遺伝子発現を誘導するための組成物および方法
【課題】低酸素関連疾病と関連する虚血損傷を治療または予防するための組成物および方法の提供。
【解決手段】ＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化能力を持つタンパク質ドメインを含む、キメラトランスアクティベータータンパク質をコードする組換え核酸分子。哺乳動物細胞内に感染および／またはトランスフェクトし、そして生物学的に活性なキメラトランスアクティベータータンパク質の発現を持続する能力を持つ、組換えウイルスおよび非ウイルスベクター。また、生物学的に活性なキメラトランスアクティベータータンパク質を発現する能力を持つ、宿主細胞系および非ヒトトランスジェニック動物。
【解決手段】ＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化能力を持つタンパク質ドメインを含む、キメラトランスアクティベータータンパク質をコードする組換え核酸分子。哺乳動物細胞内に感染および／またはトランスフェクトし、そして生物学的に活性なキメラトランスアクティベータータンパク質の発現を持続する能力を持つ、組換えウイルスおよび非ウイルスベクター。また、生物学的に活性なキメラトランスアクティベータータンパク質を発現する能力を持つ、宿主細胞系および非ヒトトランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は遺伝子発現を誘導するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血性心臓疾患は、心筋が適切な血液供給を受けず、そしてしたがって必要なレベルの酸素および栄養素が欠乏する際、発生する。虚血は、通常、心筋への血流を提供する冠状動脈の遮断を引き起こす、アテローム性硬化症の結果である。
虚血性心臓疾患は、心臓内の、有益である可能性がある特定の適応応答を生じる可能性がある。これらの応答の中には：１）遮断された冠状動脈の周りに側副（ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ）循環形成を導く、血管形成性増殖因子およびその受容体発現の増加；２）Ｏ2を必要としない代謝経路を活性化させる手段としての、解糖酵素発現の増加；および３）虚血組織を死から保護することが可能である、熱ショックタンパク質の発現がある。
【０００３】
これらの応答の少なくともいくつかは、複雑な酸素感受機構に制御されるようであり、該機構は最終的に、本適応に関与する必須遺伝子の発現を調節する転写因子の活性化を導く。この遺伝子発現の改変は、通常、病気の心臓に運動などの負担がかかったときにのみ発生する、低酸素症にのみ応答して発生するため、心臓病患者は、通常、この内因性保証機構から大きな利益は受けない。そのため、いくつかの慣用療法は、虚血に対する心臓の天然の治療応答を補足することを試みている。
【０００４】
例えば、こうした治療は、薬理学的療法、冠状動脈バイパス手術およびバルーン血管形成術などの技術を用いた経皮血管再生を含む。標準的な薬理学的療法は、心筋への血液供給を増加させるか、または心筋の酸素および栄養素に対する要求を減少させることかどちらかを伴う戦略に基礎を置く。
【０００５】
心筋層への血液供給の増加は、カルシウムチャンネル遮断剤またはニトログリセリンなどの剤により達成される。これらの剤は、動脈壁の平滑筋弛緩を引き起こすことにより、病気の動脈の直径を増加させると考えられる。心筋の酸素および栄養素に対する要求の減少は、心臓に対する血流力学的負荷を減少させる剤、例えば動脈拡張剤、または既定の血流力学的負荷に対する心臓の収縮反応を減少させるもの、例えばベータ−アドレナリン受容体アンタゴニストのどちらかにより達成される。
【０００６】
虚血性心臓疾患の外科的治療は、戦略的に置かれたバイパス移植片（通常、伏在静脈または内部乳房動脈移植片）での病気の動脈部分のバイパスに基づく。経皮血管再生は、病気の冠状動脈の狭窄を減少させるカテーテルの使用に基づく。これらの戦略はすべて、虚血症状の出現の数を減少させ、または該出現を根絶するために用いられるが、すべてさまざまな限界を有する。
【０００７】
より最近、虚血に対する心臓の天然応答をさらに増大するのに、タンパク質または遺伝子治療を介した血管形成性因子または熱ショックタンパク質の搬送が、提唱されてきている。実際、多様な刊行物により、心臓疾患の治療または予防のための遺伝子搬送の使用が議論されてきている。例えば、Ｍａｚｕｒら，“Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ”， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２１：１０４−１１１（１９９４）；Ｆｒｅｎｃｈ， Ｂ．Ａ．“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ”Ｈｅｒｚ． １８（４）：２２２−２２９（１９９３）；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，“Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｓｃｈｅｍｉｃ Ｈｅａｒｔ Ｄｉｓｅａｓｅ”， Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ． ３０６：１２９−１３６（１９９３）；ＳｃｈｎｅｉｄｅｒおよびＦｒｅｎｃｈ“Ｔｈｅ Ａｄｖｅｎｔ ｏｆ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅ”Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８８：１９３７−４２（１９９３）を参照されたい。“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｃａｒｄｉａｃ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ”と題された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／１１１３３号は、心臓血管平滑筋の機能を制御するためのアデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）媒介遺伝子運搬の使用を報告している。
【０００８】
したがって、当技術分野には、虚血関連細胞において有益な低酸素症誘導性遺伝子発現を誘導するための組成物および方法に対する必要性が存在する。さらに、生物学的に活性がある哺乳動物転写因子の持続直接発現により活性化される多様な潜在的に有益な遺伝子の効率的な発現を可能にする、新規ベクター組成物に対する必要性が存在する。本発明はこれらの必要性を満たし、そして関連する利点もまた提供する。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、哺乳動物低酸素症誘導性因子タンパク質であるＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、および転写活性化タンパク質の機能的な転写活性化ドメインを含む、キメラトランス活性化因子をコードする組換え核酸分子を提供する。
【００１０】
したがって、本発明の作成において、我々は血管疾患に関連した虚血治療のための代替アプローチとして、低酸素症に対する適応応答を利用しようと求めた。我々は、遺伝子治療を介した修飾ＨＩＦ−１α転写因子の投与が、潜在的に有益な多様な遺伝子の発現を誘導し、そして究極的に虚血組織の新規血管新生を導く可能性があると考えた。我々は、ＨＩＦ−１α由来のＤＮＡ結合およびダイマー化ドメインおよび単純疱疹ウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）ＶＰ１６タンパク質由来のトランス活性化ドメインからなる、ＨＩＦ−１αの構成的な活性化型を生成した。本修飾転写因子の標的遺伝子となる可能性があるものの中に、内皮細胞特異的分裂促進物質および血管形成の強力な刺激物質であるＶＥＧＦがある。
【００１１】
本発明のＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッド転写因子のｉｎ ｖｉｔｒｏ解析により、ＨｅＬａおよびＣ６細胞において、ＶＥＧＦまたはＥＰＯプロモーターのいずれかの転写調節下でのルシフェラーゼ・レポーター構築物の活性化と共に、内因性ＶＥＧＦ遺伝子発現の上方制御が誘導と独立していることが立証された。ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６をコードするプラスミドの外因性投与が、側副血管形成を亢進することが可能であるという仮説を試験し、そしてまた血管形成療法としてのＨＩＦ−１α／ＶＰ１６の効力をＶＥＧＦのものと比較するため、ウサギ後肢虚血モデルで実験を行った。これらの研究結果により、転写因子をコードするＤＮＡの投与は、組織虚血に対する実行可能な治療戦略を代表する可能性があることが示唆される。
【００１２】
本発明はまた、哺乳動物細胞において、生物学的に活性があるキメラヒト・ウイルストランス活性化タンパク質を感染させおよび／またはトランスフェクションし、そして発現を持続することが可能な組換えウイルスおよび非ウイルスベクターも提供する。
【００１３】
本発明はさらに、組換えプラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６／Ａｆｌ２）を提供する。
【００１４】
別の態様において、本発明は組換えプラスミド発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６／ＲＩ）を提供する。
【００１５】
さらに別の態様において、本発明は、ｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６／Ａｆｌ２またはｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６／ＲＩでトランスフェクションした哺乳動物細胞および細胞株を提供する。
【００１６】
さらに別の態様において、本発明は、持続したレベルで、生物学的に活性があるキメラヒト・ウイルストランス活性化タンパク質を発現することが可能な組換え哺乳動物細胞株を提供する。
【００１７】
本発明はまた、持続したレベルで、生物学的に活性があるキメラヒト・ウイルストランス活性化タンパク質を発現しそして分泌することが可能な組換え哺乳動物宿主細胞株も提供する。
【００１８】
さらに別の態様において、本発明は、ＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、ここでＤＮＡ結合タンパク質は哺乳動物低酸素症誘導性因子１α（ＨＩＦ−１α）タンパク質である、をアミノ末端に、そして転写活性化タンパク質の機能的な転写活性化ドメイン、ここで前記転写活性化タンパク質はＨＳＶ ＶＰ１６である、をカルボキシ末端に含む、融合タンパク質を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、ＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、ここで前記ＤＮＡ結合タンパク質は哺乳動物低酸素症誘導性因子１α（ＨＩＦ−１α）タンパク質である、および転写活性化タンパク質の機能的な転写活性化ドメイン、ここで前記転写活性化タンパク質はＨＳＶ ＶＰ１６である、を含む、キメラトランス活性化因子をコードする組換えＤＮＡを発現する、非ヒトトランスジェニック哺乳動物を提供する。
【００２０】
さらに別の態様において、本発明は、低酸素症誘導性遺伝子の発現を増加させるための方法を提供する。
【００２１】
さらに別の態様において、本発明は、酸素正常条件下で、生物学的に活性があるＨＩＦ−１αの持続発現を提供するための方法を提供する。
【００２２】
本発明はまた、患者における低酸素症関連組織損傷を治療する／予防する／調節するための方法も提供する。
【００２３】
本発明はさらに、個体の細胞に、生物学的に活性があるキメラヒト・ウイルストランス活性化タンパク質を提供するための方法であって、個体の細胞にトランスフェクションし、そして生物学的に活性があるキメラヒト・ウイルストランス活性化タンパク質発現を持続するのに有効な量のｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６／ＲＩまたはｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６／Ａｆｌ２を、該細胞に導入することを含む、前記方法を提供する。
【００２４】
本発明のさらなる特徴および利点は、以下の詳細な説明と共に請求項から明らかになるであろう。
【００２５】
本明細書に引用されるすべての特許出願、特許、および参考文献は、本明細書に完全に援用される。矛盾または不一致の場合、定義を含む本明細書中の説明が優先する。
【００２６】
発明の詳細な説明
低酸素症（Ｏ2要求が供給を上回る状態）は遺伝子発現の強力な調節要因である。低酸素症に対する生理学的応答には、赤血球生成の亢進（Ｊｅｌｋｍａｎ，
Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７２：４４９−４８９（１９９２））、虚血組織における新規血管新生（Ｗｈｉｔｅら， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ７１：１４９０−１５００（１９９２））および解糖に基づく代謝へのスイッチ（Ｗｏｌｆｅら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３５：４０５−４１２（１９８３））が含まれる。これらの適応応答は、Ｏ2搬送を増加させるか、またはＯ2を必要としない代替代謝経路を活性化するかどちらかである。これらの過程に関与する遺伝子産物には、例えば：（ｉ）赤血球生成の主要な制御因子であり、そしてしたがって血液Ｏ2運搬能力の主要な決定要素であるエリスロポエチンをコードするＥＰＯ（Ｊｉａｎｇら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１（３０）：１７７７１−７８（１９９６））；（ｉｉ）血管形成の主要な制御因子であり、そしてしたがって組織灌流の主要な決定要素である、血管内皮増殖因子をコードする、ＶＥＧＦ（Ｌｅｖｙら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１３３３３（１９９５）；Ｌｉｕら， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ７７：６３８（１９９５）；Ｆｏｒｓｙｔｈｅら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １６：４６０４（１９９６））；（ｉｉｉ）Ｏ2の非存在下でＡＴＰ生成の代謝経路を提供する解糖酵素、アルドラーゼ１、エノラーゼ１、乳酸デヒドロゲナーゼＡ、ホスホフルクトキナーゼＬ、およびホスホグリセリン酸キナーゼ１をそれぞれコードする、ＡＬＤＡ、ＥＮＯ１、ＬＤＨＡ、ＰＦＫＬ、およびＰＧＫ１（Ｆｉｒｔｈら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ９１：６４９６（１９９４）；Ｆｉｒｔｈら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：２１０２１（１９９５）；Ｓｅｍｅｎｚａら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：２３７５７（１９９４））；（ｉｖ）それぞれが血管作動性分子である一酸化炭素および一酸化窒素の合成を担う、ヘムオキシゲナーゼ１および誘導性一酸化窒素シンターゼをコードする、ＨＯ１およびｉＮＯＳ（Ｌｅｅら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：５３７５；Ｍｅｌｉｌｌｏら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８２：１６８３（１９９５））が含まれる。
【００２７】
これらの応答の重要な媒介因子は、ＤＮＡ結合の低酸素症誘導性因子タンパク質を含む転写複合体と、その同系のＤＮＡ認識部位である低酸素症誘導性遺伝子のプロモーター／エンハンサー領域内に位置する低酸素症応答要素（ＨＲＥ）との相互作用である。ＨＲＥは低酸素症誘導性因子タンパク質結合部位（コア配列として５’−ＣＧＴＧ−３’を含む）と共に、機能に必要なさらなるＤＮＡ配列からなり、それはある要素では第二の結合部位を含む。
【００２８】
ＨＩＦ−１は、２つのサブユニット：（ｉ）構成的に発現されるベータ（β）サブユニット（他の関連する転写因子と共有されている）および（ｉｉ）低酸素症条件の間のみ高レベルのアルファサブユニットが検出されるように、翻訳後機構により蓄積が制御されている、アルファ（α）サブユニット（例えば、ＨＩＦ−１αの最近のアフィニティー精製および分子クローニングを記載する、ＷＯ ９６／３９４２６、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２５１号を参照されたい）からなるヘテロ二量体タンパク質である。どちらのサブユニットも、転写因子の塩基性へリックス・ループ・へリックス（ｂＨＬＨ）・ＰＡＳファミリーのメンバーである。これらのドメインはＤＮＡ結合およびダイマー化を制御する。トランス活性化ドメインは、タンパク質のＣ末端に存在すると考えられる。
【００２９】
ＨＩＦ−１β（ＡＲＮＴ）は、高レベルで構成的に発現される一方、ＨＩＦ−１αの細胞内蓄積はＯ2濃度に感受性であり、低酸素症の間のみ高レベルで検出される。本観察からは、Ｏ2濃度がセンサータンパク質により検出され、そして複雑な情報伝達機構を通じＨＩＦ−１αサブユニットの安定化が導かれるという、標的遺伝子活性化の機構の提唱につながった。その後、ＨＩＦ−１αは、ＨＩＦ−１βと複合体を形成することが可能になり、そして標的遺伝子のプロモーター／エンハンサー内のＨＲＥ部位に選択的に結合する。この応答を与えるのに関与するＨＩＦ−１αタンパク質の領域は、トランス活性化に関与する領域と一致すると考えられる。
【００３０】
低酸素症に応答したＨＩＦ−１の活性化の誘導は、ＨＩＦ−１αタンパク質の安定化を介して起こると考えられる。この応答に関与するＨＩＦ−１αの領域は、タンパク質のＣ末端に位置決定されており、そしてトランス活性化ドメインと重なる。例えば、Ｊｉａｎｇら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１（３０）：１７７７１−７８（１９９６）は、アミノ酸３９０で切除されている（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＨＩＦ−１αはトランス活性化活性を失うが、ＤＮＡ結合能力を保持し、そして酸素正常および低酸素条件下両方で高レベルのタンパク質を示すことを示した。本結果により、トランス活性化ドメインと共に、酸素正常で不安定さを与える領域もタンパク質のＣ末端側に存在することが示唆された。Ｐｕｇｈら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２（１７）：１１２０５−１４（１９９７）は、関与する領域をさらに、２つの領域、アミノ酸５４９−５８２および７７５−８２６に位置決定した。
【００３１】
１つの態様において、本発明は、ＤＮＡと結合しおよびＨＩＦ−１β（ＡＲＮＴ）とダイマー化するのに十分なＨＩＦ−１αタンパク質のドメインおよび転写活性化が可能なタンパク質ドメインとを含む、生物学的に活性があるキメラトランス活性化タンパク質をコードする核酸分子を提供する。
【００３２】
別の態様において、関連するＤＮＡ結合性の低酸素症誘導性因子タンパク質はＥＰＡＳ１である。ＥＰＡＳ１は内皮ＰＡＳ−１と称されるＰＡＳドメイン転写因子である。Ｔｉａｎら， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １１：７２（１９９７）。ＥＰＡＳ１はＨＩＦ−１αと４８％の同一性および転写因子のｂＨＬＨ／ＰＡＳドメインファミリーの他のメンバーとより低い類似性を共有する（ＥＰＡＳ１ヒト配列ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第Ｕ８１９８４号；マウス配列ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第Ｕ８１９８３号）。ＨＩＦ−１α同様、ＥＰＡＳ１は、元来ＥＰＯ遺伝子から単離され、そしてＨＲＥコア配列を含むＤＮＡ要素に結合し、そして該要素からの転写を活性化する。ＥＰＡＳ１はまた、標的遺伝子の転写活性化前にＡＲＮＴとヘテロ二量体性複合体を形成する。
【００３３】
ヒトおよびネズミＥＰＡＳ１は、ＨＩＦ−１αと広い一次アミノ酸配列同一性を共有する（４８％）。２つのタンパク質の間の配列保存性は、ｂＨＬＨ（８５％）、ＰＡＳ−Ａ（６８％）、およびＰＡＳ−Ｂ（７３％）領域で最も高い。配列同一性の第二の領域は、ＥＰＡＳ１およびＨＩＦ−１αタンパク質の極Ｃ末端に現れる。ｍＨＩＦ−１α内のこの保存領域は、低酸素症応答ドメインを含むことが示されてきている（Ｌｉら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１（３５）：２１２６２−６７（１９９６））。ＥＰＡＳ１およびＨＩＦ−１αの間の高度の配列類似性により、これらが共通の生理学的機能を共有することが示唆される。低酸素条件は、ＨＩＦ−１αがＨＲＥコア配列を含む標的遺伝子をトランス活性化する能力を刺激する。ＥＰＡＳ１の活性もまた、低酸素条件下で増殖する細胞で亢進され、ＥＰＡＳ１がＨＩＦ−１αと同一の制御影響にさらされる可能性があることが示唆される。
【００３４】
本発明のさらに別の態様において、転写因子としての、ＤＮＡ結合性の低酸素症誘導性因子タンパク質はＨＬＦである。ＨＬＦはＨＩＦ−１α様因子と称されるｂＨＬＨ−ＰＡＳタンパク質である。Ｅｍａら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ９４：４２７３（１９９７）。ＨＬＦは計算分子量が９７ｋＤａである、８７４アミノ酸の新規ポリペプチドである（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第Ｄ８９７８７号）。配列比較により、該アミノ酸配列は、ｂＨＬＨ（８３．９％）およびＰＡＳ（６６．５％）モチーフを含むアミノ末端側（ａａ１−３４４）でＨＩＦ−１αと著しい類似性を有し、その後、中程度の類似性を持つ配列が続く（３６．４％、ａａ３４５−５５９）。Ｃ末端側半分の配列のほとんどは、本タンパク質およびＨＩＦ−１αの間で多様である一方、極Ｃ末端で注目される配列類似性の小部分（６３％、ａａ８２４−８７４）が見出された。ＤＮＡ認識に関与するｂＨＬＨ領域の塩基性アミノ酸が、ＨＬＦおよびＨＩＦ−１αで完全に保存されていることは、これらの因子が、同一でなくても非常に類似の制御ＤＮＡ配列を認識することを示唆する。実験により、ＨＬＦおよびＨＩＦ−１αの両方がＡＲＮＴと一緒になって、同様の親和性でＶＥＧＦおよびＥＰＯ ＨＲＥ配列に結合することが示された。
【００３５】
別の態様において、本発明のキメラトランス活性化タンパク質は、非哺乳動物低酸素症誘導性因子タンパク質のドメインを含む。当業者に認識されるであろうように、低酸素症に対する適応応答は、進化の間中、非常に保存されてきた可能性がある。したがって、低酸素症誘導性因子タンパク質は、非哺乳動物脊椎動物および非脊椎動物、例えば昆虫を含む多様な種で出現することが期待されるであろう。例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）由来のＳｉｍａ塩基性へリックス・ループ・へリックスＰＡＳタンパク質および哺乳動物ＨＩＦ−１αタンパク質の間の機能的な類似性を報告する、Ｂａｃｏｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．， ２４９：８１１−８１６（１９９８）を参照されたい。
【００３６】
非哺乳動物低酸素症誘導性因子タンパク質の核酸およびアミノ酸配列は、当業者により、多様な技術により、例えば、本明細書に引用される配列のすべてまたは一部を用いたクロスハイブリダイゼーションまたは増幅により、得ることが可能である。ひとたび、候補低酸素症誘導性因子タンパク質をコードする配列が決定されたら、ＨＲＥに結合し、そしてＨＩＦ−１βとダイマー化するのに十分なタンパク質の部分の位置を、例えば、ヒトＨＩＦ−１αタンパク質内のこれらのドメインの位置決定に用いたのと同じ種類の技術を用い、決定してもよい。本発明の組成物および方法に有用な、非哺乳動物低酸素症誘導性因子タンパク質の適切なドメインはまた、合成により産生しても、または既知の哺乳動物低酸素症誘導性因子タンパク質をコードするＤＮＡの部位特異的操作により産生してもよい。また、多様な哺乳動物および非哺乳動物低酸素症誘導性因子タンパク質の間で共通な配列モチーフがあれば、おそらくいかなる種でも天然には発生しないであろうが、本発明の方法および組成物に有用なドメインを生じるであろうコンセンサス配列を示唆するであろう。本明細書に例証されるヒトＨＩＦ−１αタンパク質ドメインに対し、こうした非哺乳動物低酸素症誘導性因子タンパク質ドメインを置換するために必要とされるのは、これらがＨＲＥと結合し、そしてＨＩＦ−１β（ＡＲＮＴ）とダイマー化するのが可能なことのみである。
【００３７】
したがって、低酸素症誘導性因子タンパク質を、Ｃ末端（トランス活性化）ドメインを除去し、そしてそれを強力なトランス活性化配列と置換することにより修飾することが提案される。この修飾は、該タンパク質がβ／ＡＲＮＴサブユニットとダイマー化する、または特定のＤＮＡ配列（例えばＨＲＥ）と結合する能力を変化させてはならないが、該低酸素症誘導性因子タンパク質を、潜在的に治療力がある遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ、ＥＰＯ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、およびそれらに匹敵するもの）の構成的な誘導因子に変換してもよい。
【００３８】
低酸素症誘導性因子タンパク質のＣ末端（またはトランス活性化）領域の、例えば、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）ＶＰ１６または酵母転写因子ＧＡＬ４およびＧＣＮ４などの転写活性化タンパク質由来の強力なトランス活性化ドメインでの置換を、酸素正常条件下で該タンパク質を安定化し、そして強力で構成的な転写活性化を提供するために設計した。遺伝子治療を介した、本タンパク質の患者の細胞への投与は、冠状動脈疾患、末梢血管疾患並びに、四肢の虚血性疾患による慢性虚血に対する、効果的な治療または予防法であるはずである。
【００３９】
本出願において、目的は、低酸素症誘導性因子タンパク質、例えばＨＩＦ−１α、ＥＰＡＳ１およびＨＬＦが低酸素症誘導性遺伝子、例えばＶＥＧＦおよびそれに匹敵するものの発現を誘導し、側副血管増殖の促進を通じ、症状の改善を生じる能力である。
【００４０】
例えば、ＨＩＦ−１αサブユニットは、酸素正常条件中、不安定であるが、正常酸素レベル下で培養される細胞中の本サブユニットの過剰発現により、通常、低酸素症により誘導される遺伝子の発現を誘導することが可能である。これにより、有用な遺伝子治療戦略は、組換えプラスミドまたはウイルスベクターを用い、ｉｎ ｖｉｖｏで虚血心臓において高レベルのＨＩＦ−１αサブユニットを発現するものである可能性があることが示唆される。代替戦略は、ＨＩＦ−１αサブユニットを修飾して、もはや酸素正常条件により不安定化されず、したがって、特に治療されている患者が実際には虚血でない場合も、より強力であるようにするものであろう。
【００４１】
低酸素症誘導性因子タンパク質を、酸素正常条件下で安定化し、そして強力で構成的な転写活性化を提供するため、ＨＩＦ−１α由来のＤＮＡ結合およびダイマー化ドメイン並びに単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）ＶＰ１６タンパク質由来のトランス活性化ドメインからなるハイブリッド／キメラ融合タンパク質を構築した。遺伝子治療を介した、本ハイブリッド／キメラの患者の細胞への投与は、理論的には、通常、低酸素症に応答し、上方制御される遺伝子（すなわち、ＶＥＧＦおよびそれに匹敵するもの）の発現を誘導するであろう。
【００４２】
あるいは、生物学的に活性があるキメラトランス活性化タンパク質、例えばＨＩＦ−１α由来のＤＮＡ結合およびダイマー化ドメイン並びにヒトＮＦκＢタンパク質由来のトランス活性化ドメインを含むタンパク質も、同様の結果を生じると期待される。
【００４３】
「低酸素症」は、Ｏ2要求が供給を上回る状態を意味する。
【００４４】
「低酸素症誘導性遺伝子」は、配列内に、低酸素症細胞における転写活性化を媒介する、１つまたはそれ以上の低酸素症応答要素（ＨＲＥ；結合部位）を含む遺伝子を意味する。
【００４５】
低酸素症誘導性因子は、その発現が低酸素症条件下で上方制御され、遺伝子内の低酸素症応答要素コア配列を認識し、そして該配列に結合し、そしてそれによりこうした遺伝子を活性化するＤＮＡ結合タンパク質／転写因子を意味する。
【００４６】
低酸素症関連障害には、例えば、虚血性心臓疾患、末梢血管疾患、四肢の虚血性疾患、およびそれらに匹敵するものが含まれる。
【００４７】
「核酸」（ポリヌクレオチドとも呼ばれる）という用語は、ＲＮＡと共に一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む。
【００４８】
核酸はまた、例えばＨＩＦ−１α、ＥＰＡＳ１、またはＨＬＦ配列由来の、センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を含む、単離核酸配列も含む。ＨＩＦ−１α、ＥＰＡＳ１、またはＨＬＦ由来配列はまた、プロモーター、エンハンサー、応答要素、シグナル配列、ポリアデニル化配列、およびそれらに匹敵するものを含む、異種性配列と結合させてもよい。本明細書において、「単離」という句は、天然に発生しない形であるポリヌクレオチドを意味する。ポリヌクレオチドを単離する１つの手段は、当業者に周知の方法を用い、天然または人工的に設計されたＤＮＡプローブで、ヒト組織特異的ライブラリーを探査する（ｐｒｏｂｅ）ことである。ヒトＨＩＦ−１α遺伝子、ＥＰＡＳ１、またはＨＬＦ遺伝子由来のＤＮＡプローブは、本目的に特に有用である。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡおよびｃＤＮＡ分子を用い、以下により詳細に記載される方法により、ヒト、哺乳動物、または他の動物供給源から、相補的ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを得ても、またはｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、関連するｃＤＮＡまたはゲノムクローンを単離してもよい。
【００４９】
さらに、該核酸を修飾し、安定性、可溶性、結合親和性、および特異性を改変してもよい。例えば、本発明由来の配列はさらに、ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、およびメチルホスホネート誘導体や、さらには、Ｎｉｅｌｓｅｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５４：１４９７（１９９１）に記載されるような、塩基をアミノ酸骨格に結合することにより形成される「タンパク質核酸（ＰＮＡ）」を含んでもよい。該核酸は、α−アノマー・ヌクレオチドの連結により、またはメチルもしくはエチルホスホトリエステルまたはアルキルホスホロアミデート連結の形成により、誘導体化してもよい。さらに、本発明の核酸配列はまた、直接または間接的に、検出可能なシグナルを提供することが可能な標識で修飾してもよい。典型的な標識には、放射性同位体、蛍光分子、ビオチン、およびそれらに匹敵するものが含まれる。
【００５０】
一般的に、本発明にしたがった核酸操作は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第二版（ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９）、またはＡｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ニューヨーク州ニューヨーク，１９９２）に開示されるような、当業者に周知の方法を用いる。
【００５１】
本発明はまた、ヒトＨＩＦ−１α、ＥＰＡＳ１、またはＨＬＦをコードする核酸とは異なるが、同一の表現型、すなわちそれぞれ、実質的に同一のアミノ酸配列を有する核酸も含む。表現型が類似である核酸はまた、「機能的に同等である核酸」とも称される。本明細書において、「機能的に同等である核酸」という句は、本明細書に開示される核酸と、同一のまたは実質的に同一のタンパク質産物を、実質的に同一の方式で産生するよう機能するであろう、わずかでそして重大でない配列変動により特徴付けられる核酸を含む。特に、機能的に同等である核酸は、本明細書に開示されるものと同一である、または保存的アミノ酸変動を有するタンパク質をコードする。例えば、保存的変動には、非極性残基の別の非極性残基での置換、または荷電残基の同様に荷電されている残基での置換が含まれる。これらの変動には、当業者により、タンパク質の三次構造を実質的に改変しないものと認識されるものが含まれる。
【００５２】
構造遺伝子は、タンパク質、ポリペプチドまたはその断片をコードするＤＮＡ部分を含み、そして転写開始を指示する５’配列を除く、遺伝子部分である。構造遺伝子は、通常細胞に見られるものであってもよく、または異種性遺伝子と呼ばれるものである場合、導入される細胞部位に通常見られないものであってもよい。異種性遺伝子は、全体的にまたは部分的に、細菌ゲノムまたはエピソーム、真核、核またはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡまたは化学的に合成されたＤＮＡを含む、当業者に知られるいかなる供給源由来であってもよい。構造遺伝子は、コードまたは非翻訳領域のどちらにおいても、発現産物の生物学的活性もしくは化学構造、発現速度または発現調節方式に影響を与える可能性がある、１つまたはそれ以上の修飾を含んでもよい。こうした修飾には、限定されるわけではないが、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失および置換が含まれる。構造遺伝子は、中断されないコード配列を構成してもよいし、または適切なスプライス連結部(splice junction)が結合している１つまたはそれ以上のイントロンを含んでもよい。構造遺伝子は、天然に存在するかまたは合成の、複数の供給源由来の部分の複合物であってもよい。構造遺伝子はまた、融合タンパク質をコードしてもよい。構造遺伝子／トランス活性化因子複合体を含む組換えＤＮＡ分子の導入は、構造遺伝子およびトランス活性化因子が各々、異なる供給源または種由来である構築物を含むことが意図される。
【００５３】
真核転写因子は、しばしば、別個のそして独立したＤＮＡ結合および転写活性化ドメインからなる（ＭｉｔｃｈｅｌｌおよびＴｊｉａｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：３７１−３７８（１９８９））。ドメインが独立していることにより、異種性タンパク質のＤＮＡ結合および活性化ドメインからなる機能的な融合タンパク質の生成が可能になってきている。ｌｅｘＡ ＤＮＡ結合タンパク質および酵母転写因子ＧＡＬ４の活性化ドメインからなるキメラ真核制御タンパク質が、ＢｒｅｎｔおよびＰｔａｓｈｎｅにより構築された（Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６１２−６１５（１９８５））。融合タンパク質の使用は、転写活性化因子として作用するいくつかの種類のタンパク質ドメインを同定してきている。これらのドメインはアミノ酸類似性をほとんど持たないが、しばしば非常に酸性（ＧＡＬ４およびＧＮＣ４の場合のように）、グルタミン・リッチ（Ｓｐ１の場合のように）、またはプロリン・リッチ（ＮＦ１の場合のように、ＭａおよびＰｔａｓｈｎｅ， Ｃｅｌｌ ５１：１１３−１１９（１９８７）；ＣｏｕｒｅｙおよびＴｊｉａｎ（１９８８）；Ｍｅｒｍｏｎｄら， Ｃｅｌｌ ５８：７４１−７５３（１９８９））のいずれかであるとして特徴付けられる。
【００５４】
最も効果的な、既知の活性化ドメインの１つは、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）ビリオンタンパク質１６（ＶＰ１６；Ｓａｄｏｗｓｋｉら， Ｎａｔｕｒｅ ３３５：５６３−５６４（１９８８）；Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇら， Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ． ２：７１８−７２９（１９８８））のカルボキシル末端１００アミノ酸に含まれる。ＶＰ１６は、Ｖｍｗ６５またはアルファ−遺伝子トランス誘導因子としても知られるＨＳＶの構造タンパク質で、ＩＣＰＯおよびＩＣＰ４に対するものを含む、該ウイルスの極初期プロモーターの転写を活性化する（Ｃａｍｐｂｅｌｌら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８０：１−１９（１９８４）；ＫｒｉｓｔｉｅおよびＲｏｉｚｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ８１：４０６５−４０６９（１９８４）；Ｐｅｌｌｅｔら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ８２：５８７０−５８７４（１９８５））。ＶＰ１６は、いわゆるＴＡＡＴＧＡＲＡＴ要素を含むプロモーターを特異的に活性化するが、該特異性は、ＶＰ１６のアミノ末端ドメインと複合体を形成する細胞性ＤＮＡ結合タンパク質により与えられる（ＭｃＫｎｉｇｈｔら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ８４：７０６１−７０６５（１９８７）；Ｐｒｅｓｔｏｎら， Ｃｅｌｌ ５２：４２５−４３４（１９８８））。
【００５５】
本発明は、ＤＮＡ結合タンパク質の機能的な部分および転写活性化タンパク質の機能的な部分を含む、新規ハイブリッド／キメラトランス活性化タンパク質を提供する。本発明のハイブリッド／キメラトランス活性化タンパク質は、低酸素症応答要素（ＨＲＥ）を含む低酸素症誘導性遺伝子発現の特異的な活性化、それによる非常に高いレベルの遺伝子発現の達成を含む、多様な利点を提供する。本発明のハイブリッド／キメラトランス活性化タンパク質は、脊椎動物細胞を含む真核細胞由来の天然発生転写トランス活性化タンパク質またはタンパク質のドメイン、ウイルストランス活性化タンパク質、あるいは脊椎動物細胞で機能することが可能であり、そして脊椎動物プロモーターからの転写を刺激することが可能な、いかなる合成アミノ酸配列も含んでもよい。こうしたトランス活性化タンパク質の例には、限定されるわけではないが、Ｍｕｌｌｅｒらに同定されたリンパ系特異的転写因子（Ｎａｔｕｒｅ ３３６：５４４−５５１（１９８８））、ｆｏｓタンパク質（Ｌｕｃｉｂｅｌｌｏら， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３：４３−５２（１９８８））；ｖ−ｊｕｎタンパク質（Ｂｏｓら， Ｃｅｌｌ ５２：７０５−７１２（１９８８））；因子ＥＦ−Ｃ（Ｏｓｔａｐｃｈｕｋら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ９：２７８７−２７９７（１９８９））；ＨＩＶ−１ ｔａｔタンパク質（Ａｒｙａら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：６９−７３（１９８５））、パピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）Ｅ２タンパク質（Ｌａｍｂｅｒｔら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：３１５１−３１５４（１９８９））、アデノウイルスＥ１Ａタンパク質（ＦｌｉｎｔおよびＳｈｅｎｋ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．（１９８９）に概説される）、熱ショック因子（ＨＳＦ１およびＨＳＦ２）（Ｒａｂｉｎｄｒａｎら， ＰＮＡＳ ８８：６９０６−６９１０（１９９１））；ｐ５３タンパク質（Ｌｅｖｉｎｅ， Ｃｅｌｌ ８８：３２３−３３１（１９９７）、ＫｏおよびＰｒｉｖｅｓ， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １０：１０５４−１０７２（１９９６））；Ｓｐ１（Ｋａｄｏｎａｇａら， Ｃｅｌｌ ５１：１０７９−１０９０（１９８７））；ＡＰ１（Ｌｅｅら， Ｎａｔｕｒｅ ３２５：３６８−３７２（１９８７））；ＣＴＦ／ＮＦ１（Ｍｅｒｍｏｄら， Ｃｅｌｌ ５８：７４１−７５３（１９８９））、Ｅ２Ｆ１（Ｎｅｕｍａｎら， Ｇｅｎｅ １７３：１６３−１６９（１９９６））；ＨＡＰ１（Ｐｆｅｉｆｅｒら， Ｃｅｌｌ ５６：２９１−３０１（１９８９））；ＨＡＰ２（Ｐｉｎｋｈａｍら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７：５７８−５８５（１９８７））；ＭＣＭ１（Ｐａｓｓｍｏｒｅら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０４：５９３−６０６（１９８８））；ＰＨＯ２（ＳｅｎｇｓｔａｇおよびＨｉｎｎｅｎ， ＮＡＲ １５：２３３−２４６（１９８７））；およびＧＡＬ１１（Ｓｕｚｕｋｉら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：４９０１−４９９９（１９８８））が含まれる。本発明の好ましい態様において、トランス活性化タンパク質は単純疱疹ウイルスＶＰ１６（Ｓａｄｏｗｓｋｉら， Ｎａｔｕｒｅ ３３５：５６３−５６４（１９８８）；Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇら， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ． ２：７１８−７２９（１９８８））、ＮＦκＢ（ＳｃｈｍｉｔｚおよびＢａｅｕｅｒｌｅ，ＥＭＢＯ Ｊ． １０：３８０５−３８１７（１９９１）；Ｓｃｈｍｉｔｚら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：２５６１３−２５６２０（１９９４）；およびＳｃｈｍｉｔｚら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１５５７６−１５５８４（１９９５））、および酵母活性化因子ＧＡＬ４およびＧＣＮ４である。
【００５６】
もちろん、当業者は、本発明の組成物および方法に有用な転写活性化ドメインもまた、合成でも、すなわち既知の天然発生タンパク質内に含まれない配列に基づいてもよいことを理解するであろう。例えば、転写活性化は、本質的に柔軟な過程であり、特定の構造または立体特異的タンパク質接触に対する必要性はあるとしてもわずかであることを解説する、ＰｏｌｌｏｃｋおよびＧｉｌｍａｎ， ＰＮＡＳ ９４：１３３８８−１３３８９（１９９７）を参照されたい。該文献はまた、転写活性化因子として機能することが可能な多様な異なる分子を概説し、該分子には短ペプチドモチーフ（８アミノ酸であるほど小さい）、単純な両親媒性らせんおよび転写活性化に関係がないタンパク質の突然変異ドメインでさえ含まれる。
【００５７】
本発明にしたがい、ＤＮＡ結合タンパク質およびトランス活性化タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、各々の、それぞれ結合およびトランス活性化特性を保持するよう、結合させる。本発明の多様な態様において、トランス活性化タンパク質、または転写活性化が可能なその部分をコードするＤＮＡを、前記ＤＮＡ結合タンパク質の機能を完全には混乱させない遺伝子座でＤＮＡに挿入してもよい。ＤＮＡ結合タンパク質または転写トランス活性化タンパク質の機能に必要でない領域は、他のより機能的に適切な分子の部分より突然変異に対する感受性が低いと推定され、マップされる突然変異解析と共にマップされる突然変異を欠く領域の同定を含む、当業者に知られるいかなる方法により、同定してもよい。Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）））に示されるものを含む、分子生物学の標準的な技術を用い、適切な組換え構築物を産生してもよい。
【００５８】
キメラトランス活性化タンパク質をコードする組換えＤＮＡ構築物は、適切なプロモーターおよび／または他の発現調節配列の調節下に置いても（すなわち該配列に機能可能であるように連結しても）よい。トランス活性化タンパク質が構成的に活性があるプロモーター配列の調節下に置かれることが望ましい可能性があるが、前記トランス活性化タンパク質はまた、メタロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２（１９８２））または組織特異的プロモーターなどの誘導性プロモーターの調節下に置いてもよい。本発明にしたがい用いてもよいプロモーター配列には、限定されるわけではないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０（１９８１））、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）の末端反復配列（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら， Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７（１９８０））、ヘルペス・チミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｕ．Ｓ．Ａ． ７８：１４４−１４４５（１９８１））、ヒトサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）極初期プロモーター／エンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔら， Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））、および組織特異性を示し、そしてトランスジェニック動物で利用されてきている以下の動物転写調節領域：膵臓腺房（ａｃｉｎａｒ）細胞で活性があるエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Ｓｗｉｆｔら， Ｃｅｌｌ ３８：６３９−６４６（１９８４）；Ｏｒｎｉｔｚら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５（１９８７））；膵臓ベータ細胞で活性があるインスリン遺伝子調節領域（Ｈａｎａｈａｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−１２２（１９８５））、リンパ系細胞で活性がある免疫グロブリン遺伝子調節領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら， Ｃｅｌｌ ３８：６４７−６５８（１９８４）；Ａｄａｍｅｓら， Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−５３８（１９８５）；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７：１４３６−１４４４（１９８７））、精巣、乳房、リンパ系およびマスト細胞で活性があるマウス乳癌ウイルス調節領域（Ｌｅｄｅｒら， Ｃｅｌｌ ４５：４８５−４９５（１９８６））、肝臓で活性があるアルブミン遺伝子調節領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １：２６８−２７６（１９８７））、肝臓で活性があるアルファ−フェトプロテイン遺伝子調節領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：１６３９−１６４８（１９８５）；Ｈａｍｍｅｒら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８（１９８７））；肝臓で活性があるアルファ１−アンチトリプシン遺伝子調節領域（Ｋｅｌｓｅｙら， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １：１６１−１７１（１９８７））、赤血球系細胞で活性があるベータ−グロビン遺伝子調節領域（Ｍｏｇｒａｍら， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０（１９８５）；Ｋｏｌｌｉａｓら， Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４（１９８６））；脳の乏突起神経膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ）で活性があるミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら， Ｃｅｌｌ ４８：７０３−７１２（１９８７））；骨格筋で活性があるミオシン軽鎖−２遺伝子調節領域（Ｓａｎｉ， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−２８６（１９８５））、および視床下部で活性がある性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子調節領域（Ｍａｓｏｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−１３７８（１９８６））が含まれる。特に関心となるのは、どちらも心筋で活性がある、α−ミオシン重鎖遺伝子（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２４６１３−２４６２０（１９９１））およびミオシン軽鎖−２プロモーター（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：１８１４２−１８１４８（１９８９）およびＲｕｏｑｉａｎ−Ｓｈｅｎら，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１：１６７６−１６８５（１９９１））である。
【００５９】
本発明の１つの好ましい特定の態様において、キメラトランス活性化タンパク質は、実施例１および図１に示される方法にしたがい構築される、ｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６／Ａｆｌ２にコードされる。本発明の別の好ましい特定の態様において、キメラトランス活性化タンパク質は、ＶＰ１６部分がＨＩＦ−１αコード領域のコドン５３０の後に挿入されている以外はｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６／Ａｆｌ２と同一である、ｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６／ＲＩにコードされる。
【００６０】
本発明にしたがい、本発明のハイブリッド／キメラトランス活性化タンパク質を利用し、低酸素症応答要素（ＨＲＥ）を含む遺伝子の発現を特異的に制御してもよい。これらのＨＲＥはキメラトランス活性化タンパク質の骨格として使用されるＤＮＡ結合タンパク質により認識されそして結合される核酸配列に一致する。
【００６１】
一般的に、本発明のキメラトランス活性化タンパク質を用い、目的の遺伝子の発現を選択的に調節してもよい。例えば、そして限定ではなく、本発明のキメラトランス活性化タンパク質を構成的なプロモーターの調節下においてもよく、そして、例えば細胞培養またはトランスジェニック動物において、特定の遺伝子産物を大量に産生するのが望ましい場合、低酸素症応答要素（ＨＲＥ）と結合させた目的の遺伝子の発現を構成的に増加させるのに用いてもよい。あるいは、トランス活性化タンパク質を組織特異的プロモータの調節下に置き、目的の遺伝子が特定の組織で発現するようにしてもよい。本発明の別の態様において、キメラトランス活性化機能は誘導性であり、それゆえ、低酸素症応答要素（ＨＲＥ）を介した、目的の遺伝子の発現を、選択的に増加しまたは減少することが可能である。条件付きのそして誘導性導入遺伝子の概説には、Ｆｉｓｈｍａｎ， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ．， ８２：８３７−８４４（１９８８）およびＦｉｓｈｍａｎ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｍｅｄ．， ５：２１１−２１７（１９９５）を参照されたい。
【００６２】
キメラトランス活性化タンパク質は、該キメラタンパク質のＤＮＡ結合タンパク質骨格により認識されるＤＮＡ配列に相同な応答要素に特異的に結合する、有益な特性を有する。
【００６３】
ベクター：ベクターの例は、ウイルス、例えばアデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｅｓ）、ヘルペスウイルス、陽性鎖ＲＮＡウイルス、ワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓｅｓ）、バキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ）およびレトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター、および多様な真核および原核宿主での発現に関し記載されてきている、当技術分野で典型的に用いられる他の組換え媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）であり、そして遺伝子治療と共に単純なタンパク質発現に用いてもよい。
【００６４】
ポリヌクレオチド／導入遺伝子は、当業者に周知の方法を用い、ベクターゲノムに挿入する。例えば、挿入物およびベクターＤＮＡを、適切な条件下で、制限酵素と接触させ、各分子上に、互いに対を作り、そしてリガーゼで共につなぐことが可能な相補的末端を生成してもよい。あるいは、合成核酸リンカーを、制限処理されたポリヌクレオチドの末端に連結してもよい。これらの合成リンカーは、ベクターＤＮＡの特定の制限部位に対応する核酸配列を含む。さらに、終止コドンおよび適切な制限部位を含むオリゴヌクレオチドを、例えば、以下のいくつかまたはすべてを含むベクターに挿入するため連結してもよい：選択可能マーカー遺伝子、例えば哺乳動物細胞での安定または一過性トランスフェクタントの選択のためのネオマイシン遺伝子；高レベル転写のためのヒトＣＭＶ極初期遺伝子由来のエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡ安定性のためのＳＶ４０由来の転写終結およびＲＮＡプロセシングシグナル；適切なエピソーム複製のためのＳＶ４０ポリオーマ複製起点およびＣｏｌＥ１；多用途マルチクローニング部位；並びにセンスおよびアンチセンスＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのＴ７およびＳＰ６ ＲＮＡプロモーター。他の手段が当業者に周知であり、そして利用可能である。
【００６５】
当業者は、ベクターからの発現が望ましい場合、ポリヌクレオチド／導入遺伝子が、発現調節配列に、機能可能であるよう連結されることを認識するであろう。ポリヌクレオチドを機能可能であるように連結してもよい、プロモーターおよびクローニング部位を両方含むベクターは、当業者に周知である。こうしたベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡを転写することが可能であり、そしてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州ラホヤ）およびＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（ウィスコンシン州マディソン）などの供給源から商業的に入手可能である。発現および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を最適化するため、クローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去し、該部分に付加し、または該部分を改変し、転写または翻訳レベルどちらかで、発現に干渉しまたは発現を減少させる可能性がある、余分で、潜在的に不適切な代替翻訳開始コドンまたは他の配列を除去することが必要である可能性がある。あるいは、コンセンサスリボソーム結合部位を開始コドンのすぐ５’に挿入し、発現を亢進してもよい。同様に、転写を亢進するため、同一のアミノ酸をコードする代替コドンで、ヒトＨＩＦ−１α、ＥＰＡＳ１またはＨＬＦポリペプチドのコード配列を置換してもよい（例えば、宿主細胞のコドン優先性（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を採用してもよい、Ｇ−Ｃリッチドメインの存在を減少させてもよい、およびそれらに匹敵するもの）。
【００６６】
ヒトＨＩＦ−１α、ＥＰＡＳ１およびＨＬＦまたは別の低酸素症誘導性因子タンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチドの調製を、当業者に知られる方法を用い、個々の細胞内に搬送するため、適切なベクターに取り込んでもよい。例えば、ＦｉｎｋｅｌおよびＥｐｓｔｅｉｎ， ＦＡＳＥＢ Ｊ． ９：８４３−８５１（１９９５）；Ｆｅｌｄｍａｎら， Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓ． ３２：１９４−２０７（１９９６）を参照されたい。
【００６７】
１つの態様において、本発明は、薬学的に許容しうるキャリアーおよび生物学的に活性があるキメラトランス活性化タンパク質を発現することが可能な核酸分子を含む組成物を提供する。該核酸分子にコードされるキメラトランス活性化タンパク質には、低酸素症誘導性因子タンパク質由来のＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化が可能なタンパク質ドメインが含まれる。こうしたドメインは、天然発生または合成いずれかの転写活性化分子由来であってもよい。該組成物内の核酸分子は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞内への搬送に適切な型である。多様なこうした型が、当業者に周知である。本明細書に示される解説を与えられたなら、当業者は、投与部位および経路並びに発現の望ましいレベルおよび期間などの要因に応じ、多様なベクターおよび他の発現／搬送要素から選択することが可能である。
【００６８】
裸のＤＮＡ−裸のプラスミドＤＮＡを、例えば、組織への直接注入により、筋肉細胞内に導入してもよい（Ｗｏｌｆｆら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５（１９８９））。
【００６９】
ＤＮＡ・脂質複合体−脂質キャリアーを裸のＤＮＡ（例えばプラスミドＤＮＡ）と結合させ、細胞膜を通じた輸送を容易にしてもよい。陽イオン性、陰イオン性、または中性脂質をこの目的に用いてもよい。しかし、陽イオン性脂質は、一般的に負荷電を有するＤＮＡとよりよく結合することが示されてきているため、陽イオン性脂質が好ましい。陽イオン性脂質はまた、プラスミドＤＮＡの細胞内搬送を媒介することも示されてきている（ＦｅｌｇｎｅｒおよびＲｉｎｇｏｌｄ， Ｎａｔｕｒｅ ３３７：３８７（１９８９））。陽イオン性脂質・プラスミド複合体のマウスへの静脈内注射は、肺での発現を生じることが示されてきている（Ｂｒｉｇｈａｍら， Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ． ２９８：２７８（１９８９））。Ｏｓａｋａら， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８５（６）：６１２−６１８（１９９６）；Ｓａｎら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：７８１−７８８（１９９３）；Ｓｅｎｉｏｒら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １０７０：１７３−１７９（１９９１）；ＫａｂａｎｏｖおよびＫａｂａｎｏｖ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ６：７−２０（１９９５）；Ｒｅｍｙら， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５：６４７−６５４（１９９４）；Ｂｅｈｒ， Ｊ−Ｐ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５：３８２−３８９（１９９４）；Ｂｅｈｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ８６：６９８２−６９８６（１９８９）；およびＷｙｍａｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３６：３００８−３０１７（１９９７）も参照されたい。
【００７０】
陽イオン性脂質は、一般の当業者に知られる。代表的な陽イオン性脂質には、例えば、その開示が本明細書に援用される、米国特許第５，２８３，１８５号；およびＰＣＴ／ＵＳ９５／１６１７４（ＷＯ ９６／１８３７２）に開示されるものが含まれる。好ましい態様において、陽イオン性脂質はＷＯ ９６／１８３７２に開示されるＮ4−スペルミン・コレステロール・カルバメート（ＧＬ−６７）である。
【００７１】
アデノウイルス−導入遺伝子搬送のためのアデノウイルスに基づくベクターは当業者に周知であり、そして商業的に入手してもまたは標準的な分子生物学的方法により構築してもよい。運搬する外因性遺伝子を含む組換えアデノウイルスベクターは、一般的に、アデノウイルス２型（Ａｄ２）およびアデノウイルス５型（Ａｄ５）由来である。これらはまた、他の非オンコジーン性血清型由来であってもよい。例えば、本明細書に援用される、Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”ＶＩＲＯＲＯＧＹ，第二版中，Ｆｉｅｌｄｓら監修，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．，ニューヨーク，１９９０を参照されたい。
【００７２】
本発明のアデノウイルスベクターは、複製が不可能であり、最低限のウイルス遺伝子しか発現せず、そして標的細胞において導入遺伝子を発現することが可能である。アデノウイルスベクターは、一般的に、Ｅ１領域遺伝子の欠失により、複製不全にされている。複製不全ベクターは、Ｅ１機能を発現するヒト胚腎臓細胞株である２９３細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）で産生することが可能である。欠失Ｅ１領域を、アデノウイルスまたは非アデノウイルスプロモーターの調節下にある目的の導入遺伝子で置き換えてもよい。導入遺伝子はまた、アデノウイルスゲノムの他の領域に置いてもよい。複製不全アデノウイルスベクター産生の概説には、やはり本明細書に援用される、Ｇｒａｈａｍら，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｖａｃｃｉｎｅｓ”ＶＡＣＣＩＮＥＳ： ＮＥＷ ＡＰＰＲＯＡＣＨＥＳ ｔｏ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＰＲＯＢＬＥＭＳ中 ｐｐ３６３−３９０，Ｅｌｌｉｓ監修，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，ボストン，（１９９２）を参照されたい。
【００７３】
当業者はまた、アデノウイルスの他の非必須領域を欠失させ、またはウイルスゲノム内で再配置し、本発明にしたがった導入遺伝子の搬送に適したアデノウイルスベクターを提供してもよいことにも気づく。例えば、本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ９３／１１６６７（ＷＯ ９４／１２６４９）および米国特許第５，６７０，４８８号は、Ｅ１およびＥ３領域のある程度またはすべてを欠失させてもよく、そしてＥ４の非必須読み枠（ＯＲＦ）もまた欠失させてもよいことを開示する。他の代表的なアデノウイルスベクターは、例えば、本明細書に援用される、Ｒｉｃｈら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４６１（１９９３）；Ｂｒｏｄｙら， Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７１６：９０（１９９４）；Ｗｉｌｓｏｎ， Ｎ． Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３４：１１８５（１９９６）；Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４（１９９５）；Ｏ’Ｎｅａｌら， Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ３：１４９７（１９９４）；およびＧｒａｈａｍら、上記に開示される。本発明の好ましい態様において、アデノウイルスベクターは、Ｅ１欠失Ａｄ２に基づくベクターである。
【００７４】
本発明のアデノウイルスベクターにおいて、ポリヌクレオチド／導入遺伝子は、発現調節配列、例えば導入遺伝子の発現を指示するプロモーターに、機能可能であるように連結されている。本明細書において、「機能可能であるように連結されている」という句は、ポリヌクレオチド／導入遺伝子とヌクレオチドの制御およびエフェクター配列、例えばプロモーター、エンハンサー、転写および翻訳終止部位、および他のシグナル配列との、機能的な関係を指す。例えば、ポリヌクレオチドのプロモーターへの機能可能である連結は、ＤＮＡの転写が、プロモーターを特異的に認識しそして該プロモーターに結合するＲＮＡポリメラーゼにより、該プロモーターから開始され、そしてここで該プロモーターがポリヌクレオチドからのＲＮＡの転写を指示するような、ポリヌクレオチドおよびプロモーターとの間の物理的および機能的関係を指す。
【００７５】
プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼ認識、結合および転写開始に十分な特定の配列を含む。さらに、プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合および転写開始活性を調節する配列を含む。こうした配列は、シス作用であってもよく、またはトランス作用因子に反応してもよい。制御の性質に応じ、プロモーターは構成的であっても、または制御されていてもよい。プロモーターの例は、ＳＰ６、Ｔ４、Ｔ７、ＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ステロイド誘導性プロモーター、モロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）（ＭＭＬＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびそれらに匹敵するものである。あるいは、プロモーターは内因性アデノウイルスプロモーター、例えばＥ１ａプロモーターまたはＡｄ２主要後期プロモーター（ＭＬＰ）であってもよい。同様に、一般の当業者は、内因性または異種性ポリＡ付加シグナルを利用し、アデノウイルスベクターを構築してもよい。
【００７６】
本明細書において、「プロモーター」は、転写開始を指示する、構造遺伝子の５’端のヌクレオチド配列を指す。プロモーター配列は、下流遺伝子の発現を操縦するのに必要であるが、常に十分であるわけではない。一般的に、真核プロモーターには、転写開始部位（ＣＡＰ部位）の約１０−３０ｂｐ ５’のコンセンサス５’ＴＡＴＡボックスに相同な、特徴的なＤＮＡ配列が含まれる。別のプロモーター構成要素、ＣＡＡＴボックスは、しばしばＴＡＴＡボックスの約３０−７０ｂｐ ５’に見られる。
【００７７】
本明細書において、「エンハンサー」は、近傍の遺伝子に関する位置および方向に比較的独立した方式で、転写効率を増加させるようである、真核プロモーター配列要素を指す（ＫｈｏｕｒｙおよびＧｒｕｓｓ（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：３１３−３１４）。エンハンサー配列が、真核遺伝子の上流、内部または下流で機能する能力は、これらを古典的なプロモーター要素とは区別する。
【００７８】
本発明のウイルスおよび非ウイルスベクターは、ポリヌクレオチド／導入遺伝子の標的細胞への運搬に有用である。標的細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏであってもｉｎ ｖｉｖｏであってもよい。本発明のベクターのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用により、ポリヌクレオチド／導入遺伝子の培養細胞への運搬が可能になり、そして該使用は、ポリヌクレオチド／導入遺伝子産物の組換え産生に有用である。ｉｎ ｖｉｔｒｏ法はまた、ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療法にも有用であり、この中で、導入遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に導入し、そして該細胞をその後、個体に移植する。当業者は、こうした技術を使用する際、導入遺伝子を新たに単離された細胞または培養細胞に導入してもよいことを認識するであろう。さらに、導入遺伝子含有細胞は、導入遺伝子の導入直後に移植しても、または移植前に培養してもよい。
【００７９】
本発明のベクターは、虚血および他の低酸素症関連障害の予防または治療に有用な、多様なｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療法に使用を見出す。例えば、培養心筋細胞の心筋傷組織への移植は心不全を予防することが可能であると報告されてきている（Ｒｅｎ−Ｋｅ Ｌｉら， Ａｎｎ． Ｔｈｏｒａｃ． Ｓｕｒｇ． ６２：６５４−６６１（１９９６））。また、多様な組み合わせの増殖因子が非心臓系列細胞の心臓発生を誘導することが可能であることも報告されてきている（ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４２２９を参照されたい）。本明細書に含まれる解説を与えられれば、当業者は、本発明にしたがったキメラトランス活性化タンパク質を発現することが可能な核酸分子を、ｉｎ ｖｉｖｏ移植前に標的細胞に導入すると、少なくとも２つの点で細胞治療法に対しさらなる利点を提供する可能性があることを理解するであろう。第一に、細胞は発現構築物の運搬媒体として作用することが可能であり、その結果、細胞が移植される、体のいかなる領域においても、キメラトランス活性化タンパク質の部位特異的搬送が行われる。第二に、移植細胞におけるキメラトランス活性化タンパク質の発現は、移植後に存在する可能性があるいかなる低酸素状態にも該細胞がより容易に適応することを可能にすることにより、および／または移植領域で血管発達を刺激することにより、移植後の該細胞の生存を促進することが可能である。
【００８０】
本発明のベクターを、ポリヌクレオチド／導入遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで細胞に搬送するのに使用すること、例えば、低酸素症関連障害、例えば虚血性心臓疾患の場合、ＨＩＦ−１αがない、不充分なまたは機能していない細胞に搬送するのに使用することは、多様な障害の治療に有用である。したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明にしたがった生物学的に活性があるキメラトランス活性化タンパク質を、発現に適した型（例えば発現調節配列に機能可能であるように連結されている）で含む組成物の有効量を、投与することにより、こうした発現増加が望ましい患者の標的細胞における低酸素症誘導性遺伝子の発現を増加させるための方法を提供する。「有効量」は、生物学的に活性があるキメラトランス活性化タンパク質の、低酸素症関連障害に関連する症状の１つまたはそれ以上を軽減するのに十分なレベルおよび期間での発現を生じる量を指す。こうした方法は、ＨＩＦ−１αおよび低酸素症誘導性遺伝子の、低酸素および酸素正常条件下の組織での発現を増加させまたは持続するのに有用である。
【００８１】
関連する態様において、本発明は、生物学的に活性があるキメラトランス活性化タンパク質の発現が望ましい細胞に、本発明の核酸分子の有効量をｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ投与することにより、患者における低酸素症関連組織損傷を治療し、減少させおよび／または予防するための方法を提供する。低酸素症関連組織損傷の治療および／または予防は、組織の以前の虚血領域への灌流の増加を含む、多様な生理学的効果により明らかになる可能性がある。本発明の方法は、冠状動脈疾患および重大な四肢虚血を含む末梢血管疾患などの疾患の治療に使用を見出す。
【００８２】
本発明の組成物のｉｎ ｖｉｖｏ投与は、筋内、静脈内、鼻腔内、皮下、挿管、洗浄（ｌａｖａｇｅ）および動脈内搬送を含む、多様な経路により達成してもよい。こうした方法は当業者に周知である。同様に、投与すべき組成物の正確な有効量は、当業者により、投与すべき組成物の特定の構成要素、投与経路、および治療される患者の年齢、体重、疾患の度合いおよび肉体的状態などの要因を考慮し、決定することが可能である。
【００８３】
本発明により、やはり提供されるのは、ＨＩＦ−１α、ＥＰＡＳ１、ＨＬＦポリペプチドおよび他の低酸素症誘導性因子タンパク質のドメインをコードするポリヌクレオチドを含む、細菌細胞、酵母細胞、両生類細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、および他の動物細胞での発現に適応したベクターである。さらに、該ベクターは、その発現を可能にするように、ポリヌクレオチドに対し位置する、細菌、酵母、両生類、哺乳動物または動物細胞におけるポリヌクレオチド発現に必要な制御要素を含む。
ここに用いられている、「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるプロセスをさす。ポリペプチドがゲノムＤＮＡから誘導される場合、適当な真核生物宿主を選択すると、発現には、ｍＲＮＡのスプライシングも含まれるであろう。発現に必要な調節エレメントには、ＲＮＡポリメラーゼと結合するためのプロモーター配列、およびリボソーム結合用転写開始配列が含まれる。例えば、細菌発現ベクターには、ｌａｃプロモーターのようなプロモーターならびに転写開始用シャイン−ダルカルノ配列および開始コドンＡＵＧが含まれる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９；またはＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，ＮＹ、１９９２）。同様に、真核生物発現ベクターには、異種または同種のＲＮＡポリメラーゼII用プロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボソーム分離用終止コドンが含まれる。そのようなベクターは、市販されているか、またはこの技術分野で周知の方法、例えば一般にベクターを構築するための上記の方法、に記載された配列で組み立てることができる。発現ベクターは、本発明のハイブリッド／キメラトランスアクティベーター（融合）ポリペプチドを発現する細胞を作成するために有用である。
【００８４】
本発明は、本発明のハイブリッド／キメラトランスアクティベーター（融合）ポリペプチドを組換え発現する形質転換された宿主細胞を提供する。本発明の宿主細胞を、哺乳動物または非哺乳動物の低酸素−誘導因子タンパク質のＤＮＡ結合ドメインおよび転写アクティベータータンパク質の機能的転写アクティベータードメインを含む、キメラトランスアクティベーターをコードする組換え核酸分子で形質転換した。例として、哺乳動物細胞内での発現に適合したプラスミドを含む哺乳動物細胞があげられる。プラスミドは、哺乳動物または非哺乳動物の低酸素−誘導因子タンパク質のＤＮＡ結合ドメインおよび転写アクティベータータンパク質の機能的転写アクティベータードメインをコードするポリヌクレオチド、ならびに本発明のハイブリッド／キメラトランスアクティベーター（融合）ポリペプチドの発現に必要な調節エレメントを含む。
【００８５】
適当な宿主細胞には、細菌、古細菌、真菌、特に酵母、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞、特に哺乳動物細胞が含まれる。特に興味あるのは、大腸菌、枯草菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、ニューロスポラ、およびＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、および不朽化した哺乳動物骨髄細胞系およびリンパ細胞系が含まれる。好ましい複製システムには、Ｍ１３、ＣｏｌＥ１、ＳＶ４０、バキュロウイルス、ラムダ、アデノウイルス、人工染色体等が含まれる。多数の転写開始領域および終止調節領域が単離され、様々な宿主内での異種タンパク質の転写および翻訳に有用であることが示された。これらの領域の例、単離方法、マニピュレーション法等は、この技術分野で既知である。適当な発現条件下では、宿主細胞を、本発明のハイブリッド／キメラトランスアクティベーター（融合）タンパク質を組み換え生産する源として用いることができる。
【００８６】
また、本発明のハイブリッド／キメラトランスアクティベーター（融合）ポリペプチドをコードする核酸（ポリヌクレオチド）を、組換えによってレシピエント細胞のゲノム内に組込ませることもできる。また、特に多能性細胞内では、非相同組換えまたは相同組換えによる内因性遺伝子の欠損の様な別の組換えに基づく方法を、用いることもできる。
【００８７】
標的細胞または宿主細胞への本発明のベクターの標的化は、ベクターに標的化分子を連結させることによって、成し遂げることができる。標的化分子は、興味ある細胞または組織型に特異的であり、例えば、リガンド、抗体、糖、レセプター、またはその他の結合分子を含む、任意の薬剤である。標的化ベクターは、本発明のベクターを、低酸素関連疾病の治療に特に有用にする能力を持つ。
【００８８】
本発明のベクターによる標的細胞または宿主細胞へのポリヌクレオチド／トランスジーンのトランスファーを、標的細胞または宿主細胞でのポリヌクレオチド／トランスジーンの生成レベルを測定することによって、評価することができる。標的細胞または宿主細胞内でのポリヌクレオチド／トランスジーンの生成レベルは、本発明のベクターによるポリヌクレオチド／トランスジーンのトランスファー効率と直接的に関係する。
【００８９】
ポリヌクレオチド／トランスジーンの発現は、とりわけ、免疫学的アッセイ、組織化学的アッセイおよび活性アッセイを含むこの技術分野で既知の様々な方法によって、モニターすることができる。サンプル内のハイブリッド／キメラトランスアクティベーター（融合）ポリペプチドのインビトロでの検出に有用な免疫学的方法には、検出可能抗体を用いるイムノアッセイが含まれる。そのようなイムノアッセイには、例えば、この技術分野で周知の、ＥＬＩＳＡ、Ｐａｎｄｅｘ微量蛍光測定アッセイ、凝集アッセイ、フローサイトメトリー、血清診断アッセイおよび免疫組織化学染色法が含まれる。この技術分野で周知の様々な手段によって、抗体を検出可能にすることができる。例えば、検出可能マーカーを、抗体に直接または間接的に付けることができる。有用なマーカーには、例えば、放射性核種、酵素、蛍光源、色原体および化学ルミネセンス標識が含まれる。
【００９０】
インビボでの画像診断法用では、検出可能抗体を、患者、組織または細胞に投与し、そして、ポリヌクレオチド／トランスジーン生成物への抗体の結合を、この技術分野で周知の画像診断技術によって検出することができる。適当な画像診断薬剤は、既知であり、例えば、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ、５１Ｃｒ等のようなγ線放射放射性核種、ならびに合衆国特許第４，６４７，４４７号に記載の常磁性金属イオンが含まれる。放射性核種は、γシンチレーション光度計、陽電子射出断層撮影、シングルフォトンエミッションコンピューター断層撮影およびγ線カメラ全身画像診断による、組織の画像診断を可能にし、これに対して、常磁性金属イオンは磁気共鳴画像診断による可視化を可能にする。
【００９１】
本発明は、本発明の核酸によってコードされる、単離されたハイブリッド／キメラトランスアクティベーター（融合）ペプチド、ポリペプチド（類）および／またはタンパク質（類）を、提供する。ここに用いられている、用語「単離された」は、細胞成分および／またはインビボでの天然環境で通常関連する混入物を含まないタンパク質分子を意味する。本発明のポリペプチドおよび／またはタンパク質には、任意の天然発生のアレレ変異体、ならびにその組換え型、を含む。本発明のポリペプチドを、当業者らに周知の様々な方法を用いて、単離することができる。
【００９２】
本発明の融合タンパク質の単離精製に利用できる方法には、沈殿、ゲルろ過、ならびに分子ふるい、イオン交換および、例えばＨＩＦ−１α、ＥＰＡＳ１−またはＨＬＦ−特異的抗体およびリガンドを用いたアフィニティークロマトグラフィーを含むクロマトグラフ法が含まれる。その他の周知の方法は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒら、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｔｙ、第１８２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９０、に記載されている。精製された本発明のポリペプチドを組換え系内で生成させる場合、組換え発現ベクターは、さらなるアミノ末端またはカルボキシ末端アミノ酸をコードするさらなる配列を含み、これらの追加アミノ酸は、固定化抗体を用いるイムノアフィニティー精製用または固定化リガンドを用いるアフィニティ精製用の「タグ」として働くであろう。
【００９３】
本発明のハイブリッド／キメラトランスアクティベーター（融合）ポリペプチド（類）を調製する手段の例としては、細菌細胞、酵母細胞、両生類細胞（例えば卵母細胞）、昆虫細胞（例えばショウジョウバエ）または哺乳動物細胞のような、適当な宿主細胞内で、この技術分野で周知の方法を用いて、本発明のポリヌクレオチドを発現し、そして発現したポリペプチドを回収し、再び周知の方法を用いることである。本発明のポリペプチドを、ここにさらに詳細に記載する方法に従って、発現ベクターで形質転換された細胞から直接単離することができる。本発明のハイブリッド／キメラトランスアクティベーター（融合）ポリペプチド、生物学的に活性なフラグメントおよびその機能的等価物を、化学合成によって作成することもできる。ここに用いられているように、「生物学的に活性なフラグメント」とは、活性タンパク質に組み立てることのできるポリペプチドの任意の部分をさす。合成ポリペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｄｅｌ ４３０Ａまたは４３１Ａ自動ペプチドシンセサイザー（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を製造者らによって提供された化学に従って用いることによって、作成することができる。
【００９４】
以下の語句「組換えで発現した／生成した」、「精製した」または「実質上純粋」を伴う、本発明の核酸、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質の修飾には、人の手によってそのような形に作成された核酸、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質が含まれ、従ってインビボでの天然の細胞環境から分離される。この様なヒトの介入の結果として、本発明の組換え核酸、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質は、選択された薬剤または化合物の同定のような関連する天然発生分子が有用ででない場合に、有用である。
【００９５】
本発明は、キメラトランスアクティベータータンパク質をコードするトランス遺伝子を持つ非ヒト−トランスジェニック動物を提供する。このトランスジェニック動物は、さらに、低酸素応答エレメント（ＨＲＥｓ）(hypoxia responsive elements) の制御下の興味ある遺伝子を含むことができる。本発明の様々な実施態様では、トランスアクティベータータンパク質は、興味ある遺伝子の発現を本質的に強化することができる。代わりに、トランスアクティベータータンパク質は、ある条件下、例えば、制限するつもりはないが、誘導によって、興味ある遺伝子の発現を強化することができるだけである。本発明の組換えＤＮＡ分子を、本技術分野で既知のトランスジェニック動物を作成するための任意の方法を用いて、非ヒト−動物のゲノム内に導入することができた。
【００９６】
本発明は、本発明のハイブリッド／キメラトランスアクティベーター（融合）ポリペプチドをコードする核酸を発現する能力を持つトランスジェニック非ヒト−哺乳動物を提供する。
【００９７】
また、本発明のハイブリッド／キメラトランスアクティベーター（融合）ポリペプチドをコードする核酸を発現する能力を持つトランスジェニック非ヒト−哺乳動物が提供され、その結果、トランスジェニック哺乳動物は正常な活性を失うような変異を受けた。
【００９８】
また、本発明は、本発明のハイブリッド／キメラトランスアクティベーター（融合）ポリペプチドをコードする核酸と相補的なアンチセンス核酸を含むゲノムを持つトランスジェニック非ヒト−哺乳動物を提供し、その結果、ゲノムは本発明の融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに相補的なアンチセンスｍＲＮＡに転写されるように配置され、アンチセンス核酸は前記核酸とハイブリダイズし、それによってその翻訳を減少させる。さらに、ポリヌクレオチドは、誘発性プロモーターおよび／または組織特異的調節エレメントを含むことができ、その結果、発現を誘発するか、または特定の細胞の型に限定することができる。非ヒト−トランスジェニック哺乳動物の例として、トランスジェニック−ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、ラットおよびマウスがあげられる。組織特異性−決定エレメントの例としては、メタロチオネインプロモーターおよびＴ１７プロモーターがあげられる。
【００９９】
本発明のポリペプチドの生理学的行動に関する役割を解明する動物モデルシステムを、ポリペプチドの発現を様々な技術を用いて変化させたトランスジェニック動物を作り出すことによって、作成する。そのような技術の例としては、ミクロインジェクション、レトロウイルス感染または当業者らに周知のその他の手段によって、適当な受精胎児細胞に本発明の融合ポリペプチドをコードする正常または変異型核酸を挿入し、トランスジェニック動物を作り出すことが含まれる。例えば、Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１，１２６３−１２７０、１９９３；Ｃａｒｖｅｒら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，７７−８４、１９９２；Ｃｌａｒｋら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７，４８７−４９２、１９８９；Ｓｉｍｏｎｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，１７９−１８３、１９８８；Ｓｗａｎｓｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，５５７−５５９、１９９２；Ｖｅｌａｎｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１２００３−１２００７、１９９２；Ｈａｍｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３１５，６８０−６８３、１９８５；Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８４４−８４７、１９９１；Ｅｂｅｒｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３５−８３８、１９９１；Ｓｉｍｏｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２８，５３０−５３２、１９８７；Ｐｉｔｔｉｕｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５８７４−５８７８、１９８８；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８．８３２７−８３３１、１９９１；Ｗｈｉｔｅｌａｗら、Ｔｒａｎｓｇ．Ｒｅｓ．，１，３−１３、１９９１；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５，１１８３−１１８７、１９８７；Ｇｒｏｓｖｅｌｄら、Ｃｅｌｌ，５１，９７５−９８５、１９８７；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４７８−４８２、１９９１；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，８３６−８４０、１９８８；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４４３８−４４４２、１９８５；Ａｌ−Ｓｈａｗｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０（３），１１９２−１１９８、１９９０；Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，６１４８−６１５２，１９８５；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，５６，３１３−３２１、１９８９；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２４４−１２４６、１９８１；および、Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８６）を参照のこと。
【０１００】
その他の技術、トランスジェニック動物内の天然遺伝子座と変異体または正常型のこれらの遺伝子の相同組換えを用いると、本発明のポリペプチドの発現の調節またはその構造を変化させることができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１２８８、１９８９；Ｚｉｍｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３８，１５０、１９８９を参照のこと）。相同組換え技術は、この技術分野で周知である。相同組換えは、天然（内因性）遺伝子を組換えまたは変異遺伝子で置換し、天然（内因性）タンパク質を発現できないが、例えば、結果として本発明の融合ポリペプチドの発現を変化させる変異タンパク質を発現することができる、動物を作り出す。
【０１０１】
相同組換えとは対照的に、ミクロインジェクションは、宿主遺伝子を除去することなく、遺伝子を宿主ゲノムに加える。ミクロインジェクションは、内因性および外因性の両ポリペプチドを発現する能力を持つトランスジェニック動物を作り出すことができる。誘発性プロモーターを、核酸のコード領域に連結して、トランス遺伝子の発現を調節する手段を提供することもできる。組織−特異的調節エレメントを、コード領域に連結すると、トランス遺伝子の組織特異的発現を可能にすることができる。トランスジェニック動物モデルシステムは、インビボでのリガンド同定用の化合物；例えば、ポリペプチド応答を活性化するか、あるいは阻害する、アゴニストまたはアンタゴニスト；のスクリーニングに有用である。
【０１０２】
さらに、本発明は、受容可能なキャリヤーおよび任意の単離精製されたハイブリッド／キメラトランスアクティベーター（融合）ポリペプチド、その活性フラグメント、または精製された成熟タンパク質およびその活性フラグメントを、単独または互いに組み合わせて、含む組成物を提供する。これらのポリペプチドまたはタンパク質は、組換え誘導されるか、化学的に合成されるか、または精製されうる。ここに用いられている、用語「受容可能なキャリヤー」は、リン酸塩バッファー溶液、水および油／水または水／油エマルジョンのようなエマルジョンおよび様々な型の湿潤剤のような、任意の標準的製剤キャリヤーを包含する。
【０１０３】
ここに用いられている、用語「有効量」とは、個体細胞内で生物学的に活性なキメラヒト−ウイルストランスアクティベータータンパク質を持続的に生成することによって、欠乏を和らげる量を指す。低酸素関連疾病、例えば虚血性心疾患、末梢血管疾病、虚血性肢疾患等、と関連する症状の緩和によって、個体内での生物学的に活性なキメラヒト−ウイルストランスアクティベータータンパク質の持続的な生成を、評価することができる。当業者らは、本発明の方法に用いられるベクターの正確な有効量を、例えば、年齢、体重、疾病の範囲および個体の状態の個体差を考慮して、決定することができる。
【０１０４】
さらに、本発明は、低酸素関連疾患の患者の細胞に、生物学的に活性なキメラヒト−ウイルストランスアクティベータータンパク質を提供する方法であって、関連する転写因子がその中で欠落しているか、不充分か、または機能しない細胞内に、生物的に活性なキメラヒト−ウイルストランスアクティベータータンパク質の発現を感染させ持続させるのに有効な量の本発明のベクターを、そのような個体内に導入することを含む、前記の方法を提供する。本発明のベクターを、ベクターおよび医薬として許容しうるキャリヤーを含む医薬組成物として、標的細胞に配達することができる。当業者らに周知の方法、例えば、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、挿管法、洗浄等によって、ベクターを標的細胞に配達することができる。
【０１０５】
従って、本発明は、生物学的に活性な哺乳動物転写因子の発現に次いで、一連の潜在性有益遺伝子の発現を誘導する代替法を提供する。
【０１０６】
ＨＩＦ−１αを、ＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡからＰＣＲによってクローン化し、発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）内に挿入した。このプラスミドでは、遺伝子発現は、ＣＭＶプロモーターによって制御されている。配列決定により構築物の構造を確認した後、ＥＰＯプロモーター／エンハンサーまたはＶＥＧＦプロモーターのいずれかによってルシフェラーゼ遺伝子の転写を調節するレポータープラスミドと共にコトランスフェクションすることによって、ＨｅＬａおよび２９３細胞内で試験した。ＨＩＦ−１α活性の誘導は、ＣｏＣｌ２またはデスフェリオキサミン(desferrioxamine)のいずれかで、細胞を処理することによって、成し遂げられ、両者は低酸素と類似のメカニズムでＨＩＦ−１α活性を誘導することが知られている。このアッセイでは、ＨＩＦ−１αタンパク質が真に活性であることが確認された。
【０１０７】
２つのＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッドを構築し、第一のハイブリッドは、ＨＩＦ−１αのアミノ酸３９０で、第二はアミノ酸５３０で切除した。次に、ＨＳＶ ＶＰ１６（アミノ酸４１３−４９０）のトランス活性化ドメインを下流に結合した。これらのタンパク質を、上記の方法に従って、ＥＰ０−ルシフェラーゼまたはＶＥＧＦ−ルシフェラーゼレポータープラスミドのいずれかと共に、ＨｅＬａおよび２９３細胞内にコトランスフェクションすることによって試験した。結果は、両細胞系内では、ハイブリッドでコトランスフェクトされた細胞内で認められたルシフェラーゼ遺伝子発現のレベルは、ＣｏＣｌ２またはデスフェリオキサミンによる誘導に晒した場合でさえ、ＨＩＦ−１αで得られたそれより（２０−１００Ｘほど）高い。この結果は、ハイブリッドタンパク質が真に活性であり、ＶＰ１６ドメインは、誘導されない場合（例えば酸素正常状態条件下）でさえ、強いトランスアクティベーション活性を供与することを、暗に示している。このことは、これらのハイブリッド／キメラ融合タンパク質が低酸素心臓疾患の実行可能な治療法であることを示唆している。
【０１０８】
さらに、本発明は、以下の実施例によって説明され、これら実施例は、決してさらなる制限として解釈されるべきでない。この明細書全体で引用されたすべての参考文献の内容は、ここに参照として採用される。
【０１０９】
実施例
実施例１：ハイブリッド／キメラ構築物
ＨＩＦ−１αからのＤＮＡ結合ドメインおよびダイマー化(dimerization)ドメインならびに単純ヘルペスウイルスＶＰ１６からのトランス活性化ドメイン（図１）からなるハイブリッド転写因子（ｐｃＤＮＡ３／ＨＩＰ．ＶＰ−１６．Ａｆｌ２）を構築し、低酸素に対する生理学的適応に通常含まれる遺伝子の強く本質的な活性化を提供する。以下に記載した方法に従って、我々は、インビトロでのＶＥＧＦ遺伝子発現およびウサギ後脚虚血モデルでの新生血管形成への、このＨＩＦ−１α／ＶＰ１６転写因子の影響について分析した。
【０１１０】
組換えプラスミド
全長（ａａｌ−８２６）のＨＩＦ−１α遺伝子を、配列番号１および２に示したプライマーを用いてＨｅｌａ細胞ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲ（Ａｄｖａｎａｇｅ ｃＤＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）によって単離し、発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＫｐｎＩおよびＸｂａＩ部位の間に挿入した。このプラスミドでは、遺伝子発現は、シトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型早期エンハンサー／プロモーターによって調節される。ＨＩＦ−１α／ＶＰ−１６ハイブリッドを、ａａ３９０（Ａｆｌ２部位）でＨＩＦ−１αを切除し、次いでＨＳＶ ＶＰ−１６下流のトランス活性化ドメインを連結することによって構築した。Ａｆｌ２およびＸｂａＩ末端を持つＶＰ１６フラグメント（ａａ４１３−４９０）を、Ｖｅｎｔポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）および配列番号３および４に示したプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅し、このフラグメントをｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ−１α構築物の適当な部位にクローン化した。関連する構築物（ｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ−１６／Ｒ１）は、ＥｃｏＲＩでの部分消化によりａａ５３０でＨＩＦ−１αを切除することによって、作成された。ＰＣＲによって生成した全配列の完全性を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いたＤＮＡシークエンシングによって確認した。全クローニングマニュピュレーションを、標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、１９８９）に従って行った。制限酵素およびＤＮＡ修飾酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓまたはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）のいずれかから得られ、製造者らの明細書に従って用いられた。プラスミドＤＮＡｓをＱｉａｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）から得たキットで精製した。ヒトＶＥＧＦ１６５（ｐｈＶＥＦＧ１６５）を発現するプラスミド構築物については、以前に記載されている（Ｔｓｕｒｕｍｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９６，II−３８２−II−３８８、１９７７）。ルシフェラーゼレポータープラスミド（ＥＰＯ−ｌｕｃおよびＶＥＧＦ−ｌｕｃ）は、Ｄｒ．Ｈ．Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｂｕｎｎ（Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ）から提供して頂いた。
【０１１１】
一過性トランスフェクション
ＨｅＬａ細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏのイーグル修飾培地−高グルコース（ＤＭＥ；Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）内で増殖させた。ルシフェラーゼレポーター実験用に、ＨｅｌＡ細胞（３ｘ１０５細胞／６０ｍＭ皿）を、リン酸カルシウムＰｒｏＦｅｃｔｉｏｎキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を製造者らの使用説明書に従って用いて、トランスフェクトした。二重の皿を、それぞれ５μｇのプラスミド［ＨＩＦ−１α構築物およびＥＰＯ−ｌｕｃ（Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｋ．Ｌ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２，５３７３−８５、１９９２）またはＶＥＧＦ−ｌｕｃ（Ｌｅｖｙ，Ａ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１３３３３−４０、１９９５）レポーターのいずれか、ならびにｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）］でトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間で、１セットの皿を１００μＭデスフェリオキサミン(desferrioxamine)で誘導した。細胞を誘導後１８時間で集菌し、ルシフェラーゼ活性をアッセイした（Ｐｒｏｍｅｇａ）。また、個々のサンプル内のβ−ガラクトシダーゼ活性を、Ｇａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔキット（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて定量し、これらの値を用いて、トランスフェクション効率の対照として、ルシフェラーゼ活性を標準化した。
【０１１２】
実施例２：インビトロでのＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−１α／ＶＰ１６キメラ／ハイブリッド構築物の活性
ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッド構築物を、レポータープラスミドと共に２９３またはＨｅＬａ細胞のいずれかへコトランスフェクションすることによって、遺伝子発現を活性化する能力について、試験した（それぞれ図３および４）。これらの実験に用いられたレポータープラスミドは、エリスロポイエチンエンハンサー／プロモーター（Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｋ．Ｌ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２，５３７３−８５、１９９２）またはＶＥＧＦプロモーター（Ｌｅｖｙ，Ａ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１３３３３−４０、１９９５）のいずれかの転写調節下で、ルシフェラーゼ遺伝子を含んでいた（図３−５では、ｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６．Ａｆｌ２およびｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６．Ｒ１を、それぞれ”ＨＩＦ−４／ＶＰ−１６．ＡｆｌII”および”ＨＩ−４／ＶＰ−１６．Ｒ１”と示している）。
【０１１３】
トランスフェクションの前に、細胞を、１ｘ１０６（２３９）または２．５ｘ１０５（ＨｅＬａ）細胞／皿の密度で、６ｃｍの皿に塗布した。ＨＩＦ−１αまたはＨＩＦ−１α／ＶＰ１６発現プラスミド、およびＥＰＯエンハンサー／プロモーターまたはＶＥＧＦプロモーターのいずれかを含むルシフェラーゼレポータープラスミドで、細胞をコトランスフェクトした。
【０１１４】
トランスフェクションは、それぞれ５μｇのＨＩＦ−１α／ＶＰ１６発現構築物およびレポータープラスミド／皿を用い、ＰｒｏＦｅｃｔｉｏｎＴＭキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いたリン酸カルシウム沈殿によって行われた。トランスフェクション２４時間後、１００μｇ／ｍｌ ＣｏＣｌ２ または１００μｇ／ｍｌデスフェリオキサミンのいずれかを含む新鮮培地を加えることによって、細胞を誘導した。誘導１６時間後、細胞を収集し、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者らの説明書に従って用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【０１１５】
ＨＩＦ−１活性の誘導は、デスフェリオキサミン、鉄キレーターで処理することによって刺激され、これは低酸素症と類似の機構で作用する。ＨＩＦ−１α／ＶＰ−１６ハイブリッド転写因子で予想されたように、ルシフェラーゼ発現は構成的であり、デスフェリオキサミン誘導に依存しなかった。非誘導細胞およびデスフェリオキサミン処理細胞でのルシフェラーゼ発現も有意に違わなかった。これとは対照的に、全長のＨＩＦ−１α構築物でトランスフェクトされた細胞内のルシフェラーゼ活性は、デスフェリオキサミンでの処理後、４−５倍に増加した。さらに、非誘導細胞内でＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッドによって達成された転写活性化は、全長のＨＩＦαでトランスフェクトされたデスフェリオキサミン処理細胞内で認められたそれより、１０−２０倍高かった。全体では、ＨＩＦ−１αで活性化されたルシフェラーゼ発現レベルは、ＨｅＬａ細胞内の内因性ＨＩＦ−１活性に帰因するバックグラウンドレベルより非常に高くはなかった。図６に示すように、以下の研究でこれらの知見を確認した。
図６（左）は、ＥＰＯ３’エンハンサー−プロモーター−ルシフェラーゼレポーター構築物を用いて生成したルシフェラーゼ活性を示している。図６（右）は、ＶＥＧＦプロモーター−ルシフェラーゼレポーター構築物を用いて生成したルシフェラーゼ活性を示している。
【０１１６】
実施例３：ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッド構築物に応答するＶＥＧＦの生成
ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッドが内因性ＶＥＧＦ遺伝子の発現を活性化する能力を持つか否かを決定するために、これら構築物をＨｅＬａ細胞内にトランスフェクトし、ＶＥＧＦをＥＬＩＳＡでアッセイした。トランスフェクション前、ＨｅＬａ細胞を、６ｃｍ皿に５ｘ１０５細胞／皿の密度で塗布した。細胞を１０μｇのＨＩＰ−１α／ＶＰ１６ハイブリッドプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、二重プレート内の細胞は、対照（誘導せず）か、または１００μｇ／ｍｌのデスフェリオキサミンを含む新規の培地を加えることによって誘導するかのいずれかであった。誘導４０時間後、培養液を収集し、ＥＬＩＳＡ（ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＴＭ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を製造者らの指示書に従って用いることによって、ＶＥＧＦについてアッセイした。
【０１１７】
このアッセイからの結果（図５）は、ハイブリッドＨＩＦ−１α／ＶＰ１６／ＡｆｌII構築物（ＨＩＦ−１αのアミノ酸３９０で切除）は、誘導されない場合でさえ、ＶＥＧＦの発現を活性化する能力を持つことを、示している。しかしながら、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６／ＡｆｌII−トランスフェクト細胞からの培地内のＶＥＧＦの濃度は、誘導を伴って、ｍｏｃｋ−トランスフェクト細胞またはＨＩＦ−１α−トランスフェクト細胞内で認められたそれより高くなかった。このことから、多分、最大プラトーレベルは、ＨｅＬａ細胞内に存在する内因性のＨＩＦ−１αによって達成されることを、示唆している。しかしながら、重要な所見は、このレベルが、誘導されていないＨＩＦ−１α／ＶＰ１６／ＡｆｌIIハイブリッドでも達成することができる、と言うことである。
【０１１８】
同じ結果は、第二のハイブリッド構築物ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６／Ｒ１（ＨＩＦ−１αのアミノ酸５３０で切除）では達成されないが、この構築物は、ルシフェラーゼレポーターアッセイで活性であった。さらなるインビトロでの分析から、２つの構築物の間の活性の明らかな差が確認された。特に、ルシフェラーゼレポーター構築物の転写活性化ならびにＨｅＬａ細胞およびＨｅｐ３Ｂ細胞の内因性ＶＥＧＦおよびＥＰＯ遺伝子発現のアップレギュレーションに関しては両方とも、ＨＩＦ−１α／Ｖｐ１６／Ａｆｌ２構築物（ＨＩＦ−１αのアミノ酸３９０で切除）は、より長いＨＩＦ−１α／ＶＰ１６／Ｒ１構築物より活性である。この活性の違いは、酸素正常常態化で不安定になると報告されているＨＩＦ−１αの「酸素依存性ドメイン」の部分のより長い構築物の存在によるらしい（Ｈｕａｎｇら、ＰＮＡＳ，９５，７９８７−７９９２、１９９８を参照のこと）。
【０１１９】
ＶＥＧＦ生成のさらなる分析では、ＨｅＬａ細胞（３ｘ１０５細胞／６０ｍＭ皿）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，）中のリポフェクタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，３．７μｇ ＤＮＡ、１４μｌのリポフェクタミン）で、１７時間トランスフェクトした。７時間後、１セットの皿を１００μＭのデスフェリオキサミンで処理した。誘導４２時間後、培養液を収集し、細胞を２５０μｌの溶解バッファー［０．５％ ＮＰ−４０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、１００μＭ ＰＭＳＦ、０．１Ｕ／ｍｌアプロチニン(Aprotinin) 、１μＭペファブロック(Pefabloc)、５μｇ／ｍｌロイペプチン(Leupeptin)］内で溶解した。ＶＥＧＦ濃度を、上記の方法に従ってアッセイし、全細胞タンパク質を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）タンパク質アッセイを用いて分析した。ＥＬＩＳＡ値を、全細胞タンパク質に対して標準化した。
【０１２０】
ラットＣ６グリオーム細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｅ，ＭＤ）を、トランスフェクション３日前に１２穴培養プレート上に接種し、１０％ ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加したＤＭＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で培養した。トランスフェクションは、本質的には、以前に記載された方法（Ｌｅｅ，Ｅ．Ｒ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７，１７０１−１７１７、１９９６）に従って、成し遂げられた。簡単に言えば、プラスミドＤＮＡを同容量のカチオン脂質ＧＬ＃６７と複合させると、最終濃度８０：２０μＭ（ＤＮＡ：脂質）となった。脂質／ＤＮＡ複合体（４００μｌ／穴、おおよそ５ｘ１０５細胞／穴）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地内の細胞に加え、５時間インキュベートした。次いで、複合体を除去し、細胞をＤＭＥ＋１０％ＦＢＳに戻した。トランスフェクションの２４時間後、デスフェリオキサミン（１００μＭ）を含むかまたは含まない新鮮培地（１ｍｌ／穴）で、培地を置き換えた。２４時間後、培養液を、ＶＥＧＦ生成分析用に収集し、細胞を５００μｌの細胞溶解バッファー内で溶解した。ＶＥＧＦ生成は、マウスＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）について特異的なＥＬＩＳＡキットを用いてアッセイされ、値は全細胞タンパク質に標準化された。
【０１２１】
ＨｅＬａ細胞およびＣ６細胞の両方で、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッド構築物は、デスフェリオキサミン処理をしない場合にもＶＥＧＦ生成を有意に強化した。ＨｅＬａ細胞内では、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６−トランスフェクト細胞内のＦＥＧＦ生成は、デスフェリオキサミンによってさらに強化されたが、Ｃ６細胞内では、差は認められなかった。ＶＥＧＦ発現のバックグラウンドレベルは、Ｃ６細胞内よりＨｅＬａ細胞内の方がより高かった。ＶＥＧＦ発現の大きさへのＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッドの影響は、Ｃ６細胞内でより大きく認められた（デスフェリオキサミンで処理された、トランスフェクトされていない細胞またはＨＩＦ−１α−トランスフェクト細胞より５倍高かった）。ＨｅＬａ細胞では、非誘導ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６−トランスフェクト細胞内でのＶＥＧＦ生成は、デスフェリオキサミンに晒されたトランスフェクトされていない細胞内のそれと似通っていた。しかしながら、両細胞系共、非誘導のＨＩＦ−１α／ＶＰ１６−トランスフェクト細胞内で生成されたＶＥＧＦの絶対量（２．３ｐｇ／μｇタンパク質もまた、同一であった。これらの結果は、内因性ＨＩＦ−１αタンパク質および／またはＨＩＦ−１α活性のデスフェリオキサミン誘導レベルは、Ｃ６細胞内よりＨｅＬａ細胞内でより大きいことを示唆しており、このことは、種特異的または細胞型特異的差異によって説明できる。とりわけ、ヒト転写因子に基づくＨＩＦ−１α／Ｖｐ１６ハイブリッドは、ラットＶＥＧＦ遺伝子を活性化することができ、このことは、種を越えてＨＲＥｓが保存されることを示唆している。ラットＶＥＧＦ遺伝子の５’−フランキング領域の配列分析は、いくつかの潜在的ＨＲＥｓを明らかにし、これらの内の一つの位置は、ラットとヒト遺伝子の間で保存されている。このエレメントは、ラットとヒトのＶＥＧＦ遺伝子で同一な２８ｂｐ領域内に位置している。
【０１２２】
実施例４：ウサギ後脚虚血モデル内のＨＩＦ−１α／Ｖｐ１６ハイブリッド転写因子の分析
Ａ．血清ＶＥＧＦレベル
ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッド遺伝子（ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６）またはヒトＶＥＧＦ１６５（ｐｈＶＥＧＦ１６５）のいずれかをコードするむき出しのプラスミドＤＮＡを、大腿動脈をてき出して後脚虚血を誘導した、ウサギの中央内転筋および半膜様筋肉内に注射することによって、投与した。血清ＶＥＧＦレベルを、ヒトＶＥＧＦに対して調製したＥＬＩＳＡアッセイによってアッセイした。従って、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６−処理グループに適用したようなこのアッセイは、ウサギの内因性タンパク質がこれらの動物内で生成される程、定量的ではない。しかしながら、ＶＥＧＦ発現の反応速度論および持続性を、グループ内で比較することはできる。処理前、血清ＶＥＧＦレベルはほとんど検出できず、それぞれのグループで類似していた。しかしながら、投与３日後、ＶＥＧＦレベルは、ｐｈＶＥＧＦ１６５−トランスフェクト動物では１０．５（±３．９）ｐｇ／ｍｌに、ＨＩＦ−１α／ＶＰ−１６処理グループでは２６．３（±４．６）ｐｇ／ｍｌに、増加した。処理５日後、ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ−１６処理動物内のＶＥＧＦレベルは未だ高く、徐々に減少していた（１４．９±３．０ｐｇ／ｍｌ）。対照的に、５日後、ｐｈＶＥＧＦ１６５処理動物では、血清ＶＥＧＦを検出できなかった。対照（ｐＣＭＶβ−処理）グループでは、処理前、または処理３日後および５日後のいずれでも、ＶＥＧＦは検出されなかった。ＶＥＧＦタンパク質レベルは５日迄に減少したが、両方のトランスジーン発現は、ＲＴ−ＰＣＲで分析したところ、投与１４日後迄、持続した。
【０１２３】
Ｂ．赤血球の測定
ｐｈＶＥＧＦ１６５−ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６での処理前（１０日）および処理後３０日（４０日）ならびに対照グループの赤血球数、ヘマトクリット値およびヘモグロビン値を、下の表１に示している。処理前または処理後のいずれでも、３グループ間で赤血球数およびヘモグロビンに差はなかった。ヘマトクリットはｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６−処理動物内で増加する様に思われたが、同様の増加が対照グループ内にも認められ、この結果が、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッド転写因子の発現によるものでなかったことを示唆している。
【０１２４】
Ｃ．ウシ後脚の血圧
虚血誘導１０日後（プラスミド注射直前）、ウシ血圧比（虚血／正常脚）は、３グループ間で類似していた（ｐｈＶＥＧＦ１６５ ＝０．４５±０．０１、ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６＝０．４４±０．０２、対照＝０．４５±０．０３；Ｐ＝ＮＳ）。４０日迄（トランスフェクション後３０日）、血圧比は、３グループ間で改良した。しかしながら、ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６処理動物の血圧比（０．９３±０．０２）は、ｐｈＶＥＧＦ１６５を受けた動物の血圧比（０．８２±０．０３）または対照グループのそれ（０．６９±０．０２）より有意に高かった（Ｐ＜０．０１）。４０日の血圧比は、ｐｈＶＥＧＦ１６５−処理グループで対照より高かった（Ｐ＜０．０１）。
【０１２５】
Ｄ．血管内ドップラーガイドワイヤ測定
虚血脚内の静止血流および最大血流（パパベリン−刺激）は、１０日では、３グループ間で類似していた。しかしながら、４０日では、静止血流およびパパベリン刺激最大血流は、ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６−トランスフェクトグループ（それぞれ４１．６±３．１ｍｌ／分および１１１．２±５．７ｍｌ／分）およびｐｈＶＥＧＦ１６５トランスフェクトグループ（それぞれ４２．２±３．９ｍｌ／分および８８．７±７．４ｍｌ／分）では、対照グループのそれ（それぞれ２８．７±１．５ｍｌ／分および６５．３±３．８ｍｌ／分）より有意に高かった。静止血流は、ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６およびｐｈＶＥＧＦ１６５−処理ウサギ間では類似していた（４０日）が、最大血流は、ｐｈＶＥＧＦ１６５処理グループよりｐＨＩＦ−１α／Ｖｐ１６でトランスフェクトした動物の方が、有意に高かった（ｐ＜０．０５）。非虚血脚内の静止血流および最大血流は、１０日ならびに４０日共、３グル−プ間で類似していた。
【０１２６】
Ｅ．側副血管発達へのＨＩＦ−１α／ＶＰ１６およびＶＥＧＦ１６５の影響
大腿中央の血管造影視覚型の側副血管の定量分析は、血管密度を測定することによって成し遂げられた。処理前（１０日）の基準線では、ｐｈＶＥＧＦ１６５、ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６および対照グループ間の血管造影スコアに有意の差はなかった（それぞれ０．３８±０．０３、０．４２±０．０１、０．４１±０．０２、Ｐ＝ＮＳ）。４０日まで、ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６−処理ウサギ（０．６１±０．０１）およびｐｈＶＥＧＦ１６５−処理ウサギ（０．５８±０．０３）の血管造影スコアは、対照グループのそれ（０．５１±０．０５）より有意に高かった。４０日では、ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６−処理およびｐｈＶＥＧＦ１６５処理グループ間の血管造影スコアに、統計上有意な差はなかった。ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６およびｐｈＶＥＧＦ１６５を受けた動物内で認められる血管造影スコアの増加を説明する主な知見は、いわゆる中央帯の側副血管の強化であった。
【０１２７】
さらに、虚血後脚の血管再生への筋肉内ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６およびＶＥＧＦ遺伝子治療の効果を評価するために、虚血脚の大腿中央筋を、４０日に組織学的に試験した。ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６処理グループ（２５５±１３／ｍｍ２）およびｐｈＶＥＧＦ１６５処理グループ（２１０±１０／ｍｍ２）の筋肉内で認められた毛細血管密度は、対照グループのそれ（１５０±４／ｍｍ２）より有意に高かった。さらに、毛細血管密度は、ｐｈＶＥＧＦ１６５ 処理動物より、ｐＨＩＦα／ＶＰ１６でトランスフェクトした動物で高かった（ｐ＜０．０５）。さらに、ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６およびｐｈＶＥＧＦ１６５処理ウサギの毛細血管／筋肉繊維比（それぞれ、０．８８±０．０６および０．７５±０．０３）は、対照（０．５８±０．０３、結果は示していない）より有意に高かった。明らかな筋壊死の光学顕微鏡的徴候はいずれのグループでも認められなかった。
【０１２８】
医療へのかかわり
インビトロおよびインビボでＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッド因子によってＶＥＧＦ遺伝子発現が活性化されることから、ＶＰ１６活性化ドメインが試験した細胞型（ヒト頸部上皮、ラットグリオーム、ウサギ骨格筋）内のＨＩＦ−１標的遺伝子の発現に必要とされるアクセサリー因子と相互作用するであろうと、考えられる。従って、遺伝子治療によるＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッドの投与は、血管障害に関連する虚血への有効な治療法であることが分かる。この適用では、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６は、ＶＥＧＦを含む様々な遺伝子をアップレギュレートすることができる。治療による恩恵は、血管形成の刺激の結果としてのみならず、血管拡張および嫌気代謝のアップレギュレーションのような、低い酸素圧へのさらなるＨＩＦ−１仲介局所適応を通してでも、達成することができる。成長因子および／または血管形成を強化するそれらをコードする遺伝子の投与は、慣用の血管再生技術が適さない場合の組織虚血の治療として、有用であることができる。
【０１２９】
インビボではＶＥＧＦ１６５と相関してＨＩＦ−１α／ＶＰ１６で認められる潜在能力の強化は、いくつかの因子によるものであろう。第一に、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６によって促進されるＶＥＧＦの発現レベルは、ＶＥＧＦ１６５プラスミドで達成されたそれを越えるように見えた。さらに、ＶＥＧＦ発現は、ｐｈＶＥＧＦ１６５を与えられた動物より、ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６処理動物で、より長く持続するように思われた。なぜなら、投与５日後、血清ＶＥＧＦは、後者のグループではなく、前者のグループで認められたからである。
【０１３０】
Ｆ．方法
筋肉内遺伝子のトランスファー
２９のウサギを用いて、後脚虚血への筋肉内遺伝子治療の効果について研究した。全プロトコールは、Ｓｔ．Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ’ｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｅｅによって承認されている。雄のニュージーランド白ウサギ（４．０−４．３ｋｇ）（Ｐｉｎｅ Ａｃｒｅ Ｒａｂｂｉｔｒｙ，Ｎｏｒｔｏｎ，ＭＡ）に、キシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）を前投与した後、ケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）およびアセプロマジン（０．８ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔をかけた。手術方法は、前記の通りである（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９３，６６２−６７０、１９９４ａ）。簡単に言えば、大腿動脈を、外腸骨動脈からの分岐のその中央に近い源から伏在静脈と膝窩動脈に分かれる末梢部まで、完全に剔出した。手術後、全動物を、綿密にモニターした。無痛剤（０．２５ｍｇ／ｋｇの酒石酸レボファノール、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）を、１日間、皮下投与した。また、予防的に抗生物質（エンロフロキサシン、Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ，ＫＡ）を、手術後、合計５日間、皮下投与した。
【０１３１】
ウサギをカテーテル法実験室に戻した後、１０日間隔で、術後回復について考慮した。基準線測定完成後、プラスミドＤＮＡまたはベヒクルのみ（標準生理食塩水）を、小さな皮膚切開を通して３ｍｌのシリンジおよび２５ゲージの針を用いて、主な３つの大腿筋の別の４部位に、直接注射した。個々の注射で、中央にある大きい筋肉（２部位）、内転筋（１部位）および半膜様筋（１部位）に、針の先を、典型的には３−５ｍｍの深さで挿入した。筋肉注射についての詳細な方法は、前記の通りである（Ｔｓｕｒｕｍｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９４，３２８１−３２８９、１９９６）。この技術を用いて、５００μｇのｐＨＩＦ−１α／Ｖｐ１６（ｎ＝１１）、５００μｇのｐｈＶＥＧＦ１６５（ｎ＝１０）、または５００μｇのｐＣＭＶβ（ｎ＝８）を投与した。１２５μｇ／０．５ｍｌの標準生理食塩水を、個々の動物当たり全体で５００μｇ／２．０ｍｌを、それぞれ４部位に注射した。４部位への注射が完了した後、皮膚を４−０ナイロン縫合糸で閉じた。
【０１３２】
血清ＶＥＧＦのイムノアッセイ
それぞれのグループから最初に６匹のウサギについて、プラスミドトランスフェクション処理の直前ならびに処理後３および５日に、血液サンプルを、２３ゲージの針を用いて、ウサギの耳の中心動脈から採血した。血液サンプルを、４℃で３０分間保存し、次いで、３，０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離した。ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によるＶＥＧＦアッセイを行うまでは、血清を−８０℃に凍結した。血清ＶＥＧＦの検出の最低限界は９．０ｐｇ／ｍｌであった。アッセイは、それぞれのサンプルについて、二重に行った。観察者内での変化率は、８％以下であった。
【０１３３】
赤血球、ヘマトクリット、およびヘモグロビンの測定
血液サンプルを、ウサギの耳の中心動脈から、２３ゲージの針を用いて、処理直前（１０日）および屠殺日（４０日）に、採血した。赤血球、ヘマトクリットおよびヘモグロビンを、市販の自動検出器（Ｓｙｓｍｅｘ ａｌｐｈａ，Ｓｙｓｍｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｏｎｇ Ｇｒｏｏｖｅ,ＩＬ）で測定した。
【０１３４】
ウシ血圧比
ウシ血圧比を、ドップラーフローメーター［Ｍｏｄｅｌ１０５０；Ｐａｒｋｓ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｌｅｃｔｏｒｏｎｉｃｓ．Ａｌｏｈａ，（ＯＲ）］を用いて、処理直前（１０日）ならびに治療開始後１ヶ月（４０日）に、両方の後脚で測定した。個々の場合、麻酔下で、ウサギの後脚の毛を剃りきれいにした。トップラープローブを用いて、後脛骨動脈のパルスを同定し、後脚の心収縮期血圧を、標準的技術を用いて測定した（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９３，６６２−６７０、１９９４ａ）。ウシの血圧比は、虚血脚の心収縮期血圧と正常な脚のそれの比率として、それぞれのウサギ毎に定義した。
【０１３５】
インビボでのドップラーフロー測定
前記の方法（Ｂａｕｔｅｒｓ．Ｃ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６７，Ｈ１２６３−Ｈ１２７１、１９９４）に従って、０．０１８／ドップラーガイドワイヤー（Ｃａｒｄｉｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて、選択的腸骨内血液造影前１０日および４０日に、インビボで血流量を測定した。虚血脚の代わりとなる腸骨内動脈の隣接セグメントへの共通の腸骨動脈の源に、ワイヤーチップを位置付けた。スペクトルピーク速度の時間平均（ＡＰＶ）(time average of the spectral peak velocity) を静止状態で記録し、最大ＡＰＶを２ｍｇのパパベリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のボーラス注射の後記録した。
【０１３６】
ドップラー誘導血流（ＱＤ）を、ＱＤ＝（πｄ２／４）（０．５ｘＡＰＶ）（式中、ｄはベッセル直径であり、ＡＰＶはスペクトルピーク速度の時間平均である）として、計算した。腸骨動脈の管腔直径は、インビボで以前に確認された自動エッジ検出システムでの血管造影によって測定された。血管直径を、ドップラーサンプル容量の部位（ワイヤーチップに５ｍｍの距離）で測定した。断面積領域を、環状内腔と仮定して計算した。平均速度を、ベッセルを横切る時間平均化放物線状速度プロフィールと仮定することによって、０．５ｘＡＰＶで評価した。この様式で計算されたドップラー誘導血流は、インビトロおよびインビボの両方で電磁フローメーターによって測定された血流測定との相関で示された（Ｔｓｕｒｕｍｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９４，３２８１−３２９０、１９９６）。２ｍｇのパパベリンは、管の直径に影響を与えなかった（Ｋｕ，Ｄ．Ｄ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６５，Ｈ５８６−Ｈ５９２、１９９３）ので、直径測定値を用いて静止および最大血流の両方を計算した。
【０１３７】
選択的血管造影法
選択的腸骨内血管造影は、前記の方法（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９３，６６２−６７０、１９９４ａ）に従って、成し遂げられた。カテーテルのチップを、第７腰椎と第一仙椎との間の空間レベルで、腸骨内動脈内に配置した。全５ｍｌの非イオン性対照培地（Ｉｓｏｖｕｅ−３７０；Ｓｑｕｉｂｂ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｎｅｗ Ｂｒａｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）を、腸骨内動脈に配置した３Ｆ摂取カテーテル（Ｔｒａｃｋｅｒ−１８；Ｔａｒｇｅｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を通して、流速１ｍｌ／ｓで、自動血管造影インジェクターで注入した。次いで、虚血腔脚の一連の像を、１０５ｍｍスポットフィルム上に、１秒当たり１フィルムの割合で少なくとも１０秒間、記録した。血管造影完了後、カテーテルを除去し、傷を閉じた。
【０１３８】
側副血管発達の定量的血管造影分析は、５ｍｍ離れた間隔で列に並べられた２．５ｍｍ直径の円からなるグリッドの重塁を用いて行われた。この重塁は、４ｓ血管造影図の中央大腿領域上に置かれた。中央大腿領域内のグリッド腱画の総数、ならびに対比混濁化(contrast-opacified)動脈と交差する腱画の総数を、単一盲検様式でカウントした。血管造影スコアを、それぞれのフィルムについて、混濁化動脈と交差するグリッド腱画を、中央大腿のグリッド腱画の総数で割った比率として、計算した。
【０１３９】
毛細管密度
血管密度を、虚血後脚から採取した光学顕微鏡切片を用いて、毛細血管レベルで評価した。組織検体は、動物屠殺時に、虚血脚の内転筋および半膜様筋からの横切片として得られた。筋肉サンプルを、ＯＣＴ化合物（Ｍｉｌｅｓ，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）内に包埋し、液体窒素でスナップ凍結し、５μｍ厚の切片に切断した。前記の方法（Ｚｉａｄａ，Ａ．Ｍ．ら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．，１８，７２４−７３２、１９８４）に従って、組織切片をインドキシル−テトラゾリウム法でアルカリホスファターゼで染色して毛細血管内皮細胞を検出し、次いで、エオシンで対抗染色した。２つの筋肉からの全体で２０の異なる領域を無作為に選択し、毛細血管および筋細繊維の数を２０ｘ対物レンズ下でカウントした。次に、毛細血管密度（毛細血管／ｍｍ２）および毛細血管−対−筋細繊維の比率を測定した。
【０１４０】
実施例５：ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６組換えアデノウイルス
むき出しのＤＮＡの代わりとして、以下に記載する方法に従って、ＨＩＦ−１αに基づく遺伝子構築物を持つアデノウイルスベクターを構築した。
【０１４１】
２つのＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッドを、プレウイルスプラスミドベクター（ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０ｐＡ、ｐ１Ｘ−；いわゆる「エンプティーベクター」（ＥＶ）、Ｒ．Ｄｏｌｌから得られた）内にクローン化した。上記のように、これらの２つのハイブリッドタンパク質は、ＨＩＦ−１αからのＤＮＡ−結合ドメインおよびダイマー化ドメイン（最初は、ＨＩＦ−１αのａａ３９０のＡＦ１１１部位で切除され；第二は、ａａ５３０のＥｃｏＲＩ部位で切除されている）ならびに単純ヘルペスＶＰ−１６タンパク質からのトランス活性化ドメインを含んでいる。
【０１４２】
シャトルベクターＥＶ／ＨＩＦ−１α／ＶＰ−１６．Ａｆ１１１を、ＢｓｔＢ１で直線化し、シャトルベクターＥＶ／ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６．Ｒ１をＢａｍＨ１で直線化した。個々のベクターの１５μｇのＤＮＡを４時間消化し、次いで、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって二度精製した。ペレットを５０μｌの０．１ｘＴＥに再懸濁し、トランスフェクションに用いた（トランスフェクション前、２μｌの個々の消化ＤＮＡをゲル上で走行させた）。
【０１４３】
ウイルス骨格ＤＮＡの調製
５μｇのＡｄ２ＣＭＶＢｇａｌ−６ ＤＮＡをＰｓｈＡ１およびＳｎａＢ１で、３７℃で２４時間消化し、反応物の１／１０を０．８％アガロース／ＴＢＥゲル上に走行させ、消化の完全性をチェックした。残りの反応物をトランスフェクションに用いた。
【０１４４】
Ａｄ２ＣＭＶＢｇａｌ−６骨格は、合衆国特許第５，７０７，６１８号（ここに参照としてその全体を採用される）の実施例に記載のベクターのそれとほぼ同一であるが、ベクターの欠損Ｅ１部分内へ挿入されたＢ−ｇａｌ遺伝子を含んでいた。特に、このベクターは、ＡｄＥ１に関して欠損があり、Ｅ４配列は、３４０７７のＤｌａＩ部位から３５５９７のＴａｑＩ部位まで欠損している。３３１７８から３４０８２迄のＯＲＦ６配列をＥ４領域に挿入した。ＳＶ４０早期ポリＡ配列を、ＯＲＦ６に隣接して挿入し、そうすることによって、ＯＲＦ６遺伝子からＬ５（繊維）配列内への読み通しもまた妨害される。プロテインＩＸを、その元来の位置からＢａｍＨ１フラグメントとしてのＥ４欠損領域内のウイルスゲノム内に再配置する。プロテインＩＸフラグメントは、それ自身プロモーターを含み、いずれの方向でもベクター内にクローン化することができる。構築物は前記の合衆国特許第５，７０７，６１８号の図３に示されている。
【０１４５】
トランスフェクション
以下に示すように、Ｐｒｏｍｅｇａの”Ｐｒｏｆｅｃｔｉｏｎ−Ｃａｌｃｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ”からの標準プロトコールを用いて、トランスフェクションを行った。
第１日： ６０ｍｍ皿上に２９３細胞を１ｘ１０６／皿で塗布し、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする。
第２日：
１．トランスフェクション４時間前、細胞からの培地を除き、それを４．５ｍｌの新しい増殖培地に置き換える。
２．ＤＮＡおよびＣａＣｌ２混合物
【表１】
を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ内に調製し、穏やかに混合する。混合物を、室温に１５ー３０分間、放置する。
３．３００μｌの２ｘＨＢＳでＤＮＡ−ＣａＣｌ２を沈殿させ、ＲＴで０．５−２時間インキュベートする。次いで、沈殿させたＤＮＡを細胞に加え、１６−１７時間インキュベートする。
第３日： 培地を交換する。
第５日： ６０ｍｍ皿から１００ｍｍの皿に細胞をスプリットする。
第７日： 細胞を１００ｍｍの皿から１５０ｍｍの皿にスプリットする。
第９日： それぞれのトランスフェクションから５プラークをピックアップする。
第１１日： ＥＶ＋ＲＩから１２のさらなるプラークを、ＥＶ＋Ａｆ１１１から１０のさらなるプラークをピックアップする。２５０μｌの増殖培地中でプラークを凍結解凍を３回繰り返し、−２０℃に保存した。
【０１４６】
組換えアデノウイルスの最初のスクリーニング
１．感染
第１日： 細胞を２４穴プレートに１．４ｘ１０５細胞／穴で塗布する。
第２日： ２００μｌのそれぞれのプラーク、３７℃／５％ＣＯ２で２時間、細胞を感染させ（約４０−５０％の集密度）、次いで、８００μｌの増殖培地を加える。細胞をインキュベーター内に置き、ＣＰＥが起こるまで、増殖させる。
第４日： ＣＰＥが進んだとき、それぞれのプレートの一つの穴を集菌する。
第５日： ＥＶ＋Ａｆ１１１の１０の穴から、およびＥＶ＋ＲＩの１３の穴からＣＰＥ細胞を洗浄除去する。
第８日： 残ったＣＰＥ細胞を洗浄除去する。
【０１４７】
ＣＰＥ細胞溶解物を３回凍結／解凍する。
【０１４８】
２．ＣＰＥ細胞溶解物からのウイスルＤＮＡの調製
２５０μｌのＣＰＥ
２５０μｌの２ｘプロテイナーゼＫ溶解バッファー
４０μｌの１０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ
細胞を３７℃で３時間インキュベートし、フェノール／クロロホルムで２回抽出した。サンプルを、２０℃ Ｏ／Ｎ、エタノールで沈殿させ、ペレットを２５μｌのｄｄＨ２Ｏ内に再懸濁した（溶解バッファー：４０ｍＭ ＥＤＴＡ、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、２％ＳＤＳ）。
【０１４９】
３．ウイルスＤＮＡ消化
２５μｌのＤＮＡを制限酵素ＢｃII、５０℃ Ｏ／Ｎで消化し、次いで、０．８％アガロース／ＴＢＥゲル上で分離した。全プラークは、真の組換え体であった。バックグラウンドはなかった。ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６アデノウイルスベクターと共に含まれるアデノウイルス配列の概要を図７に示す。このベクターは、Ａｄ２ＣＭＶＢｇａｌ−６骨格とほぼ同一であったが、Ｂ−ｇａｌ遺伝子は、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッド構築物で置き換えられていた。
【０１５０】
実施例６： ＨＩＦ−１α／ＮＦκＢハイブリッドトランスアクティベーター
実験１に記載の技術と類似の技術を用いて、我々は、ＨＩＦ−１αからのＤＮＡ結合ドメインおよびダイマー化ドメインならびにＮＦ−κＢからのトランス活性化ドメインを含むキメラトランスアクティベータータンパク質をコードする核酸配列を構築した。特に、ＮＦκＢのｐ６５サブユニットの活性化ドメインをコードするＤＮＡフラグメント（Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｍ．Ｌ．およびＢａｅｕｅｒｌｅ，Ｐ．Ａ．、１９９１、ＥＭＢＯ Ｊ．，１０．３８０５−３８１７；Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｍ．Ｌ．ら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２５６１３−２５６３０；Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｍ．Ｌ．ら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１５５７６−１５５８４）を、ＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅（ａｄｖａｎｔａｇｅ ｃＤＮＡ ＰＣＲキット、Ｃｌｏｔｅｃｈ）によって、作成した。次いで、ＤＮＡフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ−１α発現ベクターのＡｆｌ２とＸｂａＩ部位の間に挿入した。この構築物（ｐＨＩＦ−α／ＮＦ−κＢ）は、それ故、ＨＩＦ−１αのａａ１−３９０およびＨＦ−κＢ ｐ６５サブユニットのａａ４０７−５５１からなる。ＰＣＲによって生成した配列の完全性を、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。
【０１５１】
最初のインビトロでの発現は、ＨＩＦ−１α／ＮＦ−κＢハイブリッドの能力を上昇させるために行われ、ＨｅＬａ細胞内の内因性ＶＥＧＦ遺伝子の発現を活性化した。実施例３に記載した方法と類似の方法を用いて、ｐＨＩＦ−１α／ＮＦ−κＢ構築物を、ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６構築物と共に、ｐＨＩＦ−１α（全長、野生型ＨＩＦ−１α遺伝子）を対照として、平衡にＨｅＬａ細胞のプレート内に二重にトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後、ＨＩＦ−１α活性を誘導するために、１セットのプレートをデスフェリオキサミンに晒し、その他のセットは、処理しないままに置いた。培養液は、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステム）によるＶＥＧＦアッセイのために、誘導４８時間後に集菌した。図８上図に示すように、ｐＨＩＦ−１α／ＮＦ−κＢ構築物は、本質的に活性であるらしい、即ち、非誘導細胞内で検出されたＶＥＧＦレベルは、比較的高く、誘導されたｍｏｃｋ−トランスフェクト細胞のそれと等しかった。しかしながら、ｐＨＩＦ−１α／ＮＦ−κＢ構築物でトランスフェクトされた細胞内のＶＥＧＦ発現の全体レベルは、ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６でトランスフェクトされた細胞内で認められたそれほど高くはなかった。
【０１５２】
類似の実験が、Ｈｅｐ３Ｂ細胞内へのトランスフェクション後、ｐＨＩＦ−１α／ＮＦ−κＢによるエリトロポイエチン（ＥＰＯ）遺伝子発現のアップレギュレーションを評価するために、行われた。ＶＥＧＦと共に、ｐＨＩＦ−１α／ＮＦ−κＢでの細胞のトランスフェクションは、結果として非誘導下でも内因性ＥＰＯを発現したが、そのＥＰＯレベルは、ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６でトランスフェクトされた細胞内で認められたそれより低い（図８下図）。
【０１５３】
本発明は開示された実施態様に関連して記載されているが、様々な修飾を、本発明の精神から離れることなく作り出すことができることを理解すべきである。従って、本発明は、請求の範囲によってのみ制限される。
【０１５４】
参考文献
【表２】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】図１は、ハイブリッド構築物ｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６／Ａｆｌ２の制限マップを示す。
【図２】図２は、ハイブリッド構築物ｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６／ＲＩの制限マップを示す。
【図３】図３は、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッド構築物が、２９３細胞において、ＥＰＯまたはＶＥＧＦ遺伝子発現を活性化する能力を試験したアッセイ結果を示す。
【図４】図４は、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッド構築物が、ＨｅＬａ細胞において、ＥＰＯまたはＶＥＧＦ遺伝子発現を活性化する能力を試験したアッセイ結果を示す。
【図５】図５は、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッド構築物が、ＨｅＬａ細胞において、内因性ＶＥＧＦ遺伝子発現を活性化する能力を試験したアッセイ結果を示す。
【図６】図６は、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッド構築物が、２９３細胞において、ＥＰＯ（左）またはＶＥＧＦ（右）遺伝子発現を活性化する能力を試験した結果を示す。
【図７】図７は、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッドアデノウイルスベクターに含まれるアデノウイルス配列の図式を示す。
【図８】図８は、ＨＩＦ−１α／ＮＦκＢ構築物が、ＨｅＬａ細胞において内因性ＶＥＧＦ遺伝子発現（上）を、そしてＨｅｐ３Ｂ細胞において、内因性ＥＰＯ遺伝子発現（下）を活性化する能力を試験したアッセイ結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本出願は遺伝子発現を誘導するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血性心臓疾患は、心筋が適切な血液供給を受けず、そしてしたがって必要なレベルの酸素および栄養素が欠乏する際、発生する。虚血は、通常、心筋への血流を提供する冠状動脈の遮断を引き起こす、アテローム性硬化症の結果である。
虚血性心臓疾患は、心臓内の、有益である可能性がある特定の適応応答を生じる可能性がある。これらの応答の中には：１）遮断された冠状動脈の周りに側副（ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ）循環形成を導く、血管形成性増殖因子およびその受容体発現の増加；２）Ｏ2を必要としない代謝経路を活性化させる手段としての、解糖酵素発現の増加；および３）虚血組織を死から保護することが可能である、熱ショックタンパク質の発現がある。
【０００３】
これらの応答の少なくともいくつかは、複雑な酸素感受機構に制御されるようであり、該機構は最終的に、本適応に関与する必須遺伝子の発現を調節する転写因子の活性化を導く。この遺伝子発現の改変は、通常、病気の心臓に運動などの負担がかかったときにのみ発生する、低酸素症にのみ応答して発生するため、心臓病患者は、通常、この内因性保証機構から大きな利益は受けない。そのため、いくつかの慣用療法は、虚血に対する心臓の天然の治療応答を補足することを試みている。
【０００４】
例えば、こうした治療は、薬理学的療法、冠状動脈バイパス手術およびバルーン血管形成術などの技術を用いた経皮血管再生を含む。標準的な薬理学的療法は、心筋への血液供給を増加させるか、または心筋の酸素および栄養素に対する要求を減少させることかどちらかを伴う戦略に基礎を置く。
【０００５】
心筋層への血液供給の増加は、カルシウムチャンネル遮断剤またはニトログリセリンなどの剤により達成される。これらの剤は、動脈壁の平滑筋弛緩を引き起こすことにより、病気の動脈の直径を増加させると考えられる。心筋の酸素および栄養素に対する要求の減少は、心臓に対する血流力学的負荷を減少させる剤、例えば動脈拡張剤、または既定の血流力学的負荷に対する心臓の収縮反応を減少させるもの、例えばベータ−アドレナリン受容体アンタゴニストのどちらかにより達成される。
【０００６】
虚血性心臓疾患の外科的治療は、戦略的に置かれたバイパス移植片（通常、伏在静脈または内部乳房動脈移植片）での病気の動脈部分のバイパスに基づく。経皮血管再生は、病気の冠状動脈の狭窄を減少させるカテーテルの使用に基づく。これらの戦略はすべて、虚血症状の出現の数を減少させ、または該出現を根絶するために用いられるが、すべてさまざまな限界を有する。
【０００７】
より最近、虚血に対する心臓の天然応答をさらに増大するのに、タンパク質または遺伝子治療を介した血管形成性因子または熱ショックタンパク質の搬送が、提唱されてきている。実際、多様な刊行物により、心臓疾患の治療または予防のための遺伝子搬送の使用が議論されてきている。例えば、Ｍａｚｕｒら，“Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ”， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２１：１０４−１１１（１９９４）；Ｆｒｅｎｃｈ， Ｂ．Ａ．“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ”Ｈｅｒｚ． １８（４）：２２２−２２９（１９９３）；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，“Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｓｃｈｅｍｉｃ Ｈｅａｒｔ Ｄｉｓｅａｓｅ”， Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ． ３０６：１２９−１３６（１９９３）；ＳｃｈｎｅｉｄｅｒおよびＦｒｅｎｃｈ“Ｔｈｅ Ａｄｖｅｎｔ ｏｆ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅ”Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８８：１９３７−４２（１９９３）を参照されたい。“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｃａｒｄｉａｃ ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ”と題された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／１１１３３号は、心臓血管平滑筋の機能を制御するためのアデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）媒介遺伝子運搬の使用を報告している。
【０００８】
したがって、当技術分野には、虚血関連細胞において有益な低酸素症誘導性遺伝子発現を誘導するための組成物および方法に対する必要性が存在する。さらに、生物学的に活性がある哺乳動物転写因子の持続直接発現により活性化される多様な潜在的に有益な遺伝子の効率的な発現を可能にする、新規ベクター組成物に対する必要性が存在する。本発明はこれらの必要性を満たし、そして関連する利点もまた提供する。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、哺乳動物低酸素症誘導性因子タンパク質であるＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、および転写活性化タンパク質の機能的な転写活性化ドメインを含む、キメラトランス活性化因子をコードする組換え核酸分子を提供する。
【００１０】
したがって、本発明の作成において、我々は血管疾患に関連した虚血治療のための代替アプローチとして、低酸素症に対する適応応答を利用しようと求めた。我々は、遺伝子治療を介した修飾ＨＩＦ−１α転写因子の投与が、潜在的に有益な多様な遺伝子の発現を誘導し、そして究極的に虚血組織の新規血管新生を導く可能性があると考えた。我々は、ＨＩＦ−１α由来のＤＮＡ結合およびダイマー化ドメインおよび単純疱疹ウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）ＶＰ１６タンパク質由来のトランス活性化ドメインからなる、ＨＩＦ−１αの構成的な活性化型を生成した。本修飾転写因子の標的遺伝子となる可能性があるものの中に、内皮細胞特異的分裂促進物質および血管形成の強力な刺激物質であるＶＥＧＦがある。
【００１１】
本発明のＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッド転写因子のｉｎ ｖｉｔｒｏ解析により、ＨｅＬａおよびＣ６細胞において、ＶＥＧＦまたはＥＰＯプロモーターのいずれかの転写調節下でのルシフェラーゼ・レポーター構築物の活性化と共に、内因性ＶＥＧＦ遺伝子発現の上方制御が誘導と独立していることが立証された。ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６をコードするプラスミドの外因性投与が、側副血管形成を亢進することが可能であるという仮説を試験し、そしてまた血管形成療法としてのＨＩＦ−１α／ＶＰ１６の効力をＶＥＧＦのものと比較するため、ウサギ後肢虚血モデルで実験を行った。これらの研究結果により、転写因子をコードするＤＮＡの投与は、組織虚血に対する実行可能な治療戦略を代表する可能性があることが示唆される。
【００１２】
本発明はまた、哺乳動物細胞において、生物学的に活性があるキメラヒト・ウイルストランス活性化タンパク質を感染させおよび／またはトランスフェクションし、そして発現を持続することが可能な組換えウイルスおよび非ウイルスベクターも提供する。
【００１３】
本発明はさらに、組換えプラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６／Ａｆｌ２）を提供する。
【００１４】
別の態様において、本発明は組換えプラスミド発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６／ＲＩ）を提供する。
【００１５】
さらに別の態様において、本発明は、ｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６／Ａｆｌ２またはｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６／ＲＩでトランスフェクションした哺乳動物細胞および細胞株を提供する。
【００１６】
さらに別の態様において、本発明は、持続したレベルで、生物学的に活性があるキメラヒト・ウイルストランス活性化タンパク質を発現することが可能な組換え哺乳動物細胞株を提供する。
【００１７】
本発明はまた、持続したレベルで、生物学的に活性があるキメラヒト・ウイルストランス活性化タンパク質を発現しそして分泌することが可能な組換え哺乳動物宿主細胞株も提供する。
【００１８】
さらに別の態様において、本発明は、ＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、ここでＤＮＡ結合タンパク質は哺乳動物低酸素症誘導性因子１α（ＨＩＦ−１α）タンパク質である、をアミノ末端に、そして転写活性化タンパク質の機能的な転写活性化ドメイン、ここで前記転写活性化タンパク質はＨＳＶ ＶＰ１６である、をカルボキシ末端に含む、融合タンパク質を提供する。
【００１９】
本発明はさらに、ＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、ここで前記ＤＮＡ結合タンパク質は哺乳動物低酸素症誘導性因子１α（ＨＩＦ−１α）タンパク質である、および転写活性化タンパク質の機能的な転写活性化ドメイン、ここで前記転写活性化タンパク質はＨＳＶ ＶＰ１６である、を含む、キメラトランス活性化因子をコードする組換えＤＮＡを発現する、非ヒトトランスジェニック哺乳動物を提供する。
【００２０】
さらに別の態様において、本発明は、低酸素症誘導性遺伝子の発現を増加させるための方法を提供する。
【００２１】
さらに別の態様において、本発明は、酸素正常条件下で、生物学的に活性があるＨＩＦ−１αの持続発現を提供するための方法を提供する。
【００２２】
本発明はまた、患者における低酸素症関連組織損傷を治療する／予防する／調節するための方法も提供する。
【００２３】
本発明はさらに、個体の細胞に、生物学的に活性があるキメラヒト・ウイルストランス活性化タンパク質を提供するための方法であって、個体の細胞にトランスフェクションし、そして生物学的に活性があるキメラヒト・ウイルストランス活性化タンパク質発現を持続するのに有効な量のｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６／ＲＩまたはｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６／Ａｆｌ２を、該細胞に導入することを含む、前記方法を提供する。
【００２４】
本発明のさらなる特徴および利点は、以下の詳細な説明と共に請求項から明らかになるであろう。
【００２５】
本明細書に引用されるすべての特許出願、特許、および参考文献は、本明細書に完全に援用される。矛盾または不一致の場合、定義を含む本明細書中の説明が優先する。
【００２６】
発明の詳細な説明
低酸素症（Ｏ2要求が供給を上回る状態）は遺伝子発現の強力な調節要因である。低酸素症に対する生理学的応答には、赤血球生成の亢進（Ｊｅｌｋｍａｎ，
Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７２：４４９−４８９（１９９２））、虚血組織における新規血管新生（Ｗｈｉｔｅら， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ７１：１４９０−１５００（１９９２））および解糖に基づく代謝へのスイッチ（Ｗｏｌｆｅら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３５：４０５−４１２（１９８３））が含まれる。これらの適応応答は、Ｏ2搬送を増加させるか、またはＯ2を必要としない代替代謝経路を活性化するかどちらかである。これらの過程に関与する遺伝子産物には、例えば：（ｉ）赤血球生成の主要な制御因子であり、そしてしたがって血液Ｏ2運搬能力の主要な決定要素であるエリスロポエチンをコードするＥＰＯ（Ｊｉａｎｇら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１（３０）：１７７７１−７８（１９９６））；（ｉｉ）血管形成の主要な制御因子であり、そしてしたがって組織灌流の主要な決定要素である、血管内皮増殖因子をコードする、ＶＥＧＦ（Ｌｅｖｙら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１３３３３（１９９５）；Ｌｉｕら， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ７７：６３８（１９９５）；Ｆｏｒｓｙｔｈｅら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １６：４６０４（１９９６））；（ｉｉｉ）Ｏ2の非存在下でＡＴＰ生成の代謝経路を提供する解糖酵素、アルドラーゼ１、エノラーゼ１、乳酸デヒドロゲナーゼＡ、ホスホフルクトキナーゼＬ、およびホスホグリセリン酸キナーゼ１をそれぞれコードする、ＡＬＤＡ、ＥＮＯ１、ＬＤＨＡ、ＰＦＫＬ、およびＰＧＫ１（Ｆｉｒｔｈら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ９１：６４９６（１９９４）；Ｆｉｒｔｈら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：２１０２１（１９９５）；Ｓｅｍｅｎｚａら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：２３７５７（１９９４））；（ｉｖ）それぞれが血管作動性分子である一酸化炭素および一酸化窒素の合成を担う、ヘムオキシゲナーゼ１および誘導性一酸化窒素シンターゼをコードする、ＨＯ１およびｉＮＯＳ（Ｌｅｅら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：５３７５；Ｍｅｌｉｌｌｏら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８２：１６８３（１９９５））が含まれる。
【００２７】
これらの応答の重要な媒介因子は、ＤＮＡ結合の低酸素症誘導性因子タンパク質を含む転写複合体と、その同系のＤＮＡ認識部位である低酸素症誘導性遺伝子のプロモーター／エンハンサー領域内に位置する低酸素症応答要素（ＨＲＥ）との相互作用である。ＨＲＥは低酸素症誘導性因子タンパク質結合部位（コア配列として５’−ＣＧＴＧ−３’を含む）と共に、機能に必要なさらなるＤＮＡ配列からなり、それはある要素では第二の結合部位を含む。
【００２８】
ＨＩＦ−１は、２つのサブユニット：（ｉ）構成的に発現されるベータ（β）サブユニット（他の関連する転写因子と共有されている）および（ｉｉ）低酸素症条件の間のみ高レベルのアルファサブユニットが検出されるように、翻訳後機構により蓄積が制御されている、アルファ（α）サブユニット（例えば、ＨＩＦ−１αの最近のアフィニティー精製および分子クローニングを記載する、ＷＯ ９６／３９４２６、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２５１号を参照されたい）からなるヘテロ二量体タンパク質である。どちらのサブユニットも、転写因子の塩基性へリックス・ループ・へリックス（ｂＨＬＨ）・ＰＡＳファミリーのメンバーである。これらのドメインはＤＮＡ結合およびダイマー化を制御する。トランス活性化ドメインは、タンパク質のＣ末端に存在すると考えられる。
【００２９】
ＨＩＦ−１β（ＡＲＮＴ）は、高レベルで構成的に発現される一方、ＨＩＦ−１αの細胞内蓄積はＯ2濃度に感受性であり、低酸素症の間のみ高レベルで検出される。本観察からは、Ｏ2濃度がセンサータンパク質により検出され、そして複雑な情報伝達機構を通じＨＩＦ−１αサブユニットの安定化が導かれるという、標的遺伝子活性化の機構の提唱につながった。その後、ＨＩＦ−１αは、ＨＩＦ−１βと複合体を形成することが可能になり、そして標的遺伝子のプロモーター／エンハンサー内のＨＲＥ部位に選択的に結合する。この応答を与えるのに関与するＨＩＦ−１αタンパク質の領域は、トランス活性化に関与する領域と一致すると考えられる。
【００３０】
低酸素症に応答したＨＩＦ−１の活性化の誘導は、ＨＩＦ−１αタンパク質の安定化を介して起こると考えられる。この応答に関与するＨＩＦ−１αの領域は、タンパク質のＣ末端に位置決定されており、そしてトランス活性化ドメインと重なる。例えば、Ｊｉａｎｇら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１（３０）：１７７７１−７８（１９９６）は、アミノ酸３９０で切除されている（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ＨＩＦ−１αはトランス活性化活性を失うが、ＤＮＡ結合能力を保持し、そして酸素正常および低酸素条件下両方で高レベルのタンパク質を示すことを示した。本結果により、トランス活性化ドメインと共に、酸素正常で不安定さを与える領域もタンパク質のＣ末端側に存在することが示唆された。Ｐｕｇｈら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２（１７）：１１２０５−１４（１９９７）は、関与する領域をさらに、２つの領域、アミノ酸５４９−５８２および７７５−８２６に位置決定した。
【００３１】
１つの態様において、本発明は、ＤＮＡと結合しおよびＨＩＦ−１β（ＡＲＮＴ）とダイマー化するのに十分なＨＩＦ−１αタンパク質のドメインおよび転写活性化が可能なタンパク質ドメインとを含む、生物学的に活性があるキメラトランス活性化タンパク質をコードする核酸分子を提供する。
【００３２】
別の態様において、関連するＤＮＡ結合性の低酸素症誘導性因子タンパク質はＥＰＡＳ１である。ＥＰＡＳ１は内皮ＰＡＳ−１と称されるＰＡＳドメイン転写因子である。Ｔｉａｎら， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １１：７２（１９９７）。ＥＰＡＳ１はＨＩＦ−１αと４８％の同一性および転写因子のｂＨＬＨ／ＰＡＳドメインファミリーの他のメンバーとより低い類似性を共有する（ＥＰＡＳ１ヒト配列ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第Ｕ８１９８４号；マウス配列ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第Ｕ８１９８３号）。ＨＩＦ−１α同様、ＥＰＡＳ１は、元来ＥＰＯ遺伝子から単離され、そしてＨＲＥコア配列を含むＤＮＡ要素に結合し、そして該要素からの転写を活性化する。ＥＰＡＳ１はまた、標的遺伝子の転写活性化前にＡＲＮＴとヘテロ二量体性複合体を形成する。
【００３３】
ヒトおよびネズミＥＰＡＳ１は、ＨＩＦ−１αと広い一次アミノ酸配列同一性を共有する（４８％）。２つのタンパク質の間の配列保存性は、ｂＨＬＨ（８５％）、ＰＡＳ−Ａ（６８％）、およびＰＡＳ−Ｂ（７３％）領域で最も高い。配列同一性の第二の領域は、ＥＰＡＳ１およびＨＩＦ−１αタンパク質の極Ｃ末端に現れる。ｍＨＩＦ−１α内のこの保存領域は、低酸素症応答ドメインを含むことが示されてきている（Ｌｉら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１（３５）：２１２６２−６７（１９９６））。ＥＰＡＳ１およびＨＩＦ−１αの間の高度の配列類似性により、これらが共通の生理学的機能を共有することが示唆される。低酸素条件は、ＨＩＦ−１αがＨＲＥコア配列を含む標的遺伝子をトランス活性化する能力を刺激する。ＥＰＡＳ１の活性もまた、低酸素条件下で増殖する細胞で亢進され、ＥＰＡＳ１がＨＩＦ−１αと同一の制御影響にさらされる可能性があることが示唆される。
【００３４】
本発明のさらに別の態様において、転写因子としての、ＤＮＡ結合性の低酸素症誘導性因子タンパク質はＨＬＦである。ＨＬＦはＨＩＦ−１α様因子と称されるｂＨＬＨ−ＰＡＳタンパク質である。Ｅｍａら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ９４：４２７３（１９９７）。ＨＬＦは計算分子量が９７ｋＤａである、８７４アミノ酸の新規ポリペプチドである（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第Ｄ８９７８７号）。配列比較により、該アミノ酸配列は、ｂＨＬＨ（８３．９％）およびＰＡＳ（６６．５％）モチーフを含むアミノ末端側（ａａ１−３４４）でＨＩＦ−１αと著しい類似性を有し、その後、中程度の類似性を持つ配列が続く（３６．４％、ａａ３４５−５５９）。Ｃ末端側半分の配列のほとんどは、本タンパク質およびＨＩＦ−１αの間で多様である一方、極Ｃ末端で注目される配列類似性の小部分（６３％、ａａ８２４−８７４）が見出された。ＤＮＡ認識に関与するｂＨＬＨ領域の塩基性アミノ酸が、ＨＬＦおよびＨＩＦ−１αで完全に保存されていることは、これらの因子が、同一でなくても非常に類似の制御ＤＮＡ配列を認識することを示唆する。実験により、ＨＬＦおよびＨＩＦ−１αの両方がＡＲＮＴと一緒になって、同様の親和性でＶＥＧＦおよびＥＰＯ ＨＲＥ配列に結合することが示された。
【００３５】
別の態様において、本発明のキメラトランス活性化タンパク質は、非哺乳動物低酸素症誘導性因子タンパク質のドメインを含む。当業者に認識されるであろうように、低酸素症に対する適応応答は、進化の間中、非常に保存されてきた可能性がある。したがって、低酸素症誘導性因子タンパク質は、非哺乳動物脊椎動物および非脊椎動物、例えば昆虫を含む多様な種で出現することが期待されるであろう。例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）由来のＳｉｍａ塩基性へリックス・ループ・へリックスＰＡＳタンパク質および哺乳動物ＨＩＦ−１αタンパク質の間の機能的な類似性を報告する、Ｂａｃｏｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．， ２４９：８１１−８１６（１９９８）を参照されたい。
【００３６】
非哺乳動物低酸素症誘導性因子タンパク質の核酸およびアミノ酸配列は、当業者により、多様な技術により、例えば、本明細書に引用される配列のすべてまたは一部を用いたクロスハイブリダイゼーションまたは増幅により、得ることが可能である。ひとたび、候補低酸素症誘導性因子タンパク質をコードする配列が決定されたら、ＨＲＥに結合し、そしてＨＩＦ−１βとダイマー化するのに十分なタンパク質の部分の位置を、例えば、ヒトＨＩＦ−１αタンパク質内のこれらのドメインの位置決定に用いたのと同じ種類の技術を用い、決定してもよい。本発明の組成物および方法に有用な、非哺乳動物低酸素症誘導性因子タンパク質の適切なドメインはまた、合成により産生しても、または既知の哺乳動物低酸素症誘導性因子タンパク質をコードするＤＮＡの部位特異的操作により産生してもよい。また、多様な哺乳動物および非哺乳動物低酸素症誘導性因子タンパク質の間で共通な配列モチーフがあれば、おそらくいかなる種でも天然には発生しないであろうが、本発明の方法および組成物に有用なドメインを生じるであろうコンセンサス配列を示唆するであろう。本明細書に例証されるヒトＨＩＦ−１αタンパク質ドメインに対し、こうした非哺乳動物低酸素症誘導性因子タンパク質ドメインを置換するために必要とされるのは、これらがＨＲＥと結合し、そしてＨＩＦ−１β（ＡＲＮＴ）とダイマー化するのが可能なことのみである。
【００３７】
したがって、低酸素症誘導性因子タンパク質を、Ｃ末端（トランス活性化）ドメインを除去し、そしてそれを強力なトランス活性化配列と置換することにより修飾することが提案される。この修飾は、該タンパク質がβ／ＡＲＮＴサブユニットとダイマー化する、または特定のＤＮＡ配列（例えばＨＲＥ）と結合する能力を変化させてはならないが、該低酸素症誘導性因子タンパク質を、潜在的に治療力がある遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ、ＥＰＯ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、およびそれらに匹敵するもの）の構成的な誘導因子に変換してもよい。
【００３８】
低酸素症誘導性因子タンパク質のＣ末端（またはトランス活性化）領域の、例えば、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）ＶＰ１６または酵母転写因子ＧＡＬ４およびＧＣＮ４などの転写活性化タンパク質由来の強力なトランス活性化ドメインでの置換を、酸素正常条件下で該タンパク質を安定化し、そして強力で構成的な転写活性化を提供するために設計した。遺伝子治療を介した、本タンパク質の患者の細胞への投与は、冠状動脈疾患、末梢血管疾患並びに、四肢の虚血性疾患による慢性虚血に対する、効果的な治療または予防法であるはずである。
【００３９】
本出願において、目的は、低酸素症誘導性因子タンパク質、例えばＨＩＦ−１α、ＥＰＡＳ１およびＨＬＦが低酸素症誘導性遺伝子、例えばＶＥＧＦおよびそれに匹敵するものの発現を誘導し、側副血管増殖の促進を通じ、症状の改善を生じる能力である。
【００４０】
例えば、ＨＩＦ−１αサブユニットは、酸素正常条件中、不安定であるが、正常酸素レベル下で培養される細胞中の本サブユニットの過剰発現により、通常、低酸素症により誘導される遺伝子の発現を誘導することが可能である。これにより、有用な遺伝子治療戦略は、組換えプラスミドまたはウイルスベクターを用い、ｉｎ ｖｉｖｏで虚血心臓において高レベルのＨＩＦ−１αサブユニットを発現するものである可能性があることが示唆される。代替戦略は、ＨＩＦ−１αサブユニットを修飾して、もはや酸素正常条件により不安定化されず、したがって、特に治療されている患者が実際には虚血でない場合も、より強力であるようにするものであろう。
【００４１】
低酸素症誘導性因子タンパク質を、酸素正常条件下で安定化し、そして強力で構成的な転写活性化を提供するため、ＨＩＦ−１α由来のＤＮＡ結合およびダイマー化ドメイン並びに単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）ＶＰ１６タンパク質由来のトランス活性化ドメインからなるハイブリッド／キメラ融合タンパク質を構築した。遺伝子治療を介した、本ハイブリッド／キメラの患者の細胞への投与は、理論的には、通常、低酸素症に応答し、上方制御される遺伝子（すなわち、ＶＥＧＦおよびそれに匹敵するもの）の発現を誘導するであろう。
【００４２】
あるいは、生物学的に活性があるキメラトランス活性化タンパク質、例えばＨＩＦ−１α由来のＤＮＡ結合およびダイマー化ドメイン並びにヒトＮＦκＢタンパク質由来のトランス活性化ドメインを含むタンパク質も、同様の結果を生じると期待される。
【００４３】
「低酸素症」は、Ｏ2要求が供給を上回る状態を意味する。
【００４４】
「低酸素症誘導性遺伝子」は、配列内に、低酸素症細胞における転写活性化を媒介する、１つまたはそれ以上の低酸素症応答要素（ＨＲＥ；結合部位）を含む遺伝子を意味する。
【００４５】
低酸素症誘導性因子は、その発現が低酸素症条件下で上方制御され、遺伝子内の低酸素症応答要素コア配列を認識し、そして該配列に結合し、そしてそれによりこうした遺伝子を活性化するＤＮＡ結合タンパク質／転写因子を意味する。
【００４６】
低酸素症関連障害には、例えば、虚血性心臓疾患、末梢血管疾患、四肢の虚血性疾患、およびそれらに匹敵するものが含まれる。
【００４７】
「核酸」（ポリヌクレオチドとも呼ばれる）という用語は、ＲＮＡと共に一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む。
【００４８】
核酸はまた、例えばＨＩＦ−１α、ＥＰＡＳ１、またはＨＬＦ配列由来の、センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を含む、単離核酸配列も含む。ＨＩＦ−１α、ＥＰＡＳ１、またはＨＬＦ由来配列はまた、プロモーター、エンハンサー、応答要素、シグナル配列、ポリアデニル化配列、およびそれらに匹敵するものを含む、異種性配列と結合させてもよい。本明細書において、「単離」という句は、天然に発生しない形であるポリヌクレオチドを意味する。ポリヌクレオチドを単離する１つの手段は、当業者に周知の方法を用い、天然または人工的に設計されたＤＮＡプローブで、ヒト組織特異的ライブラリーを探査する（ｐｒｏｂｅ）ことである。ヒトＨＩＦ−１α遺伝子、ＥＰＡＳ１、またはＨＬＦ遺伝子由来のＤＮＡプローブは、本目的に特に有用である。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡおよびｃＤＮＡ分子を用い、以下により詳細に記載される方法により、ヒト、哺乳動物、または他の動物供給源から、相補的ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを得ても、またはｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、関連するｃＤＮＡまたはゲノムクローンを単離してもよい。
【００４９】
さらに、該核酸を修飾し、安定性、可溶性、結合親和性、および特異性を改変してもよい。例えば、本発明由来の配列はさらに、ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、およびメチルホスホネート誘導体や、さらには、Ｎｉｅｌｓｅｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５４：１４９７（１９９１）に記載されるような、塩基をアミノ酸骨格に結合することにより形成される「タンパク質核酸（ＰＮＡ）」を含んでもよい。該核酸は、α−アノマー・ヌクレオチドの連結により、またはメチルもしくはエチルホスホトリエステルまたはアルキルホスホロアミデート連結の形成により、誘導体化してもよい。さらに、本発明の核酸配列はまた、直接または間接的に、検出可能なシグナルを提供することが可能な標識で修飾してもよい。典型的な標識には、放射性同位体、蛍光分子、ビオチン、およびそれらに匹敵するものが含まれる。
【００５０】
一般的に、本発明にしたがった核酸操作は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第二版（ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９）、またはＡｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ニューヨーク州ニューヨーク，１９９２）に開示されるような、当業者に周知の方法を用いる。
【００５１】
本発明はまた、ヒトＨＩＦ−１α、ＥＰＡＳ１、またはＨＬＦをコードする核酸とは異なるが、同一の表現型、すなわちそれぞれ、実質的に同一のアミノ酸配列を有する核酸も含む。表現型が類似である核酸はまた、「機能的に同等である核酸」とも称される。本明細書において、「機能的に同等である核酸」という句は、本明細書に開示される核酸と、同一のまたは実質的に同一のタンパク質産物を、実質的に同一の方式で産生するよう機能するであろう、わずかでそして重大でない配列変動により特徴付けられる核酸を含む。特に、機能的に同等である核酸は、本明細書に開示されるものと同一である、または保存的アミノ酸変動を有するタンパク質をコードする。例えば、保存的変動には、非極性残基の別の非極性残基での置換、または荷電残基の同様に荷電されている残基での置換が含まれる。これらの変動には、当業者により、タンパク質の三次構造を実質的に改変しないものと認識されるものが含まれる。
【００５２】
構造遺伝子は、タンパク質、ポリペプチドまたはその断片をコードするＤＮＡ部分を含み、そして転写開始を指示する５’配列を除く、遺伝子部分である。構造遺伝子は、通常細胞に見られるものであってもよく、または異種性遺伝子と呼ばれるものである場合、導入される細胞部位に通常見られないものであってもよい。異種性遺伝子は、全体的にまたは部分的に、細菌ゲノムまたはエピソーム、真核、核またはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡまたは化学的に合成されたＤＮＡを含む、当業者に知られるいかなる供給源由来であってもよい。構造遺伝子は、コードまたは非翻訳領域のどちらにおいても、発現産物の生物学的活性もしくは化学構造、発現速度または発現調節方式に影響を与える可能性がある、１つまたはそれ以上の修飾を含んでもよい。こうした修飾には、限定されるわけではないが、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失および置換が含まれる。構造遺伝子は、中断されないコード配列を構成してもよいし、または適切なスプライス連結部(splice junction)が結合している１つまたはそれ以上のイントロンを含んでもよい。構造遺伝子は、天然に存在するかまたは合成の、複数の供給源由来の部分の複合物であってもよい。構造遺伝子はまた、融合タンパク質をコードしてもよい。構造遺伝子／トランス活性化因子複合体を含む組換えＤＮＡ分子の導入は、構造遺伝子およびトランス活性化因子が各々、異なる供給源または種由来である構築物を含むことが意図される。
【００５３】
真核転写因子は、しばしば、別個のそして独立したＤＮＡ結合および転写活性化ドメインからなる（ＭｉｔｃｈｅｌｌおよびＴｊｉａｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：３７１−３７８（１９８９））。ドメインが独立していることにより、異種性タンパク質のＤＮＡ結合および活性化ドメインからなる機能的な融合タンパク質の生成が可能になってきている。ｌｅｘＡ ＤＮＡ結合タンパク質および酵母転写因子ＧＡＬ４の活性化ドメインからなるキメラ真核制御タンパク質が、ＢｒｅｎｔおよびＰｔａｓｈｎｅにより構築された（Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６１２−６１５（１９８５））。融合タンパク質の使用は、転写活性化因子として作用するいくつかの種類のタンパク質ドメインを同定してきている。これらのドメインはアミノ酸類似性をほとんど持たないが、しばしば非常に酸性（ＧＡＬ４およびＧＮＣ４の場合のように）、グルタミン・リッチ（Ｓｐ１の場合のように）、またはプロリン・リッチ（ＮＦ１の場合のように、ＭａおよびＰｔａｓｈｎｅ， Ｃｅｌｌ ５１：１１３−１１９（１９８７）；ＣｏｕｒｅｙおよびＴｊｉａｎ（１９８８）；Ｍｅｒｍｏｎｄら， Ｃｅｌｌ ５８：７４１−７５３（１９８９））のいずれかであるとして特徴付けられる。
【００５４】
最も効果的な、既知の活性化ドメインの１つは、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）ビリオンタンパク質１６（ＶＰ１６；Ｓａｄｏｗｓｋｉら， Ｎａｔｕｒｅ ３３５：５６３−５６４（１９８８）；Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇら， Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ． ２：７１８−７２９（１９８８））のカルボキシル末端１００アミノ酸に含まれる。ＶＰ１６は、Ｖｍｗ６５またはアルファ−遺伝子トランス誘導因子としても知られるＨＳＶの構造タンパク質で、ＩＣＰＯおよびＩＣＰ４に対するものを含む、該ウイルスの極初期プロモーターの転写を活性化する（Ｃａｍｐｂｅｌｌら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８０：１−１９（１９８４）；ＫｒｉｓｔｉｅおよびＲｏｉｚｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ８１：４０６５−４０６９（１９８４）；Ｐｅｌｌｅｔら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ８２：５８７０−５８７４（１９８５））。ＶＰ１６は、いわゆるＴＡＡＴＧＡＲＡＴ要素を含むプロモーターを特異的に活性化するが、該特異性は、ＶＰ１６のアミノ末端ドメインと複合体を形成する細胞性ＤＮＡ結合タンパク質により与えられる（ＭｃＫｎｉｇｈｔら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ８４：７０６１−７０６５（１９８７）；Ｐｒｅｓｔｏｎら， Ｃｅｌｌ ５２：４２５−４３４（１９８８））。
【００５５】
本発明は、ＤＮＡ結合タンパク質の機能的な部分および転写活性化タンパク質の機能的な部分を含む、新規ハイブリッド／キメラトランス活性化タンパク質を提供する。本発明のハイブリッド／キメラトランス活性化タンパク質は、低酸素症応答要素（ＨＲＥ）を含む低酸素症誘導性遺伝子発現の特異的な活性化、それによる非常に高いレベルの遺伝子発現の達成を含む、多様な利点を提供する。本発明のハイブリッド／キメラトランス活性化タンパク質は、脊椎動物細胞を含む真核細胞由来の天然発生転写トランス活性化タンパク質またはタンパク質のドメイン、ウイルストランス活性化タンパク質、あるいは脊椎動物細胞で機能することが可能であり、そして脊椎動物プロモーターからの転写を刺激することが可能な、いかなる合成アミノ酸配列も含んでもよい。こうしたトランス活性化タンパク質の例には、限定されるわけではないが、Ｍｕｌｌｅｒらに同定されたリンパ系特異的転写因子（Ｎａｔｕｒｅ ３３６：５４４−５５１（１９８８））、ｆｏｓタンパク質（Ｌｕｃｉｂｅｌｌｏら， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３：４３−５２（１９８８））；ｖ−ｊｕｎタンパク質（Ｂｏｓら， Ｃｅｌｌ ５２：７０５−７１２（１９８８））；因子ＥＦ−Ｃ（Ｏｓｔａｐｃｈｕｋら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ９：２７８７−２７９７（１９８９））；ＨＩＶ−１ ｔａｔタンパク質（Ａｒｙａら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：６９−７３（１９８５））、パピローマウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）Ｅ２タンパク質（Ｌａｍｂｅｒｔら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：３１５１−３１５４（１９８９））、アデノウイルスＥ１Ａタンパク質（ＦｌｉｎｔおよびＳｈｅｎｋ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．（１９８９）に概説される）、熱ショック因子（ＨＳＦ１およびＨＳＦ２）（Ｒａｂｉｎｄｒａｎら， ＰＮＡＳ ８８：６９０６−６９１０（１９９１））；ｐ５３タンパク質（Ｌｅｖｉｎｅ， Ｃｅｌｌ ８８：３２３−３３１（１９９７）、ＫｏおよびＰｒｉｖｅｓ， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １０：１０５４−１０７２（１９９６））；Ｓｐ１（Ｋａｄｏｎａｇａら， Ｃｅｌｌ ５１：１０７９−１０９０（１９８７））；ＡＰ１（Ｌｅｅら， Ｎａｔｕｒｅ ３２５：３６８−３７２（１９８７））；ＣＴＦ／ＮＦ１（Ｍｅｒｍｏｄら， Ｃｅｌｌ ５８：７４１−７５３（１９８９））、Ｅ２Ｆ１（Ｎｅｕｍａｎら， Ｇｅｎｅ １７３：１６３−１６９（１９９６））；ＨＡＰ１（Ｐｆｅｉｆｅｒら， Ｃｅｌｌ ５６：２９１−３０１（１９８９））；ＨＡＰ２（Ｐｉｎｋｈａｍら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７：５７８−５８５（１９８７））；ＭＣＭ１（Ｐａｓｓｍｏｒｅら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０４：５９３−６０６（１９８８））；ＰＨＯ２（ＳｅｎｇｓｔａｇおよびＨｉｎｎｅｎ， ＮＡＲ １５：２３３−２４６（１９８７））；およびＧＡＬ１１（Ｓｕｚｕｋｉら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：４９０１−４９９９（１９８８））が含まれる。本発明の好ましい態様において、トランス活性化タンパク質は単純疱疹ウイルスＶＰ１６（Ｓａｄｏｗｓｋｉら， Ｎａｔｕｒｅ ３３５：５６３−５６４（１９８８）；Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇら， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ． ２：７１８−７２９（１９８８））、ＮＦκＢ（ＳｃｈｍｉｔｚおよびＢａｅｕｅｒｌｅ，ＥＭＢＯ Ｊ． １０：３８０５−３８１７（１９９１）；Ｓｃｈｍｉｔｚら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：２５６１３−２５６２０（１９９４）；およびＳｃｈｍｉｔｚら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１５５７６−１５５８４（１９９５））、および酵母活性化因子ＧＡＬ４およびＧＣＮ４である。
【００５６】
もちろん、当業者は、本発明の組成物および方法に有用な転写活性化ドメインもまた、合成でも、すなわち既知の天然発生タンパク質内に含まれない配列に基づいてもよいことを理解するであろう。例えば、転写活性化は、本質的に柔軟な過程であり、特定の構造または立体特異的タンパク質接触に対する必要性はあるとしてもわずかであることを解説する、ＰｏｌｌｏｃｋおよびＧｉｌｍａｎ， ＰＮＡＳ ９４：１３３８８−１３３８９（１９９７）を参照されたい。該文献はまた、転写活性化因子として機能することが可能な多様な異なる分子を概説し、該分子には短ペプチドモチーフ（８アミノ酸であるほど小さい）、単純な両親媒性らせんおよび転写活性化に関係がないタンパク質の突然変異ドメインでさえ含まれる。
【００５７】
本発明にしたがい、ＤＮＡ結合タンパク質およびトランス活性化タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、各々の、それぞれ結合およびトランス活性化特性を保持するよう、結合させる。本発明の多様な態様において、トランス活性化タンパク質、または転写活性化が可能なその部分をコードするＤＮＡを、前記ＤＮＡ結合タンパク質の機能を完全には混乱させない遺伝子座でＤＮＡに挿入してもよい。ＤＮＡ結合タンパク質または転写トランス活性化タンパク質の機能に必要でない領域は、他のより機能的に適切な分子の部分より突然変異に対する感受性が低いと推定され、マップされる突然変異解析と共にマップされる突然変異を欠く領域の同定を含む、当業者に知られるいかなる方法により、同定してもよい。Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）））に示されるものを含む、分子生物学の標準的な技術を用い、適切な組換え構築物を産生してもよい。
【００５８】
キメラトランス活性化タンパク質をコードする組換えＤＮＡ構築物は、適切なプロモーターおよび／または他の発現調節配列の調節下に置いても（すなわち該配列に機能可能であるように連結しても）よい。トランス活性化タンパク質が構成的に活性があるプロモーター配列の調節下に置かれることが望ましい可能性があるが、前記トランス活性化タンパク質はまた、メタロチオネインプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２（１９８２））または組織特異的プロモーターなどの誘導性プロモーターの調節下に置いてもよい。本発明にしたがい用いてもよいプロモーター配列には、限定されるわけではないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０（１９８１））、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）の末端反復配列（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら， Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７（１９８０））、ヘルペス・チミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｕ．Ｓ．Ａ． ７８：１４４−１４４５（１９８１））、ヒトサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）極初期プロモーター／エンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔら， Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））、および組織特異性を示し、そしてトランスジェニック動物で利用されてきている以下の動物転写調節領域：膵臓腺房（ａｃｉｎａｒ）細胞で活性があるエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Ｓｗｉｆｔら， Ｃｅｌｌ ３８：６３９−６４６（１９８４）；Ｏｒｎｉｔｚら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５（１９８７））；膵臓ベータ細胞で活性があるインスリン遺伝子調節領域（Ｈａｎａｈａｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−１２２（１９８５））、リンパ系細胞で活性がある免疫グロブリン遺伝子調節領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら， Ｃｅｌｌ ３８：６４７−６５８（１９８４）；Ａｄａｍｅｓら， Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−５３８（１９８５）；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７：１４３６−１４４４（１９８７））、精巣、乳房、リンパ系およびマスト細胞で活性があるマウス乳癌ウイルス調節領域（Ｌｅｄｅｒら， Ｃｅｌｌ ４５：４８５−４９５（１９８６））、肝臓で活性があるアルブミン遺伝子調節領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １：２６８−２７６（１９８７））、肝臓で活性があるアルファ−フェトプロテイン遺伝子調節領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：１６３９−１６４８（１９８５）；Ｈａｍｍｅｒら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８（１９８７））；肝臓で活性があるアルファ１−アンチトリプシン遺伝子調節領域（Ｋｅｌｓｅｙら， Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． １：１６１−１７１（１９８７））、赤血球系細胞で活性があるベータ−グロビン遺伝子調節領域（Ｍｏｇｒａｍら， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０（１９８５）；Ｋｏｌｌｉａｓら， Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４（１９８６））；脳の乏突起神経膠細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｃｅｌｌ）で活性があるミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら， Ｃｅｌｌ ４８：７０３−７１２（１９８７））；骨格筋で活性があるミオシン軽鎖−２遺伝子調節領域（Ｓａｎｉ， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−２８６（１９８５））、および視床下部で活性がある性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子調節領域（Ｍａｓｏｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−１３７８（１９８６））が含まれる。特に関心となるのは、どちらも心筋で活性がある、α−ミオシン重鎖遺伝子（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２４６１３−２４６２０（１９９１））およびミオシン軽鎖−２プロモーター（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：１８１４２−１８１４８（１９８９）およびＲｕｏｑｉａｎ−Ｓｈｅｎら，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１：１６７６−１６８５（１９９１））である。
【００５９】
本発明の１つの好ましい特定の態様において、キメラトランス活性化タンパク質は、実施例１および図１に示される方法にしたがい構築される、ｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６／Ａｆｌ２にコードされる。本発明の別の好ましい特定の態様において、キメラトランス活性化タンパク質は、ＶＰ１６部分がＨＩＦ−１αコード領域のコドン５３０の後に挿入されている以外はｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６／Ａｆｌ２と同一である、ｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６／ＲＩにコードされる。
【００６０】
本発明にしたがい、本発明のハイブリッド／キメラトランス活性化タンパク質を利用し、低酸素症応答要素（ＨＲＥ）を含む遺伝子の発現を特異的に制御してもよい。これらのＨＲＥはキメラトランス活性化タンパク質の骨格として使用されるＤＮＡ結合タンパク質により認識されそして結合される核酸配列に一致する。
【００６１】
一般的に、本発明のキメラトランス活性化タンパク質を用い、目的の遺伝子の発現を選択的に調節してもよい。例えば、そして限定ではなく、本発明のキメラトランス活性化タンパク質を構成的なプロモーターの調節下においてもよく、そして、例えば細胞培養またはトランスジェニック動物において、特定の遺伝子産物を大量に産生するのが望ましい場合、低酸素症応答要素（ＨＲＥ）と結合させた目的の遺伝子の発現を構成的に増加させるのに用いてもよい。あるいは、トランス活性化タンパク質を組織特異的プロモータの調節下に置き、目的の遺伝子が特定の組織で発現するようにしてもよい。本発明の別の態様において、キメラトランス活性化機能は誘導性であり、それゆえ、低酸素症応答要素（ＨＲＥ）を介した、目的の遺伝子の発現を、選択的に増加しまたは減少することが可能である。条件付きのそして誘導性導入遺伝子の概説には、Ｆｉｓｈｍａｎ， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ．， ８２：８３７−８４４（１９８８）およびＦｉｓｈｍａｎ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｍｅｄ．， ５：２１１−２１７（１９９５）を参照されたい。
【００６２】
キメラトランス活性化タンパク質は、該キメラタンパク質のＤＮＡ結合タンパク質骨格により認識されるＤＮＡ配列に相同な応答要素に特異的に結合する、有益な特性を有する。
【００６３】
ベクター：ベクターの例は、ウイルス、例えばアデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｅｓ）、ヘルペスウイルス、陽性鎖ＲＮＡウイルス、ワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓｅｓ）、バキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ）およびレトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター、および多様な真核および原核宿主での発現に関し記載されてきている、当技術分野で典型的に用いられる他の組換え媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）であり、そして遺伝子治療と共に単純なタンパク質発現に用いてもよい。
【００６４】
ポリヌクレオチド／導入遺伝子は、当業者に周知の方法を用い、ベクターゲノムに挿入する。例えば、挿入物およびベクターＤＮＡを、適切な条件下で、制限酵素と接触させ、各分子上に、互いに対を作り、そしてリガーゼで共につなぐことが可能な相補的末端を生成してもよい。あるいは、合成核酸リンカーを、制限処理されたポリヌクレオチドの末端に連結してもよい。これらの合成リンカーは、ベクターＤＮＡの特定の制限部位に対応する核酸配列を含む。さらに、終止コドンおよび適切な制限部位を含むオリゴヌクレオチドを、例えば、以下のいくつかまたはすべてを含むベクターに挿入するため連結してもよい：選択可能マーカー遺伝子、例えば哺乳動物細胞での安定または一過性トランスフェクタントの選択のためのネオマイシン遺伝子；高レベル転写のためのヒトＣＭＶ極初期遺伝子由来のエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡ安定性のためのＳＶ４０由来の転写終結およびＲＮＡプロセシングシグナル；適切なエピソーム複製のためのＳＶ４０ポリオーマ複製起点およびＣｏｌＥ１；多用途マルチクローニング部位；並びにセンスおよびアンチセンスＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのＴ７およびＳＰ６ ＲＮＡプロモーター。他の手段が当業者に周知であり、そして利用可能である。
【００６５】
当業者は、ベクターからの発現が望ましい場合、ポリヌクレオチド／導入遺伝子が、発現調節配列に、機能可能であるよう連結されることを認識するであろう。ポリヌクレオチドを機能可能であるように連結してもよい、プロモーターおよびクローニング部位を両方含むベクターは、当業者に周知である。こうしたベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡを転写することが可能であり、そしてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州ラホヤ）およびＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（ウィスコンシン州マディソン）などの供給源から商業的に入手可能である。発現および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を最適化するため、クローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去し、該部分に付加し、または該部分を改変し、転写または翻訳レベルどちらかで、発現に干渉しまたは発現を減少させる可能性がある、余分で、潜在的に不適切な代替翻訳開始コドンまたは他の配列を除去することが必要である可能性がある。あるいは、コンセンサスリボソーム結合部位を開始コドンのすぐ５’に挿入し、発現を亢進してもよい。同様に、転写を亢進するため、同一のアミノ酸をコードする代替コドンで、ヒトＨＩＦ−１α、ＥＰＡＳ１またはＨＬＦポリペプチドのコード配列を置換してもよい（例えば、宿主細胞のコドン優先性（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を採用してもよい、Ｇ−Ｃリッチドメインの存在を減少させてもよい、およびそれらに匹敵するもの）。
【００６６】
ヒトＨＩＦ−１α、ＥＰＡＳ１およびＨＬＦまたは別の低酸素症誘導性因子タンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチドの調製を、当業者に知られる方法を用い、個々の細胞内に搬送するため、適切なベクターに取り込んでもよい。例えば、ＦｉｎｋｅｌおよびＥｐｓｔｅｉｎ， ＦＡＳＥＢ Ｊ． ９：８４３−８５１（１９９５）；Ｆｅｌｄｍａｎら， Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓ． ３２：１９４−２０７（１９９６）を参照されたい。
【００６７】
１つの態様において、本発明は、薬学的に許容しうるキャリアーおよび生物学的に活性があるキメラトランス活性化タンパク質を発現することが可能な核酸分子を含む組成物を提供する。該核酸分子にコードされるキメラトランス活性化タンパク質には、低酸素症誘導性因子タンパク質由来のＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化が可能なタンパク質ドメインが含まれる。こうしたドメインは、天然発生または合成いずれかの転写活性化分子由来であってもよい。該組成物内の核酸分子は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞内への搬送に適切な型である。多様なこうした型が、当業者に周知である。本明細書に示される解説を与えられたなら、当業者は、投与部位および経路並びに発現の望ましいレベルおよび期間などの要因に応じ、多様なベクターおよび他の発現／搬送要素から選択することが可能である。
【００６８】
裸のＤＮＡ−裸のプラスミドＤＮＡを、例えば、組織への直接注入により、筋肉細胞内に導入してもよい（Ｗｏｌｆｆら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５（１９８９））。
【００６９】
ＤＮＡ・脂質複合体−脂質キャリアーを裸のＤＮＡ（例えばプラスミドＤＮＡ）と結合させ、細胞膜を通じた輸送を容易にしてもよい。陽イオン性、陰イオン性、または中性脂質をこの目的に用いてもよい。しかし、陽イオン性脂質は、一般的に負荷電を有するＤＮＡとよりよく結合することが示されてきているため、陽イオン性脂質が好ましい。陽イオン性脂質はまた、プラスミドＤＮＡの細胞内搬送を媒介することも示されてきている（ＦｅｌｇｎｅｒおよびＲｉｎｇｏｌｄ， Ｎａｔｕｒｅ ３３７：３８７（１９８９））。陽イオン性脂質・プラスミド複合体のマウスへの静脈内注射は、肺での発現を生じることが示されてきている（Ｂｒｉｇｈａｍら， Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ． ２９８：２７８（１９８９））。Ｏｓａｋａら， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８５（６）：６１２−６１８（１９９６）；Ｓａｎら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：７８１−７８８（１９９３）；Ｓｅｎｉｏｒら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １０７０：１７３−１７９（１９９１）；ＫａｂａｎｏｖおよびＫａｂａｎｏｖ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ６：７−２０（１９９５）；Ｒｅｍｙら， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５：６４７−６５４（１９９４）；Ｂｅｈｒ， Ｊ−Ｐ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５：３８２−３８９（１９９４）；Ｂｅｈｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ８６：６９８２−６９８６（１９８９）；およびＷｙｍａｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３６：３００８−３０１７（１９９７）も参照されたい。
【００７０】
陽イオン性脂質は、一般の当業者に知られる。代表的な陽イオン性脂質には、例えば、その開示が本明細書に援用される、米国特許第５，２８３，１８５号；およびＰＣＴ／ＵＳ９５／１６１７４（ＷＯ ９６／１８３７２）に開示されるものが含まれる。好ましい態様において、陽イオン性脂質はＷＯ ９６／１８３７２に開示されるＮ4−スペルミン・コレステロール・カルバメート（ＧＬ−６７）である。
【００７１】
アデノウイルス−導入遺伝子搬送のためのアデノウイルスに基づくベクターは当業者に周知であり、そして商業的に入手してもまたは標準的な分子生物学的方法により構築してもよい。運搬する外因性遺伝子を含む組換えアデノウイルスベクターは、一般的に、アデノウイルス２型（Ａｄ２）およびアデノウイルス５型（Ａｄ５）由来である。これらはまた、他の非オンコジーン性血清型由来であってもよい。例えば、本明細書に援用される、Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”ＶＩＲＯＲＯＧＹ，第二版中，Ｆｉｅｌｄｓら監修，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．，ニューヨーク，１９９０を参照されたい。
【００７２】
本発明のアデノウイルスベクターは、複製が不可能であり、最低限のウイルス遺伝子しか発現せず、そして標的細胞において導入遺伝子を発現することが可能である。アデノウイルスベクターは、一般的に、Ｅ１領域遺伝子の欠失により、複製不全にされている。複製不全ベクターは、Ｅ１機能を発現するヒト胚腎臓細胞株である２９３細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）で産生することが可能である。欠失Ｅ１領域を、アデノウイルスまたは非アデノウイルスプロモーターの調節下にある目的の導入遺伝子で置き換えてもよい。導入遺伝子はまた、アデノウイルスゲノムの他の領域に置いてもよい。複製不全アデノウイルスベクター産生の概説には、やはり本明細書に援用される、Ｇｒａｈａｍら，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｖａｃｃｉｎｅｓ”ＶＡＣＣＩＮＥＳ： ＮＥＷ ＡＰＰＲＯＡＣＨＥＳ ｔｏ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＰＲＯＢＬＥＭＳ中 ｐｐ３６３−３９０，Ｅｌｌｉｓ監修，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，ボストン，（１９９２）を参照されたい。
【００７３】
当業者はまた、アデノウイルスの他の非必須領域を欠失させ、またはウイルスゲノム内で再配置し、本発明にしたがった導入遺伝子の搬送に適したアデノウイルスベクターを提供してもよいことにも気づく。例えば、本明細書に援用されるＰＣＴ／ＵＳ９３／１１６６７（ＷＯ ９４／１２６４９）および米国特許第５，６７０，４８８号は、Ｅ１およびＥ３領域のある程度またはすべてを欠失させてもよく、そしてＥ４の非必須読み枠（ＯＲＦ）もまた欠失させてもよいことを開示する。他の代表的なアデノウイルスベクターは、例えば、本明細書に援用される、Ｒｉｃｈら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４６１（１９９３）；Ｂｒｏｄｙら， Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７１６：９０（１９９４）；Ｗｉｌｓｏｎ， Ｎ． Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３４：１１８５（１９９６）；Ｃｒｙｓｔａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４（１９９５）；Ｏ’Ｎｅａｌら， Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔ． ３：１４９７（１９９４）；およびＧｒａｈａｍら、上記に開示される。本発明の好ましい態様において、アデノウイルスベクターは、Ｅ１欠失Ａｄ２に基づくベクターである。
【００７４】
本発明のアデノウイルスベクターにおいて、ポリヌクレオチド／導入遺伝子は、発現調節配列、例えば導入遺伝子の発現を指示するプロモーターに、機能可能であるように連結されている。本明細書において、「機能可能であるように連結されている」という句は、ポリヌクレオチド／導入遺伝子とヌクレオチドの制御およびエフェクター配列、例えばプロモーター、エンハンサー、転写および翻訳終止部位、および他のシグナル配列との、機能的な関係を指す。例えば、ポリヌクレオチドのプロモーターへの機能可能である連結は、ＤＮＡの転写が、プロモーターを特異的に認識しそして該プロモーターに結合するＲＮＡポリメラーゼにより、該プロモーターから開始され、そしてここで該プロモーターがポリヌクレオチドからのＲＮＡの転写を指示するような、ポリヌクレオチドおよびプロモーターとの間の物理的および機能的関係を指す。
【００７５】
プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼ認識、結合および転写開始に十分な特定の配列を含む。さらに、プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼの認識、結合および転写開始活性を調節する配列を含む。こうした配列は、シス作用であってもよく、またはトランス作用因子に反応してもよい。制御の性質に応じ、プロモーターは構成的であっても、または制御されていてもよい。プロモーターの例は、ＳＰ６、Ｔ４、Ｔ７、ＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ステロイド誘導性プロモーター、モロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）（ＭＭＬＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびそれらに匹敵するものである。あるいは、プロモーターは内因性アデノウイルスプロモーター、例えばＥ１ａプロモーターまたはＡｄ２主要後期プロモーター（ＭＬＰ）であってもよい。同様に、一般の当業者は、内因性または異種性ポリＡ付加シグナルを利用し、アデノウイルスベクターを構築してもよい。
【００７６】
本明細書において、「プロモーター」は、転写開始を指示する、構造遺伝子の５’端のヌクレオチド配列を指す。プロモーター配列は、下流遺伝子の発現を操縦するのに必要であるが、常に十分であるわけではない。一般的に、真核プロモーターには、転写開始部位（ＣＡＰ部位）の約１０−３０ｂｐ ５’のコンセンサス５’ＴＡＴＡボックスに相同な、特徴的なＤＮＡ配列が含まれる。別のプロモーター構成要素、ＣＡＡＴボックスは、しばしばＴＡＴＡボックスの約３０−７０ｂｐ ５’に見られる。
【００７７】
本明細書において、「エンハンサー」は、近傍の遺伝子に関する位置および方向に比較的独立した方式で、転写効率を増加させるようである、真核プロモーター配列要素を指す（ＫｈｏｕｒｙおよびＧｒｕｓｓ（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：３１３−３１４）。エンハンサー配列が、真核遺伝子の上流、内部または下流で機能する能力は、これらを古典的なプロモーター要素とは区別する。
【００７８】
本発明のウイルスおよび非ウイルスベクターは、ポリヌクレオチド／導入遺伝子の標的細胞への運搬に有用である。標的細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏであってもｉｎ ｖｉｖｏであってもよい。本発明のベクターのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用により、ポリヌクレオチド／導入遺伝子の培養細胞への運搬が可能になり、そして該使用は、ポリヌクレオチド／導入遺伝子産物の組換え産生に有用である。ｉｎ ｖｉｔｒｏ法はまた、ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療法にも有用であり、この中で、導入遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に導入し、そして該細胞をその後、個体に移植する。当業者は、こうした技術を使用する際、導入遺伝子を新たに単離された細胞または培養細胞に導入してもよいことを認識するであろう。さらに、導入遺伝子含有細胞は、導入遺伝子の導入直後に移植しても、または移植前に培養してもよい。
【００７９】
本発明のベクターは、虚血および他の低酸素症関連障害の予防または治療に有用な、多様なｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療法に使用を見出す。例えば、培養心筋細胞の心筋傷組織への移植は心不全を予防することが可能であると報告されてきている（Ｒｅｎ−Ｋｅ Ｌｉら， Ａｎｎ． Ｔｈｏｒａｃ． Ｓｕｒｇ． ６２：６５４−６６１（１９９６））。また、多様な組み合わせの増殖因子が非心臓系列細胞の心臓発生を誘導することが可能であることも報告されてきている（ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４２２９を参照されたい）。本明細書に含まれる解説を与えられれば、当業者は、本発明にしたがったキメラトランス活性化タンパク質を発現することが可能な核酸分子を、ｉｎ ｖｉｖｏ移植前に標的細胞に導入すると、少なくとも２つの点で細胞治療法に対しさらなる利点を提供する可能性があることを理解するであろう。第一に、細胞は発現構築物の運搬媒体として作用することが可能であり、その結果、細胞が移植される、体のいかなる領域においても、キメラトランス活性化タンパク質の部位特異的搬送が行われる。第二に、移植細胞におけるキメラトランス活性化タンパク質の発現は、移植後に存在する可能性があるいかなる低酸素状態にも該細胞がより容易に適応することを可能にすることにより、および／または移植領域で血管発達を刺激することにより、移植後の該細胞の生存を促進することが可能である。
【００８０】
本発明のベクターを、ポリヌクレオチド／導入遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで細胞に搬送するのに使用すること、例えば、低酸素症関連障害、例えば虚血性心臓疾患の場合、ＨＩＦ−１αがない、不充分なまたは機能していない細胞に搬送するのに使用することは、多様な障害の治療に有用である。したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明にしたがった生物学的に活性があるキメラトランス活性化タンパク質を、発現に適した型（例えば発現調節配列に機能可能であるように連結されている）で含む組成物の有効量を、投与することにより、こうした発現増加が望ましい患者の標的細胞における低酸素症誘導性遺伝子の発現を増加させるための方法を提供する。「有効量」は、生物学的に活性があるキメラトランス活性化タンパク質の、低酸素症関連障害に関連する症状の１つまたはそれ以上を軽減するのに十分なレベルおよび期間での発現を生じる量を指す。こうした方法は、ＨＩＦ−１αおよび低酸素症誘導性遺伝子の、低酸素および酸素正常条件下の組織での発現を増加させまたは持続するのに有用である。
【００８１】
関連する態様において、本発明は、生物学的に活性があるキメラトランス活性化タンパク質の発現が望ましい細胞に、本発明の核酸分子の有効量をｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ投与することにより、患者における低酸素症関連組織損傷を治療し、減少させおよび／または予防するための方法を提供する。低酸素症関連組織損傷の治療および／または予防は、組織の以前の虚血領域への灌流の増加を含む、多様な生理学的効果により明らかになる可能性がある。本発明の方法は、冠状動脈疾患および重大な四肢虚血を含む末梢血管疾患などの疾患の治療に使用を見出す。
【００８２】
本発明の組成物のｉｎ ｖｉｖｏ投与は、筋内、静脈内、鼻腔内、皮下、挿管、洗浄（ｌａｖａｇｅ）および動脈内搬送を含む、多様な経路により達成してもよい。こうした方法は当業者に周知である。同様に、投与すべき組成物の正確な有効量は、当業者により、投与すべき組成物の特定の構成要素、投与経路、および治療される患者の年齢、体重、疾患の度合いおよび肉体的状態などの要因を考慮し、決定することが可能である。
【００８３】
本発明により、やはり提供されるのは、ＨＩＦ−１α、ＥＰＡＳ１、ＨＬＦポリペプチドおよび他の低酸素症誘導性因子タンパク質のドメインをコードするポリヌクレオチドを含む、細菌細胞、酵母細胞、両生類細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、および他の動物細胞での発現に適応したベクターである。さらに、該ベクターは、その発現を可能にするように、ポリヌクレオチドに対し位置する、細菌、酵母、両生類、哺乳動物または動物細胞におけるポリヌクレオチド発現に必要な制御要素を含む。
ここに用いられている、「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるプロセスをさす。ポリペプチドがゲノムＤＮＡから誘導される場合、適当な真核生物宿主を選択すると、発現には、ｍＲＮＡのスプライシングも含まれるであろう。発現に必要な調節エレメントには、ＲＮＡポリメラーゼと結合するためのプロモーター配列、およびリボソーム結合用転写開始配列が含まれる。例えば、細菌発現ベクターには、ｌａｃプロモーターのようなプロモーターならびに転写開始用シャイン−ダルカルノ配列および開始コドンＡＵＧが含まれる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９；またはＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，ＮＹ、１９９２）。同様に、真核生物発現ベクターには、異種または同種のＲＮＡポリメラーゼII用プロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボソーム分離用終止コドンが含まれる。そのようなベクターは、市販されているか、またはこの技術分野で周知の方法、例えば一般にベクターを構築するための上記の方法、に記載された配列で組み立てることができる。発現ベクターは、本発明のハイブリッド／キメラトランスアクティベーター（融合）ポリペプチドを発現する細胞を作成するために有用である。
【００８４】
本発明は、本発明のハイブリッド／キメラトランスアクティベーター（融合）ポリペプチドを組換え発現する形質転換された宿主細胞を提供する。本発明の宿主細胞を、哺乳動物または非哺乳動物の低酸素−誘導因子タンパク質のＤＮＡ結合ドメインおよび転写アクティベータータンパク質の機能的転写アクティベータードメインを含む、キメラトランスアクティベーターをコードする組換え核酸分子で形質転換した。例として、哺乳動物細胞内での発現に適合したプラスミドを含む哺乳動物細胞があげられる。プラスミドは、哺乳動物または非哺乳動物の低酸素−誘導因子タンパク質のＤＮＡ結合ドメインおよび転写アクティベータータンパク質の機能的転写アクティベータードメインをコードするポリヌクレオチド、ならびに本発明のハイブリッド／キメラトランスアクティベーター（融合）ポリペプチドの発現に必要な調節エレメントを含む。
【００８５】
適当な宿主細胞には、細菌、古細菌、真菌、特に酵母、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞、特に哺乳動物細胞が含まれる。特に興味あるのは、大腸菌、枯草菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、ニューロスポラ、およびＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、および不朽化した哺乳動物骨髄細胞系およびリンパ細胞系が含まれる。好ましい複製システムには、Ｍ１３、ＣｏｌＥ１、ＳＶ４０、バキュロウイルス、ラムダ、アデノウイルス、人工染色体等が含まれる。多数の転写開始領域および終止調節領域が単離され、様々な宿主内での異種タンパク質の転写および翻訳に有用であることが示された。これらの領域の例、単離方法、マニピュレーション法等は、この技術分野で既知である。適当な発現条件下では、宿主細胞を、本発明のハイブリッド／キメラトランスアクティベーター（融合）タンパク質を組み換え生産する源として用いることができる。
【００８６】
また、本発明のハイブリッド／キメラトランスアクティベーター（融合）ポリペプチドをコードする核酸（ポリヌクレオチド）を、組換えによってレシピエント細胞のゲノム内に組込ませることもできる。また、特に多能性細胞内では、非相同組換えまたは相同組換えによる内因性遺伝子の欠損の様な別の組換えに基づく方法を、用いることもできる。
【００８７】
標的細胞または宿主細胞への本発明のベクターの標的化は、ベクターに標的化分子を連結させることによって、成し遂げることができる。標的化分子は、興味ある細胞または組織型に特異的であり、例えば、リガンド、抗体、糖、レセプター、またはその他の結合分子を含む、任意の薬剤である。標的化ベクターは、本発明のベクターを、低酸素関連疾病の治療に特に有用にする能力を持つ。
【００８８】
本発明のベクターによる標的細胞または宿主細胞へのポリヌクレオチド／トランスジーンのトランスファーを、標的細胞または宿主細胞でのポリヌクレオチド／トランスジーンの生成レベルを測定することによって、評価することができる。標的細胞または宿主細胞内でのポリヌクレオチド／トランスジーンの生成レベルは、本発明のベクターによるポリヌクレオチド／トランスジーンのトランスファー効率と直接的に関係する。
【００８９】
ポリヌクレオチド／トランスジーンの発現は、とりわけ、免疫学的アッセイ、組織化学的アッセイおよび活性アッセイを含むこの技術分野で既知の様々な方法によって、モニターすることができる。サンプル内のハイブリッド／キメラトランスアクティベーター（融合）ポリペプチドのインビトロでの検出に有用な免疫学的方法には、検出可能抗体を用いるイムノアッセイが含まれる。そのようなイムノアッセイには、例えば、この技術分野で周知の、ＥＬＩＳＡ、Ｐａｎｄｅｘ微量蛍光測定アッセイ、凝集アッセイ、フローサイトメトリー、血清診断アッセイおよび免疫組織化学染色法が含まれる。この技術分野で周知の様々な手段によって、抗体を検出可能にすることができる。例えば、検出可能マーカーを、抗体に直接または間接的に付けることができる。有用なマーカーには、例えば、放射性核種、酵素、蛍光源、色原体および化学ルミネセンス標識が含まれる。
【００９０】
インビボでの画像診断法用では、検出可能抗体を、患者、組織または細胞に投与し、そして、ポリヌクレオチド／トランスジーン生成物への抗体の結合を、この技術分野で周知の画像診断技術によって検出することができる。適当な画像診断薬剤は、既知であり、例えば、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ、５１Ｃｒ等のようなγ線放射放射性核種、ならびに合衆国特許第４，６４７，４４７号に記載の常磁性金属イオンが含まれる。放射性核種は、γシンチレーション光度計、陽電子射出断層撮影、シングルフォトンエミッションコンピューター断層撮影およびγ線カメラ全身画像診断による、組織の画像診断を可能にし、これに対して、常磁性金属イオンは磁気共鳴画像診断による可視化を可能にする。
【００９１】
本発明は、本発明の核酸によってコードされる、単離されたハイブリッド／キメラトランスアクティベーター（融合）ペプチド、ポリペプチド（類）および／またはタンパク質（類）を、提供する。ここに用いられている、用語「単離された」は、細胞成分および／またはインビボでの天然環境で通常関連する混入物を含まないタンパク質分子を意味する。本発明のポリペプチドおよび／またはタンパク質には、任意の天然発生のアレレ変異体、ならびにその組換え型、を含む。本発明のポリペプチドを、当業者らに周知の様々な方法を用いて、単離することができる。
【００９２】
本発明の融合タンパク質の単離精製に利用できる方法には、沈殿、ゲルろ過、ならびに分子ふるい、イオン交換および、例えばＨＩＦ−１α、ＥＰＡＳ１−またはＨＬＦ−特異的抗体およびリガンドを用いたアフィニティークロマトグラフィーを含むクロマトグラフ法が含まれる。その他の周知の方法は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒら、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｔｙ、第１８２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９０、に記載されている。精製された本発明のポリペプチドを組換え系内で生成させる場合、組換え発現ベクターは、さらなるアミノ末端またはカルボキシ末端アミノ酸をコードするさらなる配列を含み、これらの追加アミノ酸は、固定化抗体を用いるイムノアフィニティー精製用または固定化リガンドを用いるアフィニティ精製用の「タグ」として働くであろう。
【００９３】
本発明のハイブリッド／キメラトランスアクティベーター（融合）ポリペプチド（類）を調製する手段の例としては、細菌細胞、酵母細胞、両生類細胞（例えば卵母細胞）、昆虫細胞（例えばショウジョウバエ）または哺乳動物細胞のような、適当な宿主細胞内で、この技術分野で周知の方法を用いて、本発明のポリヌクレオチドを発現し、そして発現したポリペプチドを回収し、再び周知の方法を用いることである。本発明のポリペプチドを、ここにさらに詳細に記載する方法に従って、発現ベクターで形質転換された細胞から直接単離することができる。本発明のハイブリッド／キメラトランスアクティベーター（融合）ポリペプチド、生物学的に活性なフラグメントおよびその機能的等価物を、化学合成によって作成することもできる。ここに用いられているように、「生物学的に活性なフラグメント」とは、活性タンパク質に組み立てることのできるポリペプチドの任意の部分をさす。合成ポリペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｄｅｌ ４３０Ａまたは４３１Ａ自動ペプチドシンセサイザー（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を製造者らによって提供された化学に従って用いることによって、作成することができる。
【００９４】
以下の語句「組換えで発現した／生成した」、「精製した」または「実質上純粋」を伴う、本発明の核酸、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質の修飾には、人の手によってそのような形に作成された核酸、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質が含まれ、従ってインビボでの天然の細胞環境から分離される。この様なヒトの介入の結果として、本発明の組換え核酸、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチドおよびタンパク質は、選択された薬剤または化合物の同定のような関連する天然発生分子が有用ででない場合に、有用である。
【００９５】
本発明は、キメラトランスアクティベータータンパク質をコードするトランス遺伝子を持つ非ヒト−トランスジェニック動物を提供する。このトランスジェニック動物は、さらに、低酸素応答エレメント（ＨＲＥｓ）(hypoxia responsive elements) の制御下の興味ある遺伝子を含むことができる。本発明の様々な実施態様では、トランスアクティベータータンパク質は、興味ある遺伝子の発現を本質的に強化することができる。代わりに、トランスアクティベータータンパク質は、ある条件下、例えば、制限するつもりはないが、誘導によって、興味ある遺伝子の発現を強化することができるだけである。本発明の組換えＤＮＡ分子を、本技術分野で既知のトランスジェニック動物を作成するための任意の方法を用いて、非ヒト−動物のゲノム内に導入することができた。
【００９６】
本発明は、本発明のハイブリッド／キメラトランスアクティベーター（融合）ポリペプチドをコードする核酸を発現する能力を持つトランスジェニック非ヒト−哺乳動物を提供する。
【００９７】
また、本発明のハイブリッド／キメラトランスアクティベーター（融合）ポリペプチドをコードする核酸を発現する能力を持つトランスジェニック非ヒト−哺乳動物が提供され、その結果、トランスジェニック哺乳動物は正常な活性を失うような変異を受けた。
【００９８】
また、本発明は、本発明のハイブリッド／キメラトランスアクティベーター（融合）ポリペプチドをコードする核酸と相補的なアンチセンス核酸を含むゲノムを持つトランスジェニック非ヒト−哺乳動物を提供し、その結果、ゲノムは本発明の融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに相補的なアンチセンスｍＲＮＡに転写されるように配置され、アンチセンス核酸は前記核酸とハイブリダイズし、それによってその翻訳を減少させる。さらに、ポリヌクレオチドは、誘発性プロモーターおよび／または組織特異的調節エレメントを含むことができ、その結果、発現を誘発するか、または特定の細胞の型に限定することができる。非ヒト−トランスジェニック哺乳動物の例として、トランスジェニック−ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、ラットおよびマウスがあげられる。組織特異性−決定エレメントの例としては、メタロチオネインプロモーターおよびＴ１７プロモーターがあげられる。
【００９９】
本発明のポリペプチドの生理学的行動に関する役割を解明する動物モデルシステムを、ポリペプチドの発現を様々な技術を用いて変化させたトランスジェニック動物を作り出すことによって、作成する。そのような技術の例としては、ミクロインジェクション、レトロウイルス感染または当業者らに周知のその他の手段によって、適当な受精胎児細胞に本発明の融合ポリペプチドをコードする正常または変異型核酸を挿入し、トランスジェニック動物を作り出すことが含まれる。例えば、Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１，１２６３−１２７０、１９９３；Ｃａｒｖｅｒら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，７７−８４、１９９２；Ｃｌａｒｋら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７，４８７−４９２、１９８９；Ｓｉｍｏｎｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，１７９−１８３、１９８８；Ｓｗａｎｓｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，５５７−５５９、１９９２；Ｖｅｌａｎｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１２００３−１２００７、１９９２；Ｈａｍｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３１５，６８０−６８３、１９８５；Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８４４−８４７、１９９１；Ｅｂｅｒｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３５−８３８、１９９１；Ｓｉｍｏｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２８，５３０−５３２、１９８７；Ｐｉｔｔｉｕｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５８７４−５８７８、１９８８；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８．８３２７−８３３１、１９９１；Ｗｈｉｔｅｌａｗら、Ｔｒａｎｓｇ．Ｒｅｓ．，１，３−１３、１９９１；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５，１１８３−１１８７、１９８７；Ｇｒｏｓｖｅｌｄら、Ｃｅｌｌ，５１，９７５−９８５、１９８７；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４７８−４８２、１９９１；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，８３６−８４０、１９８８；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４４３８−４４４２、１９８５；Ａｌ−Ｓｈａｗｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０（３），１１９２−１１９８、１９９０；Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，６１４８−６１５２，１９８５；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，５６，３１３−３２１、１９８９；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２４４−１２４６、１９８１；および、Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８６）を参照のこと。
【０１００】
その他の技術、トランスジェニック動物内の天然遺伝子座と変異体または正常型のこれらの遺伝子の相同組換えを用いると、本発明のポリペプチドの発現の調節またはその構造を変化させることができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１２８８、１９８９；Ｚｉｍｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３８，１５０、１９８９を参照のこと）。相同組換え技術は、この技術分野で周知である。相同組換えは、天然（内因性）遺伝子を組換えまたは変異遺伝子で置換し、天然（内因性）タンパク質を発現できないが、例えば、結果として本発明の融合ポリペプチドの発現を変化させる変異タンパク質を発現することができる、動物を作り出す。
【０１０１】
相同組換えとは対照的に、ミクロインジェクションは、宿主遺伝子を除去することなく、遺伝子を宿主ゲノムに加える。ミクロインジェクションは、内因性および外因性の両ポリペプチドを発現する能力を持つトランスジェニック動物を作り出すことができる。誘発性プロモーターを、核酸のコード領域に連結して、トランス遺伝子の発現を調節する手段を提供することもできる。組織−特異的調節エレメントを、コード領域に連結すると、トランス遺伝子の組織特異的発現を可能にすることができる。トランスジェニック動物モデルシステムは、インビボでのリガンド同定用の化合物；例えば、ポリペプチド応答を活性化するか、あるいは阻害する、アゴニストまたはアンタゴニスト；のスクリーニングに有用である。
【０１０２】
さらに、本発明は、受容可能なキャリヤーおよび任意の単離精製されたハイブリッド／キメラトランスアクティベーター（融合）ポリペプチド、その活性フラグメント、または精製された成熟タンパク質およびその活性フラグメントを、単独または互いに組み合わせて、含む組成物を提供する。これらのポリペプチドまたはタンパク質は、組換え誘導されるか、化学的に合成されるか、または精製されうる。ここに用いられている、用語「受容可能なキャリヤー」は、リン酸塩バッファー溶液、水および油／水または水／油エマルジョンのようなエマルジョンおよび様々な型の湿潤剤のような、任意の標準的製剤キャリヤーを包含する。
【０１０３】
ここに用いられている、用語「有効量」とは、個体細胞内で生物学的に活性なキメラヒト−ウイルストランスアクティベータータンパク質を持続的に生成することによって、欠乏を和らげる量を指す。低酸素関連疾病、例えば虚血性心疾患、末梢血管疾病、虚血性肢疾患等、と関連する症状の緩和によって、個体内での生物学的に活性なキメラヒト−ウイルストランスアクティベータータンパク質の持続的な生成を、評価することができる。当業者らは、本発明の方法に用いられるベクターの正確な有効量を、例えば、年齢、体重、疾病の範囲および個体の状態の個体差を考慮して、決定することができる。
【０１０４】
さらに、本発明は、低酸素関連疾患の患者の細胞に、生物学的に活性なキメラヒト−ウイルストランスアクティベータータンパク質を提供する方法であって、関連する転写因子がその中で欠落しているか、不充分か、または機能しない細胞内に、生物的に活性なキメラヒト−ウイルストランスアクティベータータンパク質の発現を感染させ持続させるのに有効な量の本発明のベクターを、そのような個体内に導入することを含む、前記の方法を提供する。本発明のベクターを、ベクターおよび医薬として許容しうるキャリヤーを含む医薬組成物として、標的細胞に配達することができる。当業者らに周知の方法、例えば、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、挿管法、洗浄等によって、ベクターを標的細胞に配達することができる。
【０１０５】
従って、本発明は、生物学的に活性な哺乳動物転写因子の発現に次いで、一連の潜在性有益遺伝子の発現を誘導する代替法を提供する。
【０１０６】
ＨＩＦ−１αを、ＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡからＰＣＲによってクローン化し、発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）内に挿入した。このプラスミドでは、遺伝子発現は、ＣＭＶプロモーターによって制御されている。配列決定により構築物の構造を確認した後、ＥＰＯプロモーター／エンハンサーまたはＶＥＧＦプロモーターのいずれかによってルシフェラーゼ遺伝子の転写を調節するレポータープラスミドと共にコトランスフェクションすることによって、ＨｅＬａおよび２９３細胞内で試験した。ＨＩＦ−１α活性の誘導は、ＣｏＣｌ２またはデスフェリオキサミン(desferrioxamine)のいずれかで、細胞を処理することによって、成し遂げられ、両者は低酸素と類似のメカニズムでＨＩＦ−１α活性を誘導することが知られている。このアッセイでは、ＨＩＦ−１αタンパク質が真に活性であることが確認された。
【０１０７】
２つのＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッドを構築し、第一のハイブリッドは、ＨＩＦ−１αのアミノ酸３９０で、第二はアミノ酸５３０で切除した。次に、ＨＳＶ ＶＰ１６（アミノ酸４１３−４９０）のトランス活性化ドメインを下流に結合した。これらのタンパク質を、上記の方法に従って、ＥＰ０−ルシフェラーゼまたはＶＥＧＦ−ルシフェラーゼレポータープラスミドのいずれかと共に、ＨｅＬａおよび２９３細胞内にコトランスフェクションすることによって試験した。結果は、両細胞系内では、ハイブリッドでコトランスフェクトされた細胞内で認められたルシフェラーゼ遺伝子発現のレベルは、ＣｏＣｌ２またはデスフェリオキサミンによる誘導に晒した場合でさえ、ＨＩＦ−１αで得られたそれより（２０−１００Ｘほど）高い。この結果は、ハイブリッドタンパク質が真に活性であり、ＶＰ１６ドメインは、誘導されない場合（例えば酸素正常状態条件下）でさえ、強いトランスアクティベーション活性を供与することを、暗に示している。このことは、これらのハイブリッド／キメラ融合タンパク質が低酸素心臓疾患の実行可能な治療法であることを示唆している。
【０１０８】
さらに、本発明は、以下の実施例によって説明され、これら実施例は、決してさらなる制限として解釈されるべきでない。この明細書全体で引用されたすべての参考文献の内容は、ここに参照として採用される。
【０１０９】
実施例
実施例１：ハイブリッド／キメラ構築物
ＨＩＦ−１αからのＤＮＡ結合ドメインおよびダイマー化(dimerization)ドメインならびに単純ヘルペスウイルスＶＰ１６からのトランス活性化ドメイン（図１）からなるハイブリッド転写因子（ｐｃＤＮＡ３／ＨＩＰ．ＶＰ−１６．Ａｆｌ２）を構築し、低酸素に対する生理学的適応に通常含まれる遺伝子の強く本質的な活性化を提供する。以下に記載した方法に従って、我々は、インビトロでのＶＥＧＦ遺伝子発現およびウサギ後脚虚血モデルでの新生血管形成への、このＨＩＦ−１α／ＶＰ１６転写因子の影響について分析した。
【０１１０】
組換えプラスミド
全長（ａａｌ−８２６）のＨＩＦ−１α遺伝子を、配列番号１および２に示したプライマーを用いてＨｅｌａ細胞ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲ（Ａｄｖａｎａｇｅ ｃＤＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）によって単離し、発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＫｐｎＩおよびＸｂａＩ部位の間に挿入した。このプラスミドでは、遺伝子発現は、シトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型早期エンハンサー／プロモーターによって調節される。ＨＩＦ−１α／ＶＰ−１６ハイブリッドを、ａａ３９０（Ａｆｌ２部位）でＨＩＦ−１αを切除し、次いでＨＳＶ ＶＰ−１６下流のトランス活性化ドメインを連結することによって構築した。Ａｆｌ２およびＸｂａＩ末端を持つＶＰ１６フラグメント（ａａ４１３−４９０）を、Ｖｅｎｔポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）および配列番号３および４に示したプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅し、このフラグメントをｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ−１α構築物の適当な部位にクローン化した。関連する構築物（ｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ−１６／Ｒ１）は、ＥｃｏＲＩでの部分消化によりａａ５３０でＨＩＦ−１αを切除することによって、作成された。ＰＣＲによって生成した全配列の完全性を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを用いたＤＮＡシークエンシングによって確認した。全クローニングマニュピュレーションを、標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、１９８９）に従って行った。制限酵素およびＤＮＡ修飾酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓまたはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）のいずれかから得られ、製造者らの明細書に従って用いられた。プラスミドＤＮＡｓをＱｉａｇｅｎ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）から得たキットで精製した。ヒトＶＥＧＦ１６５（ｐｈＶＥＦＧ１６５）を発現するプラスミド構築物については、以前に記載されている（Ｔｓｕｒｕｍｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９６，II−３８２−II−３８８、１９７７）。ルシフェラーゼレポータープラスミド（ＥＰＯ−ｌｕｃおよびＶＥＧＦ−ｌｕｃ）は、Ｄｒ．Ｈ．Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｂｕｎｎ（Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ）から提供して頂いた。
【０１１１】
一過性トランスフェクション
ＨｅＬａ細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏのイーグル修飾培地−高グルコース（ＤＭＥ；Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）内で増殖させた。ルシフェラーゼレポーター実験用に、ＨｅｌＡ細胞（３ｘ１０５細胞／６０ｍＭ皿）を、リン酸カルシウムＰｒｏＦｅｃｔｉｏｎキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を製造者らの使用説明書に従って用いて、トランスフェクトした。二重の皿を、それぞれ５μｇのプラスミド［ＨＩＦ−１α構築物およびＥＰＯ−ｌｕｃ（Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｋ．Ｌ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２，５３７３−８５、１９９２）またはＶＥＧＦ−ｌｕｃ（Ｌｅｖｙ，Ａ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１３３３３−４０、１９９５）レポーターのいずれか、ならびにｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）］でトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間で、１セットの皿を１００μＭデスフェリオキサミン(desferrioxamine)で誘導した。細胞を誘導後１８時間で集菌し、ルシフェラーゼ活性をアッセイした（Ｐｒｏｍｅｇａ）。また、個々のサンプル内のβ−ガラクトシダーゼ活性を、Ｇａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔキット（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて定量し、これらの値を用いて、トランスフェクション効率の対照として、ルシフェラーゼ活性を標準化した。
【０１１２】
実施例２：インビトロでのＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−１α／ＶＰ１６キメラ／ハイブリッド構築物の活性
ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッド構築物を、レポータープラスミドと共に２９３またはＨｅＬａ細胞のいずれかへコトランスフェクションすることによって、遺伝子発現を活性化する能力について、試験した（それぞれ図３および４）。これらの実験に用いられたレポータープラスミドは、エリスロポイエチンエンハンサー／プロモーター（Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｋ．Ｌ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２，５３７３−８５、１９９２）またはＶＥＧＦプロモーター（Ｌｅｖｙ，Ａ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１３３３３−４０、１９９５）のいずれかの転写調節下で、ルシフェラーゼ遺伝子を含んでいた（図３−５では、ｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６．Ａｆｌ２およびｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６．Ｒ１を、それぞれ”ＨＩＦ−４／ＶＰ−１６．ＡｆｌII”および”ＨＩ−４／ＶＰ−１６．Ｒ１”と示している）。
【０１１３】
トランスフェクションの前に、細胞を、１ｘ１０６（２３９）または２．５ｘ１０５（ＨｅＬａ）細胞／皿の密度で、６ｃｍの皿に塗布した。ＨＩＦ−１αまたはＨＩＦ−１α／ＶＰ１６発現プラスミド、およびＥＰＯエンハンサー／プロモーターまたはＶＥＧＦプロモーターのいずれかを含むルシフェラーゼレポータープラスミドで、細胞をコトランスフェクトした。
【０１１４】
トランスフェクションは、それぞれ５μｇのＨＩＦ−１α／ＶＰ１６発現構築物およびレポータープラスミド／皿を用い、ＰｒｏＦｅｃｔｉｏｎＴＭキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いたリン酸カルシウム沈殿によって行われた。トランスフェクション２４時間後、１００μｇ／ｍｌ ＣｏＣｌ２ または１００μｇ／ｍｌデスフェリオキサミンのいずれかを含む新鮮培地を加えることによって、細胞を誘導した。誘導１６時間後、細胞を収集し、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者らの説明書に従って用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【０１１５】
ＨＩＦ−１活性の誘導は、デスフェリオキサミン、鉄キレーターで処理することによって刺激され、これは低酸素症と類似の機構で作用する。ＨＩＦ−１α／ＶＰ−１６ハイブリッド転写因子で予想されたように、ルシフェラーゼ発現は構成的であり、デスフェリオキサミン誘導に依存しなかった。非誘導細胞およびデスフェリオキサミン処理細胞でのルシフェラーゼ発現も有意に違わなかった。これとは対照的に、全長のＨＩＦ−１α構築物でトランスフェクトされた細胞内のルシフェラーゼ活性は、デスフェリオキサミンでの処理後、４−５倍に増加した。さらに、非誘導細胞内でＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッドによって達成された転写活性化は、全長のＨＩＦαでトランスフェクトされたデスフェリオキサミン処理細胞内で認められたそれより、１０−２０倍高かった。全体では、ＨＩＦ−１αで活性化されたルシフェラーゼ発現レベルは、ＨｅＬａ細胞内の内因性ＨＩＦ−１活性に帰因するバックグラウンドレベルより非常に高くはなかった。図６に示すように、以下の研究でこれらの知見を確認した。
図６（左）は、ＥＰＯ３’エンハンサー−プロモーター−ルシフェラーゼレポーター構築物を用いて生成したルシフェラーゼ活性を示している。図６（右）は、ＶＥＧＦプロモーター−ルシフェラーゼレポーター構築物を用いて生成したルシフェラーゼ活性を示している。
【０１１６】
実施例３：ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッド構築物に応答するＶＥＧＦの生成
ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッドが内因性ＶＥＧＦ遺伝子の発現を活性化する能力を持つか否かを決定するために、これら構築物をＨｅＬａ細胞内にトランスフェクトし、ＶＥＧＦをＥＬＩＳＡでアッセイした。トランスフェクション前、ＨｅＬａ細胞を、６ｃｍ皿に５ｘ１０５細胞／皿の密度で塗布した。細胞を１０μｇのＨＩＰ−１α／ＶＰ１６ハイブリッドプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、二重プレート内の細胞は、対照（誘導せず）か、または１００μｇ／ｍｌのデスフェリオキサミンを含む新規の培地を加えることによって誘導するかのいずれかであった。誘導４０時間後、培養液を収集し、ＥＬＩＳＡ（ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＴＭ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を製造者らの指示書に従って用いることによって、ＶＥＧＦについてアッセイした。
【０１１７】
このアッセイからの結果（図５）は、ハイブリッドＨＩＦ−１α／ＶＰ１６／ＡｆｌII構築物（ＨＩＦ−１αのアミノ酸３９０で切除）は、誘導されない場合でさえ、ＶＥＧＦの発現を活性化する能力を持つことを、示している。しかしながら、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６／ＡｆｌII−トランスフェクト細胞からの培地内のＶＥＧＦの濃度は、誘導を伴って、ｍｏｃｋ−トランスフェクト細胞またはＨＩＦ−１α−トランスフェクト細胞内で認められたそれより高くなかった。このことから、多分、最大プラトーレベルは、ＨｅＬａ細胞内に存在する内因性のＨＩＦ−１αによって達成されることを、示唆している。しかしながら、重要な所見は、このレベルが、誘導されていないＨＩＦ−１α／ＶＰ１６／ＡｆｌIIハイブリッドでも達成することができる、と言うことである。
【０１１８】
同じ結果は、第二のハイブリッド構築物ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６／Ｒ１（ＨＩＦ−１αのアミノ酸５３０で切除）では達成されないが、この構築物は、ルシフェラーゼレポーターアッセイで活性であった。さらなるインビトロでの分析から、２つの構築物の間の活性の明らかな差が確認された。特に、ルシフェラーゼレポーター構築物の転写活性化ならびにＨｅＬａ細胞およびＨｅｐ３Ｂ細胞の内因性ＶＥＧＦおよびＥＰＯ遺伝子発現のアップレギュレーションに関しては両方とも、ＨＩＦ−１α／Ｖｐ１６／Ａｆｌ２構築物（ＨＩＦ−１αのアミノ酸３９０で切除）は、より長いＨＩＦ−１α／ＶＰ１６／Ｒ１構築物より活性である。この活性の違いは、酸素正常常態化で不安定になると報告されているＨＩＦ−１αの「酸素依存性ドメイン」の部分のより長い構築物の存在によるらしい（Ｈｕａｎｇら、ＰＮＡＳ，９５，７９８７−７９９２、１９９８を参照のこと）。
【０１１９】
ＶＥＧＦ生成のさらなる分析では、ＨｅＬａ細胞（３ｘ１０５細胞／６０ｍＭ皿）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，）中のリポフェクタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，３．７μｇ ＤＮＡ、１４μｌのリポフェクタミン）で、１７時間トランスフェクトした。７時間後、１セットの皿を１００μＭのデスフェリオキサミンで処理した。誘導４２時間後、培養液を収集し、細胞を２５０μｌの溶解バッファー［０．５％ ＮＰ−４０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、１００μＭ ＰＭＳＦ、０．１Ｕ／ｍｌアプロチニン(Aprotinin) 、１μＭペファブロック(Pefabloc)、５μｇ／ｍｌロイペプチン(Leupeptin)］内で溶解した。ＶＥＧＦ濃度を、上記の方法に従ってアッセイし、全細胞タンパク質を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）タンパク質アッセイを用いて分析した。ＥＬＩＳＡ値を、全細胞タンパク質に対して標準化した。
【０１２０】
ラットＣ６グリオーム細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｅ，ＭＤ）を、トランスフェクション３日前に１２穴培養プレート上に接種し、１０％ ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加したＤＭＥ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で培養した。トランスフェクションは、本質的には、以前に記載された方法（Ｌｅｅ，Ｅ．Ｒ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７，１７０１−１７１７、１９９６）に従って、成し遂げられた。簡単に言えば、プラスミドＤＮＡを同容量のカチオン脂質ＧＬ＃６７と複合させると、最終濃度８０：２０μＭ（ＤＮＡ：脂質）となった。脂質／ＤＮＡ複合体（４００μｌ／穴、おおよそ５ｘ１０５細胞／穴）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地内の細胞に加え、５時間インキュベートした。次いで、複合体を除去し、細胞をＤＭＥ＋１０％ＦＢＳに戻した。トランスフェクションの２４時間後、デスフェリオキサミン（１００μＭ）を含むかまたは含まない新鮮培地（１ｍｌ／穴）で、培地を置き換えた。２４時間後、培養液を、ＶＥＧＦ生成分析用に収集し、細胞を５００μｌの細胞溶解バッファー内で溶解した。ＶＥＧＦ生成は、マウスＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）について特異的なＥＬＩＳＡキットを用いてアッセイされ、値は全細胞タンパク質に標準化された。
【０１２１】
ＨｅＬａ細胞およびＣ６細胞の両方で、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッド構築物は、デスフェリオキサミン処理をしない場合にもＶＥＧＦ生成を有意に強化した。ＨｅＬａ細胞内では、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６−トランスフェクト細胞内のＦＥＧＦ生成は、デスフェリオキサミンによってさらに強化されたが、Ｃ６細胞内では、差は認められなかった。ＶＥＧＦ発現のバックグラウンドレベルは、Ｃ６細胞内よりＨｅＬａ細胞内の方がより高かった。ＶＥＧＦ発現の大きさへのＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッドの影響は、Ｃ６細胞内でより大きく認められた（デスフェリオキサミンで処理された、トランスフェクトされていない細胞またはＨＩＦ−１α−トランスフェクト細胞より５倍高かった）。ＨｅＬａ細胞では、非誘導ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６−トランスフェクト細胞内でのＶＥＧＦ生成は、デスフェリオキサミンに晒されたトランスフェクトされていない細胞内のそれと似通っていた。しかしながら、両細胞系共、非誘導のＨＩＦ−１α／ＶＰ１６−トランスフェクト細胞内で生成されたＶＥＧＦの絶対量（２．３ｐｇ／μｇタンパク質もまた、同一であった。これらの結果は、内因性ＨＩＦ−１αタンパク質および／またはＨＩＦ−１α活性のデスフェリオキサミン誘導レベルは、Ｃ６細胞内よりＨｅＬａ細胞内でより大きいことを示唆しており、このことは、種特異的または細胞型特異的差異によって説明できる。とりわけ、ヒト転写因子に基づくＨＩＦ−１α／Ｖｐ１６ハイブリッドは、ラットＶＥＧＦ遺伝子を活性化することができ、このことは、種を越えてＨＲＥｓが保存されることを示唆している。ラットＶＥＧＦ遺伝子の５’−フランキング領域の配列分析は、いくつかの潜在的ＨＲＥｓを明らかにし、これらの内の一つの位置は、ラットとヒト遺伝子の間で保存されている。このエレメントは、ラットとヒトのＶＥＧＦ遺伝子で同一な２８ｂｐ領域内に位置している。
【０１２２】
実施例４：ウサギ後脚虚血モデル内のＨＩＦ−１α／Ｖｐ１６ハイブリッド転写因子の分析
Ａ．血清ＶＥＧＦレベル
ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッド遺伝子（ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６）またはヒトＶＥＧＦ１６５（ｐｈＶＥＧＦ１６５）のいずれかをコードするむき出しのプラスミドＤＮＡを、大腿動脈をてき出して後脚虚血を誘導した、ウサギの中央内転筋および半膜様筋肉内に注射することによって、投与した。血清ＶＥＧＦレベルを、ヒトＶＥＧＦに対して調製したＥＬＩＳＡアッセイによってアッセイした。従って、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６−処理グループに適用したようなこのアッセイは、ウサギの内因性タンパク質がこれらの動物内で生成される程、定量的ではない。しかしながら、ＶＥＧＦ発現の反応速度論および持続性を、グループ内で比較することはできる。処理前、血清ＶＥＧＦレベルはほとんど検出できず、それぞれのグループで類似していた。しかしながら、投与３日後、ＶＥＧＦレベルは、ｐｈＶＥＧＦ１６５−トランスフェクト動物では１０．５（±３．９）ｐｇ／ｍｌに、ＨＩＦ−１α／ＶＰ−１６処理グループでは２６．３（±４．６）ｐｇ／ｍｌに、増加した。処理５日後、ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ−１６処理動物内のＶＥＧＦレベルは未だ高く、徐々に減少していた（１４．９±３．０ｐｇ／ｍｌ）。対照的に、５日後、ｐｈＶＥＧＦ１６５処理動物では、血清ＶＥＧＦを検出できなかった。対照（ｐＣＭＶβ−処理）グループでは、処理前、または処理３日後および５日後のいずれでも、ＶＥＧＦは検出されなかった。ＶＥＧＦタンパク質レベルは５日迄に減少したが、両方のトランスジーン発現は、ＲＴ−ＰＣＲで分析したところ、投与１４日後迄、持続した。
【０１２３】
Ｂ．赤血球の測定
ｐｈＶＥＧＦ１６５−ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６での処理前（１０日）および処理後３０日（４０日）ならびに対照グループの赤血球数、ヘマトクリット値およびヘモグロビン値を、下の表１に示している。処理前または処理後のいずれでも、３グループ間で赤血球数およびヘモグロビンに差はなかった。ヘマトクリットはｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６−処理動物内で増加する様に思われたが、同様の増加が対照グループ内にも認められ、この結果が、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッド転写因子の発現によるものでなかったことを示唆している。
【０１２４】
Ｃ．ウシ後脚の血圧
虚血誘導１０日後（プラスミド注射直前）、ウシ血圧比（虚血／正常脚）は、３グループ間で類似していた（ｐｈＶＥＧＦ１６５ ＝０．４５±０．０１、ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６＝０．４４±０．０２、対照＝０．４５±０．０３；Ｐ＝ＮＳ）。４０日迄（トランスフェクション後３０日）、血圧比は、３グループ間で改良した。しかしながら、ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６処理動物の血圧比（０．９３±０．０２）は、ｐｈＶＥＧＦ１６５を受けた動物の血圧比（０．８２±０．０３）または対照グループのそれ（０．６９±０．０２）より有意に高かった（Ｐ＜０．０１）。４０日の血圧比は、ｐｈＶＥＧＦ１６５−処理グループで対照より高かった（Ｐ＜０．０１）。
【０１２５】
Ｄ．血管内ドップラーガイドワイヤ測定
虚血脚内の静止血流および最大血流（パパベリン−刺激）は、１０日では、３グループ間で類似していた。しかしながら、４０日では、静止血流およびパパベリン刺激最大血流は、ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６−トランスフェクトグループ（それぞれ４１．６±３．１ｍｌ／分および１１１．２±５．７ｍｌ／分）およびｐｈＶＥＧＦ１６５トランスフェクトグループ（それぞれ４２．２±３．９ｍｌ／分および８８．７±７．４ｍｌ／分）では、対照グループのそれ（それぞれ２８．７±１．５ｍｌ／分および６５．３±３．８ｍｌ／分）より有意に高かった。静止血流は、ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６およびｐｈＶＥＧＦ１６５−処理ウサギ間では類似していた（４０日）が、最大血流は、ｐｈＶＥＧＦ１６５処理グループよりｐＨＩＦ−１α／Ｖｐ１６でトランスフェクトした動物の方が、有意に高かった（ｐ＜０．０５）。非虚血脚内の静止血流および最大血流は、１０日ならびに４０日共、３グル−プ間で類似していた。
【０１２６】
Ｅ．側副血管発達へのＨＩＦ−１α／ＶＰ１６およびＶＥＧＦ１６５の影響
大腿中央の血管造影視覚型の側副血管の定量分析は、血管密度を測定することによって成し遂げられた。処理前（１０日）の基準線では、ｐｈＶＥＧＦ１６５、ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６および対照グループ間の血管造影スコアに有意の差はなかった（それぞれ０．３８±０．０３、０．４２±０．０１、０．４１±０．０２、Ｐ＝ＮＳ）。４０日まで、ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６−処理ウサギ（０．６１±０．０１）およびｐｈＶＥＧＦ１６５−処理ウサギ（０．５８±０．０３）の血管造影スコアは、対照グループのそれ（０．５１±０．０５）より有意に高かった。４０日では、ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６−処理およびｐｈＶＥＧＦ１６５処理グループ間の血管造影スコアに、統計上有意な差はなかった。ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６およびｐｈＶＥＧＦ１６５を受けた動物内で認められる血管造影スコアの増加を説明する主な知見は、いわゆる中央帯の側副血管の強化であった。
【０１２７】
さらに、虚血後脚の血管再生への筋肉内ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６およびＶＥＧＦ遺伝子治療の効果を評価するために、虚血脚の大腿中央筋を、４０日に組織学的に試験した。ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６処理グループ（２５５±１３／ｍｍ２）およびｐｈＶＥＧＦ１６５処理グループ（２１０±１０／ｍｍ２）の筋肉内で認められた毛細血管密度は、対照グループのそれ（１５０±４／ｍｍ２）より有意に高かった。さらに、毛細血管密度は、ｐｈＶＥＧＦ１６５ 処理動物より、ｐＨＩＦα／ＶＰ１６でトランスフェクトした動物で高かった（ｐ＜０．０５）。さらに、ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６およびｐｈＶＥＧＦ１６５処理ウサギの毛細血管／筋肉繊維比（それぞれ、０．８８±０．０６および０．７５±０．０３）は、対照（０．５８±０．０３、結果は示していない）より有意に高かった。明らかな筋壊死の光学顕微鏡的徴候はいずれのグループでも認められなかった。
【０１２８】
医療へのかかわり
インビトロおよびインビボでＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッド因子によってＶＥＧＦ遺伝子発現が活性化されることから、ＶＰ１６活性化ドメインが試験した細胞型（ヒト頸部上皮、ラットグリオーム、ウサギ骨格筋）内のＨＩＦ−１標的遺伝子の発現に必要とされるアクセサリー因子と相互作用するであろうと、考えられる。従って、遺伝子治療によるＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッドの投与は、血管障害に関連する虚血への有効な治療法であることが分かる。この適用では、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６は、ＶＥＧＦを含む様々な遺伝子をアップレギュレートすることができる。治療による恩恵は、血管形成の刺激の結果としてのみならず、血管拡張および嫌気代謝のアップレギュレーションのような、低い酸素圧へのさらなるＨＩＦ−１仲介局所適応を通してでも、達成することができる。成長因子および／または血管形成を強化するそれらをコードする遺伝子の投与は、慣用の血管再生技術が適さない場合の組織虚血の治療として、有用であることができる。
【０１２９】
インビボではＶＥＧＦ１６５と相関してＨＩＦ−１α／ＶＰ１６で認められる潜在能力の強化は、いくつかの因子によるものであろう。第一に、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６によって促進されるＶＥＧＦの発現レベルは、ＶＥＧＦ１６５プラスミドで達成されたそれを越えるように見えた。さらに、ＶＥＧＦ発現は、ｐｈＶＥＧＦ１６５を与えられた動物より、ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６処理動物で、より長く持続するように思われた。なぜなら、投与５日後、血清ＶＥＧＦは、後者のグループではなく、前者のグループで認められたからである。
【０１３０】
Ｆ．方法
筋肉内遺伝子のトランスファー
２９のウサギを用いて、後脚虚血への筋肉内遺伝子治療の効果について研究した。全プロトコールは、Ｓｔ．Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ’ｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｅｅによって承認されている。雄のニュージーランド白ウサギ（４．０−４．３ｋｇ）（Ｐｉｎｅ Ａｃｒｅ Ｒａｂｂｉｔｒｙ，Ｎｏｒｔｏｎ，ＭＡ）に、キシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）を前投与した後、ケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）およびアセプロマジン（０．８ｍｇ／ｋｇ）の混合物で麻酔をかけた。手術方法は、前記の通りである（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９３，６６２−６７０、１９９４ａ）。簡単に言えば、大腿動脈を、外腸骨動脈からの分岐のその中央に近い源から伏在静脈と膝窩動脈に分かれる末梢部まで、完全に剔出した。手術後、全動物を、綿密にモニターした。無痛剤（０．２５ｍｇ／ｋｇの酒石酸レボファノール、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）を、１日間、皮下投与した。また、予防的に抗生物質（エンロフロキサシン、Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ，ＫＡ）を、手術後、合計５日間、皮下投与した。
【０１３１】
ウサギをカテーテル法実験室に戻した後、１０日間隔で、術後回復について考慮した。基準線測定完成後、プラスミドＤＮＡまたはベヒクルのみ（標準生理食塩水）を、小さな皮膚切開を通して３ｍｌのシリンジおよび２５ゲージの針を用いて、主な３つの大腿筋の別の４部位に、直接注射した。個々の注射で、中央にある大きい筋肉（２部位）、内転筋（１部位）および半膜様筋（１部位）に、針の先を、典型的には３−５ｍｍの深さで挿入した。筋肉注射についての詳細な方法は、前記の通りである（Ｔｓｕｒｕｍｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９４，３２８１−３２８９、１９９６）。この技術を用いて、５００μｇのｐＨＩＦ−１α／Ｖｐ１６（ｎ＝１１）、５００μｇのｐｈＶＥＧＦ１６５（ｎ＝１０）、または５００μｇのｐＣＭＶβ（ｎ＝８）を投与した。１２５μｇ／０．５ｍｌの標準生理食塩水を、個々の動物当たり全体で５００μｇ／２．０ｍｌを、それぞれ４部位に注射した。４部位への注射が完了した後、皮膚を４−０ナイロン縫合糸で閉じた。
【０１３２】
血清ＶＥＧＦのイムノアッセイ
それぞれのグループから最初に６匹のウサギについて、プラスミドトランスフェクション処理の直前ならびに処理後３および５日に、血液サンプルを、２３ゲージの針を用いて、ウサギの耳の中心動脈から採血した。血液サンプルを、４℃で３０分間保存し、次いで、３，０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離した。ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によるＶＥＧＦアッセイを行うまでは、血清を−８０℃に凍結した。血清ＶＥＧＦの検出の最低限界は９．０ｐｇ／ｍｌであった。アッセイは、それぞれのサンプルについて、二重に行った。観察者内での変化率は、８％以下であった。
【０１３３】
赤血球、ヘマトクリット、およびヘモグロビンの測定
血液サンプルを、ウサギの耳の中心動脈から、２３ゲージの針を用いて、処理直前（１０日）および屠殺日（４０日）に、採血した。赤血球、ヘマトクリットおよびヘモグロビンを、市販の自動検出器（Ｓｙｓｍｅｘ ａｌｐｈａ，Ｓｙｓｍｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｏｎｇ Ｇｒｏｏｖｅ,ＩＬ）で測定した。
【０１３４】
ウシ血圧比
ウシ血圧比を、ドップラーフローメーター［Ｍｏｄｅｌ１０５０；Ｐａｒｋｓ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｌｅｃｔｏｒｏｎｉｃｓ．Ａｌｏｈａ，（ＯＲ）］を用いて、処理直前（１０日）ならびに治療開始後１ヶ月（４０日）に、両方の後脚で測定した。個々の場合、麻酔下で、ウサギの後脚の毛を剃りきれいにした。トップラープローブを用いて、後脛骨動脈のパルスを同定し、後脚の心収縮期血圧を、標準的技術を用いて測定した（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９３，６６２−６７０、１９９４ａ）。ウシの血圧比は、虚血脚の心収縮期血圧と正常な脚のそれの比率として、それぞれのウサギ毎に定義した。
【０１３５】
インビボでのドップラーフロー測定
前記の方法（Ｂａｕｔｅｒｓ．Ｃ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６７，Ｈ１２６３−Ｈ１２７１、１９９４）に従って、０．０１８／ドップラーガイドワイヤー（Ｃａｒｄｉｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて、選択的腸骨内血液造影前１０日および４０日に、インビボで血流量を測定した。虚血脚の代わりとなる腸骨内動脈の隣接セグメントへの共通の腸骨動脈の源に、ワイヤーチップを位置付けた。スペクトルピーク速度の時間平均（ＡＰＶ）(time average of the spectral peak velocity) を静止状態で記録し、最大ＡＰＶを２ｍｇのパパベリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のボーラス注射の後記録した。
【０１３６】
ドップラー誘導血流（ＱＤ）を、ＱＤ＝（πｄ２／４）（０．５ｘＡＰＶ）（式中、ｄはベッセル直径であり、ＡＰＶはスペクトルピーク速度の時間平均である）として、計算した。腸骨動脈の管腔直径は、インビボで以前に確認された自動エッジ検出システムでの血管造影によって測定された。血管直径を、ドップラーサンプル容量の部位（ワイヤーチップに５ｍｍの距離）で測定した。断面積領域を、環状内腔と仮定して計算した。平均速度を、ベッセルを横切る時間平均化放物線状速度プロフィールと仮定することによって、０．５ｘＡＰＶで評価した。この様式で計算されたドップラー誘導血流は、インビトロおよびインビボの両方で電磁フローメーターによって測定された血流測定との相関で示された（Ｔｓｕｒｕｍｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９４，３２８１−３２９０、１９９６）。２ｍｇのパパベリンは、管の直径に影響を与えなかった（Ｋｕ，Ｄ．Ｄ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６５，Ｈ５８６−Ｈ５９２、１９９３）ので、直径測定値を用いて静止および最大血流の両方を計算した。
【０１３７】
選択的血管造影法
選択的腸骨内血管造影は、前記の方法（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ，Ｓ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９３，６６２−６７０、１９９４ａ）に従って、成し遂げられた。カテーテルのチップを、第７腰椎と第一仙椎との間の空間レベルで、腸骨内動脈内に配置した。全５ｍｌの非イオン性対照培地（Ｉｓｏｖｕｅ−３７０；Ｓｑｕｉｂｂ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｎｅｗ Ｂｒａｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）を、腸骨内動脈に配置した３Ｆ摂取カテーテル（Ｔｒａｃｋｅｒ−１８；Ｔａｒｇｅｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を通して、流速１ｍｌ／ｓで、自動血管造影インジェクターで注入した。次いで、虚血腔脚の一連の像を、１０５ｍｍスポットフィルム上に、１秒当たり１フィルムの割合で少なくとも１０秒間、記録した。血管造影完了後、カテーテルを除去し、傷を閉じた。
【０１３８】
側副血管発達の定量的血管造影分析は、５ｍｍ離れた間隔で列に並べられた２．５ｍｍ直径の円からなるグリッドの重塁を用いて行われた。この重塁は、４ｓ血管造影図の中央大腿領域上に置かれた。中央大腿領域内のグリッド腱画の総数、ならびに対比混濁化(contrast-opacified)動脈と交差する腱画の総数を、単一盲検様式でカウントした。血管造影スコアを、それぞれのフィルムについて、混濁化動脈と交差するグリッド腱画を、中央大腿のグリッド腱画の総数で割った比率として、計算した。
【０１３９】
毛細管密度
血管密度を、虚血後脚から採取した光学顕微鏡切片を用いて、毛細血管レベルで評価した。組織検体は、動物屠殺時に、虚血脚の内転筋および半膜様筋からの横切片として得られた。筋肉サンプルを、ＯＣＴ化合物（Ｍｉｌｅｓ，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）内に包埋し、液体窒素でスナップ凍結し、５μｍ厚の切片に切断した。前記の方法（Ｚｉａｄａ，Ａ．Ｍ．ら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．，１８，７２４−７３２、１９８４）に従って、組織切片をインドキシル−テトラゾリウム法でアルカリホスファターゼで染色して毛細血管内皮細胞を検出し、次いで、エオシンで対抗染色した。２つの筋肉からの全体で２０の異なる領域を無作為に選択し、毛細血管および筋細繊維の数を２０ｘ対物レンズ下でカウントした。次に、毛細血管密度（毛細血管／ｍｍ２）および毛細血管−対−筋細繊維の比率を測定した。
【０１４０】
実施例５：ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６組換えアデノウイルス
むき出しのＤＮＡの代わりとして、以下に記載する方法に従って、ＨＩＦ−１αに基づく遺伝子構築物を持つアデノウイルスベクターを構築した。
【０１４１】
２つのＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッドを、プレウイルスプラスミドベクター（ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０ｐＡ、ｐ１Ｘ−；いわゆる「エンプティーベクター」（ＥＶ）、Ｒ．Ｄｏｌｌから得られた）内にクローン化した。上記のように、これらの２つのハイブリッドタンパク質は、ＨＩＦ−１αからのＤＮＡ−結合ドメインおよびダイマー化ドメイン（最初は、ＨＩＦ−１αのａａ３９０のＡＦ１１１部位で切除され；第二は、ａａ５３０のＥｃｏＲＩ部位で切除されている）ならびに単純ヘルペスＶＰ−１６タンパク質からのトランス活性化ドメインを含んでいる。
【０１４２】
シャトルベクターＥＶ／ＨＩＦ−１α／ＶＰ−１６．Ａｆ１１１を、ＢｓｔＢ１で直線化し、シャトルベクターＥＶ／ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６．Ｒ１をＢａｍＨ１で直線化した。個々のベクターの１５μｇのＤＮＡを４時間消化し、次いで、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって二度精製した。ペレットを５０μｌの０．１ｘＴＥに再懸濁し、トランスフェクションに用いた（トランスフェクション前、２μｌの個々の消化ＤＮＡをゲル上で走行させた）。
【０１４３】
ウイルス骨格ＤＮＡの調製
５μｇのＡｄ２ＣＭＶＢｇａｌ−６ ＤＮＡをＰｓｈＡ１およびＳｎａＢ１で、３７℃で２４時間消化し、反応物の１／１０を０．８％アガロース／ＴＢＥゲル上に走行させ、消化の完全性をチェックした。残りの反応物をトランスフェクションに用いた。
【０１４４】
Ａｄ２ＣＭＶＢｇａｌ−６骨格は、合衆国特許第５，７０７，６１８号（ここに参照としてその全体を採用される）の実施例に記載のベクターのそれとほぼ同一であるが、ベクターの欠損Ｅ１部分内へ挿入されたＢ−ｇａｌ遺伝子を含んでいた。特に、このベクターは、ＡｄＥ１に関して欠損があり、Ｅ４配列は、３４０７７のＤｌａＩ部位から３５５９７のＴａｑＩ部位まで欠損している。３３１７８から３４０８２迄のＯＲＦ６配列をＥ４領域に挿入した。ＳＶ４０早期ポリＡ配列を、ＯＲＦ６に隣接して挿入し、そうすることによって、ＯＲＦ６遺伝子からＬ５（繊維）配列内への読み通しもまた妨害される。プロテインＩＸを、その元来の位置からＢａｍＨ１フラグメントとしてのＥ４欠損領域内のウイルスゲノム内に再配置する。プロテインＩＸフラグメントは、それ自身プロモーターを含み、いずれの方向でもベクター内にクローン化することができる。構築物は前記の合衆国特許第５，７０７，６１８号の図３に示されている。
【０１４５】
トランスフェクション
以下に示すように、Ｐｒｏｍｅｇａの”Ｐｒｏｆｅｃｔｉｏｎ−Ｃａｌｃｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ”からの標準プロトコールを用いて、トランスフェクションを行った。
第１日： ６０ｍｍ皿上に２９３細胞を１ｘ１０６／皿で塗布し、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする。
第２日：
１．トランスフェクション４時間前、細胞からの培地を除き、それを４．５ｍｌの新しい増殖培地に置き換える。
２．ＤＮＡおよびＣａＣｌ２混合物
【表１】
を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ内に調製し、穏やかに混合する。混合物を、室温に１５ー３０分間、放置する。
３．３００μｌの２ｘＨＢＳでＤＮＡ−ＣａＣｌ２を沈殿させ、ＲＴで０．５−２時間インキュベートする。次いで、沈殿させたＤＮＡを細胞に加え、１６−１７時間インキュベートする。
第３日： 培地を交換する。
第５日： ６０ｍｍ皿から１００ｍｍの皿に細胞をスプリットする。
第７日： 細胞を１００ｍｍの皿から１５０ｍｍの皿にスプリットする。
第９日： それぞれのトランスフェクションから５プラークをピックアップする。
第１１日： ＥＶ＋ＲＩから１２のさらなるプラークを、ＥＶ＋Ａｆ１１１から１０のさらなるプラークをピックアップする。２５０μｌの増殖培地中でプラークを凍結解凍を３回繰り返し、−２０℃に保存した。
【０１４６】
組換えアデノウイルスの最初のスクリーニング
１．感染
第１日： 細胞を２４穴プレートに１．４ｘ１０５細胞／穴で塗布する。
第２日： ２００μｌのそれぞれのプラーク、３７℃／５％ＣＯ２で２時間、細胞を感染させ（約４０−５０％の集密度）、次いで、８００μｌの増殖培地を加える。細胞をインキュベーター内に置き、ＣＰＥが起こるまで、増殖させる。
第４日： ＣＰＥが進んだとき、それぞれのプレートの一つの穴を集菌する。
第５日： ＥＶ＋Ａｆ１１１の１０の穴から、およびＥＶ＋ＲＩの１３の穴からＣＰＥ細胞を洗浄除去する。
第８日： 残ったＣＰＥ細胞を洗浄除去する。
【０１４７】
ＣＰＥ細胞溶解物を３回凍結／解凍する。
【０１４８】
２．ＣＰＥ細胞溶解物からのウイスルＤＮＡの調製
２５０μｌのＣＰＥ
２５０μｌの２ｘプロテイナーゼＫ溶解バッファー
４０μｌの１０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ
細胞を３７℃で３時間インキュベートし、フェノール／クロロホルムで２回抽出した。サンプルを、２０℃ Ｏ／Ｎ、エタノールで沈殿させ、ペレットを２５μｌのｄｄＨ２Ｏ内に再懸濁した（溶解バッファー：４０ｍＭ ＥＤＴＡ、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、２％ＳＤＳ）。
【０１４９】
３．ウイルスＤＮＡ消化
２５μｌのＤＮＡを制限酵素ＢｃII、５０℃ Ｏ／Ｎで消化し、次いで、０．８％アガロース／ＴＢＥゲル上で分離した。全プラークは、真の組換え体であった。バックグラウンドはなかった。ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６アデノウイルスベクターと共に含まれるアデノウイルス配列の概要を図７に示す。このベクターは、Ａｄ２ＣＭＶＢｇａｌ−６骨格とほぼ同一であったが、Ｂ−ｇａｌ遺伝子は、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッド構築物で置き換えられていた。
【０１５０】
実施例６： ＨＩＦ−１α／ＮＦκＢハイブリッドトランスアクティベーター
実験１に記載の技術と類似の技術を用いて、我々は、ＨＩＦ−１αからのＤＮＡ結合ドメインおよびダイマー化ドメインならびにＮＦ−κＢからのトランス活性化ドメインを含むキメラトランスアクティベータータンパク質をコードする核酸配列を構築した。特に、ＮＦκＢのｐ６５サブユニットの活性化ドメインをコードするＤＮＡフラグメント（Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｍ．Ｌ．およびＢａｅｕｅｒｌｅ，Ｐ．Ａ．、１９９１、ＥＭＢＯ Ｊ．，１０．３８０５−３８１７；Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｍ．Ｌ．ら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，２５６１３−２５６３０；Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｍ．Ｌ．ら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１５５７６−１５５８４）を、ＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅（ａｄｖａｎｔａｇｅ ｃＤＮＡ ＰＣＲキット、Ｃｌｏｔｅｃｈ）によって、作成した。次いで、ＤＮＡフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ−１α発現ベクターのＡｆｌ２とＸｂａＩ部位の間に挿入した。この構築物（ｐＨＩＦ−α／ＮＦ−κＢ）は、それ故、ＨＩＦ−１αのａａ１−３９０およびＨＦ−κＢ ｐ６５サブユニットのａａ４０７−５５１からなる。ＰＣＲによって生成した配列の完全性を、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。
【０１５１】
最初のインビトロでの発現は、ＨＩＦ−１α／ＮＦ−κＢハイブリッドの能力を上昇させるために行われ、ＨｅＬａ細胞内の内因性ＶＥＧＦ遺伝子の発現を活性化した。実施例３に記載した方法と類似の方法を用いて、ｐＨＩＦ−１α／ＮＦ−κＢ構築物を、ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６構築物と共に、ｐＨＩＦ−１α（全長、野生型ＨＩＦ−１α遺伝子）を対照として、平衡にＨｅＬａ細胞のプレート内に二重にトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後、ＨＩＦ−１α活性を誘導するために、１セットのプレートをデスフェリオキサミンに晒し、その他のセットは、処理しないままに置いた。培養液は、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステム）によるＶＥＧＦアッセイのために、誘導４８時間後に集菌した。図８上図に示すように、ｐＨＩＦ−１α／ＮＦ−κＢ構築物は、本質的に活性であるらしい、即ち、非誘導細胞内で検出されたＶＥＧＦレベルは、比較的高く、誘導されたｍｏｃｋ−トランスフェクト細胞のそれと等しかった。しかしながら、ｐＨＩＦ−１α／ＮＦ−κＢ構築物でトランスフェクトされた細胞内のＶＥＧＦ発現の全体レベルは、ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６でトランスフェクトされた細胞内で認められたそれほど高くはなかった。
【０１５２】
類似の実験が、Ｈｅｐ３Ｂ細胞内へのトランスフェクション後、ｐＨＩＦ−１α／ＮＦ−κＢによるエリトロポイエチン（ＥＰＯ）遺伝子発現のアップレギュレーションを評価するために、行われた。ＶＥＧＦと共に、ｐＨＩＦ−１α／ＮＦ−κＢでの細胞のトランスフェクションは、結果として非誘導下でも内因性ＥＰＯを発現したが、そのＥＰＯレベルは、ｐＨＩＦ−１α／ＶＰ１６でトランスフェクトされた細胞内で認められたそれより低い（図８下図）。
【０１５３】
本発明は開示された実施態様に関連して記載されているが、様々な修飾を、本発明の精神から離れることなく作り出すことができることを理解すべきである。従って、本発明は、請求の範囲によってのみ制限される。
【０１５４】
参考文献
【表２】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】図１は、ハイブリッド構築物ｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６／Ａｆｌ２の制限マップを示す。
【図２】図２は、ハイブリッド構築物ｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６／ＲＩの制限マップを示す。
【図３】図３は、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッド構築物が、２９３細胞において、ＥＰＯまたはＶＥＧＦ遺伝子発現を活性化する能力を試験したアッセイ結果を示す。
【図４】図４は、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッド構築物が、ＨｅＬａ細胞において、ＥＰＯまたはＶＥＧＦ遺伝子発現を活性化する能力を試験したアッセイ結果を示す。
【図５】図５は、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッド構築物が、ＨｅＬａ細胞において、内因性ＶＥＧＦ遺伝子発現を活性化する能力を試験したアッセイ結果を示す。
【図６】図６は、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッド構築物が、２９３細胞において、ＥＰＯ（左）またはＶＥＧＦ（右）遺伝子発現を活性化する能力を試験した結果を示す。
【図７】図７は、ＨＩＦ−１α／ＶＰ１６ハイブリッドアデノウイルスベクターに含まれるアデノウイルス配列の図式を示す。
【図８】図８は、ＨＩＦ−１α／ＮＦκＢ構築物が、ＨｅＬａ細胞において内因性ＶＥＧＦ遺伝子発現（上）を、そしてＨｅｐ３Ｂ細胞において、内因性ＥＰＯ遺伝子発現（下）を活性化する能力を試験したアッセイ結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）低酸素症誘導性因子タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン；および
（ｂ）転写活性化が可能なタンパク質ドメイン
を含む、生物学的に活性があるキメラトランス活性化タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項２】
低酸素症誘導性因子タンパク質がＨＩＦ−１αである、請求項１の核酸分子。
【請求項３】
ＨＩＦ−１αのＤＮＡ結合ドメインが最初のアミノ酸からＡｆｌ２部位までのアミノ酸残基を含む、請求項２の核酸分子。
【請求項４】
転写活性化が可能なタンパク質ドメインが：ＨＳＶ ＶＰ１６；ＮＦκＢ；熱ショック因子；ｐ５３；ｆｏｓ；ｖ−ｊｕｎ；因子ＥＦ−Ｃ；ＨＩＶ ｔａｔ；ＨＰＶ Ｅ２；Ａｄ Ｅ１Ａ；Ｓｐ１；ＡＰ１；ＣＴＦ／ＮＦ１；Ｅ２Ｆ１；ＨＡＰ１；ＨＡＰ２；ＭＣＭ１；ＰＨＯ２；ＧＡＬ４；ＧＣＮ４；およびＧＡＬ１１からなる群より選択されるタンパク質由来である、請求項１の核酸分子。
【請求項５】
低酸素症誘導性因子タンパク質がヒト低酸素症誘導性因子ＨＩＦ−１αである、請求項４の核酸分子。
【請求項６】
低酸素症誘導性因子タンパク質がＨＩＦ−１αであり、そして転写活性化が可能なタンパク質ドメインがＨＳＶ ＶＰ１６由来の転写活性化ドメインである、請求項１の核酸分子。
【請求項７】
ＨＩＦ−１αのＤＮＡ結合ドメインが最初のアミノ酸からＡｆｌ２部位までのアミノ酸残基を含む、請求項６の核酸分子。
【請求項８】
低酸素症誘導性因子タンパク質がＨＩＦ−１αであり、そして転写活性化が可能なタンパク質ドメインがＮＦκＢ由来の転写活性化ドメインである、請求項１の核酸分子。
【請求項９】
ＨＩＦ−１αのＤＮＡ結合ドメインが最初のアミノ酸からＡｆｌ２部位までのアミノ酸残基を含む、請求項８の核酸分子。
【請求項１０】
低酸素症誘導性因子タンパク質がヒト低酸素症誘導性因子である、請求項１の核酸分子。
【請求項１１】
低酸素症誘導性因子タンパク質がヒトＨＩＦ−１αである、請求項１の核酸分子。
【請求項１２】
発現調節配列に、機能可能であるように連結されている、請求項１−１１のいずれか１つの核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項１３】
発現調節配列が誘導性プロモーターを含む、請求項１２の発現ベクター。
【請求項１４】
発現ベクターがｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６／Ａｆｌ２である、請求項１２の発現ベクター。
【請求項１５】
ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項１２の発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１２−１５のいずれか１つの発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１−１１のいずれか１つの核酸分子にコードされる、生物学的に活性があるキメラトランス活性化タンパク質。
【請求項１８】
請求項１２−１５のいずれか１つの発現ベクターおよび薬学的に許容しうるキャリアーを含む、薬剤組成物。
【請求項１９】
請求項１２−１５のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む、低酸素症誘導性遺伝子の標的細胞における発現を増加させるための薬剤。
【請求項２０】
請求項１２−１５のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む、酸素正常条件下で細胞における生物学的に活性があるＨＩＦ−１αの持続発現を提供するための薬剤。
【請求項２１】
請求項１２−１５のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む、低酸素症関連障害を有する哺乳類患者における虚血性組織損傷を減少させるための薬剤。
【請求項２２】
請求項１−１１のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、酸素正常条件下で細胞における生物学的に活性があるＨＩＦ−１αの持続発現を提供するための薬剤であって、前記核酸分子が前記細胞におけるその発現を指示する発現調節配列に、機能可能であるように連結されている、前記薬剤。
【請求項２３】
請求項１−１１のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、低酸素症関連障害を有する哺乳類患者における虚血性組織損傷を減少させるための薬剤。
【請求項１】
（ａ）低酸素症誘導性因子タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン；および
（ｂ）転写活性化が可能なタンパク質ドメイン
を含む、生物学的に活性があるキメラトランス活性化タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項２】
低酸素症誘導性因子タンパク質がＨＩＦ−１αである、請求項１の核酸分子。
【請求項３】
ＨＩＦ−１αのＤＮＡ結合ドメインが最初のアミノ酸からＡｆｌ２部位までのアミノ酸残基を含む、請求項２の核酸分子。
【請求項４】
転写活性化が可能なタンパク質ドメインが：ＨＳＶ ＶＰ１６；ＮＦκＢ；熱ショック因子；ｐ５３；ｆｏｓ；ｖ−ｊｕｎ；因子ＥＦ−Ｃ；ＨＩＶ ｔａｔ；ＨＰＶ Ｅ２；Ａｄ Ｅ１Ａ；Ｓｐ１；ＡＰ１；ＣＴＦ／ＮＦ１；Ｅ２Ｆ１；ＨＡＰ１；ＨＡＰ２；ＭＣＭ１；ＰＨＯ２；ＧＡＬ４；ＧＣＮ４；およびＧＡＬ１１からなる群より選択されるタンパク質由来である、請求項１の核酸分子。
【請求項５】
低酸素症誘導性因子タンパク質がヒト低酸素症誘導性因子ＨＩＦ−１αである、請求項４の核酸分子。
【請求項６】
低酸素症誘導性因子タンパク質がＨＩＦ−１αであり、そして転写活性化が可能なタンパク質ドメインがＨＳＶ ＶＰ１６由来の転写活性化ドメインである、請求項１の核酸分子。
【請求項７】
ＨＩＦ−１αのＤＮＡ結合ドメインが最初のアミノ酸からＡｆｌ２部位までのアミノ酸残基を含む、請求項６の核酸分子。
【請求項８】
低酸素症誘導性因子タンパク質がＨＩＦ−１αであり、そして転写活性化が可能なタンパク質ドメインがＮＦκＢ由来の転写活性化ドメインである、請求項１の核酸分子。
【請求項９】
ＨＩＦ−１αのＤＮＡ結合ドメインが最初のアミノ酸からＡｆｌ２部位までのアミノ酸残基を含む、請求項８の核酸分子。
【請求項１０】
低酸素症誘導性因子タンパク質がヒト低酸素症誘導性因子である、請求項１の核酸分子。
【請求項１１】
低酸素症誘導性因子タンパク質がヒトＨＩＦ−１αである、請求項１の核酸分子。
【請求項１２】
発現調節配列に、機能可能であるように連結されている、請求項１−１１のいずれか１つの核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項１３】
発現調節配列が誘導性プロモーターを含む、請求項１２の発現ベクター。
【請求項１４】
発現ベクターがｐｃＤＮＡ３／ＨＩＦ／ＶＰ１６／Ａｆｌ２である、請求項１２の発現ベクター。
【請求項１５】
ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項１２の発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１２−１５のいずれか１つの発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１−１１のいずれか１つの核酸分子にコードされる、生物学的に活性があるキメラトランス活性化タンパク質。
【請求項１８】
請求項１２−１５のいずれか１つの発現ベクターおよび薬学的に許容しうるキャリアーを含む、薬剤組成物。
【請求項１９】
請求項１２−１５のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む、低酸素症誘導性遺伝子の標的細胞における発現を増加させるための薬剤。
【請求項２０】
請求項１２−１５のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む、酸素正常条件下で細胞における生物学的に活性があるＨＩＦ−１αの持続発現を提供するための薬剤。
【請求項２１】
請求項１２−１５のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む、低酸素症関連障害を有する哺乳類患者における虚血性組織損傷を減少させるための薬剤。
【請求項２２】
請求項１−１１のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、酸素正常条件下で細胞における生物学的に活性があるＨＩＦ−１αの持続発現を提供するための薬剤であって、前記核酸分子が前記細胞におけるその発現を指示する発現調節配列に、機能可能であるように連結されている、前記薬剤。
【請求項２３】
請求項１−１１のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、低酸素症関連障害を有する哺乳類患者における虚血性組織損傷を減少させるための薬剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００７−１９５５５５（Ｐ２００７−１９５５５５Ａ）
【公開日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−４０９８７（Ｐ２００７−４０９８７）
【出願日】平成１９年２月２１日（２００７．２．２１）
【分割の表示】特願２０００−５２３３４５（Ｐ２０００−５２３３４５）の分割
【原出願日】平成１０年１２月４日（１９９８．１２．４）
【出願人】（３９１０１８５３６）ジェンザイム・コーポレーション (13)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＺＹＭＥ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月９日（２００７．８．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２１日（２００７．２．２１）
【分割の表示】特願２０００−５２３３４５（Ｐ２０００−５２３３４５）の分割
【原出願日】平成１０年１２月４日（１９９８．１２．４）
【出願人】（３９１０１８５３６）ジェンザイム・コーポレーション (13)
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＺＹＭＥ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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