電気触媒性インターカレーターを用いる核酸の決定
核酸の電気化学的検出のための組成物および方法が開示される。組成物は、２本鎖の核酸に結合して核酸を酸化する電気触媒性インターカレーターを備える。試料中の核酸の検出方法は、電気触媒性インターカレーターによって結合する２本鎖の核酸を形成する工程を含み、インターカレーターは電極表面で核酸の酸化を触媒する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は概して、電気触媒性インターカレーターを用いて核酸を検出するためのバイオセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸系バイオセンサーは、遺伝子型決定から分子診断にわたり潜在的適用を有する。蛍光法は、特異的核酸配列および遺伝子発現を分析するための高密度核酸アレイを与える。これらのアレイは広く採用されてはいるが、標的核酸試料の標識を必要とする。したがって、電気化学的伝達法が核酸ハイブリダイゼーション事象の超高感度検出のために提案されている。蛍光の代わりに電気化学法を使用することで、より単純でより小さい検出器が可能になりうる。核酸を選択的かつ高感度で直接検出できることが、電気化学的研究の主な目標である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、本発明者らは、試料中の核酸を検出するためのバイオセンサーに新しいアプローチを案出することに成功した。このアプローチは、超高感度核酸検出に使用するために新規な核酸インターカレーターを合成および分析応用することに基づく。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
種々の実施形態において、本発明は下記式Ｉのコア化合物を提供する。
Ｌ１−Ｄ−Ｌ２
（Ｉ）
式中、Ｄは２価の環状基である。Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、約３から約２０個の非水素原子、脂肪族アミノ基、および窒素部分を有する有機アミンを備える連結基である。
【０００５】
さらなる実施形態において、本発明は、式ＩＩの遷移金属化合物に結合した式Ｉのコア化合物を備える電気触媒性インターカレーターも提供する。
【０００６】
【化１】
式中、Ｍは、窒素に配位結合を形成することができる金属元素である。ＲおよびＲ’は、それらの窒素原子でＭに配位した窒素含有有機部分である。Ｚはハロゲン原子であり、ｍは＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、または＋６である。Ｘは、ｍとバランスを保つアニオンまたは複数のアニオンの組合せである。好ましい実施形態において、金属元素はルテニウムである。
【０００７】
種々のさらなる実施形態において、本発明は、前記電気触媒性インターカレーターの調製方法も提供する。この方法は、式Ｉのコア化合物に式ＩＩの遷移金属化合物を接触させることにより、コア化合物と遷移金属化合物との間に金属から窒素への配位結合を形成する工程を備える。
【０００８】
本発明は、前記電気触媒性インターカレーターを利用した核酸の電気触媒的検出方法をさらに提供する。種々の実施形態において、電気触媒性インターカレーターが複合体に挿入されるように、電気触媒性インターカレーターに標的核酸を含む複合体が接触する。
【０００９】
さらなる実施形態において、本発明は電気触媒性インターカレーターを備えるキット、および当該電気触媒性インターカレーターを核酸の電気触媒的検出に利用するバイオセンサーにも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明により、核酸の塩基対の間に挿入され、電気化学的増強後にヌクレオチドの酸化を触媒する新規な電気触媒性インターカレーターを本出願者らは発見した。本発明のインターカレーターは、このインターカレーターの電気触媒的性質に寄与する様々な部分を備える。本出願者らは、２本鎖の核酸への本発明の電気触媒性インターカレーターの選択的組込み、および効率的な電気触媒が、標的核酸を高感度で無標識決定または検出するための一般的なプラットフォームをもたらすことを発見した。
【００１１】
例えば、複数の縫込み型インターカレーターは、２本鎖の核酸と可逆的に相互作用する重要な化合物の群である。縫込み型インターカレーターは、例えば２本鎖のＤＮＡの塩基対間に挿入されて結合する平面多環芳香族系の存在などの構造上の共通な特徴を有している。特定の理論に縛られるわけではないが、２本鎖の核酸への本願の電気触媒性インターカレーターの挿入後に、電気触媒性インターカレーターがヌクレオチドを酸化し、電子がヌクレオチドからバイオセンサー／電極に移動する電子流が電極で検出される。本発明の有用性、機能、または組成物を限定することなしに、電気触媒性インターカレーターは、電気化学的増強後にヌクレオチドを酸化する。触媒サイクルでは、インターカレーターは電極によって酸化され、酸化したインターカレーターはヌクレオチドから電子を除去してラジカルカチオンを形成することができ、ラジカルカチオンは脱プロトンしてさらなる反応を受ける。このように、本反応は触媒的であり、核酸から直接電子を除去する一連の反応によって核酸の消費を導き、電極に電子が移動する結果として検出可能な電流が生じる。
【００１２】
位置実施形態において、本発明は、式（Ｉ）に対応する構造を有するコア化合物を提供する。
Ｌ１−Ｄ−Ｌ２
（Ｉ）
式（Ｉ）において、Ｄは１つまたは複数の置換基を有することができる２価の環状基を表す。好ましくは、この２価の環状基は平面環状基を備える。２価の環状基の非限定的な例としては、２つの窒素原子に２つの結合部位を有するナフタレンジイミド基、２−および６−位または１−および５−位（好ましくは２−および６−位）に２つの結合部位を有するアントラセン基、アントラセン基と同様に２つの結合部位を有するアントラキノン基、２−および６−位に２つの結合部位を有するフルオレン基、２−および６−位に２つの結合部位を有するビフェニレン基、２−および７−位に２つの結合部位を有するフェナントレン基、ならびに２−および７−位に２つの結合部位を有するピレン基が挙げられる。好ましい環状基は、窒素原子に２つの結合を有するナフタレンジイミド基である。２価の環状基の置換基の非限定的な例は、ハロゲン原子（例えば、塩素（Ｃｌ）または臭素（Ｂｒ））、またはメチル、エチル、もしくはｎ−プロピルなどの１〜６個の炭素原子を有するアルキル基である。
【００１３】
好ましい実施形態において、Ｄは核酸インターカレーターである。インターカレーターは、例えば、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドなどの２本鎖の核酸の塩基対間に滑込むことができる分子である。好ましくは、インターカレーターはナフタレンジイミド基を備える。好ましい実施形態において、インターカレーターは１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物を備える。
【００１４】
上記式（Ｉ）において、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、約３から約２０個の非水素原子、脂肪族アミノ基を有する有機アミンを備える連結基であり、該連結基は、金属から窒素への配位結合をもたらすことができる窒素部分をさらに備えている。好ましい実施形態において、窒素部分は、少なくとも１つの窒素原子を含む複素環である。適切な窒素部分の非限定的な例としては、イミダゾール、ベンゾイミダゾール、ピロール、ピラゾール、トリアゾール、ベンゾトリアゾール、ピリジン、ピリダジン、ピラジン、ピリミジン、およびトリアジンが挙げられる。複素環の窒素の１つは、金属と配位結合を形成することができる。好ましい窒素部分はイミダゾールである。窒素部分が複素環であるとき、脂肪族アミノ基は、環に結合したアルキル基上に好ましくは保持される。アルキル基は直鎖でも分岐でもよく、一般に約１から約２０個の炭素、好ましくは約２から約１２個、さらに好ましくは約３個から約６個の炭素原子を含む。好ましい連結基は３−アミノプロピルイミダゾールである。
【００１５】
別の実施形態において、上記式（Ｉ）に対応する構造を有する化合物は電気触媒性インターカレーターの一部である。好ましい実施形態において、電気触媒性インターカレーターは、式（ＩＩ）の遷移金属化合物に結合した式（Ｉ）の化合物を備えている。
【００１６】
【化２】
式中、Ｍは窒素への配位結合を形成する金属元素である。ＲおよびＲ’は、それらの窒素原子でＭに配位した窒素含有有機部分である。Ｚはハロゲン原子であり、ｍは＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、または＋６である。Ｘは、ｍとバランスを保つアニオンまたは複数のアニオンの組合せである。
【００１７】
式ＩＩにおいて、Ｍとしての使用に適切な金属元素としては、例えば、ルテニウム（Ｒｕ）、オスミウム（Ｏｓ）、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、ロジウム（Ｒｈ）、レニウム（Ｒｅ）、白金（Ｐｔ）、スカンジウム（Ｓｃ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、カドミウム（Ｃｄ）、マグネシウム（Ｍｇ）、銅（Ｃｕ）、コバルト（Ｃｏ）、パラジウム（Ｐｄ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、ニッケル（Ｎｉ）、モリブデン（Ｍｏ）、タングステン（Ｗ）、イリジウム（Ｉｒ）、およびその混合物が挙げられる。好ましい実施形態において、金属元素Ｍは遷移金属ルテニウム（Ｒｕ）である。
【００１８】
式ＩＩのＲおよびＲ’は同一または異なることがあり、それらの窒素原子で金属元素に配位している。Ｒ、Ｒ’、またはその両方は、例えば２，２’−ビピリジル；Ｃ１〜Ｃ４アルキル、フェニル、および１つまたは複数のＣ１〜Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換された２，２’−ビピリジル；１，１０−フェナントロリニル；ならびにＣ１〜Ｃ４アルキル、フェニル、および１つまたは複数のＣ１〜Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換された１，１０−フェナントロリニルでもよい。好ましくは、ＲおよびＲ’の少なくとも１つは２，２’−ビピリジルである。
【００１９】
別の実施形態において、ＲおよびＲ’の少なくとも１つおよび好ましくは両方が、２，２’−ビピリジルまたは１，１０−フェナントロリニルであり、それらのいずれも任意で置換されてもよい。ビピリジルまたはフェナントロリニルが置換されているとき、置換基は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、フェニル、およびＣ１〜Ｃ４アルキルでさらに置換されたフェニルからなる群から好ましくは選択され、さらに好ましくはＣ１〜Ｃ２アルキル基である。置換されたビピリジルおよびフェナントロリニル配位基は、一置換でもよいし、二置換以上でもよい。種々の実施形態において、例えば４，４’−二置換−２，２’−ビピリジル、５，５’−二置換−２，２’−ビピリジル、１，１０−フェナントロリニル、４，７−二置換−１，１０−フェナントロリニル、および５，６−二置換−１，１０−フェナントロリニルを含む二置換配位基を使用することができる。
【００２０】
ＲおよびＲ’の一方だけがビピリジルまたはフェナントロリニルであるか、上述した任意で置換された基の１つであるとき、好ましくは、他方は、金属Ｍと配位結合を形成することができる２つの窒素原子を含む脂肪族配位子から選択される。非限定的な例としては、１，３−プロパンジアミン、１，４−ブタンジアミン、およびそのいずれかの誘導体が挙げられ、誘導体は、窒素から金属Ｍへの配位結合も、その複合体の電気化学的活性も妨害しないアルキル、アリール、または他の基で任意に置換された１，３−プロパンジアミンまたは１，４−ブタンジアミン骨格に基づく。
【００２１】
式ＩＩにおいて、Ｚはハロゲン原子である。好ましい実施形態において、Ｚは塩素または臭素であり、さらに好ましくは塩素である。上付文字ｍは、Ｍの酸化状態に応じて＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、または＋６である。好ましい実施形態において、例えばＭが酸化状態＋４のルテニウムであるとき、Ｚは塩素であり、ｍは＋３である。Ｘはカチオンの形式電荷ｍとバランスを保つアニオンまたは複数のアニオンの組合せである。例えば、Ｘは、非限定的に塩素、臭素、ヨウ素、フッ素、テトラフルオロボレート、過塩素酸、硝酸、硫酸、炭酸、または亜硫酸でもよい。
【００２２】
好ましい実施形態において、本発明の電気触媒性インターカレーターは、式（ＩＩ）の化合物に結合した式（Ｉ）の化合物を備えており、式中、Ｄは１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物であり、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ３−アミノプロピルイミダゾールであり、Ｍはルテニウムであり、ＲおよびＲ’はそれぞれ２，２’−ビピリジルであり、Ｚは塩素である。さらに好ましくは、本発明の電気触媒性インターカレーターは、下記式を備える。
【００２３】
【化３】
本発明は、上記電気触媒性インターカレーターの調製方法も提供する。本発明の好ましい方法では、電気触媒性インターカレーターは、一般式（Ｉ）のコア化合物および一般式（ＩＩ）の遷移金属化合物の間の配位子交換によって調製される。本願に記載された遷移金属化合物は、金属との安定な複合体の形成を助け、配位子交換条件下で連結基Ｌ１またはＬ２によって置換可能なフィラー配位子Ｚを備えている。好ましい連結基は、金属に対して金属から窒素への配位結合をもたらす窒素部分を備えている。好ましい実施形態において、金属はルテニウムであり、Ｚは塩素であり、連結基は３−アミノプロピルイミダゾールである。
【００２４】
本発明の電気触媒性インターカレーターを、試料中の標的核酸を検出するために使用することができる。非限定的な例では、核酸およびその電気触媒性インターカレーターを備える複合体が電極などの固体支持体の表面に形成され、電子移動が検出される。本発明によると、電気触媒性インターカレーターは、相補性プローブ分子にハイブリダイズした標的核酸を含む２本鎖の核酸の塩基対の間に挿入される。本発明のメカニズム、機能、または有用性を限定することなしに、当該方法はヌクレオチドの電気化学的酸化を利用している。電気触媒性インターカレーターは、２本鎖の核酸への挿入の際に、および適切な電気化学的増強の際に、ヌクレオチド、好ましくはグアニンを酸化することができる。特定の理論に縛られるわけではないが、触媒サイクルでは、インターカレーターは電極によって酸化され、酸化したインターカレーターはヌクレオチドから電子を除去してラジカルカチオンを形成することができ、ラジカルカチオンは脱プロトン化してさらなる反応を受ける。この反応は触媒的であり、核酸から直接電子を除去する一連の反応によって核酸の消費を導いて電極に電子が移動する結果として、検出可能な電流が生じる。
【００２５】
一実施形態において、標的核酸および電気触媒性インターカレーターを備える複合体は、電極表面に固定されているか電極表面に結合可能なプローブとの標的核酸のハイブリダイゼーションによって電極の表面に形成されている。適切なプローブは、標的核酸の特異的配列に相補性の１本鎖領域を含む核酸を備えることができる。検出される標的核酸は核酸を含むことができ、該核酸は特定された１本鎖もしくは２本鎖であるか、または２本鎖および１本鎖配列の両方の部分を含むことができる。標的核酸が２本鎖の核酸のみを含むとき、相補性プローブへの標的核酸のハイブリダイゼーション前に変性が必要であることが認識されている。
【００２６】
標的核酸はＤＮＡ（ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれか）、ＲＮＡ、またはハイブリッドでもよく、核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組合せ、ならびに例えばウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなどを含む塩基の任意の組合せを含む。例えばハイブリダイゼーションにより標的核酸がプローブに結合することができる。
【００２７】
一般に、プローブは、例えばＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、または発現配列タグ（ＥＳＴ）を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。プローブをＤＮＡまたはその断片から得ることができ、生体からの抽出、制限酵素による開裂、電気泳動による分離、および熱処理またはアルカリ処理による変性によってプローブを得てもよい。プローブを化学合成することもできる。プローブ鎖中のグアニンの代用であろう（すなわち、グアニンのように、核酸２本鎖中の他の塩基よりもシトシンに対してより大きな結合親和性を有する塩基である）が、適用可能な反応条件下で電気触媒性インターカレーターによって酸化しないであろう代替塩基を使用してプローブを合成することも可能である。当該代替塩基の例としては、イノシンおよび７−デアザ−グアニンが挙げられる。
【００２８】
プローブの調製に適した塩基を、天然の、非天然の、または「合成」のヌクレオチド塩基から選択することができる。天然のヌクレオチド塩基は、例えばアデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、およびチミンでもよい。プローブは、７−デアザ−グアニン、８−オキソ−グアニン、６−メルカプトグアニン、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシエチル）ウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノ−メチル−２−チオリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチルプソイドウリジン、β−Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルプソイドウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、β−Ｄ−マンノシルキュェオシン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルチオプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチルカルバモイル）トレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、キュェオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、２−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、ワイブトシン、および３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジンなどの非天然の、または「合成」のヌクレオチド塩基から調製されてもよい。ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭素環などの修飾糖、ならびにフルオロおよびメトキシなどの２’置換を含む糖を含む任意のオリゴヌクレオチド主鎖が採用されてもよい。オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間の架橋リン酸残基の少なくとも１つまたは全てが、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデート、およびホスホルアミデートなどの修飾されたリン酸であるオリゴヌクレオチドでもよい（例えば１つおきのヌクレオチド間架橋リン酸残基が、記載されたように修飾されてもよい）。オリゴヌクレオチドは、参照によって本願に援用されるＰ．ニールセン（Ｐ．Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４、１４９７〜１５００（１９９１）に記載されているような「ペプチド核酸」でもよい。唯一必要なのは、少なくとも一部がＤＮＡ試料の配列の公知の部分に結合可能な配列をオリゴヌクレオチドプローブが有すべきであるということである。標的核酸試料に、異なる塩基配列を有するいくつかのオリゴヌクレオチドプローブを接触させることが一部の適用では理想的なことがある（例えば、試料中に２つ以上の標的核酸が存在する場合、または「サンドイッチ」アッセイにおいて単一標的核酸が２つ以上のプローブにハイブリダイズしている場合）。
【００２９】
プローブ分子は電極に固定化されてもよい。好ましい実施形態において、プローブは金属電極に結合する。しかし、当業者は、当業界で公知のいくつかの技法によってプローブを電極に固定化することができることを理解するだろう。文献の手順を採用して、本発明に係る使用のために、電極の表面上にプローブを固定化するための様々な技法を利用することができ、それらの技法は当業者に公知である。
【００３０】
非限定的な例において、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドなどのプローブ分子の５’−または３’−末端（５’−末端が好ましい）にチオール基が結合することができ、結合したチオールは電極の金原子に配位する。ＤＮＡにチオール基を組み込むための方法は、参照によって本願明細書に援用されるＭ．マエダ（Ｍ．Ｍａｅｄａ）ら、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１８０５〜１８０６（１９９４）およびＡ．コノリー（Ａ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１３、４４８４（１９８５）に記載されている。この固定方法では、チオール末端を有するプローブ分子が金電極上に滴下されて低温で２、３時間放置された後、所望のプローブ分子が電極上に固定される。
【００３１】
ガラス状炭素電極の使用などの別の非限定的な例において、電極は過マンガン酸カリウムによって酸化され、電極の表面上にカルボキシル基が生成される。アミド結合が形成されてガラス状炭素電極の表面上にプローブ分子が固定されるように、カルボキシル基を有する表面上に、チオール末端を有するプローブ分子が滴下される。この方法の詳細は、参照によって本願に援用されるＫ．Ｍ．ミラン（Ｋ．Ｍ．Ｍｉｌｌａｎ）ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６５、２３１７〜２３２３（１９９３）に記載されている。
【００３２】
認識対がプローブの電極への結合に使用されてもよい。これについて、プローブが修飾されて該プローブが認識対の第１メンバーを備え、電極表面が第２メンバーで被覆されてもよい。したがって、プローブ／標的核酸ハイブリッドを備える２本鎖の核酸が、認識対の第１および第２メンバーの相互作用を介して電極の表面に形成されてもよい。認識対および様々な分子へのそれらの結合は、当技術分野において公知である。非限定的な例では、認識対はビオチンおよびアビジンからなる。
【００３３】
インターカレーターの添加前に、またはインターカレーターの存在下でプローブへの標的核酸のハイブリダイゼーションが行われてもよい。好ましくは、インターカレーターは数ｎＭから数ｍＭの濃度で使用される。当業者に公知の任意の適切な方法で標的核酸試料にプローブが接触してもよい。例えば、標的試料を溶液に溶解し、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、標的試料を有する溶液にプローブを溶解することによって、標的試料をプローブに接触させることができる。適切な条件は当業者に十分に公知であり、その条件として様々な塩濃度条件が挙げられる。あるいは、固体支持体上に固定化されたプローブを有する溶液に標的試料を溶解してもよく、標的試料を含有する溶液に、オリゴヌクレオチドプローブが固定化された固体支持体を浸漬することによって、標的試料にプローブが接触してもよい。プローブ分子と標的核酸とのハイブリダイゼーションは、電極への電位の適用および電流の検出の際に決定される。
【００３４】
プローブ分子に部分的に相補性である標的核酸断片試料を検出するためにもまた、本発明の電気触媒性インターカレーターを採用可能である。当該断片試料は「ミスマッチ断片」と一般に称される。ミスマッチしている可能性のある標的核酸断片の検出で得られたピーク電流強度を、完全な相補性を有する標的核酸断片（すなわち完全マッチ断片）の検出で得られた対応するピーク電流強度と比較することによって、ミスマッチ断片を検出することができる。
【００３５】
当業者に公知の任意の適切な手段により、酸化および還元を伴う触媒サイクルが検出されてもよい。酸化還元反応に関連する電気信号の検出により、ハイブリダイズしたプローブ／標的核酸の存在または不在の決定が可能になる。任意の適切な手段により、反応速度を測定する工程が行われてもよい。例えば、走査速度、プローブ濃度、標的濃度、メディエータ、緩衝液、温度、および／または電気化学的方法の関数として電流を比較することによって、相対反応速度が決定されてもよい。
【００３６】
当業者に公知の適切な手段により、酸化還元反応速度が測定されてもよい。典型的には、酸化還元反応の発生に関連する電気信号を測定することによって、酸化還元反応速度は測定される。例えば、検出電極と電気的に接続された適切な装置が提供されることによって、酸化還元反応に関連する電気信号が測定されてもよい。適切な装置は、ハイブリダイズしたプローブ／標的核酸と電気触媒性インターカレーターとの反応の酸化還元反応速度を測定するために発生した電気信号を測定することができるであろう。この電気信号は、サイクリックボルタンメトリー、ノーマルパルスボルタンメトリー、クロノアンペロメトリー、および矩形波ボルタンメトリーを含む任意の電気化学的方法の特性を有してもよく、サイクリックボルタンメトリーが現在好ましい形式である。
【００３７】
好ましい実施形態において、本方法は遺伝子診断に使用される。例えば、ｐ５３に対する遺伝子などの標的分析物の配列を決定するためにオリゴヌクレオチドプローブを使用することができ、遺伝子は様々な癌に関連する遺伝子である。他の非限定的な例としては、非ポリポーシス性結腸癌の遺伝子、ＢＲＣＡ１乳癌遺伝子、患者の容易な発症前スクリーニングを可能にする、アルツハイマー病のより大きなリスクを示すＡｐｏ Ｅ４遺伝子、嚢胞性線維症遺伝子の突然変異、または当技術分野で十分に公知のその他の任意のものが挙げられる。
【００３８】
その他の種々の実施形態において、本発明の電気触媒性インターカレーターを用いて、ウイルスおよび細菌の検出が可能である。この実施形態において、プローブは、様々な細菌およびウイルスから標的配列を検出するように設計される。本願に開示された方法は、臨床試料を直接スクリーニングして例えばＨＩＶ核酸配列を検出可能にする。さらに、これは、抗ウイルス療法の有効性を評価する改良法として、患者内で循環するウイルスの直接モニタリングを可能にする。同様に、白血病に関連するウイルス、ＨＴＬＶ−Ｉ、およびＨＴＬＶ−ＩＩが、このように検出されてもよい。結核などの細菌感染が検出されてもよい。
【００３９】
他の実施形態において、例えば水試料および食品試料のスクリーニングでの有毒細菌用のプローブが使用されてもよい。例えば、試料が処理されて細菌が溶解し、その細菌の核酸が放出され、次にサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）腸毒性株およびレジオネラ症細菌などの病原株を非限定的に含む細菌株を認識するプローブが設計されてもよい。同様に、本発明の組成物を使用してバイオレメディエーション戦略が評価されてもよい。
【００４０】
他の実施形態において、プローブは法医学のために使用可能であり、このとき、ＤＮＡフィンガープリントを使用して、ＤＮＡなどの犯罪現場の標的核酸を、被害者および容疑者から採取した試料と照合することができる。
【００４１】
標的核酸の供給源として、例えばヒト、動物、植物、または環境を挙げることができる。
他の実施形態において、本発明は、電気触媒性インターカレーターを備えるキットにも関する。キットは、検出される標的核酸を認識して結合することができる、本願に記載されたものなどのプローブをさらに備えることができる。
【００４２】
種々の他の実施形態において、本発明はさらに、本願に記載された電気触媒性インターカレーターを利用するバイオセンサーに関する。バイオセンサーは、装置を備えてもよいし、１つもしくは複数の電気触媒性インターカレーターによって発生する信号を検出および測定するのに必要な構成要素を備えるシステム中で使用されてもよい。装置は、電源および検出器に結合したバイオセンサーアレイを含む集積回路を備えることができる。このような集積回路は当業者に公知である。バイオセンサーアレイを備えるシステムは、作用電極に電位が印加された後の電気化学信号を測定するための手段を追加的に含んでもよい。
【００４３】
本願に記載された方法および装置は、当業者に十分に公知の検査法を利用し、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、２００１；スペクター（Ｓｐｅｃｔｏｒ），Ｄ．Ｌ．ら、Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９９８；およびハーロー（Ｈａｒｌｏｗ），Ｅ．、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９９９などの検査マニュアルに見出され得る。
【００４４】
本願に記載された方法および装置は、当業者に十分に公知の検査法を利用し、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、２００１；スペクター（Ｓｐｅｃｔｏｒ），Ｄ．Ｌ．ら、Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９９８；およびハーロー（Ｈａｒｌｏｗ），Ｅ．、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９９９などの検査マニュアルに見出され得る。
【００４５】
本願に使用された（[背景技術]および[発明の開示]などの）項目名は、本発明の開示内の表題の一般的な編制だけを意図しており、本発明の開示もその任意の態様も限定することを意図しない。特に、[背景技術]に開示された主題は、本発明の範囲内の技法の態様を含むことがあり、従来技術の詳述を構成しないことがある。[発明の開示]に開示された主題は、本発明の範囲全体またはその任意の実施形態の網羅的または完全な開示ではない。
【００４６】
本願における参照の引用は、これらの参照が従来技術であるという承認を与えず、本願に開示された本発明の特許性に何ら関連しない。本願に引用された全ての参照は、参照によってその全体が本願に援用される。
【００４７】
本説明および具体的な実施例は本発明の実施形態を示しているが、例示目的のみを意図しており、本発明の範囲を制限することを意図しない。さらに、述べられた特徴を有する多数の実施形態の詳述は、追加の特徴を有する他の実施形態および述べられた特徴の異なる組合せを組み込んでいる他の実施形態を除外することを意図しない。具体的な実施例は、本発明の組成物および方法をどのように製造、使用、および実行するかの例示的な目的で提供され、別に明確に述べない限り、本発明の与えられた実施形態が製造または試験されたか、またはされなかったという表現であることを意図しない。
【００４８】
本願で使用されるように、単語「好ましい」および「好ましくは」は、ある状況である利益を与える本発明の実施形態を指す。しかし、同じ状況または他の状況で他の実施形態もまた好ましいことがある。さらに、１つまたは複数の好ましい実施形態の詳述は、他の実施形態が有用ではないことを意味せず、本発明の範囲から他の実施形態を除外することを意図しない。
【００４９】
本発明で使用されるように、単語「含む」およびその変形は、非限定的であることを意図するためであり、リストにある項目の詳述は、本発明の材料、組成物、デバイス、および方法に同様に有用でありうる他の類似の項目を除外することではない。
【００５０】
以下の説明において、用語「決定」または「検出」は、試料中の核酸の定性的および定量決的な定または検出の両方を意味するために使用される。例えば、下記に定義される方法およびシステムは、媒質中の核酸を決定または検出するために使用され、これはその媒質中の核酸の存在と、任意で濃度とを決定することを意味することを意図する。したがって、成句「存在または不在を決定すること」は、検出された事象（例えば、ＤＮＡハイブリダイゼーション、ＲＮＡハイブリダイゼーション、標的核酸を検出することなど）の存在または不在を定性的に決定すること、および定量的に決定することの両方を含むことを意図する。
【００５１】
本願で使用されるように、用語「インターカレーター」は、核酸の塩基対の間に挿入および／またはスタッキングすることができる平面芳香族部分または平面複素芳香族部分を意味することを意図する。
【００５２】
本願で使用されるように、用語「縫込み型インターカレーター」は、置換基または側鎖を有するインターカレーターを意味することを意図する。
本願で使用されるように、用語「電気触媒性インターカレーター」は、電極によって酸化可能であるとともに電気化学的増強後にヌクレオチドを酸化可能なインターカレーターを意味することを意図する。
【００５３】
本願で使用されるように、用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む任意の核酸を指す。本発明の核酸は、典型的にはポリ核酸、すなわち３’，５’−ホスホジエステル結合によって共有結合した、個別のヌクレオチドのポリマーである。本発明の方法および装置を本願においてＤＮＡに関して説明することがあるが、これは明確さのためのものであり、本発明の方法および／または装置をＲＮＡなどの他の核酸に適用することができるものとする。
【００５４】
本願で使用されるように、用語「相補性核酸」は、別の核酸に特異的に結合してハイブリダイズした核酸を形成する、オリゴヌクレオチドプローブを含む任意の核酸を指す。
本願で使用されるように、用語「ハイブリダイズした」または「ハイブリダイゼーション」は、完全に塩基対を形成していることもあるし、また形成していないこともある、相互に会合した少なくとも２本の核酸鎖を意味することを意図する。
【００５５】
本願で使用されるように、用語「変性すること」または「変性」は、オリゴヌクレオチド２本鎖の鎖がもはや水素結合によって塩基対を形成しておらず、１本鎖分子に分離される方法を意味することを意図する。
【００５６】
本願で使用されるように、用語「電極」は、導電媒質へ入出する電流を伝導する導電体を意味することを意図する。２つの電極、すなわち陽極および陰極は電子をそれぞれ受け取り、放出する。電極は、一般に導体を記載するために使用される。本発明において、電極は、別々にアドレス可能な多数の電極からなるマイクロアレイまたは超マイクロ電極のこともある。
【００５７】
本願で使用されるように、用語「ヌクレオシド」は、リボース、デオキシリボースまたはその誘導体もしくはアナログのいずれかであるペントースに結合した含窒素複素環塩基を意味することを意図する。用語「ヌクレオチド」は、含窒素複素環塩基、ペントース、および１つまたは複数のリン酸基または他の主鎖形成基を含むヌクレオシドのリン酸エステルに関する。ヌクレオチドはオリゴヌクレオチドのモノマーユニットである。ヌクレオチドユニットは、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、またはその誘導体などの共通塩基を含んでもよい。ペントースは、デオキシリボース、リボース、またはそれを代替する基でもよい。
【００５８】
本願で使用されるように、用語「ヌクレオチドアナログ」、「修飾塩基」、「塩基アナログ」、または「修飾ヌクレオシド」は、天然の対応物に類似して機能するが構造的に修飾された部分を意味することを意図する。
【００５９】
本願で使用されるように、用語「オリゴヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」は、ホスホロジエステルまたは他の主鎖形成基によって結合した天然の複素環塩基およびペントフラノシル同等基から特異的配列に形成された、複数の結合したヌクレオチドユニットを意味することを意図する。
【００６０】
本願で使用されるように、用語「オリゴヌクレオチドアナログ」または「修飾オリゴヌクレオチド」は、天然のオリゴヌクレオチドと類似して機能するが、非天然部分を有する組成物を意味することを意図する。オリゴヌクレオチドアナログまたは修飾オリゴヌクレオチドは、当技術分野における使用について公知である改変された糖部分、改変された塩基、改変された糖および塩基の両方、または改変された糖間結合を有してもよい。
【００６１】
本願で使用されるように、用語「バイオセンサー」は、酸化または還元反応で生成された電子の運動によって発生した信号を検出または測定するために必要な構成要素を備える装置またはシステムを意味することを意図する。用語「バイオセンサー」は、生物系が直接利用されない場合でさえも、物質の濃度および生物学的関心対象である他のパラメータを決定するための装置を含む。
【実施例】
【００６２】
以下の実施例は例示を意図し、本発明の範囲を限定することを意図しない。
実施例１
本実施例は、電気触媒性インターカレーター（Ｒｕ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２でグラフトされたＮ，Ｎ’−ビス［１（３−プロピル）イミダゾール］−１，４，５，８−ナフタレンジイミド（ＰＩＮＤ）（「ＰＩＮＤ−Ｒｕ」））の合成を例示する。
【００６３】
ＰＩＮＤ−Ｒｕの合成を以下のように概略する。
【００６４】
【化４】
１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物（ＮＤ）の合成のための一般的な手順に従ってＰＩＮＤを調製する。３−アミノプロピルイミジゾール（ＡＩ）３．０ｍｌおよびテトラヒドロフラン３．０ｍｌを磁気撹拌した混合物に、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物０．３０ｇをゆっくりと添加する。塊がほとんどできないように添加速度を制御する。反応混合物を２４時間還流し、次に室温に冷却する。次いで、得られた反応物をアセトン／水（３／１）混液１０ｍｌに分散させ、次に、高速撹拌した無水エーテル５００ｍｌに注いで目的化合物を沈殿させる。得られた沈殿を目の細かい焼結ガラス漏斗を通した吸引ろ過によって収集し、エタノールで短時間洗浄する。クロロホルム／エタノール（体積比１／１）から結晶化することにより精製を行い、４０℃で終夜減圧乾燥して黄色結晶０．４６ｇを得る（収率８５％）。
【００６５】
１段階配位子交換反応でＰＩＮＤ−Ｒｕを合成する。Ｒｕ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２（０．５２ｍｍｏｌ）の新鮮な蒸留エチレングリコール溶液８．０ｍｌに、１０分間にわたり少量ずつＰＩＮＤ（０．２５ｍｍｏｌ）を添加し、結果として生じた混合物を３０〜４０分間還流する。サイクリックボルタンメトリーにより配位子交換反応の完了を監視する。次に、得られた紫色の反応混合物を、高速撹拌したＫＣｌ飽和エタノール１００ｍｌにゆっくりと注ぎ入れる。得られた沈殿を、目の細かい焼結ガラス漏斗を通した吸引ろ過によって収集する。粗生成物をＰＢＳで洗浄し、エタノール３．０〜５．０ｍｌに溶解し、ＫＣｌ飽和エタノールでもう一度沈殿させる。得られた沈殿をエタノールで結晶化させることによってさらに精製し、純生成物を収率７８％で得る。得られた生成物は、ＰＢＳ中でＥ１／２０．６３Ｖを有して金電極で１対の可逆酸化還元波を示す。ＰＩＮＤの２つのイミダゾール末端での完全な二重配位子交換を確実にするために、わずかに過剰のＲｕ（ｂｐｙ）２（１０〜１５％）が必要である。
【００６６】
Ｆｉｎｎｉｇａｎ／ＭＡＴ ＬＣＱ質量分析計（サーモフィニガン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）［カリフォルニア州サンホゼ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）所在］）を用いて質量分析実験を行う。別に言及しない限り全てのスペクトルを室温で記録する。
【００６７】
プロトン核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）分光法（３００ＭＨｚ ＣＤＣｌ３）δ８．７６（４Ｈ）、７．５４（２Ｈ）、７．２６（２Ｈ）、４．２７（４Ｈ）、４．１２（４Ｈ）、２．３１（４Ｈ）、および１．８３９（２Ｈ）（図１）。
【００６８】
エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を用いたＰＩＮＤに関する質量分析試験は、ＰＩＮＤ＋Ｈ＋、および（ＰＩＮＤ＋２Ｈ＋）／２に対応するｍ／ｚ４８３．３および２４２．３に主ピークを示し（図２）、これは所望の化合物の分子量とよく一致している。一方がグラフトされたＰＩＮＤはＥＳＩ−ＭＳスペクトルで観察されないことから、ＰＩＮＤの任意の不完全なグラフト形成を除外することができる。
【００６９】
実施例２
本実施例は、サイクリックボルタンメトリーを用いた電気活性ＰＩＮＤ−Ｒｕインターカレーターの形成および電気化学的性質を例示する。
【００７０】
エチレングリコール中での還流中、５分毎にサイクリックボルタンメトリー試験を行う。図３に、最初の３０分間に得られた２つの典型的なボルタモグラムを示す。図３のトレース１から分かるように、Ｒｕ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２へのＰＩＮＤの添加前に、０．４０Ｖを中心とする１対の可逆なボルタンメトリーピークが得られ、これはＲｕ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２の十分に公知の酸化還元過程に対応する。ＰＩＮＤの添加の際に、新たな対のボルタンメトリーピークが０．６３Ｖに出現し、これはＰＩＮＤ−Ｒｕの形成を示す（図３、トレース２）。両方の電子移動過程は明らかに分解され、反応媒質のより大きなｉＲ降下を主な原因としてわずかにピーク間の電位分離が大きいことを除き、可逆過程の特徴の全てを有する。０．６３Ｖでのボルタンメトリーピークの強度は反応時間と共に徐々に増加する。同時に、０．４０Ｖでの強度は徐々に減少する。両方の酸化還元対は還流３０〜４０分後に定常状態に達する。０．４０Ｖでのボルタンメトリーの微細ピークは、過剰量のＲｕ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２を示す。分離および精製後に、このように精製されたＰＩＮＤ−Ｒｕのボルタンメトリー試験は、精製工程が非常に効果的であることを意味する１対だけのボルタンメトリーピークを示す（図３、トレース３）。
【００７１】
図３のトレース３に例示するように、ＰＩＮＤ−Ｒｕは溶液中で高度に可逆な酸化還元カップルについて正に予想通りのことを示す。０．０から＋０．９０Ｖの間の多数の繰返し電位サイクル後にほとんど変化が観察されず、これは溶液中でＰＩＮＤ−Ｒｕの安定性が良好であることを明らかにしている。＜５００ｍＶ／ｓの低スキャン速度で、理想的なネルンスト挙動を示す一電子交換系について予想されるような、拡散に制御される典型的ボルタモグラムが記録され、ピーク電流は電位スキャン速度の平方根に比例し、ピーク間の電位分離は理論値５９ｍＶに非常に近く、電位スキャン速度は独立している（図４）。これらの結果は、ルテニウム酸化還元中心の全てが電極表面に到達し、可逆性の不均一な電子移動が進むことを確認している。
【００７２】
実施例３
本実施例は、ＰＩＮＤ−ＲｕのＵＶ−ｖｉｓ分光光度法によって決定された、ＰＩＮＤ−Ｒｕとｄｓ−ＤＮＡとの相互作用を例示する。
【００７３】
漸増する量のサケ精子ＤＮＡの存在下でＵＶ−ｖｉｓ分光光度法によって決定されたＰＩＮＤ−Ｒｕとｄｓ−ＤＮＡとの相互作用の様式を検討した（図５Ａ）。ＵＶ−可視スペクトルをＡｇｉｌｅｎｔ８４５３ ＵＶ−可視分光光度計で記録する。ＵＶ−ｖｉｓ分光光度法では、縫込み型インターカレーターの融合した平面芳香環系がｄｓ−ＤＮＡの塩基対の間に挿入される、インターカレートした結合のシグネチャは淡色効果および赤方偏移である。図５Ａに示すように、ＤＮＡ塩基対／ＰＩＮＤ−Ｒｕ比４．０でのＰＩＮＤ−ＲｕへのＤＮＡの添加は、３６６および３８７ｎｍでＮＤ吸光バンドの４０％減少および２ｎｍ赤方偏移を生じる。類似の現象が、脂肪族第三アミン側鎖を有するナフタレンジイミド（ＮＤ）で以前に観察された。ＮＤ吸光バンドの淡色効果はＤＮＡ塩基対／ＰＩＮＤ−Ｒｕ比＞４．０でプラトーに達し、一定の淡色効果が観察される。これは、ｄｓ−ＤＮＡに対するＰＩＮＤ−Ｒｕの結合がＮＤの選択的インターカレーションによって起こることを示している。
【００７４】
ボジャー（Ｂｏｇｅｒ）によって提案されたのと類似した、短鎖ヘアピンオリゴヌクレオチドを用いた競合実験により、インターカレーションの安定性を推定する。ＰＩＮＤ−Ｒｕの当量に対する蛍光変化のプロットは滴定曲線をもたらし、それから１：１の化学量論比が決定される（図５Ｂ）。競合実験によって決定された安定性定数は３．０×１０７であることが見出され、これはＮＤに対して約７５倍の増強に対応する。安定性定数の増強についての妥当と思われる説明は、ＮＤ基がｄｓ−ＤＮＡに挿入された後、ＰＩＮＤ−Ｒｕ中の２つのカチオン性Ｒｕ（ｂｐｙ）２Ｃｌ基が、リン酸基を有するイオン対をｄｓ−ＤＮＡの各側に形成し、ＮＤをｄｓ−ＤＮＡの塩基対の間でより堅固に固定させることであろう。
【００７５】
実施例４
本実施例は、ＤＮＡバイオセンサーへのＰＩＮＤ−Ｒｕの適用を例示する。
金電極の調製および前処理は、シェ（Ｘｉｅ）ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７６：１６１１〜１６１７（２００４）；シェ（Ｘｉｅ）ら、Ｎｕｃｅｌｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２、ｅ１５（２００４）；シェ（Ｘｉｅ）ら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．７６：４０２３〜４０２９（２００４）；およびガオ（Ｇａｏ）ら、Ｓｙｎｔｈ．Ｍｅｔ．７５：５〜１０（１９９５）に以前に記載されたとおりであり、これらの全ては参照によって本願に援用される。簡潔には、捕獲プローブ（ＣＰ）の吸着前に、金電極を酸素プラズマに５〜１０分間曝露し、次に、直ちに無水エタノール中に２０分間浸漬して酸化物層を還元する。１００μｇ／ｍｌのＣＰのＰＢＳ溶液に１６〜２４時間金電極を浸漬することによってＣＰ単層を吸着させる。吸着後、電極をＰＢＳで何度もすすぎ、ＰＢＳ中に２０分間浸し、もう一度すすぎ、気流をあてて乾燥させる。スチール（Ｓｔｅｅｌ）によって提案された手順に従って、カチオン性酸化還元プローブの使用によって電気化学的に評価されたＣＰの表面密度は、１．１３〜１．３０×１０−１１ｍｏｌ／ｃｍ２の範囲であることが見出されている。ＤＮＡに関係しないＰＩＮＤ−Ｒｕの取込みを最小にし、ＣＰ単層の質および安定性を改善するために、ＣＰを被覆した金電極を２．０ｍｇ／ｍｌの１−メルカプトドデカン（ＭＤ）のメタノール溶液に４〜６時間浸漬する。未反応のＭＤ分子をすすいで除き、撹拌したエタノールに１０分間浸漬し、続いてエタノールおよび水で完全にすすぐことによって電極を洗浄する。得られた電極は、風乾後にいつでも使用可能な状態である。
【００７６】
標的ＤＮＡのハイブリダイゼーションおよびその電気化学的検出を３工程で行う。まず、標的ＤＮＡを含有するハイブリダイゼーション溶液２．５μｌを電極上に均一に広げ、電極を、６０℃（塩分調整融解温度より２７℃下の低ストリンジェンシー）に維持した水分飽和環境チャンバーに３０分間置く。次に、電極をブランクハイブリダイゼーション溶液を用いて６０℃で完全にすすぎ、ハイブリダイゼーション溶液中の１００μｇ／ｍｌ ＰＩＮＤ−Ｒｕ５．０μｌとともに３５℃で１０分間インキュベートする。縫込み型インターカレーションによって、ハイブリダイズした標的ＤＮＡにＰＩＮＤ−Ｒｕを結合させる。電極を空冷して室温に１０分間保持した後で、１０％エタノールを含有するＮａＣｌ飽和リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて完全な洗浄を行う。ボルタンメトリーによって電気触媒性酸化電流を測定する。低ＤＮＡ濃度では各測定後に平滑化を適用しており、ランダムノイズおよび電磁干渉を除去する。
【００７７】
低電流モジュールに結合したＣＨインストルメント（ＣＨ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）モデル６６０Ａ電気化学ワークステーション（ＣＨインストルメント（ＣＨ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）［テキサス州オースティン（Ａｕｓｔｉｎ）所在］）を用いて電気化学実験を行う。３電極系は、直径３．０ｍｍの金作用電極、ノンリーク小形Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極（サイプレス・システムズ（Ｃｙｐｒｅｓｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ）［カンザス州ローレンス（Ｌａｗｒｅｎｃｅ）所在］および白金線対電極を備えている。直径３．０ｍｍの作用域を超えて試料滴が広がることを避けるために、ＣＰの固定化後にパターン化した疎水性フィルムを金電極に適用する。本研究で報告された全ての電位はＡｇ／ＡｇＣｌ電極を参照としている。
【００７８】
最初のハイブリダイゼーション検査では、２００ｎＭのポリ（ＡＴ）２０、ポリ（ＡＧ）２０、およびポリ（Ｇ）４０のＴＥ溶液５．０μＬを、対応する相補性ＣＰ被覆電極とそれぞれハイブリダイズする。比較のために、同セットの電極を２００ｎＭのポリ（Ｔ）４０５．０μＬで処理する。ハイブリダイゼーションの際に、オリゴヌクレオチドはそれらの相補性ＣＰに選択的に結合し、電極表面に固定される。ハイブリダイゼーション緩衝液を用いた完全なすすぎで、ハイブリダイゼーションに関係しないオリゴヌクレオチドを全て洗い流す。ハイブリダイゼーション溶液中の１００μｇ／ｍｌ ＰＩＮＤ−Ｒｕ５．０μｌとともにその後インキュベートする間、ＰＩＮＤ−Ｒｕは電極表面に設けられる。１０％エタノールを含有するＮａＣｌ飽和１０ｍＭリン酸緩衝液を用いた徹底的な洗浄は、ＤＮＡに関係しないＰＩＮＤ−Ｒｕの取込みの大部分を除去する。
【００７９】
ハイブリダイゼーション後の電極についてのサイクリックボルタモグラムを図６Ａに示す。非相補性ポリ（Ｔ）４０について、ボルタンメトリーで１対の微細ピークが、ハイブリダイゼーション後にＰＩＮＤ−Ｒｕの酸化還元電位（０．６３Ｖ）で観察される（図６Ａトレース１）。これは、電極表面でのＰＩＮＤ−ＲｕとＣＰとの純粋な静電相互作用を大きな原因としている。相補性ポリ（ＡＴ）２０、ポリ（ＡＧ）２０、およびポリ（Ｇ）４０について、酸化還元電位のわずかな正のシフトが観察され、ピーク電流は１００倍だけ増加する（図６Ａトレース２、３および４）。したがって、２００ｎＭのポリ（ＡＴ）２０とハイブリダイゼーション後に観察された電流０．３０μＡは、活性であるとともに挿入されたＰＩＮＤ−Ｒｕ１．３ｐｍｏｌに起因する。この数字は、アッセイ液滴中に含まれるＰＩＮＤ−Ｒｕの＜０．５０％に相当する。表面ＣＰ被覆率として１．２×１０−１１ｍｏｌ／ｃｍ２（推定値の範囲中央）を採用し、最大ＰＩＮＤ−Ｒｕ／塩基比を１／４と仮定すると、標的ＤＮＡの０．１３ｐｍｏｌがハイブリダイズする。このように、標的ＤＮＡ１３％および表面に結合したＣＰの１５％が実際にハイブリダイズし、この値は文献にみられる値に匹敵する。興味深いことに、ポリ（ＡＧ）２０およびポリ（Ｇ）４０が対応する相補性ＣＰ被覆電極とハイブリダイズするとき、陽極電流の顕著な増加および陰極電流のわずかな減少が観察され（図６Ａトレース３および４）、グアニン含量が増加するに伴い、陽極電流の増分はほぼ直線的に増加する。このことは、オリゴヌクレオチド中のグアニンが、挿入されたＰＩＮＤ−Ｒｕによって０．６３Ｖで触媒酸化することを示している。これらの結果は、ＰＩＮＤ−Ｒｕがｄｓ−ＤＮＡと選択的に相互作用し、ＰＩＮＤ−Ｒｕ−ｄｓ−ＤＮＡ付加物が非常に低速の解離速度および高度に効率的なグアニン酸化電気触媒を有することを実証している。そのことは超高感度ＤＮＡバイオセンサーを開発するための道を開いている。
【００８０】
次に、ｍＲＮＡ中の完全長腫瘍タンパク質ｐ５３（ＴＰ５３）遺伝子を標的遺伝子として採用して、ｍＲＮＡ中の癌感受性遺伝子を直接検出するための電気活性指示物質として挿入されたＰＩＮＤ−Ｒｕを評価する。ハイブリダイゼーション前に、ｍＲＮＡ混合物を７０℃で１０分間変性させる。ＴＰ５３遺伝子に相補性の配列を有するオリゴヌクレオチドを電極表面に固定化し、ＣＰとして利用する。５３℃で３０分間のハイブリダイゼーションの際に、混合物からのＴＰ５３ ｍＲＮＡは電極表面に選択的に結合する。ハイブリダイゼーション緩衝液を用いた完全なすすぎで、ハイブリダイゼーションに関係しないｍＲＮＡを全て洗い流す。
【００８１】
ＰＩＮＤ−Ｒｕを適用後の電極の典型的なサイクリックボルタモグラムである図６Ｂに示すように、かなり高ピークの電流が陽極過程について観察され、これは、最も確からしくは捕獲された長鎖ＴＰ５３ ｍＲＮＡ分子が原因となって、大量の電子が酸化過程で生じることを示し、ｍＲＮＡ分子は大量のグアニンを電極表面にもたらす。逐次電位サイクルの間にピーク電流は顕著に降下し、定常状態ボルタモグラムが０および０．９０Ｖの間で５サイクル後に達成される（図５Ｂトレース２）。低スキャン速度≦１０ｍＶ／ｓでの酸化または還元電流ピークの積分によって、電気活性Ｒｕ２＋／Ｒｕ３＋部位に関して３．８ｐｍｏｌの表面被覆率が得られる。ＰＩＮＤ−Ｒｕの合計量１．９×１０−１１ｍｏｌｅ／ｃｍ２は、ハイブリダイズして完全に挿入されているＣＰの３２％に等しい。ハイブリダイゼーション効率およびＰＩＮＤ−Ｒｕの負荷レベルをさらに理解するために、ハイブリダイゼーション後およびＰＩＮＤ−Ｒｕの挿入後に、一連の水晶微量天秤（ＱＣＭ）の測定をＴＰ５３に関して行う。結果を表１にまとめる。
【００８２】
【表１】
表１に示すように、約４０ｆｍｏｌｅのＴＰ５３がハイブリダイズする。この数字は、表面に結合したＣＰの約１．６％が実際にハイブリダイズすることに相当し、これは文献で報告された短鎖オリゴヌクレオチド（２０〜５０塩基長）の値よりもずっと低い。分析される遺伝子の長さが増加するに伴い、ハイブリダイゼーション効率が激しく減少するのは驚くべきことではない。さらに、ＱＣＭ実験は、ＴＰ５３の１１〜１４塩基あたり１個のＰＩＮＤ−Ｒｕが挿入されたことを示し、これは、ＰＩＮＤ−Ｒｕ分子の一部がＴＰ５３の二次構造に挿入され、それがさらに本方法の感度を上げていることを示唆している。ＰＩＮＤ−Ｒｕの負荷密度は１．５〜２．２×１０−１１ｍｏｌｅ／ｃｍ２の範囲にあることが見出され、この値はボルタンメトリー試験で得られた値とよく一致する。
【００８３】
ＴＰ５３のｍＲＮＡから転写し、使用前にＴＥ緩衝液で種々の濃度に希釈した精製ｃＤＮＡを用いて、ＴＰ５３遺伝子定量のダイナミックレンジを確立する。対照実験について、電極の調製に非相補性ＣＰを使用する。電流は２．５から３５０ｐＭのｃＤＮＡ濃度で直線的に増加し、検出限界は０．６０ｎｇ／ｍｌに対応する１．５ｐＭであることが見出される。試料体積を考慮すると、提案された方法を用いて７．５アトモルという少量のＴＰ５３ ｃＤＮＡがうまく検出される。直接核酸酸化アッセイの以前の結果と比較して、本発明の触媒性縫込み型インターカレーター・スキームを採用することによって、ゲノム核酸アッセイの感受性は大きく改善する。核酸を直接検出するための非標識電気化学法の魅力は、酸化還元活性ユニット（グアニンおよび挿入されたＰＩＮＤ−Ｒｕ）の多くを含む現実世界の試料由来の遺伝子が高感度を示すことである。本願に記載されたＰＩＮＤ−Ｒｕ触媒系の長所は、グアニンおよびＰＩＮＤ−Ｒｕの両方が０．６３Ｖという低い電位で酸化され、バックグラウンド電流がほとんど存在しないことである。さらに、グアニンをより多く有する遺伝子は、より高感度の信号を与える。これらの２つの組合せは、ピコモル濃度の検出限界および最大３５０ｐＭのダイナミックレンジを可能にする。本発明の教示の範囲から逸脱せずに、上記方法および組成物に様々な変更を加えることができることから、上記説明に含まれる全ての事柄は例示であり限定的な意味ではないと解釈されることが意図される。行われた（すなわち、過去形を使用して）活動を挙げるために明示的に述べない限り、例示および実施例は、本教示の与えられた実施形態が行われたか、または行われなかったという表現であることを意図しない。
【００８４】
本願に引用された全ての参照は、その全体が参照によって本願に援用される。本願における参照の論考は、それらの著者によってなされた主張を要約することだけを意図し、任意の参照が特許性に関連する従来技術を構成するという承認は行われない。本出願者は、引用された参照の正確さおよび適切性に異議を申し立てる権利を留保する。
【００８５】
当業者は、下記の図面が例示のためだけであることを了解しているであろう。これらの図面は、本教示の範囲をいかなる方法で制限することも意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】ＣＤＣｌ３中のＰＩＮＤのプロトン核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）分光法（３００ＭＨｚ）の図。
【図２】エレクトロスプレーイオン化モードを用いたＰＩＮＤの質量分析試験の図。
【図３】Ｒｕ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２（トレース１）、エチレングリコール中でＰＩＮＤと３０分間還流後のＲｕ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２（トレース２）、ならびに精製ＰＩＮＤ−Ｒｕ（トレース３）のサイクリックボルタモグラムの図。（トレース３）についての支持電解質はＰＢＳであり、電位スキャン速度は１００ｍＶ／ｓである。
【図４】ＰＢＳ中の精製ＰＩＮＤ−Ｒｕのサイクリックボルタモグラムの図。内側から外側のボルタモグラムにかけて電位スキャン速度は１００（トレース１）、２００（トレース２）、３００（トレース３）、４００（トレース４）および５００（トレース５）ｍＶ／ｓであった。
【図５】（Ａ）（塩基対単位で）０（トレース１）、２５（トレース２）、５０（トレース３）、および１００μＭ（トレース４）という漸増する濃度のサケ精子ＤＮＡの関数としての２５μＭ ＰＩＮＤ−ＲｕのＵＶ−ｖｉｓスペクトル；（Ｂ）配列５’−ＡＡＴＴＴ−ＣＣＣＣＣ−ＡＡＡＴＴを含むヘアピンオリゴヌクレオチドに対するＰＩＮＤ−Ｒｕの蛍光インターカレーター置換滴定曲線の図。
【図６】（Ａ）非相補性ＣＰ被覆電極にハイブリダイズした２００ｎＭポリ（Ｔ）４０（トレース１）、ならびにそれぞれ相補性ＣＰ被覆電極にハイブリダイズした２００ｎＭのポリ（ＡＴ）２０（トレース２）、ポリ（ＡＧ）２０（トレース３）、およびポリ（Ｇ）４０（トレース４）のサイクリックボルタモグラム；（Ｂ）ｐ５３核酸がハイブリダイズしたバイオセンサーのＰＢＳ中での１回目（トレース１）および５回目（トレース２）の電位サイクルの図。電位スキャン速度は１００ｍＶ／ｓである。
【技術分野】
【０００１】
本出願は概して、電気触媒性インターカレーターを用いて核酸を検出するためのバイオセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸系バイオセンサーは、遺伝子型決定から分子診断にわたり潜在的適用を有する。蛍光法は、特異的核酸配列および遺伝子発現を分析するための高密度核酸アレイを与える。これらのアレイは広く採用されてはいるが、標的核酸試料の標識を必要とする。したがって、電気化学的伝達法が核酸ハイブリダイゼーション事象の超高感度検出のために提案されている。蛍光の代わりに電気化学法を使用することで、より単純でより小さい検出器が可能になりうる。核酸を選択的かつ高感度で直接検出できることが、電気化学的研究の主な目標である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、本発明者らは、試料中の核酸を検出するためのバイオセンサーに新しいアプローチを案出することに成功した。このアプローチは、超高感度核酸検出に使用するために新規な核酸インターカレーターを合成および分析応用することに基づく。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
種々の実施形態において、本発明は下記式Ｉのコア化合物を提供する。
Ｌ１−Ｄ−Ｌ２
（Ｉ）
式中、Ｄは２価の環状基である。Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、約３から約２０個の非水素原子、脂肪族アミノ基、および窒素部分を有する有機アミンを備える連結基である。
【０００５】
さらなる実施形態において、本発明は、式ＩＩの遷移金属化合物に結合した式Ｉのコア化合物を備える電気触媒性インターカレーターも提供する。
【０００６】
【化１】
式中、Ｍは、窒素に配位結合を形成することができる金属元素である。ＲおよびＲ’は、それらの窒素原子でＭに配位した窒素含有有機部分である。Ｚはハロゲン原子であり、ｍは＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、または＋６である。Ｘは、ｍとバランスを保つアニオンまたは複数のアニオンの組合せである。好ましい実施形態において、金属元素はルテニウムである。
【０００７】
種々のさらなる実施形態において、本発明は、前記電気触媒性インターカレーターの調製方法も提供する。この方法は、式Ｉのコア化合物に式ＩＩの遷移金属化合物を接触させることにより、コア化合物と遷移金属化合物との間に金属から窒素への配位結合を形成する工程を備える。
【０００８】
本発明は、前記電気触媒性インターカレーターを利用した核酸の電気触媒的検出方法をさらに提供する。種々の実施形態において、電気触媒性インターカレーターが複合体に挿入されるように、電気触媒性インターカレーターに標的核酸を含む複合体が接触する。
【０００９】
さらなる実施形態において、本発明は電気触媒性インターカレーターを備えるキット、および当該電気触媒性インターカレーターを核酸の電気触媒的検出に利用するバイオセンサーにも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明により、核酸の塩基対の間に挿入され、電気化学的増強後にヌクレオチドの酸化を触媒する新規な電気触媒性インターカレーターを本出願者らは発見した。本発明のインターカレーターは、このインターカレーターの電気触媒的性質に寄与する様々な部分を備える。本出願者らは、２本鎖の核酸への本発明の電気触媒性インターカレーターの選択的組込み、および効率的な電気触媒が、標的核酸を高感度で無標識決定または検出するための一般的なプラットフォームをもたらすことを発見した。
【００１１】
例えば、複数の縫込み型インターカレーターは、２本鎖の核酸と可逆的に相互作用する重要な化合物の群である。縫込み型インターカレーターは、例えば２本鎖のＤＮＡの塩基対間に挿入されて結合する平面多環芳香族系の存在などの構造上の共通な特徴を有している。特定の理論に縛られるわけではないが、２本鎖の核酸への本願の電気触媒性インターカレーターの挿入後に、電気触媒性インターカレーターがヌクレオチドを酸化し、電子がヌクレオチドからバイオセンサー／電極に移動する電子流が電極で検出される。本発明の有用性、機能、または組成物を限定することなしに、電気触媒性インターカレーターは、電気化学的増強後にヌクレオチドを酸化する。触媒サイクルでは、インターカレーターは電極によって酸化され、酸化したインターカレーターはヌクレオチドから電子を除去してラジカルカチオンを形成することができ、ラジカルカチオンは脱プロトンしてさらなる反応を受ける。このように、本反応は触媒的であり、核酸から直接電子を除去する一連の反応によって核酸の消費を導き、電極に電子が移動する結果として検出可能な電流が生じる。
【００１２】
位置実施形態において、本発明は、式（Ｉ）に対応する構造を有するコア化合物を提供する。
Ｌ１−Ｄ−Ｌ２
（Ｉ）
式（Ｉ）において、Ｄは１つまたは複数の置換基を有することができる２価の環状基を表す。好ましくは、この２価の環状基は平面環状基を備える。２価の環状基の非限定的な例としては、２つの窒素原子に２つの結合部位を有するナフタレンジイミド基、２−および６−位または１−および５−位（好ましくは２−および６−位）に２つの結合部位を有するアントラセン基、アントラセン基と同様に２つの結合部位を有するアントラキノン基、２−および６−位に２つの結合部位を有するフルオレン基、２−および６−位に２つの結合部位を有するビフェニレン基、２−および７−位に２つの結合部位を有するフェナントレン基、ならびに２−および７−位に２つの結合部位を有するピレン基が挙げられる。好ましい環状基は、窒素原子に２つの結合を有するナフタレンジイミド基である。２価の環状基の置換基の非限定的な例は、ハロゲン原子（例えば、塩素（Ｃｌ）または臭素（Ｂｒ））、またはメチル、エチル、もしくはｎ−プロピルなどの１〜６個の炭素原子を有するアルキル基である。
【００１３】
好ましい実施形態において、Ｄは核酸インターカレーターである。インターカレーターは、例えば、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドなどの２本鎖の核酸の塩基対間に滑込むことができる分子である。好ましくは、インターカレーターはナフタレンジイミド基を備える。好ましい実施形態において、インターカレーターは１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物を備える。
【００１４】
上記式（Ｉ）において、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、約３から約２０個の非水素原子、脂肪族アミノ基を有する有機アミンを備える連結基であり、該連結基は、金属から窒素への配位結合をもたらすことができる窒素部分をさらに備えている。好ましい実施形態において、窒素部分は、少なくとも１つの窒素原子を含む複素環である。適切な窒素部分の非限定的な例としては、イミダゾール、ベンゾイミダゾール、ピロール、ピラゾール、トリアゾール、ベンゾトリアゾール、ピリジン、ピリダジン、ピラジン、ピリミジン、およびトリアジンが挙げられる。複素環の窒素の１つは、金属と配位結合を形成することができる。好ましい窒素部分はイミダゾールである。窒素部分が複素環であるとき、脂肪族アミノ基は、環に結合したアルキル基上に好ましくは保持される。アルキル基は直鎖でも分岐でもよく、一般に約１から約２０個の炭素、好ましくは約２から約１２個、さらに好ましくは約３個から約６個の炭素原子を含む。好ましい連結基は３−アミノプロピルイミダゾールである。
【００１５】
別の実施形態において、上記式（Ｉ）に対応する構造を有する化合物は電気触媒性インターカレーターの一部である。好ましい実施形態において、電気触媒性インターカレーターは、式（ＩＩ）の遷移金属化合物に結合した式（Ｉ）の化合物を備えている。
【００１６】
【化２】
式中、Ｍは窒素への配位結合を形成する金属元素である。ＲおよびＲ’は、それらの窒素原子でＭに配位した窒素含有有機部分である。Ｚはハロゲン原子であり、ｍは＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、または＋６である。Ｘは、ｍとバランスを保つアニオンまたは複数のアニオンの組合せである。
【００１７】
式ＩＩにおいて、Ｍとしての使用に適切な金属元素としては、例えば、ルテニウム（Ｒｕ）、オスミウム（Ｏｓ）、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、ロジウム（Ｒｈ）、レニウム（Ｒｅ）、白金（Ｐｔ）、スカンジウム（Ｓｃ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、カドミウム（Ｃｄ）、マグネシウム（Ｍｇ）、銅（Ｃｕ）、コバルト（Ｃｏ）、パラジウム（Ｐｄ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、ニッケル（Ｎｉ）、モリブデン（Ｍｏ）、タングステン（Ｗ）、イリジウム（Ｉｒ）、およびその混合物が挙げられる。好ましい実施形態において、金属元素Ｍは遷移金属ルテニウム（Ｒｕ）である。
【００１８】
式ＩＩのＲおよびＲ’は同一または異なることがあり、それらの窒素原子で金属元素に配位している。Ｒ、Ｒ’、またはその両方は、例えば２，２’−ビピリジル；Ｃ１〜Ｃ４アルキル、フェニル、および１つまたは複数のＣ１〜Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換された２，２’−ビピリジル；１，１０−フェナントロリニル；ならびにＣ１〜Ｃ４アルキル、フェニル、および１つまたは複数のＣ１〜Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換された１，１０−フェナントロリニルでもよい。好ましくは、ＲおよびＲ’の少なくとも１つは２，２’−ビピリジルである。
【００１９】
別の実施形態において、ＲおよびＲ’の少なくとも１つおよび好ましくは両方が、２，２’−ビピリジルまたは１，１０−フェナントロリニルであり、それらのいずれも任意で置換されてもよい。ビピリジルまたはフェナントロリニルが置換されているとき、置換基は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、フェニル、およびＣ１〜Ｃ４アルキルでさらに置換されたフェニルからなる群から好ましくは選択され、さらに好ましくはＣ１〜Ｃ２アルキル基である。置換されたビピリジルおよびフェナントロリニル配位基は、一置換でもよいし、二置換以上でもよい。種々の実施形態において、例えば４，４’−二置換−２，２’−ビピリジル、５，５’−二置換−２，２’−ビピリジル、１，１０−フェナントロリニル、４，７−二置換−１，１０−フェナントロリニル、および５，６−二置換−１，１０−フェナントロリニルを含む二置換配位基を使用することができる。
【００２０】
ＲおよびＲ’の一方だけがビピリジルまたはフェナントロリニルであるか、上述した任意で置換された基の１つであるとき、好ましくは、他方は、金属Ｍと配位結合を形成することができる２つの窒素原子を含む脂肪族配位子から選択される。非限定的な例としては、１，３−プロパンジアミン、１，４−ブタンジアミン、およびそのいずれかの誘導体が挙げられ、誘導体は、窒素から金属Ｍへの配位結合も、その複合体の電気化学的活性も妨害しないアルキル、アリール、または他の基で任意に置換された１，３−プロパンジアミンまたは１，４−ブタンジアミン骨格に基づく。
【００２１】
式ＩＩにおいて、Ｚはハロゲン原子である。好ましい実施形態において、Ｚは塩素または臭素であり、さらに好ましくは塩素である。上付文字ｍは、Ｍの酸化状態に応じて＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、または＋６である。好ましい実施形態において、例えばＭが酸化状態＋４のルテニウムであるとき、Ｚは塩素であり、ｍは＋３である。Ｘはカチオンの形式電荷ｍとバランスを保つアニオンまたは複数のアニオンの組合せである。例えば、Ｘは、非限定的に塩素、臭素、ヨウ素、フッ素、テトラフルオロボレート、過塩素酸、硝酸、硫酸、炭酸、または亜硫酸でもよい。
【００２２】
好ましい実施形態において、本発明の電気触媒性インターカレーターは、式（ＩＩ）の化合物に結合した式（Ｉ）の化合物を備えており、式中、Ｄは１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物であり、Ｌ１およびＬ２はそれぞれ３−アミノプロピルイミダゾールであり、Ｍはルテニウムであり、ＲおよびＲ’はそれぞれ２，２’−ビピリジルであり、Ｚは塩素である。さらに好ましくは、本発明の電気触媒性インターカレーターは、下記式を備える。
【００２３】
【化３】
本発明は、上記電気触媒性インターカレーターの調製方法も提供する。本発明の好ましい方法では、電気触媒性インターカレーターは、一般式（Ｉ）のコア化合物および一般式（ＩＩ）の遷移金属化合物の間の配位子交換によって調製される。本願に記載された遷移金属化合物は、金属との安定な複合体の形成を助け、配位子交換条件下で連結基Ｌ１またはＬ２によって置換可能なフィラー配位子Ｚを備えている。好ましい連結基は、金属に対して金属から窒素への配位結合をもたらす窒素部分を備えている。好ましい実施形態において、金属はルテニウムであり、Ｚは塩素であり、連結基は３−アミノプロピルイミダゾールである。
【００２４】
本発明の電気触媒性インターカレーターを、試料中の標的核酸を検出するために使用することができる。非限定的な例では、核酸およびその電気触媒性インターカレーターを備える複合体が電極などの固体支持体の表面に形成され、電子移動が検出される。本発明によると、電気触媒性インターカレーターは、相補性プローブ分子にハイブリダイズした標的核酸を含む２本鎖の核酸の塩基対の間に挿入される。本発明のメカニズム、機能、または有用性を限定することなしに、当該方法はヌクレオチドの電気化学的酸化を利用している。電気触媒性インターカレーターは、２本鎖の核酸への挿入の際に、および適切な電気化学的増強の際に、ヌクレオチド、好ましくはグアニンを酸化することができる。特定の理論に縛られるわけではないが、触媒サイクルでは、インターカレーターは電極によって酸化され、酸化したインターカレーターはヌクレオチドから電子を除去してラジカルカチオンを形成することができ、ラジカルカチオンは脱プロトン化してさらなる反応を受ける。この反応は触媒的であり、核酸から直接電子を除去する一連の反応によって核酸の消費を導いて電極に電子が移動する結果として、検出可能な電流が生じる。
【００２５】
一実施形態において、標的核酸および電気触媒性インターカレーターを備える複合体は、電極表面に固定されているか電極表面に結合可能なプローブとの標的核酸のハイブリダイゼーションによって電極の表面に形成されている。適切なプローブは、標的核酸の特異的配列に相補性の１本鎖領域を含む核酸を備えることができる。検出される標的核酸は核酸を含むことができ、該核酸は特定された１本鎖もしくは２本鎖であるか、または２本鎖および１本鎖配列の両方の部分を含むことができる。標的核酸が２本鎖の核酸のみを含むとき、相補性プローブへの標的核酸のハイブリダイゼーション前に変性が必要であることが認識されている。
【００２６】
標的核酸はＤＮＡ（ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれか）、ＲＮＡ、またはハイブリッドでもよく、核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組合せ、ならびに例えばウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなどを含む塩基の任意の組合せを含む。例えばハイブリダイゼーションにより標的核酸がプローブに結合することができる。
【００２７】
一般に、プローブは、例えばＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、または発現配列タグ（ＥＳＴ）を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。プローブをＤＮＡまたはその断片から得ることができ、生体からの抽出、制限酵素による開裂、電気泳動による分離、および熱処理またはアルカリ処理による変性によってプローブを得てもよい。プローブを化学合成することもできる。プローブ鎖中のグアニンの代用であろう（すなわち、グアニンのように、核酸２本鎖中の他の塩基よりもシトシンに対してより大きな結合親和性を有する塩基である）が、適用可能な反応条件下で電気触媒性インターカレーターによって酸化しないであろう代替塩基を使用してプローブを合成することも可能である。当該代替塩基の例としては、イノシンおよび７−デアザ−グアニンが挙げられる。
【００２８】
プローブの調製に適した塩基を、天然の、非天然の、または「合成」のヌクレオチド塩基から選択することができる。天然のヌクレオチド塩基は、例えばアデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、およびチミンでもよい。プローブは、７−デアザ−グアニン、８−オキソ−グアニン、６−メルカプトグアニン、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシエチル）ウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノ−メチル−２−チオリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチルプソイドウリジン、β−Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−メチルアデノシン、１−メチルプソイドウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、β−Ｄ−マンノシルキュェオシン、５−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルチオプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチルカルバモイル）トレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、キュェオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、２−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、ワイブトシン、および３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジンなどの非天然の、または「合成」のヌクレオチド塩基から調製されてもよい。ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭素環などの修飾糖、ならびにフルオロおよびメトキシなどの２’置換を含む糖を含む任意のオリゴヌクレオチド主鎖が採用されてもよい。オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間の架橋リン酸残基の少なくとも１つまたは全てが、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデート、およびホスホルアミデートなどの修飾されたリン酸であるオリゴヌクレオチドでもよい（例えば１つおきのヌクレオチド間架橋リン酸残基が、記載されたように修飾されてもよい）。オリゴヌクレオチドは、参照によって本願に援用されるＰ．ニールセン（Ｐ．Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４、１４９７〜１５００（１９９１）に記載されているような「ペプチド核酸」でもよい。唯一必要なのは、少なくとも一部がＤＮＡ試料の配列の公知の部分に結合可能な配列をオリゴヌクレオチドプローブが有すべきであるということである。標的核酸試料に、異なる塩基配列を有するいくつかのオリゴヌクレオチドプローブを接触させることが一部の適用では理想的なことがある（例えば、試料中に２つ以上の標的核酸が存在する場合、または「サンドイッチ」アッセイにおいて単一標的核酸が２つ以上のプローブにハイブリダイズしている場合）。
【００２９】
プローブ分子は電極に固定化されてもよい。好ましい実施形態において、プローブは金属電極に結合する。しかし、当業者は、当業界で公知のいくつかの技法によってプローブを電極に固定化することができることを理解するだろう。文献の手順を採用して、本発明に係る使用のために、電極の表面上にプローブを固定化するための様々な技法を利用することができ、それらの技法は当業者に公知である。
【００３０】
非限定的な例において、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドなどのプローブ分子の５’−または３’−末端（５’−末端が好ましい）にチオール基が結合することができ、結合したチオールは電極の金原子に配位する。ＤＮＡにチオール基を組み込むための方法は、参照によって本願明細書に援用されるＭ．マエダ（Ｍ．Ｍａｅｄａ）ら、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１８０５〜１８０６（１９９４）およびＡ．コノリー（Ａ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１３、４４８４（１９８５）に記載されている。この固定方法では、チオール末端を有するプローブ分子が金電極上に滴下されて低温で２、３時間放置された後、所望のプローブ分子が電極上に固定される。
【００３１】
ガラス状炭素電極の使用などの別の非限定的な例において、電極は過マンガン酸カリウムによって酸化され、電極の表面上にカルボキシル基が生成される。アミド結合が形成されてガラス状炭素電極の表面上にプローブ分子が固定されるように、カルボキシル基を有する表面上に、チオール末端を有するプローブ分子が滴下される。この方法の詳細は、参照によって本願に援用されるＫ．Ｍ．ミラン（Ｋ．Ｍ．Ｍｉｌｌａｎ）ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６５、２３１７〜２３２３（１９９３）に記載されている。
【００３２】
認識対がプローブの電極への結合に使用されてもよい。これについて、プローブが修飾されて該プローブが認識対の第１メンバーを備え、電極表面が第２メンバーで被覆されてもよい。したがって、プローブ／標的核酸ハイブリッドを備える２本鎖の核酸が、認識対の第１および第２メンバーの相互作用を介して電極の表面に形成されてもよい。認識対および様々な分子へのそれらの結合は、当技術分野において公知である。非限定的な例では、認識対はビオチンおよびアビジンからなる。
【００３３】
インターカレーターの添加前に、またはインターカレーターの存在下でプローブへの標的核酸のハイブリダイゼーションが行われてもよい。好ましくは、インターカレーターは数ｎＭから数ｍＭの濃度で使用される。当業者に公知の任意の適切な方法で標的核酸試料にプローブが接触してもよい。例えば、標的試料を溶液に溶解し、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、標的試料を有する溶液にプローブを溶解することによって、標的試料をプローブに接触させることができる。適切な条件は当業者に十分に公知であり、その条件として様々な塩濃度条件が挙げられる。あるいは、固体支持体上に固定化されたプローブを有する溶液に標的試料を溶解してもよく、標的試料を含有する溶液に、オリゴヌクレオチドプローブが固定化された固体支持体を浸漬することによって、標的試料にプローブが接触してもよい。プローブ分子と標的核酸とのハイブリダイゼーションは、電極への電位の適用および電流の検出の際に決定される。
【００３４】
プローブ分子に部分的に相補性である標的核酸断片試料を検出するためにもまた、本発明の電気触媒性インターカレーターを採用可能である。当該断片試料は「ミスマッチ断片」と一般に称される。ミスマッチしている可能性のある標的核酸断片の検出で得られたピーク電流強度を、完全な相補性を有する標的核酸断片（すなわち完全マッチ断片）の検出で得られた対応するピーク電流強度と比較することによって、ミスマッチ断片を検出することができる。
【００３５】
当業者に公知の任意の適切な手段により、酸化および還元を伴う触媒サイクルが検出されてもよい。酸化還元反応に関連する電気信号の検出により、ハイブリダイズしたプローブ／標的核酸の存在または不在の決定が可能になる。任意の適切な手段により、反応速度を測定する工程が行われてもよい。例えば、走査速度、プローブ濃度、標的濃度、メディエータ、緩衝液、温度、および／または電気化学的方法の関数として電流を比較することによって、相対反応速度が決定されてもよい。
【００３６】
当業者に公知の適切な手段により、酸化還元反応速度が測定されてもよい。典型的には、酸化還元反応の発生に関連する電気信号を測定することによって、酸化還元反応速度は測定される。例えば、検出電極と電気的に接続された適切な装置が提供されることによって、酸化還元反応に関連する電気信号が測定されてもよい。適切な装置は、ハイブリダイズしたプローブ／標的核酸と電気触媒性インターカレーターとの反応の酸化還元反応速度を測定するために発生した電気信号を測定することができるであろう。この電気信号は、サイクリックボルタンメトリー、ノーマルパルスボルタンメトリー、クロノアンペロメトリー、および矩形波ボルタンメトリーを含む任意の電気化学的方法の特性を有してもよく、サイクリックボルタンメトリーが現在好ましい形式である。
【００３７】
好ましい実施形態において、本方法は遺伝子診断に使用される。例えば、ｐ５３に対する遺伝子などの標的分析物の配列を決定するためにオリゴヌクレオチドプローブを使用することができ、遺伝子は様々な癌に関連する遺伝子である。他の非限定的な例としては、非ポリポーシス性結腸癌の遺伝子、ＢＲＣＡ１乳癌遺伝子、患者の容易な発症前スクリーニングを可能にする、アルツハイマー病のより大きなリスクを示すＡｐｏ Ｅ４遺伝子、嚢胞性線維症遺伝子の突然変異、または当技術分野で十分に公知のその他の任意のものが挙げられる。
【００３８】
その他の種々の実施形態において、本発明の電気触媒性インターカレーターを用いて、ウイルスおよび細菌の検出が可能である。この実施形態において、プローブは、様々な細菌およびウイルスから標的配列を検出するように設計される。本願に開示された方法は、臨床試料を直接スクリーニングして例えばＨＩＶ核酸配列を検出可能にする。さらに、これは、抗ウイルス療法の有効性を評価する改良法として、患者内で循環するウイルスの直接モニタリングを可能にする。同様に、白血病に関連するウイルス、ＨＴＬＶ−Ｉ、およびＨＴＬＶ−ＩＩが、このように検出されてもよい。結核などの細菌感染が検出されてもよい。
【００３９】
他の実施形態において、例えば水試料および食品試料のスクリーニングでの有毒細菌用のプローブが使用されてもよい。例えば、試料が処理されて細菌が溶解し、その細菌の核酸が放出され、次にサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）腸毒性株およびレジオネラ症細菌などの病原株を非限定的に含む細菌株を認識するプローブが設計されてもよい。同様に、本発明の組成物を使用してバイオレメディエーション戦略が評価されてもよい。
【００４０】
他の実施形態において、プローブは法医学のために使用可能であり、このとき、ＤＮＡフィンガープリントを使用して、ＤＮＡなどの犯罪現場の標的核酸を、被害者および容疑者から採取した試料と照合することができる。
【００４１】
標的核酸の供給源として、例えばヒト、動物、植物、または環境を挙げることができる。
他の実施形態において、本発明は、電気触媒性インターカレーターを備えるキットにも関する。キットは、検出される標的核酸を認識して結合することができる、本願に記載されたものなどのプローブをさらに備えることができる。
【００４２】
種々の他の実施形態において、本発明はさらに、本願に記載された電気触媒性インターカレーターを利用するバイオセンサーに関する。バイオセンサーは、装置を備えてもよいし、１つもしくは複数の電気触媒性インターカレーターによって発生する信号を検出および測定するのに必要な構成要素を備えるシステム中で使用されてもよい。装置は、電源および検出器に結合したバイオセンサーアレイを含む集積回路を備えることができる。このような集積回路は当業者に公知である。バイオセンサーアレイを備えるシステムは、作用電極に電位が印加された後の電気化学信号を測定するための手段を追加的に含んでもよい。
【００４３】
本願に記載された方法および装置は、当業者に十分に公知の検査法を利用し、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、２００１；スペクター（Ｓｐｅｃｔｏｒ），Ｄ．Ｌ．ら、Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９９８；およびハーロー（Ｈａｒｌｏｗ），Ｅ．、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９９９などの検査マニュアルに見出され得る。
【００４４】
本願に記載された方法および装置は、当業者に十分に公知の検査法を利用し、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、２００１；スペクター（Ｓｐｅｃｔｏｒ），Ｄ．Ｌ．ら、Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９９８；およびハーロー（Ｈａｒｌｏｗ），Ｅ．、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９９９などの検査マニュアルに見出され得る。
【００４５】
本願に使用された（[背景技術]および[発明の開示]などの）項目名は、本発明の開示内の表題の一般的な編制だけを意図しており、本発明の開示もその任意の態様も限定することを意図しない。特に、[背景技術]に開示された主題は、本発明の範囲内の技法の態様を含むことがあり、従来技術の詳述を構成しないことがある。[発明の開示]に開示された主題は、本発明の範囲全体またはその任意の実施形態の網羅的または完全な開示ではない。
【００４６】
本願における参照の引用は、これらの参照が従来技術であるという承認を与えず、本願に開示された本発明の特許性に何ら関連しない。本願に引用された全ての参照は、参照によってその全体が本願に援用される。
【００４７】
本説明および具体的な実施例は本発明の実施形態を示しているが、例示目的のみを意図しており、本発明の範囲を制限することを意図しない。さらに、述べられた特徴を有する多数の実施形態の詳述は、追加の特徴を有する他の実施形態および述べられた特徴の異なる組合せを組み込んでいる他の実施形態を除外することを意図しない。具体的な実施例は、本発明の組成物および方法をどのように製造、使用、および実行するかの例示的な目的で提供され、別に明確に述べない限り、本発明の与えられた実施形態が製造または試験されたか、またはされなかったという表現であることを意図しない。
【００４８】
本願で使用されるように、単語「好ましい」および「好ましくは」は、ある状況である利益を与える本発明の実施形態を指す。しかし、同じ状況または他の状況で他の実施形態もまた好ましいことがある。さらに、１つまたは複数の好ましい実施形態の詳述は、他の実施形態が有用ではないことを意味せず、本発明の範囲から他の実施形態を除外することを意図しない。
【００４９】
本発明で使用されるように、単語「含む」およびその変形は、非限定的であることを意図するためであり、リストにある項目の詳述は、本発明の材料、組成物、デバイス、および方法に同様に有用でありうる他の類似の項目を除外することではない。
【００５０】
以下の説明において、用語「決定」または「検出」は、試料中の核酸の定性的および定量決的な定または検出の両方を意味するために使用される。例えば、下記に定義される方法およびシステムは、媒質中の核酸を決定または検出するために使用され、これはその媒質中の核酸の存在と、任意で濃度とを決定することを意味することを意図する。したがって、成句「存在または不在を決定すること」は、検出された事象（例えば、ＤＮＡハイブリダイゼーション、ＲＮＡハイブリダイゼーション、標的核酸を検出することなど）の存在または不在を定性的に決定すること、および定量的に決定することの両方を含むことを意図する。
【００５１】
本願で使用されるように、用語「インターカレーター」は、核酸の塩基対の間に挿入および／またはスタッキングすることができる平面芳香族部分または平面複素芳香族部分を意味することを意図する。
【００５２】
本願で使用されるように、用語「縫込み型インターカレーター」は、置換基または側鎖を有するインターカレーターを意味することを意図する。
本願で使用されるように、用語「電気触媒性インターカレーター」は、電極によって酸化可能であるとともに電気化学的増強後にヌクレオチドを酸化可能なインターカレーターを意味することを意図する。
【００５３】
本願で使用されるように、用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む任意の核酸を指す。本発明の核酸は、典型的にはポリ核酸、すなわち３’，５’−ホスホジエステル結合によって共有結合した、個別のヌクレオチドのポリマーである。本発明の方法および装置を本願においてＤＮＡに関して説明することがあるが、これは明確さのためのものであり、本発明の方法および／または装置をＲＮＡなどの他の核酸に適用することができるものとする。
【００５４】
本願で使用されるように、用語「相補性核酸」は、別の核酸に特異的に結合してハイブリダイズした核酸を形成する、オリゴヌクレオチドプローブを含む任意の核酸を指す。
本願で使用されるように、用語「ハイブリダイズした」または「ハイブリダイゼーション」は、完全に塩基対を形成していることもあるし、また形成していないこともある、相互に会合した少なくとも２本の核酸鎖を意味することを意図する。
【００５５】
本願で使用されるように、用語「変性すること」または「変性」は、オリゴヌクレオチド２本鎖の鎖がもはや水素結合によって塩基対を形成しておらず、１本鎖分子に分離される方法を意味することを意図する。
【００５６】
本願で使用されるように、用語「電極」は、導電媒質へ入出する電流を伝導する導電体を意味することを意図する。２つの電極、すなわち陽極および陰極は電子をそれぞれ受け取り、放出する。電極は、一般に導体を記載するために使用される。本発明において、電極は、別々にアドレス可能な多数の電極からなるマイクロアレイまたは超マイクロ電極のこともある。
【００５７】
本願で使用されるように、用語「ヌクレオシド」は、リボース、デオキシリボースまたはその誘導体もしくはアナログのいずれかであるペントースに結合した含窒素複素環塩基を意味することを意図する。用語「ヌクレオチド」は、含窒素複素環塩基、ペントース、および１つまたは複数のリン酸基または他の主鎖形成基を含むヌクレオシドのリン酸エステルに関する。ヌクレオチドはオリゴヌクレオチドのモノマーユニットである。ヌクレオチドユニットは、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、またはその誘導体などの共通塩基を含んでもよい。ペントースは、デオキシリボース、リボース、またはそれを代替する基でもよい。
【００５８】
本願で使用されるように、用語「ヌクレオチドアナログ」、「修飾塩基」、「塩基アナログ」、または「修飾ヌクレオシド」は、天然の対応物に類似して機能するが構造的に修飾された部分を意味することを意図する。
【００５９】
本願で使用されるように、用語「オリゴヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」は、ホスホロジエステルまたは他の主鎖形成基によって結合した天然の複素環塩基およびペントフラノシル同等基から特異的配列に形成された、複数の結合したヌクレオチドユニットを意味することを意図する。
【００６０】
本願で使用されるように、用語「オリゴヌクレオチドアナログ」または「修飾オリゴヌクレオチド」は、天然のオリゴヌクレオチドと類似して機能するが、非天然部分を有する組成物を意味することを意図する。オリゴヌクレオチドアナログまたは修飾オリゴヌクレオチドは、当技術分野における使用について公知である改変された糖部分、改変された塩基、改変された糖および塩基の両方、または改変された糖間結合を有してもよい。
【００６１】
本願で使用されるように、用語「バイオセンサー」は、酸化または還元反応で生成された電子の運動によって発生した信号を検出または測定するために必要な構成要素を備える装置またはシステムを意味することを意図する。用語「バイオセンサー」は、生物系が直接利用されない場合でさえも、物質の濃度および生物学的関心対象である他のパラメータを決定するための装置を含む。
【実施例】
【００６２】
以下の実施例は例示を意図し、本発明の範囲を限定することを意図しない。
実施例１
本実施例は、電気触媒性インターカレーター（Ｒｕ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２でグラフトされたＮ，Ｎ’−ビス［１（３−プロピル）イミダゾール］−１，４，５，８−ナフタレンジイミド（ＰＩＮＤ）（「ＰＩＮＤ−Ｒｕ」））の合成を例示する。
【００６３】
ＰＩＮＤ−Ｒｕの合成を以下のように概略する。
【００６４】
【化４】
１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物（ＮＤ）の合成のための一般的な手順に従ってＰＩＮＤを調製する。３−アミノプロピルイミジゾール（ＡＩ）３．０ｍｌおよびテトラヒドロフラン３．０ｍｌを磁気撹拌した混合物に、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物０．３０ｇをゆっくりと添加する。塊がほとんどできないように添加速度を制御する。反応混合物を２４時間還流し、次に室温に冷却する。次いで、得られた反応物をアセトン／水（３／１）混液１０ｍｌに分散させ、次に、高速撹拌した無水エーテル５００ｍｌに注いで目的化合物を沈殿させる。得られた沈殿を目の細かい焼結ガラス漏斗を通した吸引ろ過によって収集し、エタノールで短時間洗浄する。クロロホルム／エタノール（体積比１／１）から結晶化することにより精製を行い、４０℃で終夜減圧乾燥して黄色結晶０．４６ｇを得る（収率８５％）。
【００６５】
１段階配位子交換反応でＰＩＮＤ−Ｒｕを合成する。Ｒｕ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２（０．５２ｍｍｏｌ）の新鮮な蒸留エチレングリコール溶液８．０ｍｌに、１０分間にわたり少量ずつＰＩＮＤ（０．２５ｍｍｏｌ）を添加し、結果として生じた混合物を３０〜４０分間還流する。サイクリックボルタンメトリーにより配位子交換反応の完了を監視する。次に、得られた紫色の反応混合物を、高速撹拌したＫＣｌ飽和エタノール１００ｍｌにゆっくりと注ぎ入れる。得られた沈殿を、目の細かい焼結ガラス漏斗を通した吸引ろ過によって収集する。粗生成物をＰＢＳで洗浄し、エタノール３．０〜５．０ｍｌに溶解し、ＫＣｌ飽和エタノールでもう一度沈殿させる。得られた沈殿をエタノールで結晶化させることによってさらに精製し、純生成物を収率７８％で得る。得られた生成物は、ＰＢＳ中でＥ１／２０．６３Ｖを有して金電極で１対の可逆酸化還元波を示す。ＰＩＮＤの２つのイミダゾール末端での完全な二重配位子交換を確実にするために、わずかに過剰のＲｕ（ｂｐｙ）２（１０〜１５％）が必要である。
【００６６】
Ｆｉｎｎｉｇａｎ／ＭＡＴ ＬＣＱ質量分析計（サーモフィニガン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）［カリフォルニア州サンホゼ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）所在］）を用いて質量分析実験を行う。別に言及しない限り全てのスペクトルを室温で記録する。
【００６７】
プロトン核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）分光法（３００ＭＨｚ ＣＤＣｌ３）δ８．７６（４Ｈ）、７．５４（２Ｈ）、７．２６（２Ｈ）、４．２７（４Ｈ）、４．１２（４Ｈ）、２．３１（４Ｈ）、および１．８３９（２Ｈ）（図１）。
【００６８】
エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を用いたＰＩＮＤに関する質量分析試験は、ＰＩＮＤ＋Ｈ＋、および（ＰＩＮＤ＋２Ｈ＋）／２に対応するｍ／ｚ４８３．３および２４２．３に主ピークを示し（図２）、これは所望の化合物の分子量とよく一致している。一方がグラフトされたＰＩＮＤはＥＳＩ−ＭＳスペクトルで観察されないことから、ＰＩＮＤの任意の不完全なグラフト形成を除外することができる。
【００６９】
実施例２
本実施例は、サイクリックボルタンメトリーを用いた電気活性ＰＩＮＤ−Ｒｕインターカレーターの形成および電気化学的性質を例示する。
【００７０】
エチレングリコール中での還流中、５分毎にサイクリックボルタンメトリー試験を行う。図３に、最初の３０分間に得られた２つの典型的なボルタモグラムを示す。図３のトレース１から分かるように、Ｒｕ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２へのＰＩＮＤの添加前に、０．４０Ｖを中心とする１対の可逆なボルタンメトリーピークが得られ、これはＲｕ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２の十分に公知の酸化還元過程に対応する。ＰＩＮＤの添加の際に、新たな対のボルタンメトリーピークが０．６３Ｖに出現し、これはＰＩＮＤ−Ｒｕの形成を示す（図３、トレース２）。両方の電子移動過程は明らかに分解され、反応媒質のより大きなｉＲ降下を主な原因としてわずかにピーク間の電位分離が大きいことを除き、可逆過程の特徴の全てを有する。０．６３Ｖでのボルタンメトリーピークの強度は反応時間と共に徐々に増加する。同時に、０．４０Ｖでの強度は徐々に減少する。両方の酸化還元対は還流３０〜４０分後に定常状態に達する。０．４０Ｖでのボルタンメトリーの微細ピークは、過剰量のＲｕ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２を示す。分離および精製後に、このように精製されたＰＩＮＤ−Ｒｕのボルタンメトリー試験は、精製工程が非常に効果的であることを意味する１対だけのボルタンメトリーピークを示す（図３、トレース３）。
【００７１】
図３のトレース３に例示するように、ＰＩＮＤ−Ｒｕは溶液中で高度に可逆な酸化還元カップルについて正に予想通りのことを示す。０．０から＋０．９０Ｖの間の多数の繰返し電位サイクル後にほとんど変化が観察されず、これは溶液中でＰＩＮＤ−Ｒｕの安定性が良好であることを明らかにしている。＜５００ｍＶ／ｓの低スキャン速度で、理想的なネルンスト挙動を示す一電子交換系について予想されるような、拡散に制御される典型的ボルタモグラムが記録され、ピーク電流は電位スキャン速度の平方根に比例し、ピーク間の電位分離は理論値５９ｍＶに非常に近く、電位スキャン速度は独立している（図４）。これらの結果は、ルテニウム酸化還元中心の全てが電極表面に到達し、可逆性の不均一な電子移動が進むことを確認している。
【００７２】
実施例３
本実施例は、ＰＩＮＤ−ＲｕのＵＶ−ｖｉｓ分光光度法によって決定された、ＰＩＮＤ−Ｒｕとｄｓ−ＤＮＡとの相互作用を例示する。
【００７３】
漸増する量のサケ精子ＤＮＡの存在下でＵＶ−ｖｉｓ分光光度法によって決定されたＰＩＮＤ−Ｒｕとｄｓ−ＤＮＡとの相互作用の様式を検討した（図５Ａ）。ＵＶ−可視スペクトルをＡｇｉｌｅｎｔ８４５３ ＵＶ−可視分光光度計で記録する。ＵＶ−ｖｉｓ分光光度法では、縫込み型インターカレーターの融合した平面芳香環系がｄｓ−ＤＮＡの塩基対の間に挿入される、インターカレートした結合のシグネチャは淡色効果および赤方偏移である。図５Ａに示すように、ＤＮＡ塩基対／ＰＩＮＤ−Ｒｕ比４．０でのＰＩＮＤ−ＲｕへのＤＮＡの添加は、３６６および３８７ｎｍでＮＤ吸光バンドの４０％減少および２ｎｍ赤方偏移を生じる。類似の現象が、脂肪族第三アミン側鎖を有するナフタレンジイミド（ＮＤ）で以前に観察された。ＮＤ吸光バンドの淡色効果はＤＮＡ塩基対／ＰＩＮＤ−Ｒｕ比＞４．０でプラトーに達し、一定の淡色効果が観察される。これは、ｄｓ−ＤＮＡに対するＰＩＮＤ−Ｒｕの結合がＮＤの選択的インターカレーションによって起こることを示している。
【００７４】
ボジャー（Ｂｏｇｅｒ）によって提案されたのと類似した、短鎖ヘアピンオリゴヌクレオチドを用いた競合実験により、インターカレーションの安定性を推定する。ＰＩＮＤ−Ｒｕの当量に対する蛍光変化のプロットは滴定曲線をもたらし、それから１：１の化学量論比が決定される（図５Ｂ）。競合実験によって決定された安定性定数は３．０×１０７であることが見出され、これはＮＤに対して約７５倍の増強に対応する。安定性定数の増強についての妥当と思われる説明は、ＮＤ基がｄｓ−ＤＮＡに挿入された後、ＰＩＮＤ−Ｒｕ中の２つのカチオン性Ｒｕ（ｂｐｙ）２Ｃｌ基が、リン酸基を有するイオン対をｄｓ−ＤＮＡの各側に形成し、ＮＤをｄｓ−ＤＮＡの塩基対の間でより堅固に固定させることであろう。
【００７５】
実施例４
本実施例は、ＤＮＡバイオセンサーへのＰＩＮＤ−Ｒｕの適用を例示する。
金電極の調製および前処理は、シェ（Ｘｉｅ）ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７６：１６１１〜１６１７（２００４）；シェ（Ｘｉｅ）ら、Ｎｕｃｅｌｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２、ｅ１５（２００４）；シェ（Ｘｉｅ）ら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．７６：４０２３〜４０２９（２００４）；およびガオ（Ｇａｏ）ら、Ｓｙｎｔｈ．Ｍｅｔ．７５：５〜１０（１９９５）に以前に記載されたとおりであり、これらの全ては参照によって本願に援用される。簡潔には、捕獲プローブ（ＣＰ）の吸着前に、金電極を酸素プラズマに５〜１０分間曝露し、次に、直ちに無水エタノール中に２０分間浸漬して酸化物層を還元する。１００μｇ／ｍｌのＣＰのＰＢＳ溶液に１６〜２４時間金電極を浸漬することによってＣＰ単層を吸着させる。吸着後、電極をＰＢＳで何度もすすぎ、ＰＢＳ中に２０分間浸し、もう一度すすぎ、気流をあてて乾燥させる。スチール（Ｓｔｅｅｌ）によって提案された手順に従って、カチオン性酸化還元プローブの使用によって電気化学的に評価されたＣＰの表面密度は、１．１３〜１．３０×１０−１１ｍｏｌ／ｃｍ２の範囲であることが見出されている。ＤＮＡに関係しないＰＩＮＤ−Ｒｕの取込みを最小にし、ＣＰ単層の質および安定性を改善するために、ＣＰを被覆した金電極を２．０ｍｇ／ｍｌの１−メルカプトドデカン（ＭＤ）のメタノール溶液に４〜６時間浸漬する。未反応のＭＤ分子をすすいで除き、撹拌したエタノールに１０分間浸漬し、続いてエタノールおよび水で完全にすすぐことによって電極を洗浄する。得られた電極は、風乾後にいつでも使用可能な状態である。
【００７６】
標的ＤＮＡのハイブリダイゼーションおよびその電気化学的検出を３工程で行う。まず、標的ＤＮＡを含有するハイブリダイゼーション溶液２．５μｌを電極上に均一に広げ、電極を、６０℃（塩分調整融解温度より２７℃下の低ストリンジェンシー）に維持した水分飽和環境チャンバーに３０分間置く。次に、電極をブランクハイブリダイゼーション溶液を用いて６０℃で完全にすすぎ、ハイブリダイゼーション溶液中の１００μｇ／ｍｌ ＰＩＮＤ−Ｒｕ５．０μｌとともに３５℃で１０分間インキュベートする。縫込み型インターカレーションによって、ハイブリダイズした標的ＤＮＡにＰＩＮＤ−Ｒｕを結合させる。電極を空冷して室温に１０分間保持した後で、１０％エタノールを含有するＮａＣｌ飽和リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて完全な洗浄を行う。ボルタンメトリーによって電気触媒性酸化電流を測定する。低ＤＮＡ濃度では各測定後に平滑化を適用しており、ランダムノイズおよび電磁干渉を除去する。
【００７７】
低電流モジュールに結合したＣＨインストルメント（ＣＨ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）モデル６６０Ａ電気化学ワークステーション（ＣＨインストルメント（ＣＨ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）［テキサス州オースティン（Ａｕｓｔｉｎ）所在］）を用いて電気化学実験を行う。３電極系は、直径３．０ｍｍの金作用電極、ノンリーク小形Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極（サイプレス・システムズ（Ｃｙｐｒｅｓｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ）［カンザス州ローレンス（Ｌａｗｒｅｎｃｅ）所在］および白金線対電極を備えている。直径３．０ｍｍの作用域を超えて試料滴が広がることを避けるために、ＣＰの固定化後にパターン化した疎水性フィルムを金電極に適用する。本研究で報告された全ての電位はＡｇ／ＡｇＣｌ電極を参照としている。
【００７８】
最初のハイブリダイゼーション検査では、２００ｎＭのポリ（ＡＴ）２０、ポリ（ＡＧ）２０、およびポリ（Ｇ）４０のＴＥ溶液５．０μＬを、対応する相補性ＣＰ被覆電極とそれぞれハイブリダイズする。比較のために、同セットの電極を２００ｎＭのポリ（Ｔ）４０５．０μＬで処理する。ハイブリダイゼーションの際に、オリゴヌクレオチドはそれらの相補性ＣＰに選択的に結合し、電極表面に固定される。ハイブリダイゼーション緩衝液を用いた完全なすすぎで、ハイブリダイゼーションに関係しないオリゴヌクレオチドを全て洗い流す。ハイブリダイゼーション溶液中の１００μｇ／ｍｌ ＰＩＮＤ−Ｒｕ５．０μｌとともにその後インキュベートする間、ＰＩＮＤ−Ｒｕは電極表面に設けられる。１０％エタノールを含有するＮａＣｌ飽和１０ｍＭリン酸緩衝液を用いた徹底的な洗浄は、ＤＮＡに関係しないＰＩＮＤ−Ｒｕの取込みの大部分を除去する。
【００７９】
ハイブリダイゼーション後の電極についてのサイクリックボルタモグラムを図６Ａに示す。非相補性ポリ（Ｔ）４０について、ボルタンメトリーで１対の微細ピークが、ハイブリダイゼーション後にＰＩＮＤ−Ｒｕの酸化還元電位（０．６３Ｖ）で観察される（図６Ａトレース１）。これは、電極表面でのＰＩＮＤ−ＲｕとＣＰとの純粋な静電相互作用を大きな原因としている。相補性ポリ（ＡＴ）２０、ポリ（ＡＧ）２０、およびポリ（Ｇ）４０について、酸化還元電位のわずかな正のシフトが観察され、ピーク電流は１００倍だけ増加する（図６Ａトレース２、３および４）。したがって、２００ｎＭのポリ（ＡＴ）２０とハイブリダイゼーション後に観察された電流０．３０μＡは、活性であるとともに挿入されたＰＩＮＤ−Ｒｕ１．３ｐｍｏｌに起因する。この数字は、アッセイ液滴中に含まれるＰＩＮＤ−Ｒｕの＜０．５０％に相当する。表面ＣＰ被覆率として１．２×１０−１１ｍｏｌ／ｃｍ２（推定値の範囲中央）を採用し、最大ＰＩＮＤ−Ｒｕ／塩基比を１／４と仮定すると、標的ＤＮＡの０．１３ｐｍｏｌがハイブリダイズする。このように、標的ＤＮＡ１３％および表面に結合したＣＰの１５％が実際にハイブリダイズし、この値は文献にみられる値に匹敵する。興味深いことに、ポリ（ＡＧ）２０およびポリ（Ｇ）４０が対応する相補性ＣＰ被覆電極とハイブリダイズするとき、陽極電流の顕著な増加および陰極電流のわずかな減少が観察され（図６Ａトレース３および４）、グアニン含量が増加するに伴い、陽極電流の増分はほぼ直線的に増加する。このことは、オリゴヌクレオチド中のグアニンが、挿入されたＰＩＮＤ−Ｒｕによって０．６３Ｖで触媒酸化することを示している。これらの結果は、ＰＩＮＤ−Ｒｕがｄｓ−ＤＮＡと選択的に相互作用し、ＰＩＮＤ−Ｒｕ−ｄｓ−ＤＮＡ付加物が非常に低速の解離速度および高度に効率的なグアニン酸化電気触媒を有することを実証している。そのことは超高感度ＤＮＡバイオセンサーを開発するための道を開いている。
【００８０】
次に、ｍＲＮＡ中の完全長腫瘍タンパク質ｐ５３（ＴＰ５３）遺伝子を標的遺伝子として採用して、ｍＲＮＡ中の癌感受性遺伝子を直接検出するための電気活性指示物質として挿入されたＰＩＮＤ−Ｒｕを評価する。ハイブリダイゼーション前に、ｍＲＮＡ混合物を７０℃で１０分間変性させる。ＴＰ５３遺伝子に相補性の配列を有するオリゴヌクレオチドを電極表面に固定化し、ＣＰとして利用する。５３℃で３０分間のハイブリダイゼーションの際に、混合物からのＴＰ５３ ｍＲＮＡは電極表面に選択的に結合する。ハイブリダイゼーション緩衝液を用いた完全なすすぎで、ハイブリダイゼーションに関係しないｍＲＮＡを全て洗い流す。
【００８１】
ＰＩＮＤ−Ｒｕを適用後の電極の典型的なサイクリックボルタモグラムである図６Ｂに示すように、かなり高ピークの電流が陽極過程について観察され、これは、最も確からしくは捕獲された長鎖ＴＰ５３ ｍＲＮＡ分子が原因となって、大量の電子が酸化過程で生じることを示し、ｍＲＮＡ分子は大量のグアニンを電極表面にもたらす。逐次電位サイクルの間にピーク電流は顕著に降下し、定常状態ボルタモグラムが０および０．９０Ｖの間で５サイクル後に達成される（図５Ｂトレース２）。低スキャン速度≦１０ｍＶ／ｓでの酸化または還元電流ピークの積分によって、電気活性Ｒｕ２＋／Ｒｕ３＋部位に関して３．８ｐｍｏｌの表面被覆率が得られる。ＰＩＮＤ−Ｒｕの合計量１．９×１０−１１ｍｏｌｅ／ｃｍ２は、ハイブリダイズして完全に挿入されているＣＰの３２％に等しい。ハイブリダイゼーション効率およびＰＩＮＤ−Ｒｕの負荷レベルをさらに理解するために、ハイブリダイゼーション後およびＰＩＮＤ−Ｒｕの挿入後に、一連の水晶微量天秤（ＱＣＭ）の測定をＴＰ５３に関して行う。結果を表１にまとめる。
【００８２】
【表１】
表１に示すように、約４０ｆｍｏｌｅのＴＰ５３がハイブリダイズする。この数字は、表面に結合したＣＰの約１．６％が実際にハイブリダイズすることに相当し、これは文献で報告された短鎖オリゴヌクレオチド（２０〜５０塩基長）の値よりもずっと低い。分析される遺伝子の長さが増加するに伴い、ハイブリダイゼーション効率が激しく減少するのは驚くべきことではない。さらに、ＱＣＭ実験は、ＴＰ５３の１１〜１４塩基あたり１個のＰＩＮＤ−Ｒｕが挿入されたことを示し、これは、ＰＩＮＤ−Ｒｕ分子の一部がＴＰ５３の二次構造に挿入され、それがさらに本方法の感度を上げていることを示唆している。ＰＩＮＤ−Ｒｕの負荷密度は１．５〜２．２×１０−１１ｍｏｌｅ／ｃｍ２の範囲にあることが見出され、この値はボルタンメトリー試験で得られた値とよく一致する。
【００８３】
ＴＰ５３のｍＲＮＡから転写し、使用前にＴＥ緩衝液で種々の濃度に希釈した精製ｃＤＮＡを用いて、ＴＰ５３遺伝子定量のダイナミックレンジを確立する。対照実験について、電極の調製に非相補性ＣＰを使用する。電流は２．５から３５０ｐＭのｃＤＮＡ濃度で直線的に増加し、検出限界は０．６０ｎｇ／ｍｌに対応する１．５ｐＭであることが見出される。試料体積を考慮すると、提案された方法を用いて７．５アトモルという少量のＴＰ５３ ｃＤＮＡがうまく検出される。直接核酸酸化アッセイの以前の結果と比較して、本発明の触媒性縫込み型インターカレーター・スキームを採用することによって、ゲノム核酸アッセイの感受性は大きく改善する。核酸を直接検出するための非標識電気化学法の魅力は、酸化還元活性ユニット（グアニンおよび挿入されたＰＩＮＤ−Ｒｕ）の多くを含む現実世界の試料由来の遺伝子が高感度を示すことである。本願に記載されたＰＩＮＤ−Ｒｕ触媒系の長所は、グアニンおよびＰＩＮＤ−Ｒｕの両方が０．６３Ｖという低い電位で酸化され、バックグラウンド電流がほとんど存在しないことである。さらに、グアニンをより多く有する遺伝子は、より高感度の信号を与える。これらの２つの組合せは、ピコモル濃度の検出限界および最大３５０ｐＭのダイナミックレンジを可能にする。本発明の教示の範囲から逸脱せずに、上記方法および組成物に様々な変更を加えることができることから、上記説明に含まれる全ての事柄は例示であり限定的な意味ではないと解釈されることが意図される。行われた（すなわち、過去形を使用して）活動を挙げるために明示的に述べない限り、例示および実施例は、本教示の与えられた実施形態が行われたか、または行われなかったという表現であることを意図しない。
【００８４】
本願に引用された全ての参照は、その全体が参照によって本願に援用される。本願における参照の論考は、それらの著者によってなされた主張を要約することだけを意図し、任意の参照が特許性に関連する従来技術を構成するという承認は行われない。本出願者は、引用された参照の正確さおよび適切性に異議を申し立てる権利を留保する。
【００８５】
当業者は、下記の図面が例示のためだけであることを了解しているであろう。これらの図面は、本教示の範囲をいかなる方法で制限することも意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】ＣＤＣｌ３中のＰＩＮＤのプロトン核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）分光法（３００ＭＨｚ）の図。
【図２】エレクトロスプレーイオン化モードを用いたＰＩＮＤの質量分析試験の図。
【図３】Ｒｕ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２（トレース１）、エチレングリコール中でＰＩＮＤと３０分間還流後のＲｕ（ｂｐｙ）２Ｃｌ２（トレース２）、ならびに精製ＰＩＮＤ−Ｒｕ（トレース３）のサイクリックボルタモグラムの図。（トレース３）についての支持電解質はＰＢＳであり、電位スキャン速度は１００ｍＶ／ｓである。
【図４】ＰＢＳ中の精製ＰＩＮＤ−Ｒｕのサイクリックボルタモグラムの図。内側から外側のボルタモグラムにかけて電位スキャン速度は１００（トレース１）、２００（トレース２）、３００（トレース３）、４００（トレース４）および５００（トレース５）ｍＶ／ｓであった。
【図５】（Ａ）（塩基対単位で）０（トレース１）、２５（トレース２）、５０（トレース３）、および１００μＭ（トレース４）という漸増する濃度のサケ精子ＤＮＡの関数としての２５μＭ ＰＩＮＤ−ＲｕのＵＶ−ｖｉｓスペクトル；（Ｂ）配列５’−ＡＡＴＴＴ−ＣＣＣＣＣ−ＡＡＡＴＴを含むヘアピンオリゴヌクレオチドに対するＰＩＮＤ−Ｒｕの蛍光インターカレーター置換滴定曲線の図。
【図６】（Ａ）非相補性ＣＰ被覆電極にハイブリダイズした２００ｎＭポリ（Ｔ）４０（トレース１）、ならびにそれぞれ相補性ＣＰ被覆電極にハイブリダイズした２００ｎＭのポリ（ＡＴ）２０（トレース２）、ポリ（ＡＧ）２０（トレース３）、およびポリ（Ｇ）４０（トレース４）のサイクリックボルタモグラム；（Ｂ）ｐ５３核酸がハイブリダイズしたバイオセンサーのＰＢＳ中での１回目（トレース１）および５回目（トレース２）の電位サイクルの図。電位スキャン速度は１００ｍＶ／ｓである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式の化合物。
Ｌ１−Ｄ−Ｌ２
（式中、
Ｄは２価の環状基であり、
Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、約３から約２０個の非水素原子、脂肪族アミノ基、および窒素部分を有する有機アミンを備える連結基である）
【請求項２】
前記２価の環状基が２本鎖の核酸に挿入可能な部分を備える、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記部分が１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物を備える、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記窒素部分が金属から窒素への配位結合を備える、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記有機アミンが３−アミノプロピルイミダゾールである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
下式を備える化合物。
【化１】
【請求項７】
下式の遷移金属化合物
【化２】
（式中、
Ｍは、窒素への配位結合を形成することができる金属元素であり、
ＲおよびＲ’は、それらの窒素原子でＭに配位した窒素含有有機部分であり、ここで、ＲおよびＲ’は、２，２’−ビピリジル；Ｃ１〜Ｃ４アルキル、フェニル、および１つまたは複数のＣ１〜Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換された２，２’−ビピリジル；１，１０−フェナントロリニル；ならびにＣ１〜Ｃ４アルキル、フェニル、および１つまたは複数のＣ１〜Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換された１，１０−フェナントロリニルからなる群から独立して選択され、
Ｚはハロゲン原子であり、
ｍは、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、または＋６であり、
Ｘは、ｍとバランスを保つアニオンまたは複数のアニオンの組合せである）
に結合した下式のコア化合物を備える電気触媒性インターカレーター。
Ｌ１−Ｄ−Ｌ２
（式中、
Ｄは２価の環状基であり、
Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、約３から約２０個の非水素原子、脂肪族アミノ基、および窒素部分を有する有機アミンを備える連結基である）
【請求項８】
前記コア化合物が、金属から窒素への配位結合を有する遷移金属化合物に結合している、請求項７に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項９】
Ｍが、ルテニウム、オスミウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステン、およびイリジウム、またはその混合物からなる群から選択される、請求項８に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項１０】
Ｍがルテニウムである、請求項８に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項１１】
前記有機アミンが３−アミノプロピルイミダゾールを備える、請求項７に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項１２】
Ｚが塩素または臭素である、請求項８に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項１３】
前記２価の環状基が２本鎖の核酸に挿入可能な部分を備える、請求項８に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項１４】
前記部分が１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物を備える、請求項１３に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項１５】
ＲおよびＲ’が、２，２’−ビピリジル、４，４’−メチル−２，２’−ビピリジル、４，４’−エチル−２，２’−ビピリジル、４，４’−フェニル−２，２’−ビピリジル、５，５’−メチル−２，２’−ビピリジル、５，５’−エチル−２，２’−ビピリジル、および５，５’−フェニル−２，２’−ビピリジルからなる群から独立して選択される、請求項８に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項１６】
Ｍが、ルテニウム、オスミウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステン、およびイリジウム、またはその混合物からなる群から選択される、請求項１５に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項１７】
Ｍがルテニウムである、請求項１６に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項１８】
前記有機アミンが３−アミノプロピルイミダゾールを備える、請求項１５に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項１９】
Ｚが塩素または臭素である、請求項１５に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項２０】
前記２価の環状基が２本鎖の核酸に挿入可能な部分を備える、請求項１５に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項２１】
前記部分が１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物を備える、請求項２０に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項２２】
Ｉが１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物であり、前記有機アミンが３−アミノプロピルイミダゾールであり、ＲおよびＲ’の少なくとも一方が２，２’−ビピリジルであり、Ｍがルテニウムであり、Ｚが塩素である、請求項７に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項２３】
下式を備える電気触媒性インターカレーター。
【化３】
【請求項２４】
下式のコア化合物に、
Ｌ１−Ｄ−Ｌ２
（式中、
Ｄは２価の環状基であり、
Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、約３から約２０個の非水素原子、脂肪族アミノ基、および窒素部分を有する有機アミンを備える連結基である）
下式
【化４】
（式中、
Ｍは、窒素への配位結合を形成することができる金属元素であり、
ＲおよびＲ’は、それらの窒素原子でＭに配位した窒素含有有機部分であり、ここで、ＲおよびＲ’は、２，２’−ビピリジル；Ｃ１〜Ｃ４アルキル、フェニル、および１つまたは複数のＣ１〜Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換された２，２’−ビピリジル；１，１０−フェナントロリニル；ならびにＣ１〜Ｃ４アルキル、フェニル、および１つまたは複数のＣ１〜Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換された１，１０−フェナントロリニルからなる群から独立して選択され、
Ｚはハロゲン原子であり、
ｍは、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、または＋６であり、
Ｘは、ｍとバランスを保つアニオンまたは複数のアニオンの組合せである）
の遷移金属化合物を接触させることにより、該コア化合物と該遷移金属化合物との間に金属から窒素への配位結合を形成させる工程を備える、電気触媒性インターカレーターの調製方法。
【請求項２５】
Ｍが、ルテニウム、オスミウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステン、およびイリジウム、またはその混合物からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
Ｍがルテニウムである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記有機アミンが３−アミノプロピルイミダゾールを備える、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
Ｚが塩素または臭素である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記２価の環状基が２本鎖の核酸に挿入可能な部分を備える、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記部分が１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物を備える、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＲおよびＲ’が、２，２’−ビピリジル、４，４’−メチル−２，２’−ビピリジル、４，４’−エチル−２，２’−ビピリジル、４，４’−フェニル−２，２’−ビピリジル、５，５’−メチル−２，２’−ビピリジル、５，５’−エチル−２，２’−ビピリジル、および５，５’−フェニル−２，２’−ビピリジルからなる群から独立して選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
Ｍが、ルテニウム、オスミウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステン、およびイリジウム、またはその混合物からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
Ｍがルテニウムである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記有機アミンが３−アミノプロピルイミダゾールを備える、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
Ｚが塩素または臭素である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記２価の環状基が２本鎖の核酸に挿入可能な部分を備える、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記部分が１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物を備える、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
Ｉが１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物であり、前記有機アミンが３−アミノプロピルイミダゾールであり、ＲおよびＲ’の少なくとも一方が２，２−ビピリジルであり、Ｍがルテニウムであり、Ｚが塩素である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３９】
水性媒質中で、下式の遷移金属化合物
【化５】
（式中、
Ｍは、窒素への配位結合を形成することができる金属元素であり、
ＲおよびＲ’は、それらの窒素原子でＭに配位した窒素含有有機部分であり、ここで、ＲおよびＲ’は、２，２’−ビピリジル；Ｃ１〜Ｃ４アルキル、フェニル、および１つまたは複数のＣ１〜Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換された２，２’−ビピリジル；１，１０−フェナントロリニル；ならびにＣ１〜Ｃ４アルキル、フェニル、および１つまたは複数のＣ１〜Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換された１，１０−フェナントロリニルからなる群から独立して選択され、
Ｚはハロゲン原子であり、
ｍは＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、または＋６であり、
Ｘは、ｍとバランスを保つアニオンまたはアニオンの組合せである）
に結合した下式のコア化合物を備える電気触媒性インターカレーター
Ｌ１−Ｄ−Ｌ２
（式中、
Ｄは２価の環状基であり、
Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、約３から約２０個の非水素原子、脂肪族アミノ基、および窒素部分を有する有機アミンからなる連結基である）
に核酸を備える複合体を接触させることにより、該複合体に該電気触媒性インターカレーターを挿入する工程と、
該電気触媒性インターカレーターがヌクレオチドを酸化するときの電流を検出する工程とを備える、核酸の検出方法。
【請求項４０】
前記ヌクレオチドがグアニンである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
Ｍが、ルテニウム、オスミウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステン、およびイリジウム、またはその混合物からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
Ｍがルテニウムである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記有機アミンが３−アミノプロピルイミダゾールを備える、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
Ｚが塩素または臭素である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記２価の環状基が２本鎖の核酸に挿入可能な部分を備える、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
前記部分が１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物を備える、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
電極にプローブを固定化する工程と、
前記核酸を溶液中で該電極と接触させる工程であって、該プローブおよび核酸が相互にハイブリダイズする工程とをさらに備える、請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
認識対の第１メンバーを電極に固定化する工程と、
プローブを認識対の第２メンバーで標識する工程と、
標識された該プローブを溶液中で該電極と接触させて組み合わせる工程であって、該プローブおよび前記核酸がハイブリダイズして該電極の表面に結合した複合体を形成する工程とをさらに備える、請求項３９に記載の方法。
【請求項４９】
前記電気触媒性インターカレーターが下式を備える化合物である、請求項３９に記載の方法。
【化６】
【請求項１】
下式の化合物。
Ｌ１−Ｄ−Ｌ２
（式中、
Ｄは２価の環状基であり、
Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、約３から約２０個の非水素原子、脂肪族アミノ基、および窒素部分を有する有機アミンを備える連結基である）
【請求項２】
前記２価の環状基が２本鎖の核酸に挿入可能な部分を備える、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記部分が１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物を備える、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記窒素部分が金属から窒素への配位結合を備える、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記有機アミンが３−アミノプロピルイミダゾールである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
下式を備える化合物。
【化１】
【請求項７】
下式の遷移金属化合物
【化２】
（式中、
Ｍは、窒素への配位結合を形成することができる金属元素であり、
ＲおよびＲ’は、それらの窒素原子でＭに配位した窒素含有有機部分であり、ここで、ＲおよびＲ’は、２，２’−ビピリジル；Ｃ１〜Ｃ４アルキル、フェニル、および１つまたは複数のＣ１〜Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換された２，２’−ビピリジル；１，１０−フェナントロリニル；ならびにＣ１〜Ｃ４アルキル、フェニル、および１つまたは複数のＣ１〜Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換された１，１０−フェナントロリニルからなる群から独立して選択され、
Ｚはハロゲン原子であり、
ｍは、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、または＋６であり、
Ｘは、ｍとバランスを保つアニオンまたは複数のアニオンの組合せである）
に結合した下式のコア化合物を備える電気触媒性インターカレーター。
Ｌ１−Ｄ−Ｌ２
（式中、
Ｄは２価の環状基であり、
Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、約３から約２０個の非水素原子、脂肪族アミノ基、および窒素部分を有する有機アミンを備える連結基である）
【請求項８】
前記コア化合物が、金属から窒素への配位結合を有する遷移金属化合物に結合している、請求項７に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項９】
Ｍが、ルテニウム、オスミウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステン、およびイリジウム、またはその混合物からなる群から選択される、請求項８に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項１０】
Ｍがルテニウムである、請求項８に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項１１】
前記有機アミンが３−アミノプロピルイミダゾールを備える、請求項７に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項１２】
Ｚが塩素または臭素である、請求項８に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項１３】
前記２価の環状基が２本鎖の核酸に挿入可能な部分を備える、請求項８に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項１４】
前記部分が１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物を備える、請求項１３に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項１５】
ＲおよびＲ’が、２，２’−ビピリジル、４，４’−メチル−２，２’−ビピリジル、４，４’−エチル−２，２’−ビピリジル、４，４’−フェニル−２，２’−ビピリジル、５，５’−メチル−２，２’−ビピリジル、５，５’−エチル−２，２’−ビピリジル、および５，５’−フェニル−２，２’−ビピリジルからなる群から独立して選択される、請求項８に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項１６】
Ｍが、ルテニウム、オスミウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステン、およびイリジウム、またはその混合物からなる群から選択される、請求項１５に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項１７】
Ｍがルテニウムである、請求項１６に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項１８】
前記有機アミンが３−アミノプロピルイミダゾールを備える、請求項１５に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項１９】
Ｚが塩素または臭素である、請求項１５に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項２０】
前記２価の環状基が２本鎖の核酸に挿入可能な部分を備える、請求項１５に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項２１】
前記部分が１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物を備える、請求項２０に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項２２】
Ｉが１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物であり、前記有機アミンが３−アミノプロピルイミダゾールであり、ＲおよびＲ’の少なくとも一方が２，２’−ビピリジルであり、Ｍがルテニウムであり、Ｚが塩素である、請求項７に記載の電気触媒性インターカレーター。
【請求項２３】
下式を備える電気触媒性インターカレーター。
【化３】
【請求項２４】
下式のコア化合物に、
Ｌ１−Ｄ−Ｌ２
（式中、
Ｄは２価の環状基であり、
Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、約３から約２０個の非水素原子、脂肪族アミノ基、および窒素部分を有する有機アミンを備える連結基である）
下式
【化４】
（式中、
Ｍは、窒素への配位結合を形成することができる金属元素であり、
ＲおよびＲ’は、それらの窒素原子でＭに配位した窒素含有有機部分であり、ここで、ＲおよびＲ’は、２，２’−ビピリジル；Ｃ１〜Ｃ４アルキル、フェニル、および１つまたは複数のＣ１〜Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換された２，２’−ビピリジル；１，１０−フェナントロリニル；ならびにＣ１〜Ｃ４アルキル、フェニル、および１つまたは複数のＣ１〜Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換された１，１０−フェナントロリニルからなる群から独立して選択され、
Ｚはハロゲン原子であり、
ｍは、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、または＋６であり、
Ｘは、ｍとバランスを保つアニオンまたは複数のアニオンの組合せである）
の遷移金属化合物を接触させることにより、該コア化合物と該遷移金属化合物との間に金属から窒素への配位結合を形成させる工程を備える、電気触媒性インターカレーターの調製方法。
【請求項２５】
Ｍが、ルテニウム、オスミウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステン、およびイリジウム、またはその混合物からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
Ｍがルテニウムである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記有機アミンが３−アミノプロピルイミダゾールを備える、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
Ｚが塩素または臭素である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記２価の環状基が２本鎖の核酸に挿入可能な部分を備える、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記部分が１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物を備える、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＲおよびＲ’が、２，２’−ビピリジル、４，４’−メチル−２，２’−ビピリジル、４，４’−エチル−２，２’−ビピリジル、４，４’−フェニル−２，２’−ビピリジル、５，５’−メチル−２，２’−ビピリジル、５，５’−エチル−２，２’−ビピリジル、および５，５’−フェニル−２，２’−ビピリジルからなる群から独立して選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
Ｍが、ルテニウム、オスミウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステン、およびイリジウム、またはその混合物からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
Ｍがルテニウムである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記有機アミンが３−アミノプロピルイミダゾールを備える、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
Ｚが塩素または臭素である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記２価の環状基が２本鎖の核酸に挿入可能な部分を備える、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記部分が１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物を備える、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
Ｉが１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物であり、前記有機アミンが３−アミノプロピルイミダゾールであり、ＲおよびＲ’の少なくとも一方が２，２−ビピリジルであり、Ｍがルテニウムであり、Ｚが塩素である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３９】
水性媒質中で、下式の遷移金属化合物
【化５】
（式中、
Ｍは、窒素への配位結合を形成することができる金属元素であり、
ＲおよびＲ’は、それらの窒素原子でＭに配位した窒素含有有機部分であり、ここで、ＲおよびＲ’は、２，２’−ビピリジル；Ｃ１〜Ｃ４アルキル、フェニル、および１つまたは複数のＣ１〜Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換された２，２’−ビピリジル；１，１０−フェナントロリニル；ならびにＣ１〜Ｃ４アルキル、フェニル、および１つまたは複数のＣ１〜Ｃ４アルキル基で置換されたフェニルからなる群から選択される１つまたは複数の置換基で置換された１，１０−フェナントロリニルからなる群から独立して選択され、
Ｚはハロゲン原子であり、
ｍは＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、または＋６であり、
Ｘは、ｍとバランスを保つアニオンまたはアニオンの組合せである）
に結合した下式のコア化合物を備える電気触媒性インターカレーター
Ｌ１−Ｄ−Ｌ２
（式中、
Ｄは２価の環状基であり、
Ｌ１およびＬ２はそれぞれ独立して、約３から約２０個の非水素原子、脂肪族アミノ基、および窒素部分を有する有機アミンからなる連結基である）
に核酸を備える複合体を接触させることにより、該複合体に該電気触媒性インターカレーターを挿入する工程と、
該電気触媒性インターカレーターがヌクレオチドを酸化するときの電流を検出する工程とを備える、核酸の検出方法。
【請求項４０】
前記ヌクレオチドがグアニンである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
Ｍが、ルテニウム、オスミウム、亜鉛、鉄、ロジウム、レニウム、白金、スカンジウム、チタン、バナジウム、カドミウム、マグネシウム、銅、コバルト、パラジウム、クロム、マンガン、ニッケル、モリブデン、タングステン、およびイリジウム、またはその混合物からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
Ｍがルテニウムである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記有機アミンが３−アミノプロピルイミダゾールを備える、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
Ｚが塩素または臭素である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記２価の環状基が２本鎖の核酸に挿入可能な部分を備える、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
前記部分が１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物を備える、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
電極にプローブを固定化する工程と、
前記核酸を溶液中で該電極と接触させる工程であって、該プローブおよび核酸が相互にハイブリダイズする工程とをさらに備える、請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
認識対の第１メンバーを電極に固定化する工程と、
プローブを認識対の第２メンバーで標識する工程と、
標識された該プローブを溶液中で該電極と接触させて組み合わせる工程であって、該プローブおよび前記核酸がハイブリダイズして該電極の表面に結合した複合体を形成する工程とをさらに備える、請求項３９に記載の方法。
【請求項４９】
前記電気触媒性インターカレーターが下式を備える化合物である、請求項３９に記載の方法。
【化６】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【公表番号】特表２００８−５１１６２４（Ｐ２００８−５１１６２４Ａ）
【公表日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２９７８３（Ｐ２００７−５２９７８３）
【出願日】平成１７年７月１９日（２００５．７．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００５／０００２４２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２５７９６
【国際公開日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【出願人】（５０６２０５１０３）エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ (26)
【氏名又は名称原語表記】ＡＧＥＮＣＹ ＦＯＲ ＳＣＩＥＮＣＥ，ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年４月１７日（２００８．４．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月１９日（２００５．７．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＳＧ２００５／０００２４２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２５７９６
【国際公開日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【出願人】（５０６２０５１０３）エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ (26)
【氏名又は名称原語表記】ＡＧＥＮＣＹ ＦＯＲ ＳＣＩＥＮＣＥ，ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ
【Ｆターム（参考）】
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