醸造酒に含まれる微生物由来のＤＮＡの検出方法
【課題】醸造酒に含まれるＤＮＡであって、微生物由来のＤＮＡを簡便に検出する方法を提供すること、並びに醸造に使用した微生物の推定や変異株の検出が可能な、ＤＮＡの検出方法を提供すること。
【解決手段】以下の（１）〜（４）の工程：（１）醸造酒のアルコール沈殿処理を行ってＤＮＡを抽出する工程、（２）陰イオン交換膜若しくは樹脂を用いる精製と、シリカベース膜若しくは樹脂を用いる精製とを組み合わせて、工程（１）で抽出されたＤＮＡを精製する工程、（３）工程（２）で精製されたＤＮＡからＰＣＲ阻害物質を除去する工程、並びに（４）工程（３）で得られたＤＮＡを、標的微生物の特異的プライマーを用いるＰＣＲにより増幅する工程、を含む、醸造酒に含まれるＤＮＡであって、該標的微生物由来のＤＮＡの検出方法。
【解決手段】以下の（１）〜（４）の工程：（１）醸造酒のアルコール沈殿処理を行ってＤＮＡを抽出する工程、（２）陰イオン交換膜若しくは樹脂を用いる精製と、シリカベース膜若しくは樹脂を用いる精製とを組み合わせて、工程（１）で抽出されたＤＮＡを精製する工程、（３）工程（２）で精製されたＤＮＡからＰＣＲ阻害物質を除去する工程、並びに（４）工程（３）で得られたＤＮＡを、標的微生物の特異的プライマーを用いるＰＣＲにより増幅する工程、を含む、醸造酒に含まれるＤＮＡであって、該標的微生物由来のＤＮＡの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、醸造酒に含まれるＤＮＡであって、標的微生物由来のＤＮＡの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酒類は糖質を酵母によって発酵させて製造される。従って、蒸留工程を伴わない醸造酒においては、酵母や麹菌といった製造工程で用いた微生物に由来するＤＮＡが残存している可能性がある。醸造酒から微生物由来のＤＮＡを検出することができれば様々な用途への応用、例えば醸造に使用した微生物を製品から推定すること、が考えられる。
【０００３】
醸造酒中より検出の可能性のある微生物由来のＤＮＡとして、醸造用酵母、麹菌等のＤＮＡが考えられる。発酵後これらの微生物菌体自体はろ過等によって分離されるため、一般には醸造酒中に残存することはない。しかし、これらの微生物は発酵中に一部又は全て死滅するため、醸造酒中にその細胞内容物が残ると考える。この際、微生物由来のＤＮＡも醸造酒中に放出されるものと考えられる。
【０００４】
しかし、醸造酒は原料に由来する様々な成分等（アルコール、糖質、アミノ酸、有機酸、ホップ、ポリフェノール等）を含んでいる。さらに、原料の加熱処理、残存する微生物及び酵素に起因する変質の防止のための製品の加熱処理、又は経時等により、メイラード反応を始めとする成分間反応が起こり、黄色や赤褐色の色素成分（メラノイジン）等が増加する。これらの成分は醸造酒からのＤＮＡの回収を困難にし、またその多くが酵素阻害作用を持っているため、ＰＣＲを阻害する。このため、醸造酒中の微生物由来のＤＮＡをＰＣＲにより検出することは困難であった。
【０００５】
食品中に含まれるＤＮＡの抽出については数多くの報告例があるが、醸造酒由来のＤＮＡ抽出例としては、ビールの報告（特許文献１）を含め数例である。この報告では、液体加工食品のｐＨを直接調整した後、キャリアＤＮＡとして精製したファージＤＮＡを添加し、陰イオン交換カラムを用いて、液体加工食品由来のＤＮＡを調製することを特徴としている。この方法によれば、ビール中に含まれる酵母の多コピー配列を検出することが可能となった。しかし、多コピー配列のみでは使用酵母等の識別は不可能である。
【０００６】
また、その他に醸造酒中の原料植物の品種判別法（特許文献２）が報告されている。この報告では、醸造酒に含まれるＤＮＡを酵素法等によって抽出・精製して鋳型とし、植物遺伝子由来のプライマー存在下でＰＣＲを行い、増幅ＤＮＡの多型に基づいて、醸造酒の原料植物の種類又は品種を判別することを特徴としている。しかし、本方法は醸造酒の濃縮を伴うために所定の設備が必要となり、しかも、酵母等の微生物由来の菌株判別法については確立されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−６５２６０号公報
【特許文献２】特開２００７−３３０２３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、醸造酒に含まれるＤＮＡであって、微生物由来のＤＮＡを簡便に検出する方法を提供することである。さらに本発明の課題は、醸造に使用した微生物の推定や変異株の検出が可能な、ＤＮＡの検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らが検討を重ねた結果、種々のＤＮＡの精製方法の中から、原理の異なる特定の複数の精製方法を組み合わせて用いることにより、醸造酒に含まれるＰＣＲ阻害物質の影響を排除しつつ、醸造酒に微量に含まれるＤＮＡを検出できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
即ち、本発明の要旨は、以下の（１）〜（４）の工程：
（１） 醸造酒のアルコール沈殿処理を行ってＤＮＡを抽出する工程、
（２） 陰イオン交換膜若しくは樹脂を用いる精製と、シリカベース膜若しくは樹脂を用いる精製とを組み合わせて、工程（１）で抽出されたＤＮＡを精製する工程、
（３） 工程（２）で精製されたＤＮＡからＰＣＲ阻害物質を除去する工程、並びに
（４） 工程（３）で得られたＤＮＡを、標的微生物の特異的プライマーを用いるＰＣＲにより増幅する工程、
を含む、醸造酒に含まれるＤＮＡであって、該標的微生物由来のＤＮＡの検出方法、に関するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、醸造酒中に含まれるＤＮＡであって、標的微生物由来のＤＮＡを検出することができる。これにより、醸造酒の製造に用いられた微生物等のＤＮＡ配列の迅速な確認、同定が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】醸造酒中の酵母遺伝子（ｒＤＮＡ）の検出。酵母のｒＤＮＡ検出用プライマーを用いてＰＣＲ後、電気泳動を行った。電気泳動後のゲルの写真を図１に示す。試料は以下のとおりである。レーン１−１２は市販醸造酒（レーン１−１１は清酒、レーン１２はワイン）、Ｎは水（ＰＣＲ陰性対照）、Ｐは酵母きょうかい７号株ＤＮＡ（ＰＣＲ陽性対照）をそれぞれ示す。
【図２】醸造酒中の酵母遺伝子（ＳＣＣ４）の検出。酵母のＳＣＣ４検出用プライマーを用いてＰＣＲ後、電気泳動を行った。電気泳動後のゲルの写真を図２に示す。試料は以下のとおりである。レーン１−１２は市販醸造酒（レーン１−６は清酒、レーン７−１２はワイン）、Ｎは水（ＰＣＲ陰性対照）、Ｐは酵母きょうかい７号株ＤＮＡ（ＰＣＲ陽性対照）をそれぞれ示す。
【図３】清酒中の酵母遺伝子（ＦＡＳ２）の検出。酵母のＦＡＳ２検出用プライマーを用いてＰＣＲ後、電気泳動を行った。電気泳動後のゲルの写真を図３に示す。試料は以下のとおりである。レーン１−１８は清酒、Ｎは水（ＰＣＲ陰性対照）、Ｐは酵母きょうかい７号株ＤＮＡ（ＰＣＲ陽性対照）をそれぞれ示す。
【図４】カプロン酸エチル高生産性に関与する酵母遺伝子（ＦＡＳ２）の３７４８番目の塩基の識別。酵母のＦＡＳ２検出用プライマーを用いてＰＣＲ後、得られた増幅産物をシークエンスに供した。その結果、使用された酵母は２倍体であるので、３７４８番目の塩基には図に示される三通りの場合があることが分かった。図中の矢印は３７４８番目の塩基をそれぞれ示す。野生型（Ａ）の３７４８番目の塩基はＧを示し、変異型（Ｂ、Ｃ）の同塩基はＧ／Ａ（ヘテロザイガスな変異）若しくはＡ（ホモザイガスな変異）を示す。
【図５】醸造酒中の酵母遺伝子（ＳＣＣ４）の検出。酵母のＳＣＣ４検出用プライマーを用いてＰＣＲ後、電気泳動を行った。電気泳動後のゲルの写真を図５に示す。レーン１−８は市販醸造酒、Ｎは水（ＰＣＲ陰性対照）、Ｐは酵母きょうかい７号株ＤＮＡ（ＰＣＲ陽性対照）をそれぞれ示す。
【図６】酵母遺伝子（ｇＤＮＡ）の検出。電気泳動後のゲルの写真を図６に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、以下の（１）〜（４）の工程を含む、醸造酒に含まれるＤＮＡであって、当該標的微生物由来のＤＮＡの検出方法である。
【００１４】
＜工程（１）＞
工程（１）は、醸造酒のアルコール沈殿処理を行ってＤＮＡを抽出する工程である。
本発明における醸造酒とは、果実又は穀物原料をアルコール発酵させた後に蒸留工程を経ていない酒類がその一部に含まれる、あるいは全部を占めるものを指す。醸造酒には、以下のものに限定されないが、例えば、日本酒、ビール、発泡酒、ワイン、老酒、リンゴ酒等が含まれる。
【００１５】
醸造酒からＤＮＡを抽出するために、醸造酒のアルコール沈殿処理を行う。具体的には、醸造酒に直接、塩及びアルコールを添加し、遠心分離することで、ＤＮＡを抽出する。塩としては、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、酢酸アンモニウム等が挙げられ、酢酸ナトリウムが好ましい。アルコールとしては、イソプロパノール、エタノール等が挙げられ、イソプロパノールが好ましい。添加する塩及びアルコールの量や、その他の具体的なアルコール沈殿処理の条件、及び遠心分離の条件としては、公知の条件を適宜採用することができる。
【００１６】
本発明においては、醸造酒の凍結乾燥等の濃縮操作を経ることなく、その後の操作に使用することができるＤＮＡを上記のように簡便に抽出することができる。
【００１７】
＜工程（２）＞
工程（２）は、陰イオン交換膜若しくは樹脂を用いる精製と、シリカベース膜若しくは樹脂を用いる精製とを組み合わせて、工程（１）で抽出されたＤＮＡを精製する工程である。
【００１８】
陰イオン交換膜又は樹脂、及びシリカベース膜又は樹脂としては、多くのメーカーからＤＮＡ精製用製品として市販されているものを使用することができるが、市販品に限定されるわけではない。陰イオン交換膜又は樹脂の具体例としては、陰イオン交換膜又は樹脂を利用したキット、例えば、Invitrogen社のChargeSwitch-pro PCR Clean-up Kit、Qiagen社のGenomic-tipが挙げられる。シリカベース膜又は樹脂の具体例としては、シリカベース膜又は樹脂を利用したキット、例えば、Promega社のWizard PCR Preps DNA Purification System、同じくPromega社のWizard DNA Clean-up Systemが挙げられる。これらの樹脂等によるＤＮＡの精製操作、例えばカラムの平衡化等としては、製品に添付された取扱説明書に従って行えばよいが、適宜アレンジしてもよい。例えば、アルコール沈殿により抽出されたＤＮＡをカラムにアプライし、製品付属の洗浄用緩衝液又はそれに準ずるものにより洗浄後、製品付属の溶出用緩衝液又はｐＨ変更、塩濃度変更によりＤＮＡを溶出する。
【００１９】
工程（２）における、陰イオン交換膜又は樹脂による精製操作とシリカベース膜又は樹脂による精製操作の順序としては特に制限されない。標的微生物のＤＮＡをより確実に検出する観点からは、工程（１）で抽出されたＤＮＡを最初に陰イオン交換膜又は樹脂を用いて精製し、次いで、精製されたＤＮＡを、シリカベース膜又は樹脂を用いてさらに精製することが好ましい。
【００２０】
＜工程（３）＞
工程（３）は、工程（２）で精製されたＤＮＡからＰＣＲ阻害物質を除去する工程である。
【００２１】
本工程において、ＰＣＲ阻害物質を除去するための操作の一例としては、ＰＣＲ阻害物質を除去する膜又は樹脂を用いて精製ＤＮＡを処理する操作が挙げられる。ＰＣＲ阻害物質を除去する膜又は樹脂としては、多くのメーカーからＤＮＡ精製用製品として市販されているものを使用することができるが、市販品に限定されるわけではない。ＰＣＲ阻害物質を除去する膜又は樹脂の具体例としては、ＰＣＲ阻害物質を除去する膜又は樹脂を利用したキット、例えば、ZymoResearch社のOneStep PCR Inhibitor Removal Kit、GLサイエンス社のMonoFas genome for Legionella Columnが挙げられる。かかる樹脂等によるＰＣＲ阻害物質の除去操作としては、製品に添付された取扱説明書に従って行えばよいが、適宜アレンジしてもよい。例えば、工程（２）で得られた精製されたＤＮＡを、製品添付のＰＣＲ阻害物質を除去する膜若しくは樹脂にアプライし、製品添付の取扱説明書に従ってＤＮＡを溶出する。
【００２２】
＜工程（４）＞
工程（４）は、工程（３）で得られたＤＮＡを、標的微生物の特異的プライマーを用いるＰＣＲにより増幅する工程である。
【００２３】
標的微生物のＤＮＡの検出は、適切な遺伝子をターゲットとしたプライマーを用いるＰＣＲによりＤＮＡを増幅することによって行われる。ＰＣＲは通常、２種の特異的プライマーを用いて実施され、次いで、増幅産物を電気泳動後、検出されるバンドを確認し、場合によってはシークエンスにより得られたＤＮＡの配列を確認することにより、標的微生物のＤＮＡの検出を確定する。工程（４）においては、必要に応じてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ又は２ｎｄ ＰＣＲを行ってもよい。
【００２４】
標的微生物としては、醸造酒に含まれ得る微生物、即ち醸造酒の製造に用いられた微生物の他に、醸造酒に含まれることが好ましくない微生物が挙げられる。具体的な標的微生物の設定は、標的微生物の特異的プライマーを選択することにより行うことができる。標的微生物の具体例としては、例えば、Saccharomyces属の酵母及びAspergillus属のカビからなる群より選択される一種以上の微生物が挙げられる。Saccharomyces属の酵母の具体例としては、Saccharomyces cerevisiaeが挙げられる。Aspergillus属のカビの具体例としては、Aspergillus oryzaeが挙げられる。
【００２５】
標的微生物の特異的プライマーとしては、例えば、配列表の配列番号：１〜配列番号：１０に規定の配列からなる群より選択される一種以上の配列が挙げられる。
【００２６】
酵母のＤＮＡを検出する場合、例えば、配列表の配列番号１〜４に記載の配列を有するプライマーを用いることができる。これらの配列は、酵母のｒＤＮＡ検出（ＩＴＳ領域）用プライマーである。
【００２７】
酵母のＤＮＡを検出する場合、例えば、配列表の配列番号５〜８に記載の配列を有するプライマーを用いることもできる。これらの配列は、酵母の単コピー配列であるＳＣＣ４の検出用プライマーである。かかるプライマーを用いることにより、酵母のＤＮＡを検出することができる。
【００２８】
酵母のＤＮＡを検出する場合、例えば、配列表の配列番号９〜１０に記載の配列を有するプライマーを用いることもできる。これらの配列は、酵母のＦＡＳ２変異点検出用プライマーである。かかるプライマーを用いることにより、酵母の変異株を判別することができる。
【００２９】
標的微生物の特異的プライマーとしては、標的微生物の単コピー配列でもよく、又は多コピー配列でもよい。醸造に使用した微生物をより確実に検出する観点から、特異的プライマーとして標的微生物の単コピー配列を用いることが好ましい。標的微生物の単コピー配列は、公知の配列データベースから、目的に応じて適宜設定することができる。さらに本発明においては、一塩基多型検出プライマーを用いてもよい。
【００３０】
本発明によれば、従来の方法では増幅させることができなかった、醸造酒に含まれるＤＮＡを増幅させることができる。増幅されたＤＮＡについては、従来より公知の方法、例えば電気泳動を利用した方法や、シークエンサーによる配列決定法等を用いて、微生物の推定や変異株の検出を行うことができる。
【実施例】
【００３１】
本発明を下記実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３２】
実施例１ 市販の醸造酒に含まれるＤＮＡの検出
＜清酒及びワインからのＤＮＡの抽出＞
市販の清酒及びワインを試料とした。５０ｍＬの遠沈管に試料を２０ｍＬ分注し、これに２ｍＬの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、２０ｍＬのイソプロパノールを加え、転倒混和後、遠心（２０℃、９０００×ｇ、２０分間）した。得られた沈殿に２０ｍＬの７０％エタノールを加え、遠心（２０℃、９０００×ｇ、５分間）した。上清を捨て、風乾した後、１００μＬのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解させた。得られた粗ＤＮＡ溶液を遠心（４℃、２１９００×ｇ、３０分間）、上清のみ回収した。
【００３３】
この粗ＤＮＡ溶液を陰イオン交換樹脂を利用したキット、具体的にはInvitrogen社のChargeSwitch-pro PCR Clean-up Kitを用いてＤＮＡの精製を行った。即ち、上述の粗抽出液に等量のPurification Bufferを加え、混合した。これを適量ずつカラムに添加し、遠心（２０℃、１００００×ｇ、１分間）した。試料を全て添加するまで、操作を繰り返した。５００μＬのWash Bufferをカラムに添加し、遠心（２０℃、１００００×ｇ、１分間）した。２００μＬのElution Bufferをカラムに添加し、室温で１分間静置した後、遠心（２０℃、１００００×ｇ、１分間）した。
【００３４】
次に、得られたこのＤＮＡ溶液（約２００μＬ）をシリカベース樹脂を利用したキット、具体的にはPromega社のWizard PCR Preps DNA Purification Systemを用いてＤＮＡの精製を行った。即ち、２００μＬのＤＮＡ溶液に１００μＬのDirect Purification Bufferと１ｍＬの樹脂を加えて、混合後、１分間室温に静置した。この操作を２回繰り返し、計３回行った。得られたこの懸濁液を、シリンジを用いてカラムにつめた。２ｍＬの８０％のイソプロパノールで洗浄後、カラムを遠心（２０℃、１００００×ｇ、２分間）した。あらかじめ６５℃で加温しておいた超純水若しくはＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を２００μＬ添加し、遠心（２０℃、５０００×ｇ、２０秒間）した。
【００３５】
最後に、得られたこのＤＮＡ溶液からフミン酸、ポリフェノール等のＰＣＲ阻害物質を除去する樹脂を利用したキット、具体的にはZymoResearch社のOneStep PCR Inhibitor Removal Kitを用いて、かかる阻害物質を除去した。カラムを軽く振り、中の担体を懸濁後、カラムの下部をねじ切り、添付のチューブに装着した後、遠心（２０℃、８０００×ｇ、３分間）した。遠心後のカラムに２００μＬの上記のＤＮＡ溶液を添加し、遠心（２０℃、８０００×ｇ、１分間）した。得られた溶液に１μＬのグリコーゲン（２０ｍｇ／ｍＬ）、２０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、６００μＬのエタノールを添加して軽く混和後、遠心（２０℃、２１９００×ｇ、２０分間）した。得られた沈殿に５００μＬの７０％エタノールを加え、遠心（２０℃、２１９００×ｇ、５分間）した。上清を捨て、風乾した後、ＰＣＲグレード水に溶解した。このものを醸造酒ＤＮＡ画分とした。
【００３６】
＜酵母ＤＮＡの検出＞
上記の醸造酒ＤＮＡ画分の適量をKAPA BIOSYSTEMS社のKAPA 2G Robust Hot Start PCR Kitに、最終濃度０．２５μＭのプライマーと共に添加した。検出に用いたプライマーは酵母Saccharomyces cerevisiaeのｒＤＮＡに対する以下のものであり、ＤＮＡ配列はＳｃ−ＩＴＳ２−Ｆ（配列表の配列番号１）及びＩＴＳ２−Ｒ（配列表の配列番号２）である。反応溶液の最終量は２０μＬとした。１ｓｔ ＰＣＲはAppliedBiosystems社のApplied Biosystems VeritiTM96-wellサーマルサイクラー０．２ｍＬを用い、反応条件は反応液を９４℃で３０秒保持した後、以後９４℃２０秒、５８℃２０秒、７２℃３０秒を１サイクルとして４５サイクルの反復を行い、７２℃で１分間保持後、４℃とした。
【００３７】
次に、１ｓｔ ＰＣＲ後の増幅産物をｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲに供した。検出に用いたプライマーは酵母のｒＤＮＡに対する以下のものであり、ＤＮＡ配列はＩＴＳ２−ｎｅｓｔＦ（配列表の配列番号３）及びＩＴＳ２−ｎｅｓｔＲ：（配列表の配列番号４）である。反応は１ｓｔ ＰＣＲと同様の条件で行い、増幅産物についてはその５μＬをＴＡＥ緩衝液で調製した３％アガロースゲルにアプライし、ＴＡＥ緩衝液中３５分間１００Ｖで電気泳動を行った。泳動終了後、ゲルのエチジウムブロマイドによる染色の後、カメラにより紫外線照射下撮影を行った。結果を図１に示す。図１より、醸造酒の各試料に関して、酵母きょうかい７号株と同じ位置にバンドが見られることが分かった。この結果から、本発明の方法により、醸造酒中の酵母ＤＮＡの検出が可能であることが示された。
【００３８】
実施例２ 醸造酒を試料とする酵母の単コピー配列の検出
各種の醸造酒（清酒又はワイン）について、上記の実施例１と同様の方法で得られた醸造酒ＤＮＡ画分の適量を、KAPA BIOSYSTEMS社のKAPA 2G Robust Hot Start PCR Kitに、最終濃度０．２５μＭのプライマーと共に添加した。今回検出に用いたプライマーは酵母のＳＣＣ４に対する以下のものであり、ＤＮＡ配列はＳＣＣ４−Ｆ（配列表の配列番号５）及びＳＣＣ４−Ｒ（配列表の配列番号６）である。反応溶液の最終量は２０μＬとした。ＰＣＲはAppliedBiosystems社のApplied Biosystems VeritiTM 96-wellサーマルサイクラー０．２ｍＬを用い反応条件は反応液を９４℃で３０秒保持した後、以後９４℃２０秒、５２℃２０秒、７２℃３０秒を１サイクルとして４５サイクルの反復を行い、７２℃で１分間保持後、４℃とした。
【００３９】
次に、１ｓｔ ＰＣＲ後の増幅産物をｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲに供した。検出に用いたプライマーは酵母Saccharomyces cerevisiaeのＳＣＣ４に対する以下のものであり、ＤＮＡ配列はＳＣＣ４−ｎｅｓｔＦ（配列表の配列番号７）及びＳＣＣ４−ｎｅｓｔＲ：（配列表の配列番号８）である。反応は１ｓｔ ＰＣＲと同様の条件で行い、増幅産物については５μＬをＴＡＥ緩衝液で調製した３％アガロースゲルにアプライし、ＴＡＥ緩衝液中３５分間１００Ｖで電気泳動を行った。泳動終了後、ゲルのエチジウムブロマイドによる染色の後、カメラにより紫外線照射下撮影を行った。結果を図２に示す。図２より、醸造酒の各試料に関して、酵母きょうかい７号株と同じ位置にバンドが見られることが分かった。以上、本法により醸造酒中の酵母の単コピー配列の検出が可能であることが示された。
【００４０】
実施例３ 清酒を試料とする変異酵母使用の識別例
清酒中より検出の可能性のある酵母Saccharomyces cerevisiaeの遺伝子として、変異型ＦＡＳ２がある。ＦＡＳ２遺伝子の３７４８番目の塩基がＧ（野生型）からＡ（変異型）に置換した変異酵母は、カプロン酸エチル高生産性を示すことが知られており、主に吟醸酒等に用いられている(Akada et al., Detection of a point mutation in FAS2 gene of sake yeast strains by allele-specific PCR amplification., J.Biosci.Bioeng., 92, 189-192, 2001.)。
【００４１】
清酒の１８サンプルについて、上記の実施例１と同様の方法で醸造酒ＤＮＡ画分を調製した。得られた醸造酒ＤＮＡ画分の適量を、KAPA BIOSYSTEMS社のKAPA 2G Robust Hot Start PCR Kitに、最終濃度０．２５μＭのプライマーと共に添加した。今回検出に用いたプライマーは酵母のＦＡＳ２に対する以下のものであり、ＤＮＡ配列はＦＡＳ２−２００Ｆ（配列表の配列番号９）及びＦＡＳ２−２００Ｒ（配列表の配列番号１０）である。反応溶液の最終量は２０μＬとした。ＰＣＲはAppliedBiosystems社のApplied Biosystems VeritiTM96-wellサーマルサイクラー０．２ｍＬを用い反応条件は反応液を９４℃で３０秒保持した後、以後９４℃２０秒、５８℃２０秒、７２℃３０秒を１サイクルとして４５サイクルの反復を行い、７２℃で１分間保持後、４℃とした。
【００４２】
次に、１ｓｔ ＰＣＲ後の増幅産物を２ｎｄ ＰＣＲに供した。検出に用いたプライマーは１ｓｔ ＰＣＲで用いたプライマーと同じものとした。反応は１ｓｔ ＰＣＲと同様の条件で行い、増幅産物については５μＬをＴＡＥ緩衝液で調製した３％アガロースゲルにアプライし、ＴＡＥ緩衝液中３５分間１００Ｖで電気泳動を行った。泳動終了後、ゲルのエチジウムブロマイドによる染色の後、カメラにより紫外線照射下撮影を行った。結果を図３に示す。
【００４３】
また、得られた増幅産物を精製後、シークエンスに供して３７４８番目の塩基の識別を行った。その結果、図４に示すように、（Ｂ）変異型がヘテロザイガスな変異であり、（Ｃ）変異型がホモザイガスな変異であることが分かった。本発明の方法を用いて、醸造に使用した酵母が変異株であるかどうかを検出し、識別することができることが示された。
【００４４】
比較例１〜４ 市販の醸造酒に含まれるＤＮＡの検出
実施例１におけるアルコール沈殿処理により得られた各粗ＤＮＡ溶液について、次のような操作による精製を行った。
（１）各粗ＤＮＡ溶液についてＰＣＲにてＤＮＡの増幅を行った態様（比較例１、図５（Ａ））
（２）陰イオン交換樹脂及びシリカベース樹脂を用いて精製処理を行わずに、各粗ＤＮＡ溶液についてＰＣＲ阻害物質を除去する工程を経た後、ＰＣＲにてＤＮＡの増幅を行った態様（比較例２、図５（Ｂ））
（３）各粗ＤＮＡ溶液について陰イオン交換樹脂を用いて精製処理を行った後、ＰＣＲ阻害物質を除去する工程を経た試料についてＰＣＲにてＤＮＡの増幅を行った態様（比較例３、図５（Ｃ））
（４）各粗ＤＮＡ溶液についてシリカベース樹脂を用いて精製処理を行った後、ＰＣＲ阻害物質を除去する工程を経た試料についてＰＣＲにてＤＮＡの増幅を行った態様（比較例４、図５（Ｄ））
【００４５】
上記の（１）〜（４）の各態様において、具体的な精製処理、ＤＮＡの増幅工程及び電気泳動の条件は実施例１と同じ条件とした。電気泳動の結果を図５の（Ａ）〜（Ｄ）に示す。その結果、上記の（１）及び（２）の態様において、ＤＮＡの増幅が確認できなかった（図５の（Ａ）及び（Ｂ））。また、上記の（３）及び（４）の態様においては、増幅できたＤＮＡと増幅できなかったＤＮＡとが生じ、安定した検出結果を得ることができなかった（図５の（Ｃ）及び（Ｄ））。
【００４６】
試験例１ 粗ＤＮＡ溶液中のＰＣＲ阻害物質の存否確認
以下の実験により、粗ＤＮＡ溶液中にＰＣＲ阻害物質が存在しているかどうかについて確認した。
【００４７】
試料としては、上記の実施例でＰＣＲ陽性対照として使用した酵母きょうかい７号株ｇＤＮＡ（図６のレーン１）、きょうかい７号酵母のｇＤＮＡと実施例１の粗ＤＮＡ溶液との混合物（レーン２）、きょうかい７号酵母のｇＤＮＡと実施例１の醸造酒ＤＮＡ画分との混合物（レーン３）、きょうかい７号酵母のｇＤＮＡとＴＥ緩衝液との混合物（レーン４）及びＰＣＲ陰性対照としての水（レーン５）を用いた。これらの試料について、実施例１と同様の方法でＰＣＲ増幅産物を得て、電気泳動に供した。電気泳動の結果を図６に示す。
【００４８】
図６から、粗ＤＮＡ溶液にはＰＣＲ阻害物質が存在していること、及び粗ＤＮＡ溶液の調製時に使用したＴＥ緩衝液中のＥＤＴＡは、ＰＣＲには影響しなかったことが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明によれば、醸造酒を試料として製造工程で使用された酵母菌株の判別が可能となるので、製造工程への野生酵母等の混入の判定、製品からの使用酵母菌株の推定に有用であり、工程管理や情報収集等の目的で、酒造会社や酒販店等が産業的に利用することができる。また本発明によれば、特許菌株等の知的財産保護や遺伝子組換え酵母使用の検査等が可能となるので、法令違反や表示の偽装の発見や防止の目的で、検査機関等が産業的に利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００５０】
配列表の配列番号１は、酵母のｒＤＮＡ検出（ＩＴＳ領域）用プライマーである。
配列表の配列番号２は、酵母のｒＤＮＡ検出（ＩＴＳ領域）用プライマーである。
配列表の配列番号３は、酵母のｒＤＮＡ検出（ＩＴＳ領域）用プライマーである。
配列表の配列番号４は、酵母のｒＤＮＡ検出（ＩＴＳ領域）用プライマーである。
配列表の配列番号５は、酵母のＳＣＣ４検出用プライマーである。
配列表の配列番号６は、酵母のＳＣＣ４検出用プライマーである。
配列表の配列番号７は、酵母のＳＣＣ４検出用プライマーである。
配列表の配列番号８は、酵母のＳＣＣ４検出用プライマーである。
配列表の配列番号９は、酵母のＦＡＳ２変異点検出用プライマーである。
配列表の配列番号１０は、酵母のＦＡＳ２変異点検出用プライマーである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、醸造酒に含まれるＤＮＡであって、標的微生物由来のＤＮＡの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酒類は糖質を酵母によって発酵させて製造される。従って、蒸留工程を伴わない醸造酒においては、酵母や麹菌といった製造工程で用いた微生物に由来するＤＮＡが残存している可能性がある。醸造酒から微生物由来のＤＮＡを検出することができれば様々な用途への応用、例えば醸造に使用した微生物を製品から推定すること、が考えられる。
【０００３】
醸造酒中より検出の可能性のある微生物由来のＤＮＡとして、醸造用酵母、麹菌等のＤＮＡが考えられる。発酵後これらの微生物菌体自体はろ過等によって分離されるため、一般には醸造酒中に残存することはない。しかし、これらの微生物は発酵中に一部又は全て死滅するため、醸造酒中にその細胞内容物が残ると考える。この際、微生物由来のＤＮＡも醸造酒中に放出されるものと考えられる。
【０００４】
しかし、醸造酒は原料に由来する様々な成分等（アルコール、糖質、アミノ酸、有機酸、ホップ、ポリフェノール等）を含んでいる。さらに、原料の加熱処理、残存する微生物及び酵素に起因する変質の防止のための製品の加熱処理、又は経時等により、メイラード反応を始めとする成分間反応が起こり、黄色や赤褐色の色素成分（メラノイジン）等が増加する。これらの成分は醸造酒からのＤＮＡの回収を困難にし、またその多くが酵素阻害作用を持っているため、ＰＣＲを阻害する。このため、醸造酒中の微生物由来のＤＮＡをＰＣＲにより検出することは困難であった。
【０００５】
食品中に含まれるＤＮＡの抽出については数多くの報告例があるが、醸造酒由来のＤＮＡ抽出例としては、ビールの報告（特許文献１）を含め数例である。この報告では、液体加工食品のｐＨを直接調整した後、キャリアＤＮＡとして精製したファージＤＮＡを添加し、陰イオン交換カラムを用いて、液体加工食品由来のＤＮＡを調製することを特徴としている。この方法によれば、ビール中に含まれる酵母の多コピー配列を検出することが可能となった。しかし、多コピー配列のみでは使用酵母等の識別は不可能である。
【０００６】
また、その他に醸造酒中の原料植物の品種判別法（特許文献２）が報告されている。この報告では、醸造酒に含まれるＤＮＡを酵素法等によって抽出・精製して鋳型とし、植物遺伝子由来のプライマー存在下でＰＣＲを行い、増幅ＤＮＡの多型に基づいて、醸造酒の原料植物の種類又は品種を判別することを特徴としている。しかし、本方法は醸造酒の濃縮を伴うために所定の設備が必要となり、しかも、酵母等の微生物由来の菌株判別法については確立されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−６５２６０号公報
【特許文献２】特開２００７−３３０２３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、醸造酒に含まれるＤＮＡであって、微生物由来のＤＮＡを簡便に検出する方法を提供することである。さらに本発明の課題は、醸造に使用した微生物の推定や変異株の検出が可能な、ＤＮＡの検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らが検討を重ねた結果、種々のＤＮＡの精製方法の中から、原理の異なる特定の複数の精製方法を組み合わせて用いることにより、醸造酒に含まれるＰＣＲ阻害物質の影響を排除しつつ、醸造酒に微量に含まれるＤＮＡを検出できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
即ち、本発明の要旨は、以下の（１）〜（４）の工程：
（１） 醸造酒のアルコール沈殿処理を行ってＤＮＡを抽出する工程、
（２） 陰イオン交換膜若しくは樹脂を用いる精製と、シリカベース膜若しくは樹脂を用いる精製とを組み合わせて、工程（１）で抽出されたＤＮＡを精製する工程、
（３） 工程（２）で精製されたＤＮＡからＰＣＲ阻害物質を除去する工程、並びに
（４） 工程（３）で得られたＤＮＡを、標的微生物の特異的プライマーを用いるＰＣＲにより増幅する工程、
を含む、醸造酒に含まれるＤＮＡであって、該標的微生物由来のＤＮＡの検出方法、に関するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、醸造酒中に含まれるＤＮＡであって、標的微生物由来のＤＮＡを検出することができる。これにより、醸造酒の製造に用いられた微生物等のＤＮＡ配列の迅速な確認、同定が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】醸造酒中の酵母遺伝子（ｒＤＮＡ）の検出。酵母のｒＤＮＡ検出用プライマーを用いてＰＣＲ後、電気泳動を行った。電気泳動後のゲルの写真を図１に示す。試料は以下のとおりである。レーン１−１２は市販醸造酒（レーン１−１１は清酒、レーン１２はワイン）、Ｎは水（ＰＣＲ陰性対照）、Ｐは酵母きょうかい７号株ＤＮＡ（ＰＣＲ陽性対照）をそれぞれ示す。
【図２】醸造酒中の酵母遺伝子（ＳＣＣ４）の検出。酵母のＳＣＣ４検出用プライマーを用いてＰＣＲ後、電気泳動を行った。電気泳動後のゲルの写真を図２に示す。試料は以下のとおりである。レーン１−１２は市販醸造酒（レーン１−６は清酒、レーン７−１２はワイン）、Ｎは水（ＰＣＲ陰性対照）、Ｐは酵母きょうかい７号株ＤＮＡ（ＰＣＲ陽性対照）をそれぞれ示す。
【図３】清酒中の酵母遺伝子（ＦＡＳ２）の検出。酵母のＦＡＳ２検出用プライマーを用いてＰＣＲ後、電気泳動を行った。電気泳動後のゲルの写真を図３に示す。試料は以下のとおりである。レーン１−１８は清酒、Ｎは水（ＰＣＲ陰性対照）、Ｐは酵母きょうかい７号株ＤＮＡ（ＰＣＲ陽性対照）をそれぞれ示す。
【図４】カプロン酸エチル高生産性に関与する酵母遺伝子（ＦＡＳ２）の３７４８番目の塩基の識別。酵母のＦＡＳ２検出用プライマーを用いてＰＣＲ後、得られた増幅産物をシークエンスに供した。その結果、使用された酵母は２倍体であるので、３７４８番目の塩基には図に示される三通りの場合があることが分かった。図中の矢印は３７４８番目の塩基をそれぞれ示す。野生型（Ａ）の３７４８番目の塩基はＧを示し、変異型（Ｂ、Ｃ）の同塩基はＧ／Ａ（ヘテロザイガスな変異）若しくはＡ（ホモザイガスな変異）を示す。
【図５】醸造酒中の酵母遺伝子（ＳＣＣ４）の検出。酵母のＳＣＣ４検出用プライマーを用いてＰＣＲ後、電気泳動を行った。電気泳動後のゲルの写真を図５に示す。レーン１−８は市販醸造酒、Ｎは水（ＰＣＲ陰性対照）、Ｐは酵母きょうかい７号株ＤＮＡ（ＰＣＲ陽性対照）をそれぞれ示す。
【図６】酵母遺伝子（ｇＤＮＡ）の検出。電気泳動後のゲルの写真を図６に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、以下の（１）〜（４）の工程を含む、醸造酒に含まれるＤＮＡであって、当該標的微生物由来のＤＮＡの検出方法である。
【００１４】
＜工程（１）＞
工程（１）は、醸造酒のアルコール沈殿処理を行ってＤＮＡを抽出する工程である。
本発明における醸造酒とは、果実又は穀物原料をアルコール発酵させた後に蒸留工程を経ていない酒類がその一部に含まれる、あるいは全部を占めるものを指す。醸造酒には、以下のものに限定されないが、例えば、日本酒、ビール、発泡酒、ワイン、老酒、リンゴ酒等が含まれる。
【００１５】
醸造酒からＤＮＡを抽出するために、醸造酒のアルコール沈殿処理を行う。具体的には、醸造酒に直接、塩及びアルコールを添加し、遠心分離することで、ＤＮＡを抽出する。塩としては、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、酢酸アンモニウム等が挙げられ、酢酸ナトリウムが好ましい。アルコールとしては、イソプロパノール、エタノール等が挙げられ、イソプロパノールが好ましい。添加する塩及びアルコールの量や、その他の具体的なアルコール沈殿処理の条件、及び遠心分離の条件としては、公知の条件を適宜採用することができる。
【００１６】
本発明においては、醸造酒の凍結乾燥等の濃縮操作を経ることなく、その後の操作に使用することができるＤＮＡを上記のように簡便に抽出することができる。
【００１７】
＜工程（２）＞
工程（２）は、陰イオン交換膜若しくは樹脂を用いる精製と、シリカベース膜若しくは樹脂を用いる精製とを組み合わせて、工程（１）で抽出されたＤＮＡを精製する工程である。
【００１８】
陰イオン交換膜又は樹脂、及びシリカベース膜又は樹脂としては、多くのメーカーからＤＮＡ精製用製品として市販されているものを使用することができるが、市販品に限定されるわけではない。陰イオン交換膜又は樹脂の具体例としては、陰イオン交換膜又は樹脂を利用したキット、例えば、Invitrogen社のChargeSwitch-pro PCR Clean-up Kit、Qiagen社のGenomic-tipが挙げられる。シリカベース膜又は樹脂の具体例としては、シリカベース膜又は樹脂を利用したキット、例えば、Promega社のWizard PCR Preps DNA Purification System、同じくPromega社のWizard DNA Clean-up Systemが挙げられる。これらの樹脂等によるＤＮＡの精製操作、例えばカラムの平衡化等としては、製品に添付された取扱説明書に従って行えばよいが、適宜アレンジしてもよい。例えば、アルコール沈殿により抽出されたＤＮＡをカラムにアプライし、製品付属の洗浄用緩衝液又はそれに準ずるものにより洗浄後、製品付属の溶出用緩衝液又はｐＨ変更、塩濃度変更によりＤＮＡを溶出する。
【００１９】
工程（２）における、陰イオン交換膜又は樹脂による精製操作とシリカベース膜又は樹脂による精製操作の順序としては特に制限されない。標的微生物のＤＮＡをより確実に検出する観点からは、工程（１）で抽出されたＤＮＡを最初に陰イオン交換膜又は樹脂を用いて精製し、次いで、精製されたＤＮＡを、シリカベース膜又は樹脂を用いてさらに精製することが好ましい。
【００２０】
＜工程（３）＞
工程（３）は、工程（２）で精製されたＤＮＡからＰＣＲ阻害物質を除去する工程である。
【００２１】
本工程において、ＰＣＲ阻害物質を除去するための操作の一例としては、ＰＣＲ阻害物質を除去する膜又は樹脂を用いて精製ＤＮＡを処理する操作が挙げられる。ＰＣＲ阻害物質を除去する膜又は樹脂としては、多くのメーカーからＤＮＡ精製用製品として市販されているものを使用することができるが、市販品に限定されるわけではない。ＰＣＲ阻害物質を除去する膜又は樹脂の具体例としては、ＰＣＲ阻害物質を除去する膜又は樹脂を利用したキット、例えば、ZymoResearch社のOneStep PCR Inhibitor Removal Kit、GLサイエンス社のMonoFas genome for Legionella Columnが挙げられる。かかる樹脂等によるＰＣＲ阻害物質の除去操作としては、製品に添付された取扱説明書に従って行えばよいが、適宜アレンジしてもよい。例えば、工程（２）で得られた精製されたＤＮＡを、製品添付のＰＣＲ阻害物質を除去する膜若しくは樹脂にアプライし、製品添付の取扱説明書に従ってＤＮＡを溶出する。
【００２２】
＜工程（４）＞
工程（４）は、工程（３）で得られたＤＮＡを、標的微生物の特異的プライマーを用いるＰＣＲにより増幅する工程である。
【００２３】
標的微生物のＤＮＡの検出は、適切な遺伝子をターゲットとしたプライマーを用いるＰＣＲによりＤＮＡを増幅することによって行われる。ＰＣＲは通常、２種の特異的プライマーを用いて実施され、次いで、増幅産物を電気泳動後、検出されるバンドを確認し、場合によってはシークエンスにより得られたＤＮＡの配列を確認することにより、標的微生物のＤＮＡの検出を確定する。工程（４）においては、必要に応じてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ又は２ｎｄ ＰＣＲを行ってもよい。
【００２４】
標的微生物としては、醸造酒に含まれ得る微生物、即ち醸造酒の製造に用いられた微生物の他に、醸造酒に含まれることが好ましくない微生物が挙げられる。具体的な標的微生物の設定は、標的微生物の特異的プライマーを選択することにより行うことができる。標的微生物の具体例としては、例えば、Saccharomyces属の酵母及びAspergillus属のカビからなる群より選択される一種以上の微生物が挙げられる。Saccharomyces属の酵母の具体例としては、Saccharomyces cerevisiaeが挙げられる。Aspergillus属のカビの具体例としては、Aspergillus oryzaeが挙げられる。
【００２５】
標的微生物の特異的プライマーとしては、例えば、配列表の配列番号：１〜配列番号：１０に規定の配列からなる群より選択される一種以上の配列が挙げられる。
【００２６】
酵母のＤＮＡを検出する場合、例えば、配列表の配列番号１〜４に記載の配列を有するプライマーを用いることができる。これらの配列は、酵母のｒＤＮＡ検出（ＩＴＳ領域）用プライマーである。
【００２７】
酵母のＤＮＡを検出する場合、例えば、配列表の配列番号５〜８に記載の配列を有するプライマーを用いることもできる。これらの配列は、酵母の単コピー配列であるＳＣＣ４の検出用プライマーである。かかるプライマーを用いることにより、酵母のＤＮＡを検出することができる。
【００２８】
酵母のＤＮＡを検出する場合、例えば、配列表の配列番号９〜１０に記載の配列を有するプライマーを用いることもできる。これらの配列は、酵母のＦＡＳ２変異点検出用プライマーである。かかるプライマーを用いることにより、酵母の変異株を判別することができる。
【００２９】
標的微生物の特異的プライマーとしては、標的微生物の単コピー配列でもよく、又は多コピー配列でもよい。醸造に使用した微生物をより確実に検出する観点から、特異的プライマーとして標的微生物の単コピー配列を用いることが好ましい。標的微生物の単コピー配列は、公知の配列データベースから、目的に応じて適宜設定することができる。さらに本発明においては、一塩基多型検出プライマーを用いてもよい。
【００３０】
本発明によれば、従来の方法では増幅させることができなかった、醸造酒に含まれるＤＮＡを増幅させることができる。増幅されたＤＮＡについては、従来より公知の方法、例えば電気泳動を利用した方法や、シークエンサーによる配列決定法等を用いて、微生物の推定や変異株の検出を行うことができる。
【実施例】
【００３１】
本発明を下記実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３２】
実施例１ 市販の醸造酒に含まれるＤＮＡの検出
＜清酒及びワインからのＤＮＡの抽出＞
市販の清酒及びワインを試料とした。５０ｍＬの遠沈管に試料を２０ｍＬ分注し、これに２ｍＬの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、２０ｍＬのイソプロパノールを加え、転倒混和後、遠心（２０℃、９０００×ｇ、２０分間）した。得られた沈殿に２０ｍＬの７０％エタノールを加え、遠心（２０℃、９０００×ｇ、５分間）した。上清を捨て、風乾した後、１００μＬのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解させた。得られた粗ＤＮＡ溶液を遠心（４℃、２１９００×ｇ、３０分間）、上清のみ回収した。
【００３３】
この粗ＤＮＡ溶液を陰イオン交換樹脂を利用したキット、具体的にはInvitrogen社のChargeSwitch-pro PCR Clean-up Kitを用いてＤＮＡの精製を行った。即ち、上述の粗抽出液に等量のPurification Bufferを加え、混合した。これを適量ずつカラムに添加し、遠心（２０℃、１００００×ｇ、１分間）した。試料を全て添加するまで、操作を繰り返した。５００μＬのWash Bufferをカラムに添加し、遠心（２０℃、１００００×ｇ、１分間）した。２００μＬのElution Bufferをカラムに添加し、室温で１分間静置した後、遠心（２０℃、１００００×ｇ、１分間）した。
【００３４】
次に、得られたこのＤＮＡ溶液（約２００μＬ）をシリカベース樹脂を利用したキット、具体的にはPromega社のWizard PCR Preps DNA Purification Systemを用いてＤＮＡの精製を行った。即ち、２００μＬのＤＮＡ溶液に１００μＬのDirect Purification Bufferと１ｍＬの樹脂を加えて、混合後、１分間室温に静置した。この操作を２回繰り返し、計３回行った。得られたこの懸濁液を、シリンジを用いてカラムにつめた。２ｍＬの８０％のイソプロパノールで洗浄後、カラムを遠心（２０℃、１００００×ｇ、２分間）した。あらかじめ６５℃で加温しておいた超純水若しくはＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を２００μＬ添加し、遠心（２０℃、５０００×ｇ、２０秒間）した。
【００３５】
最後に、得られたこのＤＮＡ溶液からフミン酸、ポリフェノール等のＰＣＲ阻害物質を除去する樹脂を利用したキット、具体的にはZymoResearch社のOneStep PCR Inhibitor Removal Kitを用いて、かかる阻害物質を除去した。カラムを軽く振り、中の担体を懸濁後、カラムの下部をねじ切り、添付のチューブに装着した後、遠心（２０℃、８０００×ｇ、３分間）した。遠心後のカラムに２００μＬの上記のＤＮＡ溶液を添加し、遠心（２０℃、８０００×ｇ、１分間）した。得られた溶液に１μＬのグリコーゲン（２０ｍｇ／ｍＬ）、２０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、６００μＬのエタノールを添加して軽く混和後、遠心（２０℃、２１９００×ｇ、２０分間）した。得られた沈殿に５００μＬの７０％エタノールを加え、遠心（２０℃、２１９００×ｇ、５分間）した。上清を捨て、風乾した後、ＰＣＲグレード水に溶解した。このものを醸造酒ＤＮＡ画分とした。
【００３６】
＜酵母ＤＮＡの検出＞
上記の醸造酒ＤＮＡ画分の適量をKAPA BIOSYSTEMS社のKAPA 2G Robust Hot Start PCR Kitに、最終濃度０．２５μＭのプライマーと共に添加した。検出に用いたプライマーは酵母Saccharomyces cerevisiaeのｒＤＮＡに対する以下のものであり、ＤＮＡ配列はＳｃ−ＩＴＳ２−Ｆ（配列表の配列番号１）及びＩＴＳ２−Ｒ（配列表の配列番号２）である。反応溶液の最終量は２０μＬとした。１ｓｔ ＰＣＲはAppliedBiosystems社のApplied Biosystems VeritiTM96-wellサーマルサイクラー０．２ｍＬを用い、反応条件は反応液を９４℃で３０秒保持した後、以後９４℃２０秒、５８℃２０秒、７２℃３０秒を１サイクルとして４５サイクルの反復を行い、７２℃で１分間保持後、４℃とした。
【００３７】
次に、１ｓｔ ＰＣＲ後の増幅産物をｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲに供した。検出に用いたプライマーは酵母のｒＤＮＡに対する以下のものであり、ＤＮＡ配列はＩＴＳ２−ｎｅｓｔＦ（配列表の配列番号３）及びＩＴＳ２−ｎｅｓｔＲ：（配列表の配列番号４）である。反応は１ｓｔ ＰＣＲと同様の条件で行い、増幅産物についてはその５μＬをＴＡＥ緩衝液で調製した３％アガロースゲルにアプライし、ＴＡＥ緩衝液中３５分間１００Ｖで電気泳動を行った。泳動終了後、ゲルのエチジウムブロマイドによる染色の後、カメラにより紫外線照射下撮影を行った。結果を図１に示す。図１より、醸造酒の各試料に関して、酵母きょうかい７号株と同じ位置にバンドが見られることが分かった。この結果から、本発明の方法により、醸造酒中の酵母ＤＮＡの検出が可能であることが示された。
【００３８】
実施例２ 醸造酒を試料とする酵母の単コピー配列の検出
各種の醸造酒（清酒又はワイン）について、上記の実施例１と同様の方法で得られた醸造酒ＤＮＡ画分の適量を、KAPA BIOSYSTEMS社のKAPA 2G Robust Hot Start PCR Kitに、最終濃度０．２５μＭのプライマーと共に添加した。今回検出に用いたプライマーは酵母のＳＣＣ４に対する以下のものであり、ＤＮＡ配列はＳＣＣ４−Ｆ（配列表の配列番号５）及びＳＣＣ４−Ｒ（配列表の配列番号６）である。反応溶液の最終量は２０μＬとした。ＰＣＲはAppliedBiosystems社のApplied Biosystems VeritiTM 96-wellサーマルサイクラー０．２ｍＬを用い反応条件は反応液を９４℃で３０秒保持した後、以後９４℃２０秒、５２℃２０秒、７２℃３０秒を１サイクルとして４５サイクルの反復を行い、７２℃で１分間保持後、４℃とした。
【００３９】
次に、１ｓｔ ＰＣＲ後の増幅産物をｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲに供した。検出に用いたプライマーは酵母Saccharomyces cerevisiaeのＳＣＣ４に対する以下のものであり、ＤＮＡ配列はＳＣＣ４−ｎｅｓｔＦ（配列表の配列番号７）及びＳＣＣ４−ｎｅｓｔＲ：（配列表の配列番号８）である。反応は１ｓｔ ＰＣＲと同様の条件で行い、増幅産物については５μＬをＴＡＥ緩衝液で調製した３％アガロースゲルにアプライし、ＴＡＥ緩衝液中３５分間１００Ｖで電気泳動を行った。泳動終了後、ゲルのエチジウムブロマイドによる染色の後、カメラにより紫外線照射下撮影を行った。結果を図２に示す。図２より、醸造酒の各試料に関して、酵母きょうかい７号株と同じ位置にバンドが見られることが分かった。以上、本法により醸造酒中の酵母の単コピー配列の検出が可能であることが示された。
【００４０】
実施例３ 清酒を試料とする変異酵母使用の識別例
清酒中より検出の可能性のある酵母Saccharomyces cerevisiaeの遺伝子として、変異型ＦＡＳ２がある。ＦＡＳ２遺伝子の３７４８番目の塩基がＧ（野生型）からＡ（変異型）に置換した変異酵母は、カプロン酸エチル高生産性を示すことが知られており、主に吟醸酒等に用いられている(Akada et al., Detection of a point mutation in FAS2 gene of sake yeast strains by allele-specific PCR amplification., J.Biosci.Bioeng., 92, 189-192, 2001.)。
【００４１】
清酒の１８サンプルについて、上記の実施例１と同様の方法で醸造酒ＤＮＡ画分を調製した。得られた醸造酒ＤＮＡ画分の適量を、KAPA BIOSYSTEMS社のKAPA 2G Robust Hot Start PCR Kitに、最終濃度０．２５μＭのプライマーと共に添加した。今回検出に用いたプライマーは酵母のＦＡＳ２に対する以下のものであり、ＤＮＡ配列はＦＡＳ２−２００Ｆ（配列表の配列番号９）及びＦＡＳ２−２００Ｒ（配列表の配列番号１０）である。反応溶液の最終量は２０μＬとした。ＰＣＲはAppliedBiosystems社のApplied Biosystems VeritiTM96-wellサーマルサイクラー０．２ｍＬを用い反応条件は反応液を９４℃で３０秒保持した後、以後９４℃２０秒、５８℃２０秒、７２℃３０秒を１サイクルとして４５サイクルの反復を行い、７２℃で１分間保持後、４℃とした。
【００４２】
次に、１ｓｔ ＰＣＲ後の増幅産物を２ｎｄ ＰＣＲに供した。検出に用いたプライマーは１ｓｔ ＰＣＲで用いたプライマーと同じものとした。反応は１ｓｔ ＰＣＲと同様の条件で行い、増幅産物については５μＬをＴＡＥ緩衝液で調製した３％アガロースゲルにアプライし、ＴＡＥ緩衝液中３５分間１００Ｖで電気泳動を行った。泳動終了後、ゲルのエチジウムブロマイドによる染色の後、カメラにより紫外線照射下撮影を行った。結果を図３に示す。
【００４３】
また、得られた増幅産物を精製後、シークエンスに供して３７４８番目の塩基の識別を行った。その結果、図４に示すように、（Ｂ）変異型がヘテロザイガスな変異であり、（Ｃ）変異型がホモザイガスな変異であることが分かった。本発明の方法を用いて、醸造に使用した酵母が変異株であるかどうかを検出し、識別することができることが示された。
【００４４】
比較例１〜４ 市販の醸造酒に含まれるＤＮＡの検出
実施例１におけるアルコール沈殿処理により得られた各粗ＤＮＡ溶液について、次のような操作による精製を行った。
（１）各粗ＤＮＡ溶液についてＰＣＲにてＤＮＡの増幅を行った態様（比較例１、図５（Ａ））
（２）陰イオン交換樹脂及びシリカベース樹脂を用いて精製処理を行わずに、各粗ＤＮＡ溶液についてＰＣＲ阻害物質を除去する工程を経た後、ＰＣＲにてＤＮＡの増幅を行った態様（比較例２、図５（Ｂ））
（３）各粗ＤＮＡ溶液について陰イオン交換樹脂を用いて精製処理を行った後、ＰＣＲ阻害物質を除去する工程を経た試料についてＰＣＲにてＤＮＡの増幅を行った態様（比較例３、図５（Ｃ））
（４）各粗ＤＮＡ溶液についてシリカベース樹脂を用いて精製処理を行った後、ＰＣＲ阻害物質を除去する工程を経た試料についてＰＣＲにてＤＮＡの増幅を行った態様（比較例４、図５（Ｄ））
【００４５】
上記の（１）〜（４）の各態様において、具体的な精製処理、ＤＮＡの増幅工程及び電気泳動の条件は実施例１と同じ条件とした。電気泳動の結果を図５の（Ａ）〜（Ｄ）に示す。その結果、上記の（１）及び（２）の態様において、ＤＮＡの増幅が確認できなかった（図５の（Ａ）及び（Ｂ））。また、上記の（３）及び（４）の態様においては、増幅できたＤＮＡと増幅できなかったＤＮＡとが生じ、安定した検出結果を得ることができなかった（図５の（Ｃ）及び（Ｄ））。
【００４６】
試験例１ 粗ＤＮＡ溶液中のＰＣＲ阻害物質の存否確認
以下の実験により、粗ＤＮＡ溶液中にＰＣＲ阻害物質が存在しているかどうかについて確認した。
【００４７】
試料としては、上記の実施例でＰＣＲ陽性対照として使用した酵母きょうかい７号株ｇＤＮＡ（図６のレーン１）、きょうかい７号酵母のｇＤＮＡと実施例１の粗ＤＮＡ溶液との混合物（レーン２）、きょうかい７号酵母のｇＤＮＡと実施例１の醸造酒ＤＮＡ画分との混合物（レーン３）、きょうかい７号酵母のｇＤＮＡとＴＥ緩衝液との混合物（レーン４）及びＰＣＲ陰性対照としての水（レーン５）を用いた。これらの試料について、実施例１と同様の方法でＰＣＲ増幅産物を得て、電気泳動に供した。電気泳動の結果を図６に示す。
【００４８】
図６から、粗ＤＮＡ溶液にはＰＣＲ阻害物質が存在していること、及び粗ＤＮＡ溶液の調製時に使用したＴＥ緩衝液中のＥＤＴＡは、ＰＣＲには影響しなかったことが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明によれば、醸造酒を試料として製造工程で使用された酵母菌株の判別が可能となるので、製造工程への野生酵母等の混入の判定、製品からの使用酵母菌株の推定に有用であり、工程管理や情報収集等の目的で、酒造会社や酒販店等が産業的に利用することができる。また本発明によれば、特許菌株等の知的財産保護や遺伝子組換え酵母使用の検査等が可能となるので、法令違反や表示の偽装の発見や防止の目的で、検査機関等が産業的に利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００５０】
配列表の配列番号１は、酵母のｒＤＮＡ検出（ＩＴＳ領域）用プライマーである。
配列表の配列番号２は、酵母のｒＤＮＡ検出（ＩＴＳ領域）用プライマーである。
配列表の配列番号３は、酵母のｒＤＮＡ検出（ＩＴＳ領域）用プライマーである。
配列表の配列番号４は、酵母のｒＤＮＡ検出（ＩＴＳ領域）用プライマーである。
配列表の配列番号５は、酵母のＳＣＣ４検出用プライマーである。
配列表の配列番号６は、酵母のＳＣＣ４検出用プライマーである。
配列表の配列番号７は、酵母のＳＣＣ４検出用プライマーである。
配列表の配列番号８は、酵母のＳＣＣ４検出用プライマーである。
配列表の配列番号９は、酵母のＦＡＳ２変異点検出用プライマーである。
配列表の配列番号１０は、酵母のＦＡＳ２変異点検出用プライマーである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（４）の工程：
（１） 醸造酒のアルコール沈殿処理を行ってＤＮＡを抽出する工程、
（２） 陰イオン交換膜若しくは樹脂を用いる精製と、シリカベース膜若しくは樹脂を用いる精製とを組み合わせて、工程（１）で抽出されたＤＮＡを精製する工程、
（３） 工程（２）で精製されたＤＮＡからＰＣＲ阻害物質を除去する工程、並びに
（４） 工程（３）で得られたＤＮＡを、標的微生物の特異的プライマーを用いるＰＣＲにより増幅する工程、
を含む、醸造酒に含まれるＤＮＡであって、該標的微生物由来のＤＮＡの検出方法。
【請求項２】
醸造酒が清酒、ビール又はワインである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的微生物がSaccharomyces属の酵母及びAspergillus属のカビからなる群より選択される一種以上の微生物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
特異的プライマーが配列表の配列番号：１〜配列番号：１０に規定の配列からなる群より選択される一種以上の配列である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
特異的プライマーが標的微生物の単コピー配列に対するプライマーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
以下の（１）〜（４）の工程：
（１） 醸造酒のアルコール沈殿処理を行ってＤＮＡを抽出する工程、
（２） 陰イオン交換膜若しくは樹脂を用いる精製と、シリカベース膜若しくは樹脂を用いる精製とを組み合わせて、工程（１）で抽出されたＤＮＡを精製する工程、
（３） 工程（２）で精製されたＤＮＡからＰＣＲ阻害物質を除去する工程、並びに
（４） 工程（３）で得られたＤＮＡを、標的微生物の特異的プライマーを用いるＰＣＲにより増幅する工程、
を含む、醸造酒に含まれるＤＮＡであって、該標的微生物由来のＤＮＡの検出方法。
【請求項２】
醸造酒が清酒、ビール又はワインである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的微生物がSaccharomyces属の酵母及びAspergillus属のカビからなる群より選択される一種以上の微生物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
特異的プライマーが配列表の配列番号：１〜配列番号：１０に規定の配列からなる群より選択される一種以上の配列である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
特異的プライマーが標的微生物の単コピー配列に対するプライマーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−１６７１６６（Ｐ２０１１−１６７１６６Ａ）
【公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−３６５２９（Ｐ２０１０−３６５２９）
【出願日】平成２２年２月２２日（２０１０．２．２２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 〔発行者〕 社団法人日本生物工学会 〔刊行物名〕 第６１回日本生物工学会大会講演要旨集 〔発行日〕 ２００９年８月２５日
【出願人】（３０１０２５６３４）独立行政法人酒類総合研究所 (55)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月２２日（２０１０．２．２２）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 〔発行者〕 社団法人日本生物工学会 〔刊行物名〕 第６１回日本生物工学会大会講演要旨集 〔発行日〕 ２００９年８月２５日
【出願人】（３０１０２５６３４）独立行政法人酒類総合研究所 (55)
【Ｆターム（参考）】
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