酢酸菌の増殖促進機能に関与する遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法
【課題】高濃度の酢酸を含有する食酢を短時間で効率良く製造する方法の提供。
【解決手段】高濃度酢酸存在下での酢酸菌の増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。該ＤＮＡを含む組換えベクター。該組換えベクターを含む形質転換体。該ＤＮＡの細胞内でのコピー数が増幅されたことにより、酢酸存在下での増殖促進機能が増強された微生物。該微生物を、アルコールを含有する培地で培養し、培地中に酢酸を生成蓄積せしめる、食酢の製造方法。
【解決手段】高濃度酢酸存在下での酢酸菌の増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。該ＤＮＡを含む組換えベクター。該組換えベクターを含む形質転換体。該ＤＮＡの細胞内でのコピー数が増幅されたことにより、酢酸存在下での増殖促進機能が増強された微生物。該微生物を、アルコールを含有する培地で培養し、培地中に酢酸を生成蓄積せしめる、食酢の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物に由来する酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子のコピー数を増幅した微生物、特にアセトバクター属（Acetobacter）及びグルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）に属する酢酸菌、及びこれらの微生物を用いて高濃度の酢酸を含有する食酢を短時間で効率よく製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酢酸菌は食酢製造に広く利用されている微生物であり、特にアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌が工業的な酢酸発酵に利用されている。
【０００３】
酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸菌によって酸化されて酢酸に変換され、その結果、酢酸が培地中に蓄積することになるが、酢酸は酢酸菌にとっても阻害的であり、酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢酸濃度が高くなるにつれて酢酸菌の増殖能力や発酵能力は次第に低下する。
【０００４】
例えば、発酵を開始してから実際に酢酸菌の増殖が開始して酢酸の蓄積が確認できるようになるまでの期間、すなわち増殖誘導期と呼ばれる期間は、酢酸濃度が高くなればなるほど長くなる傾向が認められている。また、酢酸濃度が高くなればなるほど、酢酸菌の増殖速度や増殖量なども小さくなることが確認されている。
【０００５】
このような酢酸菌の酢酸存在下における増殖能力を育種改良するべく、酢酸存在下での酢酸菌の増殖促進機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を取得し、酢酸菌の増殖促進機能を増強して、高濃度酢酸発酵能が改善された酢酸菌を開発することが進められてきており、例えば、大腸菌（Escherichia coli）などのｏｍｐＡ遺伝子と相同性が高い酢酸菌のｏｍｐＡ遺伝子がクローニングされ、酢酸菌の酢酸存在下における増殖促進機能が確認されたが（例えば、特許文献１参照）、その効果は十分といいうるものではなかった。
【０００６】
さらに、高濃度酢酸中で培養中の酢酸菌において発現しているタンパク質群の中に、高濃度酢酸への適応機構に関与するタンパク質が存在するとの仮定から、該タンパク質群中に、プロテアーゼＩ、プクチンリアーゼＩＩ前駆体、ユビキノンオキシドレダクターゼ、シャペロンＧｒｏＥＬなどとＮ末端側のアミノ酸配列の相同性が高いものが存在することが報告されているが（例えば、非特許文献１参照）、これらのタンパク質が酢酸菌の酢酸存在下における増殖促進機能を有するタンパク質であるかどうかについては確認されていない。
【０００７】
このように、実用的なレベルで、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を取得し、該遺伝子を用いて酢酸存在下における酢酸菌の増殖促進機能を増強して、高濃度酢酸発酵能が改善された酢酸菌を開発することが求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／００１０９５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】「アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol.）」、６７巻、５４７４〜５４８１頁、２００１年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、高濃度酢酸存在下での酢酸菌の増殖促進機能を有するタンパク質をコードする新規遺伝子を取得し、酢酸菌の増殖促進機能を増強して、高濃度酢酸発酵能が改善された酢酸菌を開発し、該酢酸菌を用いて高濃度の酢酸を含有する食酢を短時間で効率良く製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、酢酸存在下でも増殖して発酵することができる酢酸菌には、他の微生物には存在しない、酢酸に対する耐性を有する特異的なタンパク質が存在するとの仮説を立て、こうしたタンパク質をコードする遺伝子を用いれば、酢酸存在下での微生物の増殖促進機能を従来以上に向上させることができ、さらには従来得られなかった高濃度の酢酸を含有する新規食酢の効率的な製造法を開発することが可能になるとの新規着想を得た。
【００１２】
そこで、本発明者らは、酢酸菌から酢酸存在下における増殖促進機能を有する遺伝子を見い出す方法について鋭意検討し、酢酸菌のタンパク質を高濃度の酢酸にさらし、その後、変性されずに可溶性のままで存在するタンパク質を検索することにより、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質を検出しうると考え、酢酸菌体の破砕液にｐＨ４．０に調整した酢酸を最終濃度１Ｍになるように添加し、酢酸存在下における不溶性タンパク質を遠心除去後、二次元電気泳動により可溶性タンパク質を分離し、該タンパク質のＮ末端アミノ酸配列の同定を行なった。そして、同定したＮ末端アミノ酸配列から作製したＤＮＡをプローブとし、コロニーハイブリダイゼーションにより遺伝子の同定を行なうことにより、酢酸存在下での増殖を促進することが可能なタンパク質をコードする遺伝子を抽出することができた。そして、同定した遺伝子については、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No.1023）株（特許生物寄託センター（宛名：茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に平成元年２月１３日、受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７として寄託）に形質転換を行ない、元株に対して優位に増殖を促進することを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、［１］（Ａ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（Ｂ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質や、［２］（Ａ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（Ｂ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加又は逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、［３］（Ａ）配列表の配列番号５に示される塩基配列のうち、塩基番号２３１〜８３６の塩基配列からなるＤＮＡ、（Ｂ）配列表の配列番号５に示される塩基配列のうち、塩基番号２３１〜８３６の塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は（Ｃ）配列表の配列番号５に示される塩基配列のうち、塩基番号２３１〜８３６の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加又は逆位された塩基配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡに関する。
【００１４】
また本発明は、［４］前記［２］、［３］に記載のＤＮＡの中から選ばれる１又は２以上のＤＮＡを含む組換えベクターや、［５］前記［４］に記載の組換えベクターを含む形質転換体や、［６］前記［２］、［３］に記載のＤＮＡの中から選ばれる１又は２以上のＤＮＡの細胞内でのコピー数が増幅されたことにより、酢酸存在下での増殖促進機能が増強された微生物や、［７］微生物がアセトバクター属、又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする前記［６］に記載の微生物や、［８］前記［６］又は［７］に記載の微生物を、アルコールを含有する培地で培養し、該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、微生物に対して、酢酸存在下での増殖促進機能を付与し、増強することができる。そして、アルコール酸化能を有する微生物、特に酢酸菌においては、酢酸存在下での増殖機能が向上し、増殖誘導期が顕著に短縮して、培地中に高濃度の酢酸を効率良く蓄積する能力を付与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】スポットＡＡＲ１についてクローニングされた遺伝子断片の制限酵素地図と増殖促進機能を有する遺伝子の位置、及びｐＰＰＩへの挿入断片の概略図である。
【図２】配列番号１に示す塩基配列のうち、塩基番号２１３〜７６４の塩基配列によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図３】プライマー１を示す図である。
【図４】プライマー２を示す図である。
【図５】スポットＡＡＲ２についてクローニングされた遺伝子断片の制限酵素地図と増殖促進機能を有する遺伝子の位置、及びｐＳＯＤへの挿入断片の概略図である。
【図６】配列番号５に示す塩基配列のうち、塩基番号２３１〜８３６の塩基配列によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図７】プライマー３を示す図である。
【図８】プライマー４を示す図である。
【図９】スポットＡＡＲ３についてクローニングされた遺伝子断片の制限酵素地図と増殖促進機能を有する遺伝子の位置、及びｐＵＮＫへの挿入断片の概略図である。
【図１０】配列番号９に示す塩基配列のうち、塩基番号２０１〜５７６の塩基配列によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図１１】プライマー５を示す図である。
【図１２】プライマー６を示す図である。
【図１３】スポットＡＡＲ４についてクローニングされた遺伝子断片の制限酵素地図と増殖促進機能を有する遺伝子の位置、及びｐＹＢＨへの挿入断片の概略図である。
【図１４】配列番号１３に示す塩基配列のうち、塩基番号２４０〜７３１の塩基配列によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図１５】プライマー７を示す図である。
【図１６】プライマー８を示す図である。
【図１７】スポットＡＡＲ５についてクローニングされた遺伝子断片の制限酵素地図と増殖促進機能を有する遺伝子の位置、及びｐＡＨＲへの挿入断片の概略図である。
【図１８】配列番号１７に示す塩基配列のうち、塩基番号２０１〜７６１の塩基配列によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図１９】プライマー９を示す図である。
【図２０】プライマー１０を示す図である。
【図２１】スポットＡＡＲ６についてクローニングされた遺伝子断片の制限酵素地図と増殖促進機能を有する遺伝子の位置、及びｐＵＮＫ２への挿入断片の概略図である。
【図２２】配列番号２１に示す塩基配列のうち、塩基番号１９３〜６４２の塩基配列によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図２３】プライマー１１を示す図である。
【図２４】プライマー１２を示す図である。
【図２５】スポットＡＡＲ７についてクローニングされた遺伝子断片の制限酵素地図と増殖促進機能を有する遺伝子の位置、及びｐＵＮＫ３への挿入断片の概略図である。
【図２６】配列番号２５に示す塩基配列のうち、塩基番号２２８〜７７３の塩基配列によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図２７】プライマー１３を示す図である。
【図２８】プライマー１４を示す図である。
【図２９】形質転換株（ｐＰＰＩ）の培養経過を示す図である。
【図３０】形質転換株（ｐＳＯＤ）の培養経過を示す図である。
【図３１】形質転換株（ｐＵＮＫ）の培養経過を示す図である。
【図３２】形質転換株（ｐＹＢＨ）の培養経過を示す図である。
【図３３】形質転換株（ｐＡＨＲ）の培養経過を示す図である。
【図３４】形質転換株（ｐＵＮＫ２）の培養経過を示す図である。
【図３５】形質転換株（ｐＵＮＫ３）の培養経過を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のタンパク質としては、配列表の配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、配列表の配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質や、配列表の配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質であれば特に制限されず、本発明において、「酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質」とは、当該タンパク質をコードするＤＮＡをアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法によって形質転換した形質転換株を、エタノール３％と酢酸３％とを含有する１００ｍｌのＹＰＧ培地に接種し、３０℃で振とう培養（１５０ｒｐｍ）を５日間行ない、形質転換株が生育した酢酸添加ＹＰＧ培地の６６０ｎｍにおける吸光度を測定した値が、未形質転換の元株（親株）の場合と比較して、２倍以上の値を示す当該タンパク質をいう。
【００１８】
また、本発明のＤＮＡとしては、配列表の配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号１（塩基番号２１３〜７６４），５（塩基番号２３１〜８３６），９（塩基番号２０１〜５７８），１３（塩基番号２４０〜７３１），１７（塩基番号２０１〜７６１），２１（塩基番号１９３〜６４２），又は２５（塩基番号２２８〜７７３）の塩基配列からなるＤＮＡや、配列表の配列番号１（塩基番号２１３〜７６４），５（塩基番号２３１〜８３６），９（塩基番号２０１〜５７８），１３（塩基番号２４０〜７３１），１７（塩基番号２０１〜７６１），２１（塩基番号１９３〜６４２），又は２５（塩基番号２２８〜７７３）の塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号１（塩基番号２１３〜７６４），５（塩基番号２３１〜８３６），９（塩基番号２０１〜５７８），１３（塩基番号２４０〜７３１），１７（塩基番号２０１〜７６１），２１（塩基番号１９３〜６４２），又は２５（塩基番号２２８〜７７３）の塩基配列の一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号１（塩基番号２１３〜７６４），５（塩基番号２３１〜８３６），９（塩基番号２０１〜５７８），１３（塩基番号２４０〜７３１），１７（塩基番号２０１〜７６１），２１（塩基番号１９３〜６４２），又は２５（塩基番号２２８〜７７３）の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加又は逆位された塩基配列からなり、かつ酢酸存在下での酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば特に制限されず、例えば、上記の「配列番号１（塩基番号２１３〜７６４）」などの表記は、「配列番号１に示される塩基配列のうち塩基番号２１３〜７６４」を意味する。
【００１９】
このように、本発明の酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、コードされるタンパク質の酢酸耐性を増強する機能が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加された、あるいは逆位とされたタンパク質をコードするものであってもよい。このような酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、あるいは逆位として塩基配列を改変することによっても取得することができる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。さらに、一般的にタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から得ることが可能である。
【００２０】
上記「１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加又は逆位された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が置換、欠失、挿入、付加又は逆位された塩基配列を意味する。
【００２１】
例えば、これら１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加又は逆位された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、上記のように、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列表の配列番号１（塩基番号２１３〜７６４），５（塩基番号２３１〜８３６），９（塩基番号２０１〜５７８），１３（塩基番号２４０〜７３１），１７（塩基番号２０１〜７６１），２１（塩基番号１９３〜６４２），又は２５（塩基番号２２８〜７７３）に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加又は逆位されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
【００２２】
上記「配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列との相同性が８５％以上であれば特に制限されるものではなく、例えば、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上であることを意味する。
【００２３】
上記「ストリジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、５０〜７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。また、上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.（以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２４】
例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。
【００２５】
本発明のＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１，５，９，１３，１７，２１，又は２５に示される塩基配列情報又は配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該ＤＮＡが存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的のＤＮＡを単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。
【００２６】
例えば、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明の遺伝子ＤＮＡに特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明の遺伝子ＤＮＡを取得することができる。また、これらの酢酸菌からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明の遺伝子ＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、モレキュラークローニング第２版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。
【００２７】
具体的には、本発明の配列番号１，５，９，１３，１７，２１，又は２５に示される塩基配列からなるＤＮＡは、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の染色体ＤＮＡから次のようにして取得することができる。まず、グルコンアセトバクター・エンタニイ、例えばアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）の染色体ＤＮＡライブラリーを調製する。なお、染色体ＤＮＡは、常法（例えば、特開昭６０−９４８９号公報参照）により取得する。次に得られた染色体ＤＮＡから増殖促進機能を有する遺伝子を単離するために、染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分分解して種々の断片混合物を得る。切断反応時間などを調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵素が使用できる。例えば、Ｓａｕ３ＡＩを温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／ｍｌで様々な時間（１分〜２時間）、染色体ＤＮＡに作用させてこれを消化する。次いで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、酢酸菌内で自律複製可能なベクターＤＮＡに連結し、組換えベクターを作製する。具体的には、染色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素Ｓａｕ３ＡＩと相補的な末端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばＢａｍＨＩを温度３０℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で、１時間以上ベクターＤＮＡに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。次に、上記のようにして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と切断開裂されたベクターＤＮＡを混合し、これにＴ４ＤＮＡリガーゼを温度４〜１６℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で１時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組換えベクターを得る。得られた組換えベクターのＤＮＡを、大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセルと混合し、０℃下で１０分間放置後、４２℃で４５秒間加温して、細胞内に取り込ませる。これにＳＯＣ培地を添加し、１時間振とう培養後、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天平板培地上に広げて、３７℃で１晩培養し、この平板培地上で、白色のコロニーを作る菌を形質転換体として選択し、さらに得られた形質転換株の中から、酢酸耐性を有するタンパク質として同定したタンパク質のＮ末アミノ酸配列から作製した遺伝子をＤＮＡプローブとし、ジゴキシゲニンでラベルしたコロニーハイブリダイゼーションを行ない、ポジティブな形質転換株を得る。
【００２８】
また、上記配列表の配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどからなる本発明の変異遺伝子又は相同遺伝子としては、配列番号１，５，９，１３，１７，２１，若しくは２５に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡ断片を利用し、他の酢酸菌等より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。その他、前述の変異ＤＮＡの作製方法により調製することもできる。
【００２９】
例えば、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、又は変異処理したアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば配列表の配列番号１（塩基番号２１３〜７６４），５（塩基番号２３１〜８３６），９（塩基番号２０１〜５７８），１３（塩基番号２４０〜７３１），１７（塩基番号２０１〜７６１），２１（塩基番号１９３〜６４２），又は２５（塩基番号２２８〜７７３）に示される塩基配列、又はその一部から作製したプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、該タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得ることができる。
【００３０】
本発明のタンパク質の取得・調製方法は特に限定されず、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現している微生物細胞からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。化学合成によりタンパク質を調製する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、ｔＢＯＣ法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。
【００３１】
例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明のタンパク質を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。
【００３２】
さらに、配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を示す配列番号１（塩基番号２１３〜７６４），５（塩基番号２３１〜８３６），９（塩基番号２０１〜５７８），１３（塩基番号２４０〜７３１），１７（塩基番号２０１〜７６１），２１（塩基番号１９３〜６４２），又は２５（塩基番号２２８〜７７３）に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。例えば、配列番号１（塩基番号２１３〜７６４），５（塩基番号２３１〜８３６），９（塩基番号２０１〜５７８），１３（塩基番号２４０〜７３１），１７（塩基番号２０１〜７６１），２１（塩基番号１９３〜６４２），又は２５（塩基番号２２８〜７７３）に示される塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ反応）によって、あるいは該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによって、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌、あるいはそれら以外の酢酸菌より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニング後、発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造することができる。
【００３３】
オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて定法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）などを使用して、定法に従って行なうことができる。
【００３４】
上記本発明のタンパク質とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させて融合タンパク質とすることもできる。マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本発明のタンパク質の精製や、本発明のタンパク質の検出や、本発明のタンパク質に対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００３５】
本発明の組換えベクターとしては、前記本発明のＤＮＡを１種以上含み、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質を発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本発明のＤＮＡを発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明のＤＮＡを発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。
【００３６】
細菌用の発現ベクターとしては、例えば、酢酸菌―大腸菌シャトルベクター（マルチコピーベクター）ｐＧＩ１８（例えば、特開２００５−１１０５９７号公報参照）、ｐＭＶ２４（例えば、特開昭６１−５８５８４号公報参照）、ｐＴＡ５００１（Ａ）、ｐＴＡ５００１（Ｂ）（例えば、特開昭６０−９４８８号公報参照）、ｐＭＶＬ１（例えば、「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricaltural and Biological Chemistry）」、５２巻、３１２５−３１２９頁、１９８８年参照）の他、ｐＢＴｒＰ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもべ一リンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（Pharmacia社製）、ｐＳＥ２８０（Invitrogen社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Promega社製）、ｐＱＥ−８（QIAGEN社製）、ｐＱＥ−３０（QIAGEN社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Agrc.Biol.Chem., 48, 669(1984)〕、ＰＬＳＡ１〔Agrc. Blo1. Chem., 53, 277(1989)〕、ｐＧＥＬ１〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｌｐｔＩＩ ＳＫ＋、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（Stratagene社製）、ｐＴｒＳ３０（FERMBP-5407）、ｐＴｒＳ３２（FERM BP-5408）、ｐＧＥＸ（Pharmacia社製）、ｐＥＴ−３（Novagen社製）、ｐＴｅｒｍ２（US4686191、US4939094、US5160735）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＵＣ１８〔Gene, 33, 103(1985)〕、ｐＵＣ１９〔Gene, 33, 103(1985)〕、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＳＴＶ２９（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）、ｐＱＥ−３０（QIAGEN社製)等が挙げられる。細菌用のプロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。
【００３７】
本発明の形質転換体としては、上記本発明の組換えベクターを含み、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質を発現することができる宿主細胞であれば特に制限されず、上記宿主細胞としては、細菌、酵母、昆虫細胞、動植物細胞を挙げることができるが細菌が好ましく、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌が特に好ましいが、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属以外の酢酸菌の他、エッシェリヒア（Escherichia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、バチラス（Bacillus）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、セラチア（Serratia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、エルウニア（Erwinia）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属、ザイモモナス（Zymomonas）属等に属する微生物を挙げることができる。細菌宿主へ組換えベクターを導入する方法としては、塩化カルシュウム法（例えば、「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricaltural and Biological Chemistry）」、４９巻、２０９１−２０９７頁、１９８５年参照）やエレクトロポレーション法（「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）」、８７巻、８１３０−８１３４頁、１９９０年参照）、プロトプラスト法等を挙げることができる。本発明の好適な形質転換体として、酢酸菌―大腸菌シャトルベクター（マルチコピーベクター）ｐＧＩ１８にＤＮＡ断片を挿入してなる組換えベクターをアセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）Ｎｏ．１０２３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７）に導入することにより得られる形質転換体を具体的に例示することができる。
【００３８】
本発明の微生物としては、前記本発明のＤＮＡの中から選ばれる１又は２以上のＤＮＡの細胞内でのコピー数が増幅されたことにより、酢酸存在下での増殖促進機能が増強された微生物であれば特に制限されるものではなく、酢酸存在下での増殖促進機能が増強されたアセトバクター属、又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌が特に好ましいが、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属以外の酢酸菌の他、エッシェリヒア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチラス属、ミクロバクテリウム属、セラチア属、シュードモナス属、アグロバクテリウム属、アースロバクター属、エルウニア属、メチロバクテリウム属、ロドバクター属、ストレプトミセス属、ザイモモナス属等に属する微生物を挙げることもできる。
【００３９】
上記アセトバクター属に属する酢酸菌として具体的には、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）が挙げられ、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No.1023）株（特許生物寄託センター（宛名：茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に平成元年２月１３日、受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７として寄託）を好適に例示することができる。また、グルコンアセトバクター属に属する酢酸菌として具体的には、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）が挙げられ、現在特許生物寄託センター（宛名：茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−４９１として寄託されている（寄託日：昭和５９年２月２３日）アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株を好適に例示することができる。
【００４０】
アルコール酸化能を有するアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌において酢酸耐性を増強すると、酢酸の生産量や生産効率を増大させることができる。増殖促進機能の増強は、例えば増殖促進機能を有する遺伝子の細胞内のコピー数を増幅すること、あるいは、該遺伝子の構造遺伝子を含むＤＮＡ断片をアセトバクター属細菌中で効率よく機能するプロモーター配列に連結して得られる組換えＤＮＡを用いて、アセトバクター属細菌等を形質転換することによって増強することができる。また、染色体ＤＮＡ上の該遺伝子のプロモーター配列を、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌中で効率よく機能する他のプロモーター配列、例えば大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）のカナマイシン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ３９６（タカラバイオ社製）のクロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの各遺伝子のプロモーターなどの酢酸菌以外の微生物由来のプロモーター配列に置き換えることによっても高濃度酢酸存在下での増殖促進機能を増強することができる。そして、遺伝子の細胞内コピー数の増幅は、該遺伝子を保持するマルチコピーベクターをアセトバクター属酢酸菌の細胞に導入することによって行なうことができる。すなわち、該遺伝子を保持するプラスミド、トランスポゾン等をアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌の細胞に導入することによって行なうことができる。マルチコピーベクターとしては、ｐＧＩ１８やｐＭＶ２４、ｐＴＡ５００１（Ａ）、ｐＴＡ５００１（Ｂ）などが挙げられ、染色体組み込み型ベクターであるｐＭＶＬ１も挙げられる。また、トランスポゾンとしては、ＭｕやＩＳ１４５２などを挙げることができる。
【００４１】
本発明の食酢の製造方法としては、上記本発明の微生物を、アルコールを含有する培地で培養し、該培地中に酢酸を生成蓄積せしめる方法であれば特に制限されず、上記微生物としては、アセトバクター属、又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌が特に好ましい。例えば、高濃度酢酸存在下での増殖促進機能を有する遺伝子のコピー数が増幅されたことにより増殖促進機能が選択的に増強されたアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌であってアルコール酸化能を有する本発明の微生物を、アルコール含有培地で培養し、該培地中に酢酸を生産蓄積せしめることにより、高濃度の酢酸を含有する食酢を効率よく製造することができる。また、本発明の食酢の製造方法における酢酸発酵は、従来の酢酸菌の発酵法による食酢の製造法と同様にして行えばよく、酢酸発酵に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物、エタノールを含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でもよい。上記炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸が挙げられる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。また、培養は、静置培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行ない、培養温度は通常３０℃で行なう。培地のｐＨは通常２．５〜７の範囲であり、２．７〜６．５の範囲が好ましく、各種酸、各種塩基、緩衝液等によって調製することもできる。通常１〜２１日間の培養によって、培地中に高濃度の酢酸を蓄積させることができる。
また、本発明は、上記本発明の食酢の製造方法により得られる食酢にも関する。
【００４２】
以下に、実施例等を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、これら実施例等により限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
グルコンアセトバクター・エンタニイからの増殖促進機能を有するタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡのクローニングと塩基配列及びアミノ酸配列の決定
（１）酢酸安定タンパク質の同定
グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１として寄託）の菌体をフレンチプレスにて破砕を行ない、破砕液は遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）により未破砕菌体などを取り除き、上清液を得た。上清液から酢酸に対して安定なタンパク質を抽出する為に、ｐＨ４．０に調整した酢酸を最終濃度１Ｍになるように上清に添加し、酢酸の添加により不溶性となったタンパク質を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）により除去し、酢酸存在下でも可溶性で、酢酸に対して安定なタンパク質を含有する上澄液を得た。
【００４４】
得られた上澄液を、一次元目が等電点ｐＩ３〜１０（７ｃｍ、ｐＨ３〜１０、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）の等電点電気泳動を行ない、二次元目がＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パジェル５−１２．５％グラジエントゲル）の電気泳動を行った。得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルからセミドライ式（ＡＥ−６６７７、Ａｔｔｏ社製）でウェスタンブロッティングを行ないＰＶＤＦ膜（Ｓｅｑｕｉ−ｂｌｏｔ ＰＶＤＨ ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ａｔｔｏ社製）に転写を行なった。その結果、表１に示されるように、スポットＡＡＲ１からＡＡＲ１０までの主な１０スポットが検出され、ＰＶＤＦ膜に転写されたそれぞれのスポットを切り出し、アミノ酸シークエンサー（Applied Biosystems社製）により各スポットのＮ末アミノ酸配列の同定を行なった。該１０スポットの等電点、分子量、Ｎ末端側アミノ酸配列について、表１にまとめた。
【００４５】
【表１】
【００４６】
（２）染色体ＤＮＡライブラリーの作製
グルコンアセトバクター・エンタニイの１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）を６％酢酸、４％エタノールを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン）で３０℃にて振とう培養を行なった。培養後、培養液を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）し、菌体を得た。得られた菌体より、染色体ＤＮＡ調製法（例えば、特開昭６０−９４８９号公報参照）により、染色体ＤＮＡを調製した。
【００４７】
上記のようにして得られた染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（タカラバイオ社製）で部分消化し、また大腸菌−酢酸菌シャトルベクターｐＧＩ１８を制限酵素ＢａｍＨＩで完全消化して切断した。これらのＤＮＡを適量ずつ混合し、ライゲーションキット（Takara DNA Ligation Kit Ver.2、タカラバイオ社製）を用いて連結して、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で選択した。出現したコロニーを、上記（１）において同定したアミノ酸配列をもとにして作製し、ジゴキシゲニンでラベルしたプローブ（表２）を用い、コロニーハイブリダイゼーションを行ないポジティブな形質転換体７株（ＡＡＲ１〜ＡＡＲ７）を得た。
【００４８】
【表２】
【００４９】
（３）クローン化されたＤＮＡ断片の塩基配列の決定
１．スポットＡＡＲ１について
上記のクローン化されたＳａｕ３ＡＩ断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した結果、配列番号１に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
【００５０】
配列番号１に示される塩基配列中には、塩基番号２１３から塩基番号７６４にかけて、配列番号２に記載したような１８４個のアミノ酸（図２）をコードするオープンリーディング・フレームの存在が確認された。なお、配列番号１の塩基番号２１３〜７６４からなる塩基配列を含むＤＮＡは、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）のＰＰＩａｓｅと７９％の相同性があり、そのＰＰＩａｓｅは細胞内でタンパク質の折りたたみやシャペロン様の働きをしていると考えられるが、これまでのところ該遺伝子が増殖促進機能と関係していることは全く知られていない。
【００５１】
また、配列番号２に記載のタンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列はＭｅｔ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌであり、先にアミノ酸シークエンスにより決定した該タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列と一致することが確認された。
【００５２】
２．スポットＡＡＲ２について
上記のクローン化されたＳａｕ３ＡＩ断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した結果、配列番号５に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
【００５３】
配列番号５に示される塩基配列中には、塩基番号２３１から塩基番号８３６にかけて、配列番号６に記載したような２０２個のアミノ酸（図６）をコードするオープンリーディング・フレームの存在が確認された。なお、配列番号５の塩基番号２３１〜８３６からなる塩基配列を含むＤＮＡは、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）のＳＯＤと８０％の相同性を示しており、そのＳＯＤは抗酸化機能に関与していると考えられるが、増殖促進機能と関係していることは全く知られていない。
【００５４】
また、配列番号６に記載のタンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列はＭｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅであり、先にアミノ酸シークエンスにより決定した該タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列と一致することが確認された。
【００５５】
３．スポットＡＡＲ３について
上記のクローン化されたＳａｕ３ＡＩ断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した結果、配列番号９に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
【００５６】
配列番号９に示される塩基配列中には、塩基番号２０１から塩基番号５７８にかけて、配列番号１０に記載したような１２６個のアミノ酸（図１０）をコードするオープンリーディング・フレームの存在が確認された。
【００５７】
また、配列番号１０に記載のタンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列はＭｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｖａｌであり、先にアミノ酸シークエンスにより決定した該タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列と一致することが確認された。なお、塩基番号２０１〜５７８からなる塩基配列を含むＤＮＡは、磁性細菌（Magnetospirillum magnetotacticum）の遺伝子とアミノ酸配列レベルで２８％の、またアンモニア酸化細菌（Nitrosomonas europaea）の遺伝子とはアミノ酸配列レベルで２３％の相同性を示し、タンパク質をコードする遺伝子であることが推定されたが、その相同性の程度は極めて低いものであったことから、酢酸菌に特異的な新規タンパク質をコードする新規遺伝子ＵＮＫであることが確認された。
【００５８】
４．スポットＡＡＲ４について
上記のクローン化されたＳａｕ３ＡＩ断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した結果、配列番号１３に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
【００５９】
配列番号１３に示される塩基配列中には、塩基番号２４０から塩基番号７３１にかけて、配列番号１４に記載したような１６４個のアミノ酸（図１４）をコードするオープンリーディング・フレームの存在が確認された。また、配列番号１４に記載のタンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列はＭｅｔ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅであり、先にアミノ酸シークエンスにより決定した該タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列と一致することが確認された。
【００６０】
なお、塩基番号２４０〜７３１からなる塩基配列を含むＤＮＡは、大腸菌（Escherichia coli）のｙｂｈＢ遺伝子とアミノ酸配列レベルで６３％の、また赤痢菌（Shigella flexneri）の遺伝子とはアミノ酸配列レベルで６２％の相同性を示し、タンパク質をコードする遺伝子であることが推定されたが、他の微生物でも機能が分かっておらず、また該遺伝子が増殖促進機能と関係していることは全く知られていない。
【００６１】
５．スポットＡＡＲ５について
上記のクローン化されたＳａｕ３ＡＩ断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した結果、配列番号１７に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
【００６２】
配列番号１７に示される塩基配列中には、塩基番号２０１から塩基番号７６１にかけて、配列番号１８に記載したような１８７個のアミノ酸（図１８）をコードするオープンリーディング・フレームの存在が確認された。また、配列番号１８に記載のタンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列はＭｅｔ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏであり、先にアミノ酸シークエンスにより決定した該タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列と一致することが確認された。
【００６３】
なお、塩基番号２０１〜７６１からなる塩基配列を含むＤＮＡは、シュードモナス・シリンジャエ（Pseudomonas syringae）のアルキルハイドロパーオキサイド還元酵素（alkyl hydroperoxide reductase）(以下、ＡＨＤと称する場合もある)の遺伝子とアミノ酸配列レベルで７４％の、またカウロバクター・クレセンタス（Caulobacter crescentus）の該遺伝子とはアミノ酸配列レベルで６７％の相同性を示していた。一般にＡＨＤは過酸化物代謝に関与していると考えられているが、該遺伝子が高濃度酢酸存在下での増殖促進機能に関与していることは全く知られていない。
【００６４】
６．スポットＡＡＲ６について
上記のクローン化されたＳａｕ３ＡＩ断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した結果、配列番号２１に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
【００６５】
配列番号２１に示される塩基配列中には、塩基番号１９３から塩基番号６４２にかけて、配列番号２２に記載したような１５０個のアミノ酸（図２２）をコードするオープンリーディング・フレームの存在が確認された。また、配列番号２２に記載のタンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列はＭｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇであり、先にアミノ酸シークエンスにより決定した該タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列と一致することが確認された。
【００６６】
なお、塩基番号１９３〜６４２からなる塩基配列を含むＤＮＡは、ブラディリゾビューム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）の機能未知タンパク質（hypothetical protein）(以下、ＵＮＫ２と称する場合もある)の遺伝子とアミノ酸配列レベルで４６％の、またメソリゾビューム・ロッティ（Mesorhizobium loti）の遺伝子とはアミノ酸配列レベルで５０％の相同性を示しており、タンパク質をコードする遺伝子であることが推定されたが、タンパク質の機能がわかっておらず、該遺伝子が高濃度酢酸存在下での増殖促進機能に関与していることは全く知られていない。
【００６７】
７．スポットＡＡＲ７について
上記のクローン化されたＳａｕ３ＡＩ断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した結果、配列番号２５に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
【００６８】
配列番号２５に示される塩基配列中には、塩基番号２２８から塩基番号７７３にかけて、配列番号２６に記載したような１８２個のアミノ酸（図２６）をコードするオープンリーディング・フレームの存在が確認された。また、配列番号２６に記載のタンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列はＭｅｔ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌであり、先にアミノ酸シークエンスにより決定した該タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列と一致することが確認された。
【００６９】
なお、塩基番号２２８〜７７３からなる塩基配列を含むＤＮＡは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の機能未知タンパク質（hypothetical protein）(以下、ＵＮＫ３と称する場合もある)遺伝子とアミノ酸配列レベルで６１％の、またシノリゾビウム・メリロッティ（Sinorhizobium meliloti）の遺伝子とはアミノ酸配列レベルで６６％の相同性を示し、タンパク質をコードする遺伝子であることが推定されたが、タンパク質の機能がわかっておらず、該遺伝子が高濃度酢酸存在下での増殖促進機能に関与していることは全く知られていない。
【実施例２】
【００７０】
グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の増殖促進機能を有する遺伝子で形質転換した形質転換株での増殖促進効果（その１）
（１）アセトバクター・アセチへの形質転換
上記のようにしてクローン化されたアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）由来のＤＮＡ断片のうち、スポットＡＡＲ１において得られたＤＮＡをＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ法により増幅し、増幅したＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位に挿入したプラスミドｐＰＰＩを作製した。プラスミドに挿入された増幅断片の概略を図１に示す。
【００７１】
ＰＣＲ法は具体的には次のようにして実施した。すなわち、鋳型としてアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株のゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー１(その塩基配列を図３に示す)及びプライマー２（その塩基配列を図４に示す）を用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を使用し、９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ３０秒を１サイクルとして、３０サイクルというＰＣＲ条件にてＰＣＲを実施した。
【００７２】
このｐＰＰＩをアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（例えば、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）」、８７巻、８１３０−８１３４頁、１９９０年参照）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１％の酢酸を添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、増殖促進機能を有する遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
【００７３】
（２）形質転換株の増殖促進機能
上記のようにして得られたプラスミドを有するアンピシリン耐性の形質転換株を、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育について、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株と比較した。
【００７４】
具体的には、エタノール３％、酢酸３％とアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有する１００ｍｌのＹＰＧ培地に、形質転換株とシャトルベクターｐＧＩ１８を有する元株をそれぞれ２株ずつ接種し、３０℃で振とう培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定した値の平均値を比較した。
【００７５】
その結果、図２９に示すように、形質転換株は増殖が可能であるのに対して、元株は増殖できないことが確認でき、スポットＡＡＲ１において得られたＤＮＡの増殖促進機能が確認できた。
【実施例３】
【００７６】
グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の増殖促進機能を有する遺伝子で形質転換した形質転換株での増殖促進効果（その２）
スポットＡＡＲ２において得られたＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー３(その塩基配列を図７に示す)及びプライマー４（その塩基配列を図８に示す）を用いる以外は実施例２と同様に行い、プラスミドｐＳＯＤを作製した。プラスミドに挿入された増幅断片の概略を図５に示す。
【００７７】
実施例２と同様にして、このｐＳＯＤをアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法によって形質転換した形質転換株が増殖促進機能を有する遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した後、実施例２と同様にして、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定した値の平均値を比較した。その結果、図３０に示すように、形質転換株は増殖が可能であるのに対して、元株は増殖できないことが確認でき、スポットＡＡＲ２において得られたＤＮＡの増殖促進機能が確認できた。
【実施例４】
【００７８】
グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の増殖促進機能を有する遺伝子で形質転換した形質転換株での増殖促進効果（その３）
スポットＡＡＲ３において得られたＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー５(その塩基配列を図１１に示す)及びプライマー６（その塩基配列を図１２に示す）を用いる以外は実施例２と同様に行い、プラスミドｐＵＮＫを作製した。プラスミドに挿入された増幅断片の概略を図９に示す。
【００７９】
実施例２と同様にして、このｐＵＮＫをアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法によって形質転換した形質転換株が増殖促進機能を有する遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した後、実施例２と同様にして、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定した値の平均値を比較した。その結果、図３１に示すように、形質転換株は増殖が可能であるのに対して、元株は増殖できないことが確認でき、スポットＡＡＲ３において得られたＤＮＡの増殖促進機能が確認できた。
【実施例５】
【００８０】
グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の増殖促進機能を有する遺伝子で形質転換した形質転換株での増殖促進効果（その４）
（１）アセトバクター・アセチへの形質転換
スポットＡＡＲ４において得られたＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー７(その塩基配列を図１５に示す)及びプライマー８（その塩基配列を図１６に示す）を用いる以外は実施例２と同様に行い、プラスミドｐＹＢＨを作製した。プラスミドに挿入された増幅断片の概略を図１３に示す。
【００８１】
実施例２と同様にして、このｐＹＢＨをアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法によって形質転換した形質転換株が増殖促進機能を有する遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した後、実施例２と同様にして、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定した値の平均値を比較した。その結果、図３２に示すように、形質転換株は増殖が可能であるのに対して、元株は増殖できないことが確認でき、スポットＡＡＲ４において得られたＤＮＡの増殖促進機能が確認できた。
【実施例６】
【００８２】
グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の増殖促進機能を有する遺伝子で形質転換した形質転換株での増殖促進効果（その５）
スポットＡＡＲ５において得られたＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー９(その塩基配列を図１９に示す)及びプライマー１０（その塩基配列を図２０に示す）を用いる以外は実施例２と同様に行い、プラスミドｐＡＨＲを作製した。プラスミドに挿入された増幅断片の概略を図１７に示す。
【００８３】
実施例２と同様にして、このｐＡＨＲをアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法によって形質転換した形質転換株が増殖促進機能を有する遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した後、実施例２と同様にして、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定した値の平均値を比較した。その結果、図３３に示すように、形質転換株は増殖が可能であるのに対して、元株は増殖できないことが確認でき、スポットＡＡＲ５において得られたＤＮＡの増殖促進機能が確認できた。
【実施例７】
【００８４】
グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の増殖促進機能を有する遺伝子で形質転換した形質転換株での増殖促進効果（その６）
スポットＡＡＲ６において得られたＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー１１(その塩基配列を図２３に示す)及びプライマー１２（その塩基配列を図２４に示す）を用いる以外は実施例２と同様に行い、プラスミドｐＵＮＫ２を作製した。プラスミドに挿入された増幅断片の概略を図２１に示す。
【００８５】
実施例２と同様にして、このｐＵＮＫ２をアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法によって形質転換した形質転換株が増殖促進機能を有する遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した後、実施例２と同様にして、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定した値の平均値を比較した。その結果、図３４に示すように、形質転換株は増殖が可能であるのに対して、元株は増殖できないことが確認でき、スポットＡＡＲ６において得られたＤＮＡの増殖促進機能が確認できた。
【実施例８】
【００８６】
グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の増殖促進機能を有する遺伝子で形質転換した形質転換株での増殖促進効果（その７）
スポットＡＡＲ７において得られたＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー１３(その塩基配列を図２７に示す)及びプライマー１４（その塩基配列を図２８に示す）を用いる以外は実施例２と同様に行い、プラスミドｐＵＮＫ３を作製した。プラスミドに挿入された増幅断片の概略を図２５に示す。
【００８７】
実施例２と同様にして、このｐＵＮＫ３をアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法によって形質転換した形質転換株が増殖促進機能を有する遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した後、実施例２と同様にして、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定した値の平均値を比較した。その結果、図３５に示すように、形質転換株は増殖が可能であるのに対して、元株は増殖できないことが確認でき、スポットＡＡＲ７において得られたＤＮＡの増殖促進機能が確認できた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物に由来する酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子のコピー数を増幅した微生物、特にアセトバクター属（Acetobacter）及びグルコンアセトバクター属（Gluconacetobacter）に属する酢酸菌、及びこれらの微生物を用いて高濃度の酢酸を含有する食酢を短時間で効率よく製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酢酸菌は食酢製造に広く利用されている微生物であり、特にアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌が工業的な酢酸発酵に利用されている。
【０００３】
酢酸発酵では、培地中のエタノールが酢酸菌によって酸化されて酢酸に変換され、その結果、酢酸が培地中に蓄積することになるが、酢酸は酢酸菌にとっても阻害的であり、酢酸の蓄積量が増大して培地中の酢酸濃度が高くなるにつれて酢酸菌の増殖能力や発酵能力は次第に低下する。
【０００４】
例えば、発酵を開始してから実際に酢酸菌の増殖が開始して酢酸の蓄積が確認できるようになるまでの期間、すなわち増殖誘導期と呼ばれる期間は、酢酸濃度が高くなればなるほど長くなる傾向が認められている。また、酢酸濃度が高くなればなるほど、酢酸菌の増殖速度や増殖量なども小さくなることが確認されている。
【０００５】
このような酢酸菌の酢酸存在下における増殖能力を育種改良するべく、酢酸存在下での酢酸菌の増殖促進機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を取得し、酢酸菌の増殖促進機能を増強して、高濃度酢酸発酵能が改善された酢酸菌を開発することが進められてきており、例えば、大腸菌（Escherichia coli）などのｏｍｐＡ遺伝子と相同性が高い酢酸菌のｏｍｐＡ遺伝子がクローニングされ、酢酸菌の酢酸存在下における増殖促進機能が確認されたが（例えば、特許文献１参照）、その効果は十分といいうるものではなかった。
【０００６】
さらに、高濃度酢酸中で培養中の酢酸菌において発現しているタンパク質群の中に、高濃度酢酸への適応機構に関与するタンパク質が存在するとの仮定から、該タンパク質群中に、プロテアーゼＩ、プクチンリアーゼＩＩ前駆体、ユビキノンオキシドレダクターゼ、シャペロンＧｒｏＥＬなどとＮ末端側のアミノ酸配列の相同性が高いものが存在することが報告されているが（例えば、非特許文献１参照）、これらのタンパク質が酢酸菌の酢酸存在下における増殖促進機能を有するタンパク質であるかどうかについては確認されていない。
【０００７】
このように、実用的なレベルで、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を取得し、該遺伝子を用いて酢酸存在下における酢酸菌の増殖促進機能を増強して、高濃度酢酸発酵能が改善された酢酸菌を開発することが求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／００１０９５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】「アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー（Appl. Environ. Microbiol.）」、６７巻、５４７４〜５４８１頁、２００１年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、高濃度酢酸存在下での酢酸菌の増殖促進機能を有するタンパク質をコードする新規遺伝子を取得し、酢酸菌の増殖促進機能を増強して、高濃度酢酸発酵能が改善された酢酸菌を開発し、該酢酸菌を用いて高濃度の酢酸を含有する食酢を短時間で効率良く製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、酢酸存在下でも増殖して発酵することができる酢酸菌には、他の微生物には存在しない、酢酸に対する耐性を有する特異的なタンパク質が存在するとの仮説を立て、こうしたタンパク質をコードする遺伝子を用いれば、酢酸存在下での微生物の増殖促進機能を従来以上に向上させることができ、さらには従来得られなかった高濃度の酢酸を含有する新規食酢の効率的な製造法を開発することが可能になるとの新規着想を得た。
【００１２】
そこで、本発明者らは、酢酸菌から酢酸存在下における増殖促進機能を有する遺伝子を見い出す方法について鋭意検討し、酢酸菌のタンパク質を高濃度の酢酸にさらし、その後、変性されずに可溶性のままで存在するタンパク質を検索することにより、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質を検出しうると考え、酢酸菌体の破砕液にｐＨ４．０に調整した酢酸を最終濃度１Ｍになるように添加し、酢酸存在下における不溶性タンパク質を遠心除去後、二次元電気泳動により可溶性タンパク質を分離し、該タンパク質のＮ末端アミノ酸配列の同定を行なった。そして、同定したＮ末端アミノ酸配列から作製したＤＮＡをプローブとし、コロニーハイブリダイゼーションにより遺伝子の同定を行なうことにより、酢酸存在下での増殖を促進することが可能なタンパク質をコードする遺伝子を抽出することができた。そして、同定した遺伝子については、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No.1023）株（特許生物寄託センター（宛名：茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に平成元年２月１３日、受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７として寄託）に形質転換を行ない、元株に対して優位に増殖を促進することを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、［１］（Ａ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（Ｂ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質や、［２］（Ａ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（Ｂ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加又は逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、［３］（Ａ）配列表の配列番号５に示される塩基配列のうち、塩基番号２３１〜８３６の塩基配列からなるＤＮＡ、（Ｂ）配列表の配列番号５に示される塩基配列のうち、塩基番号２３１〜８３６の塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は（Ｃ）配列表の配列番号５に示される塩基配列のうち、塩基番号２３１〜８３６の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加又は逆位された塩基配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡに関する。
【００１４】
また本発明は、［４］前記［２］、［３］に記載のＤＮＡの中から選ばれる１又は２以上のＤＮＡを含む組換えベクターや、［５］前記［４］に記載の組換えベクターを含む形質転換体や、［６］前記［２］、［３］に記載のＤＮＡの中から選ばれる１又は２以上のＤＮＡの細胞内でのコピー数が増幅されたことにより、酢酸存在下での増殖促進機能が増強された微生物や、［７］微生物がアセトバクター属、又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする前記［６］に記載の微生物や、［８］前記［６］又は［７］に記載の微生物を、アルコールを含有する培地で培養し、該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、微生物に対して、酢酸存在下での増殖促進機能を付与し、増強することができる。そして、アルコール酸化能を有する微生物、特に酢酸菌においては、酢酸存在下での増殖機能が向上し、増殖誘導期が顕著に短縮して、培地中に高濃度の酢酸を効率良く蓄積する能力を付与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】スポットＡＡＲ１についてクローニングされた遺伝子断片の制限酵素地図と増殖促進機能を有する遺伝子の位置、及びｐＰＰＩへの挿入断片の概略図である。
【図２】配列番号１に示す塩基配列のうち、塩基番号２１３〜７６４の塩基配列によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図３】プライマー１を示す図である。
【図４】プライマー２を示す図である。
【図５】スポットＡＡＲ２についてクローニングされた遺伝子断片の制限酵素地図と増殖促進機能を有する遺伝子の位置、及びｐＳＯＤへの挿入断片の概略図である。
【図６】配列番号５に示す塩基配列のうち、塩基番号２３１〜８３６の塩基配列によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図７】プライマー３を示す図である。
【図８】プライマー４を示す図である。
【図９】スポットＡＡＲ３についてクローニングされた遺伝子断片の制限酵素地図と増殖促進機能を有する遺伝子の位置、及びｐＵＮＫへの挿入断片の概略図である。
【図１０】配列番号９に示す塩基配列のうち、塩基番号２０１〜５７６の塩基配列によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図１１】プライマー５を示す図である。
【図１２】プライマー６を示す図である。
【図１３】スポットＡＡＲ４についてクローニングされた遺伝子断片の制限酵素地図と増殖促進機能を有する遺伝子の位置、及びｐＹＢＨへの挿入断片の概略図である。
【図１４】配列番号１３に示す塩基配列のうち、塩基番号２４０〜７３１の塩基配列によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図１５】プライマー７を示す図である。
【図１６】プライマー８を示す図である。
【図１７】スポットＡＡＲ５についてクローニングされた遺伝子断片の制限酵素地図と増殖促進機能を有する遺伝子の位置、及びｐＡＨＲへの挿入断片の概略図である。
【図１８】配列番号１７に示す塩基配列のうち、塩基番号２０１〜７６１の塩基配列によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図１９】プライマー９を示す図である。
【図２０】プライマー１０を示す図である。
【図２１】スポットＡＡＲ６についてクローニングされた遺伝子断片の制限酵素地図と増殖促進機能を有する遺伝子の位置、及びｐＵＮＫ２への挿入断片の概略図である。
【図２２】配列番号２１に示す塩基配列のうち、塩基番号１９３〜６４２の塩基配列によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図２３】プライマー１１を示す図である。
【図２４】プライマー１２を示す図である。
【図２５】スポットＡＡＲ７についてクローニングされた遺伝子断片の制限酵素地図と増殖促進機能を有する遺伝子の位置、及びｐＵＮＫ３への挿入断片の概略図である。
【図２６】配列番号２５に示す塩基配列のうち、塩基番号２２８〜７７３の塩基配列によりコードされたタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図２７】プライマー１３を示す図である。
【図２８】プライマー１４を示す図である。
【図２９】形質転換株（ｐＰＰＩ）の培養経過を示す図である。
【図３０】形質転換株（ｐＳＯＤ）の培養経過を示す図である。
【図３１】形質転換株（ｐＵＮＫ）の培養経過を示す図である。
【図３２】形質転換株（ｐＹＢＨ）の培養経過を示す図である。
【図３３】形質転換株（ｐＡＨＲ）の培養経過を示す図である。
【図３４】形質転換株（ｐＵＮＫ２）の培養経過を示す図である。
【図３５】形質転換株（ｐＵＮＫ３）の培養経過を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のタンパク質としては、配列表の配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、配列表の配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質や、配列表の配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質であれば特に制限されず、本発明において、「酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質」とは、当該タンパク質をコードするＤＮＡをアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法によって形質転換した形質転換株を、エタノール３％と酢酸３％とを含有する１００ｍｌのＹＰＧ培地に接種し、３０℃で振とう培養（１５０ｒｐｍ）を５日間行ない、形質転換株が生育した酢酸添加ＹＰＧ培地の６６０ｎｍにおける吸光度を測定した値が、未形質転換の元株（親株）の場合と比較して、２倍以上の値を示す当該タンパク質をいう。
【００１８】
また、本発明のＤＮＡとしては、配列表の配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号１（塩基番号２１３〜７６４），５（塩基番号２３１〜８３６），９（塩基番号２０１〜５７８），１３（塩基番号２４０〜７３１），１７（塩基番号２０１〜７６１），２１（塩基番号１９３〜６４２），又は２５（塩基番号２２８〜７７３）の塩基配列からなるＤＮＡや、配列表の配列番号１（塩基番号２１３〜７６４），５（塩基番号２３１〜８３６），９（塩基番号２０１〜５７８），１３（塩基番号２４０〜７３１），１７（塩基番号２０１〜７６１），２１（塩基番号１９３〜６４２），又は２５（塩基番号２２８〜７７３）の塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号１（塩基番号２１３〜７６４），５（塩基番号２３１〜８３６），９（塩基番号２０１〜５７８），１３（塩基番号２４０〜７３１），１７（塩基番号２０１〜７６１），２１（塩基番号１９３〜６４２），又は２５（塩基番号２２８〜７７３）の塩基配列の一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号１（塩基番号２１３〜７６４），５（塩基番号２３１〜８３６），９（塩基番号２０１〜５７８），１３（塩基番号２４０〜７３１），１７（塩基番号２０１〜７６１），２１（塩基番号１９３〜６４２），又は２５（塩基番号２２８〜７７３）の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加又は逆位された塩基配列からなり、かつ酢酸存在下での酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば特に制限されず、例えば、上記の「配列番号１（塩基番号２１３〜７６４）」などの表記は、「配列番号１に示される塩基配列のうち塩基番号２１３〜７６４」を意味する。
【００１９】
このように、本発明の酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、コードされるタンパク質の酢酸耐性を増強する機能が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加された、あるいは逆位とされたタンパク質をコードするものであってもよい。このような酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、あるいは逆位として塩基配列を改変することによっても取得することができる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。さらに、一般的にタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、酢酸菌全般、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の種、株、変異体、変種から得ることが可能である。
【００２０】
上記「１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加又は逆位された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が置換、欠失、挿入、付加又は逆位された塩基配列を意味する。
【００２１】
例えば、これら１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加又は逆位された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、上記のように、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列表の配列番号１（塩基番号２１３〜７６４），５（塩基番号２３１〜８３６），９（塩基番号２０１〜５７８），１３（塩基番号２４０〜７３１），１７（塩基番号２０１〜７６１），２１（塩基番号１９３〜６４２），又は２５（塩基番号２２８〜７７３）に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加又は逆位されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
【００２２】
上記「配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列との相同性が８５％以上であれば特に制限されるものではなく、例えば、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上であることを意味する。
【００２３】
上記「ストリジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、５０〜７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。また、上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.（以後 "モレキュラークローニング第２版" と略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２４】
例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。
【００２５】
本発明のＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号１，５，９，１３，１７，２１，又は２５に示される塩基配列情報又は配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該ＤＮＡが存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的のＤＮＡを単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。
【００２６】
例えば、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明の遺伝子ＤＮＡに特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明の遺伝子ＤＮＡを取得することができる。また、これらの酢酸菌からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明の遺伝子ＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、モレキュラークローニング第２版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。
【００２７】
具体的には、本発明の配列番号１，５，９，１３，１７，２１，又は２５に示される塩基配列からなるＤＮＡは、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の染色体ＤＮＡから次のようにして取得することができる。まず、グルコンアセトバクター・エンタニイ、例えばアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）の染色体ＤＮＡライブラリーを調製する。なお、染色体ＤＮＡは、常法（例えば、特開昭６０−９４８９号公報参照）により取得する。次に得られた染色体ＤＮＡから増殖促進機能を有する遺伝子を単離するために、染色体ＤＮＡライブラリーを作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部分分解して種々の断片混合物を得る。切断反応時間などを調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵素が使用できる。例えば、Ｓａｕ３ＡＩを温度３０℃以上、好ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／ｍｌで様々な時間（１分〜２時間）、染色体ＤＮＡに作用させてこれを消化する。次いで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、酢酸菌内で自律複製可能なベクターＤＮＡに連結し、組換えベクターを作製する。具体的には、染色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素Ｓａｕ３ＡＩと相補的な末端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばＢａｍＨＩを温度３０℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で、１時間以上ベクターＤＮＡに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。次に、上記のようにして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と切断開裂されたベクターＤＮＡを混合し、これにＴ４ＤＮＡリガーゼを温度４〜１６℃、酵素濃度１〜１００ユニット／ｍｌの条件下で１時間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組換えベクターを得る。得られた組換えベクターのＤＮＡを、大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセルと混合し、０℃下で１０分間放置後、４２℃で４５秒間加温して、細胞内に取り込ませる。これにＳＯＣ培地を添加し、１時間振とう培養後、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天平板培地上に広げて、３７℃で１晩培養し、この平板培地上で、白色のコロニーを作る菌を形質転換体として選択し、さらに得られた形質転換株の中から、酢酸耐性を有するタンパク質として同定したタンパク質のＮ末アミノ酸配列から作製した遺伝子をＤＮＡプローブとし、ジゴキシゲニンでラベルしたコロニーハイブリダイゼーションを行ない、ポジティブな形質転換株を得る。
【００２８】
また、上記配列表の配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどからなる本発明の変異遺伝子又は相同遺伝子としては、配列番号１，５，９，１３，１７，２１，若しくは２５に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡ断片を利用し、他の酢酸菌等より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。その他、前述の変異ＤＮＡの作製方法により調製することもできる。
【００２９】
例えば、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、又は変異処理したアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば配列表の配列番号１（塩基番号２１３〜７６４），５（塩基番号２３１〜８３６），９（塩基番号２０１〜５７８），１３（塩基番号２４０〜７３１），１７（塩基番号２０１〜７６１），２１（塩基番号１９３〜６４２），又は２５（塩基番号２２８〜７７３）に示される塩基配列、又はその一部から作製したプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、該タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得ることができる。
【００３０】
本発明のタンパク質の取得・調製方法は特に限定されず、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現している微生物細胞からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。化学合成によりタンパク質を調製する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、ｔＢＯＣ法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。
【００３１】
例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明のタンパク質を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。
【００３２】
さらに、配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２，６，１０，１４，１８，２２，又は２６に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の一例を示す配列番号１（塩基番号２１３〜７６４），５（塩基番号２３１〜８３６），９（塩基番号２０１〜５７８），１３（塩基番号２４０〜７３１），１７（塩基番号２０１〜７６１），２１（塩基番号１９３〜６４２），又は２５（塩基番号２２８〜７７３）に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。例えば、配列番号１（塩基番号２１３〜７６４），５（塩基番号２３１〜８３６），９（塩基番号２０１〜５７８），１３（塩基番号２４０〜７３１），１７（塩基番号２０１〜７６１），２１（塩基番号１９３〜６４２），又は２５（塩基番号２２８〜７７３）に示される塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ反応）によって、あるいは該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによって、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌、あるいはそれら以外の酢酸菌より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニング後、発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造することができる。
【００３３】
オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて定法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ２４００を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）などを使用して、定法に従って行なうことができる。
【００３４】
上記本発明のタンパク質とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させて融合タンパク質とすることもできる。マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本発明のタンパク質の精製や、本発明のタンパク質の検出や、本発明のタンパク質に対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００３５】
本発明の組換えベクターとしては、前記本発明のＤＮＡを１種以上含み、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質を発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、本発明の組換えベクターは、本発明のＤＮＡを発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明のＤＮＡを発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。
【００３６】
細菌用の発現ベクターとしては、例えば、酢酸菌―大腸菌シャトルベクター（マルチコピーベクター）ｐＧＩ１８（例えば、特開２００５−１１０５９７号公報参照）、ｐＭＶ２４（例えば、特開昭６１−５８５８４号公報参照）、ｐＴＡ５００１（Ａ）、ｐＴＡ５００１（Ｂ）（例えば、特開昭６０−９４８８号公報参照）、ｐＭＶＬ１（例えば、「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricaltural and Biological Chemistry）」、５２巻、３１２５−３１２９頁、１９８８年参照）の他、ｐＢＴｒＰ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもべ一リンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（Pharmacia社製）、ｐＳＥ２８０（Invitrogen社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Promega社製）、ｐＱＥ−８（QIAGEN社製）、ｐＱＥ−３０（QIAGEN社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Agrc.Biol.Chem., 48, 669(1984)〕、ＰＬＳＡ１〔Agrc. Blo1. Chem., 53, 277(1989)〕、ｐＧＥＬ１〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｌｐｔＩＩ ＳＫ＋、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（Stratagene社製）、ｐＴｒＳ３０（FERMBP-5407）、ｐＴｒＳ３２（FERM BP-5408）、ｐＧＥＸ（Pharmacia社製）、ｐＥＴ−３（Novagen社製）、ｐＴｅｒｍ２（US4686191、US4939094、US5160735）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＵＣ１８〔Gene, 33, 103(1985)〕、ｐＵＣ１９〔Gene, 33, 103(1985)〕、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＳＴＶ２９（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）、ｐＱＥ−３０（QIAGEN社製)等が挙げられる。細菌用のプロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。
【００３７】
本発明の形質転換体としては、上記本発明の組換えベクターを含み、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質を発現することができる宿主細胞であれば特に制限されず、上記宿主細胞としては、細菌、酵母、昆虫細胞、動植物細胞を挙げることができるが細菌が好ましく、中でもアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌が特に好ましいが、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属以外の酢酸菌の他、エッシェリヒア（Escherichia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、バチラス（Bacillus）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、セラチア（Serratia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、エルウニア（Erwinia）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属、ザイモモナス（Zymomonas）属等に属する微生物を挙げることができる。細菌宿主へ組換えベクターを導入する方法としては、塩化カルシュウム法（例えば、「アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricaltural and Biological Chemistry）」、４９巻、２０９１−２０９７頁、１９８５年参照）やエレクトロポレーション法（「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）」、８７巻、８１３０−８１３４頁、１９９０年参照）、プロトプラスト法等を挙げることができる。本発明の好適な形質転換体として、酢酸菌―大腸菌シャトルベクター（マルチコピーベクター）ｐＧＩ１８にＤＮＡ断片を挿入してなる組換えベクターをアセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）Ｎｏ．１０２３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７）に導入することにより得られる形質転換体を具体的に例示することができる。
【００３８】
本発明の微生物としては、前記本発明のＤＮＡの中から選ばれる１又は２以上のＤＮＡの細胞内でのコピー数が増幅されたことにより、酢酸存在下での増殖促進機能が増強された微生物であれば特に制限されるものではなく、酢酸存在下での増殖促進機能が増強されたアセトバクター属、又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌が特に好ましいが、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属以外の酢酸菌の他、エッシェリヒア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチラス属、ミクロバクテリウム属、セラチア属、シュードモナス属、アグロバクテリウム属、アースロバクター属、エルウニア属、メチロバクテリウム属、ロドバクター属、ストレプトミセス属、ザイモモナス属等に属する微生物を挙げることもできる。
【００３９】
上記アセトバクター属に属する酢酸菌として具体的には、アセトバクター・アセチ（Acetobacter aceti）が挙げられ、アセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（Acetobacter aceti No.1023）株（特許生物寄託センター（宛名：茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に平成元年２月１３日、受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８７として寄託）を好適に例示することができる。また、グルコンアセトバクター属に属する酢酸菌として具体的には、グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）が挙げられ、現在特許生物寄託センター（宛名：茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−４９１として寄託されている（寄託日：昭和５９年２月２３日）アセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株を好適に例示することができる。
【００４０】
アルコール酸化能を有するアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌において酢酸耐性を増強すると、酢酸の生産量や生産効率を増大させることができる。増殖促進機能の増強は、例えば増殖促進機能を有する遺伝子の細胞内のコピー数を増幅すること、あるいは、該遺伝子の構造遺伝子を含むＤＮＡ断片をアセトバクター属細菌中で効率よく機能するプロモーター配列に連結して得られる組換えＤＮＡを用いて、アセトバクター属細菌等を形質転換することによって増強することができる。また、染色体ＤＮＡ上の該遺伝子のプロモーター配列を、アセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌中で効率よく機能する他のプロモーター配列、例えば大腸菌のプラスミドｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）のアンピシリン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）のカナマイシン耐性遺伝子、プラスミドｐＨＳＧ３９６（タカラバイオ社製）のクロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの各遺伝子のプロモーターなどの酢酸菌以外の微生物由来のプロモーター配列に置き換えることによっても高濃度酢酸存在下での増殖促進機能を増強することができる。そして、遺伝子の細胞内コピー数の増幅は、該遺伝子を保持するマルチコピーベクターをアセトバクター属酢酸菌の細胞に導入することによって行なうことができる。すなわち、該遺伝子を保持するプラスミド、トランスポゾン等をアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌の細胞に導入することによって行なうことができる。マルチコピーベクターとしては、ｐＧＩ１８やｐＭＶ２４、ｐＴＡ５００１（Ａ）、ｐＴＡ５００１（Ｂ）などが挙げられ、染色体組み込み型ベクターであるｐＭＶＬ１も挙げられる。また、トランスポゾンとしては、ＭｕやＩＳ１４５２などを挙げることができる。
【００４１】
本発明の食酢の製造方法としては、上記本発明の微生物を、アルコールを含有する培地で培養し、該培地中に酢酸を生成蓄積せしめる方法であれば特に制限されず、上記微生物としては、アセトバクター属、又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌が特に好ましい。例えば、高濃度酢酸存在下での増殖促進機能を有する遺伝子のコピー数が増幅されたことにより増殖促進機能が選択的に増強されたアセトバクター属やグルコンアセトバクター属の酢酸菌であってアルコール酸化能を有する本発明の微生物を、アルコール含有培地で培養し、該培地中に酢酸を生産蓄積せしめることにより、高濃度の酢酸を含有する食酢を効率よく製造することができる。また、本発明の食酢の製造方法における酢酸発酵は、従来の酢酸菌の発酵法による食酢の製造法と同様にして行えばよく、酢酸発酵に使用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物、エタノールを含有し、必要があれば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するものであれば、合成培地でも天然培地でもよい。上記炭素源としては、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭水化物、各種有機酸が挙げられる。窒素源としては、ペプトン、発酵菌体分解物などの天然窒素源を用いることができる。また、培養は、静置培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行ない、培養温度は通常３０℃で行なう。培地のｐＨは通常２．５〜７の範囲であり、２．７〜６．５の範囲が好ましく、各種酸、各種塩基、緩衝液等によって調製することもできる。通常１〜２１日間の培養によって、培地中に高濃度の酢酸を蓄積させることができる。
また、本発明は、上記本発明の食酢の製造方法により得られる食酢にも関する。
【００４２】
以下に、実施例等を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、これら実施例等により限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
グルコンアセトバクター・エンタニイからの増殖促進機能を有するタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡのクローニングと塩基配列及びアミノ酸配列の決定
（１）酢酸安定タンパク質の同定
グルコンアセトバクター・エンタニイ（Gluconacetobacter entanii）の１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４（Acetobacter altoacetigenes MH-24）株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１として寄託）の菌体をフレンチプレスにて破砕を行ない、破砕液は遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）により未破砕菌体などを取り除き、上清液を得た。上清液から酢酸に対して安定なタンパク質を抽出する為に、ｐＨ４．０に調整した酢酸を最終濃度１Ｍになるように上清に添加し、酢酸の添加により不溶性となったタンパク質を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）により除去し、酢酸存在下でも可溶性で、酢酸に対して安定なタンパク質を含有する上澄液を得た。
【００４４】
得られた上澄液を、一次元目が等電点ｐＩ３〜１０（７ｃｍ、ｐＨ３〜１０、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）の等電点電気泳動を行ない、二次元目がＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パジェル５−１２．５％グラジエントゲル）の電気泳動を行った。得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルからセミドライ式（ＡＥ−６６７７、Ａｔｔｏ社製）でウェスタンブロッティングを行ないＰＶＤＦ膜（Ｓｅｑｕｉ−ｂｌｏｔ ＰＶＤＨ ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ａｔｔｏ社製）に転写を行なった。その結果、表１に示されるように、スポットＡＡＲ１からＡＡＲ１０までの主な１０スポットが検出され、ＰＶＤＦ膜に転写されたそれぞれのスポットを切り出し、アミノ酸シークエンサー（Applied Biosystems社製）により各スポットのＮ末アミノ酸配列の同定を行なった。該１０スポットの等電点、分子量、Ｎ末端側アミノ酸配列について、表１にまとめた。
【００４５】
【表１】
【００４６】
（２）染色体ＤＮＡライブラリーの作製
グルコンアセトバクター・エンタニイの１株であるアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）を６％酢酸、４％エタノールを添加したＹＰＧ培地（３％グルコース、０．５％酵母エキス、０．２％ポリペプトン）で３０℃にて振とう培養を行なった。培養後、培養液を遠心分離（７，５００×ｇ、１０分）し、菌体を得た。得られた菌体より、染色体ＤＮＡ調製法（例えば、特開昭６０−９４８９号公報参照）により、染色体ＤＮＡを調製した。
【００４７】
上記のようにして得られた染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（タカラバイオ社製）で部分消化し、また大腸菌−酢酸菌シャトルベクターｐＧＩ１８を制限酵素ＢａｍＨＩで完全消化して切断した。これらのＤＮＡを適量ずつ混合し、ライゲーションキット（Takara DNA Ligation Kit Ver.2、タカラバイオ社製）を用いて連結して、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で選択した。出現したコロニーを、上記（１）において同定したアミノ酸配列をもとにして作製し、ジゴキシゲニンでラベルしたプローブ（表２）を用い、コロニーハイブリダイゼーションを行ないポジティブな形質転換体７株（ＡＡＲ１〜ＡＡＲ７）を得た。
【００４８】
【表２】
【００４９】
（３）クローン化されたＤＮＡ断片の塩基配列の決定
１．スポットＡＡＲ１について
上記のクローン化されたＳａｕ３ＡＩ断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した結果、配列番号１に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
【００５０】
配列番号１に示される塩基配列中には、塩基番号２１３から塩基番号７６４にかけて、配列番号２に記載したような１８４個のアミノ酸（図２）をコードするオープンリーディング・フレームの存在が確認された。なお、配列番号１の塩基番号２１３〜７６４からなる塩基配列を含むＤＮＡは、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）のＰＰＩａｓｅと７９％の相同性があり、そのＰＰＩａｓｅは細胞内でタンパク質の折りたたみやシャペロン様の働きをしていると考えられるが、これまでのところ該遺伝子が増殖促進機能と関係していることは全く知られていない。
【００５１】
また、配列番号２に記載のタンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列はＭｅｔ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌであり、先にアミノ酸シークエンスにより決定した該タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列と一致することが確認された。
【００５２】
２．スポットＡＡＲ２について
上記のクローン化されたＳａｕ３ＡＩ断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した結果、配列番号５に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
【００５３】
配列番号５に示される塩基配列中には、塩基番号２３１から塩基番号８３６にかけて、配列番号６に記載したような２０２個のアミノ酸（図６）をコードするオープンリーディング・フレームの存在が確認された。なお、配列番号５の塩基番号２３１〜８３６からなる塩基配列を含むＤＮＡは、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）のＳＯＤと８０％の相同性を示しており、そのＳＯＤは抗酸化機能に関与していると考えられるが、増殖促進機能と関係していることは全く知られていない。
【００５４】
また、配列番号６に記載のタンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列はＭｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅであり、先にアミノ酸シークエンスにより決定した該タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列と一致することが確認された。
【００５５】
３．スポットＡＡＲ３について
上記のクローン化されたＳａｕ３ＡＩ断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した結果、配列番号９に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
【００５６】
配列番号９に示される塩基配列中には、塩基番号２０１から塩基番号５７８にかけて、配列番号１０に記載したような１２６個のアミノ酸（図１０）をコードするオープンリーディング・フレームの存在が確認された。
【００５７】
また、配列番号１０に記載のタンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列はＭｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｖａｌであり、先にアミノ酸シークエンスにより決定した該タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列と一致することが確認された。なお、塩基番号２０１〜５７８からなる塩基配列を含むＤＮＡは、磁性細菌（Magnetospirillum magnetotacticum）の遺伝子とアミノ酸配列レベルで２８％の、またアンモニア酸化細菌（Nitrosomonas europaea）の遺伝子とはアミノ酸配列レベルで２３％の相同性を示し、タンパク質をコードする遺伝子であることが推定されたが、その相同性の程度は極めて低いものであったことから、酢酸菌に特異的な新規タンパク質をコードする新規遺伝子ＵＮＫであることが確認された。
【００５８】
４．スポットＡＡＲ４について
上記のクローン化されたＳａｕ３ＡＩ断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した結果、配列番号１３に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
【００５９】
配列番号１３に示される塩基配列中には、塩基番号２４０から塩基番号７３１にかけて、配列番号１４に記載したような１６４個のアミノ酸（図１４）をコードするオープンリーディング・フレームの存在が確認された。また、配列番号１４に記載のタンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列はＭｅｔ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅであり、先にアミノ酸シークエンスにより決定した該タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列と一致することが確認された。
【００６０】
なお、塩基番号２４０〜７３１からなる塩基配列を含むＤＮＡは、大腸菌（Escherichia coli）のｙｂｈＢ遺伝子とアミノ酸配列レベルで６３％の、また赤痢菌（Shigella flexneri）の遺伝子とはアミノ酸配列レベルで６２％の相同性を示し、タンパク質をコードする遺伝子であることが推定されたが、他の微生物でも機能が分かっておらず、また該遺伝子が増殖促進機能と関係していることは全く知られていない。
【００６１】
５．スポットＡＡＲ５について
上記のクローン化されたＳａｕ３ＡＩ断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した結果、配列番号１７に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
【００６２】
配列番号１７に示される塩基配列中には、塩基番号２０１から塩基番号７６１にかけて、配列番号１８に記載したような１８７個のアミノ酸（図１８）をコードするオープンリーディング・フレームの存在が確認された。また、配列番号１８に記載のタンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列はＭｅｔ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏであり、先にアミノ酸シークエンスにより決定した該タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列と一致することが確認された。
【００６３】
なお、塩基番号２０１〜７６１からなる塩基配列を含むＤＮＡは、シュードモナス・シリンジャエ（Pseudomonas syringae）のアルキルハイドロパーオキサイド還元酵素（alkyl hydroperoxide reductase）(以下、ＡＨＤと称する場合もある)の遺伝子とアミノ酸配列レベルで７４％の、またカウロバクター・クレセンタス（Caulobacter crescentus）の該遺伝子とはアミノ酸配列レベルで６７％の相同性を示していた。一般にＡＨＤは過酸化物代謝に関与していると考えられているが、該遺伝子が高濃度酢酸存在下での増殖促進機能に関与していることは全く知られていない。
【００６４】
６．スポットＡＡＲ６について
上記のクローン化されたＳａｕ３ＡＩ断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した結果、配列番号２１に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
【００６５】
配列番号２１に示される塩基配列中には、塩基番号１９３から塩基番号６４２にかけて、配列番号２２に記載したような１５０個のアミノ酸（図２２）をコードするオープンリーディング・フレームの存在が確認された。また、配列番号２２に記載のタンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列はＭｅｔ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇであり、先にアミノ酸シークエンスにより決定した該タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列と一致することが確認された。
【００６６】
なお、塩基番号１９３〜６４２からなる塩基配列を含むＤＮＡは、ブラディリゾビューム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）の機能未知タンパク質（hypothetical protein）(以下、ＵＮＫ２と称する場合もある)の遺伝子とアミノ酸配列レベルで４６％の、またメソリゾビューム・ロッティ（Mesorhizobium loti）の遺伝子とはアミノ酸配列レベルで５０％の相同性を示しており、タンパク質をコードする遺伝子であることが推定されたが、タンパク質の機能がわかっておらず、該遺伝子が高濃度酢酸存在下での増殖促進機能に関与していることは全く知られていない。
【００６７】
７．スポットＡＡＲ７について
上記のクローン化されたＳａｕ３ＡＩ断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位に挿入し、該断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・チェーン・ターミネーション法よって決定した結果、配列番号２５に記載した塩基配列が決定された。配列決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行ない、切断点は全てオーバーラップする様にして行なった。
【００６８】
配列番号２５に示される塩基配列中には、塩基番号２２８から塩基番号７７３にかけて、配列番号２６に記載したような１８２個のアミノ酸（図２６）をコードするオープンリーディング・フレームの存在が確認された。また、配列番号２６に記載のタンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列はＭｅｔ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌであり、先にアミノ酸シークエンスにより決定した該タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列と一致することが確認された。
【００６９】
なお、塩基番号２２８〜７７３からなる塩基配列を含むＤＮＡは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の機能未知タンパク質（hypothetical protein）(以下、ＵＮＫ３と称する場合もある)遺伝子とアミノ酸配列レベルで６１％の、またシノリゾビウム・メリロッティ（Sinorhizobium meliloti）の遺伝子とはアミノ酸配列レベルで６６％の相同性を示し、タンパク質をコードする遺伝子であることが推定されたが、タンパク質の機能がわかっておらず、該遺伝子が高濃度酢酸存在下での増殖促進機能に関与していることは全く知られていない。
【実施例２】
【００７０】
グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の増殖促進機能を有する遺伝子で形質転換した形質転換株での増殖促進効果（その１）
（１）アセトバクター・アセチへの形質転換
上記のようにしてクローン化されたアセトバクター・アルトアセトゲネスＭＨ−２４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４９１）由来のＤＮＡ断片のうち、スポットＡＡＲ１において得られたＤＮＡをＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いてＰＣＲ法により増幅し、増幅したＤＮＡ断片を酢酸菌−大腸菌シャトルベクターｐＧＩ１８の制限酵素ＳｍａＩ切断部位に挿入したプラスミドｐＰＰＩを作製した。プラスミドに挿入された増幅断片の概略を図１に示す。
【００７１】
ＰＣＲ法は具体的には次のようにして実施した。すなわち、鋳型としてアセトバクター・アルトアセチゲネスＭＨ−２４株のゲノムＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー１(その塩基配列を図３に示す)及びプライマー２（その塩基配列を図４に示す）を用いて、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を使用し、９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ３０秒を１サイクルとして、３０サイクルというＰＣＲ条件にてＰＣＲを実施した。
【００７２】
このｐＰＰＩをアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法（例えば、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）」、８７巻、８１３０−８１３４頁、１９９０年参照）によって形質転換した。形質転換株は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１％の酢酸を添加したＹＰＧ寒天培地で選択した。選択培地上で生育したアンピシリン耐性の形質転換株について、定法によりプラスミドを抽出して解析し、増殖促進機能を有する遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した。
【００７３】
（２）形質転換株の増殖促進機能
上記のようにして得られたプラスミドを有するアンピシリン耐性の形質転換株を、酢酸を添加したＹＰＧ培地での生育について、シャトルベクターｐＧＩ１８のみを導入した元株と比較した。
【００７４】
具体的には、エタノール３％、酢酸３％とアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有する１００ｍｌのＹＰＧ培地に、形質転換株とシャトルベクターｐＧＩ１８を有する元株をそれぞれ２株ずつ接種し、３０℃で振とう培養（１５０ｒｐｍ）を行ない、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定した値の平均値を比較した。
【００７５】
その結果、図２９に示すように、形質転換株は増殖が可能であるのに対して、元株は増殖できないことが確認でき、スポットＡＡＲ１において得られたＤＮＡの増殖促進機能が確認できた。
【実施例３】
【００７６】
グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の増殖促進機能を有する遺伝子で形質転換した形質転換株での増殖促進効果（その２）
スポットＡＡＲ２において得られたＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー３(その塩基配列を図７に示す)及びプライマー４（その塩基配列を図８に示す）を用いる以外は実施例２と同様に行い、プラスミドｐＳＯＤを作製した。プラスミドに挿入された増幅断片の概略を図５に示す。
【００７７】
実施例２と同様にして、このｐＳＯＤをアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法によって形質転換した形質転換株が増殖促進機能を有する遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した後、実施例２と同様にして、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定した値の平均値を比較した。その結果、図３０に示すように、形質転換株は増殖が可能であるのに対して、元株は増殖できないことが確認でき、スポットＡＡＲ２において得られたＤＮＡの増殖促進機能が確認できた。
【実施例４】
【００７８】
グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の増殖促進機能を有する遺伝子で形質転換した形質転換株での増殖促進効果（その３）
スポットＡＡＲ３において得られたＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー５(その塩基配列を図１１に示す)及びプライマー６（その塩基配列を図１２に示す）を用いる以外は実施例２と同様に行い、プラスミドｐＵＮＫを作製した。プラスミドに挿入された増幅断片の概略を図９に示す。
【００７９】
実施例２と同様にして、このｐＵＮＫをアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法によって形質転換した形質転換株が増殖促進機能を有する遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した後、実施例２と同様にして、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定した値の平均値を比較した。その結果、図３１に示すように、形質転換株は増殖が可能であるのに対して、元株は増殖できないことが確認でき、スポットＡＡＲ３において得られたＤＮＡの増殖促進機能が確認できた。
【実施例５】
【００８０】
グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の増殖促進機能を有する遺伝子で形質転換した形質転換株での増殖促進効果（その４）
（１）アセトバクター・アセチへの形質転換
スポットＡＡＲ４において得られたＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー７(その塩基配列を図１５に示す)及びプライマー８（その塩基配列を図１６に示す）を用いる以外は実施例２と同様に行い、プラスミドｐＹＢＨを作製した。プラスミドに挿入された増幅断片の概略を図１３に示す。
【００８１】
実施例２と同様にして、このｐＹＢＨをアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法によって形質転換した形質転換株が増殖促進機能を有する遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した後、実施例２と同様にして、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定した値の平均値を比較した。その結果、図３２に示すように、形質転換株は増殖が可能であるのに対して、元株は増殖できないことが確認でき、スポットＡＡＲ４において得られたＤＮＡの増殖促進機能が確認できた。
【実施例６】
【００８２】
グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の増殖促進機能を有する遺伝子で形質転換した形質転換株での増殖促進効果（その５）
スポットＡＡＲ５において得られたＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー９(その塩基配列を図１９に示す)及びプライマー１０（その塩基配列を図２０に示す）を用いる以外は実施例２と同様に行い、プラスミドｐＡＨＲを作製した。プラスミドに挿入された増幅断片の概略を図１７に示す。
【００８３】
実施例２と同様にして、このｐＡＨＲをアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法によって形質転換した形質転換株が増殖促進機能を有する遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した後、実施例２と同様にして、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定した値の平均値を比較した。その結果、図３３に示すように、形質転換株は増殖が可能であるのに対して、元株は増殖できないことが確認でき、スポットＡＡＲ５において得られたＤＮＡの増殖促進機能が確認できた。
【実施例７】
【００８４】
グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の増殖促進機能を有する遺伝子で形質転換した形質転換株での増殖促進効果（その６）
スポットＡＡＲ６において得られたＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー１１(その塩基配列を図２３に示す)及びプライマー１２（その塩基配列を図２４に示す）を用いる以外は実施例２と同様に行い、プラスミドｐＵＮＫ２を作製した。プラスミドに挿入された増幅断片の概略を図２１に示す。
【００８５】
実施例２と同様にして、このｐＵＮＫ２をアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法によって形質転換した形質転換株が増殖促進機能を有する遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した後、実施例２と同様にして、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定した値の平均値を比較した。その結果、図３４に示すように、形質転換株は増殖が可能であるのに対して、元株は増殖できないことが確認でき、スポットＡＡＲ６において得られたＤＮＡの増殖促進機能が確認できた。
【実施例８】
【００８６】
グルコンアセトバクター・エンタニイ由来の増殖促進機能を有する遺伝子で形質転換した形質転換株での増殖促進効果（その７）
スポットＡＡＲ７において得られたＤＮＡを用い、プライマーとしてプライマー１３(その塩基配列を図２７に示す)及びプライマー１４（その塩基配列を図２８に示す）を用いる以外は実施例２と同様に行い、プラスミドｐＵＮＫ３を作製した。プラスミドに挿入された増幅断片の概略を図２５に示す。
【００８７】
実施例２と同様にして、このｐＵＮＫ３をアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３株にエレクトロポレーション法によって形質転換した形質転換株が増殖促進機能を有する遺伝子を保有するプラスミドを保持していることを確認した後、実施例２と同様にして、形質転換株と元株の酢酸添加培地での生育を６６０ｎｍにおける吸光度を測定した値の平均値を比較した。その結果、図３５に示すように、形質転換株は増殖が可能であるのに対して、元株は増殖できないことが確認でき、スポットＡＡＲ７において得られたＤＮＡの増殖促進機能が確認できた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示されるタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質
【請求項２】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示されるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加又は逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質
【請求項３】
以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号５に示される塩基配列のうち、塩基番号２３１〜８３６の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｂ）配列表の配列番号５に示される塩基配列のうち、塩基番号２３１〜８３６の塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（Ｃ）配列表の配列番号５に示される塩基配列のうち、塩基番号２３１〜８３６の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加又は逆位された塩基配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
請求項２、３に記載のＤＮＡの中から選ばれる１又は２以上のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項２、３に記載のＤＮＡの中から選ばれる１又は２以上のＤＮＡの細胞内でのコピー数が増幅されたことにより、酢酸存在下での増殖促進機能が増強された微生物。
【請求項７】
微生物がアセトバクター属、又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の微生物を、アルコールを含有する培地で培養し、該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
【請求項１】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示されるタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質
【請求項２】
以下の（Ａ）又は（Ｂ）に示されるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（Ｂ）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加又は逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質
【請求項３】
以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号５に示される塩基配列のうち、塩基番号２３１〜８３６の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｂ）配列表の配列番号５に示される塩基配列のうち、塩基番号２３１〜８３６の塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（Ｃ）配列表の配列番号５に示される塩基配列のうち、塩基番号２３１〜８３６の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加又は逆位された塩基配列からなり、かつ酢酸存在下での増殖促進機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
請求項２、３に記載のＤＮＡの中から選ばれる１又は２以上のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項２、３に記載のＤＮＡの中から選ばれる１又は２以上のＤＮＡの細胞内でのコピー数が増幅されたことにより、酢酸存在下での増殖促進機能が増強された微生物。
【請求項７】
微生物がアセトバクター属、又はグルコンアセトバクター属の酢酸菌であることを特徴とする請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の微生物を、アルコールを含有する培地で培養し、該培地中に酢酸を生成蓄積せしめることを特徴とする食酢の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【公開番号】特開２０１０−２１３７１４（Ｐ２０１０−２１３７１４Ａ）
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１１０４９７（Ｐ２０１０−１１０４９７）
【出願日】平成２２年５月１２日（２０１０．５．１２）
【分割の表示】特願２００６−５８５３３（Ｐ２００６−５８５３３）の分割
【原出願日】平成１８年３月３日（２００６．３．３）
【出願人】（３９８０６５５３１）株式会社ミツカングループ本社 (157)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月１２日（２０１０．５．１２）
【分割の表示】特願２００６−５８５３３（Ｐ２００６−５８５３３）の分割
【原出願日】平成１８年３月３日（２００６．３．３）
【出願人】（３９８０６５５３１）株式会社ミツカングループ本社 (157)
【Ｆターム（参考）】
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