防御的抗ＨＩＶ−１抗体の産生を誘導する方法
本発明は、概して、ＨＩＶワクチン接種のための免疫原に、ならびに特にＨＩＶエンベロープおよび非ＨＩＶ免疫原の組み合わせを用いてＢ細胞生殖細胞系列およびクローン中間体を標的化することにより防御的抗ＨＩＶ抗体の産生を誘導する方法に関する。本発明は、そのような方法における使用に適した組成物にも関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１０年２月２５日に出願された米国仮出願第６１／２８２，５２６号、２０１０年７月２７日に出願された米国仮出願第６１／３４４，４５７号、２０１０年８月２５日に出願された米国仮出願第６１／３４４，５８０号、および２０１０年９月１日に出願された米国仮出願第６１／３４４，６２２号からの優先権を主張し、その内容全体を本明細書に援用する。
【０００２】
この発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）により与えられた助成金第ＡＩ０６７８５４号、第ＡＩ２４３３５号および第ＡＩ８１５７９号の下での政府援助によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、概して、ＨＩＶ−１ワクチン接種のための免疫原に、ならびに特に非ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−１免疫原の組み合わせを用いてＢ細胞生殖細胞系列およびクローン中間体（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ）を標的化することにより防御的抗ＨＩＶ−１抗体の産生を誘導する方法に関する。本発明は、そのような方法における使用に適した組成物にも関する。
【背景技術】
【０００４】
伝染／始祖（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ／ｆｏｕｎｄｅｒ）ＨＩＶ−１エンベロープに対する最初の抗体応答は非中和的であり、Ｅｎｖ ｇｐ４１を標的とし、血漿ウイルス血症の出現の平均１３日後に起こる(Tomaras et al, J. Virology 82:12449-63 (2008))。最初の抗体応答と同時に起こるＨＩＶ−１に対する最初のＴ細胞応答はＨＩＶ−１のＴ細胞エピトープ内での変異を駆動するが、ＨＩＶ−１に対する最初のｇｐ４１抗体応答はそれをしない。むしろ、それは自己由来中和抗体応答であり、それは伝染のおおよそ３ヶ月後まで遅れ、それは抗体回避変異体と関係する最初の中和抗体応答である(McMichael et al, Nature Rev. Immunol. 10:11-23 (2010))。
【０００５】
稀な広く反応する中和抗体が結合するＨＩＶ−１エンベロープ上の４つのエピトープは、ＣＤ４結合部位（ＣＤ４ＢＳ）（ｍａｂ（モノクローナル抗体）ＩｇＧ１ｂ１２）(Zwick et al, J. Virol. 77(10):5863-5876 (2003))、ヒトｍａｂ ２Ｆ５および４Ｅ１０により定められる膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）エピトープ(Armbruster et al, J. Antimicrob. Chemother. 54:915-920 (2004), Stiegler and Katinger, J. Antimicrob. Chemother. 51:757-759 (2003), Zwick et al, Journal of Virology 79:1252-1261 (2005), Purtscher et al, AIDS 10:587 (1996))、ならびにヒトｍａｂ ２Ｇ１２により定められるマンナングリカンエピトープ(Scanlan et al, Adv. Exper. Med. Biol. 535:205-218 (2003))である。これらの４種類の稀なヒトｍａｂは全て普通ではなく：２種類はＩｇＧ３であり（２Ｆ５および４Ｅ１０）、１種類は独特のＩｇ二量体構造を有し（２Ｇ１２）、１種類は非常に疎水性のＣＤＲ３を有し（２Ｆ５）(Ofek et al, J. Virol. 198:10724 (2004))、そして４種類全てにおいて、そのＣＤＲ３が異常に長い(Burton et al, Nature Immunol. 5(3):233-236 (2004), Kunert et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 20(7):755-762 (2004), Zwick et al, J. Virol. 78(6):3155-3161 (2004), Cardoso et al, Immunity 22:163-172 (2005))。これらの内で、２Ｆ５および４Ｅ１０様のヒトｍａｂは極めて稀である。急性ＨＩＶ−１患者はＭＰＥＲまたは２Ｇ１２エピトープに対する抗体を作らず、ＭＰＥＲはＨＩＶエンベロープのアミノ酸６５２〜６８３として定義することができる(Cardoso et al, Immunity 22:163-173 (2005)（例えば、ＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦＤＩＴＮＷＬＷＹＩＫ）。ＣＤ４結合部位（ＢＳ）抗体は一般にＨＩＶ−１感染の早期に作られるが、これらの抗体は一般にｍａｂ ＩｇＧ１ｂ１２により示される広い中和のスペクトルを有しない(Burtonet al, Nat. Immunol. 5(3):233-236 (2004))。
【０００６】
ＨＩＶ−１エンベロープ（Ｅｎｖ）に対する効果的でない初期抗体応答の病因を理解するため、ＨＩＶ−１の伝染の１７〜３０日後の５人の急性感染した対象からの単一の血球または骨髄形質細胞からの重および軽鎖（ＶＨおよびＶＬ）遺伝子の免疫グロブリン可変領域の増幅のためのＰＣＲを行った。ＨＩＶ−１感染により誘導される形質細胞応答の特異性を決定した。伝染したＨＩＶ−１により誘導された単一のヒト形質細胞のＶＨおよびＶＬ遺伝子のＰＣＲ増幅を用いて、ＨＩＶ−１に対する初期の形質細胞／形質芽球応答を研究した。ＨＩＶ−１に対する最初の抗体応答はＨＩＶ−１ Ｅｎｖ ｇｐ４１に対して誘導されること、そしてｇｐ４１は既存の記憶Ｂ細胞クローンにおいて抗体応答を誘導し、結果としていくつかの宿主および細菌の分子、特にヒトの腸細菌叢の分子と交差反応する低親和性、多反応性の抗Ｅｎｖ抗体を生じさせることが分かった。
【０００７】
本発明は、少なくとも部分的に、初期の抗ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ ｇｐ４１抗体および稀な広く中和する抗体の両方の源を同定するように設計された研究の結果もたらされる。本発明はさらに、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１ ＭＰＥＲの２Ｆ５、およびおそらく４Ｅ１０に構造的に類似している、ほとんどの温血脊椎動物において発現している細胞タンパク質の同定の結果もたらされる。
【０００８】
本発明は、ＨＩＶ−１に対する広く中和する抗体を生じるように駆動され得るナイーブＢ細胞のプールを標的とするように設計されたＨＩＶ−１ワクチンを提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Tomaras et al, J. Virology 82:12449-63 (2008)
【非特許文献２】McMichael et al, Nature Rev. Immunol. 10:11-23 (2010)
【非特許文献３】Zwick et al, J. Virol. 77(10):5863-5876 (2003)
【非特許文献４】Armbruster et al, J. Antimicrob. Chemother. 54:915-920 (2004)
【非特許文献５】Stiegler and Katinger, J. Antimicrob. Chemother. 51:757-759 (2003)
【非特許文献６】Zwick et al, Journal of Virology 79:1252-1261 (2005)
【非特許文献７】Purtscher et al, AIDS 10:587 (1996)
【非特許文献８】Scanlan et al, Adv. Exper. Med. Biol. 535:205-218 (2003)
【非特許文献９】Ofek et al, J. Virol. 198:10724 (2004)
【非特許文献１０】Burton et al, Nature Immunol. 5(3):233-236 (2004)
【非特許文献１１】Kunert et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 20(7):755-762 (2004)
【非特許文献１２】Zwick et al, J. Virol. 78(6):3155-3161 (2004)
【非特許文献１３】Cardoso et al, Immunity 22:163-172 (2005)
【発明の概要】
【００１０】
概して、本発明は、ＨＩＶ−１ワクチン接種のための免疫原に関する。より具体的には、本発明は、非ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−１免疫原の組み合わせを用いてＢ細胞生殖細胞系列およびクローン中間体を標的化することにより防御的抗ＨＩＶ−１抗体の産生を誘導する方法に関する。本発明は、そのような方法における使用に適した組成物にも関する。
【００１１】
本発明の目的および利点は、以下の記述から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１．Ｈ１ソロモン諸島（Ｓｏｌｏｍａｎ Ｉｓｌａｎｄｓ）ヘマグルチニンに対する代表的なインフルエンザ抗体クローン。
【図２】図２．ＨＩＶ−１の伝染の約２０日後の患者６８４−６における形質細胞抗体レパートリー。
【図３】図３．推定される中間クローン抗体の生成。
【図４】図４．そのクローンの発生のどこでｇｐ４１との反応性が獲得されたのかを決定するために、クレードＢ ｇｐ４１、自己由来ｇｐ１４０およびグループＭコンセンサスｇｐ１４０との反応性に関してアッセイされた、推定される生殖細胞系列およびクローンメンバー中間体。
【図５】図５．２番目の中間前駆体抗体において獲得されたクローン６８４−６Ｂの反応性（図４も参照）。
【図６】図６．ｍｇの量で産生され、ｇｐ４１に対する抗体結合の解離定数（Ｋｄ）に関して分析された、追加の推定される中間抗体クローン。
【図７】図７．患者６８４−６のクローン６８４−６Ｂ生殖細胞系列におけるｇｐ４１反応性の獲得および推定される中間抗体。
【図８】図８．６８４６クローン５２の生殖細胞系列および推定される中間ｇｐ４１抗体の多反応性。
【図９】図９．好気性腸細菌叢のクローン６８４−６Ｂ抗体との反応性。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂ．腸抽出物のＢｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥおよびＭｏｊｏ抗体に対するウェスタンブロット画像。図１０Ａ．クーマシーブルー画像。図１０Ｂ．ウェスタンブロット画像。
【図１１】図１１．腸抽出物のＭｏｊｏ抗体に対するウェスタンブロット画像−非還元的、ＨＶ００２７６に対して。
【図１２】図１２．腸抽出物のＭｏｊｏ抗体に対するウェスタンブロット画像−還元的、ＨＶ００２７６に対して。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂ．１ｂ１２生殖細胞系列抗体は脂質（ＰＣ：ＣＬリポソーム）に結合する。図１３Ａ．ＨＩＶ８９．６ ｇｐ１２０への結合。図１３Ｂ．脂質（ＰＣ：カルジオリピン）への結合。
【図１４】図１４．４Ｅ１０ ＶＨノックインマウスでは、骨髄において４Ｅ１０ ＶＨを発現するＢ細胞の大部分がプレＢ〜未熟Ｂ細胞期において削除される（ｄｅｌｅｔｅｄ）。
【図１５】図１５．広く中和する抗体の誘導に関する２つの障害。第１の障害は、稀な広く中和する抗体を産生するＢ細胞を刺激するように現在設計されているワクチンは、免疫原に応答することが必要とされているナイーブＢ細胞の生殖細胞系列Ｂ細胞受容体と反応しないことである。ＨＩＶ−１ Ｅｎｖに対する初期のＢ細胞応答は感染後早期に開始されるが、初期のｇｐ４１抗体応答を作るそのＢ細胞抗体クローンが既存の多反応性の自然Ｂ細胞クローン（それの生殖細胞系列はｇｐ４１とも反応せず、ｇｐ４１との交差反応性は宿主または外来の抗原に駆動されるクローン拡大により獲得されるため、それのｇｐ４１に対する反応性はクローン性抗体発生の後期に獲得される）に由来するような、ｇｐ４１の宿主または既存の外来分子との交差反応性が存在する。一度ｇｐ４１の反応性が獲得されたら、次いでｇｐ４１はクローンの拡張を駆動する。ワクチン開発に対する第２の障害は、これらの抗体の両方が中和するために脂質反応性を有する長い疎水性のＣＤＲ３を必要とすること(Alam et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:20234-9 (2009))、ならびに２Ｆ５および４Ｅ１０ ＶＨはノックインマウスにおいて削除を促進するのに十分に自己反応性であることを示す研究から来ている(Verkoczy et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:181-186 (2010))。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜１６Ｆ．広く中和する抗体の誘導のための戦略。図１６Ａ．ワクチンは、それに多反応性ナイーブＢ細胞受容体（ＢＣＲ）が結合する宿主の（例えば脂質）および／または外来の（例えば腸の細菌叢）抗原（一番左の矢印）のどちらか、および生じてＥｎｖと交差反応するＢ細胞の中間クローンを標的化するための抗原（好ましいＥｎｖコンストラクト）を含むことによりＢ細胞前駆体を刺激するように設計されなければならない。そのワクチンのこの構成要素のためのＥｎｖのリード候補は、マラウイ１０８６クレードＣ ｇｐ１４０オリゴマー（それはモルモットにおいて中和抗体においてかなりの広さを誘導した）をクレードＢ ＪＲＦＬ ｇｐ１４０ Ｅｎｖ（それはＭＰＥＲ中和エピトープを選択的に発現する）と（中央の矢印）、および／または伝染した始祖Ｅｎｖ６２４０、０４０および６３５２１（図１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄ参照）（それは好ましくは広く中和するモノクローナル抗体により結合されるエピトープを発現する）と混合したものである。最後に、多反応性の中和抗体を作るように駆動される、Ｂ細胞の末梢での削除および／またはアネルギーを克服するため、そのワクチンは強力なＴＬＲ拮抗薬または生殖細胞系列および中間クローンを標的とするワクチンによる多反応性Ｂ細胞の活性化を駆動するための他のアジュバント（一番右の矢印）を含有する。図１６Ｅ．アポフェリチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像。図１６Ｆ．アポフェリチンのＨＶ００２７４、ＨＶ００２７６に対するウェスタンブロット画像。急性ＨＩＶ感染ｇｐ４１推定中間抗体２７６（クローン６８４−６Ｂから）および２７４（クローン６８４−６Ａから）は両方とも１９Ｋｄのアポフェリチンサブユニットに結合する。両方のｍａｂは未変性マーカー中の６０Ｋｄのタンパク質にも結合する。
【図１６Ｂ】図１６Ａ〜１６Ｆ．広く中和する抗体の誘導のための戦略。図１６Ａ．ワクチンは、それに多反応性ナイーブＢ細胞受容体（ＢＣＲ）が結合する宿主の（例えば脂質）および／または外来の（例えば腸の細菌叢）抗原（一番左の矢印）のどちらか、および生じてＥｎｖと交差反応するＢ細胞の中間クローンを標的化するための抗原（好ましいＥｎｖコンストラクト）を含むことによりＢ細胞前駆体を刺激するように設計されなければならない。そのワクチンのこの構成要素のためのＥｎｖのリード候補は、マラウイ１０８６クレードＣ ｇｐ１４０オリゴマー（それはモルモットにおいて中和抗体においてかなりの広さを誘導した）をクレードＢ ＪＲＦＬ ｇｐ１４０ Ｅｎｖ（それはＭＰＥＲ中和エピトープを選択的に発現する）と（中央の矢印）、および／または伝染した始祖Ｅｎｖ６２４０、０４０および６３５２１（図１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄ参照）（それは好ましくは広く中和するモノクローナル抗体により結合されるエピトープを発現する）と混合したものである。最後に、多反応性の中和抗体を作るように駆動される、Ｂ細胞の末梢での削除および／またはアネルギーを克服するため、そのワクチンは強力なＴＬＲ拮抗薬または生殖細胞系列および中間クローンを標的とするワクチンによる多反応性Ｂ細胞の活性化を駆動するための他のアジュバント（一番右の矢印）を含有する。図１６Ｅ．アポフェリチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像。図１６Ｆ．アポフェリチンのＨＶ００２７４、ＨＶ００２７６に対するウェスタンブロット画像。急性ＨＩＶ感染ｇｐ４１推定中間抗体２７６（クローン６８４−６Ｂから）および２７４（クローン６８４−６Ａから）は両方とも１９Ｋｄのアポフェリチンサブユニットに結合する。両方のｍａｂは未変性マーカー中の６０Ｋｄのタンパク質にも結合する。
【図１６Ｃ】図１６Ａ〜１６Ｆ．広く中和する抗体の誘導のための戦略。図１６Ａ．ワクチンは、それに多反応性ナイーブＢ細胞受容体（ＢＣＲ）が結合する宿主の（例えば脂質）および／または外来の（例えば腸の細菌叢）抗原（一番左の矢印）のどちらか、および生じてＥｎｖと交差反応するＢ細胞の中間クローンを標的化するための抗原（好ましいＥｎｖコンストラクト）を含むことによりＢ細胞前駆体を刺激するように設計されなければならない。そのワクチンのこの構成要素のためのＥｎｖのリード候補は、マラウイ１０８６クレードＣ ｇｐ１４０オリゴマー（それはモルモットにおいて中和抗体においてかなりの広さを誘導した）をクレードＢ ＪＲＦＬ ｇｐ１４０ Ｅｎｖ（それはＭＰＥＲ中和エピトープを選択的に発現する）と（中央の矢印）、および／または伝染した始祖Ｅｎｖ６２４０、０４０および６３５２１（図１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄ参照）（それは好ましくは広く中和するモノクローナル抗体により結合されるエピトープを発現する）と混合したものである。最後に、多反応性の中和抗体を作るように駆動される、Ｂ細胞の末梢での削除および／またはアネルギーを克服するため、そのワクチンは強力なＴＬＲ拮抗薬または生殖細胞系列および中間クローンを標的とするワクチンによる多反応性Ｂ細胞の活性化を駆動するための他のアジュバント（一番右の矢印）を含有する。図１６Ｅ．アポフェリチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像。図１６Ｆ．アポフェリチンのＨＶ００２７４、ＨＶ００２７６に対するウェスタンブロット画像。急性ＨＩＶ感染ｇｐ４１推定中間抗体２７６（クローン６８４−６Ｂから）および２７４（クローン６８４−６Ａから）は両方とも１９Ｋｄのアポフェリチンサブユニットに結合する。両方のｍａｂは未変性マーカー中の６０Ｋｄのタンパク質にも結合する。
【図１６Ｄ】図１６Ａ〜１６Ｆ．広く中和する抗体の誘導のための戦略。図１６Ａ．ワクチンは、それに多反応性ナイーブＢ細胞受容体（ＢＣＲ）が結合する宿主の（例えば脂質）および／または外来の（例えば腸の細菌叢）抗原（一番左の矢印）のどちらか、および生じてＥｎｖと交差反応するＢ細胞の中間クローンを標的化するための抗原（好ましいＥｎｖコンストラクト）を含むことによりＢ細胞前駆体を刺激するように設計されなければならない。そのワクチンのこの構成要素のためのＥｎｖのリード候補は、マラウイ１０８６クレードＣ ｇｐ１４０オリゴマー（それはモルモットにおいて中和抗体においてかなりの広さを誘導した）をクレードＢ ＪＲＦＬ ｇｐ１４０ Ｅｎｖ（それはＭＰＥＲ中和エピトープを選択的に発現する）と（中央の矢印）、および／または伝染した始祖Ｅｎｖ６２４０、０４０および６３５２１（図１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄ参照）（それは好ましくは広く中和するモノクローナル抗体により結合されるエピトープを発現する）と混合したものである。最後に、多反応性の中和抗体を作るように駆動される、Ｂ細胞の末梢での削除および／またはアネルギーを克服するため、そのワクチンは強力なＴＬＲ拮抗薬または生殖細胞系列および中間クローンを標的とするワクチンによる多反応性Ｂ細胞の活性化を駆動するための他のアジュバント（一番右の矢印）を含有する。図１６Ｅ．アポフェリチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像。図１６Ｆ．アポフェリチンのＨＶ００２７４、ＨＶ００２７６に対するウェスタンブロット画像。急性ＨＩＶ感染ｇｐ４１推定中間抗体２７６（クローン６８４−６Ｂから）および２７４（クローン６８４−６Ａから）は両方とも１９Ｋｄのアポフェリチンサブユニットに結合する。両方のｍａｂは未変性マーカー中の６０Ｋｄのタンパク質にも結合する。
【図１６Ｅ】図１６Ａ〜１６Ｆ．広く中和する抗体の誘導のための戦略。図１６Ａ．ワクチンは、それに多反応性ナイーブＢ細胞受容体（ＢＣＲ）が結合する宿主の（例えば脂質）および／または外来の（例えば腸の細菌叢）抗原（一番左の矢印）のどちらか、および生じてＥｎｖと交差反応するＢ細胞の中間クローンを標的化するための抗原（好ましいＥｎｖコンストラクト）を含むことによりＢ細胞前駆体を刺激するように設計されなければならない。そのワクチンのこの構成要素のためのＥｎｖのリード候補は、マラウイ１０８６クレードＣ ｇｐ１４０オリゴマー（それはモルモットにおいて中和抗体においてかなりの広さを誘導した）をクレードＢ ＪＲＦＬ ｇｐ１４０ Ｅｎｖ（それはＭＰＥＲ中和エピトープを選択的に発現する）と（中央の矢印）、および／または伝染した始祖Ｅｎｖ６２４０、０４０および６３５２１（図１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄ参照）（それは好ましくは広く中和するモノクローナル抗体により結合されるエピトープを発現する）と混合したものである。最後に、多反応性の中和抗体を作るように駆動される、Ｂ細胞の末梢での削除および／またはアネルギーを克服するため、そのワクチンは強力なＴＬＲ拮抗薬または生殖細胞系列および中間クローンを標的とするワクチンによる多反応性Ｂ細胞の活性化を駆動するための他のアジュバント（一番右の矢印）を含有する。図１６Ｅ．アポフェリチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像。図１６Ｆ．アポフェリチンのＨＶ００２７４、ＨＶ００２７６に対するウェスタンブロット画像。急性ＨＩＶ感染ｇｐ４１推定中間抗体２７６（クローン６８４−６Ｂから）および２７４（クローン６８４−６Ａから）は両方とも１９Ｋｄのアポフェリチンサブユニットに結合する。両方のｍａｂは未変性マーカー中の６０Ｋｄのタンパク質にも結合する。
【図１６Ｆ】図１６Ａ〜１６Ｆ．広く中和する抗体の誘導のための戦略。図１６Ａ．ワクチンは、それに多反応性ナイーブＢ細胞受容体（ＢＣＲ）が結合する宿主の（例えば脂質）および／または外来の（例えば腸の細菌叢）抗原（一番左の矢印）のどちらか、および生じてＥｎｖと交差反応するＢ細胞の中間クローンを標的化するための抗原（好ましいＥｎｖコンストラクト）を含むことによりＢ細胞前駆体を刺激するように設計されなければならない。そのワクチンのこの構成要素のためのＥｎｖのリード候補は、マラウイ１０８６クレードＣ ｇｐ１４０オリゴマー（それはモルモットにおいて中和抗体においてかなりの広さを誘導した）をクレードＢ ＪＲＦＬ ｇｐ１４０ Ｅｎｖ（それはＭＰＥＲ中和エピトープを選択的に発現する）と（中央の矢印）、および／または伝染した始祖Ｅｎｖ６２４０、０４０および６３５２１（図１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄ参照）（それは好ましくは広く中和するモノクローナル抗体により結合されるエピトープを発現する）と混合したものである。最後に、多反応性の中和抗体を作るように駆動される、Ｂ細胞の末梢での削除および／またはアネルギーを克服するため、そのワクチンは強力なＴＬＲ拮抗薬または生殖細胞系列および中間クローンを標的とするワクチンによる多反応性Ｂ細胞の活性化を駆動するための他のアジュバント（一番右の矢印）を含有する。図１６Ｅ．アポフェリチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像。図１６Ｆ．アポフェリチンのＨＶ００２７４、ＨＶ００２７６に対するウェスタンブロット画像。急性ＨＩＶ感染ｇｐ４１推定中間抗体２７６（クローン６８４−６Ｂから）および２７４（クローン６８４−６Ａから）は両方とも１９Ｋｄのアポフェリチンサブユニットに結合する。両方のｍａｂは未変性マーカー中の６０Ｋｄのタンパク質にも結合する。
【図１７】図１７．ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ ｇｐ１４０コンストラクトの設計。
【図１８】図１８．Ｂｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、急性ＨＩＶ−１ ＥｎｖおよびグループＭコンセンサスＨＩＶ−１ Ｅｎｖの分析。
【図１９Ａ】図１９Ａおよび１９Ｂ．図１９Ａ．グループＭコンセンサスＨＩＶ−１ Ｅｎｖ、ＣＯＮ−Ｓおよび亜型Ｃ急性ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ、１０８６Ｃ、亜型Ｂ慢性ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ、ＪＲＦＬの免疫原性。図１９Ｂ．方法。
【図１９Ｂ】図１９Ａおよび１９Ｂ．図１９Ａ．グループＭコンセンサスＨＩＶ−１ Ｅｎｖ、ＣＯＮ−Ｓおよび亜型Ｃ急性ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ、１０８６Ｃ、亜型Ｂ慢性ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ、ＪＲＦＬの免疫原性。図１９Ｂ．方法。
【図２０】図２０．ＪＲＦＬ Ｅｎｖ ｇｐ１４０ ＣＦのＰＮＧａｓｅによる糖鎖除去。
【図２１Ａ】図２１Ａおよび２１Ｂ．ＥＬＩＳＡにおけるＪＲＦＬ ＨＩＶ Ｅｎｖ ｇｐ１４０ＣＦの抗原性。
【図２１Ｂ】図２１Ａおよび２１Ｂ．ＥＬＩＳＡにおけるＪＲＦＬ ＨＩＶ Ｅｎｖ ｇｐ１４０ＣＦの抗原性。
【図２２】図２２．ＳＰＲにおけるＪＲＦＬ ｇｐ１４０ Ｅｎｖの抗原性。
【図２３】図２３．広く中和する抗体により標的とされるＨＩＶ−１ ｇｐ４１の融合中間体状態。
【図２４Ａ】図２４Ａおよび２４Ｂ．図２４Ａ．膜に固定されたｇｐ４１−ｉｎｔｅｒの設計。図２４Ｂ．２Ｆ５および４Ｅ１０ ｍＡｂは、膜にコンジュゲートされたｇｐ４１−ｉｎｔｅｒに、ｎＭのＫｄおよびほとんど不可逆的な解離速度で結合する。
【図２４Ｂ】図２４Ａおよび２４Ｂ．図２４Ａ．膜に固定されたｇｐ４１−ｉｎｔｅｒの設計。図２４Ｂ．２Ｆ５および４Ｅ１０ ｍＡｂは、膜にコンジュゲートされたｇｐ４１−ｉｎｔｅｒとｎＭのＫｄおよびほとんど不可逆的な解離速度で結合する。
【図２５】図２５．リード候補免疫原。
【図２６】図２６．ＴＬＲリガンドおよび封入された免疫調節性リガンドを有するｇｐ４１−ｉｎｔｅｒリポソーム。
【図２７】図２７．ＨＩＶ−１の伝染始祖Ｅｎｖ １０８６．Ｃ、０８９．Ｃ、０４０＿Ｃ９、および６３５２１に関するアミノ酸配列およびコドン最適化されたコーディング配列。
【図２８】図２８．クレードＢ ＪＲＦＬおよび６２４０ ｇｐ１４０ Ｅｎｖ配列およびコーディング配列。
【図２９−１】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−３】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−４】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−５】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−６】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−７】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−８】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−９】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１０】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１１】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１２】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１３】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１４】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１５】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１６】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１７】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１８】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１９】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２０】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２１】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１０年２月２５日に出願された米国仮出願第６１／２８２，５２６号、２０１０年７月２７日に出願された米国仮出願第６１／３４４，４５７号、２０１０年８月２５日に出願された米国仮出願第６１／３４４，５８０号、および２０１０年９月１日に出願された米国仮出願第６１／３４４，６２２号からの優先権を主張し、その内容全体を本明細書に援用する。
【０００２】
この発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）により与えられた助成金第ＡＩ０６７８５４号、第ＡＩ２４３３５号および第ＡＩ８１５７９号の下での政府援助によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、概して、ＨＩＶ−１ワクチン接種のための免疫原に、ならびに特に非ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−１免疫原の組み合わせを用いてＢ細胞生殖細胞系列およびクローン中間体（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ）を標的化することにより防御的抗ＨＩＶ−１抗体の産生を誘導する方法に関する。本発明は、そのような方法における使用に適した組成物にも関する。
【背景技術】
【０００４】
伝染／始祖（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ／ｆｏｕｎｄｅｒ）ＨＩＶ−１エンベロープに対する最初の抗体応答は非中和的であり、Ｅｎｖ ｇｐ４１を標的とし、血漿ウイルス血症の出現の平均１３日後に起こる(Tomaras et al, J. Virology 82:12449-63 (2008))。最初の抗体応答と同時に起こるＨＩＶ−１に対する最初のＴ細胞応答はＨＩＶ−１のＴ細胞エピトープ内での変異を駆動するが、ＨＩＶ−１に対する最初のｇｐ４１抗体応答はそれをしない。むしろ、それは自己由来中和抗体応答であり、それは伝染のおおよそ３ヶ月後まで遅れ、それは抗体回避変異体と関係する最初の中和抗体応答である(McMichael et al, Nature Rev. Immunol. 10:11-23 (2010))。
【０００５】
稀な広く反応する中和抗体が結合するＨＩＶ−１エンベロープ上の４つのエピトープは、ＣＤ４結合部位（ＣＤ４ＢＳ）（ｍａｂ（モノクローナル抗体）ＩｇＧ１ｂ１２）(Zwick et al, J. Virol. 77(10):5863-5876 (2003))、ヒトｍａｂ ２Ｆ５および４Ｅ１０により定められる膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）エピトープ(Armbruster et al, J. Antimicrob. Chemother. 54:915-920 (2004), Stiegler and Katinger, J. Antimicrob. Chemother. 51:757-759 (2003), Zwick et al, Journal of Virology 79:1252-1261 (2005), Purtscher et al, AIDS 10:587 (1996))、ならびにヒトｍａｂ ２Ｇ１２により定められるマンナングリカンエピトープ(Scanlan et al, Adv. Exper. Med. Biol. 535:205-218 (2003))である。これらの４種類の稀なヒトｍａｂは全て普通ではなく：２種類はＩｇＧ３であり（２Ｆ５および４Ｅ１０）、１種類は独特のＩｇ二量体構造を有し（２Ｇ１２）、１種類は非常に疎水性のＣＤＲ３を有し（２Ｆ５）(Ofek et al, J. Virol. 198:10724 (2004))、そして４種類全てにおいて、そのＣＤＲ３が異常に長い(Burton et al, Nature Immunol. 5(3):233-236 (2004), Kunert et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 20(7):755-762 (2004), Zwick et al, J. Virol. 78(6):3155-3161 (2004), Cardoso et al, Immunity 22:163-172 (2005))。これらの内で、２Ｆ５および４Ｅ１０様のヒトｍａｂは極めて稀である。急性ＨＩＶ−１患者はＭＰＥＲまたは２Ｇ１２エピトープに対する抗体を作らず、ＭＰＥＲはＨＩＶエンベロープのアミノ酸６５２〜６８３として定義することができる(Cardoso et al, Immunity 22:163-173 (2005)（例えば、ＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦＤＩＴＮＷＬＷＹＩＫ）。ＣＤ４結合部位（ＢＳ）抗体は一般にＨＩＶ−１感染の早期に作られるが、これらの抗体は一般にｍａｂ ＩｇＧ１ｂ１２により示される広い中和のスペクトルを有しない(Burtonet al, Nat. Immunol. 5(3):233-236 (2004))。
【０００６】
ＨＩＶ−１エンベロープ（Ｅｎｖ）に対する効果的でない初期抗体応答の病因を理解するため、ＨＩＶ−１の伝染の１７〜３０日後の５人の急性感染した対象からの単一の血球または骨髄形質細胞からの重および軽鎖（ＶＨおよびＶＬ）遺伝子の免疫グロブリン可変領域の増幅のためのＰＣＲを行った。ＨＩＶ−１感染により誘導される形質細胞応答の特異性を決定した。伝染したＨＩＶ−１により誘導された単一のヒト形質細胞のＶＨおよびＶＬ遺伝子のＰＣＲ増幅を用いて、ＨＩＶ−１に対する初期の形質細胞／形質芽球応答を研究した。ＨＩＶ−１に対する最初の抗体応答はＨＩＶ−１ Ｅｎｖ ｇｐ４１に対して誘導されること、そしてｇｐ４１は既存の記憶Ｂ細胞クローンにおいて抗体応答を誘導し、結果としていくつかの宿主および細菌の分子、特にヒトの腸細菌叢の分子と交差反応する低親和性、多反応性の抗Ｅｎｖ抗体を生じさせることが分かった。
【０００７】
本発明は、少なくとも部分的に、初期の抗ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ ｇｐ４１抗体および稀な広く中和する抗体の両方の源を同定するように設計された研究の結果もたらされる。本発明はさらに、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１ ＭＰＥＲの２Ｆ５、およびおそらく４Ｅ１０に構造的に類似している、ほとんどの温血脊椎動物において発現している細胞タンパク質の同定の結果もたらされる。
【０００８】
本発明は、ＨＩＶ−１に対する広く中和する抗体を生じるように駆動され得るナイーブＢ細胞のプールを標的とするように設計されたＨＩＶ−１ワクチンを提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Tomaras et al, J. Virology 82:12449-63 (2008)
【非特許文献２】McMichael et al, Nature Rev. Immunol. 10:11-23 (2010)
【非特許文献３】Zwick et al, J. Virol. 77(10):5863-5876 (2003)
【非特許文献４】Armbruster et al, J. Antimicrob. Chemother. 54:915-920 (2004)
【非特許文献５】Stiegler and Katinger, J. Antimicrob. Chemother. 51:757-759 (2003)
【非特許文献６】Zwick et al, Journal of Virology 79:1252-1261 (2005)
【非特許文献７】Purtscher et al, AIDS 10:587 (1996)
【非特許文献８】Scanlan et al, Adv. Exper. Med. Biol. 535:205-218 (2003)
【非特許文献９】Ofek et al, J. Virol. 198:10724 (2004)
【非特許文献１０】Burton et al, Nature Immunol. 5(3):233-236 (2004)
【非特許文献１１】Kunert et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 20(7):755-762 (2004)
【非特許文献１２】Zwick et al, J. Virol. 78(6):3155-3161 (2004)
【非特許文献１３】Cardoso et al, Immunity 22:163-172 (2005)
【発明の概要】
【００１０】
概して、本発明は、ＨＩＶ−１ワクチン接種のための免疫原に関する。より具体的には、本発明は、非ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−１免疫原の組み合わせを用いてＢ細胞生殖細胞系列およびクローン中間体を標的化することにより防御的抗ＨＩＶ−１抗体の産生を誘導する方法に関する。本発明は、そのような方法における使用に適した組成物にも関する。
【００１１】
本発明の目的および利点は、以下の記述から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１．Ｈ１ソロモン諸島（Ｓｏｌｏｍａｎ Ｉｓｌａｎｄｓ）ヘマグルチニンに対する代表的なインフルエンザ抗体クローン。
【図２】図２．ＨＩＶ−１の伝染の約２０日後の患者６８４−６における形質細胞抗体レパートリー。
【図３】図３．推定される中間クローン抗体の生成。
【図４】図４．そのクローンの発生のどこでｇｐ４１との反応性が獲得されたのかを決定するために、クレードＢ ｇｐ４１、自己由来ｇｐ１４０およびグループＭコンセンサスｇｐ１４０との反応性に関してアッセイされた、推定される生殖細胞系列およびクローンメンバー中間体。
【図５】図５．２番目の中間前駆体抗体において獲得されたクローン６８４−６Ｂの反応性（図４も参照）。
【図６】図６．ｍｇの量で産生され、ｇｐ４１に対する抗体結合の解離定数（Ｋｄ）に関して分析された、追加の推定される中間抗体クローン。
【図７】図７．患者６８４−６のクローン６８４−６Ｂ生殖細胞系列におけるｇｐ４１反応性の獲得および推定される中間抗体。
【図８】図８．６８４６クローン５２の生殖細胞系列および推定される中間ｇｐ４１抗体の多反応性。
【図９】図９．好気性腸細菌叢のクローン６８４−６Ｂ抗体との反応性。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂ．腸抽出物のＢｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥおよびＭｏｊｏ抗体に対するウェスタンブロット画像。図１０Ａ．クーマシーブルー画像。図１０Ｂ．ウェスタンブロット画像。
【図１１】図１１．腸抽出物のＭｏｊｏ抗体に対するウェスタンブロット画像−非還元的、ＨＶ００２７６に対して。
【図１２】図１２．腸抽出物のＭｏｊｏ抗体に対するウェスタンブロット画像−還元的、ＨＶ００２７６に対して。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂ．１ｂ１２生殖細胞系列抗体は脂質（ＰＣ：ＣＬリポソーム）に結合する。図１３Ａ．ＨＩＶ８９．６ ｇｐ１２０への結合。図１３Ｂ．脂質（ＰＣ：カルジオリピン）への結合。
【図１４】図１４．４Ｅ１０ ＶＨノックインマウスでは、骨髄において４Ｅ１０ ＶＨを発現するＢ細胞の大部分がプレＢ〜未熟Ｂ細胞期において削除される（ｄｅｌｅｔｅｄ）。
【図１５】図１５．広く中和する抗体の誘導に関する２つの障害。第１の障害は、稀な広く中和する抗体を産生するＢ細胞を刺激するように現在設計されているワクチンは、免疫原に応答することが必要とされているナイーブＢ細胞の生殖細胞系列Ｂ細胞受容体と反応しないことである。ＨＩＶ−１ Ｅｎｖに対する初期のＢ細胞応答は感染後早期に開始されるが、初期のｇｐ４１抗体応答を作るそのＢ細胞抗体クローンが既存の多反応性の自然Ｂ細胞クローン（それの生殖細胞系列はｇｐ４１とも反応せず、ｇｐ４１との交差反応性は宿主または外来の抗原に駆動されるクローン拡大により獲得されるため、それのｇｐ４１に対する反応性はクローン性抗体発生の後期に獲得される）に由来するような、ｇｐ４１の宿主または既存の外来分子との交差反応性が存在する。一度ｇｐ４１の反応性が獲得されたら、次いでｇｐ４１はクローンの拡張を駆動する。ワクチン開発に対する第２の障害は、これらの抗体の両方が中和するために脂質反応性を有する長い疎水性のＣＤＲ３を必要とすること(Alam et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:20234-9 (2009))、ならびに２Ｆ５および４Ｅ１０ ＶＨはノックインマウスにおいて削除を促進するのに十分に自己反応性であることを示す研究から来ている(Verkoczy et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:181-186 (2010))。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜１６Ｆ．広く中和する抗体の誘導のための戦略。図１６Ａ．ワクチンは、それに多反応性ナイーブＢ細胞受容体（ＢＣＲ）が結合する宿主の（例えば脂質）および／または外来の（例えば腸の細菌叢）抗原（一番左の矢印）のどちらか、および生じてＥｎｖと交差反応するＢ細胞の中間クローンを標的化するための抗原（好ましいＥｎｖコンストラクト）を含むことによりＢ細胞前駆体を刺激するように設計されなければならない。そのワクチンのこの構成要素のためのＥｎｖのリード候補は、マラウイ１０８６クレードＣ ｇｐ１４０オリゴマー（それはモルモットにおいて中和抗体においてかなりの広さを誘導した）をクレードＢ ＪＲＦＬ ｇｐ１４０ Ｅｎｖ（それはＭＰＥＲ中和エピトープを選択的に発現する）と（中央の矢印）、および／または伝染した始祖Ｅｎｖ６２４０、０４０および６３５２１（図１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄ参照）（それは好ましくは広く中和するモノクローナル抗体により結合されるエピトープを発現する）と混合したものである。最後に、多反応性の中和抗体を作るように駆動される、Ｂ細胞の末梢での削除および／またはアネルギーを克服するため、そのワクチンは強力なＴＬＲ拮抗薬または生殖細胞系列および中間クローンを標的とするワクチンによる多反応性Ｂ細胞の活性化を駆動するための他のアジュバント（一番右の矢印）を含有する。図１６Ｅ．アポフェリチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像。図１６Ｆ．アポフェリチンのＨＶ００２７４、ＨＶ００２７６に対するウェスタンブロット画像。急性ＨＩＶ感染ｇｐ４１推定中間抗体２７６（クローン６８４−６Ｂから）および２７４（クローン６８４−６Ａから）は両方とも１９Ｋｄのアポフェリチンサブユニットに結合する。両方のｍａｂは未変性マーカー中の６０Ｋｄのタンパク質にも結合する。
【図１６Ｂ】図１６Ａ〜１６Ｆ．広く中和する抗体の誘導のための戦略。図１６Ａ．ワクチンは、それに多反応性ナイーブＢ細胞受容体（ＢＣＲ）が結合する宿主の（例えば脂質）および／または外来の（例えば腸の細菌叢）抗原（一番左の矢印）のどちらか、および生じてＥｎｖと交差反応するＢ細胞の中間クローンを標的化するための抗原（好ましいＥｎｖコンストラクト）を含むことによりＢ細胞前駆体を刺激するように設計されなければならない。そのワクチンのこの構成要素のためのＥｎｖのリード候補は、マラウイ１０８６クレードＣ ｇｐ１４０オリゴマー（それはモルモットにおいて中和抗体においてかなりの広さを誘導した）をクレードＢ ＪＲＦＬ ｇｐ１４０ Ｅｎｖ（それはＭＰＥＲ中和エピトープを選択的に発現する）と（中央の矢印）、および／または伝染した始祖Ｅｎｖ６２４０、０４０および６３５２１（図１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄ参照）（それは好ましくは広く中和するモノクローナル抗体により結合されるエピトープを発現する）と混合したものである。最後に、多反応性の中和抗体を作るように駆動される、Ｂ細胞の末梢での削除および／またはアネルギーを克服するため、そのワクチンは強力なＴＬＲ拮抗薬または生殖細胞系列および中間クローンを標的とするワクチンによる多反応性Ｂ細胞の活性化を駆動するための他のアジュバント（一番右の矢印）を含有する。図１６Ｅ．アポフェリチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像。図１６Ｆ．アポフェリチンのＨＶ００２７４、ＨＶ００２７６に対するウェスタンブロット画像。急性ＨＩＶ感染ｇｐ４１推定中間抗体２７６（クローン６８４−６Ｂから）および２７４（クローン６８４−６Ａから）は両方とも１９Ｋｄのアポフェリチンサブユニットに結合する。両方のｍａｂは未変性マーカー中の６０Ｋｄのタンパク質にも結合する。
【図１６Ｃ】図１６Ａ〜１６Ｆ．広く中和する抗体の誘導のための戦略。図１６Ａ．ワクチンは、それに多反応性ナイーブＢ細胞受容体（ＢＣＲ）が結合する宿主の（例えば脂質）および／または外来の（例えば腸の細菌叢）抗原（一番左の矢印）のどちらか、および生じてＥｎｖと交差反応するＢ細胞の中間クローンを標的化するための抗原（好ましいＥｎｖコンストラクト）を含むことによりＢ細胞前駆体を刺激するように設計されなければならない。そのワクチンのこの構成要素のためのＥｎｖのリード候補は、マラウイ１０８６クレードＣ ｇｐ１４０オリゴマー（それはモルモットにおいて中和抗体においてかなりの広さを誘導した）をクレードＢ ＪＲＦＬ ｇｐ１４０ Ｅｎｖ（それはＭＰＥＲ中和エピトープを選択的に発現する）と（中央の矢印）、および／または伝染した始祖Ｅｎｖ６２４０、０４０および６３５２１（図１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄ参照）（それは好ましくは広く中和するモノクローナル抗体により結合されるエピトープを発現する）と混合したものである。最後に、多反応性の中和抗体を作るように駆動される、Ｂ細胞の末梢での削除および／またはアネルギーを克服するため、そのワクチンは強力なＴＬＲ拮抗薬または生殖細胞系列および中間クローンを標的とするワクチンによる多反応性Ｂ細胞の活性化を駆動するための他のアジュバント（一番右の矢印）を含有する。図１６Ｅ．アポフェリチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像。図１６Ｆ．アポフェリチンのＨＶ００２７４、ＨＶ００２７６に対するウェスタンブロット画像。急性ＨＩＶ感染ｇｐ４１推定中間抗体２７６（クローン６８４−６Ｂから）および２７４（クローン６８４−６Ａから）は両方とも１９Ｋｄのアポフェリチンサブユニットに結合する。両方のｍａｂは未変性マーカー中の６０Ｋｄのタンパク質にも結合する。
【図１６Ｄ】図１６Ａ〜１６Ｆ．広く中和する抗体の誘導のための戦略。図１６Ａ．ワクチンは、それに多反応性ナイーブＢ細胞受容体（ＢＣＲ）が結合する宿主の（例えば脂質）および／または外来の（例えば腸の細菌叢）抗原（一番左の矢印）のどちらか、および生じてＥｎｖと交差反応するＢ細胞の中間クローンを標的化するための抗原（好ましいＥｎｖコンストラクト）を含むことによりＢ細胞前駆体を刺激するように設計されなければならない。そのワクチンのこの構成要素のためのＥｎｖのリード候補は、マラウイ１０８６クレードＣ ｇｐ１４０オリゴマー（それはモルモットにおいて中和抗体においてかなりの広さを誘導した）をクレードＢ ＪＲＦＬ ｇｐ１４０ Ｅｎｖ（それはＭＰＥＲ中和エピトープを選択的に発現する）と（中央の矢印）、および／または伝染した始祖Ｅｎｖ６２４０、０４０および６３５２１（図１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄ参照）（それは好ましくは広く中和するモノクローナル抗体により結合されるエピトープを発現する）と混合したものである。最後に、多反応性の中和抗体を作るように駆動される、Ｂ細胞の末梢での削除および／またはアネルギーを克服するため、そのワクチンは強力なＴＬＲ拮抗薬または生殖細胞系列および中間クローンを標的とするワクチンによる多反応性Ｂ細胞の活性化を駆動するための他のアジュバント（一番右の矢印）を含有する。図１６Ｅ．アポフェリチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像。図１６Ｆ．アポフェリチンのＨＶ００２７４、ＨＶ００２７６に対するウェスタンブロット画像。急性ＨＩＶ感染ｇｐ４１推定中間抗体２７６（クローン６８４−６Ｂから）および２７４（クローン６８４−６Ａから）は両方とも１９Ｋｄのアポフェリチンサブユニットに結合する。両方のｍａｂは未変性マーカー中の６０Ｋｄのタンパク質にも結合する。
【図１６Ｅ】図１６Ａ〜１６Ｆ．広く中和する抗体の誘導のための戦略。図１６Ａ．ワクチンは、それに多反応性ナイーブＢ細胞受容体（ＢＣＲ）が結合する宿主の（例えば脂質）および／または外来の（例えば腸の細菌叢）抗原（一番左の矢印）のどちらか、および生じてＥｎｖと交差反応するＢ細胞の中間クローンを標的化するための抗原（好ましいＥｎｖコンストラクト）を含むことによりＢ細胞前駆体を刺激するように設計されなければならない。そのワクチンのこの構成要素のためのＥｎｖのリード候補は、マラウイ１０８６クレードＣ ｇｐ１４０オリゴマー（それはモルモットにおいて中和抗体においてかなりの広さを誘導した）をクレードＢ ＪＲＦＬ ｇｐ１４０ Ｅｎｖ（それはＭＰＥＲ中和エピトープを選択的に発現する）と（中央の矢印）、および／または伝染した始祖Ｅｎｖ６２４０、０４０および６３５２１（図１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄ参照）（それは好ましくは広く中和するモノクローナル抗体により結合されるエピトープを発現する）と混合したものである。最後に、多反応性の中和抗体を作るように駆動される、Ｂ細胞の末梢での削除および／またはアネルギーを克服するため、そのワクチンは強力なＴＬＲ拮抗薬または生殖細胞系列および中間クローンを標的とするワクチンによる多反応性Ｂ細胞の活性化を駆動するための他のアジュバント（一番右の矢印）を含有する。図１６Ｅ．アポフェリチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像。図１６Ｆ．アポフェリチンのＨＶ００２７４、ＨＶ００２７６に対するウェスタンブロット画像。急性ＨＩＶ感染ｇｐ４１推定中間抗体２７６（クローン６８４−６Ｂから）および２７４（クローン６８４−６Ａから）は両方とも１９Ｋｄのアポフェリチンサブユニットに結合する。両方のｍａｂは未変性マーカー中の６０Ｋｄのタンパク質にも結合する。
【図１６Ｆ】図１６Ａ〜１６Ｆ．広く中和する抗体の誘導のための戦略。図１６Ａ．ワクチンは、それに多反応性ナイーブＢ細胞受容体（ＢＣＲ）が結合する宿主の（例えば脂質）および／または外来の（例えば腸の細菌叢）抗原（一番左の矢印）のどちらか、および生じてＥｎｖと交差反応するＢ細胞の中間クローンを標的化するための抗原（好ましいＥｎｖコンストラクト）を含むことによりＢ細胞前駆体を刺激するように設計されなければならない。そのワクチンのこの構成要素のためのＥｎｖのリード候補は、マラウイ１０８６クレードＣ ｇｐ１４０オリゴマー（それはモルモットにおいて中和抗体においてかなりの広さを誘導した）をクレードＢ ＪＲＦＬ ｇｐ１４０ Ｅｎｖ（それはＭＰＥＲ中和エピトープを選択的に発現する）と（中央の矢印）、および／または伝染した始祖Ｅｎｖ６２４０、０４０および６３５２１（図１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄ参照）（それは好ましくは広く中和するモノクローナル抗体により結合されるエピトープを発現する）と混合したものである。最後に、多反応性の中和抗体を作るように駆動される、Ｂ細胞の末梢での削除および／またはアネルギーを克服するため、そのワクチンは強力なＴＬＲ拮抗薬または生殖細胞系列および中間クローンを標的とするワクチンによる多反応性Ｂ細胞の活性化を駆動するための他のアジュバント（一番右の矢印）を含有する。図１６Ｅ．アポフェリチンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像。図１６Ｆ．アポフェリチンのＨＶ００２７４、ＨＶ００２７６に対するウェスタンブロット画像。急性ＨＩＶ感染ｇｐ４１推定中間抗体２７６（クローン６８４−６Ｂから）および２７４（クローン６８４−６Ａから）は両方とも１９Ｋｄのアポフェリチンサブユニットに結合する。両方のｍａｂは未変性マーカー中の６０Ｋｄのタンパク質にも結合する。
【図１７】図１７．ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ ｇｐ１４０コンストラクトの設計。
【図１８】図１８．Ｂｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、急性ＨＩＶ−１ ＥｎｖおよびグループＭコンセンサスＨＩＶ−１ Ｅｎｖの分析。
【図１９Ａ】図１９Ａおよび１９Ｂ．図１９Ａ．グループＭコンセンサスＨＩＶ−１ Ｅｎｖ、ＣＯＮ−Ｓおよび亜型Ｃ急性ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ、１０８６Ｃ、亜型Ｂ慢性ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ、ＪＲＦＬの免疫原性。図１９Ｂ．方法。
【図１９Ｂ】図１９Ａおよび１９Ｂ．図１９Ａ．グループＭコンセンサスＨＩＶ−１ Ｅｎｖ、ＣＯＮ−Ｓおよび亜型Ｃ急性ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ、１０８６Ｃ、亜型Ｂ慢性ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ、ＪＲＦＬの免疫原性。図１９Ｂ．方法。
【図２０】図２０．ＪＲＦＬ Ｅｎｖ ｇｐ１４０ ＣＦのＰＮＧａｓｅによる糖鎖除去。
【図２１Ａ】図２１Ａおよび２１Ｂ．ＥＬＩＳＡにおけるＪＲＦＬ ＨＩＶ Ｅｎｖ ｇｐ１４０ＣＦの抗原性。
【図２１Ｂ】図２１Ａおよび２１Ｂ．ＥＬＩＳＡにおけるＪＲＦＬ ＨＩＶ Ｅｎｖ ｇｐ１４０ＣＦの抗原性。
【図２２】図２２．ＳＰＲにおけるＪＲＦＬ ｇｐ１４０ Ｅｎｖの抗原性。
【図２３】図２３．広く中和する抗体により標的とされるＨＩＶ−１ ｇｐ４１の融合中間体状態。
【図２４Ａ】図２４Ａおよび２４Ｂ．図２４Ａ．膜に固定されたｇｐ４１−ｉｎｔｅｒの設計。図２４Ｂ．２Ｆ５および４Ｅ１０ ｍＡｂは、膜にコンジュゲートされたｇｐ４１−ｉｎｔｅｒに、ｎＭのＫｄおよびほとんど不可逆的な解離速度で結合する。
【図２４Ｂ】図２４Ａおよび２４Ｂ．図２４Ａ．膜に固定されたｇｐ４１−ｉｎｔｅｒの設計。図２４Ｂ．２Ｆ５および４Ｅ１０ ｍＡｂは、膜にコンジュゲートされたｇｐ４１−ｉｎｔｅｒとｎＭのＫｄおよびほとんど不可逆的な解離速度で結合する。
【図２５】図２５．リード候補免疫原。
【図２６】図２６．ＴＬＲリガンドおよび封入された免疫調節性リガンドを有するｇｐ４１−ｉｎｔｅｒリポソーム。
【図２７】図２７．ＨＩＶ−１の伝染始祖Ｅｎｖ １０８６．Ｃ、０８９．Ｃ、０４０＿Ｃ９、および６３５２１に関するアミノ酸配列およびコドン最適化されたコーディング配列。
【図２８】図２８．クレードＢ ＪＲＦＬおよび６２４０ ｇｐ１４０ Ｅｎｖ配列およびコーディング配列。
【図２９−１】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−３】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−４】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−５】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−６】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−７】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−８】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−９】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１０】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１１】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１２】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１３】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１４】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１５】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１６】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１７】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１８】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−１９】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２０】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２１】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象においてＨＩＶ−１に対する広く中和する抗体の産生を誘導する方法であって、以下の：
ｉ）前記の対象に生殖細胞系列Ｂ細胞受容体に結合する非ＨＩＶ−１抗原を投与し、前記の非ＨＩＶ−１抗原はＨＩＶ−１ Ｅｎｖと交差反応する抗体を分泌するＢ細胞の中間クローンが生成されるような量で、およびそのような条件の下で投与され、そして
ｉｉ）前記の対象にＨＩＶ−１抗原を、前記の広く中和する抗ＨＩＶ−１抗体を分泌するナイーブＢ細胞または前記のＢ細胞の中間クローンが生成されるような量で、およびそのような条件の下で投与する
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
前記の対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の非ＨＩＶ−１抗原が脂質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記の脂質がカルジオリピン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、またはそれらの誘導体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記の脂質が１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＰＯＰＳ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、またはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記の脂質がリン脂質の六方ＩＩ相である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記の非ＨＩＶ−１抗原がフィコエリトリン（ＰＥ）、Ｃ−フィコシアニン（Ｃ−ＰＣ）、アポフェリチン、または嫌気性もしくは好気性腸細菌叢もしくはその構成要素である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記の非ＨＩＶ−１抗原が細菌または真核生物のＲＮＡポリメラーゼコアタンパク質のαサブユニットを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記の非ＨＩＶ−１抗原がキヌレニナーゼ（ＫＹＮＵ）またはその抗原性断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記のＫＹＮＵがＣＨＯまたは２９３Ｔ細胞で発現させた組換えＫＹＮＵ、またはその抗原性断片である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
さらにアジュバントを投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記のアジュバントがスクアレンに基づくアジュバント、ＴＲＬ作動薬、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｔｉｄｅｓ）（ｏＣｐＧ）またはＲ８４８である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記のＨＩＶ−１抗原が膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）抗原、またはその変種である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記のＨＩＶ−１抗原が図１６Ｂ、１６Ｃ、１７、１８、２０、２５または２６において示した免疫原である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記の変種がＬ６６９Ｓ変異を有するＭＰＥＲエピトープペプチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記のＨＩＶ−１抗原が伝染始祖ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ、またはその抗原性断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記の断片がｇｐ１２０のＣＤ４結合部位の一部、ＭＰＥＲ配列、またはｇｐ１２０のＶ２もしくはＶ３領域を含むｇｐ１２０の一部を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
その方法が、前記の対象に前記の非ＨＩＶ−１抗原を含む予備刺激免疫処置、続いて前記のＨＩＶ−１抗原を含む１回以上の追加免疫を施すことにより達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記の非ＨＩＶ−１抗原が脂質、嫌気性または好気性腸細菌叢の細菌の構成要素、フィコビリタンパク質、またはＫＹＮＵもしくはその断片を含み、前記のＨＩＶ−１抗原がマラウイからの伝染始祖Ｅｎｖ １０８６．Ｃ、マラウイからの０８９．Ｃ、米国からの０４０＿Ｃ９およびクレードＢ急性ＨＩＶ−１に感染した米国の患者からの６３５２１からなるグループから選択されるＨＩＶ−１ Ｅｎｖ抗原を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記の非ＨＩＶ抗原または前記のＨＩＶ抗原がタンパク質を含み、前記のタンパク質をコードするＤＮＡ配列が、前記のＤＮＡ配列が発現し、それにより前記のタンパク質が生成されるような条件の下で前記の対象に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
Ａ２４４ｇＤ＋エンベロープが予備刺激として投与され、ＣＨＯ１、ＣＨＯ２、ＣＨＯ３、ＣＨＯ４またはＣＨＯ５により結合されるエンベロープが追加免疫として投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記の非ＨＩＶ−１抗原が前記のＨＩＶ−１抗原および少なくとも１種類のアジュバントと共にリポソーム中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記の非ＨＩＶ−１抗原が前記のＨＩＶ−１抗原にコンジュゲートしており、１種類以上のアジュバントと配合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
ＣＨＯ１、ＣＨＯ２、ＣＨＯ３、ＣＨＯ４、およびＣＨＯ５、またはその抗原結合断片からなるグループから選択される抗体。
【請求項１】
対象においてＨＩＶ−１に対する広く中和する抗体の産生を誘導する方法であって、以下の：
ｉ）前記の対象に生殖細胞系列Ｂ細胞受容体に結合する非ＨＩＶ−１抗原を投与し、前記の非ＨＩＶ−１抗原はＨＩＶ−１ Ｅｎｖと交差反応する抗体を分泌するＢ細胞の中間クローンが生成されるような量で、およびそのような条件の下で投与され、そして
ｉｉ）前記の対象にＨＩＶ−１抗原を、前記の広く中和する抗ＨＩＶ−１抗体を分泌するナイーブＢ細胞または前記のＢ細胞の中間クローンが生成されるような量で、およびそのような条件の下で投与する
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
前記の対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の非ＨＩＶ−１抗原が脂質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記の脂質がカルジオリピン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、またはそれらの誘導体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記の脂質が１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＰＯＰＳ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、またはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記の脂質がリン脂質の六方ＩＩ相である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記の非ＨＩＶ−１抗原がフィコエリトリン（ＰＥ）、Ｃ−フィコシアニン（Ｃ−ＰＣ）、アポフェリチン、または嫌気性もしくは好気性腸細菌叢もしくはその構成要素である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記の非ＨＩＶ−１抗原が細菌または真核生物のＲＮＡポリメラーゼコアタンパク質のαサブユニットを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記の非ＨＩＶ−１抗原がキヌレニナーゼ（ＫＹＮＵ）またはその抗原性断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記のＫＹＮＵがＣＨＯまたは２９３Ｔ細胞で発現させた組換えＫＹＮＵ、またはその抗原性断片である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
さらにアジュバントを投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記のアジュバントがスクアレンに基づくアジュバント、ＴＲＬ作動薬、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｔｉｄｅｓ）（ｏＣｐＧ）またはＲ８４８である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記のＨＩＶ−１抗原が膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）抗原、またはその変種である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記のＨＩＶ−１抗原が図１６Ｂ、１６Ｃ、１７、１８、２０、２５または２６において示した免疫原である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記の変種がＬ６６９Ｓ変異を有するＭＰＥＲエピトープペプチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記のＨＩＶ−１抗原が伝染始祖ＨＩＶ−１ Ｅｎｖ、またはその抗原性断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記の断片がｇｐ１２０のＣＤ４結合部位の一部、ＭＰＥＲ配列、またはｇｐ１２０のＶ２もしくはＶ３領域を含むｇｐ１２０の一部を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
その方法が、前記の対象に前記の非ＨＩＶ−１抗原を含む予備刺激免疫処置、続いて前記のＨＩＶ−１抗原を含む１回以上の追加免疫を施すことにより達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記の非ＨＩＶ−１抗原が脂質、嫌気性または好気性腸細菌叢の細菌の構成要素、フィコビリタンパク質、またはＫＹＮＵもしくはその断片を含み、前記のＨＩＶ−１抗原がマラウイからの伝染始祖Ｅｎｖ １０８６．Ｃ、マラウイからの０８９．Ｃ、米国からの０４０＿Ｃ９およびクレードＢ急性ＨＩＶ−１に感染した米国の患者からの６３５２１からなるグループから選択されるＨＩＶ−１ Ｅｎｖ抗原を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記の非ＨＩＶ抗原または前記のＨＩＶ抗原がタンパク質を含み、前記のタンパク質をコードするＤＮＡ配列が、前記のＤＮＡ配列が発現し、それにより前記のタンパク質が生成されるような条件の下で前記の対象に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
Ａ２４４ｇＤ＋エンベロープが予備刺激として投与され、ＣＨＯ１、ＣＨＯ２、ＣＨＯ３、ＣＨＯ４またはＣＨＯ５により結合されるエンベロープが追加免疫として投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記の非ＨＩＶ−１抗原が前記のＨＩＶ−１抗原および少なくとも１種類のアジュバントと共にリポソーム中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記の非ＨＩＶ−１抗原が前記のＨＩＶ−１抗原にコンジュゲートしており、１種類以上のアジュバントと配合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
ＣＨＯ１、ＣＨＯ２、ＣＨＯ３、ＣＨＯ４、およびＣＨＯ５、またはその抗原結合断片からなるグループから選択される抗体。
【図２９−２１】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２２】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２３】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２４】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２５】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２６】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２７】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２８】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２９】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−３０】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図３０】図３０．広く中和する抗体である２Ｆ５および４Ｅ１０は、系統発生的に保存されている自己抗原と反応する。
【図３１】図３１．２Ｆ５はウェスタンブロットにおいて４３ｋＤａ、５０ｋＤａ、７０ｋＤａおよび３５０ｋＤａの３Ｔ３（マウス）細胞タンパク質に特異的に結合する。
【図３２】図３２．２Ｆ５名目（ｎｏｍｉｎａｌ）エピトープを有する保存された自己抗原。
【図３３】図３３．キヌレニナーゼ（ｋｙｎｕｅｒｅｎｉｎａｓｅ）（ＫＹＮＵ）のＨ３ドメインは高度に保存されている。
【図３４】図３４．ヒトＫＹＮＵ（ＰＤＢ ２ＨＺＰ）の構造およびＥＬＤＫＷＡモチーフの位置。
【図３５】図３５．ヒトＫＹＮＵ中のＤＫＷ残基（ＥＬＤＫＷＡ）の図説。
【図３６】図３６．２Ｆ５抗体のヒトＫＹＮＵへの結合は、そのＨ３ドメインの歪みを必要とする可能性がある。
【図３７】図３７．ＫＹＮＵ二量体はおそらく潜在的２Ｆ５結合部位を覆い隠す。
【図３８】図３８．２Ｆ５およびおそらく４Ｅ１０抗体は、ウェスタンブロットにおいて組換えヒトＫＹＮＵに結合する。
【図３９】図３９．ＫＹＮＵは２Ｆ５ファミリー抗体により認識される。
【図４０】図４０．２Ｆ５抗体は標準的なＥＬＩＳＡにおいてｒｈＫＹＮＵと強く（ａｖｉｄｌｙ）反応する。
【図４１】図４１．２Ｆ５抗体は２Ｆ５エピトープを含有するペプチド（ＤＰ１７８−Ｑ１６Ｌ）と反応する−抗ＫＹＮＵ抗体は反応しない。
【図４２】図４２．ｒｈＫＹＮＵおよびＤＰ１７８−Ｑ１６Ｌに対する２Ｆ５の結合は標準的なＥＬＩＳＡにおいて比較可能である。
【図４３】図４３．ＥＬＩＳＡプレートにおける抗体結合は抗原特異的である。
【図４４】図４４．１３Ｈ１１はｒｈＫＹＮＵに結合しない。
【図４５】図４５．１３Ｈ１１はＤＰ１７８−Ｑ１６Ｌと反応するがＭＰＥＲ−６５６とは反応しない。
【図４６】図４６．ＪＲＦＬ、ＤＰ１７８−Ｑ１６ＬおよびＲ４Ａによる、２Ｆ５のｒｈＫＹＮＵへの結合の競合阻害。
【図４７】図４７．２Ｆ５のｒｈＫＹＮＵおよびＪＲＦＬへの結合の競合阻害。
【図４８】図４８．可溶性ＫＹＮＵは２Ｆ５により結合される。
【図４９】図４９．表面に捕捉されたｍａｂへのｒｈＫＹＮＵの結合。
【図５０−１】図５０Ａ〜５０Ｃ．２Ｆ５ ｍＡｂおよび２Ｆ５ ＲＵＡ（復帰未変異祖先（ｒｅｖｅｒｔｅｄ ｕｎｍｕｔａｔｅｄ ａｎｃｅｓｔｏｒ））抗体のＫＹＮＵへの結合、（図５０Ａ）２Ｆ５、（図５０Ｂ）２Ｆ５−ＧＬ１、（図５０Ｃ）２Ｆ５−ＧＬ３。
【図５０−２】図５０Ａ〜５０Ｃ．２Ｆ５ ｍＡｂおよび２Ｆ５ ＲＵＡ（復帰未変異祖先（ｒｅｖｅｒｔｅｄ ｕｎｍｕｔａｔｅｄ ａｎｃｅｓｔｏｒ））抗体のＫＹＮＵへの結合、（図５０Ａ）２Ｆ５、（図５０Ｂ）２Ｆ５−ＧＬ１、（図５０Ｃ）２Ｆ５−ＧＬ３。
【図５１】図５１．組換えＨＩＶ−１ ｇｐ１４０（ＪＲＦＬ）、ならびにＤＰ１７８およびＲ４Ａペプチドによる、２Ｆ５の３Ｔ３細胞への結合の阻害。
【図５２−１】図５２Ａ〜５２Ｄ．ｍＡｂ ＨＶ００２７６と反応する腸細菌溶解物におけるタンパク質のバンドの濃縮（Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）および同定。（図５２Ａ）Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥゲル泳動後のウェスタンブロット分析。（図５２Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の後に集められた約５００ｋＤａの分子量を有する細菌溶解物からのタンパク質画分。（図５２Ｃ）ＳＥＣ画分は、クーマシーブルー（１）および銀染色（２）およびウェスタンブロッティング（３、矢印）により５２０ｋＤａのタンパク質の濃縮を示す。（図５２Ｄ）ｚｏｏｍ等電点分画法。
【図５２−２】図５２Ａ〜５２Ｄ．ｍＡｂ ＨＶ００２７６と反応する腸細菌溶解物におけるタンパク質のバンドの濃縮（Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）および同定。（図５２Ａ）Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥゲル泳動後のウェスタンブロット分析。（図５２Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の後に集められた約５００ｋＤａの分子量を有する細菌溶解物からのタンパク質画分。（図５２Ｃ）ＳＥＣ画分は、クーマシーブルー（１）および銀染色（２）およびウェスタンブロッティング（３、矢印）により５２０ｋＤａのタンパク質の濃縮を示す。（図５２Ｄ）ｚｏｏｍ等電点分画法。
【図５３Ａ】図５３Ａ〜５３Ｃ．ＲＮＡポリメラーゼの液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）による同定。（図５３Ａ）ＲＮＡポリメラーゼβサブユニットのＬＣ−ＭＳ同定。（図５３Ｂ）ＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニットのＬＣ−ＭＳ同定。（図５３Ｃ）ＲＮＡポリメラーゼαサブユニットのＬＣ−ＭＳ同定。
【図５３Ｂ】図５３Ａ〜５３Ｃ．ＲＮＡポリメラーゼの液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）による同定。（図５３Ａ）ＲＮＡポリメラーゼβサブユニットのＬＣ−ＭＳ同定。（図５３Ｂ）ＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニットのＬＣ−ＭＳ同定。（図５３Ｃ）ＲＮＡポリメラーゼαサブユニットのＬＣ−ＭＳ同定。
【図５３Ｃ】図５３Ａ〜５３Ｃ．ＲＮＡポリメラーゼの液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）による同定。（図５３Ａ）ＲＮＡポリメラーゼβサブユニットのＬＣ−ＭＳ同定。（図５３Ｂ）ＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニットのＬＣ−ＭＳ同定。（図５３Ｃ）ＲＮＡポリメラーゼαサブユニットのＬＣ−ＭＳ同定。
【図５４】図５４．Ｍａｂ ＨＶ００２７６はＲＮＡポリメラーゼのコアタンパク質に結合する。
【図５５】図５５．Ｍａｂ ＨＶ００２７６はＲＮＡポリメラーゼのコアタンパク質のαサブユニットに結合する。
【図５６】図５６．一次記憶Ｂ細胞培養物の中和スクリーニング。ＣＨＡＶＩ０８、慢性的にＨＩＶ−１に感染した志願者７０７−０１−０２１−９の末梢血からの記憶Ｂ細胞をＥＢＶで形質転換し、ＣＤ４０リガンド、ｏＣｐＧおよびＣＨＫ−２阻害剤の存在下で８細胞／ウェルの密度で１４日間刺激した。刺激の終了時に、上清をレポーターである２層（ｔｉｅｒ）クレードＣ ＣＡＰ４５ウイルスに対する中和活性に関して試験した。黒い点は３，６００培養物のそれぞれの中和の百分率を表す。モノクローナル抗体ＣＨ０１〜ＣＨ０５は白い点の記号で表した培養物から分離された。陽性対照（ＨＩＶ Ｉｇ）を右端の白い点として示す。
【図５７Ａ】図５７Ａ〜５７Ｃ．モノクローナル抗体ＣＨ０１〜ＣＨ０５のＶ重およびＶ軽鎖の配列比較。ＣＨ０１〜ＣＨ０５のＶ重鎖（図５７Ａ）、ＣＨ０１〜ＣＨ０４（図５７Ｂ）およびＣＨ０５（図５７Ｃ）のＶ軽鎖の配列の配列比較。推定上の復帰未変異祖先の配列を、Ｖ重鎖およびＣＨ０１〜ＣＨ０４Ｖ軽鎖両方の配列比較のための鋳型として用いた。ＣＨ０５は関連のないＶκ１〜６鎖を有するため、それは別に示した。
【図５７Ｂ】図５７Ａ〜５７Ｃ．モノクローナル抗体ＣＨ０１〜ＣＨ０５のＶ重およびＶ軽鎖の配列比較。ＣＨ０１〜ＣＨ０５のＶ重鎖（図５７Ａ）、ＣＨ０１〜ＣＨ０４（図５７Ｂ）およびＣＨ０５（図５７Ｃ）のＶ軽鎖の配列の配列比較。推定上の復帰未変異祖先の配列を、Ｖ重鎖およびＣＨ０１〜ＣＨ０４Ｖ軽鎖両方の配列比較のための鋳型として用いた。ＣＨ０５は関連のないＶκ１〜６鎖を有するため、それは別に示した。
【図５７Ｃ】図５７Ａ〜５７Ｃ．モノクローナル抗体ＣＨ０１〜ＣＨ０５のＶ重およびＶ軽鎖の配列比較。ＣＨ０１〜ＣＨ０５のＶ重鎖（図５７Ａ）、ＣＨ０１〜ＣＨ０４（図５７Ｂ）およびＣＨ０５（図５７Ｃ）のＶ軽鎖の配列の配列比較。推定上の復帰未変異祖先の配列を、Ｖ重鎖およびＣＨ０１〜ＣＨ０４Ｖ軽鎖両方の配列比較のための鋳型として用いた。ＣＨ０５は関連のないＶκ１〜６鎖を有するため、それは別に示した。
【図５８】図５８．ＣＨ０１〜ＣＨ０５モノクローナル抗体のＶ重鎖の系統樹。
【図５９−１】図５９．推定される推定上の復帰未変異祖先抗体の配列比較。Ｖ重鎖を適用することにより推定される、全ての推定上の復帰未変異祖先抗体の配列比較は、“〜〜〜”によりＶ軽鎖から隔てられている。
【図５９−２】図５９．推定される推定上の復帰未変異祖先抗体の配列比較。Ｖ重鎖を適用することにより推定される、全ての推定上の復帰未変異祖先抗体の配列比較は、“〜〜〜”によりＶ軽鎖から隔てられている。
【図５９−３】図５９．推定される推定上の復帰未変異祖先抗体の配列比較。Ｖ重鎖を適用することにより推定される、全ての推定上の復帰未変異祖先抗体の配列比較は、“〜〜〜”によりＶ軽鎖から隔てられている。
【図６０】図６０．ＣＨ０１、ＣＨ０２、ＣＨ０３の４次の広く中和する抗体のＡ２４４ ｇｐ１２０への結合。
【図６１】図６１．ＣＨ０１、ＣＨ０２、ＣＨ０３の４次の広く中和する抗体の復帰未変異祖先のＡ２４４ ｇｐ１２０への結合。
【図６２】図６２．ＰＧ９およびＰＧ１６はＡ２４４ ｇｐ１２０および６４２０ Ｔ／Ｆ ｇｐ１４０の両方に結合する。
【図６３】図６３．Ａ２４４ｇＤ＋ ｇｐ１２０エンベロープと比較してＡ２４４ｇＤ− ｇｐ１２０エンベロープへの結合親和性が減少したＣＨ０１モノクローナル抗体。
【図６４】図６４．４８パーセントの抗ｇＤ ＩｇＡワクチン応答（９９人の対象）。
【図６５】図６５．８１パーセントの抗ｇＤ ＩｇＧワクチン応答（９９人の対象）。
【図６６】図６６．ｇＤの免疫原性の強い関連性。
【図６７】図６７．ＨＥＰ−２の結合。
【図６８】図６８．キフネンシン（ｋｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅ）処置の、ＣＨ０１の中和を仲介する能力への作用。
【図６９−１】図６９．ＣＨ０１（ここでは１−２７−Ｇ２と呼ぶ）の配列のＰＧ１６ Ｆａｂとの重ね合わせ（Ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）。
【図６９−２】図６９．ＣＨ０１（ここでは１−２７−Ｇ２と呼ぶ）の配列のＰＧ１６ Ｆａｂとの重ね合わせ（Ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、対象（例えばヒトの対象）においてＨＩＶ−１に対する広く中和する抗体の産生を誘導する方法に関する。その方法は、対象に生殖細胞系列Ｂ細胞受容体に結合する非ＨＩＶ−１抗原を投与することを含み、その非ＨＩＶ−１抗原は、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖと交差反応する抗体を分泌するＢ細胞の中間クローンが生成されるような量で、およびそのような条件の下で投与される。その方法はさらに、その対象にＨＩＶ−１抗原を、広く中和する抗ＨＩＶ−１抗体を分泌するナイーブＢ細胞またはそれらのＢ細胞中間クローンが生成されるような量で、およびそのような条件の下で投与することを含む。ｇｐ１２０上のいくつかのエピトープに関して、それらのエピトープに結合することができる稀なナイーブＢ細胞が存在するであろう一方で、他のエピトープに関して、広く中和する抗体を生じることができるナイーブＢ細胞はＥｎｖに結合せず、追加の非Ｅｎｖエピトープにより刺激される必要があるであろうと考えられる。広く中和する抗体の誘導に対する障害を図１５において記述し、それらの障害を克服するための本戦略を図１６Ａにおいて記述する。
【００１４】
本発明における使用に適した非ＨＩＶ−１抗原には、宿主および／または外来抗原が含まれる。非ＨＩＶ−１抗原には、例えば脂質、例えばカルジオリピン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、およびそれらの誘導体、例えば１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＰＯＰＳ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、またはそれらの断片が含まれる。リン脂質の六方ＩＩ相（ｈｅａｇｏｎａｌ ＩＩ ｐｈａｓｅ）の使用は好都合である可能性があり、（例えば生理的条件下での）六方ＩＩ管状相の六方晶的に充填された円柱を容易に形成するリン脂質が好ましく、六方ＩＩ相で安定化され得るリン脂質も同様である。（Rauch et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:41 12-41 14 (1990); Aguilar et al et al, J. Biol. Chem. 274: 25193-25196 (1999)を参照）。他の適切な非ＨＩＶ−１抗原には、例えば、フィコエリトリン（ＰＥ）、Ｃ−フィコシアニン（Ｃ−ＰＣ）、または他のフィコビリタンパク質、アポフェリチン、および嫌気性または好気性腸細菌叢またはその構成要素（単数または複数）（例えば５２０Ｋｄ抗原（またはＲＮＡポリメラーゼホロ酵素またはＲＮＡポリメラーゼコアタンパク質、またはそのサブユニット、例えばＲＮＡポリメラーゼコアタンパク質のαサブユニットもしくはそれにｍＡｂ ＨＶ００２７６が結合するエピトープを含むその一部）、または６０Ｋｄもしくは５０Ｋｄ抗原）が含まれる。実施例２で示すデータは、ｍＡｂ ＨＶ００２７６が大腸菌ＲＮＡポリメラーゼコアタンパク質のαサブユニットに結合することを示している。大腸菌ＲＮＡポリメラーゼコアタンパク質のαサブユニットと他の細菌（例えば枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、志賀赤痢菌（Ｓ． ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅａ）、サルモネラ菌（Ｓ． ｅｎｔｅｒｉｃａ）、結核菌（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）およびインフルエンザ菌（Ｈ． ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）および真核生物からのαの相同体（例えば出芽酵母のＲｐｂ３およびＲｐｂ１１と関連するヒトおよびマウスのタンパク質）の間で配列の相同性が高い(Zhang and Darst, Science 281 :262-266 (1998))。従って、本発明には、大腸菌に加えて真核生物からの、および細菌からの５２０Ｋｄ抗原（またはそのサブユニット、例えばＲＮＡポリメラーゼコアタンパク質のαサブユニットまたはｍＡｂ ＨＶ００２７６が結合するエピトープを含むそれの一部）の使用が含まれる。（例えば、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼαサブユニット：ＮＰ＿２８９８５６（ｇｉ／１５８０３８２２）；志賀赤痢菌：ＹＰ＿４０４９４０（ｇｉ：８２７７８５９１）；インフルエンザ菌：ＮＰ＿４３８９６２（ｇｉ：１６２７２７４４）；Ｒｐｂ３：スイスプロット：Ｐ３７３８２．２；Ｒｐｂ３（ヒト）：ＮＰ＿１１６５５８．１（ｇｉ：１４７０２１７１）参照。）
キヌレニナーゼ（ＫＹＮＵ）は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼスーパーファミリーとして知られているピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）依存性酵素のファミリーのメンバーである。真核生物の構成的キヌレニナーゼ類は３−ヒドロキシ−ｌ−キヌレニンの加水分解的切断を優先的に触媒して３−ヒドロキシアントラニル酸およびｌ−アラニンを生成する。ヒトのＫＹＮＵのクローニング、発現、精製、特性付けおよび結晶化が報告されている(Lima et al, Biochemistry 46(10):2735-2744 (2007)。下記の実施例３で記述するように、ＫＹＮＵはその保存されたＨ３ドメイン中にコア２Ｆ５エピトープを有する。
【００１５】
実施例３で提供するデータに基づいて、この内在性のリガンドはＢおよびＴリンパ球の寛容化を招き、それによりＨＩＶ−１ ｇｐ４１ ＭＰＥＲエピトープペプチドを投与されたヒトにおいてＨＩＶ−１に対する有効な免疫応答の生成を阻害することが予想される。本発明は、１態様において、この寛容を特異的に、すなわち他の無関係な自己抗原に対する寛容化に影響を及ぼすことなく壊す交差反応性抗原を投与することを含む、ＨＩＶ−１に対する免疫形成を達成する方法を提供する。適切な抗原には、例えば、ＣＨＯまたは２９３Ｔ細胞において発現させたＥＬＤＫＷＡ配列またはＥＬＥＫＷＡ配列（ＥＬＥＫＷＡはヒトのタンパク質には存在せず、従って寛容化されないと予想される）を有する変異ｇｐ４１もしくはＫＹＮＵ配列を有する組換えＫＹＮＵ分子が含まれる。用いることができる他の免疫原には、ＥＬＥＫＷＡまたはＥＬＤＫＷＡ配列のどちらかを有するリポソーム中の伝染／始祖または野生型慢性エンベロープｇｐ１４０もしくはｇｐ１６０またはＭＰＥＲペプチドが含まれる。ＥＬＤＫＷＡ配列を有する免疫原は、強いアジュバント、例えばスクアレンに基づくモノホスホリル（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ）リピドＡ、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｔｉｄｅｓ）（ｏＣｐＧ）およびＲ８４８（ＴＲＬ−７／８作動薬）と共に投与するのが好都合である。これらのＴＬＲ作動薬およびＩＦＮαを含むリポソームも用いることができる。（下記の注釈も参照。）
本発明における使用に適したＨＩＶ−１抗原には、膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）抗原(Armbruster et al, J. Antimicrob. Chemother. 54:915-920 (2004), Stiegler and Katinger, J. Antimicrob. Chemother. 512:757-759 (2003), Zwick et al, Journal of Virology 79:1252-1261 (2005), Purtscher et al, AIDS 10:587 (1996))ならびにその変種、例えばＭＰＥＲ Ｍａｂ ２Ｆ５および４Ｅ１０に対する、または他の広く中和するＥｎｖに対するより高い中和感受性を与える変種、例えばＭＰＥＲ中にＬ６６９Ｓ変異を含有するＭＰＥＲ変異体Ｅｎｖペプチド脂質複合体が含まれる(Shen et al, J. Virology 83:3617-25 (2009))。好ましい免疫原には、図２５および２６、ならびに図１６Ｂ、１６Ｃ、図１７、図１８および図２０において示した免疫原が含まれる。別の好ましい態様において、その変種はＭＰＥＲ ｍＡｂ ２Ｆ５および４Ｅ１０に対するより高い中和感受性を与えるＬ６６９Ｓ変異を有するＭＰＥＲエピトープペプチドである(Shen et al, J. Virology 83: 3617-25 (2009))。
【００１６】
本発明における使用に適したＨＩＶ−１抗原には、伝染始祖ＨＩＶ−１ Ｅｎｖまたはその断片も含まれる。これらの断片は、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位の一部(Chen et al, Science 362(5956):1123-7 (2009))、ＭＰＥＲ配列、ｇｐ１２０のＶ２、Ｖ３領域を組み込むｇｐ１２０の一部(Walker et al, Science 326(5950):285-9 (2009) Epub ２００９年９月３日)等に相当するものであることができる（例えば、図２７および２８において示す１０８６、０８９、６２４０、０４０＿Ｃ９および６３５２１に関する配列を参照）。好ましいＥｎｖ抗原には、マラウイ１０８６クレードＣ、６３２１および以前に記述された(Liao et al, Virology 30:268-282 (2006))ように生成された米国クレードＢ ０４０＿Ｃ９ ｇｐｌ４０オリゴマー（図１７および１８）(Keele et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:7552-7 (2008))が含まれ、それはクレードＢ ＪＲＦＬ ｇｐ１４０ ＥｎｖまたはＭＰＥＲ中和エピトープを選択的に示すその断片（図２８参照）と混合されてモルモットにおいて中和抗体におけるかなりの広さを誘導した（図１９Ａ）。ＪＲＦＬ ｇｐ１４０ Ｅｎｖオリゴマー（図１９Ｂ、２０、２１Ａおよび２１Ｂ）は構成的に２Ｆ５ ｍＡｂに結合する。５００ＵのＰＮｇａｓｅエンドグリコシダーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，マサチューセッツ州イプスウィッチ）を用いて糖鎖除去されたＪＲＦＬオリゴマーは、２Ｆ５の増進された結合および４Ｅ１０ ｍＡｂの新規の結合（ｇｐ４１上の４Ｅ１０エピトープの露出）を有する（図２１Ａおよび２１Ｂ）。４Ｅ１０の糖鎖除去されたＪＲＦＬへの増進された結合は、図２２の表面プラズモン共鳴（ｒｅａｓｏｎａｎｃｅ）分析においても示されている。
【００１７】
本発明の方法は、対象に非ＨＩＶ−１免疫原を含む予備刺激（ｐｒｉｍｅ）免疫処置、続いてＨＩＶ−１ Ｅｎｖ抗原の１回以上の追加免疫を施すことにより達成することができる。上記で指摘したように、適切な非ＨＩＶ−１免疫原には脂質（例えばカルジオリピン、ホスファチジルセリン、または他の陰イオン性脂質）、嫌気性または好気性腸細菌叢の細菌の構成要素、フィコビリタンパク質（例えばＰＥ）およびＫＹＮＵまたはその断片が含まれる。やはり上記で指摘したように、適切なＨＩＶ−１ Ｅｎｖ抗原にはマラウイからの伝染始祖Ｅｎｖ １０８６．Ｃ、マラウイからの０８９．Ｃ、米国からの０４０＿Ｃ９およびクレードＢ急性ＨＩＶ−１に感染した米国の患者からの６３５２１が含まれる。本方法における使用に適した予備刺激および追加免疫の両方が非ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−１免疫原の両方を含むことができる。当業者は予備刺激／追加免疫計画（ｒｅｇｉｍｅｓ）を容易に最適化することができる。そのような投与計画のタンパク質性構成要素をコードするＤＮＡ配列を、そのタンパク質性構成要素がインビボで生成されるような条件下で投与することができる。
【００１８】
下記の実施例５で記述するように、広く中和する抗体（ＣＨ０１〜０５）を産生するクローン的に関連するＢ細胞を、１人の患者から分離した。そのクローン的に関連する抗体の可能性のある復帰未変異祖先を推定し、実際の抗体として発現させた。これらの抗体の系統樹を再現した。自然抗体および推定される祖先抗体の両方を、一群の（ａ ｐａｎｅｌ ｏｆ）ＨＩＶエピトープタンパク質に結合する、および一群のＨＩＶ分離株を中和するそれらの能力に関して特性付けした。その復帰未変異祖先（ＲＵＡ）がＡ２４４ｇＤ＋エンベロープに結合することを特筆するのは重要である。従って、そのようなエンベロープまたはそのＲＵＡにより中和されることが記述されている他のエンベロープを、本発明の好ましいワクチン戦略における“予備刺激”として用いることができる。この戦略に従って、“追加免疫”を例えば本明細書で記述する成熟抗体により結合されるエンベロープを用いて達成することができる。さらなる“追加免疫”を、例えば６４２０または６３５２１（または結合する他のタンパク質、ペプチドまたはポリペプチド）を用いて達成することができる。
【００１９】
ＤＮＡでの予備刺激または追加免疫を用いる場合、適切な配合物には、ＤＮＡでの予備刺激および組換えアデノウイルスでの追加免疫ならびにＤＮＡでの予備刺激および組換えマイコバクテリアでの追加免疫が含まれ、ここでそのＤＮＡまたはそのベクターは、例えばＨＩＶ−１エンベロープまたはタンパク質性非ＨＩＶ−１抗原、例えば腸細菌叢もしくはＫＹＮＵ構成要素をコードしている。これらのベクターの他の組み合わせを、ＨＩＶ−１抗原および／または非ＨＩＶ−１抗原有りまたは無しのどちらにおいても、予備刺激または追加免疫として用いることができる。
【００２０】
本発明に従って、その非ＨＩＶ−１抗原はＨＩＶ−１ Ｅｎｖ抗原および１種類以上のアジュバントを含むリポソーム中に存在することができる。あるいは、その非ＨＩＶ−１抗原は、例えばヘテロ二官能性（ｈｅｔｅｒｏ−ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）薬剤、例えばＤＳＳＰを用いてＨＩＶ−１ Ｅｎｖ抗原にコンジュゲートさせて１種類以上のアジュバントと配合することができる。
【００２１】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）作動薬有りまたは無しでＭＰＥＲ抗原を発現する（ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ）リポソーム(Dennison, et al, J. Virology 83:10211-23 (2009))が記述されている（例えばＷＯ ２００８／１２７６５１を参照）。Ｇｐ４１中間体状態タンパク質（図２３）は、(Frey et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105-3739-44 (2008))により記述されている。そのｇｐ４１中間体は、リポソームと配合して（図２４Ａおよび２４Ｂ）２Ｆ５および４Ｅ１０に十分に結合する安定な免疫原を形成することができる（図２５）。本発明のＧｐ４１ ＭＰＥＲ免疫原は、例えばモノホスホリルリピドＡ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ Ａ）（ＭＰＬ−Ａ）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，アラバマ州アラバスター）およびＴＬＲ９作動薬、例えばｏＣｐＧ １０１０３（５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＣＧＴＴＴＴ−３’）およびＲ８４８ ＴＬＲ７作動薬（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ニューヨーク州ファーミングデール）を組み込むことにより抗原性を増強することができる（図２６）。加えて、Ｂ細胞クラススイッチのサイトカイン刺激物質、例えばＢＡＦＦ（ＢＬＹＳ）および／またはＡＰＲＩＬ(He et al, Immunity 26:812-26 (2007); Cerutti and Rescigno, Immunity 28: 740-50 (2008))を、最適なＢ細胞の刺激のためにそのリポソーム中に組み込むことができる。
【００２２】
本発明における使用に適したリポソームには、ＰＯＰＣ、ＰＯＰＥ、ＤＭＰＡ（またはスフィンゴミエリン（ＳＭ））、リゾホスホリルコリン（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ホスファチジルセリン、およびコレステロール（Ｃｈ）を含むリポソームが含まれるが、それらに限定されない。最適な比率は当業者が決定することができるが、例には４５：２５：２０：１０の比率でのＰＯＰＣ：ＰＯＰＥ（またはＰＯＰＳ）：ＳＭ：ＣｈまたはＰＯＰＣ：ＰＯＰＥ（またはＰＯＰＳ）：ＤＭＰＡ：Ｃｈが含まれる。用いることができるリポソームの代替配合物には、９：７．５：１のモル比で配合されたＤＭＰＣ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）（またはリゾホスホリルコリン）、コレステロール（Ｃｈ）およびＤＭＰＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）が含まれる(Wassef et al, ImmunoMethods 4:217-222 (1994); Alving et al, G. Gregoriadis (ed.), Liposome technology 第２版, vol. Ill CRC Press, Inc., フロリダ州ボカラトン(1993); Richards et al, Infect. Immun. 66(6):285902865 (1998))。上記の脂質組成物は、リピドＡと複合体化してリン脂質に対する抗体応答を誘導するための免疫原として用いることができる(Schuster et al, J. Immunol. 122:900-905 (1979))。好ましい配合物は、Schuster et al, J. Immunol. 122:900-905 (1979)に従ってリピドＡと複合体化された６０：３０：１０の比率のＰＯＰＣ：ＰＯＰＳ：Ｃｈを含む。ペプチドの総脂質に対する最適な比率は、例えばそのペプチドおよびそのリポソームによって異なり得る。
【００２３】
本発明において、様々なアジュバントを用いることができる（上記で言及したアジュバントが含まれる）。上記のペプチド−リポソーム免疫原およびコンジュゲートは、アジュバント、例えばスクアレンに基づくアジュバント(Kaldova, Biochem. Biophys. Res. Communication, Dec. 16, 2009 印刷物に先駆けたE-pub)、および／またはＴＬＲ作動薬（例えばＴＲＬ３、ＴＲＬ５、ＴＲＬ４、ＴＲＬ９またはＴＲＬ７／８作動薬、またはそれらの組み合わせ）と共に配合する、および／または投与することができ、それは強い抗体応答を促進する(Rao et al, Immunobiol. Cell Biol. 82(5):523 (2004))。用いることができる他のアジュバントには、ミョウバンおよびＱ５２１が含まれる。油エマルジョン、例えばＥｍｕｌｓｉｇｅｎ（水中油エマルジョン）中のオリゴＣｐＧ類(Tran et al, Clin. Immunol. 109(3):278-287 (2003))も用いることができる。追加の適切なアジュバントには、２００５年１２月１４日に出願された１１／３０２，５０５において記述されているアジュバントが含まれ、それにはその中で開示されているＴＲＬ作動薬が含まれる。（Tran et al, Clin. Immunol. 109:278-287 (2003),米国出願第２００３０１８１４０６号、第２００４０００６２４２号、第２００４０００６０３２号、第２００４００９２４７２号、第２００４００６７９０５号、第２００４００５３８８０号、第２００４０１５２６４９号、第２００４０１７１０８６号、第２００４０１９８６８０号、第２００５０００５９６１９号も参照）。免疫応答を増進するＴＬＲリガンド、例えばリピドＡ、オリゴＣｐＧおよびＲ−８４８を、それらの中にコンジュゲートされたＨＩＶ−１ Ｅｎｖを有するリポソーム中に個別に、または組み合わせで配合することができる。
【００２４】
強いアジュバント（例えば強力なＴＬＲ作動薬）を装填された（ｌｏａｄｅｄ）リポソームは、多反応性中和抗体を作るように駆動されたＢ細胞の末梢での削除および／またはアネルギーを克服するために用いることができる免疫原の例である。
【００２５】
ＨＩＶ−１ ｇｐ４１ペプチドをリポソームに固定する膜貫通ドメインを用いて、機能的なエピトープの提示を達成することができる。ＨＩＶ−１ ｇｐ４１の膜貫通ドメインを用いて、そのペプチドを合成脂質を含むリポソーム中に固定することができる。ＴＭＤの三量体化の誘導は、ｇｐ４１ ＭＰＥＲの三量体型の形成を促進することができる。あるいは、Ｅｎｖ ｇｐｌ４０のＨｉｓタグ化（ｃ末端）バージョンは、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１の中間体型（ｇｐ４１−ｉｎｔｅｒ）に関して記述したようにリポソーム中に固定することができる。
【００２６】
非ＨＩＶ−１免疫原および／またはＨＩＶ−１タンパク質／ポリペプチド／ペプチド、またはコーディング配列の投与の方式は、その免疫原、患者および求められる作用、同様に、投与される用量により異なり得る。典型的には、投与経路は筋肉内、静脈内、腹腔内または皮下注射であろう。加えて、その配合物は鼻内経路により、または直腸内もしくは膣内に坐剤様のビヒクルとして投与することができる。一般に、そのリポソームは水性の液体、例えば通常の生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．０中で懸濁される。当業者は最適な投与計画を容易に決定することができる。その免疫原は予防的に使用されるのが好ましいが、感染した人へのそれらの投与はウイルス負荷を低減させる可能性がある。
【００２７】
ヒトモノクローナル抗体（ｈｕ ｍＡｂ）２Ｆ５および４Ｅ１０は、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１ ＭＰＥＲに相当するポリペプチドに高い特異性およびナノモル濃度（ｎＭ）の親和性で結合する。両方のｈｕ ｍＡｂは、免疫蛍光顕微鏡検査およびウェスタンブロッティングにより決定されるように、別個のヒトおよびマウスの細胞抗原とも反応する。これらの特性は、２Ｆ５および４Ｅ１０が、哺乳類細胞から生化学的に抽出され、標準的な免疫沈降法により回収される、変性した形およびポリペプチドが含まれる細胞タンパク質の単離に理想的であることを示している。２Ｆ５および４Ｅ１０の同じ特性は、それらを抽出された細胞タンパク質／ポリペプチドの標準的な質量分析の方法による同定に適したものにする。簡潔には、２Ｆ５または４Ｅ１０に特異的に結合する、免疫沈降された細胞タンパク質／ポリペプチドに酵素消化を施し、得られた断片の質量および電荷を用いてその親分子（単数または複数）を同定することができる。
【００２８】
本発明の特定の観点を以下の限定的でない実施例においてより詳細に記述する（Maksyutov et al, J. Clin. Virol. Dec; 31 Suppl 1:S26-38 (2004), Haynes et al, Science 308:1906 (2005), Gurgo et al, Virology 164:531-536 (1988),米国特許第７，６１１，７０４号、２００７年６月２２日に出願された米国出願第１１／８１２，９９２号、２００７年４月１３日に出願された米国出願第１１／７８５，０７７号、２００６年４月１２日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１３６８４、ＰＣＴ／ＵＳ０４／３０３９７（ＷＯ２００５／０２８６２５）、ＷＯ ２００６／１１０８３１、ＷＯ ２００８／１２７６５１、米国公開出願第２００８／００３１８９０号および第２００８／００５７０７５号、２００８年１２月２２日に出願された米国出願第１１／９１８，２１９号、２００７年２月２８日に出願された米国仮出願第６０／９６０，４１３号、ならびに全て２００９年４月３日に出願された米国仮出願第６１／１６６，６２５号、第６１／１６６，６４８号、および第６１／２０２，７７８号、２０１０年２月２５日に出願された米国仮出願第６１／２８２，５２６号、２０１０年７月２７日に出願された米国仮出願第６１／３４４，４５７号、２０１０年８月２５日に出願された米国仮出願依頼人ファイル番号０１５７９−１５９７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０１０１８、ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３００１１、ならびにＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０１０１７も参照、その全内容を本明細書に援用する）。
【実施例】
【００２９】
実施例１
実験の詳細
急性のＨＩＶ−１に感染した患者。研究のために選択された患者は、患者の履歴およびＦｉｅｂｉｇの分類(Fiebig et al, AIDS 17:1871-1879 (2003))から見積もられた伝染の日により、伝染後１７から３０日までであった。患者０６５−０およびＦＩＫＥはＦｉｅｂｉｇ第１期であり、一方で患者０６８−９、６８４−６およびＭＣＥＲはＦｉｅｂｉｇ第２期であった。
【００３０】
対照の対象。単一形質芽球／形質細胞選別を、感染していない対象および３価不活化（ＴＶＩ）インフルエンザワクチン（ＦＬＵＺＯＮＥ（登録商標）２００７または２００８）をワクチン接種した対象の骨髄、白血球除去または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に対して実施した。ＴＶＩで免疫した対象を、免疫処置の７日後に試験した(Liao et al, J. Virologic Methods 158:171-9, (2009); Wrammert et al, Nature 453 :667-71 (2008); Smith et al, Nature Protocols 4:372-84 (2009))。
【００３１】
流動選別戦略。ＰＢＭＣ、白血球除去または骨髄試料を、以前に記述されたように(Liao et al, J. Virologic Methods 158:171-9 (2009))抗Ｂ細胞抗体と反応させた。Wrammertら(Nature 453:667-71 (2008))は、ヒトＰＢＭＣ中の抗体分泌細胞である細胞は、ＣＤ１９＋、ＣＤ３８ｈｉ＋、ＩｇＤ−、ＣＤ２０ｌｏ＋／−Ｂ細胞の範囲内の細胞であることを示した。従って、急性ＨＩＶ感染（ＡＨＩ）およびインフルエンザワクチンでワクチン接種した対照の両方において、単一の抗体分泌形質芽球／形質細胞を分離するために、記述されたように(Liao et al, J. Virologic Methods 158:171-9 (2008); Wrammert et al, Nature 453:667-71 (2008))ＣＤ１９＋、ＣＤ３８ｈｉ＋、ＩｇＤ−、ＣＤ２０ｌｏ＋／−細胞をフローサイトメトリーによりＲＮＡ抽出緩衝液を含有する単一の９６ウェルプレートの中に選別した。正確な形質芽球／形質細胞集団の分離の成功の明確化のための陽性対照として、同じ集団を３価インフルエンザワクチン（ＦＬＵＺＯＮＥ（登録商標）２００７または２００８）ワクチン後の７日目から分離した。予想されたように、それらの選別された細胞の７５％が実際にインフルエンザ特異的抗体であったことが実証された(Wrammert et al, Nature 453 :667-71 (2008))。
【００３２】
伝染／始祖エンベロープの同定および発現。患者６８４−６およびＦＩＫＥの伝染／始祖Ｅｎｖを、以前に記述されたように(Keele et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:7552-7(2008))単一ゲノム増幅およびＥｎｖ遺伝子の配列決定により同定した。Ｅｎｖ ｇｐ１４０Ｃ（ｇｐ１２０／４１切断部位が変異している）、ｇｐ１２０およびｇｐ４１タンパク質を、記述されたように(Liao et al, J. Virologic Methods 158:171-9 (2008))２９３Ｔ細胞の一過性形質移入により発現させた。
【００３３】
形質芽球／形質細胞の免疫グロブリンＶＨおよびＶＬ遺伝子のＰＣＲ増幅。選別されたＢ形質芽球／形質細胞のＶＨおよびＶＬ Ｉｇ鎖を単一細胞ＰＣＲにより分離し、記述されたように(Liao et al, J. Virologic Methods 158:171-9 (2009) ; Wrammert et al, Nature 453:667-71 (2008) ; Smith et al, Nature Protocols 4:372-84 (2009))組換え抗体を産生させた。
【００３４】
Ｉｇ ＶＨおよびＶＬの配列の配列決定、配列の注釈、品質管理、およびデータの管理。Ｉｇ ＶＨおよびＶＬ遺伝子の全てのＰＣＲ産物はＱｉａｇｅｎ（カリフォルニア州ヴァレンシア）ＰＣＲ精製キットを用いて精製され、ＡＢＩ ３７００機器およびＢｉｇＤｙｅ（登録商標）配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州フォスターシティー）を用いて順方向および逆方向で配列決定された。それぞれの試料に関する塩基呼び出し（Ｂａｓｅ ｃａｌｌｉｎｇ）は、Ｐｈｒｅｄ(Ewing et al, Genome Res. 8:175-85 (1998); Ewing and Green, Genome Res. 8:186-94 (1998))を用いて行われる。その抗体遺伝子の順方向および逆方向の鎖を、それぞれの位置における品質スコア（ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅｓ）に基づく新規の組み立てアルゴリズム(Kepler et al,投稿中)を用いて１つの最終的なヌクレオチド配列へと組み立てる。見積もられるＰＣＲアーティファクト率は．２８または増幅された５個の遺伝子あたりおおよそ１個のＰＣＲアーティファクトであった。免疫グロブリンのアイソタイプを局所的整列アルゴリズム(Smith and Waterman, J. Mol. Biol. 147:195-7 (1981))により決定する。質を保証された抗体配列の生殖細胞系列再編成を、ＳｏＤＡを用いて決定する(Volpe et. al, Bioinformatics 22:438-44 (2006))。ＳｏＤＡに由来するゲノム情報、例えば遺伝子断片利用、体細胞変異およびＣＤＲ３領域を、容易なアクセスのためにＯＲＡＣＬＥデータベース中で保管する。
【００３５】
同じ対象からの抗体がクローン的に関連しているかどうかを決定するため、以下の３個の基準を利用した。第１に、問題の抗体の重鎖は同じＶＨおよびＪＨ遺伝子断片を用いなければならない。Ｄ断片における長さおよび高い変異のため、これらは同定するのがより難しい。従って、Ｄ断片の類似性は、クローンの関連性に関する基準として用いなかった。同様に、両方の軽鎖は同じＶκ／ＶλおよびＪκ／Ｊλを用いなければならない。第２に、問題の抗体の重鎖は同じＣＤＲ３の長さを有していなければならない。これは軽鎖にも適用される。第３に、その重鎖のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は７０％同一でなければならない。同じことがその軽鎖のＣＤＲ３に適用される。これらの３個の基準を守る抗体を、クローン的に関連するものとして分類する。ＰＨＹＬＩＰ ３．６３パッケージ(Felsenstein, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 360:1427-34 (2005))を用いて、推定されるＳｏＤＡからの生殖細胞系列を根として用いて最尤樹を構築してそのクローンの間の系統的関係を決定した。その祖先配列も同じパッケージを用いて推定した。
【００３６】
推定される生殖細胞系列および中間抗体の設計および生成。抗体クローンファミリーのそれぞれのメンバーに関して、生殖細胞系列抗体前駆体および多数の抗体の中間的な型を推定するために最尤分析を用いた(Felsenstein, J. Mol. Evol. 17:368-76 (1981); Volpe et al, Bioinformatics 22:438-44 (2006))。これらのＶＨおよびＶＬ遺伝子を合成し（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ，ニュージャージー州ピスカタウェイ)、上記のような組換え技法によりＩｇＧ１ ｍＡｂとして発現させた。
【００３７】
ＶＨおよびＶＬの組換えｍＡｂとしての発現。単離されたＩｇ ＶＨおよびＶＬ遺伝子対をＰＣＲにより組み立てて、記述されたような方法(Liao et al, J. Virol. Methods 158:171-9 (2009))を用いるヒト胚腎臓細胞株２９３Ｔ（ＡＴＣＣ，バージニア州マナサス）中への形質移入による組換えｍＡｂの産生のための線状の完全長Ｉｇ重および軽鎖遺伝子発現カセットにした。対になるＩｇ重および軽鎖遺伝子発現カセットの精製されたＰＣＲ産物を、６ウェル組織培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ，ニュージャージー州フランクリンレイク）で増殖させた８０〜９０％コンフルエントの２９３Ｔ細胞中に、ＰｏｌｙＦｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ，カリフォルニア州バレンシア）および製造業者により推奨されるプロトコルを用いて同時形質移入した（ウェルあたりそれぞれ２μｇ）。形質移入の６〜８時間後に、その２９３Ｔ細胞に２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補った新しい培地を与え、５％ＣＯ２培養器中で３７℃で培養した。培養上清を形質移入の３日後に回収し、発現したＩｇＧのレベルに関して定量化し、抗体の特異性に関してスクリーニングした。スクリーニングアッセイにより同定された選ばれた抗体の将来の特性付けのため、その線状Ｉｇ重および軽鎖遺伝子コンストラクトを、精製された組換えｍＡｂの産生のために、標準的な分子プロトコルを用いてｐｃＤＮＡ３．３の中にクローニングした。
【００３８】
単離されたＶＨおよびＶＬ遺伝子ならびに推定される生殖細胞系列および中間前駆体抗体配列に由来する精製された組換えｍＡｂの産生のため、Ｔ１７５フラスコ中で培養した２９３Ｔ細胞に重および軽鎖Ｉｇ遺伝子を含有するプラスミドをＰｏｌｙＦｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ，カリフォルニア州バレンシア）を用いて同時形質移入し、２％ＦＣＳを補ったＤＭＥＭ中で培養した。組換えｍＡｂをその形質移入した２９３Ｔ細胞の培養上清から、抗ヒトＩｇ重鎖特異的抗体−アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ州セントルイス）を用いて精製した。
【００３９】
ＥＬＩＳＡおよびＬｕｍｉｎｅｘアッセイによる抗体特異性に関するスクリーニング。上清中の組換えｍＡｂの濃度を、記述されたような方法(Liao et al, J. Virol. Meth. 158:171-179 (2009))を用いて決定した。発現した組換えｍＡｂの特異性を、ＨＩＶ−１抗原に対する、および一群の非ＨＩＶ−１抗原に対する抗体反応性に関してアッセイした。ＨＩＶ抗原には、Ｅｎｖペプチドｇｐ４１免疫優性領域（ＲＶＬＡＶＥＲＹＬＲＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳＷＳＮＫＳＬＮＫ）、ｇｐ４１ ＭＰＥＲ領域（ＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮ）、ＨＩＶ−１ ＭＮ ｇｐ４１（Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，マサチューセッツ州ウォバーン）、ＨＩＶ−１グループＭコンセンサスｇｐ１２０(Liao et al, Virology 353:268-82 (2006))、ＨＩＶ−１グループＭコンセンサスｇｐ１４０ ＣＦＩ(Liao et al, Virology 353:268-82 (2006))、ｐ６６（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ニュージャージー州レイクウッド）、ｐ５５（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，コネチカット州メリデン）、ｐ３１（Ｇｅｎｗａｙ，カリフォルニア州サンディエゴ）、ｎｅｆ（Ｇｅｎｗａｙ，カリフォルニア州サンディエゴ）、ｔａｔ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，メリーランド州ケンシントン）、およびＡＴ−２不活化ＨＩＶ−１ ＡＤＡビリオン(Rutebemberwa et al, AIDS Res. Human Retrovirol. 23:532-42 (2007))；ＮＩＨ，ＮＣＩ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ癌研究施設のJeffrey Lifsonから頂いたもの）が含まれていた。加えて、６８４−６ ｍＡｂを自己由来ｇｐ１４０、ｇｐ１２０およびｇｐ４１に対してアッセイし、ＦＩＫＥ ｍＡｂを自己由来ｇｐ１４０およびｇｐ１２０に対してアッセイした。非ＨＩＶ−１抗原には、３価インフルエンザワクチン２００７（ＦＬＵＺＯＮＥ ２００７）、Ｈ１Ａ／ソロモン諸島／０３／２００６からの組換えインフルエンザＨＡタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．コネチカット州メリデン）、破傷風トキソイド（ｔｏｘｉｏｄ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，カリフォルニア州サンディエゴ）、ＨＥＰ−２細胞（Ｉｎｖｅｒｎｅｓｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ニュージャージー州プリンストン）、カルジオリピン（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，所在地（アラバマ州アラバスター）(Haynes et al, Science 308:1906-8 (2005)）およびリピドＡ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，アラバマ州アラバスター）が含まれていた。腸細菌叢と呼ばれる嫌気性および好気性細菌抽出物の全細胞溶解物を、下記で記述するように調製した。簡潔には、細菌を患者からの４つの便の標本から接種し、寒天プレート上で嫌気性または好気性条件下で３０℃において増殖させた。コンフルエントの細菌を回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、商業的に入手可能な細菌タンパク質抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，イリノイ州ロックフォード）を用いて処理した。得られた抽出物を０．２２μｍフィルターを用いて濾過し、使用まで−８０℃で保管した(Kawatsu et al, J. Clin. Microbiol. 46:1226-31 (2008))。ＦＬＵＺＯＮＥ（登録商標）、インフルエンザＨＡ、ｇｐ４１免疫優性およびＭＰＥＲ領域、ならびに腸細菌叢全細胞溶解物に対するアッセイを、ＥＬＩＳＡ(Tomaras et al, J. Virology 82:12449-63 (2008))およびＬｕｍｉｎｅｘビーズアッセイ(Tomaras et al, J. Virology 82:12449-63 (2008))の両方により実施した。破傷風トキソイド、カルジオリピン（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ州セントルイス）、死菌クリプトコッカスおよびカンジダアルビカンスに対するアッセイはＨｅｐ−２上皮細胞との反応性に関するＥＬＩＳＡアッセイであり、間接的な免疫蛍光アッセイであった(Mietzner et al, Proc. Natl. Acad.. Sci. USA 105:9727-32 (2009))。
【００４０】
抗体反応性の表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅａｓｏｎａｎｃｅ）（ＳＰＲ）分析。ＳＰＲ結合アッセイを、２０℃で維持されたＢＩＡｃｏｒｅ ３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ，ニュージャージー州ピスカタウェイ）上で実施した。ＨＩＶ−１ ｇｐ４１またはオリゴマー状ｇｐ１４０タンパク質（Ｃｏｎ Ｓ ｇｐ１４０、自己由来Ｅｎｖ ｇｐ１４０）を、以前に記述されたように(Alam et al, J. Immunol. 178:4424-35 (2007))標準的なアミンカップリングによりＣＭ５センサーチップ上に固定した。ヒトｍＡｂを抗ヒトＦｃ抗体を結合させた表面上に捕捉し、次いでそれぞれのヒトｍＡｂを約２００〜５００ＲＵまで捕捉した。対照表面上の非特異的結合の減算の後、ｍＡｂ結合の特異的な結合応答が得られた（Ｅｎｖが固定された表面に関してＨＩＶ−１ ｇｐ１２０およびｍＡｂが固定された表面に関してヒトＩｇＧ、ＩＳ６）。（２価Ｉｇ分子の結合力を説明するために）２価分析物モデルおよびｍＡｂの抗体価測定から得られた結合曲線への全体的な曲線当てはめを用いて速度定数を測定した。ＭＡｂを３０μＬ／分で２〜６分間注入し、グリシン−ＨＣｌ ｐＨ２．０および界面活性剤Ｐ２０（０．０１％）を再生緩衝液として用いた。
【００４１】
結果
インフルエンザワクチン接種。インフルエンザワクチン接種された対象からの、単一細胞選別された形質細胞／形質芽球に由来する抗体のクローンを試験し、その応答が高度にクローン的であることが分かった。そのクローンメンバーはほぼ全て試験したインフルエンザ抗原と反応した。図１は、Ｈ１ソロモン諸島（Ｓｏｌｏｍａｎ Ｉｓｌａｎｄｓ）ヘマグルチニンに対する代表的なインフルエンザ抗体クローンを示す。合計４５０の抗体を３人のインフルエンザワクチン接種された対象の形質細胞／形質芽球から分離し、これらの内で５７．７％がインフルエンザ特異的であった。インフルエンザに感染した対象から分離された全部で２６５の抗体のうちで、クローン的に関連した抗体の２０種類の独立したクローンが同定され、その中で１１５の抗体（９２％）がインフルエンザ抗原と反応した。
【００４２】
急性ＨＩＶ−１感染におけるクローン性抗体応答。約７５％の形質細胞／形質芽球がインフルエンザ特異的であるインフルエンザワクチン接種とは対照的に、５人のＡＨＩ患者の形質芽球／形質細胞から分離された合計１０７４の組換え抗体の内で、８９または８．３％の発現した抗体（３．３％〜１３．３％の範囲）がＨＩＶ−１特異的であり、一方で残りの大部分は非ＨＩＶ抗原に対するものであるか（約６％）、または未知の特異性を有するか（８８２または８２．１％）のどちらかであった。一群の非ＨＩＶ−１関連抗原アッセイにより、Ｈｅｐ−２上皮細胞（２７または２．５％）、腸細菌叢（５または０．５％）、カルジオリピン（４または０．４％）、インフルエンザ（９または０．８％）、クリプトコッカス（４または０．４％）、カンジダアルビカンス（２または０．２％）、および破傷風トキソイド（８または０．７％）に対する高い親和性の抗体を実証することが可能であった。追加の３８または３．５％は、これらの抗原の少なくとも２種類と反応した。その患者の３人はリピドＡ抗体を有し、１人の患者は腸細菌叢抗体を有し、それは非常に早期の腸の損傷の開始、微生物の移行および抗リピドＡおよび腸細菌叢抗体の誘導を示唆している。注目すべきことには、これらの早期ＡＨＩ患者のいずれも、ＨＩＶ−１の伝染後１７〜３０日の内にｇｐ４１以外のＨＩＶ−１特異性が検出されたｍＡｂを全く有していなかった。
【００４３】
ｇｐ４１に対するＡＨＩ応答の検出においてコンセンサスＥｎｖが自己由来Ｅｎｖに等しいことが以前に報告された(Tomaras et al, J. Virology 82:12449-63 (2008))。しかし、ＡＨＩ Ｂ細胞分析において応答が失われていた可能性を除外するため、６８４−６およびＦＩＫＥからのｍＡｂをそれらの自己由来組換えｇｐ１４０ Ｅｎｖを用いてスクリーニングした。概して、自己由来ｇｐ１４０ ｅｎｖに対する応答はクレードＢ ｇｐ４１に対するものよりもはるかに小さかった。
【００４４】
従って、伝染／始祖ウイルスに対する初期の形質芽球／形質細胞レパートリーの応答は、血漿抗体応答(Tomaras et al, J. Virol. 82:12440-63 (2008))と同様に、Ｅｎｖ ｇｐ４１エピトープに焦点が合わせられた。加えて、ＨＩＶ−１は以前のワクチン接種または感染性因子抗原、例えばクリプトコッカス、カンジダアルビカンス、および破傷風トキソイドからの既存の記憶Ｂ細胞を最終分化へと活性化し、駆動する。さらに、ＡＨＩの過程において、Ｈｅｐ−２細胞自己反応性Ｂ細胞の多反応性クローンはその初期の形質芽球／形質細胞応答に加わるように誘導される。
【００４５】
ＡＨＩ形質芽球／形質細胞レパートリー内の抗体クローンの分析。一般に、報告されたインフルエンザワクチン接種により誘導された形質芽球／形質細胞レパートリー(Wrammert et al, Nature 453:667-72 (2009))または血漿中に広く中和する抗体活性を有する対象におけるｇｐ１４０＋Ｂ細胞の記憶Ｂ細胞レパートリー(Scheid et al, Nature 458:636-40 (2009))と比較して、ＡＨＩ形質芽球／形質細胞レパートリーからは少数のクローンしか分離されなかった。広く中和する抗体を有する６人の患者における慢性ＨＩＶ−１感染において、Scheidら(Nature 458:636-40 (2009))は、そのＢ細胞クローンの数がそれらの６人の患者から分離された５０２の抗体において患者の間で２２から５０まで異なっていたことを見出した。
【００４６】
ＡＨＩの研究において、５人のＡＨＩの患者から分離された１０７４のｍＡｂにおいて、わずか８種類の抗体のクローンしか見付からなかった。これらには、ＡＨＩ患者の１人において同定された６種類の独立した抗体のクローンの中のｇｐ４１と反応する３種類の抗体のクローンが含まれていた。興味深いことに、その３種類のＡＨＩ ｇｐ４１クローンの全部で５２のクローン性メンバーの内で、１７（３７％）のみがｇｐ４１と反応した。これは、インフルエンザ反応性インフルエンザクローンメンバーの９４％と対照的である。
【００４７】
図２は、５２のメンバーを有するＡＨＩクローン６８５−６Ｂ−注目すべきＶＨ３−７、ＤＨ１−２６、ＪＨ５、ＶＫ１−３９、ＪＫ４、ＩｇＧ３変異クローンを示し、変異していないメンバーは無い。その５７の抗体の内で、４（８％）のみがｇｐ４１と反応した。
【００４８】
ｇｐ４１の推定される生殖細胞系列および中間抗体のクローンとの反応性の分析。ＨＩＶ−１ ｇｐ４１がナイーブＢ細胞の生殖細胞系列Ｂ細胞受容体と反応しており、低い抗原駆動（ａｎｔｉｇｅｎ ｄｒｉｖｅ）を有する低親和性クローンを刺激しているのか、またはｇｐ４１が既存の記憶Ｂ細胞のクローンと交差反応してクローン性メンバーを同時のｇｐ４１および自己抗原駆動を経るように命じる可能性があるのかを推論した。これらの２つの可能性を区別するため、最尤分析を用いて生殖細胞系列未変異抗体および部分的に変異したクローン中間体がそれらのｇｐ４１との反応性を決定するために用いられたと推定した（図３）。そのクローンの発生のどこでｇｐ４１との反応性が獲得されたのかを決定するために（すなわち生殖細胞系列ＶＨ＋ＶＬまたはより後の中間体）、推定される生殖細胞系列およびクローンメンバー中間体をクレードＢ ｇｐ４１、自己由来ｇｐ１４０およびグループＭコンセンサスｇｐ１４０との反応性に関してアッセイした（図４）。クローン６８４−６Ｂの反応性は２番目の中間前駆体抗体において獲得されたことが分かった（図４および５）。
【００４９】
問われた次の疑問は、ｇｐ４１との反応性はｇｐ４１による抗原駆動を表しているのかどうかであった。図６は、さらなる推定された中間抗体クローンをｍｇの量で生成し、ｇｐ４１に対する抗体結合の解離定数（Ｋｄ）に関して分析したことを示している。図７は解離定数をＫｄのＬｏｇ１０としてプロットしたヒートマッププロットを示し、実際、中間体が実際の分離された抗体へと進行するにつれて、ｇｐ４１に対する結合に関する親和性の成熟の進行が存在することを実証している。
【００５０】
ＡＨＩの間に多反応性非ＨＩＶ−１ ｇｐ４１クローンが誘導されるとして、問われる次の疑問は、クローン６８４−６ＢメンバーがカルジオリピンおよびＨｅｐ−２上皮細胞との反応性により多反応性であるかどうかであった。Ｈｅｐ−２間接免疫蛍光アッセイにおいて、クローン６８４−６Ｂの反応性はｇｐ４１反応性と同じ推定される中間前駆体期において獲得された（図８）。生殖細胞系列未変異抗体を含む６８４−６Ｂの全てのクローンメンバーはカルジオリピンと反応し、一方でＨｅｐ−２反応性はクローンの発達の間に大きくなったり小さくなったりし、カルジオリピンとの反応性は最終クローン３０７および３５０までの中間体全体を通して比較的安定していた。生殖細胞系列および他のクローンメンバーのカルジオリピンとの多反応性は、ＨＩＶに対する初期の抗体応答はＨＩＶ−１ ｇｐ４１が既存の多反応性の自然抗体のクローンを刺激することに由来し、ｇｐ４１は最初のクローンが体細胞超変異によりｇｐ４１に対する交差反応性を獲得するとすぐにＢ細胞のクローンを多反応性ｇｐ４１クローンになるように補充する（ｒｅｃｒｕｉｔｓ）ことを強く示唆している。この発見は、ＨＩＶワクチン設計にかなりの波及を有する。
【００５１】
非ＨＩＶ−１抗原に対する生殖細胞系列反応性の性質。それぞれのクローンの生殖細胞系列抗体においてではなく推定されるクローン中間体における６８４−６Ｂクローンの反応性の獲得の驚くべき結果を考慮して、ＨＩＶにおいて活性化される抗体クローンの起源だと思われるものを同定するため、それに対してその生殖細胞系列が反応する可能性のある宿主抗原を同定するための努力がなされた。
【００５２】
腸においてＡＨＩによる早期の腸の微生物の移行が存在するため、およびＡＨＩにおける初期の抗原刺激の多くが粘膜表面において生じるため、初期の抗体応答は腸微生物性抗体応答に何らかの方法で結び付けられる、または関連する可能性があるという仮説が立てられた。これを研究するため、嫌気性および好気性腸細菌叢の全細胞溶解物に対する６８４−６Ｂクローンからのクローン性抗体ならびに推定される生殖細胞系列および推定される中間体の測定可能な反応性が存在するかどうかに関する決定がなされた。加えて、ＥＢＶによる形質転換を用いて、ＡＨＩまたは未感染の対象の腸、骨髄または血液から一群の五量体ＩｇＭ ｍＡｂを分離した。
【００５３】
最初に、一連のＩｇＭ抗体をＡＨＩから分離し、未感染の対象からｇｐ４１反応性またはｇｐ４１非反応性のどちらかである２種類のＩｇＭ抗体を分離した。問われた疑問は、ｇｐ４１と反応性であるＩｇＭが腸細菌叢とも反応性であるかどうかであった。表１は、実際にｇｐ４１と反応性であった全てのｍＡｂが腸細菌叢抗原とも反応性である一方で、ｇｐ４１と反応性でなかったｍＡｂは腸細菌叢と反応性でなかったことを示している。
【００５４】
【表１】
【００５５】
注目すべきことに、試験した全てのクローンからの生殖細胞系列および中間前駆体を好気性および嫌気性腸細菌叢の全細胞溶解物を用いてアッセイした際に、そのクローンの全てにおける抗体の全てが腸細菌叢全細胞溶解物と反応した。図９は、それぞれのｍＡｂにおいて好気性全細胞溶解物（ＷＣＬ）と反応する６８４−６Ｂクローンのヒートマップを示す。嫌気性ＷＣＬを用いて同様の結果が得られた。腸細菌叢により仲介される抗原駆動を決定するための分析を実施した際、ｇｐ４１に関してほどではないが、実際にＡＨＩクローンにおける進行的な体細胞超変異と同時に起こる抗体親和性の増大が存在することが分かった。
【００５６】
ＡＨＩ ｇｐ４１ ｍＡｂの嫌気性および好気性腸細菌叢全細胞溶解物とのウェスタンブロット。次に、図６における推定される中間体＃２（ＨＶ００２７６）の反応性を、嫌気性および好気性ＷＣＬの両方を用いて、ｂｌｕｅ ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥで（図１０ＡおよびＢ）、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥで（図１１および１２）決定した。ｂｌｕｅ ｎａｔｉｖｅゲルでの分析において、６８４−６ＢクローンのｍＡｂは好気性および嫌気性腸試料の両方において５２０，０００Ｄａの分子と反応した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。さらに、ｍＡｂ ２７６は４８０ＫＤａのＭＷマーカーとも反応し、それはフィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｔｈｒｙｎ）である（図１０Ａおよび１０Ｂ）。図１１および１２は、非還元（図１１）および還元（図１２）条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥの下で、約５２０，０００Ｄａにおいてまた強いバンドが見られることを示している。還元条件下での未変性マーカーにおいても同様に、おおよそ６０および５０Ｋｄにおいてより小さいバンドが見られる（図１２）。その未変性マーカーはまたもフィコエリトリン（ＰＥ）であり、それは６８４−６ＢクローンのｍａｂによるＰＥに対する多反応性を示している。
【００５７】
重要なことだが、体細胞変異した元の２Ｆ５および４Ｅ１０の広く中和する抗体も腸細菌叢ＷＣＬにおいてタンパク質のバンドと反応し、２Ｆ５は好気性ＷＣＬにおいて約３００，０００Ｄａの分子および約８０，０００Ｄａの分子と反応し、４Ｅ１０は好気性ＷＣＬにおいて約８０，０００および１００，０００Ｄａの分子と反応する。図１２（還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において、ＨＶ００２７６（中間体６８４−６ ａｂ ＃２）は好気性および嫌気性ＷＣＬにおいて約５２０，０００Ｄａのバンドに結合し、一方で２Ｆ５は好気性ＷＣＬにおいて約８０，０００Ｄａのバンドと反応し、４Ｅ１０はおおよそ６０，０００ｄａのバンドと反応することが分かる。
【００５８】
広く中和する抗体２Ｆ５、４Ｅ１０および１ｂ１２は多数の宿主抗原に結合する多反応性抗体であることが以前に示されている。従って、疑問は、ＨＩＶに対する初期応答が多反応性抗体応答によるものであるならば、広く中和する多反応性抗体はなぜ作られないのかである。２つの可能性が考えられている。
【００５９】
第１に、１ｂ１２、２Ｆ５および２Ｇ１２の生殖細胞系列はＨＩＶのｇｐ１２０またはｇｐ４１に結合せず、一方で体細胞超変異した抗体は結合することが示されている(Xiao et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 390:404-9 (2009))。従って、広く中和する抗体のエピトープの多くに関して、当分野が用いてきた免疫原はそれらが標的としているナイーブＢ細胞のＢ細胞受容体を標的としないことが考えられる。１ｂ１２の生殖細胞系列はここで脂質反応性に関して、および腸細菌叢全細胞溶解物活性に関して研究されており、実際にその生殖細胞系列１ｂ１２の反応性はＨＩＶ ｇｐ１２０エンベロープに対して陰性であり、一方でその体細胞変異した１ｂ１２の反応性はＨＩＶ ｇｐ１２０に対して非常に高いことが分かっている（図１３）。それに対し、１ｂ１２の生殖細胞系列の反応性はカルジオリピンに対して非常に高く、一方で体細胞変異した多反応性の最初の１ｂ１２のカルジオリピンに対する反応性は陰性ではないが非常に低い（図１３）。さらに、１ｂ１２の生殖細胞系列は腸細菌叢全細胞溶解物とも反応性であり、一方で成熟した最初の体細胞変異した１Ｂ１２ ｍＡｂはごく弱く反応性である（表２）。
【００６０】
【表２】
【００６１】
第２に、２Ｆ５、４Ｅ１０および１ｂ１２の多反応性はこれらのタイプの抗体を作るＢ細胞を削除またはアネルギーに向けるという仮説が立てられた(Haynes et al, Science 308:1906-8 (2005); Haynes et al, Human Antibodies 14:59-67 (2005); Alam et al, J. Immunol. 178:4424-35 (2007))。この仮説は最近２Ｆ５ ＶＨに関して２Ｆ５ ＦＨホモ接合性ノックインマウスにおいて証明されており(Verkoczy et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:181-6 (2010))、ここで４Ｅ１０ ＶＨホモ接合性マウスにおいて証明された（図１４）。その広く反応する体細胞変異したＶＨのノックインの両方の動物モデルにおいて、その変異したＶＨは骨髄において削除を引き起こすのに、および抹消において多数の寛容性機構を誘起するのに十分に自己反応性である。
【００６２】
要約すると、上記で記述した結果は以下のことを示している：
・ＨＩＶに対する初期の抗体応答は、非中和性Ｅｎｖ ｇｐ４１エピトープに焦点が合わせられている。
【００６３】
・初期のｇｐ４１抗体応答は、その生殖細胞系列Ａｂはｇｐ４１とは反応しないがその推定される中間Ａｂはｇｐ４１と反応する、既存の体細胞変異した多反応性の“自然”抗体クローンから生じる。
【００６４】
・ｇｐ４１抗体反応性クローンの抗体メンバーは多反応性であり、脂質および他の自己細胞性抗原と交差反応するが、抗ｇｐ４１抗体の親和性は体細胞超変異が起こるにつれて増大し、これはｇｐ４１抗原駆動を示している。
【００６５】
・しかし、初期のＨＩＶに誘導されるクローンの発達は、おそらく自己模倣（ｓｅｌｆ ｍｉｍｉｃｒｙ）のため効率的でも高親和性でもなく、それはＨＩＶ Ｅｎｖ反応性および非反応性抗体クローンメンバーの混在につながる。
【００６６】
・広く中和する抗体１ｂ１２、２Ｆ５および２Ｇ１２の生殖細胞系列はそれらの推定される生殖細胞系列抗体と反応しないようである。
・ＡＨＩまたは未感染の対象から分離されたｇｐ４１に結合するＩｇＭ抗体は腸細菌叢にも結合するが、ｇｐ４１陰性ＩｇＭは腸細菌叢抗原に結合しない。
【００６７】
・１ｂ１２の生殖細胞系列は脂質および腸細菌叢と反応し、これはおそらく元々腸細菌叢に対して標的化されていたＢ細胞クローンに由来する既存の多反応性自然抗体産生ナイーブＢ細胞に由来することを暗示している。
【００６８】
・体細胞変異した２Ｆ５、４Ｅ１０および１ｂ１２の広く中和する抗体は全て腸細菌叢全細胞溶解物中の抗原と反応し、これはこれらの抗体がおそらく元々腸細菌叢に対して標的化されていたナイーブＢ細胞のクローンに由来することを示している。
【００６９】
実施例２
ｍＡｂ ＨＶ００２７６と反応する腸細菌溶解物中のタンパク質のバンドの濃縮および同定を図５２に示す。Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥゲル泳動後のウェスタンブロット分析は、ｍＡｂ ＨＶ００２７６が嫌気性および好気性腸細菌溶解物中の約５２０ｋＤａのタンパク質のバンドに結合することを示している。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の後に、約５００ｋＤａの分子量を有する細菌溶解物からのタンパク質画分を集めた。ＳＥＣ画分は、クーマシーブルー（１）、銀染色（２）およびｍＡｂ ＨＶ００２７６によるウェスタンブロッティング（３、矢印）により５２０ｋＤａのタンパク質の濃縮を示す。ｚｏｏｍ等電点分画法は、ｍＡｂ反応性タンパク質のｐＨ６．２〜７を有するゲル区画Ａ４への移動を示す。
【００７０】
濃縮された画分からの５２０ｋＤａのバンドに対して、タンパク質の同定のためにＬＣ−ＭＳ分析を行った。ＲＮＡポリメラーゼβ、β’およびαサブユニットが同定された（図５３）。
【００７１】
大腸菌ＲＮＡポリメーラーゼコアタンパク質およびホロ酵素（コアタンパク質＋σサブユニット）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ウィスコンシン州マディソン）をＮａｔｉｖｅＰＡＧＥゲル上で泳動し、ｍＡｂ ＨＶ００２７６の反応性をウェスタンブロッティングを用いて検出した。コアおよびホロ酵素の両方に対する反応性が検出され、それはｍＡｂ ＨＶ００２７６がＲＮＡポリメーラーゼコアタンパク質に結合することを示している。
【００７２】
大腸菌ＲＮＡポリメーラーゼコアタンパク質（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ウィスコンシン州マディソン）を変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、還元（Ｒｅｄ）および非還元（ＮＲ）条件下の両方で泳動した（左のパネル）。変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、コアタンパク質の個々のサブユニット（β、β’、αおよびω）を分解し、クーマシーブルー染色の後に可視化することができる（右のパネル）。転写したゲルのウェスタンブロット分析は、２７６ｍＡｂがＲＮＡポリメーラーゼコアタンパク質の３７ｋＤａのαサブユニットにのみ結合することを示している。腸細菌溶解物タンパク質に関して陰性であったＨＶ００５０３ ｍＡｂの反応性がないことは、そのコアタンパク質サブユニットのいずれに関しても観察された。
【００７３】
実施例３
自己寛容がどのようにＨＩＶ−１に対する防御的体液性応答に影響を及ぼす可能性があるかを理解するためには、どの自己抗原がＨＩＶ−１エピトープにより模倣されるのか、およびどこで／いつこれらの自己抗原がＴおよびＢリンパ球に晒されるのかを決定することが重要である。図３０において、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１ ＭＰＥＲのエピトープに特異的なモノクローナルヒト抗体はアセトン固定されたマウス３Ｔ３細胞中に存在する自己抗原とも反応することが示されている。図３１において示されているように、少なくとも４種類の別個の分子がマウス３Ｔ３細胞からビオチン化２Ｆ５抗体により免疫沈降され得る。沈降した主要な種は、おおよそ５０〜５４ｋＤａの見た目の分子量を有する。
【００７４】
保存された哺乳類のタンパク質ＫＹＮＵはコア２Ｆ５エピトープを有し、５１ｋＤａの分子量を有する（図３２）。その２Ｆ５コアエピトープは多くの脊椎動物種のＫＹＮＵ中に存在し（図３３）、ＫＹＮＵの保存されたＨ３ドメイン中に存在している（図３４）。図３５で示したように、ＥＬＤＫＷＡ領域は秩序正しいアルファらせん中にある。ＤＫＷモチーフは表面に露出していない。
【００７５】
２Ｆ５抗体のヒトＫＹＮＵへの結合はＨ３ドメインの歪みを必要とする可能性があり、それは結果として遅くなったＫＯＮをもたらす可能性がある。図３６で示したように、Ｈ３において、ＤおよびＷ残基はおそらく露出した側鎖を有するが、Ｋは埋まっている。２Ｆ５抗体はＥＬＤＫＷＡエピトープに結合するために必然的にＨ３らせんを“歪める”可能性がある。生理的条件下では、ＫＹＮＵはホモ二量体であると考えられる。ＥＬＤＫＷＡモチーフはＫＹＮＵ単量体にとって利用可能である可能性があるが、ＫＹＮＵが２量体を形成した際はアクセス可能でありそうもない（図３７および３８）。
【００７６】
推定上の生殖細胞系列２Ｆ５抗体は、ｒｈＫＹＮＵとも反応する（図３９および４０）。これは、それがＫＹＮＵは最終的に変異した高親和性２Ｆ５抗体を産生したＢ細胞の本来のリガンドである可能性があることを実証している点で、重要な点である。図４１において示したように、２Ｆ５抗体は２Ｆ５エピトープを含有するペプチド（ＤＰ１７８−Ｑ１６Ｌ）と強く反応する一方で、抗ＫＹＮＵ抗体は反応しない（図４２および４３も参照）。
【００７７】
１３Ｈ１１は、２Ｆ５決定基に近位のエピトープを認識する非中和性マウスＨＩＶ−１ ＭＰＥＲモノクローナル抗体であり、ｒｈＫＹＮＵと結合しない（図４４）。図４５は、２Ｆ５および１３Ｈ１１モノクローナル抗体のＨＩＶ−１ ｇｐ４１ ＭＰＥＲへの結合部位を区別する残基のマッピングを提供する。図４６において示したデータは、組換えＨＩＶ−１ ｇｐ１４０ ｅｎｖ（ＪＲＦＬ）、ＤＰ１７８−Ｑ１６Ｌ、および無関係なペプチド抗原Ｒ４Ａによる、２Ｆ５のｒｈＫＹＮＵへの結合の競合阻害を示す。
【００７８】
ＪＲＦＬ組換えＨＩＶ−１ ｇｐ１４０は２Ｆ５のＪＲＦＬへの（同種阻害）、およびｒｈＫＹＮＵへの（異種阻害）結合を比較可能なほどに阻害する（図４７）。その阻害曲線の類似性は、単一の共通のエピトープが２Ｆ５のＪＲＦＬおよびｒｈＫＹＮＵへの結合の両方に寄与していることを示している。
【００７９】
図４８において示したように、２Ｆ５モノクローナル抗体はプレートに結合したｒｈＫＹＮＵおよび可溶性ｒｈＫＹＮＵの両方に比較可能なほどに結合する。表面プラズモン共鳴による研究は、２Ｆ５およびその未変異前駆体がｒｈＫＹＮＵに強く結合することができることを実証している（図４９）。より遅いＫｏｎは、２Ｆ５抗体が最大限の相互作用を達成するために自然なＫＹＮＵの構造を歪めることと一致している。Ｋｏｆｆ速度は非常に遅く、これは結合したＫＹＮＵが全ての２Ｆ５のタイプと安定して相互作用することを示している。
【００８０】
ＳＰＲ結合分析は、２Ｆ５ ｍＡｂおよびそのＲＵＡ（２Ｆ５−ＧＬ１および２Ｆ５−ＧＬ３）がＫＹＮＵに結合することを示している（図５０）。その抗体のそれぞれがヒト抗Ｆｃ（ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ−Ｆｃ）が固定されたセンサー表面上に捕捉され、可溶性ＫＹＮＵが５０、３０、２０、および１０μｇ／ｍＬの濃度で注入された。結合曲線の重ね合わせは、ＫＹＮＵのそれぞれの抗体への特異的な結合を示している。非特異的結合は、ＫＹＮＵへの結合を示さない対照ｍＡｂ（Ｓｙｎａｇｉｓ，抗ＲＳＶ）を用いて測定された。
【００８１】
実施例４
２Ｆ５の固定された３Ｔ３細胞への反応性が、２Ｆ５ ＭＰＥＲコアエピトープ（ＥＬＤＫＷＡ）を含有するタンパク質／ポリペプチドにより阻害され得るかどうかを決定するため、２Ｆ５モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）を増大するモル濃度の同種（ＪＲＦＬおよびＤＰ１７８）または異種（Ｒ４Ａ）阻害剤と反応させた（１時間、２５℃）。続いてこれらの混合物を、メタノール／アセトンで固定した３Ｔ３細胞で覆われた水和された／ブロッキングされたスライドに添加した（２時間、２５℃）。スライドをすすぎ、次いで２５０ｍｌの（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０および０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中で一夜洗浄した。洗浄されたスライドを、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０および０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中１：４００）で覆った。１時間後、スライドを洗浄し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ中でカバーガラスを乗せた（ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｅｄ）。２４時間後、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ共焦点顕微鏡を２００倍の倍率および固定された３００ｍｓｅｃの露光時間で用いて蛍光画像を得た。
【００８２】
同種阻害剤であるＪＦＲＬタンパク質、およびより低い程度でＤＰ１７８ポリペプチドは、２Ｆ５の３Ｔ３細胞への結合を阻害した。無関係なポリペプチドであるＲ４Ａは阻害を示さなかった（図５１参照）。これらのデータは、２Ｆ５の固定された３Ｔ３細胞に対する反応性の相当量が非特異的脂質結合ではなくタンパク質−タンパク質相互作用により決定されていることを実証している。従って、ＫＹＮＵと同様に、タンパク質は２Ｆ５に関する主要な自己リガンド（ａｕｔｏｌｉｇａｎｄ）であることができる。
【００８３】
実施例５
上記で記述したように、本発明は、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ペプチドまたはポリペプチド）を投与して、第１に広く中和する成熟した抗体を生じることができる未変異祖先抗体を発現するＢ細胞を標的とし、次いでその体細胞成熟を経ているＢ細胞を選択されたＨＩＶエンベロープタンパク質（ペプチドまたはポリペプチド）により追加免疫することにより、Ｂ細胞クローンの成熟を望まれる中和の広さに向けて駆動することを含むワクチン戦略に関する。その戦略の開発には、この成熟経路の再構築が含まれていた。望まれる最終的な（成熟した）抗体を広く中和する抗体を産生する患者から分離し、その抗体を特性付けした。そのそれぞれの推定上の祖先抗体を推定し、実際の抗体として発現させ、何にそれらが結合するかに関する決定を行った。未変異の“祖先”および中間抗体を発現するＢ細胞は、適切なタンパク質（ペプチドまたはポリペプチド）により引き金を引くと親和性が成熟してその患者において観察される広く中和する抗体を分泌するＢ細胞をもたらすであろうと考えられる。
【００８４】
クレードをまたぐ（ｃｒｏｓｓ−ｃｌａｄｅ）中和モノクローナル抗体ＣＨ０１、ＣＨ０２、ＣＨ０３、ＣＨ０４およびＣＨ０５の選択および分離
対象７０７−０１−０２１−９の凍結されたＰＢＭＣから得られたおおよそ３０，０００個の記憶Ｂ細胞をスクリーニングし、ＣＡＰ４５の感染性を５０％より大きく中和する２８の培養物を見つけた（図５６）。モノクローナル抗体ＣＨ０１、ＣＨ０２、ＣＨ０３、ＣＨ０４およびＣＨ０５（ＣＨ０１〜ＣＨ０５）をこれらの培養ウェルの４つから分離した（１−２７−Ｇ２、１−２７−Ｇ１１、１−１９−Ｆｌ０および１−１９−Ｂ７）（図５６）。
【００８５】
スクリーニングの時点で凍結した、ＲＮＡを後で処理した（ＲＮＡ−ｌａｔｅｒ−ｔｒｅａｔｅｄ）記憶Ｂ細胞から得られたＶ重鎖およびＶ軽鎖の増幅および配列決定を実施した。培養物１−２７−Ｇ２および１−１９−Ｆｌ０は１つの対のみ（３〜２０／κ３〜２０；それぞれＣＨ０１およびＣＨ０２モノクローナル抗体）を含有しており、それはその培養物がモノクローナルであったことおよびＣＨ０１およびＣＨ０２が自然抗体であることを示している。逆に、１−２７−Ｇ１１および１−１９−Ｂ７は多数のＶ重鎖およびＶ軽鎖を含有しており、それはその培養物がオリゴクローナルであったことを示している。
【００８６】
これらの後者の培養物からの自然対（ｎａｔｕｒａｌ ｐａｉｒｓ）を同定するため、最初のスクリーニングの時点で集められた単一細胞選別された記憶Ｂ細胞を増幅し、配列決定した。ＣＨ０３およびＣＨ０４（共に３〜２０／κ３〜２０）は、それぞれ培養物１−２７−Ｇ１１および１−１９−Ｂ７から分離された自然対であった。
【００８７】
培養物１−１９−Ｂ７から、その記憶Ｂ細胞をおおよそ４週間の間連続限界希釈によりさらに拡張およびクローニングすることにより、ヒトＢ細胞ハイブリドーマを生成した。この手段により、ＣＨ０４自然抗体を得てＣＨ０５を同定し、それは拡張された記憶Ｂ細胞のより少ない集団により生成され、ＣＨ０４と同じ３〜２０Ｖ重鎖を発現していたが、異なるκ１〜６Ｖ軽鎖と対になっていた。
【００８８】
そのＣＨ０１〜ＣＨ０３モノクローナル抗体は、Ｖ重鎖およびＶ軽鎖の対を２９３Ｔ細胞中に形質移入し、以前に記述されたように(Liao et al, J Virol Methods. 158(1-2):171-9 (2009))ＩｇＧ１主鎖中で発現させることにより得られた。モノクローナル抗体ＣＨ０４およびＣＨ０５は代わりにハイブリドーマＢ細胞株から精製された。
【００８９】
これらのデータは、その戦略が中和するモノクローナル抗体のおおよそ２週間での迅速な同定および１ヶ月もの早さでの自然モノクローナル抗体の産生を可能にすることを実証している。さらに、この方法は、インビボでのレパートリーにおいて表されている自然抗体と違いのないモノクローナル抗体の正確な特性付けに関して、古典的なファージディスプレイライブラリーの不確実性を解決する。最後に、ＨＩＶ−１を広く中和する２種類の自然ヒトＢ細胞ハイブリドーマの生成を初めて報告した。
【００９０】
ＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体のゲノム的特性付け
ＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体は、以下の要因に基づいて全て同じクローンファミリーのメンバーであることが決定された：（１）Ｖ（Ｄ）Ｊファミリー；（２）ＨＣＤＲ３の長さ；（３）ＨＣＤＲ３領域およびｎ−挿入のヌクレオチド配列。
【００９１】
重鎖の分析は、ＣＨ０１〜ＣＨ０５がＩｇＧ１抗体であり、同じＶ３〜２０＊１／Ｊ２＊０１再編成（表３）を共有していることを示した（表３）。それらは同じＤ領域も共有しており、それは３〜１０＊１および２ＯＦ１５＊２／ｉｎｖ領域のＤ−Ｄ融合の結果生じる（表３）。そのＨＣＤＲ３は２６アミノ酸長である（表３）。Ｎ−挿入も同じ長さであり、ヌクレオチド構成を共有しており、それはＣＨ０１〜ＣＨ０５モノクローナル抗体がクローン的に関連しているという考えと一致する（図５７Ａ）。ＣＨ０４およびＣＨ０５のＶ重鎖配列は同じであり（図５７Ａ）、それはＶ軽鎖の末梢での編集が起こる瞬間が妨害されたことを示唆している。
【００９２】
【表３】
【００９３】
そのＶ重鎖を見た限りでは、ＣＨ０１〜ＣＨ０４は同じＶＬκ３〜２０／ＪＬκ１再編成（図５７Ｂ）、同じ長さ（９アミノ酸）のＬＣＤＲ３および類似のｎ−挿入（図５７Ｂ）を共有していた。モノクローナル抗体ＣＨ０５のＶ軽鎖は代わりに無関係であり（図５７Ｃ）、異なるＶＬκ１／ＪＬκ２再編成、ＬＣＤＲ３の長さおよびｎ−挿入を有していた。Ｖ軽鎖のＶＨ３〜２０鎖への対合の基礎をなす生物学は、より大きなＶＬκの数はＪκの位置により近く、従って祖先抗体は最初にＶＬκ３を、次いでＶＬκ１を再編成しなければならなかったと考えられるため、ＶＨ３〜２０／ＶＬκ３〜２０鎖の対（ＣＨＯ１〜ＣＨ０４）がＶＨ３〜２０／ＶＬκ１〜６の対合（ＣＨ０５）に先行したことであると考えられる。さらに、小さい数のＪκの位置は大きい数のＪκの位置より前に来なければならない。従って、ＶＬκ３／ＪＬκ１からＶＬκ１／ＪＬκ２への移行は単純な編集と一致する。最後に、図５８に示した、以下で論じる系統樹は、さらにＶＬκ３／ＪＬκ２の再編成が最初に起こったという非常に強い証拠を提供する。
【００９４】
次に、Ｖ重鎖の系統樹を構築することにより、ＣＨ０１〜ＣＨ０５モノクローナル抗体の遺伝的関係の決定を行った（図５８）。それを行うために、観察された抗体に全体として最尤分析を適用することにより、ＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体の推定上の復帰未変異祖先を推定した。この方法を用いて、位置３２９における１個の沈黙ヌクレオチド置換（ＧまたはＴ）に関してのみ異なる２種類の可能性のあるＲＵＡ（０２１９−ＲＵＡ１および０２１９−ＲＵＡ２）が予想された（図５９）。その推定上のＲＵＡは、それぞれの観察されたモノクローナル抗体を独立して分析することによっても予想された。この方法を用いて、９個のＲＵＡ抗体の候補を同定した：ＣＨ０１に関して１個（ＣＨ０１−ＲＵＡ１）、ＣＨ０２に関して２個（ＣＨ０２−ＲＵＡ１およびＣＨ０２−ＲＵＡ２）、ＣＨ０３に関して４個（ＣＨ０３−ＲＵＡ１、ＣＨ０３−ＲＵＡ２、ＣＨ０３−ＲＵＡ３およびＣＨ０３−ＲＵＡ４）ＣＨ０４に関して２個（ＣＨ０４−ＲＵＡ１およびＣＨ０４−ＲＵＡ２）。全ての算出された推定上のＲＵＡの配列比較を図５９において示す。
【００９５】
Ｖ重鎖の系統樹（図５８）は、ＣＨ０２およびＣＨ０３が互いに遺伝的に近く、ＣＨ０３はそのファミリーの内で最も体細胞変異したモノクローナル抗体であることを示している。
【００９６】
まとめると、これらのデータは、ＣＨ０１〜ＣＨ０５はクローン的に関連した重度に体細胞変異したモノクローナル抗体であり、それらは長いＨＣＤＲ３を共有し、Ｄ−Ｄ融合再編成を有することを示している。さらに、これはヒトにおける末梢での軽鎖の編集の最初の記述である。
【００９７】
ＣＨ０１〜ＣＨ０５モノクローナル抗体は２層ＨＩＶ−１分離株を広く中和し、単量体性ｇｐ１２０／ｇｐ１４０ ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の限られたセットに結合する。
【００９８】
ＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体の中和の広さを、９６種類のＨＩＶ−１初代分離株の集団に対して試験した。その集団は、４種類の１Ａ層分離株、３種類の１Ｂ層分離株（２種類のクレードＢおよび１種類のクレードＡＥ）ならびに１０種類のクレードＡ、２１種類のクレードＢ、２７種類のクレードＣ、４種類のクレードＤ、７種類のクレードＧ、１種類のクレードＡＥ、１種類のクレードＡＤ、９種類のＣＲＦ０１＿ＡＥおよび９種類のＣＲＦ０２＿ＡＧウイルスが含まれる８９種類の２層分離株を含んでいた。
【００９９】
遺伝的分析により予想されたように、ＣＨ０１〜ＣＨ０５は非常に類似した中和のパターンを共有していた（表４）。全ての抗体は多数のクレードからのウイルスを中和し、その中和の広さはＣＨ０１の４４．９％（４３／９６分離株）からＣＨ０２の３４．７％（３３／９５分離株）までの範囲であった。ＣＨ０３、ＣＨ０４およびＣＨ０５はそれぞれ４３．２％（４１／９５）、４３．２％（４１／９５）および４４．２％（４２／９５）の分離株を中和した。１Ａ層分離株を中和した抗体は無かった。１Ｂ層分離株は、ＣＨ０１（３種類の内２種類）、ＣＨ０２およびＣＨ０３（３種類の内１種類）によってのみ中和され、ＣＨ０４またはＣＨ０５によっては中和されなかった。逆に、ＣＨ０１〜ＣＨ０５は２層ウイルスに対してより大きい中和の広さを示した。ＣＨ０１はＣＲＦ０２＿ＡＧ分離株（７／９；７７．８％）を優先的に中和し、クレードＡ（７／１０；７０％）、ＣＲＦ０１＿ＡＥ（５／９；５５．６％）、クレードＢ（９／２１；４２．９％）、クレードＣ（１１／２７；４０．７％）、およびクレードＧ（１／７；１４．３％）分離株が続いた。クレードＤウイルスは中和されなかった。逆に、ＣＨ０１〜ＣＨ０５モノクローナル抗体はＡＥ．ＣＭ２４４．ｅｃ１を強く中和したことを特筆するのは重要である（表４）。１層ウイルスを上回る２層ウイルスの優先的な中和は、以前の研究により中和しやすい１層分離株の広い中和はより中和しにくい２層分離株に対する広さに変換されないことが実証されており、従ってそれらの種類の抗体はＨＩＶ−１の感染の予防または制御において限られた助けにしかならない可能性がある点で重要である。
【０１００】
【表４−１】
【０１０１】
【表４−２】
【０１０２】
【表４−３】
【０１０３】
比較すると、表中に示した最近記述されたＰＧ９およびＰＧ１６ ４次抗体は、それぞれ７３／８３（８８％）および６９／８３（８３．１％）の２層分離株を中和した。興味深いことに、ただ１つの例外（Ｔ２５１−１８）を除き、ＰＧ１６はＰＧ９により中和された分離株の亜集団を中和し、ＣＨ０１〜ＣＨ０５の広く中和する抗体はＰＧ１６により中和されるウイルスの亜集団を中和する。この発見は、ＣＨ０１〜ＣＨ０５のエピトープがＰＧ９／ＰＧ１６のエピトープと関連しているという仮説と一致する。
【０１０４】
次に、ＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体の中和感受性分離株に対する効力を評価した。全体的に、ＩＣ５０の中央値はおおよそ１μｇ／ｍｌであり、ＩＣ５０の平均値は２．４から５．６μｇ／ｍｌまでの範囲であった。ＣＨ０３はＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体の中で最も強い効力を示し、ＩＣ５０の平均値は２．４μｇ／ｍｌ、ＩＣ５０の中央値は０．４６μｇ／ｍｌであり、ＰＧ９のそれら（ＩＣ５０の平均値＝２．１μｇ／ｍｌ；ＩＣ５０の中央値＝０．１１μｇ／ｍｌ）と比較可能であったが、ＰＧ１６のそれら（平均値＝０．６７μｇ／ｍｌ；中央値＜０．０２μｇ／ｍｌ）より弱かった。最も広い中和剤（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｒ）であるＣＨ０１は、それぞれ３．７および１．１μｇ／ｍｌのＩＣ５０の平均値および中央値を示した。ＣＨ０２、ＣＨ０４およびＣＨ０５のＩＣ５０の平均値はそれぞれ４．９、４．７および４．３μｇ／ｍｌ、ＩＣ５０の中央値はそれぞれ０．９７、０．８および０．７９であった。
【０１０５】
伝染した始祖ウイルスを中和する能力は、評価すべき別の重要なパラメーターである。表４で示したように、ＣＨ０１〜ＣＨ０５ ｂＮａｂは３／３（１００％）のクレードＡ、２／９（２２．２％）のクレードＢおよび２／３（６６．７％）のクレードＣの伝染した始祖ウイルスを中和することができた。
【０１０６】
まとめると、これらのデータはＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体のクローンファミリーは伝染した始祖ウイルスを含む多数のクレードからの２層分離株を広く中和することを示している。これは広く中和する抗体のクローンファミリーの最初の報告である。ＣＨ０５の中和のパターンには、そのクローンファミリーの他の広く中和する抗体の中和のパターンと比較して有意な違いがないため、これらの結果は、編集されたＶＬκ１〜６鎖がＶＬκ３〜２０鎖と比較可能なレベルでの試験された分離株の中和を可能にしたことも示している。
【０１０７】
成熟した抗体とは対照的に、推定される推定上のＲＵＡはそのような中和の広さを示さなかった。それでも、少数の分離株しか強く中和されなかった。２４種類の分離株の集団に対して試験した６種類の推定されたＲＵＡの中和プロフィールを表５に示す。ＣＨ０３−ＲＵＡ１、ＣＨ０３−ＲＵＡ４およびＣＨ０３−ＲＵＡ３がＡＥ．ＣＭ２４４．ｅｃｌ分離株をそれぞれ４．４５、５．２６および１８．８μｇ／ｍｌのＩＣ５０で中和したことを特筆するのは重要である。また、Ｂ．ＷＩＴＯ４１６０．３３は試験した全てのＲＵＡにより強く中和された（０．０６から０．４７μｇ／ｍｌまでのＩＣ５０）。Ａ．Ｑ２３．１７分離株も、ＣＨ０１−ＲＵＡ１、ＣＨ０３−ＲＵＡ１、ＣＨ０３−ＲＵＡ３およびＣＨ０３−ＲＵＡ４により０．０２μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０で非常に強く中和された。逆に、ＣＨ０２−ＲＵＡ１およびＣＨ０３−ＲＵＡ２はＡ．Ｑ２３．１７を３桁高いＩＣ５０で中和し、これはＣ．ＺＭ２３３Ｍ．ＰＢ６と同じ中和のパターンを示している。
【０１０８】
【表５】
【０１０９】
ＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体の単量体性ｇｐ１２０／ｇｐ１４０ ＨＩＶ−１エンベロープへの結合。
Ｂ細胞に結合させてＣＨ０１〜ＣＨ０５様抗体の産生を誘発するためにどの単量体性エンベロープをワクチン配合物中で用いることができるかを決定するために、ＣＨ０１〜ＣＨ０５モノクローナル抗体およびＲＵＡを３２種類の単量体性エンベロープの集団への結合に関して試験した。表６は、μＭで表したＥＣ５０を示す。
【０１１０】
【表６】
【０１１１】
単量体性エンベロープへの結合はｇｐ１２０ Ａ２４４ｇＤ＋を除いて弱く、それはＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体により７．８μΜ（ＣＨ０１)から１５０μΜ（ＣＨ０２)までの範囲のＥＣ５０で結合された。加えて、そして広く中和する抗体を分泌することができるＢ細胞の前駆体の選択的標的化と非常に関連して、２種類の推定上のＲＵＡもいくらかの結合を示した（表６）。５種類の成熟した抗体全てにより結合された他のＨＩＶ−１エンベロープは、そのＥＣ５０の平均値はより高かったが、ｇｐ１２０ ＣＭ２４３であった。Ａ２４４（ＣＭ２４４）エンベロープの配列は、Ｌ１２４Ｐ、Ｎ１９６Ｓ、Ｋ１９８Ｅ、Ａ２１２ＰおよびＤ２８４Ｎのａａ置換を除き、ＭｃＣｕｔｃｈａｎら(AIDS Res. Hum. Retrovir. 8(11):1887-1895 (1992))からのものである。加えて、ｇｐ１２０ Ａ１４４（ＣＭ２４４）のＮ末端に、単純ヘルペスウイルスのｇＤタンパク質からの３０ＡＡ配列（ＫＹＡＬＶＤＡＳＬＫＭＡＤＰＮＲＦＲＧＫＤＬＰＶＬＤＱ）が存在する。この配列は、ＨＳＶの侵入および感染に必要なｇＤタンパク質の受容体結合部位を含む(Yoon et al, J. Virol. 77:9221 (2003), Connolly et al, J. Virol. 79:1282-1295 (2005), Campadelli-Fiume et al, Rev. Med. Virol. 17:313-326 (2007))。このＡ２４４ ｇｐ１２０が免疫原として用いられたＲＶ１４４タイワクチン試験において、その対象はＭＮ ｇｐ１２０およびＡ２４４ ｇｐ１２０の両方においてそのｇＤタンパク質に、ＩｇＡ（図６０）およびＩｇＧ（図６１）ｇＤ抗体の両方で応答した。図６２は、ｇＤペプチド中に２個の可能性のある目的の部位が存在することを示しており、それはｇｐ１２０のアルファ４ベータ７結合部位であるＬＰＶおよびＬＤＱを模倣している可能性がある。従って、これは３つの可能性を生じさせる：
１．ｇｐ１２０のａ４ｂ７への結合のためのモチーフはＬＤＶおよびＬＤＩである
ＨＳＶ ｇＤ ＬＰＶおよびＬＤＱ
これは、ｇＤに対する抗体はＨＩＶ ｇｐ１２０のａ４ｂ７への結合を妨害することができるかどうかという疑問を生じさせる。
【０１１２】
２．ＨＳＶ−ｇＤのＬＤＱは、宿主の細胞の受容体のヘパラン硫酸に関する受容体結合部位である(Yoon et al, J.Virol. 77:9221 (2003))。
これは、ｇＤに対する抗体はＨＩＶ Ｅｎｖのヘパラン硫酸への結合を妨害することができるかどうかという疑問を生じさせる。
【０１１３】
３．ＬＤＱは第２のＨＳＶ受容体ＨＶＥＭに関する受容体結合部位でもある。ＬＤＱに対する抗ＨＳＶ抗体応答は、ＨＳＶに対して防御的であることができた(Yoon et al, J.Virol. 77:9221 (2003))。
【０１１４】
従って、抗ｇＤ応答は有効な感染を低減することによりＨＩＶに関して防御的であることができるであろう。
ほとんどの単量体性ｇｐ１２０／ｇｐ１４０エンベロープへの結合の欠如は、ＣＨ０１〜ＣＨ０５が三量体性エンベロープ上で優先的に発現している立体構造感受性の４次抗体に結合することを示している。同様の発見がＰＧ９およびＰＧ１６抗体に関して報告されている(Walker et al, Science 326(5950):285-9 (2009))。逆に、Ａ２４４ｇＤ＋ ｇｐ１２０エンベロープへの強い結合は、ＨＳＶ−１糖タンパク質Ｄの同時発現が機能性エピトープを回復したことを示唆していた。
【０１１５】
ＨＳＶ−１の糖タンパク質ＤのＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体の結合の増進における役割を調べるため、そしてＲＵＡのエンベロープへの結合を標準的なＥＬＩＳＡの検出の閾値より下であるがなお生理学的に関連性がある可能性のあるレベルで検出するため、ＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体およびＲＵＡのＡ２４４ｇＤ＋およびＡ２４４ｇＤ− ｇｐ１２０エンベロープに対する解離定数（ｋｄ）を、表面プラズモン共鳴を用いて測定した（表７）。Ａ２４４ｇＤ＋は一貫してＡ２４４ｇＤ−よりも少なくとも１桁低いｋｄを示したが、さらにもっと重要なことには、全てのＲＵＡがＡ２４４ｇＤ＋ ｇｐ１２０に７９０ｎＭから２６．７ｎＭまでの範囲のｋｄで結合した。これらのデータに関する表面プラズモン共鳴パターンを図６３〜６６に示す。伝染した始祖ウイルス６２４０がＰＧ９にナノモル濃度のＫｄで結合したことは、図６６においても示されている。まとめると、これらのデータは、Ａ２４４ ｇＤ＋エンベロープおよび６２４０伝染始祖エンベロープは天然のＥｎｖ三量体において見出されるｇｐ１２０と類似の立体構造にあり、従って免疫原としての使用に関して正しい立体構造にあるはずであることを示している。
【０１１６】
【表７】
【０１１７】
ＣＨ０１〜ＣＨ０５の広く中和する抗体の自己反応性および多反応性プロフィール。
表８は、ＣＨ０３はＲＮＰ、ヒストンおよびセントロメアＢ自己抗原と自己反応性であることを示している。ＣＨ０３におけるセントロメアに結合する抗体の存在は、ＨＥｐ−２細胞における間接蛍光抗体染色を用いても見出された（図６７）。表１２は、ＣＨ０１〜ＣＨ０５の４種類の非ＨＩＶ抗原への結合（Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイにより測定した）を報告する。そのデータは、ＣＨ０１〜ＣＨ０３が強く多反応性であることを示している。ＣＨ０４およびＣＨ０５の多反応性は、さらに低いレベルにおいてさえもなお検出可能である。逆に、ＰＧ９およびＰＧ１６は多反応性能力を示さなかった。これらのデータは、ＣＨ０１〜ＣＨ０５ならびにＰＧ９およびＰＧ１６抗体の間のそれぞれの発生の生物学における関連する可能性のある違いを指摘する。
【０１１８】
【表８】
【０１１９】
【表９】
【０１２０】
ＣＨ０１〜ＣＨ０５の広く中和する抗体により標的とされるエピトープの特性付け。ＰＧ１６様表現型（ｐｈｅｈｏｔｙｐｅ）
ＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体は、Ｗａｌｋｅｒらにより最近記述された(PLoS Pathog. 6(8).pii:el 001028 (２０１０年８月５日))４次の広く中和するＰＧ９およびＰＧ１６抗体と独特の特徴を共有している。特に、ＣＨ０１〜ＣＨ０５ ｂＮａｂは、以下の４つの基準に基づいて“ＰＧ様”抗体として特性付けられた：（１）ｇｐ１２０タンパク質の位置１６０におけるアスパラギンのリシンへの点変異（Ｎ１６０Ｋ）が、そうでなければ中和感受性である分離株の中和を抑止する（ａｂｒｏｇａｔｅｓ）、（２）そうでなければ中和感受性である分離株の中和が、そのウイルスがマンノシダーゼＩ−阻害剤キフネンシンで処理された細胞中でのそれの産生により部分的に糖鎖除去された際に抑止される、（３）そのエピトープはエンベロープ三量体の状況において優先的に提示されるが、単量体性ｇｐ１２０またはｇｐ１４０エンベロープ上には見付からない、そして（４）スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）がＰＧ９またはＰＧ１６ ｂＮａｂとの高い類似性を示す。ｂＮａｂのＣＨ０１〜ＣＨ０５クローンファミリーの代表として、ＣＨ０１をそれがその４つの基準を全て満たすかどうか決定するために試験した。
【０１２１】
表９は、一群の野生型および変異した分離株（クレードＡ Ｑ２３．１７およびクレードＢ ＪＲ−ＣＳＦ ＪＲＦＬおよび７１６５．１８分離株）に対するＰＧ９およびＰＧ１６の中和活性と比較した、ＣＨ０１の中和活性（ＩＣ５０およびＩＣ８０）へのＮ１６０Ｋ点変異の作用を示す。ＣＨ０１、ＰＧ９およびＰＧ１６は全て野生型Ｑ２３．１７（それぞれＩＣ５０＝０．０１４、０．００２および０．００１μｇ／ｍｌ）およびＪＲ−ＣＳＦ（それぞれＩＣ５０＝０．０７、０．００３および０．００３μｇ／ｍｌ）分離株を強く中和する。Ｑ２３．１７およびＪＲ−ＣＳＦのｇｐ１２０タンパク質中のＮ１６０Ｋ変異の導入は、その３種類の抗体による中和活性の完全な抑止につながる（ＩＣ５０＞５０μｇ／ｍｌ）。また、ＣＨ０１、ＰＧ９およびＰＧ１６はＪＲＦＬおよびその変異体に対して同じ中和パターンを共有している。それらのいずれも野生型のＪＲＦＬを中和しない。位置１６８における単一の変異（Ｅ１６８Ｋ）は正しく適合された（ｃｏｎｆｏｒｍｅｄ）エピトープを再構成し、結果として強力な中和（ＣＨ０１、ＰＧ９およびＰＧ１６に関してそれぞれＩＣ５０＝０．０４４、０．００８および０．００３μｇ／ｍｌ）をもたらすが、それに続くＮ１６０Ｋ変異の導入はＥ１６８Ｋ変異の作用を復帰させ、そのＪＲＦＬ／Ｅ１６８Ｋ／Ｎ１６０Ｋ分離株をその３種類のｂＮａｂ全てに対して中和抵抗性（ＩＣ５０＞５０μｇ／ｍｌ）にする。最後に、７１６５．１８はＣＨ０１（ＩＣ５０＝５．８２μｇ／ｍｌ）およびＰＧ１６（ＩＣ５０＝１１．８μｇ／ｍｌ）により中和されるが、ＰＧ９（ＩＣ５０＞５０μｇ／ｍｌ）によっては中和されず、またもＮ１６０Ｋ変異はＣＨ０１およびＰＧ１６の両方による中和を抑止する。まとめると、これらのデータは、ＣＨ０１の中和活性はＰＧ９およびＰＧ１６と同様にｇｐ１２０における署名（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）Ｎ１６０Ｋ変異により影響を受ける。
【０１２２】
【表１０】
【０１２３】
ＰＧ９およびＰＧ１６の別の特徴は、そうでなければ中和感受性であるウイルスが、そのウイルスを産生するために用いられる２９３Ｔ細胞をキフネンシンで処理した場合に抵抗性になることである。図６８は、２９３Ｔ細胞中で産生されたＹＵ２のＣＨ０１による中和が５０μＭのキフネンシンを用いた処理により見た限りでは無効にされていることを示している。
【０１２４】
上記で記述された単量体性ｇｐ１２０およびｇｐ１４０エンベロープへの限られた結合の広さを有する広く中和する抗体は、そのエピトープが三量体性エンベロープの状況において正しく露出される４次抗体の典型的なものである。
【０１２５】
７種類の別個のモノクローナル抗体のスレッド（ｔｈｒｅａｄｓ）上へのＣＨ０１の重ね合わせは、ＰＧ１６の構造はＨＣ０１の３Ｄ立体構造を予想するのに最も適していることを示した（表１０）。図６９は、ＣＨ０１のＰＧ１６のスレッド上への重ね合わせを示す。ＰＧ９およびＰＧ１６はＨＣＤＲ３領域の独特の形状により特性付けられ、それはその抗体の構造の先端から“ハンマー様の”形状で突き出している(Pancera et al, J. Virol. 84(16):8098-110 (2010))。そのような特徴を有する他の抗体は以前に記述されていなかった。特に、ＣＨ０１の構造は非常に類似しており、その“ハンマー”の“頭部”はＰＧ１６のそれとよく重なり合う（図６９）。ＨＣＤＲ３はＰＧ９およびＰＧ１６よりも短いため、その配列はいくつかの部分で異なっており、これはＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体およびＰＧ９／ＰＧ１６の間の異なる反応性の広さの構造的説明である可能性がある。
【０１２６】
【表１１】
【０１２７】
４次抗体の興味深い特徴は、それらがＣＤ４ｉ抗体と同じ方法でチロシン硫酸化され得ることである(Huang et al, PNAS 101(9):2706-2711 (2004) Epub ２００４年２月２３日、およびPejchal et al, PNAS 107(25):11483-8 (2010))。チロシン硫酸化予想プログラムである“ｓｕｌｆｉｎａｔｏｒ”を用いて実施されたＣＨ０１の配列分析は、硫酸化されそうな１個のチロシンを予想した（ＡＲＧＴＤＹＴＩＤＤＡＧＩＨＹＱＧＳＧＴＦＷＹＦＤＬ）（表１１）。（ＣＨ０１が１−２７−Ｇ２と呼ばれていることに注意。）
【０１２８】
【表１２】
【０１２９】
まとめると、これらのデータは、ＣＨ０１〜ＣＨ０５ ｂＮａｂがｇｐ１２０のＶ２領域を含む４次エピトープを認識するＰＧ様の抗体であるという考えを強く支持している。
要約すると、上記で示したデータは以下のことを実証している：（１）ファージディスプレイライブラリーを生成する必要のない自然抗体の迅速な同定および分離を可能にする戦略を開発した；（２）５種類のクローン的に関連する広く中和する抗体のファミリーを記述し、それらの発達を追跡した；（３）ヒトにおける末梢での受容体の編集の予備的な証拠を提供した；（４）以前に記述されたＰＧ９およびＰＧ１６の広く中和する抗体に遺伝的に関連しない、ＰＧ様ファミリーの広く中和する抗体の新規のメンバーを記述した；そして（５）１個より多くのモノクローナル抗体が入手可能である場合に推定上の復帰未変異祖先の予想の正確さを増大するための方法を開発した。
【０１３０】
４次Ｖ２、Ｖ３抗体の誘導のための免疫原の設計に関して、実施例５において、単純ヘルぺスのｇＤの配列を有するｇｐ１２０ Ｅｎｖ Ａ２４４は、Ｖ２、Ｖ３の立体構造決定的な（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）広く中和するＡｂ ＰＧ９、ＰＧ１６、ＣＨ０１〜ＣＨ０５に十分に結合することができ、ＣＨ０１、０２および０３抗体の復帰未変異祖先にも結合することができることが実証された。さらに、６２４０伝染始祖ＥｎｖはＰＧ９、およびＰＧ１６ ｍａｂに十分に結合することができる。従って、Ｖ２、Ｖ３の広く中和する抗体の誘導のための強力な免疫処置計画は、Ｎ末端においてｇＤ配列を有するＡ２４４ ｇｐ１２０エンベロープで数回（例えば１〜３回）予備刺激し、次いで例えば６２４０伝染始祖ｇｐ１４０で（例えば１〜３回）全身的に（例えばＩＭまたは皮下で）または粘膜に（例えば鼻内に、舌下に（ｓｕｂｌｉｎｇｕａｌｙ）、膣内に、または直腸に）のどちらかで追加免疫することである。Ａ２２４ ｇｐ１２０中のＨＳＶ受容体結合領域の免疫原性を考えれば、そのｇＤペプチドを含有するこのコンストラクトはＨＳＶワクチンコンストラクトにも用いることができる。同様に、あらゆるＨＩＶ−１エンベロープのＮ末端に類似の方法で挿入されたそのｇＤペプチドは、１型および２型単純ヘルペスウイルスに対する防御抗体を誘導するために用いることができる。
【０１３１】
上記で引用されたすべての文献および他の情報源を、本明細書にそのまま援用する。
【図２７−１】
【図２７−２】
【図２７−３】
【図２８−１】
【図２８−２】
【図５７Ａ】
【図５７Ｂ】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１６Ｄ】
【図１６Ｅ】
【図１６Ｆ】
【図１７】
【図１８】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図２０】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２２】
【図２３】
【図２４Ａ】
【図２４Ｂ】
【図２５】
【図２６】
【図２９−１】
【図２９−２】
【図２９−３】
【図２９−４】
【図２９−５】
【図２９−６】
【図２９−７】
【図２９−８】
【図２９−９】
【図２９−１０】
【図２９−１１】
【図２９−１２】
【図２９−１３】
【図２９−１４】
【図２９−１５】
【図２９−１６】
【図２９−１７】
【図２９−１８】
【図２９−１９】
【図２９−２０】
【図２９−２１】
【図２９−２２】
【図２９−２３】
【図２９−２４】
【図２９−２５】
【図２９−２６】
【図２９−２７】
【図２９−２８】
【図２９−２９】
【図２９−３０】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０−１】
【図５０−２】
【図５１】
【図５２−１】
【図５２−２】
【図５３Ａ】
【図５３Ｂ】
【図５３Ｃ】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７Ｃ】
【図５８】
【図５９−１】
【図６０】
【図６１】
【図６２】
【図６３】
【図６４】
【図６５】
【図６６】
【図６７】
【図６８】
【図６９−１】
【図６９−２】
【図２９−２２】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２３】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２４】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２５】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２６】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２７】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２８】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−２９】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図２９−３０】図２９．ＨＩＶ−１に対する早期Ｂ細胞応答：生得的Ｂ細胞の役割。
【図３０】図３０．広く中和する抗体である２Ｆ５および４Ｅ１０は、系統発生的に保存されている自己抗原と反応する。
【図３１】図３１．２Ｆ５はウェスタンブロットにおいて４３ｋＤａ、５０ｋＤａ、７０ｋＤａおよび３５０ｋＤａの３Ｔ３（マウス）細胞タンパク質に特異的に結合する。
【図３２】図３２．２Ｆ５名目（ｎｏｍｉｎａｌ）エピトープを有する保存された自己抗原。
【図３３】図３３．キヌレニナーゼ（ｋｙｎｕｅｒｅｎｉｎａｓｅ）（ＫＹＮＵ）のＨ３ドメインは高度に保存されている。
【図３４】図３４．ヒトＫＹＮＵ（ＰＤＢ ２ＨＺＰ）の構造およびＥＬＤＫＷＡモチーフの位置。
【図３５】図３５．ヒトＫＹＮＵ中のＤＫＷ残基（ＥＬＤＫＷＡ）の図説。
【図３６】図３６．２Ｆ５抗体のヒトＫＹＮＵへの結合は、そのＨ３ドメインの歪みを必要とする可能性がある。
【図３７】図３７．ＫＹＮＵ二量体はおそらく潜在的２Ｆ５結合部位を覆い隠す。
【図３８】図３８．２Ｆ５およびおそらく４Ｅ１０抗体は、ウェスタンブロットにおいて組換えヒトＫＹＮＵに結合する。
【図３９】図３９．ＫＹＮＵは２Ｆ５ファミリー抗体により認識される。
【図４０】図４０．２Ｆ５抗体は標準的なＥＬＩＳＡにおいてｒｈＫＹＮＵと強く（ａｖｉｄｌｙ）反応する。
【図４１】図４１．２Ｆ５抗体は２Ｆ５エピトープを含有するペプチド（ＤＰ１７８−Ｑ１６Ｌ）と反応する−抗ＫＹＮＵ抗体は反応しない。
【図４２】図４２．ｒｈＫＹＮＵおよびＤＰ１７８−Ｑ１６Ｌに対する２Ｆ５の結合は標準的なＥＬＩＳＡにおいて比較可能である。
【図４３】図４３．ＥＬＩＳＡプレートにおける抗体結合は抗原特異的である。
【図４４】図４４．１３Ｈ１１はｒｈＫＹＮＵに結合しない。
【図４５】図４５．１３Ｈ１１はＤＰ１７８−Ｑ１６Ｌと反応するがＭＰＥＲ−６５６とは反応しない。
【図４６】図４６．ＪＲＦＬ、ＤＰ１７８−Ｑ１６ＬおよびＲ４Ａによる、２Ｆ５のｒｈＫＹＮＵへの結合の競合阻害。
【図４７】図４７．２Ｆ５のｒｈＫＹＮＵおよびＪＲＦＬへの結合の競合阻害。
【図４８】図４８．可溶性ＫＹＮＵは２Ｆ５により結合される。
【図４９】図４９．表面に捕捉されたｍａｂへのｒｈＫＹＮＵの結合。
【図５０−１】図５０Ａ〜５０Ｃ．２Ｆ５ ｍＡｂおよび２Ｆ５ ＲＵＡ（復帰未変異祖先（ｒｅｖｅｒｔｅｄ ｕｎｍｕｔａｔｅｄ ａｎｃｅｓｔｏｒ））抗体のＫＹＮＵへの結合、（図５０Ａ）２Ｆ５、（図５０Ｂ）２Ｆ５−ＧＬ１、（図５０Ｃ）２Ｆ５−ＧＬ３。
【図５０−２】図５０Ａ〜５０Ｃ．２Ｆ５ ｍＡｂおよび２Ｆ５ ＲＵＡ（復帰未変異祖先（ｒｅｖｅｒｔｅｄ ｕｎｍｕｔａｔｅｄ ａｎｃｅｓｔｏｒ））抗体のＫＹＮＵへの結合、（図５０Ａ）２Ｆ５、（図５０Ｂ）２Ｆ５−ＧＬ１、（図５０Ｃ）２Ｆ５−ＧＬ３。
【図５１】図５１．組換えＨＩＶ−１ ｇｐ１４０（ＪＲＦＬ）、ならびにＤＰ１７８およびＲ４Ａペプチドによる、２Ｆ５の３Ｔ３細胞への結合の阻害。
【図５２−１】図５２Ａ〜５２Ｄ．ｍＡｂ ＨＶ００２７６と反応する腸細菌溶解物におけるタンパク質のバンドの濃縮（Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）および同定。（図５２Ａ）Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥゲル泳動後のウェスタンブロット分析。（図５２Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の後に集められた約５００ｋＤａの分子量を有する細菌溶解物からのタンパク質画分。（図５２Ｃ）ＳＥＣ画分は、クーマシーブルー（１）および銀染色（２）およびウェスタンブロッティング（３、矢印）により５２０ｋＤａのタンパク質の濃縮を示す。（図５２Ｄ）ｚｏｏｍ等電点分画法。
【図５２−２】図５２Ａ〜５２Ｄ．ｍＡｂ ＨＶ００２７６と反応する腸細菌溶解物におけるタンパク質のバンドの濃縮（Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）および同定。（図５２Ａ）Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥゲル泳動後のウェスタンブロット分析。（図５２Ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の後に集められた約５００ｋＤａの分子量を有する細菌溶解物からのタンパク質画分。（図５２Ｃ）ＳＥＣ画分は、クーマシーブルー（１）および銀染色（２）およびウェスタンブロッティング（３、矢印）により５２０ｋＤａのタンパク質の濃縮を示す。（図５２Ｄ）ｚｏｏｍ等電点分画法。
【図５３Ａ】図５３Ａ〜５３Ｃ．ＲＮＡポリメラーゼの液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）による同定。（図５３Ａ）ＲＮＡポリメラーゼβサブユニットのＬＣ−ＭＳ同定。（図５３Ｂ）ＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニットのＬＣ−ＭＳ同定。（図５３Ｃ）ＲＮＡポリメラーゼαサブユニットのＬＣ−ＭＳ同定。
【図５３Ｂ】図５３Ａ〜５３Ｃ．ＲＮＡポリメラーゼの液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）による同定。（図５３Ａ）ＲＮＡポリメラーゼβサブユニットのＬＣ−ＭＳ同定。（図５３Ｂ）ＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニットのＬＣ−ＭＳ同定。（図５３Ｃ）ＲＮＡポリメラーゼαサブユニットのＬＣ−ＭＳ同定。
【図５３Ｃ】図５３Ａ〜５３Ｃ．ＲＮＡポリメラーゼの液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）による同定。（図５３Ａ）ＲＮＡポリメラーゼβサブユニットのＬＣ−ＭＳ同定。（図５３Ｂ）ＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニットのＬＣ−ＭＳ同定。（図５３Ｃ）ＲＮＡポリメラーゼαサブユニットのＬＣ−ＭＳ同定。
【図５４】図５４．Ｍａｂ ＨＶ００２７６はＲＮＡポリメラーゼのコアタンパク質に結合する。
【図５５】図５５．Ｍａｂ ＨＶ００２７６はＲＮＡポリメラーゼのコアタンパク質のαサブユニットに結合する。
【図５６】図５６．一次記憶Ｂ細胞培養物の中和スクリーニング。ＣＨＡＶＩ０８、慢性的にＨＩＶ−１に感染した志願者７０７−０１−０２１−９の末梢血からの記憶Ｂ細胞をＥＢＶで形質転換し、ＣＤ４０リガンド、ｏＣｐＧおよびＣＨＫ−２阻害剤の存在下で８細胞／ウェルの密度で１４日間刺激した。刺激の終了時に、上清をレポーターである２層（ｔｉｅｒ）クレードＣ ＣＡＰ４５ウイルスに対する中和活性に関して試験した。黒い点は３，６００培養物のそれぞれの中和の百分率を表す。モノクローナル抗体ＣＨ０１〜ＣＨ０５は白い点の記号で表した培養物から分離された。陽性対照（ＨＩＶ Ｉｇ）を右端の白い点として示す。
【図５７Ａ】図５７Ａ〜５７Ｃ．モノクローナル抗体ＣＨ０１〜ＣＨ０５のＶ重およびＶ軽鎖の配列比較。ＣＨ０１〜ＣＨ０５のＶ重鎖（図５７Ａ）、ＣＨ０１〜ＣＨ０４（図５７Ｂ）およびＣＨ０５（図５７Ｃ）のＶ軽鎖の配列の配列比較。推定上の復帰未変異祖先の配列を、Ｖ重鎖およびＣＨ０１〜ＣＨ０４Ｖ軽鎖両方の配列比較のための鋳型として用いた。ＣＨ０５は関連のないＶκ１〜６鎖を有するため、それは別に示した。
【図５７Ｂ】図５７Ａ〜５７Ｃ．モノクローナル抗体ＣＨ０１〜ＣＨ０５のＶ重およびＶ軽鎖の配列比較。ＣＨ０１〜ＣＨ０５のＶ重鎖（図５７Ａ）、ＣＨ０１〜ＣＨ０４（図５７Ｂ）およびＣＨ０５（図５７Ｃ）のＶ軽鎖の配列の配列比較。推定上の復帰未変異祖先の配列を、Ｖ重鎖およびＣＨ０１〜ＣＨ０４Ｖ軽鎖両方の配列比較のための鋳型として用いた。ＣＨ０５は関連のないＶκ１〜６鎖を有するため、それは別に示した。
【図５７Ｃ】図５７Ａ〜５７Ｃ．モノクローナル抗体ＣＨ０１〜ＣＨ０５のＶ重およびＶ軽鎖の配列比較。ＣＨ０１〜ＣＨ０５のＶ重鎖（図５７Ａ）、ＣＨ０１〜ＣＨ０４（図５７Ｂ）およびＣＨ０５（図５７Ｃ）のＶ軽鎖の配列の配列比較。推定上の復帰未変異祖先の配列を、Ｖ重鎖およびＣＨ０１〜ＣＨ０４Ｖ軽鎖両方の配列比較のための鋳型として用いた。ＣＨ０５は関連のないＶκ１〜６鎖を有するため、それは別に示した。
【図５８】図５８．ＣＨ０１〜ＣＨ０５モノクローナル抗体のＶ重鎖の系統樹。
【図５９−１】図５９．推定される推定上の復帰未変異祖先抗体の配列比較。Ｖ重鎖を適用することにより推定される、全ての推定上の復帰未変異祖先抗体の配列比較は、“〜〜〜”によりＶ軽鎖から隔てられている。
【図５９−２】図５９．推定される推定上の復帰未変異祖先抗体の配列比較。Ｖ重鎖を適用することにより推定される、全ての推定上の復帰未変異祖先抗体の配列比較は、“〜〜〜”によりＶ軽鎖から隔てられている。
【図５９−３】図５９．推定される推定上の復帰未変異祖先抗体の配列比較。Ｖ重鎖を適用することにより推定される、全ての推定上の復帰未変異祖先抗体の配列比較は、“〜〜〜”によりＶ軽鎖から隔てられている。
【図６０】図６０．ＣＨ０１、ＣＨ０２、ＣＨ０３の４次の広く中和する抗体のＡ２４４ ｇｐ１２０への結合。
【図６１】図６１．ＣＨ０１、ＣＨ０２、ＣＨ０３の４次の広く中和する抗体の復帰未変異祖先のＡ２４４ ｇｐ１２０への結合。
【図６２】図６２．ＰＧ９およびＰＧ１６はＡ２４４ ｇｐ１２０および６４２０ Ｔ／Ｆ ｇｐ１４０の両方に結合する。
【図６３】図６３．Ａ２４４ｇＤ＋ ｇｐ１２０エンベロープと比較してＡ２４４ｇＤ− ｇｐ１２０エンベロープへの結合親和性が減少したＣＨ０１モノクローナル抗体。
【図６４】図６４．４８パーセントの抗ｇＤ ＩｇＡワクチン応答（９９人の対象）。
【図６５】図６５．８１パーセントの抗ｇＤ ＩｇＧワクチン応答（９９人の対象）。
【図６６】図６６．ｇＤの免疫原性の強い関連性。
【図６７】図６７．ＨＥＰ−２の結合。
【図６８】図６８．キフネンシン（ｋｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅ）処置の、ＣＨ０１の中和を仲介する能力への作用。
【図６９−１】図６９．ＣＨ０１（ここでは１−２７−Ｇ２と呼ぶ）の配列のＰＧ１６ Ｆａｂとの重ね合わせ（Ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）。
【図６９−２】図６９．ＣＨ０１（ここでは１−２７−Ｇ２と呼ぶ）の配列のＰＧ１６ Ｆａｂとの重ね合わせ（Ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、対象（例えばヒトの対象）においてＨＩＶ−１に対する広く中和する抗体の産生を誘導する方法に関する。その方法は、対象に生殖細胞系列Ｂ細胞受容体に結合する非ＨＩＶ−１抗原を投与することを含み、その非ＨＩＶ−１抗原は、ＨＩＶ−１ Ｅｎｖと交差反応する抗体を分泌するＢ細胞の中間クローンが生成されるような量で、およびそのような条件の下で投与される。その方法はさらに、その対象にＨＩＶ−１抗原を、広く中和する抗ＨＩＶ−１抗体を分泌するナイーブＢ細胞またはそれらのＢ細胞中間クローンが生成されるような量で、およびそのような条件の下で投与することを含む。ｇｐ１２０上のいくつかのエピトープに関して、それらのエピトープに結合することができる稀なナイーブＢ細胞が存在するであろう一方で、他のエピトープに関して、広く中和する抗体を生じることができるナイーブＢ細胞はＥｎｖに結合せず、追加の非Ｅｎｖエピトープにより刺激される必要があるであろうと考えられる。広く中和する抗体の誘導に対する障害を図１５において記述し、それらの障害を克服するための本戦略を図１６Ａにおいて記述する。
【００１４】
本発明における使用に適した非ＨＩＶ−１抗原には、宿主および／または外来抗原が含まれる。非ＨＩＶ−１抗原には、例えば脂質、例えばカルジオリピン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、およびそれらの誘導体、例えば１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ＰＯＰＳ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、またはそれらの断片が含まれる。リン脂質の六方ＩＩ相（ｈｅａｇｏｎａｌ ＩＩ ｐｈａｓｅ）の使用は好都合である可能性があり、（例えば生理的条件下での）六方ＩＩ管状相の六方晶的に充填された円柱を容易に形成するリン脂質が好ましく、六方ＩＩ相で安定化され得るリン脂質も同様である。（Rauch et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:41 12-41 14 (1990); Aguilar et al et al, J. Biol. Chem. 274: 25193-25196 (1999)を参照）。他の適切な非ＨＩＶ−１抗原には、例えば、フィコエリトリン（ＰＥ）、Ｃ−フィコシアニン（Ｃ−ＰＣ）、または他のフィコビリタンパク質、アポフェリチン、および嫌気性または好気性腸細菌叢またはその構成要素（単数または複数）（例えば５２０Ｋｄ抗原（またはＲＮＡポリメラーゼホロ酵素またはＲＮＡポリメラーゼコアタンパク質、またはそのサブユニット、例えばＲＮＡポリメラーゼコアタンパク質のαサブユニットもしくはそれにｍＡｂ ＨＶ００２７６が結合するエピトープを含むその一部）、または６０Ｋｄもしくは５０Ｋｄ抗原）が含まれる。実施例２で示すデータは、ｍＡｂ ＨＶ００２７６が大腸菌ＲＮＡポリメラーゼコアタンパク質のαサブユニットに結合することを示している。大腸菌ＲＮＡポリメラーゼコアタンパク質のαサブユニットと他の細菌（例えば枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、志賀赤痢菌（Ｓ． ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅａ）、サルモネラ菌（Ｓ． ｅｎｔｅｒｉｃａ）、結核菌（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）およびインフルエンザ菌（Ｈ． ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）および真核生物からのαの相同体（例えば出芽酵母のＲｐｂ３およびＲｐｂ１１と関連するヒトおよびマウスのタンパク質）の間で配列の相同性が高い(Zhang and Darst, Science 281 :262-266 (1998))。従って、本発明には、大腸菌に加えて真核生物からの、および細菌からの５２０Ｋｄ抗原（またはそのサブユニット、例えばＲＮＡポリメラーゼコアタンパク質のαサブユニットまたはｍＡｂ ＨＶ００２７６が結合するエピトープを含むそれの一部）の使用が含まれる。（例えば、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼαサブユニット：ＮＰ＿２８９８５６（ｇｉ／１５８０３８２２）；志賀赤痢菌：ＹＰ＿４０４９４０（ｇｉ：８２７７８５９１）；インフルエンザ菌：ＮＰ＿４３８９６２（ｇｉ：１６２７２７４４）；Ｒｐｂ３：スイスプロット：Ｐ３７３８２．２；Ｒｐｂ３（ヒト）：ＮＰ＿１１６５５８．１（ｇｉ：１４７０２１７１）参照。）
キヌレニナーゼ（ＫＹＮＵ）は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼスーパーファミリーとして知られているピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）依存性酵素のファミリーのメンバーである。真核生物の構成的キヌレニナーゼ類は３−ヒドロキシ−ｌ−キヌレニンの加水分解的切断を優先的に触媒して３−ヒドロキシアントラニル酸およびｌ−アラニンを生成する。ヒトのＫＹＮＵのクローニング、発現、精製、特性付けおよび結晶化が報告されている(Lima et al, Biochemistry 46(10):2735-2744 (2007)。下記の実施例３で記述するように、ＫＹＮＵはその保存されたＨ３ドメイン中にコア２Ｆ５エピトープを有する。
【００１５】
実施例３で提供するデータに基づいて、この内在性のリガンドはＢおよびＴリンパ球の寛容化を招き、それによりＨＩＶ−１ ｇｐ４１ ＭＰＥＲエピトープペプチドを投与されたヒトにおいてＨＩＶ−１に対する有効な免疫応答の生成を阻害することが予想される。本発明は、１態様において、この寛容を特異的に、すなわち他の無関係な自己抗原に対する寛容化に影響を及ぼすことなく壊す交差反応性抗原を投与することを含む、ＨＩＶ−１に対する免疫形成を達成する方法を提供する。適切な抗原には、例えば、ＣＨＯまたは２９３Ｔ細胞において発現させたＥＬＤＫＷＡ配列またはＥＬＥＫＷＡ配列（ＥＬＥＫＷＡはヒトのタンパク質には存在せず、従って寛容化されないと予想される）を有する変異ｇｐ４１もしくはＫＹＮＵ配列を有する組換えＫＹＮＵ分子が含まれる。用いることができる他の免疫原には、ＥＬＥＫＷＡまたはＥＬＤＫＷＡ配列のどちらかを有するリポソーム中の伝染／始祖または野生型慢性エンベロープｇｐ１４０もしくはｇｐ１６０またはＭＰＥＲペプチドが含まれる。ＥＬＤＫＷＡ配列を有する免疫原は、強いアジュバント、例えばスクアレンに基づくモノホスホリル（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ）リピドＡ、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｔｉｄｅｓ）（ｏＣｐＧ）およびＲ８４８（ＴＲＬ−７／８作動薬）と共に投与するのが好都合である。これらのＴＬＲ作動薬およびＩＦＮαを含むリポソームも用いることができる。（下記の注釈も参照。）
本発明における使用に適したＨＩＶ−１抗原には、膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）抗原(Armbruster et al, J. Antimicrob. Chemother. 54:915-920 (2004), Stiegler and Katinger, J. Antimicrob. Chemother. 512:757-759 (2003), Zwick et al, Journal of Virology 79:1252-1261 (2005), Purtscher et al, AIDS 10:587 (1996))ならびにその変種、例えばＭＰＥＲ Ｍａｂ ２Ｆ５および４Ｅ１０に対する、または他の広く中和するＥｎｖに対するより高い中和感受性を与える変種、例えばＭＰＥＲ中にＬ６６９Ｓ変異を含有するＭＰＥＲ変異体Ｅｎｖペプチド脂質複合体が含まれる(Shen et al, J. Virology 83:3617-25 (2009))。好ましい免疫原には、図２５および２６、ならびに図１６Ｂ、１６Ｃ、図１７、図１８および図２０において示した免疫原が含まれる。別の好ましい態様において、その変種はＭＰＥＲ ｍＡｂ ２Ｆ５および４Ｅ１０に対するより高い中和感受性を与えるＬ６６９Ｓ変異を有するＭＰＥＲエピトープペプチドである(Shen et al, J. Virology 83: 3617-25 (2009))。
【００１６】
本発明における使用に適したＨＩＶ−１抗原には、伝染始祖ＨＩＶ−１ Ｅｎｖまたはその断片も含まれる。これらの断片は、ｇｐ１２０のＣＤ４結合部位の一部(Chen et al, Science 362(5956):1123-7 (2009))、ＭＰＥＲ配列、ｇｐ１２０のＶ２、Ｖ３領域を組み込むｇｐ１２０の一部(Walker et al, Science 326(5950):285-9 (2009) Epub ２００９年９月３日)等に相当するものであることができる（例えば、図２７および２８において示す１０８６、０８９、６２４０、０４０＿Ｃ９および６３５２１に関する配列を参照）。好ましいＥｎｖ抗原には、マラウイ１０８６クレードＣ、６３２１および以前に記述された(Liao et al, Virology 30:268-282 (2006))ように生成された米国クレードＢ ０４０＿Ｃ９ ｇｐｌ４０オリゴマー（図１７および１８）(Keele et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:7552-7 (2008))が含まれ、それはクレードＢ ＪＲＦＬ ｇｐ１４０ ＥｎｖまたはＭＰＥＲ中和エピトープを選択的に示すその断片（図２８参照）と混合されてモルモットにおいて中和抗体におけるかなりの広さを誘導した（図１９Ａ）。ＪＲＦＬ ｇｐ１４０ Ｅｎｖオリゴマー（図１９Ｂ、２０、２１Ａおよび２１Ｂ）は構成的に２Ｆ５ ｍＡｂに結合する。５００ＵのＰＮｇａｓｅエンドグリコシダーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，マサチューセッツ州イプスウィッチ）を用いて糖鎖除去されたＪＲＦＬオリゴマーは、２Ｆ５の増進された結合および４Ｅ１０ ｍＡｂの新規の結合（ｇｐ４１上の４Ｅ１０エピトープの露出）を有する（図２１Ａおよび２１Ｂ）。４Ｅ１０の糖鎖除去されたＪＲＦＬへの増進された結合は、図２２の表面プラズモン共鳴（ｒｅａｓｏｎａｎｃｅ）分析においても示されている。
【００１７】
本発明の方法は、対象に非ＨＩＶ−１免疫原を含む予備刺激（ｐｒｉｍｅ）免疫処置、続いてＨＩＶ−１ Ｅｎｖ抗原の１回以上の追加免疫を施すことにより達成することができる。上記で指摘したように、適切な非ＨＩＶ−１免疫原には脂質（例えばカルジオリピン、ホスファチジルセリン、または他の陰イオン性脂質）、嫌気性または好気性腸細菌叢の細菌の構成要素、フィコビリタンパク質（例えばＰＥ）およびＫＹＮＵまたはその断片が含まれる。やはり上記で指摘したように、適切なＨＩＶ−１ Ｅｎｖ抗原にはマラウイからの伝染始祖Ｅｎｖ １０８６．Ｃ、マラウイからの０８９．Ｃ、米国からの０４０＿Ｃ９およびクレードＢ急性ＨＩＶ−１に感染した米国の患者からの６３５２１が含まれる。本方法における使用に適した予備刺激および追加免疫の両方が非ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−１免疫原の両方を含むことができる。当業者は予備刺激／追加免疫計画（ｒｅｇｉｍｅｓ）を容易に最適化することができる。そのような投与計画のタンパク質性構成要素をコードするＤＮＡ配列を、そのタンパク質性構成要素がインビボで生成されるような条件下で投与することができる。
【００１８】
下記の実施例５で記述するように、広く中和する抗体（ＣＨ０１〜０５）を産生するクローン的に関連するＢ細胞を、１人の患者から分離した。そのクローン的に関連する抗体の可能性のある復帰未変異祖先を推定し、実際の抗体として発現させた。これらの抗体の系統樹を再現した。自然抗体および推定される祖先抗体の両方を、一群の（ａ ｐａｎｅｌ ｏｆ）ＨＩＶエピトープタンパク質に結合する、および一群のＨＩＶ分離株を中和するそれらの能力に関して特性付けした。その復帰未変異祖先（ＲＵＡ）がＡ２４４ｇＤ＋エンベロープに結合することを特筆するのは重要である。従って、そのようなエンベロープまたはそのＲＵＡにより中和されることが記述されている他のエンベロープを、本発明の好ましいワクチン戦略における“予備刺激”として用いることができる。この戦略に従って、“追加免疫”を例えば本明細書で記述する成熟抗体により結合されるエンベロープを用いて達成することができる。さらなる“追加免疫”を、例えば６４２０または６３５２１（または結合する他のタンパク質、ペプチドまたはポリペプチド）を用いて達成することができる。
【００１９】
ＤＮＡでの予備刺激または追加免疫を用いる場合、適切な配合物には、ＤＮＡでの予備刺激および組換えアデノウイルスでの追加免疫ならびにＤＮＡでの予備刺激および組換えマイコバクテリアでの追加免疫が含まれ、ここでそのＤＮＡまたはそのベクターは、例えばＨＩＶ−１エンベロープまたはタンパク質性非ＨＩＶ−１抗原、例えば腸細菌叢もしくはＫＹＮＵ構成要素をコードしている。これらのベクターの他の組み合わせを、ＨＩＶ−１抗原および／または非ＨＩＶ−１抗原有りまたは無しのどちらにおいても、予備刺激または追加免疫として用いることができる。
【００２０】
本発明に従って、その非ＨＩＶ−１抗原はＨＩＶ−１ Ｅｎｖ抗原および１種類以上のアジュバントを含むリポソーム中に存在することができる。あるいは、その非ＨＩＶ−１抗原は、例えばヘテロ二官能性（ｈｅｔｅｒｏ−ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）薬剤、例えばＤＳＳＰを用いてＨＩＶ−１ Ｅｎｖ抗原にコンジュゲートさせて１種類以上のアジュバントと配合することができる。
【００２１】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）作動薬有りまたは無しでＭＰＥＲ抗原を発現する（ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ）リポソーム(Dennison, et al, J. Virology 83:10211-23 (2009))が記述されている（例えばＷＯ ２００８／１２７６５１を参照）。Ｇｐ４１中間体状態タンパク質（図２３）は、(Frey et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105-3739-44 (2008))により記述されている。そのｇｐ４１中間体は、リポソームと配合して（図２４Ａおよび２４Ｂ）２Ｆ５および４Ｅ１０に十分に結合する安定な免疫原を形成することができる（図２５）。本発明のＧｐ４１ ＭＰＥＲ免疫原は、例えばモノホスホリルリピドＡ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ Ａ）（ＭＰＬ−Ａ）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，アラバマ州アラバスター）およびＴＬＲ９作動薬、例えばｏＣｐＧ １０１０３（５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＣＧＴＴＴＴ−３’）およびＲ８４８ ＴＬＲ７作動薬（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ニューヨーク州ファーミングデール）を組み込むことにより抗原性を増強することができる（図２６）。加えて、Ｂ細胞クラススイッチのサイトカイン刺激物質、例えばＢＡＦＦ（ＢＬＹＳ）および／またはＡＰＲＩＬ(He et al, Immunity 26:812-26 (2007); Cerutti and Rescigno, Immunity 28: 740-50 (2008))を、最適なＢ細胞の刺激のためにそのリポソーム中に組み込むことができる。
【００２２】
本発明における使用に適したリポソームには、ＰＯＰＣ、ＰＯＰＥ、ＤＭＰＡ（またはスフィンゴミエリン（ＳＭ））、リゾホスホリルコリン（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、ホスファチジルセリン、およびコレステロール（Ｃｈ）を含むリポソームが含まれるが、それらに限定されない。最適な比率は当業者が決定することができるが、例には４５：２５：２０：１０の比率でのＰＯＰＣ：ＰＯＰＥ（またはＰＯＰＳ）：ＳＭ：ＣｈまたはＰＯＰＣ：ＰＯＰＥ（またはＰＯＰＳ）：ＤＭＰＡ：Ｃｈが含まれる。用いることができるリポソームの代替配合物には、９：７．５：１のモル比で配合されたＤＭＰＣ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）（またはリゾホスホリルコリン）、コレステロール（Ｃｈ）およびＤＭＰＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）が含まれる(Wassef et al, ImmunoMethods 4:217-222 (1994); Alving et al, G. Gregoriadis (ed.), Liposome technology 第２版, vol. Ill CRC Press, Inc., フロリダ州ボカラトン(1993); Richards et al, Infect. Immun. 66(6):285902865 (1998))。上記の脂質組成物は、リピドＡと複合体化してリン脂質に対する抗体応答を誘導するための免疫原として用いることができる(Schuster et al, J. Immunol. 122:900-905 (1979))。好ましい配合物は、Schuster et al, J. Immunol. 122:900-905 (1979)に従ってリピドＡと複合体化された６０：３０：１０の比率のＰＯＰＣ：ＰＯＰＳ：Ｃｈを含む。ペプチドの総脂質に対する最適な比率は、例えばそのペプチドおよびそのリポソームによって異なり得る。
【００２３】
本発明において、様々なアジュバントを用いることができる（上記で言及したアジュバントが含まれる）。上記のペプチド−リポソーム免疫原およびコンジュゲートは、アジュバント、例えばスクアレンに基づくアジュバント(Kaldova, Biochem. Biophys. Res. Communication, Dec. 16, 2009 印刷物に先駆けたE-pub)、および／またはＴＬＲ作動薬（例えばＴＲＬ３、ＴＲＬ５、ＴＲＬ４、ＴＲＬ９またはＴＲＬ７／８作動薬、またはそれらの組み合わせ）と共に配合する、および／または投与することができ、それは強い抗体応答を促進する(Rao et al, Immunobiol. Cell Biol. 82(5):523 (2004))。用いることができる他のアジュバントには、ミョウバンおよびＱ５２１が含まれる。油エマルジョン、例えばＥｍｕｌｓｉｇｅｎ（水中油エマルジョン）中のオリゴＣｐＧ類(Tran et al, Clin. Immunol. 109(3):278-287 (2003))も用いることができる。追加の適切なアジュバントには、２００５年１２月１４日に出願された１１／３０２，５０５において記述されているアジュバントが含まれ、それにはその中で開示されているＴＲＬ作動薬が含まれる。（Tran et al, Clin. Immunol. 109:278-287 (2003),米国出願第２００３０１８１４０６号、第２００４０００６２４２号、第２００４０００６０３２号、第２００４００９２４７２号、第２００４００６７９０５号、第２００４００５３８８０号、第２００４０１５２６４９号、第２００４０１７１０８６号、第２００４０１９８６８０号、第２００５０００５９６１９号も参照）。免疫応答を増進するＴＬＲリガンド、例えばリピドＡ、オリゴＣｐＧおよびＲ−８４８を、それらの中にコンジュゲートされたＨＩＶ−１ Ｅｎｖを有するリポソーム中に個別に、または組み合わせで配合することができる。
【００２４】
強いアジュバント（例えば強力なＴＬＲ作動薬）を装填された（ｌｏａｄｅｄ）リポソームは、多反応性中和抗体を作るように駆動されたＢ細胞の末梢での削除および／またはアネルギーを克服するために用いることができる免疫原の例である。
【００２５】
ＨＩＶ−１ ｇｐ４１ペプチドをリポソームに固定する膜貫通ドメインを用いて、機能的なエピトープの提示を達成することができる。ＨＩＶ−１ ｇｐ４１の膜貫通ドメインを用いて、そのペプチドを合成脂質を含むリポソーム中に固定することができる。ＴＭＤの三量体化の誘導は、ｇｐ４１ ＭＰＥＲの三量体型の形成を促進することができる。あるいは、Ｅｎｖ ｇｐｌ４０のＨｉｓタグ化（ｃ末端）バージョンは、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１の中間体型（ｇｐ４１−ｉｎｔｅｒ）に関して記述したようにリポソーム中に固定することができる。
【００２６】
非ＨＩＶ−１免疫原および／またはＨＩＶ−１タンパク質／ポリペプチド／ペプチド、またはコーディング配列の投与の方式は、その免疫原、患者および求められる作用、同様に、投与される用量により異なり得る。典型的には、投与経路は筋肉内、静脈内、腹腔内または皮下注射であろう。加えて、その配合物は鼻内経路により、または直腸内もしくは膣内に坐剤様のビヒクルとして投与することができる。一般に、そのリポソームは水性の液体、例えば通常の生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．０中で懸濁される。当業者は最適な投与計画を容易に決定することができる。その免疫原は予防的に使用されるのが好ましいが、感染した人へのそれらの投与はウイルス負荷を低減させる可能性がある。
【００２７】
ヒトモノクローナル抗体（ｈｕ ｍＡｂ）２Ｆ５および４Ｅ１０は、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１ ＭＰＥＲに相当するポリペプチドに高い特異性およびナノモル濃度（ｎＭ）の親和性で結合する。両方のｈｕ ｍＡｂは、免疫蛍光顕微鏡検査およびウェスタンブロッティングにより決定されるように、別個のヒトおよびマウスの細胞抗原とも反応する。これらの特性は、２Ｆ５および４Ｅ１０が、哺乳類細胞から生化学的に抽出され、標準的な免疫沈降法により回収される、変性した形およびポリペプチドが含まれる細胞タンパク質の単離に理想的であることを示している。２Ｆ５および４Ｅ１０の同じ特性は、それらを抽出された細胞タンパク質／ポリペプチドの標準的な質量分析の方法による同定に適したものにする。簡潔には、２Ｆ５または４Ｅ１０に特異的に結合する、免疫沈降された細胞タンパク質／ポリペプチドに酵素消化を施し、得られた断片の質量および電荷を用いてその親分子（単数または複数）を同定することができる。
【００２８】
本発明の特定の観点を以下の限定的でない実施例においてより詳細に記述する（Maksyutov et al, J. Clin. Virol. Dec; 31 Suppl 1:S26-38 (2004), Haynes et al, Science 308:1906 (2005), Gurgo et al, Virology 164:531-536 (1988),米国特許第７，６１１，７０４号、２００７年６月２２日に出願された米国出願第１１／８１２，９９２号、２００７年４月１３日に出願された米国出願第１１／７８５，０７７号、２００６年４月１２日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１３６８４、ＰＣＴ／ＵＳ０４／３０３９７（ＷＯ２００５／０２８６２５）、ＷＯ ２００６／１１０８３１、ＷＯ ２００８／１２７６５１、米国公開出願第２００８／００３１８９０号および第２００８／００５７０７５号、２００８年１２月２２日に出願された米国出願第１１／９１８，２１９号、２００７年２月２８日に出願された米国仮出願第６０／９６０，４１３号、ならびに全て２００９年４月３日に出願された米国仮出願第６１／１６６，６２５号、第６１／１６６，６４８号、および第６１／２０２，７７８号、２０１０年２月２５日に出願された米国仮出願第６１／２８２，５２６号、２０１０年７月２７日に出願された米国仮出願第６１／３４４，４５７号、２０１０年８月２５日に出願された米国仮出願依頼人ファイル番号０１５７９−１５９７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０１０１８、ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３００１１、ならびにＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０１０１７も参照、その全内容を本明細書に援用する）。
【実施例】
【００２９】
実施例１
実験の詳細
急性のＨＩＶ−１に感染した患者。研究のために選択された患者は、患者の履歴およびＦｉｅｂｉｇの分類(Fiebig et al, AIDS 17:1871-1879 (2003))から見積もられた伝染の日により、伝染後１７から３０日までであった。患者０６５−０およびＦＩＫＥはＦｉｅｂｉｇ第１期であり、一方で患者０６８−９、６８４−６およびＭＣＥＲはＦｉｅｂｉｇ第２期であった。
【００３０】
対照の対象。単一形質芽球／形質細胞選別を、感染していない対象および３価不活化（ＴＶＩ）インフルエンザワクチン（ＦＬＵＺＯＮＥ（登録商標）２００７または２００８）をワクチン接種した対象の骨髄、白血球除去または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に対して実施した。ＴＶＩで免疫した対象を、免疫処置の７日後に試験した(Liao et al, J. Virologic Methods 158:171-9, (2009); Wrammert et al, Nature 453 :667-71 (2008); Smith et al, Nature Protocols 4:372-84 (2009))。
【００３１】
流動選別戦略。ＰＢＭＣ、白血球除去または骨髄試料を、以前に記述されたように(Liao et al, J. Virologic Methods 158:171-9 (2009))抗Ｂ細胞抗体と反応させた。Wrammertら(Nature 453:667-71 (2008))は、ヒトＰＢＭＣ中の抗体分泌細胞である細胞は、ＣＤ１９＋、ＣＤ３８ｈｉ＋、ＩｇＤ−、ＣＤ２０ｌｏ＋／−Ｂ細胞の範囲内の細胞であることを示した。従って、急性ＨＩＶ感染（ＡＨＩ）およびインフルエンザワクチンでワクチン接種した対照の両方において、単一の抗体分泌形質芽球／形質細胞を分離するために、記述されたように(Liao et al, J. Virologic Methods 158:171-9 (2008); Wrammert et al, Nature 453:667-71 (2008))ＣＤ１９＋、ＣＤ３８ｈｉ＋、ＩｇＤ−、ＣＤ２０ｌｏ＋／−細胞をフローサイトメトリーによりＲＮＡ抽出緩衝液を含有する単一の９６ウェルプレートの中に選別した。正確な形質芽球／形質細胞集団の分離の成功の明確化のための陽性対照として、同じ集団を３価インフルエンザワクチン（ＦＬＵＺＯＮＥ（登録商標）２００７または２００８）ワクチン後の７日目から分離した。予想されたように、それらの選別された細胞の７５％が実際にインフルエンザ特異的抗体であったことが実証された(Wrammert et al, Nature 453 :667-71 (2008))。
【００３２】
伝染／始祖エンベロープの同定および発現。患者６８４−６およびＦＩＫＥの伝染／始祖Ｅｎｖを、以前に記述されたように(Keele et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:7552-7(2008))単一ゲノム増幅およびＥｎｖ遺伝子の配列決定により同定した。Ｅｎｖ ｇｐ１４０Ｃ（ｇｐ１２０／４１切断部位が変異している）、ｇｐ１２０およびｇｐ４１タンパク質を、記述されたように(Liao et al, J. Virologic Methods 158:171-9 (2008))２９３Ｔ細胞の一過性形質移入により発現させた。
【００３３】
形質芽球／形質細胞の免疫グロブリンＶＨおよびＶＬ遺伝子のＰＣＲ増幅。選別されたＢ形質芽球／形質細胞のＶＨおよびＶＬ Ｉｇ鎖を単一細胞ＰＣＲにより分離し、記述されたように(Liao et al, J. Virologic Methods 158:171-9 (2009) ; Wrammert et al, Nature 453:667-71 (2008) ; Smith et al, Nature Protocols 4:372-84 (2009))組換え抗体を産生させた。
【００３４】
Ｉｇ ＶＨおよびＶＬの配列の配列決定、配列の注釈、品質管理、およびデータの管理。Ｉｇ ＶＨおよびＶＬ遺伝子の全てのＰＣＲ産物はＱｉａｇｅｎ（カリフォルニア州ヴァレンシア）ＰＣＲ精製キットを用いて精製され、ＡＢＩ ３７００機器およびＢｉｇＤｙｅ（登録商標）配列決定キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州フォスターシティー）を用いて順方向および逆方向で配列決定された。それぞれの試料に関する塩基呼び出し（Ｂａｓｅ ｃａｌｌｉｎｇ）は、Ｐｈｒｅｄ(Ewing et al, Genome Res. 8:175-85 (1998); Ewing and Green, Genome Res. 8:186-94 (1998))を用いて行われる。その抗体遺伝子の順方向および逆方向の鎖を、それぞれの位置における品質スコア（ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅｓ）に基づく新規の組み立てアルゴリズム(Kepler et al,投稿中)を用いて１つの最終的なヌクレオチド配列へと組み立てる。見積もられるＰＣＲアーティファクト率は．２８または増幅された５個の遺伝子あたりおおよそ１個のＰＣＲアーティファクトであった。免疫グロブリンのアイソタイプを局所的整列アルゴリズム(Smith and Waterman, J. Mol. Biol. 147:195-7 (1981))により決定する。質を保証された抗体配列の生殖細胞系列再編成を、ＳｏＤＡを用いて決定する(Volpe et. al, Bioinformatics 22:438-44 (2006))。ＳｏＤＡに由来するゲノム情報、例えば遺伝子断片利用、体細胞変異およびＣＤＲ３領域を、容易なアクセスのためにＯＲＡＣＬＥデータベース中で保管する。
【００３５】
同じ対象からの抗体がクローン的に関連しているかどうかを決定するため、以下の３個の基準を利用した。第１に、問題の抗体の重鎖は同じＶＨおよびＪＨ遺伝子断片を用いなければならない。Ｄ断片における長さおよび高い変異のため、これらは同定するのがより難しい。従って、Ｄ断片の類似性は、クローンの関連性に関する基準として用いなかった。同様に、両方の軽鎖は同じＶκ／ＶλおよびＪκ／Ｊλを用いなければならない。第２に、問題の抗体の重鎖は同じＣＤＲ３の長さを有していなければならない。これは軽鎖にも適用される。第３に、その重鎖のＣＤＲ３のヌクレオチド配列は７０％同一でなければならない。同じことがその軽鎖のＣＤＲ３に適用される。これらの３個の基準を守る抗体を、クローン的に関連するものとして分類する。ＰＨＹＬＩＰ ３．６３パッケージ(Felsenstein, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 360:1427-34 (2005))を用いて、推定されるＳｏＤＡからの生殖細胞系列を根として用いて最尤樹を構築してそのクローンの間の系統的関係を決定した。その祖先配列も同じパッケージを用いて推定した。
【００３６】
推定される生殖細胞系列および中間抗体の設計および生成。抗体クローンファミリーのそれぞれのメンバーに関して、生殖細胞系列抗体前駆体および多数の抗体の中間的な型を推定するために最尤分析を用いた(Felsenstein, J. Mol. Evol. 17:368-76 (1981); Volpe et al, Bioinformatics 22:438-44 (2006))。これらのＶＨおよびＶＬ遺伝子を合成し（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ，ニュージャージー州ピスカタウェイ)、上記のような組換え技法によりＩｇＧ１ ｍＡｂとして発現させた。
【００３７】
ＶＨおよびＶＬの組換えｍＡｂとしての発現。単離されたＩｇ ＶＨおよびＶＬ遺伝子対をＰＣＲにより組み立てて、記述されたような方法(Liao et al, J. Virol. Methods 158:171-9 (2009))を用いるヒト胚腎臓細胞株２９３Ｔ（ＡＴＣＣ，バージニア州マナサス）中への形質移入による組換えｍＡｂの産生のための線状の完全長Ｉｇ重および軽鎖遺伝子発現カセットにした。対になるＩｇ重および軽鎖遺伝子発現カセットの精製されたＰＣＲ産物を、６ウェル組織培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｓｏｎ，ニュージャージー州フランクリンレイク）で増殖させた８０〜９０％コンフルエントの２９３Ｔ細胞中に、ＰｏｌｙＦｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ，カリフォルニア州バレンシア）および製造業者により推奨されるプロトコルを用いて同時形質移入した（ウェルあたりそれぞれ２μｇ）。形質移入の６〜８時間後に、その２９３Ｔ細胞に２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補った新しい培地を与え、５％ＣＯ２培養器中で３７℃で培養した。培養上清を形質移入の３日後に回収し、発現したＩｇＧのレベルに関して定量化し、抗体の特異性に関してスクリーニングした。スクリーニングアッセイにより同定された選ばれた抗体の将来の特性付けのため、その線状Ｉｇ重および軽鎖遺伝子コンストラクトを、精製された組換えｍＡｂの産生のために、標準的な分子プロトコルを用いてｐｃＤＮＡ３．３の中にクローニングした。
【００３８】
単離されたＶＨおよびＶＬ遺伝子ならびに推定される生殖細胞系列および中間前駆体抗体配列に由来する精製された組換えｍＡｂの産生のため、Ｔ１７５フラスコ中で培養した２９３Ｔ細胞に重および軽鎖Ｉｇ遺伝子を含有するプラスミドをＰｏｌｙＦｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ，カリフォルニア州バレンシア）を用いて同時形質移入し、２％ＦＣＳを補ったＤＭＥＭ中で培養した。組換えｍＡｂをその形質移入した２９３Ｔ細胞の培養上清から、抗ヒトＩｇ重鎖特異的抗体−アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ州セントルイス）を用いて精製した。
【００３９】
ＥＬＩＳＡおよびＬｕｍｉｎｅｘアッセイによる抗体特異性に関するスクリーニング。上清中の組換えｍＡｂの濃度を、記述されたような方法(Liao et al, J. Virol. Meth. 158:171-179 (2009))を用いて決定した。発現した組換えｍＡｂの特異性を、ＨＩＶ−１抗原に対する、および一群の非ＨＩＶ−１抗原に対する抗体反応性に関してアッセイした。ＨＩＶ抗原には、Ｅｎｖペプチドｇｐ４１免疫優性領域（ＲＶＬＡＶＥＲＹＬＲＤＱＱＬＬＧＩＷＧＣＳＧＫＬＩＣＴＴＡＶＰＷＮＡＳＷＳＮＫＳＬＮＫ）、ｇｐ４１ ＭＰＥＲ領域（ＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮ）、ＨＩＶ−１ ＭＮ ｇｐ４１（Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，マサチューセッツ州ウォバーン）、ＨＩＶ−１グループＭコンセンサスｇｐ１２０(Liao et al, Virology 353:268-82 (2006))、ＨＩＶ−１グループＭコンセンサスｇｐ１４０ ＣＦＩ(Liao et al, Virology 353:268-82 (2006))、ｐ６６（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ニュージャージー州レイクウッド）、ｐ５５（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，コネチカット州メリデン）、ｐ３１（Ｇｅｎｗａｙ，カリフォルニア州サンディエゴ）、ｎｅｆ（Ｇｅｎｗａｙ，カリフォルニア州サンディエゴ）、ｔａｔ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，メリーランド州ケンシントン）、およびＡＴ−２不活化ＨＩＶ−１ ＡＤＡビリオン(Rutebemberwa et al, AIDS Res. Human Retrovirol. 23:532-42 (2007))；ＮＩＨ，ＮＣＩ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ癌研究施設のJeffrey Lifsonから頂いたもの）が含まれていた。加えて、６８４−６ ｍＡｂを自己由来ｇｐ１４０、ｇｐ１２０およびｇｐ４１に対してアッセイし、ＦＩＫＥ ｍＡｂを自己由来ｇｐ１４０およびｇｐ１２０に対してアッセイした。非ＨＩＶ−１抗原には、３価インフルエンザワクチン２００７（ＦＬＵＺＯＮＥ ２００７）、Ｈ１Ａ／ソロモン諸島／０３／２００６からの組換えインフルエンザＨＡタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．コネチカット州メリデン）、破傷風トキソイド（ｔｏｘｉｏｄ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，カリフォルニア州サンディエゴ）、ＨＥＰ−２細胞（Ｉｎｖｅｒｎｅｓｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ニュージャージー州プリンストン）、カルジオリピン（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，所在地（アラバマ州アラバスター）(Haynes et al, Science 308:1906-8 (2005)）およびリピドＡ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，アラバマ州アラバスター）が含まれていた。腸細菌叢と呼ばれる嫌気性および好気性細菌抽出物の全細胞溶解物を、下記で記述するように調製した。簡潔には、細菌を患者からの４つの便の標本から接種し、寒天プレート上で嫌気性または好気性条件下で３０℃において増殖させた。コンフルエントの細菌を回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、商業的に入手可能な細菌タンパク質抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，イリノイ州ロックフォード）を用いて処理した。得られた抽出物を０．２２μｍフィルターを用いて濾過し、使用まで−８０℃で保管した(Kawatsu et al, J. Clin. Microbiol. 46:1226-31 (2008))。ＦＬＵＺＯＮＥ（登録商標）、インフルエンザＨＡ、ｇｐ４１免疫優性およびＭＰＥＲ領域、ならびに腸細菌叢全細胞溶解物に対するアッセイを、ＥＬＩＳＡ(Tomaras et al, J. Virology 82:12449-63 (2008))およびＬｕｍｉｎｅｘビーズアッセイ(Tomaras et al, J. Virology 82:12449-63 (2008))の両方により実施した。破傷風トキソイド、カルジオリピン（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ州セントルイス）、死菌クリプトコッカスおよびカンジダアルビカンスに対するアッセイはＨｅｐ−２上皮細胞との反応性に関するＥＬＩＳＡアッセイであり、間接的な免疫蛍光アッセイであった(Mietzner et al, Proc. Natl. Acad.. Sci. USA 105:9727-32 (2009))。
【００４０】
抗体反応性の表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅａｓｏｎａｎｃｅ）（ＳＰＲ）分析。ＳＰＲ結合アッセイを、２０℃で維持されたＢＩＡｃｏｒｅ ３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ，ニュージャージー州ピスカタウェイ）上で実施した。ＨＩＶ−１ ｇｐ４１またはオリゴマー状ｇｐ１４０タンパク質（Ｃｏｎ Ｓ ｇｐ１４０、自己由来Ｅｎｖ ｇｐ１４０）を、以前に記述されたように(Alam et al, J. Immunol. 178:4424-35 (2007))標準的なアミンカップリングによりＣＭ５センサーチップ上に固定した。ヒトｍＡｂを抗ヒトＦｃ抗体を結合させた表面上に捕捉し、次いでそれぞれのヒトｍＡｂを約２００〜５００ＲＵまで捕捉した。対照表面上の非特異的結合の減算の後、ｍＡｂ結合の特異的な結合応答が得られた（Ｅｎｖが固定された表面に関してＨＩＶ−１ ｇｐ１２０およびｍＡｂが固定された表面に関してヒトＩｇＧ、ＩＳ６）。（２価Ｉｇ分子の結合力を説明するために）２価分析物モデルおよびｍＡｂの抗体価測定から得られた結合曲線への全体的な曲線当てはめを用いて速度定数を測定した。ＭＡｂを３０μＬ／分で２〜６分間注入し、グリシン−ＨＣｌ ｐＨ２．０および界面活性剤Ｐ２０（０．０１％）を再生緩衝液として用いた。
【００４１】
結果
インフルエンザワクチン接種。インフルエンザワクチン接種された対象からの、単一細胞選別された形質細胞／形質芽球に由来する抗体のクローンを試験し、その応答が高度にクローン的であることが分かった。そのクローンメンバーはほぼ全て試験したインフルエンザ抗原と反応した。図１は、Ｈ１ソロモン諸島（Ｓｏｌｏｍａｎ Ｉｓｌａｎｄｓ）ヘマグルチニンに対する代表的なインフルエンザ抗体クローンを示す。合計４５０の抗体を３人のインフルエンザワクチン接種された対象の形質細胞／形質芽球から分離し、これらの内で５７．７％がインフルエンザ特異的であった。インフルエンザに感染した対象から分離された全部で２６５の抗体のうちで、クローン的に関連した抗体の２０種類の独立したクローンが同定され、その中で１１５の抗体（９２％）がインフルエンザ抗原と反応した。
【００４２】
急性ＨＩＶ−１感染におけるクローン性抗体応答。約７５％の形質細胞／形質芽球がインフルエンザ特異的であるインフルエンザワクチン接種とは対照的に、５人のＡＨＩ患者の形質芽球／形質細胞から分離された合計１０７４の組換え抗体の内で、８９または８．３％の発現した抗体（３．３％〜１３．３％の範囲）がＨＩＶ−１特異的であり、一方で残りの大部分は非ＨＩＶ抗原に対するものであるか（約６％）、または未知の特異性を有するか（８８２または８２．１％）のどちらかであった。一群の非ＨＩＶ−１関連抗原アッセイにより、Ｈｅｐ−２上皮細胞（２７または２．５％）、腸細菌叢（５または０．５％）、カルジオリピン（４または０．４％）、インフルエンザ（９または０．８％）、クリプトコッカス（４または０．４％）、カンジダアルビカンス（２または０．２％）、および破傷風トキソイド（８または０．７％）に対する高い親和性の抗体を実証することが可能であった。追加の３８または３．５％は、これらの抗原の少なくとも２種類と反応した。その患者の３人はリピドＡ抗体を有し、１人の患者は腸細菌叢抗体を有し、それは非常に早期の腸の損傷の開始、微生物の移行および抗リピドＡおよび腸細菌叢抗体の誘導を示唆している。注目すべきことには、これらの早期ＡＨＩ患者のいずれも、ＨＩＶ−１の伝染後１７〜３０日の内にｇｐ４１以外のＨＩＶ−１特異性が検出されたｍＡｂを全く有していなかった。
【００４３】
ｇｐ４１に対するＡＨＩ応答の検出においてコンセンサスＥｎｖが自己由来Ｅｎｖに等しいことが以前に報告された(Tomaras et al, J. Virology 82:12449-63 (2008))。しかし、ＡＨＩ Ｂ細胞分析において応答が失われていた可能性を除外するため、６８４−６およびＦＩＫＥからのｍＡｂをそれらの自己由来組換えｇｐ１４０ Ｅｎｖを用いてスクリーニングした。概して、自己由来ｇｐ１４０ ｅｎｖに対する応答はクレードＢ ｇｐ４１に対するものよりもはるかに小さかった。
【００４４】
従って、伝染／始祖ウイルスに対する初期の形質芽球／形質細胞レパートリーの応答は、血漿抗体応答(Tomaras et al, J. Virol. 82:12440-63 (2008))と同様に、Ｅｎｖ ｇｐ４１エピトープに焦点が合わせられた。加えて、ＨＩＶ−１は以前のワクチン接種または感染性因子抗原、例えばクリプトコッカス、カンジダアルビカンス、および破傷風トキソイドからの既存の記憶Ｂ細胞を最終分化へと活性化し、駆動する。さらに、ＡＨＩの過程において、Ｈｅｐ−２細胞自己反応性Ｂ細胞の多反応性クローンはその初期の形質芽球／形質細胞応答に加わるように誘導される。
【００４５】
ＡＨＩ形質芽球／形質細胞レパートリー内の抗体クローンの分析。一般に、報告されたインフルエンザワクチン接種により誘導された形質芽球／形質細胞レパートリー(Wrammert et al, Nature 453:667-72 (2009))または血漿中に広く中和する抗体活性を有する対象におけるｇｐ１４０＋Ｂ細胞の記憶Ｂ細胞レパートリー(Scheid et al, Nature 458:636-40 (2009))と比較して、ＡＨＩ形質芽球／形質細胞レパートリーからは少数のクローンしか分離されなかった。広く中和する抗体を有する６人の患者における慢性ＨＩＶ−１感染において、Scheidら(Nature 458:636-40 (2009))は、そのＢ細胞クローンの数がそれらの６人の患者から分離された５０２の抗体において患者の間で２２から５０まで異なっていたことを見出した。
【００４６】
ＡＨＩの研究において、５人のＡＨＩの患者から分離された１０７４のｍＡｂにおいて、わずか８種類の抗体のクローンしか見付からなかった。これらには、ＡＨＩ患者の１人において同定された６種類の独立した抗体のクローンの中のｇｐ４１と反応する３種類の抗体のクローンが含まれていた。興味深いことに、その３種類のＡＨＩ ｇｐ４１クローンの全部で５２のクローン性メンバーの内で、１７（３７％）のみがｇｐ４１と反応した。これは、インフルエンザ反応性インフルエンザクローンメンバーの９４％と対照的である。
【００４７】
図２は、５２のメンバーを有するＡＨＩクローン６８５−６Ｂ−注目すべきＶＨ３−７、ＤＨ１−２６、ＪＨ５、ＶＫ１−３９、ＪＫ４、ＩｇＧ３変異クローンを示し、変異していないメンバーは無い。その５７の抗体の内で、４（８％）のみがｇｐ４１と反応した。
【００４８】
ｇｐ４１の推定される生殖細胞系列および中間抗体のクローンとの反応性の分析。ＨＩＶ−１ ｇｐ４１がナイーブＢ細胞の生殖細胞系列Ｂ細胞受容体と反応しており、低い抗原駆動（ａｎｔｉｇｅｎ ｄｒｉｖｅ）を有する低親和性クローンを刺激しているのか、またはｇｐ４１が既存の記憶Ｂ細胞のクローンと交差反応してクローン性メンバーを同時のｇｐ４１および自己抗原駆動を経るように命じる可能性があるのかを推論した。これらの２つの可能性を区別するため、最尤分析を用いて生殖細胞系列未変異抗体および部分的に変異したクローン中間体がそれらのｇｐ４１との反応性を決定するために用いられたと推定した（図３）。そのクローンの発生のどこでｇｐ４１との反応性が獲得されたのかを決定するために（すなわち生殖細胞系列ＶＨ＋ＶＬまたはより後の中間体）、推定される生殖細胞系列およびクローンメンバー中間体をクレードＢ ｇｐ４１、自己由来ｇｐ１４０およびグループＭコンセンサスｇｐ１４０との反応性に関してアッセイした（図４）。クローン６８４−６Ｂの反応性は２番目の中間前駆体抗体において獲得されたことが分かった（図４および５）。
【００４９】
問われた次の疑問は、ｇｐ４１との反応性はｇｐ４１による抗原駆動を表しているのかどうかであった。図６は、さらなる推定された中間抗体クローンをｍｇの量で生成し、ｇｐ４１に対する抗体結合の解離定数（Ｋｄ）に関して分析したことを示している。図７は解離定数をＫｄのＬｏｇ１０としてプロットしたヒートマッププロットを示し、実際、中間体が実際の分離された抗体へと進行するにつれて、ｇｐ４１に対する結合に関する親和性の成熟の進行が存在することを実証している。
【００５０】
ＡＨＩの間に多反応性非ＨＩＶ−１ ｇｐ４１クローンが誘導されるとして、問われる次の疑問は、クローン６８４−６ＢメンバーがカルジオリピンおよびＨｅｐ−２上皮細胞との反応性により多反応性であるかどうかであった。Ｈｅｐ−２間接免疫蛍光アッセイにおいて、クローン６８４−６Ｂの反応性はｇｐ４１反応性と同じ推定される中間前駆体期において獲得された（図８）。生殖細胞系列未変異抗体を含む６８４−６Ｂの全てのクローンメンバーはカルジオリピンと反応し、一方でＨｅｐ−２反応性はクローンの発達の間に大きくなったり小さくなったりし、カルジオリピンとの反応性は最終クローン３０７および３５０までの中間体全体を通して比較的安定していた。生殖細胞系列および他のクローンメンバーのカルジオリピンとの多反応性は、ＨＩＶに対する初期の抗体応答はＨＩＶ−１ ｇｐ４１が既存の多反応性の自然抗体のクローンを刺激することに由来し、ｇｐ４１は最初のクローンが体細胞超変異によりｇｐ４１に対する交差反応性を獲得するとすぐにＢ細胞のクローンを多反応性ｇｐ４１クローンになるように補充する（ｒｅｃｒｕｉｔｓ）ことを強く示唆している。この発見は、ＨＩＶワクチン設計にかなりの波及を有する。
【００５１】
非ＨＩＶ−１抗原に対する生殖細胞系列反応性の性質。それぞれのクローンの生殖細胞系列抗体においてではなく推定されるクローン中間体における６８４−６Ｂクローンの反応性の獲得の驚くべき結果を考慮して、ＨＩＶにおいて活性化される抗体クローンの起源だと思われるものを同定するため、それに対してその生殖細胞系列が反応する可能性のある宿主抗原を同定するための努力がなされた。
【００５２】
腸においてＡＨＩによる早期の腸の微生物の移行が存在するため、およびＡＨＩにおける初期の抗原刺激の多くが粘膜表面において生じるため、初期の抗体応答は腸微生物性抗体応答に何らかの方法で結び付けられる、または関連する可能性があるという仮説が立てられた。これを研究するため、嫌気性および好気性腸細菌叢の全細胞溶解物に対する６８４−６Ｂクローンからのクローン性抗体ならびに推定される生殖細胞系列および推定される中間体の測定可能な反応性が存在するかどうかに関する決定がなされた。加えて、ＥＢＶによる形質転換を用いて、ＡＨＩまたは未感染の対象の腸、骨髄または血液から一群の五量体ＩｇＭ ｍＡｂを分離した。
【００５３】
最初に、一連のＩｇＭ抗体をＡＨＩから分離し、未感染の対象からｇｐ４１反応性またはｇｐ４１非反応性のどちらかである２種類のＩｇＭ抗体を分離した。問われた疑問は、ｇｐ４１と反応性であるＩｇＭが腸細菌叢とも反応性であるかどうかであった。表１は、実際にｇｐ４１と反応性であった全てのｍＡｂが腸細菌叢抗原とも反応性である一方で、ｇｐ４１と反応性でなかったｍＡｂは腸細菌叢と反応性でなかったことを示している。
【００５４】
【表１】
【００５５】
注目すべきことに、試験した全てのクローンからの生殖細胞系列および中間前駆体を好気性および嫌気性腸細菌叢の全細胞溶解物を用いてアッセイした際に、そのクローンの全てにおける抗体の全てが腸細菌叢全細胞溶解物と反応した。図９は、それぞれのｍＡｂにおいて好気性全細胞溶解物（ＷＣＬ）と反応する６８４−６Ｂクローンのヒートマップを示す。嫌気性ＷＣＬを用いて同様の結果が得られた。腸細菌叢により仲介される抗原駆動を決定するための分析を実施した際、ｇｐ４１に関してほどではないが、実際にＡＨＩクローンにおける進行的な体細胞超変異と同時に起こる抗体親和性の増大が存在することが分かった。
【００５６】
ＡＨＩ ｇｐ４１ ｍＡｂの嫌気性および好気性腸細菌叢全細胞溶解物とのウェスタンブロット。次に、図６における推定される中間体＃２（ＨＶ００２７６）の反応性を、嫌気性および好気性ＷＣＬの両方を用いて、ｂｌｕｅ ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥで（図１０ＡおよびＢ）、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥで（図１１および１２）決定した。ｂｌｕｅ ｎａｔｉｖｅゲルでの分析において、６８４−６ＢクローンのｍＡｂは好気性および嫌気性腸試料の両方において５２０，０００Ｄａの分子と反応した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。さらに、ｍＡｂ ２７６は４８０ＫＤａのＭＷマーカーとも反応し、それはフィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｔｈｒｙｎ）である（図１０Ａおよび１０Ｂ）。図１１および１２は、非還元（図１１）および還元（図１２）条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥの下で、約５２０，０００Ｄａにおいてまた強いバンドが見られることを示している。還元条件下での未変性マーカーにおいても同様に、おおよそ６０および５０Ｋｄにおいてより小さいバンドが見られる（図１２）。その未変性マーカーはまたもフィコエリトリン（ＰＥ）であり、それは６８４−６ＢクローンのｍａｂによるＰＥに対する多反応性を示している。
【００５７】
重要なことだが、体細胞変異した元の２Ｆ５および４Ｅ１０の広く中和する抗体も腸細菌叢ＷＣＬにおいてタンパク質のバンドと反応し、２Ｆ５は好気性ＷＣＬにおいて約３００，０００Ｄａの分子および約８０，０００Ｄａの分子と反応し、４Ｅ１０は好気性ＷＣＬにおいて約８０，０００および１００，０００Ｄａの分子と反応する。図１２（還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において、ＨＶ００２７６（中間体６８４−６ ａｂ ＃２）は好気性および嫌気性ＷＣＬにおいて約５２０，０００Ｄａのバンドに結合し、一方で２Ｆ５は好気性ＷＣＬにおいて約８０，０００Ｄａのバンドと反応し、４Ｅ１０はおおよそ６０，０００ｄａのバンドと反応することが分かる。
【００５８】
広く中和する抗体２Ｆ５、４Ｅ１０および１ｂ１２は多数の宿主抗原に結合する多反応性抗体であることが以前に示されている。従って、疑問は、ＨＩＶに対する初期応答が多反応性抗体応答によるものであるならば、広く中和する多反応性抗体はなぜ作られないのかである。２つの可能性が考えられている。
【００５９】
第１に、１ｂ１２、２Ｆ５および２Ｇ１２の生殖細胞系列はＨＩＶのｇｐ１２０またはｇｐ４１に結合せず、一方で体細胞超変異した抗体は結合することが示されている(Xiao et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 390:404-9 (2009))。従って、広く中和する抗体のエピトープの多くに関して、当分野が用いてきた免疫原はそれらが標的としているナイーブＢ細胞のＢ細胞受容体を標的としないことが考えられる。１ｂ１２の生殖細胞系列はここで脂質反応性に関して、および腸細菌叢全細胞溶解物活性に関して研究されており、実際にその生殖細胞系列１ｂ１２の反応性はＨＩＶ ｇｐ１２０エンベロープに対して陰性であり、一方でその体細胞変異した１ｂ１２の反応性はＨＩＶ ｇｐ１２０に対して非常に高いことが分かっている（図１３）。それに対し、１ｂ１２の生殖細胞系列の反応性はカルジオリピンに対して非常に高く、一方で体細胞変異した多反応性の最初の１ｂ１２のカルジオリピンに対する反応性は陰性ではないが非常に低い（図１３）。さらに、１ｂ１２の生殖細胞系列は腸細菌叢全細胞溶解物とも反応性であり、一方で成熟した最初の体細胞変異した１Ｂ１２ ｍＡｂはごく弱く反応性である（表２）。
【００６０】
【表２】
【００６１】
第２に、２Ｆ５、４Ｅ１０および１ｂ１２の多反応性はこれらのタイプの抗体を作るＢ細胞を削除またはアネルギーに向けるという仮説が立てられた(Haynes et al, Science 308:1906-8 (2005); Haynes et al, Human Antibodies 14:59-67 (2005); Alam et al, J. Immunol. 178:4424-35 (2007))。この仮説は最近２Ｆ５ ＶＨに関して２Ｆ５ ＦＨホモ接合性ノックインマウスにおいて証明されており(Verkoczy et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107:181-6 (2010))、ここで４Ｅ１０ ＶＨホモ接合性マウスにおいて証明された（図１４）。その広く反応する体細胞変異したＶＨのノックインの両方の動物モデルにおいて、その変異したＶＨは骨髄において削除を引き起こすのに、および抹消において多数の寛容性機構を誘起するのに十分に自己反応性である。
【００６２】
要約すると、上記で記述した結果は以下のことを示している：
・ＨＩＶに対する初期の抗体応答は、非中和性Ｅｎｖ ｇｐ４１エピトープに焦点が合わせられている。
【００６３】
・初期のｇｐ４１抗体応答は、その生殖細胞系列Ａｂはｇｐ４１とは反応しないがその推定される中間Ａｂはｇｐ４１と反応する、既存の体細胞変異した多反応性の“自然”抗体クローンから生じる。
【００６４】
・ｇｐ４１抗体反応性クローンの抗体メンバーは多反応性であり、脂質および他の自己細胞性抗原と交差反応するが、抗ｇｐ４１抗体の親和性は体細胞超変異が起こるにつれて増大し、これはｇｐ４１抗原駆動を示している。
【００６５】
・しかし、初期のＨＩＶに誘導されるクローンの発達は、おそらく自己模倣（ｓｅｌｆ ｍｉｍｉｃｒｙ）のため効率的でも高親和性でもなく、それはＨＩＶ Ｅｎｖ反応性および非反応性抗体クローンメンバーの混在につながる。
【００６６】
・広く中和する抗体１ｂ１２、２Ｆ５および２Ｇ１２の生殖細胞系列はそれらの推定される生殖細胞系列抗体と反応しないようである。
・ＡＨＩまたは未感染の対象から分離されたｇｐ４１に結合するＩｇＭ抗体は腸細菌叢にも結合するが、ｇｐ４１陰性ＩｇＭは腸細菌叢抗原に結合しない。
【００６７】
・１ｂ１２の生殖細胞系列は脂質および腸細菌叢と反応し、これはおそらく元々腸細菌叢に対して標的化されていたＢ細胞クローンに由来する既存の多反応性自然抗体産生ナイーブＢ細胞に由来することを暗示している。
【００６８】
・体細胞変異した２Ｆ５、４Ｅ１０および１ｂ１２の広く中和する抗体は全て腸細菌叢全細胞溶解物中の抗原と反応し、これはこれらの抗体がおそらく元々腸細菌叢に対して標的化されていたナイーブＢ細胞のクローンに由来することを示している。
【００６９】
実施例２
ｍＡｂ ＨＶ００２７６と反応する腸細菌溶解物中のタンパク質のバンドの濃縮および同定を図５２に示す。Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥゲル泳動後のウェスタンブロット分析は、ｍＡｂ ＨＶ００２７６が嫌気性および好気性腸細菌溶解物中の約５２０ｋＤａのタンパク質のバンドに結合することを示している。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の後に、約５００ｋＤａの分子量を有する細菌溶解物からのタンパク質画分を集めた。ＳＥＣ画分は、クーマシーブルー（１）、銀染色（２）およびｍＡｂ ＨＶ００２７６によるウェスタンブロッティング（３、矢印）により５２０ｋＤａのタンパク質の濃縮を示す。ｚｏｏｍ等電点分画法は、ｍＡｂ反応性タンパク質のｐＨ６．２〜７を有するゲル区画Ａ４への移動を示す。
【００７０】
濃縮された画分からの５２０ｋＤａのバンドに対して、タンパク質の同定のためにＬＣ−ＭＳ分析を行った。ＲＮＡポリメラーゼβ、β’およびαサブユニットが同定された（図５３）。
【００７１】
大腸菌ＲＮＡポリメーラーゼコアタンパク質およびホロ酵素（コアタンパク質＋σサブユニット）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ウィスコンシン州マディソン）をＮａｔｉｖｅＰＡＧＥゲル上で泳動し、ｍＡｂ ＨＶ００２７６の反応性をウェスタンブロッティングを用いて検出した。コアおよびホロ酵素の両方に対する反応性が検出され、それはｍＡｂ ＨＶ００２７６がＲＮＡポリメーラーゼコアタンパク質に結合することを示している。
【００７２】
大腸菌ＲＮＡポリメーラーゼコアタンパク質（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ウィスコンシン州マディソン）を変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で、還元（Ｒｅｄ）および非還元（ＮＲ）条件下の両方で泳動した（左のパネル）。変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、コアタンパク質の個々のサブユニット（β、β’、αおよびω）を分解し、クーマシーブルー染色の後に可視化することができる（右のパネル）。転写したゲルのウェスタンブロット分析は、２７６ｍＡｂがＲＮＡポリメーラーゼコアタンパク質の３７ｋＤａのαサブユニットにのみ結合することを示している。腸細菌溶解物タンパク質に関して陰性であったＨＶ００５０３ ｍＡｂの反応性がないことは、そのコアタンパク質サブユニットのいずれに関しても観察された。
【００７３】
実施例３
自己寛容がどのようにＨＩＶ−１に対する防御的体液性応答に影響を及ぼす可能性があるかを理解するためには、どの自己抗原がＨＩＶ−１エピトープにより模倣されるのか、およびどこで／いつこれらの自己抗原がＴおよびＢリンパ球に晒されるのかを決定することが重要である。図３０において、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１ ＭＰＥＲのエピトープに特異的なモノクローナルヒト抗体はアセトン固定されたマウス３Ｔ３細胞中に存在する自己抗原とも反応することが示されている。図３１において示されているように、少なくとも４種類の別個の分子がマウス３Ｔ３細胞からビオチン化２Ｆ５抗体により免疫沈降され得る。沈降した主要な種は、おおよそ５０〜５４ｋＤａの見た目の分子量を有する。
【００７４】
保存された哺乳類のタンパク質ＫＹＮＵはコア２Ｆ５エピトープを有し、５１ｋＤａの分子量を有する（図３２）。その２Ｆ５コアエピトープは多くの脊椎動物種のＫＹＮＵ中に存在し（図３３）、ＫＹＮＵの保存されたＨ３ドメイン中に存在している（図３４）。図３５で示したように、ＥＬＤＫＷＡ領域は秩序正しいアルファらせん中にある。ＤＫＷモチーフは表面に露出していない。
【００７５】
２Ｆ５抗体のヒトＫＹＮＵへの結合はＨ３ドメインの歪みを必要とする可能性があり、それは結果として遅くなったＫＯＮをもたらす可能性がある。図３６で示したように、Ｈ３において、ＤおよびＷ残基はおそらく露出した側鎖を有するが、Ｋは埋まっている。２Ｆ５抗体はＥＬＤＫＷＡエピトープに結合するために必然的にＨ３らせんを“歪める”可能性がある。生理的条件下では、ＫＹＮＵはホモ二量体であると考えられる。ＥＬＤＫＷＡモチーフはＫＹＮＵ単量体にとって利用可能である可能性があるが、ＫＹＮＵが２量体を形成した際はアクセス可能でありそうもない（図３７および３８）。
【００７６】
推定上の生殖細胞系列２Ｆ５抗体は、ｒｈＫＹＮＵとも反応する（図３９および４０）。これは、それがＫＹＮＵは最終的に変異した高親和性２Ｆ５抗体を産生したＢ細胞の本来のリガンドである可能性があることを実証している点で、重要な点である。図４１において示したように、２Ｆ５抗体は２Ｆ５エピトープを含有するペプチド（ＤＰ１７８−Ｑ１６Ｌ）と強く反応する一方で、抗ＫＹＮＵ抗体は反応しない（図４２および４３も参照）。
【００７７】
１３Ｈ１１は、２Ｆ５決定基に近位のエピトープを認識する非中和性マウスＨＩＶ−１ ＭＰＥＲモノクローナル抗体であり、ｒｈＫＹＮＵと結合しない（図４４）。図４５は、２Ｆ５および１３Ｈ１１モノクローナル抗体のＨＩＶ−１ ｇｐ４１ ＭＰＥＲへの結合部位を区別する残基のマッピングを提供する。図４６において示したデータは、組換えＨＩＶ−１ ｇｐ１４０ ｅｎｖ（ＪＲＦＬ）、ＤＰ１７８−Ｑ１６Ｌ、および無関係なペプチド抗原Ｒ４Ａによる、２Ｆ５のｒｈＫＹＮＵへの結合の競合阻害を示す。
【００７８】
ＪＲＦＬ組換えＨＩＶ−１ ｇｐ１４０は２Ｆ５のＪＲＦＬへの（同種阻害）、およびｒｈＫＹＮＵへの（異種阻害）結合を比較可能なほどに阻害する（図４７）。その阻害曲線の類似性は、単一の共通のエピトープが２Ｆ５のＪＲＦＬおよびｒｈＫＹＮＵへの結合の両方に寄与していることを示している。
【００７９】
図４８において示したように、２Ｆ５モノクローナル抗体はプレートに結合したｒｈＫＹＮＵおよび可溶性ｒｈＫＹＮＵの両方に比較可能なほどに結合する。表面プラズモン共鳴による研究は、２Ｆ５およびその未変異前駆体がｒｈＫＹＮＵに強く結合することができることを実証している（図４９）。より遅いＫｏｎは、２Ｆ５抗体が最大限の相互作用を達成するために自然なＫＹＮＵの構造を歪めることと一致している。Ｋｏｆｆ速度は非常に遅く、これは結合したＫＹＮＵが全ての２Ｆ５のタイプと安定して相互作用することを示している。
【００８０】
ＳＰＲ結合分析は、２Ｆ５ ｍＡｂおよびそのＲＵＡ（２Ｆ５−ＧＬ１および２Ｆ５−ＧＬ３）がＫＹＮＵに結合することを示している（図５０）。その抗体のそれぞれがヒト抗Ｆｃ（ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ−Ｆｃ）が固定されたセンサー表面上に捕捉され、可溶性ＫＹＮＵが５０、３０、２０、および１０μｇ／ｍＬの濃度で注入された。結合曲線の重ね合わせは、ＫＹＮＵのそれぞれの抗体への特異的な結合を示している。非特異的結合は、ＫＹＮＵへの結合を示さない対照ｍＡｂ（Ｓｙｎａｇｉｓ，抗ＲＳＶ）を用いて測定された。
【００８１】
実施例４
２Ｆ５の固定された３Ｔ３細胞への反応性が、２Ｆ５ ＭＰＥＲコアエピトープ（ＥＬＤＫＷＡ）を含有するタンパク質／ポリペプチドにより阻害され得るかどうかを決定するため、２Ｆ５モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）を増大するモル濃度の同種（ＪＲＦＬおよびＤＰ１７８）または異種（Ｒ４Ａ）阻害剤と反応させた（１時間、２５℃）。続いてこれらの混合物を、メタノール／アセトンで固定した３Ｔ３細胞で覆われた水和された／ブロッキングされたスライドに添加した（２時間、２５℃）。スライドをすすぎ、次いで２５０ｍｌの（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０および０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）中で一夜洗浄した。洗浄されたスライドを、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０および０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中１：４００）で覆った。１時間後、スライドを洗浄し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ中でカバーガラスを乗せた（ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｅｄ）。２４時間後、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ共焦点顕微鏡を２００倍の倍率および固定された３００ｍｓｅｃの露光時間で用いて蛍光画像を得た。
【００８２】
同種阻害剤であるＪＦＲＬタンパク質、およびより低い程度でＤＰ１７８ポリペプチドは、２Ｆ５の３Ｔ３細胞への結合を阻害した。無関係なポリペプチドであるＲ４Ａは阻害を示さなかった（図５１参照）。これらのデータは、２Ｆ５の固定された３Ｔ３細胞に対する反応性の相当量が非特異的脂質結合ではなくタンパク質−タンパク質相互作用により決定されていることを実証している。従って、ＫＹＮＵと同様に、タンパク質は２Ｆ５に関する主要な自己リガンド（ａｕｔｏｌｉｇａｎｄ）であることができる。
【００８３】
実施例５
上記で記述したように、本発明は、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ペプチドまたはポリペプチド）を投与して、第１に広く中和する成熟した抗体を生じることができる未変異祖先抗体を発現するＢ細胞を標的とし、次いでその体細胞成熟を経ているＢ細胞を選択されたＨＩＶエンベロープタンパク質（ペプチドまたはポリペプチド）により追加免疫することにより、Ｂ細胞クローンの成熟を望まれる中和の広さに向けて駆動することを含むワクチン戦略に関する。その戦略の開発には、この成熟経路の再構築が含まれていた。望まれる最終的な（成熟した）抗体を広く中和する抗体を産生する患者から分離し、その抗体を特性付けした。そのそれぞれの推定上の祖先抗体を推定し、実際の抗体として発現させ、何にそれらが結合するかに関する決定を行った。未変異の“祖先”および中間抗体を発現するＢ細胞は、適切なタンパク質（ペプチドまたはポリペプチド）により引き金を引くと親和性が成熟してその患者において観察される広く中和する抗体を分泌するＢ細胞をもたらすであろうと考えられる。
【００８４】
クレードをまたぐ（ｃｒｏｓｓ−ｃｌａｄｅ）中和モノクローナル抗体ＣＨ０１、ＣＨ０２、ＣＨ０３、ＣＨ０４およびＣＨ０５の選択および分離
対象７０７−０１−０２１−９の凍結されたＰＢＭＣから得られたおおよそ３０，０００個の記憶Ｂ細胞をスクリーニングし、ＣＡＰ４５の感染性を５０％より大きく中和する２８の培養物を見つけた（図５６）。モノクローナル抗体ＣＨ０１、ＣＨ０２、ＣＨ０３、ＣＨ０４およびＣＨ０５（ＣＨ０１〜ＣＨ０５）をこれらの培養ウェルの４つから分離した（１−２７−Ｇ２、１−２７−Ｇ１１、１−１９−Ｆｌ０および１−１９−Ｂ７）（図５６）。
【００８５】
スクリーニングの時点で凍結した、ＲＮＡを後で処理した（ＲＮＡ−ｌａｔｅｒ−ｔｒｅａｔｅｄ）記憶Ｂ細胞から得られたＶ重鎖およびＶ軽鎖の増幅および配列決定を実施した。培養物１−２７−Ｇ２および１−１９−Ｆｌ０は１つの対のみ（３〜２０／κ３〜２０；それぞれＣＨ０１およびＣＨ０２モノクローナル抗体）を含有しており、それはその培養物がモノクローナルであったことおよびＣＨ０１およびＣＨ０２が自然抗体であることを示している。逆に、１−２７−Ｇ１１および１−１９−Ｂ７は多数のＶ重鎖およびＶ軽鎖を含有しており、それはその培養物がオリゴクローナルであったことを示している。
【００８６】
これらの後者の培養物からの自然対（ｎａｔｕｒａｌ ｐａｉｒｓ）を同定するため、最初のスクリーニングの時点で集められた単一細胞選別された記憶Ｂ細胞を増幅し、配列決定した。ＣＨ０３およびＣＨ０４（共に３〜２０／κ３〜２０）は、それぞれ培養物１−２７−Ｇ１１および１−１９−Ｂ７から分離された自然対であった。
【００８７】
培養物１−１９−Ｂ７から、その記憶Ｂ細胞をおおよそ４週間の間連続限界希釈によりさらに拡張およびクローニングすることにより、ヒトＢ細胞ハイブリドーマを生成した。この手段により、ＣＨ０４自然抗体を得てＣＨ０５を同定し、それは拡張された記憶Ｂ細胞のより少ない集団により生成され、ＣＨ０４と同じ３〜２０Ｖ重鎖を発現していたが、異なるκ１〜６Ｖ軽鎖と対になっていた。
【００８８】
そのＣＨ０１〜ＣＨ０３モノクローナル抗体は、Ｖ重鎖およびＶ軽鎖の対を２９３Ｔ細胞中に形質移入し、以前に記述されたように(Liao et al, J Virol Methods. 158(1-2):171-9 (2009))ＩｇＧ１主鎖中で発現させることにより得られた。モノクローナル抗体ＣＨ０４およびＣＨ０５は代わりにハイブリドーマＢ細胞株から精製された。
【００８９】
これらのデータは、その戦略が中和するモノクローナル抗体のおおよそ２週間での迅速な同定および１ヶ月もの早さでの自然モノクローナル抗体の産生を可能にすることを実証している。さらに、この方法は、インビボでのレパートリーにおいて表されている自然抗体と違いのないモノクローナル抗体の正確な特性付けに関して、古典的なファージディスプレイライブラリーの不確実性を解決する。最後に、ＨＩＶ−１を広く中和する２種類の自然ヒトＢ細胞ハイブリドーマの生成を初めて報告した。
【００９０】
ＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体のゲノム的特性付け
ＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体は、以下の要因に基づいて全て同じクローンファミリーのメンバーであることが決定された：（１）Ｖ（Ｄ）Ｊファミリー；（２）ＨＣＤＲ３の長さ；（３）ＨＣＤＲ３領域およびｎ−挿入のヌクレオチド配列。
【００９１】
重鎖の分析は、ＣＨ０１〜ＣＨ０５がＩｇＧ１抗体であり、同じＶ３〜２０＊１／Ｊ２＊０１再編成（表３）を共有していることを示した（表３）。それらは同じＤ領域も共有しており、それは３〜１０＊１および２ＯＦ１５＊２／ｉｎｖ領域のＤ−Ｄ融合の結果生じる（表３）。そのＨＣＤＲ３は２６アミノ酸長である（表３）。Ｎ−挿入も同じ長さであり、ヌクレオチド構成を共有しており、それはＣＨ０１〜ＣＨ０５モノクローナル抗体がクローン的に関連しているという考えと一致する（図５７Ａ）。ＣＨ０４およびＣＨ０５のＶ重鎖配列は同じであり（図５７Ａ）、それはＶ軽鎖の末梢での編集が起こる瞬間が妨害されたことを示唆している。
【００９２】
【表３】
【００９３】
そのＶ重鎖を見た限りでは、ＣＨ０１〜ＣＨ０４は同じＶＬκ３〜２０／ＪＬκ１再編成（図５７Ｂ）、同じ長さ（９アミノ酸）のＬＣＤＲ３および類似のｎ−挿入（図５７Ｂ）を共有していた。モノクローナル抗体ＣＨ０５のＶ軽鎖は代わりに無関係であり（図５７Ｃ）、異なるＶＬκ１／ＪＬκ２再編成、ＬＣＤＲ３の長さおよびｎ−挿入を有していた。Ｖ軽鎖のＶＨ３〜２０鎖への対合の基礎をなす生物学は、より大きなＶＬκの数はＪκの位置により近く、従って祖先抗体は最初にＶＬκ３を、次いでＶＬκ１を再編成しなければならなかったと考えられるため、ＶＨ３〜２０／ＶＬκ３〜２０鎖の対（ＣＨＯ１〜ＣＨ０４）がＶＨ３〜２０／ＶＬκ１〜６の対合（ＣＨ０５）に先行したことであると考えられる。さらに、小さい数のＪκの位置は大きい数のＪκの位置より前に来なければならない。従って、ＶＬκ３／ＪＬκ１からＶＬκ１／ＪＬκ２への移行は単純な編集と一致する。最後に、図５８に示した、以下で論じる系統樹は、さらにＶＬκ３／ＪＬκ２の再編成が最初に起こったという非常に強い証拠を提供する。
【００９４】
次に、Ｖ重鎖の系統樹を構築することにより、ＣＨ０１〜ＣＨ０５モノクローナル抗体の遺伝的関係の決定を行った（図５８）。それを行うために、観察された抗体に全体として最尤分析を適用することにより、ＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体の推定上の復帰未変異祖先を推定した。この方法を用いて、位置３２９における１個の沈黙ヌクレオチド置換（ＧまたはＴ）に関してのみ異なる２種類の可能性のあるＲＵＡ（０２１９−ＲＵＡ１および０２１９−ＲＵＡ２）が予想された（図５９）。その推定上のＲＵＡは、それぞれの観察されたモノクローナル抗体を独立して分析することによっても予想された。この方法を用いて、９個のＲＵＡ抗体の候補を同定した：ＣＨ０１に関して１個（ＣＨ０１−ＲＵＡ１）、ＣＨ０２に関して２個（ＣＨ０２−ＲＵＡ１およびＣＨ０２−ＲＵＡ２）、ＣＨ０３に関して４個（ＣＨ０３−ＲＵＡ１、ＣＨ０３−ＲＵＡ２、ＣＨ０３−ＲＵＡ３およびＣＨ０３−ＲＵＡ４）ＣＨ０４に関して２個（ＣＨ０４−ＲＵＡ１およびＣＨ０４−ＲＵＡ２）。全ての算出された推定上のＲＵＡの配列比較を図５９において示す。
【００９５】
Ｖ重鎖の系統樹（図５８）は、ＣＨ０２およびＣＨ０３が互いに遺伝的に近く、ＣＨ０３はそのファミリーの内で最も体細胞変異したモノクローナル抗体であることを示している。
【００９６】
まとめると、これらのデータは、ＣＨ０１〜ＣＨ０５はクローン的に関連した重度に体細胞変異したモノクローナル抗体であり、それらは長いＨＣＤＲ３を共有し、Ｄ−Ｄ融合再編成を有することを示している。さらに、これはヒトにおける末梢での軽鎖の編集の最初の記述である。
【００９７】
ＣＨ０１〜ＣＨ０５モノクローナル抗体は２層ＨＩＶ−１分離株を広く中和し、単量体性ｇｐ１２０／ｇｐ１４０ ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の限られたセットに結合する。
【００９８】
ＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体の中和の広さを、９６種類のＨＩＶ−１初代分離株の集団に対して試験した。その集団は、４種類の１Ａ層分離株、３種類の１Ｂ層分離株（２種類のクレードＢおよび１種類のクレードＡＥ）ならびに１０種類のクレードＡ、２１種類のクレードＢ、２７種類のクレードＣ、４種類のクレードＤ、７種類のクレードＧ、１種類のクレードＡＥ、１種類のクレードＡＤ、９種類のＣＲＦ０１＿ＡＥおよび９種類のＣＲＦ０２＿ＡＧウイルスが含まれる８９種類の２層分離株を含んでいた。
【００９９】
遺伝的分析により予想されたように、ＣＨ０１〜ＣＨ０５は非常に類似した中和のパターンを共有していた（表４）。全ての抗体は多数のクレードからのウイルスを中和し、その中和の広さはＣＨ０１の４４．９％（４３／９６分離株）からＣＨ０２の３４．７％（３３／９５分離株）までの範囲であった。ＣＨ０３、ＣＨ０４およびＣＨ０５はそれぞれ４３．２％（４１／９５）、４３．２％（４１／９５）および４４．２％（４２／９５）の分離株を中和した。１Ａ層分離株を中和した抗体は無かった。１Ｂ層分離株は、ＣＨ０１（３種類の内２種類）、ＣＨ０２およびＣＨ０３（３種類の内１種類）によってのみ中和され、ＣＨ０４またはＣＨ０５によっては中和されなかった。逆に、ＣＨ０１〜ＣＨ０５は２層ウイルスに対してより大きい中和の広さを示した。ＣＨ０１はＣＲＦ０２＿ＡＧ分離株（７／９；７７．８％）を優先的に中和し、クレードＡ（７／１０；７０％）、ＣＲＦ０１＿ＡＥ（５／９；５５．６％）、クレードＢ（９／２１；４２．９％）、クレードＣ（１１／２７；４０．７％）、およびクレードＧ（１／７；１４．３％）分離株が続いた。クレードＤウイルスは中和されなかった。逆に、ＣＨ０１〜ＣＨ０５モノクローナル抗体はＡＥ．ＣＭ２４４．ｅｃ１を強く中和したことを特筆するのは重要である（表４）。１層ウイルスを上回る２層ウイルスの優先的な中和は、以前の研究により中和しやすい１層分離株の広い中和はより中和しにくい２層分離株に対する広さに変換されないことが実証されており、従ってそれらの種類の抗体はＨＩＶ−１の感染の予防または制御において限られた助けにしかならない可能性がある点で重要である。
【０１００】
【表４−１】
【０１０１】
【表４−２】
【０１０２】
【表４−３】
【０１０３】
比較すると、表中に示した最近記述されたＰＧ９およびＰＧ１６ ４次抗体は、それぞれ７３／８３（８８％）および６９／８３（８３．１％）の２層分離株を中和した。興味深いことに、ただ１つの例外（Ｔ２５１−１８）を除き、ＰＧ１６はＰＧ９により中和された分離株の亜集団を中和し、ＣＨ０１〜ＣＨ０５の広く中和する抗体はＰＧ１６により中和されるウイルスの亜集団を中和する。この発見は、ＣＨ０１〜ＣＨ０５のエピトープがＰＧ９／ＰＧ１６のエピトープと関連しているという仮説と一致する。
【０１０４】
次に、ＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体の中和感受性分離株に対する効力を評価した。全体的に、ＩＣ５０の中央値はおおよそ１μｇ／ｍｌであり、ＩＣ５０の平均値は２．４から５．６μｇ／ｍｌまでの範囲であった。ＣＨ０３はＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体の中で最も強い効力を示し、ＩＣ５０の平均値は２．４μｇ／ｍｌ、ＩＣ５０の中央値は０．４６μｇ／ｍｌであり、ＰＧ９のそれら（ＩＣ５０の平均値＝２．１μｇ／ｍｌ；ＩＣ５０の中央値＝０．１１μｇ／ｍｌ）と比較可能であったが、ＰＧ１６のそれら（平均値＝０．６７μｇ／ｍｌ；中央値＜０．０２μｇ／ｍｌ）より弱かった。最も広い中和剤（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｒ）であるＣＨ０１は、それぞれ３．７および１．１μｇ／ｍｌのＩＣ５０の平均値および中央値を示した。ＣＨ０２、ＣＨ０４およびＣＨ０５のＩＣ５０の平均値はそれぞれ４．９、４．７および４．３μｇ／ｍｌ、ＩＣ５０の中央値はそれぞれ０．９７、０．８および０．７９であった。
【０１０５】
伝染した始祖ウイルスを中和する能力は、評価すべき別の重要なパラメーターである。表４で示したように、ＣＨ０１〜ＣＨ０５ ｂＮａｂは３／３（１００％）のクレードＡ、２／９（２２．２％）のクレードＢおよび２／３（６６．７％）のクレードＣの伝染した始祖ウイルスを中和することができた。
【０１０６】
まとめると、これらのデータはＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体のクローンファミリーは伝染した始祖ウイルスを含む多数のクレードからの２層分離株を広く中和することを示している。これは広く中和する抗体のクローンファミリーの最初の報告である。ＣＨ０５の中和のパターンには、そのクローンファミリーの他の広く中和する抗体の中和のパターンと比較して有意な違いがないため、これらの結果は、編集されたＶＬκ１〜６鎖がＶＬκ３〜２０鎖と比較可能なレベルでの試験された分離株の中和を可能にしたことも示している。
【０１０７】
成熟した抗体とは対照的に、推定される推定上のＲＵＡはそのような中和の広さを示さなかった。それでも、少数の分離株しか強く中和されなかった。２４種類の分離株の集団に対して試験した６種類の推定されたＲＵＡの中和プロフィールを表５に示す。ＣＨ０３−ＲＵＡ１、ＣＨ０３−ＲＵＡ４およびＣＨ０３−ＲＵＡ３がＡＥ．ＣＭ２４４．ｅｃｌ分離株をそれぞれ４．４５、５．２６および１８．８μｇ／ｍｌのＩＣ５０で中和したことを特筆するのは重要である。また、Ｂ．ＷＩＴＯ４１６０．３３は試験した全てのＲＵＡにより強く中和された（０．０６から０．４７μｇ／ｍｌまでのＩＣ５０）。Ａ．Ｑ２３．１７分離株も、ＣＨ０１−ＲＵＡ１、ＣＨ０３−ＲＵＡ１、ＣＨ０３−ＲＵＡ３およびＣＨ０３−ＲＵＡ４により０．０２μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０で非常に強く中和された。逆に、ＣＨ０２−ＲＵＡ１およびＣＨ０３−ＲＵＡ２はＡ．Ｑ２３．１７を３桁高いＩＣ５０で中和し、これはＣ．ＺＭ２３３Ｍ．ＰＢ６と同じ中和のパターンを示している。
【０１０８】
【表５】
【０１０９】
ＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体の単量体性ｇｐ１２０／ｇｐ１４０ ＨＩＶ−１エンベロープへの結合。
Ｂ細胞に結合させてＣＨ０１〜ＣＨ０５様抗体の産生を誘発するためにどの単量体性エンベロープをワクチン配合物中で用いることができるかを決定するために、ＣＨ０１〜ＣＨ０５モノクローナル抗体およびＲＵＡを３２種類の単量体性エンベロープの集団への結合に関して試験した。表６は、μＭで表したＥＣ５０を示す。
【０１１０】
【表６】
【０１１１】
単量体性エンベロープへの結合はｇｐ１２０ Ａ２４４ｇＤ＋を除いて弱く、それはＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体により７．８μΜ（ＣＨ０１)から１５０μΜ（ＣＨ０２)までの範囲のＥＣ５０で結合された。加えて、そして広く中和する抗体を分泌することができるＢ細胞の前駆体の選択的標的化と非常に関連して、２種類の推定上のＲＵＡもいくらかの結合を示した（表６）。５種類の成熟した抗体全てにより結合された他のＨＩＶ−１エンベロープは、そのＥＣ５０の平均値はより高かったが、ｇｐ１２０ ＣＭ２４３であった。Ａ２４４（ＣＭ２４４）エンベロープの配列は、Ｌ１２４Ｐ、Ｎ１９６Ｓ、Ｋ１９８Ｅ、Ａ２１２ＰおよびＤ２８４Ｎのａａ置換を除き、ＭｃＣｕｔｃｈａｎら(AIDS Res. Hum. Retrovir. 8(11):1887-1895 (1992))からのものである。加えて、ｇｐ１２０ Ａ１４４（ＣＭ２４４）のＮ末端に、単純ヘルペスウイルスのｇＤタンパク質からの３０ＡＡ配列（ＫＹＡＬＶＤＡＳＬＫＭＡＤＰＮＲＦＲＧＫＤＬＰＶＬＤＱ）が存在する。この配列は、ＨＳＶの侵入および感染に必要なｇＤタンパク質の受容体結合部位を含む(Yoon et al, J. Virol. 77:9221 (2003), Connolly et al, J. Virol. 79:1282-1295 (2005), Campadelli-Fiume et al, Rev. Med. Virol. 17:313-326 (2007))。このＡ２４４ ｇｐ１２０が免疫原として用いられたＲＶ１４４タイワクチン試験において、その対象はＭＮ ｇｐ１２０およびＡ２４４ ｇｐ１２０の両方においてそのｇＤタンパク質に、ＩｇＡ（図６０）およびＩｇＧ（図６１）ｇＤ抗体の両方で応答した。図６２は、ｇＤペプチド中に２個の可能性のある目的の部位が存在することを示しており、それはｇｐ１２０のアルファ４ベータ７結合部位であるＬＰＶおよびＬＤＱを模倣している可能性がある。従って、これは３つの可能性を生じさせる：
１．ｇｐ１２０のａ４ｂ７への結合のためのモチーフはＬＤＶおよびＬＤＩである
ＨＳＶ ｇＤ ＬＰＶおよびＬＤＱ
これは、ｇＤに対する抗体はＨＩＶ ｇｐ１２０のａ４ｂ７への結合を妨害することができるかどうかという疑問を生じさせる。
【０１１２】
２．ＨＳＶ−ｇＤのＬＤＱは、宿主の細胞の受容体のヘパラン硫酸に関する受容体結合部位である(Yoon et al, J.Virol. 77:9221 (2003))。
これは、ｇＤに対する抗体はＨＩＶ Ｅｎｖのヘパラン硫酸への結合を妨害することができるかどうかという疑問を生じさせる。
【０１１３】
３．ＬＤＱは第２のＨＳＶ受容体ＨＶＥＭに関する受容体結合部位でもある。ＬＤＱに対する抗ＨＳＶ抗体応答は、ＨＳＶに対して防御的であることができた(Yoon et al, J.Virol. 77:9221 (2003))。
【０１１４】
従って、抗ｇＤ応答は有効な感染を低減することによりＨＩＶに関して防御的であることができるであろう。
ほとんどの単量体性ｇｐ１２０／ｇｐ１４０エンベロープへの結合の欠如は、ＣＨ０１〜ＣＨ０５が三量体性エンベロープ上で優先的に発現している立体構造感受性の４次抗体に結合することを示している。同様の発見がＰＧ９およびＰＧ１６抗体に関して報告されている(Walker et al, Science 326(5950):285-9 (2009))。逆に、Ａ２４４ｇＤ＋ ｇｐ１２０エンベロープへの強い結合は、ＨＳＶ−１糖タンパク質Ｄの同時発現が機能性エピトープを回復したことを示唆していた。
【０１１５】
ＨＳＶ−１の糖タンパク質ＤのＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体の結合の増進における役割を調べるため、そしてＲＵＡのエンベロープへの結合を標準的なＥＬＩＳＡの検出の閾値より下であるがなお生理学的に関連性がある可能性のあるレベルで検出するため、ＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体およびＲＵＡのＡ２４４ｇＤ＋およびＡ２４４ｇＤ− ｇｐ１２０エンベロープに対する解離定数（ｋｄ）を、表面プラズモン共鳴を用いて測定した（表７）。Ａ２４４ｇＤ＋は一貫してＡ２４４ｇＤ−よりも少なくとも１桁低いｋｄを示したが、さらにもっと重要なことには、全てのＲＵＡがＡ２４４ｇＤ＋ ｇｐ１２０に７９０ｎＭから２６．７ｎＭまでの範囲のｋｄで結合した。これらのデータに関する表面プラズモン共鳴パターンを図６３〜６６に示す。伝染した始祖ウイルス６２４０がＰＧ９にナノモル濃度のＫｄで結合したことは、図６６においても示されている。まとめると、これらのデータは、Ａ２４４ ｇＤ＋エンベロープおよび６２４０伝染始祖エンベロープは天然のＥｎｖ三量体において見出されるｇｐ１２０と類似の立体構造にあり、従って免疫原としての使用に関して正しい立体構造にあるはずであることを示している。
【０１１６】
【表７】
【０１１７】
ＣＨ０１〜ＣＨ０５の広く中和する抗体の自己反応性および多反応性プロフィール。
表８は、ＣＨ０３はＲＮＰ、ヒストンおよびセントロメアＢ自己抗原と自己反応性であることを示している。ＣＨ０３におけるセントロメアに結合する抗体の存在は、ＨＥｐ−２細胞における間接蛍光抗体染色を用いても見出された（図６７）。表１２は、ＣＨ０１〜ＣＨ０５の４種類の非ＨＩＶ抗原への結合（Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイにより測定した）を報告する。そのデータは、ＣＨ０１〜ＣＨ０３が強く多反応性であることを示している。ＣＨ０４およびＣＨ０５の多反応性は、さらに低いレベルにおいてさえもなお検出可能である。逆に、ＰＧ９およびＰＧ１６は多反応性能力を示さなかった。これらのデータは、ＣＨ０１〜ＣＨ０５ならびにＰＧ９およびＰＧ１６抗体の間のそれぞれの発生の生物学における関連する可能性のある違いを指摘する。
【０１１８】
【表８】
【０１１９】
【表９】
【０１２０】
ＣＨ０１〜ＣＨ０５の広く中和する抗体により標的とされるエピトープの特性付け。ＰＧ１６様表現型（ｐｈｅｈｏｔｙｐｅ）
ＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体は、Ｗａｌｋｅｒらにより最近記述された(PLoS Pathog. 6(8).pii:el 001028 (２０１０年８月５日))４次の広く中和するＰＧ９およびＰＧ１６抗体と独特の特徴を共有している。特に、ＣＨ０１〜ＣＨ０５ ｂＮａｂは、以下の４つの基準に基づいて“ＰＧ様”抗体として特性付けられた：（１）ｇｐ１２０タンパク質の位置１６０におけるアスパラギンのリシンへの点変異（Ｎ１６０Ｋ）が、そうでなければ中和感受性である分離株の中和を抑止する（ａｂｒｏｇａｔｅｓ）、（２）そうでなければ中和感受性である分離株の中和が、そのウイルスがマンノシダーゼＩ−阻害剤キフネンシンで処理された細胞中でのそれの産生により部分的に糖鎖除去された際に抑止される、（３）そのエピトープはエンベロープ三量体の状況において優先的に提示されるが、単量体性ｇｐ１２０またはｇｐ１４０エンベロープ上には見付からない、そして（４）スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）がＰＧ９またはＰＧ１６ ｂＮａｂとの高い類似性を示す。ｂＮａｂのＣＨ０１〜ＣＨ０５クローンファミリーの代表として、ＣＨ０１をそれがその４つの基準を全て満たすかどうか決定するために試験した。
【０１２１】
表９は、一群の野生型および変異した分離株（クレードＡ Ｑ２３．１７およびクレードＢ ＪＲ−ＣＳＦ ＪＲＦＬおよび７１６５．１８分離株）に対するＰＧ９およびＰＧ１６の中和活性と比較した、ＣＨ０１の中和活性（ＩＣ５０およびＩＣ８０）へのＮ１６０Ｋ点変異の作用を示す。ＣＨ０１、ＰＧ９およびＰＧ１６は全て野生型Ｑ２３．１７（それぞれＩＣ５０＝０．０１４、０．００２および０．００１μｇ／ｍｌ）およびＪＲ−ＣＳＦ（それぞれＩＣ５０＝０．０７、０．００３および０．００３μｇ／ｍｌ）分離株を強く中和する。Ｑ２３．１７およびＪＲ−ＣＳＦのｇｐ１２０タンパク質中のＮ１６０Ｋ変異の導入は、その３種類の抗体による中和活性の完全な抑止につながる（ＩＣ５０＞５０μｇ／ｍｌ）。また、ＣＨ０１、ＰＧ９およびＰＧ１６はＪＲＦＬおよびその変異体に対して同じ中和パターンを共有している。それらのいずれも野生型のＪＲＦＬを中和しない。位置１６８における単一の変異（Ｅ１６８Ｋ）は正しく適合された（ｃｏｎｆｏｒｍｅｄ）エピトープを再構成し、結果として強力な中和（ＣＨ０１、ＰＧ９およびＰＧ１６に関してそれぞれＩＣ５０＝０．０４４、０．００８および０．００３μｇ／ｍｌ）をもたらすが、それに続くＮ１６０Ｋ変異の導入はＥ１６８Ｋ変異の作用を復帰させ、そのＪＲＦＬ／Ｅ１６８Ｋ／Ｎ１６０Ｋ分離株をその３種類のｂＮａｂ全てに対して中和抵抗性（ＩＣ５０＞５０μｇ／ｍｌ）にする。最後に、７１６５．１８はＣＨ０１（ＩＣ５０＝５．８２μｇ／ｍｌ）およびＰＧ１６（ＩＣ５０＝１１．８μｇ／ｍｌ）により中和されるが、ＰＧ９（ＩＣ５０＞５０μｇ／ｍｌ）によっては中和されず、またもＮ１６０Ｋ変異はＣＨ０１およびＰＧ１６の両方による中和を抑止する。まとめると、これらのデータは、ＣＨ０１の中和活性はＰＧ９およびＰＧ１６と同様にｇｐ１２０における署名（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）Ｎ１６０Ｋ変異により影響を受ける。
【０１２２】
【表１０】
【０１２３】
ＰＧ９およびＰＧ１６の別の特徴は、そうでなければ中和感受性であるウイルスが、そのウイルスを産生するために用いられる２９３Ｔ細胞をキフネンシンで処理した場合に抵抗性になることである。図６８は、２９３Ｔ細胞中で産生されたＹＵ２のＣＨ０１による中和が５０μＭのキフネンシンを用いた処理により見た限りでは無効にされていることを示している。
【０１２４】
上記で記述された単量体性ｇｐ１２０およびｇｐ１４０エンベロープへの限られた結合の広さを有する広く中和する抗体は、そのエピトープが三量体性エンベロープの状況において正しく露出される４次抗体の典型的なものである。
【０１２５】
７種類の別個のモノクローナル抗体のスレッド（ｔｈｒｅａｄｓ）上へのＣＨ０１の重ね合わせは、ＰＧ１６の構造はＨＣ０１の３Ｄ立体構造を予想するのに最も適していることを示した（表１０）。図６９は、ＣＨ０１のＰＧ１６のスレッド上への重ね合わせを示す。ＰＧ９およびＰＧ１６はＨＣＤＲ３領域の独特の形状により特性付けられ、それはその抗体の構造の先端から“ハンマー様の”形状で突き出している(Pancera et al, J. Virol. 84(16):8098-110 (2010))。そのような特徴を有する他の抗体は以前に記述されていなかった。特に、ＣＨ０１の構造は非常に類似しており、その“ハンマー”の“頭部”はＰＧ１６のそれとよく重なり合う（図６９）。ＨＣＤＲ３はＰＧ９およびＰＧ１６よりも短いため、その配列はいくつかの部分で異なっており、これはＣＨ０１〜ＣＨ０５抗体およびＰＧ９／ＰＧ１６の間の異なる反応性の広さの構造的説明である可能性がある。
【０１２６】
【表１１】
【０１２７】
４次抗体の興味深い特徴は、それらがＣＤ４ｉ抗体と同じ方法でチロシン硫酸化され得ることである(Huang et al, PNAS 101(9):2706-2711 (2004) Epub ２００４年２月２３日、およびPejchal et al, PNAS 107(25):11483-8 (2010))。チロシン硫酸化予想プログラムである“ｓｕｌｆｉｎａｔｏｒ”を用いて実施されたＣＨ０１の配列分析は、硫酸化されそうな１個のチロシンを予想した（ＡＲＧＴＤＹＴＩＤＤＡＧＩＨＹＱＧＳＧＴＦＷＹＦＤＬ）（表１１）。（ＣＨ０１が１−２７−Ｇ２と呼ばれていることに注意。）
【０１２８】
【表１２】
【０１２９】
まとめると、これらのデータは、ＣＨ０１〜ＣＨ０５ ｂＮａｂがｇｐ１２０のＶ２領域を含む４次エピトープを認識するＰＧ様の抗体であるという考えを強く支持している。
要約すると、上記で示したデータは以下のことを実証している：（１）ファージディスプレイライブラリーを生成する必要のない自然抗体の迅速な同定および分離を可能にする戦略を開発した；（２）５種類のクローン的に関連する広く中和する抗体のファミリーを記述し、それらの発達を追跡した；（３）ヒトにおける末梢での受容体の編集の予備的な証拠を提供した；（４）以前に記述されたＰＧ９およびＰＧ１６の広く中和する抗体に遺伝的に関連しない、ＰＧ様ファミリーの広く中和する抗体の新規のメンバーを記述した；そして（５）１個より多くのモノクローナル抗体が入手可能である場合に推定上の復帰未変異祖先の予想の正確さを増大するための方法を開発した。
【０１３０】
４次Ｖ２、Ｖ３抗体の誘導のための免疫原の設計に関して、実施例５において、単純ヘルぺスのｇＤの配列を有するｇｐ１２０ Ｅｎｖ Ａ２４４は、Ｖ２、Ｖ３の立体構造決定的な（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）広く中和するＡｂ ＰＧ９、ＰＧ１６、ＣＨ０１〜ＣＨ０５に十分に結合することができ、ＣＨ０１、０２および０３抗体の復帰未変異祖先にも結合することができることが実証された。さらに、６２４０伝染始祖ＥｎｖはＰＧ９、およびＰＧ１６ ｍａｂに十分に結合することができる。従って、Ｖ２、Ｖ３の広く中和する抗体の誘導のための強力な免疫処置計画は、Ｎ末端においてｇＤ配列を有するＡ２４４ ｇｐ１２０エンベロープで数回（例えば１〜３回）予備刺激し、次いで例えば６２４０伝染始祖ｇｐ１４０で（例えば１〜３回）全身的に（例えばＩＭまたは皮下で）または粘膜に（例えば鼻内に、舌下に（ｓｕｂｌｉｎｇｕａｌｙ）、膣内に、または直腸に）のどちらかで追加免疫することである。Ａ２２４ ｇｐ１２０中のＨＳＶ受容体結合領域の免疫原性を考えれば、そのｇＤペプチドを含有するこのコンストラクトはＨＳＶワクチンコンストラクトにも用いることができる。同様に、あらゆるＨＩＶ−１エンベロープのＮ末端に類似の方法で挿入されたそのｇＤペプチドは、１型および２型単純ヘルペスウイルスに対する防御抗体を誘導するために用いることができる。
【０１３１】
上記で引用されたすべての文献および他の情報源を、本明細書にそのまま援用する。
【図２７−１】
【図２７−２】
【図２７−３】
【図２８−１】
【図２８−２】
【図５７Ａ】
【図５７Ｂ】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１６Ｄ】
【図１６Ｅ】
【図１６Ｆ】
【図１７】
【図１８】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図２０】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２２】
【図２３】
【図２４Ａ】
【図２４Ｂ】
【図２５】
【図２６】
【図２９−１】
【図２９−２】
【図２９−３】
【図２９−４】
【図２９−５】
【図２９−６】
【図２９−７】
【図２９−８】
【図２９−９】
【図２９−１０】
【図２９−１１】
【図２９−１２】
【図２９−１３】
【図２９−１４】
【図２９−１５】
【図２９−１６】
【図２９−１７】
【図２９−１８】
【図２９−１９】
【図２９−２０】
【図２９−２１】
【図２９−２２】
【図２９−２３】
【図２９−２４】
【図２９−２５】
【図２９−２６】
【図２９−２７】
【図２９−２８】
【図２９−２９】
【図２９−３０】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０−１】
【図５０−２】
【図５１】
【図５２−１】
【図５２−２】
【図５３Ａ】
【図５３Ｂ】
【図５３Ｃ】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７Ｃ】
【図５８】
【図５９−１】
【図６０】
【図６１】
【図６２】
【図６３】
【図６４】
【図６５】
【図６６】
【図６７】
【図６８】
【図６９−１】
【図６９−２】
【公表番号】特表２０１３−５２０４９８（Ｐ２０１３−５２０４９８Ａ）
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５５００３（Ｐ２０１２−５５５００３）
【出願日】平成２３年２月２５日（２０１１．２．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０００３５２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０６１００
【国際公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【出願人】（５１１０４３９６５）デューク ユニバーシティー (9)
【氏名又は名称原語表記】ＤＵＫＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月２５日（２０１１．２．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０００３５２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０６１００
【国際公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【出願人】（５１１０４３９６５）デューク ユニバーシティー (9)
【氏名又は名称原語表記】ＤＵＫＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
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