９；
残基１３６４〜１３７２；
残基１４０３〜１４０６；
残基１４５０〜１４５２；
残基１４６７〜１４７３；および
残基１４７４〜１８５９、
のいずれかから選択される、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１の断片を含む、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、該断片は、以下：
ａ）配列番号３；
ｂ）配列番号５；
ｃ）配列番号６；および
ｄ）配列番号１０；
からなる群より選択される、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１に完全に相補的な核酸配列を有する断片を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子であって、該断片は、以下：
ａ）配列番号４；
ｂ）配列番号７；
ｃ）配列番号８；
ｄ）配列番号１１；および
ｅ）配列番号１２、
からなる群より選択される、単離された核酸分子。
【請求項６】
前記請求項１の断片は、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む、請求項３に記載の単離されたポリヌクレオチド断片。
【請求項７】
前記少なくとも１つのオープンリーディングフレームは、以下：
ａ）配列番号１３；
ｂ）配列番号１４；
ｃ）配列番号１５；
ｄ）配列番号１６；
ｅ）配列番号１７；
ｆ）配列番号１８；
ｇ）配列番号１９；
ｈ）配列番号２０；
ｉ）配列番号２１；
ａ）配列番号２２；
ｂ）配列番号２３；
ｃ）配列番号２４；
ｄ）配列番号２５；
ｅ）配列番号２６；
ｆ）配列番号２７；
ｇ）配列番号２８；
ｈ）配列番号２９；
ｉ）配列番号３０；
ｊ）配列番号３１；および
ｋ）配列番号３２、
からなる群より選択されるポリペプチドをコードする、請求項６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
第１のポリヌクレオチドおよび請求項７に記載の第２のポリヌクレオチドを含む組成物であって、ここで該第１のポリヌクレオチドは、配列番号２９をコードするオープンリーディングフレームを含む、組成物。
【請求項９】
配列番号２の断片は、少なくとも１つの推定ＭＮＴＦプロモーター配列および少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む、請求項３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記推定ＭＮＴＦプロモーター配列は、以下：
ａ）配列番号２の残基８６２〜９１１；および
ｂ）配列番号２の残基２３１５〜２３６４、
からなる群より選択される、請求項９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号２の前記断片は、配列番号２の残基２５０１〜４３５９を含む潜在的転写開始配列を含む、請求項１０に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのオープンリーディングフレームは、以下：
ａ） 配列番号１３；
ｂ） 配列番号１４；
ｃ） 配列番号１５；
ｄ） 配列番号１６；
ｅ） 配列番号１７；
ｆ） 配列番号１８；
ｇ） 配列番号１９；
ｈ） 配列番号２０；
ｉ） 配列番号２１；
ｊ） 配列番号２２；
ｋ） 配列番号２３；
ｌ） 配列番号２４；
ｍ） 配列番号２５；
ｎ） 配列番号２６；
ｏ） 配列番号２７；
ｐ） 配列番号２８；
ｑ） 配列番号２９；
ｒ） 配列番号３０；
ｓ） 配列番号３１；および
ｔ） 配列番号３２、
からなる群より選択されるポリペプチドをコードする、請求項９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号１のオープンリーディングフレームにコードされる、単離されたＭＮＴＦ関連ポリペプリヂド。
【請求項１４】
異種のタンパク質に連結された、配列番号１のオープンリーディングフレームによりコードされるＭＮＴＦ関連ポリペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドに作動可能に連結された発現ベクターであって、ここで少なくとも１つのオープンリーディングフレームは、望ましい宿主ベクターと適合性の制御配列に作動可能に連結されている、発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の発現ベクターで形質転換された、単離された宿主細胞。
【請求項１７】
媒体中におけるＭＮＴＦ関連ポリヌクレオチドの存在を決定するための方法であって、以下の工程：
ＭＮＴＦ関連核酸配列を含み得る該媒体を、合成されかつ単離されたオリゴヌクレオチドと接触させる工程であって、該合成されかつ単離されたオリゴヌクレオチドは、該媒体内で、前もって選択されたハイブリダイゼーション条件下で該ＭＮＴＦ関連核酸配列とハイブリダイズするが、該ＭＮＴＦ関連核酸配列以外の核酸配列とはハイブリダイズしない、工程；および
該前もって選択されたハイブリダイゼーション条件下において、該ＭＮＴＦ関連核酸配列の存在を検出する工程、
を包含する方法。
【請求項１８】
異なるサンプルにおけるＭＮＴＦ関連発現産物の相対量を比較する方法であって、以下：
第一のサンプルおよび第二のサンプルを得る工程であって、ここで該第一のサンプルは該第二サンプルと異なる、工程；
該第一のサンプルおよび該第二のサンプルについて、ＭＮＴＦ関連発現産物を検出する工程；ならびに
該第一のサンプルおよび該第二のサンプルの該ＭＮＴＦ関連発現産物の相対量を比較する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
ＭＮＴＦ ＲＮＡが前記発現産物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＭＮＴＦ関連ポリペプチドが前記発現産物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも配列番号２９を有するポリペプチドが前記発現産物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記比較する工程が、前記ＲＮＡと相補的な核酸プローブとのハイブリダイゼーションを含む工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
ハイブリダイゼーションアッセイにおける使用のためのパネルであって、固相支持体の表面に安定して結合している、２つ以上の請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むパネル。
【請求項２５】
配列番号１または配列番号２の断片を含む単離されたポリヌクレオチドであって、ただし該断片のヌクレオチド配列は、米国特許第６，３０９，８７７号における配列番号２に完全には一致しない、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２６】
配列番号１または配列番号２の断片を含む単離されたポリヌクレオチドであって、ただし該断片のヌクレオチド配列は、米国特許第６，３０９，８７７号における配列番号５に完全には一致しない、単離されたポリヌクレオチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００７−５１０４１７（Ｐ２００７−５１０４１７Ａ）
【公表日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３８５６６（Ｐ２００６−５３８５６６）
【出願日】平成１６年１１月８日（２００４．１１．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３８６５１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４７４８７
【国際公開日】平成１７年５月２６日（２００５．５．２６）
【出願人】（３０２０６２４０３）ジェナボン バイオファーマシューティカルズ エルエルシー (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年４月２６日（２００７．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月８日（２００４．１１．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３８６５１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４７４８７
【国際公開日】平成１７年５月２６日（２００５．５．２６）
【出願人】（３０２０６２４０３）ジェナボン バイオファーマシューティカルズ エルエルシー (6)
【Ｆターム（参考）】
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