酸化ストレス関連障害を処置するためのペプチド
単離されたＤＪ−１関連ペプチドが開示され、酸化ストレス関連障害を処置するためにそれを含む医薬組成物も開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、酸化ストレス関連障害を処置するためのペプチド薬剤に関連する。
【背景技術】
【０００２】
フリーラジカルは、生物学的系における著しい破壊を引き起こす極めて反応性の化学種である。フリーラジカルが生物学的分子と無差別的に反応することにより、細胞および細胞構成成分（例えば、ミトコンドリア）の破壊がもたらされ得るので、生理学的プロセスが、細胞がその構造および／または機能を失うことによって影響を受ける。
【０００３】
生物学的系において、フリーラジカルは「活性酸素種」（ＲＯＳ）と一般に呼ばれる。ＲＯＳは酸素含有化学種の代謝により内因性起源に由来し、また、外因性起源（例えば、毒素および大気汚染物質など）に由来する。
【０００４】
生物学的分子に対するＲＯＳの攻撃は「酸化ストレス」と呼ばれる。酸化ストレスは数多くの変性疾患において原因的要因として関係づけられている。
【０００５】
パーキンソン病（ＰＤ）は、遺伝的要因および環境的要因の両方によって引き起こされる多因性疾患である。ほとんどのＰＤ罹患患者が散発性疾患を有するが、いくつかの遺伝的原因が近年では特定されている。ＰＤの遺伝性形態を引き起こす遺伝子の増大する数は、この疾患の根底にある機構に対する新しい洞察のための機会を提供している。これらの遺伝子には、α−シヌクレイン、パーキン、ＰＩＮＫ１、ダーダリン（ＬＲＲＫ２）およびＤＪ−１が含まれる。
【０００６】
ＰＤの病理発生の現在の考えは、ＲＯＳの形成、および、黒質緻密部に対する酸化損傷をもたらす酸化ストレスの開始に集中している。広範囲に及ぶ死後研究は、ＰＤの病理発生における酸化ストレスの関与を裏付ける証拠をもたらしている；具体的には、これらには、脳の鉄含有量における変化、損なわれたミトコンドリア機能、抗酸化性保護系における変化（最も注目されるのが、スーパーオキシドジスムターゼ［ＳＯＤ］および還元型グルタチオン［ＧＳＨ］）、ならびに、脂質、タンパク質およびＤＮＡに対する酸化損傷の証拠が含まれる。鉄は酸化ストレスを誘導する可能性があり、黒質内注入は、進行性パーキンソン症候群のモデルを誘導することが示されている。
【０００７】
多発性硬化症（ＭＳ）は、神経学的機能不全の様々な症状によって特徴づけられる中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症性脱髄疾患である。ＭＳおよびその動物モデル（実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ））は、自己免疫媒介による活性化された免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球およびＢリンパ球など）、ならびに、マクロファージおよびミクログリアから生じると考えられる。病理学的には、ＭＳは、プラークと呼ばれる脱髄性病変をもたらす、ＣＮＳ実質内へのリンパ球およびマクロファージの静脈周囲浸潤によって特徴づけられる。これらのプラークは、ＭＳの顕著な特徴である一方で、希突起神経膠細胞の死、軸索損傷およびニューロン喪失を伴う。ＭＳが炎症性の神経変性疾患であると見なされ得るという見解が、急性プラークから離れた領域におけるニューロン傷害および軸索傷害を明らかにする研究によって、同様にまた、正常に見える白質および灰白質における変化を明らかにする画像化研究によって裏付けられる。
【０００８】
ＭＳの病因は未だ完全には解明されておらず、遺伝的原因および環境的原因の両方に起因すると考えられている。蓄積しつつあるデータは、酸化ストレスがＭＳの病理発生において大きな役割を果たすことを示している。活性酸素種（ＲＯＳ）（これは酸化ストレスをもたらし、主に活性化ミクログリアによって過剰に生じる）が、ＭＳおよびＥＡＥの両方において脱髄および軸索損傷の媒介因子として関係づけられている。
【０００９】
神経伝達物質のグルタミン酸が、主にそのイオンチャネル型受容体の活性化によるＭＳにおける酸化ストレスの起源の１つである。希突起神経膠細胞（ＣＮＳのミエリン産生細胞）はまた、主としてＡＭＰＡ／カイニン酸受容体を介して、グルタミン酸の興奮毒性に対して非常に傷つきやすい。ＲＯＳが、主要な細胞成分（例えば、脂質、タンパク質および核酸など）に対する損傷を引き起こし、これにより、細胞死を生じさせる。ＲＯＳ影響に対する増大した脆弱性をもたらす、ＭＳ患者のＣＮＳにおける弱まった細胞抗酸化防御系はＣＮＳ損傷を増大させるかもしれない。
【００１０】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）はルーゲーリッグ病とも呼ばれ、合衆国では毎年、３００００人もの多くのアメリカ人が冒され、５０００人の新たな症例が発生する進行性の致命的な神経学的疾患である。この障害は、運動ニューロン疾患として知られる一群の障害に属する。随意運動を制御する脳および脊髄における特定の神経細胞が徐々に変性するとき、ＡＬＳが生じる。家族性筋萎縮性側索硬化症（ＦＡＬＳ）は、その家族性背景のみによって、より一般的な散発性異型から区別されるＡＬＳの形態である。
【００１１】
酸化ストレスが運動ニューロンの死の一因であるという仮説を裏付ける実質的証拠が存在する。例えば、抗酸化酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）の変異が疾患を有意な少数派の症例において引き起こすことが発見されている。
【００１２】
ＤＪ−１は、多種多様な生物種を通して至るところで発現され、かつ、高度に保存される１８９アミノ酸の小さいタンパク質である。蓄積しつつあるデータは、様々な細胞プロセスにおけるその関与、とりわけ、酸化ストレスにおけるその関与を明らかにした。ＤＪ−１は、等電点が５．５〜７の間にあるいくつかのイソ型を有することが知られており、アルカリ性イソ型が正常な状態では優勢である。ＲＯＳにさらされたとき、システイン残基の酸化を介して媒介されるＤＪ−１のより酸性のイソ型の蓄積が認められる［Ｂａｎｄｏｐａｄｈｙａｙ Ｒ他、Ｂｒａｉｎ、１２７：４２０〜４３０、２００４；Ｃａｎｅｔ−Ａｖｉｌｅｓ他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０１：９１０３〜９１０８、２００４］。
【００１３】
ＤＪ−１は脳に広く分布し、かつ、非常に発現され、１つだけの機能的系または解剖学的場所に限定されない。ＤＪ−１が、異なる神経伝達物質表現型のニューロンにおいて、また、すべてのグリア細胞タイプ（例えば、星状膠細胞、ミクログリアおよび希突起神経膠細胞など）において発現される。近年、ＤＪ−１の変異が発見され、家族性パーキンソン病（ＰＤ）に関連していた［Ｂｏｎｉｆａｔｉ他、２００３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９９：２５６〜９、２００３］。コントロールに対する散発性ＰＤの脳から得られる脳サンプルの死後研究では、ＤＪ−１の酸性イソ型がＰＤの脳にはより多く存在することが見出された［Ｂａｎｄｏｐａｄｈｙａｙ Ｒ他、Ｂｒａｉｎ、１２７：４２０〜４３０、２００４］。ＤＪ−１の免疫反応性が、多系統萎縮症、アルツハイマー病、進行性核上麻痺、第１７染色体に連鎖するパーキンソン症候群を伴う前頭側頭型認知症、および、ピック病を含む他の神経変性疾患において検出された［Ｂａｎｄｏｐａｄｈｙａｙ Ｒ他、Ｂｒａｉｎ、１２７：４２０〜４３０、２００４；Ｎｅｕｍａｎｎ Ｎ．他、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ（Ｂｅｒｌ）、１０７：４８９〜４９６、２００４；Ｒｉｚｚｕ Ｐ．他、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ、５５：１１３〜１１８、２００４］。
【００１４】
国際公開ＷＯ２００７／１１９２３７は、酸化ストレス関連障害を診断するためのＤＪ−１のレベルおよび活性の分析を議論する。
【００１５】
米国特許出願公開第２００６０１５３８０７号および米国特許出願公開第２００６０１７１９３５号は、ベクター媒介による遺伝子調節、例えば、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病など）を処置するためのＤＪ−１関連薬剤のベクター媒介遺伝子調節を議論する。
【００１６】
国際公開ＷＯ２００８／１１１０６３は、ＤＪ−１依存性ＶＭＡＴ２の転写を神経変性疾患の処置のためにアップレギュレーションすることができるペプチド薬剤を議論する。
【発明の概要】
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、配列番号３に示されるような配列を含む、最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドであって、酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる単離されたペプチドが提供される。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体と、医薬的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物であって、単離されたペプチドが酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる医薬組成物が提供される。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体を含む医薬組成物であって、単離されたペプチドが酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる医薬組成物が提供される。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、酸化ストレス関連障害をその必要性のある対象において処置する方法であって、本発明の医薬組成物の治療効果的な量をそのような対象に投与し、それにより、酸化ストレス関連障害を処置することを含む方法が提供される。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体と、医薬的に許容されるキャリアとが提供され、この場合、単離されたペプチドは酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体が提供され、この場合、単離されたペプチドは酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号３に示されるような配列を含む。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号１４に示されるような配列を含む。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号２４に示される通りである。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に由来する少なくとも５個の連続するアミノ酸を含む。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列に由来する少なくとも５個の連続するアミノ酸を含む。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に由来する最大でも１５個の連続するアミノ酸を含む。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列に由来する最大でも１５個の連続するアミノ酸を含む。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、最大でも２０アミノ酸である。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号３８に示されるような配列を含む。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号３９に示されるような配列を含む。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号１０に示されるような配列を含む。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号１１に示されるような配列を含む。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号１または配列番号３に示されるような配列を含む。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号４０に示されるような配列を含む。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号１３に示されるような配列を含む。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号４１に示されるような配列を含む。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号４２に示されるような配列を含む。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号２に示されるような配列を含む。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、アミノ酸の少なくとも１つが、天然に存在するアミノ酸である。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、アミノ酸の少なくとも１つが合成アミノ酸である。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは細胞浸透性作用因子に結合される。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは共有結合により結合される。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞浸透性作用因子はペプチド薬剤である。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ペプチド細胞浸透性作用因子は、配列番号２１〜配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは配列番号２４〜配列番号３６に示される通りである。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞はニューロン細胞を含む。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＯＳ状態は、６−ヒドロキシドーパミン毒性、過酸化水素毒性、ＵＶ線およびドーパミン毒性からなる群から選択される。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、酸化ストレス関連障害は神経変性疾患である。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、神経変性疾患は、パーキンソン病、多発性硬化症、ＡＬＳ、多系統萎縮症、アルツハイマー病、卒中、進行性核上麻痺、第１７染色体に連鎖するパーキンソン症候群を伴う前頭側頭型認知症、および、ピック病からなる群から選択される。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、酸化ストレス関連障害を処置することにおける使用のためのものである。
【００５３】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の画像を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００５５】
【図１Ａ−１Ｄ】図１Ａ−１Ｄは、ＤＪ−１関連ペプチドＴＡＴ２ａ（配列番号２４）が酸化的毒性傷害に対してインビトロで保護することを例示する棒グラフである。増大した細胞生存能力（Ａ）、低下したミトコンドリア損傷（Ｂ）および増大した代謝活性（Ｃ）が、Ｈ２Ｏ２への暴露によって誘導される酸化ストレスにさらされた後、生理的食塩水単独と比較した場合、ＤＪ−１関連ペプチド処置に関して見出された。細胞増殖が、［３Ｈ］チミジン取り込みを定量することによって測定された。ペプチドへの暴露による増大した細胞増殖が何ら認められなかった（Ｄ）。
【図１Ｅ−１Ｆ】図１Ｅ−１Ｆは、ＤＪ−１関連ペプチドＴＡＴ２ａ（配列番号２４）が酸化的毒性傷害に対してインビトロで保護することを例示する棒グラフである。６−ヒドロキシドーパミン毒性およびドーパミン毒性に対する保護が図１Ｅおよび図１Ｆにそれぞれ示される。示された実験はヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対して行われ、少なくとも３回繰り返された。＊ｐ＜０．０５（ビヒクルにより処置され、同じ毒性傷害にさらされたコントロール細胞と比較した場合）。
【００５６】
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａ−２Ｂは、ＤＪ−１関連ペプチドが６−ヒドロキシドーパミン毒性に対してインビトロで保護することを例示する棒グラフである。増大した代謝活性が、生理的食塩水と比較した場合、６−ヒドロキシドーパミン暴露前に、ヒト神経芽細胞腫細胞ＳＨ−ＳＹ５ＹがＤＪ−１関連ペプチドにより前処理されたときに見出された。ＤＪ−１関連ペプチド＃２の誘導体による６−ヒドロキシドーパミン毒性に対する保護が図２Ａに示され、ＤＪ−１関連ペプチド＃５の誘導体による６−ヒドロキシドーパミン毒性に対する保護が図２Ｂに示される。変異ペプチドは、図２Ａ〜図２Ｂに示されるように、６−ヒドロキシドーパミン毒性に対して保護することができなかった。示された実験はヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対して行われ、少なくとも３回繰り返された。＊ｐ＜０．０５（同じ毒性傷害にさらされたコントロール細胞と比較した場合）。
【００５７】
【図３】図３は、ＤＪ−１関連ペプチドが６−ヒドロキシドーパミン毒性に対してインビトロで保護することを例示する。増大した生存能力が、生理的食塩水と比較した場合、６−ヒドロキシドーパミン暴露前に、ヒト神経芽細胞腫細胞ＳＨ−ＳＹ５ＹがＤＪ−１関連ペプチドＩＩ（配列番号８）により前処理されたときに見出された。＊ｐ＜０．０５（同じ毒性傷害にさらされたコントロール細胞と比較した場合）。
【００５８】
【図４Ａ】図４Ａは、ＤＪ−１関連ペプチドが血清欠乏に対して保護することを例示する棒グラフである。増大した生存能力が、生理的食塩水と比較した場合、血清欠乏期間中に、ヒト神経芽細胞腫細胞ＳＨ−ＳＹ５ＹがＤＪ−１関連ペプチドＩ（配列番号１０）、ＤＪ−１関連ペプチドＩＩ（配列番号８）およびＤＪ−１関連ペプチドｓｈｏｒｔ２ａ（配列番号９）により前処理されたときに見出された。＊ｐ＜０．０５。
【００５９】
【図４Ｂ】図４Ｂは、コントロールのＤＪ−１関連ペプチドが酸化的な毒素誘導毒性に対して保護しないことを例示する棒グラフである。細胞が、コントロールペプチドのＸおよびＹ（神経保護を誘導することが見込まれなかった配列）による前処理を伴って、または伴うことなく、増大する用量の６−ヒドロキシドーパミン（０〜２５ｕＭ）に、または、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２、０〜５０ｕＭ）にさらされた。示された実験はヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対して行われ、３回繰り返された。有意差が、ビヒクルにより処置され、同じ毒性用量にさらされたコントロール細胞と比較して何ら認められなかった。
【００６０】
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａ−５Ｂは、初代培養物におけるＴＡＴ２ａ（配列番号２４）ペプチドによる、Ｈ２Ｏ２および６−ヒドロキシドーパミンの毒性に対する保護を例示する棒グラフである。増大する濃度の過酸化水素および６−ヒドロキシドーパミンに対する類似した保護が、生後の野生型Ｃ５７／ｂｌマウスの皮質から得られる初代混合ニューロン・グリア培養物において明らかにされた。それぞれの実験が３回繰り返された。＊ｐ＜０．０５（ビヒクルにより処置され、同じ毒性傷害にさらされたコントロール細胞と比較した場合）。
【００６１】
【図６】図６は、ＤＪ−１関連ペプチドＩ（配列番号２３）およびＤＪ−１関連ペプチドＩＩ（配列番号８）が、ニューロン分化したマウス神経幹細胞において酸化傷害に対して保護することを例示する棒グラフである。増大した生存能力が、生理的食塩水と比較した場合、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）暴露前に、これらの細胞がＤＪ−１関連ペプチドＩまたはＤＪ−１関連ペプチドＩＩにより前処理されたときに見出された。＊ｐ＜０．０５（同じ毒性傷害にさらされたコントロール細胞と比較した場合）。
【００６２】
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａ−７Ｂは、α−シヌクレインについての免疫組織化学染色を、ナイーブ神経芽細胞腫細胞（図７Ａ）、および、Ａ５３Ｔ変異型α−シヌクレインにより安定的にトランスフェクションされた細胞（図７Ｂ）において例示する写真である。α−シヌクレインがＡｌｅｘａ−５６８コンジュゲート化二次抗体によって赤く染まる。核がＤＡＰＩによって対比染色された（青色）。実験が三連で３回繰り返された。
【００６３】
【図８】図８は、α−シヌクレインのグラフィック定量を例示する棒グラフ、ならびに、モックトランスフェクションされた神経芽細胞腫細胞、および、野生型（ＷＴ）α−シヌクレインまたはＡ５３Ｔ変異型α−シヌクレインにより安定的にトランスフェクションされた細胞におけるα−シヌクレインについての代表的なウエスタンブロットの写真である。実験が三連で３回繰り返された。
【００６４】
【図９】図９は、変異型α−シヌクレインを過剰発現する細胞におけるペプチド＃２の誘導体による、６−ヒドロキシドーパミン毒性に対する保護を例示する棒グラフである。著しく増大した代謝活性が、ＤＪ−１関連ペプチド＃２の誘導体により処理されたとき、６−ヒドロキシドーパミンにさらされた、Ａ５３Ｔα−シヌクレインを過剰発現する神経芽細胞腫細胞において明らかにされた。それぞれの実験が３回繰り返された。＊ｐ＜０．０５（ビヒクルにより処置され、同じ毒性傷害にさらされたコントロール細胞と比較した場合）。
【００６５】
【図１０】図１０は、変異型α−シヌクレインを過剰発現する細胞におけるペプチドＴＡＴ２ａ（配列番号２４）による、過酸化水素毒性に対する保護を例示する棒グラフである。著しく増大した生存能力が、ＤＪ−１関連ペプチドＴＡＴ２ａ（配列番号２４）により処理されたとき、過酸化水素にさらされた、Ａ５３Ｔα−シヌクレインを過剰発現する神経芽細胞腫細胞において明らかにされた。＊ｐ＜０．０５（ビヒクルにより処置され、同じ毒性傷害にさらされたコントロール細胞と比較した場合）。
【００６６】
【図１１】図１１は、ＤＪ−１関連ペプチドがドーパミン毒性に対してインビトロで保護することを例示する棒グラフである。細胞が、ＤＪ−１関連ペプチド＃２の誘導体による前処理を伴って、または伴うことなく、増大する用量のドーパミン（０〜５０ｕＭ）にさらされた。示された実験はヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対して行われ、３回繰り返された。＊ｐ＜０．０５（ビヒクルにより処置され、同じドーパミン用量にさらされたコントロール細胞と比較した場合）。
【００６７】
【図１２Ａ−１２Ｂ】図１２Ａ−１２Ｂは、ＤＪ−１関連ペプチドがＮＳＣ−３４細胞において過酸化水素およびＳＩＮ−Ｉの毒性に対して保護することを例示する棒グラフである。増大した生存能力が、生理的食塩水と比較した場合、過酸化水素（図１２Ａ）またはＳＩＮ−Ｉ（図１２Ｂ）の毒性暴露前に、ＮＳＣ−３４細胞がＤＪ−１関連ペプチドＴＡＴ２ａ（配列番号２４）またはＤＪ−１関連ペプチドＴＡＴ２ｂ（配列番号２５）により前処理されたときに見出された。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（同じ毒性傷害にさらされたコントロール細胞と比較した場合）。
【００６８】
【図１３】図１３は、ＤＪ−１関連ペプチド＃２の誘導体がＡＬＳの細胞モデルにおいて保護することを例示する棒グラフである。増大した代謝活性が、生理的食塩水と比較した場合、ＳＩＮ−Ｉ毒性暴露前に、ＮＳＣ−３４細胞がＤＪ−１関連ペプチド＃２の誘導体により前処理されたときに見出された。変異ペプチド＃２は、示されるように、ＳＩＮ−Ｉ毒性に対して保護することができなかった。示された実験は３回繰り返された。＊ｐ＜０．０５（同じ毒性傷害にさらされたコントロール細胞と比較した場合）。
【００６９】
【図１４】図１４は、ＤＪ−１関連ペプチドがＵＶ線に対して細胞モデルにおいて保護することを例示する棒グラフである。増大した代謝活性が、生理的食塩水と比較した場合、ＵＶ線暴露前に、ＨａＣａＴ細胞がＤＪ−１関連ペプチドＩＩ（配列番号８）またはＤＪ−１関連ペプチドＴＡＴ２ａ（配列番号２４）により前処理されたときに見出された。示された実験は３回繰り返された。＊ｐ＜０．０５（コントロールと比較した場合）。
【００７０】
【図１５Ａ−１５Ｂ】図１５Ａ−１５Ｂは、線条体内へのＴＡＴ２ａペプチド注入がインビボ６−ヒドロキシドーパミン片側パーキンソン症候群マウスモデルに対して保護することを例示する棒グラフである。生理的食塩水に溶解された１００μＭペプチドＴＡＴ２ａ（配列番号２４）または生理的食塩水単独の２μｌが６−ヒドロキシドーパミン傷害化の１時間前に右側線条体に定位注入された。傷害後２週間および４週間での著しく低下したアンフェタミン誘発回転が、コントロールと比較した場合、ペプチド処置マウスにおいて見出された。＊ｐ＜０．０１（図１５Ａ）。そのうえ、傷害マウスのより少ない割合がアンフェタミン注入に応答して回転した（図１５Ｂ）。実験が２回繰り返された。
【００７１】
【図１６Ａ−１６Ｂ】図１６Ａ−１６Ｂは、静脈内（ＩＶ）へのペプチドＴＡＴ２ａ（配列番号２４）注入がインビボ６−ヒドロキシドーパミン片側パーキンソン症候群マウスモデルに対して保護することを例示する棒グラフである。５０μｇのペプチドＴＡＴ２ａ（配列番号２４）または生理的食塩水単独が６−ヒドロキシドーパミン傷害化の４時間前にＩＶ注入された。著しく低下したアンフェタミン誘発回転が、コントロールと比較した場合、ＩＶペプチド処置マウスにおいて見出された。＊ｐ＜０．０１（図１６Ａ）。傷害マウスのより少ない割合がアンフェタミン注入に応答して回転した（図１６Ｂ）。
【００７２】
【図１７】図１７は、ペプチド（配列番号２５）の皮下注入がＭＰＴＰパーキンソンモデルに対して保護することを例示する棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
多くの神経変性障害が酸化ストレスに関連すると考えられる（例えば、パーキンソン病および卒中など）。蓄積しつつあるデータは、ＤＪ−１（１８９アミノ酸の小さいタンパク質）が、様々な細胞プロセスに、とりわけ、酸化ストレスに関与することを明らかにしており、神経変性疾患を処置するためのその使用が提案されている。
【００７４】
本開示は、そのいくつかの実施形態において、酸化ストレス関連障害を処置するために有用であるＤＪ−１関連ペプチドに関連する。治療活性を構成するＤＪ−１タンパク質における２つの最小コア配列が本開示に関連して特定されている。そのようなコア配列の１つまたは複数を含んだ数多くのペプチドが調製されており、神経保護特性が明らかにされている。
【００７５】
具体的には、これら２つのコア配列の少なくとも１つを含むＤＪ−１関連ペプチドは、インビトロ細胞系における、６−ヒドロキシドーパミン、ドーパミンおよびＨ２Ｏ２を含む毒性傷害に対して保護することができ（図１Ａ〜図１Ｆ、図２Ａ〜図２Ｂ、図３、図１１、図１２Ａ）、同様にまた、血清欠乏に対して保護することができ（図４Ａ）、一方、特定されたコア配列のどちらも含まない他のＤＪ−１関連ペプチドはそのような神経保護特性を何ら構成しないこと（図４Ｂ）が見出されている。実験が初代培養物（図５Ａ〜図５Ｂ）および分化した神経幹細胞（図６）において繰り返され、同じ結果であった。
【００７６】
本開示の別の局面が、変異型Ａ５３Ｔα−シヌクレインを神経芽細胞腫細胞において過剰発現する、パーキンソン病のインビトロ細胞モデルに関連する。本開示の実施形態のＤＪ−１関連ペプチドは、このインビトロ細胞モデルにおいて６−ヒドロキシドーパミン毒性（図９）およびＨ２Ｏ２毒性（図１０）に対して保護することが明らかにされた。
【００７７】
本開示のさらに別の局面が、ＡＬＳおよびＵＶ照射についての細胞モデルに関連し、このモデルにおいて、本開示の実施形態のＤＪ−１関連ペプチドが、これらのアッセイにおいて同様に保護することが明らかにされた（図１３および図１４）。
【００７８】
最後に、本開示の実施形態のＤＪ−１関連ペプチドがパーキンソン病のインビボモデルにおいて試験される。ある種のＤＪ−１関連ペプチドが局所投与（図１５Ａ〜図１５Ｂ）および全身投与（図１６Ａ〜図１６Ｂ）の両方の後で治療活性を示した。
【００７９】
まとめると、本開示によれば、ＤＪ−１に由来するペプチド（「ＤＪ−１関連ペプチド」）が酸化ストレス関連障害の処置のために使用され得ることが見出されている。表現「酸化ストレス状態」は、本明細書中で使用される場合、正常なレベルを超えて活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルを上昇させる状態を示す。述べられるように、これは、抗酸化剤の不足から、または、多すぎるフリーラジカルから生じるかもしれない。例示的なＲＯＳ状態は、６−ヒドロキシドーパミン毒性、過酸化水素毒性、ＵＶ線およびドーパミン毒性を含むが、これらに限定されない。
【００８０】
いくつかの実施形態において、本開示のいくつかの局面は、本明細書中により詳しく記載されるように、長さが最大でも２０アミノ酸である短いＤＪ−１関連ペプチドに関連する。より具体的には、本開示の１つの局面によれば、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたＤＪ−１関連ペプチドまたはそのペプチド模倣体（ただし、単離されたペプチドは酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる）が提供される。
【００８１】
ＫＧＡＥＥＭＥＴＶＩＰＶＤＶＭＲＲＡＧＩ−（配列番号１；これはまた、本明細書中では＃ペプチド２として示される）
本開示のこの局面の実施形態によれば、ペプチドは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に由来する少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個の連続するアミノ酸を含む。
【００８２】
ＫＧＡＥＥＭＥＴＶＩＰＶＤＶＭＲＲＡＧＩ−（配列番号１）
本開示のこの局面の１つの実施形態によれば、ペプチドは、配列番号１の最大でも１０個の連続するアミノ酸を含む。
【００８３】
本開示のこの局面の他の実施形態によれば、ペプチドは、配列番号１の最大でも１５個の連続するアミノ酸を含む。
【００８４】
本開示のこの局面のペプチドに含まれる例示的配列には、配列番号１〜配列番号１２、配列番号３８または配列番号３９が含まれる。
【００８５】
本開示の別の局面によれば、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体（ただし、単離されたペプチドは酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる）が提供される。
【００８６】
ＥＧＰＹＤＶＶＶＬＰＧＧＮＬＧＡＱＮＬＳ−（配列番号２；これはまた、本明細書中ではペプチド＃５として示される）
本開示のこの局面の実施形態によれば、ペプチドは、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列に由来する少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個の連続するアミノ酸を含む。
【００８７】
本開示のこの局面の１つの実施形態によれば、ペプチドは、配列番号２の最大でも１０個の連続するアミノ酸を含む。
【００８８】
本開示のこの局面の他の実施形態によれば、ペプチドは、配列番号２の最大でも１５個の連続するアミノ酸を含む。
【００８９】
本開示のこの局面のペプチドに含まれる例示的配列には、配列番号２、配列番号１３〜配列番号２０、配列番号４０〜配列番号４２が含まれる。
【００９０】
本明細書において使用される用語「ペプチド」には、天然のペプチド（分解産物または合成的に合成されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドのいずれか）、ペプチド模倣体（典型的には合成的に合成されたペプチド）そしてポリペプチドアナログであるペプトイドおよびセミペプトイドを含む、天然または合成アミノ酸のポリマーを示し、これらは、例えば、ペプチドを体内でより安定化させる修飾、またはペプチドの細胞浸透能力を高める修飾を有し得る。
【００９１】
そのような修飾には、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ポリペプチド結合の修飾（ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨまたはＣＦ＝ＣＨを含むが、これらに限定されない）、骨格の修飾、および残基の修飾が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド模倣体化合物を調製するための方法はこの分野では十分に知られており、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に具体的に記載される（これは、全体が本明細書中に示されるように参考として組み込まれる）。これに関するさらなる詳細が本明細書中下記に示される。
【００９２】
ポリペプチド内のポリペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、ｏ−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは任意のアルキル（例えば、メチル）である）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ポリペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子において自然界で示される「通常」の側鎖である）によって置換することができる。
【００９３】
これらの修飾は、ポリペプチド鎖に沿った結合の任意のところに存在させることができ、そして同時に数カ所（２カ所〜３カ所）においてさえ存在させることができる。
【００９４】
天然の芳香族アミノ酸（Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）は、フェニルグリシン、Ｔｉｃ、ナフチルアラニン（Ｎａｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ−メチル−Ｔｙｒなどの合成された非天然型の酸に置換することができる。
【００９５】
上述のことに加えて、本発明のポリペプチドは一以上の修飾されたアミノ酸または一以上の非アミノ酸モノマー（例えば脂肪酸、複合体炭水化物など）も含むことができる。
【００９６】
従って、本明細書において使用される用語「アミノ酸」には、２０個の天然に存在するアミノ酸；インビボで多くの場合には翻訳後修飾されたそのようなアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンを含む）；および他の非通常型アミノ酸（２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンを含むが、これらに限定されない）が含まれることが理解される。さらに、用語「アミノ酸」には、この用語が本明細書中で定義されるように少なくとも１つの付加アミノ酸にペプチド結合またはペプチド結合アナログを介して連結されるＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸（異性体）の両方が含まれる。
【００９７】
下記の表１〜表２には、天然に存在するアミノ酸のすべて（表１）および非通常型アミノ酸または修飾型アミノ酸（表２）が示される。
【００９８】
【００９９】
本発明のペプチドのアミノ酸は、保存的または非保存的のどちらでも置換され得る。
【０１００】
用語「保存的置換」は、本明細書中で使用される場合、ペプチドにおける天然配列に存在するアミノ酸が、類似する立体的特性を有する天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸あるいはペプチド模倣体により置き換えられることを示す。置換されることになる天然アミノ酸の側鎖が極性または疎水性のどちらかである場合、保存的置換は、（置換されたアミノ酸の側鎖と同じ立体的特性を有することに加えて）同様に極性または疎水性である天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、または、ペプチド模倣体成分によるものでなければならない。
【０１０１】
天然に存在するアミノ酸は典型的には、それらの特性に従ってグループ分けされるので、天然に存在するアミノ酸による保存的置換は、本発明によれば、立体的に類似する非荷電アミノ酸による荷電アミノ酸の置換は保存的置換として見なされるという事実を念頭において容易に決定することができる。
【０１０２】
天然に存在しないアミノ酸による保存的置換を生じさせるために、この技術分野では広く知られているアミノ酸アナログ（合成アミノ酸）を使用することもまた可能である。天然に存在するアミノ酸のペプチド模倣体が、当業者に知られている文献において十分に記録されている。
【０１０３】
保存的置換に影響するとき、代用アミノ酸は、元のアミノ酸と同じまたは類似する官能基を側鎖に有しなければならない。
【０１０４】
表現「非保存的置換」は、本明細書中で使用される場合、親配列に存在するようなアミノ酸が、異なる電気化学的特性および／または立体的特性を有する別の天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸によって置き換えられることを示す。したがって、代用アミノ酸の側鎖は、置換される天然アミノ酸の側鎖よりも著しく大きく（または小さく）することができ、かつ／または、置換されるアミノ酸とは著しく異なる電子的特性を有する官能基を有することができる。このタイプの非保存的置換の例には、アラニンに代わるフェニルアラニンまたはシクロヘキシルメチルグリシンへの置換、グリシンに代わるイソロイシンへの置換、アスパラギン酸に代わる−ＮＨ−ＣＨ［（−ＣＨ２）５−ＣＯＯＨ］−ＣＯ−への置換が含まれる。本発明の範囲に含まれるそれらの非保存的置換は、抗菌特性を有するペプチドを依然として構成する非保存的置換である。
【０１０５】
述べられたように、本発明のペプチドのＮ末端およびＣ末端は官能基によって保護することができる。好適な官能基が、ＧｒｅｅｎおよびＷｕｔｓ、“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、第５章および第７章、１９９１）に記載される（その教示は参照によって本明細書中に組み込まれる）。好ましい保護基は、保護基に結合した化合物の細胞内への輸送を、例えば、化合物の親水性を低下させ、また、化合物の親油性を増大させることによって容易にするものである。
【０１０６】
これらの成分は、細胞の内部で、加水分解または酵素的のどちらかによってインビボで切断され得る。ヒドロキシル保護基には、エステル、カルボナートおよびカルバマート保護基が含まれる。アミン保護基には、Ｎ末端保護基について上記で記載されるように、アルコキシカルボニル基およびアリールオキシカルボニル基が含まれる。カルボン酸保護基には、Ｃ末端保護基について上記で記載されるように、脂肪族エステル、ベンジル型エステルおよびアリールエステルが含まれる。１つの実施形態において、本発明のペプチドにおける１つまたは複数のグルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基の側鎖におけるカルボン酸基が、好ましくはメチルエステル、エチルエステル、ベンジルエステルまたは置換ベンジルエステルにより保護される。
【０１０７】
Ｎ末端保護基の例には、アシル基（−ＣＯ−Ｒ１）およびアルコキシカルボニル基またはアリールオキシカルボニル基（−ＣＯ−Ｏ−Ｒ１）（式中、Ｒ１は、脂肪族基、置換脂肪族基、ベンジル基、置換ベンジル基、芳香族基または置換芳香族基である）が含まれる。アシル基の具体的な例には、アセチル、（エチル）−ＣＯ−、ｎ−プロピル−ＣＯ−、ｉｓｏ−プロピル−ＣＯ−、ｎ−ブチル−ＣＯ−、ｓｅｃ−ブチル−ＣＯ−、ｔ−ブチル−ＣＯ−、ヘキシル、ラウロイル、パルミトイル、ミリストイル、ステアリル、オレオイル、フェニル−ＣＯ−、置換フェニル−ＣＯ−、ベンジル−ＣＯ−および（置換ベンジル）−ＣＯ−が含まれる。アルコキシカルボニル基およびアリールオキシカルボニル基の例には、ＣＨ３−Ｏ−ＣＯ−、（エチル）−Ｏ−ＣＯ−、ｎ−プロピル−Ｏ−ＣＯ−、ｉｓｏ−プロピル−Ｏ−ＣＯ−、ｎ−ブチル−Ｏ−ＣＯ−、ｓｅｃ−Ｏ−ブチル−ＣＯ−、ｔ−ブチル−Ｏ−ＣＯ−、フェニル−Ｏ−ＣＯ−、置換フェニル−Ｏ−ＣＯ−およびベンジル−Ｏ−ＣＯ−、（置換ベンジル）−Ｏ−ＣＯ−が含まれる。アダマンタン、ナフタレン、ミリストレイル、ツルエン、ビフェニル、シンナモイル、ニトロベンゾイル、トルオイル、フロイル、ベンゾイル、シクロヘキサン、ノルボルナン、Ｚ−カプロン酸。Ｎ−アシル化を促進させるために、１個〜４個のグリシン残基を分子のＮ末端に存在させることができる。
【０１０８】
化合物のＣ末端におけるカルボキシル基は、例えば、アミド（すなわち、Ｃ末端におけるヒドロキシル基が、−ＮＨ２、−ＮＨＲ２および−ＮＲ２Ｒ３により置換される）またはエステル（すなわち、Ｃ末端におけるヒドロキシル基が−ＯＲ２により置換される）によって保護することができる。Ｒ２およびＲ３は独立して、脂肪族基、置換脂肪族基、ベンジル基、置換ベンジル基、アリール基または置換アリール基である。加えて、窒素原子と一緒になって、Ｒ２およびＲ３は、約０個〜２個のさらなるヘテロ原子（例えば、窒素、酸素またはイオウなど）を有するＣ４〜Ｃ８の複素環式環を形成することができる。好適な複素環式環の例には、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリノ、チオモルホリノまたはピペラジニルが含まれる。Ｃ末端保護基の例には、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＮＨ（エチル）、−Ｎ（エチル）２、−Ｎ（メチル）（エチル）、−ＮＨ（ベンジル）、−Ｎ（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（ベンジル）、−ＮＨ（フェニル）、−Ｎ（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（フェニル）、−ＯＣＨ３、−Ｏ−（エチル）、−Ｏ−（ｎ−プロピル）、−Ｏ−（ｎ−ブチル）、−Ｏ−（ｉｓｏ−プロピル）、−Ｏ−（ｓｅｃ−ブチル）、−Ｏ−（ｔ−ブチル）、−Ｏ−ベンジルおよび−Ｏ−フェニルが含まれる。
【０１０９】
本発明のＤＪ−１関連ペプチドは浸透性作用因子に（共有結合または非共有結合のどちらによってでも）結合することができる。
【０１１０】
本明細書中で使用される場合、表現「浸透性作用因子」は、細胞膜を横断する結合ペプチドのいずれかの転位置を高める作用因子を示す。
【０１１１】
１つの実施形態によれば、浸透性作用因子はペプチドであり、ペプチド結合を介して（直接的または非直接的のどちらでも）ＤＪ−１関連ペプチドに結合される。
【０１１２】
典型的には、ペプチド浸透性作用因子は、正荷電アミノ酸（例えば、リシンまたはアルギニンなど）の比較的大きい存在量を含有するアミノ酸組成を有するか、または、極性／荷電アミノ酸および非極性の疎水性アミノ酸の交互パターンを含有する配列を有するかのどちらかである。
【０１１３】
ペプチド浸透性作用因子の例には、配列番号２１〜配列番号２３に示されるものが含まれる。限定されない例として、細胞浸透ペプチド（ＣＰＰ）配列を、細胞内浸透を高めるために使用することができる。ＣＰＰは、ＴＡＴの短い形態および長い形態（ＹＧＲＫＫＲＲ−配列番号２１、および、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−配列番号２２）、ならびに、ＰＴＤ（ＲＲＱＲＲ−配列番号２３）を含むことができる。しかしながら、開示はそのように限定されず、当業者によって知られているように、好適な浸透性作用因子はどれも使用することができる。
【０１１４】
具体的な実施形態によれば、本発明のペプチドは最大でも２５アミノ酸である（これには、何らかのさらなる結合した配列（例えば、上記で記載されるような細胞浸透ペプチドなど）と一緒にＤＪ−１関連ペプチドが含まれる）。
【０１１５】
本発明のペプチドはまた、非アミノ酸成分を含むことができる；例えば、ペプチドに結合される疎水性成分（様々な線状、分岐型、環式、多環式または複素環式の炭化水素および炭化水素誘導体）；ペプチド以外の浸透性作用因子；とりわけ、化合物が線状である場合には、分解を低下させるために化合物の末端に結合される様々な保護基など。化合物に存在する化学的（非アミノ酸）基は、様々な生理学的特性を改善するために含まれ得る：例えば、低下した分解またはクリアランス；様々な細胞ポンプによる低下した反発など、免疫原性活性を改善する、様々な投与様式を改善する（例えば、様々なバリアを介した浸透、消化管を介した浸透などを可能にする様々な配列の結合など）；増大した特異性、増大した親和性、低下した毒性およびその他。
【０１１６】
本発明のペプチドのアミノ酸配列成分を他の非アミノ酸作用因子に結合することは、本発明の最終的なペプチドを製造するために、共有結合により連結することによって；非共有結合による複合体化によって、例えば、分解または切断されて、これにより、持続した放出が可能である化合物を生じさせることができる疎水性ポリマーへの複合体化によって；ペプチドのアミノ酸部分をリポソームまたはミセルに閉じ込めることによって行うことができる。連携を、本発明の最終的なペプチドを製造するために、アミノ酸配列を他方の成分（リポソーム、ミセル）の中に閉じ込めることによって、または、アミノ酸配列をポリマー内に含浸することによって行うことができる。
【０１１７】
本発明のペプチドは線状または環状とすることができる（環化は安定性を改善することができる）。環化を、この技術分野で知られているどのような手段によってでも行うことができる。化合物が主としてアミノ酸から構成される場合、環化は、Ｎ末端からＣ末端への環化、Ｎ末端から側鎖への環化およびＮ末端から骨格への環化、Ｃ末端から側鎖への環化、Ｃ末端から骨格への環化、側鎖から骨格への環化および側鎖から側鎖への環化、同様にまた、骨格から骨格への環化により行うことができる。ペプチドの環化はまた、ペプチドに含まれる非アミノ酸有機成分を介して行うことができる。
【０１１８】
本発明のペプチドは、例えば、標準的な固相技術を使用することなどによって生化学的に合成することができる。これらの方法には、もっぱらの固相合成、部分的固相合成法、フラグメント縮合、古典的溶液合成が含まれる。固相ポリペプチド合成手順がこの技術分野では広く知られており、Ｊｏｈｎ Ｍｏｒｒｏｗ ＳｔｅｗａｒｔおよびＪａｎｉｓ Ｄｉｌｌａｈａ Ｙｏｕｎｇによってさらに記載される（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８４）。
【０１１９】
大規模ペプチド合成がＡｎｄｅｒｓｓｏｎによって記載される（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２０００、５５（３）：２２７〜５０）。
【０１２０】
合成ペプチドは調製用高速液体クロマトグラフィーによって精製することができ［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ Ｔ．（１９８３）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．］、その組成をアミノ酸配列決定によって確認することができる。
【０１２１】
組換え技術もまた、本発明のペプチドを作製するために使用することができる。本発明のペプチドを、組換え技術を使用して製造するためには、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドが核酸発現ベクターに連結される。この場合、核酸発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列を、本発明のポリペプチドの構成的転写、組織特異的転写または誘導可能な転写を宿主細胞において導くために好適なシス調節配列（例えば、プロモーター配列）の転写制御下に含む。
【０１２２】
宿主細胞において合成可能であることに加えて、本発明のペプチドはまた、インビトロ発現システムを使用して合成することができる。これらの方法はこの技術分野では広く知られており、また、このシステムの構成成分が市販されている。
【０１２３】
述べられるように、本発明のペプチドは、酸化ストレス関連障害を処置するために使用することができる。
【０１２４】
本明細書中で使用される場合、表現「酸化ストレス」は、酸化剤の数が抗酸化剤の数を上回る望ましくない不均衡を示す。ＲＯＳ産生の速度が、存在する抗酸化性防御を圧倒するならば、この状況が生じ得る。そのような環境では、ＲＯＳ産生における一層より大きい増大をもたらし得る一連の細胞応答が生じ得る。過度なＲＯＳ産生およびその異なった効果的でない調節は細胞および組織にとって有害となり得るので、究極的には細胞死（アポトーシス）を引き起こし得る細胞損傷を誘導する。酸化ストレス関連損傷はまた、アポトーシスの代わりに細胞の増殖を生じさせ得る、細胞の構造的一体性および機能的一体性に対する望ましくない変化を引き起こし得る。加えて、酸化損傷を受けた、細胞の高分子は、疾患を引き起こし得る免疫応答を誘発し得る。一般には、Ｄ．Ｇ．Ｌｉｎｄｓａｙ他（２００２）、Ｍｏｌ．Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｅｄ．、２３：１〜３８を参照のこと（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０１２５】
酸化ストレスが、疾患を開始させるか、または、そうでなければ、疾患を生じさせることに関わっているかもしれないことが理解されるであろう。代替において、または、加えて、疾患の進行が何らかの生じた酸化ストレスによって影響され得る。
【０１２６】
したがって、表現「酸化ストレス関連障害」は、本明細書中で使用される場合、その発症または進行が酸化ストレスによって促進される疾患または医学的状態（症候群を含む）を示す。酸化ストレスは、多くの神経学的疾患、心臓疾患、悪性疾患および加齢関連疾患の病理発生に関わっていると考えられるので、本発明では、すべてのそのような疾患が意図され、これらには、例えば、アテローム性動脈硬化、自己免疫疾患、ガン、心臓血管疾患、白内障、認知症、糖尿病および糖尿病性血管症、ならびに、神経変性疾患が含まれる。
【０１２７】
例示的な神経変性疾患には、パーキンソン病、多発性硬化症、ＡＬＳ、多系統萎縮症、アルツハイマー病、卒中、進行性核上麻痺、第１７染色体に連鎖するパーキンソン症候群を伴う前頭側頭型認知症、および、ピック病が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２８】
本発明のペプチドは、それ自体で、あるいは、本発明のペプチドが好適なキャリアまたは賦形剤と混合される医薬組成物の一部として提供され得る。
【０１２９】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。
【０１３０】
本明細書中において、用語「有効成分（活性成分）」は、生物学的効果を説明することができるＤＪ−１関連ペプチドを示す。
【０１３１】
本明細書中以降、表現「生理学的に許容されるキャリア」および表現「医薬的に許容されるキャリア」は、交換可能に使用され得るが、生物に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された化合物の生物学的な活性および性質を妨げないキャリアまたは希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に包含される。
【０１３２】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１３３】
薬物の配合および投与のための技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出されることができ、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【０１３４】
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に経鼻送達、腸管送達、または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射、例えば、総冠状動脈中への右又は左心室中への心内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が含まれることができる。
【０１３５】
中枢神経系（ＣＮＳ）への薬物送達のための従来からの取り組みには、下記が含まれる：神経外科的方策（例えば、脳内注射、脳室内注入）；ＢＢＢの内因性輸送経路の１つを利用する試みでの薬剤の分子的操作（例えば、ＢＢＢを自身が越えることができない薬剤との組合せで、内皮細胞表面分子に対する親和性を有する輸送ペプチドを含むキメラな融合タンパク質の製造）；薬剤の脂質溶解性を増大させるために設計される薬理学的方策（例えば、脂質キャリアまたはコレステロールキャリアへの水溶性薬剤のコンジュゲート化）；および、高浸透圧破壊によるＢＢＢの一体性の一時的破壊（これは、頸動脈へのマンニトール溶液の注入、または、生物学的活性薬剤（例えば、アンギオテンシンペプチドなど）の使用から生じる）。しかしながら、これらの方策のそれぞれが制限を有する：例えば、侵襲的外科的手順に関連する固有的危険性、内因性輸送系において固有的な制限によって負わされるサイズ制限、ＣＮＳ以外において活性であり得るキャリアモチーフから構成されるキメラ分子の全身投与に関連する潜在的に望ましくない生物学的副作用、および、ＢＢＢが破壊される脳の領域の内部における脳損傷の起こり得る危険性（これはこの方策を最適でない送達方法にする）など。
【０１３６】
あるいは、例えば、患者の組織領域に直接的に医薬組成物の注射をすることによって、全身的な方法よりも局所的に医薬組成物を投与することができる。
【０１３７】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られているプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥のプロセスによって製造されることができる。
【０１３８】
本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用されることができる調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容されるキャリアを使用して従来の様式で配合されることできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【０１３９】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合しうる緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な食塩緩衝液など）において配合されることができる。経粘膜投与の場合、浸透されるバリヤーに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０１４０】
経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物をこの分野でよく知られている医薬的に許容されるキャリアと組み合わせることによって容易に配合されることができる。そのようなキャリアは、医薬組成物が、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物は、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、錠剤または糖衣錠コアを得るために、望ましい好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製されることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーである。もし望むなら、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤が加えられることができる。
【０１４１】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有しうる。色素または顔料は、活性化合物の量を明らかにするために、または活性化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えられることができる。
【０１４２】
経口使用されうる医薬組成物としては、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが挙げられる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）、および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分は、好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁されることができる。さらに、安定化剤が加えられることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【０１４３】
口内投与の場合、組成物は、従来の方法で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０１４４】
鼻吸入による投与の場合、本発明による使用のための有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投与量は、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定されることができる。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは、化合物および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有して配合されることができる。
【０１４５】
本明細書中に記載される医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合されることができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供されることができる。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【０１４６】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態の活性調製物の水溶液が含まれる。さらに、有効成分の懸濁物は、適切な油性または水性の注射用懸濁物として調製されることができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが挙げられる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために、有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０１４７】
あるいは、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、無菌の、パイロジェン不含水溶液）を使用前に用いて構成される粉末形態であることができる。
【０１４８】
本発明の医薬組成物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合されることができる。
【０１４９】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物として、有効成分が、その意図された目的を達成するために有効な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、「治療有効量」は、処置されている対象の疾患（例えば、パーキンソン病）の症状を予防、緩和あるいは改善するために効果的であるか、または、処置されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分（ＤＪ−１関連ペプチド）の量を意味する。
【０１５０】
治療有効量の決定は、特に本明細書に与えられた詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１５１】
本発明の方法において使用されるいかなる調製物についても、投与量または治療有効量は、生体外および細胞培養アッセイから最初に推定されることができる。例えば、投与量は、所望の濃度または力価を達成するために動物モデルにおいて決定されることができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用されることができる。
【０１５２】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、生体外、細胞培養物、または実験動物における標準的な薬学的手法によって決定されることができる。これらの生体外、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を定めるために使用されることができる。投与量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化しうる。正確な配合、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択されることができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、（１９７５）「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１ ｐ．１を参照のこと）。
【０１５３】
投薬量および投薬間隔は、生物学的効果を誘導または抑制するために十分である有効成分の脳内レベルまたは血中レベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）に合わせて個々に調節することができる。ＭＥＣはそれぞれの調製物について異なるが、インビトロデータから見積もることができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は個々の特徴および投与経路に依存する。検出アッセイを、血漿中の濃度を求めるために使用することができる。
【０１５４】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、単回または複数回投与で行われることができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
【０１５５】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存するだろう。
【０１５６】
本発明の組成物は、所望されるならば、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパック）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随し得る。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きであり得るか、または、承認された製品添付文書であり得る。適合し得る医薬用キャリアに配合された本発明の調製物もまた、上でさらに詳述されたように、示された疾患を処置するために調製され、適切な容器に入れられ、かつ標識され得る。
【０１５７】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０１５８】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。
【０１５９】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。
【０１６０】
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。
【０１６１】
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【０１６２】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０１６３】
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【０１６４】
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
【０１６５】
本明細書で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
【０１６６】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０１６７】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０１６８】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１６９】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ−Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），第３版；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１７０】
材料および方法
ＤＪ−１関連ペプチド：ＤＪ−１タンパク質のバイオインフォマティックデータおよびスクリーニングに基づいて、ＤＪ−１に基づく２０アミノ酸のいくつかのペプチド配列を選択することができる。神経保護特性を明らかにするペプチド配列がペプチド＃２およびペプチド＃５として設計され、それらの配列は下記の通りである：
ペプチド＃２：ＫＧＡＥＥＭＥＴＶＩＰＶＤＶＭＲＲＡＧＩ−配列番号１
ペプチド＃５：ＥＧＰＹＤＶＶＶＬＰＧＧＮＬＧＡＱＮＬＳ−配列番号２
【０１７１】
ペプチド＃２のより短いペプチド誘導体を下記のように合成することができる：
ＫＧＡＥＥＭＥＴＶＩＰＶＤ（Ｐｅｐ２ａ；配列番号３）；ＴＶＩＰＶＤＶＭＲＲＡＧＩ（Ｐｅｐ２ｂ；配列番号４）；ＥＭＥＴＶＩＰＶＤＶＭＲＲ（Ｐｅｐ２ｃ；配列番号５）；ＫＧＡＥＥＭＥＴＶＩＰＶＤＶＭ（配列番号６）；ＭＥＴＶＩＰＶＤＶＭＲＲＡＧＩ（配列番号７）；ＶＤＶＭＲＲＡＧＩ（ＰｅｐＩＩ；配列番号８）；ＫＧＡＥＥＭＥＴＶＩＰＶ（Ｐｅｐ ｓｈｏｒｔ２ａ；配列番号９）；ＧＡＥＥＭＥ−（ＰｅｐＩ；配列番号１０）；ＤＶＭＲＲＡＧＩ（Ｐｅｐ ｓｈｏｒｔ ＩＩ；配列番号１１）；ＴＶＩＰＶ−（ＰｅｐＩＩＩ；配列番号３７）；ＶＩＰ（ＰｅｐＩＶ；配列番号１２）。
【０１７２】
ペプチド＃５のより短いペプチド誘導体を下記のように合成することができる：
ＤＶＶＶＬＰＧＧ（ＰｅｐＶ；配列番号１３）；ＥＧＰＹＤＶＶＶＬＰＧＧＮ（配列番号１４）；ＶＬＰＧＧＮＬＧＡＱＮＬＳ（配列番号１５）；ＤＶＶＶＬＰＧＧＮＬＧＡＱ（配列番号１６）；ＥＧＰＹＤＶＶＶＬＰＧＧＮＬＧ（配列番号１７）；ＶＶＶＬＰＧＧＮＬＧＡＱＮＬＳ（配列番号１８）；ＥＧＰＹＤＶＶＶＬ（配列番号１９）；およびＧＮＬＧＡＱＮＬＳ（配列番号２０）。
【０１７３】
これらのペプチドが、製造者の説明書を使用して、ＰＵＬＳｉｎ法を使用して細胞に導入される。
【０１７４】
これらのペプチドはその後、細胞内浸透を高めるために細胞浸透ペプチド（ＣＰＰ）配列に結合される。使用されたＣＰＰには、ＴＡＴの短い形態および長い形態（ＹＧＲＫＫＲＲ−配列番号２１、および、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−配列番号２２）、ならびに、ＰＴＤ（ＲＲＱＲＲ−配列番号２３）が含まれた。
【０１７５】
ペプチド＃２のペプチド誘導体（これらは細胞浸透ペプチドに結合される）は下記の通りである：
Ｐｅｐ２ ＴＡＴａ：ＹＧＲＫＫＲＲＫＧＡＥＥＭＥＴＶＩＰＶＤ−配列番号２４
Ｐｅｐ２ ＴＡＴｂ：ＹＧＲＫＫＲＲＴＶＩＰＶＤＶＭＲＲＡＧＩ−配列番号２５
Ｐｅｐ２ ＴＡＴｃ：ＹＧＲＫＫＲＲＥＭＥＴＶＩＰＶＤＶＭＲＲ−配列番号２６
Ｐｅｐ２ ＰＴＤ−５ａ：ＲＲＱＲＲＫＧＡＥＥＭＥＴＶＩＰＶＤＶＭ−配列番号２７
Ｐｅｐ２ ＰＴＤ−５ｂ：ＲＲＱＲＲＭＥＴＶＩＰＶＤＶＭＲＲＡＧＩ−配列番号２８
Ｐｅｐ２ ｎｕｃ ＴＡＴ：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＶＤＶＭＲＲＡＧＩ−配列番号２９
【０１７６】
ペプチド＃５のペプチド誘導体（これらは細胞浸透ペプチドに結合される）：
Ｐｅｐ５ ＴＡＴａ：ＹＧＲＫＫＲＲＥＧＰＹＤＶＶＶＬＰＧＧＮ−配列番号３０
Ｐｅｐ５ ＴＡＴｂ：ＹＧＲＫＫＲＲＶＬＰＧＧＮＬＧＡＱＮＬＳ−配列番号３１
Ｐｅｐ５ ＴＡＴｃ：ＹＧＲＫＫＲＲＤＶＶＶＬＰＧＧＮＬＧＡＱ−配列番号３２
Ｐｅｐ５ ＰＴＤ−５ａ：ＲＲＱＲＲＥＧＰＹＤＶＶＶＬＰＧＧＮＬＧ−配列番号３３
Ｐｅｐ５ ＰＴＤ−５ｂ：ＲＲＱＲＲＶＶＶＬＰＧＧＮＬＧＡＱＮＬＳ−配列番号３４
Ｐｅｐ５ ｎｕｃ ＴＡＴａ：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＥＧＰＹＤＶＶＶＬ−配列番号３５
Ｐｅｐ５ ｎｕｃ ＴＡＴｂ：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＮＬＧＡＱＮＬＳ−配列番号３６
【０１７７】
細胞：ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞が、Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、米国）から得られる。細胞を、５％ＣＯ２の加湿雰囲気において３７℃で、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）およびグルタミン（５ｍＭ）が補充されるＤＭＥＭ培地で単層として無菌条件下で成長させる。培地を４日毎に定期的に交換し、細胞を８日後に継代する。すべての実験が、ほぼコンフルエンスである細胞に対して行われる。
【０１７８】
不死化されたヒトＨａＣａＴケラチノサイト細胞が、ＵＶ線誘導傷害に対して保護するＤＪ−１関連ペプチドの能力を試験するために使用される。細胞を、５ｃｍのペトリ皿において、０．０７５ｍＭ Ｃａ２＋（ＭＥＭ−７５）および１０％ＦＣＳを含有する最少必須培地で維持し、３日毎〜４日毎に継代培養する。
【０１７９】
初代培養物および神経幹細胞：神経始原細胞／幹細胞が生後ｃ５７／ｂｌマウスのマウス皮質から単離され、ニューロスフェアとして培養される。神経およびアストログリアの分化が誘導される。
【０１８０】
分化した神経始原細胞／幹細胞および未分化の神経始原細胞／幹細胞の、酸化的毒性傷害に対する感受性が、ＤＪ−１関連ペプチドによる事前の前処理を行って、または行うことなく求められる。
【０１８１】
生後ｃ５７／ｂｌマウスの皮質組織に由来するマウスのニューロン・星状膠細胞の初代培養物が、ＤＪ−１関連ペプチドの潜在的保護能を調べるために調製され、使用される。
【０１８２】
細胞の安定的トランスフェクション：ヒトの野生型またはＡ５３Ｔ変異型のα−シヌクレインｃＤＮＡのコード領域がｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）にサブクローン化される。Ａ５３Ｔ変異型α−シヌクレインの過剰発現を達成するために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞が、Ａ５３Ｔ変異型α−シヌクレインを含有するプラスミドにより安定的にトランスフェクションされる。トランスフェクションが、リポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して行われる。トランスフェクション細胞の選抜が、細胞を致死量のジェネティシン（Ｇ−４１８）により処理することによって行われる。ナイーブ神経芽細胞腫細胞、ならびに、空ベクターにより安定的にトランスフェクションされた細胞がコントロールとして使用される。
【０１８３】
安定的トランスフェクションが、リアルタイムＰＣＲおよびウエスタンブロッティングを使用してα−シヌクレインのｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルを測定することによって確認される。
【０１８４】
処置：神経芽細胞腫細胞を、ＲＯＳ形成を生じさせるために、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）（０〜１ｍＭ；Ｓｉｇｍａ，Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）、６−ヒドロキシドーパミン（０〜１００μＭ；Ｓｉｇｍａ，Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）、ドーパミン（０〜５００μＭ；Ｓｉｇｍａ，Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）および３−（４−モルホリニル）−シドノンイミン（ＳＩＮ−Ｉ）（０〜５ｍＭ；Ｓｉｇｍａ）（これはペルオキシニトリト系のフリーラジカルドナーである）と接触させる。
【０１８５】
細胞毒性アッセイおよび細胞生存能力アッセイ：いくつかの方法が、細胞代謝活性、ミトコンドリア活性および細胞生存能力に対する、酸化傷害、神経毒およびドーパミンの毒性影響を求めるために使用される。
【０１８６】
Ａｌａｍａｒブルー：細胞をウエルあたり５０００細胞の濃度で９６ウエルプレートに播種し、一晩接着させる。翌日、細胞が、血清非含有培地において、増大する用量のドーパミン（０〜５００ｕＭ）に４時間さらされる。Ａｌａｍａｒブルーは、代謝活性に応答して色を変化させるレドックス指標を取り込む非毒性試薬である。還元により誘導される色変化が細胞数および時間に関して比例して変化する。１０％のａｌａｍａｒブルーの溶液が、増大する用量のドーパミンにさらした４時間後に血清非含有培地において２時間加えられる。Ａｌａｍａｒブルーの蛍光を５４４ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの放射波長でＦＬＵＯｓｔａｒ分光蛍光計によって測定する。それぞれの実験がそれぞれの処置について三連で行われる。実験が３回繰り返される。
【０１８７】
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）細胞毒性：損傷細胞によって細胞培養上清に放出されるＬＤＨが、製造者の説明書に従ってＬＤＨ細胞毒性検出キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ、米国）を使用して求められる。ＬＤＨ活性の量が培養物における損傷細胞の数に相関する。培養上清に存在するＬＤＨは、黄色のテトラゾリウム塩を赤色のホルマザン産物に変換する共役反応に加わる。死細胞の百分率が吸光度値の下記式によって計算される：
（三連吸光度−低コントロール）／（最大吸収−低コントロール）×１００。
【０１８８】
最大吸収が、細胞を１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により処理することによって得られる。酵素活性の量が４９０ｎｍにおける吸光度によってマイクロプレートリーダーで測定される。それぞれの実験がそれぞれの処置について三連で行われる。実験が３回繰り返される。
【０１８９】
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２：アポトーシス細胞の核の形態学における変化を調べるために、細胞が核染料Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８で標識され、蛍光顕微鏡法で調べられる。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２は、ＤＮＡに対する親和性を有する細胞蛍光性透過性色素である。毒素暴露後、細胞を冷７０％エタノールにより固定処理し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（１０ｕｇ／ｍｌ）とインキュベーションする。核の形態学を蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ｂｘ５２、Ｌｅｅｄｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）で観察する。低下した核サイズ、クロマチン凝縮、強い蛍光および核の断片化を示した細胞が、アポトーシスしていると見なされる。
【０１９０】
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２は、無傷の膜または損傷した膜を有する細胞に入り、ＤＮＡを青く染色し、それにより、それぞれのウエルにおける細胞数の評価を同様に可能にする。ＦＬＵＯｓｔａｒ分光蛍光計マイクロプレートリーダーを、種々の用量の様々な毒素に対する暴露の後でのそれぞれのウエルにおける細胞数を評価するために使用することができる。励起が３４６ｎｍで行われ、放射波長が４６０ｎｍで測定される。実験がそれぞれの処置について三連で行われる。すべての実験が少なくとも３回繰り返される。
【０１９１】
ウエスタンブロッティング：ＷＴ型および変異型のα−シヌクレインの過剰発現が、ウエスタンブロットを使用して求められる。細胞をＰＢＳにより洗浄し、トリプシン処理し、遠心分離によって集める。全細胞溶解物を調製するために、細胞を溶解緩衝液（これは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１％ＳＤＳ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％デオキシコール酸ナトリウム、および、プロテアーゼ阻害剤のカクテル（Ｓｉｇｍａ）を含有する）に再懸濁する。タンパク質濃度を、タンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して求める。それぞれのサンプルから得られる総タンパク質の２５マイクログラムを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分離し、ニトロセルロースメンブランに転写する。メンブランを５％脱脂乳において室温で１時間ブロッキング処理し、その後、モノクローナル抗α−シヌクレイン抗体（ＬＢ５０９、１：２０００；Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と４℃で一晩インキュベーションし、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体（１：１００００；Ｓｉｇｍａ）とインキュベーションし、ＥＣＬｐｌｕｓ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により発色させる。メンブランはまた、α−シヌクレインの発現レベルをβ−アクチンのレベルに対して正規化するために、マウス抗β−アクチン抗体（１：１００００、Ｓｉｇｍａ）とインキュベーションされ、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体（１：１００００；Ｓｉｇｍａ）とインキュベーションされ、ＥＣＬｐｌｕｓ検出システムにより発色させられる。
【０１９２】
α−シヌクレインについての免疫細胞化学：細胞を４％パラホルムアルデヒドにより固定処理し、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により透過処理した。続いて、固定処理された細胞をブロッキング溶液においてインキュベーションし、その後、モノクローナル抗α−シヌクレイン抗体（ＬＢ５０９、１：２０００；Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と４℃で一晩インキュベーションし、その後、ａｌｅｘａ−５６８結合二次抗体とインキュベーションした。核をＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）によって対比染色する。核の形態学を蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ｂｘ５２、Ｌｅｅｄｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）で観察する。
【０１９３】
免疫細胞化学によるアポトーシス割合の評価：細胞を４％パラホルムアルデヒドにより固定処理し、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により透過処理する。その後、固定処理された細胞をブロッキング溶液においてインキュベーションし、その後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（１０ｕｇ／ｍｌ）とインキュベーションする。核の形態学を蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ｂｘ５２、Ｌｅｅｄｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）で観察する。低下した核サイズ、クロマチン凝縮、強い蛍光および核の断片化を示した細胞が、アポトーシスしていると見なされる。
【０１９４】
インビボでの６−ヒドロキシドーパミン誘導片側パーキンソン症候群マウスモデル：オスのｃ５７／ｂｌマウスがＰＤのこのインビボモデルのために使用される。マウスは、（０．０２％のアスコルビン酸を含有する２μｌの生理的食塩水に溶解された）４μｇの６−ヒドロキシドーパミン臭化水素酸塩の片側線条体内注入を、定位手術手順を使用して受けた。注入が、下記の座標を使用して中心線条体に対して向けられる：ブレグマに対して０．７ｍｍ前方、ブレグマに対して２．０ｍｍ側方、および、３．５ｍｍの深さ。
【０１９５】
線条体内６−ヒドロキシドーパミン傷害化の行動影響が、加速ロータロッド試験および腹腔内アンフェタミン（２．５ｍｇ／ｋｇ）誘導回転行動によって評価される。
【０１９６】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるカテコールアミンレベルの測定、および、免疫組織化学によって評価されるような病理学的損傷の程度の測定が、傷害化後１ヶ月で行われる。
【０１９７】
統計学的分析：統計学的分析が、ＳＰＳＳソフトウエアを使用して行われる。２つの群の間での比較が、両側スチューデントｔ検定を使用して行われる。３つ以上の群の間での統計学的分析が、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、その後、最小有意差（ＬＳＤ）事後比較を使用して行われる。結果が、平均±標準偏差によって表される。群間の差は、誤差確率（ｐ）が５％未満（ｐ≦０．０５）であったならば、有意であると見なされる。
【０１９８】
実施例１
細胞株において分析されるような本発明のペプチドの神経保護活性の分析
結果
Ｔａｔ２Ａ（配列番号２４）が、インビトロ細胞プラットホームを使用して、神経毒に対するその保護効果を求めるために調べられる。ペプチドが、ＰＵＬＳｉｎキット（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）によって、続いて、細胞浸透ペプチドへの結合によって神経芽細胞腫細胞に送達される。図１Ａ〜図１Ｆに例示されるように、試験されたペプチドのいくつかは、血清欠乏、過酸化水素、６−ヒドロキシドーパミンおよびドーパミンへの暴露によって誘導される酸化的神経毒性傷害に対する著しい保護効果を示した。これらのペプチドは、（ＭＴＴアッセイによって評価される）ミトコンドリア損傷を低下させ、（Ａｌａｍａｒブルー法によって示される）代謝損傷を低下させ、（ＬＤＨ細胞毒性検出キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によって評価される）細胞毒性を低下させ、かつ、（Ｈｏｅｃｈｓｔ染色による）細胞生存能力を増大させた。
【０１９９】
ＤＪ−１変異ペプチドは、いくつかのＤＪ−１関連ペプチドの保護効果を示す図２Ａ〜図２Ｂに例示されるように、それらの対応する非変異ペプチドの保護効果を示さなかった（＊ｐ＜０．０５）。
【０２００】
図３は、ＤＪ−１関連ペプチドが６−ヒドロキシドーパミン毒性に対してインビトロで保護することを例示し、これに対して、図４Ａは、ＤＪ−１関連ペプチドが血清欠乏に対して保護することを例示する。
【０２０１】
様々な非保存的ＤＪ−１関連ペプチドが、本発明のペプチドの特異的な効果を確認するためにコントロールとして使用された。これらのペプチドへの神経芽細胞腫細胞の暴露は、図４Ｂに例示されるように、６−ヒドロキシドーパミンまたは過酸化水素の処置によって誘導される傷害から細胞を保護しなかった。
【０２０２】
実施例２
初代マウス培養物において分析されるような本発明のペプチドの神経保護活性の分析
結果
初代培養物に対する、また、Ｃ５７／ｂｌマウスの脳から得られる分化した神経幹細胞および未分化の神経幹細胞に対するＤＪ−１ペプチドの保護効果が評価された。結果は、選択されたＤＪ−１関連ペプチドが、過酸化水素および６−ヒドロキシドーパミンの毒性に対して著しく保護したことを示す。具体的には、図５Ａ〜図５Ｂは、生後マウスの脳から得られる初代混合ニューロン・星状膠細胞培養物における酸化的毒性傷害に対するＴａｔ２Ａの保護を例示する。神経始原細胞／幹細胞を生後ｃ５７／ｂｌマウスのマウス皮質から単離し、ニューロスフェアとして培養した。神経およびアストログリアの分化を誘導した。
【０２０３】
分化した神経始原細胞／幹細胞および未分化の神経始原細胞／幹細胞の、酸化的毒性傷害に対する感受性を、図６に例示されるように、ＤＪ−１関連ペプチドによる事前の前処理を行って、または行うことなく求めた。
【０２０４】
実施例３
変異型α−シヌクレインの毒性に対する保護
Ａ５３Ｔ変異型α−シヌクレインは遺伝性パーキンソン病についての原因の１つである。変異α−シヌクレインを過剰発現する神経芽細胞腫細胞を、パーキンソン病についての細胞プラットホームとして使用した。Ａ５３Ｔ変異型α−シヌクレインの過剰発現を達成するために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞を、Ａ５３Ｔ変異型α−シヌクレインを含有するプラスミドにより安定的にトランスフェクションした。
【０２０５】
α−シヌクレインの過剰発現の確認が、α−シヌクレインについての免疫細胞化学染色により行われた。図７Ａは、ナイーブ神経芽細胞腫細胞のα−シヌクレイン染色を例示し、一方、図７Ｂは、Ａ５３Ｔ変異型α−シヌクレインによりトランスフェクションされた細胞のα−シヌクレイン染色を例示する。
【０２０６】
α−シヌクレインタンパク質の定量を、図８に例示されるように、ウエスタンブロッティングを使用して行った。
【０２０７】
ＤＪ−１関連ペプチドは、変異型Ａ５３Ｔα−シヌクレインを過剰発現する神経芽細胞腫細胞において６−ヒドロキシドーパミン毒性に対して保護すること（図９）、および、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）暴露によって誘導される純粋な酸化傷害に対して保護すること（図１０）が示された。
【０２０８】
実施例４
ＤＪ−１関連ペプチドはドーパミン毒性に対して保護する
神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、ＤＪ−１関連ペプチドによる事前の前処理を行って、または行うことなく、増大する用量のドーパミンにさらした。ドーパミンに対する脆弱性が、図１１に例示されるように、ＤＪ−１関連ペプチド処置によって統計学的に有意に弱まった。
【０２０９】
実施例５
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の細胞モデルに対する保護
ＮＳＣ−３４細胞をＡＬＳについての細胞モデルとして使用した。増大する用量の過酸化水素およびＳＩＮ−Ｉ（ＮＯドナー）（これらはＡＬＳの病理発生に関係している）を使用した。ＤＪ−１関連ペプチド＃２は、図１２Ａ〜図１２Ｂおよび図１３に例示されるように、ＡＬＳのこの細胞モデルにおいてＨ２Ｏ２およびＳＩＮ−Ｉの毒性に対する保護効果を示した。
【０２１０】
実施例６
ＤＪ−１関連ペプチドのＵＶ線に対して保護する能力
培養されたケラチノサイトを、ＵＶ線の損傷影響に対して保護するＤＪ−１関連ペプチドの能力を調べるために使用した。いくつかのＤＪ−１関連ペプチドが、図１４に示されるように、ＵＶ線により誘導される細胞死に対する著しい保護効果を示した。
【０２１１】
実施例７
ＤＪ−１関連ペプチドはパーキンソン病のインビボモデルに対して保護する
近年の研究では、ｔａｔに結合したタンパク質が、静脈内投与および腹腔内投与の後、脳に浸透し、脳に影響することが示されている［Ｋｉｍ他、２０１０；Ｄｏｅｐｐｎｅｒ他、２０１０］。本発明者らは、ペプチド２ａ（１３アミノ酸）をｔａｔに結合し、このペプチドを十分に確立されている６−ヒドロキシドーパミン片側パーキンソン症候群マウスモデルにおいて調べた。
【０２１２】
次に、線条体内注入されたＤＪ−１関連ペプチドの保護能を調べた。２つの群のオスｃ５７／ｂｌマウスが、生理的食塩水に溶解された１００μＭのＴＡＴ２ａ ＤＪ−１関連ペプチド（配列番号２４）または生理的食塩水単独のどちらかの２μｌを右側線条体に定位注入されて受けた。１時間後、４μｇの６−ヒドロキシドーパミンを、同じ座標を使用して注入した。行動研究には、アンフェタミン誘導回転行動および加速ロータロッド試験が含まれた。
【０２１３】
６−ヒドロキシドーパミンモデルにおけるＤＪ−１関連ペプチドの影響が２回試験された。合計で１０匹のｃ５７／ｂｌのオスマウスが最初の実験のために使用され、２６匹が２回目の実験で使用された。両方において、ペプチド処置マウスにおける著しく低下したアンフェタミン誘導回転が、コントロールと比較して見出された（ｐ＜０．０１）。これは２回の実験のそれぞれにおいて２回確認された：図１５Ａ〜図１５Ｂに例示されるように、最初は６−ヒドロキシドーパミン線条体傷害化後の２週間後、続いて、４週間後。
【０２１４】
加速ロータロッド試験では、有意差（ｐ＝０．０２）が、ＴＡＴ２ａペプチド（配列番号２４）処置マウスと、生理的食塩水処置コントロールとの間で明らかにされた。チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）についての免疫組織化学染色では、傷害された線条体におけるＴＨ染色の６−ヒドロキシドーパミン誘導喪失が、ｔａｔ２ａ ＤＪ−１関連ペプチド（配列番号２４）によって取り消されたことが明らかにされた。
【０２１５】
次に、ＤＪ−１関連ペプチドの全身投与の影響を調べた。ペプチドの静脈内送達を、６−ヒドロキシドーパミン片側パーキンソン症候群マウスモデルを調節するための手段として使用した。５０μｇのペプチドを６−ヒドロキシドーパミン傷害化の４時間前に静脈内投与した。コントロールと比較して、傷害化後２週間および４週間でのペプチド処置マウスにおけるアンフェタミン誘導回転における劇的な低下が見出された（図１６Ａおよび図１６Ｂ）。
【０２１６】
実施例８
パーキンソン病についての動物モデルを作製するために、マウスを１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）により処置した。５匹のマウス（Ｃ５７／ｂｌ）に、ＤＪ−１関連ペプチド（０．４ｍＭの皮下；配列番号２５）の存在下および非存在下で、２０ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰ（ｉ．ｐ．）を５日間連続して注射した。１８日後、マウスを屠殺し、２つの半球におけるドーパミンレベルをＨＰＬＣによって測定した。
【０２１７】
結果
実験の結果が図１７に明らかにされる。
【０２１８】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０２１９】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【配列表フリーテキスト】
【０２２０】
配列番号１〜４２は、合成ペプチドの配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、酸化ストレス関連障害を処置するためのペプチド薬剤に関連する。
【背景技術】
【０００２】
フリーラジカルは、生物学的系における著しい破壊を引き起こす極めて反応性の化学種である。フリーラジカルが生物学的分子と無差別的に反応することにより、細胞および細胞構成成分（例えば、ミトコンドリア）の破壊がもたらされ得るので、生理学的プロセスが、細胞がその構造および／または機能を失うことによって影響を受ける。
【０００３】
生物学的系において、フリーラジカルは「活性酸素種」（ＲＯＳ）と一般に呼ばれる。ＲＯＳは酸素含有化学種の代謝により内因性起源に由来し、また、外因性起源（例えば、毒素および大気汚染物質など）に由来する。
【０００４】
生物学的分子に対するＲＯＳの攻撃は「酸化ストレス」と呼ばれる。酸化ストレスは数多くの変性疾患において原因的要因として関係づけられている。
【０００５】
パーキンソン病（ＰＤ）は、遺伝的要因および環境的要因の両方によって引き起こされる多因性疾患である。ほとんどのＰＤ罹患患者が散発性疾患を有するが、いくつかの遺伝的原因が近年では特定されている。ＰＤの遺伝性形態を引き起こす遺伝子の増大する数は、この疾患の根底にある機構に対する新しい洞察のための機会を提供している。これらの遺伝子には、α−シヌクレイン、パーキン、ＰＩＮＫ１、ダーダリン（ＬＲＲＫ２）およびＤＪ−１が含まれる。
【０００６】
ＰＤの病理発生の現在の考えは、ＲＯＳの形成、および、黒質緻密部に対する酸化損傷をもたらす酸化ストレスの開始に集中している。広範囲に及ぶ死後研究は、ＰＤの病理発生における酸化ストレスの関与を裏付ける証拠をもたらしている；具体的には、これらには、脳の鉄含有量における変化、損なわれたミトコンドリア機能、抗酸化性保護系における変化（最も注目されるのが、スーパーオキシドジスムターゼ［ＳＯＤ］および還元型グルタチオン［ＧＳＨ］）、ならびに、脂質、タンパク質およびＤＮＡに対する酸化損傷の証拠が含まれる。鉄は酸化ストレスを誘導する可能性があり、黒質内注入は、進行性パーキンソン症候群のモデルを誘導することが示されている。
【０００７】
多発性硬化症（ＭＳ）は、神経学的機能不全の様々な症状によって特徴づけられる中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症性脱髄疾患である。ＭＳおよびその動物モデル（実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ））は、自己免疫媒介による活性化された免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球およびＢリンパ球など）、ならびに、マクロファージおよびミクログリアから生じると考えられる。病理学的には、ＭＳは、プラークと呼ばれる脱髄性病変をもたらす、ＣＮＳ実質内へのリンパ球およびマクロファージの静脈周囲浸潤によって特徴づけられる。これらのプラークは、ＭＳの顕著な特徴である一方で、希突起神経膠細胞の死、軸索損傷およびニューロン喪失を伴う。ＭＳが炎症性の神経変性疾患であると見なされ得るという見解が、急性プラークから離れた領域におけるニューロン傷害および軸索傷害を明らかにする研究によって、同様にまた、正常に見える白質および灰白質における変化を明らかにする画像化研究によって裏付けられる。
【０００８】
ＭＳの病因は未だ完全には解明されておらず、遺伝的原因および環境的原因の両方に起因すると考えられている。蓄積しつつあるデータは、酸化ストレスがＭＳの病理発生において大きな役割を果たすことを示している。活性酸素種（ＲＯＳ）（これは酸化ストレスをもたらし、主に活性化ミクログリアによって過剰に生じる）が、ＭＳおよびＥＡＥの両方において脱髄および軸索損傷の媒介因子として関係づけられている。
【０００９】
神経伝達物質のグルタミン酸が、主にそのイオンチャネル型受容体の活性化によるＭＳにおける酸化ストレスの起源の１つである。希突起神経膠細胞（ＣＮＳのミエリン産生細胞）はまた、主としてＡＭＰＡ／カイニン酸受容体を介して、グルタミン酸の興奮毒性に対して非常に傷つきやすい。ＲＯＳが、主要な細胞成分（例えば、脂質、タンパク質および核酸など）に対する損傷を引き起こし、これにより、細胞死を生じさせる。ＲＯＳ影響に対する増大した脆弱性をもたらす、ＭＳ患者のＣＮＳにおける弱まった細胞抗酸化防御系はＣＮＳ損傷を増大させるかもしれない。
【００１０】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）はルーゲーリッグ病とも呼ばれ、合衆国では毎年、３００００人もの多くのアメリカ人が冒され、５０００人の新たな症例が発生する進行性の致命的な神経学的疾患である。この障害は、運動ニューロン疾患として知られる一群の障害に属する。随意運動を制御する脳および脊髄における特定の神経細胞が徐々に変性するとき、ＡＬＳが生じる。家族性筋萎縮性側索硬化症（ＦＡＬＳ）は、その家族性背景のみによって、より一般的な散発性異型から区別されるＡＬＳの形態である。
【００１１】
酸化ストレスが運動ニューロンの死の一因であるという仮説を裏付ける実質的証拠が存在する。例えば、抗酸化酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）の変異が疾患を有意な少数派の症例において引き起こすことが発見されている。
【００１２】
ＤＪ−１は、多種多様な生物種を通して至るところで発現され、かつ、高度に保存される１８９アミノ酸の小さいタンパク質である。蓄積しつつあるデータは、様々な細胞プロセスにおけるその関与、とりわけ、酸化ストレスにおけるその関与を明らかにした。ＤＪ−１は、等電点が５．５〜７の間にあるいくつかのイソ型を有することが知られており、アルカリ性イソ型が正常な状態では優勢である。ＲＯＳにさらされたとき、システイン残基の酸化を介して媒介されるＤＪ−１のより酸性のイソ型の蓄積が認められる［Ｂａｎｄｏｐａｄｈｙａｙ Ｒ他、Ｂｒａｉｎ、１２７：４２０〜４３０、２００４；Ｃａｎｅｔ−Ａｖｉｌｅｓ他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１０１：９１０３〜９１０８、２００４］。
【００１３】
ＤＪ−１は脳に広く分布し、かつ、非常に発現され、１つだけの機能的系または解剖学的場所に限定されない。ＤＪ−１が、異なる神経伝達物質表現型のニューロンにおいて、また、すべてのグリア細胞タイプ（例えば、星状膠細胞、ミクログリアおよび希突起神経膠細胞など）において発現される。近年、ＤＪ−１の変異が発見され、家族性パーキンソン病（ＰＤ）に関連していた［Ｂｏｎｉｆａｔｉ他、２００３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９９：２５６〜９、２００３］。コントロールに対する散発性ＰＤの脳から得られる脳サンプルの死後研究では、ＤＪ−１の酸性イソ型がＰＤの脳にはより多く存在することが見出された［Ｂａｎｄｏｐａｄｈｙａｙ Ｒ他、Ｂｒａｉｎ、１２７：４２０〜４３０、２００４］。ＤＪ−１の免疫反応性が、多系統萎縮症、アルツハイマー病、進行性核上麻痺、第１７染色体に連鎖するパーキンソン症候群を伴う前頭側頭型認知症、および、ピック病を含む他の神経変性疾患において検出された［Ｂａｎｄｏｐａｄｈｙａｙ Ｒ他、Ｂｒａｉｎ、１２７：４２０〜４３０、２００４；Ｎｅｕｍａｎｎ Ｎ．他、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ（Ｂｅｒｌ）、１０７：４８９〜４９６、２００４；Ｒｉｚｚｕ Ｐ．他、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ、５５：１１３〜１１８、２００４］。
【００１４】
国際公開ＷＯ２００７／１１９２３７は、酸化ストレス関連障害を診断するためのＤＪ−１のレベルおよび活性の分析を議論する。
【００１５】
米国特許出願公開第２００６０１５３８０７号および米国特許出願公開第２００６０１７１９３５号は、ベクター媒介による遺伝子調節、例えば、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病など）を処置するためのＤＪ−１関連薬剤のベクター媒介遺伝子調節を議論する。
【００１６】
国際公開ＷＯ２００８／１１１０６３は、ＤＪ−１依存性ＶＭＡＴ２の転写を神経変性疾患の処置のためにアップレギュレーションすることができるペプチド薬剤を議論する。
【発明の概要】
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、配列番号３に示されるような配列を含む、最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドであって、酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる単離されたペプチドが提供される。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体と、医薬的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物であって、単離されたペプチドが酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる医薬組成物が提供される。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体を含む医薬組成物であって、単離されたペプチドが酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる医薬組成物が提供される。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、酸化ストレス関連障害をその必要性のある対象において処置する方法であって、本発明の医薬組成物の治療効果的な量をそのような対象に投与し、それにより、酸化ストレス関連障害を処置することを含む方法が提供される。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体と、医薬的に許容されるキャリアとが提供され、この場合、単離されたペプチドは酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体が提供され、この場合、単離されたペプチドは酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号３に示されるような配列を含む。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号１４に示されるような配列を含む。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号２４に示される通りである。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に由来する少なくとも５個の連続するアミノ酸を含む。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列に由来する少なくとも５個の連続するアミノ酸を含む。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に由来する最大でも１５個の連続するアミノ酸を含む。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列に由来する最大でも１５個の連続するアミノ酸を含む。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、最大でも２０アミノ酸である。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号３８に示されるような配列を含む。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号３９に示されるような配列を含む。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号１０に示されるような配列を含む。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号１１に示されるような配列を含む。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号１または配列番号３に示されるような配列を含む。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号４０に示されるような配列を含む。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号１３に示されるような配列を含む。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号４１に示されるような配列を含む。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号４２に示されるような配列を含む。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、配列番号２に示されるような配列を含む。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、アミノ酸の少なくとも１つが、天然に存在するアミノ酸である。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、アミノ酸の少なくとも１つが合成アミノ酸である。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは細胞浸透性作用因子に結合される。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは共有結合により結合される。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞浸透性作用因子はペプチド薬剤である。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ペプチド細胞浸透性作用因子は、配列番号２１〜配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは配列番号２４〜配列番号３６に示される通りである。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞はニューロン細胞を含む。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＯＳ状態は、６−ヒドロキシドーパミン毒性、過酸化水素毒性、ＵＶ線およびドーパミン毒性からなる群から選択される。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、酸化ストレス関連障害は神経変性疾患である。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、神経変性疾患は、パーキンソン病、多発性硬化症、ＡＬＳ、多系統萎縮症、アルツハイマー病、卒中、進行性核上麻痺、第１７染色体に連鎖するパーキンソン症候群を伴う前頭側頭型認知症、および、ピック病からなる群から選択される。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、単離されたペプチドは、酸化ストレス関連障害を処置することにおける使用のためのものである。
【００５３】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の画像を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００５５】
【図１Ａ−１Ｄ】図１Ａ−１Ｄは、ＤＪ−１関連ペプチドＴＡＴ２ａ（配列番号２４）が酸化的毒性傷害に対してインビトロで保護することを例示する棒グラフである。増大した細胞生存能力（Ａ）、低下したミトコンドリア損傷（Ｂ）および増大した代謝活性（Ｃ）が、Ｈ２Ｏ２への暴露によって誘導される酸化ストレスにさらされた後、生理的食塩水単独と比較した場合、ＤＪ−１関連ペプチド処置に関して見出された。細胞増殖が、［３Ｈ］チミジン取り込みを定量することによって測定された。ペプチドへの暴露による増大した細胞増殖が何ら認められなかった（Ｄ）。
【図１Ｅ−１Ｆ】図１Ｅ−１Ｆは、ＤＪ−１関連ペプチドＴＡＴ２ａ（配列番号２４）が酸化的毒性傷害に対してインビトロで保護することを例示する棒グラフである。６−ヒドロキシドーパミン毒性およびドーパミン毒性に対する保護が図１Ｅおよび図１Ｆにそれぞれ示される。示された実験はヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対して行われ、少なくとも３回繰り返された。＊ｐ＜０．０５（ビヒクルにより処置され、同じ毒性傷害にさらされたコントロール細胞と比較した場合）。
【００５６】
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａ−２Ｂは、ＤＪ−１関連ペプチドが６−ヒドロキシドーパミン毒性に対してインビトロで保護することを例示する棒グラフである。増大した代謝活性が、生理的食塩水と比較した場合、６−ヒドロキシドーパミン暴露前に、ヒト神経芽細胞腫細胞ＳＨ−ＳＹ５ＹがＤＪ−１関連ペプチドにより前処理されたときに見出された。ＤＪ−１関連ペプチド＃２の誘導体による６−ヒドロキシドーパミン毒性に対する保護が図２Ａに示され、ＤＪ−１関連ペプチド＃５の誘導体による６−ヒドロキシドーパミン毒性に対する保護が図２Ｂに示される。変異ペプチドは、図２Ａ〜図２Ｂに示されるように、６−ヒドロキシドーパミン毒性に対して保護することができなかった。示された実験はヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対して行われ、少なくとも３回繰り返された。＊ｐ＜０．０５（同じ毒性傷害にさらされたコントロール細胞と比較した場合）。
【００５７】
【図３】図３は、ＤＪ−１関連ペプチドが６−ヒドロキシドーパミン毒性に対してインビトロで保護することを例示する。増大した生存能力が、生理的食塩水と比較した場合、６−ヒドロキシドーパミン暴露前に、ヒト神経芽細胞腫細胞ＳＨ−ＳＹ５ＹがＤＪ−１関連ペプチドＩＩ（配列番号８）により前処理されたときに見出された。＊ｐ＜０．０５（同じ毒性傷害にさらされたコントロール細胞と比較した場合）。
【００５８】
【図４Ａ】図４Ａは、ＤＪ−１関連ペプチドが血清欠乏に対して保護することを例示する棒グラフである。増大した生存能力が、生理的食塩水と比較した場合、血清欠乏期間中に、ヒト神経芽細胞腫細胞ＳＨ−ＳＹ５ＹがＤＪ−１関連ペプチドＩ（配列番号１０）、ＤＪ−１関連ペプチドＩＩ（配列番号８）およびＤＪ−１関連ペプチドｓｈｏｒｔ２ａ（配列番号９）により前処理されたときに見出された。＊ｐ＜０．０５。
【００５９】
【図４Ｂ】図４Ｂは、コントロールのＤＪ−１関連ペプチドが酸化的な毒素誘導毒性に対して保護しないことを例示する棒グラフである。細胞が、コントロールペプチドのＸおよびＹ（神経保護を誘導することが見込まれなかった配列）による前処理を伴って、または伴うことなく、増大する用量の６−ヒドロキシドーパミン（０〜２５ｕＭ）に、または、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２、０〜５０ｕＭ）にさらされた。示された実験はヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対して行われ、３回繰り返された。有意差が、ビヒクルにより処置され、同じ毒性用量にさらされたコントロール細胞と比較して何ら認められなかった。
【００６０】
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａ−５Ｂは、初代培養物におけるＴＡＴ２ａ（配列番号２４）ペプチドによる、Ｈ２Ｏ２および６−ヒドロキシドーパミンの毒性に対する保護を例示する棒グラフである。増大する濃度の過酸化水素および６−ヒドロキシドーパミンに対する類似した保護が、生後の野生型Ｃ５７／ｂｌマウスの皮質から得られる初代混合ニューロン・グリア培養物において明らかにされた。それぞれの実験が３回繰り返された。＊ｐ＜０．０５（ビヒクルにより処置され、同じ毒性傷害にさらされたコントロール細胞と比較した場合）。
【００６１】
【図６】図６は、ＤＪ−１関連ペプチドＩ（配列番号２３）およびＤＪ−１関連ペプチドＩＩ（配列番号８）が、ニューロン分化したマウス神経幹細胞において酸化傷害に対して保護することを例示する棒グラフである。増大した生存能力が、生理的食塩水と比較した場合、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）暴露前に、これらの細胞がＤＪ−１関連ペプチドＩまたはＤＪ−１関連ペプチドＩＩにより前処理されたときに見出された。＊ｐ＜０．０５（同じ毒性傷害にさらされたコントロール細胞と比較した場合）。
【００６２】
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａ−７Ｂは、α−シヌクレインについての免疫組織化学染色を、ナイーブ神経芽細胞腫細胞（図７Ａ）、および、Ａ５３Ｔ変異型α−シヌクレインにより安定的にトランスフェクションされた細胞（図７Ｂ）において例示する写真である。α−シヌクレインがＡｌｅｘａ−５６８コンジュゲート化二次抗体によって赤く染まる。核がＤＡＰＩによって対比染色された（青色）。実験が三連で３回繰り返された。
【００６３】
【図８】図８は、α−シヌクレインのグラフィック定量を例示する棒グラフ、ならびに、モックトランスフェクションされた神経芽細胞腫細胞、および、野生型（ＷＴ）α−シヌクレインまたはＡ５３Ｔ変異型α−シヌクレインにより安定的にトランスフェクションされた細胞におけるα−シヌクレインについての代表的なウエスタンブロットの写真である。実験が三連で３回繰り返された。
【００６４】
【図９】図９は、変異型α−シヌクレインを過剰発現する細胞におけるペプチド＃２の誘導体による、６−ヒドロキシドーパミン毒性に対する保護を例示する棒グラフである。著しく増大した代謝活性が、ＤＪ−１関連ペプチド＃２の誘導体により処理されたとき、６−ヒドロキシドーパミンにさらされた、Ａ５３Ｔα−シヌクレインを過剰発現する神経芽細胞腫細胞において明らかにされた。それぞれの実験が３回繰り返された。＊ｐ＜０．０５（ビヒクルにより処置され、同じ毒性傷害にさらされたコントロール細胞と比較した場合）。
【００６５】
【図１０】図１０は、変異型α−シヌクレインを過剰発現する細胞におけるペプチドＴＡＴ２ａ（配列番号２４）による、過酸化水素毒性に対する保護を例示する棒グラフである。著しく増大した生存能力が、ＤＪ−１関連ペプチドＴＡＴ２ａ（配列番号２４）により処理されたとき、過酸化水素にさらされた、Ａ５３Ｔα−シヌクレインを過剰発現する神経芽細胞腫細胞において明らかにされた。＊ｐ＜０．０５（ビヒクルにより処置され、同じ毒性傷害にさらされたコントロール細胞と比較した場合）。
【００６６】
【図１１】図１１は、ＤＪ−１関連ペプチドがドーパミン毒性に対してインビトロで保護することを例示する棒グラフである。細胞が、ＤＪ−１関連ペプチド＃２の誘導体による前処理を伴って、または伴うことなく、増大する用量のドーパミン（０〜５０ｕＭ）にさらされた。示された実験はヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対して行われ、３回繰り返された。＊ｐ＜０．０５（ビヒクルにより処置され、同じドーパミン用量にさらされたコントロール細胞と比較した場合）。
【００６７】
【図１２Ａ−１２Ｂ】図１２Ａ−１２Ｂは、ＤＪ−１関連ペプチドがＮＳＣ−３４細胞において過酸化水素およびＳＩＮ−Ｉの毒性に対して保護することを例示する棒グラフである。増大した生存能力が、生理的食塩水と比較した場合、過酸化水素（図１２Ａ）またはＳＩＮ−Ｉ（図１２Ｂ）の毒性暴露前に、ＮＳＣ−３４細胞がＤＪ−１関連ペプチドＴＡＴ２ａ（配列番号２４）またはＤＪ−１関連ペプチドＴＡＴ２ｂ（配列番号２５）により前処理されたときに見出された。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１（同じ毒性傷害にさらされたコントロール細胞と比較した場合）。
【００６８】
【図１３】図１３は、ＤＪ−１関連ペプチド＃２の誘導体がＡＬＳの細胞モデルにおいて保護することを例示する棒グラフである。増大した代謝活性が、生理的食塩水と比較した場合、ＳＩＮ−Ｉ毒性暴露前に、ＮＳＣ−３４細胞がＤＪ−１関連ペプチド＃２の誘導体により前処理されたときに見出された。変異ペプチド＃２は、示されるように、ＳＩＮ−Ｉ毒性に対して保護することができなかった。示された実験は３回繰り返された。＊ｐ＜０．０５（同じ毒性傷害にさらされたコントロール細胞と比較した場合）。
【００６９】
【図１４】図１４は、ＤＪ−１関連ペプチドがＵＶ線に対して細胞モデルにおいて保護することを例示する棒グラフである。増大した代謝活性が、生理的食塩水と比較した場合、ＵＶ線暴露前に、ＨａＣａＴ細胞がＤＪ−１関連ペプチドＩＩ（配列番号８）またはＤＪ−１関連ペプチドＴＡＴ２ａ（配列番号２４）により前処理されたときに見出された。示された実験は３回繰り返された。＊ｐ＜０．０５（コントロールと比較した場合）。
【００７０】
【図１５Ａ−１５Ｂ】図１５Ａ−１５Ｂは、線条体内へのＴＡＴ２ａペプチド注入がインビボ６−ヒドロキシドーパミン片側パーキンソン症候群マウスモデルに対して保護することを例示する棒グラフである。生理的食塩水に溶解された１００μＭペプチドＴＡＴ２ａ（配列番号２４）または生理的食塩水単独の２μｌが６−ヒドロキシドーパミン傷害化の１時間前に右側線条体に定位注入された。傷害後２週間および４週間での著しく低下したアンフェタミン誘発回転が、コントロールと比較した場合、ペプチド処置マウスにおいて見出された。＊ｐ＜０．０１（図１５Ａ）。そのうえ、傷害マウスのより少ない割合がアンフェタミン注入に応答して回転した（図１５Ｂ）。実験が２回繰り返された。
【００７１】
【図１６Ａ−１６Ｂ】図１６Ａ−１６Ｂは、静脈内（ＩＶ）へのペプチドＴＡＴ２ａ（配列番号２４）注入がインビボ６−ヒドロキシドーパミン片側パーキンソン症候群マウスモデルに対して保護することを例示する棒グラフである。５０μｇのペプチドＴＡＴ２ａ（配列番号２４）または生理的食塩水単独が６−ヒドロキシドーパミン傷害化の４時間前にＩＶ注入された。著しく低下したアンフェタミン誘発回転が、コントロールと比較した場合、ＩＶペプチド処置マウスにおいて見出された。＊ｐ＜０．０１（図１６Ａ）。傷害マウスのより少ない割合がアンフェタミン注入に応答して回転した（図１６Ｂ）。
【００７２】
【図１７】図１７は、ペプチド（配列番号２５）の皮下注入がＭＰＴＰパーキンソンモデルに対して保護することを例示する棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
多くの神経変性障害が酸化ストレスに関連すると考えられる（例えば、パーキンソン病および卒中など）。蓄積しつつあるデータは、ＤＪ−１（１８９アミノ酸の小さいタンパク質）が、様々な細胞プロセスに、とりわけ、酸化ストレスに関与することを明らかにしており、神経変性疾患を処置するためのその使用が提案されている。
【００７４】
本開示は、そのいくつかの実施形態において、酸化ストレス関連障害を処置するために有用であるＤＪ−１関連ペプチドに関連する。治療活性を構成するＤＪ−１タンパク質における２つの最小コア配列が本開示に関連して特定されている。そのようなコア配列の１つまたは複数を含んだ数多くのペプチドが調製されており、神経保護特性が明らかにされている。
【００７５】
具体的には、これら２つのコア配列の少なくとも１つを含むＤＪ−１関連ペプチドは、インビトロ細胞系における、６−ヒドロキシドーパミン、ドーパミンおよびＨ２Ｏ２を含む毒性傷害に対して保護することができ（図１Ａ〜図１Ｆ、図２Ａ〜図２Ｂ、図３、図１１、図１２Ａ）、同様にまた、血清欠乏に対して保護することができ（図４Ａ）、一方、特定されたコア配列のどちらも含まない他のＤＪ−１関連ペプチドはそのような神経保護特性を何ら構成しないこと（図４Ｂ）が見出されている。実験が初代培養物（図５Ａ〜図５Ｂ）および分化した神経幹細胞（図６）において繰り返され、同じ結果であった。
【００７６】
本開示の別の局面が、変異型Ａ５３Ｔα−シヌクレインを神経芽細胞腫細胞において過剰発現する、パーキンソン病のインビトロ細胞モデルに関連する。本開示の実施形態のＤＪ−１関連ペプチドは、このインビトロ細胞モデルにおいて６−ヒドロキシドーパミン毒性（図９）およびＨ２Ｏ２毒性（図１０）に対して保護することが明らかにされた。
【００７７】
本開示のさらに別の局面が、ＡＬＳおよびＵＶ照射についての細胞モデルに関連し、このモデルにおいて、本開示の実施形態のＤＪ−１関連ペプチドが、これらのアッセイにおいて同様に保護することが明らかにされた（図１３および図１４）。
【００７８】
最後に、本開示の実施形態のＤＪ−１関連ペプチドがパーキンソン病のインビボモデルにおいて試験される。ある種のＤＪ−１関連ペプチドが局所投与（図１５Ａ〜図１５Ｂ）および全身投与（図１６Ａ〜図１６Ｂ）の両方の後で治療活性を示した。
【００７９】
まとめると、本開示によれば、ＤＪ−１に由来するペプチド（「ＤＪ−１関連ペプチド」）が酸化ストレス関連障害の処置のために使用され得ることが見出されている。表現「酸化ストレス状態」は、本明細書中で使用される場合、正常なレベルを超えて活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルを上昇させる状態を示す。述べられるように、これは、抗酸化剤の不足から、または、多すぎるフリーラジカルから生じるかもしれない。例示的なＲＯＳ状態は、６−ヒドロキシドーパミン毒性、過酸化水素毒性、ＵＶ線およびドーパミン毒性を含むが、これらに限定されない。
【００８０】
いくつかの実施形態において、本開示のいくつかの局面は、本明細書中により詳しく記載されるように、長さが最大でも２０アミノ酸である短いＤＪ−１関連ペプチドに関連する。より具体的には、本開示の１つの局面によれば、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたＤＪ−１関連ペプチドまたはそのペプチド模倣体（ただし、単離されたペプチドは酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる）が提供される。
【００８１】
ＫＧＡＥＥＭＥＴＶＩＰＶＤＶＭＲＲＡＧＩ−（配列番号１；これはまた、本明細書中では＃ペプチド２として示される）
本開示のこの局面の実施形態によれば、ペプチドは、配列番号１に示されるようなアミノ酸配列に由来する少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個の連続するアミノ酸を含む。
【００８２】
ＫＧＡＥＥＭＥＴＶＩＰＶＤＶＭＲＲＡＧＩ−（配列番号１）
本開示のこの局面の１つの実施形態によれば、ペプチドは、配列番号１の最大でも１０個の連続するアミノ酸を含む。
【００８３】
本開示のこの局面の他の実施形態によれば、ペプチドは、配列番号１の最大でも１５個の連続するアミノ酸を含む。
【００８４】
本開示のこの局面のペプチドに含まれる例示的配列には、配列番号１〜配列番号１２、配列番号３８または配列番号３９が含まれる。
【００８５】
本開示の別の局面によれば、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体（ただし、単離されたペプチドは酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる）が提供される。
【００８６】
ＥＧＰＹＤＶＶＶＬＰＧＧＮＬＧＡＱＮＬＳ−（配列番号２；これはまた、本明細書中ではペプチド＃５として示される）
本開示のこの局面の実施形態によれば、ペプチドは、配列番号２に示されるようなアミノ酸配列に由来する少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個の連続するアミノ酸を含む。
【００８７】
本開示のこの局面の１つの実施形態によれば、ペプチドは、配列番号２の最大でも１０個の連続するアミノ酸を含む。
【００８８】
本開示のこの局面の他の実施形態によれば、ペプチドは、配列番号２の最大でも１５個の連続するアミノ酸を含む。
【００８９】
本開示のこの局面のペプチドに含まれる例示的配列には、配列番号２、配列番号１３〜配列番号２０、配列番号４０〜配列番号４２が含まれる。
【００９０】
本明細書において使用される用語「ペプチド」には、天然のペプチド（分解産物または合成的に合成されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドのいずれか）、ペプチド模倣体（典型的には合成的に合成されたペプチド）そしてポリペプチドアナログであるペプトイドおよびセミペプトイドを含む、天然または合成アミノ酸のポリマーを示し、これらは、例えば、ペプチドを体内でより安定化させる修飾、またはペプチドの細胞浸透能力を高める修飾を有し得る。
【００９１】
そのような修飾には、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ポリペプチド結合の修飾（ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨまたはＣＦ＝ＣＨを含むが、これらに限定されない）、骨格の修飾、および残基の修飾が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド模倣体化合物を調製するための方法はこの分野では十分に知られており、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に具体的に記載される（これは、全体が本明細書中に示されるように参考として組み込まれる）。これに関するさらなる詳細が本明細書中下記に示される。
【００９２】
ポリペプチド内のポリペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、ｏ−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは任意のアルキル（例えば、メチル）である）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ポリペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子において自然界で示される「通常」の側鎖である）によって置換することができる。
【００９３】
これらの修飾は、ポリペプチド鎖に沿った結合の任意のところに存在させることができ、そして同時に数カ所（２カ所〜３カ所）においてさえ存在させることができる。
【００９４】
天然の芳香族アミノ酸（Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）は、フェニルグリシン、Ｔｉｃ、ナフチルアラニン（Ｎａｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ−メチル−Ｔｙｒなどの合成された非天然型の酸に置換することができる。
【００９５】
上述のことに加えて、本発明のポリペプチドは一以上の修飾されたアミノ酸または一以上の非アミノ酸モノマー（例えば脂肪酸、複合体炭水化物など）も含むことができる。
【００９６】
従って、本明細書において使用される用語「アミノ酸」には、２０個の天然に存在するアミノ酸；インビボで多くの場合には翻訳後修飾されたそのようなアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンを含む）；および他の非通常型アミノ酸（２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンを含むが、これらに限定されない）が含まれることが理解される。さらに、用語「アミノ酸」には、この用語が本明細書中で定義されるように少なくとも１つの付加アミノ酸にペプチド結合またはペプチド結合アナログを介して連結されるＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸（異性体）の両方が含まれる。
【００９７】
下記の表１〜表２には、天然に存在するアミノ酸のすべて（表１）および非通常型アミノ酸または修飾型アミノ酸（表２）が示される。
【００９８】
【００９９】
本発明のペプチドのアミノ酸は、保存的または非保存的のどちらでも置換され得る。
【０１００】
用語「保存的置換」は、本明細書中で使用される場合、ペプチドにおける天然配列に存在するアミノ酸が、類似する立体的特性を有する天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸あるいはペプチド模倣体により置き換えられることを示す。置換されることになる天然アミノ酸の側鎖が極性または疎水性のどちらかである場合、保存的置換は、（置換されたアミノ酸の側鎖と同じ立体的特性を有することに加えて）同様に極性または疎水性である天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、または、ペプチド模倣体成分によるものでなければならない。
【０１０１】
天然に存在するアミノ酸は典型的には、それらの特性に従ってグループ分けされるので、天然に存在するアミノ酸による保存的置換は、本発明によれば、立体的に類似する非荷電アミノ酸による荷電アミノ酸の置換は保存的置換として見なされるという事実を念頭において容易に決定することができる。
【０１０２】
天然に存在しないアミノ酸による保存的置換を生じさせるために、この技術分野では広く知られているアミノ酸アナログ（合成アミノ酸）を使用することもまた可能である。天然に存在するアミノ酸のペプチド模倣体が、当業者に知られている文献において十分に記録されている。
【０１０３】
保存的置換に影響するとき、代用アミノ酸は、元のアミノ酸と同じまたは類似する官能基を側鎖に有しなければならない。
【０１０４】
表現「非保存的置換」は、本明細書中で使用される場合、親配列に存在するようなアミノ酸が、異なる電気化学的特性および／または立体的特性を有する別の天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸によって置き換えられることを示す。したがって、代用アミノ酸の側鎖は、置換される天然アミノ酸の側鎖よりも著しく大きく（または小さく）することができ、かつ／または、置換されるアミノ酸とは著しく異なる電子的特性を有する官能基を有することができる。このタイプの非保存的置換の例には、アラニンに代わるフェニルアラニンまたはシクロヘキシルメチルグリシンへの置換、グリシンに代わるイソロイシンへの置換、アスパラギン酸に代わる−ＮＨ−ＣＨ［（−ＣＨ２）５−ＣＯＯＨ］−ＣＯ−への置換が含まれる。本発明の範囲に含まれるそれらの非保存的置換は、抗菌特性を有するペプチドを依然として構成する非保存的置換である。
【０１０５】
述べられたように、本発明のペプチドのＮ末端およびＣ末端は官能基によって保護することができる。好適な官能基が、ＧｒｅｅｎおよびＷｕｔｓ、“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、第５章および第７章、１９９１）に記載される（その教示は参照によって本明細書中に組み込まれる）。好ましい保護基は、保護基に結合した化合物の細胞内への輸送を、例えば、化合物の親水性を低下させ、また、化合物の親油性を増大させることによって容易にするものである。
【０１０６】
これらの成分は、細胞の内部で、加水分解または酵素的のどちらかによってインビボで切断され得る。ヒドロキシル保護基には、エステル、カルボナートおよびカルバマート保護基が含まれる。アミン保護基には、Ｎ末端保護基について上記で記載されるように、アルコキシカルボニル基およびアリールオキシカルボニル基が含まれる。カルボン酸保護基には、Ｃ末端保護基について上記で記載されるように、脂肪族エステル、ベンジル型エステルおよびアリールエステルが含まれる。１つの実施形態において、本発明のペプチドにおける１つまたは複数のグルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基の側鎖におけるカルボン酸基が、好ましくはメチルエステル、エチルエステル、ベンジルエステルまたは置換ベンジルエステルにより保護される。
【０１０７】
Ｎ末端保護基の例には、アシル基（−ＣＯ−Ｒ１）およびアルコキシカルボニル基またはアリールオキシカルボニル基（−ＣＯ−Ｏ−Ｒ１）（式中、Ｒ１は、脂肪族基、置換脂肪族基、ベンジル基、置換ベンジル基、芳香族基または置換芳香族基である）が含まれる。アシル基の具体的な例には、アセチル、（エチル）−ＣＯ−、ｎ−プロピル−ＣＯ−、ｉｓｏ−プロピル−ＣＯ−、ｎ−ブチル−ＣＯ−、ｓｅｃ−ブチル−ＣＯ−、ｔ−ブチル−ＣＯ−、ヘキシル、ラウロイル、パルミトイル、ミリストイル、ステアリル、オレオイル、フェニル−ＣＯ−、置換フェニル−ＣＯ−、ベンジル−ＣＯ−および（置換ベンジル）−ＣＯ−が含まれる。アルコキシカルボニル基およびアリールオキシカルボニル基の例には、ＣＨ３−Ｏ−ＣＯ−、（エチル）−Ｏ−ＣＯ−、ｎ−プロピル−Ｏ−ＣＯ−、ｉｓｏ−プロピル−Ｏ−ＣＯ−、ｎ−ブチル−Ｏ−ＣＯ−、ｓｅｃ−Ｏ−ブチル−ＣＯ−、ｔ−ブチル−Ｏ−ＣＯ−、フェニル−Ｏ−ＣＯ−、置換フェニル−Ｏ−ＣＯ−およびベンジル−Ｏ−ＣＯ−、（置換ベンジル）−Ｏ−ＣＯ−が含まれる。アダマンタン、ナフタレン、ミリストレイル、ツルエン、ビフェニル、シンナモイル、ニトロベンゾイル、トルオイル、フロイル、ベンゾイル、シクロヘキサン、ノルボルナン、Ｚ−カプロン酸。Ｎ−アシル化を促進させるために、１個〜４個のグリシン残基を分子のＮ末端に存在させることができる。
【０１０８】
化合物のＣ末端におけるカルボキシル基は、例えば、アミド（すなわち、Ｃ末端におけるヒドロキシル基が、−ＮＨ２、−ＮＨＲ２および−ＮＲ２Ｒ３により置換される）またはエステル（すなわち、Ｃ末端におけるヒドロキシル基が−ＯＲ２により置換される）によって保護することができる。Ｒ２およびＲ３は独立して、脂肪族基、置換脂肪族基、ベンジル基、置換ベンジル基、アリール基または置換アリール基である。加えて、窒素原子と一緒になって、Ｒ２およびＲ３は、約０個〜２個のさらなるヘテロ原子（例えば、窒素、酸素またはイオウなど）を有するＣ４〜Ｃ８の複素環式環を形成することができる。好適な複素環式環の例には、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリノ、チオモルホリノまたはピペラジニルが含まれる。Ｃ末端保護基の例には、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＮＨ（エチル）、−Ｎ（エチル）２、−Ｎ（メチル）（エチル）、−ＮＨ（ベンジル）、−Ｎ（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（ベンジル）、−ＮＨ（フェニル）、−Ｎ（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）（フェニル）、−ＯＣＨ３、−Ｏ−（エチル）、−Ｏ−（ｎ−プロピル）、−Ｏ−（ｎ−ブチル）、−Ｏ−（ｉｓｏ−プロピル）、−Ｏ−（ｓｅｃ−ブチル）、−Ｏ−（ｔ−ブチル）、−Ｏ−ベンジルおよび−Ｏ−フェニルが含まれる。
【０１０９】
本発明のＤＪ−１関連ペプチドは浸透性作用因子に（共有結合または非共有結合のどちらによってでも）結合することができる。
【０１１０】
本明細書中で使用される場合、表現「浸透性作用因子」は、細胞膜を横断する結合ペプチドのいずれかの転位置を高める作用因子を示す。
【０１１１】
１つの実施形態によれば、浸透性作用因子はペプチドであり、ペプチド結合を介して（直接的または非直接的のどちらでも）ＤＪ−１関連ペプチドに結合される。
【０１１２】
典型的には、ペプチド浸透性作用因子は、正荷電アミノ酸（例えば、リシンまたはアルギニンなど）の比較的大きい存在量を含有するアミノ酸組成を有するか、または、極性／荷電アミノ酸および非極性の疎水性アミノ酸の交互パターンを含有する配列を有するかのどちらかである。
【０１１３】
ペプチド浸透性作用因子の例には、配列番号２１〜配列番号２３に示されるものが含まれる。限定されない例として、細胞浸透ペプチド（ＣＰＰ）配列を、細胞内浸透を高めるために使用することができる。ＣＰＰは、ＴＡＴの短い形態および長い形態（ＹＧＲＫＫＲＲ−配列番号２１、および、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−配列番号２２）、ならびに、ＰＴＤ（ＲＲＱＲＲ−配列番号２３）を含むことができる。しかしながら、開示はそのように限定されず、当業者によって知られているように、好適な浸透性作用因子はどれも使用することができる。
【０１１４】
具体的な実施形態によれば、本発明のペプチドは最大でも２５アミノ酸である（これには、何らかのさらなる結合した配列（例えば、上記で記載されるような細胞浸透ペプチドなど）と一緒にＤＪ−１関連ペプチドが含まれる）。
【０１１５】
本発明のペプチドはまた、非アミノ酸成分を含むことができる；例えば、ペプチドに結合される疎水性成分（様々な線状、分岐型、環式、多環式または複素環式の炭化水素および炭化水素誘導体）；ペプチド以外の浸透性作用因子；とりわけ、化合物が線状である場合には、分解を低下させるために化合物の末端に結合される様々な保護基など。化合物に存在する化学的（非アミノ酸）基は、様々な生理学的特性を改善するために含まれ得る：例えば、低下した分解またはクリアランス；様々な細胞ポンプによる低下した反発など、免疫原性活性を改善する、様々な投与様式を改善する（例えば、様々なバリアを介した浸透、消化管を介した浸透などを可能にする様々な配列の結合など）；増大した特異性、増大した親和性、低下した毒性およびその他。
【０１１６】
本発明のペプチドのアミノ酸配列成分を他の非アミノ酸作用因子に結合することは、本発明の最終的なペプチドを製造するために、共有結合により連結することによって；非共有結合による複合体化によって、例えば、分解または切断されて、これにより、持続した放出が可能である化合物を生じさせることができる疎水性ポリマーへの複合体化によって；ペプチドのアミノ酸部分をリポソームまたはミセルに閉じ込めることによって行うことができる。連携を、本発明の最終的なペプチドを製造するために、アミノ酸配列を他方の成分（リポソーム、ミセル）の中に閉じ込めることによって、または、アミノ酸配列をポリマー内に含浸することによって行うことができる。
【０１１７】
本発明のペプチドは線状または環状とすることができる（環化は安定性を改善することができる）。環化を、この技術分野で知られているどのような手段によってでも行うことができる。化合物が主としてアミノ酸から構成される場合、環化は、Ｎ末端からＣ末端への環化、Ｎ末端から側鎖への環化およびＮ末端から骨格への環化、Ｃ末端から側鎖への環化、Ｃ末端から骨格への環化、側鎖から骨格への環化および側鎖から側鎖への環化、同様にまた、骨格から骨格への環化により行うことができる。ペプチドの環化はまた、ペプチドに含まれる非アミノ酸有機成分を介して行うことができる。
【０１１８】
本発明のペプチドは、例えば、標準的な固相技術を使用することなどによって生化学的に合成することができる。これらの方法には、もっぱらの固相合成、部分的固相合成法、フラグメント縮合、古典的溶液合成が含まれる。固相ポリペプチド合成手順がこの技術分野では広く知られており、Ｊｏｈｎ Ｍｏｒｒｏｗ ＳｔｅｗａｒｔおよびＪａｎｉｓ Ｄｉｌｌａｈａ Ｙｏｕｎｇによってさらに記載される（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８４）。
【０１１９】
大規模ペプチド合成がＡｎｄｅｒｓｓｏｎによって記載される（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２０００、５５（３）：２２７〜５０）。
【０１２０】
合成ペプチドは調製用高速液体クロマトグラフィーによって精製することができ［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ Ｔ．（１９８３）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．］、その組成をアミノ酸配列決定によって確認することができる。
【０１２１】
組換え技術もまた、本発明のペプチドを作製するために使用することができる。本発明のペプチドを、組換え技術を使用して製造するためには、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドが核酸発現ベクターに連結される。この場合、核酸発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列を、本発明のポリペプチドの構成的転写、組織特異的転写または誘導可能な転写を宿主細胞において導くために好適なシス調節配列（例えば、プロモーター配列）の転写制御下に含む。
【０１２２】
宿主細胞において合成可能であることに加えて、本発明のペプチドはまた、インビトロ発現システムを使用して合成することができる。これらの方法はこの技術分野では広く知られており、また、このシステムの構成成分が市販されている。
【０１２３】
述べられるように、本発明のペプチドは、酸化ストレス関連障害を処置するために使用することができる。
【０１２４】
本明細書中で使用される場合、表現「酸化ストレス」は、酸化剤の数が抗酸化剤の数を上回る望ましくない不均衡を示す。ＲＯＳ産生の速度が、存在する抗酸化性防御を圧倒するならば、この状況が生じ得る。そのような環境では、ＲＯＳ産生における一層より大きい増大をもたらし得る一連の細胞応答が生じ得る。過度なＲＯＳ産生およびその異なった効果的でない調節は細胞および組織にとって有害となり得るので、究極的には細胞死（アポトーシス）を引き起こし得る細胞損傷を誘導する。酸化ストレス関連損傷はまた、アポトーシスの代わりに細胞の増殖を生じさせ得る、細胞の構造的一体性および機能的一体性に対する望ましくない変化を引き起こし得る。加えて、酸化損傷を受けた、細胞の高分子は、疾患を引き起こし得る免疫応答を誘発し得る。一般には、Ｄ．Ｇ．Ｌｉｎｄｓａｙ他（２００２）、Ｍｏｌ．Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｍｅｄ．、２３：１〜３８を参照のこと（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０１２５】
酸化ストレスが、疾患を開始させるか、または、そうでなければ、疾患を生じさせることに関わっているかもしれないことが理解されるであろう。代替において、または、加えて、疾患の進行が何らかの生じた酸化ストレスによって影響され得る。
【０１２６】
したがって、表現「酸化ストレス関連障害」は、本明細書中で使用される場合、その発症または進行が酸化ストレスによって促進される疾患または医学的状態（症候群を含む）を示す。酸化ストレスは、多くの神経学的疾患、心臓疾患、悪性疾患および加齢関連疾患の病理発生に関わっていると考えられるので、本発明では、すべてのそのような疾患が意図され、これらには、例えば、アテローム性動脈硬化、自己免疫疾患、ガン、心臓血管疾患、白内障、認知症、糖尿病および糖尿病性血管症、ならびに、神経変性疾患が含まれる。
【０１２７】
例示的な神経変性疾患には、パーキンソン病、多発性硬化症、ＡＬＳ、多系統萎縮症、アルツハイマー病、卒中、進行性核上麻痺、第１７染色体に連鎖するパーキンソン症候群を伴う前頭側頭型認知症、および、ピック病が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２８】
本発明のペプチドは、それ自体で、あるいは、本発明のペプチドが好適なキャリアまたは賦形剤と混合される医薬組成物の一部として提供され得る。
【０１２９】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。
【０１３０】
本明細書中において、用語「有効成分（活性成分）」は、生物学的効果を説明することができるＤＪ−１関連ペプチドを示す。
【０１３１】
本明細書中以降、表現「生理学的に許容されるキャリア」および表現「医薬的に許容されるキャリア」は、交換可能に使用され得るが、生物に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された化合物の生物学的な活性および性質を妨げないキャリアまたは希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に包含される。
【０１３２】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１３３】
薬物の配合および投与のための技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出されることができ、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【０１３４】
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に経鼻送達、腸管送達、または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射、例えば、総冠状動脈中への右又は左心室中への心内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が含まれることができる。
【０１３５】
中枢神経系（ＣＮＳ）への薬物送達のための従来からの取り組みには、下記が含まれる：神経外科的方策（例えば、脳内注射、脳室内注入）；ＢＢＢの内因性輸送経路の１つを利用する試みでの薬剤の分子的操作（例えば、ＢＢＢを自身が越えることができない薬剤との組合せで、内皮細胞表面分子に対する親和性を有する輸送ペプチドを含むキメラな融合タンパク質の製造）；薬剤の脂質溶解性を増大させるために設計される薬理学的方策（例えば、脂質キャリアまたはコレステロールキャリアへの水溶性薬剤のコンジュゲート化）；および、高浸透圧破壊によるＢＢＢの一体性の一時的破壊（これは、頸動脈へのマンニトール溶液の注入、または、生物学的活性薬剤（例えば、アンギオテンシンペプチドなど）の使用から生じる）。しかしながら、これらの方策のそれぞれが制限を有する：例えば、侵襲的外科的手順に関連する固有的危険性、内因性輸送系において固有的な制限によって負わされるサイズ制限、ＣＮＳ以外において活性であり得るキャリアモチーフから構成されるキメラ分子の全身投与に関連する潜在的に望ましくない生物学的副作用、および、ＢＢＢが破壊される脳の領域の内部における脳損傷の起こり得る危険性（これはこの方策を最適でない送達方法にする）など。
【０１３６】
あるいは、例えば、患者の組織領域に直接的に医薬組成物の注射をすることによって、全身的な方法よりも局所的に医薬組成物を投与することができる。
【０１３７】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られているプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥のプロセスによって製造されることができる。
【０１３８】
本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用されることができる調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容されるキャリアを使用して従来の様式で配合されることできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【０１３９】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合しうる緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な食塩緩衝液など）において配合されることができる。経粘膜投与の場合、浸透されるバリヤーに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０１４０】
経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物をこの分野でよく知られている医薬的に許容されるキャリアと組み合わせることによって容易に配合されることができる。そのようなキャリアは、医薬組成物が、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物は、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、錠剤または糖衣錠コアを得るために、望ましい好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製されることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーである。もし望むなら、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤が加えられることができる。
【０１４１】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有しうる。色素または顔料は、活性化合物の量を明らかにするために、または活性化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えられることができる。
【０１４２】
経口使用されうる医薬組成物としては、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが挙げられる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）、および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分は、好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁されることができる。さらに、安定化剤が加えられることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【０１４３】
口内投与の場合、組成物は、従来の方法で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０１４４】
鼻吸入による投与の場合、本発明による使用のための有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投与量は、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定されることができる。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは、化合物および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有して配合されることができる。
【０１４５】
本明細書中に記載される医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合されることができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供されることができる。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【０１４６】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態の活性調製物の水溶液が含まれる。さらに、有効成分の懸濁物は、適切な油性または水性の注射用懸濁物として調製されることができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが挙げられる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために、有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０１４７】
あるいは、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、無菌の、パイロジェン不含水溶液）を使用前に用いて構成される粉末形態であることができる。
【０１４８】
本発明の医薬組成物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合されることができる。
【０１４９】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物として、有効成分が、その意図された目的を達成するために有効な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、「治療有効量」は、処置されている対象の疾患（例えば、パーキンソン病）の症状を予防、緩和あるいは改善するために効果的であるか、または、処置されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分（ＤＪ−１関連ペプチド）の量を意味する。
【０１５０】
治療有効量の決定は、特に本明細書に与えられた詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１５１】
本発明の方法において使用されるいかなる調製物についても、投与量または治療有効量は、生体外および細胞培養アッセイから最初に推定されることができる。例えば、投与量は、所望の濃度または力価を達成するために動物モデルにおいて決定されることができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用されることができる。
【０１５２】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、生体外、細胞培養物、または実験動物における標準的な薬学的手法によって決定されることができる。これらの生体外、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を定めるために使用されることができる。投与量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化しうる。正確な配合、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択されることができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、（１９７５）「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１ ｐ．１を参照のこと）。
【０１５３】
投薬量および投薬間隔は、生物学的効果を誘導または抑制するために十分である有効成分の脳内レベルまたは血中レベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）に合わせて個々に調節することができる。ＭＥＣはそれぞれの調製物について異なるが、インビトロデータから見積もることができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は個々の特徴および投与経路に依存する。検出アッセイを、血漿中の濃度を求めるために使用することができる。
【０１５４】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、単回または複数回投与で行われることができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
【０１５５】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存するだろう。
【０１５６】
本発明の組成物は、所望されるならば、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパック）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随し得る。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きであり得るか、または、承認された製品添付文書であり得る。適合し得る医薬用キャリアに配合された本発明の調製物もまた、上でさらに詳述されたように、示された疾患を処置するために調製され、適切な容器に入れられ、かつ標識され得る。
【０１５７】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０１５８】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。
【０１５９】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。
【０１６０】
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。
【０１６１】
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【０１６２】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０１６３】
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【０１６４】
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
【０１６５】
本明細書で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
【０１６６】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０１６７】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０１６８】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１６９】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ−Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４），第３版；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１７０】
材料および方法
ＤＪ−１関連ペプチド：ＤＪ−１タンパク質のバイオインフォマティックデータおよびスクリーニングに基づいて、ＤＪ−１に基づく２０アミノ酸のいくつかのペプチド配列を選択することができる。神経保護特性を明らかにするペプチド配列がペプチド＃２およびペプチド＃５として設計され、それらの配列は下記の通りである：
ペプチド＃２：ＫＧＡＥＥＭＥＴＶＩＰＶＤＶＭＲＲＡＧＩ−配列番号１
ペプチド＃５：ＥＧＰＹＤＶＶＶＬＰＧＧＮＬＧＡＱＮＬＳ−配列番号２
【０１７１】
ペプチド＃２のより短いペプチド誘導体を下記のように合成することができる：
ＫＧＡＥＥＭＥＴＶＩＰＶＤ（Ｐｅｐ２ａ；配列番号３）；ＴＶＩＰＶＤＶＭＲＲＡＧＩ（Ｐｅｐ２ｂ；配列番号４）；ＥＭＥＴＶＩＰＶＤＶＭＲＲ（Ｐｅｐ２ｃ；配列番号５）；ＫＧＡＥＥＭＥＴＶＩＰＶＤＶＭ（配列番号６）；ＭＥＴＶＩＰＶＤＶＭＲＲＡＧＩ（配列番号７）；ＶＤＶＭＲＲＡＧＩ（ＰｅｐＩＩ；配列番号８）；ＫＧＡＥＥＭＥＴＶＩＰＶ（Ｐｅｐ ｓｈｏｒｔ２ａ；配列番号９）；ＧＡＥＥＭＥ−（ＰｅｐＩ；配列番号１０）；ＤＶＭＲＲＡＧＩ（Ｐｅｐ ｓｈｏｒｔ ＩＩ；配列番号１１）；ＴＶＩＰＶ−（ＰｅｐＩＩＩ；配列番号３７）；ＶＩＰ（ＰｅｐＩＶ；配列番号１２）。
【０１７２】
ペプチド＃５のより短いペプチド誘導体を下記のように合成することができる：
ＤＶＶＶＬＰＧＧ（ＰｅｐＶ；配列番号１３）；ＥＧＰＹＤＶＶＶＬＰＧＧＮ（配列番号１４）；ＶＬＰＧＧＮＬＧＡＱＮＬＳ（配列番号１５）；ＤＶＶＶＬＰＧＧＮＬＧＡＱ（配列番号１６）；ＥＧＰＹＤＶＶＶＬＰＧＧＮＬＧ（配列番号１７）；ＶＶＶＬＰＧＧＮＬＧＡＱＮＬＳ（配列番号１８）；ＥＧＰＹＤＶＶＶＬ（配列番号１９）；およびＧＮＬＧＡＱＮＬＳ（配列番号２０）。
【０１７３】
これらのペプチドが、製造者の説明書を使用して、ＰＵＬＳｉｎ法を使用して細胞に導入される。
【０１７４】
これらのペプチドはその後、細胞内浸透を高めるために細胞浸透ペプチド（ＣＰＰ）配列に結合される。使用されたＣＰＰには、ＴＡＴの短い形態および長い形態（ＹＧＲＫＫＲＲ−配列番号２１、および、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−配列番号２２）、ならびに、ＰＴＤ（ＲＲＱＲＲ−配列番号２３）が含まれた。
【０１７５】
ペプチド＃２のペプチド誘導体（これらは細胞浸透ペプチドに結合される）は下記の通りである：
Ｐｅｐ２ ＴＡＴａ：ＹＧＲＫＫＲＲＫＧＡＥＥＭＥＴＶＩＰＶＤ−配列番号２４
Ｐｅｐ２ ＴＡＴｂ：ＹＧＲＫＫＲＲＴＶＩＰＶＤＶＭＲＲＡＧＩ−配列番号２５
Ｐｅｐ２ ＴＡＴｃ：ＹＧＲＫＫＲＲＥＭＥＴＶＩＰＶＤＶＭＲＲ−配列番号２６
Ｐｅｐ２ ＰＴＤ−５ａ：ＲＲＱＲＲＫＧＡＥＥＭＥＴＶＩＰＶＤＶＭ−配列番号２７
Ｐｅｐ２ ＰＴＤ−５ｂ：ＲＲＱＲＲＭＥＴＶＩＰＶＤＶＭＲＲＡＧＩ−配列番号２８
Ｐｅｐ２ ｎｕｃ ＴＡＴ：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＶＤＶＭＲＲＡＧＩ−配列番号２９
【０１７６】
ペプチド＃５のペプチド誘導体（これらは細胞浸透ペプチドに結合される）：
Ｐｅｐ５ ＴＡＴａ：ＹＧＲＫＫＲＲＥＧＰＹＤＶＶＶＬＰＧＧＮ−配列番号３０
Ｐｅｐ５ ＴＡＴｂ：ＹＧＲＫＫＲＲＶＬＰＧＧＮＬＧＡＱＮＬＳ−配列番号３１
Ｐｅｐ５ ＴＡＴｃ：ＹＧＲＫＫＲＲＤＶＶＶＬＰＧＧＮＬＧＡＱ−配列番号３２
Ｐｅｐ５ ＰＴＤ−５ａ：ＲＲＱＲＲＥＧＰＹＤＶＶＶＬＰＧＧＮＬＧ−配列番号３３
Ｐｅｐ５ ＰＴＤ−５ｂ：ＲＲＱＲＲＶＶＶＬＰＧＧＮＬＧＡＱＮＬＳ−配列番号３４
Ｐｅｐ５ ｎｕｃ ＴＡＴａ：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＥＧＰＹＤＶＶＶＬ−配列番号３５
Ｐｅｐ５ ｎｕｃ ＴＡＴｂ：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＮＬＧＡＱＮＬＳ−配列番号３６
【０１７７】
細胞：ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞が、Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、米国）から得られる。細胞を、５％ＣＯ２の加湿雰囲気において３７℃で、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）およびグルタミン（５ｍＭ）が補充されるＤＭＥＭ培地で単層として無菌条件下で成長させる。培地を４日毎に定期的に交換し、細胞を８日後に継代する。すべての実験が、ほぼコンフルエンスである細胞に対して行われる。
【０１７８】
不死化されたヒトＨａＣａＴケラチノサイト細胞が、ＵＶ線誘導傷害に対して保護するＤＪ−１関連ペプチドの能力を試験するために使用される。細胞を、５ｃｍのペトリ皿において、０．０７５ｍＭ Ｃａ２＋（ＭＥＭ−７５）および１０％ＦＣＳを含有する最少必須培地で維持し、３日毎〜４日毎に継代培養する。
【０１７９】
初代培養物および神経幹細胞：神経始原細胞／幹細胞が生後ｃ５７／ｂｌマウスのマウス皮質から単離され、ニューロスフェアとして培養される。神経およびアストログリアの分化が誘導される。
【０１８０】
分化した神経始原細胞／幹細胞および未分化の神経始原細胞／幹細胞の、酸化的毒性傷害に対する感受性が、ＤＪ−１関連ペプチドによる事前の前処理を行って、または行うことなく求められる。
【０１８１】
生後ｃ５７／ｂｌマウスの皮質組織に由来するマウスのニューロン・星状膠細胞の初代培養物が、ＤＪ−１関連ペプチドの潜在的保護能を調べるために調製され、使用される。
【０１８２】
細胞の安定的トランスフェクション：ヒトの野生型またはＡ５３Ｔ変異型のα−シヌクレインｃＤＮＡのコード領域がｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）にサブクローン化される。Ａ５３Ｔ変異型α−シヌクレインの過剰発現を達成するために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞が、Ａ５３Ｔ変異型α−シヌクレインを含有するプラスミドにより安定的にトランスフェクションされる。トランスフェクションが、リポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して行われる。トランスフェクション細胞の選抜が、細胞を致死量のジェネティシン（Ｇ−４１８）により処理することによって行われる。ナイーブ神経芽細胞腫細胞、ならびに、空ベクターにより安定的にトランスフェクションされた細胞がコントロールとして使用される。
【０１８３】
安定的トランスフェクションが、リアルタイムＰＣＲおよびウエスタンブロッティングを使用してα−シヌクレインのｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルを測定することによって確認される。
【０１８４】
処置：神経芽細胞腫細胞を、ＲＯＳ形成を生じさせるために、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）（０〜１ｍＭ；Ｓｉｇｍａ，Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）、６−ヒドロキシドーパミン（０〜１００μＭ；Ｓｉｇｍａ，Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）、ドーパミン（０〜５００μＭ；Ｓｉｇｍａ，Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）および３−（４−モルホリニル）−シドノンイミン（ＳＩＮ−Ｉ）（０〜５ｍＭ；Ｓｉｇｍａ）（これはペルオキシニトリト系のフリーラジカルドナーである）と接触させる。
【０１８５】
細胞毒性アッセイおよび細胞生存能力アッセイ：いくつかの方法が、細胞代謝活性、ミトコンドリア活性および細胞生存能力に対する、酸化傷害、神経毒およびドーパミンの毒性影響を求めるために使用される。
【０１８６】
Ａｌａｍａｒブルー：細胞をウエルあたり５０００細胞の濃度で９６ウエルプレートに播種し、一晩接着させる。翌日、細胞が、血清非含有培地において、増大する用量のドーパミン（０〜５００ｕＭ）に４時間さらされる。Ａｌａｍａｒブルーは、代謝活性に応答して色を変化させるレドックス指標を取り込む非毒性試薬である。還元により誘導される色変化が細胞数および時間に関して比例して変化する。１０％のａｌａｍａｒブルーの溶液が、増大する用量のドーパミンにさらした４時間後に血清非含有培地において２時間加えられる。Ａｌａｍａｒブルーの蛍光を５４４ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの放射波長でＦＬＵＯｓｔａｒ分光蛍光計によって測定する。それぞれの実験がそれぞれの処置について三連で行われる。実験が３回繰り返される。
【０１８７】
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）細胞毒性：損傷細胞によって細胞培養上清に放出されるＬＤＨが、製造者の説明書に従ってＬＤＨ細胞毒性検出キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ、米国）を使用して求められる。ＬＤＨ活性の量が培養物における損傷細胞の数に相関する。培養上清に存在するＬＤＨは、黄色のテトラゾリウム塩を赤色のホルマザン産物に変換する共役反応に加わる。死細胞の百分率が吸光度値の下記式によって計算される：
（三連吸光度−低コントロール）／（最大吸収−低コントロール）×１００。
【０１８８】
最大吸収が、細胞を１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により処理することによって得られる。酵素活性の量が４９０ｎｍにおける吸光度によってマイクロプレートリーダーで測定される。それぞれの実験がそれぞれの処置について三連で行われる。実験が３回繰り返される。
【０１８９】
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２：アポトーシス細胞の核の形態学における変化を調べるために、細胞が核染料Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８で標識され、蛍光顕微鏡法で調べられる。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２は、ＤＮＡに対する親和性を有する細胞蛍光性透過性色素である。毒素暴露後、細胞を冷７０％エタノールにより固定処理し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（１０ｕｇ／ｍｌ）とインキュベーションする。核の形態学を蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ｂｘ５２、Ｌｅｅｄｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）で観察する。低下した核サイズ、クロマチン凝縮、強い蛍光および核の断片化を示した細胞が、アポトーシスしていると見なされる。
【０１９０】
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２は、無傷の膜または損傷した膜を有する細胞に入り、ＤＮＡを青く染色し、それにより、それぞれのウエルにおける細胞数の評価を同様に可能にする。ＦＬＵＯｓｔａｒ分光蛍光計マイクロプレートリーダーを、種々の用量の様々な毒素に対する暴露の後でのそれぞれのウエルにおける細胞数を評価するために使用することができる。励起が３４６ｎｍで行われ、放射波長が４６０ｎｍで測定される。実験がそれぞれの処置について三連で行われる。すべての実験が少なくとも３回繰り返される。
【０１９１】
ウエスタンブロッティング：ＷＴ型および変異型のα−シヌクレインの過剰発現が、ウエスタンブロットを使用して求められる。細胞をＰＢＳにより洗浄し、トリプシン処理し、遠心分離によって集める。全細胞溶解物を調製するために、細胞を溶解緩衝液（これは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１％ＳＤＳ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％デオキシコール酸ナトリウム、および、プロテアーゼ阻害剤のカクテル（Ｓｉｇｍａ）を含有する）に再懸濁する。タンパク質濃度を、タンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して求める。それぞれのサンプルから得られる総タンパク質の２５マイクログラムを１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分離し、ニトロセルロースメンブランに転写する。メンブランを５％脱脂乳において室温で１時間ブロッキング処理し、その後、モノクローナル抗α−シヌクレイン抗体（ＬＢ５０９、１：２０００；Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と４℃で一晩インキュベーションし、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体（１：１００００；Ｓｉｇｍａ）とインキュベーションし、ＥＣＬｐｌｕｓ検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により発色させる。メンブランはまた、α−シヌクレインの発現レベルをβ−アクチンのレベルに対して正規化するために、マウス抗β−アクチン抗体（１：１００００、Ｓｉｇｍａ）とインキュベーションされ、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体（１：１００００；Ｓｉｇｍａ）とインキュベーションされ、ＥＣＬｐｌｕｓ検出システムにより発色させられる。
【０１９２】
α−シヌクレインについての免疫細胞化学：細胞を４％パラホルムアルデヒドにより固定処理し、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により透過処理した。続いて、固定処理された細胞をブロッキング溶液においてインキュベーションし、その後、モノクローナル抗α−シヌクレイン抗体（ＬＢ５０９、１：２０００；Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と４℃で一晩インキュベーションし、その後、ａｌｅｘａ−５６８結合二次抗体とインキュベーションした。核をＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）によって対比染色する。核の形態学を蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ｂｘ５２、Ｌｅｅｄｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）で観察する。
【０１９３】
免疫細胞化学によるアポトーシス割合の評価：細胞を４％パラホルムアルデヒドにより固定処理し、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により透過処理する。その後、固定処理された細胞をブロッキング溶液においてインキュベーションし、その後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（１０ｕｇ／ｍｌ）とインキュベーションする。核の形態学を蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ｂｘ５２、Ｌｅｅｄｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）で観察する。低下した核サイズ、クロマチン凝縮、強い蛍光および核の断片化を示した細胞が、アポトーシスしていると見なされる。
【０１９４】
インビボでの６−ヒドロキシドーパミン誘導片側パーキンソン症候群マウスモデル：オスのｃ５７／ｂｌマウスがＰＤのこのインビボモデルのために使用される。マウスは、（０．０２％のアスコルビン酸を含有する２μｌの生理的食塩水に溶解された）４μｇの６−ヒドロキシドーパミン臭化水素酸塩の片側線条体内注入を、定位手術手順を使用して受けた。注入が、下記の座標を使用して中心線条体に対して向けられる：ブレグマに対して０．７ｍｍ前方、ブレグマに対して２．０ｍｍ側方、および、３．５ｍｍの深さ。
【０１９５】
線条体内６−ヒドロキシドーパミン傷害化の行動影響が、加速ロータロッド試験および腹腔内アンフェタミン（２．５ｍｇ／ｋｇ）誘導回転行動によって評価される。
【０１９６】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるカテコールアミンレベルの測定、および、免疫組織化学によって評価されるような病理学的損傷の程度の測定が、傷害化後１ヶ月で行われる。
【０１９７】
統計学的分析：統計学的分析が、ＳＰＳＳソフトウエアを使用して行われる。２つの群の間での比較が、両側スチューデントｔ検定を使用して行われる。３つ以上の群の間での統計学的分析が、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、その後、最小有意差（ＬＳＤ）事後比較を使用して行われる。結果が、平均±標準偏差によって表される。群間の差は、誤差確率（ｐ）が５％未満（ｐ≦０．０５）であったならば、有意であると見なされる。
【０１９８】
実施例１
細胞株において分析されるような本発明のペプチドの神経保護活性の分析
結果
Ｔａｔ２Ａ（配列番号２４）が、インビトロ細胞プラットホームを使用して、神経毒に対するその保護効果を求めるために調べられる。ペプチドが、ＰＵＬＳｉｎキット（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）によって、続いて、細胞浸透ペプチドへの結合によって神経芽細胞腫細胞に送達される。図１Ａ〜図１Ｆに例示されるように、試験されたペプチドのいくつかは、血清欠乏、過酸化水素、６−ヒドロキシドーパミンおよびドーパミンへの暴露によって誘導される酸化的神経毒性傷害に対する著しい保護効果を示した。これらのペプチドは、（ＭＴＴアッセイによって評価される）ミトコンドリア損傷を低下させ、（Ａｌａｍａｒブルー法によって示される）代謝損傷を低下させ、（ＬＤＨ細胞毒性検出キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によって評価される）細胞毒性を低下させ、かつ、（Ｈｏｅｃｈｓｔ染色による）細胞生存能力を増大させた。
【０１９９】
ＤＪ−１変異ペプチドは、いくつかのＤＪ−１関連ペプチドの保護効果を示す図２Ａ〜図２Ｂに例示されるように、それらの対応する非変異ペプチドの保護効果を示さなかった（＊ｐ＜０．０５）。
【０２００】
図３は、ＤＪ−１関連ペプチドが６−ヒドロキシドーパミン毒性に対してインビトロで保護することを例示し、これに対して、図４Ａは、ＤＪ−１関連ペプチドが血清欠乏に対して保護することを例示する。
【０２０１】
様々な非保存的ＤＪ−１関連ペプチドが、本発明のペプチドの特異的な効果を確認するためにコントロールとして使用された。これらのペプチドへの神経芽細胞腫細胞の暴露は、図４Ｂに例示されるように、６−ヒドロキシドーパミンまたは過酸化水素の処置によって誘導される傷害から細胞を保護しなかった。
【０２０２】
実施例２
初代マウス培養物において分析されるような本発明のペプチドの神経保護活性の分析
結果
初代培養物に対する、また、Ｃ５７／ｂｌマウスの脳から得られる分化した神経幹細胞および未分化の神経幹細胞に対するＤＪ−１ペプチドの保護効果が評価された。結果は、選択されたＤＪ−１関連ペプチドが、過酸化水素および６−ヒドロキシドーパミンの毒性に対して著しく保護したことを示す。具体的には、図５Ａ〜図５Ｂは、生後マウスの脳から得られる初代混合ニューロン・星状膠細胞培養物における酸化的毒性傷害に対するＴａｔ２Ａの保護を例示する。神経始原細胞／幹細胞を生後ｃ５７／ｂｌマウスのマウス皮質から単離し、ニューロスフェアとして培養した。神経およびアストログリアの分化を誘導した。
【０２０３】
分化した神経始原細胞／幹細胞および未分化の神経始原細胞／幹細胞の、酸化的毒性傷害に対する感受性を、図６に例示されるように、ＤＪ−１関連ペプチドによる事前の前処理を行って、または行うことなく求めた。
【０２０４】
実施例３
変異型α−シヌクレインの毒性に対する保護
Ａ５３Ｔ変異型α−シヌクレインは遺伝性パーキンソン病についての原因の１つである。変異α−シヌクレインを過剰発現する神経芽細胞腫細胞を、パーキンソン病についての細胞プラットホームとして使用した。Ａ５３Ｔ変異型α−シヌクレインの過剰発現を達成するために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞を、Ａ５３Ｔ変異型α−シヌクレインを含有するプラスミドにより安定的にトランスフェクションした。
【０２０５】
α−シヌクレインの過剰発現の確認が、α−シヌクレインについての免疫細胞化学染色により行われた。図７Ａは、ナイーブ神経芽細胞腫細胞のα−シヌクレイン染色を例示し、一方、図７Ｂは、Ａ５３Ｔ変異型α−シヌクレインによりトランスフェクションされた細胞のα−シヌクレイン染色を例示する。
【０２０６】
α−シヌクレインタンパク質の定量を、図８に例示されるように、ウエスタンブロッティングを使用して行った。
【０２０７】
ＤＪ−１関連ペプチドは、変異型Ａ５３Ｔα−シヌクレインを過剰発現する神経芽細胞腫細胞において６−ヒドロキシドーパミン毒性に対して保護すること（図９）、および、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）暴露によって誘導される純粋な酸化傷害に対して保護すること（図１０）が示された。
【０２０８】
実施例４
ＤＪ−１関連ペプチドはドーパミン毒性に対して保護する
神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、ＤＪ−１関連ペプチドによる事前の前処理を行って、または行うことなく、増大する用量のドーパミンにさらした。ドーパミンに対する脆弱性が、図１１に例示されるように、ＤＪ−１関連ペプチド処置によって統計学的に有意に弱まった。
【０２０９】
実施例５
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の細胞モデルに対する保護
ＮＳＣ−３４細胞をＡＬＳについての細胞モデルとして使用した。増大する用量の過酸化水素およびＳＩＮ−Ｉ（ＮＯドナー）（これらはＡＬＳの病理発生に関係している）を使用した。ＤＪ−１関連ペプチド＃２は、図１２Ａ〜図１２Ｂおよび図１３に例示されるように、ＡＬＳのこの細胞モデルにおいてＨ２Ｏ２およびＳＩＮ−Ｉの毒性に対する保護効果を示した。
【０２１０】
実施例６
ＤＪ−１関連ペプチドのＵＶ線に対して保護する能力
培養されたケラチノサイトを、ＵＶ線の損傷影響に対して保護するＤＪ−１関連ペプチドの能力を調べるために使用した。いくつかのＤＪ−１関連ペプチドが、図１４に示されるように、ＵＶ線により誘導される細胞死に対する著しい保護効果を示した。
【０２１１】
実施例７
ＤＪ−１関連ペプチドはパーキンソン病のインビボモデルに対して保護する
近年の研究では、ｔａｔに結合したタンパク質が、静脈内投与および腹腔内投与の後、脳に浸透し、脳に影響することが示されている［Ｋｉｍ他、２０１０；Ｄｏｅｐｐｎｅｒ他、２０１０］。本発明者らは、ペプチド２ａ（１３アミノ酸）をｔａｔに結合し、このペプチドを十分に確立されている６−ヒドロキシドーパミン片側パーキンソン症候群マウスモデルにおいて調べた。
【０２１２】
次に、線条体内注入されたＤＪ−１関連ペプチドの保護能を調べた。２つの群のオスｃ５７／ｂｌマウスが、生理的食塩水に溶解された１００μＭのＴＡＴ２ａ ＤＪ−１関連ペプチド（配列番号２４）または生理的食塩水単独のどちらかの２μｌを右側線条体に定位注入されて受けた。１時間後、４μｇの６−ヒドロキシドーパミンを、同じ座標を使用して注入した。行動研究には、アンフェタミン誘導回転行動および加速ロータロッド試験が含まれた。
【０２１３】
６−ヒドロキシドーパミンモデルにおけるＤＪ−１関連ペプチドの影響が２回試験された。合計で１０匹のｃ５７／ｂｌのオスマウスが最初の実験のために使用され、２６匹が２回目の実験で使用された。両方において、ペプチド処置マウスにおける著しく低下したアンフェタミン誘導回転が、コントロールと比較して見出された（ｐ＜０．０１）。これは２回の実験のそれぞれにおいて２回確認された：図１５Ａ〜図１５Ｂに例示されるように、最初は６−ヒドロキシドーパミン線条体傷害化後の２週間後、続いて、４週間後。
【０２１４】
加速ロータロッド試験では、有意差（ｐ＝０．０２）が、ＴＡＴ２ａペプチド（配列番号２４）処置マウスと、生理的食塩水処置コントロールとの間で明らかにされた。チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）についての免疫組織化学染色では、傷害された線条体におけるＴＨ染色の６−ヒドロキシドーパミン誘導喪失が、ｔａｔ２ａ ＤＪ−１関連ペプチド（配列番号２４）によって取り消されたことが明らかにされた。
【０２１５】
次に、ＤＪ−１関連ペプチドの全身投与の影響を調べた。ペプチドの静脈内送達を、６−ヒドロキシドーパミン片側パーキンソン症候群マウスモデルを調節するための手段として使用した。５０μｇのペプチドを６−ヒドロキシドーパミン傷害化の４時間前に静脈内投与した。コントロールと比較して、傷害化後２週間および４週間でのペプチド処置マウスにおけるアンフェタミン誘導回転における劇的な低下が見出された（図１６Ａおよび図１６Ｂ）。
【０２１６】
実施例８
パーキンソン病についての動物モデルを作製するために、マウスを１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）により処置した。５匹のマウス（Ｃ５７／ｂｌ）に、ＤＪ−１関連ペプチド（０．４ｍＭの皮下；配列番号２５）の存在下および非存在下で、２０ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰ（ｉ．ｐ．）を５日間連続して注射した。１８日後、マウスを屠殺し、２つの半球におけるドーパミンレベルをＨＰＬＣによって測定した。
【０２１７】
結果
実験の結果が図１７に明らかにされる。
【０２１８】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０２１９】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【配列表フリーテキスト】
【０２２０】
配列番号１〜４２は、合成ペプチドの配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３に示される配列を含む、最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドであって、酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる単離されたペプチド。
【請求項２】
酸化ストレス関連障害をその必要性のある対象において処置する方法であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体の治療効果的な量と、医薬的に許容されるキャリアとをそのような対象に投与し、単離されたペプチドが酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させ、それにより、酸化ストレス関連障害を処置することを含む方法。
【請求項３】
酸化ストレス関連障害をその必要性のある対象において処置する方法であって、配列番号２に示されるアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体の治療効果的な量と、医薬的に許容されるキャリアとをそのような対象に投与し、単離されたペプチドが酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させ、それにより、酸化ストレス関連障害を処置することを含む方法。
【請求項４】
配列番号１に示されるアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体であって、単離されたペプチドは、酸化ストレス関連障害を処置するのに使用するための酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる、単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体。
【請求項５】
配列番号２に示されるアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体であって、単離されたペプチドは、酸化ストレス関連障害を処置するのに使用するための酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる、単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体。
【請求項６】
前記酸化ストレス関連障害は神経変性疾患である、請求項２〜５のいずれかに記載の方法または単離されたペプチド。
【請求項７】
前記神経変性疾患は、パーキンソン病、多発性硬化症、ＡＬＳ、多系統萎縮症、アルツハイマー病、卒中、進行性核上麻痺、第１７染色体に連鎖するパーキンソン症候群を伴う前頭側頭型認知症、および、ピック病からなる群から選択される、請求項６に記載の方法または単離されたペプチド。
【請求項８】
配列番号１に示されるアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体と、医薬的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物であって、単離されたペプチドが酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる、医薬組成物。
【請求項９】
配列番号２に示されるアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体と、医薬的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物であって、単離されたペプチドが酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる、医薬組成物。
【請求項１０】
前記単離されたペプチドは、配列番号３に示される配列を含む、請求項２，４または８に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１１】
前記単離されたペプチドは、配列番号１４に示される配列を含む、請求項３，５または９に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１２】
前記単離されたペプチドは、配列番号２４に示される通りである、請求項１または１０に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１３】
前記単離されたペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に由来する少なくとも５個の連続するアミノ酸を含む、請求項２，４または８に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１４】
前記単離されたペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に由来する少なくとも５個の連続するアミノ酸を含む、請求項３，５または９に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１５】
前記単離されたペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に由来する最大でも１５個の連続するアミノ酸を含む、請求項２，４または８に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１６】
前記単離されたペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に由来する最大でも１５個の連続するアミノ酸を含む、請求項３，５または９に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１７】
前記単離されたペプチドは、最大でも２０アミノ酸である、請求項２〜９のいずれかに記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１８】
前記単離されたペプチドは、配列番号３８に示される配列を含む、請求項２，４または８に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１９】
前記単離されたペプチドは、配列番号３９に示される配列を含む、請求項２，４または８に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２０】
前記単離されたペプチドは、配列番号１０に示される配列を含む、請求項２，４または８に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２１】
前記単離されたペプチドは、配列番号１１に示される配列を含む、請求項２，４または８に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２２】
前記単離されたペプチドは、配列番号１または配列番号３に示される配列を含む、請求項２，４または８に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２３】
前記単離されたペプチドは、配列番号４０に示される配列を含む、請求項３，５または９に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２４】
前記単離されたペプチドは、配列番号１３に示される配列を含む、請求項２３に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２５】
前記単離されたペプチドは、配列番号４１に示される配列を含む、請求項３，５または９に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２６】
前記単離されたペプチドは、配列番号４２に示される配列を含む、請求項２５に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２７】
前記単離されたペプチドは、配列番号２に示される配列を含む、請求項３，５または９に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２８】
前記アミノ酸の少なくとも１つが、天然に存在するアミノ酸である、請求項２〜９のいずれかに記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２９】
前記アミノ酸の少なくとも１つが合成アミノ酸である、請求項２〜９のいずれかに記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３０】
前記単離されたペプチドは細胞浸透性作用因子に結合される、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３１】
前記単離されたペプチドは共有結合により結合される、請求項３０に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３２】
前記細胞浸透性作用因子はペプチド薬剤である、請求項３０に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３３】
前記ペプチド細胞浸透性作用因子は、配列番号２１〜配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３４】
前記単離されたペプチドは配列番号２４〜配列番号３６に示される通りである、請求項３３に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３５】
前記細胞はニューロン細胞を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３６】
前記ＲＯＳ状態は、６−ヒドロキシドーパミン毒性、過酸化水素毒性、ＵＶ線およびドーパミン毒性からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３７】
配列番号１に示されるアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体であって、単離されたペプチドは酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる、単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体。
【請求項３８】
配列番号２に示されるアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体であって、単離されたペプチドは酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる、単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体。
【請求項１】
配列番号３に示される配列を含む、最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドであって、酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる単離されたペプチド。
【請求項２】
酸化ストレス関連障害をその必要性のある対象において処置する方法であって、配列番号１に示されるアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体の治療効果的な量と、医薬的に許容されるキャリアとをそのような対象に投与し、単離されたペプチドが酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させ、それにより、酸化ストレス関連障害を処置することを含む方法。
【請求項３】
酸化ストレス関連障害をその必要性のある対象において処置する方法であって、配列番号２に示されるアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体の治療効果的な量と、医薬的に許容されるキャリアとをそのような対象に投与し、単離されたペプチドが酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させ、それにより、酸化ストレス関連障害を処置することを含む方法。
【請求項４】
配列番号１に示されるアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体であって、単離されたペプチドは、酸化ストレス関連障害を処置するのに使用するための酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる、単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体。
【請求項５】
配列番号２に示されるアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体であって、単離されたペプチドは、酸化ストレス関連障害を処置するのに使用するための酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる、単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体。
【請求項６】
前記酸化ストレス関連障害は神経変性疾患である、請求項２〜５のいずれかに記載の方法または単離されたペプチド。
【請求項７】
前記神経変性疾患は、パーキンソン病、多発性硬化症、ＡＬＳ、多系統萎縮症、アルツハイマー病、卒中、進行性核上麻痺、第１７染色体に連鎖するパーキンソン症候群を伴う前頭側頭型認知症、および、ピック病からなる群から選択される、請求項６に記載の方法または単離されたペプチド。
【請求項８】
配列番号１に示されるアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体と、医薬的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物であって、単離されたペプチドが酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる、医薬組成物。
【請求項９】
配列番号２に示されるアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体と、医薬的に許容されるキャリアとを含む医薬組成物であって、単離されたペプチドが酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる、医薬組成物。
【請求項１０】
前記単離されたペプチドは、配列番号３に示される配列を含む、請求項２，４または８に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１１】
前記単離されたペプチドは、配列番号１４に示される配列を含む、請求項３，５または９に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１２】
前記単離されたペプチドは、配列番号２４に示される通りである、請求項１または１０に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１３】
前記単離されたペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に由来する少なくとも５個の連続するアミノ酸を含む、請求項２，４または８に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１４】
前記単離されたペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に由来する少なくとも５個の連続するアミノ酸を含む、請求項３，５または９に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１５】
前記単離されたペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に由来する最大でも１５個の連続するアミノ酸を含む、請求項２，４または８に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１６】
前記単離されたペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に由来する最大でも１５個の連続するアミノ酸を含む、請求項３，５または９に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１７】
前記単離されたペプチドは、最大でも２０アミノ酸である、請求項２〜９のいずれかに記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１８】
前記単離されたペプチドは、配列番号３８に示される配列を含む、請求項２，４または８に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１９】
前記単離されたペプチドは、配列番号３９に示される配列を含む、請求項２，４または８に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２０】
前記単離されたペプチドは、配列番号１０に示される配列を含む、請求項２，４または８に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２１】
前記単離されたペプチドは、配列番号１１に示される配列を含む、請求項２，４または８に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２２】
前記単離されたペプチドは、配列番号１または配列番号３に示される配列を含む、請求項２，４または８に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２３】
前記単離されたペプチドは、配列番号４０に示される配列を含む、請求項３，５または９に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２４】
前記単離されたペプチドは、配列番号１３に示される配列を含む、請求項２３に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２５】
前記単離されたペプチドは、配列番号４１に示される配列を含む、請求項３，５または９に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２６】
前記単離されたペプチドは、配列番号４２に示される配列を含む、請求項２５に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２７】
前記単離されたペプチドは、配列番号２に示される配列を含む、請求項３，５または９に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２８】
前記アミノ酸の少なくとも１つが、天然に存在するアミノ酸である、請求項２〜９のいずれかに記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２９】
前記アミノ酸の少なくとも１つが合成アミノ酸である、請求項２〜９のいずれかに記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３０】
前記単離されたペプチドは細胞浸透性作用因子に結合される、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３１】
前記単離されたペプチドは共有結合により結合される、請求項３０に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３２】
前記細胞浸透性作用因子はペプチド薬剤である、請求項３０に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３３】
前記ペプチド細胞浸透性作用因子は、配列番号２１〜配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３４】
前記単離されたペプチドは配列番号２４〜配列番号３６に示される通りである、請求項３３に記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３５】
前記細胞はニューロン細胞を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３６】
前記ＲＯＳ状態は、６−ヒドロキシドーパミン毒性、過酸化水素毒性、ＵＶ線およびドーパミン毒性からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法、ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３７】
配列番号１に示されるアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体であって、単離されたペプチドは酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる、単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体。
【請求項３８】
配列番号２に示されるアミノ酸配列に由来する少なくとも２つの連続するアミノ酸を含む最大でも２５アミノ酸である単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体であって、単離されたペプチドは酸化ストレス条件のもとでの細胞の生存能力を増大させる、単離されたペプチドまたはそのペプチド模倣体。
【図４Ａ】
【図１１】
【図１４】
【図１Ａ−１Ｄ】
【図１Ｅ−１Ｆ】
【図２Ａ−２Ｂ】
【図３】
【図４Ｂ】
【図５Ａ−５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ−７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１２Ａ−１２Ｂ】
【図１３】
【図１５Ａ−１５Ｂ】
【図１６Ａ−１６Ｂ】
【図１７】
【図１１】
【図１４】
【図１Ａ−１Ｄ】
【図１Ｅ−１Ｆ】
【図２Ａ−２Ｂ】
【図３】
【図４Ｂ】
【図５Ａ−５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ−７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１２Ａ−１２Ｂ】
【図１３】
【図１５Ａ−１５Ｂ】
【図１６Ａ−１６Ｂ】
【図１７】
【公表番号】特表２０１３−５０５２３０（Ｐ２０１３−５０５２３０Ａ）
【公表日】平成２５年２月１４日（２０１３．２．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２９３９９（Ｐ２０１２−５２９３９９）
【出願日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２０１０／０００７６０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３３５１１
【国際公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【出願人】（５０１１７７６０９）ラモット・アット・テル・アビブ・ユニバーシテイ・リミテッド (14)
【氏名又は名称原語表記】ＲＡＭＯＴ ＡＴ ＴＥＬ ＡＶＩＶ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＬＴＤ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月１４日（２０１３．２．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２０１０／０００７６０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０３３５１１
【国際公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【出願人】（５０１１７７６０９）ラモット・アット・テル・アビブ・ユニバーシテイ・リミテッド (14)
【氏名又は名称原語表記】ＲＡＭＯＴ ＡＴ ＴＥＬ ＡＶＩＶ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＬＴＤ．
【Ｆターム（参考）】
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