遺伝子発現プロファイルおよび使用の方法
本発明は、遺伝子発現プロファイル、遺伝子発現プロファイルを表す核酸配列を含むマイクロアレイ、および発現プロファイルおよびマイクロアレイを使用する方法に関する。本発明は、癌を検出するための診断アッセイのための方法および組成物、ならびに癌を処置するための治療方法および組成物も提供する。本発明は、癌に対する治療をデザインし、同定し、そして最適化するための方法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現プロファイル、遺伝子発現プロファイルを表す核酸配列を含むマイクロアレイならびに遺伝子発現プロファイルおよびマイクロアレイを使用する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
多くの疾患状態は、遺伝子ＤＮＡのコピー数の変化によりまたは特定の遺伝子の転写のレベルの変化により（例えば、開始のコントロール、ＲＮＡ前駆体の提供、ＲＮＡプロセッシング等により）種々の遺伝子の発現レベルの差により特徴付けられる。例えば、遺伝子物質の損失および獲得(gain)は、悪性トランスフォーメーションおよび進行において重要な役割を演じる。これらの獲得および損失は、少なくとも２つの種類の遺伝子、癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子により「駆動される」と考えられる。癌遺伝子は、腫瘍発生のポジティブレギュレーターであり、腫瘍抑制遺伝子は腫瘍発生のネガティブレギュレーターである(Marshall, Cell 64: 313-326, 1991; Weinberg, Science 254: 1138-1146, 1991)。従って、レギュレーションされていない成長を活性化する１つの機構は、癌遺伝子タンパク質をコードする遺伝子の数を増加させることまたはこれらの癌遺伝子の発現のレベルを増加させること（例えば、細胞変化または環境変化に応答して）であり、そして他の機構は遺伝子物質を失うことまたは腫瘍抑制遺伝子をコードする遺伝子の発現のレベルを減少させることである。このモデルは、グリオーマ進行と関連した遺伝子物質の損失および獲得により支持される(Mikkelson, et al., J. Cellular Biochem. 46:3-8, 1991)。かくして、特定の遺伝子（例えば癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子）の発現（転写）レベルの変化は、種々の癌の存在および進行の道標として役立つ。
【０００３】
これらの種々の疾患（例えば癌）を処置するための治療剤として使用される化合物は、これらの遺伝子発現変化の一部またはすべてを多分逆にする。従って、これらの遺伝子の少なくとも一部の発現変化は、このような治療の有効性を監視または予測すらするための方法として使用されうる。これらの発現変化の解析は、関心のあるターゲット組織（例えば、癌）においてまたはいくらかの代理細胞集団（例えば、末梢血白血球）において行うことができる。後者の場合には、発現変化パターンが有効性のマーカーとして使用されるためには、有効性（例えば、腫瘍収縮または非成長）と遺伝子発現変化の相関は、特に強くなければならない。
【０００４】
多数の研究室が、分子レベルでヒト腫瘍を分類するために、マイクロアレイまたは他の方法により遺伝子発現解析を使用することに成功したことを報告した(Bittner et al., Nature 406：536-540, 2000; Alon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 6745-6750, 1999; Alizadeh et al., Nature 403: 503-511, 2000; Golub et al., Science 286: 531-537, 1999; Perou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 9212-9217, 1999; Kahn et al., American Journal of Pathology 155: 1887-1900, 2000)。個々にまたはサブセットとしてこの方法で同定された遺伝子は、治療化合物（１つまたは複数）の有効性と相関する変化について追跡されうるマーカーとして使用することができ、または特定の治療からどの患者が利益を得ることができるかを予測するために使用することができる。同様に、研究室は、凍結された全血または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）から単離されたＲＮＡの遺伝子発現プロファイルを使用して疾患（例えば、癌）と関連している遺伝子発現パターンを同定したり、治療に対する感受性を予測する遺伝子発現パターンを同定した(DePrimo et al, BMC Cancer 3:3, 2003; Kaneta et al, Jpn. J. Cancer Res. 93:849-856, 2002; Hofmann et al, The Lancet 359: 481-486, 2002; Whitney et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 1896-1901, 2003.)。これに関して、血液細胞は、疾患状態の同定または治療に対する応答のための代理システムまたは循環しているバイオセンサと考えることができる。
【０００５】
全ＲＮＡは、ソラフェニブの臨床試験において記録された肝細胞癌を有する患者から採取された全血サンプルから単離された。ＲＮＡを、Affymetrix技術により各サンプルから分析し、そしてＲＥＣＩＳＴまたはＷＨＯ基準により規定されたソラフェニブに対する患者の応答と比較して、患者の応答を予測するために使用されうる遺伝子のサブセットを同定した。
【０００６】
発明の要約
本発明は、遺伝子発現プロファイル、該遺伝子発現プロファイルを表す核酸配列を含むマイクロアレイ、ならびに該遺伝子発現プロファイルおよびマイクロアレイを使用する方法を指向する。
【０００７】
本発明の１つの態様では、遺伝子発現プロファイルは、薬物への暴露の後変化した発現を示す１つ以上の遺伝子（例えば、配列番号１〜１８）を含む発現プロファイルである。例えば、発現プロファイルは、マルチキナーゼ阻害剤（例えば、ソラフェニブ）に暴露した後に変化した発現を示す１つ以上の遺伝子を含む。
【０００８】
他の態様では、発現プロファイルは、薬物への暴露の後変化した発現を示す１つ以上のポリペプチドコード遺伝子（例えば、配列番号１〜１８）を含む発現プロファイルである。例えば、発現プロファイルは、マルチキナーゼ阻害剤（例えば、ソラフェニブ）に暴露した後に変化した発現を示す１つ以上のポリペプチドを含む。
【０００９】
マルチキナーゼ阻害剤（例えば、ソラフェニブ）に暴露した後に変化した発現を示す１つ以上の遺伝子を含むマイクロアレイも、本発明の範囲内にある。本発明の他の態様では、マイクロアレイは、表１に列挙された遺伝子（配列番号１〜１８）からなる群より選ばれる１つ以上の遺伝子を含むマイクロアレイであることができる。更なる態様では、マイクロアレイは、表１に列挙された遺伝子（配列番号１〜１８）を含む群から単離された１つ以上のバイオマーカーを含むマイクロアレイであることができる。
【００１０】
更に、本発明の他の局面は、癌の予防、診断、予後および治療のための方法および試薬を提供することである。
【００１１】
本発明は、組織または細胞サンプルに対する薬物または処置（例えば、マルチキナーゼ阻害剤）の効果をスクリーニングし、組織または細胞サンプルに対する毒性効果をスクリーニングし、組織または細胞サンプルにおける疾患状態を同定し、患者診断を与え、処置に対する患者の応答を予測し、コントロールと薬物処置されたサンプル間で識別し、正常なサンプルと腫瘍サンプルとを識別し、新規な薬物を発見し、そして組織または細胞サンプルにおける遺伝子発現のレベルを決定することを含むがそれらに限定されない、前記マイクロアレイを使用するための方法にも関する。
【００１２】
本発明の他の態様は、１つ以上の遺伝子（例えば、配列番号１〜１８）および／または遺伝子産物の発現のレベルを解析する工程を含み、組織または細胞サンプルにおける遺伝子発現レベルおよび／または遺伝子産物レベルを薬物への暴露の前後に解析し、そして遺伝子および／または遺伝子産物の発現レベルの変化は、薬物効果を示し、または患者診断を与え、または処置に対する患者の応答を予測する、組織または細胞サンプルに対する薬物（例えば、マルチキナーゼ阻害剤）の効果をスクリーニングするための方法である。
【００１３】
本発明の他の局面は、１つ以上の遺伝子および／または遺伝子産物の発現のレベルを解析する工程を含み、細胞の遺伝子発現レベルおよび／または遺伝子産物レベルを薬物への暴露の前後に解析し、そして遺伝子および／または遺伝子産物の発現レベルの変化は薬物有効性を示す、新規な薬物を発見するための方法である。
【００１４】
本発明は、更に、癌を有する被験体に試験化合物を投与し、そしてポリペプチドの活性を測定することを含み、ポリペプチドの活性の変化は、試験化合物が癌の処置に有用であることを示す、癌の処置に有用な化合物を同定するための方法を提供する。
【００１５】
従って、本発明は、例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト、部分アゴニスト、インバースアゴニスト、アクチベーター、コアクチベーターおよび阻害剤などのレギュレーターまたはモデュレーターとして作用することができる化合物を同定するために使用することができる方法を提供する。従って、本発明は、癌と関連したポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現をレギュレーションするための試薬および方法を提供する。ポリヌクレオチドの発現、安定性または量あるいはポリペプチドの活性をモデュレーションする試薬は、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、核酸、核酸アナログ（例えば、ペプチド核酸、ロックされた核酸(locked nucleic acid)）、または低分子(small molecule)であることができる。
【００１６】
本発明は、１つ以上の遺伝子および／または遺伝子産物の発現のレベルを解析する工程を含み、正常なサンプルと患者サンプルの遺伝子発現および／または遺伝子産物レベルを解析し、そして患者サンプルにおける遺伝子および／または遺伝子産物の発現レベルの変化は、疾患の診断に役立つ、患者の診断を与えるための方法も提供する。患者サンプルは、血液、羊水、血漿、精液、骨髄および組織生検を含むが、それらに限定されない。
【００１７】
本発明は、なお更に、癌を有する疑いのある被験体におけるポリペプチドの活性を測定することを含み、癌を有する疑いのない被験体におけるポリペプチドの活性と比較して、ポリペプチドの活性の差があるならば、被験体は癌を有すると診断される、被験体における癌を診断する方法を提供する。
【００１８】
他の態様では、本発明は、タンパク質に対する抗体を使用して患者サンプルにおけるタンパク質と反応させる、患者サンプルにおける癌を検出するための方法を提供する。
【００１９】
本発明の他の局面は、正常な組織と罹患組織の遺伝子発現および／または遺伝子産物レベルを解析し、そして遺伝子および／または遺伝子産物の発現レベルの変化が疾患状態を示す、１つ以上の遺伝子および／または遺伝子産物の発現のレベルを解析する工程を含む正常な状態と疾患状態を識別するための方法である。
【００２０】
他の態様では、本発明は、正常な細胞と比較してディファレンシャルに発現される少なくとも１つの遺伝子の、正常な細胞に対してディファレンシャルな発現を検出することを含む、細胞の表現型を決定する方法に関する。
【００２１】
更に他の態様では、本発明は、細胞の表現型を決定する方法であって、少なくとも１つのポリペプチドの、正常な細胞に対するディファレンシャルな発現を検出することを含み、このタンパク質は正常な細胞と比較してディファレンシャルに発現される、方法に関する。
【００２２】
他の態様では、本発明は、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２５または少なくとも約４０の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む核酸プローブを提供し、患者から細胞のサンプルを得、場合により細胞の第２サンプルであってその実質的すべてが非癌性である第２サンプルを提供し、核酸プローブを、該第１細胞サンプルおよび第２細胞サンプルの各々のｍＲＮＡとストリンジェントな条件下に接触させ、そして（ａ）第１細胞サンプルのｍＲＮＡとプローブのハイブリダイゼーションの量を、（ｂ）第２細胞サンプルのｍＲＮＡとプローブのハイブリダイゼーションの量と比較し、第２細胞サンプルのｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量と比較した第１細胞サンプルのｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量の差は第１細胞サンプル中の細胞の表現型を示す、ことにより患者からの細胞の表現型を決定するための方法に関する。
【００２３】
他の態様では、本発明は、患者から単離された細胞のサンプルにおける核酸のレベルを測定するための、プローブ／プライマーを含む、癌細胞または組織の存在を同定するための検査キットを提供する。ある態様では、キットは、キットを使用するためのインストラクション、細胞を懸濁するためまたは固定するための溶液、検出可能なタグまたは標識、核酸をハイブリダイゼーションし易くするための溶液、細胞を溶解するための溶液または核酸の精製のための溶液を更に含むことができる。
【００２４】
１つの態様では、本発明は、タンパク質に対して特異的な抗体を含む、癌細胞または組織の存在を同定するための検査キットを提供する。ある態様では、キットは、キットを使用するためのインストラクションを更に含む。ある態様では、キットは、細胞を懸濁するためまたは固定するための溶液、検出可能なタグまたはラベル、ポリペプチドを抗体の結合を受け易くするための溶液、細胞を溶解するための溶液またはポリペプチドの精製のための溶液を更に含むことができる。
【００２５】
他の態様では、患者から単離された細胞のサンプルにおける核酸のレベルを測定するための、プローブ／プライマーを含む、癌細胞または組織における化合物または治療の有効性を監視するための検査キットを提供する。ある態様では、キットは、キットを使用するためのインストラクション、細胞を懸濁するためまたは固定するための溶液、検出可能なタグまたは標識、核酸をハイブリダイゼーションし易くするための溶液、細胞を溶解するための溶液または核酸の精製のための溶液を更に含むことができる。
【００２６】
１つの態様では、本発明は、タンパク質に対する特異的抗体を含む、癌細胞または組織における化合物または治療の有効性を監視するための検査キットを提供する。ある態様では、キットは、キットを使用するためのインストラクションを更に含む。ある態様では、キットは、細胞を懸濁するためまたは固定するための溶液、検出可能なタグまたは標識、ポリペプチドを抗体の結合を受け易くするための溶液、細胞を溶解するための溶液またはポリペプチドの精製のための溶液を更に含むことができる。
【００２７】
本発明は、疾患または薬物処置を表す遺伝子発現プロファイルからのバイオマーカー遺伝子のセットを選ぶ工程を含む、バイオマーカーを同定する方法にも関する。
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明は、説明した特定の方法、プロトコール、細胞系、動物種または属、構築物および試薬に限定されず、それ自体変わることができることは理解されるべきである。本明細書で使用された用語は、特定の態様を説明するだけの目的のためであり、そして特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解されるべきである。
【００２９】
本明細書で使用されそして特許請求の範囲で使用された、単数形態は特記しないかぎり複数の言及を含む。従って、例えば、遺伝子という言及は、１つ以上の遺伝子を指し、そして当業者に知られている均等物を含む。
【００３０】
特記しない限り、本明細書で使用されたすべての技術用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に普通に理解されると同じ意味を有する。本明細書で説明された任意の方法、装置、およびそれらに類似した物質またはこれらに対する均等物を、本発明の実施または試験において使用することができるけれども、好ましい方法、装置および物質がここでは述べられる。
【００３１】
本明細書で挙げられたすべての刊行物および特許は、例えば、本発明と関連して使用されうる刊行物に記載の構築物および方法を説明し、そして開示する目的で参照により本明細書で組みこまれる。上記したそしてテキスト全体にわたり論議された刊行物は、本願の出願日前のそれらの開示についてのみ与えられる。本明細書でなにもなければ、本発明者は、先行発明によるこのような開示に先行する資格を与えられないことの承認と解釈されるべきである。
【００３２】
定義
便宜上、明細書、実施例および特許請求の範囲で使用されたある用語および語句の意味は、以下に与えられる。
【００３３】
語句、罹患細胞「の対応する正常な細胞」または罹患細胞「に対応する正常な細胞」または罹患細胞「の正常な対応細胞」は、罹患細胞のタイプと同じタイプの正常な細胞を指す。
【００３４】
アレイ（例えばマイクロアレイ）における「アドレス」は、エレメント、例えばオリゴヌクレオチドがアレイの固体表面に結合しているロケーションを指す。
【００３５】
本明細書で使用された用語「アゴニスト」は、タンパク質の生物活性を模倣するかまたはアップレギュレーションする（例えば強化するかまたは補充する）作用物質を指すことを意味する。アゴニストは、野生型タンパク質または野生型タンパク質の少なくとも１つの生物活性を有するその誘導体であることができる。アゴニストは、遺伝子の発現をアップレギュレーションする化合物またはタンパク質の少なくとも１つの生物活性を増加させる化合物であることもできる。アゴニストは、他の分子、例えばターゲットペプチドまたは核酸とポリペプチドの相互作用を増加させる化合物であることもできる。
【００３６】
本明細書で使用された「増幅」は、核酸配列の追加のコピーの産生に関する。例えば、増幅は、当技術分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して行うことができる(例えば、Dieffenbach, C. W. and G. S. Dveksler(1995) PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.参照)。
【００３７】
本明細書で使用された「アンタゴニスト」は、タンパク質の少なくとも１つの生物活性をダウンレギュレーションする（例えば、抑制するかまたは阻害する）作用物質を指すことを意味する。アンタゴニストは、タンパク質と他の分子、例えば、ターゲットペプチドまたは酵素基質との相互作用を阻害するかまたは減少させる化合物であることができる。アンタゴニストは、遺伝子の発現をダウンレギュレーションする化合物または存在する発現されたタンパク質の量を減少させる化合物であることもできる。例えば、マルチキナーゼ阻害剤は、このようなアンタゴニストの例である。
【００３８】
本明細書で使用された用語「抗体」は、任意のアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ等）の完全抗体を含むことおよび脊椎動物（例えば、哺乳動物）タンパク質とやはり特異的に反応性のそのフラグメントを含むことを意図する。抗体は、慣用の技術を使用してフラグメント化することができ、そして完全抗体について前記したのと同じ方法で有用性についてスクリーニングされたフラグメントであることができる。従って、この用語は、あるタンパク質と選択的に反応することができる抗体分子のタンパク質分解的に開裂された部分またはリコンビナントに調製された部分のセグメントを含む。このようなタンパク質分解フラグメントおよび／またはリコンビナントフラグメントの非限定的例は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖおよび、ペプチドリンカーにより接合されたＶ［Ｌ］および／またはＶ［Ｈ］ドメインを含有する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖ’ｓは、共有結合によりまたは非共有結合により連結されて２つ以上の結合部位を有する抗体を形成することができる。本発明は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または抗体およびリコンビナント抗体の他の精製された調製物を含む。
【００３９】
用語「アレイ」または「マトリックス」は、デバイス上のアドレス可能なロケーションまたは「アドレス」の配列を指す。ロケーションは、二次元アレイ、三次元アレイまたは他のマトリックスフォーマットで配列されうる。ロケーションの数は、いくつかから少なくとも数十万の範囲にあることができる。最も重要なことに、各ロケーションは、全体的に独立した反応部位を表す。「核酸アレイ」は、核酸プローブ、例えば遺伝子のオリゴヌクレオチドまたはより大きい部分を含有するアレイを指す。アレイ上の核酸は一本鎖であることができる。プローブがオリゴヌクレオチドであるアレイは、「オリゴヌクレオチドアレイ」または「オリゴヌクレオチドチップ」と言われる。本明細書で「バイオチップ」または「生物学的チップ」とも呼ばれる「マイクロアレイ」は、少なくとも約１００／cm2、または少なくとも約１０００/cm2の分離した領域の密度を有する領域のアレイである。マイクロアレイにおける領域は、約１０〜２５０μmの範囲の典型的な寸法、例えば直径を有し、そしてほぼ同じ距離だけアレイにおける他の領域から分離される。
【００４０】
相互に交換可能に使用される「生物学的活性」、「生物活性」、「活性」または「生物学的機能」は、本明細書ではポリペプチド（そのネイティブなコンフォメーションにあろうがまたは変性されたコンフォメーションにあろうが）によりまたはその任意のサブ配列により直接または間接に行われるエフェクター機能または抗原性機能を意味する。生物学的活性は、ポリペプチドへの結合、他のタンパク質または分子への結合、ＤＮＡ結合タンパク質としての活性、転写レギュレーターとしての活性、損傷を受けたＤＮＡに結合する能力等を含む。生物活性は、被験体ポリペプチドに直接影響を与えることによりモデュレーションされうる。あるいは、生物活性は、ポリペプチドのレベルをモデュレーションすることにより、例えば対応する遺伝子の発現をモデュレーションすることにより変えられうる。
【００４１】
本明細書で使用された用語「生物学的サンプル」は、生物からまたは生物の構成要素（例えば細胞）から得られたサンプルを指す。サンプルは、任意の生物学的組織または流体であることができる、サンプルは、患者由来のサンプルである「臨床的サンプル」であることができる。このようなサンプルは、痰、血液、血液細胞（例えば白血球）、組織または微細針生検サンプル、尿、腹水および胸膜水またはそれらからの細胞を含むが、それらに限定されない。生物学的サンプルは、組織学的目的で採取された凍結した切片などの組織の切片を含むこともできる。
【００４２】
用語「バイオマーカー」または「マーカー」は、広い範囲の細胞内および細胞外事象ならびに全体の生物の生理学的変化を包含する。バイオマーカーは、本質的に細胞機能の任意の面、例えば、シグナリング分子、転写因子、代謝物、遺伝子転写物の産生のレベルまたは比率ならびにタンパク質の翻訳後の修飾を表すことができるが、それらに限定されない。バイオマーカーは、転写レベルの全体のゲノム解析またはタンパク質レベルおよび／または修飾の全体のプロテオーム解析を含むことができる。
【００４３】
バイオマーカーは、無処置の罹患細胞と比較して疾患を有する被験体の化合物で処置された罹患細胞においてアップレギュレーションされるかまたはダウンレギュレーションされる遺伝子または遺伝子産物を指すこともできる。即ち、この遺伝子または遺伝子産物は、それが場合により他の遺伝子または遺伝子産物と共に使用されて低分子の有効性を同定し、予想しまたは検出することができるのに十分に、処置された細胞に対して特異的である。従って、バイオマーカーは、罹患細胞における化合物の有効性または化合物による処置に対するその罹患細胞の応答について特徴的な遺伝子または遺伝子産物である。
【００４４】
ヌクレオチド配列は、他のヌクレオチド配列に対して、もしもこれらの２つの配列の塩基の各々がマッチするならば、即ち、ワトソン−クリック塩基対を形成することができるならば、「相補性」である。用語「相補性鎖」は、本明細書では用語「相補体(complement)」と相互に交換可能に使用される。核酸鎖の相補体は、コード鎖の相補体または非コード鎖の相補体であることができる。
【００４５】
「遺伝子の検出剤」は、遺伝子またはそれに関係する他の生物学的分子、例えば、遺伝子から転写されたＲＮＡまたは遺伝子によりコードされたポリペプチドを特異的に検出するために使用されうる作用物質を指す。例示的検出剤は、遺伝子に対応する核酸にハイブリダイゼーションする核酸プローブおよび抗体である。
【００４６】
例えば、正常な細胞と罹患細胞との「ディファレンシャルな遺伝子発現パターン」は、正常な細胞と罹患細胞との遺伝子発現の差を反映するパターンを指す。ディファレンシャルな遺伝子発現パターンは、１つの時点での細胞と他の時点での細胞との間で得られうるか、または化合物とインキュベーションもしくは接触された細胞と化合物とインキュベーションもしくは接触されていない細胞との間でも得られうる。
【００４７】
用語「癌」は、固形腫瘍、例えば、乳房、気道、脳、生殖器官、消化管、尿路、眼、肝臓、皮膚、心臓および頚、甲状腺、副甲状腺の癌およびそれらの遠位転移を含むが、それらに限定されない。この用語は、リンパ腫、肉腫および白血病も含む。
【００４８】
乳癌の例は、侵襲的管癌、侵襲的小葉性癌、上皮内導管癌、上皮内小葉性癌を含むが、それらに限定されない。
【００４９】
気道の癌の例は、小細胞肺癌および非小細胞肺癌ならびに気管支腺腫および胸膜肺芽腫(pleuropulmonary blastoma)を含むが、それらに限定されない。
【００５０】
脳癌の例は、脳幹グリオーマおよびハイポフタルミックグリオーマ(hypophtalmic glyoma)、小脳および大脳アストロサイトーマ、髄芽腫(medulloblastoma)、上衣腫(ependymoma)および神経外胚葉腫瘍および松果体腫瘍を含むが、それらに限定されない。
【００５１】
雄生殖器官の腫瘍は、前立腺癌および睾丸癌を含むが、それらに限定されない。雌生殖器官の腫瘍は、子宮内膜癌、頸部癌(cerevical cancer)、卵巣癌、膣癌および外陰癌、ならびに子宮の肉腫を含むが、それらに限定されない。
【００５２】
消化管の腫瘍は、肛門癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、膵臓癌、直腸癌、小腸癌および唾液腺癌を含むが、それらに限定されない。
【００５３】
尿路の腫瘍は、膀胱、陰茎、腎臓、腎盂、尿管および尿道癌を含むが、それらに限定されない。
【００５４】
眼癌は、眼球内メラノーマおよび網膜芽腫(retinoblastoma)を含むが、それらに限定されない。
【００５５】
肝臓癌の例は、肝細胞癌（線維層状変異体を伴うまたは伴わない肝臓細胞癌）、胆管腫（肝臓内胆管癌）および混合肝細胞胆管癌を含むが、それらに限定されない。
【００５６】
皮膚癌は、扁平上皮癌、カポジ肉腫、悪性メラノーマ、メルケル細胞皮膚癌よび非メラノーマ皮膚癌を含むが、それらに限定されない。
【００５７】
頭部および頸部癌は、喉頭／下咽頭／鼻咽頭／口腔咽頭癌および唇癌および口腔癌を含むが、それらに限定されない。
【００５８】
リンパ腫は、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、ホジキン病および中枢神経系のリンパ腫を含むが、それらに限定されない。
【００５９】
肉腫は、軟質組織の肉腫、骨肉種、悪性線維性組織球腫、リンパ肉腫および横紋筋肉腫を含むが、それらに限定されない。
【００６０】
白血病は、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球白血病、慢性リンパ球白血病、慢性骨髄性白血病およびヘアリー細胞白血病を含むが、それらに限定されない。
【００６１】
「癌の罹患細胞」は、癌を有する被験体に存在する細胞を指す。すなわち、正常な細胞の変異した形態(modified form)でありそして癌を有していない被験体において存在しない細胞、または癌を有していない被験体に比較して癌を有する被験体において有意により多いまたはより少ない数で存在する細胞である。
【００６２】
用語「均等物」は、機能的に同等なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むと理解される。均等なヌクレオチド配列は、１つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失により異なる配列、例えばアレル変異体を含むことができ、従って、遺伝子コードの縮重により表１に示された核酸のヌクレオチド配列とは異なる配列を含むことができる。
【００６３】
細胞の「遺伝子発現プロファイル」または「フィンガープリント」と本明細書で交換可能に使用される用語「発現プロファイル」は、細胞における１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡレベルを表す値のセットを指す。発現プロファイルは、例えば、少なくとも約２遺伝子、少なくとも約５遺伝子、少なくとも約１０遺伝子または少なくとも約５０、１００、２００またはそれより多くの遺伝子の発現レベルを表す値を含むことができる。発現プロファイルは、多数の細胞および条件で同様なレベルで発現される遺伝子(例えば、ＧＡＰＤＨなどの恒常発現遺伝子)のｍＲＮＡレベルを含むこともできる。
【００６４】
用語「遺伝子」は、ポリペプチドまたは前駆体の産生のために必要なコントロール配列およびコード配列を含む核酸配列を指す。ポリペプチドは、完全長コード配列またはコード配列の任意の部分によりコードされうる。遺伝子は、植物、真菌、動物、バクテリアゲノムもしくはエピソーム、真核細胞の核もしくはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または化学的に合成されたＤＮＡを含む、当技術分野で知られた任意のソースに全体的にまたは部分的に由来することができる。遺伝子は、発現産物の生物学的活性もしくは化学的構造発現の速度または発現コントロールの方式に影響を与えることができるコード領域もしくは非翻訳領域において１つ以上の改変を含有することができる。このような改変は、１つ以上のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失および置換を含むが、それらに限定されない。遺伝子は、中断されていないコード配列を構成することができ、または遺伝子は適切なスプライス部位により結合された１つ以上のイントロンを含むことができる。
【００６５】
「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対形成により相補性鎖と結合する任意のプロセスを指す。例えば、２つの一本鎖核酸は、それらが二本鎖デュプレックスを形成するとき「ハイブリダイゼーションする」。二本鎖形成(double-strandedness)の領域は、一本鎖核酸の１つまたは両方の完全長、または１つの一本鎖核酸のすべてと他の一本鎖核酸のサブ配列を含むことができ、あるいは二本鎖形成の領域は、各核酸のサブ配列を含むことができる。ハイブリダイゼーションは、２つの鎖がまだ二本鎖ヘリックスを形成しているとの条件下に、あるミスマッチを含有するデュプレックスの形成も含む。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、本質的に特異的なハイブリダイゼーションをもたらすハイブリダイゼーション条件を指す。
【００６６】
核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡに関して、本明細書で使用された用語「単離された」
は、それぞれ、高分子の天然のソースに存在する他のＤＮＡｓまたはＲＮＡｓから分離された分子を指す。本明細書で使用された用語「単離された」は、細胞物質、ウイルス物質、リコンビナントＤＮＡ技術により産生されるときの培養培地、化学的に合成されるときの化学的前駆体もしくは他の化学品を実質的に含まない核酸またはペプチドも指す。更に、「単離された核酸」は、フラグメントとして天然に存在しない核酸フラグメントおよび天然の状態で見出されない核酸フラグメントを含むことができる。用語「単離された」は、精製されたポリペプチドおよびリコンビナントポリペプチドの両方を包含することを意味するポリペプチドを指さすためにも本明細書で使用される。
【００６７】
本明細書で使用された用語「標識」および「検出可能な標識」は、放射性同位元素、蛍光団、化学発光部分、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、染料、金属イオン、リガンド（例えば、ビオチンまたはハプテン）等を含むが、それらに限定されない、検出することができる分子を指す。用語「蛍光発光物質(fluorescer)」は、検出可能な範囲の蛍光を示すことができる物質またはその一部を指す。本発明で使用できる標識の特定の例は、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、アンベリフェロン、テキサスレッド、ルミノール、ＮＡＤＰＨ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびセイヨウワサビペルオキシダーゼを含む。
【００６８】
語句「発現のレベル」は、細胞における遺伝子によりコードされたｍＲＮＡ、ならびにプレｍＲＮＡ新生転写物、転写物プロセッシング中間体、成熟ｍＲＮＡおよび分解産物のレベルを指す。また、語句「発現のレベル」は、細胞におけるタンパク質またはポリペプチドのレベルを指す。
【００６９】
本明細書で使用された、用語「核酸」は、ポリヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および、適当ならば、リボ核酸（ＲＮＡ）を指す。この用語は、均等物として、ヌクレオチドアナログから作られたＲＮＡもしくはＤＮＡのアナログ、および説明されている態様に適用可能なものとして、一本鎖（センスもしくはアンチセンス）ポリヌクレオチドおよび二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきでもある。染色体、ｃＤＮＡｓ、ｍＲＮＡｓ、ｒＲＮＡｓおよびＥＳＴｓは、核酸と呼ばれるうる分子の代表的例である。
【００７０】
語句「遺伝子に対応する核酸」は、遺伝子を検出するために使用されうる核酸、例えば、遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションすることができる核酸を指す。
【００７１】
語句「ＲＮＡに由来する核酸サンプル」は、ＲＮＡから合成されうる１つ以上の核酸分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）を指し、そしてＰＣＲ（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）を使用する方法から産生されたＤＮＡを含む。
【００７２】
本明細書で使用された用語「オリゴヌクレオチド」は、例えば約１０〜約１０００ヌクレオチドを含む核酸分子を指す。本発明で使用するためのオリゴヌクレオチドは、長さが約１５〜約１５０ヌクレオチド、または約１５０〜約１０００ヌクレオチドであることができる。オリゴヌクレオチドは、天然に存在するオリゴヌクレオチドまたは合成オリゴヌクレオチドであることができる。オリゴヌクレオチドは、ホスホルアミダイト法(Beaucage and Carruthers, Tetrahedron Lett. 22: 1859-62, 1981)またはトリエステル法(Matteucci, et al., J. Am. Chem. Soc. 103:3185, 1981)または当技術分野で知られている他の化学的方法により調製されうる。
【００７３】
本明細書で使用された用語「患者」または「被験体」は、哺乳動物（例えば、ヒトおよび動物）を含む。
【００７４】
用語「百分率同一性」は、２つのアミノ酸配列間の配列同一性または２つのヌクレオチド配列間の配列同一性を指す。例えば、２つの配列間の同一性は、比較の目的でアライメントされうる各配列の特定の位置を比較することにより決定されうる。比較した配列の同等な位置が同じ塩基またはアミノ酸により占められているときは、分子はその位置で同一である。均等な部位が、同じまたは類似したアミノ酸残基（例えば、立体的および／または電子的性質が類似している）により占められているときは、分子は、その位置で相同性（類似性）であると言うことができる。相同性、類似性または同一性の百分率としての表現は、比較された配列により共有された位置での同一または類似アミノ酸の数の関数を指す。例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＥＮＴＲＥＺを含む種々のアライメントアルゴリズムおよび／またはプログラムを使用することができる。ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴは、ＧＣＧ配列解析パッケージの一部として入手可能であり(University of Wisconsin, Madison, Wis)、そして例えばデフォルト設定(default settings)と共に使用することができる。ＥＮＴＲＥＺは、National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, MDにより入手可能である。１つの態様では、２つの配列の百分率同一性は、ギャップ重量を１とするＧＣＧプログラム（例えば、各アミノ酸ギャップは、それが２つの配列間の１つのアミノ酸またはヌクレオチドミスマッチであるかのように重量を付けられる）により決定されうる。アライメントのための他の技術は、Methods in Enzymology(vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis(1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & Co., San Diego, California, USA)に記載されている。配列におけるギャップを許容するアライメントプログラムは、配列をアライメントするために利用されうる。例えば、Smith- Watermanは、配列アライメントにおいてギャップを許容するアルゴリズムの１つのタイプである(例えば、Meth. Mol. Biol. 70: 173-187, 1997 参照)。Needleman and Wunschアライメント方法を使用するＧＡＰプログラムも、配列をアライメントさせるために利用されうる。別のサーチストラテジーは、MASPARコンピューターで実行されるMPSRCHソフトウエアを使用する。MPSRCHは、Smith- Watermanアルゴリズムを使用して超大型パラレルコンピューター(massively parallel computer)で配列をスコア化する。このアプローチは、離れて関連したマッチ(distantly related matches)を検出する能力を改良し、そして小さなギャップおよびヌクレオチド配列エラーについて特に寛容である。核酸でコードされたアミノ酸配列は、タンパク質およびＤＮＡデータベースの両方をサーチするために使用されうる。個々の配列を有するデータベースは、上記Methods in Enzymology, ed. Doolittleに記載されている。データベースは、例えば、Genbank, EMBL, およびDNA Database of Japan(DDBJ)を含む。
【００７５】
本明細書で使用された、アレイに結合された核酸または他の分子は、「プローブ」 または「捕捉プローブ」と呼ばれる。アレイが１つの遺伝子に対応するいくつかのプローブを含有するとき、これらのプローブは、「遺伝子プローブセット」と呼ばれる。遺伝子プローブセットは、例えば、約２〜約２０プローブ、約２〜約１０プローブ、または約５プローブからなることができる。
【００７６】
細胞の生物学的状態の「プロファイル」は、薬物処置に応答して変化することが知られている細胞の種々の構成要素のレベルおよび細胞の生物学的状態の他のパーターベーション(perturbations)を指す。細胞の構成要素は、例えば、ＲＮＡのレベル、タンパク質量のレベルまたはタンパク質活性レベルを含む。
【００７７】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、遺伝子産物を指すときは本明細書では相互に交換可能に使用される。
【００７８】
１つの細胞における発現プロファイルおよび他の細胞における発現プロファイルにおける遺伝子の発現のレベルが十分に類似している（この類似性が、共通の特徴、例えば、同じタイプの細胞を示すように）とき、１つの細胞における発現プロファイルは他の細胞における発現プロファイルに「類似している」。
【００７９】
本明細書で使用された「低分子」は、約５kDaより小さいまたは約４kDaより小さい分子量を有する組成物を指す。低分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質または他の有機または無機分子であることができる。多くの製薬会社は、化学的および／または生物学的混合物、しばしば真菌、バクテリアまたは藻類抽出物の広範なライブラリーを有し、これらは、本発明のアッセイのいずれかによりスクリーニングされ得て、生物活性をモデュレーションする化合物を同定することができる。
【００８０】
テンプレート核酸のターゲット部位へのプローブの「特異的ハイブリダイゼーション」という用語は、ハイブリダイゼーションシグナルが明白に解明されうるような、主としてターゲットへのプローブのハイブリダイゼーションを指す。本明細書で更に記載されたように、特異的ハイブリダイゼーションをもたらすこのような条件は、相同性の領域の長さ、該領域のＧＣ含有率、およびハイブリッドの融解温度（「Ｔｍ」）に依存して変わる。従って、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション溶液および洗浄液の塩含有率、酸度および温度において変わりうる。
【００８１】
ポリペプチドの「変異体」は、１つ以上のアミノ酸残基が変えられているアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。変異体は、置換されたアミノ酸が類似した構造的または化学的性質を有する「保存性」変化（例えばイソロイシンによるロイシンの置換）を有することができる。変異体は、「非保存性」変化（例えば、グリシンのトリプトファンによる置換）を有することもできる。類似的小変異(analogous minor variations)は、アミノ酸欠失または挿入またはその両方を含むことができる。生物学的活性または免疫学的活性を無効にすることなくどのアミノ酸残基が置換、挿入または欠失されうるかを決定する際のガイダンスは、当技術分野で周知のコンピュータープログラム、例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用して同定されうる。
【００８２】
ポリヌクレオチド配列に関して使用されるときの用語「変異体」は、特定の遺伝子またはそのコード配列のポリヌクレオチド配列に関係したポリヌクレオチド配列を包含することができる。この定義は、例えば、「アレル」、「スプライス」、「種」または「多形」変異体を含むこともできる。スプライス変異体は、参照分子に対する有意な同一性を有することができるが、一般にｍＲＮＡプロセシング期間中のエキソンの別のスプライシングにより大きい数またはより少ない数のポリヌクレオチドを有するであろう。対応するポリペプチドは、追加の機能的ドメインを有することができまたはドメインの不存在を伴うことができる。種変異体は、１つの種から他の種まで変わるポリヌクレオチド配列である。得られるポリペプチドは、一般にお互いに対して有意なアミノ酸同一性を有するであろう。多形変異体は、所与の種の個体間の特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列における変化である。多形変異体は、ポリヌクレオチド配列が１塩基だけ変わる一塩基多形（ＳＮＰｓ）を包含することもできる。ＳＮＰｓの存在は、例えば、ある集団、疾患状態または疾患状態の傾向を示すことができる。
【００８３】
遺伝子の発現のレベルを決定するためのマイクロアレイ
一般に、マイクロアレイにより発現プロファイルを決定することは、下記の工程：（ａ）被験体からｍＲＮＡサンプルを得、そしてそれから標識された核酸（「ターゲット核酸」または「ターゲット」を調製し；（ｂ）ターゲット核酸がアレイ上の対応するプローブに、例えばハイブリダイゼーションまたは特異的結合により結合するのに十分な条件下で、ターゲット核酸をアレイと接触させ；（ｃ）場合により結合しなかったターゲットをアレイから除去し；（ｄ）結合したターゲットを検出し；そして（ｅ）その結果を、例えばコンピューターをベースとする解析方法を使用して解析する工程を含む。本明細書で使用された「核酸プローブ」または「プローブ」は、アレイに結合している核酸であり、これに対して「ターゲット核酸」は、アレイにハイブリダイゼーションされる核酸である。これらの工程の各々は下記に更に詳細に説明される。
【００８４】
核酸試験片は、「侵襲性」サンプリング手段または「非侵襲性」サンプリング手段を使用して試験されるべき個体から得られうる。サンプリング手段は、もしそれが動物（マウス(murine)、ヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、またはネコ動物を含む）の皮膚または器官内からの核酸の採集を伴うならば、「侵襲性」と言われる。侵襲性方法の例は、血液採集、精液採集、針生検、胸膜吸引、臍帯生検等を含む。このような方法の例は、Kim, et al.,(J. Virol. 66:3879-3882, 1992); Biswas, et al., (Ann. NY Acad. Sci. 590:582-583, 1990); およびBiswas, et al., (J. Clin. Microbiol. 29:2228-2233, 1991)により論議されている。
【００８５】
対照的に、「非侵襲性」サンプリング手段は、核酸分子を動物の内表面または外表面から回収するサンプリング手段である。このような「非侵襲性」サンプリング手段の例は、例えば、涙、唾液、尿、糞便物、汗または発汗、髪等の「スワブによる」(swabbing)採集を含む。
【００８６】
本発明の１つの態様では、試験されるべき被験体から１つ以上の細胞を得、その細胞からＲＮＡを単離する。１つの態様では、末梢血白血球（ＰＢＬｓ）細胞のサンプルが、被験体から得られる。細胞サンプルを被験体から得、次いでサンプルを所望の細胞型について濃縮する(enrich)ことも可能である。例えば、細胞を、種々の技術、例えば、所望の細胞型の細胞表面のエピトープに結合する抗体による単離、を使用して他の細胞から単離することができる。所望の細胞が固体組織中にある場合に、特定の細胞を、例えばマイクロディセクションによりまたはレーザーキャプチャーマイクロディセクション（ＬＣＭ）により切断することができる(例えば、Bonner, et al., Science 278:1481, 1997; Emmert-Buck, et al., Science 274-998 1996; Fend, et al., Am. J. Path. 154: 61, 1999; およびMurakami, et al., Kidney Int. 58: 1346, 2000参照)。
【００８７】
ＲＮＡは、種々の方法、例えば、グアニジンチオシアネート溶解(guanidium thiocyanate lysis)、次いでＣｓＣｌ遠心により組織または細胞サンプルから抽出されうる(Chirgwin, et al., Biochemistry 18:5294-5299,1979)。単一細胞からのＲＮＡは、単一細胞からのｃＤＮＡライブラリーを調製するための方法に記載のとおりに得られうる(例えば、Dulac, Curr. Top. Dev. Biol. 36:245, 1998; Jena et al., J. Immunol. Methods 190:199, 1996参照)。
【００８８】
ＲＮＡサンプルは、特定の種について更に濃縮することができる。１つの態様では、例えば、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、ＲＮＡサンプルから単離することができる。特に、ポリＴオリゴヌクレオチドは、固体支持体上に固定化されてｍＲＮＡのためのアフィニティーリガントとして役立つことができる。この目的のキット、例えばMessageMakerキット(Life Technologies, Grand Island, NY)は市販されている。
【００８９】
１つの態様では、ＲＮＡ集団は、関心のある配列、例えば表１に記載の遺伝子（例えば配列番号１〜１８）について濃縮することができる。濃縮は、例えば、プライマー特異的ｃＤＮＡ合成、またはｃＤＮＡ合成およびテンプレート指向ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に基づく多数回の線状増幅により達成されうる(例えば、Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9717, 1989; Dulac, et al., supra; Jena, et al., supra参照)。
【００９０】
特定の種または配列において濃縮されたまたは濃縮されていないＲＮＡの集団は、更に増幅させることができる。このような増幅は、単一細胞または少数の細胞からのＲＮＡを使用する場合に特に重要である。例えばＰＣＲ；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）(例えば、Wu and Wallace, Genomics 4: 560, 1989; Landegren, et al., Science 241: 1077, 1988)；ＳＳＲ法(self-sustained sequence replication)(例えば、Guatelli, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874, 1990)；核酸をベースとする配列増幅（ＮＡＳＢＡ）および転写増幅(例えば、Kwoh, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173, 1989参照)を含む種々の増幅方法が、本発明の方法で使用するために適当である。ＰＣＲ技術のための方法は、当技術分野で周知である(例えば、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification(ed. H. A. Erlich, Freeman Press, N. Y., N. Y.,m 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1990); Mattila, et al., Nucleic Acids Res. 19: 4967, 1991; Eckert, et al., PCR Methods and Applications 1: 17, 1991; PCR(eds. McPherson, et al., IRL Press, Oxford); およびU. S. Pat. No. 4,683,202参照)。増幅の方法は、例えば、Ohyama, et al., (Bio Techniques 29: 530, 2000); Luo, et al., (Nat. Med. 5: 117, 1999); Hegde, et al., (Bio Techniques 29: 548, 2000); Kacharmina, et al., (Meth. Enzymol. 303: 3, 1999); Livesey, et al., Curr. Biol. 10:301, 2000); Spirin, et al.,(Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 40: 3108, 1999); およびSakai, et al., (Anal. Biochem. 287: 32, 2000)により記載されている。ＲＮＡ増幅およびｃＤＮＡ合成は、細胞においてin situで行われることもできる（例えば、Eberwine, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3010, 1992）。
【００９１】
一般に、ターゲット分子は、マイクロアレイに対するターゲット分子のハイブリダイゼーションの検出を可能とするように標識されるであろう。即ち、プローブは、シグナル産生システムのメンバーを含むことができ、したがって直接検出可能であるか、またはシグナル産生システムの１つ以上の追加のメンバーとの組み合わさった作用を通じて検出可能である。直接検出可能な標識の例は、プローブの一部、例えばヌクレオチドモノマー単位（例えばプライマーのｄＮＭＰ）に、通常共有結合により組み込まれた同位元素部分および蛍光部分、またはプローブ分子の官能性部分に結合されうる検出可能な標識の光活性または化学的活性誘導体を含む。
【００９２】
核酸は、ＲＮＡｓの濃縮および／または増幅の期間中または後に標識されうる。例えば、逆転写は、検出可能な標識にコンジュゲーションされたｄＮＴＰ、例えば蛍光的に標識されたｄＮＴＰの存在下に行うことができる。他の態様では、ｃＤＮＡまたはＲＮＡプローブは、検出可能な標識の不存在下に合成され得、次いで、例えば、ビオチニル化されたｄＮＴＰｓもしくはｒＮＴＰを組み込みこむこと、またはいくらかの同様な手段（例えばＲＮＡｓにビオチンのソラレン誘導体を光架橋連結すること）、次いで標識されたストレプトアビジン（例えば、フィコエリトリンをコンジュゲーションされたストレプトアビジン）または均等物の添加により標識されうる。
【００９３】
関心のある蛍光部分または標識は、クマリンおよびその誘導体（例えば、７−アミノ−４−メチルクマリン、アミノクマリン）；ボディパイ染料、例えばBodipy FLおよびカスケードブルー；フルオレセインおよびその誘導体（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、オレゴングリーン）；ローダミン染料（例えば、テキサスレッド、テトラメチルローダミン）；エオシンおよびエリスロシン；シアニン染料（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７）；Fluorx、ランタニドイオンの大環状キレート（例えば、クオンタム染料（商標））；蛍光エネルギー移行染料、例えば、チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロダイマー、ＴＯＴＡＢ、ダンシル等を含む。本発明の装置またはアッセイにおいて望ましく検出されたエレメントに連結するための官能性を有する個々の蛍光化合物、またはこのような官能性を組み込むために改変されうる個々の蛍光化合物を利用することもできる(例えば、Kricka, 1992, Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press San Diego, Calif参照)。
【００９４】
化学発光標識は、ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールを含む。
【００９５】
標識は、同じシステムの１つ以上の追加のメンバーと協力して作用して検出可能なシグナルを与えるシグナル産生システムのメンバーであることもできる。このような標識の例示的なものは、特異的結合ペアのメンバー、例えばリガンド、例えば、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、抗原、多価カチオン、キレーター基等である。メンバーは、シグナル産生システムの追加のメンバーに特異的に結合することができ、そして該追加のメンバーは、直接または間接に、検出可能なシグナル、例えば、基質を色素産生性産物に転換することができる蛍光部分または酵素部分にコンジュゲーションされた抗体（例えば、アルカリホスファターゼコンジュゲート抗体等）を与えることができる。
【００９６】
関心のある追加の標識は、関連するプローブがターゲット分子に特異的に結合されるときのみシグナルを与える標識を含む。このような標識は、Tyagi and Kramer(Nature Biotech. 14: 303, 1996)およびEP0070685B1に記載の「分子ビーコン」を含む。関心のある他の標識は、U.S.Pat No 5,563,037; WO 97/17471; および WO 97/17076に記載の標識を含む。
【００９７】
他の態様では、ターゲット核酸は標識されないことがある。この場合に、ハイブリダイゼーションは、例えば、プラズモン共鳴により決定されうる（例えば、Thiel, et al., Anal. Chem. 69: 4948, 1997参照）。
【００９８】
１つの態様では、複数の（例えば、２、３、４、５またはそれより多くの）セットのターゲット核酸を標識し、そして１つのハイブリダイゼーション反応において使用する（「マルチプレックス」解析）。例えば、１つのセットの核酸は１つの細胞からのＲＮＡに対応することができ、そして他のセットの核酸は、他の細胞からのＲＮＡに対応することができる。複数のセットの核酸は、それらが識別されうるように異なる発光スペクトルを有する異なる標識、例えば異なる蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）で標識されうる。次いでこれらのセットを混合し、そして同時に１つのマイクロアレイにハイブリダイゼーションさせることができる（例えば、Shena, et al., Science 270: 467-470, 1995参照）。
【００９９】
複数のターゲット核酸を１つのアレイにハイブリダイゼーションさせる場合に使用するための識別可能な標識の例は、当技術分野で周知であり、そして２つ以上の異なる発光波長の蛍光染料、例えばＣｙ３とＣｙ５；蛍光タンパク質と染料の組み合わせ、例えばフィコエリスリンとＣｙ５；異なる発光エネルギーを有する２つ以上の同位元素、例えば３２Ｐと３３Ｐ；異なる散乱スペクトルを有する金または銀粒子；異なる処置条件、例えば温度、pH、追加の化学剤による処置などの下でシグナルを発生する標識；または処置後の異なる時点でシグナルを発生する標識を含む。シグナル発生のために１つ以上の酵素を使用することは、酵素の異なる基質特異性に基づくより多様でさえある識別可能な標識の使用を可能とする（例えば、アルカリホスファターゼ／ペルオキシダーゼ）。
【０１００】
標識された核酸の品質は、アレイへのハイブリダイゼーションの前に評価することができる。１つの態様では、Affymetrix(Santa Clara, CA)からのGeneChip（登録商標）Test3 Arrayをその目的に使用することができる。このアレイは、哺乳動物を含むいくつかの生物からの特徴付けられた遺伝子のサブセットを表すプローブを含有する。従って、標識された核酸サンプルの品質は、アレイへのサンプルのフラクションのハイブリダイゼーションにより決定することができる。
【０１０１】
本発明に従う使用のためのマイクロアレイは、低分子有効性に特徴的な遺伝子の１つ以上のプローブを含む。１つの態様では、マイクロアレイは、癌においてアップレギュレーションされる遺伝子および癌においてダウンレギュレーションされる遺伝子からなる群より選ばれる１つ以上の遺伝子に対応するプローブを含む。マイクロアレイは、例えば、低分子有効性の少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１００以上の特徴に対応するプローブを含むことができる。マイクロアレイは、表１に列挙された各遺伝子または遺伝子産物に対応するプローブを含むことができる。
【０１０２】
マイクロアレイ上には各遺伝子に対応する１つ以上のプローブが存在しうる。例えば、マイクロアレイは、１つの遺伝子または約５〜１０に対応する２〜２０のプローブを含有することができる。プローブは、低分子有効性に特徴的な遺伝子の完全長ＲＮＡ配列またはその相補体に対応することができ、またはプローブは、特異的なハイブリダイゼーションを可能とするのに十分な長さであるその部分に対応することができる。このようなプローブは、約５０ヌクレオチド〜約１００、２００、５００または１０００ヌクレオチドまたは１０００より多くのヌクレオチドを含むことができる。更に本明細書に記載されたとおり、マイクロアレイは、約１０〜５０ヌクレオチド、約１５〜３０ヌクレオチドまたは約２０〜２５ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドプローブを含有することができる。プローブは、一本鎖であることができ、そして配列特異的ハイブリダイゼーションの所望のレベルを与えるのに十分なそのターゲットに対する相補性を有するであろう。
【０１０３】
典型的には、本発明で使用されるアレイは、１００より多くの異なるプローブ／ｃｍ２の部位密度を有するであろう。アレイは、例えば、５００／ｃｍ２より多くの、約１０００／ｃｍ２より多くの、または約１０，０００／ｃｍ２より多くの部位密度を有することができる。アレイは、例えば、１つの基材上に１００より多くの異なプローブ、１つの基材上に約１０００より多くの異なるプローブ、約１０，０００より多くの異なるプローブまたは１００，０００より多くのプローブを有することができる。
【０１０４】
多数の異なるマイクロアレイ配置およびその産生のための方法は、当業者に知られており、そしてU.S.Pat Nos: 5,242,974; 5,384,261; 5,405,783; 5,412,087; 5,424,186; 5,429,807; 5,436,327; 5,445,934; 5,556,752; 5,405,783; 5,412,087; 5,424,186; 5,429,807; 5,436,327; 5,472,672; 5,527,681; 5,529,756; 5,545,531; 5,554,501; 5,561,071; 5,571,639; 5,593,839; 5,624,711; 5,700,637; 5,774,305; 5,770,456; 5,770,722; 5,837,832; 5,856,101; 5,874,219; 5,885,837; 5,919,523; 6,022,963; 6,077,674;および 6,156,501; Shena, et al., Tibtech 16: 301, 1998; Duggan, et al., Nat. Genet. 21:10, 1999; Bowtell, et al., Nat. Genet. 21:25, 1999; Lipshutz, et al., 21 Nature Genet. 20-24, 1999; Blanchard, et al., 11 Biosensors and Bioelectronics, 687-90, 1996; Maskos, et al., 21 Nucleic Acids Res. 4663-69, 1993; Hughes, et al., Nat, Biotechnol. 19: 342, 2001; に開示されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。種々の用途にアレイを使用する方法を記載する特許は、U.S.Pat Nos. 5,143,854; 5,288,644; 5,324,633; 5,432,049; 5,470,710; 5,492,806; 5,503,980; 5,510,270; 5,525,464; 5,547,839; 5,580,732; 5,661,028; 5,848,859; および5,874,219を含み、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０５】
アレイは、コントロールおよび参照核酸を含むこともできる。コントロール核酸は、例えば、原核生物遺伝子、例えば、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＣおよびｂｉｏＤ、Ｐ１バクテリオファージからのｃｒｅまたはポリＡコントロール、例えばｄａｐ、ｌｙｓ、ｐｈｅ、ｔｈｒおよびｔｒｐを含む。参照核酸は、１つの実験から他の実験までの結果の正規化および定量的レベルでの多数の実験の比較を可能とする。例示的参照核酸は、既知の発現レベルのハウスキーピング遺伝子、例えば、ＧＡＰＤＨ、ヘキソキナーゼおよびアクチンを含む。
【０１０６】
１つの態様では、オリゴヌクレオチドのアレイは、固体支持体上で合成されうる。例示的固体支持体は、ガラス、プラスチック、ポリマー、金属、メタロイド、セラミック、有機物等を含む。チップマスキング技術および光保護化学を使用して、核酸プローブのオーダードアレイを発生することが可能である。例えば、「ＤＮＡチップ」または非常に大規模な固定化されたポリマーアレイ（「VLSIPS(商標)」アレイ）として知られているこれらのアレイは、約１cm2〜数cm2の面積を有する基材上に数百万の規定されたプローブ領域を含むことができ、それにより数プローブ〜数百万のプローブを組み込むことができる(例えば、U.S.Pat No. 5,631,734参照)。
【０１０７】
核酸プローブは、少なくとも、例えば、約１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００またはそれより多くのヌクレオチドであることができ、そして完全長遺伝子を含むことができる。例えば、プローブは、表１に列挙された遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションするプローブであることができる。
【０１０８】
核酸プローブは、例えば、ゲノム、ｃＤＮＡからの遺伝子セグメントのＰＣＲ増幅（例えばＲＴ−ＰＣＲ）またはクローニングされた配列のＰＣＲ増幅により得られうる。ｃＤＮＡプローブは、当技術分野で知られている方法および更に本明細書に記載されている方法に従って、例えば、配列特異的プライマーを使用するＲＮＡの逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により調製されうる。プローブを発生させる遺伝子またはｃＤＮＡの配列は、例えば、GenBank、他の公的データベースまたは刊行物から得られうる。
【０１０９】
オリゴヌクレオチドプローブは、当技術分野で知られている標準方法により、例えば、自動化ＤＮＡ合成機または任意の他の化学的方法により合成することもできる。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Stein, et al., (Nucl. Acids Res. 16: 3209, 1988)の方法により合成することができ、そしてメチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、コントロールされた細孔ガラスポリマー支持体により調製されうる（例えば、Sarin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 7448-7451, 1988参照）。他の態様では、オリゴヌクレオチドは、２’−メチルリボヌクレオチドであることができ(Inoue, et al., Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148, 1987)、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログであることができる(Inoue, et al., FEBS Lett. 215: 327-330, 1987)。
【０１１０】
核酸プローブは、天然の核酸または化学的に改変された核酸で（例えば、ヌクレオチドアナログからなる）であることができるが、プローブは連結化学に適合しうる活性化されたヒドロキシル基を有するべきである。保護基は、光不安定性であることができ、または保護基はある化学的条件下に（例えば酸）不安定であることができる。固体支持体の表面は、光に暴露されると酸を発生する組成物を含有することができる。かくして、基質のある領域の光への暴露は、暴露された領域において保護基を除去するその領域において酸を発生させる。また合成方法は、３’−保護された５’−Ｏ−ホスホルアミダイト活性化デオキシヌクレオシドを使用することができる。この場合に、オリゴヌクレオチドは、５’から３’方向に合成され、これは遊離５’端部をもたらす。
【０１１１】
本発明の１つの態様では、アレイのオリゴヌクレオチドは、数千のオリゴヌクレオチドを産生することができる９６ウエル自動化多重スオリゴヌクレオチド合成機（Ａ．Ｍ．Ｏ．Ｓ．）を使用して合成されうる（例えば、Lashkari, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7912, 1995）。
【０１１２】
発現レベルを比較するために、標識された核酸を、ターゲット核酸とアレイ上のプローブとの結合のための十分な条件下にアレイと接触させることができる。１つの態様では、ハイブリダイゼーション条件は、所望のレベルのハイブリダイゼーション特異性を与えるように選択され得；即ち、標識された核酸とマイクロアレイ上のプローブとの間でハイブリダイゼーションが起こるのに十分な条件であることができる。
【０１１３】
ハイブリダイゼーションは、本質的に特異的なハイブリダイゼーションを可能とする条件で行うことができる。核酸の長さおよびＧＣ含有率は、熱融解点を決定し、従って、プローブのターゲット核酸への特異的ハイブリダイゼーションを得るために必要なハイブリダイゼーション条件を決定するであろう。これらのファクターは、当業者に周知であり、そしてアッセイにおいて試験することもできる。核酸ハイブリダイゼーションへの広範囲のガイドはTijssen, et al.に見出されうる(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization With Nucleic Acid Probes, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y.,(1993))。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびpHで特異的配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選ばれうる。Ｔｍは、ターゲット配列の５０％が完全にマッチしたプローブにハイブリダイゼーションする温度（規定されたイオン強度およびｐＨ下に）である。高度にストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴｍ点に等しいように選ばれうる。あるときは、用語「解離温度」（Ｔｄ）は、プローブの少なくとも半分が完全にマッチしたターゲット核酸から解離する温度を定義するために使用される。いずれにせよ、ＴｍまたはＴｄを評価するための多様な技術が利用可能であり、そして一般に上記Tijssenに記載されている。典型的には、約８０〜１００℃の理論的最大値まで、二本鎖におけるＧ−Ｃ塩基対はＴｍに約３℃寄与すると評価されるが、Ａ−Ｔ塩基対は約２℃寄与すると評価される。しかしながら、Ｇ−Ｃスタッキング相互作用、溶媒効果、所望のアッセイ温度等を考慮に入れたＴｍおよびＴｄのより高性能のモデルが利用可能である。
【０１１４】
１つの態様では、非特異的結合またはバックグラウンドシグナルは、ハイブリダイゼーション期間中洗剤（例えば、Ｃ−ＴＡＢ）またはブロッキング試薬（例えば、精子ＤＮＡ、ｃｏｔ−１ＤＮＡ等）の使用により減少させることができる。１つの態様では、ハイブリダイゼーションは、約０．５mg/mlＤＮＡ（例えば、ニシン精子ＤＮＡ）の存在において行うことができる。ハイブリダイゼーションにおけるブロッキング剤の使用は、当業者に周知である（例えば、上記Tijssen参照）。
【０１１５】
ターゲット配列が同じ標識を使用して検出されるならば、各生理学的ソースについて異なるアレイを使用することができ、または同じアレイを多数回スクリーニングすることができる。上記方法は、異なるターゲット集団（例えば、異なる生理学的ソース）について異なる標識および識別可能な標識を使用することにより多重解析を与えるように変えることができる。この多重方法に従えば、同じアレイを、異なるターゲット集団の各々について同時に使用することができる。
【０１１６】
上記した方法は、アレイ表面の標識されたターゲット核酸のハイブリダイゼーションパターンの産生をもたらす。標識された核酸の得られるハイブリダイゼーションパターンは、種々の方法で、ターゲット核酸の特定の標識に基づいて選ばれた特定の検出方式で、可視化または検出されうる。代表的な検出手段は、シンチレーション計数、オートラジオグラフィー、蛍光測定、比色測定、発光測定、光散乱等を含む。
【０１１７】
１つのこのような検出方法は、市販のアレイスキャナー（Affymetrix, Santa Clara,CA）、例えば、４１７（商標）Arrayer、４１８（商標）Array ScannerまたはAgilent GeneArray（商標）Scannerを利用する。このスキャナーは、インターフェースおよび簡単に使用できるソフトウエアツールによりシステムコンピューターからコントロールされる。アウトプットは、直接インポートされうるかまたは種々のソフトウエアアプリケーションにより直接読み出されうる。スキャニング装置は、例えば、U.S.Pat Nos. 5,143,854および5,424,186に記載されている。
【０１１８】
蛍光標識されたプローブについて、転写物アレイの各部位における蛍光発光は、スキャニング共焦点レーザー顕微鏡法により検出することができる。あるいは、２つのフルオロフォアに特異的な波長での同時の試験片照射を可能とするレーザーを使用することができ、そして２つのフルオロフォアからの発光を同時に解析することができる(例えば、Shalon, et al., Genome Res. 6:639-645, 1996参照)。例えば、アレイは、コンピューターでコントロールされたＸ−Ｙステージおよび顕微鏡対物レンズを使用するレーザー蛍光スキャナーによりスキュニングされうる。蛍光レーザースキャニング装置は、上記Shalon, et al.に記載されている。
【０１１９】
データ蓄積操作の後、典型的には、データはデータ解析操作に報告されるであろう。サンプル解析操作を促進するために、装置からリーダーにより得られたデータは、ディジタルコンピューターを使用して解析されうる。典型的には、コンピューターは、装置からのデータの受け取りおよび保存、ならびに蓄積されたデータの解析および報告、例えば、バックグラウンドの減算、多色像のデコンボリューション、アーティファクトの減少または除去、コントロールが適切に行われたことの証明、シグナルの正規化、蛍光データを解釈してハイブリダイゼーションされたターゲットの量を決定すること、バックグラウンドおよび一塩基ミスマッチハイブリダイゼーションの正規化等のために適切にプログラムされるであろう。
【０１２０】
１つの態様では、システムは、特異的パターン、例えば、被験体における癌細胞の発現プロファイルと対応の正常細胞の発現プロファイルとの間のディファレンシャルな遺伝子発現に関するパターンをサーチすることを可能とするサーチ機能を含む。例えば、システムは、２つより多くのサンプル間の遺伝子発現のパターンをサーチすることを可能とする。
【０１２１】
遺伝子発現プロファイルデータ、例えば行うべき比較のタイプを解析するための種々のアルゴリズムが利用可能である。ある態様では、コレギュレーションされる遺伝子をグループに分けることが望ましい。これは、多数のプロファイルの比較を可能とする。このような遺伝子のグループを同定するための１つの態様は、クラスタリングアルゴリズムを含む(クラスタリングアルゴリズムの概観については、例えば、Fukunaga, 1990, Statistical Pattern Recognition, 2nd Ed., Academic Press, San Diego; Everitt, 1974, Cluster Analysis, London: Heinemann Educ. Books; Hartigan, 1975, Clustering Algorithms, New York: Wiley; Sneath and Sokal, 1973, Numerical Taxonomy, Freeman; Anderberg, 1973, Cluster Analysis for Applications, Academic Press: New York参照)。
【０１２２】
クラスタリングは、遺伝子の他の特徴、例えば、それらの発現のレベル（例えば、U.S.Pat No. 6,203,987参照）に基づくことができ、または時間曲線のクラスタリングを可能とする（例えば、U.S.Pat No.6,263,287参照）。クラスタリングアルゴリズムの例は、Ｋ−ｍｅａｎｓクラスタリングおよび階層的クラスタリングを含む。クラスタリングは、データのグラフ表示を使用して遺伝子発現データの視覚による検査により達成することもできる（例えば、「ヒートマップ」）。クラスタリングアルゴリズムおよび遺伝子発現データをグラフで表示するための手段を含有するソフトウエアの例は、Spotfire DecisionSite(Spotfire, Inc., Somerville, Massachusetts and Gouteborg, Sweden)である。
【０１２３】
低分子有効性の特徴的な１つ以上の遺伝子の発現レベルの、参照発現レベル、例えば癌の罹患細胞における発現レベルまたは正常な対応細胞における発現レベル、との比較は、コンピューターシステムを使用して行うことができる。１つの態様では、発現レベルは２つの細胞から得ることができ、そしてこれらの２セットの発現レベルは比較のためにコンピューターシステムに導入することができる。例えば、１セットの発現レベルは、コンピュータームシステム中にすでに存在する値との比較のためにコンピューターシステムに入力され、または、後でコンピューターシステムに入力されるコンピューター可読形態にある。
【０１２４】
１つの態様では、コンピューターシステムは、低分子有効性に特徴的な１つ以上の遺伝子の発現のレベルを表す値を含むデータベースを含有することもできる。データベースは、異なる細胞における低分子有効性に特徴的な遺伝子の１つ以上の発現プロファイルを含有することができる。
【０１２５】
他の態様では、本発明は、遺伝子発現プロファイルデータのコンピューター可読形態または罹患細胞における癌に特徴的な少なくとも１つの遺伝子の発現のレベルに対応する値のコンピューター可読形態を与える。この値は実験、例えばマイクロアレイ解析から得られたｍＲＮＡ発現レベルであることができる。この値は、参照遺伝子であってその発現が多数の条件下に多数の細胞において一定である参照遺伝子（例えば、ＧＡＰＤＨ）に対して正規化されたｍＲＮＡレベルであることもできる。他の態様では、コンピューターにおける値は、異なるサンプルにおける正規化されたまたは正規化されていないｍＲＮＡレベルの比または異なるサンプルにおける正規化されたまたは正規化されていないｍＲＮＡレベル間の差であることができる。
【０１２６】
１つの態様では、発現プロファイルは、がん細胞が薬物、例えばマルチキナーゼ阻害剤によりｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで処置される１つ以上の被験体からの癌細胞からの発現プロファイルである。薬物によりｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで処置された被験体の細胞の発現データは、コンピューターに入力され、そしてコンピューターは、入力されたデータをコンピューターにおけるデータと比較し、そしてコンピューターへの発現データインプットが薬物に応答性の被験体の細胞のこれらにより高度に類似しているかまたは薬物に応答性ではない被験体の細胞のこれらにより高度に類似しているかどうかを示す結果を与えるようにインストラクションされる。従って、結果は、被験体が薬物による処置に応答しそうであるかまたはそれに応答しそうでないかどうかを示す。
【０１２７】
本発明は、下記の工程：（ｉ）クエリー細胞における低分子有効性に特徴的な１つ以上の遺伝子の発現レベルに対応する複数の値を、１つ以上の参照細胞の参照発現または発現プロファイルデータを含む記録および細胞のタイプのアノテーションを含むデータベースと比較する工程、および（ｉｉ）クエリー細胞が発現プロファイルの類似性に基づいてどの細胞に最も類似しているかを示す工程を行うためのプログラムインストラクションを含む機械可読媒体またはコンピューター可読媒体も提供する。参照細胞は、癌の異なる段階における被験体からの細胞であることができる。参照細胞は、特定の薬物処置に応答するまたは応答しない被験体からの細胞であって、場合により薬物とｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでインキュベーションされた細胞であることもできる。
【０１２８】
参照細胞は、いくつかの異なる処置に応答するかまたは応答しない被験体からの細胞であることもでき、そしてコンピューターシステムは被験体のための好ましい処置を示す。従って、本発明は、癌を有する患者のための治療を選ぶための方法であって、（ｉ）患者の罹患細胞における低分子有効性に特徴的な１つ以上の遺伝子の発現のレベルを提供し；（ｉｉ）各々治療と関連した複数の参照プロファイルであって、被験体発現プロファイルおよび各参照プロファイルが複数の値を有し、各値が癌に特徴的な遺伝子の発現のレベルを表す、複数の参照プロファイルを提供し；そして（ｉｉｉ）被験体発現プロファイルに最も類似した参照プロファイルを選び、それにより前記患者に対する治療を選ぶことを含む方法を提供する。１つの態様では、工程（ｉｉｉ）は、コンピューターにより行うことができる。最も類似した参照プロファイルは、対応する発現データと関連した加重値(weight value)を使用して複数の比較値に重みを付けることにより選ぶことができる。
【０１２９】
２つの生物学的サンプルにおけるｍＲＮＡの相対的アバンダンスは、パーターベーションおよび決定されたその大きさとしてスコア化されることができ（即ち、アバンダンスは、試験されたｍＲＮＡの２つのソースにおいて異なる）またはパーターベーションされていないものとしてスコア化されうる（即ち、相対的アバンダンスは同じである）。種々の態様において、ＲＮＡの２つのソース間の差はパーターベーションとしてスコア化される。パーターベーションは、計算および発現比較のためにコンピューターにより使用されうる。
【０１３０】
マイクロアレイを使用する薬物デザイン
本発明は、癌用の薬物、例えば、本明細書に記載のとおりに同定された薬物をデザインし、そして最適化するための方法も提供する。１つの態様では、癌の罹患細胞または類似した細胞の試験化合物とのインキュベーションの後に、低分子有効性に特徴的な１つ以上の遺伝子の発現レベルを比較することにより、化合物をスクリーニングすることができる。他の態様では、遺伝子の発現レベルは、マイクロアレイを使用し、そして試験化合物に応答した細胞の遺伝子発現プロファイルを癌の罹患細胞に対応する正常細胞の遺伝子発現プロファイル（「参照プロファイル」）と比較して決定することができる。更なる態様では、発現プロファイルは、癌の罹患細胞の発現プロファイルと比較することもできる。比較は、薬物で処置された細胞の遺伝子発現プロファイルデータを、適切なアルゴリズムを使用して、コンピューター可読形態で保存されている参照遺伝子発現プロファイルを含むコンピューターシステムに導入することにより行うことができる。試験化合物は、低分子有効性に特徴的な遺伝子の発現のレベルを変える化合物についてスクリーニングされうる。このような化合物、即ち、低分子有効性に特徴的な本質的にすべての遺伝子の発現を正規化することができる化合物は候補治療剤である。
【０１３１】
次いで化合物の有効性を、追加のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおいて、そして動物モデル（例えば、異種移植片モデル）において試験することができる。試験化合物は、試験動物に投与することができ、そして疾患の１つ以上の症候を動物の状態の改良のために監視することができる。低分子有効性に特徴的な１つ以上の遺伝子の発現は、動物への試験化合物の投与の前後に測定することもできる。これらの遺伝子の１つ以上の発現の正規化は、動物における癌を処置するための化合物の有効性を示す。
【０１３２】
臨床的状態において、癌を示す組織のヒト由来のサンプルを得ることは、禁止されてはいないとしても、困難でありうる。従って、治療化合物の有効性を示す遺伝子発現変化の同定は、より容易にアクセス可能な代理細胞集団、例えば、末梢血白血球（ＰＢＬｓ）において決定することができる。この方法は、ヒトまたは動物モデルシステムにおいて行うことができる。１つの態様では、試験化合物は、その動物モデルにおいて癌を処置するのに有効であることが観察された同じ用量で試験動物（正常なまたは癌含有）に投与することができる。血液を、種々の時点で（例えば、多数日投与の方式の最初、中間および最後の日の１、４、７および２４時間後）動物から採取することができる。ビヒクルを投与された動物をコントロールとして使用することができる。ＲＮＡはＰＢＬｓから単離することができ、そしてマイクロアレイへのハイブリダイゼーションのためのプローブを発生させるのに使用することができる。次いでハイブリダイゼーションの結果を、上記したコンピュータープログラムおよびデータベースを使用して解析することができる。得られる発現プロファイルを、処置された癌組織からの類似したプロファイルと類似性について直接比較することができ、または動物モデルにおいて有効性と簡単に相関させることができる（例えば、用量および時点によって）。
【０１３３】
他の態様では、ヒト血液を、動物モデルにおける治療用量と合致した用量でまたは動物モデルにおける治療用量の既知の血漿レベルと合致した用量で、治療化合物でｅｘ ｖｉｖｏで処置することができる。血液を、治療化合物で直ちに処置する（例えば、３７℃で揺する）ことができ、または血液採取後に遺伝子発現が再平衡化するのを可能とするためのある期間のインキュベーション時間（例えば、２４時間）後に処置することができる。血液は、種々の時点（例えば、４および２４時間）で治療化合物で処置することもでき、次いでＰＢＬ ＲＮＡを単離し、そしてマイクロアレイへのハイブリダイゼーションのためのプローブを創生するのに使用することができる。化合物可溶化剤（例えば、ＤＭＳＯ）をコントロールとして使用することができる。得られる発現プロファイルは、類似性について処置された癌組織からの類似したプロファイルと直接比較することができ、または動物モデルにおいて有効性と簡単に相関させることができる（例えば、用量および時点によって）。
【０１３４】
候補治療化合物の毒性は、例えば、化合物が毒性応答と関連していることが知られている遺伝子の発現を誘導するかどうかを決定することにより評価することができる。このような毒性関連遺伝子の発現は、種々の細胞型、例えば該遺伝子を発現することが知られている細胞型において決定することができる。実際、遺伝子発現の変化は、ルーチンな症状発現前安全性検査よりも感受性の高いヒト毒性のマーカーとして役立つことができる。マイクロアレイは、毒性応答と関連していることが知られている遺伝子の発現の変化を検出するために使用することができる。遺伝子発現レベルの変化が、ルーチンな症状発現前安全性検査により同定されなかった毒性事象を予測することができるということを証明するコンセプトの研究の証明を行うことを可能としうる(例えば、Huang, et al., Toxicol. Sci. 63: 196-207, 2001; Waring, et al., Toxicol. Appl. Pharmacol. 175:28-42, 2001参照)。
【０１３５】
薬物スクリーニングは、試験化合物を細胞のサンプルに加え、そして効果を監視することにより行うことができる。試験化合物を受け取らない平行サンプルをコントロールとして監視することもできる。次いで処置された細胞と無処置細胞を、顕微鏡解析、生存率試験、複製する能力、組織学的検査、細胞と関連した特定のＲＮＡまたはポリペプチドのレベル、細胞または細胞溶解物により発現された酵素活性のレベル、および細胞の他の細胞または化合物と相互作用する能力を含むがそれらに限定されない任意の適当な表現型基準により比較する。処置された細胞と無処置細胞との差は試験化合物に帰されうる効果を示す。
【０１３６】
試験化合物の望ましい効果は、癌関連マーカー核酸配列により与えられた任意の表現型に対する効果を含む。例は、ｍＲＮＡのオーバーアバンダンスを制限するか、コードされたタンパク質の産生を制限するか、またはタンパク質の機能的効果を制限する試験化合物を含む。処置された細胞と無処置細胞間で結果を比較するとき、試験化合物の効果は明らかであろう。
【０１３７】
診断および予後アッセイ
本発明は、癌においてディファレンシャルにレギュレーションされる核酸配列およびこのような配列を同定するための方法を提供する。本発明は、癌を有する被験体においてディファレンシャルにレギュレーションされるヌクレオチド配列を同定するための方法であって、被験体から得られたＲＮＡに対応する核酸サンプルを既知のアイデンティティーの１つ以上の核酸分子を含む核酸サンプルにハイブリダイゼーションさせ；そして既知のアイデンティティーの１つ以上の核酸分子への該核酸サンプルのハイブリダイゼーションを測定し、癌のない被験体から得られた核酸サンプルに比較して既知のアイデンティティーの１つ以上の核酸分子への該核酸サンプルのハイブリダイゼーションの差が、癌を有する被験体におけるヌクレオチド配列のディファレンシャルな発現を示す、ことを含む方法を提供する。
【０１３８】
一般に、本発明は、癌を有する被験体においてディファレンシャルにレギュレーションされる核酸配列を同定するための方法であって、被験体からメッセンジャーＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡサンプルからｃＲＮＡを発生させ、該ｃＲＮＡを、マイクロアレイであって、該アレイ上の分離したロケーションと安定に会合した複数の核酸分子を含むマイクロアレイにハイブリダイゼーションさせ、そして該アレイへのｃＲＮＡのハイブリダイゼーションのパターンを同定することを含む方法を提供する。本発明に従えば、アレイ上の所与のロケーションにハイブリダイゼーションする核酸分子は、もしハイブリダイゼーションシグナルが、例えば、癌を持たない被験体から得られた核酸サンプルとハイブリダイゼーションした同じアレイ上の同じロケーションにおけるハイブリダイゼーションシグナルよりも高いかまたは低いならば、ディファレンシャルにレギュレーションされていると言われる。
【０１３９】
発現パターンは、患者における薬物処置の有効性を予測するために使用されうるバイオマーカーのパネルを誘導するために使用することができる。バイオマーカーは、生物学的サンプルから単離されたＲＮＡ、腫瘍生検の凍結されたサンプルから単離されたＲＮＡに関するマイクロアレイ実験からの遺伝子発現レベル、または血清中の質量分析法由来のタンパク質質量からなることができる。
【０１４０】
データ解析のための正確な機構はデータの正確な性質に依存するであろうけれども、バイオマーカーのパネルを開発するための典型的な技法は、下記のとおりである。データ（遺伝子発現レベルまたは質量スペクトル）は、処置の前に各患者について収集される。検査が進行するにつれて、患者は、薬物処置に対するそれらの応答に従って、有効性または非有効性として分類される。多重レベルの有効性をデータモデルにおいて適応させることができるが、特にもし患者集団が数百より少ないならば、バイナリ比較が最適であると考えられる。各クラスにおける十分な数の患者を仮定して、タンパク質および／または遺伝子発現データを、当技術分野で知られている多数の技術により解析することができる。技術の多くは、伝統的統計学および機械学習の分野に由来する。これらの技術は２つの目的にも役立つ。
１．データの次元の数(dimensionality)を減少させる、−質量スペクトルまたは遺伝子発現マイクロアレイの場合に、データを、数千の個々のデータ点から、例えば約３〜１０に減少させる。この減少は、セットとして取られるときのデータ点の予想力に基づいている。
２．訓練−次いでこれらの３〜１０データ点を使用して、この場合に、有効な薬物処置を非有効薬物処置から識別するタンパク質質量または遺伝子発現のパターンを認識することを「学習する」多重機械学習アルゴリズムを訓練する。すべての患者サンプルを使用してアルゴリズムを訓練することができる。
【０１４１】
次いで、得られる訓練されたアルゴリズムを検定して、それらの予想力を測定する。典型的には、数百より少ない訓練例が入手可能であるときは、ある形態の交差検証(cross-validation)を行う。説明のために、１０倍交差検証を考える。この場合に、患者サンプルを１０個の箱(bins)の１つにランダムに割り当てる。第１ラウンドの検定において、９個の箱の中のサンプルを訓練のために使用し、そして１０番目の箱の中の残りのサンプルを使用してアルゴリズムを検定する。これを更に９回繰り返し、各回検定のための異なる箱中のサンプルを抜いておく。１０ラウンドのすべてからの結果（正しい予想および誤り）を組み合わせ、次いで予測力を評価する。異なるアルゴリズムおよび異なるパネルをこの検査のためにこの方法において比較することができる。次いで「最善の」アルゴリズム／パネル組み合わせが選ばれるであろう。この「スマートな」アルゴリズム("smart" algorithm)を次いで更なる検査で使用して、処置に最も応答しそうな患者を選ぶことができる。
【０１４２】
多くのアルゴリズムには、患者について取られた追加の情報が役立つ。例えば、性または年齢を使用して予想力を改良することができる。正規化および平滑化などのデータ変換を使用してノイズを減少させることができる。この故に、多くの異なるパラメーターを使用して多数のアルゴリズムを訓練して結果を最適化することができる。もし予想パターンがデータにおいて存在するならば、最適なまたは最適に近い「スマートな」アルゴリズムを開発することができそうである。より多くの患者サンプルが入手可能であるならば、アルゴリズムを再訓練して新しいデータを利用することができる。
【０１４３】
質量分析法を使用する例として、血漿を疎水性ＳＥＬＤＩターゲットに適用し、水中でよく洗浄し、そして質量分光計のＳＥＬＤＩ−Ｔにより解析することができる。これを１００以上の患者サンプルで繰り返すことができる。各サンプルにおけるいくらかの１６，０００ｍ／ｚ値の強度から得られるタンパク質プロファイルを統計的に解析して薬物有効性を予測する特異的ｍ／ｚ値のセットを同定する。他のＳＥＬＤＩターゲット、例えばイオン交換またはＩＭＡＣ表面を使用する同じ実験を行うこともできる。これらは、血漿中に存在するタンパク質の異なるサブセットを捕捉するであろう。更に、血漿は、ＳＥＬＤＩターゲットに適用する前に変性され、そして予備分画されることができる。
【０１４４】
本発明は、バイオマーカー、即ち、癌のための核酸および／またはポリペプチドマーカーを検出することにより、被験体が望まれない細胞増殖により特徴付けられる疾患または状態を発症する危険があるかどうかを決定するための方法を提供する。
【０１４５】
臨床的適用において、ヒト組織サンプルを、本明細書で同定されたバイオマーカーの存在および／または不存在についてスクリーニングすることができる。このようなサンプルは、針生検コア、外科切除サンプル、リンパ節組織または血清からなることができる。例えば、これらの方法は、生検を得、これを場合によりクリオスタット切断により分画して全細胞集団の約８０％に腫瘍細胞を濃縮することを含む。ある態様では、これらのサンプルから抽出された核酸を、当技術分野で周知技術を使用して増幅することができる。検出された選ばれたマーカーのレベルを、転移、非転移悪性、良性または正常組織サンプルの統計的に有効なグループと比較する。
【０１４６】
１つの態様では、診断方法は、被験体がバイオマーカーの異常なｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルを有するかどうかを、例えばノーザンブロット解析、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、in situハイブリダイゼーション、免疫沈降、ウエスタンブロットハイブリダイゼーション、または免疫組織化学により決定することを含む。本方法に従えば、細胞を被験体から得ることができ、そしてバイオマーカー、タンパク質のレベルまたはｍＲＮＡレベルを決定し、そして健康な被験体のこれらのマーカーのレベルと比較する。バイオマーカーポリペプチドまたはｍＲＮＡレベルの異常なレベルは癌を示しそうである。
【０１４７】
１つの態様では、本方法は、核酸プローブを使用して患者からの組織における癌細胞の存在を決定することを含む。特に、本方法は、
１．ヌクレオチド配列、例えば少なくとも１０、１５、２５または４０ヌクレオチドおよび核酸配列のコード配列の一部に対して相補性であり、そして腫瘍細胞においてディファレンシャルに発現されるコード配列のすべてまたは殆どすべて以下を含む核酸プローブを提供し、
２．癌細胞を潜在的に含む患者からの組織サンプルを得；
３．その実質的すべてが非癌性である細胞を含有する第２組織サンプルを提供し；
４．核酸プローブを該第１組織サンプルおよび第２組織サンプルの各々のＤＮＡとストリンジェントな条件下に接触させ（例えば、ノーザンブロットまたはin situハイブリダイゼーションアッセイにおいて）；そして
５．（ａ）第１組織サンプルのＲＮＡとプローブのハイブリダイゼーションの量を、（ｂ）第２組織サンプルのＲＮＡとプローブのハイブリダイゼーションの量と比較し、第２組織サンプルのＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量と比較して第１組織サンプルのＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量の統計的に有意な差は、第１組織サンプルにおける癌細胞の存在を示す、
ことを含む。
【０１４８】
１つの局面では、本方法は、所与のマーカー核酸配列に由来するプローブとのin situハイブリダイゼーションを含む。本方法は、標識されたハイブリダイゼーションプローブを、癌または前癌細胞を潜在的に含有する所与の型の組織のサンプルおよび正常な細胞を含有する組織のサンプルと接触させ、そしてプローブが同じ組織型の他の細胞を標識する程度と有意に異なる程度に、プローブが所与の組織型のある細胞を標識するかどうかを決定することを含む。
【０１４９】
試験細胞のｍＲＮＡを、核酸プローブ、例えば、少なくとも約１０、１５、２５または４０ヌクレオチドおよび核酸配列のコード配列の一部に対して相補性でありそして所与の組織型の正常な細胞と比較して腫瘍細胞においてディファレンシャルに発現される配列のすべてまたは殆どすべて以下と接触させ；そして、プローブのｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションの近似的量を決定し、その組織型の正常な細胞のｍＲＮＡで見られるハイブリダイゼーションの量より多くのまたは少ないハイブリダイゼーションの量は、試験細胞が癌性または前癌性であることを示す、ことにより所与のヒト組織からの試験細胞の表現型、例えば細胞が（ａ）正常であるかまたは（ｂ）癌性もしくは前癌性であるかどうかを決定する方法も本発明の範囲内にある。
【０１５０】
あるいは、上記診断アッセイは、マーカー核酸配列によりコードされたタンパク質産物を検出するために、抗体を使用して行われうる。従って、１つの態様では、アッセイは、試験細胞のタンパク質を、核酸の遺伝子産物に対して特異的な抗体と接触させ、その際マーカー核酸は、試験細胞と同じ組織型の正常な細胞において所与のコントロールレベルで発現されるマーカー核酸であり、そして抗体と試験細胞のタンパク質による免疫複合体形成の適切な量を決定し、その際同じ組織型の正常な細胞と比較して試験細胞のタンパク質と形成された免疫複合体の量の統計的に有意な差は、試験細胞が癌性または前癌性であるという指示である、ことを含むであろう。
【０１５１】
本発明において有用なポリペプチドに特異的に結合するポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体を産生するための方法は、当業者に既知であり、そして例えば、Dymecki, et al., (J. Biol. Chem. 267: 4815, 1992); Boersma & Van Leeuwen,(J. Neurosci. Methods 51: 317, 1994); Green, et al., (Cell 28: 477, 1982); and Arnheiter, et al., (Nature 294: 278, 1981)に見出されうる。
【０１５２】
他のこのような方法は、マーカー核酸配列の遺伝子産物に特異的な抗体を提供し、該遺伝子産物は、同じ組織型の非癌組織における遺伝子産物のレベルより多いかまたは少ないレベルで所与の組織型の癌組織中に存在し；所与の組織型の組織の第１サンプルを患者から得、該サンプルは癌細胞を潜在的に含み；同じ組織型（同じ患者からのものまたは正常なコントロール、例えば他の個体の細胞もしくは培養された細胞からのものであることができる）の組織の第２サンプルを提供し、この第２サンプルは正常な細胞を含有し、そして本質的に癌細胞を含有せず；前記抗体を、該抗体とサンプル中に存在するマーカー核酸配列産物との免疫複合体形成を可能とする条件下に第１および第２サンプルのタンパク質（溶解されたが分画されていない細胞においてまたはin situで、部分的に精製されていてもよい）と接触させ、そして（ａ）第１サンプルにおける免疫複合体形成の量を、（ｂ）第２サンプルにおける免疫複合体形成の量と比較し、その際第２サンプルにおける免疫複合体形成の量のと比較して、より少ない第１サンプルにおける免疫複合体形成の量の統計的に有意な差は、組織の第１サンプル中に癌細胞が存在することを示す、工程を含む。
【０１５３】
本発明は、更に、被験体から得られた細胞サンプルが異常な量のマーカーポリペプチドを有するかどうかを決定する方法であって、（ａ）被験体から細胞サンプルを得、（ｂ）そのように得られたサンプル中のマーカーポリペプチドの量を定量的に決定し、そして（ｃ）そのように決定されたマーカーポリペプチドの量を既知の標準と比較し、それにより被験体から得られた細胞サンプルが異常な量のマーカーポリペプチドを有するかどうかを決定することを含む方法を提供する。このようなマーカーポリペプチドは、免疫組織化学アッセイ、ドットプロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ等により検出することができる。
【０１５４】
イムノアッセイは、細胞サンプル中のタンパク質のレベルを定量するためによく使用され、そして多くの他のイムノアッセイ技術は当技術分野で知られている。本発明は、特定のアッセイ技法に限定されず、従って、均一な技法および不均一な技法の両方を含むことを意図する。本発明に従って行われうる例示的イムノアッセイは、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、比濁阻害イムノアッセイ（ＮＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を含む。インディケーター部分または標識基は、被験体抗体に結合させることができ、そしてアッセイ装置および適合性イムノアッセイ技法の利用可能性によりしばしば決定される方法の様々の使用の必要をかなえるように選ばれる。上記した様々なイムノアッセイを行う際に使用されるべき一般技術は、当業者に知られている。
【０１５５】
他の態様では、患者の生物学的流体（例えば、血液または尿）中のコードされた産物のレベルまたは替るものとしてポリペプチドのレベルは、その患者の細胞におけるマーカー核酸配列の発現のレベルを監視する方法として決定されうる。このような方法は、患者からの生物学的流体のサンプルを得、サンプル（またはサンプルからのタンパク質）をコードされたマーカーポリペプチドに対して特異的な抗体と接触させ、そして抗体による免疫複合体形成の量を決定する工程を含み、免疫複合体形成の量は、サンプル中のマーカーコード産物のレベルを示す。この決定は、正常な個体から採取されたコントロールサンプルにおけるまたは同じ人から以前にまたは以後に得られた１つ以上のサンプルにおける同じ抗体による免疫複合体形成の量と比較するとき、特に有益である。
【０１５６】
他の態様では、本方法は、同様に過増殖性障害の進行と相関されうる、細胞中に存在するマーカーポリペプチドの量を決定するために使用することができる。マーカーポリペプチドのレベルは、細胞のサンプルが、トランスフォーメーションされた細胞であるかまたはトランスフォーメーションされた細胞となる素因のある細胞を含有するかどうかを予測的に評価するために使用されうる。更に、本方法は、トランスフォーメーションされることが知られている細胞の表現型を評価するために使用することができ、表現型化の結果は、特定の治療方式をプランニングするのに有用である。例えば、サンプル細胞中のマーカーポリペプチドの非常に高いレベルは癌の強力な診断マーカーおよび予後マーカーである。マーカーポリペプチドレベルの観察は、例えばより侵襲性の治療の使用に関する決定に利用することができる。
【０１５７】
上記したとおり、本発明の１つの局面は、患者から単離された細胞に関して、マーカーポリペプチドのレベルがサンプル細胞において有意に減少しているかどうかを決定するための診断アッセイに関する。用語「有意に減少した」は、同様な組織起源の正常な細胞に比べて細胞がマーカーポリペプチドの減少した細胞量を有する、細胞表現型を指す。このアッセイは、試験細胞におけるマーカーポリペプチドのレベルを評価し、そして測定されたレベルを、少なくとも１つのコントロール細胞、例えば、正常な細胞および／または既知の表現型のトランスフォーメーションされた細胞において検出されたマーカーポリペプチドと比較することができる。
【０１５８】
本発明の他の局面は、正常なまたは異常なマーカーポリペプチドレベルと関連した細胞の数により決定されたマーカーポリペプチドのレベルを定量する能力である。次いで、特定のマーカーポリペプチド表現型を有する細胞の数を、患者の予後と相関させることができる。本発明の１つの態様では、病変(lesion)のマーカーポリペプチド表現型は、マーカーポリペプチドの異常に高い／低いレベルを有することが見出される生検における細胞の百分率として決定される。このような発現は、免疫組織学的アッセイ、ドットブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ等により検出されうる。
【０１５９】
組織サンプルが使用される場合には、免疫組織学的染色を使用してマーカーポリペプチド表現型を有する細胞の数を決定することができる。このような染色のために、多重プロックの組織を生検または他の組織サンプルから採取することができ、そしてプロテアーゼＫまたはペプシンなどの作用物質を使用してタンパク質分解性加水分解に付すことができる。ある態様では、サンプル細胞から核画分を単離し、そして核画分におけるマーカーポリペプチドのレベルを検出することが望ましいことがある。
【０１６０】
組織サンプルは、ホルマリン、グルタルアルデヒド、メタノール等などの試薬での処置により固定される。次いでサンプルを、マーカーポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体（例えば、モノクローナル抗体）とインキュベーションさせる。この抗体は、その後の結合の検出のために標識にコンジュゲーションさせることができる。サンプルを、免疫複合体の形成に十分な時間インキュベーションする。次いで抗体の結合を、この抗体にコンジュゲーションされた標識により検出する。抗体が標識されていない場合には、例えば、抗マーカーポリペプチド抗体のアイソタイプに対して特異的である第２の標識された抗体を使用することができる。使用されうる標識の例は、放射性核種、蛍光物質、化学発光物質、酵素等を含む。
【０１６１】
酵素が使用される場合には、酵素のための基質をサンプルに加えて着色した産物または蛍光産物を与えることができる。コンジュゲートにおいて使用するための適当な酵素の例は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ等を含む。市販されていない場合には、このような抗体−酵素コンジュゲートは、当業者に知られている技術によって容易に産生される。
【０１６２】
１つの態様では、アッセイはドットブロットアッセイとして行われる。ドットブロットアッセイは、組織サンプルを使用する特定の用途を見出す。何故ならば、それは、所定の数の細胞から産生された細胞不含有抽出物中のマーカーポリペプチドの量を相関させることにより単一細胞と関連したマーカーポリペプチドの平均量の決定を可能とするからである。
【０１６３】
同じ型の腫瘍細胞（例えば、肺および／または結腸腫瘍細胞）が、個々の癌遺伝子の均一に増加した発現または個々の癌抑制遺伝子の均一に減少した発現を示さないことがあることは、癌文献で十分に確立されている。所与の型の癌の細胞間ですら所与のマーカー遺伝子の発現のレベルの変化もあり得、１回の試験よりはむしろ一連の試験に頼る必要が更に強調される。従って、１つの局面では、本発明は、診断試験の信頼性および／または精度を改良するために、本発明の多数のプローブを使用する一連の試験を提供する。
【０１６４】
１つの態様では、本発明は、核酸プローブを組織化されたアレイにおけるＤＮＡチップ上に固定化する方法も提供する。オリゴヌクレオチドは、リソグラフィーを含む様々な方法により固体支持体に結合されうる。例えば、チップは、２５０，０００までのオリゴヌクレオチドを保持することができる。これらの核酸プローブは、例えば、長さが少なくとも約１２、１５、２５または４０ヌクレオチドのヌクレオチド配列、およびマーカー核酸配列のコード配列の一部に対して相補性でありそして腫瘍細胞においてディファレンシャルに発現される配列のすべてまたは殆どすべて以下、を含む。本発明は、種々の癌についての利用可能な試験に対する有意な利点を与える。なぜならば、それは単一チップ上の核酸マーカーのアレイを与えることにより試験の信頼性を増加させるからである。
【０１６５】
上記方法は、場合によりクリオスタット切断により分画されて腫瘍細胞に富む生検を得ることを含む。次いでＤＮＡまたはＲＮＡを抽出し、増幅し、そしてＤＮＡチップで解析してマーカー核酸配列の存在または不存在を決定する。
【０１６６】
１つの態様では、核酸プローブを二次元マトリックスまたはアレイにおいて基材上にスポットする。核酸のサンプルを標識し、次いでプローブにハイブリダイゼーションさせることができる。プローブ核酸に結合された標識されたサンプル核酸を含む二本鎖核酸は、サンプルの結合しなかった部分を洗浄除去すれば、検出することができる。
【０１６７】
プローブ核酸を、ガラス、ニトロセルロース等を含む基材上にスポットすることができる。プローブを共有結合または非特異的相互作用、例えば、疎水性相互作用により基質に結合させることができる。サンプル核酸を、放射能標識、蛍光団、発色団等を使用して標識することができる。
【０１６８】
更に他の態様では、本発明は、本発明のマーカーポリペプチドに対して発生させられる抗体のパネルを使用することを意図する。このような抗体のパネルは、癌のための信頼性のある診断プローブとして使用することができる。本発明のアッセイは、細胞、例えば肺細胞を含有する生検サンプルを、１種以上のコードされた産物に対する抗体のパネルと接触させて、マーカーポリペプチドの存在または不存在を決定することを含む。
【０１６９】
本発明の診断方法は、処置の追跡検査として使用することもでき、例えば、マーカーポリペプチドのレベルの定量は、現在の癌治療の有効性または先に使用された癌治療の有効性および患者の予後に対するこれらの治療の効果を示すことができる。
【０１７０】
更に、マーカー核酸またはマーカーポリペプチドは、最初の検出、追跡検査スクリーニング、再発の検出および化学療法または外科処置に対する処置後の監視、のための診断パネルの一部として利用することができる。
【０１７１】
従って、本発明は、細胞からのマーカーポリペプチドの増加および／または損失を検出するための診断アッセイおよび試薬を利用可能として、例えば細胞の腫瘍形成性トランスフォーメーションから生じる増殖性疾患の診断および表現型決定を助ける。
【０１７２】
上記した診断アッセイは、予後アッセイとしても使用されるように適合させることができる。このような適用は、腫瘍の進行の特徴的な段階で起こる事象に対する本発明のアッセイの感受性を利用する。例えば、所与のマーカー遺伝子は、極早期の段階で、多分細胞が悪性へと進展するように不可逆的にコミットされる前に、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされうるが、他のマーカー遺伝子は、はるかに後の段階でのみ特徴的にアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされうる。このような方法は、試験細胞のｍＲＮＡを、腫瘍進行の異なる段階で癌細胞または前癌細胞における異なる特徴的なレベルで発現される所与のマーカー核酸に由来する核酸プローブと接触させ、そして細胞のｍＲＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーションの近似的量を決定し、このような量は細胞における遺伝子の発現のレベルを示し、従って、細胞の腫瘍進行の段階を示す、工程を含むことができる。あるいは、アッセイは、試験細胞のタンパク質と接触させた所与のマーカー核酸の遺伝子産物に対して特異的な抗体により行うことができる。一連のこのような試験は、腫瘍の存在およびロケーションを開示するのみならず、臨床医が腫瘍に最も適切な処置方式を選び、そしてその処置の成功の可能性を予測することも可能とするであろう。
【０１７３】
本発明の方法は、腫瘍の臨床的経過を追跡するのに使用することもできる。例えば、本発明のアッセイは、患者からの組織サンプルに適用することができ；癌について患者を処置した後、他の組織サンプルを採取し、そして試験を繰り返す。成功した処置は、癌細胞または前癌細胞に特徴的なディファレンシャルな発現を示すすべての細胞の除去をもたらすか、またはこれらの細胞における遺伝子の発現の実質的な増加であって、多分正常なレベルに近づくかまたは正常なレベルを超えることすらある増加をもたらすであろう。
【０１７４】
更に他の態様では、本発明は、被験体が、ポリペプチドの異常な活性と関連した、癌を発生する素因などの疾患を発生する危険にさらされているかどうかを決定するための方法であって、ポリペプチドの異常な活性は、ａ）マーカーポリペプチドをコードする遺伝子の元のままの状態(integrity)に影響を与える変化または（ｂ）コード核酸の誤発現(mis-expression)の少なくとも１つにより特徴付けられた遺伝的病変(genetic lesion)の存在または不存在を検出することにより特徴付けられる。例示するために、このような遺伝的病変は、（ｉ）核酸配列からの１つ以上のヌクレオチドの欠失、（ｉｉ）核酸配列への１つ以上のヌクレオチドの付加、（ｉｉｉ）核酸配列の１つ以上のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）核酸配列の全体的染色体再構成(gross chromosomal rearrangement)、（ｖ）核酸配列のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルの全体的変化、（ｖｉ）核酸配列の、例えばゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常な修飾、（ｖｉｉ）遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、（ｖｉｉｉ）マーカーポリペプチドの非野生型レベル、（ｉｘ）遺伝子のアレル損失及び／又は（ｘ）マーカーポリペプチドの不適切な翻訳後修飾の少なくとも１つの存在を確認することにより検出されうる。
【０１７５】
本発明は、コード核酸配列における病変を検出するためのアッセイ技術を提供する。これらの方法は、配列解析、サザーンブロットハイブリダイゼーション、制限酵素部位マッピングを含む方法、および解析されるべき核酸とプローブとのヌクレオチド対形成の不存在の検出を含む方法を含むが、それらに限定されない。
【０１７６】
特異的疾患または障害、例えば遺伝的疾患または障害は、必ずしも突然変異したタンパク質をコードしないある遺伝子の多型領域の特異的アレル変異体と関連している。従って、被験体における遺伝子の多型領域の特異的アレル変異体の存在は、被験体を特異的疾患または障害を発生させやすくすることができる。遺伝子における多型領域は、個体の集団における遺伝子のヌクレオチド配列を決定することにより同定されうる。多型領域が同定されるならば、特異的疾患との連鎖(link)は、個体、例えば、癌などの特異的疾患を発生した個体の特異的集団を研究することにより決定されうる。多型領域は、遺伝子の任意の領域、例えば、エキソン、エキソンの領域のコード領域または非コード領域、イントロンおよびプロモーター領域に位置することができる。
【０１７７】
例示的態様では、遺伝子のセンス配列もしくはアンチセンス配列にハイブリダイゼーションすることができるヌクレオチド配列またはその天然に存在する突然変異体あるいは被験体遺伝子と天然に関連した５’もしくは３’フランキング配列またはイントロン配列または天然に存在するその突然変異体の領域を含む核酸プローブを含む核酸組成物が提供される。細胞の核酸は、ハイブリダイゼーションを受け易くされ、プローブをサンプルの核酸と接触させ、そしてサンプル核酸へのプローブのハイブリダイゼーションを検出する。このような技術は、欠失、置換等を含むゲノムもしくはｍＲＮＡレベルで病変もしくはアレル変異体を検出するためおよびｍＲＮＡ転写物レベルを決定するために使用することができる。
【０１７８】
検出方法の例は、突然変異もしくは多型部位にオーバーラッビングし、そして突然変異領域もしくは多型領域付近の約５、１０、２０、２５または３０ヌクレオチドを有するプローブを使用するアレル特異的ハイブリダイゼーションである。本発明の１つの態様では、アレル変異体に特異的にハイブリダイゼーションすることができるいくつかのプローブを固相支持体、例えば、「チップ」に結合させる。「ＤＮＡプローブアレイ」とも呼ばれる、オリゴヌクレオチドを含むこれらのチップを使用する突然変異検出解析は、例えば、Cronin, et al., (Human Mutation 7:244, 1996)により記載されている。１つの態様では、チップは、遺伝子の少なくとも１つの多型領域のすべてのアレル変異体を含むことができる。次いで、固相支持体を試験核酸と接触させ、そして特異的プローブに対するハイブリダイゼーションを検出する。従って、１つ以上の遺伝子の多数のアレル変異体のアイデンティティーを、簡単なハイブリダイゼーション実験において同定することができる。
【０１７９】
ある態様では、病変の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、U.S.Pat Nos. 4,683,195および4,683,202を参照のこと)、例えばアンカーＰＣＲもしくはＲＡＣＥ ＰＣＲにおけるプローブ／プライマー、または替わりにリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）(例えば、Landegran, et al., Science 241: 1077-1080, 1988; Nakazaw, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 360-364, 1994を参照のこと)におけるプローブ／プライマーを利用することを含み、その後者は、遺伝子における点突然変異を検出するために特に有用でありうる(例えば、Abravaya, et al., Nuc. Acid. Res. 23:675-682, 1995を参照のこと)。例示的態様では、上記方法は、（ｉ）患者からの細胞のサンプルを採集し、（ｉｉ）サンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方）を単離し、（ｉｉｉ）核酸サンプルを、核酸（もし存在すれば）のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下に核酸配列に特異的にハイブリダイゼーションする１つ以上のプライマーと接触させ、そして（ｉｖ）増幅産物の存在または不存在を検出するかまたは増幅産物のサイズを検出し、そして長さをコントロールサンプルと比較する工程を含む。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に記載の突然変異を検出するために使用された技術のいずれかと共に予備増幅工程として使用することが望ましいことがあると予想される。
【０１８０】
従って、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの核酸マーカーの発現を抑制または増強させる作用物質をスクリーニングする方法であって、マーカー核酸ｍＲＮＡが培養された細胞において検出可能である細胞または組織を作用物質に曝露して該作用物質がｍＲＮＡの産生を抑制または増強させることができるかどうかを決定し、そして曝露された細胞もしくは組織におけるｍＲＮＡのレベルを決定し、その際該作用物質への細胞系の曝露後のｍＲＮＡのレベルの減少はマーカー核酸ｍＲＮＡ産生の抑制を示し、そしてｍＲＮＡレベルの増加はマーカーｍＲＮＡ産生の増強を示す、ことを含む方法も包含する。
【０１８１】
あるいは、スクリーニング方法は、マーカータンパク質が培養された細胞において検出可能である細胞もしくは組織の、マーカータンパク質の産生を抑制するかまたは増強すると思われる作用物質に対するｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング、および細胞または組織におけるマーカータンパク質のレベルを決定すること、その際細胞または組織の前記作用物質への曝露後のマーカータンパク質のレベルの減少はマーカータンパク質産生の抑制を示し、そしてマーカータンパク質のレベルの増加はマーカータンパク質産生の増強を示す、ことを含むことができる。
【０１８２】
本発明は、マーカー核酸の発現を抑制または増強する作用物質をスクリーニングするｉｎ ｖｉｖｏ方法であって、マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質が検出可能である腫瘍細胞を有する被験体をマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質を抑制するまたは増強すると思われる作用物質に曝露し；そして曝露された哺乳動物の腫瘍細胞におけるマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを決定することを含むｉｎ ｖｉｖｏ方法も包含する。被験体を作用物質に曝露した後のマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルの減少は、マーカー核酸発現の抑制を示し、そしてマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルの増加は、マーカー核酸発現の増強を示す。
【０１８３】
従って、本発明は、マーカー核酸を発現する細胞を試験化合物とインキュベーションし、そしてｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを測定することを含む方法を提供する。本発明は、更に、細胞集団におけるマーカー核酸の発現のレベルを定量的に決定するための方法、および作用物質が細胞集団におけるマーカー核酸の発現のレベルを増加または減少させることができるかどうかを決定するための方法を提供する。作用物質が細胞集団におけるマーカー核酸の発現のレベルを増加または減少させることができるかどうかを決定するための方法は、（ａ）コントロールおよび作用物質で処置された細胞集団から細胞抽出物を調製し、（ｂ）細胞抽出物からマーカーポリペプチドを単離し、そして（ｃ）マーカーポリペプチドと該ポリペプチドに対して特異的な抗体とで形成された免疫複合体の量を定量する（例えば、平行に）工程を含む。本発明のマーカーポリペプチドは、その生物活性についてアッセイすることによって定量することもできる。マーカー核酸発現の増加を誘導する作用物質は、コントロール細胞において形成された免疫複合体の量と比較して処置された細胞において形成された免疫複合体の量を増加させるそれらの能力によって同定されうる。同様な方法で、マーカー核酸の発現を減少させる作用物質は、コントロール細胞と比較して処置された細胞抽出物において形成された免疫複合体の量を減少させるそれらの能力により同定されうる。
【０１８４】
予想アッセイ
所与の抗癌剤からの臨床的利益を予想することができる実験室をベースとするアッセイは、癌を有する患者の臨床的処理を顕著に高めるであろう。この効果を評価するために、抗癌剤と関連したバイオマーカーを、処置の前、処置期間中および処置後に生物学的サンプル（例えば、腫瘍サンプル、血漿）において解析することができる。
【０１８５】
処置を監視するための他のアプローチは、血清プロテオミックなスペクトトルの評価である。特定的には、血漿サンプルを質量分析法（例えば、表面増強レーザー脱離イオン化）に付すことができ、そして各患者についてプロテオミックなスペクトルを発生させることができる。処置前および処置後の患者からの血漿の解析に由来するスペクトルのセットを、処置されたサンプルを無処置サンプルから完全に識別するプロテオームパターンを同定することができる反復サーチングアルゴリズムにより解析されうる。次いで得られるパターンを使用して処置後の臨床的利益を予測することができる。
【０１８６】
生物学的サンプル（例えば、腫瘍生検サンプル、血液サンプル）の全体的遺伝子発現
プロファイリングおよびバイオインフォマティクスで駆動されるパターン同定を利用して、抗癌剤の臨床的利益および抗癌剤に対する感受性ならびに抗癌剤に対する耐性の発生を予測することができる。例えば、処置前および処置期間中患者からの全血に由来する細胞から単離されたＲＮＡを使用して、Affymetrix GeneChip技術およびアルゴリズムを利用して血液細胞遺伝子発現プロファイルを発生させることができる。次いでこれらの遺伝子発現プロファイルは、特定の抗癌剤による処置からの臨床的利益を予測することができる。
【０１８７】
１Ｄ１Ｈ−ＮＭＲ（核磁気共鳴）による尿の生化学的組成の分析を、予測アッセイとして利用することができる。パターン認識技術を使用して抗癌剤による処置に対する代謝応答を評価し、そしてこの応答を臨床的ゴールと相関させることができる。尿中に排泄された生化学的または内因性代謝物は、正常な被験体についてプロトンＮＭＲにより十分に特徴付けられている(Zuppi, et al., Clin Chim Acta 265:85-97, 1997)。これらの代謝物（約３０〜４０）は、主要代謝経路、例えばクエン酸サイクルおよび尿素サイクルの副生物を表す。薬物刺激、疾患刺激および遺伝的刺激は、該刺激に対する代謝応答の時刻表および大きさを示すベースライン尿プロファイルの代謝特異的変化を生じさせることが示された。これらの解析は、多変数であり、従ってパターン認識技術を使用してデータ解釈を改良する。尿代謝プロファイルを臨床的ゴールと相関させて臨床的利益を決定することができる。
【０１８８】
キット
本発明は、低分子有効性に特徴的な遺伝子の発現レベルを決定するためのキットを提供する。このキットは、癌を発生する素因のある被験体または癌を有する被験体を同定するためならびに癌に対する治療を同定および確認するために有用でありうる。１つの態様では、キットは、癌の罹患細胞の１つ以上の遺伝子発現プロファイルまたは少なくとも罹患細胞における低分子有効性に特徴的な１つ以上の遺伝子の発現のレベルを表す値が保存されているコンピューター可読媒体を含む。コンピューター可読媒体は、対応する正常細胞、薬物で処置された罹患細胞の遺伝子発現プロファイルおよび本明細書に記載の任意の他の遺伝子発現プロファイルを含むこともできる。キットは、コンピューターシステムのメモリーにロードされうる発現プロファイル解析ソフトウエアを含むことができる。
【０１８９】
キットは、低分子有効性について特徴的な遺伝子のプローブを含むマイクロアレイを含むことができる。キットは、低分子有効性に特徴的な１つ以上の遺伝子の発現レベルを検出するための１つ以上のプローブまたはプライマー、および／またはプローブが結合それておりそしてサンプルにおける低分子有効性に特徴的な１つ以上の遺伝子の発現を検出するために使用されうる固体支持体を含むことができる。キットは、更に核酸コントロール、バッファーおよび使用のためのインストラクションを含むことができる。
【０１９０】
他のキットは、癌を処置するための組成物を提供する。例えば、キットは、低分子有効性に特徴的な１つ以上の遺伝子に対応する１つ以上の核酸（例えば、癌を有する患者を処置するのに使用するための）を含むこともできる。核酸は、プラスミドまたはベクター（例えば、ウイルスベクター）内に含まれうる。他のキットは、癌に特徴的な遺伝子によりコードされたポリペプチドまたはポリペプチドに対する抗体を含む。更に他のキットは、低分子有効性に特徴的な遺伝子のアゴニストまたはアンタゴニストとして本明細書で同定された化合物を含む。組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物であることができる。
【０１９１】
実施例
本明細書に記載の実施例および態様は説明として与えられており、限定するものでないこと、および他の実施例が特許請求の範囲に記載された本発明の精神および範囲から逸脱することなく使用されうることは当業者には明らかであろう。
【０１９２】
実施例１．遺伝子発現プロファイリングプロトコール
ａ．血液ソース
ヒト血液は、処置前に薬物ソラフェニブで処置された患者から得られた。患者は、２つのグループ、進行性疾患のＷＨＯ基準により決定された最善の応答を有する患者（「プログレッサー(progressors)」）および安定な疾患の最善の応答またはより良好な応答を有する患者（「ノンプログレッサー(non-progressors)」）、に分けられた。
【０１９３】
Ｂ．ヒト全血からの全ＲＮＡ単離
この方法は、Qiagen QlAamp RNA Blood Mini kit: Version 01/99: “QIAamp RNA Mini Protocol for Isolation of Total Cellular RNA from Whole Human Blood”(http://www.qiagen.com/literature/Handbooks/PDF/DNA RNA isolation clinical/INT/QA RNA Blood Mini/qarnab blood.pdf)を利用する。
【０１９４】
プロトコール
１．−８０℃の冷蔵庫から全血のチューブを取り出し；チューブを氷中に置く。
２．氷上で血液を部分的に解凍する。
・チューブキャップまで氷中にチューブを浸漬しておく。
・血液がチューブを逆さにするとき自由に移動する氷状スラリーとなるまで解凍する。
３．氷冷バッファーＥＬ３容積に全血１容積を加える（プロトコールの改変された工程１）。
・バッファーＥＬ２容積を有する５０mlコニカルチューブを氷上に置く。
・氷冷バッファーＥＬを入れた５０mlコニカルチューブに部分的に解凍された全血を注ぐ。
・氷冷バッファーＥＬの残りの１容積を使用して第１チューブからの残留血液をすすぐ。
４．５０mlコニカルチューブを穏やかに数回逆転させ；チューブを氷に戻す。
５．チューブを氷上で１０分間インキュベーションし；インキュベーション期間中チューブを数回穏かに逆転させる。
６．テーブルトップ遠心機において、４℃で１０００RPMで１０分間チューブをスピンさせる。
７．上清を穏かにデカンテーションしてバイオハザード廃棄物とし；５０mlコニカルチューブを氷上に置く。
８．コニカルチューブの下側の氷冷バッファーＥＬ１容積を穏かにピペッティングする。
９．チューブを穏かに回転させて(swirl)リンパ球細胞ペレットを再懸濁させ；氷上に置いてあった１５mlコニカルチューブに注ぐ。
１０．追加の０．５容積の氷冷バッファーＥＬを使用して５０mlコニカルチューブをすすぎ；１５mlコニカルチューブ中に第１洗浄液と一緒にする。
１１．テーブルトップ遠心機において、４℃で１０００RPMで５分間チューブをスピンさせる。
１２．細いピペットチップおよび真空ソースを使用して上清を注意深く除去し；細胞ペレットを妨害しないように注意する。
１３．細胞ペレットにバッファーＲＬＴ（Ｂ−ＭＥを含有する）５８０ulを加え；激しくボルテックスして細胞ペレットを可溶化する。
１４．（ａ）細胞ライセートを−８０℃で凍結するか、または（ｂ）Ｑｉａｇｅｎプロトコールの工程７で続ける。
１５．Ｑｉａｇｅｎ ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔを使用して場合によりオンカラムＤＮａｓｅ消化工程を含ませ；室温で３０分間ＤＮａｓｅ消化する。
１６．５００ul（３５０ulの代わりに）バッファーＲＷ１を使用してＤＮａｓｅ消化の前および後の両方においてカラムを洗浄することによりＤＮａｓｅ消化プロトコールを改変する。
１７．オプション１２ａを含ませる。
１８．与えられたＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ水でＲＮＡを溶離し；４４ulを直接フィルターに加え、１分間放置し、次いで≧１０，０００ｒｐｍで１分間遠心する。溶離を繰り返さない。
１９．溶離された血液ＲＮＡのチューブを−８０℃で貯蔵する。
【０１９５】
C.Affymetrix GeneChip Microarray Method
Affymetrixプロトコールにより記載されたSuperscript Choice System(Invitrogen; Carlsbad,CA)を使用して５００ng〜５ugＲＮＡを使用して第１および第２鎖ｃＤＮＡ合成を行う。簡単に言えば、１００ピコモルＴ７ｄ（Ｔ）２４プライマー（Invitrogen, CA）をＲＮＡに加え、７０℃で１０分間インキュベーションし、そして氷上でクエンチした。ついで混合物を、第１鎖ｃＤＮＡバッファー、１０mM ＤＴＴおよび１mM ｄＮＴＰｓ中で４２℃で２分間インキュベーションした。次いで２００U ＳＳＩＩ逆転写酵素を加え、そして更に４２℃で１時間インキュベーションした。次いで各チューブを第２鎖バッファー、０．２mM ｄＮＴＰｓ、１０U Ｅ．Ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、４０U ＤＮＡポリメラーゼＩおよび２U ＲＮａｓｅＨを添加した後に１６℃で２時間インキュベーションした。２時間後に、10U T4 DNA ポリメラーゼを加え、そして反応を１６℃で更に５分間インキュベーションした。０．５M EDTAの添加により反応を停止させ、そしてｃＤＮＡをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール抽出を使用して精製し、次いで７．５M ＮＨ４ＯＡｃによりエタノール沈殿させた。ペレットをＤＥＰＣ Ｈ２Ｏ中に再懸濁させた。
【０１９６】
製造者により記載されたBioArray HighYield Transcription Kit(Enzo Diagnostics, NY)を使用するｃＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により、アレイ解析用のｃＲＮＡを発生させた。簡単に言えば、テンプレートｃＤＮＡを、HYバッファー、Ｂｉｏｔｉｎ ＮＴＰｓ、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅ阻害剤およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと混合した。チューブを３７℃で５時間インキュベーションした。ｃＲＮＡをＲＮｅａｓｙクリーンアップ技法(RNeasy clean-up procedure)を使用して精製し、そしてＵＶ分光光度法により測定した。１５μgまでのｃＲＮＡを．２Mトリス−アセテート、０．５M ＫＯＡｃおよび０．１５M ＭｇＯＡｃ中で９４℃で３５分間フラグメント化した。アレイハイブリダイゼーションのために、フラグメント化されたｃＲＮＡ，５０pM コントロールオリゴＢ２、AffymetrixからのコントロールｃＲＮＡスパイク、３０μgニシン精子ＤＮＡ、１５０μgＢＳＡおよびＨｙｂバッファー（１００mM ＭＥＳ、１M Ｎａ＋、２０mM ＥＤＴＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）からカクテルを作成した。
【０１９７】
AffymetrixからのHＧ−Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ２．０アレイ（約５０，０００ＲＮＡ転写物を表す６０，０００以上のプローブセットを含有する）をGeneChip Hybridization Oven ６４０中で６０ｒｐｍで回転させながら４５℃で１０分間ハイブリダイゼーションバッファーとプレハイブリダイゼーションさせ、次いでサンプルハイブリダイゼーションカクテルの一部と一夜ハイブリダイゼーションさせた。
【０１９８】
次いでチップを、６×ＳＳＰＥ、．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．００５％消泡剤および１００mM ＭＥＳによる一連の洗浄を実施した。チップを、１００mM ＭＥＳおよび１．２mg ＢＳＡ中で６ug フィコエリトリン−ストレプトアビジン(Molecular Probes, CA)で染色した。チップを、４８８nmでGeneChip Scanner 3000(GCS3000)により走査し、そしてAffymetrixからのMicroArray Suite 5.0ソフトウエアを使用して解析した。このソフトウエアは、アレイにより発せられた光の強度を遺伝子発現のレベルを示す数値にディジタル変換した。
【０１９９】
Ｄ．データ解析
この目的は、プログレッサーと非プログレッサーを識別するためのマーカーのセットを発生させることである。マーカーセット１(Marker Set One)（表１）は、サポートベクターマシンを使用して、患者がプログレッサーまたは非プログレッサーであるかないかの予測のための最善のセットであるプローブセットの組を表す。最適なセットは、最も高い予測精度および相対的に小さい数の遺伝子を示すセットであると決定される。このマーカーセットは、下記の方法を使用して誘導される。
１．データをSpotfireにインポートする。
２．プログレッサーと非プログレッサーの処置比較(Treatment Comparison)を行った。
３．下記の基準を使用してプローブセットを選んだ：
ａ．プローブセットは、いずれかのグループにおける患者の８５％より多くについてAffymetrix1 Microarray Suite ソフトウエアｖ．５．０により決定してすべて「不存在」ではない(all not "absent")ことをデータが示した(1Affymetrix,Inc., Santa Clara, CA)。
ｂ．これらの基準をかなえないすべてのプローブセットを更なる解析から排除した。
４．残りのデータを、サポートベクターマシン(Support Vector Machine)と呼ばれるWEKA2ソフトウエアパッケージおよびアルゴリズムを使用して選択プロセスにおいて使用した(2Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. lan H. Witten, Eibe Frank. Morgan Kaufmann, October 1999. ISBN 155860-552-5に記載されている)。このソフトウエアは、患者における最善の応答を予測するためのそれらの適切さに関してプローブセットに順位を付けた。
５．患者がプログレッサーまたは非プログレッサーであるかないかを予測するとき、交差検証(cross-validation)により決定して１００％の評価された精度を生じた小さなサブセットを決定するために、トップの順位のプローブセットのサブセットを使用して多数のモデルを発生させた。
６．上記基準をかなえる最善のモデルを生じたプローブセットを、アノテーション３と共に、表１に列挙する(3Affymetrix web site address(file dated 16Sep2005)
http://www.affymetrix.com/support/technical/byproduct.affx?product=hg-u133-plus)。
【０２００】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現プロファイル、遺伝子発現プロファイルを表す核酸配列を含むマイクロアレイならびに遺伝子発現プロファイルおよびマイクロアレイを使用する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
多くの疾患状態は、遺伝子ＤＮＡのコピー数の変化によりまたは特定の遺伝子の転写のレベルの変化により（例えば、開始のコントロール、ＲＮＡ前駆体の提供、ＲＮＡプロセッシング等により）種々の遺伝子の発現レベルの差により特徴付けられる。例えば、遺伝子物質の損失および獲得(gain)は、悪性トランスフォーメーションおよび進行において重要な役割を演じる。これらの獲得および損失は、少なくとも２つの種類の遺伝子、癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子により「駆動される」と考えられる。癌遺伝子は、腫瘍発生のポジティブレギュレーターであり、腫瘍抑制遺伝子は腫瘍発生のネガティブレギュレーターである(Marshall, Cell 64: 313-326, 1991; Weinberg, Science 254: 1138-1146, 1991)。従って、レギュレーションされていない成長を活性化する１つの機構は、癌遺伝子タンパク質をコードする遺伝子の数を増加させることまたはこれらの癌遺伝子の発現のレベルを増加させること（例えば、細胞変化または環境変化に応答して）であり、そして他の機構は遺伝子物質を失うことまたは腫瘍抑制遺伝子をコードする遺伝子の発現のレベルを減少させることである。このモデルは、グリオーマ進行と関連した遺伝子物質の損失および獲得により支持される(Mikkelson, et al., J. Cellular Biochem. 46:3-8, 1991)。かくして、特定の遺伝子（例えば癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子）の発現（転写）レベルの変化は、種々の癌の存在および進行の道標として役立つ。
【０００３】
これらの種々の疾患（例えば癌）を処置するための治療剤として使用される化合物は、これらの遺伝子発現変化の一部またはすべてを多分逆にする。従って、これらの遺伝子の少なくとも一部の発現変化は、このような治療の有効性を監視または予測すらするための方法として使用されうる。これらの発現変化の解析は、関心のあるターゲット組織（例えば、癌）においてまたはいくらかの代理細胞集団（例えば、末梢血白血球）において行うことができる。後者の場合には、発現変化パターンが有効性のマーカーとして使用されるためには、有効性（例えば、腫瘍収縮または非成長）と遺伝子発現変化の相関は、特に強くなければならない。
【０００４】
多数の研究室が、分子レベルでヒト腫瘍を分類するために、マイクロアレイまたは他の方法により遺伝子発現解析を使用することに成功したことを報告した(Bittner et al., Nature 406：536-540, 2000; Alon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 6745-6750, 1999; Alizadeh et al., Nature 403: 503-511, 2000; Golub et al., Science 286: 531-537, 1999; Perou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 9212-9217, 1999; Kahn et al., American Journal of Pathology 155: 1887-1900, 2000)。個々にまたはサブセットとしてこの方法で同定された遺伝子は、治療化合物（１つまたは複数）の有効性と相関する変化について追跡されうるマーカーとして使用することができ、または特定の治療からどの患者が利益を得ることができるかを予測するために使用することができる。同様に、研究室は、凍結された全血または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）から単離されたＲＮＡの遺伝子発現プロファイルを使用して疾患（例えば、癌）と関連している遺伝子発現パターンを同定したり、治療に対する感受性を予測する遺伝子発現パターンを同定した(DePrimo et al, BMC Cancer 3:3, 2003; Kaneta et al, Jpn. J. Cancer Res. 93:849-856, 2002; Hofmann et al, The Lancet 359: 481-486, 2002; Whitney et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 1896-1901, 2003.)。これに関して、血液細胞は、疾患状態の同定または治療に対する応答のための代理システムまたは循環しているバイオセンサと考えることができる。
【０００５】
全ＲＮＡは、ソラフェニブの臨床試験において記録された肝細胞癌を有する患者から採取された全血サンプルから単離された。ＲＮＡを、Affymetrix技術により各サンプルから分析し、そしてＲＥＣＩＳＴまたはＷＨＯ基準により規定されたソラフェニブに対する患者の応答と比較して、患者の応答を予測するために使用されうる遺伝子のサブセットを同定した。
【０００６】
発明の要約
本発明は、遺伝子発現プロファイル、該遺伝子発現プロファイルを表す核酸配列を含むマイクロアレイ、ならびに該遺伝子発現プロファイルおよびマイクロアレイを使用する方法を指向する。
【０００７】
本発明の１つの態様では、遺伝子発現プロファイルは、薬物への暴露の後変化した発現を示す１つ以上の遺伝子（例えば、配列番号１〜１８）を含む発現プロファイルである。例えば、発現プロファイルは、マルチキナーゼ阻害剤（例えば、ソラフェニブ）に暴露した後に変化した発現を示す１つ以上の遺伝子を含む。
【０００８】
他の態様では、発現プロファイルは、薬物への暴露の後変化した発現を示す１つ以上のポリペプチドコード遺伝子（例えば、配列番号１〜１８）を含む発現プロファイルである。例えば、発現プロファイルは、マルチキナーゼ阻害剤（例えば、ソラフェニブ）に暴露した後に変化した発現を示す１つ以上のポリペプチドを含む。
【０００９】
マルチキナーゼ阻害剤（例えば、ソラフェニブ）に暴露した後に変化した発現を示す１つ以上の遺伝子を含むマイクロアレイも、本発明の範囲内にある。本発明の他の態様では、マイクロアレイは、表１に列挙された遺伝子（配列番号１〜１８）からなる群より選ばれる１つ以上の遺伝子を含むマイクロアレイであることができる。更なる態様では、マイクロアレイは、表１に列挙された遺伝子（配列番号１〜１８）を含む群から単離された１つ以上のバイオマーカーを含むマイクロアレイであることができる。
【００１０】
更に、本発明の他の局面は、癌の予防、診断、予後および治療のための方法および試薬を提供することである。
【００１１】
本発明は、組織または細胞サンプルに対する薬物または処置（例えば、マルチキナーゼ阻害剤）の効果をスクリーニングし、組織または細胞サンプルに対する毒性効果をスクリーニングし、組織または細胞サンプルにおける疾患状態を同定し、患者診断を与え、処置に対する患者の応答を予測し、コントロールと薬物処置されたサンプル間で識別し、正常なサンプルと腫瘍サンプルとを識別し、新規な薬物を発見し、そして組織または細胞サンプルにおける遺伝子発現のレベルを決定することを含むがそれらに限定されない、前記マイクロアレイを使用するための方法にも関する。
【００１２】
本発明の他の態様は、１つ以上の遺伝子（例えば、配列番号１〜１８）および／または遺伝子産物の発現のレベルを解析する工程を含み、組織または細胞サンプルにおける遺伝子発現レベルおよび／または遺伝子産物レベルを薬物への暴露の前後に解析し、そして遺伝子および／または遺伝子産物の発現レベルの変化は、薬物効果を示し、または患者診断を与え、または処置に対する患者の応答を予測する、組織または細胞サンプルに対する薬物（例えば、マルチキナーゼ阻害剤）の効果をスクリーニングするための方法である。
【００１３】
本発明の他の局面は、１つ以上の遺伝子および／または遺伝子産物の発現のレベルを解析する工程を含み、細胞の遺伝子発現レベルおよび／または遺伝子産物レベルを薬物への暴露の前後に解析し、そして遺伝子および／または遺伝子産物の発現レベルの変化は薬物有効性を示す、新規な薬物を発見するための方法である。
【００１４】
本発明は、更に、癌を有する被験体に試験化合物を投与し、そしてポリペプチドの活性を測定することを含み、ポリペプチドの活性の変化は、試験化合物が癌の処置に有用であることを示す、癌の処置に有用な化合物を同定するための方法を提供する。
【００１５】
従って、本発明は、例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト、部分アゴニスト、インバースアゴニスト、アクチベーター、コアクチベーターおよび阻害剤などのレギュレーターまたはモデュレーターとして作用することができる化合物を同定するために使用することができる方法を提供する。従って、本発明は、癌と関連したポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現をレギュレーションするための試薬および方法を提供する。ポリヌクレオチドの発現、安定性または量あるいはポリペプチドの活性をモデュレーションする試薬は、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、核酸、核酸アナログ（例えば、ペプチド核酸、ロックされた核酸(locked nucleic acid)）、または低分子(small molecule)であることができる。
【００１６】
本発明は、１つ以上の遺伝子および／または遺伝子産物の発現のレベルを解析する工程を含み、正常なサンプルと患者サンプルの遺伝子発現および／または遺伝子産物レベルを解析し、そして患者サンプルにおける遺伝子および／または遺伝子産物の発現レベルの変化は、疾患の診断に役立つ、患者の診断を与えるための方法も提供する。患者サンプルは、血液、羊水、血漿、精液、骨髄および組織生検を含むが、それらに限定されない。
【００１７】
本発明は、なお更に、癌を有する疑いのある被験体におけるポリペプチドの活性を測定することを含み、癌を有する疑いのない被験体におけるポリペプチドの活性と比較して、ポリペプチドの活性の差があるならば、被験体は癌を有すると診断される、被験体における癌を診断する方法を提供する。
【００１８】
他の態様では、本発明は、タンパク質に対する抗体を使用して患者サンプルにおけるタンパク質と反応させる、患者サンプルにおける癌を検出するための方法を提供する。
【００１９】
本発明の他の局面は、正常な組織と罹患組織の遺伝子発現および／または遺伝子産物レベルを解析し、そして遺伝子および／または遺伝子産物の発現レベルの変化が疾患状態を示す、１つ以上の遺伝子および／または遺伝子産物の発現のレベルを解析する工程を含む正常な状態と疾患状態を識別するための方法である。
【００２０】
他の態様では、本発明は、正常な細胞と比較してディファレンシャルに発現される少なくとも１つの遺伝子の、正常な細胞に対してディファレンシャルな発現を検出することを含む、細胞の表現型を決定する方法に関する。
【００２１】
更に他の態様では、本発明は、細胞の表現型を決定する方法であって、少なくとも１つのポリペプチドの、正常な細胞に対するディファレンシャルな発現を検出することを含み、このタンパク質は正常な細胞と比較してディファレンシャルに発現される、方法に関する。
【００２２】
他の態様では、本発明は、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２５または少なくとも約４０の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む核酸プローブを提供し、患者から細胞のサンプルを得、場合により細胞の第２サンプルであってその実質的すべてが非癌性である第２サンプルを提供し、核酸プローブを、該第１細胞サンプルおよび第２細胞サンプルの各々のｍＲＮＡとストリンジェントな条件下に接触させ、そして（ａ）第１細胞サンプルのｍＲＮＡとプローブのハイブリダイゼーションの量を、（ｂ）第２細胞サンプルのｍＲＮＡとプローブのハイブリダイゼーションの量と比較し、第２細胞サンプルのｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量と比較した第１細胞サンプルのｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量の差は第１細胞サンプル中の細胞の表現型を示す、ことにより患者からの細胞の表現型を決定するための方法に関する。
【００２３】
他の態様では、本発明は、患者から単離された細胞のサンプルにおける核酸のレベルを測定するための、プローブ／プライマーを含む、癌細胞または組織の存在を同定するための検査キットを提供する。ある態様では、キットは、キットを使用するためのインストラクション、細胞を懸濁するためまたは固定するための溶液、検出可能なタグまたは標識、核酸をハイブリダイゼーションし易くするための溶液、細胞を溶解するための溶液または核酸の精製のための溶液を更に含むことができる。
【００２４】
１つの態様では、本発明は、タンパク質に対して特異的な抗体を含む、癌細胞または組織の存在を同定するための検査キットを提供する。ある態様では、キットは、キットを使用するためのインストラクションを更に含む。ある態様では、キットは、細胞を懸濁するためまたは固定するための溶液、検出可能なタグまたはラベル、ポリペプチドを抗体の結合を受け易くするための溶液、細胞を溶解するための溶液またはポリペプチドの精製のための溶液を更に含むことができる。
【００２５】
他の態様では、患者から単離された細胞のサンプルにおける核酸のレベルを測定するための、プローブ／プライマーを含む、癌細胞または組織における化合物または治療の有効性を監視するための検査キットを提供する。ある態様では、キットは、キットを使用するためのインストラクション、細胞を懸濁するためまたは固定するための溶液、検出可能なタグまたは標識、核酸をハイブリダイゼーションし易くするための溶液、細胞を溶解するための溶液または核酸の精製のための溶液を更に含むことができる。
【００２６】
１つの態様では、本発明は、タンパク質に対する特異的抗体を含む、癌細胞または組織における化合物または治療の有効性を監視するための検査キットを提供する。ある態様では、キットは、キットを使用するためのインストラクションを更に含む。ある態様では、キットは、細胞を懸濁するためまたは固定するための溶液、検出可能なタグまたは標識、ポリペプチドを抗体の結合を受け易くするための溶液、細胞を溶解するための溶液またはポリペプチドの精製のための溶液を更に含むことができる。
【００２７】
本発明は、疾患または薬物処置を表す遺伝子発現プロファイルからのバイオマーカー遺伝子のセットを選ぶ工程を含む、バイオマーカーを同定する方法にも関する。
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明は、説明した特定の方法、プロトコール、細胞系、動物種または属、構築物および試薬に限定されず、それ自体変わることができることは理解されるべきである。本明細書で使用された用語は、特定の態様を説明するだけの目的のためであり、そして特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解されるべきである。
【００２９】
本明細書で使用されそして特許請求の範囲で使用された、単数形態は特記しないかぎり複数の言及を含む。従って、例えば、遺伝子という言及は、１つ以上の遺伝子を指し、そして当業者に知られている均等物を含む。
【００３０】
特記しない限り、本明細書で使用されたすべての技術用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に普通に理解されると同じ意味を有する。本明細書で説明された任意の方法、装置、およびそれらに類似した物質またはこれらに対する均等物を、本発明の実施または試験において使用することができるけれども、好ましい方法、装置および物質がここでは述べられる。
【００３１】
本明細書で挙げられたすべての刊行物および特許は、例えば、本発明と関連して使用されうる刊行物に記載の構築物および方法を説明し、そして開示する目的で参照により本明細書で組みこまれる。上記したそしてテキスト全体にわたり論議された刊行物は、本願の出願日前のそれらの開示についてのみ与えられる。本明細書でなにもなければ、本発明者は、先行発明によるこのような開示に先行する資格を与えられないことの承認と解釈されるべきである。
【００３２】
定義
便宜上、明細書、実施例および特許請求の範囲で使用されたある用語および語句の意味は、以下に与えられる。
【００３３】
語句、罹患細胞「の対応する正常な細胞」または罹患細胞「に対応する正常な細胞」または罹患細胞「の正常な対応細胞」は、罹患細胞のタイプと同じタイプの正常な細胞を指す。
【００３４】
アレイ（例えばマイクロアレイ）における「アドレス」は、エレメント、例えばオリゴヌクレオチドがアレイの固体表面に結合しているロケーションを指す。
【００３５】
本明細書で使用された用語「アゴニスト」は、タンパク質の生物活性を模倣するかまたはアップレギュレーションする（例えば強化するかまたは補充する）作用物質を指すことを意味する。アゴニストは、野生型タンパク質または野生型タンパク質の少なくとも１つの生物活性を有するその誘導体であることができる。アゴニストは、遺伝子の発現をアップレギュレーションする化合物またはタンパク質の少なくとも１つの生物活性を増加させる化合物であることもできる。アゴニストは、他の分子、例えばターゲットペプチドまたは核酸とポリペプチドの相互作用を増加させる化合物であることもできる。
【００３６】
本明細書で使用された「増幅」は、核酸配列の追加のコピーの産生に関する。例えば、増幅は、当技術分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して行うことができる(例えば、Dieffenbach, C. W. and G. S. Dveksler(1995) PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.参照)。
【００３７】
本明細書で使用された「アンタゴニスト」は、タンパク質の少なくとも１つの生物活性をダウンレギュレーションする（例えば、抑制するかまたは阻害する）作用物質を指すことを意味する。アンタゴニストは、タンパク質と他の分子、例えば、ターゲットペプチドまたは酵素基質との相互作用を阻害するかまたは減少させる化合物であることができる。アンタゴニストは、遺伝子の発現をダウンレギュレーションする化合物または存在する発現されたタンパク質の量を減少させる化合物であることもできる。例えば、マルチキナーゼ阻害剤は、このようなアンタゴニストの例である。
【００３８】
本明細書で使用された用語「抗体」は、任意のアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ等）の完全抗体を含むことおよび脊椎動物（例えば、哺乳動物）タンパク質とやはり特異的に反応性のそのフラグメントを含むことを意図する。抗体は、慣用の技術を使用してフラグメント化することができ、そして完全抗体について前記したのと同じ方法で有用性についてスクリーニングされたフラグメントであることができる。従って、この用語は、あるタンパク質と選択的に反応することができる抗体分子のタンパク質分解的に開裂された部分またはリコンビナントに調製された部分のセグメントを含む。このようなタンパク質分解フラグメントおよび／またはリコンビナントフラグメントの非限定的例は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖおよび、ペプチドリンカーにより接合されたＶ［Ｌ］および／またはＶ［Ｈ］ドメインを含有する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖ’ｓは、共有結合によりまたは非共有結合により連結されて２つ以上の結合部位を有する抗体を形成することができる。本発明は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または抗体およびリコンビナント抗体の他の精製された調製物を含む。
【００３９】
用語「アレイ」または「マトリックス」は、デバイス上のアドレス可能なロケーションまたは「アドレス」の配列を指す。ロケーションは、二次元アレイ、三次元アレイまたは他のマトリックスフォーマットで配列されうる。ロケーションの数は、いくつかから少なくとも数十万の範囲にあることができる。最も重要なことに、各ロケーションは、全体的に独立した反応部位を表す。「核酸アレイ」は、核酸プローブ、例えば遺伝子のオリゴヌクレオチドまたはより大きい部分を含有するアレイを指す。アレイ上の核酸は一本鎖であることができる。プローブがオリゴヌクレオチドであるアレイは、「オリゴヌクレオチドアレイ」または「オリゴヌクレオチドチップ」と言われる。本明細書で「バイオチップ」または「生物学的チップ」とも呼ばれる「マイクロアレイ」は、少なくとも約１００／cm2、または少なくとも約１０００/cm2の分離した領域の密度を有する領域のアレイである。マイクロアレイにおける領域は、約１０〜２５０μmの範囲の典型的な寸法、例えば直径を有し、そしてほぼ同じ距離だけアレイにおける他の領域から分離される。
【００４０】
相互に交換可能に使用される「生物学的活性」、「生物活性」、「活性」または「生物学的機能」は、本明細書ではポリペプチド（そのネイティブなコンフォメーションにあろうがまたは変性されたコンフォメーションにあろうが）によりまたはその任意のサブ配列により直接または間接に行われるエフェクター機能または抗原性機能を意味する。生物学的活性は、ポリペプチドへの結合、他のタンパク質または分子への結合、ＤＮＡ結合タンパク質としての活性、転写レギュレーターとしての活性、損傷を受けたＤＮＡに結合する能力等を含む。生物活性は、被験体ポリペプチドに直接影響を与えることによりモデュレーションされうる。あるいは、生物活性は、ポリペプチドのレベルをモデュレーションすることにより、例えば対応する遺伝子の発現をモデュレーションすることにより変えられうる。
【００４１】
本明細書で使用された用語「生物学的サンプル」は、生物からまたは生物の構成要素（例えば細胞）から得られたサンプルを指す。サンプルは、任意の生物学的組織または流体であることができる、サンプルは、患者由来のサンプルである「臨床的サンプル」であることができる。このようなサンプルは、痰、血液、血液細胞（例えば白血球）、組織または微細針生検サンプル、尿、腹水および胸膜水またはそれらからの細胞を含むが、それらに限定されない。生物学的サンプルは、組織学的目的で採取された凍結した切片などの組織の切片を含むこともできる。
【００４２】
用語「バイオマーカー」または「マーカー」は、広い範囲の細胞内および細胞外事象ならびに全体の生物の生理学的変化を包含する。バイオマーカーは、本質的に細胞機能の任意の面、例えば、シグナリング分子、転写因子、代謝物、遺伝子転写物の産生のレベルまたは比率ならびにタンパク質の翻訳後の修飾を表すことができるが、それらに限定されない。バイオマーカーは、転写レベルの全体のゲノム解析またはタンパク質レベルおよび／または修飾の全体のプロテオーム解析を含むことができる。
【００４３】
バイオマーカーは、無処置の罹患細胞と比較して疾患を有する被験体の化合物で処置された罹患細胞においてアップレギュレーションされるかまたはダウンレギュレーションされる遺伝子または遺伝子産物を指すこともできる。即ち、この遺伝子または遺伝子産物は、それが場合により他の遺伝子または遺伝子産物と共に使用されて低分子の有効性を同定し、予想しまたは検出することができるのに十分に、処置された細胞に対して特異的である。従って、バイオマーカーは、罹患細胞における化合物の有効性または化合物による処置に対するその罹患細胞の応答について特徴的な遺伝子または遺伝子産物である。
【００４４】
ヌクレオチド配列は、他のヌクレオチド配列に対して、もしもこれらの２つの配列の塩基の各々がマッチするならば、即ち、ワトソン−クリック塩基対を形成することができるならば、「相補性」である。用語「相補性鎖」は、本明細書では用語「相補体(complement)」と相互に交換可能に使用される。核酸鎖の相補体は、コード鎖の相補体または非コード鎖の相補体であることができる。
【００４５】
「遺伝子の検出剤」は、遺伝子またはそれに関係する他の生物学的分子、例えば、遺伝子から転写されたＲＮＡまたは遺伝子によりコードされたポリペプチドを特異的に検出するために使用されうる作用物質を指す。例示的検出剤は、遺伝子に対応する核酸にハイブリダイゼーションする核酸プローブおよび抗体である。
【００４６】
例えば、正常な細胞と罹患細胞との「ディファレンシャルな遺伝子発現パターン」は、正常な細胞と罹患細胞との遺伝子発現の差を反映するパターンを指す。ディファレンシャルな遺伝子発現パターンは、１つの時点での細胞と他の時点での細胞との間で得られうるか、または化合物とインキュベーションもしくは接触された細胞と化合物とインキュベーションもしくは接触されていない細胞との間でも得られうる。
【００４７】
用語「癌」は、固形腫瘍、例えば、乳房、気道、脳、生殖器官、消化管、尿路、眼、肝臓、皮膚、心臓および頚、甲状腺、副甲状腺の癌およびそれらの遠位転移を含むが、それらに限定されない。この用語は、リンパ腫、肉腫および白血病も含む。
【００４８】
乳癌の例は、侵襲的管癌、侵襲的小葉性癌、上皮内導管癌、上皮内小葉性癌を含むが、それらに限定されない。
【００４９】
気道の癌の例は、小細胞肺癌および非小細胞肺癌ならびに気管支腺腫および胸膜肺芽腫(pleuropulmonary blastoma)を含むが、それらに限定されない。
【００５０】
脳癌の例は、脳幹グリオーマおよびハイポフタルミックグリオーマ(hypophtalmic glyoma)、小脳および大脳アストロサイトーマ、髄芽腫(medulloblastoma)、上衣腫(ependymoma)および神経外胚葉腫瘍および松果体腫瘍を含むが、それらに限定されない。
【００５１】
雄生殖器官の腫瘍は、前立腺癌および睾丸癌を含むが、それらに限定されない。雌生殖器官の腫瘍は、子宮内膜癌、頸部癌(cerevical cancer)、卵巣癌、膣癌および外陰癌、ならびに子宮の肉腫を含むが、それらに限定されない。
【００５２】
消化管の腫瘍は、肛門癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、膵臓癌、直腸癌、小腸癌および唾液腺癌を含むが、それらに限定されない。
【００５３】
尿路の腫瘍は、膀胱、陰茎、腎臓、腎盂、尿管および尿道癌を含むが、それらに限定されない。
【００５４】
眼癌は、眼球内メラノーマおよび網膜芽腫(retinoblastoma)を含むが、それらに限定されない。
【００５５】
肝臓癌の例は、肝細胞癌（線維層状変異体を伴うまたは伴わない肝臓細胞癌）、胆管腫（肝臓内胆管癌）および混合肝細胞胆管癌を含むが、それらに限定されない。
【００５６】
皮膚癌は、扁平上皮癌、カポジ肉腫、悪性メラノーマ、メルケル細胞皮膚癌よび非メラノーマ皮膚癌を含むが、それらに限定されない。
【００５７】
頭部および頸部癌は、喉頭／下咽頭／鼻咽頭／口腔咽頭癌および唇癌および口腔癌を含むが、それらに限定されない。
【００５８】
リンパ腫は、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、ホジキン病および中枢神経系のリンパ腫を含むが、それらに限定されない。
【００５９】
肉腫は、軟質組織の肉腫、骨肉種、悪性線維性組織球腫、リンパ肉腫および横紋筋肉腫を含むが、それらに限定されない。
【００６０】
白血病は、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球白血病、慢性リンパ球白血病、慢性骨髄性白血病およびヘアリー細胞白血病を含むが、それらに限定されない。
【００６１】
「癌の罹患細胞」は、癌を有する被験体に存在する細胞を指す。すなわち、正常な細胞の変異した形態(modified form)でありそして癌を有していない被験体において存在しない細胞、または癌を有していない被験体に比較して癌を有する被験体において有意により多いまたはより少ない数で存在する細胞である。
【００６２】
用語「均等物」は、機能的に同等なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むと理解される。均等なヌクレオチド配列は、１つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失により異なる配列、例えばアレル変異体を含むことができ、従って、遺伝子コードの縮重により表１に示された核酸のヌクレオチド配列とは異なる配列を含むことができる。
【００６３】
細胞の「遺伝子発現プロファイル」または「フィンガープリント」と本明細書で交換可能に使用される用語「発現プロファイル」は、細胞における１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡレベルを表す値のセットを指す。発現プロファイルは、例えば、少なくとも約２遺伝子、少なくとも約５遺伝子、少なくとも約１０遺伝子または少なくとも約５０、１００、２００またはそれより多くの遺伝子の発現レベルを表す値を含むことができる。発現プロファイルは、多数の細胞および条件で同様なレベルで発現される遺伝子(例えば、ＧＡＰＤＨなどの恒常発現遺伝子)のｍＲＮＡレベルを含むこともできる。
【００６４】
用語「遺伝子」は、ポリペプチドまたは前駆体の産生のために必要なコントロール配列およびコード配列を含む核酸配列を指す。ポリペプチドは、完全長コード配列またはコード配列の任意の部分によりコードされうる。遺伝子は、植物、真菌、動物、バクテリアゲノムもしくはエピソーム、真核細胞の核もしくはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、または化学的に合成されたＤＮＡを含む、当技術分野で知られた任意のソースに全体的にまたは部分的に由来することができる。遺伝子は、発現産物の生物学的活性もしくは化学的構造発現の速度または発現コントロールの方式に影響を与えることができるコード領域もしくは非翻訳領域において１つ以上の改変を含有することができる。このような改変は、１つ以上のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失および置換を含むが、それらに限定されない。遺伝子は、中断されていないコード配列を構成することができ、または遺伝子は適切なスプライス部位により結合された１つ以上のイントロンを含むことができる。
【００６５】
「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対形成により相補性鎖と結合する任意のプロセスを指す。例えば、２つの一本鎖核酸は、それらが二本鎖デュプレックスを形成するとき「ハイブリダイゼーションする」。二本鎖形成(double-strandedness)の領域は、一本鎖核酸の１つまたは両方の完全長、または１つの一本鎖核酸のすべてと他の一本鎖核酸のサブ配列を含むことができ、あるいは二本鎖形成の領域は、各核酸のサブ配列を含むことができる。ハイブリダイゼーションは、２つの鎖がまだ二本鎖ヘリックスを形成しているとの条件下に、あるミスマッチを含有するデュプレックスの形成も含む。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、本質的に特異的なハイブリダイゼーションをもたらすハイブリダイゼーション条件を指す。
【００６６】
核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡに関して、本明細書で使用された用語「単離された」
は、それぞれ、高分子の天然のソースに存在する他のＤＮＡｓまたはＲＮＡｓから分離された分子を指す。本明細書で使用された用語「単離された」は、細胞物質、ウイルス物質、リコンビナントＤＮＡ技術により産生されるときの培養培地、化学的に合成されるときの化学的前駆体もしくは他の化学品を実質的に含まない核酸またはペプチドも指す。更に、「単離された核酸」は、フラグメントとして天然に存在しない核酸フラグメントおよび天然の状態で見出されない核酸フラグメントを含むことができる。用語「単離された」は、精製されたポリペプチドおよびリコンビナントポリペプチドの両方を包含することを意味するポリペプチドを指さすためにも本明細書で使用される。
【００６７】
本明細書で使用された用語「標識」および「検出可能な標識」は、放射性同位元素、蛍光団、化学発光部分、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、染料、金属イオン、リガンド（例えば、ビオチンまたはハプテン）等を含むが、それらに限定されない、検出することができる分子を指す。用語「蛍光発光物質(fluorescer)」は、検出可能な範囲の蛍光を示すことができる物質またはその一部を指す。本発明で使用できる標識の特定の例は、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、アンベリフェロン、テキサスレッド、ルミノール、ＮＡＤＰＨ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびセイヨウワサビペルオキシダーゼを含む。
【００６８】
語句「発現のレベル」は、細胞における遺伝子によりコードされたｍＲＮＡ、ならびにプレｍＲＮＡ新生転写物、転写物プロセッシング中間体、成熟ｍＲＮＡおよび分解産物のレベルを指す。また、語句「発現のレベル」は、細胞におけるタンパク質またはポリペプチドのレベルを指す。
【００６９】
本明細書で使用された、用語「核酸」は、ポリヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および、適当ならば、リボ核酸（ＲＮＡ）を指す。この用語は、均等物として、ヌクレオチドアナログから作られたＲＮＡもしくはＤＮＡのアナログ、および説明されている態様に適用可能なものとして、一本鎖（センスもしくはアンチセンス）ポリヌクレオチドおよび二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきでもある。染色体、ｃＤＮＡｓ、ｍＲＮＡｓ、ｒＲＮＡｓおよびＥＳＴｓは、核酸と呼ばれるうる分子の代表的例である。
【００７０】
語句「遺伝子に対応する核酸」は、遺伝子を検出するために使用されうる核酸、例えば、遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションすることができる核酸を指す。
【００７１】
語句「ＲＮＡに由来する核酸サンプル」は、ＲＮＡから合成されうる１つ以上の核酸分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）を指し、そしてＰＣＲ（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）を使用する方法から産生されたＤＮＡを含む。
【００７２】
本明細書で使用された用語「オリゴヌクレオチド」は、例えば約１０〜約１０００ヌクレオチドを含む核酸分子を指す。本発明で使用するためのオリゴヌクレオチドは、長さが約１５〜約１５０ヌクレオチド、または約１５０〜約１０００ヌクレオチドであることができる。オリゴヌクレオチドは、天然に存在するオリゴヌクレオチドまたは合成オリゴヌクレオチドであることができる。オリゴヌクレオチドは、ホスホルアミダイト法(Beaucage and Carruthers, Tetrahedron Lett. 22: 1859-62, 1981)またはトリエステル法(Matteucci, et al., J. Am. Chem. Soc. 103:3185, 1981)または当技術分野で知られている他の化学的方法により調製されうる。
【００７３】
本明細書で使用された用語「患者」または「被験体」は、哺乳動物（例えば、ヒトおよび動物）を含む。
【００７４】
用語「百分率同一性」は、２つのアミノ酸配列間の配列同一性または２つのヌクレオチド配列間の配列同一性を指す。例えば、２つの配列間の同一性は、比較の目的でアライメントされうる各配列の特定の位置を比較することにより決定されうる。比較した配列の同等な位置が同じ塩基またはアミノ酸により占められているときは、分子はその位置で同一である。均等な部位が、同じまたは類似したアミノ酸残基（例えば、立体的および／または電子的性質が類似している）により占められているときは、分子は、その位置で相同性（類似性）であると言うことができる。相同性、類似性または同一性の百分率としての表現は、比較された配列により共有された位置での同一または類似アミノ酸の数の関数を指す。例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＥＮＴＲＥＺを含む種々のアライメントアルゴリズムおよび／またはプログラムを使用することができる。ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴは、ＧＣＧ配列解析パッケージの一部として入手可能であり(University of Wisconsin, Madison, Wis)、そして例えばデフォルト設定(default settings)と共に使用することができる。ＥＮＴＲＥＺは、National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, MDにより入手可能である。１つの態様では、２つの配列の百分率同一性は、ギャップ重量を１とするＧＣＧプログラム（例えば、各アミノ酸ギャップは、それが２つの配列間の１つのアミノ酸またはヌクレオチドミスマッチであるかのように重量を付けられる）により決定されうる。アライメントのための他の技術は、Methods in Enzymology(vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis(1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & Co., San Diego, California, USA)に記載されている。配列におけるギャップを許容するアライメントプログラムは、配列をアライメントするために利用されうる。例えば、Smith- Watermanは、配列アライメントにおいてギャップを許容するアルゴリズムの１つのタイプである(例えば、Meth. Mol. Biol. 70: 173-187, 1997 参照)。Needleman and Wunschアライメント方法を使用するＧＡＰプログラムも、配列をアライメントさせるために利用されうる。別のサーチストラテジーは、MASPARコンピューターで実行されるMPSRCHソフトウエアを使用する。MPSRCHは、Smith- Watermanアルゴリズムを使用して超大型パラレルコンピューター(massively parallel computer)で配列をスコア化する。このアプローチは、離れて関連したマッチ(distantly related matches)を検出する能力を改良し、そして小さなギャップおよびヌクレオチド配列エラーについて特に寛容である。核酸でコードされたアミノ酸配列は、タンパク質およびＤＮＡデータベースの両方をサーチするために使用されうる。個々の配列を有するデータベースは、上記Methods in Enzymology, ed. Doolittleに記載されている。データベースは、例えば、Genbank, EMBL, およびDNA Database of Japan(DDBJ)を含む。
【００７５】
本明細書で使用された、アレイに結合された核酸または他の分子は、「プローブ」 または「捕捉プローブ」と呼ばれる。アレイが１つの遺伝子に対応するいくつかのプローブを含有するとき、これらのプローブは、「遺伝子プローブセット」と呼ばれる。遺伝子プローブセットは、例えば、約２〜約２０プローブ、約２〜約１０プローブ、または約５プローブからなることができる。
【００７６】
細胞の生物学的状態の「プロファイル」は、薬物処置に応答して変化することが知られている細胞の種々の構成要素のレベルおよび細胞の生物学的状態の他のパーターベーション(perturbations)を指す。細胞の構成要素は、例えば、ＲＮＡのレベル、タンパク質量のレベルまたはタンパク質活性レベルを含む。
【００７７】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、遺伝子産物を指すときは本明細書では相互に交換可能に使用される。
【００７８】
１つの細胞における発現プロファイルおよび他の細胞における発現プロファイルにおける遺伝子の発現のレベルが十分に類似している（この類似性が、共通の特徴、例えば、同じタイプの細胞を示すように）とき、１つの細胞における発現プロファイルは他の細胞における発現プロファイルに「類似している」。
【００７９】
本明細書で使用された「低分子」は、約５kDaより小さいまたは約４kDaより小さい分子量を有する組成物を指す。低分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、脂質または他の有機または無機分子であることができる。多くの製薬会社は、化学的および／または生物学的混合物、しばしば真菌、バクテリアまたは藻類抽出物の広範なライブラリーを有し、これらは、本発明のアッセイのいずれかによりスクリーニングされ得て、生物活性をモデュレーションする化合物を同定することができる。
【００８０】
テンプレート核酸のターゲット部位へのプローブの「特異的ハイブリダイゼーション」という用語は、ハイブリダイゼーションシグナルが明白に解明されうるような、主としてターゲットへのプローブのハイブリダイゼーションを指す。本明細書で更に記載されたように、特異的ハイブリダイゼーションをもたらすこのような条件は、相同性の領域の長さ、該領域のＧＣ含有率、およびハイブリッドの融解温度（「Ｔｍ」）に依存して変わる。従って、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション溶液および洗浄液の塩含有率、酸度および温度において変わりうる。
【００８１】
ポリペプチドの「変異体」は、１つ以上のアミノ酸残基が変えられているアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。変異体は、置換されたアミノ酸が類似した構造的または化学的性質を有する「保存性」変化（例えばイソロイシンによるロイシンの置換）を有することができる。変異体は、「非保存性」変化（例えば、グリシンのトリプトファンによる置換）を有することもできる。類似的小変異(analogous minor variations)は、アミノ酸欠失または挿入またはその両方を含むことができる。生物学的活性または免疫学的活性を無効にすることなくどのアミノ酸残基が置換、挿入または欠失されうるかを決定する際のガイダンスは、当技術分野で周知のコンピュータープログラム、例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を使用して同定されうる。
【００８２】
ポリヌクレオチド配列に関して使用されるときの用語「変異体」は、特定の遺伝子またはそのコード配列のポリヌクレオチド配列に関係したポリヌクレオチド配列を包含することができる。この定義は、例えば、「アレル」、「スプライス」、「種」または「多形」変異体を含むこともできる。スプライス変異体は、参照分子に対する有意な同一性を有することができるが、一般にｍＲＮＡプロセシング期間中のエキソンの別のスプライシングにより大きい数またはより少ない数のポリヌクレオチドを有するであろう。対応するポリペプチドは、追加の機能的ドメインを有することができまたはドメインの不存在を伴うことができる。種変異体は、１つの種から他の種まで変わるポリヌクレオチド配列である。得られるポリペプチドは、一般にお互いに対して有意なアミノ酸同一性を有するであろう。多形変異体は、所与の種の個体間の特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列における変化である。多形変異体は、ポリヌクレオチド配列が１塩基だけ変わる一塩基多形（ＳＮＰｓ）を包含することもできる。ＳＮＰｓの存在は、例えば、ある集団、疾患状態または疾患状態の傾向を示すことができる。
【００８３】
遺伝子の発現のレベルを決定するためのマイクロアレイ
一般に、マイクロアレイにより発現プロファイルを決定することは、下記の工程：（ａ）被験体からｍＲＮＡサンプルを得、そしてそれから標識された核酸（「ターゲット核酸」または「ターゲット」を調製し；（ｂ）ターゲット核酸がアレイ上の対応するプローブに、例えばハイブリダイゼーションまたは特異的結合により結合するのに十分な条件下で、ターゲット核酸をアレイと接触させ；（ｃ）場合により結合しなかったターゲットをアレイから除去し；（ｄ）結合したターゲットを検出し；そして（ｅ）その結果を、例えばコンピューターをベースとする解析方法を使用して解析する工程を含む。本明細書で使用された「核酸プローブ」または「プローブ」は、アレイに結合している核酸であり、これに対して「ターゲット核酸」は、アレイにハイブリダイゼーションされる核酸である。これらの工程の各々は下記に更に詳細に説明される。
【００８４】
核酸試験片は、「侵襲性」サンプリング手段または「非侵襲性」サンプリング手段を使用して試験されるべき個体から得られうる。サンプリング手段は、もしそれが動物（マウス(murine)、ヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、またはネコ動物を含む）の皮膚または器官内からの核酸の採集を伴うならば、「侵襲性」と言われる。侵襲性方法の例は、血液採集、精液採集、針生検、胸膜吸引、臍帯生検等を含む。このような方法の例は、Kim, et al.,(J. Virol. 66:3879-3882, 1992); Biswas, et al., (Ann. NY Acad. Sci. 590:582-583, 1990); およびBiswas, et al., (J. Clin. Microbiol. 29:2228-2233, 1991)により論議されている。
【００８５】
対照的に、「非侵襲性」サンプリング手段は、核酸分子を動物の内表面または外表面から回収するサンプリング手段である。このような「非侵襲性」サンプリング手段の例は、例えば、涙、唾液、尿、糞便物、汗または発汗、髪等の「スワブによる」(swabbing)採集を含む。
【００８６】
本発明の１つの態様では、試験されるべき被験体から１つ以上の細胞を得、その細胞からＲＮＡを単離する。１つの態様では、末梢血白血球（ＰＢＬｓ）細胞のサンプルが、被験体から得られる。細胞サンプルを被験体から得、次いでサンプルを所望の細胞型について濃縮する(enrich)ことも可能である。例えば、細胞を、種々の技術、例えば、所望の細胞型の細胞表面のエピトープに結合する抗体による単離、を使用して他の細胞から単離することができる。所望の細胞が固体組織中にある場合に、特定の細胞を、例えばマイクロディセクションによりまたはレーザーキャプチャーマイクロディセクション（ＬＣＭ）により切断することができる(例えば、Bonner, et al., Science 278:1481, 1997; Emmert-Buck, et al., Science 274-998 1996; Fend, et al., Am. J. Path. 154: 61, 1999; およびMurakami, et al., Kidney Int. 58: 1346, 2000参照)。
【００８７】
ＲＮＡは、種々の方法、例えば、グアニジンチオシアネート溶解(guanidium thiocyanate lysis)、次いでＣｓＣｌ遠心により組織または細胞サンプルから抽出されうる(Chirgwin, et al., Biochemistry 18:5294-5299,1979)。単一細胞からのＲＮＡは、単一細胞からのｃＤＮＡライブラリーを調製するための方法に記載のとおりに得られうる(例えば、Dulac, Curr. Top. Dev. Biol. 36:245, 1998; Jena et al., J. Immunol. Methods 190:199, 1996参照)。
【００８８】
ＲＮＡサンプルは、特定の種について更に濃縮することができる。１つの態様では、例えば、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、ＲＮＡサンプルから単離することができる。特に、ポリＴオリゴヌクレオチドは、固体支持体上に固定化されてｍＲＮＡのためのアフィニティーリガントとして役立つことができる。この目的のキット、例えばMessageMakerキット(Life Technologies, Grand Island, NY)は市販されている。
【００８９】
１つの態様では、ＲＮＡ集団は、関心のある配列、例えば表１に記載の遺伝子（例えば配列番号１〜１８）について濃縮することができる。濃縮は、例えば、プライマー特異的ｃＤＮＡ合成、またはｃＤＮＡ合成およびテンプレート指向ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に基づく多数回の線状増幅により達成されうる(例えば、Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9717, 1989; Dulac, et al., supra; Jena, et al., supra参照)。
【００９０】
特定の種または配列において濃縮されたまたは濃縮されていないＲＮＡの集団は、更に増幅させることができる。このような増幅は、単一細胞または少数の細胞からのＲＮＡを使用する場合に特に重要である。例えばＰＣＲ；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）(例えば、Wu and Wallace, Genomics 4: 560, 1989; Landegren, et al., Science 241: 1077, 1988)；ＳＳＲ法(self-sustained sequence replication)(例えば、Guatelli, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874, 1990)；核酸をベースとする配列増幅（ＮＡＳＢＡ）および転写増幅(例えば、Kwoh, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173, 1989参照)を含む種々の増幅方法が、本発明の方法で使用するために適当である。ＰＣＲ技術のための方法は、当技術分野で周知である(例えば、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification(ed. H. A. Erlich, Freeman Press, N. Y., N. Y.,m 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1990); Mattila, et al., Nucleic Acids Res. 19: 4967, 1991; Eckert, et al., PCR Methods and Applications 1: 17, 1991; PCR(eds. McPherson, et al., IRL Press, Oxford); およびU. S. Pat. No. 4,683,202参照)。増幅の方法は、例えば、Ohyama, et al., (Bio Techniques 29: 530, 2000); Luo, et al., (Nat. Med. 5: 117, 1999); Hegde, et al., (Bio Techniques 29: 548, 2000); Kacharmina, et al., (Meth. Enzymol. 303: 3, 1999); Livesey, et al., Curr. Biol. 10:301, 2000); Spirin, et al.,(Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 40: 3108, 1999); およびSakai, et al., (Anal. Biochem. 287: 32, 2000)により記載されている。ＲＮＡ増幅およびｃＤＮＡ合成は、細胞においてin situで行われることもできる（例えば、Eberwine, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3010, 1992）。
【００９１】
一般に、ターゲット分子は、マイクロアレイに対するターゲット分子のハイブリダイゼーションの検出を可能とするように標識されるであろう。即ち、プローブは、シグナル産生システムのメンバーを含むことができ、したがって直接検出可能であるか、またはシグナル産生システムの１つ以上の追加のメンバーとの組み合わさった作用を通じて検出可能である。直接検出可能な標識の例は、プローブの一部、例えばヌクレオチドモノマー単位（例えばプライマーのｄＮＭＰ）に、通常共有結合により組み込まれた同位元素部分および蛍光部分、またはプローブ分子の官能性部分に結合されうる検出可能な標識の光活性または化学的活性誘導体を含む。
【００９２】
核酸は、ＲＮＡｓの濃縮および／または増幅の期間中または後に標識されうる。例えば、逆転写は、検出可能な標識にコンジュゲーションされたｄＮＴＰ、例えば蛍光的に標識されたｄＮＴＰの存在下に行うことができる。他の態様では、ｃＤＮＡまたはＲＮＡプローブは、検出可能な標識の不存在下に合成され得、次いで、例えば、ビオチニル化されたｄＮＴＰｓもしくはｒＮＴＰを組み込みこむこと、またはいくらかの同様な手段（例えばＲＮＡｓにビオチンのソラレン誘導体を光架橋連結すること）、次いで標識されたストレプトアビジン（例えば、フィコエリトリンをコンジュゲーションされたストレプトアビジン）または均等物の添加により標識されうる。
【００９３】
関心のある蛍光部分または標識は、クマリンおよびその誘導体（例えば、７−アミノ−４−メチルクマリン、アミノクマリン）；ボディパイ染料、例えばBodipy FLおよびカスケードブルー；フルオレセインおよびその誘導体（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、オレゴングリーン）；ローダミン染料（例えば、テキサスレッド、テトラメチルローダミン）；エオシンおよびエリスロシン；シアニン染料（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７）；Fluorx、ランタニドイオンの大環状キレート（例えば、クオンタム染料（商標））；蛍光エネルギー移行染料、例えば、チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロダイマー、ＴＯＴＡＢ、ダンシル等を含む。本発明の装置またはアッセイにおいて望ましく検出されたエレメントに連結するための官能性を有する個々の蛍光化合物、またはこのような官能性を組み込むために改変されうる個々の蛍光化合物を利用することもできる(例えば、Kricka, 1992, Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press San Diego, Calif参照)。
【００９４】
化学発光標識は、ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールを含む。
【００９５】
標識は、同じシステムの１つ以上の追加のメンバーと協力して作用して検出可能なシグナルを与えるシグナル産生システムのメンバーであることもできる。このような標識の例示的なものは、特異的結合ペアのメンバー、例えばリガンド、例えば、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、抗原、多価カチオン、キレーター基等である。メンバーは、シグナル産生システムの追加のメンバーに特異的に結合することができ、そして該追加のメンバーは、直接または間接に、検出可能なシグナル、例えば、基質を色素産生性産物に転換することができる蛍光部分または酵素部分にコンジュゲーションされた抗体（例えば、アルカリホスファターゼコンジュゲート抗体等）を与えることができる。
【００９６】
関心のある追加の標識は、関連するプローブがターゲット分子に特異的に結合されるときのみシグナルを与える標識を含む。このような標識は、Tyagi and Kramer(Nature Biotech. 14: 303, 1996)およびEP0070685B1に記載の「分子ビーコン」を含む。関心のある他の標識は、U.S.Pat No 5,563,037; WO 97/17471; および WO 97/17076に記載の標識を含む。
【００９７】
他の態様では、ターゲット核酸は標識されないことがある。この場合に、ハイブリダイゼーションは、例えば、プラズモン共鳴により決定されうる（例えば、Thiel, et al., Anal. Chem. 69: 4948, 1997参照）。
【００９８】
１つの態様では、複数の（例えば、２、３、４、５またはそれより多くの）セットのターゲット核酸を標識し、そして１つのハイブリダイゼーション反応において使用する（「マルチプレックス」解析）。例えば、１つのセットの核酸は１つの細胞からのＲＮＡに対応することができ、そして他のセットの核酸は、他の細胞からのＲＮＡに対応することができる。複数のセットの核酸は、それらが識別されうるように異なる発光スペクトルを有する異なる標識、例えば異なる蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）で標識されうる。次いでこれらのセットを混合し、そして同時に１つのマイクロアレイにハイブリダイゼーションさせることができる（例えば、Shena, et al., Science 270: 467-470, 1995参照）。
【００９９】
複数のターゲット核酸を１つのアレイにハイブリダイゼーションさせる場合に使用するための識別可能な標識の例は、当技術分野で周知であり、そして２つ以上の異なる発光波長の蛍光染料、例えばＣｙ３とＣｙ５；蛍光タンパク質と染料の組み合わせ、例えばフィコエリスリンとＣｙ５；異なる発光エネルギーを有する２つ以上の同位元素、例えば３２Ｐと３３Ｐ；異なる散乱スペクトルを有する金または銀粒子；異なる処置条件、例えば温度、pH、追加の化学剤による処置などの下でシグナルを発生する標識；または処置後の異なる時点でシグナルを発生する標識を含む。シグナル発生のために１つ以上の酵素を使用することは、酵素の異なる基質特異性に基づくより多様でさえある識別可能な標識の使用を可能とする（例えば、アルカリホスファターゼ／ペルオキシダーゼ）。
【０１００】
標識された核酸の品質は、アレイへのハイブリダイゼーションの前に評価することができる。１つの態様では、Affymetrix(Santa Clara, CA)からのGeneChip（登録商標）Test3 Arrayをその目的に使用することができる。このアレイは、哺乳動物を含むいくつかの生物からの特徴付けられた遺伝子のサブセットを表すプローブを含有する。従って、標識された核酸サンプルの品質は、アレイへのサンプルのフラクションのハイブリダイゼーションにより決定することができる。
【０１０１】
本発明に従う使用のためのマイクロアレイは、低分子有効性に特徴的な遺伝子の１つ以上のプローブを含む。１つの態様では、マイクロアレイは、癌においてアップレギュレーションされる遺伝子および癌においてダウンレギュレーションされる遺伝子からなる群より選ばれる１つ以上の遺伝子に対応するプローブを含む。マイクロアレイは、例えば、低分子有効性の少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１００以上の特徴に対応するプローブを含むことができる。マイクロアレイは、表１に列挙された各遺伝子または遺伝子産物に対応するプローブを含むことができる。
【０１０２】
マイクロアレイ上には各遺伝子に対応する１つ以上のプローブが存在しうる。例えば、マイクロアレイは、１つの遺伝子または約５〜１０に対応する２〜２０のプローブを含有することができる。プローブは、低分子有効性に特徴的な遺伝子の完全長ＲＮＡ配列またはその相補体に対応することができ、またはプローブは、特異的なハイブリダイゼーションを可能とするのに十分な長さであるその部分に対応することができる。このようなプローブは、約５０ヌクレオチド〜約１００、２００、５００または１０００ヌクレオチドまたは１０００より多くのヌクレオチドを含むことができる。更に本明細書に記載されたとおり、マイクロアレイは、約１０〜５０ヌクレオチド、約１５〜３０ヌクレオチドまたは約２０〜２５ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドプローブを含有することができる。プローブは、一本鎖であることができ、そして配列特異的ハイブリダイゼーションの所望のレベルを与えるのに十分なそのターゲットに対する相補性を有するであろう。
【０１０３】
典型的には、本発明で使用されるアレイは、１００より多くの異なるプローブ／ｃｍ２の部位密度を有するであろう。アレイは、例えば、５００／ｃｍ２より多くの、約１０００／ｃｍ２より多くの、または約１０，０００／ｃｍ２より多くの部位密度を有することができる。アレイは、例えば、１つの基材上に１００より多くの異なプローブ、１つの基材上に約１０００より多くの異なるプローブ、約１０，０００より多くの異なるプローブまたは１００，０００より多くのプローブを有することができる。
【０１０４】
多数の異なるマイクロアレイ配置およびその産生のための方法は、当業者に知られており、そしてU.S.Pat Nos: 5,242,974; 5,384,261; 5,405,783; 5,412,087; 5,424,186; 5,429,807; 5,436,327; 5,445,934; 5,556,752; 5,405,783; 5,412,087; 5,424,186; 5,429,807; 5,436,327; 5,472,672; 5,527,681; 5,529,756; 5,545,531; 5,554,501; 5,561,071; 5,571,639; 5,593,839; 5,624,711; 5,700,637; 5,774,305; 5,770,456; 5,770,722; 5,837,832; 5,856,101; 5,874,219; 5,885,837; 5,919,523; 6,022,963; 6,077,674;および 6,156,501; Shena, et al., Tibtech 16: 301, 1998; Duggan, et al., Nat. Genet. 21:10, 1999; Bowtell, et al., Nat. Genet. 21:25, 1999; Lipshutz, et al., 21 Nature Genet. 20-24, 1999; Blanchard, et al., 11 Biosensors and Bioelectronics, 687-90, 1996; Maskos, et al., 21 Nucleic Acids Res. 4663-69, 1993; Hughes, et al., Nat, Biotechnol. 19: 342, 2001; に開示されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。種々の用途にアレイを使用する方法を記載する特許は、U.S.Pat Nos. 5,143,854; 5,288,644; 5,324,633; 5,432,049; 5,470,710; 5,492,806; 5,503,980; 5,510,270; 5,525,464; 5,547,839; 5,580,732; 5,661,028; 5,848,859; および5,874,219を含み、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０５】
アレイは、コントロールおよび参照核酸を含むこともできる。コントロール核酸は、例えば、原核生物遺伝子、例えば、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＣおよびｂｉｏＤ、Ｐ１バクテリオファージからのｃｒｅまたはポリＡコントロール、例えばｄａｐ、ｌｙｓ、ｐｈｅ、ｔｈｒおよびｔｒｐを含む。参照核酸は、１つの実験から他の実験までの結果の正規化および定量的レベルでの多数の実験の比較を可能とする。例示的参照核酸は、既知の発現レベルのハウスキーピング遺伝子、例えば、ＧＡＰＤＨ、ヘキソキナーゼおよびアクチンを含む。
【０１０６】
１つの態様では、オリゴヌクレオチドのアレイは、固体支持体上で合成されうる。例示的固体支持体は、ガラス、プラスチック、ポリマー、金属、メタロイド、セラミック、有機物等を含む。チップマスキング技術および光保護化学を使用して、核酸プローブのオーダードアレイを発生することが可能である。例えば、「ＤＮＡチップ」または非常に大規模な固定化されたポリマーアレイ（「VLSIPS(商標)」アレイ）として知られているこれらのアレイは、約１cm2〜数cm2の面積を有する基材上に数百万の規定されたプローブ領域を含むことができ、それにより数プローブ〜数百万のプローブを組み込むことができる(例えば、U.S.Pat No. 5,631,734参照)。
【０１０７】
核酸プローブは、少なくとも、例えば、約１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００またはそれより多くのヌクレオチドであることができ、そして完全長遺伝子を含むことができる。例えば、プローブは、表１に列挙された遺伝子に特異的にハイブリダイゼーションするプローブであることができる。
【０１０８】
核酸プローブは、例えば、ゲノム、ｃＤＮＡからの遺伝子セグメントのＰＣＲ増幅（例えばＲＴ−ＰＣＲ）またはクローニングされた配列のＰＣＲ増幅により得られうる。ｃＤＮＡプローブは、当技術分野で知られている方法および更に本明細書に記載されている方法に従って、例えば、配列特異的プライマーを使用するＲＮＡの逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により調製されうる。プローブを発生させる遺伝子またはｃＤＮＡの配列は、例えば、GenBank、他の公的データベースまたは刊行物から得られうる。
【０１０９】
オリゴヌクレオチドプローブは、当技術分野で知られている標準方法により、例えば、自動化ＤＮＡ合成機または任意の他の化学的方法により合成することもできる。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Stein, et al., (Nucl. Acids Res. 16: 3209, 1988)の方法により合成することができ、そしてメチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、コントロールされた細孔ガラスポリマー支持体により調製されうる（例えば、Sarin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 7448-7451, 1988参照）。他の態様では、オリゴヌクレオチドは、２’−メチルリボヌクレオチドであることができ(Inoue, et al., Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148, 1987)、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログであることができる(Inoue, et al., FEBS Lett. 215: 327-330, 1987)。
【０１１０】
核酸プローブは、天然の核酸または化学的に改変された核酸で（例えば、ヌクレオチドアナログからなる）であることができるが、プローブは連結化学に適合しうる活性化されたヒドロキシル基を有するべきである。保護基は、光不安定性であることができ、または保護基はある化学的条件下に（例えば酸）不安定であることができる。固体支持体の表面は、光に暴露されると酸を発生する組成物を含有することができる。かくして、基質のある領域の光への暴露は、暴露された領域において保護基を除去するその領域において酸を発生させる。また合成方法は、３’−保護された５’−Ｏ−ホスホルアミダイト活性化デオキシヌクレオシドを使用することができる。この場合に、オリゴヌクレオチドは、５’から３’方向に合成され、これは遊離５’端部をもたらす。
【０１１１】
本発明の１つの態様では、アレイのオリゴヌクレオチドは、数千のオリゴヌクレオチドを産生することができる９６ウエル自動化多重スオリゴヌクレオチド合成機（Ａ．Ｍ．Ｏ．Ｓ．）を使用して合成されうる（例えば、Lashkari, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7912, 1995）。
【０１１２】
発現レベルを比較するために、標識された核酸を、ターゲット核酸とアレイ上のプローブとの結合のための十分な条件下にアレイと接触させることができる。１つの態様では、ハイブリダイゼーション条件は、所望のレベルのハイブリダイゼーション特異性を与えるように選択され得；即ち、標識された核酸とマイクロアレイ上のプローブとの間でハイブリダイゼーションが起こるのに十分な条件であることができる。
【０１１３】
ハイブリダイゼーションは、本質的に特異的なハイブリダイゼーションを可能とする条件で行うことができる。核酸の長さおよびＧＣ含有率は、熱融解点を決定し、従って、プローブのターゲット核酸への特異的ハイブリダイゼーションを得るために必要なハイブリダイゼーション条件を決定するであろう。これらのファクターは、当業者に周知であり、そしてアッセイにおいて試験することもできる。核酸ハイブリダイゼーションへの広範囲のガイドはTijssen, et al.に見出されうる(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization With Nucleic Acid Probes, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y.,(1993))。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびpHで特異的配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選ばれうる。Ｔｍは、ターゲット配列の５０％が完全にマッチしたプローブにハイブリダイゼーションする温度（規定されたイオン強度およびｐＨ下に）である。高度にストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴｍ点に等しいように選ばれうる。あるときは、用語「解離温度」（Ｔｄ）は、プローブの少なくとも半分が完全にマッチしたターゲット核酸から解離する温度を定義するために使用される。いずれにせよ、ＴｍまたはＴｄを評価するための多様な技術が利用可能であり、そして一般に上記Tijssenに記載されている。典型的には、約８０〜１００℃の理論的最大値まで、二本鎖におけるＧ−Ｃ塩基対はＴｍに約３℃寄与すると評価されるが、Ａ−Ｔ塩基対は約２℃寄与すると評価される。しかしながら、Ｇ−Ｃスタッキング相互作用、溶媒効果、所望のアッセイ温度等を考慮に入れたＴｍおよびＴｄのより高性能のモデルが利用可能である。
【０１１４】
１つの態様では、非特異的結合またはバックグラウンドシグナルは、ハイブリダイゼーション期間中洗剤（例えば、Ｃ−ＴＡＢ）またはブロッキング試薬（例えば、精子ＤＮＡ、ｃｏｔ−１ＤＮＡ等）の使用により減少させることができる。１つの態様では、ハイブリダイゼーションは、約０．５mg/mlＤＮＡ（例えば、ニシン精子ＤＮＡ）の存在において行うことができる。ハイブリダイゼーションにおけるブロッキング剤の使用は、当業者に周知である（例えば、上記Tijssen参照）。
【０１１５】
ターゲット配列が同じ標識を使用して検出されるならば、各生理学的ソースについて異なるアレイを使用することができ、または同じアレイを多数回スクリーニングすることができる。上記方法は、異なるターゲット集団（例えば、異なる生理学的ソース）について異なる標識および識別可能な標識を使用することにより多重解析を与えるように変えることができる。この多重方法に従えば、同じアレイを、異なるターゲット集団の各々について同時に使用することができる。
【０１１６】
上記した方法は、アレイ表面の標識されたターゲット核酸のハイブリダイゼーションパターンの産生をもたらす。標識された核酸の得られるハイブリダイゼーションパターンは、種々の方法で、ターゲット核酸の特定の標識に基づいて選ばれた特定の検出方式で、可視化または検出されうる。代表的な検出手段は、シンチレーション計数、オートラジオグラフィー、蛍光測定、比色測定、発光測定、光散乱等を含む。
【０１１７】
１つのこのような検出方法は、市販のアレイスキャナー（Affymetrix, Santa Clara,CA）、例えば、４１７（商標）Arrayer、４１８（商標）Array ScannerまたはAgilent GeneArray（商標）Scannerを利用する。このスキャナーは、インターフェースおよび簡単に使用できるソフトウエアツールによりシステムコンピューターからコントロールされる。アウトプットは、直接インポートされうるかまたは種々のソフトウエアアプリケーションにより直接読み出されうる。スキャニング装置は、例えば、U.S.Pat Nos. 5,143,854および5,424,186に記載されている。
【０１１８】
蛍光標識されたプローブについて、転写物アレイの各部位における蛍光発光は、スキャニング共焦点レーザー顕微鏡法により検出することができる。あるいは、２つのフルオロフォアに特異的な波長での同時の試験片照射を可能とするレーザーを使用することができ、そして２つのフルオロフォアからの発光を同時に解析することができる(例えば、Shalon, et al., Genome Res. 6:639-645, 1996参照)。例えば、アレイは、コンピューターでコントロールされたＸ−Ｙステージおよび顕微鏡対物レンズを使用するレーザー蛍光スキャナーによりスキュニングされうる。蛍光レーザースキャニング装置は、上記Shalon, et al.に記載されている。
【０１１９】
データ蓄積操作の後、典型的には、データはデータ解析操作に報告されるであろう。サンプル解析操作を促進するために、装置からリーダーにより得られたデータは、ディジタルコンピューターを使用して解析されうる。典型的には、コンピューターは、装置からのデータの受け取りおよび保存、ならびに蓄積されたデータの解析および報告、例えば、バックグラウンドの減算、多色像のデコンボリューション、アーティファクトの減少または除去、コントロールが適切に行われたことの証明、シグナルの正規化、蛍光データを解釈してハイブリダイゼーションされたターゲットの量を決定すること、バックグラウンドおよび一塩基ミスマッチハイブリダイゼーションの正規化等のために適切にプログラムされるであろう。
【０１２０】
１つの態様では、システムは、特異的パターン、例えば、被験体における癌細胞の発現プロファイルと対応の正常細胞の発現プロファイルとの間のディファレンシャルな遺伝子発現に関するパターンをサーチすることを可能とするサーチ機能を含む。例えば、システムは、２つより多くのサンプル間の遺伝子発現のパターンをサーチすることを可能とする。
【０１２１】
遺伝子発現プロファイルデータ、例えば行うべき比較のタイプを解析するための種々のアルゴリズムが利用可能である。ある態様では、コレギュレーションされる遺伝子をグループに分けることが望ましい。これは、多数のプロファイルの比較を可能とする。このような遺伝子のグループを同定するための１つの態様は、クラスタリングアルゴリズムを含む(クラスタリングアルゴリズムの概観については、例えば、Fukunaga, 1990, Statistical Pattern Recognition, 2nd Ed., Academic Press, San Diego; Everitt, 1974, Cluster Analysis, London: Heinemann Educ. Books; Hartigan, 1975, Clustering Algorithms, New York: Wiley; Sneath and Sokal, 1973, Numerical Taxonomy, Freeman; Anderberg, 1973, Cluster Analysis for Applications, Academic Press: New York参照)。
【０１２２】
クラスタリングは、遺伝子の他の特徴、例えば、それらの発現のレベル（例えば、U.S.Pat No. 6,203,987参照）に基づくことができ、または時間曲線のクラスタリングを可能とする（例えば、U.S.Pat No.6,263,287参照）。クラスタリングアルゴリズムの例は、Ｋ−ｍｅａｎｓクラスタリングおよび階層的クラスタリングを含む。クラスタリングは、データのグラフ表示を使用して遺伝子発現データの視覚による検査により達成することもできる（例えば、「ヒートマップ」）。クラスタリングアルゴリズムおよび遺伝子発現データをグラフで表示するための手段を含有するソフトウエアの例は、Spotfire DecisionSite(Spotfire, Inc., Somerville, Massachusetts and Gouteborg, Sweden)である。
【０１２３】
低分子有効性の特徴的な１つ以上の遺伝子の発現レベルの、参照発現レベル、例えば癌の罹患細胞における発現レベルまたは正常な対応細胞における発現レベル、との比較は、コンピューターシステムを使用して行うことができる。１つの態様では、発現レベルは２つの細胞から得ることができ、そしてこれらの２セットの発現レベルは比較のためにコンピューターシステムに導入することができる。例えば、１セットの発現レベルは、コンピュータームシステム中にすでに存在する値との比較のためにコンピューターシステムに入力され、または、後でコンピューターシステムに入力されるコンピューター可読形態にある。
【０１２４】
１つの態様では、コンピューターシステムは、低分子有効性に特徴的な１つ以上の遺伝子の発現のレベルを表す値を含むデータベースを含有することもできる。データベースは、異なる細胞における低分子有効性に特徴的な遺伝子の１つ以上の発現プロファイルを含有することができる。
【０１２５】
他の態様では、本発明は、遺伝子発現プロファイルデータのコンピューター可読形態または罹患細胞における癌に特徴的な少なくとも１つの遺伝子の発現のレベルに対応する値のコンピューター可読形態を与える。この値は実験、例えばマイクロアレイ解析から得られたｍＲＮＡ発現レベルであることができる。この値は、参照遺伝子であってその発現が多数の条件下に多数の細胞において一定である参照遺伝子（例えば、ＧＡＰＤＨ）に対して正規化されたｍＲＮＡレベルであることもできる。他の態様では、コンピューターにおける値は、異なるサンプルにおける正規化されたまたは正規化されていないｍＲＮＡレベルの比または異なるサンプルにおける正規化されたまたは正規化されていないｍＲＮＡレベル間の差であることができる。
【０１２６】
１つの態様では、発現プロファイルは、がん細胞が薬物、例えばマルチキナーゼ阻害剤によりｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで処置される１つ以上の被験体からの癌細胞からの発現プロファイルである。薬物によりｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで処置された被験体の細胞の発現データは、コンピューターに入力され、そしてコンピューターは、入力されたデータをコンピューターにおけるデータと比較し、そしてコンピューターへの発現データインプットが薬物に応答性の被験体の細胞のこれらにより高度に類似しているかまたは薬物に応答性ではない被験体の細胞のこれらにより高度に類似しているかどうかを示す結果を与えるようにインストラクションされる。従って、結果は、被験体が薬物による処置に応答しそうであるかまたはそれに応答しそうでないかどうかを示す。
【０１２７】
本発明は、下記の工程：（ｉ）クエリー細胞における低分子有効性に特徴的な１つ以上の遺伝子の発現レベルに対応する複数の値を、１つ以上の参照細胞の参照発現または発現プロファイルデータを含む記録および細胞のタイプのアノテーションを含むデータベースと比較する工程、および（ｉｉ）クエリー細胞が発現プロファイルの類似性に基づいてどの細胞に最も類似しているかを示す工程を行うためのプログラムインストラクションを含む機械可読媒体またはコンピューター可読媒体も提供する。参照細胞は、癌の異なる段階における被験体からの細胞であることができる。参照細胞は、特定の薬物処置に応答するまたは応答しない被験体からの細胞であって、場合により薬物とｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでインキュベーションされた細胞であることもできる。
【０１２８】
参照細胞は、いくつかの異なる処置に応答するかまたは応答しない被験体からの細胞であることもでき、そしてコンピューターシステムは被験体のための好ましい処置を示す。従って、本発明は、癌を有する患者のための治療を選ぶための方法であって、（ｉ）患者の罹患細胞における低分子有効性に特徴的な１つ以上の遺伝子の発現のレベルを提供し；（ｉｉ）各々治療と関連した複数の参照プロファイルであって、被験体発現プロファイルおよび各参照プロファイルが複数の値を有し、各値が癌に特徴的な遺伝子の発現のレベルを表す、複数の参照プロファイルを提供し；そして（ｉｉｉ）被験体発現プロファイルに最も類似した参照プロファイルを選び、それにより前記患者に対する治療を選ぶことを含む方法を提供する。１つの態様では、工程（ｉｉｉ）は、コンピューターにより行うことができる。最も類似した参照プロファイルは、対応する発現データと関連した加重値(weight value)を使用して複数の比較値に重みを付けることにより選ぶことができる。
【０１２９】
２つの生物学的サンプルにおけるｍＲＮＡの相対的アバンダンスは、パーターベーションおよび決定されたその大きさとしてスコア化されることができ（即ち、アバンダンスは、試験されたｍＲＮＡの２つのソースにおいて異なる）またはパーターベーションされていないものとしてスコア化されうる（即ち、相対的アバンダンスは同じである）。種々の態様において、ＲＮＡの２つのソース間の差はパーターベーションとしてスコア化される。パーターベーションは、計算および発現比較のためにコンピューターにより使用されうる。
【０１３０】
マイクロアレイを使用する薬物デザイン
本発明は、癌用の薬物、例えば、本明細書に記載のとおりに同定された薬物をデザインし、そして最適化するための方法も提供する。１つの態様では、癌の罹患細胞または類似した細胞の試験化合物とのインキュベーションの後に、低分子有効性に特徴的な１つ以上の遺伝子の発現レベルを比較することにより、化合物をスクリーニングすることができる。他の態様では、遺伝子の発現レベルは、マイクロアレイを使用し、そして試験化合物に応答した細胞の遺伝子発現プロファイルを癌の罹患細胞に対応する正常細胞の遺伝子発現プロファイル（「参照プロファイル」）と比較して決定することができる。更なる態様では、発現プロファイルは、癌の罹患細胞の発現プロファイルと比較することもできる。比較は、薬物で処置された細胞の遺伝子発現プロファイルデータを、適切なアルゴリズムを使用して、コンピューター可読形態で保存されている参照遺伝子発現プロファイルを含むコンピューターシステムに導入することにより行うことができる。試験化合物は、低分子有効性に特徴的な遺伝子の発現のレベルを変える化合物についてスクリーニングされうる。このような化合物、即ち、低分子有効性に特徴的な本質的にすべての遺伝子の発現を正規化することができる化合物は候補治療剤である。
【０１３１】
次いで化合物の有効性を、追加のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおいて、そして動物モデル（例えば、異種移植片モデル）において試験することができる。試験化合物は、試験動物に投与することができ、そして疾患の１つ以上の症候を動物の状態の改良のために監視することができる。低分子有効性に特徴的な１つ以上の遺伝子の発現は、動物への試験化合物の投与の前後に測定することもできる。これらの遺伝子の１つ以上の発現の正規化は、動物における癌を処置するための化合物の有効性を示す。
【０１３２】
臨床的状態において、癌を示す組織のヒト由来のサンプルを得ることは、禁止されてはいないとしても、困難でありうる。従って、治療化合物の有効性を示す遺伝子発現変化の同定は、より容易にアクセス可能な代理細胞集団、例えば、末梢血白血球（ＰＢＬｓ）において決定することができる。この方法は、ヒトまたは動物モデルシステムにおいて行うことができる。１つの態様では、試験化合物は、その動物モデルにおいて癌を処置するのに有効であることが観察された同じ用量で試験動物（正常なまたは癌含有）に投与することができる。血液を、種々の時点で（例えば、多数日投与の方式の最初、中間および最後の日の１、４、７および２４時間後）動物から採取することができる。ビヒクルを投与された動物をコントロールとして使用することができる。ＲＮＡはＰＢＬｓから単離することができ、そしてマイクロアレイへのハイブリダイゼーションのためのプローブを発生させるのに使用することができる。次いでハイブリダイゼーションの結果を、上記したコンピュータープログラムおよびデータベースを使用して解析することができる。得られる発現プロファイルを、処置された癌組織からの類似したプロファイルと類似性について直接比較することができ、または動物モデルにおいて有効性と簡単に相関させることができる（例えば、用量および時点によって）。
【０１３３】
他の態様では、ヒト血液を、動物モデルにおける治療用量と合致した用量でまたは動物モデルにおける治療用量の既知の血漿レベルと合致した用量で、治療化合物でｅｘ ｖｉｖｏで処置することができる。血液を、治療化合物で直ちに処置する（例えば、３７℃で揺する）ことができ、または血液採取後に遺伝子発現が再平衡化するのを可能とするためのある期間のインキュベーション時間（例えば、２４時間）後に処置することができる。血液は、種々の時点（例えば、４および２４時間）で治療化合物で処置することもでき、次いでＰＢＬ ＲＮＡを単離し、そしてマイクロアレイへのハイブリダイゼーションのためのプローブを創生するのに使用することができる。化合物可溶化剤（例えば、ＤＭＳＯ）をコントロールとして使用することができる。得られる発現プロファイルは、類似性について処置された癌組織からの類似したプロファイルと直接比較することができ、または動物モデルにおいて有効性と簡単に相関させることができる（例えば、用量および時点によって）。
【０１３４】
候補治療化合物の毒性は、例えば、化合物が毒性応答と関連していることが知られている遺伝子の発現を誘導するかどうかを決定することにより評価することができる。このような毒性関連遺伝子の発現は、種々の細胞型、例えば該遺伝子を発現することが知られている細胞型において決定することができる。実際、遺伝子発現の変化は、ルーチンな症状発現前安全性検査よりも感受性の高いヒト毒性のマーカーとして役立つことができる。マイクロアレイは、毒性応答と関連していることが知られている遺伝子の発現の変化を検出するために使用することができる。遺伝子発現レベルの変化が、ルーチンな症状発現前安全性検査により同定されなかった毒性事象を予測することができるということを証明するコンセプトの研究の証明を行うことを可能としうる(例えば、Huang, et al., Toxicol. Sci. 63: 196-207, 2001; Waring, et al., Toxicol. Appl. Pharmacol. 175:28-42, 2001参照)。
【０１３５】
薬物スクリーニングは、試験化合物を細胞のサンプルに加え、そして効果を監視することにより行うことができる。試験化合物を受け取らない平行サンプルをコントロールとして監視することもできる。次いで処置された細胞と無処置細胞を、顕微鏡解析、生存率試験、複製する能力、組織学的検査、細胞と関連した特定のＲＮＡまたはポリペプチドのレベル、細胞または細胞溶解物により発現された酵素活性のレベル、および細胞の他の細胞または化合物と相互作用する能力を含むがそれらに限定されない任意の適当な表現型基準により比較する。処置された細胞と無処置細胞との差は試験化合物に帰されうる効果を示す。
【０１３６】
試験化合物の望ましい効果は、癌関連マーカー核酸配列により与えられた任意の表現型に対する効果を含む。例は、ｍＲＮＡのオーバーアバンダンスを制限するか、コードされたタンパク質の産生を制限するか、またはタンパク質の機能的効果を制限する試験化合物を含む。処置された細胞と無処置細胞間で結果を比較するとき、試験化合物の効果は明らかであろう。
【０１３７】
診断および予後アッセイ
本発明は、癌においてディファレンシャルにレギュレーションされる核酸配列およびこのような配列を同定するための方法を提供する。本発明は、癌を有する被験体においてディファレンシャルにレギュレーションされるヌクレオチド配列を同定するための方法であって、被験体から得られたＲＮＡに対応する核酸サンプルを既知のアイデンティティーの１つ以上の核酸分子を含む核酸サンプルにハイブリダイゼーションさせ；そして既知のアイデンティティーの１つ以上の核酸分子への該核酸サンプルのハイブリダイゼーションを測定し、癌のない被験体から得られた核酸サンプルに比較して既知のアイデンティティーの１つ以上の核酸分子への該核酸サンプルのハイブリダイゼーションの差が、癌を有する被験体におけるヌクレオチド配列のディファレンシャルな発現を示す、ことを含む方法を提供する。
【０１３８】
一般に、本発明は、癌を有する被験体においてディファレンシャルにレギュレーションされる核酸配列を同定するための方法であって、被験体からメッセンジャーＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡサンプルからｃＲＮＡを発生させ、該ｃＲＮＡを、マイクロアレイであって、該アレイ上の分離したロケーションと安定に会合した複数の核酸分子を含むマイクロアレイにハイブリダイゼーションさせ、そして該アレイへのｃＲＮＡのハイブリダイゼーションのパターンを同定することを含む方法を提供する。本発明に従えば、アレイ上の所与のロケーションにハイブリダイゼーションする核酸分子は、もしハイブリダイゼーションシグナルが、例えば、癌を持たない被験体から得られた核酸サンプルとハイブリダイゼーションした同じアレイ上の同じロケーションにおけるハイブリダイゼーションシグナルよりも高いかまたは低いならば、ディファレンシャルにレギュレーションされていると言われる。
【０１３９】
発現パターンは、患者における薬物処置の有効性を予測するために使用されうるバイオマーカーのパネルを誘導するために使用することができる。バイオマーカーは、生物学的サンプルから単離されたＲＮＡ、腫瘍生検の凍結されたサンプルから単離されたＲＮＡに関するマイクロアレイ実験からの遺伝子発現レベル、または血清中の質量分析法由来のタンパク質質量からなることができる。
【０１４０】
データ解析のための正確な機構はデータの正確な性質に依存するであろうけれども、バイオマーカーのパネルを開発するための典型的な技法は、下記のとおりである。データ（遺伝子発現レベルまたは質量スペクトル）は、処置の前に各患者について収集される。検査が進行するにつれて、患者は、薬物処置に対するそれらの応答に従って、有効性または非有効性として分類される。多重レベルの有効性をデータモデルにおいて適応させることができるが、特にもし患者集団が数百より少ないならば、バイナリ比較が最適であると考えられる。各クラスにおける十分な数の患者を仮定して、タンパク質および／または遺伝子発現データを、当技術分野で知られている多数の技術により解析することができる。技術の多くは、伝統的統計学および機械学習の分野に由来する。これらの技術は２つの目的にも役立つ。
１．データの次元の数(dimensionality)を減少させる、−質量スペクトルまたは遺伝子発現マイクロアレイの場合に、データを、数千の個々のデータ点から、例えば約３〜１０に減少させる。この減少は、セットとして取られるときのデータ点の予想力に基づいている。
２．訓練−次いでこれらの３〜１０データ点を使用して、この場合に、有効な薬物処置を非有効薬物処置から識別するタンパク質質量または遺伝子発現のパターンを認識することを「学習する」多重機械学習アルゴリズムを訓練する。すべての患者サンプルを使用してアルゴリズムを訓練することができる。
【０１４１】
次いで、得られる訓練されたアルゴリズムを検定して、それらの予想力を測定する。典型的には、数百より少ない訓練例が入手可能であるときは、ある形態の交差検証(cross-validation)を行う。説明のために、１０倍交差検証を考える。この場合に、患者サンプルを１０個の箱(bins)の１つにランダムに割り当てる。第１ラウンドの検定において、９個の箱の中のサンプルを訓練のために使用し、そして１０番目の箱の中の残りのサンプルを使用してアルゴリズムを検定する。これを更に９回繰り返し、各回検定のための異なる箱中のサンプルを抜いておく。１０ラウンドのすべてからの結果（正しい予想および誤り）を組み合わせ、次いで予測力を評価する。異なるアルゴリズムおよび異なるパネルをこの検査のためにこの方法において比較することができる。次いで「最善の」アルゴリズム／パネル組み合わせが選ばれるであろう。この「スマートな」アルゴリズム("smart" algorithm)を次いで更なる検査で使用して、処置に最も応答しそうな患者を選ぶことができる。
【０１４２】
多くのアルゴリズムには、患者について取られた追加の情報が役立つ。例えば、性または年齢を使用して予想力を改良することができる。正規化および平滑化などのデータ変換を使用してノイズを減少させることができる。この故に、多くの異なるパラメーターを使用して多数のアルゴリズムを訓練して結果を最適化することができる。もし予想パターンがデータにおいて存在するならば、最適なまたは最適に近い「スマートな」アルゴリズムを開発することができそうである。より多くの患者サンプルが入手可能であるならば、アルゴリズムを再訓練して新しいデータを利用することができる。
【０１４３】
質量分析法を使用する例として、血漿を疎水性ＳＥＬＤＩターゲットに適用し、水中でよく洗浄し、そして質量分光計のＳＥＬＤＩ−Ｔにより解析することができる。これを１００以上の患者サンプルで繰り返すことができる。各サンプルにおけるいくらかの１６，０００ｍ／ｚ値の強度から得られるタンパク質プロファイルを統計的に解析して薬物有効性を予測する特異的ｍ／ｚ値のセットを同定する。他のＳＥＬＤＩターゲット、例えばイオン交換またはＩＭＡＣ表面を使用する同じ実験を行うこともできる。これらは、血漿中に存在するタンパク質の異なるサブセットを捕捉するであろう。更に、血漿は、ＳＥＬＤＩターゲットに適用する前に変性され、そして予備分画されることができる。
【０１４４】
本発明は、バイオマーカー、即ち、癌のための核酸および／またはポリペプチドマーカーを検出することにより、被験体が望まれない細胞増殖により特徴付けられる疾患または状態を発症する危険があるかどうかを決定するための方法を提供する。
【０１４５】
臨床的適用において、ヒト組織サンプルを、本明細書で同定されたバイオマーカーの存在および／または不存在についてスクリーニングすることができる。このようなサンプルは、針生検コア、外科切除サンプル、リンパ節組織または血清からなることができる。例えば、これらの方法は、生検を得、これを場合によりクリオスタット切断により分画して全細胞集団の約８０％に腫瘍細胞を濃縮することを含む。ある態様では、これらのサンプルから抽出された核酸を、当技術分野で周知技術を使用して増幅することができる。検出された選ばれたマーカーのレベルを、転移、非転移悪性、良性または正常組織サンプルの統計的に有効なグループと比較する。
【０１４６】
１つの態様では、診断方法は、被験体がバイオマーカーの異常なｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルを有するかどうかを、例えばノーザンブロット解析、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、in situハイブリダイゼーション、免疫沈降、ウエスタンブロットハイブリダイゼーション、または免疫組織化学により決定することを含む。本方法に従えば、細胞を被験体から得ることができ、そしてバイオマーカー、タンパク質のレベルまたはｍＲＮＡレベルを決定し、そして健康な被験体のこれらのマーカーのレベルと比較する。バイオマーカーポリペプチドまたはｍＲＮＡレベルの異常なレベルは癌を示しそうである。
【０１４７】
１つの態様では、本方法は、核酸プローブを使用して患者からの組織における癌細胞の存在を決定することを含む。特に、本方法は、
１．ヌクレオチド配列、例えば少なくとも１０、１５、２５または４０ヌクレオチドおよび核酸配列のコード配列の一部に対して相補性であり、そして腫瘍細胞においてディファレンシャルに発現されるコード配列のすべてまたは殆どすべて以下を含む核酸プローブを提供し、
２．癌細胞を潜在的に含む患者からの組織サンプルを得；
３．その実質的すべてが非癌性である細胞を含有する第２組織サンプルを提供し；
４．核酸プローブを該第１組織サンプルおよび第２組織サンプルの各々のＤＮＡとストリンジェントな条件下に接触させ（例えば、ノーザンブロットまたはin situハイブリダイゼーションアッセイにおいて）；そして
５．（ａ）第１組織サンプルのＲＮＡとプローブのハイブリダイゼーションの量を、（ｂ）第２組織サンプルのＲＮＡとプローブのハイブリダイゼーションの量と比較し、第２組織サンプルのＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量と比較して第１組織サンプルのＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量の統計的に有意な差は、第１組織サンプルにおける癌細胞の存在を示す、
ことを含む。
【０１４８】
１つの局面では、本方法は、所与のマーカー核酸配列に由来するプローブとのin situハイブリダイゼーションを含む。本方法は、標識されたハイブリダイゼーションプローブを、癌または前癌細胞を潜在的に含有する所与の型の組織のサンプルおよび正常な細胞を含有する組織のサンプルと接触させ、そしてプローブが同じ組織型の他の細胞を標識する程度と有意に異なる程度に、プローブが所与の組織型のある細胞を標識するかどうかを決定することを含む。
【０１４９】
試験細胞のｍＲＮＡを、核酸プローブ、例えば、少なくとも約１０、１５、２５または４０ヌクレオチドおよび核酸配列のコード配列の一部に対して相補性でありそして所与の組織型の正常な細胞と比較して腫瘍細胞においてディファレンシャルに発現される配列のすべてまたは殆どすべて以下と接触させ；そして、プローブのｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションの近似的量を決定し、その組織型の正常な細胞のｍＲＮＡで見られるハイブリダイゼーションの量より多くのまたは少ないハイブリダイゼーションの量は、試験細胞が癌性または前癌性であることを示す、ことにより所与のヒト組織からの試験細胞の表現型、例えば細胞が（ａ）正常であるかまたは（ｂ）癌性もしくは前癌性であるかどうかを決定する方法も本発明の範囲内にある。
【０１５０】
あるいは、上記診断アッセイは、マーカー核酸配列によりコードされたタンパク質産物を検出するために、抗体を使用して行われうる。従って、１つの態様では、アッセイは、試験細胞のタンパク質を、核酸の遺伝子産物に対して特異的な抗体と接触させ、その際マーカー核酸は、試験細胞と同じ組織型の正常な細胞において所与のコントロールレベルで発現されるマーカー核酸であり、そして抗体と試験細胞のタンパク質による免疫複合体形成の適切な量を決定し、その際同じ組織型の正常な細胞と比較して試験細胞のタンパク質と形成された免疫複合体の量の統計的に有意な差は、試験細胞が癌性または前癌性であるという指示である、ことを含むであろう。
【０１５１】
本発明において有用なポリペプチドに特異的に結合するポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体を産生するための方法は、当業者に既知であり、そして例えば、Dymecki, et al., (J. Biol. Chem. 267: 4815, 1992); Boersma & Van Leeuwen,(J. Neurosci. Methods 51: 317, 1994); Green, et al., (Cell 28: 477, 1982); and Arnheiter, et al., (Nature 294: 278, 1981)に見出されうる。
【０１５２】
他のこのような方法は、マーカー核酸配列の遺伝子産物に特異的な抗体を提供し、該遺伝子産物は、同じ組織型の非癌組織における遺伝子産物のレベルより多いかまたは少ないレベルで所与の組織型の癌組織中に存在し；所与の組織型の組織の第１サンプルを患者から得、該サンプルは癌細胞を潜在的に含み；同じ組織型（同じ患者からのものまたは正常なコントロール、例えば他の個体の細胞もしくは培養された細胞からのものであることができる）の組織の第２サンプルを提供し、この第２サンプルは正常な細胞を含有し、そして本質的に癌細胞を含有せず；前記抗体を、該抗体とサンプル中に存在するマーカー核酸配列産物との免疫複合体形成を可能とする条件下に第１および第２サンプルのタンパク質（溶解されたが分画されていない細胞においてまたはin situで、部分的に精製されていてもよい）と接触させ、そして（ａ）第１サンプルにおける免疫複合体形成の量を、（ｂ）第２サンプルにおける免疫複合体形成の量と比較し、その際第２サンプルにおける免疫複合体形成の量のと比較して、より少ない第１サンプルにおける免疫複合体形成の量の統計的に有意な差は、組織の第１サンプル中に癌細胞が存在することを示す、工程を含む。
【０１５３】
本発明は、更に、被験体から得られた細胞サンプルが異常な量のマーカーポリペプチドを有するかどうかを決定する方法であって、（ａ）被験体から細胞サンプルを得、（ｂ）そのように得られたサンプル中のマーカーポリペプチドの量を定量的に決定し、そして（ｃ）そのように決定されたマーカーポリペプチドの量を既知の標準と比較し、それにより被験体から得られた細胞サンプルが異常な量のマーカーポリペプチドを有するかどうかを決定することを含む方法を提供する。このようなマーカーポリペプチドは、免疫組織化学アッセイ、ドットプロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ等により検出することができる。
【０１５４】
イムノアッセイは、細胞サンプル中のタンパク質のレベルを定量するためによく使用され、そして多くの他のイムノアッセイ技術は当技術分野で知られている。本発明は、特定のアッセイ技法に限定されず、従って、均一な技法および不均一な技法の両方を含むことを意図する。本発明に従って行われうる例示的イムノアッセイは、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、比濁阻害イムノアッセイ（ＮＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を含む。インディケーター部分または標識基は、被験体抗体に結合させることができ、そしてアッセイ装置および適合性イムノアッセイ技法の利用可能性によりしばしば決定される方法の様々の使用の必要をかなえるように選ばれる。上記した様々なイムノアッセイを行う際に使用されるべき一般技術は、当業者に知られている。
【０１５５】
他の態様では、患者の生物学的流体（例えば、血液または尿）中のコードされた産物のレベルまたは替るものとしてポリペプチドのレベルは、その患者の細胞におけるマーカー核酸配列の発現のレベルを監視する方法として決定されうる。このような方法は、患者からの生物学的流体のサンプルを得、サンプル（またはサンプルからのタンパク質）をコードされたマーカーポリペプチドに対して特異的な抗体と接触させ、そして抗体による免疫複合体形成の量を決定する工程を含み、免疫複合体形成の量は、サンプル中のマーカーコード産物のレベルを示す。この決定は、正常な個体から採取されたコントロールサンプルにおけるまたは同じ人から以前にまたは以後に得られた１つ以上のサンプルにおける同じ抗体による免疫複合体形成の量と比較するとき、特に有益である。
【０１５６】
他の態様では、本方法は、同様に過増殖性障害の進行と相関されうる、細胞中に存在するマーカーポリペプチドの量を決定するために使用することができる。マーカーポリペプチドのレベルは、細胞のサンプルが、トランスフォーメーションされた細胞であるかまたはトランスフォーメーションされた細胞となる素因のある細胞を含有するかどうかを予測的に評価するために使用されうる。更に、本方法は、トランスフォーメーションされることが知られている細胞の表現型を評価するために使用することができ、表現型化の結果は、特定の治療方式をプランニングするのに有用である。例えば、サンプル細胞中のマーカーポリペプチドの非常に高いレベルは癌の強力な診断マーカーおよび予後マーカーである。マーカーポリペプチドレベルの観察は、例えばより侵襲性の治療の使用に関する決定に利用することができる。
【０１５７】
上記したとおり、本発明の１つの局面は、患者から単離された細胞に関して、マーカーポリペプチドのレベルがサンプル細胞において有意に減少しているかどうかを決定するための診断アッセイに関する。用語「有意に減少した」は、同様な組織起源の正常な細胞に比べて細胞がマーカーポリペプチドの減少した細胞量を有する、細胞表現型を指す。このアッセイは、試験細胞におけるマーカーポリペプチドのレベルを評価し、そして測定されたレベルを、少なくとも１つのコントロール細胞、例えば、正常な細胞および／または既知の表現型のトランスフォーメーションされた細胞において検出されたマーカーポリペプチドと比較することができる。
【０１５８】
本発明の他の局面は、正常なまたは異常なマーカーポリペプチドレベルと関連した細胞の数により決定されたマーカーポリペプチドのレベルを定量する能力である。次いで、特定のマーカーポリペプチド表現型を有する細胞の数を、患者の予後と相関させることができる。本発明の１つの態様では、病変(lesion)のマーカーポリペプチド表現型は、マーカーポリペプチドの異常に高い／低いレベルを有することが見出される生検における細胞の百分率として決定される。このような発現は、免疫組織学的アッセイ、ドットブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ等により検出されうる。
【０１５９】
組織サンプルが使用される場合には、免疫組織学的染色を使用してマーカーポリペプチド表現型を有する細胞の数を決定することができる。このような染色のために、多重プロックの組織を生検または他の組織サンプルから採取することができ、そしてプロテアーゼＫまたはペプシンなどの作用物質を使用してタンパク質分解性加水分解に付すことができる。ある態様では、サンプル細胞から核画分を単離し、そして核画分におけるマーカーポリペプチドのレベルを検出することが望ましいことがある。
【０１６０】
組織サンプルは、ホルマリン、グルタルアルデヒド、メタノール等などの試薬での処置により固定される。次いでサンプルを、マーカーポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体（例えば、モノクローナル抗体）とインキュベーションさせる。この抗体は、その後の結合の検出のために標識にコンジュゲーションさせることができる。サンプルを、免疫複合体の形成に十分な時間インキュベーションする。次いで抗体の結合を、この抗体にコンジュゲーションされた標識により検出する。抗体が標識されていない場合には、例えば、抗マーカーポリペプチド抗体のアイソタイプに対して特異的である第２の標識された抗体を使用することができる。使用されうる標識の例は、放射性核種、蛍光物質、化学発光物質、酵素等を含む。
【０１６１】
酵素が使用される場合には、酵素のための基質をサンプルに加えて着色した産物または蛍光産物を与えることができる。コンジュゲートにおいて使用するための適当な酵素の例は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ等を含む。市販されていない場合には、このような抗体−酵素コンジュゲートは、当業者に知られている技術によって容易に産生される。
【０１６２】
１つの態様では、アッセイはドットブロットアッセイとして行われる。ドットブロットアッセイは、組織サンプルを使用する特定の用途を見出す。何故ならば、それは、所定の数の細胞から産生された細胞不含有抽出物中のマーカーポリペプチドの量を相関させることにより単一細胞と関連したマーカーポリペプチドの平均量の決定を可能とするからである。
【０１６３】
同じ型の腫瘍細胞（例えば、肺および／または結腸腫瘍細胞）が、個々の癌遺伝子の均一に増加した発現または個々の癌抑制遺伝子の均一に減少した発現を示さないことがあることは、癌文献で十分に確立されている。所与の型の癌の細胞間ですら所与のマーカー遺伝子の発現のレベルの変化もあり得、１回の試験よりはむしろ一連の試験に頼る必要が更に強調される。従って、１つの局面では、本発明は、診断試験の信頼性および／または精度を改良するために、本発明の多数のプローブを使用する一連の試験を提供する。
【０１６４】
１つの態様では、本発明は、核酸プローブを組織化されたアレイにおけるＤＮＡチップ上に固定化する方法も提供する。オリゴヌクレオチドは、リソグラフィーを含む様々な方法により固体支持体に結合されうる。例えば、チップは、２５０，０００までのオリゴヌクレオチドを保持することができる。これらの核酸プローブは、例えば、長さが少なくとも約１２、１５、２５または４０ヌクレオチドのヌクレオチド配列、およびマーカー核酸配列のコード配列の一部に対して相補性でありそして腫瘍細胞においてディファレンシャルに発現される配列のすべてまたは殆どすべて以下、を含む。本発明は、種々の癌についての利用可能な試験に対する有意な利点を与える。なぜならば、それは単一チップ上の核酸マーカーのアレイを与えることにより試験の信頼性を増加させるからである。
【０１６５】
上記方法は、場合によりクリオスタット切断により分画されて腫瘍細胞に富む生検を得ることを含む。次いでＤＮＡまたはＲＮＡを抽出し、増幅し、そしてＤＮＡチップで解析してマーカー核酸配列の存在または不存在を決定する。
【０１６６】
１つの態様では、核酸プローブを二次元マトリックスまたはアレイにおいて基材上にスポットする。核酸のサンプルを標識し、次いでプローブにハイブリダイゼーションさせることができる。プローブ核酸に結合された標識されたサンプル核酸を含む二本鎖核酸は、サンプルの結合しなかった部分を洗浄除去すれば、検出することができる。
【０１６７】
プローブ核酸を、ガラス、ニトロセルロース等を含む基材上にスポットすることができる。プローブを共有結合または非特異的相互作用、例えば、疎水性相互作用により基質に結合させることができる。サンプル核酸を、放射能標識、蛍光団、発色団等を使用して標識することができる。
【０１６８】
更に他の態様では、本発明は、本発明のマーカーポリペプチドに対して発生させられる抗体のパネルを使用することを意図する。このような抗体のパネルは、癌のための信頼性のある診断プローブとして使用することができる。本発明のアッセイは、細胞、例えば肺細胞を含有する生検サンプルを、１種以上のコードされた産物に対する抗体のパネルと接触させて、マーカーポリペプチドの存在または不存在を決定することを含む。
【０１６９】
本発明の診断方法は、処置の追跡検査として使用することもでき、例えば、マーカーポリペプチドのレベルの定量は、現在の癌治療の有効性または先に使用された癌治療の有効性および患者の予後に対するこれらの治療の効果を示すことができる。
【０１７０】
更に、マーカー核酸またはマーカーポリペプチドは、最初の検出、追跡検査スクリーニング、再発の検出および化学療法または外科処置に対する処置後の監視、のための診断パネルの一部として利用することができる。
【０１７１】
従って、本発明は、細胞からのマーカーポリペプチドの増加および／または損失を検出するための診断アッセイおよび試薬を利用可能として、例えば細胞の腫瘍形成性トランスフォーメーションから生じる増殖性疾患の診断および表現型決定を助ける。
【０１７２】
上記した診断アッセイは、予後アッセイとしても使用されるように適合させることができる。このような適用は、腫瘍の進行の特徴的な段階で起こる事象に対する本発明のアッセイの感受性を利用する。例えば、所与のマーカー遺伝子は、極早期の段階で、多分細胞が悪性へと進展するように不可逆的にコミットされる前に、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされうるが、他のマーカー遺伝子は、はるかに後の段階でのみ特徴的にアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされうる。このような方法は、試験細胞のｍＲＮＡを、腫瘍進行の異なる段階で癌細胞または前癌細胞における異なる特徴的なレベルで発現される所与のマーカー核酸に由来する核酸プローブと接触させ、そして細胞のｍＲＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーションの近似的量を決定し、このような量は細胞における遺伝子の発現のレベルを示し、従って、細胞の腫瘍進行の段階を示す、工程を含むことができる。あるいは、アッセイは、試験細胞のタンパク質と接触させた所与のマーカー核酸の遺伝子産物に対して特異的な抗体により行うことができる。一連のこのような試験は、腫瘍の存在およびロケーションを開示するのみならず、臨床医が腫瘍に最も適切な処置方式を選び、そしてその処置の成功の可能性を予測することも可能とするであろう。
【０１７３】
本発明の方法は、腫瘍の臨床的経過を追跡するのに使用することもできる。例えば、本発明のアッセイは、患者からの組織サンプルに適用することができ；癌について患者を処置した後、他の組織サンプルを採取し、そして試験を繰り返す。成功した処置は、癌細胞または前癌細胞に特徴的なディファレンシャルな発現を示すすべての細胞の除去をもたらすか、またはこれらの細胞における遺伝子の発現の実質的な増加であって、多分正常なレベルに近づくかまたは正常なレベルを超えることすらある増加をもたらすであろう。
【０１７４】
更に他の態様では、本発明は、被験体が、ポリペプチドの異常な活性と関連した、癌を発生する素因などの疾患を発生する危険にさらされているかどうかを決定するための方法であって、ポリペプチドの異常な活性は、ａ）マーカーポリペプチドをコードする遺伝子の元のままの状態(integrity)に影響を与える変化または（ｂ）コード核酸の誤発現(mis-expression)の少なくとも１つにより特徴付けられた遺伝的病変(genetic lesion)の存在または不存在を検出することにより特徴付けられる。例示するために、このような遺伝的病変は、（ｉ）核酸配列からの１つ以上のヌクレオチドの欠失、（ｉｉ）核酸配列への１つ以上のヌクレオチドの付加、（ｉｉｉ）核酸配列の１つ以上のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）核酸配列の全体的染色体再構成(gross chromosomal rearrangement)、（ｖ）核酸配列のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルの全体的変化、（ｖｉ）核酸配列の、例えばゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常な修飾、（ｖｉｉ）遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、（ｖｉｉｉ）マーカーポリペプチドの非野生型レベル、（ｉｘ）遺伝子のアレル損失及び／又は（ｘ）マーカーポリペプチドの不適切な翻訳後修飾の少なくとも１つの存在を確認することにより検出されうる。
【０１７５】
本発明は、コード核酸配列における病変を検出するためのアッセイ技術を提供する。これらの方法は、配列解析、サザーンブロットハイブリダイゼーション、制限酵素部位マッピングを含む方法、および解析されるべき核酸とプローブとのヌクレオチド対形成の不存在の検出を含む方法を含むが、それらに限定されない。
【０１７６】
特異的疾患または障害、例えば遺伝的疾患または障害は、必ずしも突然変異したタンパク質をコードしないある遺伝子の多型領域の特異的アレル変異体と関連している。従って、被験体における遺伝子の多型領域の特異的アレル変異体の存在は、被験体を特異的疾患または障害を発生させやすくすることができる。遺伝子における多型領域は、個体の集団における遺伝子のヌクレオチド配列を決定することにより同定されうる。多型領域が同定されるならば、特異的疾患との連鎖(link)は、個体、例えば、癌などの特異的疾患を発生した個体の特異的集団を研究することにより決定されうる。多型領域は、遺伝子の任意の領域、例えば、エキソン、エキソンの領域のコード領域または非コード領域、イントロンおよびプロモーター領域に位置することができる。
【０１７７】
例示的態様では、遺伝子のセンス配列もしくはアンチセンス配列にハイブリダイゼーションすることができるヌクレオチド配列またはその天然に存在する突然変異体あるいは被験体遺伝子と天然に関連した５’もしくは３’フランキング配列またはイントロン配列または天然に存在するその突然変異体の領域を含む核酸プローブを含む核酸組成物が提供される。細胞の核酸は、ハイブリダイゼーションを受け易くされ、プローブをサンプルの核酸と接触させ、そしてサンプル核酸へのプローブのハイブリダイゼーションを検出する。このような技術は、欠失、置換等を含むゲノムもしくはｍＲＮＡレベルで病変もしくはアレル変異体を検出するためおよびｍＲＮＡ転写物レベルを決定するために使用することができる。
【０１７８】
検出方法の例は、突然変異もしくは多型部位にオーバーラッビングし、そして突然変異領域もしくは多型領域付近の約５、１０、２０、２５または３０ヌクレオチドを有するプローブを使用するアレル特異的ハイブリダイゼーションである。本発明の１つの態様では、アレル変異体に特異的にハイブリダイゼーションすることができるいくつかのプローブを固相支持体、例えば、「チップ」に結合させる。「ＤＮＡプローブアレイ」とも呼ばれる、オリゴヌクレオチドを含むこれらのチップを使用する突然変異検出解析は、例えば、Cronin, et al., (Human Mutation 7:244, 1996)により記載されている。１つの態様では、チップは、遺伝子の少なくとも１つの多型領域のすべてのアレル変異体を含むことができる。次いで、固相支持体を試験核酸と接触させ、そして特異的プローブに対するハイブリダイゼーションを検出する。従って、１つ以上の遺伝子の多数のアレル変異体のアイデンティティーを、簡単なハイブリダイゼーション実験において同定することができる。
【０１７９】
ある態様では、病変の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、U.S.Pat Nos. 4,683,195および4,683,202を参照のこと)、例えばアンカーＰＣＲもしくはＲＡＣＥ ＰＣＲにおけるプローブ／プライマー、または替わりにリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）(例えば、Landegran, et al., Science 241: 1077-1080, 1988; Nakazaw, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 360-364, 1994を参照のこと)におけるプローブ／プライマーを利用することを含み、その後者は、遺伝子における点突然変異を検出するために特に有用でありうる(例えば、Abravaya, et al., Nuc. Acid. Res. 23:675-682, 1995を参照のこと)。例示的態様では、上記方法は、（ｉ）患者からの細胞のサンプルを採集し、（ｉｉ）サンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方）を単離し、（ｉｉｉ）核酸サンプルを、核酸（もし存在すれば）のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下に核酸配列に特異的にハイブリダイゼーションする１つ以上のプライマーと接触させ、そして（ｉｖ）増幅産物の存在または不存在を検出するかまたは増幅産物のサイズを検出し、そして長さをコントロールサンプルと比較する工程を含む。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に記載の突然変異を検出するために使用された技術のいずれかと共に予備増幅工程として使用することが望ましいことがあると予想される。
【０１８０】
従って、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの核酸マーカーの発現を抑制または増強させる作用物質をスクリーニングする方法であって、マーカー核酸ｍＲＮＡが培養された細胞において検出可能である細胞または組織を作用物質に曝露して該作用物質がｍＲＮＡの産生を抑制または増強させることができるかどうかを決定し、そして曝露された細胞もしくは組織におけるｍＲＮＡのレベルを決定し、その際該作用物質への細胞系の曝露後のｍＲＮＡのレベルの減少はマーカー核酸ｍＲＮＡ産生の抑制を示し、そしてｍＲＮＡレベルの増加はマーカーｍＲＮＡ産生の増強を示す、ことを含む方法も包含する。
【０１８１】
あるいは、スクリーニング方法は、マーカータンパク質が培養された細胞において検出可能である細胞もしくは組織の、マーカータンパク質の産生を抑制するかまたは増強すると思われる作用物質に対するｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング、および細胞または組織におけるマーカータンパク質のレベルを決定すること、その際細胞または組織の前記作用物質への曝露後のマーカータンパク質のレベルの減少はマーカータンパク質産生の抑制を示し、そしてマーカータンパク質のレベルの増加はマーカータンパク質産生の増強を示す、ことを含むことができる。
【０１８２】
本発明は、マーカー核酸の発現を抑制または増強する作用物質をスクリーニングするｉｎ ｖｉｖｏ方法であって、マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質が検出可能である腫瘍細胞を有する被験体をマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質を抑制するまたは増強すると思われる作用物質に曝露し；そして曝露された哺乳動物の腫瘍細胞におけるマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを決定することを含むｉｎ ｖｉｖｏ方法も包含する。被験体を作用物質に曝露した後のマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルの減少は、マーカー核酸発現の抑制を示し、そしてマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルの増加は、マーカー核酸発現の増強を示す。
【０１８３】
従って、本発明は、マーカー核酸を発現する細胞を試験化合物とインキュベーションし、そしてｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを測定することを含む方法を提供する。本発明は、更に、細胞集団におけるマーカー核酸の発現のレベルを定量的に決定するための方法、および作用物質が細胞集団におけるマーカー核酸の発現のレベルを増加または減少させることができるかどうかを決定するための方法を提供する。作用物質が細胞集団におけるマーカー核酸の発現のレベルを増加または減少させることができるかどうかを決定するための方法は、（ａ）コントロールおよび作用物質で処置された細胞集団から細胞抽出物を調製し、（ｂ）細胞抽出物からマーカーポリペプチドを単離し、そして（ｃ）マーカーポリペプチドと該ポリペプチドに対して特異的な抗体とで形成された免疫複合体の量を定量する（例えば、平行に）工程を含む。本発明のマーカーポリペプチドは、その生物活性についてアッセイすることによって定量することもできる。マーカー核酸発現の増加を誘導する作用物質は、コントロール細胞において形成された免疫複合体の量と比較して処置された細胞において形成された免疫複合体の量を増加させるそれらの能力によって同定されうる。同様な方法で、マーカー核酸の発現を減少させる作用物質は、コントロール細胞と比較して処置された細胞抽出物において形成された免疫複合体の量を減少させるそれらの能力により同定されうる。
【０１８４】
予想アッセイ
所与の抗癌剤からの臨床的利益を予想することができる実験室をベースとするアッセイは、癌を有する患者の臨床的処理を顕著に高めるであろう。この効果を評価するために、抗癌剤と関連したバイオマーカーを、処置の前、処置期間中および処置後に生物学的サンプル（例えば、腫瘍サンプル、血漿）において解析することができる。
【０１８５】
処置を監視するための他のアプローチは、血清プロテオミックなスペクトトルの評価である。特定的には、血漿サンプルを質量分析法（例えば、表面増強レーザー脱離イオン化）に付すことができ、そして各患者についてプロテオミックなスペクトルを発生させることができる。処置前および処置後の患者からの血漿の解析に由来するスペクトルのセットを、処置されたサンプルを無処置サンプルから完全に識別するプロテオームパターンを同定することができる反復サーチングアルゴリズムにより解析されうる。次いで得られるパターンを使用して処置後の臨床的利益を予測することができる。
【０１８６】
生物学的サンプル（例えば、腫瘍生検サンプル、血液サンプル）の全体的遺伝子発現
プロファイリングおよびバイオインフォマティクスで駆動されるパターン同定を利用して、抗癌剤の臨床的利益および抗癌剤に対する感受性ならびに抗癌剤に対する耐性の発生を予測することができる。例えば、処置前および処置期間中患者からの全血に由来する細胞から単離されたＲＮＡを使用して、Affymetrix GeneChip技術およびアルゴリズムを利用して血液細胞遺伝子発現プロファイルを発生させることができる。次いでこれらの遺伝子発現プロファイルは、特定の抗癌剤による処置からの臨床的利益を予測することができる。
【０１８７】
１Ｄ１Ｈ−ＮＭＲ（核磁気共鳴）による尿の生化学的組成の分析を、予測アッセイとして利用することができる。パターン認識技術を使用して抗癌剤による処置に対する代謝応答を評価し、そしてこの応答を臨床的ゴールと相関させることができる。尿中に排泄された生化学的または内因性代謝物は、正常な被験体についてプロトンＮＭＲにより十分に特徴付けられている(Zuppi, et al., Clin Chim Acta 265:85-97, 1997)。これらの代謝物（約３０〜４０）は、主要代謝経路、例えばクエン酸サイクルおよび尿素サイクルの副生物を表す。薬物刺激、疾患刺激および遺伝的刺激は、該刺激に対する代謝応答の時刻表および大きさを示すベースライン尿プロファイルの代謝特異的変化を生じさせることが示された。これらの解析は、多変数であり、従ってパターン認識技術を使用してデータ解釈を改良する。尿代謝プロファイルを臨床的ゴールと相関させて臨床的利益を決定することができる。
【０１８８】
キット
本発明は、低分子有効性に特徴的な遺伝子の発現レベルを決定するためのキットを提供する。このキットは、癌を発生する素因のある被験体または癌を有する被験体を同定するためならびに癌に対する治療を同定および確認するために有用でありうる。１つの態様では、キットは、癌の罹患細胞の１つ以上の遺伝子発現プロファイルまたは少なくとも罹患細胞における低分子有効性に特徴的な１つ以上の遺伝子の発現のレベルを表す値が保存されているコンピューター可読媒体を含む。コンピューター可読媒体は、対応する正常細胞、薬物で処置された罹患細胞の遺伝子発現プロファイルおよび本明細書に記載の任意の他の遺伝子発現プロファイルを含むこともできる。キットは、コンピューターシステムのメモリーにロードされうる発現プロファイル解析ソフトウエアを含むことができる。
【０１８９】
キットは、低分子有効性について特徴的な遺伝子のプローブを含むマイクロアレイを含むことができる。キットは、低分子有効性に特徴的な１つ以上の遺伝子の発現レベルを検出するための１つ以上のプローブまたはプライマー、および／またはプローブが結合それておりそしてサンプルにおける低分子有効性に特徴的な１つ以上の遺伝子の発現を検出するために使用されうる固体支持体を含むことができる。キットは、更に核酸コントロール、バッファーおよび使用のためのインストラクションを含むことができる。
【０１９０】
他のキットは、癌を処置するための組成物を提供する。例えば、キットは、低分子有効性に特徴的な１つ以上の遺伝子に対応する１つ以上の核酸（例えば、癌を有する患者を処置するのに使用するための）を含むこともできる。核酸は、プラスミドまたはベクター（例えば、ウイルスベクター）内に含まれうる。他のキットは、癌に特徴的な遺伝子によりコードされたポリペプチドまたはポリペプチドに対する抗体を含む。更に他のキットは、低分子有効性に特徴的な遺伝子のアゴニストまたはアンタゴニストとして本明細書で同定された化合物を含む。組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物であることができる。
【０１９１】
実施例
本明細書に記載の実施例および態様は説明として与えられており、限定するものでないこと、および他の実施例が特許請求の範囲に記載された本発明の精神および範囲から逸脱することなく使用されうることは当業者には明らかであろう。
【０１９２】
実施例１．遺伝子発現プロファイリングプロトコール
ａ．血液ソース
ヒト血液は、処置前に薬物ソラフェニブで処置された患者から得られた。患者は、２つのグループ、進行性疾患のＷＨＯ基準により決定された最善の応答を有する患者（「プログレッサー(progressors)」）および安定な疾患の最善の応答またはより良好な応答を有する患者（「ノンプログレッサー(non-progressors)」）、に分けられた。
【０１９３】
Ｂ．ヒト全血からの全ＲＮＡ単離
この方法は、Qiagen QlAamp RNA Blood Mini kit: Version 01/99: “QIAamp RNA Mini Protocol for Isolation of Total Cellular RNA from Whole Human Blood”(http://www.qiagen.com/literature/Handbooks/PDF/DNA RNA isolation clinical/INT/QA RNA Blood Mini/qarnab blood.pdf)を利用する。
【０１９４】
プロトコール
１．−８０℃の冷蔵庫から全血のチューブを取り出し；チューブを氷中に置く。
２．氷上で血液を部分的に解凍する。
・チューブキャップまで氷中にチューブを浸漬しておく。
・血液がチューブを逆さにするとき自由に移動する氷状スラリーとなるまで解凍する。
３．氷冷バッファーＥＬ３容積に全血１容積を加える（プロトコールの改変された工程１）。
・バッファーＥＬ２容積を有する５０mlコニカルチューブを氷上に置く。
・氷冷バッファーＥＬを入れた５０mlコニカルチューブに部分的に解凍された全血を注ぐ。
・氷冷バッファーＥＬの残りの１容積を使用して第１チューブからの残留血液をすすぐ。
４．５０mlコニカルチューブを穏やかに数回逆転させ；チューブを氷に戻す。
５．チューブを氷上で１０分間インキュベーションし；インキュベーション期間中チューブを数回穏かに逆転させる。
６．テーブルトップ遠心機において、４℃で１０００RPMで１０分間チューブをスピンさせる。
７．上清を穏かにデカンテーションしてバイオハザード廃棄物とし；５０mlコニカルチューブを氷上に置く。
８．コニカルチューブの下側の氷冷バッファーＥＬ１容積を穏かにピペッティングする。
９．チューブを穏かに回転させて(swirl)リンパ球細胞ペレットを再懸濁させ；氷上に置いてあった１５mlコニカルチューブに注ぐ。
１０．追加の０．５容積の氷冷バッファーＥＬを使用して５０mlコニカルチューブをすすぎ；１５mlコニカルチューブ中に第１洗浄液と一緒にする。
１１．テーブルトップ遠心機において、４℃で１０００RPMで５分間チューブをスピンさせる。
１２．細いピペットチップおよび真空ソースを使用して上清を注意深く除去し；細胞ペレットを妨害しないように注意する。
１３．細胞ペレットにバッファーＲＬＴ（Ｂ−ＭＥを含有する）５８０ulを加え；激しくボルテックスして細胞ペレットを可溶化する。
１４．（ａ）細胞ライセートを−８０℃で凍結するか、または（ｂ）Ｑｉａｇｅｎプロトコールの工程７で続ける。
１５．Ｑｉａｇｅｎ ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔを使用して場合によりオンカラムＤＮａｓｅ消化工程を含ませ；室温で３０分間ＤＮａｓｅ消化する。
１６．５００ul（３５０ulの代わりに）バッファーＲＷ１を使用してＤＮａｓｅ消化の前および後の両方においてカラムを洗浄することによりＤＮａｓｅ消化プロトコールを改変する。
１７．オプション１２ａを含ませる。
１８．与えられたＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ水でＲＮＡを溶離し；４４ulを直接フィルターに加え、１分間放置し、次いで≧１０，０００ｒｐｍで１分間遠心する。溶離を繰り返さない。
１９．溶離された血液ＲＮＡのチューブを−８０℃で貯蔵する。
【０１９５】
C.Affymetrix GeneChip Microarray Method
Affymetrixプロトコールにより記載されたSuperscript Choice System(Invitrogen; Carlsbad,CA)を使用して５００ng〜５ugＲＮＡを使用して第１および第２鎖ｃＤＮＡ合成を行う。簡単に言えば、１００ピコモルＴ７ｄ（Ｔ）２４プライマー（Invitrogen, CA）をＲＮＡに加え、７０℃で１０分間インキュベーションし、そして氷上でクエンチした。ついで混合物を、第１鎖ｃＤＮＡバッファー、１０mM ＤＴＴおよび１mM ｄＮＴＰｓ中で４２℃で２分間インキュベーションした。次いで２００U ＳＳＩＩ逆転写酵素を加え、そして更に４２℃で１時間インキュベーションした。次いで各チューブを第２鎖バッファー、０．２mM ｄＮＴＰｓ、１０U Ｅ．Ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ、４０U ＤＮＡポリメラーゼＩおよび２U ＲＮａｓｅＨを添加した後に１６℃で２時間インキュベーションした。２時間後に、10U T4 DNA ポリメラーゼを加え、そして反応を１６℃で更に５分間インキュベーションした。０．５M EDTAの添加により反応を停止させ、そしてｃＤＮＡをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール抽出を使用して精製し、次いで７．５M ＮＨ４ＯＡｃによりエタノール沈殿させた。ペレットをＤＥＰＣ Ｈ２Ｏ中に再懸濁させた。
【０１９６】
製造者により記載されたBioArray HighYield Transcription Kit(Enzo Diagnostics, NY)を使用するｃＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により、アレイ解析用のｃＲＮＡを発生させた。簡単に言えば、テンプレートｃＤＮＡを、HYバッファー、Ｂｉｏｔｉｎ ＮＴＰｓ、ＤＴＴ、ＲＮａｓｅ阻害剤およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと混合した。チューブを３７℃で５時間インキュベーションした。ｃＲＮＡをＲＮｅａｓｙクリーンアップ技法(RNeasy clean-up procedure)を使用して精製し、そしてＵＶ分光光度法により測定した。１５μgまでのｃＲＮＡを．２Mトリス−アセテート、０．５M ＫＯＡｃおよび０．１５M ＭｇＯＡｃ中で９４℃で３５分間フラグメント化した。アレイハイブリダイゼーションのために、フラグメント化されたｃＲＮＡ，５０pM コントロールオリゴＢ２、AffymetrixからのコントロールｃＲＮＡスパイク、３０μgニシン精子ＤＮＡ、１５０μgＢＳＡおよびＨｙｂバッファー（１００mM ＭＥＳ、１M Ｎａ＋、２０mM ＥＤＴＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）からカクテルを作成した。
【０１９７】
AffymetrixからのHＧ−Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ２．０アレイ（約５０，０００ＲＮＡ転写物を表す６０，０００以上のプローブセットを含有する）をGeneChip Hybridization Oven ６４０中で６０ｒｐｍで回転させながら４５℃で１０分間ハイブリダイゼーションバッファーとプレハイブリダイゼーションさせ、次いでサンプルハイブリダイゼーションカクテルの一部と一夜ハイブリダイゼーションさせた。
【０１９８】
次いでチップを、６×ＳＳＰＥ、．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．００５％消泡剤および１００mM ＭＥＳによる一連の洗浄を実施した。チップを、１００mM ＭＥＳおよび１．２mg ＢＳＡ中で６ug フィコエリトリン−ストレプトアビジン(Molecular Probes, CA)で染色した。チップを、４８８nmでGeneChip Scanner 3000(GCS3000)により走査し、そしてAffymetrixからのMicroArray Suite 5.0ソフトウエアを使用して解析した。このソフトウエアは、アレイにより発せられた光の強度を遺伝子発現のレベルを示す数値にディジタル変換した。
【０１９９】
Ｄ．データ解析
この目的は、プログレッサーと非プログレッサーを識別するためのマーカーのセットを発生させることである。マーカーセット１(Marker Set One)（表１）は、サポートベクターマシンを使用して、患者がプログレッサーまたは非プログレッサーであるかないかの予測のための最善のセットであるプローブセットの組を表す。最適なセットは、最も高い予測精度および相対的に小さい数の遺伝子を示すセットであると決定される。このマーカーセットは、下記の方法を使用して誘導される。
１．データをSpotfireにインポートする。
２．プログレッサーと非プログレッサーの処置比較(Treatment Comparison)を行った。
３．下記の基準を使用してプローブセットを選んだ：
ａ．プローブセットは、いずれかのグループにおける患者の８５％より多くについてAffymetrix1 Microarray Suite ソフトウエアｖ．５．０により決定してすべて「不存在」ではない(all not "absent")ことをデータが示した(1Affymetrix,Inc., Santa Clara, CA)。
ｂ．これらの基準をかなえないすべてのプローブセットを更なる解析から排除した。
４．残りのデータを、サポートベクターマシン(Support Vector Machine)と呼ばれるWEKA2ソフトウエアパッケージおよびアルゴリズムを使用して選択プロセスにおいて使用した(2Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. lan H. Witten, Eibe Frank. Morgan Kaufmann, October 1999. ISBN 155860-552-5に記載されている)。このソフトウエアは、患者における最善の応答を予測するためのそれらの適切さに関してプローブセットに順位を付けた。
５．患者がプログレッサーまたは非プログレッサーであるかないかを予測するとき、交差検証(cross-validation)により決定して１００％の評価された精度を生じた小さなサブセットを決定するために、トップの順位のプローブセットのサブセットを使用して多数のモデルを発生させた。
６．上記基準をかなえる最善のモデルを生じたプローブセットを、アノテーション３と共に、表１に列挙する(3Affymetrix web site address(file dated 16Sep2005)
http://www.affymetrix.com/support/technical/byproduct.affx?product=hg-u133-plus)。
【０２００】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗癌剤を投与することにより癌について処置されている患者の応答を監視するための方法であって、
（ａ）抗癌剤による処置の前に患者から採取された第１の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルを決定し；
（ｂ）少なくとも抗癌剤による処置の後に患者から採取された第２の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルを決定し；そして
（ｃ）第２の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルを、第１の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルと比較する；
工程を含み、
第１の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルと比較して、第２の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルの変化が、抗癌剤による処置の有効性を示す、
方法。
【請求項２】
抗癌剤が、マルチキナーゼ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１つ以上の遺伝子が、配列番号１〜１８からなる群より選ばれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
マルチキナーゼ阻害剤が、ソラフェニブである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
抗癌剤に対する患者の応答を予測するための方法であって、
（ａ）抗癌剤による処置の前に患者から採取された第１の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルを決定し；
（ｂ）少なくとも患者から採取された第２の生物学的サンプルであって、抗癌剤に曝露された第２の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルを決定し；そして
（ｃ）第２の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルを、第１の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルと比較する；
工程を含み、
第１の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルと比較して、第２の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルの変化が、抗癌剤に対する患者の応答を予測する、
方法。
【請求項６】
抗癌剤が、マルチキナーゼ阻害剤である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
１つ以上の遺伝子が、配列番号１〜１８からなる群より選ばれる、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
マルチキナーゼ阻害剤が、ソラフェニブである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
癌の処置に有用な化合物を同定するための方法であって、
（ａ）該化合物による処置の前の細胞または組織サンプルにおける１つ以上の遺伝子および／または遺伝子産物の発現のレベルを解析し；
（ｂ）該化合物による処置の後の細胞または組織サンプルにおける１つ以上の遺伝子および／または遺伝子産物の発現のレベルを解析する；
工程を含み、
遺伝子および／または遺伝子産物の発現レベルの変化が薬物有効性を示す、
方法。
【請求項１０】
化合物が、マルチキナーゼ阻害剤である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
１つ以上の遺伝子が、配列番号１〜１８からなる群より選ばれる、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
マルチキナーゼ阻害剤が、ソラフェニブである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
癌について患者を診断するための方法であって、
（ａ）患者から採取された第１の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルを決定し；
（ｂ）少なくとも正常な患者サンプルから採取された第２の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルを決定し；そして
（ｃ）第１の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルを、第２の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルと比較する；
工程を含み、
第２の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルと比較して、第１の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルの変化が、前記疾患の診断である。
方法。
【請求項１４】
１つ以上の遺伝子が、配列番号１〜１８からなる群より選ばれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
配列番号１〜１８からなる群より選ばれる２つ以上の遺伝子に対応する２つ以上のプローブを含むアレイ。
【請求項１６】
配列番号１〜１８から選ばれる核酸の発現レベルを測定するためのプライマーまたはプローブを含む検査キット。
【請求項１７】
組織または細胞サンプルを懸濁または固定するための溶液、細胞を溶解するための溶液、ハイブリダイゼーション溶液、核酸を単離するための溶液、コントロールサンプルおよびキットを使用するためのインストラクションから選ばれる１つ以上の構成要素を更に含む、請求項１６に記載の検査キット。
【請求項１９】
配列番号１〜１８から選ばれる遺伝子によりコードされたポリペプチドに特異的な抗体を含む検査キット。
【請求項２０】
抗体が標識されている、請求項１９に記載の検査キット。
【請求項２１】
組織または細胞サンプルを懸濁または固定するための溶液、細胞を溶解するための溶液、基質、バッファー試薬、ブロッカー試薬、ブロッティング試薬、コントロールサンプルおよびキットを使用するためのインストラクションから選ばれる１つ以上の構成要素を更に含む、請求項１９または２０に記載の検査キット。
【請求項１】
抗癌剤を投与することにより癌について処置されている患者の応答を監視するための方法であって、
（ａ）抗癌剤による処置の前に患者から採取された第１の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルを決定し；
（ｂ）少なくとも抗癌剤による処置の後に患者から採取された第２の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルを決定し；そして
（ｃ）第２の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルを、第１の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルと比較する；
工程を含み、
第１の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルと比較して、第２の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルの変化が、抗癌剤による処置の有効性を示す、
方法。
【請求項２】
抗癌剤が、マルチキナーゼ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１つ以上の遺伝子が、配列番号１〜１８からなる群より選ばれる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
マルチキナーゼ阻害剤が、ソラフェニブである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
抗癌剤に対する患者の応答を予測するための方法であって、
（ａ）抗癌剤による処置の前に患者から採取された第１の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルを決定し；
（ｂ）少なくとも患者から採取された第２の生物学的サンプルであって、抗癌剤に曝露された第２の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルを決定し；そして
（ｃ）第２の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルを、第１の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルと比較する；
工程を含み、
第１の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルと比較して、第２の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルの変化が、抗癌剤に対する患者の応答を予測する、
方法。
【請求項６】
抗癌剤が、マルチキナーゼ阻害剤である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
１つ以上の遺伝子が、配列番号１〜１８からなる群より選ばれる、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
マルチキナーゼ阻害剤が、ソラフェニブである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
癌の処置に有用な化合物を同定するための方法であって、
（ａ）該化合物による処置の前の細胞または組織サンプルにおける１つ以上の遺伝子および／または遺伝子産物の発現のレベルを解析し；
（ｂ）該化合物による処置の後の細胞または組織サンプルにおける１つ以上の遺伝子および／または遺伝子産物の発現のレベルを解析する；
工程を含み、
遺伝子および／または遺伝子産物の発現レベルの変化が薬物有効性を示す、
方法。
【請求項１０】
化合物が、マルチキナーゼ阻害剤である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
１つ以上の遺伝子が、配列番号１〜１８からなる群より選ばれる、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
マルチキナーゼ阻害剤が、ソラフェニブである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
癌について患者を診断するための方法であって、
（ａ）患者から採取された第１の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルを決定し；
（ｂ）少なくとも正常な患者サンプルから採取された第２の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルを決定し；そして
（ｃ）第１の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルを、第２の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルと比較する；
工程を含み、
第２の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルと比較して、第１の生物学的サンプルにおける１つ以上の遺伝子または遺伝子産物の発現のレベルの変化が、前記疾患の診断である。
方法。
【請求項１４】
１つ以上の遺伝子が、配列番号１〜１８からなる群より選ばれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
配列番号１〜１８からなる群より選ばれる２つ以上の遺伝子に対応する２つ以上のプローブを含むアレイ。
【請求項１６】
配列番号１〜１８から選ばれる核酸の発現レベルを測定するためのプライマーまたはプローブを含む検査キット。
【請求項１７】
組織または細胞サンプルを懸濁または固定するための溶液、細胞を溶解するための溶液、ハイブリダイゼーション溶液、核酸を単離するための溶液、コントロールサンプルおよびキットを使用するためのインストラクションから選ばれる１つ以上の構成要素を更に含む、請求項１６に記載の検査キット。
【請求項１９】
配列番号１〜１８から選ばれる遺伝子によりコードされたポリペプチドに特異的な抗体を含む検査キット。
【請求項２０】
抗体が標識されている、請求項１９に記載の検査キット。
【請求項２１】
組織または細胞サンプルを懸濁または固定するための溶液、細胞を溶解するための溶液、基質、バッファー試薬、ブロッカー試薬、ブロッティング試薬、コントロールサンプルおよびキットを使用するためのインストラクションから選ばれる１つ以上の構成要素を更に含む、請求項１９または２０に記載の検査キット。
【公表番号】特表２００９−５１５５２６（Ｐ２００９−５１５５２６Ａ）
【公表日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４０２２４（Ｐ２００８−５４０２２４）
【出願日】平成１８年１１月１０日（２００６．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４３８５５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５８９６８
【国際公開日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【出願人】（５０７２６９１７５）シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド (39)
【氏名又は名称原語表記】ＳＩＥＭＥＮＳ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月１０日（２００６．１１．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４３８５５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０５８９６８
【国際公開日】平成１９年５月２４日（２００７．５．２４）
【出願人】（５０７２６９１７５）シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド (39)
【氏名又は名称原語表記】ＳＩＥＭＥＮＳ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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