遺伝子発現の転写後抑制を相乗的に生じさせることができる方法および組成物
本発明は、標的プレｍＲＮＡにおける予め選択された領域を標的とする修飾Ｕ１ｓｎＲＮＡと、ｓｉＲＮＡ型、ｓｈＲＮＡ型および／またはｍｉＲＮＡ型の遺伝子発現抑制剤の併用による遺伝子発現の転写後阻害用組成物、および前記組み合わせの、好ましくないタンパク質の過剰発現により生じる疾患の治療のための使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写後における遺伝子発現の抑制方法に関し、より詳細には、各成分を別個に使用したときに得られるよりも高い抑制レベルを得ることができる組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現を効率的且つ特異的に阻害することは、遺伝子療法プロトコルおよび機能的遺伝子研究の基礎となるものである。ある遺伝子の発現は、細胞に有害に作用して、遺伝性疾患において優性阻害である感染細胞におけるウイルス遺伝子の発現、または発現が制限されるべき遺伝子、例えば、癌遺伝子の発現などの疾患を生じることがある。これらの毒性遺伝子の発現を阻害すると、それらが引き起こす疾患が治癒するであろう。さらに、ゲノムおよびタンパク質の研究により、多数の遺伝子（それらのうちの一部は未知の機能を有する）を単離することができる。これらの手法により、それらの発現レベルによるか、あるいはこのような発現を調節する条件によりこれらの遺伝子を分類できるが、しかしそれらの機能についてはあまり知ることができない。これらの遺伝子の発現を系統的および特異的に阻害できれば、それらの機能を決定できる簡単なプロトコルを開発することができるであろう。
【０００３】
遺伝子の発現を特異的に阻害する最も簡単な方法は、それから転写されるＲＮＡの安定性を減少させるか、あるいはそれがタンパク質への翻訳をブロックすることである。アンチセンス技術（アンチセンスリボザイムおよびオリゴヌクレオチド）に基づく最も使用されている従来の系は、あまりうまくいかなかった。その理由は、機能するためには「生体内」標的ＲＮＡと相互作用する必要があり、またそれらは通常タンパク質で被覆されていて、これらの相互作用からそれらを保護する二次および三次構造を形成するからであると思われる。
【０００４】
遺伝子の発現を特異的に阻害する別法として、ＲＮＡ干渉を用いてＲＮＡの安定性を減少させることがある。この手法によれば、長さが２１−２２ヌクレオチドであり、突出した３’端を有する２つの相補的ＲＮＡ鎖から構成されているＲＮＡ二本鎖からなる、いわゆる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いることにより意図する遺伝子の特異的分解を促進することができる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、２００１年、１５：１８８−２００）。ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの分解が生じるＲＩＳＣと称される多タンパク質複合体における相補配列ｍＲＮＡとハイブリダイズする。しかしながら、ｓｉＲＮＡを使用することに基づく遺伝子抑制方法は、化学合成によりｓｉＲＮＡを調製するためのコストが、とりわけ動物モデルに使用したり、将来ヒトに使用するのに大量に必要とするときには、高くなるため困難となる。ｓｉＲＮＡ合成にともなう高コストの問題を回避するために、ｓｈＲＮＡから実際の細胞でｓｉＲＮＡが産生する方法が開発された。しかしながら、この手法では、特異性を最高にするとともに毒性を最も低くする配列を選択するのを容易にする必要がある。さらに、ｓｉＲＮＡを使用することは、ハイブリダイズするｓｉＲＮＡの特異性が最も高く、毒性が最も低くなるように標的ｍＲＮＡの最適な部位を同定するのに、過度の実験が要求されること、および副作用、例えば、インターフェロンに対する応答の活性化および「標的外れ（Ｏｆｆ−Ｔａｒｇｅｔ）」（標的とは異なる転写物に対する完全に相補的でない（非特異的）ＲＮＡ鎖の結合が一連の好ましくない影響を生じる）のため、より困難となる。
【０００５】
核内低分子リボヌクレオタンパク質（ｓｎＲＮＰ）（これらのうちの一部は、プレｍＲＮＡの特異的配列と相互作用し、核におけるｍＲＮＡの成熟プロセスの種々の段階に関与する）の機能特性を使用することが、別法としてあげられる。Ｕ１ｓｎＲＮＰの場合、タンパク質Ｕ１Ａ、７０Ｋ、Ｕ１ＣおよびＲＮＡ分子（Ｕ１ｓｎＲＮＡ）に結合した７つのＳｍタンパク質により形成される。ＲＮＡの５’端は、塩基対合により、プレｍＲＮＡのスプライシング部位で、除去される配列であるイントロンの５’端とハイブリダイズする。この相互作用は、Ｕ１ｓｎＲＮＡと直接または間接的に相互作用するタンパク質および後でプロセシングされるｍＲＮＡと直接的または関接的に相互作用するタンパク質により安定化される。Ｕ１ｓｎＲＮＰがプレｍＲＮＡと相互作用すると、イントロンの除去を決定づける他のタンパク質とｓｎＲＮＰの一連の結合が誘発される。これを可能にするためには、Ｕ１ｓｎＲＮＡがプレｍＲＮＡから分離される必要がある。
【０００６】
さらに、Ｕ１ｓｎＲＮＰがＲＮＡに結合すると、プロセシングおよびポリアデニル化機構の周辺配列に対する作用が阻害される。Ｕ１ｓｎＲＮＰのタンパク質７０Ｋは、ポリアデニル化複合体のポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）サブユニットのカルボキシ末端に結合して、その機能を阻害することができる（Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎら、１９９７年、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．１１：７６１−７７３．）。
【０００７】
プロセシングおよびポリアデニル化機構に対するＵ１ｓｎＲＮＰによる阻害は、遺伝子発現を制御するために使用されてきた。したがって、標的ｍＲＮＡの３’末端エクソンに特異的に結合して標的ｍＲＮＡを分解するように、イントロンスプライシング領域の認識に関与するＵ１ｓｎＲＮＡ領域を修飾できることが記載された。この方法は、レポーター遺伝子（ＵＳ２００３００８２１４９号、Ｂｅｃｋｌｅｙ，Ｓ．Ａ．ら、２００１年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２１：２８１５−２８２５、Ｆｕｒｔｈ，Ｐ．Ａ．ら、１９９４年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１４：５２７８−５２８９、Ｆｏｒｔｅｓ，Ｐ．ら、２００３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００：８２６４−８２６９およびＥＰ１３８４７８４）および内在性遺伝子（上記Ｆｕｒｔｈ，Ｐ．Ａ．ら、上記Ｆｏｒｔｅｓ，Ｐ．ら、およびＬｉｕ，Ｐら、２００４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、３２：１５１２−１５１７）の発現を減少させるために適用された。Ｓａｊｉｃらは、ウイルスＨＩＶ−１ＲＮＡの末端エクソンに特異的な修飾Ｕ１がＨＩＶ−１ゲノムから得られた転写産物の発現を阻害する能力、したがってウイルスの複製を阻害する能力について記載している（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２００７年、３５：２４７−２５５）。
【０００８】
しかしながら、生体内において標的遺伝子の発現を阻害するのにＵ１ｓｎＲＮＡを使用することは、最高の特異性および最も低い毒性で最大の阻害を実現できる良好な標的配列を見出すのが困難であることから、限界がある。したがって、そしてＲＮＡｉの場合でも起こるように、低細胞内Ｕ１濃度で効果的な抑制レベルに達することができて、毒性が減少し、そして生体内での抑制方法の適用もまた可能となるように、Ｕ１ｓｎＲＮＡに基づいた遺伝子抑制方法を改良する必要がある。
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは、驚くべきことに、ある標的遺伝子に特異的な修飾Ｕ１ｓｎＲＮＡと、同じ標的遺伝子を対象とする遺伝子発現抑制剤とを併用すると、各々の剤を別個に使用したときよりも強く標的遺伝子の発現を阻害することを見出した。
【００１０】
したがって、第一の態様によれば、本発明は、一つもしくはいくつかの容器またはパーツからなるキットを含んでなる組成物に関し、該組成物は
（ｉ）Ｕ１ｓｎＲＮＡまたはＵ１ｓｎＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを少なくとも含んでなる第一成分であって、前記Ｕ１ｓｎＲＮＡが、標的プレｍＲＮＡの３’末端エクソンの予め選択された領域に特異的に結合するように、イントロンの５’端のＧＵコンセンサス配列に対する結合配列が修飾されており、かつ前記標的プレｍＲＮＡの成熟を阻害することができるものである、第一成分と、
（ｉｉ）（ｉ）で定義したＵ１ｓｎＲＮＡの標的であり、かつ前記標的ｍＲＮＡの生体内抑制を生じさせることができる前記プレｍＲＮＡのプロセシングから得られるｍＲＮＡの予め選択された領域を特異的に標的とする、少なくとも一種の遺伝子発現抑制剤を含んでなる第二成分とを含んでなるものである。
【００１１】
第二の態様によれば、本発明は、ポリヌクレオチドに関し、該ポリヌクレオチドは
（ｉ）標的プレｍＲＮＡの３’末端エクソンの予め選択された領域に特異的に結合するように、イントロンの５’端のＧＵコンセンサス配列に対する結合配列が修飾されており、かつ前記標的プレｍＲＮＡのプロセシングを阻害することができる、少なくとも一種のＵ１ｓｎＲＮＡをコードする配列と、
（ｉｉ）（ｉ）で定義したポリヌクレオチドによりコードされている前記Ｕ１ｓｎＲＮＡの標的であり、かつ前記標的ｍＲＮＡの生体内抑制を生じさせることができる前記プレｍＲＮＡのプロセシングから得られるｍＲＮＡの予め選択された領域を特異的に標的とする抑制剤をコードする配列と
を含んでなるものである。
【００１２】
さらなる態様によれば、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクター、本発明のベクターを含んでなる細胞、および本発明のポリヌクレオチドを含んでなるトランスジェニック動物に関する。
【００１３】
別の態様によれば、本発明は、薬剤として使用するための、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、または本発明の細胞を有する本発明の組成物またはキットに関する。
【００１４】
別の態様によれば、本発明は、感染症疾患、腫瘍性疾患、新生物疾患、または神経変性疾患の治療または予防のための本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、または本発明の細胞を有する本発明の組成物またはキットに関する。
【００１５】
別の態様によれば、本発明は、感染症疾患、腫瘍性疾患、新生物疾患、または神経変性疾患の治療または予防のための、生体系における標的遺伝子発現の生体外または生体内転写後阻害の非治療的方法に関し、その方法は、生体系を本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の細胞を有する本発明の組成物またはキットと接触させることを含んでいる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＲＮＡｕ阻害機構についての図である。Ｕ１ｓｎＲＮＰ分子のｓｎＲＮＡ５’端が、その配列がプレｍＲＮＡ標的の３’末端エクソンの予め選択された領域と相補的であるように修飾されている。Ｕ１ｓｎＲＮＰ分子が塩基対合により予め選択された配列に結合すると、標的ＲＮＡのポリアデニル化（ｐＡ）の阻害、したがって、遺伝子発現の阻害が生じる。この図にしたがって修飾されたＵ１ｓｎＲＮＡ分子も、Ｕ１ｉと称される。
【図２】強ｓｈＲＮＡを用いたレポーター遺伝子発現阻害とＵ１ｉを用いた発現阻害との相乗作用を示す図である。対照プラスミドをトランスフェクションした細胞におけるルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼ標的配列１５８に対してｓｈＲＮＡを発現するプラスミドの一回分量または一回分量の半量（それぞれｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５８およびｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５８／２）、ルシフェラーゼに対してＵ１ｉを発現するプラスミドの一回分量または一回分量の半量（それぞれＵ１ｉαＬｕｃおよびＵ１ｉαＬｕｃ／２）、およびｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５８の一回分量の半量とＵ１ｉαＬｕｃの一回分量の半量（ｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５８／２＋Ｕ１ｉαＬｕｃ／２）について算出した。対照（非阻害）細胞のルシフェラーゼ活性を、残りの例で得られたルシフェラーゼ活性によって割ることにより得た阻害率が示されている。エラーバーは、９個の独立した測定値の標準偏差を表す。
【図３】強ｓｈＲＮＡを用いたレポーター遺伝子発現阻害とＵ１ｉを用いた発現阻害との相乗作用を示す図である。対照プラスミドをトランスフェクションした細胞におけるルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼ標的配列１５４６に対してｓｈＲＮＡを発現するプラスミドの一回分量または一回分量の半量（それぞれｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５４６およびｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５４６／２）、ルシフェラーゼに対してＵ１ｉを発現するプラスミドの一回分量または一回分量の半量（それぞれＵ１ｉαＬｕｃおよびＵ１ｉαＬｕｃ／２）、およびｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５４６の一回分量の半量とＵ１ｉαＬｕｃの一回分量の半量（ｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５４６／２＋Ｕ１ｉαＬｕｃ／２）について算出した。対照（非阻害）細胞のルシフェラーゼ活性を、残りの例で得られたルシフェラーゼ活性によって割ることにより得た阻害率が示されている。エラーバーは、９個の独立した測定値の標準偏差を表す。
【図４】中ｓｈＲＮＡを用いたレポーター遺伝子発現阻害とＵ１ｉを用いた発現阻害との相乗作用を示す図である。対照プラスミドをトランスフェクションした細胞におけるルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼ標的配列１６３に対してｓｈＲＮＡを発現するプラスミドの一回分量または一回分量の半量（それぞれｓｈＲＮＡαＬｕｃ１６３およびｓｈＲＮＡαＬｕｃ１６３／２）、ルシフェラーゼに対してＵ１ｉを発現するプラスミドの一回分量または一回分量の半量（それぞれＵ１ｉαＬｕｃおよびＵ１ｉαＬｕｃ／２）、およびｓｈＲＮＡαＬｕｃ１６３の一回分量の半量とＵ１ｉαＬｕｃの一回分量の半量（ｓｈＲＮＡαＬｕｃ１６３／２＋Ｕ１ｉαＬｕｃ／２）について算出した。対照（非阻害）細胞のルシフェラーゼ活性を、残りの例で得られたルシフェラーゼ活性によって割ることにより得た阻害率が示されている。エラーバーは、９個の独立した測定値の標準偏差を表す。
【図５】弱ｓｈＲＮＡを用いたレポーター遺伝子発現阻害とＵ１ｉを用いた発現阻害との相乗作用を示す図である。対照プラスミドをトランスフェクションした細胞におけるルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼ標的配列１５４に対してｓｈＲＮＡを発現するプラスミドの一回分量または一回分量の半量（それぞれｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５４およびｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５４／２）、ルシフェラーゼに対してＵ１ｉを発現するプラスミドの一回分量または一回分量の半量（それぞれＵ１ｉαＬｕｃおよびＵ１ｉαＬｕｃ／２）、およびｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５４の一回分量の半量とＵ１ｉαＬｕｃの一回分量の半量（ｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５４／２＋Ｕ１ｉαＬｕｃ／２）について算出した。対照（非阻害）細胞のルシフェラーゼ活性を、残りの例で得られたルシフェラーゼ活性によって割ることにより得た阻害率が示されている。エラーバーは、９個の独立した測定値の標準偏差を表す。
【図６】強ｓｈＲＮＡを用いたときの相乗効果のロバストネスの解析を示す図である。対照プラスミドをトランスフェクションした細胞におけるルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼ標的配列１５４６（１５４６）に対してｓｈＲＮＡを発現するプラスミドの量を減少（１、１／２、１／４、１／８および１／２０）していった場合、ルシフェラーゼ（Ｕ１ｉαＬｕｃ）に対してＵ１ｉを発現するプラスミドの量を減少（１、１／２、１／４、１／８および１／２０）していった場合、Ｕ１ｉαＬｕｃの一回分量の半量と組み合わせてｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５４６の量を減少（１／２、１／４、１／８および１／２０）していった場合、およびｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５４６の一回分量の半量と組み合わせてＵ１ｉαＬｕｃの量を減少（１／２、１／４、１／８および１／２０）していった場合について算出した。対照（非阻害）細胞のルシフェラーゼ活性を、残りの例で得られたルシフェラーゼ活性によって割ることにより得た阻害率が示されている。エラーバーは、９個の独立した測定値の標準偏差を表す。
【図７】中ｓｈＲＮＡを用いたときの相乗効果のロバストネスの解析を示す図である。対照プラスミドをトランスフェクションした細胞におけるルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼ標的配列１６３（１６３）に対してｓｈＲＮＡを発現するプラスミドの量を減少（１、１／２、１／４、１／８および１／２０）していった場合、ルシフェラーゼ（Ｕ１ｉαＬｕｃ）に対してＵ１ｉを発現するプラスミドの量を減少（１、１／２、１／４、１／８および１／２０）していった場合、Ｕ１ｉαＬｕｃの一回分量の半量と組み合わせてｓｈＲＮＡαＬｕｃ１６３の量を減少（１／２、１／４、１／８および１／２０）していった場合、およびｓｈＲＮＡαＬｕｃ１６３の一回分量の半量と組み合わせてＵ１ｉαＬｕｃの量を減少（１／２、１／４、１／８および１／２０）していった場合について算出した。対照（非阻害）細胞のルシフェラーゼ活性を、残りの例で得られたルシフェラーゼ活性によって割ることにより得た阻害率が示されている。エラーバーは、９個の独立した測定値の標準偏差を表す。
【図８】ｓｈＲＮＡを用いた内在性遺伝子の阻害と、Ｕ１ｉを用いたときの発現阻害との相乗作用を示す図である。Ａ．ＨｅＬａ細胞に、Ｎｏｔｃｈ１標的配列１または２に対してｓｈＲＮＡを発現する二回分量のプラスミド（それぞれｓｈＲＮＡ１αＮｏｔｃｈ１ｘ２およびｓｈＲＮＡ２αＮｏｔｃｈ１ｘ２）またはｓｈＲＮＡを発現するプラスミドの一回分量と、Ｕ１ｉαＭｏｃｋまたはＵ１ｉαＮｏｔｃｈ１を発現するプラスミドの一回分量との混合物をトランスフェクションした。トランスフェクションしてから４８時間後に細胞抽出物を採取し、Ｎｏｔｃｈ１の量を、ウエスタンブロットにより評価した。Ｂ．Ａで記載したような細胞、またはＵ１ｉαＭｏｃｋでトランスフェクションもしくはＵ１ｉαＮｏｔｃｈ１の一回分量または２回分量でトランスフェクションした細胞に、ＮＦ−κＢ依存性プロモーター下、ルシフェラーゼを発現するプラスミドをトランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性は、相対単位で表した。エラーバーは、９個の独立した測定値の標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明者らは、驚くべきことに、ある標的遺伝子に特異的なＵ１ｓｎＲＮＡと、同じ標的遺伝子を対象とする遺伝子発現抑制剤とを併用すると、各々の剤を別個に使用したときよりも強く標的遺伝子の発現を阻害することを見出した。
【００１８】
いずれの理論に拘束されることを意図しないが、相乗効果は、プレｍＲＮＡのプロセシングにおいて、二つの成分が異なる位置で作用することによるものと思われる。したがって、修飾Ｕ１は、核内で、プレｍＲＮＡのポリアデニル化を阻害することにより作用し、その結果として、細胞質ゾルへの輸送を阻害し、一方で遺伝子発現抑制剤は、細胞質ゾル内で、Ｕ１阻害剤の存在下でうまく成熟できるｍＲＮＡに作用して、その分解または翻訳の阻害を引き起こすと思われる。標的プレｍＲＮＡのポリアデニル化を阻害することができる修飾Ｕ１は、以下Ｕ１ｉと称する。
【００１９】
したがって、第一に態様によれば、本発明は、
（ｉ）少なくともＵ１ｓｎＲＮＡまたはＵ１ｓｎＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含んでなる第一成分であって、Ｕ１ｓｎＲＮＡが、標的プレｍＲＮＡの３’末端エクソンの予め選択された領域に特異的に結合するように、イントロンの５’端のＧＵコンセンサス配列に対する結合配列が修飾されており、かつ標的プレｍＲＮＡの成熟を阻害することができるものである、第一成分と、
（ｉｉ）（ｉ）で定義したＵ１ｓｎＲＮＡの標的であり、そして標的ｍＲＮＡの抑制を生じさせることができるプレｍＲＮＡのプロセシングから得られるｍＲＮＡの予め選択された領域を特異的に標的とする、少なくとも一種の遺伝子発現抑制剤を含んでなる第二成分とを含んでなる、一つもしくはいくつかの容器またはパーツからなるキットにより構成されている組成物に関する。
【００２０】
したがって、本発明の組成物は２成分を含んでなり、これらの２成分は同一の容器に入れられていてもよいし、または物理的に分離された状態でもよい。さらに、本発明は、また上記で定義した成分（ｉ）および（ｉｉ）を含んでなる組成物に関する。
【００２１】
本発明による組成物の第一成分
本発明の組成物またはキットの第一成分は、標的プレｍＲＮＡの３’末端エクソンの予め選択された領域に特異的に結合するように、イントロンの５’端のＧＵコンセンサス配列に対する結合配列が修飾されているＵ１ｓｎＲＮＡをコードするポリヌクレオチドであり、標的プレｍＲＮＡ３’端のプロセシングを防ぐことができるものである。３’端のプロセシングは、非ポリアデニル化プレｍＲＮＡからポリアデニル化ｍＲＮＡを形成するのに必要な工程であると理解される（コンセンサスポリアデニル化部位のプロセシングおよびポリ（Ａ）＋尾部の付加）。これらの修飾Ｕ１ｓｎＲＮＡは、対応するｓｎＲＮＰに組み込まれて修飾ｓｎＲＮＰを生じる。修飾ｓｎＲＮＰは、イントロンプロセシング部位のプレｍＲＮＡに結合する代わりに、Ｕ１ｓｎＲＮＡの修飾領域の配列特異性によって特定の領域でプレｍＲＮＡに結合している。この相互作用は、核内へのプレｍＲＮＡの隔離、プレｍＲＮＡの成熟低下、そして次にはコードされたタンパク質の産生の減少をもたらす、ポリアデニル化機構の停止を生じる。標的プレｍＲＮＡの発現阻害を起こす修飾Ｕ１ｓｎＲＮＡの能力から、これらの修飾Ｕ１は、Ｕ１ｉとして知られている。Ｕ１の効果は、ひいては遺伝子発現の低下または阻害である。
【００２２】
修飾Ｕ１ｓｎＲＮＡの「イントロンの５’端のＧＵコンセンサス配列に結合する配列」は、いわゆるＵ１部位または５’プロセシング部位（５’−スプライス部位）との塩基対合により相互作用するＵ１ｉの５’端により形成される領域として理解される。その領域は、ＡＧ／ＧＵＲＡＧＵコンセンサス配列（但し、Ｒは、プリンであり、および／エクソン／イントロン境界を示す）により特徴づけられる、イントロンの５’領域のプレｍＲＮＡに見られ、プレｍＲＮＡのプロセシング機構がエクソン−イントロン境界を決定できるようにするものである。この領域は、Ｕ１ｓｎＲＮＡ配列の５’端の１〜１１位のヌクレオチドに対応している（Ｚｈｕａｎｇ、ＹおよびＷｅｉｎｅｒ、Ａ．Ｍ：１９８６年、Ｃｅｌｌ、４６：８２７−８３５）。
【００２３】
プレｍＲＮＡのＵ１部位に結合するコンセンサス配列の「修飾」は、コンセンサス配列が、Ｕ１ｓｎＲＮＡのプレｍＲＮＡのＵ１部位への結合能力が大幅に損失することにより生じる多数の突然変異を含むとともに、Ｕ１ｓｎＲＮＡが、標的プレｍＲＮＡの予め選択された領域との塩基対合により二重鎖を形成することができる新たな相補性を獲得するものとして理解される。本発明にしたがって修飾したＵ１部位に結合する配列と標的プレｍＲＮＡの予め選択された領域間の相補性度は、３〜１６ヌクレオチドであることができ、好ましくは８〜１６ヌクレオチド、そしてより好ましくは１０〜１１ヌクレオチドである。しかしながら、標的遺伝子の発現を阻害する最大効率は、Ｕ１部位を形成する１０〜１１ヌクレオチドが、標的プレｍＲＮＡの予め選択された部位に相補的になるように修飾されているときに見られる（図１参照）。したがって、Ｕ１ｉは、前記領域が、標的プレｍＲＮＡの予め選択された部位において１１または１０の連続したヌクレオチドと完全に相補的であるように１〜１１または２〜１１の位置の全てのヌクレオチドにおいて修飾されているのが好ましいであろう。当業者には、Ｕ１ｉを生成するために必要なことは、標的配列に見られるものとは異なる天然のＵ１において、それらのヌクレオチドを修飾することだけであることは理解されるであろう。
【００２４】
当業者には、様々な生物のＵ１ｓｎＲＮＡ配列が知られていることは理解されるであろう。したがって、特定のＵ１ｓｎＲＮＡの配列が知られていれば、天然Ｕ１ｓｎＲＮＡに相当するか、あるいはイントロン５’端と相互作用する領域の一つ以上のヌクレオチドが修飾されているかを判定することができる。
【００２５】
修飾Ｕ１の５’領域に相補配列として組み込むために予め選択される標的ｍＲＮＡの領域は、対応するプレｍＲＮＡの末端エクソンに位置している。上記Ｆｏｒｔｅｓらが示している、標的配列がポリアデニル化配列から１０００ヌクレオチド以上離れて位置しているときでさえ、レポーター遺伝子ＲＮＡの末端エクソンを標的とする修飾Ｕ１がＲＮＡの分解を引き起こすことができるということから、標的配列のポリアデニル化部位までの距離は、特に関係はない。
【００２６】
標的配列の最適最小長さが１０ヌクレオチドであるならば、前記長さの配列についての結合部位は、１０６ヌクレオチド毎に一回ランダムに出現する。このことは、ヒトゲノムでは約３０００回出現することを意味する。しかしながら、エクソンがヒトゲノムの約２％のみを構成していること、および修飾Ｕ１を用いたｓｈＲＮＡが介在した阻害では、ポリアデニル化シグナル（ＡＡＵＡＡＡ）を含む転写産物の末端エクソンで非構造化領域への対合を必要とすることから、阻害の特異性がはるかに大きくなる。抑制を実施する細胞が由来する生体の３’末端エクソンにおいて最小回数出現する標的部位を選択することが好ましい。
【００２７】
考えられる標的の出現頻度は、配列比較により決定できる。典型的には、配列比較のために、一つの配列が参照配列としての役割を果たし、それと試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いるとき、試験配列と参照配列をコンピュータに入れ、必要に応じてサブ配列座標を指定し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。好ましくは、デフォルトプログラムパラメータを使用してもよいし、あるいは別のパラメータを指定してもよい。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一度を算出する。
【００２８】
本明細書で使用される「比較ウインドウ」は、１９〜６００、通常約５０〜約２００、より一般的に約１００〜約１５０からなる群から選択される連続位置数のうちのいずれか一つのセグメントを参照することを含み、配列を同一連続位置数の参照配列と最適に整列した後、これらの２つの配列を比較することができる。比較のための配列アラインメントの方法は、当該技術分野において周知である。比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、局部相同アルゴリズム（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、１９８１年、２：４８２）によるか、相同アラインメントアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．、１９７０年、４８：４４３）によるか、類似性検索法（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８８年、８５：２４４４）によるか、アルゴリズムをコンピュータを用いて実施（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）することによるか、またはマニュアルアラインメントおよび視覚的検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５補遺）参照）により行なうことができる。
【００２９】
配列の同一度（％）および配列の類似性（％）を決定するのに好適なアルゴリズムの好ましい例は、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９７７年、２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．、１９９０年、２１５：４０３−４１０に記載されている、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０を、本明細書に記載のパラメータとともに使用して、配列同一度（％）を求める。ＢＬＡＳＴ解析を行なうためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（国立生物工学情報センター）から公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まずクエリー配列における長さＷの短いワード（ｗｏｒｄ）を同定することによって、ハイスコア配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを含む。この短いワードは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列された場合に、ある正の値の閾値スコアＴに一致するか、または満足するかのいずれかである。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（上記Ａｌｔｓｃｈｕｌら）。これらの最初の隣接するワードのヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すために検索を開始するための基礎として役立つ。そのワードのヒットは、累積のアラインメントスコアを増加することができる限りは、各々の配列に沿って、両方の方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一対のマッチング残基についての報酬スコア：常に０）およびパラメータＮ（ミスマッチング残基についてのペナルティスコア：常に０）を用いて算出される。アミノ酸配列については、スコア付けマトリックスを使用して、累積スコアを算出する。各々の方向におけるワードのヒットの伸長は、以下の場合に停止する：累積のアラインメントスコアがその達成された最大値から量Ｘだけ低下した場合；１つ以上のネガティブスコアの残基アラインメントの蓄積によって、その累積スコアがゼロ以下になった場合；または、いずれかの配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラム（ヌクレオチド配列について）は、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝ー４、および両方の鎖の比較を、デフォルトとして使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、１９８９年、８９：１０９１５参照）、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝ー４、および両方の鎖の比較を使用する。
【００３０】
好ましくは、本発明の組成物において使用される修飾Ｕ１ｓｎＲＮＡは、標的プレｍＲＮＡの配列にしたがって修飾したイントロンの５’端のＧＵコンセンサス配列に対する結合配列が標的部位と同一または実質的に同一であるように選択される。２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関連した用語「同一の」または「同一度」（％）とは、上記したデフォルトパラメータでＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを用いて測定するか、マニュアルアラインメントおよび可視検査（例えば、ＮＣＢＩウェブサイト等参照）により測定したときに、同じ（同一）であるか、または特定の割合（％）の同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２つ以上の配列またはサブ配列を意味する（すなわち、比較ウインドウまたは指定領域に対して最大一致となるように比較し、整列したときに、標的配列の特定の領域に対して、少なくとも７０％同一、好ましくは７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の割合で同一）。その結果、このような配列は、「実質的に同一」であると言われる。
【００３１】
関連配列を有する一群のタンパク質を抑制すべきである場合、あるいは抑制されるべきｍＲＮＡの正確な特定の配列が分からない（例えば、異なる血清型を示すウイルスタンパク質の場合）場合、いくつかのタンパク質を同時抑制することができるＵ１阻害剤を作成することができる。このためには、抑制されるべきタンパク質群のヌクレオチド配列内の保存配列を同定する必要がある。これは、当業者に周知のアルゴリズムを使った配列の多重アラインメントによって実施できる（例えば、Ｃｈｅｎｎａら、２００３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３１：３４９７−３５００に記載のＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム）。種々の遺伝子のうちの保存配列領域を同定したら、タンパク質群に特異的なＵ１ｓｎＲＮＡを設計するための標的として使用できる共通領域を作成する。５’配列が、この群に属する種々のもののうちの保存配列を標的とするＵ１阻害剤の作成により、この群に属するいくつかのものを同時抑制することができる。この群に属するものが高度の同一性を示し、Ｕ１阻害剤を作成するための標的として選択することができる複数の保存領域がある場合、上記パラグラフで示したように決定した抑制を実施する生体のＲＮＡの３’末端エクソンにおいて最小出現回数のものを選択する。
【００３２】
本発明によるＵ１ｓｎＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、Ｕ１ｉが発現される細胞内でポリヌクレオチドの転写を可能とするプロモーターに動作可能に結合することができる。本発明を実施するのに好適なプロモーターは、Ｕ１プロモーターなどの構成的プロモーター、またはポリオーマウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ＣＭＶ，トリ肉腫ウイルス，Ｂ型肝炎ウイルス，メタロチオネイン遺伝子プロモーター、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲ領域、免疫グロブリン遺伝子プロモーター、アクチン遺伝子プロモーター、ＥＦ−１アルファ遺伝子プロモーターなどの真核生物ウイルスゲノム由来のプロモーターが挙げられ、さらに、遺伝子の発現が、分子または外因性信号、例えば、テトラサイクリンシステム、ＮＦカッパーＢ／紫外線システム、Ｃｒｅ／Ｌｏｘシステム、および熱ショック遺伝子プロモーターなどの付加に依存する誘導性プロモーター、ＷＯ／２００６／１３５４３６号に記載の調節可能ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、さらに、組織特異的プロモーター（例えば、ＷＯ２００６０１２２２１号に記載のＰＳＡプロモーター）が挙げられるが、これらには限定されない。好ましい実施態様によれば、プロモーターは、構成的に作用するＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである。
【００３３】
また、発現を抑制すべきである遺伝子が組織において特異的に発現される場合には、組織特異的プロモーターを使用することも可能である：
−Ｈ／Ｋ−ＡＴＰアーゼベータサブユニットプロモーター、Ｋ１９プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ＴＦＦ１プロモーター、ＴＦＦ２プロモーター、ＦＯＸａ／ＨＮＦ２ガンマプロモーターなどの胃特異的プロモーター、
−エラスターゼプロモーター、Ｐｄｘ−１プロモーター、インスリンプロモーター、またはホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターなどの膵臓特異的プロモーター、
−クララ細胞分泌タンパク質プロモーター、サーファクタントタンパク質Ｃプロモーターなどの肺特異的プロモーター
−マウス乳癌ウイルスプロモーターまたはホエイ酸性タンパク質プロモーターなどの乳房特異的プロモーター、
−ケラチンプロモーターまたはＫ１４プロモーターを含む皮膚特異的プロモーター、
−ＥＢＶプロモーターｌ２などの食道特異的プロモーター、
−主要尿タンパク質プロモーターまたはアルブミンプロモーターなどの肝臓特異的プロモーター、
−ビリンプロモーターまたはＦＡＢＰ−ＴＳ４プロモーターなどの結腸特異的プロモーター、
−クリプチジン−２プロモーター、前立腺特異的抗原プロモーター、Ｃ（３）１プロモーター、９４アミノ酸（ＰＳＰ９４）を有する前立腺から分泌されるタンパク質プロモーター、またはプロバシンプロモーターなどの前立腺特異的プロモーター、
−ウロモジュリンプロモーター、タムーホースフォールタンパク質プロモーター、またはタイプ１ガンマ−グルタミントランスペプチターゼプロモーターなどの腎臓特異的プロモーター、
−ウロプラキンプロモーターまたはウロヒンギンプロモーターなどの膀胱特異的プロモーター、
−ウテログロビンプロモーターなどの子宮特異的プロモーター。
【００３４】
さらに、Ｃｈｅｎ，Ｘら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２００６年、３４、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ）によって記載されているＴｉＰｒｏＤ組織特異的プロモーターデーターベースに記載のいずれの組織特異的プロモーターも本発明に使用することができる。
【００３５】
本発明による組成物の第二成分
本発明による組成物の第二成分は、本発明の第一成分の一部分を形成しｍＲＮＡの発現抑制を引き起こすことができるＵ１ｉが標的とする標的プレｍＲＮＡのプロセシングから生成するｍＲＮＡに特異的な遺伝子発現抑制剤または遺伝子発現抑制剤の組み合わせである。
【００３６】
「遺伝子発現抑制剤」は、いわゆるＲＮＡ干渉プロセス（ＲＮＡｉ）によって、標的ｍＲＮＡの分解やその翻訳の阻害を引き起こす化合物と理解される。このプロセスにおいて、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮａｓｅ型ＩＩＩ（ダイサー）によりＲＮＡをｓｉＲＮＡに変換することによって、遺伝子発現の抑制を引き起こすことができる。ｓｉＲＮＡ鎖の一つが、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称されるリボヌクレオタンパク質複合体に組み込まれる。ＲＩＳＣ複合体は、このＲＮＡの一本鎖を使用して、分解されるかあるいは翻訳の阻害を受ける、ＲＩＳＣに組み込まれたｓｉＲＮＡのＲＮＡ鎖に少なくとも一部が相補的であるｍＲＮＡ分子を同定する。したがって、ＲＩＳＣに組み込まれたｓｉＲＮＡ鎖は、ガイド鎖またはアンチセンス鎖として知られている。トランジエントまたはセンス鎖として知られている他の鎖は、ｓｉＲＮＡから除去され、標的ｍＲＮＡと部分的に相同である。ＲＩＳＣ複合体によって標的ｍＲＮＡが分解されると、結果としてｍＲＮＡおよびコードしている対応タンパク質の発現レベルの低下を生じる。また、ＲＩＳＣは、標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害することにより、発現の低下を引き起こす。
【００３７】
本発明に関連して、「ｍＲＮＡの発現抑制を引き起こすことができる」薬剤は、細胞内にある場合、予め選択された配列を含む標的ｍＲＮＡに結合し、その分解を生じさせることができる薬剤をコードすることができる薬剤、あるいは予め選択された配列を含む標的ｍＲＮＡに結合し、その分解を生じさせることができる薬剤として理解される。
【００３８】
標的ｍＲＮＡに対してＲＮＡｉ反応を引き起こし、そして本発明の第二成分に組み込むことができる抑制剤には、以下のものがある：
（ｉ）ｓｉＲＮＡ
（ｉｉ）ｓｈＲＮＡ
（ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）に記載の薬剤をコードするポリヌクレオチド、および
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）に記載の一つまたはいくつかの薬剤の組み合わせ。
ここで、薬剤（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）は、ＲＮＡに基づくものであり、成分（ｉｖ）は、ＤＮＡに基づくものである。
【００３９】
（ｉ）ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉により標的遺伝子の発現を阻害できる薬剤である。ｓｉＲＮＡは、化学的合成または生体外転写により得ることができる。ｓｉＲＮＡは、通常１５〜４０ヌクレオチドの長さの２本ＲＮＡ鎖から構成されており、１〜６ヌクレオチドの３’および／または５’張り出し領域を含むことができる。張り出し領域の長さは、ｓｉＲＮＡ分子の全長とは無関係である。ｓｉＲＮＡは、標的メッセンジャーの分解または転写後抑制により作用する。本発明のｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの予め選択された領域と実質的に相同である。「実質的に相同」とは、ｓｉＲＮＡがＲＮＡ干渉により、標的ｍＲＮＡの分解を引き起こすことができるように、標的ｍＲＮＡと十分に相補的、または似ている配列を有していることであると理解される。実質的に相同は、上記で定義した実質的に同一を意味することもある。干渉を引き起こすのに好適なｓｉＲＮＡには、以下のようなＲＮＡから生成するｓｉＲＮＡ、さらに様々な化学修飾を含むｓｉＲＮＡなどがある：
−ホスホロチオエート結合などの、ヌクレオチド間の結合が天然で生じる結合とは異なるｓｉＲＮＡ、
−ｓｉＲＮＡ鎖と、フルオロフォアなどの機能性試薬との接合、
−２’位水酸基を種々の官能基で修飾することよる、ｓｉＲＮＡ鎖の端、特に３’端の修飾
−２’−Ｏ−メチルリボースｐ２’−Ｏ−フルオロリボースなどの、２’位にＯ−アルキル化部位等の修飾糖を有するヌクレオチド、
−ハロゲン化塩基（例えば、５−ブロモウラシルおよび５−ヨードウラシル）、アルキル化塩基（例えば、７−メチルグアノシン）のような、修飾塩基を有するヌクレオチド。
【００４０】
本発明におけるｓｉＲＮＡは、当業者に周知の一連の技術を用いて得ることができる。例えば、ｓｉＲＮＡは、従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置により、ホスホラミダイト基で保護したリボヌクレオシドから化学的に合成できる。
【００４１】
（ｉｉ）ｓｈＲＮＡ
別の方法によれば、本発明における第二成分は、ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピンＲＮＡ）である。ｓｈＲＮＡは、本発明においては、ヘアピン領域により結合した２つの逆平行鎖からなるＲＮＡ分子として理解され、逆平行鎖の一つの配列が、標的ｍＲＮＡの予め選択された領域に対して相補的なものである。ｓｈＲＮＡは、短いアンチセンス配列（１９〜２５ヌクレオチドを有する）からなり、５〜９ヌクレオチドのループ、そしてセンス鎖がそれに続く。ｓｈＲＮＡは、従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置により、ホスホラミダイト基で保護されたリボヌクレオシドから化学的に合成でき、あるいは生体外転写によりポリヌクレオチドから得ることができる。ｓｈＲＮＡは、細胞内でＲＮａｓｅダイサーにより処理されて、ヘアピン領域が除去され、先に記載したようなｓｉＲＮＡを生じる。また、ｓｈＲＮＡは、先にｓｉＲＮＡについて記載したような異なる化学修飾を含むことができる。
【００４２】
（ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ
ｍｉＲＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡは、細胞内に天然に見られ、ｍＲＮＡの分解や翻訳を調節することにより、遺伝子発現の特異性の制御に関与している小さいＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、２２−ヌクレオチドを有する一本鎖ＲＮＡ分子であり、それは、大きな一次転写産物（プリｍｉＲＮＡ）として合成され、核内でＤｒｏｓｈａ ＲＮａｓｅＩＩＩ型により処理されて、６０塩基対の「ヘアピン」前駆体（プレｍｉＲＮＡ）を生じる。これらの分子は、細胞質へ輸送され、第２ヌクレアーゼ（ダイサー）により処理されて成熟形態（ｍｉＲＮＡ）となる。ｍｉＲＮＡは、リボヌクレオタンパク質ＲＩＳＣ複合体に組み込まれ、そこで作用して、成熟ｍＲＮＡ−ＲＩＳＣ複合体と標的ｍＲＮＡの相同領域との間、特にｍｉＲＮＡ鎖のいわゆる「シード」領域（５’端の２〜７ヌクレオチド）間の対合により標的ｍＲＮＡの分解を引き起こし、ｍＲＮＡの分解および／または翻訳減衰を生じる。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ細胞の半減期を調節することにより作用する内在性分子であるが、内在性ｍＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−３０）の構造を変更してｓｉＲＮＡをコードする配列を含むことができること、および修飾ｍｉＲＮＡを使用して内在性標的遺伝子の分解を引き起こすことができることが明らかとなった（ＷＯ０３０９３４４１号）。また、ｍｉｒ−２６ａステム領域に組み込まれたｓｉＲＮＡ配列は、ＲＮＡｉエフェクターとして働いて、相同のｍＲＮＡの分解を引き起こすことも明らかとなった（ＭｃＭａｎｕｓ，Ｍ．Ｔ．ら、２００２年、ＲＮＡ、８：８４２−８５０）。どちらの場合でも、ｍｉＲＮＡステムに導入されたヌクレオチド配列は、標的遺伝子と１００％同一であることが示された。
【００４３】
本発明の組成物に使用するのに好適なｍｉＲＮＡは、１９〜約２４ヌクレオチド、好ましくは、２１または２２ヌクレオチドで構成されている。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ転写物に高特異的にハイブリダイズするように設計することができる。一つの非相補的ヌクレオチドだけが、ｍｉＲＮＡ鎖における位置に応じて、阻害レベルを減少できることから、ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡと１００％同一または実質的に同一（すなわち、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、またはそれ以上のミスマッチを許容）であることを示すように設計することが好ましい。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの翻訳されない５’領域、コード領域、または３’領域を標的とするように設計することができる。
【００４４】
ｍｉＲＮＡは、ステムーループ領域を含んでなるプレｍｉＲＮＡをプロセッシングすることにより得られる。この構造は、リボヌクレアーゼによって、好ましくはダイサーのようなリボヌクレアーゼＩＩＩ型によって認識され、成熟ｍｉＲＮＡを形成するように設計することができる。ステムーループ構造は、４０〜１００ヌクレオチド、好ましくは５０〜７０ヌクレオチド、より好ましくは２０〜３０ヌクレオチドを有することができる。ステムは、二本鎖を形成する鎖の少なくとも一つにおいて、完全に相補的な二本鎖を含んでなることができ、またはさらに非相補的領域を含むことができる。好ましくは、非相補的領域は、あまり多くなく（例えば、１、２、または３）、そしてサイズの面では３以下のヌクレオチドから構成されている。ループ末端は、４以上のヌクレオチド（好ましくは２５以下）を含んでなることができる。ループは、サイズが６〜１５ヌクレオチドであることが好ましい。
【００４５】
ｍｉＲＮＡの効率的なプロセシングおよび機能は、典型的には、ｍｉＲＮＡが、Ｚｅｎｇ等（ＲＮＡ、２００３年、９：１１２−１２３）により記載されているような一定の構造的要件を有するときだけ可能である。本発明のｍｉＲＮＡは、ステム領域が予め選択されたｍＲＮＡの標的配列で置き換えられたｍｉｒＲ−３０構造に基づいていることが好ましい。ループ領域にｍｉＲ−３０が存在することは、望ましいけれども、絶対に必要ということではない。この理由は、ループ領域がｍｉＲ−３０で見られるループ配列と７０％超、好ましくは７９％超、さらに好ましくは８６％超、さらにより好ましくは９３％超同一であるという一定のばらつきを許容することができるからでる。同一度は、上記した方法のいずれかを用いて決定できる。
【００４６】
本発明を実施するのに好適なｍｉＲＮＡは、ＷＯ０３０９３４４１号公報に記載されているような内在性ｍｉＲ−３０ｍｉＲＮＡに基づくもの、またはＷＯ０３０２９４５９号公報に記載されているような内在性ｍｉＲＮＡに基づくものである。
【００４７】
（ｉｖ）ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド
本発明における第二成分は、転写により上記したｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡを生じるポリヌクレオチドとして準備することができる。ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドにおいて、それらは、ヘヤピンまたはステム−ループ領域により接続しているｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなる配列の転写を調節する単一のプロモーター領域を含んでなる。原則として、いずれのプロモーターもｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの発現に使用することができる。ただし、プロモーターは、ｓｉＲＮＡが発現する細胞と適合するものである。したがって、本発明を実施するのに好適なプロモーターには、Ｕ１ｉの発現について上記したものなどがある。好ましい実施態様によれば、プロモーターは、構造的に作用するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、５ＳＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ＲＮＡ７ＳＬ、およびｓｎＲＮＡＵ６などの限られた遺伝子で見られる。
【００４８】
さらに、ｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、２つの転写単位を含んでなる。これらの各々は、ｓｉＲＮＡ（センスおよびアンチセンス）で形成した鎖の一つの転写を調節するプロモーターにより構成されている。ｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、収束性または分岐転写単位を含むことができる。分岐転写ポリヌクレオチドにおいて、ｓｉＲＮＡを形成する各ＤＮＡ鎖をコードする転写単位は、ポリヌクレオチドに平行に位置しており、各ＤＮＡ鎖の転写が、自らのプロモーター（同じまたは異なってもよい）に依存している（Ｗａｎｇ，Ｊ．ら、２００３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００：５１０３−５１０６およびＬｅｅ，Ｎ．Ｓ．ら、２００２年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０：５００−５０５）。収束性転写ポリヌクレオチドにおいて、ｓｉＲＮＡを生成するＤＮＡ領域は、二つの反転したプロモーターが側面に位置しているＤＮＡ領域のセンス鎖およびアンチセンス鎖を形成する。センスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖の転写後、機能性ｓｉＲＮＡに対応するハイブリッドを形成する。反転した転写単位を含んでなるポリヌクレオチドに好適なプロモーターの組み合わせには、２Ｕ６プロモーター（Ｔｒａｎ，Ｎ．ら、２００３年、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３：２１）、マウスＵ６プロモーターおよびヒトＨ１プロモーター（Ｚｈｅｎｇ，Ｌ．ら、２００４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１：１３５−１４０およびＷＯ２００５０２６３２２号）、およびヒトＵ６プロモーターおよびマウスＨ１プロモーター（Ｋａｙｋａｓ，Ａ．＆Ｍｏｏｎ，Ｒ．、２００４年、ＢＭＣ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、５：１６）などが挙げられる。好ましい実施態様によれば、センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖は、様々なプロモーターにより制御される。さらに好ましい実施態様によれば、両方の転写単位は、収束するように配向している。好ましい実施態様によれば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ型プロモーターは、ヒトおよびマウス由来のＨ１およびＵ６遺伝子のプロモーターである。さらに好ましい実施態様によれば、プロモーターは、ヒトまたはマウス由来の２Ｕ６プロモーター，マウスＵ６プロモーターおよびヒトＨ１プロモーター、またはヒトＵ６プロモーターおよびマウスＨ１プロモーターである。
【００４９】
（ｖ）一種以上のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはそれらをコードする一種以上のポリヌクレオチドの組み合わせ
本発明における第二成分は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）で示されている一種以上の成分により構成することができる。したがって、本発明は、一種以上のｓｉＲＮＡ、一種以上のｓｈＲＮＡ、一種以上のｍｉＲＮＡおよび／または前記ポリヌクレオチドをコードする一つまたはいくつかのポリヌクレオチドの併用を意図している。様々な抑制剤が、同一のｍＲＮＡの様々な領域を標的とすることができる。
【００５０】
好ましい実施態様によれば、本発明の組成物またはパーツからなるキットの成分（ｉｉ）は、少なくとも一種のｓｈＲＮＡをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチドである。
【００５１】
本発明によるベクター構築および遺伝子構築
本発明における第一成分をコードするポリヌクレオチド、さらにはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／またはｓｈＲＮＡをコードし、そして本発明における第二成分を構成するポリヌクレオチドは、それ自体を単離することができ、または好適な宿主細胞でポリヌクレオチドを増殖できるベクターの一部を構成することもできる。ポリヌクレオチドを挿入するのに好適なベクターは、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）およびそれらの誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、Ｃｏ１Ｅ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージ、およびｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などの「シャトル」ベクターなどの原核生物の発現ベクター；２ミクロンプラスミド型のベクター、組込み型プラスミド、ＹＥＰベクター、セントロメアプラスミドなどの酵母の発現ベクター；ｐＡＣ系のベクターおよびｐＶＬベクターなどの昆虫細胞の発現ベクター；ｐＩＢＩ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥ系などの植物の発現ベクター；および市販のバキュロウイルスシステムを使用し、昆虫細胞にトランスフェクトするのに好適なバキュロウイルスを含む真核細胞の発現ベクターから得られるベクターである。真核細胞用のベクターは、好ましくはウイルスベクター（アデノウイルスおよびレトロウイルス、特にレンチウイルスなどのアデノウイルスに随伴するウイルス）、さらにｐＳｉｌｅｎｃｅｒ４．１−ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ社）などの非ウイルスベクター、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ、ｐＨＭＣＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦＩ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬおよびＰＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄ、およびｐＴＤＴ１などがある。
【００５２】
好ましい実施態様によれば、Ｕ１ｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、同一のベクターの一部分を構成する。別の実施態様によれば、Ｕ１ｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、単一のベクターの一部分を構成する。
【００５３】
ベクターは、ベクターを細胞に接触させた後、ベクターが組み込まれた細胞を同定するレポーター遺伝子または標識遺伝子を含んでなることが好ましい。本発明に有用なレポーター遺伝子には、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、チミジンキナーゼ、ＧＦＰなどが挙げられる。本発明に有用な標識遺伝子には、例えば、アミノグリコシドＧ４１８耐性をもたらすネオマイシン耐性遺伝子；ハイグロマイシン耐性をもたらすハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子；オルニチンデカルボキシラーゼ（２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン（ＤＦＭＯ））の阻害剤耐性をもたらすＯＤＣ遺伝子；メトトレキサート耐性をもたらすジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子；ピューロマイシン耐性をもたらすピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子；ゼオシン耐性をもたらすｂｌｅ遺伝子；９−ベータ−Ｄ−キシロフラノースアデニン耐性をもたらすアデノシンデアミナーゼ遺伝子；Ｎ−（ホスホンアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸塩存在下、細胞を成長させるシトシンデアミナーゼ遺伝子；アミノプテリン存在下、細胞を成長させるチミジンキナーゼ遺伝子；キサンチン存在下およびグアニン不存在下、細胞を成長させるキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子；トリプトファンに代わりインドール存在下、細胞を成長させる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｔｒｐＢ遺伝子；および細胞がヒスチジンの代わりにヒスチジノールを使用するようになる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｈｉｓＤ遺伝子が挙げられる。選択した遺伝子は、真核細胞（例えば、ＣＭＶまたはＳＶ４０プロモーター）において、その遺伝子の発現に好適なプロモーター、最適化した翻訳開始部位（例えば、いわゆるＫｏｚａｋ規則またはＩＲＥＳに続く部位）、例えば、ＳＶ４０ポリアデニル化またはホスホグリセリン酸キナーゼ部位などのポリアデニル化部位，ベータ−グロブリン遺伝子イントロンなどのイントロンをさらに含んでなるプラスミドに組み込まれる。別法として、同じベクター内にレポーター遺伝子および標識遺伝子の両方を同時に組み合わせて使用することが可能である。
【００５４】
好ましい実施態様によれば、ベクターは、ウイルスベクターである。さらに好ましい実施態様によれば、本発明の第一または第二成分の発現に使用されるベクター（但し、ＤＮＡに基づくもの）は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、およびアルファウイルスからなる群より選択されるウイルスベクターである。
【００５５】
ｓｉＲＮＡを設計する基礎とされる標的ｍＲＮＡの領域は限定されず、そしてコード配列の領域（開始コドンと終止コドン間）含んでいてもよく、あるいは非翻訳５’または３’領域の配列を含んでいてもよい。好ましくは、この領域の長さは、２１〜５０ヌクレオチドであろう。
【００５６】
ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡを設計する基準は、当業者に広く知られている（例えば、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａ．ら、２００７年、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２：２０６８−２０７８；Ｌａｄｕｎｇａ，Ｉ．、２００６年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３５：４３３−４４０およびＭａｒｔｉｎｅａｕ，Ｈ．、Ｐｙｒａｈ，Ｉ．、２００７年、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．、３５：３２７−３３６、およびＰｅｉおよびＴｕｓｃｈｌ、２００６年、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、３：６７０−６７６を参照）。
【００５７】
標的遺伝子の発現を阻害するのに好適なＵ１ｉの設計基準は、上記で説明した通りである（Ｆｏｒｔｅｓ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００３年、１００：８２６４−８２６９およびＳａｊｉｃ，Ｒら、２００６年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３５：２４７−２５５参照）。好ましくは、Ｕ１ｉを設計するための基礎としてみなされる標的プレｍＲＮＡの領域は、Ｆｏｒｔｅｓら（前掲）により示された３’末端領域のみを含んでなる。
【００５８】
好ましい実施態様によれば、本発明における、パーツからなるキットの成分（ｉ）または組成物の成分（ｉ）は、いくつかのＵ１ｓｎＲＮＡまたは種々のＵ１ｉをコードするいくつかのポリヌクレオチドを含んでなり、これらの全ては同一の標的ｍＲＮＡの種々の領域を標的としている。このように、Ｕ１ｉの相乗的阻害効果は、Ｆｏｒｔｅｓら（上記）およびＳａｊｉｃら（上記）に示されているようにして得ることができる。
【００５９】
別の好ましい実施態様によれば、本発明における、パーツからなるキットの成分（ｉｉ）または組成物の成分（ｉｉ）が、（ｉ）で定義したＵ１ｓｎＲＮＡの標的であり、そして標的ｍＲＮＡの生体内抑制を生じさせることができるプレｍＲＮＡのプロセシングから得られるｍＲＮＡの異なる予め選択された領域を特異的に標的とする、いくつかの遺伝子発現抑制剤を含んでなる。
【００６０】
さらに好ましい実施態様によれば、本発明における、パーツからなるキットのまたは組成物の成分（ｉ）が、いくつかのＵ１ｓｎＲＮＡまたは、同じ標的プレｍＲＮＡの異なる予め選択された領域に特異的に結合するように、イントロンの５’端のＧＵコンセンサス配列に対する結合配列が修飾されているＵ１ｓｎＲＮＡをコードするいくつかのポリヌクレオチドを含んでなり、パーツからなるキットまたは組成物の成分（ｉｉ）が、（ｉ）で定義したＵ１ｓｎＲＮＡの標的であり、そして標的ｍＲＮＡの生体内抑制を生じさせることができるプレｍＲＮＡのプロセシングから得られるｍＲＮＡの異なる予め選択された領域を特異的に標的とする、いくつかの遺伝子発現抑制剤を含んでなる。
【００６１】
本発明による組成物は、単一の容器に双方の成分を含んでいてもよく、または二つの成分がいくつかの容器に物理的に分離されていてもよく、この場合、「本発明のキット」と称される。「キット」は、本発明では、包装して輸送および貯蔵できるようにされた、本発明による組成物の二つの異なる成分を含む製品として理解される。キット成分を包装するのに好適な材料には、ガラス、プラスチック（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートなど）、ボトル、バイアル、紙、エンベロープなどが挙げられる。さらに、本発明のキットは、キットの成分を同時、逐次または別個投与することについての説明書を備えてなることができる。その説明書は、印刷物の形態、または装置により読み取ることができるように説明書が記憶されている電子支援媒体の形態、例えば、電子記憶媒体（磁気ディスク、テープ、および同様のもの）、光媒体（ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ）であることができる。さらに、または、その媒体は説明書を提供するインターネットアドレスを含むことができる。
【００６２】
本発明における二官能性ポリヌクレオチド
本発明者らは以下を提案する。すなわち、本発明における第二成分がＤＮＡに基づくものであり、したがって、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡをコードする配列から構成されている場合、単一のポリヌクレオチドと、本発明における第一成分の配列でありＵ１ｉをコードし、処置されるべき生体を、単一投与により同時相乗効果を得るのに必要な２つの成分と接触させることができる配列との組み合わせであってもよい。したがって、別の態様によれば、本発明は、
（ｉ）標的プレｍＲＮＡの３’末端エクソンの予め選択された領域に特異的に結合するように、イントロンの５’端のＧＵコンセンサス配列に対する結合配列が修飾されており、そして標的プレｍＲＮＡのプロセシングを阻害することができる少なくとも一種のＵ１ｓｎＲＮＡをコードする配列と、
（ｉｉ）（ｉ）で定義したポリヌクレオチドがコードするＵ１ｓｎＲＮＡの標的であり、そして標的ｍＲＮＡの生体内抑制を生じさせることができるプレｍＲＮＡのプロセシングから得られるｍＲＮＡの予め選択された領域を特異的に標的とする、抑制剤をコードする配列とを含んでなる、ポリヌクレオチド（以下、本発明の二官能性ポリヌクレオチドと称する）に関する。
【００６３】
好ましい実施態様によれば、本発明の二官能性ポリヌクレオチドの成分（ｉｉ）は、少なくとも一種のｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、少なくとも一種のプレｍｉＲＮＡ、または少なくとも一種のｓｈＲＮＡをコードする。
【００６４】
別の態様によれば、本発明は、
（ｉ）標的プレｍＲＮＡの３’末端エクソンの予め選択された領域に特異的に結合するように、イントロンの５’端のＧＵコンセンサス配列に対する結合配列が修飾されており、かつ標的プレｍＲＮＡの成熟を阻害することができるＵ１ｓｎＲＮＡをコードする配列と、
（ｉｉ）少なくとも一種のｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードする配列、少なくとも一種のプレｍｉＲＮＡをコードする配列、または少なくとも一種のｓｈＲＮＡをコードする配列（ｓｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡは、（ｉ）で定義したポリヌクレオチドがコードするＵ１ｓｎＲＮＡの標的であり、かつ標的ｍＲＮＡの生体内抑制を生じさせることができるプレｍＲＮＡのプロセシングから得られるｍＲＮＡの予め選択された領域に特異的に結合している）とを含んでなるポリヌクレオチドに関する。
【００６５】
本発明による二官能性ポリヌクレオチドは、通常、発現調節領域に結合しているが、その領域はＵ１ｉをコードする配列および抑制剤をコードする配列と同一であってもよいし、または異なっていてもよい。ポリヌクレオチドの発現に好適なプロモーターは、Ｕ１ｉの発現で上記したものと同じである（構造的、調節可能、および組織特異的）。
【００６６】
同様に、本発明による二官能性ポリヌクレオチドは、発現ベクターの一部を構成することができる。したがって、別の態様によれば、本発明は、本発明による二官能性ポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターに関する。本発明によるポリヌクレオチドをクローニングまたは増殖するのに好適なベクターは、Ｕ１ｉをコードするポリヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの発現で先に述べたことと実質的に同じものである。本発明によるポリヌクレオチドの発現ベクターは、ウイルスベクターであることが好ましく、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、およびアルファウイルスからなる群より選択されるベクターであることがより好ましい。
【００６７】
別の態様によれば、本発明は、本発明による二官能性ポリヌクレオチドを含んでなる細胞または本発明の二官能性ポリヌクレオチドを含んでなるベクターに関する。本発明による組成物の発現に好適な宿主細胞には、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、および細菌細胞が挙げられるが、これらには限定されない。細菌細胞には、バチルス属、ストレプトマイシン属、およびブドウ球菌属などのグラム陽性細菌細胞、エシェリキア属およびシュードモナス属などのグラム陰性細菌細胞が挙げられるが、これらには限定されない。真菌細胞には、サッカロミセス、ピヒア・パストリス、およびハンセヌラ・ポリモルファなどの酵母細胞が好ましい。昆虫細胞には、ショウジョウバエ細胞およびＳｆ９細胞が挙げられるが、これらには限定されない。植物細胞には、特に、穀物、薬草、観賞植物、または球根植物などの作物が挙げられる。上記細胞に、アグロバクテリウム媒介遺伝子導入、葉片の形質転換、ポリエチレングリコールにより誘導する形質転換、エレクトロポレーション、超音波処理、マイクロインジェクション、および遺伝子銃などの周知の技術を用い、本発明の二官能性ポリヌクレオチドをトランスフェクトする。本発明の二官能性ポリヌクレオチドを挿入するのに好適な哺乳類細胞は、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター）細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、９１１、ＡＴ１０８０、Ａ５４９、２９３、またはＰＥＲ．Ｃ６が挙げられる。
【００６８】
別の実施態様によれば、本発明は、本発明による二官能性ポリヌクレオチドがゲノムに組み込まれた非ヒトトランスジェニック動物に関する。
【００６９】
非ヒト動物を得る方法は、本発明による二官能性ポリヌクレオチドを、生殖系列細胞を含む全ての細胞型に分化可能な幹細胞のゲノムに挿入するときにだけ実施できるものであると理解できる。これらは、胚細胞（ＥＣ）または胚性生殖細胞（ＥＧＣ）である。胚幹細胞（ＥＳＣ）は、着床前の胞胚期における胚の内部細胞塊由来のものである。マウスおよびヒトの胚幹細胞の何種類かが知られており、例えば、マウスでは、ＥＳＣ、ＴＢＶ２、Ｒ１、およびＤ３細胞などが確立されている。これらの細胞は、好適な培養条件で非分化状態のまま生体内培養でき、胚盤胞との組み合わせ、そして偽妊娠仮親の子宮に挿入した結果として、生体内で正常な成長を開始する能力を保持している。胚性生殖細胞（ＥＧＣ）は、胎児の生殖隆起から培養した始原生殖細胞（ＰＧＣ）に由来するものである。通常、修飾ＧＤＮＦ部を運ぶ本発明のＥＳＣ細胞およびＥＧＣ細胞は、宿主胚盤胞、つまり宿主胚盤胞の胞胚腔に注入するか、または桑実胚期、すなわち、無ゾーン桑実胚までの８個細胞期の未受精卵と一緒に培養し、改変ＥＳＣ細胞は成長中の胚の内部細胞塊に組み込まれるのが好ましい。
【００７０】
一部の細胞が宿主胚盤胞に由来し、一部が改変ＥＳＣ細胞に由来することから、胚盤胞に注入したトランスジェニック同腹子はキメラと呼ばれる。宿主胚は、代わりの偽妊娠雌または中間宿主に移され、継続して成長する。その結果、手順により、体細胞系組織および生殖系組織が、遺伝子工学により得られるＥＳＣ細胞由来の細胞とレセプター胚盤胞との混合物を含んでなるキメラ動物が提供される。通常、幹細胞および胚盤胞は、キメラ動物が異なる色の斑点をもつことができるように異なる皮膚色素沈着をもつ動物から得られる。したがって、これらのキメラ動物は生殖系のトランスジェニック動物、つまり、その特性が生殖により同腹子に移るように動物の生殖細胞に修飾遺伝子をもつ動物が得られるまで再び同種と掛け合わす。生殖系のトランスジェニック動物は、例えば、同腹子を観察してその特性をもつことを判定することにより、またはトランスジェニック動物の生殖細胞を検査して、遺伝率が一致するように組み込まれた導入遺伝子が存在しているかを判定することにより同定できる。これらの動物はその後、所望の特性であるが、モザイクを示さない一卵性の動物が得られるように他の動物と掛け合わされる。
【００７１】
本明細書に記載の非ヒトトランスジェニック動物は、上記のＥＳＣ細胞の方法とは異なる方法、例えば、単細胞胚の前核に標的化構築物を前核注入する方法またはトランスフェクションしたＥＳＣ細胞を基本としない他の遺伝子標的方法により生産することができることを理解すべきである。
【００７２】
いずれかの好適な非ヒト哺乳動物を使用して、本明細書に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物を生産することができる。例えば、好適な哺乳動物は、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、テンジクネズミ、スナネズミ）、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコ、イヌ、イノシシ、または霊長類であることができる。但し、この場合、全体的に良好な健康状態、良好な胚機能、胚の良好な前核可視性、および良好な生殖能力を得るために動物の特定系統または系統群が選択される。好ましい実施態様によれば、使用される動物は、マウスである。Ｃ５７ＢＬ／６またはＣ５７ＢＬ／６ｘＤＢＡ／２Ｆｉｔなどの系統、またはＦＶＢ系統（チャールズ・リバー研究所、Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．、ジャクソン研究所、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥまたはＴａｃｏｎｉｃ研究所から購入）が使用されることが多い。好ましい系統は、１２９ｓｖ系統であり、さらにＣ５７ＢＬ／６またはＤＢＡ／１などのＨ２ｂ、Ｈ−２６、またはＨ−２ｑハプロタイプを有するものである。
【００７３】
本発明による組成物の医学的用途
本発明者らは、本発明による組成物が、標的遺伝子の発現を相乗的に、すなわち、各成分を単独で作用させるよりもより効率的に、阻害できることを明らかにした。これにより、含まれる各成分が病因に関与するタンパク質のｍＲＮＡを標的とする組成物を、医薬品として使用できる。したがって、別の態様によれば、本発明は、医学分野での使用または薬剤として使用するための、上記で記載した本発明の組成物および本発明の二官能性ヌクレオチドに関する。当業者は、ある遺伝子の過剰発現により起こる、または一定の遺伝子の発現を減少させることを必要とする疾患または病気のすべての治療に組成物を使用できることができることを理解できるであろう。
【００７４】
当業者には、本発明による組成物の投与には、様々な可能性があることが理解できるだろう。組成物の二つの成分は、別個または同じ分子の形で投与してもよい。
【００７５】
さらに、第一成分および第二成分の両方をそのまま阻害分子として投与してもよい。つまり、成分（ｉ）はＵ１ｓｎＲＮＡの形で投与してもよく、成分（ｉｉ）はそのままＲＮＡ系の抑制剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡとして投与してもよい。別法として、第一成分はＵ１ｓｎＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとして提供することができ、および／または、第二成分はＤＮＡ系、つまり抑制剤をコードするポリヌクレオチドを含んでなるものである。後者の場合、ポリヌクレオチドは、第一成分および第二成分の両方を含んでなる単一のポリヌクレオチドとして、または別個のポリヌクレオチドとして、つまり、同時、別個または逐次的のいずれかで投与してもよい。
【００７６】
したがって、本発明は、投与計画の様々な組み合わせを意図しており、その組み合わせは状況に応じて医師により決定される。
−同時投与：
−成分（ｉ）はＵ１ｓｎＲＮＡそれ自体であり、成分（ｉｉ）はＲＮＡ系抑制剤である。
−成分（ｉ）はＵ１ｓｎＲＮＡそれ自体であり、成分（ｉｉ）は、ＤＮＡ系、つまり、抑制ＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含んでなる。
−成分（ｉ）は、Ｕ１ｓｎＲＮＡそれ自体をコードするポリヌクレオチドであり、成分（ｉｉ）は、ＲＮＡ系抑制剤である。
−成分（ｉ）は、Ｕ１ｓｎＲＮＡそれ自体をコードするポリヌクレオチドであり、成分（ｉｉ）は、ＤＮＡ系抑制剤、つまり、抑制ＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含んでなる。この場合、両方のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチドの一部分を構成してもいいし、あるいは別個のポリヌクレオチドとして提供することもできる。
−分別投与または逐次投与：
−成分（ｉ）は、Ｕ１ｓｎＲＮＡそれ自体であり、成分（ｉｉ）は、ＲＮＡ系抑制剤である。
−成分（ｉ）は、Ｕ１ｓｎＲＮＡそれ自体であり、（ｉｉ）は、ＤＮＡ系、つまり、抑制剤をコードするポリヌクレオチドを含んでなる。
−成分（ｉ）は、Ｕ１ｓｎＲＮＡそれ自体をコードするポリヌクレオチドであり、成分（ｉｉ）は、ＲＮＡ系抑制剤である。
−成分（ｉ）は、Ｕ１ｓｎＲＮＡそれ自体をコードするポリヌクレオチドであり、成分（ｉｉ）は、ＤＮＡ系、つまり、抑制剤をコードするポリヌクレオチドを含んでなる。この場合、両方のポリヌクレオチドは、別個のポリヌクレオチドとして提供する必要がある。
【００７７】
当業者であれば、第一成分および第二成分の両方がＤＮＡ型、つまり活性ＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドとして使用される場合、対応するポリヌクレオチドは、ベクターにおいて提供してもよいことが理解できるだろう。別個または逐次輸送の場合、各ポリヌクレオチドは異なるベクターの一部分を構成する。同時投与の場合、両方のポリヌクレオチドを、異なるベクターにおいて提供してもよいし、両方のポリヌクレオチドを含んでなる単一のベクターにおいて提供してもよい。
【００７８】
本発明による組成物を設計するための標的として使用することができる遺伝子としては、例えば、癌遺伝子；転写因子、レセプター、酵素、構造タンパク質、サイトカイン、サイトカインレセプター、レクチン、セレクチン、免疫グロブリン、キナーゼ、ホスファターゼ、プロリン、血管新生ポリペプチド、プロテアーゼおよびアポトーシスプロセスに関与するタンパク質をコードする遺伝子；接着分子をコードする遺伝子；表面レセプターをコードする遺伝子；腫瘍細胞の転移または侵襲過程に関与するタンパク質をコードする遺伝子；成長因子をコードする遺伝子；多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）；リンホカイン、サイトカイン、免疫グロブリン、Ｔ−細胞レセプター、ＭＨＣ抗原、ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子；アミノ酸、核酸、腫瘍抑制遺伝子、５−リポオキシゲナーゼ、ホスホリパーゼＡ２、プロテインキナーゼＣ、ｐ５３、ｐ１６、ｐ２１、ＭＭＡＣ１、ｐ７３、ｚａｃ１、Ｃ−ＣＡＭ、ＢＲＣＡ１、Ｒｂ、Ｈａｒａｋｉｒｉ、ＡｄＥ１Ｂ、ＩＣＥ−ＣＥＤ３プロテアーゼ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＴＮＦ、ＧＭＣＳＦ、インターフェロン、ＣＦＴＲ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＩＬ−２レセプター、エストロゲンレセプター、Ｂｃｌ−２ファミリーの一部（Ｂｃｌ−２またはＢｃｌ−ｘＬ）、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｆｉｎｓ、ｊｕｎ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔおよびａｂｌ、アミロイド前駆体タンパク質、アンギオスタチン、エンドスタチン、ＭＥＴＨ−１、ＭＥＴＨ−２、ＩＸ因子、ＶＩＩＩ因子、コラーゲン、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリンＤ１、サイクリンＥ、ＷＡＦ１、ｃｄｋ４阻害剤、ＭＴＳ１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、トロンボポエチン、ＢＮＤＦ、ＢＭＰ、ＧＧＲＰ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＧＤＮＦ、ＧＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＫＧＦ、ミオトロフィン、ＮＧＦ、ＯＳＭ、ＰＤＧＦ、ソマトロフィン、ＴＧＦ−ベータ、ＴＧＦ−アルファ、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、カテプシンＫ、シトクロムＰ−４５０、ファルネシルトランスフェラーゼ、グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ、ヘパラナーゼ、ＨＭＧＣｏＡシンテターゼ、ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、フェニルアラニン水酸化酵素、ホスホジエステラーゼ、ｒａｓのカルボキシ末端プロテアーゼ、Ｎｏｔｃｈ、テロメラーゼ、ＴＮＦ−変換酵素、カドヘリンＥ、カドヘリンＮ、セレクチン、ＣＤ４０、ＡＮＦ、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、グルカゴン、ゴナドトロピン、ゴナドトロピン放出ホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、ソマトトロピン、インスリン、レプチン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、ＰＴＨ、甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、免疫グロブリンＣＴＬＡ４、血球凝集素、ＭＨＣ、ＶＬＡ−４、カリクレイン−キニノーゲン−キニンＣＤ４系、ｓｉｓ、ｈｓｔ、ｒａｓ、ａｂｌ、ｍｏｓ、ｍｙｃ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、Ｈ−ｒａｓ、ｋｉ−ｒａｓ、ｃ−ｆｉｎｓ、ｂｃｌ−２、Ｌ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ、ｇｉｐ、ｇｓｐ、ＨＥＲ−２、ボンベシンレセプター、ＧＡＢＡレセプター、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＮＧＦＲ、インターロイキンレセプター、イオンチャンネルレセプター、ロイコトリエンレセプターアンタゴニスト、リポタンパク質レセプター、オピオイドレセプター、サブスタンスＰレセプター、レチノイン酸およびレチノイドレセプター、ステロイドレセプター、Ｔ−細胞レセプター、甲状腺ホルモンレセプター、ＴＮＦレセプター、ｔＰＡレセプター、カルシウムポンプ、プロトンポンプ、Ｎａ／Ｃａ交換体、ＭＲＰ１、ＭＲＰ２、Ｐ１７０、ＬＲＰ、ｃＭＯＡＴ、トランスフェリン、ＡＰＣ、ｂｒｃａ１、ｂｒｃａ２、ＤＣＣ、ＭＣＣ、ＭＴＳ１、ＮＦ１、ＮＦ２、ｎｍ２３、ｐ５３、およびＲｂの合成など代謝過程に関与する遺伝子が挙げられるが、これらには限定されない。
【００７９】
本発明による組成物は、感染症疾患、腫瘍性疾患、新生物疾患、または神経変性疾患に関与する遺伝子を標的とすることができる。したがって、別の態様によれば、本発明は、感染症疾患、腫瘍性疾患、新生物疾患、または神経変性疾患の治療または予防のための、本発明の組成物またはキット、本発明の二官能性ポリヌクレオチド、または二官能性ポリヌクレオチドを含んでなるベクターまたは細胞を提供する。
【００８０】
さらに別の態様によれば、本発明は、感染症疾患、腫瘍性疾患、新生物疾患、または神経変性疾患の治療または予防のための薬剤を調製するための、本発明の組成物またはキット、本発明の二官能性ポリヌクレオチド、または本発明の二官能性ポリヌクレオチドを含んでなるベクターまたは細胞の使用を提供する。
【００８１】
さらに別の態様によれば、本発明は、本発明の組成物またはキット、本発明の二官能性ポリヌクレオチド、または本発明の二官能性ポリヌクレオチドを含んでなるベクターまたは細胞を、それを必要としている患者に投与することを含んでなる感染症疾患、腫瘍性疾患、新生物疾患、または神経変性疾患の治療方法を提供する。
【００８２】
好ましい実施態様によれば、本発明による組成物は、前記生物の病原性に必要不可欠な病原体遺伝子、さらに宿主と相互作用する病原体に必要不可欠な宿主遺伝子を標的とすることができる。この場合、組成物は、感染症疾患、例えば、ウイルスおよび細菌感染症など治療するのに好適なものである。したがって、別の態様によれば、本発明は、感染症疾患の治療または予防のための、本発明の二官能性ポリヌクレオチド、本発明のベクターまたは本発明の細胞を有する本発明の組成物またはキットに関する。別の実施態様によれば、本発明は、感染症疾患の治療または予防のための薬剤を調製するための、本発明の二官能性ポリヌクレオチド、本発明のベクターまたは本発明の細胞を有する本発明の組成物またはキットの使用に関する。
【００８３】
本発明の組成物により治療可能なウイルス感染症は、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）に関与するコロナウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトＴ−細胞リンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ）１型および２型、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１型および２型、サイトメガロウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、エプスタイン・バールウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルス、センダイウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、および麻疹ウイルスに関係する疾患や病気が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
本発明の組成物により治療可能な細菌性疾患（便宜上、酵母および真菌障害、酵母および真菌疾患も含まれる）は、アシネトバクター種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、アルガリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バクテロイデス・フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・オバタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｏｖａｔｕｓ）、バクテロイデス・ウレオリティカス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｒｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）、バクテロイデス・ブルガータス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア・ビンセンティ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ）、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブルセラ・スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ）、カンピロバクター（ビブリオ）フィータス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ（Ｖｉｂｒｉｏ）ｆｅｔｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐｐ．）、シトロバクター・ディバーサス（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｄｉｖｅｒｓｕｓ）、シトロバクター・フロインデイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、コリネバクテリウム・ジェイケイウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｅｉｋｅｉｕｍ）、クロストリディウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・ラモサム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｍｏｓｕｍ）、クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、クロストリディウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、コリネバクテリウム・ジフセリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、エドワードシエラ・タルダ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、クレブシエラ・オザエナエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｚａｅｎａｅ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・リノスクレロモチス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｒｈｉｎｏｓｃｌｅｒｏｍｏｔｉｓ）、レプトスピラ・イクテロヘモルハギア（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．）、ナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ）、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ペプトストレプトコッカス・アネロビウス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎａｅｒｏｂｉｕｓ）、ペプトストレプトコッカス・アサッカロリティカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、プレボテラ・ビビア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｉｖｉａ）およびプレボテラ・メラニノゲニカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、リケッチア
プロワツェキイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉ）、リケッチア・ツツガムシ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇｕｍｕｓｈｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シゲラ・ディセンテリエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、シゲラ・ソンネ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ストレプトコッカスＣ群（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｒｏｕｐ Ｃ）、ストレプトコッカスＧ群（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｒｏｕｐ Ｇ）、スタフィロコッカス・ヘモリチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・ホミニス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｍｉｎｉｓ）、スタフィロコッカス・シミュランス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｍｕｌａｎｓ）、スタフィロコッカス・ワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｒｎｅｒｉ）、スタフィロコッカス・キシロサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｘｙｌｏｓｕｓ）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ）、ストレプトコッカス・エクイナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、トレポネーマ・カラテネウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｃａｒａｔｅｎｅｕｍ）、トレポネーマ・パリズム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、トレポネーマ・ペルテヌエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、およびエルシニア・シュードツベルクローシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に関連する障害および疾患が挙げられるが、これらには限定されない。
【００８５】
別の実施態様によれば、本発明の組成物およびキットならびに本発明の二官能性ポリヌクレオチドは、腫瘍形成および／または新生形成過程に関与する遺伝子を標的とし、したがって、新生形成過程および異なる種類の癌、例えば、血液癌（例えば、白血病またはリンパ腫）、神経癌（例えば、星状細胞腫またはグリア芽腫）、黒色腫、乳癌、肺癌、頭部および頸部癌、胃腸腫瘍（例えば、胃癌、膵臓癌または結腸癌）、肝臓癌、腎細胞癌、泌尿生殖器癌（例えば、卵巣癌、膣癌、子宮頸癌、膀胱癌、精巣癌、および前立腺癌）、骨腫瘍および血管腫瘍に対して活性な組成物が得られる。したがって、別の態様によれば、本発明は、腫瘍性疾患または新生物疾患の治療または予防のための、本発明の二官能性ポリヌクレオチド、本発明のベクター、または本発明の細胞を有する本発明の組成物またはキットに関する。別の実施態様によれば、本発明は、腫瘍性疾患または新生物疾患の治療または予防用医薬品を調製するための、本発明の二官能性ポリヌクレオチド、本発明のベクター、または本発明の細胞を有する本発明の組成物またはキットの使用に関する。
【００８６】
別の実施態様によれば、本発明の組成物および二官能性ポリヌクレオチドは、網膜色素変性症、アレキサンダー病、アルパース病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）、カナバン病、コケーン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、ＨＩＶ関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、レヴィー小体認知症、マシャド・ジョセフ病（３型脊髄小脳失調）、多発性硬化症、多系統萎縮症、神経ボレリア症、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッハー病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、統合失調症、シュピールマイアーフォークトシェーグレンバッテン病（バッテン病としても知られている）、脊髄小脳失調、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー症候群、脊髄癆などの神経変性過程に関与する遺伝子を標的とする。したがって、別の態様によれば、本発明は、神経変性疾患の治療または予防のための、本発明の二官能性ポリヌクレオチド、本発明のベクター、または本発明の細胞を有する本発明の組成物またはキットに関する。別の実施態様によれば、本発明は、神経変性疾患の治療または予防用医薬品を調製のための、本発明の二官能性ポリヌクレオチド、本発明のベクター、または本発明の細胞を有する本発明の組成物またはキットの使用に関する。
【００８７】
別の態様によれば、本発明は、本発明の組成物または本発明の二官能性ポリヌクレオチドを一種以上の薬学的に許容される担体と一緒に含んでなる医薬に関する。薬学的に許容される担体は、固体または液体であることができる。固体担体には、香料、潤滑剤、可溶化剤、懸濁剤、賦形剤、滑剤、圧縮剤、結合剤、または錠剤崩壊剤としても作用することができる一種以上の物質を含んでなることができる。それらはまた封入材料でもある。粉剤では、担体は微粉化固体であり、微粉化した有効成分と混合する。錠剤では、有効成分が、適当な特性の中で必要とされる圧縮特性を有する担体と混合され、所望の形状と大きさに圧縮される。粉剤と錠剤は、有効成分を最大９９％含むことができる。好適な固体担体には、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、低融点ワックス、およびイオン交換樹脂などがある。
【００８８】
液体担体は、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ、エリキシル剤、および圧縮組成物の調製に使用される。有効成分は、薬学的に許容される液体担体、例えば、水、有機溶媒、両方の混合物、薬学的に許容される油または脂質などに溶解または懸濁することができる。液体担体は、可溶化剤、乳化剤、界面活性剤、緩衝剤、防腐剤、甘味剤、香料、懸濁剤、増粘剤、着色剤、粘性調節剤、安定剤、または浸透圧調節剤などの他の薬学的に好適な添加剤を含むことができる。経口投与または非経口投与用に好適な液体担体には、水（特に、前述の添加剤、例えば、セルロース誘導体、可能であれば、カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を含んでいる）、アルコール（一価アルコールまたは多価アルコール、例えば、グリコールを含んでいる）およびそれらの誘導体、および油（例えば、分留ヤシ油またはピーナッツ油）が挙げられる。非経口投与については、担体は、また、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルなどのエステル油であってもよい。無菌液体担体は、非経口投与に有用な液体形状の無菌組成物である。圧縮組成物用の液体担体は、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に好適な推進剤であってもよい。
【００８９】
無菌溶液または懸濁液である液体医薬組成物は、筋肉注射、腹腔内注射、皮下注射に好適である。無菌溶液は、また静脈内投与することができる。また、その組成物は、液体または固体の形状で経口投与することもできる。経肺投与も意図される。
【００９０】
医薬組成物は、例えば、錠剤またはカプセルのような形状でもよい。その形状では、組成物は好適な有効成分量を含む投与量単位に細かく分割する。その投与量単位の形状は、包装した粉体、バイアル、ブリスター、プレフィルドシリンジ、または液体を含む小袋などの包装組成物であってもよい。投与量単位の形状は、例えば、カプセルや錠剤であってもよく、またはこれらの組成物のいずれかを適当量を包装した形でもよい。治療で用いられる投与量は、医師により主観的に決定される必要がある。
【００９１】
さらに、本発明の化合物は、薬学的に許容される賦形剤を用いて製剤化することにより液体、クリーム、またはローションとして使用することができ、患部に塗ることができる。
【００９２】
さらに、本発明は、医薬組成物、特に本発明における第一成分および第二成分を構成する核酸の投与用、または本発明の二官能性ポリヌクレオチドの投与用に調製した医薬組成物を意図している。医薬組成物は、第一成分および第二成分の両方を含んでなり、両方が裸のままのＤＮＡ系さらにはＲＮＡ系である、すなわち、生体のヌクレアーゼによる分解から核酸を保護する化合物が欠如している状態であるならば、トランスフェクションに用いられる試薬に関連する毒性を除く利点を伴う。裸の化合物に好適な投与経路には、血管内、腫瘍内、頭蓋内、腹腔内、脾臓内、筋肉内、網膜下、皮下、粘膜、局所、または経口経路（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ、２００２年、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、２１：８５７−８６７）などがある。これらの化合物が裸の状態で投与されたときの免疫反応を誘導する能力に関する事柄がＨｅｉｄｅｌら（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００４年、２２：１５７９−１５８２）により最初に調査された。ｓｉＲＮＡを腹腔内および静脈内投与した後の血漿インターロイキンおよびインターフェロンレベルを測定したところ、免疫反応が観察されず、一方で、同時に、ｓｉＲＮＡの全身投与も十分に許容できるものであることが分かった。
【００９３】
別の実施態様によれば、本発明の組成物およびポリヌクレオチドは、いわゆる「ハイドロダイナミック（Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ）投与」によって投与され、これにより組成物が生体の血管内に高速および多量に導入されることにより、より拡散した分布の高トランスフェクションレベルが得られる。この手法を改善したものでは、多臓器で、外来遺伝子（Ｌｅｗｉｓら、２００２年、Ｎａｔ．Ｇｅｎ．，３２：１０７−１０８；ＭｃＣａｆｆｒｅｙら、２００２年、Ｎａｔｕｒｅ、４１８：３８−３９）および内在性遺伝子（Ｓｏｎｇら、２００３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、９：３４７−３５１）の裸ｓｉＲＮＡにより抑制の陽性結果を得ることができる。分子間移動の有効性は、液体の投与量や注入速度に直接依存していることが判明した（Ｌｉｕら、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０５：１４３７−１４４１）。マウスでは、投与量を、３〜５秒間において体重１０ｇあたり１ｍｌに最適化した（Ｈｏｄｇｅｓら、２００３年、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．、３：９１−９１８）。ｓｉＲＮＡをハイドロダイナミック投与した後にｓｉＲＮＡの生体内細胞トランスフェクションが起きる正確な機構はよく知られていない。マウスの場合では、尾静脈投与は心拍数を超える速度で行い、そして投与する液体は上大静脈に蓄積すると考えられる。液体はそれから臓器の血管に移動し、その後血管の穿孔を通過して血管外スペースに到達する。このようにして、ｓｉＲＮＡは血液と混合する前に標的生物の細胞に接触するので、ヌクレアーゼによる分解の可能性が低下する。好ましい実施態様によれば、本発明の組成物の第一成分を構成するＵ１ｉと本発明の組成物の第二成分を構成するＲＮＡ系の成分の両方は、それらの安定性増加に寄与する構造の修飾を含むことができる。ヌクレアーゼに対する感受性を減少する好適な修飾には、２’−Ｏ−メチル（Ｃｚａｕｄｅｒｎａら、２００３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３１：２７０５−２７１６）および２’−フルオロピリミジン（Ｌａｙｚｅｒら、２００４年、ＲＮＡ、１０：７６６−７７１）などが挙げられる。
【００９４】
本発明の組成物およびポリヌクレオチドを投与して、コレステロールまたは細胞膜介して転位を引き起こすことができる化合物、例えば、ＷＯ０７０６９０９０号（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ，Ａ．ら、２０００年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．、２１：９９−１０３；Ｓｃｈｗａｒｚｅ，Ｓ．Ｒ．ら、２０００年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．、２１：４５−４８、Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，Ｍ．ら、２００３年、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ、８：１４３−１５０およびＳｎｙｄｅｒ，Ｅ．Ｌ．およびＤｏｗｄｙ，Ｓ．Ｆ．、２００４年、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、２１：３８９−３９３）に記載のＨＩＶ−１ＴＡＴタンパク質由来のＴＡＴペプチド、キイロショウジョウバエアンテナペディアタンパク質のホメオドメインの第３へリックス、単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２タンパク質、アルギニンオリゴマーおよびペプチドなどと接合したリポソームの一部を形成することができる。別法として、本発明の第二成分がＤＮＡに基づくものであるとき、それを投与して、プラスミドベクターまたはウイルスベクターの一部を形成することができる。これらは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはレトロウイルスに基づくものであることが好ましく、特にマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）またはレンチウイルス（ＨＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶ）に基づくウイルスであることが好ましい。
【００９５】
別の実施態様によれば、医薬組成物が第一成分および第二成分により構成される場合、その組成物が本発明の組成物の第一成分および第二成分を同時、逐次または別個に使用することについての説明書を含んでなることができる。したがって、別の態様によれば、本発明は、組成物の第一成分および第二成分を同時、逐次または別個に使用することについての説明書を含んでなる本発明の組成物またはキットに関する。さらに別の態様によれば、本発明は、同時、逐次または別個に使用するための組み合わせ製剤としての本発明の組成物またはキットに関する。
【００９６】
当業者は、投与計画および治療の対象となる患者を、本発明にしたがって決定することができることを理解できるだろう。推奨投与量は、違う患者に対して間違った薬剤を不正な投与量で処方することを防止する情報として、製品のラベルに表示してあり、処方する人が対象となる患者のグループにしたがって、投与量の調整を予測できる。
【００９７】
投与計画は、医師および他の臨床学的な要因により決められ、上記した方法の一つにしたがって決めることが好ましい。医学では、周知の通り、患者への投与量は多くの要因、例えば、患者のサイズ、体の表面積、年齢、投与される化合物の詳細、性別、投与時間および投与経路、総体的な健康、および同時に他の薬剤が投与されるかどうかなどに依存している。経過は、定期的検査を通じて観察することができる。
【００９８】
本発明による組成物は、体重１キログラムあたり１０ｍｇ未満の量で投与でき、好ましくは、体重１キログラムあたり５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、または０．００００１ｍｇ未満の量で、そして、２００ｎｍｏｌ未満の量のＲＮＡ剤、すなわち、体重１キログラムあたり約４．４ｘ１０１６コピーまたは体重１キログラムあたり１５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、または０．０７５ｎｍｏｌ未満の量で投与できる。単位投与量を、注入投与、吸入投与または局所投与できる。本発明の組成物および二官能性ヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡが発現する器官に直接投与できる。この場合、器官あたり０．００００１ｍｇ〜３ｍｇ、好ましくは器官あたり０．０００１〜０．００１ｍｇ、器官あたり約０．０３〜３．０ｍｇ、器官あたり約０．１〜３．０ｍｇ、または器官あたり０．３〜３．０ｍｇを投与する。
【００９９】
投与量は治療する病気の重症度および反応に依存し、投与量は、数日〜数ヶ月間または病気の寛解が確認されるまで変更することができる。至適投与量は、患者体内の薬剤濃度を定期的に測定することにより決めることができる。至適投与量は、動物モデルを使った事前の生体外または生体内アッセイから得られるＥＣ５０値から決めることができる。単位投与量を、一日に一回または一日に一回未満、好ましくは２、４、８、または３０日毎に一回未満で投与することができる。また、一般的に初回量より少量である一回または数回の維持量の後で初回量を投与することができる。維持量の投与計画では、１日あたりおよび体重１キログラムあたり０．０１μｇ〜１．４ｍｇ、例えば、１日あたりおよび体重１キログラムあたり１０、１、０．１、０．０１、０．００１、または０．００００１ｍｇの投与量で患者を治療することを含むことができる。維持量は、多くても５、１０、または３０日毎に投与することが好ましい。治療は、患者が患っている疾患の種類、重症度および患者の状態にしたがって変更できる期間継続する必要がある。治療後、患者の経過を観察して、疾患が治療に反応しない場合には投与量を増加すべきかどうか決定し、あるいは疾患の改善が認めらる場合もしくは望ましくない副作用が認められる場合に投与量を減少するかどうかを決定する必要がある。
【０１００】
１日投与量は、特定の状況にしたがって一回で投与してもいいし、２回以上に分けて投与してもよい。連続投与または頻回投与が望ましい場合、埋め込み式のポンプ、半永久的なカテーテル（静脈内、腹腔内、嚢内、または関節包内）、または貯蔵器など、投与用の機器を使用するのが望ましい。
【０１０１】
別の態様によれば、本発明は、標的遺伝子発現の転写後阻害のための生体外および生体内非治療的方法に関し、本発明の組成物または二官能性ヌクレオチドを生体モデルに接触させることを含んでなる。生体モデルは、細胞培養物または動物であることが好ましい。
【０１０２】
細胞培養への応用に好適な組成物およびポリヌクレオチドの場合では、ポリヌクレオチドが細胞内部へ到達できるための様々な手法がある。一方では、細胞を裸のポリヌクレオチドと接触させることが可能である。細胞をそのポリヌクレオチドに接触させると、エンドソーム区画へは到達できるが、機能状態で細胞質に到達できない（Ｌｉｎｇｏｒ，Ｐ．ら、２００４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３１５：１１２３−１１３３）。したがって、ポリヌクレオチドは、マイクロインジェクションまたはエレクトロポレーションによって投与することが好ましい。または、ＤＮＡおよびＲＮＡポリヌクレオチドのトランスフェクション用に、特に、カチオン性リポソーム、膜透過性ペプチド、アテロコラーゲン、ポリアスパラギン酸ポリエチレングリコールとリン酸カルシウムのポリマーからなる有機無機ナノ粒子混成物（Ｋａｋｉｚａｗａら、２００４年；Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．、９７：３４５−３５６；Ｍｉｎａｋｕｃｈｉら、２００４年、Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３２：１０９およびＭｕｒａｔｏｖｓｋａおよびＥｃｃｌｅｓ、２００４年、Ｆｅｄ．Ｅｕｒｏ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｌｅｔｔ．、５５８：６３−６８）などの適当な試薬を用いた化学的トランスフェクションを使うことが可能である。別の実施態様によれば、本発明のポリヌクレオチドは、発現ベクターを使用して投与することができる。明らかに、本発明の組成物の第二成分がＤＮＡに基づくものであるとき、この手法が唯一の方法である。
【０１０３】
別法として、細胞による捕獲を増加することができる化学的部分で、本発明の組成物を構成する薬剤を改良することができる。したがって、本発明を構成する薬剤を、ペプチドおよび有機化合物などの異なる種類の化合物と接合することができる。接合は、当業者に知られている方法、例えば、核酸をポリアルキルシアノアクリレート（ＰＡＣＡ）のナノ粒子に結合するＬａｍｂｅｒｔら（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．、２００１年、Ｒｅｖ．：４７：９９−１１２）の方法；核酸をナノ粒子に結合したＦａｔｔａｌら（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １９９８年、５３：１３７−１４３）が記載している方法；挿入剤、疎水性基、ポリカチオンまたはＰＡＣＡナノ粒子に特異的な核酸を記載しているＳｃｈｗａｂら（Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１９９４年、５ Ｓｕｐｐｌ．４：５５−５８）の方法；および核酸をナノ粒子に結合したＧｏｄａｒｄら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９５年、２３２：４０４−４１０）が記載している方法により実施できる。
【０１０４】
別の実施態様によれば、本発明による薬剤は、陽イオン性基を含み且つ発現抑制剤の二本鎖と結合できる脂溶性部分に結合している。好適な脂溶性薬剤には、コレステロール、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＡ，葉酸、カチオン性着色剤（例えば、Ｃｙ３）、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リソコール酸、０３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンなどがある。
【０１０５】
抑制効果は、表現型の変化を検出することにより、またはＲＮＡハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロアレイ、ウエスタンブロット法、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、およびＦＡＣＳによる遺伝子発現の観察などの手法によって、あるｍＲＮＡまたはそれがコードするタンパク質の発現レベルの変化を検出する生化学的手法を使い観測できる。動物モデルまたは培養細胞モデルにおいては、レポーター遺伝子または毒物に耐性のある遺伝子の発現の修飾（その産物を容易に検出できる）を検出することが可能である。好適なレポーター遺伝子には、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）、およびそれらの誘導体などがある。好適な選択マーカーには、アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン、およびテトラサイクリンに対する耐性をコードする遺伝子などがある。
【０１０６】
別法として、転写後遺伝子発現を抑制する非治療的方法は、発現が抑制されるべき遺伝子が発現している動物モデルに適用できる。この場合、遺伝子発現抑制剤が、遺伝子発現の転写後抑制を起こすべき動物における組織または器官に到達する必要がある。そのために、本発明の薬剤を患者へ治療目的で投与するための上記したいずれかの方法を使用することができる。好ましい実施態様によれば、本発明は、同じ機能的経路で関与するタンパク質をコードする様々な標的ｍＲＮＡを標的とする組成物の投与を意図している。本発明の組成物の組み合わせの使用による阻害対象となる機能的経路には、解糖、糖新生、クレブス回路、ペントースリン酸経、グリコーゲン合成、カルビン回路、トリアシルグリセリド分解、脂肪酸の活性化、ベータ酸化、脂肪酸デノボ合成、コレステロール合成、尿素サイクル、シキミ酸経路、アミノ酸の合成、酸化的リン酸化、光合成、プリン合成、ピリミジン合成、ヒスチジン代謝、ポルフィリン代謝、イノシトール代謝などがあるが、これらに限定されない。当業者には、前述の経路の様々な段階、さらに各段階に関与する酵素が知られており、したがって、前記プロセスの各段階で関与する一つまたはいくつかの遺伝子に特異的なＵ１ｉおよび他の発現抑制剤の開発が、プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡにおける標的配列を選択する上記した基準がＵ１ｉまたは同様の抑制剤により認識されるより大きな可能性がある場合には、日常の実験により実施できることが理解できるであろう。
【０１０７】
遺伝子治療は、生体外または生体内技術による細胞内への治療遺伝子の挿入に基づいており、遺伝子導入の最も重要な応用の一つである。文献には、生体外または生体内遺伝子治療に好適なベクターおよび方法が記載され、そして当業者に知られている；例えば、Ｇｉｏｒｄａｎｏ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（１９９６年）、５３４−５３９；Ｓｃｈａｐｅｒ、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ ７９（１９９６年）、９１１−９１９；Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６（１９９２年）、８０８−８１３；Ｉｓｎｅｒ、Ｌａｎｃｅｔ ３４８（１９９６年）、３７０−３７４；Ｍｕｈｌｈａｕｓｅｒ、Ｃｉｒｃ．、Ｒｅｓ ７７（１９９５年）、１０７７−１０８６；Ｗａｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（１９９６年）、７１４−７１６；ＷＯ９４／２９４６９号；ＷＯ９７／００９５７号またはＳｃｈａｐｅｒ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７（１９９６年）、６３５−６４０およびそこにあげられている文献参照。遺伝子は、細胞に直接挿入するか、あるいはリポソームまたはウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター）により挿入するように設計することができる。その細胞は、非ヒト生殖系列細胞、非ヒト胚細胞または非ヒト卵細胞、またはそれらの細胞から誘導される細胞であることが好ましい。より好ましくは、成体幹細胞または非ヒト胚幹細胞である。上記から明らかなように、本発明の使用において、核酸配列は、特定の細胞で本発明のポリペプチドの発現および／または融合を起こす調節要素に動作可能に結合していることが好ましい。本発明に従って使用するのに好適な遺伝子分配システムは、特に、リポソーム、レセプター媒体分配システム、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなどの裸のＤＮＡおよびウイルスベクターなどを含んでもよい。遺伝子治療をする体の特異的な部位への核酸分配システムは、またＷｉｌｌｉａｍｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８（１９９１年）、２７２６−２７２９）に記載されている微粒子銃分配システムを使用することによって実現できる。組み換えＤＮＡを細胞にトランスフェクトする標準的な方法は、分子生物学の当業者によく知られた方法であり、例えば、ＷＯ９４／２９４６９号、また上記を参照されたい。遺伝子治療は、本発明の組み換えＤＮＡ分子またはベクターを患者に直接投与することによって、または本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを生体外で細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を患者に投与することによって行なわれる。
【０１０８】
本発明において特に好ましい遺伝子治療ベクターは、パルボウイルスベクターである。したがって、本発明の好ましい態様では、本発明は、動物パルボウイルスの使用、特にディペンドウイルス、例えば、感染性ヒトＡＡＶまたは感染性サルＡＡＶの使用、および本発明のキットの組成物の導入および／または発現用ベクターとして使用するためのそれらの成分（例えば、動物パルボウイルスゲノム）に関する。
【０１０９】
パルボウイルス科ファミリーのウイルスは、小型ＤＮＡをもつ動物ウイルスである。パルボウイルス科ファミリーは、脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科と昆虫に感染するデンソウイルス亜科の二つの亜科に分けることができる。パルボウイルス亜科は、ここでは、パルボウイルスと呼び、ディペンドウイルス属が含まれる。それらの属の名前から推定できるように、ディペンドウイルスは、通常細胞培養において増殖感染するためにアデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスによる重感染が必要であるという点で他に類がない。ディペンドウイルス属には、一般的にヒト（例えば、血清型２、３Ａ、３Ｂ、５、および６）または霊長類（例えば、血清型１および４、サルが起源と考えられているが、ヒトにも感染する）に感染するＡＡＶや他の温血動物に感染する近縁ウイルス（例えば、ウシ、イヌ、ウマ、およびヒツジアデノ随伴ウイルス）が含まれる。さらに、ＡＡＶ血清型およびＡＡＶ血清型由来のハイブリッドＡＡＶベクターを作製する方法に関する情報が、Ｗｕら（２００６年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １４：３１６−３２７）により記載されている。本発明は、ＡＡＶには限定されず、等しく二種以上の異なるＡＡＶ血清型に由来するハイブリッドＡＡＶベクター、ならびに他のパルボウイルスおよびそれらのハイブリッドに適用できる。遺伝子治療にＡＡＶベクターを使用することに関する技術は、例えば、ＷＯ２００７／０４６７０３号およびＷＯ２００７／１４８９７１号に記載されている。
【０１１０】
したがって、本発明の組成物またはポリヌクレオチドは、少なくとも一つのパルボウイルスまたはＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が側に位置している、意図する本発明の配列のポリヌクレオチドを含んでなるベクターを指すことがある「組み換えパルボウイルスベクターまたはＡＡＶベクター」（「ｒＡＡＶベクター」）を使用して供給することができる。本発明の組成物は、２つのｒＡＡＶベクター（各々がこのような組成物の成分のうちの一つをコードする）を用いて供給することができる。本発明において使用するのに好適なｒＡＡＶベクターは、感染ウイルス粒子がＡＡＶｒｅｐおよびＡＡＶｃａｐ遺伝子産生物（すなわち、ＡＡＶＲｅｐおよびＡＡＶＣａｐタンパク質）を発現している昆虫宿主細胞内に存在するとき、複製され、感染ウイルス粒子内に取り込まれる。ｒＡＡＶベクターが大きな核酸構築物（例えば、染色体または、クローニングあるいはトランスフェクションに使用されるプラスミドまたはバキュロウイルスなどの他のベクター）に組み込まれる場合、ｒＡＡＶベクターは、「プロベクター」と呼ばれ、ＡＡＶ取り込み機能および必要なヘルパー機能の存在下で、複製およびキャプシド化により「レスキュー」されることができる。
【０１１１】
以下、本発明を実施例により説明するが、これらの実施例は説明の目的で記載され、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１１２】
実施例１．
１．１試薬
【０１１３】
実験で使用されたｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡの一覧：
【表１】
【０１１４】
ｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡの配列
Ａ：５’配列；Ｂ：センス（トランジエントストランド）；Ｃ：ループ；Ｄ：アンチセンス（ガイド鎖）；Ｅ：終結シグナル
【表２】
【０１１５】
配列１〜４は、シグマ社から得た。配列５（Ｐｕｒｏｗら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、（２００５年）６５：２３５３−６３）と配列６は、実験室で、その配列を含むオリゴヌクレオチドをプラスミドｐＳｕｐｅｒ（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、（２００２年）２９６：５５０−３）にクローニングすることにより得た：
【表３】
【０１１６】
全ての場合において、配列を、細胞内にトランスフェクトされた時に発現するように設計されたプラスミドｐＳｕｐｅｒのＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩサイトにクローニングする。ｓｈＲＮＡの発現は、細胞の核で起こり、そこから細胞質に輸送され、そこでプロセシングされてｓｉＲＮＡを生成する。これは、活性化して塩基対合により標的ｍＲＮＡを認識し、その分解を活性化する抑制機構と相互作用する。配列１〜５において、標的ＲＮＡは、ホタルルシフェラーゼ［Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ（遺伝子バンクアクセッション番号Ｍ１５０７７）］である。配列６および７は、Ｎｏｔｃｈ１遺伝子（ＮＰ＿０６００８７．３）を対象としている。全てのクローンの配列は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によって確認された。プラスミドＤＮＡは、トランスフェクトする前にＭａｘｉｐｒｅｐキット（Ｍａｒｌｉｎｇｅｎ社製）により精製した。
【０１１７】
実験で使用したＵ１／Ｕ１ｉｓｎＲＮＡの一覧
【表４】
参考文献：
（１）Ｆｏｒｔｅｓ Ｐ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００３年、１００：８２６４−８２６９）
（２）Ｆｏｒｔｅｓ Ｐ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００３年、１００：８２６４−８２６９およびＷＯ０２０８３９０８号）
【０１１８】
ループ３において４カ所の点突然変異を有する内因性Ｕ１ｓｎＲＮＡの５’末端の配列と同一の配列を含むＵ１ｓｎＲＮＡ（Ｕ１αＭｏｃｋ）を、対照として使用した。このループにおいて２つのグアノシンとハイブリダイズしている２つのシトシンを、互いに置き換えた。得られた分子は、内因性Ｕ１ｓｎＲＮＰとは機能的な面で差はない。以前、レポーター遺伝子の３’ＵＴＲ部において内因性Ｕ１ｓｎＲＮＡとハイブリダイズする配列を付加すると、このレポーター遺伝子の発現が阻害されることが立証された。このことは、この系が機能するということを裏付けている。
【０１１９】
Ｕ１ｉαＬｕｃは、Ｕ１ＷＴ配列から構築された。この配列では、３つの位置（太字および下線で示してある）で突然変異が起きた。修飾Ｕ１ｓｎＲＮＡを、Ｕ１ｓｎＲＮＰの標的を含むレポーター遺伝子と同時トランスフェクションすると、レポーター遺伝子の発現が阻害されることが観察された。非常に多くの構築物を、３’ＵＴＲの種々の位置において試験し、そして非常に数多くの試験管内研究により、種々の修飾Ｕ１ｓｎＲＮＡを作るための一連の条件が確立された。これらの基準を以下に示す：
−Ｕ１ｓｎＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’末端エクソンに結合しているときだけ阻害する。
−Ｕ１ｓｎＲＮＡは、従来のポリアデニル化機構によりポリアデニル化されるｍＲＮＡを特異的に阻害する。
−いくつかのＵ１ｓｎＲＮＡは、相乗的に作用する。
−Ｕ１ｓｎＲＮＡとその標的との間の結合は、その発現を阻害するには少なくとも７ｎｔでなければならない。
−Ｕ１ｓｎＲＮＡの５’部を延長する場合、このＵ１ｓｎＲＮＡがさらに阻害する。
−標的配列の近接性が、Ｕ１ｓｎＲＮＡが介在する阻害に影響する。
【０１２０】
Ｕ１αＮｏｔｃｈ１配列は、偽配列またはルシフェラーゼ配列とは全く異なり、Ｕ１の最初の１２ヌクレオチドの突然変異に由来する。
【０１２１】
１．２ルシフェラーゼ遺伝子発現阻害の実験モデル
ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣから入手）を、１０％ＢＦＳ（ウシ胎仔血清）および１％ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中、５％ＣＯ２環境下で培養した。培養試薬は全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のものを使用した。使用したプラスミドは全て、Ａｐａｒｉｃｉｏら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１００６、８０：１２２３６−４７）に準じてリン酸カルシウムを使用して細胞にトランスフェクトした。さらに、ウミシイタケルシフェラーゼを発現する対照プラスミド（ｐＳＶ−ＲＬ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）および他の蛍ルシフェラーゼを発現する対照プラスミドは、ｓｉＲＮＡおよびＵ１（ｐＧＬ−３、プロモーター、Ｐｒｏｍｅｇａ社）の標的配列でトランスフェクトした。Ｏｒｉｏｎ ＩＩプレートルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）において、Ａｐａｒｉｃｉｏら、２００６年、Ｖｉｒｏｌ．８０：１２２３６−４７にしたがって、細胞抽出物をトランスフェクション４８時間後に採取し、ルシフェラーゼの発現を、その活性を測定することで定量した（デュアルルシフェラーゼシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ社）。
【０１２２】
１．３内因性Ｎｏｔｃｈ遺伝子発現阻害の実験モデル
対照としてＵ１ｉαＮｏｔｃｈ１またはＵ１αＭｏｃｋを発現するｐＧＥＭプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、またはｓｈＲＮＡ１αＮｏｔｃｈ１またはｓｈＲＮＡ２αＮｏｔｃｈ１を発現するｐＧＥＭプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してヒーラ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、７２時間後に細胞抽出物を採取し、Ｎｏｔｃｈ１の蓄積を、特異的な抗体（Ｃ−２０ ｓｃ−６０１４−Ｒ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を使用し、化学発光により現像し（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、そして定量化する（Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）ウエスタンブロットにより定量した。また、アクチン濃度を、各々負荷対照として定量した。また、Ｎｏｔｃｈ１活性は、ＮＦκＢ核内移行能を測定することにより評価した。ＮＦκＢ活性は、ルシフェラーゼ遺伝子がＮＦκＢによりプロモーター下で誘導可能であるプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）からルシフェラーゼの発現を活性化する能力を測定することにより定量した。この系を使用して、上記で記載したようにルシフェラーゼを測定した。
【０１２３】
実施例２
種々のｓｎＲＮＡＵ１および干渉ＲＮＡのルシフェラーゼ遺伝子発現に及ぼす影響
阻害を、ルシフェラーゼに対してのｓｈＲＮＡの一回分量または一回分量の半量の存在下、Ｕ１ｉαＬｕｃの一回分量または一回分量の半量の存在下、またはｓｈＲＮＡの一回分量の半量とＵ１ｉαＬｕｃの一回分量の半量との混合物の存在下で試験した。得られた結果（図２〜５）から、両方の手法を用いて得たときの阻害が、各系を別個に用いたときに得られる阻害よりも大きいことからみて、相乗効果があることが明らかである。さらに、Ｕ１ｉの一回分量の半量＋ｓｈＲＮＡの一回分量の半量を用いたときに得られた阻害は、同一のＵ１ｉの一回分量または同一のｓｈＲＮＡの一回分量を用いたときに得られた阻害よりも大きいことから、相乗効果はしっかりしたものであると言える。強ｓｈＲＮＡ、すなわち、１０〜２０倍の阻害を生じさせるｓｈＲＮＡ（図２および３）、中ｓｈＲＮＡ、すなわち、４倍の阻害を生じさせるｓｎＲＮＡ（図４）および弱ｓｈＲＮＡ、すなわち、２倍の阻害を生じさせるｓｈＲＮＡ（図５）で検出されることを考慮すると、相乗効果は、使用されるｓｈＲＮＡの阻害能とは無関係であると言える。さらに、相乗効果があることにより、ｓｈＲＮＡまたはＵ１ｉの最大投与量で得られるよりも大きな阻害を維持しながら、ｓｈＲＮＡの投与量またはＵ１ｉの投与量を強ｓｈＲＮＡ（図６）または中ｓｈＲＮＡ（図７）を使用する場合の８〜２０倍減少させることができる。
【０１２４】
実施例３
種々のｓｈＲＮＡＵ１および干渉ＲＮＡのＮｏｔｃｈ１遺伝子発現に及ぼす影響
３．１Ｕ１ｓｎＲＮＡと成熟干渉ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）との組み合わせ
阻害についての相乗効果は、阻害剤と同時トランスフェクションした外来遺伝子でのみ機能すると言えるであろう。内在性遺伝子に対して、阻害について相乗効果があったかどうかを知るために、Ｎｏｔｃｈ１の阻害を分析した。Ｎｏｔｃｈ１は、ウエスタンブロット（図８Ａ）および核ＮＦκＢの量を減少する能力により測定した。後者の場合、ルシフェラーゼ遺伝子が、プロモーター下、ＮＦκＢにより誘導可能であるプラスミドを使用した（図８Ｂ）。阻害は、Ｎｏｔｃｈ１に対するｓｈＲＮＡの一回分量または一回分量の半量、Ｕ１ｉαＮｏｔｃｈ１の一回分量（８マイクログラム）または一回分量の半量（４マイクログラム）、またはｓｈＲＮＡの一回分量の半量とＵ１ｉαＮｏｔｃｈ１の一回分量の半量との混合物の存在下で試験した。結果から、両方の手法を用いて得たときの阻害が、各系を別個に用いたときに得られる阻害よりも大きいことからみて、相乗効果があることが明らかである（図８）。さらに、Ｕ１ｉの一回分量の半量＋ｓｈＲＮＡの一回分量の半量を用いたときに得られた阻害は、同一のＵ１ｉの一回分量または同一のｓｈＲＮＡの一回分量を用いたときに得られた阻害よりも大きいので、相乗効果はしっかりしたものであると言える。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写後における遺伝子発現の抑制方法に関し、より詳細には、各成分を別個に使用したときに得られるよりも高い抑制レベルを得ることができる組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現を効率的且つ特異的に阻害することは、遺伝子療法プロトコルおよび機能的遺伝子研究の基礎となるものである。ある遺伝子の発現は、細胞に有害に作用して、遺伝性疾患において優性阻害である感染細胞におけるウイルス遺伝子の発現、または発現が制限されるべき遺伝子、例えば、癌遺伝子の発現などの疾患を生じることがある。これらの毒性遺伝子の発現を阻害すると、それらが引き起こす疾患が治癒するであろう。さらに、ゲノムおよびタンパク質の研究により、多数の遺伝子（それらのうちの一部は未知の機能を有する）を単離することができる。これらの手法により、それらの発現レベルによるか、あるいはこのような発現を調節する条件によりこれらの遺伝子を分類できるが、しかしそれらの機能についてはあまり知ることができない。これらの遺伝子の発現を系統的および特異的に阻害できれば、それらの機能を決定できる簡単なプロトコルを開発することができるであろう。
【０００３】
遺伝子の発現を特異的に阻害する最も簡単な方法は、それから転写されるＲＮＡの安定性を減少させるか、あるいはそれがタンパク質への翻訳をブロックすることである。アンチセンス技術（アンチセンスリボザイムおよびオリゴヌクレオチド）に基づく最も使用されている従来の系は、あまりうまくいかなかった。その理由は、機能するためには「生体内」標的ＲＮＡと相互作用する必要があり、またそれらは通常タンパク質で被覆されていて、これらの相互作用からそれらを保護する二次および三次構造を形成するからであると思われる。
【０００４】
遺伝子の発現を特異的に阻害する別法として、ＲＮＡ干渉を用いてＲＮＡの安定性を減少させることがある。この手法によれば、長さが２１−２２ヌクレオチドであり、突出した３’端を有する２つの相補的ＲＮＡ鎖から構成されているＲＮＡ二本鎖からなる、いわゆる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いることにより意図する遺伝子の特異的分解を促進することができる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、２００１年、１５：１８８−２００）。ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの分解が生じるＲＩＳＣと称される多タンパク質複合体における相補配列ｍＲＮＡとハイブリダイズする。しかしながら、ｓｉＲＮＡを使用することに基づく遺伝子抑制方法は、化学合成によりｓｉＲＮＡを調製するためのコストが、とりわけ動物モデルに使用したり、将来ヒトに使用するのに大量に必要とするときには、高くなるため困難となる。ｓｉＲＮＡ合成にともなう高コストの問題を回避するために、ｓｈＲＮＡから実際の細胞でｓｉＲＮＡが産生する方法が開発された。しかしながら、この手法では、特異性を最高にするとともに毒性を最も低くする配列を選択するのを容易にする必要がある。さらに、ｓｉＲＮＡを使用することは、ハイブリダイズするｓｉＲＮＡの特異性が最も高く、毒性が最も低くなるように標的ｍＲＮＡの最適な部位を同定するのに、過度の実験が要求されること、および副作用、例えば、インターフェロンに対する応答の活性化および「標的外れ（Ｏｆｆ−Ｔａｒｇｅｔ）」（標的とは異なる転写物に対する完全に相補的でない（非特異的）ＲＮＡ鎖の結合が一連の好ましくない影響を生じる）のため、より困難となる。
【０００５】
核内低分子リボヌクレオタンパク質（ｓｎＲＮＰ）（これらのうちの一部は、プレｍＲＮＡの特異的配列と相互作用し、核におけるｍＲＮＡの成熟プロセスの種々の段階に関与する）の機能特性を使用することが、別法としてあげられる。Ｕ１ｓｎＲＮＰの場合、タンパク質Ｕ１Ａ、７０Ｋ、Ｕ１ＣおよびＲＮＡ分子（Ｕ１ｓｎＲＮＡ）に結合した７つのＳｍタンパク質により形成される。ＲＮＡの５’端は、塩基対合により、プレｍＲＮＡのスプライシング部位で、除去される配列であるイントロンの５’端とハイブリダイズする。この相互作用は、Ｕ１ｓｎＲＮＡと直接または間接的に相互作用するタンパク質および後でプロセシングされるｍＲＮＡと直接的または関接的に相互作用するタンパク質により安定化される。Ｕ１ｓｎＲＮＰがプレｍＲＮＡと相互作用すると、イントロンの除去を決定づける他のタンパク質とｓｎＲＮＰの一連の結合が誘発される。これを可能にするためには、Ｕ１ｓｎＲＮＡがプレｍＲＮＡから分離される必要がある。
【０００６】
さらに、Ｕ１ｓｎＲＮＰがＲＮＡに結合すると、プロセシングおよびポリアデニル化機構の周辺配列に対する作用が阻害される。Ｕ１ｓｎＲＮＰのタンパク質７０Ｋは、ポリアデニル化複合体のポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）サブユニットのカルボキシ末端に結合して、その機能を阻害することができる（Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎら、１９９７年、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．１１：７６１−７７３．）。
【０００７】
プロセシングおよびポリアデニル化機構に対するＵ１ｓｎＲＮＰによる阻害は、遺伝子発現を制御するために使用されてきた。したがって、標的ｍＲＮＡの３’末端エクソンに特異的に結合して標的ｍＲＮＡを分解するように、イントロンスプライシング領域の認識に関与するＵ１ｓｎＲＮＡ領域を修飾できることが記載された。この方法は、レポーター遺伝子（ＵＳ２００３００８２１４９号、Ｂｅｃｋｌｅｙ，Ｓ．Ａ．ら、２００１年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２１：２８１５−２８２５、Ｆｕｒｔｈ，Ｐ．Ａ．ら、１９９４年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１４：５２７８−５２８９、Ｆｏｒｔｅｓ，Ｐ．ら、２００３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００：８２６４−８２６９およびＥＰ１３８４７８４）および内在性遺伝子（上記Ｆｕｒｔｈ，Ｐ．Ａ．ら、上記Ｆｏｒｔｅｓ，Ｐ．ら、およびＬｉｕ，Ｐら、２００４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、３２：１５１２−１５１７）の発現を減少させるために適用された。Ｓａｊｉｃらは、ウイルスＨＩＶ−１ＲＮＡの末端エクソンに特異的な修飾Ｕ１がＨＩＶ−１ゲノムから得られた転写産物の発現を阻害する能力、したがってウイルスの複製を阻害する能力について記載している（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２００７年、３５：２４７−２５５）。
【０００８】
しかしながら、生体内において標的遺伝子の発現を阻害するのにＵ１ｓｎＲＮＡを使用することは、最高の特異性および最も低い毒性で最大の阻害を実現できる良好な標的配列を見出すのが困難であることから、限界がある。したがって、そしてＲＮＡｉの場合でも起こるように、低細胞内Ｕ１濃度で効果的な抑制レベルに達することができて、毒性が減少し、そして生体内での抑制方法の適用もまた可能となるように、Ｕ１ｓｎＲＮＡに基づいた遺伝子抑制方法を改良する必要がある。
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは、驚くべきことに、ある標的遺伝子に特異的な修飾Ｕ１ｓｎＲＮＡと、同じ標的遺伝子を対象とする遺伝子発現抑制剤とを併用すると、各々の剤を別個に使用したときよりも強く標的遺伝子の発現を阻害することを見出した。
【００１０】
したがって、第一の態様によれば、本発明は、一つもしくはいくつかの容器またはパーツからなるキットを含んでなる組成物に関し、該組成物は
（ｉ）Ｕ１ｓｎＲＮＡまたはＵ１ｓｎＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを少なくとも含んでなる第一成分であって、前記Ｕ１ｓｎＲＮＡが、標的プレｍＲＮＡの３’末端エクソンの予め選択された領域に特異的に結合するように、イントロンの５’端のＧＵコンセンサス配列に対する結合配列が修飾されており、かつ前記標的プレｍＲＮＡの成熟を阻害することができるものである、第一成分と、
（ｉｉ）（ｉ）で定義したＵ１ｓｎＲＮＡの標的であり、かつ前記標的ｍＲＮＡの生体内抑制を生じさせることができる前記プレｍＲＮＡのプロセシングから得られるｍＲＮＡの予め選択された領域を特異的に標的とする、少なくとも一種の遺伝子発現抑制剤を含んでなる第二成分とを含んでなるものである。
【００１１】
第二の態様によれば、本発明は、ポリヌクレオチドに関し、該ポリヌクレオチドは
（ｉ）標的プレｍＲＮＡの３’末端エクソンの予め選択された領域に特異的に結合するように、イントロンの５’端のＧＵコンセンサス配列に対する結合配列が修飾されており、かつ前記標的プレｍＲＮＡのプロセシングを阻害することができる、少なくとも一種のＵ１ｓｎＲＮＡをコードする配列と、
（ｉｉ）（ｉ）で定義したポリヌクレオチドによりコードされている前記Ｕ１ｓｎＲＮＡの標的であり、かつ前記標的ｍＲＮＡの生体内抑制を生じさせることができる前記プレｍＲＮＡのプロセシングから得られるｍＲＮＡの予め選択された領域を特異的に標的とする抑制剤をコードする配列と
を含んでなるものである。
【００１２】
さらなる態様によれば、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクター、本発明のベクターを含んでなる細胞、および本発明のポリヌクレオチドを含んでなるトランスジェニック動物に関する。
【００１３】
別の態様によれば、本発明は、薬剤として使用するための、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、または本発明の細胞を有する本発明の組成物またはキットに関する。
【００１４】
別の態様によれば、本発明は、感染症疾患、腫瘍性疾患、新生物疾患、または神経変性疾患の治療または予防のための本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、または本発明の細胞を有する本発明の組成物またはキットに関する。
【００１５】
別の態様によれば、本発明は、感染症疾患、腫瘍性疾患、新生物疾患、または神経変性疾患の治療または予防のための、生体系における標的遺伝子発現の生体外または生体内転写後阻害の非治療的方法に関し、その方法は、生体系を本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の細胞を有する本発明の組成物またはキットと接触させることを含んでいる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＲＮＡｕ阻害機構についての図である。Ｕ１ｓｎＲＮＰ分子のｓｎＲＮＡ５’端が、その配列がプレｍＲＮＡ標的の３’末端エクソンの予め選択された領域と相補的であるように修飾されている。Ｕ１ｓｎＲＮＰ分子が塩基対合により予め選択された配列に結合すると、標的ＲＮＡのポリアデニル化（ｐＡ）の阻害、したがって、遺伝子発現の阻害が生じる。この図にしたがって修飾されたＵ１ｓｎＲＮＡ分子も、Ｕ１ｉと称される。
【図２】強ｓｈＲＮＡを用いたレポーター遺伝子発現阻害とＵ１ｉを用いた発現阻害との相乗作用を示す図である。対照プラスミドをトランスフェクションした細胞におけるルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼ標的配列１５８に対してｓｈＲＮＡを発現するプラスミドの一回分量または一回分量の半量（それぞれｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５８およびｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５８／２）、ルシフェラーゼに対してＵ１ｉを発現するプラスミドの一回分量または一回分量の半量（それぞれＵ１ｉαＬｕｃおよびＵ１ｉαＬｕｃ／２）、およびｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５８の一回分量の半量とＵ１ｉαＬｕｃの一回分量の半量（ｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５８／２＋Ｕ１ｉαＬｕｃ／２）について算出した。対照（非阻害）細胞のルシフェラーゼ活性を、残りの例で得られたルシフェラーゼ活性によって割ることにより得た阻害率が示されている。エラーバーは、９個の独立した測定値の標準偏差を表す。
【図３】強ｓｈＲＮＡを用いたレポーター遺伝子発現阻害とＵ１ｉを用いた発現阻害との相乗作用を示す図である。対照プラスミドをトランスフェクションした細胞におけるルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼ標的配列１５４６に対してｓｈＲＮＡを発現するプラスミドの一回分量または一回分量の半量（それぞれｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５４６およびｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５４６／２）、ルシフェラーゼに対してＵ１ｉを発現するプラスミドの一回分量または一回分量の半量（それぞれＵ１ｉαＬｕｃおよびＵ１ｉαＬｕｃ／２）、およびｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５４６の一回分量の半量とＵ１ｉαＬｕｃの一回分量の半量（ｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５４６／２＋Ｕ１ｉαＬｕｃ／２）について算出した。対照（非阻害）細胞のルシフェラーゼ活性を、残りの例で得られたルシフェラーゼ活性によって割ることにより得た阻害率が示されている。エラーバーは、９個の独立した測定値の標準偏差を表す。
【図４】中ｓｈＲＮＡを用いたレポーター遺伝子発現阻害とＵ１ｉを用いた発現阻害との相乗作用を示す図である。対照プラスミドをトランスフェクションした細胞におけるルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼ標的配列１６３に対してｓｈＲＮＡを発現するプラスミドの一回分量または一回分量の半量（それぞれｓｈＲＮＡαＬｕｃ１６３およびｓｈＲＮＡαＬｕｃ１６３／２）、ルシフェラーゼに対してＵ１ｉを発現するプラスミドの一回分量または一回分量の半量（それぞれＵ１ｉαＬｕｃおよびＵ１ｉαＬｕｃ／２）、およびｓｈＲＮＡαＬｕｃ１６３の一回分量の半量とＵ１ｉαＬｕｃの一回分量の半量（ｓｈＲＮＡαＬｕｃ１６３／２＋Ｕ１ｉαＬｕｃ／２）について算出した。対照（非阻害）細胞のルシフェラーゼ活性を、残りの例で得られたルシフェラーゼ活性によって割ることにより得た阻害率が示されている。エラーバーは、９個の独立した測定値の標準偏差を表す。
【図５】弱ｓｈＲＮＡを用いたレポーター遺伝子発現阻害とＵ１ｉを用いた発現阻害との相乗作用を示す図である。対照プラスミドをトランスフェクションした細胞におけるルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼ標的配列１５４に対してｓｈＲＮＡを発現するプラスミドの一回分量または一回分量の半量（それぞれｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５４およびｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５４／２）、ルシフェラーゼに対してＵ１ｉを発現するプラスミドの一回分量または一回分量の半量（それぞれＵ１ｉαＬｕｃおよびＵ１ｉαＬｕｃ／２）、およびｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５４の一回分量の半量とＵ１ｉαＬｕｃの一回分量の半量（ｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５４／２＋Ｕ１ｉαＬｕｃ／２）について算出した。対照（非阻害）細胞のルシフェラーゼ活性を、残りの例で得られたルシフェラーゼ活性によって割ることにより得た阻害率が示されている。エラーバーは、９個の独立した測定値の標準偏差を表す。
【図６】強ｓｈＲＮＡを用いたときの相乗効果のロバストネスの解析を示す図である。対照プラスミドをトランスフェクションした細胞におけるルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼ標的配列１５４６（１５４６）に対してｓｈＲＮＡを発現するプラスミドの量を減少（１、１／２、１／４、１／８および１／２０）していった場合、ルシフェラーゼ（Ｕ１ｉαＬｕｃ）に対してＵ１ｉを発現するプラスミドの量を減少（１、１／２、１／４、１／８および１／２０）していった場合、Ｕ１ｉαＬｕｃの一回分量の半量と組み合わせてｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５４６の量を減少（１／２、１／４、１／８および１／２０）していった場合、およびｓｈＲＮＡαＬｕｃ１５４６の一回分量の半量と組み合わせてＵ１ｉαＬｕｃの量を減少（１／２、１／４、１／８および１／２０）していった場合について算出した。対照（非阻害）細胞のルシフェラーゼ活性を、残りの例で得られたルシフェラーゼ活性によって割ることにより得た阻害率が示されている。エラーバーは、９個の独立した測定値の標準偏差を表す。
【図７】中ｓｈＲＮＡを用いたときの相乗効果のロバストネスの解析を示す図である。対照プラスミドをトランスフェクションした細胞におけるルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼ標的配列１６３（１６３）に対してｓｈＲＮＡを発現するプラスミドの量を減少（１、１／２、１／４、１／８および１／２０）していった場合、ルシフェラーゼ（Ｕ１ｉαＬｕｃ）に対してＵ１ｉを発現するプラスミドの量を減少（１、１／２、１／４、１／８および１／２０）していった場合、Ｕ１ｉαＬｕｃの一回分量の半量と組み合わせてｓｈＲＮＡαＬｕｃ１６３の量を減少（１／２、１／４、１／８および１／２０）していった場合、およびｓｈＲＮＡαＬｕｃ１６３の一回分量の半量と組み合わせてＵ１ｉαＬｕｃの量を減少（１／２、１／４、１／８および１／２０）していった場合について算出した。対照（非阻害）細胞のルシフェラーゼ活性を、残りの例で得られたルシフェラーゼ活性によって割ることにより得た阻害率が示されている。エラーバーは、９個の独立した測定値の標準偏差を表す。
【図８】ｓｈＲＮＡを用いた内在性遺伝子の阻害と、Ｕ１ｉを用いたときの発現阻害との相乗作用を示す図である。Ａ．ＨｅＬａ細胞に、Ｎｏｔｃｈ１標的配列１または２に対してｓｈＲＮＡを発現する二回分量のプラスミド（それぞれｓｈＲＮＡ１αＮｏｔｃｈ１ｘ２およびｓｈＲＮＡ２αＮｏｔｃｈ１ｘ２）またはｓｈＲＮＡを発現するプラスミドの一回分量と、Ｕ１ｉαＭｏｃｋまたはＵ１ｉαＮｏｔｃｈ１を発現するプラスミドの一回分量との混合物をトランスフェクションした。トランスフェクションしてから４８時間後に細胞抽出物を採取し、Ｎｏｔｃｈ１の量を、ウエスタンブロットにより評価した。Ｂ．Ａで記載したような細胞、またはＵ１ｉαＭｏｃｋでトランスフェクションもしくはＵ１ｉαＮｏｔｃｈ１の一回分量または２回分量でトランスフェクションした細胞に、ＮＦ−κＢ依存性プロモーター下、ルシフェラーゼを発現するプラスミドをトランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性は、相対単位で表した。エラーバーは、９個の独立した測定値の標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明者らは、驚くべきことに、ある標的遺伝子に特異的なＵ１ｓｎＲＮＡと、同じ標的遺伝子を対象とする遺伝子発現抑制剤とを併用すると、各々の剤を別個に使用したときよりも強く標的遺伝子の発現を阻害することを見出した。
【００１８】
いずれの理論に拘束されることを意図しないが、相乗効果は、プレｍＲＮＡのプロセシングにおいて、二つの成分が異なる位置で作用することによるものと思われる。したがって、修飾Ｕ１は、核内で、プレｍＲＮＡのポリアデニル化を阻害することにより作用し、その結果として、細胞質ゾルへの輸送を阻害し、一方で遺伝子発現抑制剤は、細胞質ゾル内で、Ｕ１阻害剤の存在下でうまく成熟できるｍＲＮＡに作用して、その分解または翻訳の阻害を引き起こすと思われる。標的プレｍＲＮＡのポリアデニル化を阻害することができる修飾Ｕ１は、以下Ｕ１ｉと称する。
【００１９】
したがって、第一に態様によれば、本発明は、
（ｉ）少なくともＵ１ｓｎＲＮＡまたはＵ１ｓｎＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含んでなる第一成分であって、Ｕ１ｓｎＲＮＡが、標的プレｍＲＮＡの３’末端エクソンの予め選択された領域に特異的に結合するように、イントロンの５’端のＧＵコンセンサス配列に対する結合配列が修飾されており、かつ標的プレｍＲＮＡの成熟を阻害することができるものである、第一成分と、
（ｉｉ）（ｉ）で定義したＵ１ｓｎＲＮＡの標的であり、そして標的ｍＲＮＡの抑制を生じさせることができるプレｍＲＮＡのプロセシングから得られるｍＲＮＡの予め選択された領域を特異的に標的とする、少なくとも一種の遺伝子発現抑制剤を含んでなる第二成分とを含んでなる、一つもしくはいくつかの容器またはパーツからなるキットにより構成されている組成物に関する。
【００２０】
したがって、本発明の組成物は２成分を含んでなり、これらの２成分は同一の容器に入れられていてもよいし、または物理的に分離された状態でもよい。さらに、本発明は、また上記で定義した成分（ｉ）および（ｉｉ）を含んでなる組成物に関する。
【００２１】
本発明による組成物の第一成分
本発明の組成物またはキットの第一成分は、標的プレｍＲＮＡの３’末端エクソンの予め選択された領域に特異的に結合するように、イントロンの５’端のＧＵコンセンサス配列に対する結合配列が修飾されているＵ１ｓｎＲＮＡをコードするポリヌクレオチドであり、標的プレｍＲＮＡ３’端のプロセシングを防ぐことができるものである。３’端のプロセシングは、非ポリアデニル化プレｍＲＮＡからポリアデニル化ｍＲＮＡを形成するのに必要な工程であると理解される（コンセンサスポリアデニル化部位のプロセシングおよびポリ（Ａ）＋尾部の付加）。これらの修飾Ｕ１ｓｎＲＮＡは、対応するｓｎＲＮＰに組み込まれて修飾ｓｎＲＮＰを生じる。修飾ｓｎＲＮＰは、イントロンプロセシング部位のプレｍＲＮＡに結合する代わりに、Ｕ１ｓｎＲＮＡの修飾領域の配列特異性によって特定の領域でプレｍＲＮＡに結合している。この相互作用は、核内へのプレｍＲＮＡの隔離、プレｍＲＮＡの成熟低下、そして次にはコードされたタンパク質の産生の減少をもたらす、ポリアデニル化機構の停止を生じる。標的プレｍＲＮＡの発現阻害を起こす修飾Ｕ１ｓｎＲＮＡの能力から、これらの修飾Ｕ１は、Ｕ１ｉとして知られている。Ｕ１の効果は、ひいては遺伝子発現の低下または阻害である。
【００２２】
修飾Ｕ１ｓｎＲＮＡの「イントロンの５’端のＧＵコンセンサス配列に結合する配列」は、いわゆるＵ１部位または５’プロセシング部位（５’−スプライス部位）との塩基対合により相互作用するＵ１ｉの５’端により形成される領域として理解される。その領域は、ＡＧ／ＧＵＲＡＧＵコンセンサス配列（但し、Ｒは、プリンであり、および／エクソン／イントロン境界を示す）により特徴づけられる、イントロンの５’領域のプレｍＲＮＡに見られ、プレｍＲＮＡのプロセシング機構がエクソン−イントロン境界を決定できるようにするものである。この領域は、Ｕ１ｓｎＲＮＡ配列の５’端の１〜１１位のヌクレオチドに対応している（Ｚｈｕａｎｇ、ＹおよびＷｅｉｎｅｒ、Ａ．Ｍ：１９８６年、Ｃｅｌｌ、４６：８２７−８３５）。
【００２３】
プレｍＲＮＡのＵ１部位に結合するコンセンサス配列の「修飾」は、コンセンサス配列が、Ｕ１ｓｎＲＮＡのプレｍＲＮＡのＵ１部位への結合能力が大幅に損失することにより生じる多数の突然変異を含むとともに、Ｕ１ｓｎＲＮＡが、標的プレｍＲＮＡの予め選択された領域との塩基対合により二重鎖を形成することができる新たな相補性を獲得するものとして理解される。本発明にしたがって修飾したＵ１部位に結合する配列と標的プレｍＲＮＡの予め選択された領域間の相補性度は、３〜１６ヌクレオチドであることができ、好ましくは８〜１６ヌクレオチド、そしてより好ましくは１０〜１１ヌクレオチドである。しかしながら、標的遺伝子の発現を阻害する最大効率は、Ｕ１部位を形成する１０〜１１ヌクレオチドが、標的プレｍＲＮＡの予め選択された部位に相補的になるように修飾されているときに見られる（図１参照）。したがって、Ｕ１ｉは、前記領域が、標的プレｍＲＮＡの予め選択された部位において１１または１０の連続したヌクレオチドと完全に相補的であるように１〜１１または２〜１１の位置の全てのヌクレオチドにおいて修飾されているのが好ましいであろう。当業者には、Ｕ１ｉを生成するために必要なことは、標的配列に見られるものとは異なる天然のＵ１において、それらのヌクレオチドを修飾することだけであることは理解されるであろう。
【００２４】
当業者には、様々な生物のＵ１ｓｎＲＮＡ配列が知られていることは理解されるであろう。したがって、特定のＵ１ｓｎＲＮＡの配列が知られていれば、天然Ｕ１ｓｎＲＮＡに相当するか、あるいはイントロン５’端と相互作用する領域の一つ以上のヌクレオチドが修飾されているかを判定することができる。
【００２５】
修飾Ｕ１の５’領域に相補配列として組み込むために予め選択される標的ｍＲＮＡの領域は、対応するプレｍＲＮＡの末端エクソンに位置している。上記Ｆｏｒｔｅｓらが示している、標的配列がポリアデニル化配列から１０００ヌクレオチド以上離れて位置しているときでさえ、レポーター遺伝子ＲＮＡの末端エクソンを標的とする修飾Ｕ１がＲＮＡの分解を引き起こすことができるということから、標的配列のポリアデニル化部位までの距離は、特に関係はない。
【００２６】
標的配列の最適最小長さが１０ヌクレオチドであるならば、前記長さの配列についての結合部位は、１０６ヌクレオチド毎に一回ランダムに出現する。このことは、ヒトゲノムでは約３０００回出現することを意味する。しかしながら、エクソンがヒトゲノムの約２％のみを構成していること、および修飾Ｕ１を用いたｓｈＲＮＡが介在した阻害では、ポリアデニル化シグナル（ＡＡＵＡＡＡ）を含む転写産物の末端エクソンで非構造化領域への対合を必要とすることから、阻害の特異性がはるかに大きくなる。抑制を実施する細胞が由来する生体の３’末端エクソンにおいて最小回数出現する標的部位を選択することが好ましい。
【００２７】
考えられる標的の出現頻度は、配列比較により決定できる。典型的には、配列比較のために、一つの配列が参照配列としての役割を果たし、それと試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いるとき、試験配列と参照配列をコンピュータに入れ、必要に応じてサブ配列座標を指定し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。好ましくは、デフォルトプログラムパラメータを使用してもよいし、あるいは別のパラメータを指定してもよい。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一度を算出する。
【００２８】
本明細書で使用される「比較ウインドウ」は、１９〜６００、通常約５０〜約２００、より一般的に約１００〜約１５０からなる群から選択される連続位置数のうちのいずれか一つのセグメントを参照することを含み、配列を同一連続位置数の参照配列と最適に整列した後、これらの２つの配列を比較することができる。比較のための配列アラインメントの方法は、当該技術分野において周知である。比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、局部相同アルゴリズム（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、１９８１年、２：４８２）によるか、相同アラインメントアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．、１９７０年、４８：４４３）によるか、類似性検索法（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８８年、８５：２４４４）によるか、アルゴリズムをコンピュータを用いて実施（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）することによるか、またはマニュアルアラインメントおよび視覚的検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５補遺）参照）により行なうことができる。
【００２９】
配列の同一度（％）および配列の類似性（％）を決定するのに好適なアルゴリズムの好ましい例は、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９７７年、２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．、１９９０年、２１５：４０３−４１０に記載されている、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０を、本明細書に記載のパラメータとともに使用して、配列同一度（％）を求める。ＢＬＡＳＴ解析を行なうためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（国立生物工学情報センター）から公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まずクエリー配列における長さＷの短いワード（ｗｏｒｄ）を同定することによって、ハイスコア配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを含む。この短いワードは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列された場合に、ある正の値の閾値スコアＴに一致するか、または満足するかのいずれかである。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（上記Ａｌｔｓｃｈｕｌら）。これらの最初の隣接するワードのヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すために検索を開始するための基礎として役立つ。そのワードのヒットは、累積のアラインメントスコアを増加することができる限りは、各々の配列に沿って、両方の方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一対のマッチング残基についての報酬スコア：常に０）およびパラメータＮ（ミスマッチング残基についてのペナルティスコア：常に０）を用いて算出される。アミノ酸配列については、スコア付けマトリックスを使用して、累積スコアを算出する。各々の方向におけるワードのヒットの伸長は、以下の場合に停止する：累積のアラインメントスコアがその達成された最大値から量Ｘだけ低下した場合；１つ以上のネガティブスコアの残基アラインメントの蓄積によって、その累積スコアがゼロ以下になった場合；または、いずれかの配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラム（ヌクレオチド配列について）は、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝ー４、および両方の鎖の比較を、デフォルトとして使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、１９８９年、８９：１０９１５参照）、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝ー４、および両方の鎖の比較を使用する。
【００３０】
好ましくは、本発明の組成物において使用される修飾Ｕ１ｓｎＲＮＡは、標的プレｍＲＮＡの配列にしたがって修飾したイントロンの５’端のＧＵコンセンサス配列に対する結合配列が標的部位と同一または実質的に同一であるように選択される。２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関連した用語「同一の」または「同一度」（％）とは、上記したデフォルトパラメータでＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを用いて測定するか、マニュアルアラインメントおよび可視検査（例えば、ＮＣＢＩウェブサイト等参照）により測定したときに、同じ（同一）であるか、または特定の割合（％）の同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２つ以上の配列またはサブ配列を意味する（すなわち、比較ウインドウまたは指定領域に対して最大一致となるように比較し、整列したときに、標的配列の特定の領域に対して、少なくとも７０％同一、好ましくは７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の割合で同一）。その結果、このような配列は、「実質的に同一」であると言われる。
【００３１】
関連配列を有する一群のタンパク質を抑制すべきである場合、あるいは抑制されるべきｍＲＮＡの正確な特定の配列が分からない（例えば、異なる血清型を示すウイルスタンパク質の場合）場合、いくつかのタンパク質を同時抑制することができるＵ１阻害剤を作成することができる。このためには、抑制されるべきタンパク質群のヌクレオチド配列内の保存配列を同定する必要がある。これは、当業者に周知のアルゴリズムを使った配列の多重アラインメントによって実施できる（例えば、Ｃｈｅｎｎａら、２００３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３１：３４９７−３５００に記載のＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム）。種々の遺伝子のうちの保存配列領域を同定したら、タンパク質群に特異的なＵ１ｓｎＲＮＡを設計するための標的として使用できる共通領域を作成する。５’配列が、この群に属する種々のもののうちの保存配列を標的とするＵ１阻害剤の作成により、この群に属するいくつかのものを同時抑制することができる。この群に属するものが高度の同一性を示し、Ｕ１阻害剤を作成するための標的として選択することができる複数の保存領域がある場合、上記パラグラフで示したように決定した抑制を実施する生体のＲＮＡの３’末端エクソンにおいて最小出現回数のものを選択する。
【００３２】
本発明によるＵ１ｓｎＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、Ｕ１ｉが発現される細胞内でポリヌクレオチドの転写を可能とするプロモーターに動作可能に結合することができる。本発明を実施するのに好適なプロモーターは、Ｕ１プロモーターなどの構成的プロモーター、またはポリオーマウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ＣＭＶ，トリ肉腫ウイルス，Ｂ型肝炎ウイルス，メタロチオネイン遺伝子プロモーター、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲ領域、免疫グロブリン遺伝子プロモーター、アクチン遺伝子プロモーター、ＥＦ−１アルファ遺伝子プロモーターなどの真核生物ウイルスゲノム由来のプロモーターが挙げられ、さらに、遺伝子の発現が、分子または外因性信号、例えば、テトラサイクリンシステム、ＮＦカッパーＢ／紫外線システム、Ｃｒｅ／Ｌｏｘシステム、および熱ショック遺伝子プロモーターなどの付加に依存する誘導性プロモーター、ＷＯ／２００６／１３５４３６号に記載の調節可能ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、さらに、組織特異的プロモーター（例えば、ＷＯ２００６０１２２２１号に記載のＰＳＡプロモーター）が挙げられるが、これらには限定されない。好ましい実施態様によれば、プロモーターは、構成的に作用するＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである。
【００３３】
また、発現を抑制すべきである遺伝子が組織において特異的に発現される場合には、組織特異的プロモーターを使用することも可能である：
−Ｈ／Ｋ−ＡＴＰアーゼベータサブユニットプロモーター、Ｋ１９プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ＴＦＦ１プロモーター、ＴＦＦ２プロモーター、ＦＯＸａ／ＨＮＦ２ガンマプロモーターなどの胃特異的プロモーター、
−エラスターゼプロモーター、Ｐｄｘ−１プロモーター、インスリンプロモーター、またはホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターなどの膵臓特異的プロモーター、
−クララ細胞分泌タンパク質プロモーター、サーファクタントタンパク質Ｃプロモーターなどの肺特異的プロモーター
−マウス乳癌ウイルスプロモーターまたはホエイ酸性タンパク質プロモーターなどの乳房特異的プロモーター、
−ケラチンプロモーターまたはＫ１４プロモーターを含む皮膚特異的プロモーター、
−ＥＢＶプロモーターｌ２などの食道特異的プロモーター、
−主要尿タンパク質プロモーターまたはアルブミンプロモーターなどの肝臓特異的プロモーター、
−ビリンプロモーターまたはＦＡＢＰ−ＴＳ４プロモーターなどの結腸特異的プロモーター、
−クリプチジン−２プロモーター、前立腺特異的抗原プロモーター、Ｃ（３）１プロモーター、９４アミノ酸（ＰＳＰ９４）を有する前立腺から分泌されるタンパク質プロモーター、またはプロバシンプロモーターなどの前立腺特異的プロモーター、
−ウロモジュリンプロモーター、タムーホースフォールタンパク質プロモーター、またはタイプ１ガンマ−グルタミントランスペプチターゼプロモーターなどの腎臓特異的プロモーター、
−ウロプラキンプロモーターまたはウロヒンギンプロモーターなどの膀胱特異的プロモーター、
−ウテログロビンプロモーターなどの子宮特異的プロモーター。
【００３４】
さらに、Ｃｈｅｎ，Ｘら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２００６年、３４、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ）によって記載されているＴｉＰｒｏＤ組織特異的プロモーターデーターベースに記載のいずれの組織特異的プロモーターも本発明に使用することができる。
【００３５】
本発明による組成物の第二成分
本発明による組成物の第二成分は、本発明の第一成分の一部分を形成しｍＲＮＡの発現抑制を引き起こすことができるＵ１ｉが標的とする標的プレｍＲＮＡのプロセシングから生成するｍＲＮＡに特異的な遺伝子発現抑制剤または遺伝子発現抑制剤の組み合わせである。
【００３６】
「遺伝子発現抑制剤」は、いわゆるＲＮＡ干渉プロセス（ＲＮＡｉ）によって、標的ｍＲＮＡの分解やその翻訳の阻害を引き起こす化合物と理解される。このプロセスにおいて、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮａｓｅ型ＩＩＩ（ダイサー）によりＲＮＡをｓｉＲＮＡに変換することによって、遺伝子発現の抑制を引き起こすことができる。ｓｉＲＮＡ鎖の一つが、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と称されるリボヌクレオタンパク質複合体に組み込まれる。ＲＩＳＣ複合体は、このＲＮＡの一本鎖を使用して、分解されるかあるいは翻訳の阻害を受ける、ＲＩＳＣに組み込まれたｓｉＲＮＡのＲＮＡ鎖に少なくとも一部が相補的であるｍＲＮＡ分子を同定する。したがって、ＲＩＳＣに組み込まれたｓｉＲＮＡ鎖は、ガイド鎖またはアンチセンス鎖として知られている。トランジエントまたはセンス鎖として知られている他の鎖は、ｓｉＲＮＡから除去され、標的ｍＲＮＡと部分的に相同である。ＲＩＳＣ複合体によって標的ｍＲＮＡが分解されると、結果としてｍＲＮＡおよびコードしている対応タンパク質の発現レベルの低下を生じる。また、ＲＩＳＣは、標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害することにより、発現の低下を引き起こす。
【００３７】
本発明に関連して、「ｍＲＮＡの発現抑制を引き起こすことができる」薬剤は、細胞内にある場合、予め選択された配列を含む標的ｍＲＮＡに結合し、その分解を生じさせることができる薬剤をコードすることができる薬剤、あるいは予め選択された配列を含む標的ｍＲＮＡに結合し、その分解を生じさせることができる薬剤として理解される。
【００３８】
標的ｍＲＮＡに対してＲＮＡｉ反応を引き起こし、そして本発明の第二成分に組み込むことができる抑制剤には、以下のものがある：
（ｉ）ｓｉＲＮＡ
（ｉｉ）ｓｈＲＮＡ
（ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）に記載の薬剤をコードするポリヌクレオチド、および
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）に記載の一つまたはいくつかの薬剤の組み合わせ。
ここで、薬剤（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）は、ＲＮＡに基づくものであり、成分（ｉｖ）は、ＤＮＡに基づくものである。
【００３９】
（ｉ）ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉により標的遺伝子の発現を阻害できる薬剤である。ｓｉＲＮＡは、化学的合成または生体外転写により得ることができる。ｓｉＲＮＡは、通常１５〜４０ヌクレオチドの長さの２本ＲＮＡ鎖から構成されており、１〜６ヌクレオチドの３’および／または５’張り出し領域を含むことができる。張り出し領域の長さは、ｓｉＲＮＡ分子の全長とは無関係である。ｓｉＲＮＡは、標的メッセンジャーの分解または転写後抑制により作用する。本発明のｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの予め選択された領域と実質的に相同である。「実質的に相同」とは、ｓｉＲＮＡがＲＮＡ干渉により、標的ｍＲＮＡの分解を引き起こすことができるように、標的ｍＲＮＡと十分に相補的、または似ている配列を有していることであると理解される。実質的に相同は、上記で定義した実質的に同一を意味することもある。干渉を引き起こすのに好適なｓｉＲＮＡには、以下のようなＲＮＡから生成するｓｉＲＮＡ、さらに様々な化学修飾を含むｓｉＲＮＡなどがある：
−ホスホロチオエート結合などの、ヌクレオチド間の結合が天然で生じる結合とは異なるｓｉＲＮＡ、
−ｓｉＲＮＡ鎖と、フルオロフォアなどの機能性試薬との接合、
−２’位水酸基を種々の官能基で修飾することよる、ｓｉＲＮＡ鎖の端、特に３’端の修飾
−２’−Ｏ−メチルリボースｐ２’−Ｏ−フルオロリボースなどの、２’位にＯ−アルキル化部位等の修飾糖を有するヌクレオチド、
−ハロゲン化塩基（例えば、５−ブロモウラシルおよび５−ヨードウラシル）、アルキル化塩基（例えば、７−メチルグアノシン）のような、修飾塩基を有するヌクレオチド。
【００４０】
本発明におけるｓｉＲＮＡは、当業者に周知の一連の技術を用いて得ることができる。例えば、ｓｉＲＮＡは、従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置により、ホスホラミダイト基で保護したリボヌクレオシドから化学的に合成できる。
【００４１】
（ｉｉ）ｓｈＲＮＡ
別の方法によれば、本発明における第二成分は、ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピンＲＮＡ）である。ｓｈＲＮＡは、本発明においては、ヘアピン領域により結合した２つの逆平行鎖からなるＲＮＡ分子として理解され、逆平行鎖の一つの配列が、標的ｍＲＮＡの予め選択された領域に対して相補的なものである。ｓｈＲＮＡは、短いアンチセンス配列（１９〜２５ヌクレオチドを有する）からなり、５〜９ヌクレオチドのループ、そしてセンス鎖がそれに続く。ｓｈＲＮＡは、従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置により、ホスホラミダイト基で保護されたリボヌクレオシドから化学的に合成でき、あるいは生体外転写によりポリヌクレオチドから得ることができる。ｓｈＲＮＡは、細胞内でＲＮａｓｅダイサーにより処理されて、ヘアピン領域が除去され、先に記載したようなｓｉＲＮＡを生じる。また、ｓｈＲＮＡは、先にｓｉＲＮＡについて記載したような異なる化学修飾を含むことができる。
【００４２】
（ｉｉｉ）ｍｉＲＮＡ
ｍｉＲＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡは、細胞内に天然に見られ、ｍＲＮＡの分解や翻訳を調節することにより、遺伝子発現の特異性の制御に関与している小さいＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、２２−ヌクレオチドを有する一本鎖ＲＮＡ分子であり、それは、大きな一次転写産物（プリｍｉＲＮＡ）として合成され、核内でＤｒｏｓｈａ ＲＮａｓｅＩＩＩ型により処理されて、６０塩基対の「ヘアピン」前駆体（プレｍｉＲＮＡ）を生じる。これらの分子は、細胞質へ輸送され、第２ヌクレアーゼ（ダイサー）により処理されて成熟形態（ｍｉＲＮＡ）となる。ｍｉＲＮＡは、リボヌクレオタンパク質ＲＩＳＣ複合体に組み込まれ、そこで作用して、成熟ｍＲＮＡ−ＲＩＳＣ複合体と標的ｍＲＮＡの相同領域との間、特にｍｉＲＮＡ鎖のいわゆる「シード」領域（５’端の２〜７ヌクレオチド）間の対合により標的ｍＲＮＡの分解を引き起こし、ｍＲＮＡの分解および／または翻訳減衰を生じる。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ細胞の半減期を調節することにより作用する内在性分子であるが、内在性ｍＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−３０）の構造を変更してｓｉＲＮＡをコードする配列を含むことができること、および修飾ｍｉＲＮＡを使用して内在性標的遺伝子の分解を引き起こすことができることが明らかとなった（ＷＯ０３０９３４４１号）。また、ｍｉｒ−２６ａステム領域に組み込まれたｓｉＲＮＡ配列は、ＲＮＡｉエフェクターとして働いて、相同のｍＲＮＡの分解を引き起こすことも明らかとなった（ＭｃＭａｎｕｓ，Ｍ．Ｔ．ら、２００２年、ＲＮＡ、８：８４２−８５０）。どちらの場合でも、ｍｉＲＮＡステムに導入されたヌクレオチド配列は、標的遺伝子と１００％同一であることが示された。
【００４３】
本発明の組成物に使用するのに好適なｍｉＲＮＡは、１９〜約２４ヌクレオチド、好ましくは、２１または２２ヌクレオチドで構成されている。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ転写物に高特異的にハイブリダイズするように設計することができる。一つの非相補的ヌクレオチドだけが、ｍｉＲＮＡ鎖における位置に応じて、阻害レベルを減少できることから、ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡと１００％同一または実質的に同一（すなわち、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、またはそれ以上のミスマッチを許容）であることを示すように設計することが好ましい。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの翻訳されない５’領域、コード領域、または３’領域を標的とするように設計することができる。
【００４４】
ｍｉＲＮＡは、ステムーループ領域を含んでなるプレｍｉＲＮＡをプロセッシングすることにより得られる。この構造は、リボヌクレアーゼによって、好ましくはダイサーのようなリボヌクレアーゼＩＩＩ型によって認識され、成熟ｍｉＲＮＡを形成するように設計することができる。ステムーループ構造は、４０〜１００ヌクレオチド、好ましくは５０〜７０ヌクレオチド、より好ましくは２０〜３０ヌクレオチドを有することができる。ステムは、二本鎖を形成する鎖の少なくとも一つにおいて、完全に相補的な二本鎖を含んでなることができ、またはさらに非相補的領域を含むことができる。好ましくは、非相補的領域は、あまり多くなく（例えば、１、２、または３）、そしてサイズの面では３以下のヌクレオチドから構成されている。ループ末端は、４以上のヌクレオチド（好ましくは２５以下）を含んでなることができる。ループは、サイズが６〜１５ヌクレオチドであることが好ましい。
【００４５】
ｍｉＲＮＡの効率的なプロセシングおよび機能は、典型的には、ｍｉＲＮＡが、Ｚｅｎｇ等（ＲＮＡ、２００３年、９：１１２−１２３）により記載されているような一定の構造的要件を有するときだけ可能である。本発明のｍｉＲＮＡは、ステム領域が予め選択されたｍＲＮＡの標的配列で置き換えられたｍｉｒＲ−３０構造に基づいていることが好ましい。ループ領域にｍｉＲ−３０が存在することは、望ましいけれども、絶対に必要ということではない。この理由は、ループ領域がｍｉＲ−３０で見られるループ配列と７０％超、好ましくは７９％超、さらに好ましくは８６％超、さらにより好ましくは９３％超同一であるという一定のばらつきを許容することができるからでる。同一度は、上記した方法のいずれかを用いて決定できる。
【００４６】
本発明を実施するのに好適なｍｉＲＮＡは、ＷＯ０３０９３４４１号公報に記載されているような内在性ｍｉＲ−３０ｍｉＲＮＡに基づくもの、またはＷＯ０３０２９４５９号公報に記載されているような内在性ｍｉＲＮＡに基づくものである。
【００４７】
（ｉｖ）ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド
本発明における第二成分は、転写により上記したｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡを生じるポリヌクレオチドとして準備することができる。ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドにおいて、それらは、ヘヤピンまたはステム−ループ領域により接続しているｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなる配列の転写を調節する単一のプロモーター領域を含んでなる。原則として、いずれのプロモーターもｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの発現に使用することができる。ただし、プロモーターは、ｓｉＲＮＡが発現する細胞と適合するものである。したがって、本発明を実施するのに好適なプロモーターには、Ｕ１ｉの発現について上記したものなどがある。好ましい実施態様によれば、プロモーターは、構造的に作用するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、５ＳＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ＲＮＡ７ＳＬ、およびｓｎＲＮＡＵ６などの限られた遺伝子で見られる。
【００４８】
さらに、ｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、２つの転写単位を含んでなる。これらの各々は、ｓｉＲＮＡ（センスおよびアンチセンス）で形成した鎖の一つの転写を調節するプロモーターにより構成されている。ｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、収束性または分岐転写単位を含むことができる。分岐転写ポリヌクレオチドにおいて、ｓｉＲＮＡを形成する各ＤＮＡ鎖をコードする転写単位は、ポリヌクレオチドに平行に位置しており、各ＤＮＡ鎖の転写が、自らのプロモーター（同じまたは異なってもよい）に依存している（Ｗａｎｇ，Ｊ．ら、２００３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００：５１０３−５１０６およびＬｅｅ，Ｎ．Ｓ．ら、２００２年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０：５００−５０５）。収束性転写ポリヌクレオチドにおいて、ｓｉＲＮＡを生成するＤＮＡ領域は、二つの反転したプロモーターが側面に位置しているＤＮＡ領域のセンス鎖およびアンチセンス鎖を形成する。センスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖の転写後、機能性ｓｉＲＮＡに対応するハイブリッドを形成する。反転した転写単位を含んでなるポリヌクレオチドに好適なプロモーターの組み合わせには、２Ｕ６プロモーター（Ｔｒａｎ，Ｎ．ら、２００３年、ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３：２１）、マウスＵ６プロモーターおよびヒトＨ１プロモーター（Ｚｈｅｎｇ，Ｌ．ら、２００４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１：１３５−１４０およびＷＯ２００５０２６３２２号）、およびヒトＵ６プロモーターおよびマウスＨ１プロモーター（Ｋａｙｋａｓ，Ａ．＆Ｍｏｏｎ，Ｒ．、２００４年、ＢＭＣ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、５：１６）などが挙げられる。好ましい実施態様によれば、センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖は、様々なプロモーターにより制御される。さらに好ましい実施態様によれば、両方の転写単位は、収束するように配向している。好ましい実施態様によれば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ型プロモーターは、ヒトおよびマウス由来のＨ１およびＵ６遺伝子のプロモーターである。さらに好ましい実施態様によれば、プロモーターは、ヒトまたはマウス由来の２Ｕ６プロモーター，マウスＵ６プロモーターおよびヒトＨ１プロモーター、またはヒトＵ６プロモーターおよびマウスＨ１プロモーターである。
【００４９】
（ｖ）一種以上のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよび／またはそれらをコードする一種以上のポリヌクレオチドの組み合わせ
本発明における第二成分は、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）で示されている一種以上の成分により構成することができる。したがって、本発明は、一種以上のｓｉＲＮＡ、一種以上のｓｈＲＮＡ、一種以上のｍｉＲＮＡおよび／または前記ポリヌクレオチドをコードする一つまたはいくつかのポリヌクレオチドの併用を意図している。様々な抑制剤が、同一のｍＲＮＡの様々な領域を標的とすることができる。
【００５０】
好ましい実施態様によれば、本発明の組成物またはパーツからなるキットの成分（ｉｉ）は、少なくとも一種のｓｈＲＮＡをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチドである。
【００５１】
本発明によるベクター構築および遺伝子構築
本発明における第一成分をコードするポリヌクレオチド、さらにはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／またはｓｈＲＮＡをコードし、そして本発明における第二成分を構成するポリヌクレオチドは、それ自体を単離することができ、または好適な宿主細胞でポリヌクレオチドを増殖できるベクターの一部を構成することもできる。ポリヌクレオチドを挿入するのに好適なベクターは、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）およびそれらの誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、Ｃｏ１Ｅ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージ、およびｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などの「シャトル」ベクターなどの原核生物の発現ベクター；２ミクロンプラスミド型のベクター、組込み型プラスミド、ＹＥＰベクター、セントロメアプラスミドなどの酵母の発現ベクター；ｐＡＣ系のベクターおよびｐＶＬベクターなどの昆虫細胞の発現ベクター；ｐＩＢＩ、ｐＥａｒｌｅｙＧａｔｅ、ｐＡＶＡ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＧＳＡ、ｐＧＷＢ、ｐＭＤＣ、ｐＭＹ、ｐＯＲＥ系などの植物の発現ベクター；および市販のバキュロウイルスシステムを使用し、昆虫細胞にトランスフェクトするのに好適なバキュロウイルスを含む真核細胞の発現ベクターから得られるベクターである。真核細胞用のベクターは、好ましくはウイルスベクター（アデノウイルスおよびレトロウイルス、特にレンチウイルスなどのアデノウイルスに随伴するウイルス）、さらにｐＳｉｌｅｎｃｅｒ４．１−ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ社）などの非ウイルスベクター、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇ、ｐＨＭＣＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦＩ／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、ｐＺｅｏＳＶ２、ｐＣＩ、ｐＳＶＬおよびＰＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１、ｐＭＬ２ｄ、およびｐＴＤＴ１などがある。
【００５２】
好ましい実施態様によれば、Ｕ１ｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、同一のベクターの一部分を構成する。別の実施態様によれば、Ｕ１ｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、単一のベクターの一部分を構成する。
【００５３】
ベクターは、ベクターを細胞に接触させた後、ベクターが組み込まれた細胞を同定するレポーター遺伝子または標識遺伝子を含んでなることが好ましい。本発明に有用なレポーター遺伝子には、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、チミジンキナーゼ、ＧＦＰなどが挙げられる。本発明に有用な標識遺伝子には、例えば、アミノグリコシドＧ４１８耐性をもたらすネオマイシン耐性遺伝子；ハイグロマイシン耐性をもたらすハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子；オルニチンデカルボキシラーゼ（２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン（ＤＦＭＯ））の阻害剤耐性をもたらすＯＤＣ遺伝子；メトトレキサート耐性をもたらすジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子；ピューロマイシン耐性をもたらすピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子；ゼオシン耐性をもたらすｂｌｅ遺伝子；９−ベータ−Ｄ−キシロフラノースアデニン耐性をもたらすアデノシンデアミナーゼ遺伝子；Ｎ−（ホスホンアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸塩存在下、細胞を成長させるシトシンデアミナーゼ遺伝子；アミノプテリン存在下、細胞を成長させるチミジンキナーゼ遺伝子；キサンチン存在下およびグアニン不存在下、細胞を成長させるキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子；トリプトファンに代わりインドール存在下、細胞を成長させる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｔｒｐＢ遺伝子；および細胞がヒスチジンの代わりにヒスチジノールを使用するようになる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｈｉｓＤ遺伝子が挙げられる。選択した遺伝子は、真核細胞（例えば、ＣＭＶまたはＳＶ４０プロモーター）において、その遺伝子の発現に好適なプロモーター、最適化した翻訳開始部位（例えば、いわゆるＫｏｚａｋ規則またはＩＲＥＳに続く部位）、例えば、ＳＶ４０ポリアデニル化またはホスホグリセリン酸キナーゼ部位などのポリアデニル化部位，ベータ−グロブリン遺伝子イントロンなどのイントロンをさらに含んでなるプラスミドに組み込まれる。別法として、同じベクター内にレポーター遺伝子および標識遺伝子の両方を同時に組み合わせて使用することが可能である。
【００５４】
好ましい実施態様によれば、ベクターは、ウイルスベクターである。さらに好ましい実施態様によれば、本発明の第一または第二成分の発現に使用されるベクター（但し、ＤＮＡに基づくもの）は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、およびアルファウイルスからなる群より選択されるウイルスベクターである。
【００５５】
ｓｉＲＮＡを設計する基礎とされる標的ｍＲＮＡの領域は限定されず、そしてコード配列の領域（開始コドンと終止コドン間）含んでいてもよく、あるいは非翻訳５’または３’領域の配列を含んでいてもよい。好ましくは、この領域の長さは、２１〜５０ヌクレオチドであろう。
【００５６】
ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡを設計する基準は、当業者に広く知られている（例えば、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａ．ら、２００７年、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２：２０６８−２０７８；Ｌａｄｕｎｇａ，Ｉ．、２００６年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３５：４３３−４４０およびＭａｒｔｉｎｅａｕ，Ｈ．、Ｐｙｒａｈ，Ｉ．、２００７年、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．、３５：３２７−３３６、およびＰｅｉおよびＴｕｓｃｈｌ、２００６年、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、３：６７０−６７６を参照）。
【００５７】
標的遺伝子の発現を阻害するのに好適なＵ１ｉの設計基準は、上記で説明した通りである（Ｆｏｒｔｅｓ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００３年、１００：８２６４−８２６９およびＳａｊｉｃ，Ｒら、２００６年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３５：２４７−２５５参照）。好ましくは、Ｕ１ｉを設計するための基礎としてみなされる標的プレｍＲＮＡの領域は、Ｆｏｒｔｅｓら（前掲）により示された３’末端領域のみを含んでなる。
【００５８】
好ましい実施態様によれば、本発明における、パーツからなるキットの成分（ｉ）または組成物の成分（ｉ）は、いくつかのＵ１ｓｎＲＮＡまたは種々のＵ１ｉをコードするいくつかのポリヌクレオチドを含んでなり、これらの全ては同一の標的ｍＲＮＡの種々の領域を標的としている。このように、Ｕ１ｉの相乗的阻害効果は、Ｆｏｒｔｅｓら（上記）およびＳａｊｉｃら（上記）に示されているようにして得ることができる。
【００５９】
別の好ましい実施態様によれば、本発明における、パーツからなるキットの成分（ｉｉ）または組成物の成分（ｉｉ）が、（ｉ）で定義したＵ１ｓｎＲＮＡの標的であり、そして標的ｍＲＮＡの生体内抑制を生じさせることができるプレｍＲＮＡのプロセシングから得られるｍＲＮＡの異なる予め選択された領域を特異的に標的とする、いくつかの遺伝子発現抑制剤を含んでなる。
【００６０】
さらに好ましい実施態様によれば、本発明における、パーツからなるキットのまたは組成物の成分（ｉ）が、いくつかのＵ１ｓｎＲＮＡまたは、同じ標的プレｍＲＮＡの異なる予め選択された領域に特異的に結合するように、イントロンの５’端のＧＵコンセンサス配列に対する結合配列が修飾されているＵ１ｓｎＲＮＡをコードするいくつかのポリヌクレオチドを含んでなり、パーツからなるキットまたは組成物の成分（ｉｉ）が、（ｉ）で定義したＵ１ｓｎＲＮＡの標的であり、そして標的ｍＲＮＡの生体内抑制を生じさせることができるプレｍＲＮＡのプロセシングから得られるｍＲＮＡの異なる予め選択された領域を特異的に標的とする、いくつかの遺伝子発現抑制剤を含んでなる。
【００６１】
本発明による組成物は、単一の容器に双方の成分を含んでいてもよく、または二つの成分がいくつかの容器に物理的に分離されていてもよく、この場合、「本発明のキット」と称される。「キット」は、本発明では、包装して輸送および貯蔵できるようにされた、本発明による組成物の二つの異なる成分を含む製品として理解される。キット成分を包装するのに好適な材料には、ガラス、プラスチック（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートなど）、ボトル、バイアル、紙、エンベロープなどが挙げられる。さらに、本発明のキットは、キットの成分を同時、逐次または別個投与することについての説明書を備えてなることができる。その説明書は、印刷物の形態、または装置により読み取ることができるように説明書が記憶されている電子支援媒体の形態、例えば、電子記憶媒体（磁気ディスク、テープ、および同様のもの）、光媒体（ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ）であることができる。さらに、または、その媒体は説明書を提供するインターネットアドレスを含むことができる。
【００６２】
本発明における二官能性ポリヌクレオチド
本発明者らは以下を提案する。すなわち、本発明における第二成分がＤＮＡに基づくものであり、したがって、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡをコードする配列から構成されている場合、単一のポリヌクレオチドと、本発明における第一成分の配列でありＵ１ｉをコードし、処置されるべき生体を、単一投与により同時相乗効果を得るのに必要な２つの成分と接触させることができる配列との組み合わせであってもよい。したがって、別の態様によれば、本発明は、
（ｉ）標的プレｍＲＮＡの３’末端エクソンの予め選択された領域に特異的に結合するように、イントロンの５’端のＧＵコンセンサス配列に対する結合配列が修飾されており、そして標的プレｍＲＮＡのプロセシングを阻害することができる少なくとも一種のＵ１ｓｎＲＮＡをコードする配列と、
（ｉｉ）（ｉ）で定義したポリヌクレオチドがコードするＵ１ｓｎＲＮＡの標的であり、そして標的ｍＲＮＡの生体内抑制を生じさせることができるプレｍＲＮＡのプロセシングから得られるｍＲＮＡの予め選択された領域を特異的に標的とする、抑制剤をコードする配列とを含んでなる、ポリヌクレオチド（以下、本発明の二官能性ポリヌクレオチドと称する）に関する。
【００６３】
好ましい実施態様によれば、本発明の二官能性ポリヌクレオチドの成分（ｉｉ）は、少なくとも一種のｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、少なくとも一種のプレｍｉＲＮＡ、または少なくとも一種のｓｈＲＮＡをコードする。
【００６４】
別の態様によれば、本発明は、
（ｉ）標的プレｍＲＮＡの３’末端エクソンの予め選択された領域に特異的に結合するように、イントロンの５’端のＧＵコンセンサス配列に対する結合配列が修飾されており、かつ標的プレｍＲＮＡの成熟を阻害することができるＵ１ｓｎＲＮＡをコードする配列と、
（ｉｉ）少なくとも一種のｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖をコードする配列、少なくとも一種のプレｍｉＲＮＡをコードする配列、または少なくとも一種のｓｈＲＮＡをコードする配列（ｓｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡは、（ｉ）で定義したポリヌクレオチドがコードするＵ１ｓｎＲＮＡの標的であり、かつ標的ｍＲＮＡの生体内抑制を生じさせることができるプレｍＲＮＡのプロセシングから得られるｍＲＮＡの予め選択された領域に特異的に結合している）とを含んでなるポリヌクレオチドに関する。
【００６５】
本発明による二官能性ポリヌクレオチドは、通常、発現調節領域に結合しているが、その領域はＵ１ｉをコードする配列および抑制剤をコードする配列と同一であってもよいし、または異なっていてもよい。ポリヌクレオチドの発現に好適なプロモーターは、Ｕ１ｉの発現で上記したものと同じである（構造的、調節可能、および組織特異的）。
【００６６】
同様に、本発明による二官能性ポリヌクレオチドは、発現ベクターの一部を構成することができる。したがって、別の態様によれば、本発明は、本発明による二官能性ポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターに関する。本発明によるポリヌクレオチドをクローニングまたは増殖するのに好適なベクターは、Ｕ１ｉをコードするポリヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの発現で先に述べたことと実質的に同じものである。本発明によるポリヌクレオチドの発現ベクターは、ウイルスベクターであることが好ましく、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、およびアルファウイルスからなる群より選択されるベクターであることがより好ましい。
【００６７】
別の態様によれば、本発明は、本発明による二官能性ポリヌクレオチドを含んでなる細胞または本発明の二官能性ポリヌクレオチドを含んでなるベクターに関する。本発明による組成物の発現に好適な宿主細胞には、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、および細菌細胞が挙げられるが、これらには限定されない。細菌細胞には、バチルス属、ストレプトマイシン属、およびブドウ球菌属などのグラム陽性細菌細胞、エシェリキア属およびシュードモナス属などのグラム陰性細菌細胞が挙げられるが、これらには限定されない。真菌細胞には、サッカロミセス、ピヒア・パストリス、およびハンセヌラ・ポリモルファなどの酵母細胞が好ましい。昆虫細胞には、ショウジョウバエ細胞およびＳｆ９細胞が挙げられるが、これらには限定されない。植物細胞には、特に、穀物、薬草、観賞植物、または球根植物などの作物が挙げられる。上記細胞に、アグロバクテリウム媒介遺伝子導入、葉片の形質転換、ポリエチレングリコールにより誘導する形質転換、エレクトロポレーション、超音波処理、マイクロインジェクション、および遺伝子銃などの周知の技術を用い、本発明の二官能性ポリヌクレオチドをトランスフェクトする。本発明の二官能性ポリヌクレオチドを挿入するのに好適な哺乳類細胞は、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター）細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、９１１、ＡＴ１０８０、Ａ５４９、２９３、またはＰＥＲ．Ｃ６が挙げられる。
【００６８】
別の実施態様によれば、本発明は、本発明による二官能性ポリヌクレオチドがゲノムに組み込まれた非ヒトトランスジェニック動物に関する。
【００６９】
非ヒト動物を得る方法は、本発明による二官能性ポリヌクレオチドを、生殖系列細胞を含む全ての細胞型に分化可能な幹細胞のゲノムに挿入するときにだけ実施できるものであると理解できる。これらは、胚細胞（ＥＣ）または胚性生殖細胞（ＥＧＣ）である。胚幹細胞（ＥＳＣ）は、着床前の胞胚期における胚の内部細胞塊由来のものである。マウスおよびヒトの胚幹細胞の何種類かが知られており、例えば、マウスでは、ＥＳＣ、ＴＢＶ２、Ｒ１、およびＤ３細胞などが確立されている。これらの細胞は、好適な培養条件で非分化状態のまま生体内培養でき、胚盤胞との組み合わせ、そして偽妊娠仮親の子宮に挿入した結果として、生体内で正常な成長を開始する能力を保持している。胚性生殖細胞（ＥＧＣ）は、胎児の生殖隆起から培養した始原生殖細胞（ＰＧＣ）に由来するものである。通常、修飾ＧＤＮＦ部を運ぶ本発明のＥＳＣ細胞およびＥＧＣ細胞は、宿主胚盤胞、つまり宿主胚盤胞の胞胚腔に注入するか、または桑実胚期、すなわち、無ゾーン桑実胚までの８個細胞期の未受精卵と一緒に培養し、改変ＥＳＣ細胞は成長中の胚の内部細胞塊に組み込まれるのが好ましい。
【００７０】
一部の細胞が宿主胚盤胞に由来し、一部が改変ＥＳＣ細胞に由来することから、胚盤胞に注入したトランスジェニック同腹子はキメラと呼ばれる。宿主胚は、代わりの偽妊娠雌または中間宿主に移され、継続して成長する。その結果、手順により、体細胞系組織および生殖系組織が、遺伝子工学により得られるＥＳＣ細胞由来の細胞とレセプター胚盤胞との混合物を含んでなるキメラ動物が提供される。通常、幹細胞および胚盤胞は、キメラ動物が異なる色の斑点をもつことができるように異なる皮膚色素沈着をもつ動物から得られる。したがって、これらのキメラ動物は生殖系のトランスジェニック動物、つまり、その特性が生殖により同腹子に移るように動物の生殖細胞に修飾遺伝子をもつ動物が得られるまで再び同種と掛け合わす。生殖系のトランスジェニック動物は、例えば、同腹子を観察してその特性をもつことを判定することにより、またはトランスジェニック動物の生殖細胞を検査して、遺伝率が一致するように組み込まれた導入遺伝子が存在しているかを判定することにより同定できる。これらの動物はその後、所望の特性であるが、モザイクを示さない一卵性の動物が得られるように他の動物と掛け合わされる。
【００７１】
本明細書に記載の非ヒトトランスジェニック動物は、上記のＥＳＣ細胞の方法とは異なる方法、例えば、単細胞胚の前核に標的化構築物を前核注入する方法またはトランスフェクションしたＥＳＣ細胞を基本としない他の遺伝子標的方法により生産することができることを理解すべきである。
【００７２】
いずれかの好適な非ヒト哺乳動物を使用して、本明細書に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物を生産することができる。例えば、好適な哺乳動物は、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、テンジクネズミ、スナネズミ）、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコ、イヌ、イノシシ、または霊長類であることができる。但し、この場合、全体的に良好な健康状態、良好な胚機能、胚の良好な前核可視性、および良好な生殖能力を得るために動物の特定系統または系統群が選択される。好ましい実施態様によれば、使用される動物は、マウスである。Ｃ５７ＢＬ／６またはＣ５７ＢＬ／６ｘＤＢＡ／２Ｆｉｔなどの系統、またはＦＶＢ系統（チャールズ・リバー研究所、Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．、ジャクソン研究所、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥまたはＴａｃｏｎｉｃ研究所から購入）が使用されることが多い。好ましい系統は、１２９ｓｖ系統であり、さらにＣ５７ＢＬ／６またはＤＢＡ／１などのＨ２ｂ、Ｈ−２６、またはＨ−２ｑハプロタイプを有するものである。
【００７３】
本発明による組成物の医学的用途
本発明者らは、本発明による組成物が、標的遺伝子の発現を相乗的に、すなわち、各成分を単独で作用させるよりもより効率的に、阻害できることを明らかにした。これにより、含まれる各成分が病因に関与するタンパク質のｍＲＮＡを標的とする組成物を、医薬品として使用できる。したがって、別の態様によれば、本発明は、医学分野での使用または薬剤として使用するための、上記で記載した本発明の組成物および本発明の二官能性ヌクレオチドに関する。当業者は、ある遺伝子の過剰発現により起こる、または一定の遺伝子の発現を減少させることを必要とする疾患または病気のすべての治療に組成物を使用できることができることを理解できるであろう。
【００７４】
当業者には、本発明による組成物の投与には、様々な可能性があることが理解できるだろう。組成物の二つの成分は、別個または同じ分子の形で投与してもよい。
【００７５】
さらに、第一成分および第二成分の両方をそのまま阻害分子として投与してもよい。つまり、成分（ｉ）はＵ１ｓｎＲＮＡの形で投与してもよく、成分（ｉｉ）はそのままＲＮＡ系の抑制剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡとして投与してもよい。別法として、第一成分はＵ１ｓｎＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとして提供することができ、および／または、第二成分はＤＮＡ系、つまり抑制剤をコードするポリヌクレオチドを含んでなるものである。後者の場合、ポリヌクレオチドは、第一成分および第二成分の両方を含んでなる単一のポリヌクレオチドとして、または別個のポリヌクレオチドとして、つまり、同時、別個または逐次的のいずれかで投与してもよい。
【００７６】
したがって、本発明は、投与計画の様々な組み合わせを意図しており、その組み合わせは状況に応じて医師により決定される。
−同時投与：
−成分（ｉ）はＵ１ｓｎＲＮＡそれ自体であり、成分（ｉｉ）はＲＮＡ系抑制剤である。
−成分（ｉ）はＵ１ｓｎＲＮＡそれ自体であり、成分（ｉｉ）は、ＤＮＡ系、つまり、抑制ＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含んでなる。
−成分（ｉ）は、Ｕ１ｓｎＲＮＡそれ自体をコードするポリヌクレオチドであり、成分（ｉｉ）は、ＲＮＡ系抑制剤である。
−成分（ｉ）は、Ｕ１ｓｎＲＮＡそれ自体をコードするポリヌクレオチドであり、成分（ｉｉ）は、ＤＮＡ系抑制剤、つまり、抑制ＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドを含んでなる。この場合、両方のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチドの一部分を構成してもいいし、あるいは別個のポリヌクレオチドとして提供することもできる。
−分別投与または逐次投与：
−成分（ｉ）は、Ｕ１ｓｎＲＮＡそれ自体であり、成分（ｉｉ）は、ＲＮＡ系抑制剤である。
−成分（ｉ）は、Ｕ１ｓｎＲＮＡそれ自体であり、（ｉｉ）は、ＤＮＡ系、つまり、抑制剤をコードするポリヌクレオチドを含んでなる。
−成分（ｉ）は、Ｕ１ｓｎＲＮＡそれ自体をコードするポリヌクレオチドであり、成分（ｉｉ）は、ＲＮＡ系抑制剤である。
−成分（ｉ）は、Ｕ１ｓｎＲＮＡそれ自体をコードするポリヌクレオチドであり、成分（ｉｉ）は、ＤＮＡ系、つまり、抑制剤をコードするポリヌクレオチドを含んでなる。この場合、両方のポリヌクレオチドは、別個のポリヌクレオチドとして提供する必要がある。
【００７７】
当業者であれば、第一成分および第二成分の両方がＤＮＡ型、つまり活性ＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチドとして使用される場合、対応するポリヌクレオチドは、ベクターにおいて提供してもよいことが理解できるだろう。別個または逐次輸送の場合、各ポリヌクレオチドは異なるベクターの一部分を構成する。同時投与の場合、両方のポリヌクレオチドを、異なるベクターにおいて提供してもよいし、両方のポリヌクレオチドを含んでなる単一のベクターにおいて提供してもよい。
【００７８】
本発明による組成物を設計するための標的として使用することができる遺伝子としては、例えば、癌遺伝子；転写因子、レセプター、酵素、構造タンパク質、サイトカイン、サイトカインレセプター、レクチン、セレクチン、免疫グロブリン、キナーゼ、ホスファターゼ、プロリン、血管新生ポリペプチド、プロテアーゼおよびアポトーシスプロセスに関与するタンパク質をコードする遺伝子；接着分子をコードする遺伝子；表面レセプターをコードする遺伝子；腫瘍細胞の転移または侵襲過程に関与するタンパク質をコードする遺伝子；成長因子をコードする遺伝子；多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）；リンホカイン、サイトカイン、免疫グロブリン、Ｔ−細胞レセプター、ＭＨＣ抗原、ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子；アミノ酸、核酸、腫瘍抑制遺伝子、５−リポオキシゲナーゼ、ホスホリパーゼＡ２、プロテインキナーゼＣ、ｐ５３、ｐ１６、ｐ２１、ＭＭＡＣ１、ｐ７３、ｚａｃ１、Ｃ−ＣＡＭ、ＢＲＣＡ１、Ｒｂ、Ｈａｒａｋｉｒｉ、ＡｄＥ１Ｂ、ＩＣＥ−ＣＥＤ３プロテアーゼ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＴＮＦ、ＧＭＣＳＦ、インターフェロン、ＣＦＴＲ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＩＬ−２レセプター、エストロゲンレセプター、Ｂｃｌ−２ファミリーの一部（Ｂｃｌ−２またはＢｃｌ−ｘＬ）、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｆｉｎｓ、ｊｕｎ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔおよびａｂｌ、アミロイド前駆体タンパク質、アンギオスタチン、エンドスタチン、ＭＥＴＨ−１、ＭＥＴＨ−２、ＩＸ因子、ＶＩＩＩ因子、コラーゲン、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリンＤ１、サイクリンＥ、ＷＡＦ１、ｃｄｋ４阻害剤、ＭＴＳ１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、トロンボポエチン、ＢＮＤＦ、ＢＭＰ、ＧＧＲＰ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＧＤＮＦ、ＧＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＫＧＦ、ミオトロフィン、ＮＧＦ、ＯＳＭ、ＰＤＧＦ、ソマトロフィン、ＴＧＦ−ベータ、ＴＧＦ−アルファ、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、カテプシンＫ、シトクロムＰ−４５０、ファルネシルトランスフェラーゼ、グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ、ヘパラナーゼ、ＨＭＧＣｏＡシンテターゼ、ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、フェニルアラニン水酸化酵素、ホスホジエステラーゼ、ｒａｓのカルボキシ末端プロテアーゼ、Ｎｏｔｃｈ、テロメラーゼ、ＴＮＦ−変換酵素、カドヘリンＥ、カドヘリンＮ、セレクチン、ＣＤ４０、ＡＮＦ、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、グルカゴン、ゴナドトロピン、ゴナドトロピン放出ホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、ソマトトロピン、インスリン、レプチン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、ＰＴＨ、甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、免疫グロブリンＣＴＬＡ４、血球凝集素、ＭＨＣ、ＶＬＡ−４、カリクレイン−キニノーゲン−キニンＣＤ４系、ｓｉｓ、ｈｓｔ、ｒａｓ、ａｂｌ、ｍｏｓ、ｍｙｃ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、Ｈ−ｒａｓ、ｋｉ−ｒａｓ、ｃ−ｆｉｎｓ、ｂｃｌ−２、Ｌ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｃ、ｇｉｐ、ｇｓｐ、ＨＥＲ−２、ボンベシンレセプター、ＧＡＢＡレセプター、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＮＧＦＲ、インターロイキンレセプター、イオンチャンネルレセプター、ロイコトリエンレセプターアンタゴニスト、リポタンパク質レセプター、オピオイドレセプター、サブスタンスＰレセプター、レチノイン酸およびレチノイドレセプター、ステロイドレセプター、Ｔ−細胞レセプター、甲状腺ホルモンレセプター、ＴＮＦレセプター、ｔＰＡレセプター、カルシウムポンプ、プロトンポンプ、Ｎａ／Ｃａ交換体、ＭＲＰ１、ＭＲＰ２、Ｐ１７０、ＬＲＰ、ｃＭＯＡＴ、トランスフェリン、ＡＰＣ、ｂｒｃａ１、ｂｒｃａ２、ＤＣＣ、ＭＣＣ、ＭＴＳ１、ＮＦ１、ＮＦ２、ｎｍ２３、ｐ５３、およびＲｂの合成など代謝過程に関与する遺伝子が挙げられるが、これらには限定されない。
【００７９】
本発明による組成物は、感染症疾患、腫瘍性疾患、新生物疾患、または神経変性疾患に関与する遺伝子を標的とすることができる。したがって、別の態様によれば、本発明は、感染症疾患、腫瘍性疾患、新生物疾患、または神経変性疾患の治療または予防のための、本発明の組成物またはキット、本発明の二官能性ポリヌクレオチド、または二官能性ポリヌクレオチドを含んでなるベクターまたは細胞を提供する。
【００８０】
さらに別の態様によれば、本発明は、感染症疾患、腫瘍性疾患、新生物疾患、または神経変性疾患の治療または予防のための薬剤を調製するための、本発明の組成物またはキット、本発明の二官能性ポリヌクレオチド、または本発明の二官能性ポリヌクレオチドを含んでなるベクターまたは細胞の使用を提供する。
【００８１】
さらに別の態様によれば、本発明は、本発明の組成物またはキット、本発明の二官能性ポリヌクレオチド、または本発明の二官能性ポリヌクレオチドを含んでなるベクターまたは細胞を、それを必要としている患者に投与することを含んでなる感染症疾患、腫瘍性疾患、新生物疾患、または神経変性疾患の治療方法を提供する。
【００８２】
好ましい実施態様によれば、本発明による組成物は、前記生物の病原性に必要不可欠な病原体遺伝子、さらに宿主と相互作用する病原体に必要不可欠な宿主遺伝子を標的とすることができる。この場合、組成物は、感染症疾患、例えば、ウイルスおよび細菌感染症など治療するのに好適なものである。したがって、別の態様によれば、本発明は、感染症疾患の治療または予防のための、本発明の二官能性ポリヌクレオチド、本発明のベクターまたは本発明の細胞を有する本発明の組成物またはキットに関する。別の実施態様によれば、本発明は、感染症疾患の治療または予防のための薬剤を調製するための、本発明の二官能性ポリヌクレオチド、本発明のベクターまたは本発明の細胞を有する本発明の組成物またはキットの使用に関する。
【００８３】
本発明の組成物により治療可能なウイルス感染症は、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）に関与するコロナウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトＴ−細胞リンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ）１型および２型、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１型および２型、サイトメガロウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、エプスタイン・バールウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルス、センダイウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、および麻疹ウイルスに関係する疾患や病気が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
本発明の組成物により治療可能な細菌性疾患（便宜上、酵母および真菌障害、酵母および真菌疾患も含まれる）は、アシネトバクター種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、エロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、アルガリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バクテロイデス・フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・オバタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｏｖａｔｕｓ）、バクテロイデス・ウレオリティカス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｒｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）、バクテロイデス・ブルガータス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア・ビンセンティ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ）、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、ブルセラ・スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ）、カンピロバクター（ビブリオ）フィータス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ（Ｖｉｂｒｉｏ）ｆｅｔｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐｐ．）、シトロバクター・ディバーサス（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｄｉｖｅｒｓｕｓ）、シトロバクター・フロインデイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、コリネバクテリウム・ジェイケイウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｅｉｋｅｉｕｍ）、クロストリディウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・ラモサム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｍｏｓｕｍ）、クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、クロストリディウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、コリネバクテリウム・ジフセリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、エドワードシエラ・タルダ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、クレブシエラ・オザエナエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｚａｅｎａｅ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・リノスクレロモチス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｒｈｉｎｏｓｃｌｅｒｏｍｏｔｉｓ）、レプトスピラ・イクテロヘモルハギア（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．）、ナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ）、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ペプトストレプトコッカス・アネロビウス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎａｅｒｏｂｉｕｓ）、ペプトストレプトコッカス・アサッカロリティカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓ）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、プレボテラ・ビビア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｂｉｖｉａ）およびプレボテラ・メラニノゲニカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、リケッチア
プロワツェキイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉ）、リケッチア・ツツガムシ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇｕｍｕｓｈｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シゲラ・ディセンテリエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、シゲラ・ソンネ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ストレプトコッカスＣ群（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｒｏｕｐ Ｃ）、ストレプトコッカスＧ群（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｒｏｕｐ Ｇ）、スタフィロコッカス・ヘモリチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、スタフィロコッカス・ホミニス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｍｉｎｉｓ）、スタフィロコッカス・シミュランス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｍｕｌａｎｓ）、スタフィロコッカス・ワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｒｎｅｒｉ）、スタフィロコッカス・キシロサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｘｙｌｏｓｕｓ）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ）、ストレプトコッカス・エクイナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、トレポネーマ・カラテネウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｃａｒａｔｅｎｅｕｍ）、トレポネーマ・パリズム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、トレポネーマ・ペルテヌエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、およびエルシニア・シュードツベルクローシス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に関連する障害および疾患が挙げられるが、これらには限定されない。
【００８５】
別の実施態様によれば、本発明の組成物およびキットならびに本発明の二官能性ポリヌクレオチドは、腫瘍形成および／または新生形成過程に関与する遺伝子を標的とし、したがって、新生形成過程および異なる種類の癌、例えば、血液癌（例えば、白血病またはリンパ腫）、神経癌（例えば、星状細胞腫またはグリア芽腫）、黒色腫、乳癌、肺癌、頭部および頸部癌、胃腸腫瘍（例えば、胃癌、膵臓癌または結腸癌）、肝臓癌、腎細胞癌、泌尿生殖器癌（例えば、卵巣癌、膣癌、子宮頸癌、膀胱癌、精巣癌、および前立腺癌）、骨腫瘍および血管腫瘍に対して活性な組成物が得られる。したがって、別の態様によれば、本発明は、腫瘍性疾患または新生物疾患の治療または予防のための、本発明の二官能性ポリヌクレオチド、本発明のベクター、または本発明の細胞を有する本発明の組成物またはキットに関する。別の実施態様によれば、本発明は、腫瘍性疾患または新生物疾患の治療または予防用医薬品を調製するための、本発明の二官能性ポリヌクレオチド、本発明のベクター、または本発明の細胞を有する本発明の組成物またはキットの使用に関する。
【００８６】
別の実施態様によれば、本発明の組成物および二官能性ポリヌクレオチドは、網膜色素変性症、アレキサンダー病、アルパース病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）、カナバン病、コケーン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、ＨＩＶ関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、レヴィー小体認知症、マシャド・ジョセフ病（３型脊髄小脳失調）、多発性硬化症、多系統萎縮症、神経ボレリア症、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッハー病、ピック病、原発性側索硬化症、プリオン病、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、統合失調症、シュピールマイアーフォークトシェーグレンバッテン病（バッテン病としても知られている）、脊髄小脳失調、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー症候群、脊髄癆などの神経変性過程に関与する遺伝子を標的とする。したがって、別の態様によれば、本発明は、神経変性疾患の治療または予防のための、本発明の二官能性ポリヌクレオチド、本発明のベクター、または本発明の細胞を有する本発明の組成物またはキットに関する。別の実施態様によれば、本発明は、神経変性疾患の治療または予防用医薬品を調製のための、本発明の二官能性ポリヌクレオチド、本発明のベクター、または本発明の細胞を有する本発明の組成物またはキットの使用に関する。
【００８７】
別の態様によれば、本発明は、本発明の組成物または本発明の二官能性ポリヌクレオチドを一種以上の薬学的に許容される担体と一緒に含んでなる医薬に関する。薬学的に許容される担体は、固体または液体であることができる。固体担体には、香料、潤滑剤、可溶化剤、懸濁剤、賦形剤、滑剤、圧縮剤、結合剤、または錠剤崩壊剤としても作用することができる一種以上の物質を含んでなることができる。それらはまた封入材料でもある。粉剤では、担体は微粉化固体であり、微粉化した有効成分と混合する。錠剤では、有効成分が、適当な特性の中で必要とされる圧縮特性を有する担体と混合され、所望の形状と大きさに圧縮される。粉剤と錠剤は、有効成分を最大９９％含むことができる。好適な固体担体には、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、低融点ワックス、およびイオン交換樹脂などがある。
【００８８】
液体担体は、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ、エリキシル剤、および圧縮組成物の調製に使用される。有効成分は、薬学的に許容される液体担体、例えば、水、有機溶媒、両方の混合物、薬学的に許容される油または脂質などに溶解または懸濁することができる。液体担体は、可溶化剤、乳化剤、界面活性剤、緩衝剤、防腐剤、甘味剤、香料、懸濁剤、増粘剤、着色剤、粘性調節剤、安定剤、または浸透圧調節剤などの他の薬学的に好適な添加剤を含むことができる。経口投与または非経口投与用に好適な液体担体には、水（特に、前述の添加剤、例えば、セルロース誘導体、可能であれば、カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を含んでいる）、アルコール（一価アルコールまたは多価アルコール、例えば、グリコールを含んでいる）およびそれらの誘導体、および油（例えば、分留ヤシ油またはピーナッツ油）が挙げられる。非経口投与については、担体は、また、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルなどのエステル油であってもよい。無菌液体担体は、非経口投与に有用な液体形状の無菌組成物である。圧縮組成物用の液体担体は、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に好適な推進剤であってもよい。
【００８９】
無菌溶液または懸濁液である液体医薬組成物は、筋肉注射、腹腔内注射、皮下注射に好適である。無菌溶液は、また静脈内投与することができる。また、その組成物は、液体または固体の形状で経口投与することもできる。経肺投与も意図される。
【００９０】
医薬組成物は、例えば、錠剤またはカプセルのような形状でもよい。その形状では、組成物は好適な有効成分量を含む投与量単位に細かく分割する。その投与量単位の形状は、包装した粉体、バイアル、ブリスター、プレフィルドシリンジ、または液体を含む小袋などの包装組成物であってもよい。投与量単位の形状は、例えば、カプセルや錠剤であってもよく、またはこれらの組成物のいずれかを適当量を包装した形でもよい。治療で用いられる投与量は、医師により主観的に決定される必要がある。
【００９１】
さらに、本発明の化合物は、薬学的に許容される賦形剤を用いて製剤化することにより液体、クリーム、またはローションとして使用することができ、患部に塗ることができる。
【００９２】
さらに、本発明は、医薬組成物、特に本発明における第一成分および第二成分を構成する核酸の投与用、または本発明の二官能性ポリヌクレオチドの投与用に調製した医薬組成物を意図している。医薬組成物は、第一成分および第二成分の両方を含んでなり、両方が裸のままのＤＮＡ系さらにはＲＮＡ系である、すなわち、生体のヌクレアーゼによる分解から核酸を保護する化合物が欠如している状態であるならば、トランスフェクションに用いられる試薬に関連する毒性を除く利点を伴う。裸の化合物に好適な投与経路には、血管内、腫瘍内、頭蓋内、腹腔内、脾臓内、筋肉内、網膜下、皮下、粘膜、局所、または経口経路（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ、２００２年、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、２１：８５７−８６７）などがある。これらの化合物が裸の状態で投与されたときの免疫反応を誘導する能力に関する事柄がＨｅｉｄｅｌら（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００４年、２２：１５７９−１５８２）により最初に調査された。ｓｉＲＮＡを腹腔内および静脈内投与した後の血漿インターロイキンおよびインターフェロンレベルを測定したところ、免疫反応が観察されず、一方で、同時に、ｓｉＲＮＡの全身投与も十分に許容できるものであることが分かった。
【００９３】
別の実施態様によれば、本発明の組成物およびポリヌクレオチドは、いわゆる「ハイドロダイナミック（Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ）投与」によって投与され、これにより組成物が生体の血管内に高速および多量に導入されることにより、より拡散した分布の高トランスフェクションレベルが得られる。この手法を改善したものでは、多臓器で、外来遺伝子（Ｌｅｗｉｓら、２００２年、Ｎａｔ．Ｇｅｎ．，３２：１０７−１０８；ＭｃＣａｆｆｒｅｙら、２００２年、Ｎａｔｕｒｅ、４１８：３８−３９）および内在性遺伝子（Ｓｏｎｇら、２００３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、９：３４７−３５１）の裸ｓｉＲＮＡにより抑制の陽性結果を得ることができる。分子間移動の有効性は、液体の投与量や注入速度に直接依存していることが判明した（Ｌｉｕら、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０５：１４３７−１４４１）。マウスでは、投与量を、３〜５秒間において体重１０ｇあたり１ｍｌに最適化した（Ｈｏｄｇｅｓら、２００３年、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．、３：９１−９１８）。ｓｉＲＮＡをハイドロダイナミック投与した後にｓｉＲＮＡの生体内細胞トランスフェクションが起きる正確な機構はよく知られていない。マウスの場合では、尾静脈投与は心拍数を超える速度で行い、そして投与する液体は上大静脈に蓄積すると考えられる。液体はそれから臓器の血管に移動し、その後血管の穿孔を通過して血管外スペースに到達する。このようにして、ｓｉＲＮＡは血液と混合する前に標的生物の細胞に接触するので、ヌクレアーゼによる分解の可能性が低下する。好ましい実施態様によれば、本発明の組成物の第一成分を構成するＵ１ｉと本発明の組成物の第二成分を構成するＲＮＡ系の成分の両方は、それらの安定性増加に寄与する構造の修飾を含むことができる。ヌクレアーゼに対する感受性を減少する好適な修飾には、２’−Ｏ−メチル（Ｃｚａｕｄｅｒｎａら、２００３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３１：２７０５−２７１６）および２’−フルオロピリミジン（Ｌａｙｚｅｒら、２００４年、ＲＮＡ、１０：７６６−７７１）などが挙げられる。
【００９４】
本発明の組成物およびポリヌクレオチドを投与して、コレステロールまたは細胞膜介して転位を引き起こすことができる化合物、例えば、ＷＯ０７０６９０９０号（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ，Ａ．ら、２０００年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．、２１：９９−１０３；Ｓｃｈｗａｒｚｅ，Ｓ．Ｒ．ら、２０００年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．、２１：４５−４８、Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，Ｍ．ら、２００３年、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ、８：１４３−１５０およびＳｎｙｄｅｒ，Ｅ．Ｌ．およびＤｏｗｄｙ，Ｓ．Ｆ．、２００４年、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、２１：３８９−３９３）に記載のＨＩＶ−１ＴＡＴタンパク質由来のＴＡＴペプチド、キイロショウジョウバエアンテナペディアタンパク質のホメオドメインの第３へリックス、単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２タンパク質、アルギニンオリゴマーおよびペプチドなどと接合したリポソームの一部を形成することができる。別法として、本発明の第二成分がＤＮＡに基づくものであるとき、それを投与して、プラスミドベクターまたはウイルスベクターの一部を形成することができる。これらは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはレトロウイルスに基づくものであることが好ましく、特にマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）またはレンチウイルス（ＨＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶ）に基づくウイルスであることが好ましい。
【００９５】
別の実施態様によれば、医薬組成物が第一成分および第二成分により構成される場合、その組成物が本発明の組成物の第一成分および第二成分を同時、逐次または別個に使用することについての説明書を含んでなることができる。したがって、別の態様によれば、本発明は、組成物の第一成分および第二成分を同時、逐次または別個に使用することについての説明書を含んでなる本発明の組成物またはキットに関する。さらに別の態様によれば、本発明は、同時、逐次または別個に使用するための組み合わせ製剤としての本発明の組成物またはキットに関する。
【００９６】
当業者は、投与計画および治療の対象となる患者を、本発明にしたがって決定することができることを理解できるだろう。推奨投与量は、違う患者に対して間違った薬剤を不正な投与量で処方することを防止する情報として、製品のラベルに表示してあり、処方する人が対象となる患者のグループにしたがって、投与量の調整を予測できる。
【００９７】
投与計画は、医師および他の臨床学的な要因により決められ、上記した方法の一つにしたがって決めることが好ましい。医学では、周知の通り、患者への投与量は多くの要因、例えば、患者のサイズ、体の表面積、年齢、投与される化合物の詳細、性別、投与時間および投与経路、総体的な健康、および同時に他の薬剤が投与されるかどうかなどに依存している。経過は、定期的検査を通じて観察することができる。
【００９８】
本発明による組成物は、体重１キログラムあたり１０ｍｇ未満の量で投与でき、好ましくは、体重１キログラムあたり５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、または０．００００１ｍｇ未満の量で、そして、２００ｎｍｏｌ未満の量のＲＮＡ剤、すなわち、体重１キログラムあたり約４．４ｘ１０１６コピーまたは体重１キログラムあたり１５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、または０．０７５ｎｍｏｌ未満の量で投与できる。単位投与量を、注入投与、吸入投与または局所投与できる。本発明の組成物および二官能性ヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡが発現する器官に直接投与できる。この場合、器官あたり０．００００１ｍｇ〜３ｍｇ、好ましくは器官あたり０．０００１〜０．００１ｍｇ、器官あたり約０．０３〜３．０ｍｇ、器官あたり約０．１〜３．０ｍｇ、または器官あたり０．３〜３．０ｍｇを投与する。
【００９９】
投与量は治療する病気の重症度および反応に依存し、投与量は、数日〜数ヶ月間または病気の寛解が確認されるまで変更することができる。至適投与量は、患者体内の薬剤濃度を定期的に測定することにより決めることができる。至適投与量は、動物モデルを使った事前の生体外または生体内アッセイから得られるＥＣ５０値から決めることができる。単位投与量を、一日に一回または一日に一回未満、好ましくは２、４、８、または３０日毎に一回未満で投与することができる。また、一般的に初回量より少量である一回または数回の維持量の後で初回量を投与することができる。維持量の投与計画では、１日あたりおよび体重１キログラムあたり０．０１μｇ〜１．４ｍｇ、例えば、１日あたりおよび体重１キログラムあたり１０、１、０．１、０．０１、０．００１、または０．００００１ｍｇの投与量で患者を治療することを含むことができる。維持量は、多くても５、１０、または３０日毎に投与することが好ましい。治療は、患者が患っている疾患の種類、重症度および患者の状態にしたがって変更できる期間継続する必要がある。治療後、患者の経過を観察して、疾患が治療に反応しない場合には投与量を増加すべきかどうか決定し、あるいは疾患の改善が認めらる場合もしくは望ましくない副作用が認められる場合に投与量を減少するかどうかを決定する必要がある。
【０１００】
１日投与量は、特定の状況にしたがって一回で投与してもいいし、２回以上に分けて投与してもよい。連続投与または頻回投与が望ましい場合、埋め込み式のポンプ、半永久的なカテーテル（静脈内、腹腔内、嚢内、または関節包内）、または貯蔵器など、投与用の機器を使用するのが望ましい。
【０１０１】
別の態様によれば、本発明は、標的遺伝子発現の転写後阻害のための生体外および生体内非治療的方法に関し、本発明の組成物または二官能性ヌクレオチドを生体モデルに接触させることを含んでなる。生体モデルは、細胞培養物または動物であることが好ましい。
【０１０２】
細胞培養への応用に好適な組成物およびポリヌクレオチドの場合では、ポリヌクレオチドが細胞内部へ到達できるための様々な手法がある。一方では、細胞を裸のポリヌクレオチドと接触させることが可能である。細胞をそのポリヌクレオチドに接触させると、エンドソーム区画へは到達できるが、機能状態で細胞質に到達できない（Ｌｉｎｇｏｒ，Ｐ．ら、２００４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３１５：１１２３−１１３３）。したがって、ポリヌクレオチドは、マイクロインジェクションまたはエレクトロポレーションによって投与することが好ましい。または、ＤＮＡおよびＲＮＡポリヌクレオチドのトランスフェクション用に、特に、カチオン性リポソーム、膜透過性ペプチド、アテロコラーゲン、ポリアスパラギン酸ポリエチレングリコールとリン酸カルシウムのポリマーからなる有機無機ナノ粒子混成物（Ｋａｋｉｚａｗａら、２００４年；Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．、９７：３４５−３５６；Ｍｉｎａｋｕｃｈｉら、２００４年、Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３２：１０９およびＭｕｒａｔｏｖｓｋａおよびＥｃｃｌｅｓ、２００４年、Ｆｅｄ．Ｅｕｒｏ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｌｅｔｔ．、５５８：６３−６８）などの適当な試薬を用いた化学的トランスフェクションを使うことが可能である。別の実施態様によれば、本発明のポリヌクレオチドは、発現ベクターを使用して投与することができる。明らかに、本発明の組成物の第二成分がＤＮＡに基づくものであるとき、この手法が唯一の方法である。
【０１０３】
別法として、細胞による捕獲を増加することができる化学的部分で、本発明の組成物を構成する薬剤を改良することができる。したがって、本発明を構成する薬剤を、ペプチドおよび有機化合物などの異なる種類の化合物と接合することができる。接合は、当業者に知られている方法、例えば、核酸をポリアルキルシアノアクリレート（ＰＡＣＡ）のナノ粒子に結合するＬａｍｂｅｒｔら（Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．、２００１年、Ｒｅｖ．：４７：９９−１１２）の方法；核酸をナノ粒子に結合したＦａｔｔａｌら（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １９９８年、５３：１３７−１４３）が記載している方法；挿入剤、疎水性基、ポリカチオンまたはＰＡＣＡナノ粒子に特異的な核酸を記載しているＳｃｈｗａｂら（Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１９９４年、５ Ｓｕｐｐｌ．４：５５−５８）の方法；および核酸をナノ粒子に結合したＧｏｄａｒｄら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９５年、２３２：４０４−４１０）が記載している方法により実施できる。
【０１０４】
別の実施態様によれば、本発明による薬剤は、陽イオン性基を含み且つ発現抑制剤の二本鎖と結合できる脂溶性部分に結合している。好適な脂溶性薬剤には、コレステロール、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＡ，葉酸、カチオン性着色剤（例えば、Ｃｙ３）、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リソコール酸、０３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンなどがある。
【０１０５】
抑制効果は、表現型の変化を検出することにより、またはＲＮＡハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロアレイ、ウエスタンブロット法、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、およびＦＡＣＳによる遺伝子発現の観察などの手法によって、あるｍＲＮＡまたはそれがコードするタンパク質の発現レベルの変化を検出する生化学的手法を使い観測できる。動物モデルまたは培養細胞モデルにおいては、レポーター遺伝子または毒物に耐性のある遺伝子の発現の修飾（その産物を容易に検出できる）を検出することが可能である。好適なレポーター遺伝子には、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）、およびそれらの誘導体などがある。好適な選択マーカーには、アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン、およびテトラサイクリンに対する耐性をコードする遺伝子などがある。
【０１０６】
別法として、転写後遺伝子発現を抑制する非治療的方法は、発現が抑制されるべき遺伝子が発現している動物モデルに適用できる。この場合、遺伝子発現抑制剤が、遺伝子発現の転写後抑制を起こすべき動物における組織または器官に到達する必要がある。そのために、本発明の薬剤を患者へ治療目的で投与するための上記したいずれかの方法を使用することができる。好ましい実施態様によれば、本発明は、同じ機能的経路で関与するタンパク質をコードする様々な標的ｍＲＮＡを標的とする組成物の投与を意図している。本発明の組成物の組み合わせの使用による阻害対象となる機能的経路には、解糖、糖新生、クレブス回路、ペントースリン酸経、グリコーゲン合成、カルビン回路、トリアシルグリセリド分解、脂肪酸の活性化、ベータ酸化、脂肪酸デノボ合成、コレステロール合成、尿素サイクル、シキミ酸経路、アミノ酸の合成、酸化的リン酸化、光合成、プリン合成、ピリミジン合成、ヒスチジン代謝、ポルフィリン代謝、イノシトール代謝などがあるが、これらに限定されない。当業者には、前述の経路の様々な段階、さらに各段階に関与する酵素が知られており、したがって、前記プロセスの各段階で関与する一つまたはいくつかの遺伝子に特異的なＵ１ｉおよび他の発現抑制剤の開発が、プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡにおける標的配列を選択する上記した基準がＵ１ｉまたは同様の抑制剤により認識されるより大きな可能性がある場合には、日常の実験により実施できることが理解できるであろう。
【０１０７】
遺伝子治療は、生体外または生体内技術による細胞内への治療遺伝子の挿入に基づいており、遺伝子導入の最も重要な応用の一つである。文献には、生体外または生体内遺伝子治療に好適なベクターおよび方法が記載され、そして当業者に知られている；例えば、Ｇｉｏｒｄａｎｏ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（１９９６年）、５３４−５３９；Ｓｃｈａｐｅｒ、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ ７９（１９９６年）、９１１−９１９；Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６（１９９２年）、８０８−８１３；Ｉｓｎｅｒ、Ｌａｎｃｅｔ ３４８（１９９６年）、３７０−３７４；Ｍｕｈｌｈａｕｓｅｒ、Ｃｉｒｃ．、Ｒｅｓ ７７（１９９５年）、１０７７−１０８６；Ｗａｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（１９９６年）、７１４−７１６；ＷＯ９４／２９４６９号；ＷＯ９７／００９５７号またはＳｃｈａｐｅｒ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７（１９９６年）、６３５−６４０およびそこにあげられている文献参照。遺伝子は、細胞に直接挿入するか、あるいはリポソームまたはウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター）により挿入するように設計することができる。その細胞は、非ヒト生殖系列細胞、非ヒト胚細胞または非ヒト卵細胞、またはそれらの細胞から誘導される細胞であることが好ましい。より好ましくは、成体幹細胞または非ヒト胚幹細胞である。上記から明らかなように、本発明の使用において、核酸配列は、特定の細胞で本発明のポリペプチドの発現および／または融合を起こす調節要素に動作可能に結合していることが好ましい。本発明に従って使用するのに好適な遺伝子分配システムは、特に、リポソーム、レセプター媒体分配システム、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなどの裸のＤＮＡおよびウイルスベクターなどを含んでもよい。遺伝子治療をする体の特異的な部位への核酸分配システムは、またＷｉｌｌｉａｍｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８（１９９１年）、２７２６−２７２９）に記載されている微粒子銃分配システムを使用することによって実現できる。組み換えＤＮＡを細胞にトランスフェクトする標準的な方法は、分子生物学の当業者によく知られた方法であり、例えば、ＷＯ９４／２９４６９号、また上記を参照されたい。遺伝子治療は、本発明の組み換えＤＮＡ分子またはベクターを患者に直接投与することによって、または本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを生体外で細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を患者に投与することによって行なわれる。
【０１０８】
本発明において特に好ましい遺伝子治療ベクターは、パルボウイルスベクターである。したがって、本発明の好ましい態様では、本発明は、動物パルボウイルスの使用、特にディペンドウイルス、例えば、感染性ヒトＡＡＶまたは感染性サルＡＡＶの使用、および本発明のキットの組成物の導入および／または発現用ベクターとして使用するためのそれらの成分（例えば、動物パルボウイルスゲノム）に関する。
【０１０９】
パルボウイルス科ファミリーのウイルスは、小型ＤＮＡをもつ動物ウイルスである。パルボウイルス科ファミリーは、脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科と昆虫に感染するデンソウイルス亜科の二つの亜科に分けることができる。パルボウイルス亜科は、ここでは、パルボウイルスと呼び、ディペンドウイルス属が含まれる。それらの属の名前から推定できるように、ディペンドウイルスは、通常細胞培養において増殖感染するためにアデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスによる重感染が必要であるという点で他に類がない。ディペンドウイルス属には、一般的にヒト（例えば、血清型２、３Ａ、３Ｂ、５、および６）または霊長類（例えば、血清型１および４、サルが起源と考えられているが、ヒトにも感染する）に感染するＡＡＶや他の温血動物に感染する近縁ウイルス（例えば、ウシ、イヌ、ウマ、およびヒツジアデノ随伴ウイルス）が含まれる。さらに、ＡＡＶ血清型およびＡＡＶ血清型由来のハイブリッドＡＡＶベクターを作製する方法に関する情報が、Ｗｕら（２００６年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １４：３１６−３２７）により記載されている。本発明は、ＡＡＶには限定されず、等しく二種以上の異なるＡＡＶ血清型に由来するハイブリッドＡＡＶベクター、ならびに他のパルボウイルスおよびそれらのハイブリッドに適用できる。遺伝子治療にＡＡＶベクターを使用することに関する技術は、例えば、ＷＯ２００７／０４６７０３号およびＷＯ２００７／１４８９７１号に記載されている。
【０１１０】
したがって、本発明の組成物またはポリヌクレオチドは、少なくとも一つのパルボウイルスまたはＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が側に位置している、意図する本発明の配列のポリヌクレオチドを含んでなるベクターを指すことがある「組み換えパルボウイルスベクターまたはＡＡＶベクター」（「ｒＡＡＶベクター」）を使用して供給することができる。本発明の組成物は、２つのｒＡＡＶベクター（各々がこのような組成物の成分のうちの一つをコードする）を用いて供給することができる。本発明において使用するのに好適なｒＡＡＶベクターは、感染ウイルス粒子がＡＡＶｒｅｐおよびＡＡＶｃａｐ遺伝子産生物（すなわち、ＡＡＶＲｅｐおよびＡＡＶＣａｐタンパク質）を発現している昆虫宿主細胞内に存在するとき、複製され、感染ウイルス粒子内に取り込まれる。ｒＡＡＶベクターが大きな核酸構築物（例えば、染色体または、クローニングあるいはトランスフェクションに使用されるプラスミドまたはバキュロウイルスなどの他のベクター）に組み込まれる場合、ｒＡＡＶベクターは、「プロベクター」と呼ばれ、ＡＡＶ取り込み機能および必要なヘルパー機能の存在下で、複製およびキャプシド化により「レスキュー」されることができる。
【０１１１】
以下、本発明を実施例により説明するが、これらの実施例は説明の目的で記載され、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１１２】
実施例１．
１．１試薬
【０１１３】
実験で使用されたｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡの一覧：
【表１】
【０１１４】
ｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡの配列
Ａ：５’配列；Ｂ：センス（トランジエントストランド）；Ｃ：ループ；Ｄ：アンチセンス（ガイド鎖）；Ｅ：終結シグナル
【表２】
【０１１５】
配列１〜４は、シグマ社から得た。配列５（Ｐｕｒｏｗら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、（２００５年）６５：２３５３−６３）と配列６は、実験室で、その配列を含むオリゴヌクレオチドをプラスミドｐＳｕｐｅｒ（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、（２００２年）２９６：５５０−３）にクローニングすることにより得た：
【表３】
【０１１６】
全ての場合において、配列を、細胞内にトランスフェクトされた時に発現するように設計されたプラスミドｐＳｕｐｅｒのＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩサイトにクローニングする。ｓｈＲＮＡの発現は、細胞の核で起こり、そこから細胞質に輸送され、そこでプロセシングされてｓｉＲＮＡを生成する。これは、活性化して塩基対合により標的ｍＲＮＡを認識し、その分解を活性化する抑制機構と相互作用する。配列１〜５において、標的ＲＮＡは、ホタルルシフェラーゼ［Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ（遺伝子バンクアクセッション番号Ｍ１５０７７）］である。配列６および７は、Ｎｏｔｃｈ１遺伝子（ＮＰ＿０６００８７．３）を対象としている。全てのクローンの配列は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によって確認された。プラスミドＤＮＡは、トランスフェクトする前にＭａｘｉｐｒｅｐキット（Ｍａｒｌｉｎｇｅｎ社製）により精製した。
【０１１７】
実験で使用したＵ１／Ｕ１ｉｓｎＲＮＡの一覧
【表４】
参考文献：
（１）Ｆｏｒｔｅｓ Ｐ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００３年、１００：８２６４−８２６９）
（２）Ｆｏｒｔｅｓ Ｐ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００３年、１００：８２６４−８２６９およびＷＯ０２０８３９０８号）
【０１１８】
ループ３において４カ所の点突然変異を有する内因性Ｕ１ｓｎＲＮＡの５’末端の配列と同一の配列を含むＵ１ｓｎＲＮＡ（Ｕ１αＭｏｃｋ）を、対照として使用した。このループにおいて２つのグアノシンとハイブリダイズしている２つのシトシンを、互いに置き換えた。得られた分子は、内因性Ｕ１ｓｎＲＮＰとは機能的な面で差はない。以前、レポーター遺伝子の３’ＵＴＲ部において内因性Ｕ１ｓｎＲＮＡとハイブリダイズする配列を付加すると、このレポーター遺伝子の発現が阻害されることが立証された。このことは、この系が機能するということを裏付けている。
【０１１９】
Ｕ１ｉαＬｕｃは、Ｕ１ＷＴ配列から構築された。この配列では、３つの位置（太字および下線で示してある）で突然変異が起きた。修飾Ｕ１ｓｎＲＮＡを、Ｕ１ｓｎＲＮＰの標的を含むレポーター遺伝子と同時トランスフェクションすると、レポーター遺伝子の発現が阻害されることが観察された。非常に多くの構築物を、３’ＵＴＲの種々の位置において試験し、そして非常に数多くの試験管内研究により、種々の修飾Ｕ１ｓｎＲＮＡを作るための一連の条件が確立された。これらの基準を以下に示す：
−Ｕ１ｓｎＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’末端エクソンに結合しているときだけ阻害する。
−Ｕ１ｓｎＲＮＡは、従来のポリアデニル化機構によりポリアデニル化されるｍＲＮＡを特異的に阻害する。
−いくつかのＵ１ｓｎＲＮＡは、相乗的に作用する。
−Ｕ１ｓｎＲＮＡとその標的との間の結合は、その発現を阻害するには少なくとも７ｎｔでなければならない。
−Ｕ１ｓｎＲＮＡの５’部を延長する場合、このＵ１ｓｎＲＮＡがさらに阻害する。
−標的配列の近接性が、Ｕ１ｓｎＲＮＡが介在する阻害に影響する。
【０１２０】
Ｕ１αＮｏｔｃｈ１配列は、偽配列またはルシフェラーゼ配列とは全く異なり、Ｕ１の最初の１２ヌクレオチドの突然変異に由来する。
【０１２１】
１．２ルシフェラーゼ遺伝子発現阻害の実験モデル
ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣから入手）を、１０％ＢＦＳ（ウシ胎仔血清）および１％ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中、５％ＣＯ２環境下で培養した。培養試薬は全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のものを使用した。使用したプラスミドは全て、Ａｐａｒｉｃｉｏら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１００６、８０：１２２３６−４７）に準じてリン酸カルシウムを使用して細胞にトランスフェクトした。さらに、ウミシイタケルシフェラーゼを発現する対照プラスミド（ｐＳＶ−ＲＬ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）および他の蛍ルシフェラーゼを発現する対照プラスミドは、ｓｉＲＮＡおよびＵ１（ｐＧＬ−３、プロモーター、Ｐｒｏｍｅｇａ社）の標的配列でトランスフェクトした。Ｏｒｉｏｎ ＩＩプレートルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）において、Ａｐａｒｉｃｉｏら、２００６年、Ｖｉｒｏｌ．８０：１２２３６−４７にしたがって、細胞抽出物をトランスフェクション４８時間後に採取し、ルシフェラーゼの発現を、その活性を測定することで定量した（デュアルルシフェラーゼシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ社）。
【０１２２】
１．３内因性Ｎｏｔｃｈ遺伝子発現阻害の実験モデル
対照としてＵ１ｉαＮｏｔｃｈ１またはＵ１αＭｏｃｋを発現するｐＧＥＭプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、またはｓｈＲＮＡ１αＮｏｔｃｈ１またはｓｈＲＮＡ２αＮｏｔｃｈ１を発現するｐＧＥＭプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してヒーラ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、７２時間後に細胞抽出物を採取し、Ｎｏｔｃｈ１の蓄積を、特異的な抗体（Ｃ−２０ ｓｃ−６０１４−Ｒ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を使用し、化学発光により現像し（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、そして定量化する（Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）ウエスタンブロットにより定量した。また、アクチン濃度を、各々負荷対照として定量した。また、Ｎｏｔｃｈ１活性は、ＮＦκＢ核内移行能を測定することにより評価した。ＮＦκＢ活性は、ルシフェラーゼ遺伝子がＮＦκＢによりプロモーター下で誘導可能であるプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）からルシフェラーゼの発現を活性化する能力を測定することにより定量した。この系を使用して、上記で記載したようにルシフェラーゼを測定した。
【０１２３】
実施例２
種々のｓｎＲＮＡＵ１および干渉ＲＮＡのルシフェラーゼ遺伝子発現に及ぼす影響
阻害を、ルシフェラーゼに対してのｓｈＲＮＡの一回分量または一回分量の半量の存在下、Ｕ１ｉαＬｕｃの一回分量または一回分量の半量の存在下、またはｓｈＲＮＡの一回分量の半量とＵ１ｉαＬｕｃの一回分量の半量との混合物の存在下で試験した。得られた結果（図２〜５）から、両方の手法を用いて得たときの阻害が、各系を別個に用いたときに得られる阻害よりも大きいことからみて、相乗効果があることが明らかである。さらに、Ｕ１ｉの一回分量の半量＋ｓｈＲＮＡの一回分量の半量を用いたときに得られた阻害は、同一のＵ１ｉの一回分量または同一のｓｈＲＮＡの一回分量を用いたときに得られた阻害よりも大きいことから、相乗効果はしっかりしたものであると言える。強ｓｈＲＮＡ、すなわち、１０〜２０倍の阻害を生じさせるｓｈＲＮＡ（図２および３）、中ｓｈＲＮＡ、すなわち、４倍の阻害を生じさせるｓｎＲＮＡ（図４）および弱ｓｈＲＮＡ、すなわち、２倍の阻害を生じさせるｓｈＲＮＡ（図５）で検出されることを考慮すると、相乗効果は、使用されるｓｈＲＮＡの阻害能とは無関係であると言える。さらに、相乗効果があることにより、ｓｈＲＮＡまたはＵ１ｉの最大投与量で得られるよりも大きな阻害を維持しながら、ｓｈＲＮＡの投与量またはＵ１ｉの投与量を強ｓｈＲＮＡ（図６）または中ｓｈＲＮＡ（図７）を使用する場合の８〜２０倍減少させることができる。
【０１２４】
実施例３
種々のｓｈＲＮＡＵ１および干渉ＲＮＡのＮｏｔｃｈ１遺伝子発現に及ぼす影響
３．１Ｕ１ｓｎＲＮＡと成熟干渉ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）との組み合わせ
阻害についての相乗効果は、阻害剤と同時トランスフェクションした外来遺伝子でのみ機能すると言えるであろう。内在性遺伝子に対して、阻害について相乗効果があったかどうかを知るために、Ｎｏｔｃｈ１の阻害を分析した。Ｎｏｔｃｈ１は、ウエスタンブロット（図８Ａ）および核ＮＦκＢの量を減少する能力により測定した。後者の場合、ルシフェラーゼ遺伝子が、プロモーター下、ＮＦκＢにより誘導可能であるプラスミドを使用した（図８Ｂ）。阻害は、Ｎｏｔｃｈ１に対するｓｈＲＮＡの一回分量または一回分量の半量、Ｕ１ｉαＮｏｔｃｈ１の一回分量（８マイクログラム）または一回分量の半量（４マイクログラム）、またはｓｈＲＮＡの一回分量の半量とＵ１ｉαＮｏｔｃｈ１の一回分量の半量との混合物の存在下で試験した。結果から、両方の手法を用いて得たときの阻害が、各系を別個に用いたときに得られる阻害よりも大きいことからみて、相乗効果があることが明らかである（図８）。さらに、Ｕ１ｉの一回分量の半量＋ｓｈＲＮＡの一回分量の半量を用いたときに得られた阻害は、同一のＵ１ｉの一回分量または同一のｓｈＲＮＡの一回分量を用いたときに得られた阻害よりも大きいので、相乗効果はしっかりしたものであると言える。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一つもしくはいくつかの容器またはパーツからなるキットを含んでなる組成物であって、
（ｉ）少なくともＵ１ｓｎＲＮＡまたはＵ１ｓｎＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含んでなる第一成分であって、前記Ｕ１ｓｎＲＮＡが、標的プレｍＲＮＡの３’末端エクソンの予め選択された領域に特異的に結合するように、イントロンの５’端のＧＵコンセンサス配列に対する結合配列が修飾されており、かつ前記標的プレｍＲＮＡのプロセシングを阻害することができるものである、第一成分と、
（ｉｉ）（ｉ）で定義したＵ１ｓｎＲＮＡの標的であり、かつ前記標的ｍＲＮＡの生体内抑制を生じさせることができる前記プレｍＲＮＡのプロセシングから得られるｍＲＮＡの予め選択された領域を特異的に標的とする、少なくとも一種の遺伝子発現抑制剤を含んでなる第二成分とを含んでなる、組成物。
【請求項２】
前記第二成分に含まれる抑制剤が、
（ｉ）ｓｉＲＮＡ、
（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ、
（ｉｉｉ）ｓｈＲＮＡ、
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）に記載の薬剤をコードするポリヌクレオチド、および
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の一つまたはいくつかの薬剤の組み合わせからなる群から選択されるものである、請求項１に記載の組成物またはキット。
【請求項３】
成分（ｉｉ）が、少なくとも一種のｓｈＲＮＡをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチドである、請求項２に記載の組成物またはキット。
【請求項４】
成分（ｉ）が、同じ標的プレｍＲＮＡの異なる予め選択された領域に特異的に結合するようにイントロンの５’端のＧＵコンセンサス配列に対する結合配列が修飾されているＵ１ｓｎＲＮＡをコードするいくつかのポリヌクレオチドを含んでなり、および／または成分（ｉｉ）が、（ｉ）で定義したＵ１ｓｎＲＮＡの標的であり、かつ前記標的ｍＲＮＡの生体内抑制を生じさせることができる前記プレｍＲＮＡのプロセシングから得られるｍＲＮＡの異なる予め選択された領域を特異的に標的とする、いくつかの遺伝子発現抑制剤を含んでなる、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物またはキット。
【請求項５】
前記第二成分が抑制剤をコードするポリヌクレオチドであり、前記ポリヌクレオチドと第一成分を構成しているポリヌクレオチドが単一のベクターの一部分を形成する、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物またはキット。
【請求項６】
前記単一のベクターが、ウイルスベクターである、請求項５に記載の組成物またはキット。
【請求項７】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、およびアルファウイルスからなる群から選択されるものである、請求項６に記載の組成物またはキット。
【請求項８】
（ｉ）標的プレｍＲＮＡの３’末端エクソンの予め選択された領域に特異的に結合するように、イントロンの５’端のＧＵコンセンサス配列に対する結合配列が修飾されており、かつ前記標的プレｍＲＮＡのプロセシングを阻害することができる、少なくとも一種のＵ１ｓｎＲＮＡをコードする配列と、
（ｉｉ）（ｉ）で定義したポリヌクレオチドによりコードされている前記Ｕ１ｓｎＲＮＡの標的であり、かつ前記標的ｍＲＮＡの生体内抑制を生じさせることができる、前記プレｍＲＮＡのプロセシングから得られるｍＲＮＡの予め選択された領域を特異的に標的とする抑制剤をコードする配列と
を含んでなる、ポリヌクレオチド。
【請求項９】
抑制剤をコードする配列が、少なくとも一種のｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、少なくとも一種のプレｍｉＲＮＡまたは少なくとも一種のｓｈＲＮＡをコードする、請求項８で定義されるポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記配列（ｉ）および（ｉｉ）が、発現調節領域に動作可能に結合してなる、請求項８または９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列（ｉ）および（ｉｉ）の前記発現調節配列が異なるものである、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含んでなる、発現ベクター。
【請求項１３】
前記発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、およびアルファウイルスからなる群より選択されるものである、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
請求項１２〜１４に記載のベクターを含んでなる、細胞。
【請求項１６】
ゲノム中に組み込まれた請求項８〜１１に記載のポリヌクレオチド、請求項１２〜１４のいずれかに記載のベクター、または請求項１５に記載の細胞を含んでなる非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１７】
医学分野での使用または薬剤としての使用のための、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物またはキット、請求項８〜１１のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項１２〜１４のいずれかに記載のベクター、または請求項１５に記載の細胞。
【請求項１８】
感染症疾患、腫瘍性疾患、新生物疾患、または神経変性疾患の治療または予防のための、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物またはキット、請求項８〜１１のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項１２〜１４のいずれかに記載のベクター、または請求項１５に記載の細胞。
【請求項１９】
感染症疾患、腫瘍性疾患、新生物疾患、または神経変性疾患の治療または予防のための薬剤調製用の請求項１〜７のいずれかに記載の組成物またはキット、請求項８〜１１のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項１２〜１４のいずれかに記載のベクター、または請求項１５に記載の細胞の使用。
【請求項２０】
請求項１〜７のいずれかに記載の組成物またはキット、請求項８〜１１のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項１２〜１４のいずれかに記載のベクター、または請求項１５に記載の細胞を、それを必要としている患者に投与することを含んでなる、感染症疾患、腫瘍性疾患、新生物疾患、または神経変性疾患の治療方法。
【請求項２１】
前記感染症疾患は、ウイルスにより引き起こされる感染症疾患である、請求項１８に記載の組成物またはキット、請求項１９に記載の使用、または請求項２０で定義される方法。
【請求項２２】
ウイルスによって引き起こされる感染症疾患が、ＨＢＶ、ＨＣＶ、またはＨＩＶによる感染である、請求項２１に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項２３】
請求項１〜７のいずれかに記載の組成物またはキット、請求項８〜１１のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項１２〜１４のいずれかに記載のベクター、または請求項１５に記載の細胞、および薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項２４】
前記第一成分および前記第二成分を同時、逐次または別個に使用することについての説明書を備えてなる、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物またはキット。
【請求項２５】
同時使用、分別使用、または逐次使用のための組み合わせ製剤としての、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物またはキット。
【請求項２６】
生体系における標的遺伝子発現の生体外または生体内転写後阻害の非治療的方法であって、前記系を、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物、請求項８〜１１のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項１２〜１４のいずれかに記載のベクター、または請求項１５に記載の細胞と接触させることを含んでなる、方法。
【請求項２７】
前記生体モデルが、動物モデルである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記転写後阻害が、同じ機能的経路に関与する２つ以上の標的ｍＲＮＡの阻害を含む、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項１】
一つもしくはいくつかの容器またはパーツからなるキットを含んでなる組成物であって、
（ｉ）少なくともＵ１ｓｎＲＮＡまたはＵ１ｓｎＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含んでなる第一成分であって、前記Ｕ１ｓｎＲＮＡが、標的プレｍＲＮＡの３’末端エクソンの予め選択された領域に特異的に結合するように、イントロンの５’端のＧＵコンセンサス配列に対する結合配列が修飾されており、かつ前記標的プレｍＲＮＡのプロセシングを阻害することができるものである、第一成分と、
（ｉｉ）（ｉ）で定義したＵ１ｓｎＲＮＡの標的であり、かつ前記標的ｍＲＮＡの生体内抑制を生じさせることができる前記プレｍＲＮＡのプロセシングから得られるｍＲＮＡの予め選択された領域を特異的に標的とする、少なくとも一種の遺伝子発現抑制剤を含んでなる第二成分とを含んでなる、組成物。
【請求項２】
前記第二成分に含まれる抑制剤が、
（ｉ）ｓｉＲＮＡ、
（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ、
（ｉｉｉ）ｓｈＲＮＡ、
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）に記載の薬剤をコードするポリヌクレオチド、および
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の一つまたはいくつかの薬剤の組み合わせからなる群から選択されるものである、請求項１に記載の組成物またはキット。
【請求項３】
成分（ｉｉ）が、少なくとも一種のｓｈＲＮＡをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチドである、請求項２に記載の組成物またはキット。
【請求項４】
成分（ｉ）が、同じ標的プレｍＲＮＡの異なる予め選択された領域に特異的に結合するようにイントロンの５’端のＧＵコンセンサス配列に対する結合配列が修飾されているＵ１ｓｎＲＮＡをコードするいくつかのポリヌクレオチドを含んでなり、および／または成分（ｉｉ）が、（ｉ）で定義したＵ１ｓｎＲＮＡの標的であり、かつ前記標的ｍＲＮＡの生体内抑制を生じさせることができる前記プレｍＲＮＡのプロセシングから得られるｍＲＮＡの異なる予め選択された領域を特異的に標的とする、いくつかの遺伝子発現抑制剤を含んでなる、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物またはキット。
【請求項５】
前記第二成分が抑制剤をコードするポリヌクレオチドであり、前記ポリヌクレオチドと第一成分を構成しているポリヌクレオチドが単一のベクターの一部分を形成する、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物またはキット。
【請求項６】
前記単一のベクターが、ウイルスベクターである、請求項５に記載の組成物またはキット。
【請求項７】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、およびアルファウイルスからなる群から選択されるものである、請求項６に記載の組成物またはキット。
【請求項８】
（ｉ）標的プレｍＲＮＡの３’末端エクソンの予め選択された領域に特異的に結合するように、イントロンの５’端のＧＵコンセンサス配列に対する結合配列が修飾されており、かつ前記標的プレｍＲＮＡのプロセシングを阻害することができる、少なくとも一種のＵ１ｓｎＲＮＡをコードする配列と、
（ｉｉ）（ｉ）で定義したポリヌクレオチドによりコードされている前記Ｕ１ｓｎＲＮＡの標的であり、かつ前記標的ｍＲＮＡの生体内抑制を生じさせることができる、前記プレｍＲＮＡのプロセシングから得られるｍＲＮＡの予め選択された領域を特異的に標的とする抑制剤をコードする配列と
を含んでなる、ポリヌクレオチド。
【請求項９】
抑制剤をコードする配列が、少なくとも一種のｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなり、少なくとも一種のプレｍｉＲＮＡまたは少なくとも一種のｓｈＲＮＡをコードする、請求項８で定義されるポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記配列（ｉ）および（ｉｉ）が、発現調節領域に動作可能に結合してなる、請求項８または９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列（ｉ）および（ｉｉ）の前記発現調節配列が異なるものである、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含んでなる、発現ベクター。
【請求項１３】
前記発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、およびアルファウイルスからなる群より選択されるものである、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
請求項１２〜１４に記載のベクターを含んでなる、細胞。
【請求項１６】
ゲノム中に組み込まれた請求項８〜１１に記載のポリヌクレオチド、請求項１２〜１４のいずれかに記載のベクター、または請求項１５に記載の細胞を含んでなる非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１７】
医学分野での使用または薬剤としての使用のための、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物またはキット、請求項８〜１１のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項１２〜１４のいずれかに記載のベクター、または請求項１５に記載の細胞。
【請求項１８】
感染症疾患、腫瘍性疾患、新生物疾患、または神経変性疾患の治療または予防のための、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物またはキット、請求項８〜１１のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項１２〜１４のいずれかに記載のベクター、または請求項１５に記載の細胞。
【請求項１９】
感染症疾患、腫瘍性疾患、新生物疾患、または神経変性疾患の治療または予防のための薬剤調製用の請求項１〜７のいずれかに記載の組成物またはキット、請求項８〜１１のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項１２〜１４のいずれかに記載のベクター、または請求項１５に記載の細胞の使用。
【請求項２０】
請求項１〜７のいずれかに記載の組成物またはキット、請求項８〜１１のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項１２〜１４のいずれかに記載のベクター、または請求項１５に記載の細胞を、それを必要としている患者に投与することを含んでなる、感染症疾患、腫瘍性疾患、新生物疾患、または神経変性疾患の治療方法。
【請求項２１】
前記感染症疾患は、ウイルスにより引き起こされる感染症疾患である、請求項１８に記載の組成物またはキット、請求項１９に記載の使用、または請求項２０で定義される方法。
【請求項２２】
ウイルスによって引き起こされる感染症疾患が、ＨＢＶ、ＨＣＶ、またはＨＩＶによる感染である、請求項２１に記載の組成物、キット、または方法。
【請求項２３】
請求項１〜７のいずれかに記載の組成物またはキット、請求項８〜１１のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項１２〜１４のいずれかに記載のベクター、または請求項１５に記載の細胞、および薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項２４】
前記第一成分および前記第二成分を同時、逐次または別個に使用することについての説明書を備えてなる、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物またはキット。
【請求項２５】
同時使用、分別使用、または逐次使用のための組み合わせ製剤としての、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物またはキット。
【請求項２６】
生体系における標的遺伝子発現の生体外または生体内転写後阻害の非治療的方法であって、前記系を、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物、請求項８〜１１のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項１２〜１４のいずれかに記載のベクター、または請求項１５に記載の細胞と接触させることを含んでなる、方法。
【請求項２７】
前記生体モデルが、動物モデルである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記転写後阻害が、同じ機能的経路に関与する２つ以上の標的ｍＲＮＡの阻害を含む、請求項２６または２７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２０１１−５１０６４７（Ｐ２０１１−５１０６４７Ａ）
【公表日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４４７３９（Ｐ２０１０−５４４７３９）
【出願日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００９／００００４５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０９５５１７
【国際公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【出願人】（５０６０６１７１６）プロイェクト、デ、ビオメディシナ、シーマ、ソシエダッド、リミターダ (34)
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＹＥＣＴＯ ＤＥ ＢＩＯＭＥＤＩＣＩＮＡ ＣＩＭＡ， Ｓ．Ｌ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年４月７日（２０１１．４．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２００９／００００４５
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０９５５１７
【国際公開日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【出願人】（５０６０６１７１６）プロイェクト、デ、ビオメディシナ、シーマ、ソシエダッド、リミターダ (34)
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＹＥＣＴＯ ＤＥ ＢＩＯＭＥＤＩＣＩＮＡ ＣＩＭＡ， Ｓ．Ｌ．
【Ｆターム（参考）】
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