【課題】セルラーゼ組成物はすでに開示されているけれども、新規および改善されたセルラーゼ組成物の必要が存在する。改善されたセルラーゼ組成物は、家庭用洗剤、布地の処理、バイオマス転化および紙の生産に用途がある。改善された性能を示すセルラーゼは、特に関心が高い。
【解決手段】本開示発明はセルラーゼ変異体に関する。特に、本開示発明は非セルロース素材への低減された結合を有するセルラーゼ変異体に関する。また、該セルラーゼをコードする核酸、当該セルラーゼを含む組成物、セルラーゼ変異体を特定する方法および該組成物を使用する方法も記載される。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．米国連邦政府によって資金提供された研究開発の下でなされた発明への権利に関する宣言
本発明は、米国政府の支援によって、米国エネルギー省から供与された制限条件付き供与番号ＤＥ−ＦＣ３６−０８ＧＯ１８０７８の下でなされた。米国政府は、本発明にある一定の権利を有する。
２．関連発明の相互参照
本出願は、米国特許仮出願番号第６１／０５９，５０６号の優先権を主張し、その内容は参照によって本明細書に取り込まれる。
３．技術分野
本願開示発明は、酵素、特にセルロース変異体に関する。また、該セルロース変異体をコードする核酸、該セルロース変異体を含む組成物、さらなる有用なセルロース変異体を特定する方法、および該組成物を使用する方法も開示される。
【背景技術】
【０００２】
セルロースおよびヘミセルロースは、光合成によって産生されるもっとも豊富な植物性素材である。これらの素材は、ポリマー基質を単糖類に加水分解する能力のある細胞外酵素を産生する多種類の微生物（たとえば、細菌、酵母および真菌）によって分解され、エネルギー源として用いられることができる（非特許文献１）。非再生資源の限界が近づいているので、主要な再生可能エネルギー源となるセルロースの潜在力は莫大である（非特許文献２）。生物学的プロセスによるセルロースの有効利用は、食物、飼料および燃料の不足を克服することへの一つの手段である（非特許文献３）。
【０００３】
セルラーゼは、セルロース（ベータ−１，４−グルカンまたはベータＤ−グルコシド結合）を加水分解して、グルコース、セロビオース、セロオリゴ糖等の形成をもたらす酵素である。セルラーゼは、従来から三つの主要な種類に分類されている、すなわちエンドグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）（「ＥＧ」）、エキソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）（「ＣＢＨ」）およびベータ−グルコシダーゼ（［ベータ］−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ：ＥＣ３．２．１．２１）（「ＢＧ」）である（非特許文献４および５）。エンドグルカナーゼはセルロース繊維の非晶質部分に主に作用し、他方、セロビオヒドロラーゼは結晶セルロースも分解することができる（非特許文献６）。したがって、結晶セルロースの効率的な可溶化のためには、セルラーゼ系中にセロビオヒドロラーゼが存在することが要求される（非特許文献７）。ベータ−グルコシダーゼは、セロビオース、セロオリゴ糖および他のグルコシドからＤ−グルコース単位を切り離す作用をする（非特許文献８）。
【０００４】
セルラーゼは、多種類の細菌、酵母および真菌によって産生されることが知られている。ある種の真菌は、結晶形態のセルロースを分解する能力のある完全なセルラーゼ系を産生し、その結果これらのセルラーゼは発酵によって大量に容易に産生される。多くの酵母、たとえばサッカロマイセスサレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ）は、セルロースを分解する能力を欠いているので、糸状菌は特別な役割を果たす（たとえば、非特許文献９）。
【０００５】
ＣＢＨ、ＥＧおよびＢＧの真菌セルラーゼの分類はさらに拡張されて、各分類の中に複数の構成分を含むことができる。たとえば、複数のＣＢＨ、ＥＧおよびＢＧが、多様な真菌源、たとえばトリコデルマリーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）（ハイポクレアジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ）とも呼ばれる。）から
単離されており、これらは、２のＣＢＨ、すなわちＣＢＨＩ（「ＣＢＨ１」）およびＣＢＨII（「ＣＢＨ２」）、少なくとも８のＥＧ、すなわちＥＧＩ（「ＥＧ１」）、ＥＧII（「ＥＧ２」）、ＥＧIII（「ＥＧ３」）、ＥＧIV（「ＥＧ４」）、ＥＧV（「ＥＧ５」）、ＥＧVI（「ＥＧ６」）、ＥＧVII（「ＥＧ７」）およびＥＧVIII（「ＥＧ８」）ならびに少なくとも５のＢＧ、すなわちＢＧ１、ＢＧ２、ＢＧ３、ＢＧ４およびＢＧ５については公知の遺伝子を含んでいる。ＥＧIV、ＥＧVIおよびＥＧVIIIもキシログカナーゼ活性を有している。
【０００６】
結晶セルロースをグルコースに効率的に転化するために、ＣＢＨ、ＥＧおよびＢＧの分類のそれぞれからの構成分を含む完全なセルラーゼ系が必要とされ、単離された成分では結晶セルロースを加水分解するのがより低度に有効である（非特許文献１０）。異なった分類からのセルラーゼ成分の間に相乗関係が観察されている。とりわけ、ＥＧ型のセルラーゼとＣＢＨ型のセルラーゼとは相乗的に相互作用して、セルロースをより効率的に分解する。
【０００７】
セルラーゼは、洗剤組成物の洗浄能力を高める目的のために、柔軟剤として使用するために、綿織物の感触および外観を改善するために等、織物の処理に有用であることが従来技術で知られている（非特許文献１１）。改善された洗浄性能を有するセルラーゼ含有洗剤組成物（特許文献１〜３）ならびに織物の処理に用いて織物の感触および外観を改善するためのセルラーゼ含有洗剤組成物（特許文献４〜７）が開示されている。したがって、真菌および細菌中で産生されたセルラーゼは相当な関心を持たれている。とりわけ、トリコデルマ種（たとえば、トリコデルマロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）またはトリコデルマリーゼイ）は、結晶形態のセルロースを分解する能力のある完全なセルラーゼ系を産生することが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４，４３５，３０７号明細書
【特許文献２】英国特許出願公開第２，０９５，２７５号明細書
【特許文献３】英国特許出願公開第２，０９４，８２６号明細書
【特許文献４】米国特許第５，６４８，２６３号明細書
【特許文献５】米国特許第５，６９１，１７８号明細書
【特許文献６】米国特許第５，７７６，７５７号明細書
【特許文献３】英国特許出願公開第１，３５８，５９９号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ａｒｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１年、第２７６巻、ｐ．２４３０９−２４３１４
【非特許文献２】Ｋｒｉｓｈｎａら、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈ、２００１年、第７７巻、ｐ．１９３−１９６
【非特許文献３】オオミヤら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｇｅｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ Ｒｅｖ、１９９７年、第１４巻、ｐ．３６５−４１４
【非特許文献４】Ｋｎｏｗｌｅｓら、ＴＩＢＴＥＣＨ、１９８７年、第５巻、ｐ．２５５−２６１
【非特許文献５】Ｓｃｈｕｌｅｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、１９８８年、第１６０巻、ｐ．２３４−２４３
【非特許文献６】ＮｅｖａｌａｉｎｅｎおよびＰｅｎｔｔｉｌａ、Ｍｙｃｏｔａ、１９９５年、ｐ．３０３−３１９
【非特許文献７】Ｓｕｕｒｎａｋｋｉら、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、２０００年、第７巻、ｐ．１８９−２０９
【非特許文献８】Ｆｒｅｅｒ、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９９３年、第２６８巻、ｐ．９３３７−９３４２
【非特許文献９】Ｗｏｏｄら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８８年、第１６０巻、ｐ．８７−１１６
【非特許文献１０】Ｆｉｌｈｏら、Ｃａｎ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９９６年、第４２巻、ｐ．１−５
【非特許文献１１】Ｋｕｍａｒら、Ｔｅｘｔｉｌｅ Ｃｈｅｍｉｓｔ ａｎｄ Ｃｏｌｏｒｉｓｔ、１９９７年、第２９巻、ｐ．３７−４２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
セルラーゼ組成物はすでに開示されているけれども、新規および改善されたセルラーゼ組成物の必要が存在する。改善されたセルラーゼ組成物は、家庭用洗剤、布地の処理、バイオマス転化および紙の生産に用途がある。改善された性能を示すセルラーゼは、特に関心が高い。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の教示は、非セルロース素材への結合力を低減するように修飾されたセルラーゼ変異体に関する。一般に、このセルラーゼ変異体は、非セルロース素材の存在下において野生型のセルラーゼと比較して増加されたセルロース分解活性を有する。ある実施態様では、このセルラーゼ変異体は、野生型のセルラーゼと比較して減少された正味電荷（すなわち、野生型のセルラーゼよりも負の電荷）を有する。ある実施態様では、このセルラーゼ変異体は、野生型のセルラーゼよりも低度に正に帯電している。ある実施態様では、セルラーゼは１以上の正電荷を除くことによって修飾される。ある実施態様では、セルラーゼは１以上の負電荷を加えることによって修飾される。ある実施態様では、セルラーゼは１以上の正電荷を除くことおよび１以上の負電荷を加えることによって修飾される。
【００１２】
ある実施態様では、本発明の教示はセロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨＩ）またはセロビオヒドロラーゼII（ＣＢＨII）の変異体に関する。ある実施態様では、このセルラーゼ変異体は、セルラーゼ活性ならびに６３、７７、１２９、１４７、１５３、１５７、１６１、１９４、１９７、２０３、２３７、２３９、２４７、２５４、２８１、２８５、２８８、２８９、２９４、３２７、３３９、３４４、３５６、３７８および３８２からなる群から選択された１以上の位置における置換を有する成熟型であり、ここで、位置は参照体（たとえば、配列番号３のアミノ酸配列を有する野生型ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２セルラーゼ）に対応して数えられ、また１以上の位置における該置換はこのセルラーゼ変異体に該参照セルラーゼと比較してより負の正味電荷を生じさせる。ある実施態様では、ＣＢＨ２は１以上の正電荷を除くことによって修飾され、これはある実施態様ではリシンまたはアルギニンが中性アミノ酸によって置換されること（たとえば、ＫまたはＲがＮもしくはＱまたは他の中性残基によって置換されること）を伴う。ある実施態様では、ＣＢＨ２は１以上の負電荷を加えることによって修飾され、これはある実施態様では中性アミノ酸が負に帯電したアミノ酸によって置換されること（たとえば、ＮｏまたはＱもしくは他の中性残基がＤまたはＥによって置換されること）を伴う。ある実施態様では、ＣＢＨ２は１以上の正電荷を除くことおよび１以上の負電荷を加えることによって修飾され、これはある実施態様ではリシンまたはアルギニンが負に帯電したアミノ酸によって置換されること（たとえば、ＫまたはＲがＤまたはＥによって置換されること）を伴う。一般に、ＣＢＨ２変異体は、配列番号３のアミノ酸配列を有する野生型ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２と比較してリグニンの存在下において増加されたセルロース分解活性を有する。本発明の教示はさらに、成熟型ＣＢＨ２中のＫ１２９Ｅ、Ｋ１５７Ｅ、Ｋ１９４Ｅ、Ｋ２８８Ｅ、Ｋ３２７Ｅ、Ｋ３５６Ｅ、Ｒ６３Ｑ、Ｒ７７Ｑ、Ｒ１５３Ｑ、Ｒ２０３Ｑ、Ｒ２９４Ｑ、Ｒ３７８Ｑ、Ｎ１６１Ｄ、Ｎ１９７Ｄ、Ｎ２３７Ｄ、Ｎ２４７Ｄ、Ｎ２５４Ｄ、Ｎ２８５Ｄ、Ｎ２８９Ｄ、Ｎ３３９Ｄ、Ｎ３４４Ｄ、Ｎ３８２Ｄ、Ｑ１４７Ｅ、Ｑ２０４Ｅ、Ｑ２３９Ｅ、Ｑ２８１Ｅ、Ｄ１５１Ｎ、Ｄ１８９Ｎ、Ｄ２１１Ｎ、Ｄ２７７Ｎ、Ｄ４０５Ｎ、Ｅ１４６Ｑ、Ｅ２０８ＱおよびＥ２４４Ｑからなる群から選択された１以上の置換を含むＣＢＨ２変異体を提供し、ここで当該置換は配列番号３の成熟型ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２に従って数えられる。ある実施態様では、この変異体は、１４６、１５１、１８９、２０８、２１１、２４４、２７７および４０５からなる群から選択された１以上のさらなる位置におけるさらなる置換を含み、ここで該さらなる位置は、配列番号３として記載された参照セロビオヒドロラーゼII（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して数えられる。ある実施態様では、この１以上のさらなる位置におけるさらなる置換は、アスパラギン酸またはグルタミン酸が中性アミノ酸によって置換されること（たとえば、ＤまたはＥがＮもしくはＱまたは他の中性残基によって置換されること）を含む。ある実施態様では、この１以上のさらなる位置におけるさらなる置換は、Ｄ１５１Ｎ、Ｄ１８９Ｎ、Ｄ２１１Ｎ、Ｄ２７７Ｎ、Ｄ４０５Ｎ、Ｅ１４６Ｑ、Ｅ２０８ＱおよびＥ２４４Ｑからなる群のうちの１以上を含み、ここで該位置は、配列番号３として記載された参照セロビオヒドロラーゼII（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して数えられる。ある好まれる実施態様では、この１以上の位置における置換は、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０個の位置からなる群から選択される。ある好まれる実施態様では、このセルラーゼ変異体は、ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２、ハイポクレアコニンギ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）ＣＢＨ２、フミコーラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）ＣＢＨ２、アクレモニウムセルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＣＢＨ２、アガリカスビスポラス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）ＣＢＨ２、フサリウムオシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｓｙｓｐｏｒｕｍ）ＥＧ、ファネロキーテクリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）ＣＢＨ２、タラロマイセスエメルソニ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）ＣＢＨ２、サーモビフィダ．フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ．ｆｕｓｃａ）６Ｂ／Ｅ３ ＣＢＨ２、サーモビフィダフスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ）６Ａ／Ｅ２ ＥＧおよびセルロモナスフィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｆｉｍｉ）ＣｅｎＡ ＥＧからなる群から選択された親セルラーゼに由来する。ある好まれる実施態様では、このセルラーゼ変異体は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３からなる群の構成員とアミノ酸配列が少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一である親セルラーゼに由来する。ある実施態様では、より負の正味電荷は参照ＣＢＨ２との比較において−１または−２である。
【００１３】
本開示発明はさらに、セルラーゼ変異体を提供し、この変異体はセルラーゼ活性を有し、かつリシン残基を化学修飾して該リシン残基の正電荷が除かれている、成熟型である。ある好まれる実施態様では、該化学修飾は無水コハク酸、無水アセトキシコハク酸、無水マレイン酸、無水酒石酸、無水フタル酸、無水トリメリット酸、無水シス−アコニット酸、無水ｔ−ニトロフタル酸、無水酢酸、無水酪酸、無水イソ酪酸、無水ヘキサン酸、無水吉草酸、無水イソ吉草酸および無水ピバル酸からなる群から選択された化合物による処理を含む。ある好まれる実施態様では、このセルラーゼ変異体は、ハイポクレアジェコリーナセロビオヒドロラーゼＩ、ハイポクレアジェコリーナセロビオヒドロラーゼII、ハイポクレアジェコリーナエンドグルカナーゼＩ、ハイポクレアジェコリーナエンドグルカナーゼIIおよびハイポクレアジェコリーナベータ−グルコシダーゼからなる群から選択された親セルラーゼに由来する。ある好まれる実施態様では、このセルラーゼ変異体は、ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２、ハイポクレアコニンギＣＢＨ２、フミコーラインソレンスＣＢＨ２、アクレモニウムセルロリティカスＣＢＨ２、アガリカスビスポラスＣＢＨ２、フサリウムオシスポラムＥＧ、ファネロキーテクリソスポリウムＣＢＨ２、タラロマイセスエメルソニＣＢＨ２、サーモビフィダ．フスカ６Ｂ／Ｅ３ ＣＢＨ２、サーモビフィダフスカ６Ａ／Ｅ２ ＥＧおよびセルロモナスフィミＣｅｎＡ ＥＧからなる群から選択された親セルラーゼに由来する。また、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３からなる群の構成員とアミノ酸配列が少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一である親セルラーゼに由来するセルラーゼ変異体も提供される。ある実施態様では、このセルラーゼ変異体は、６３、７７、１２９、１４７、１５３、１５７、１６１、１９４、１９７、２０３、２３７、２３９、２４７、２５４、２８１、２８５、２８８、２８９、２９４、３２７、３３９、３４４、３５６、３７８および３８２からなる群から選択された１以上の位置における置換を含み、ここで該位置は配列番号３として記載された参照セロビオヒドロラーゼII（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して数えられる。
【００１４】
本発明の教示はさらに、Ｋ１２９Ｅ、Ｋ１５７Ｅ、Ｋ１９４Ｅ、Ｋ２８８Ｅ、Ｋ３２７Ｅ、Ｋ３５６Ｅ、Ｒ６３Ｑ、Ｒ７７Ｑ、Ｒ１５３Ｑ、Ｒ２０３Ｑ、Ｒ２９４Ｑ、Ｒ３７８Ｑ、Ｎ１６１Ｄ、Ｎ１９７Ｄ、Ｎ２３７Ｄ、Ｎ２４７Ｄ、Ｎ２５４Ｄ、Ｎ２８５Ｄ、Ｎ２８９Ｄ、Ｎ３３９Ｄ、Ｎ３４４Ｄ、Ｎ３８２Ｄ、Ｑ１４７Ｅ、Ｑ２０４Ｅ、Ｑ２３９ＥおよびＱ２８１Ｅからなる群から選択された１〜２６の置換を含むＣＢＨ２に関する。ある実施態様では、このＣＢＨ２変異体は、ｉ）Ｋ１５７Ｅ／Ｋ１２９Ｅ、ii）Ｋ１５７Ｅ／Ｋ１２９Ｅ／Ｋ２８８Ｅ／Ｋ１９４Ｅ、iii）Ｋ１５７Ｅ／Ｋ１２９Ｅ／Ｋ２８８Ｅ／Ｋ１９４Ｅ／Ｋ３５６Ｅ／Ｋ３２７Ｅ、iv）Ｋ１５７Ｅ／Ｋ１２９Ｅ／Ｋ２８８Ｅ／Ｋ１９４Ｅ／Ｋ３５６Ｅ／Ｋ３２７Ｅ／Ｒ１５３Ｑ／Ｒ２９４Ｑ／Ｒ２０３Ｑ／Ｒ３７８Ｑ、v）Ｋ１５７Ｅ／Ｋ１２９Ｅ／Ｋ２８８Ｅ／Ｋ１９４Ｅ／Ｋ３５６Ｅ／Ｋ３２７Ｅ／Ｒ１５３Ｑ／Ｒ２９４Ｑ／Ｒ２０３Ｑ／Ｒ３７８Ｑ／Ｎ３８２Ｄ／Ｎ３４４Ｄ／Ｎ３２７Ｄ／Ｎ３３９Ｄ、vi）Ｋ１５７Ｅ／Ｋ１２９Ｅ／Ｋ２８８Ｅ／Ｋ１９４Ｅ／Ｋ３５６Ｅ／Ｋ３２７Ｅ／Ｒ１５３Ｑ／Ｒ２９４Ｑ／Ｒ２０３Ｑ／Ｒ３７８Ｑ／Ｎ３８２Ｄ／Ｎ３４４Ｄ／Ｎ３２７Ｄ／Ｎ３３９Ｄ／Ｎ２８９Ｄ／Ｎ１６１Ｄ／Ｑ２０４Ｅ／Ｑ１４７Ｅ、vii）Ｋ１５７Ｅ／Ｋ１２９Ｅ／Ｋ２８８Ｅ／Ｋ１９４Ｅ／Ｋ３５６Ｅ／Ｋ３２７Ｅ／Ｒ１５３Ｑ／Ｒ２９４Ｑ／Ｒ２０３Ｑ／Ｒ３７８Ｑ／Ｎ３８２Ｄ／Ｎ３４４Ｄ／Ｎ３２７Ｄ／Ｎ３３９Ｄ／Ｎ２８９Ｄ／Ｎ１６１Ｄ／Ｑ２０４Ｅ／Ｑ１４７Ｅ／Ｎ２８５Ｄ／Ｎ１９７Ｄ／Ｎ２５４Ｄ／Ｎ２４７Ｄ、およびviii）Ｋ１５７Ｅ／Ｋ１２９Ｅ／Ｋ２８８Ｅ／Ｋ１９４Ｅ／Ｋ３５６Ｅ／Ｋ３２７Ｅ／Ｒ１５３Ｑ／Ｒ２９４Ｑ／Ｒ２０３Ｑ／Ｒ３７８Ｑ／Ｎ３８２Ｄ／Ｎ３４４Ｄ／Ｎ３２７Ｄ／Ｎ３３９Ｄ／Ｎ２８９Ｄ／Ｎ１６１Ｄ／Ｑ２０４Ｅ／Ｑ１４７Ｅ／Ｎ２８５Ｄ／Ｎ１９７Ｄ／Ｎ２５４Ｄ／Ｎ２４７Ｄ／Ｑ２３９Ｅ／Ｑ２８１Ｅ／Ｒ６３Ｑ／Ｒ７７Ｑからなる群から選択された置換の組み合わせを含む。
【００１５】
ある実施態様では、このＣＢＨ２変異体は、Ｄ１５１Ｎ、Ｄ１８９Ｎ、Ｄ２１１Ｎ、Ｄ２７７Ｎ、Ｄ４０５Ｎ、Ｅ１４６Ｑ、Ｅ２０８ＱおよびＥ２４４Ｑからなる群から選択された１〜８の置換を含む。ある実施態様では、ｉ）Ｄ１８９Ｎ／Ｅ２０８Ｑ／Ｄ２１１Ｎ／Ｄ４０５およびii）Ｄ１８９Ｎ／Ｅ２０８Ｑ／Ｄ２１１Ｎ／Ｄ４０５／Ｅ２４４Ｑ／Ｄ２７７Ｎ／Ｄ１５１／Ｅ１４６Ｑからなる群から選択された置換の組み合わせを含む。
【００１６】
また前出の段落に記載されたセロビオヒドロラーゼ活性を有するＣＢＨ２変異体をコードする単離された核酸も記載される。第一の側面では、本開示発明は、セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸であって、該ポリペプチドが第６族のグリコールヒドロラーゼの変異体であり、かつ当該核酸が野生型ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２に比較して正味電荷を減少する残基における置換をコードする核酸も包含する。
【００１７】
他の側面では、本開示発明はＣＢＨ２変異体をコードする単離された核酸であって、当該核酸がＣＢＨ２の成熟型におけるＫ１２９Ｅ、Ｋ１５７Ｅ、Ｋ１９４Ｅ、Ｋ２８８Ｅ、Ｋ３２７Ｅ、Ｋ３５６Ｅ、Ｒ６３Ｑ、Ｒ７７Ｑ、Ｒ１５３Ｑ、Ｒ２０３Ｑ、Ｒ２９４Ｑ、Ｒ３７８Ｑ、Ｎ１６１Ｄ、Ｎ１９７Ｄ、Ｎ２３７Ｄ、Ｎ２４７Ｄ、Ｎ２５４Ｄ、Ｎ２８５Ｄ、Ｎ２８９Ｄ、Ｎ３３９Ｄ、Ｎ３４４Ｄ、Ｎ３８２Ｄ、Ｑ１４７Ｅ、Ｑ２０４Ｅ、Ｑ２３９Ｅ、Ｑ２８１Ｅ、Ｄ１５１Ｎ、Ｄ１８９Ｎ、Ｄ２１１Ｎ、Ｄ２２７Ｎ、Ｄ４０５Ｎ、Ｅ１４６Ｑ、Ｅ２０８ＱおよびＥ２４４Ｑからなる群から選択された位置における置換を含み、当該置換が配列番号３の成熟型のハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２に従って数えられる、核酸に関する。
【００１８】
ある実施態様では、本開示発明はＣＢＨ２変異体をコードする単離された核酸を含む発現カセット、調節配列に機能しうるように連結されたＣＢＨ２変異体をコードする核酸を含む構成体、およびＣＢＨ２変異体をコードする核酸を含むベクターによって形質転換された宿主細胞に関する。本発明の教示はさらに、ＣＢＨ２変異体を再生するのに適した条件下の培地中でＣＢＨ２変異体を発現する細胞を培養することによって、ＢＨ２変異体を産生する方法を提供する。
【００１９】
同様に提供されるのは、前出の段落のセルラーゼ変異体を含む組成物である。ある好まれる実施態様では、この組成物はさらに、サブチリシン、中性メタロプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼおよびペルオキシダーゼからなる群から選択された少なくとも１のさらなる酵素を含む。
【００２０】
本明細書で提供されるのは、バイオマスを糖に転化する方法であって、当該バイオマスをセルラーゼ変異体と接触させる工程を含む方法である。同様に提供されるのは、燃料を製造する方法であって、バイオマス組成物をセルラーゼ変異体を含む酵素組成物と接触させて、糖溶液を生成する工程、および燃料を製造するのに十分な条件下に発酵性微生物とともに温置する工程を含む方法である。
【００２１】
同様に提供されるのは、セルラーゼ変異体を含む組成物、たとえば洗剤組成物、たとえば飼料添加物、ならびに織物表面および／または織物を含む物品に洗剤組成物を接触させることによる洗浄および織物柔軟仕上げの方法である。また、織物表面および／または織物を含む物品にセルラーゼ変異体を接触させることによる織物柔軟仕上げの方法、たとえばけばだち防止および表面仕上げも提供される。
【００２２】
本発明の他の目的、特徴および利点は以下の詳細な説明から明らかにされる。しかし、本開示発明の範囲および精神の範囲内において様々な変更および修正が本明細書の詳細な記載から当業者には明らかになろうから、詳細な説明および特定の実施例は、本開示発明の好ましい実施態様を示すけれども、例示の目的のためにのみ示されていることが理解されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】存在するリグニン阻害剤の量を増加するときの、修飾（四角印）および非修飾（丸印）トリコデルマ種セルラーゼ調製物によるＡＰＢの糖化を示すグラフである。図１Ａは２４時間温置後の結果を示す。
【図１Ｂ】存在するリグニン阻害剤の量を増加するときの、修飾（四角印）および非修飾（丸印）トリコデルマ種セルラーゼ調製物によるＡＰＢの糖化を示すグラフである。図１Ｂは４８時間温置後の結果を示す。
【図２Ａ】各種の修飾セルラーゼを比較する糖化を示すグラフである。
【図２Ｂ】修飾および非修飾セルラーゼを用いた糖化の差異を示すグラフである。
【図３】成熟型の各種のセルラーゼ、すなわちハイポクレアジェコリーナ（トリコデルマリーゼイとしても知られている。）ＣＢＨ２（配列番号３）、ハイポクレアコニンギＣＢＨ２（配列番号４）、フミコーラインソレンスＣＢＨ２（配列番号５）、アクレモニウムセルロリティカスＣＢＨ２（配列番号６）、アガリカスビスポラスＣＢＨ２（配列番号７）、フサリウムオシスポラムＥＧ（配列番号８）、ファネロキーテクリソスポリウムＣＢＨ２（配列番号９）、タラロマイセスエメルソニＣＢＨ２（配列番号１０）、サーモビフィダフスカ６Ｂ／Ｅ３ ＣＢＨ２（配列番号１１）、サーモビフィダフスカ６Ａ／Ｅ２ＥＧ ＣＢＨ２（配列番号１２）およびセルロモナスフィミＣｅｎＡ ＥＧ（配列番号１３）のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図４】電荷変化の産物としてのＣＢＨ２変異体セルラーゼの、前処理トウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）アッセイのウィナーの予測に対する実測の相対度数を示すグラフである。
【図５】ｐＴＴＴｐｙｒ−ｃｂｈ２のプラスミドマップを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の教示は、非セルロース素材への結合力を低減するように修飾されたセルラーゼ変異体に関する。一般に、このセルラーゼ変異体は、非セルロース素材の存在下において野生型のセルラーゼと比較して増加されたセルロース分解活性を有する。ある実施態様では、このセルラーゼ変異体は、野生型のセルラーゼと比較して減少された正味電荷（すなわち、野生型のセルラーゼよりも負側の電荷）を有する。ある実施態様では、このセルラーゼ変異体は、野生型のセルラーゼよりも低度に正に帯電している。ある実施態様では、セルラーゼは１以上の正電荷を除くことによって修飾される。ある実施態様では、セルラーゼは１以上の負電荷を加えることによって修飾される。ある実施態様では、セルラーゼは１以上の正電荷を除くことおよび１以上の負電荷を加えることによって修飾される。
【００２５】
これまでの一般的記載および以降の詳細な記載の双方とも例示および説明のためのみのものであり、本明細書に記載された構成および方法を限定するものではないことが理解されなければならない。本明細書で他様に定義されない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語および科学用語は、本開示発明が属する分野の当業者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書では、単数形の使用は、他様に具体的に述べられない限り複数形をも含む。「または」の使用は、他様に述べられない限り「および／または」を意味する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「（単数形が）含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「包含している（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「（単数形が）包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」の語は限定することを意図していない。本明細書で引用されたすべての特許および刊行物は、かかる特許および刊行物内に開示されたすべてのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を含めて、参照によって本明細書に明示的に取り込まれる。本明細書に設けられた見出しは、本明細書全体を参照することによって把握されることができる本開示発明の様々な側面または実施態様を限定するものではない。したがって、本明細書の用語は本明細書全体を参照することによって、より完全に定義される。
【００２６】
本明細書で他様に定義されない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語および科学用語は、本開示発明が属する分野の当業者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、第２版、１９９４年、米国、ニューヨーク州、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ社、ならびにＨａｌｅおよびＭａｒｈａｍ、ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ、１９９１年、米国、ニューヨーク州、Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ社は、当業者に本明細書で用いられる用語の多くの一般的辞書を提供する。本明細書に記載された方法および物質と相似または同等の任意の方法および物質が、本開示発明の実施および試験に用いられることができるけれども、好まれる方法および物質が記載される。数値範囲は、その範囲を規定する数字を包含する。他様に示されない限り、核酸は左から右に５’から３’の方向に、アミノ酸配列は左から右にアミノ基からカルボキシル基の方向に、それぞれ書かれる。本発明実施者は、当分野の定義および用語のために、特にＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ: Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ(第２版)、１９８９年、米国、ニューヨーク州、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ社、およびＡｕｓｕｂｅｌ ＦＭら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９３年、米国、ニューヨーク州、ニューヨーク、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社を参照するように要請される。本開示発明は、記載された特定の方法論、手順および試薬に、これらのものは様々なものであることができるから、限定されないことが理解されなければならない。
Ｉ．定義
【００２７】
以下の用語は、本明細書全体を参照することによってより完全に定義される。
【００２８】
本明細書で用いられる「ポリペプチド」の語は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基の一本鎖からなる化合物をいう。本明細書で用いられる「タンパク質」の語は、「ポリペプチド」の語と同義であることができる。
【００２９】
「変異体」は、Ｃ−もしくはＮ−末端のいずれかもしくは双方への１以上のアミノ酸の付加、アミノ酸配列中の１もしくは多数の異なる部位における１以上のアミノ酸の置換、もしくはタンパク質の一方もしくは双方の末端における、もしくはアミノ酸配列中の１以上の部位における１以上のアミノ酸の欠失によって前駆体タンパク質（たとえば、野生型タンパク質）から誘導されたタンパク質、または１以上のアミノ酸が、電荷を変えることによって(すなわち、正電荷を除くこと、負電荷を加えること、または正電荷を除くことおよび負電荷を加えることの双方によって)修飾されることを意味する。セルラーゼ変異体の調製は、従来技術で知られた任意の手段、たとえばアミノ酸の化学修飾によって、野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列の修飾、修飾ＤＮＡ配列の好適な宿主中への形質転換、および修飾ＤＮＡ配列を発現して変異体酵素を形成することによって実施されることができる。本開示発明の変異体セルラーゼは、前駆体酵素アミノ酸配列と比較して変化されたアミノ酸配列を含むペプチドを包含し、この変異体セルラーゼは前駆体酵素の特徴的なセルロース分解性質を保持するが、ある特定の側面において変えられた特性を有することができる変異体セルラーゼである。たとえば、変異体セルラーゼは、増加されたｐＨ最適値、または増加された温度安定性もしくは酸化安定性、または非セルロース素材への減少された親和性もしくは結合性を有することができるが、その特徴的なセルロース分解性質を保持する。本開示発明に従う変異体は、セルラーゼ変異体をコードするＤＮＡ断片であって、発現されたセルラーゼ変異体の機能的活性が保持されるＤＮＡ断片に由来することができる。たとえば、セルラーゼをコードするＤＮＡ断片はさらに、５’または３’末端のいずれかにおいてセルラーゼＤＮＡ配列に付加されたヒンジまたはリンカーをコードするＤＮＡ配列またはその一部であって、コードされたセルラーゼドメインの機能的活性が保持されるＤＮＡ配列またはその一部を含むことができる。変異体および誘導体の語は、本明細書では互換的に用いられることができる。
【００３０】
「同等の残基」は、その三次構造がＸ線結晶学によってすでに決定されている前駆体セルラーゼの三次構造のレベルにおける相同性を測定することによって定義されることもできる。同等の残基とは、アラインメント後に、セルラーゼとハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２との特定のアミノ酸残基の２以上の主鎖原子の原子座標（ＮとＮ、ＣＡとＣＡ、ＣとＣおよびＯとＯ）が０．１３ｎｍ以内、好ましくは０．１ｎｍ以内であるものと定義されることができる。アラインメントは、最善のモデルが方向と位置とを定められて、問題のセルラーゼの非水素タンパク質原子の原子座標がハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２と最大の重なりを与えた後に初めて達成される。この最善のモデルは、利用可能な最高の分解能における回折実験データについてもっとも低いＲ因子を与える結晶学モデルであり、たとえば米国特許出願公開第２００６／０２０５０４２参照。
【００３１】
ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２の特定の残基に機能的に類似している同等の残基は、ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２の特定の残基について定義され帰属される様式で、タンパク室の構造を変え、基質との結合を修飾し、または触媒反応に寄与するような立体配座をとることができるセルラーゼのアミノ酸であると定義される。さらに、この同等の残基は、所与の残基の主鎖原子は相同の位置を占めることに基づく同等の判断基準を満たさないかも知れないけれども、その残基の側鎖原子の少なくとも２の原子座標がハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２の対応する側鎖原子から０．１３ｎｍに存在する程度に類似した位置を占める（その三次構造がＸ線結晶学によってすでに得られている）セルラーゼの残基である。ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２の結晶構造は、Ｚｏｕら、１９９９年（非特許文献５、前掲）に示されている。
【００３２】
「核酸分子」の語は、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む。遺伝暗号の縮重性の結果として、所与のタンパク質、たとえばＣＢＨ２および／またはその変異体をコードする複数のヌクレオチド配列が産生されることができることが理解される。本開示発明は、変異体セルラーゼ、たとえばＣＢＨ２をコードするすべての可能な変異体ヌクレオチド配列であって、遺伝暗号の縮重性を前提とすると、そのすべてが可能である変異体ヌクレオチド配列を考慮する。
【００３３】
「非相同」な核酸構成体または配列は、該「非相同」な核酸構成体または配列がその中で発現する細胞に天然でない配列の一部を有する。制御配列に関して非相同とは、その発現をその制御配列が現に調節している同じ遺伝子を調節するように天然には機能しない制御配列（すなわち、プロモーターまたはエンハンサー）をいう。一般に、非相同核酸配列は、その中に該非相同核酸配列が存在する細胞またはゲノムの一部に内因性ではなくて、その細胞にインフェクション、トランスフェクション、形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等によって加えられたものである。「非相同」核酸構成体は、天然細胞中に認められる制御配列／ＤＮＡコーディング配列の組み合わせと同じ、またはそれと異なる制御配列／ＤＮＡコーディング配列の組み合わせを有することができる。
【００３４】
本明細書で用いられる「ベクター」の語は、異なる宿主細胞間を移動するように設計された核酸構成体をいう。「発現ベクター」とは、異質細胞中に非相同ＤＮＡ断片を移入し発現する能力を有するベクターをいう。多くの原核細胞および真核細胞発現ベクターが商業的に入手可能である。適当な発現ベクターの選択は当業者の知識の範囲内である。
【００３５】
したがって、「発現カセット」または「発現ベクター」とは、標的細胞中の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸要素を有する、組換え的にまたは合成的に生成された核酸構成体である。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスまたは核酸断片中に取り込まれることができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、数ある配列の中でも、転写されるべき核酸配列およびプロモーターを含む。
【００３６】
本明細書で用いられる「プラスミド」の語は、クローン化ベクターとして用いられる環状二重鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構成体をいい、多くの細菌および一部の真核生物中で染色体外自己複製遺伝要素を形成する。
【００３７】
本明細書で用いられる「選択可能マーカーをコードする核酸配列」の語は、細胞中で発現する能力のある核酸配列をいい、該選択可能マーカーの発現は、発現された遺伝子を有する細胞に、対応する選択剤の存在下にまたは対応する選択的な成長条件下に成長する能力を与える。
【００３８】
本明細書で用いられる「プロモーター」の語は、下流の遺伝子の転写を指令するように機能する核酸配列をいう。プロモーターは一般に、その中で標的遺伝子が発現される宿主細胞に適当なものである。プロモーターは、他の転写および複写調節核酸配列（「制御配列」とも呼ばれる。）とともに所与の遺伝子を発現するのに必要である。一般に、転写および翻訳調節核酸配列は、以下に限定されることなく、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写出発および停止配列、翻訳出発および停止配列、ならびにエンハンサーまたは活性化配列を含む。
【００３９】
本明細書で定義される「キメラ遺伝子」または「非相同核酸構成体」とは、異なる遺伝子、たとえば調節要素の一部から構成されることができる非天然遺伝子（すなわち、宿主中に導入された遺伝子）をいう。宿主細胞の形質転換のためのキメラ遺伝子構成体は、典型的には非相同タンパク質をコードする配列に、または選択可能マーカーキメラ遺伝子では、たとえば、形質転換された細胞に抗生物質耐性を与えるタンパク質をコードする選択可能マーカー遺伝子に、機能しうるように連結された転写調節領域（プロモーター）から構成される。本開示発明の典型的なキメラ遺伝子は、宿主細胞中への形質転換のために、構造性または誘導性である形質転換調節領域、タンパク質をコードする配列およびターミネーター配列を含む。キメラ遺伝子構成体は、標的タンパク質の分泌が望まれるならば、シグナルペプチドをコードする第二のＤＮＡ配列も含む。
【００４０】
核酸は、他の核酸配列と機能的関係になるように置かれると「機能しうるように連結され」ている。たとえば、分泌リーダーをコードするＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現されるならば、そのポリペプチドのためのＤＮＡと機能しうるように連結されており、プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与えるならば、そのコーディング配列と機能しうるように連結されており、またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置しているならば、コーディング配列と機能しうるように連結されている。一般に、「機能しうるように連結され」とは、連結されているＤＮＡ配列が近接しており、また、分泌リーダーの場合には、近接しかつリーディングフレーム内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは近接している必要はない。連結は、都合のよい制限部位における結合によって達成される。かかる部位が存在しないならば、合成オリゴヌクレオチドアダプター、ＰＣＲ用のリンカーまたはプライマーが、慣用の実施法に従って用いられる。
【００４１】
本明細書で用いられる「遺伝子」の語は、ポリペプチド鎖の産生に関わっているＤＮＡのセグメントを意味し、このＤＮＡのセグメントは、コーディング領域の前および後の領域、たとえば５’非翻訳（５’ＵＴＲ）すなわち「リーダー」配列および３’ＵＴＲすなわち「トレーラー」配列、ならびに個々のコーディングセグメント（エキソン）間の介入配列（イントロン）を含んでいても、いなくてもよい。
【００４２】
一般に、変異体セルラーゼ、たとえばＣＢＨ２をコードする核酸分子は、中程度から高度の厳密度条件下に野生型配列、たとえば本明細書に配列番号１として示される配列とハイブリダイズする。しかし、ある場合にはＣＢＨ２をコードする、実質的に異なるコドン使用頻度を有するヌクレオチド配列が用いられ、その場合にＣＢＨ２をコードするヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質は、天然タンパク質と同じまたは実質的に同じアミノ酸配列を有する。たとえば、コーディング配列は、宿主によって特定のコドンが用いられる頻度に従って、特定の原核または真核発現系においてＣＢＨ２のより速い発現を促進するように修飾されることができる（Ｔｅ’ｏら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２０００年、第１９０巻、ｐ．１３〜１９、たとえば糸状菌中での発現のための遺伝子の最適化が記載されている。）。
【００４３】
核酸配列は、参照核酸配列に、これらの２の配列が適度から高度の厳密度のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下に互いに特異的にハイブリダイズするならば、「選択的にハイブリダイズ可能」であると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体またはプローブの融解温度（Ｔ_ｍ）を基準としている。たとえば、「最高厳密度」は典型的には約Ｔ_ｍ−５℃（プローブのＴ_ｍの５℃下）で、「高度厳密度」はＴ_ｍの約５〜１０℃下で、「適度」または「中程度の厳密度」はプローブのＴ_ｍの約１０〜２０℃下で、また「低度厳密度」はＴ_ｍの約２０〜２５℃下で行われる。機能的には、最高厳密度条件が用いられて、ハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性または厳密に近い同一性を有する配列を特定することができ、他方、高度厳密度条件が用いられて、プローブと約８０％以上の配列同一性を有する配列を特定することができる。
【００４４】
適度および高度厳密度ハイブリダイゼーション条件は、従来技術で周知である（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、第９および１１章、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、１９９３年参照。これらの内容は参照によって本明細書に明示的に取り込まれる。）。高度厳密度条件の例は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５倍のＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ修飾キャリアＤＮＡ中約４２℃におけるハイブリダイゼーション、引き続く室温で２倍ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中２回の洗浄、ならびに０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中４２℃におけるもう２回の洗浄を含む。
【００４５】
「組換え」の語は、たとえば細胞または核酸、タンパク質またはベクターに関連して用いられるときは、その細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、非相同核酸もしくはタンパク質の導入、もしくは天然核酸もしくはタンパク質の変化によって修飾されていること、またはその細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示す。したがって、たとえば組換え細胞は、天然（非組換え）型の細胞内に見出されない遺伝子を発現し、または他様に異常に発現された、不十分に発現された、もしくはまったく発現されていない天然遺伝子を発現する。
【００４６】
本明細書で用いられる、細胞に関連した「形質転換され」、「安定に形質転換され」または「トランスジェニックの」の語は、その細胞が非天然（非相同）核酸配列をそのゲノム中に、もしくは複数世代を通して維持されるエピソームプラスミドとして一体化させたことを意味する。
【００４７】
本明細書で用いられる「発現」の語は、遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが産生される過程をいう。この過程は転写および翻訳の双方を含む。
【００４８】
核酸配列を細胞中に挿入する文脈における「導入され」の語は、「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、核酸配列が真核細胞または原核細胞中に取り込まれることをいうことも含み、この場合に、核酸配列はその細胞のゲノム（たとえば、染色体、プラスミドまたはミトコンドリアＤＮＡ）中に取り込まれ、自律レプリコンに変換され、または一時的に発現されることができる（たとえば、トランスフェクトｍＲＮＡ）。
【００４９】
したがって、「ＣＢＨ２発現」の語はｃｂｈ２遺伝子またはその変異体の転写および翻訳のことをいうということになり、その産生物は前駆体ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後プロセシングを受けたポリペプチドおよびこれらの誘導体、たとえば関連した種由来のＣＢＨ２、たとえばトリコデルマコニンギ、ハイポクレアジェコリーナ（トリコデルマロンギブラキアタム、トリコデルマリーゼイまたはトリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）としても知られている。）、ハイポクレアシュワイニッチ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ）を含む。例として、ＣＢＨ２発現の試験は、ＣＢＨ２タンパク質のためのウェスタンブロット、ｃｂｈ２ ｍＲＮＡのためのノーザンブロット分析および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＴ）試験、亜リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）およびｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（ＰＡＨＢＡＨ）試験を含み、この亜リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）およびｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（ＰＡＨＢＡＨ）試験は以下に記載されている。すなわち、（ａ）ＰＡＳＣ：（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｊら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、２００１年、第２６８巻、ｐ．６４９８−６５０７、Ｗｏｏｄ，Ｔ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８８年、第１６０巻、バイオマスの章セルロースおよびヘミセルロース（Ｗｏｏｄ，Ｗ．およびＫｅｌｌｏｇ，Ｓ．編）、１９８８年、ｐ．１９−２５、米国、カリフォルニア州、Ｓａｎｄｉｅｇｏ、Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ社）および（ｂ）ＰＡＨＢＡＨ：（Ｌｅｖｅｒ，Ｍ．、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７２年、第４７巻、ｐ．２７３、Ｂｅｒｋｅｎｅｙ，Ａ．Ｂ．およびＭｕｔｔｏｎ，Ｌ．Ｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、１９８０年、第３１巻、ｐ．８８９、Ｈｅｎｒｙ，Ｒ．Ｊ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｒｅｗｉｎｇ、１９８４年、第９０巻、ｐ．３７）。
【００５０】
「選択的スプライシング」の語は、単一の遺伝子から複数のポリペプチドのイソ型が生成される過程をいい、遺伝子の転写産物のすべてではなくその一部のプロセシングの間に非連続エキソンを一緒にスプライシングすることを含む。したがって、特定のエキソンはいくつかの代わりのエキソンの任意のひとつに接続されてメッセンジャーＲＮＡを形成することができる。選択的スプライシングをされたｍＲＮＡは、その中の一部の部分が共通し他の部分が異なるポリペプチド（「スプライス変異体」）を産生する。
【００５１】
「シグナル配列」の語は、細胞の外への成熟型のタンパク質の分泌を促進するそのタンパク質のＮ末端部分にあるアミノ酸の配列をいう。成熟型の細胞外タンパク質はシグナル配列を欠いており、それは分泌過程の間に切り離される。
【００５２】
「宿主細胞」の語は、ベクターを含み、発現構成体の複写および／もしくは転写または転写および翻訳（発現）を支える細胞を意味する。本開示発明に用いられる宿主細胞は、原核細胞、たとえば大腸菌、または真核細胞、たとえば酵母、植物、昆虫、両生類もしくは哺乳類の細胞であることができる。一般に、宿主細胞は糸状菌である。
【００５３】
「糸状菌」の語は、当業者によって認識されるいずれかのまたはすべての糸状菌を意味する。好まれる糸状菌は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ、フサリウム、クリソスポリウム、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、フミコーラ、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）またはこれらの代替性型、たとえばエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、ハイポクレアからなる群から選択される。無性の工業用真菌トリコデルマリーゼイが、子嚢菌ハイポクレアジェコリーナのクローン誘導体であることは今では証明されている（Ｋｕｈｌｓら、ＰＮＡＳ、１９９６年、第９３巻、ｐ．７７５５−７７６０参照）。
【００５４】
「セロオリゴ糖」の語は、２〜８のグルコース単位を含みベータ１，４結合を有するオリゴ糖の群、たとえばセロビオースをいう。
【００５５】
「セルラーゼ」、「セルロース分解酵素」または「セルラーゼ酵素」の語は、セルロースポリマーをより短いセロオリゴ糖オリゴマー、セロビオースおよび／またはグルコースに加水分解する能力のある酵素の区分をいう。セルラーゼの多数の例、たとえばエキソグルカナーゼ、エキセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、およびグルコシダーゼが、セルロース分解生物、たとえば特に真菌、植物および細菌から得られている。これらの微生物からつくられた酵素は、セルロースをグルコースに転化するのに役立つ３の作用タイプ、すなわち、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）、セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）およびベータ−グルコシダーゼ（ＢＧＬまたはＢｇｌｕ）を有するタンパク質の混合物である。セルロース酵素のこれらの３の異なるタイプは、相乗的に作用して、セルロースおよびその誘導体をグルコースに転化する。
【００５６】
多くの微生物はセルロースを分解する酵素をつくり、たとえば木材腐朽菌トリコデルマ、コンポスト菌サーモモノスポーラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびセルロノナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）；ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）；ならびに真菌フミコーラ、アスペルギルスおよびフサリウムである。
【００５７】
ハイポクレアジェコリーナ由来のＣＢＨ２は、グリコシルヒドロラーゼファミリー６（Ｇｌｙｃｏｓｙｌ Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ｆａｍｉｌｙ６）の構成員（したがって、Ｃｅｌ６）であり、かつ、特にハイポクレアジェコリーナ中に同定されたそのファミリーの第一の構成員（したがって、Ｃｅｌ６Ａ）であった。グリコシルヒドロラーゼファミリー６はエンドグルカナーゼとセロビオヒドロラーゼ／エキソグルカナーゼとの双方を含み、ＣＢＨ２は後者である。したがって、ＣＢＨ２、ＣＢＨ２型タンパク質およびＣｅｌ６の語句は本明細書では互換的に用いられることができる。
【００５８】
本明細書で用いられる「セルロース結合ドメイン」の語は、セルラーゼのアミノ酸配列の部分またはセルラーゼまたはその誘導体のセルロース結合活性に関与する酵素の領域をいう。セルロース結合ドメインは一般に、非共有結合的にセルラーゼをセルロース、セルロース誘導体またはこれらの他の多糖等価物に結合することによって機能する。セルロース結合ドメインは、構造的に区別できる触媒コア領域によってセルロース繊維の加水分解を可能にしまたは促進し、また典型的には該触媒核とは独立に機能する。したがって、セルロース結合ドメインは、触媒コアに帰属できる有意の加水分解活性を有さない。言い換えれば、セルロース結合ドメインは、触媒活性を有する構造要素とは区別できる、セルラーゼ酵素タンパク質の三次構造の構造要素である。セルロース結合ドメインおよびセルロース結合モジュールは本明細書では互換的に用いられることができる。
【００５９】
本明細書で用いられる「界面活性剤」の語は、界面活性特性を有すると従来技術で一般的に認められる任意の化合物をいう。したがって、たとえば界面活性剤はアニオン性、カチオン性およびノニオン性界面活性剤、たとえば洗剤に普通に見られるものを含む。アニオン性界面活性剤は、直鎖状または分枝状アルキルベンゼンスルホネート、アルキルまたはアルケニルサルフェート、オレフィンスルホネート、およびアルカンスルホネートを含む。両性界面活性剤は４級アンモニウム塩スルホネート、およびベタイン型両性界面活性剤を含む。かかる両性界面活性剤は、同じ分子中に正および負に帯電した基の双方を有する。ノニオン性界面活性剤は、ポリオキシアルキレンエーテル、ならびに高級脂肪酸アルカノールアミドまたはそのアルキレンオキシド付加物、脂肪酸グリセリンモノエステル等を含むことができる。
【００６０】
本明細書で用いられる「セルロース含有布地」の語は、綿含有もしくは綿非含有セルロース、天然セルロース誘導体および人工セルロース誘導体を含む綿含有もしくは綿非含有セルロースブレンドからつくられた任意の縫製または非縫製布地、ヤーンまたは繊維（たとえば、ジュート、亜麻、ラミー、レーヨンおよびリヨセル（ｌｙｏｃｅｌｌ））をいう。
【００６１】
本明細書で用いられる「綿含有布地」の語は、純綿もしくは綿ブレンドからつくられた縫製または非縫製布地、ヤーンまたは繊維、たとえば綿織布地、綿ニット、綿デニム、綿ヤーン、原綿等をいう。
【００６２】
本明細書で用いられる「ストーンウォッシュ組成物」の語は、ストーンウォッシュセルロース含有布地に用いられる配合物をいう。ストーンウォッシュ組成物は、販売前に、すなわち製造工程の間にセルロース含有布地を修飾するために用いられる。対照的に、洗剤組成物は汚れた衣類の洗浄を目的とし、製造工程の間には用いられない。
【００６３】
本明細書で用いられる「洗剤組成物」の語は、汚れたセルロース含有布地を洗濯するための洗浄媒体中で用いられることを目的とした混合物をいう。本開示発明の文脈では、かかる組成物は、セルラーゼおよび界面活性剤に加えて、追加の加水分解酵素、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、青味剤および蛍光染料、ケーキ防止剤、マスキング剤、セルラーゼ活性化剤、酸化防止剤および可溶化剤を含んでもよい。
【００６４】
本明細書で用いられる「ｃｂｈ２遺伝子の発現の減少または排除」の語は、ｃｂｈ２遺伝子がゲノムから欠失しており、それゆえ組換え宿主微生物によって発現されることができないか、あるいは機能性ＣＢＨ２酵素が宿主微生物によって産生されないように、または非修飾のｃｂｈ２遺伝子または転写産物よりも有意に少ないレベルでｃｂｈ２遺伝子または転写産物が修飾されていることを意味する。
【００６５】
「変異体ｃｂｈ２遺伝子」の語は、ハイポクレアジェコリーナ由来のｃｂｈ２遺伝子の核酸配列が、除去、追加および／またはコーディング配列の操作によって変えられていることを意味する。
【００６６】
本明細書で用いられる「精製する」の語は、一般にトランスジェニックの配列もしくはタンパク質を含有する細胞を生化学的精製および／またはカラムクロマトグラフィーに付することをいう。
【００６７】
本明細書で用いられる「活性な」および「生物学的に活性な」の語は、特定のタンパク質と関連付けられた生物学的活性をいい、本明細書では互換的に用いられる。たとえば、プロテアーゼと関連付けられた酵素活性はタンパク質分解であり、したがって活性なプロテアーゼはタンパク質分解活性を有する。所与のタンパク質の生物学的活性は、当業者によって典型的にそのタンパク質に帰属される任意の生物学的活性をいうということになる。
【００６８】
本明細書で用いられる「濃縮され」の語は、セルラーゼ、たとえばＣＢＨ２が、野生型または天然に存在する真菌セルラーゼ組成物中に認められるＣＢＨ２濃度に比較して大きい濃度で認められることを意味する。濃縮され、高められ、および強化されの語は本明細書では互換的に用いられる。
【００６９】
野生型真菌セルラーゼ組成物は、天然に存在する真菌源によって産生されたものであり、それは１以上のＢＧＬ、ＣＢＨおよびＥＧ成分を含み、これらの成分のそれぞれは該真菌源によって産生された割合で認められる。したがって、濃縮されたＣＢＨ組成物はＣＢＨを変えられた割合で有し、ＣＢＨの他のセルラーゼ成分（すなわち、ＥＧ、ベータ−グルコシダーゼおよび他のエンドグルカナーゼ）に対する比は高められている。従来技術で知られた任意の手段によって、ＣＢＨを増加するか、あるいは少なくとも１の他の成分を減少（または除去）することによって、この比は増加されることができる。
【００７０】
本明細書で用いられる「単離され」または「精製され」の語は、それが天然に結びついている少なくとも１の成分から分離された核酸またはアミノ酸をいう。
【００７１】
したがって、例示すると、天然に存在するセルラーゼ系は、文献中に十分に公表された、広く認められている分離技術、たとえば好適なｐＨにおけるイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等によって実質的に純粋な成分に精製されることができる。たとえば、イオン交換クロマトグラフィー（普通、アニオンクロマトグラフィー）では、ｐＨ傾斜もしくは塩傾斜またはｐＨおよび塩傾斜の双方を用いて溶出することによって、セルラーゼ成分を分離することが可能である。精製されたＣＢＨは、次に酵素溶液に添加されて、濃縮されたＣＢＨ溶液を得ることができる。ＣＢＨをコードする遺伝子を過剰発現する分子遺伝学方法を、場合により他のセルラーゼをコードする１以上の遺伝子の欠失と併せて用いて、微生物によって産生されたＣＢＨの量を高めることも可能である。
【００７２】
真菌セルラーゼは、１以上のＣＢＨ成分を含むことができる。異なる成分は一般に異なる等電点を有し、イオン交換クロマトグラフィー等によってそれらが分離されることが可能になる。単一のＣＢＨ成分か、あるいはＣＢＨ成分の組み合わせが酵素溶液に用いられることができる。
【００７３】
酵素溶液に用いられるときは、同属体または変異体ＣＢＨ２成分は一般に、バイオマスからの可溶性糖質の最大放出速度を可能にするのに十分な量で添加される。添加された同属体または変異体ＣＢＨ２成分の量は、糖化されるべきバイオマスのタイプに依存し、それは当業者によって容易に決定されることができる。用いられるときは、セルラーゼ組成物中に存在する同属体または変異体ＣＢＨ２成分の重量パーセントは、好ましくは１〜１００であり、例示的実施例は約１、好ましくは約５、好ましくは約１０、好ましくは約１５、または好ましくは約２０パーセント〜好ましくは約２５、好ましくは約３０、好ましくは約３５、好ましくは約４０、好ましくは約４５、または好ましくは約５０重量パーセントである。さらに、好まれる範囲は約０．５〜約１５重量パーセント、約０．５〜約２０重量パーセント、約１〜約１０重量パーセント、約１〜約１５重量パーセント、約１〜約２０重量パーセント、約１〜約２５重量パーセント、約５〜約２０重量パーセント、約５〜約２５重量パーセント、約５〜約３０重量パーセント、約５〜約３５重量パーセント、約５〜約４０重量パーセント、約５〜約４５重量パーセント、約５〜約５０重量パーセント、約１０〜約２０重量パーセント、約１０〜約２５重量パーセント、約１０〜約３０重量パーセント、約１０〜約３５重量パーセント、約１０〜約４０重量パーセント、約１０〜約４５重量パーセント、約１０〜約５０重量パーセント、約１５〜約６０重量パーセント、約１５〜約６５重量パーセント、約１５〜約７０重量パーセント、約１５〜約７５重量パーセント、約１５〜約８０重量パーセント、約１５〜約８５重量パーセント、約１５〜約９０重量パーセント、約１５〜約９５重量パーセントである。しかし、用いられるときは、セルラーゼ組成物中に存在する任意のＥＧ型成分に対する同属体または変異体ＣＢＨ２成分の重量パーセントは、好ましくは約１、好ましくは約５、好ましくは約１０、好ましくは約１５、または好ましくは約２０パーセント〜好ましくは約２５、好ましくは約３０、好ましくは約３５、好ましくは約４０、好ましくは約４５、または好ましくは約５０重量パーセントである。さらに、好まれる範囲は約０．５〜約１５重量パーセント、約０．５〜約２０重量パーセント、約１〜約１０重量パーセント、約１〜約１５重量パーセント、約１〜約２０重量パーセント、約１〜約２５重量パーセント、約５〜約２０重量パーセント、約５〜約２５重量パーセント、約５〜約３０重量パーセント、約５〜約３５重量パーセント、約５〜約４０重量パーセント、約５〜約４５重量パーセント、約５〜約５０重量パーセント、約１０〜約２０重量パーセント、約１０〜約２５重量パーセント、約１０〜約３０重量パーセント、約１０〜約３５重量パーセント、約１０〜約４０重量パーセント、約１０〜約４５重量パーセント、約１０〜約５０重量パーセント、約１５〜約２０重量パーセント、約１５〜約２５重量パーセント、約１５〜約３０重量パーセント、約１５〜約３５重量パーセント、約１５〜約４０重量パーセント、約１５〜約４５重量パーセント、約１５〜約５０重量パーセントであることができる。
II．セルラーゼ
【００７４】
セルラーゼは、セルロース（ベータ−１，４−グルカンまたはベータＤ−グルコシド結合）を加水分解して、グルコース、セロビオース、セロオリゴ糖等を形成する酵素として従来技術で知られている。上記のように、セルロースは伝統的に３の主な種類、すなわちエンドグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）（「ＥＧ」）、エキソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）（「ＣＢＨ」）およびベータ−グルコシダーゼ（［ベータ］−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ：ＥＣ３．２．１．２１）（「ＢＧ」）に分けられている。
【００７５】
ある種の真菌は、エキソセロビオヒドロラーゼすなわちＣＢＨ型セルラーゼ、エンドグルカナーゼすなわちＥＧ型セルラーゼおよびベータ−グルコシダーゼすなわちＢＧ型セルラーゼを含む完全なセルラーゼ系を産生する。しかし、ときには、これらの系はＣＢＨ型セルラーゼおよび細菌性セルラーゼを欠き、また典型的にはＣＢＨ型セルラーゼをほとんどまたはまったく含まない。さらに、ＥＧ成分およびＣＢＨ成分は相乗的に相互作用して、セルロースをより効率的に分解することが示されている。異なる成分、すなわち多成分のまたは完全なセルラーゼ系中の各種のエンドグルカナーゼおよびエキソセロビオヒドロラーゼは、一般に異なる性質、たとえば等電点、分子量、糖化度、基質特異性および酵素作用パターンを有する。
【００７６】
エンドグルカナーゼ型セルラーゼは、セルロースの低結晶化度の領域中の内部ベータ−１，４−グルコシド結合を加水分解し、エキソセロビオヒドロラーゼ型セルラーゼは、セルロースの還元性または非還元性末端からセロビオースを加水分解すると考えられる。エンドグルカナーゼ成分の作用は、エキソセロビオヒドロラーゼ成分によって認識される新しい連鎖末端を創生することによって、エキソセロビオヒドロラーゼの作用を非常に促進することができるということになる。さらに、ベータ−グルコシダーゼ型セルラーゼは、アルキルおよび／またはアリールベータ−Ｄ−グルコシド、たとえばメチルベータ−Ｄ−グルコシドおよびｐ−ニトリフェニルグルコシド、ならびに炭水化物のみを含むグルコシド、たとえばセロビオースの加水分解を触媒することが示されている。これは、微生物のための唯一の産生物としてグルコースを生成し、セロビオヒドロラーゼおよびエンドグルカナーゼを阻害するセロビオースを低減しまたは排除する。
【００７７】
セルラーゼは、洗剤組成物に多数の用途、たとえば清浄化能力を高めること、柔軟化剤として、および綿布地の感触を改善することを見出す（Ｐｒｉｎｔｉｎｇ／Ｆｉｎｉｓｈｉｎｇ、１９９１年、第３巻、ｐ．５−１４；Ｔｙｎｄａｌｌ、Ｔｅｘｔｉｌｅ Ｃｈｅｍｉｓｔ ａｎｄ Ｃｏｌｏｒｉｓｔ、１９９２年、第２４巻、ｐ．２３−２６；およびＫｕｍａｒら、Ｃｈｅｍｉｓｔ ａｎｄ Ｃｏｌｏｒｉｓｔ、１９９７年、第２９巻、ｐ．３７−４２）。機構は本開示発明の一部ではないけれども、セルラーゼの柔軟化および色の保持特性は、米国特許第５，６４８，２６３号、５，６９１，１７８号および５，７７６，７５７号に例示されるようにセルラーゼ組成物中のエンドグルカナーゼ成分に帰されており、これらの米国特許は、特定のアルカリ性エンドグルカナーゼ成分を濃縮されたセルラーゼ組成物を含有する洗剤組成物は、かかる成分を濃縮されていないセルラーゼ組成物と比較して、処理された衣類に色の保持および改善された柔軟性を与えることを開示している。さらに、洗剤組成物中へのかかるアルカリ性エンドグルカナーゼ成分の使用は、（たとえば、米国特許第５，６４８，２６３号、５，６９１，１７８号および５，７７６，７５７号に記載されているように７．５〜１０のアルカリ性ｐＨにおいて最大活性を示すことによって）この洗剤組成物のｐＨの要求を補完することが示されている。
【００７８】
セルラーゼ組成物は、綿含有布地を分解して布地の強度の低減をもたらすことも示されており（米国特許第４，８２２，５１６号）、商業的な洗剤用途にセルラーゼ組成物を用いることへの消極に寄与している。エンドグルカナーゼ成分を含むセルラーゼ組成物は、完全なセルラーゼ系を含むセルラーゼ組成物と比較して、綿含有布地の強度損失の低減を示すことが示唆されている。
【００７９】
セルラーゼは、セルロース性バイオマスのエタノールへの分解に（この場合、セルラーゼがセルロースをグルコースに分解し、酵母または他の微生物がさらにグルコースを発酵してエタノールにする。）、機械パルプの処理に（Ｐｏｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｔａｐｐｉ Ｐｕｌｐｉｎｇ Ｃｏｎｆ．、１９９６年、第２７〜３１巻、ｐ．６９３−６９６、米国、テネシー州、Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ）、飼料添加物としての使用に（国際公開第９１／０４６７３号）、および穀粒の湿式粉砕に有用であることが示されている。
【００８０】
ほとんどのＣＢＨおよびＥＧは、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）からリンカーペプチドによって分離されたコアドメインからなる多ドメイン構造を有する（Ｓｕｕｒｎａｋｋｉら、２０００年）。コアドメインは活性部位を含み、他方、ＣＢＤは該酵素をセルロースに結合することによってセルロースと相互作用する（ｖａｎ Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１８９６年、第２０４巻、ｐ．２２３−２２７；Ｔｏｍｍｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８８年、第１７０巻、ｐ．５７５−５８１）。ＣＢＤは、結晶セルロースの加水分解に特に重要である。示されている。結晶セルロースを分解するセロビオヒドロラーゼの能力は、ＣＢＤがないと明らかに減少する（ Ｊ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９７７年、第５７巻、ｐ．１５−２８）。しかし、ＣＢＤの正確な役割および作用機構は、依然として推測の事柄である。ＣＢＤは、セルロースの表面における有効酵素濃度を単に増加することによって（Ｓｔａｈｌｂｅｒｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９１年、第９巻、ｐ．２８６−２９０）、および／またはセルロース表面から単一セルロース鎖を解き放すことによって（Ｔｏｒｍｏら、ＥＭＢＯ Ｊ、１９９６年、第１５巻、第２１号、ｐ．５７３９−５７５１）酵素活性を高めていることが示唆されている。異なる基質に対するセルラーゼドメインの効果に関するほとんどの研究が、セロビオヒドロラーゼのコアタンパク質がパパインを用いたタンパク質分解によって容易に産生されることができるので、セロビオヒドロラーゼのコアタンパク質を用いて実施されている（Ｔｏｍｍｅら、１９８８年）。多数のセルラーゼが科学文献に記載されており、その例は以下を含む：トリコデルマリーゼイから：Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９８３年、第１巻、ｐ．６９１−６９６、これはＣＢＨ１を開示している。：Ｔｅｅｒｉ，Ｔら、Ｇｅｎｅ、１９８７年、第５１巻、ｐ．４３−５２、これはＣＢＨ２を開示している。トリコデルマ以外の種からのセルラーゼも記載されており、たとえばＯｏｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９０年、第１８巻、第１９号、これはアスペルギルスアクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）によって産生されたエンドグルカナーゼＦ１−ＣＭＣをコードするｃＤＮＡ配列を開示している。Ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ｔら、Ｇｅｎｅ、１９９６年、第１７３巻、第２号、ｐ．２８７−２８８、これはアスペルギルスアクレアタス由来のベータ−グルコシダーゼ１をコードするｃＤＮＡのクローン化および配列決定を開示している。Ｓａｋａｍｏｔｏら、Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ．、１９９５年、第２７巻、ｐ．４３５−４３９、これはアスペルギルスカワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｋａｗａｃｈｉｉ）ＩＦＯ ４３０８由来のエンドグルカナーゼＣＭＣアーゼ１をコードするｃＤＮＡ配列を開示している。Ｓａａｒｉｌａｎｔら、Ｇｅｎｅ、１９９０年、第９０巻、ｐ．９−１４、これはエルビニアカロトバーナ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖａｎａ）由来のエンドグルカナーゼを開示している。Ｓｐｉｌｌｉａｅｒｔ Ｒら、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９４年、第２２４巻、第３号、ｐ．９２３−９３０、これはロードサーマスマリナス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ）由来の熱安定性ベータグルカナーゼをコードするｂｇｌＡのクローン化および配列決定を開示している。およびＨａｌｌｄｏｒｓｄｏｔｔｉｒ Ｓら、Ａｐｐｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９８年、第４９巻、第３号、ｐ．２７７−２８４、これはグリコシルヒドロラーゼファミリー１２の熱安定性セルラーゼをコードするロードサーマスマリナス遺伝子のクローン化、配列決定および過剰発現を開示している。しかし、改善された特性、たとえば熱応力条件下または界面活性剤の存在下の改善された性能、高められた比活性、変えられた基質解裂パターンおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの高レベルの発現を有する新規なセルラーゼの特性および特性解析の必要性が存在する。
【００８１】
様々な量のＣＢＨ型、ＥＧ型およびＢＧ型セルラーゼを含む新規かつ改善されたセルラーゼ組成物の開発は、（１）木材パルプまたは他のバイオマスを糖に分解するための組成物に（たとえば、バイオ燃料のようなバイオ化学品の製造のために）、（２）高められた清浄化能力を示す洗剤組成物に、（３）柔軟化剤としておよび／もしくは綿布地の感触を改善する（たとえば、「ストーンウォッシング」もしくは「バイオポリシング」）機能に、ならびに／または（３）飼料組成物として用いるために関心の対象となっている。
【００８２】
また、本開示発明で提供されるのは、セルラーゼ変異体を含む全セルラーゼ調製物である。本明細書で用いられる「全セルラーゼ調製物」の語は、天然に存在するおよび天然に存在しないセルラーゼ含有組成物の双方をいう。「天然に存在する」組成物とは、天然に存在する源によって産生されるものであり、これは１以上のセロビオヒドロラーゼ型、１以上のエンドグルカナーゼ型および１以上のベータ−グルコシダーゼ成分を含み、これらの成分のそれぞれはその源によって産生された割合で認められる。天然に存在する組成物は、その成分酵素の割合が天然の有機体によって産生されたものから変えられていないようにセルロース分解酵素に関して修飾されていない有機体によって産生されるものである。「天然に存在しない」組成物は、（１）天然に存在する割合で、あるいは天然に存在しない、すなわち変えられた割合で成分セルロース分解酵素を一緒にすること、または（２）有機体を修飾して１以上のセルロース分解酵素を過剰発現または不十分発現すること、または（３）少なくとも１のセルロース分解酵素が欠失されるように有機体を修飾することによって産生された組成物を包含する。したがって、ある実施態様では、全セルラーゼ調製物は、欠失された様々なＥＧおよび／またはＣＢＨおよび／またはベータ−グルコシダーゼの１以上を有する。たとえば、ＥＧ１は、単独でまたは他のＥＧおよび／またはＣＢＨと組み合わされて欠失されることができる。
【００８３】
一般に、全セルラーゼ調製物は、酵素、たとえば、（ｉ）エンドグルカナーゼ（ＥＧ）または１，４−β−ｄ−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ（ＥＣ ３．２．１．４）、（ii）エキソグルカナーゼ、たとえば１，４−β−ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼ（セロデキストリナーゼとしても知られている。）（ＥＣ ３．２．１．７４）および１，４−β−ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ（エキソ−セロビオヒドロラーゼ、ＣＢＨ）（ＥＣ ３．２．１．９１）、および（iii）β−グルコシダーゼ（ＢＧ）もしくはβ−グルコシドグルコヒドロラーゼ（ＥＣ ３．２．１．２１）をこれらに限定されることなく含む。
【００８４】
本開示発明では、全セルラーゼ調製物は、セルロース素材の加水分解に有用である任意の微生物由来のものであることができる。ある実施態様では、全セルラーゼ調製物は糸状菌の全セルラーゼである。「糸状菌」は、真菌類（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）および卵菌類（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）の亜門のすべての糸状型を含む。ある実施態様では、全セルラーゼ調製物は、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、フサリウム、フミコーラ、ムコール、マイセリオフソーラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポーラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、スシタリジウム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、シーラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリプロクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）またはトリコデルマ種の全セルラーゼである。ある実施態様では、全セルラーゼ調製物は、アスペルギルスアクレアタス、アスペルギルスアワモリ、アスペルギルスフォチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルスジャポニカ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃａ）、アスペルギルスニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）またはアスペルギルオリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）の全セルラーゼである。他の実施態様では、全セルラーゼ調製物は、フサリウムバクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フサリウムセレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フサリウムクルックウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フサリウムカルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フサリウムグラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フサリウムグラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フサリウムヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フサリウムネガンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フサリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウムレティクラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フサリウムロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フサリウムサンブシナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フサリウムサルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フサリウムスポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フサリウムサルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フサリウムトルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フサリウムトリコセシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）またはフサリウムベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）の全セルラーゼである。他の実施態様では、全セルラーゼ調製物は、フミコーラインソレンス、フミコーララヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコールミーヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、マイセリオフソーラサーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポーラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、スシタリジウムサーモフィラム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）またはシーラビアテレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）の全セルラーゼである。他の実施態様では、全セルラーゼ調製物は、トリコデルマハージアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマコニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマリーゼイ、たとえばＲＬ−Ｐ３７（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９８４年、第２０巻、ｐ．４６−５３；Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ Ｂ．Ｓ．、Ｃａｎ．、１９８７年）、ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６９２１）、ＮＲＲＬ １５７０９、ＡＴＣＣ １６３６１、５６７６４、５６４６６、５６７６７またはトリコデルマビリデ、たとえばＡＴＣＣ ３２０９８および３２０８６の全セルラーゼである。ある実施態様では、全セルラーゼ調製物は、トリコデルマリーゼイＲｕｔＣ３０の全セルラーゼであり、これはアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）からトリコデルマリーゼイＡＴＣＣ ５６７６５として入手可能である。
【００８５】
本開示発明に用いるのに適した市販のセルラーゼ調製物の例は、たとえばＣＥＬＬＵＣＬＡＳＴ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ社から入手可能）およびＬＡＭＩＮＥＸ（商標）、ＩｎｄｉＡｇｅ（商標）およびＰｒｉｍａｆａｓｔ（商標）ＬＡＭＩＮＥＸ ＢＧ酵素、ＡＣＣＥＬＬＥＲＡＳＥ（商標）１００およびＡＣＣＥＬＬＥＲＡＳＥ（商標）１５００（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ社、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ部門から入手可能）を含む。
【００８６】
本開示発明では、全セルラーゼ調製物は、セルロース素材を加水分解する能力のある酵素の発現をもたらす、従来技術で知られた任意の微生物培養方法由来のものであることができる。発酵は、セルラーゼが発現されまたは単離されるのを可能にする好適な培地中および条件下の、実験室または工業用発酵槽中の、振とうフラスコ培養、小規模または大規模発酵、たとえば連続、バッチ、流加もしくは固相発酵を含むことができる。
【００８７】
一般に、セルロース素材を加水分解する能力のある酵素の産生に適した細胞培地中で、微生物は培養される。培養は、従来技術で知られた手順を用いて炭素および窒素源ならびに無機塩を含む好適な栄養培地中で行われる。好適な培地、成長およびセルラーゼの産生に適した温度範囲および他の条件は従来技術で知られている。非限定的な例として、トリコデルマリーゼイによるセルラーゼの産生のための普通の温度範囲は２４℃〜２８℃である。
【００８８】
一般に、全セルラーゼ調製物は、発酵によって産生され最低限の回収および／もしくは精製をされた状態で、またはされない状態で用いられる。たとえば、セルラーゼが細胞によって細胞培地中に分泌されると、セルラーゼを含む細胞培地が用いられることができる。ある実施態様では、全セルラーゼ調製物は、培地および細胞を包含する発酵物質の非分画内容物を含む。あるいは、全セルラーゼ調製物は、任意の都合のよい方法、たとえば沈降、遠心分離、親和性、ろ過または従来技術で知られた任意の他の方法によって処理されることができる。ある実施態様では、全セルラーゼ調製物は、たとえば濃縮され、そしてさらなる精製なしに用いられることができる。ある実施態様では、全セルラーゼ調製物は、細胞生存率を減少しまたは細胞を殺す化学剤を含む。ある実施態様では、細胞は従来技術で知られた方法を用いて溶解されまたは透過性にされる。
III．分子生物学
【００８９】
１の実施態様では、本開示発明は、真菌中で機能するプロモーターの調節下における変異体ｃｂｈ２遺伝子の発現を提供する。したがって、本開示発明は、組換え遺伝学の分野のルーチンの手法に依存する（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１９８９年、第２版；Ｋｒｉｇｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１９９０年；およびＡｕｓｕｂｅｌら編、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、１９９４年、米国、ニューヨーク州、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ社参照）。
ｃｂｈ２核酸配列を変異する方法
【００９０】
変異を導入する従来技術で知られた任意の方法が、本開示発明によって検討されることができる。
【００９１】
本開示発明は、変異体ｃｂｈ２の発現、精製および／または単離ならびに使用に関する。これらの酵素は、好ましくはハイポクレアジェコリーナ由来のｃｂｈ２遺伝子を用いる組換え方法によって調製される。発酵ブロスは精製されまたはされないで用いられることができる。
【００９２】
ハイポクレアジェコリーナ由来のｃｂｈ２遺伝子の単離およびクローン化後に、従来技術で知られた他の方法、たとえば部位特異的変異誘発法が用いられて、発現されたｃｂｈ２変異体中の置換されたアミノ酸に対応する置換、付加または欠失が行われる。ここでも、部位特異的変異誘発法および発現されたタンパク質中にアミノ酸の変化を導入する他の方法は、従来技術で知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上掲；およびＡｕｓｕｂｅｌら、上掲）。
【００９３】
ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２のアミノ酸配列変異体をコードするＤＮＡは、従来技術で知られた多様な方法によって調製される。これらの方法は、以下のものに限定されることなく、部位特異的（または、オリゴヌクレオチド媒介）変異誘発法、ＰＣＲ変異誘発法およびハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２をコードする予め調製されたＤＮＡのカセット変異誘発法による調製を含む。
【００９４】
部位特異的変異誘発法は、置換変異体を調製するための好まれる方法である。この技術は従来技術で周知である（たとえば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９８５年、第１３巻、ｐ．４４３１−４４４３およびＫｕｎｋｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８７年、第８２巻、ｐ．４８８参照）。手短にいうと、ＤＮＡの部位特異的変異誘発法を実施する、出発ＤＮＡは、最初に所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドをハイブリダイズして、かかる出発ＤＮＡの一本鎖にすることによって変えられる。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、および出発ＤＮＡの一本鎖をテンプレートとして用いて、ＤＮＡポリメラーゼが用いられて第二の鎖が合成される。したがって、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドが、得られた二本鎖ＤＮＡ中に取り込まれる。
【００９５】
ＰＣＲ変異誘発法も、出発ポリペプチド、すなわちハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２のアミノ酸配列変異体をつくるのに適している。Ｈｉｇｕｃｈｉ、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１９９０年、ｐ．１７７−１８３、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社：およびＶａｌｌｅｔｅら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９８９年、第１７巻、ｐ．７２３−７３３参照。たとえば、Ｃａｄｗｅｌｌら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９２年、第２巻、ｐ．２８−３３も参照。手短にいうと、ＰＣＲ中に少量のテンプレートＤＮＡが出発物質として用いられると、テンプレートＤＮＡ中の対応する領域とは配列がわずかに異なるプライマーが用いられて、そのプライマーがそのテンプレートとは異なる位置においてのみテンプレート配列とは異なる比較的大量の特異的ＤＮＡ断片が生成されることができる。
【００９６】
変異体を調製するための他の方法であるカセット変異誘発法は、Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ、１９８５年、第３４巻、ｐ．３１５−３２３に記載された手法に基くものである。出発物質は、変異されるべき出発ポリペプチドＤＮＡを含むプラスミド（または他のベクター）である。出発ＤＮＡ中の１または複数のコドンが同定される。同定された１または複数の変異部位の各側上に、特有の制限エンドヌクレアーゼ部位が存在しなければならない。かかる制限部位が存在しないならば、出発ポリペプチドＤＮＡ中の適当な場所に制限部位を導入する上記のオリゴヌクレオチド媒介変異誘発法を用いて、該制限部位が生成されることができる。プラスミドＤＮＡはこれらの部位で切断されて直線にされる。制限部位間のＤＮＡの配列をコードするが所望の１または複数の変異を含む二本鎖オリゴヌクレオチドが、標準的な手順を用いて合成され、その際該オリゴヌクレオチドの二本鎖は別々に合成され、そして次に標準的な手法を用いて一緒にハイブリダイズされる。この二本鎖オリゴヌクレオチドはカセットと呼ばれる。このカセットは、直線にされたプラスミドにそれが直接、結合されるように、該直線にされたプラスミドの両末端と相容性である５’および３’末端を有するように設計される。このプラスミドは今、変異されたＤＮＡ配列を有する。
【００９７】
上記の代わりの方法で、または上記に加えて、変異体ＣＢＨ２をコードする所望のアミノ酸配列は決められることができ、またかかるアミノ酸配列変異体をコードする核酸配列は合成的に生成されることができる。
【００９８】
このように調製された１または複数の変異体ＣＢＨ２は、しばしば、このセルラーゼの目的とする用途に依存してさらなる修飾に付されることができる。かかる修飾は、アミノ酸配列のさらなる変更、１または複数の非相同ポリペプチドへの融合および／または共有結合的修飾を含むことができる。
IV．ｃｂｈ２核酸およびＣＢＨ２ポリペプチド
Ａ．変異体ｃｂｈ２型核酸
【００９９】
野生型ｃｂｈ２の核酸配列は配列番号１に示される。本開示発明は、本明細書に記載された変異体セルラーゼをコードする核酸分子を包含する。核酸分子はＤＮＡ分子であることができる。
【０１００】
ＣＢＨ２変異体をコードするＤＮＡ配列がＤＮＡ構成体中にクローン化された後、このＤＮＡは微生物を形質転換するために用いられる。本開示発明に従って変異体ＣＢＨ２を発現する目的のために形質転換されるべき微生物は、好都合にはトリコデルマ種に由来する菌株を含むことができる。したがって、本開示発明に従って変異体ＣＢＨ２セルラーゼを調製するための好まれる様式は、変異体ＣＢＨ２の一部または全部をコードするＤＮＡの少なくとも断片を含むＤＮＡ構成体によって、トリコデルマ種宿主細胞を形質転換することを含む。ＤＮＡ構成体は一般にプロモーターに機能的に結合される。形質転換された宿主細胞は次に所望のタンパク質を発現するような条件下に育成される。その後、所望のタンパク質産生物は実質的な均一性まで生成されることができる。
【０１０１】
しかし、実際には、変異体ＣＢＨ２をコードする所与のＤＮＡのための最善の発現媒体はハイポクレアジェコリーナとは異なることがあるかもしれない。したがって、変異体ＣＢＨ２の源有機体と系統発生的相似性を持つ形質転換宿主中でタンパク質を発現することがもっとも好都合かもしれない。アスペルギルスニガーが発現媒体として用いられることができる。アスペルギルスニガーを用いる形質転換手法の説明については、国際公開第９８／３１８２１号参照。この開示内容は参照によってその全体が取り込まれる。
【０１０２】
したがって、アスペルギルス種発現系の本明細書の記載は、例示の目的のためのみにおよび本開示発明の変異体ＣＢＨ２を発現するための一つの選択肢として提供される。しかし、当業者は変異体ＣＢＨ２をコードするＤＮＡを適切であれば異なる宿主細胞中に発現したい気がするかもしれない。そこで、最適の発現宿主を決定するには変異体ＣＢＨ２の源が考慮されなければならないことが理解されなければならない。さらに、当業者は、従来技術で入手できる用具を用いるルーチンの手法によって、特定の遺伝子について最適の発現系を選択する能力があるだろう。
Ｂ．変異体ＣＢＨ２ポリペプチド
【０１０３】
本開示発明の変異体ＣＢＨ２は、前駆体ＣＢＨ２のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する。ＣＢＨ２変異体のアミノ酸配列は、前駆体アミノ酸配列の１以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入によって前駆体ＣＢＨ２のアミノ酸配列とは異なっている。好まれる実施態様では、前駆体ＣＢＨ２はハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２である。ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２の成熟アミノ酸配列は配列番号３に示される。したがって、本開示発明は、ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２中の特定の同定された残基と同等である位置にアミノ酸残基を有するＣＢＨ２変異体に関する。ＣＢＨ２同属体の残基（アミノ酸）はハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２の残基と、それが相同である（すなわち、一次あるいは三次構造における位置において対応している）か、あるいはハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２中の特定の残基に、またはその残基の部分に機能的に類似している（すなわち、化学的もしくは構造的に結合し、反応しもしくは相互作用する、同一または類似した機能的能力を有する）ならば、同等である。本明細書で用いられる付番は、成熟ＣＢＨ２アミノ酸配列の付番（配列番号３）に対応するように意図されている。
【０１０４】
相同を決定するアミノ酸配列のアラインメントは、好ましくは「配列比較アルゴリズム」を用いることによって決定される。比較のための配列の最適のアラインメントは、たとえばＡｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．１９８１年、第２巻、ｐ．４８２の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９７０年、第４８巻、ｐ．４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８８年、第８５巻、ｐ．２４２２の相似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行によって（米国、ウィスコンシン州、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ、５７５、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ社、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗｅａｒ Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査によって実施されることができる。目視検査は図形処理パッケージ、たとえばカナダ国、モントリオール、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ社によるＭＯＥを用いてもよい。
【０１０５】
配列相似性を決定するのに適しているアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０年、第２１５巻、ｐ．４０３−４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは最初に、データベース配列中の同じ長さのワードで並べられたときに、ある正の閾値スコアＴに一致するか、あるいはそれを満たすクエリー配列中の長さＷのショートワードを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。これらの最初の近傍ワードヒットは、これらを含むもっと長いＨＳＰを見出すための出発点の役割をする。このワードヒットは、比較されている２の配列に沿って、累積アラインメントスコアが増えることができる限り遠くまで両方向に拡張される。累積アラインメントスコアが最大到達値から量Ｘだけ減少したとき；累積スコアがゼロ以下になったとき；またはいずれかの配列が末端に達したときに、ワードヒットの伸長は停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは初期値としてワード長さ（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリクス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ、１９８９年、第８９巻、ｐ．１０９１５参照）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ’５、Ｎ’−４および両ストランドの比較を用いる。
【０１０６】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、次に２の配列の相似性の統計解析を実施する（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ、１９９３年、第９０巻、ｐ．５８５７−５７８７参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって示される相似性の１の尺度は最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然によって起きる確率の目安を与える。たとえば、試験アミノ酸配列とプロテアーゼアミノ酸配列とを比較したときの最小和確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、もっとも好ましくは約０．００１未満であるならば、該アミノ酸配列はプロテアーゼに相似しているとみなされる。
【０１０７】
本開示発明の目的のために、同一性の程度は、従来技術で知られたコンピュータプログラム、たとえばＧＣＧプログラムパッケージ（ウィスコンシンパッケージのためのプログラムマニュアル、第８版、１９９４年８月、米国、５３７１１、ウィスコンシン州、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ、５７５、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ社）（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ Ｓ．Ｂ．およびＷｕｎｓｃｈ Ｃ．Ｄ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９７０年、第４８巻、ｐ．４４３―４４５）において提供されるＧＡＰによって、以下のポリヌクレオチド配列比較用の設定値、すなわち５．０のＧＡＰクリエーションペナルティおよび０．３のＧＡＰエクステンションペナルティを有するＧＡＰを用いて適当に決定される。
【０１０８】
トリコデルマリーゼイＣＢＨ２と他のセルラーゼとの間の構造アラインメントが、トリコデルマリーゼイＣＢＨ２（配列番号３）と中程度から高度の相同性、たとえば約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％またはさらに９９％を有する他のセルラーゼにおける同等の／対応する位置を同定するために用いられることができる。当該構造アラインメントを得る１の方法は、ＧＣＧパッケージからのＰｉｌｅ Ｕｐプログラムを、ギャップペナルティの初期値、すなわち３．０のギャップクリエーションペナルティおよび０．１のギャップエクステンションペナルティで用いることである。他の構造アラインメント方法は疎水性クラスター解析（Ｇａｂｏｒｉａｕｄら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８７年、第２２４巻、ｐ．１４９−１５５）およびリバーススレッディング（ＨｕｂｅｒおよびＴｏｒｄａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年、第７巻、ｐ．１４２−１４９）を含む。
【０１０９】
各種の参照セルラーゼの成熟型の典型的アラインメントが図３に示される。参照セルラーゼは、ハイポクレアジェコリーナ（トリコデルマリーゼイとしても知られている。）ＣＢＨ２、（配列番号３）、ハイポクレアキニンギＣＢＨ２（配列番号４）、フミコーラインソレンスＣＢＨ２（配列番号５）、アクレモニウムセルロリティカスＣＢＨ２（配列番号６）、アガリカスビスポラスＣＢＨ２（配列番号７）、フサリウムオシスポラムＥＧ（配列番号８）、ファネロキーテクリソスポリウムＣＢＨ２（配列番号９）、タラロマイセスエメルソニＣＢＨ２（配列番号１０）、サーモビフィダ．フスカ６Ｂ／Ｅ３ ＣＢＨ２（配列番号１１）、サーモビフィダフスカ６Ａ／Ｅ２ ＥＧ（配列番号１２）およびセルロモナスフィミＣｅｎＡ ＥＧ（配列番号１３）を含む。配列は、ＣｌｕｓｔａｌＷおよびＭＵＳＣＬＥ多重配列アラインメントアルゴリズムを用いてアラインメントされた。図３の配列アラインメントのセルラーゼの同一性パーセントを示すマトリクスは、表１に示される。
【表１】

【０１１０】
配列検索は典型的には、所与の核酸配列をＧｅｎＢａｎｋ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓおよび他の公共データベース中の核酸配列と比較して評価するときに、ＢＬＡＳＴＩＮプログラムを用いて実施された。ＧｅｎＢａｎｋ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓおよび他の公共データベース中のアミノ酸配列に対してすべてのリーディングフレームにおいてすでに翻訳されている核酸配列を検索するためには、ＢＬＡＳＴＥＸプログラムが好まれる。ＢＬＡＳＴＩＮおよびＢＬＡＳＴＥＸの双方とも、１１．０のオープンギャップペナルティおよび１．０のエクステンションギャップペナルティの初期値パラメータを用いて作動され、ＢＬＯＳＵＭ−６２マトリクスを用いる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７年参照）。
Ｖ．組換えＣＢＨ２変異体の発現
【０１１１】
本開示発明の方法は、変異体ＣＢＨ２を発現する細胞を用いることに依存し、ＣＢＨ２発現の特別な方法は要求されない。変異体ＣＢＨ２は好ましくはこの細胞から分泌される。本開示発明は、変異体ＣＢＨ２をコードする核酸配列を含む発現ベクターをすでに形質導入され、形質転換されまたはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。培養条件、たとえば温度、ｐＨ等は、形質導入、形質転換またはトランスフェクションの前に親宿主細胞についてすでに用いられたものであり、当業者には明らかであろう。
【０１１２】
１の研究方法では、真菌細胞または酵母細胞は、宿主細胞株中で変異体ＣＢＨ２をコードするＤＮＡセグメントに機能しうるように連結され、該変異体ＣＢＨ２が該宿主細胞株中で発現されるように機能するプロモーターまたは生物学的に活性なプロモーター断片または１以上（たとえば、一連）のエンハンサーを有する発現ベクターをトランスフェクトされる。
Ａ．核酸構成体／発現ベクター
【０１１３】
変異体ＣＢＨ２をコードする天然または合成ポリヌクレオチド断片（「ＣＢＨ２をコードする核酸配列」）は、真菌細胞または酵母細胞中に導入しそして複製する能力のある非相同核酸構成体またはベクター中に取り込まれることができる。本明細書に開示されたベクターおよび方法は、変異体ＣＢＨ２の発現のために宿主細胞中で用いるのに適している。任意のベクターが、それが複製可能であり、かつそれが導入される細胞中で生存可能である限り、用いられることができる。多数の好適なベクターおよびプロモーターが当業者には知られており、商業的に入手可能である。クローン化および発現ベクターはＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ Ｍら、１９８９年およびＳｔｒａｔｈｅｒｎら、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、１９８１年にも記載されており、これらのそれぞれは参照によって本明細書に明示的に取り込まれる。真菌に適切な発現ベクターは、ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ、Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．ら、Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．およびＬａｓｕｒｅ，Ｌ．Ｌ．編、Ｍｏｒｅ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ、１９９１年、ｐ．３９６−４２８、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ社に記載されている。適切なＤＮＡ配列は、多様な手順によってプラスミドまたはベクター（本明細書では「ベクター（類）」と総称される。）中に挿入されることができる。一般に、ＤＮＡ配列は、標準的な手順によって適切な１または複数の制限エンドヌクレアーゼ部位中に挿入される。かかる手順および関連したサブクローン化手順は、当業者の知識の範囲内であるとみなされる。
【０１１４】
変異体ＣＢＨ２のコーディング配列を含む組換え真菌は、変異体ＣＢＨ２をコードする配列を含む非相同核酸構成体を選択された株の真菌の細胞中に導入することによって、産生されることができる。
【０１１５】
所望の型の変異体ｃｂｈ２核酸配列が得られると、これは多様な様式で修飾されることができる。配列が非コーディングフランキング領域を含む場合には、該フランキング領域は切除、変異生成等に付される。したがって、転移、トランスバージョン、欠失および挿入が天然に存在する配列上に実施されることができる。
【０１１６】
選択された変異体ｃｂｈ２をコードする核酸は、周知の組換え技術に従って適当なベクター中に挿入され、ＣＢＨ２発現の能力のある真菌を形質転換するために用いられることができる。遺伝子暗号の本質的な縮重性のために、実質的に同じまたは機能的に同等のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列が、変異体ＣＢＨ２をクローン化し発現するために用いられることができる。したがって、コーディング領域中のかかる置換は、本開示発明によって保護される配列変異体に属すると評価される。任意およびすべてのこれらの配列変異体は、親ＣＢＨ２をコードする核酸配列について本明細書に記載されたのと同じ様式で用いられることができる。
【０１１７】
本開示発明は、上記の変異体ＣＢＨ２をコードする核酸配列の１以上を含む組換え核酸構成体も含む。この構成体は、その中に本開示発明の配列が前方向または逆方向で挿入されているベクター、たとえばプラスミドまたはウイルスベクターを含む。
【０１１８】
非相同核酸構成体は、変異体ｃｂｈ２のためのコーディング配列を（ｉ）孤立して；（ii）さらなるコーディング配列、たとえば融合タンパク質コーディング配列またはペプチドコーディング配列との組み合わせで（この場合、該ｃｂｈ２コーディング配列が主要なコーディング配列である）；（iii）適当な宿主中でのコーディング配列の発現に有効な非コーディング配列、たとえばイントロンおよび制御要素、たとえばプロモーターおよびターミネーター要素または５’および／もしくは３’非翻訳領域との組み合わせで；および／または（iv）ｃｂｈ２コーディング配列が非相同遺伝子であるベクターまたは宿主の環境において、含むことができる。
【０１１９】
本開示発明の１の側面では、非相同核酸構成体が、変異体ＣＢＨ２をコードする核酸配列をｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞中に移すために用いられ、該ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞は樹立真菌株および樹立酵母株を用いることが好まれる。変異体ＣＢＨ２の長期間の産生のためには、安定な発現が好まれる。安定な形質転換体を生成するのに有効な任意の方法が、本開示発明を実施するのに用いられることができるということになる。
【０１２０】
適切なベクターは、典型的には選択可能マーカーをコードする核酸配列、挿入部位および適当な制御要素、たとえばプロモーターおよび停止配列を備えている。ベクターは、宿主細胞中のコーディング配列の発現に有効な、該コーディング配列に機能しうるように連結された調節配列、たとえば非コーディング配列、たとえばイントロンおよび制御要素、すなわちプロモーターおよびターミネーター要素または５’および／もしくは３’非翻訳領域を含むことができる。多数の適当なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、その多くは商業的に入手可能であり、および／またはＳａｍｂｒｏｏｋら（上掲）に記載されている。
【０１２１】
典型的なプロモーターは、構造性プロモーターおよび誘導性プロモーターの双方を含み、その例はＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ−１アルファプロモーター、記載されているようなテットオン（ｔｅｔ−ｏｎ）またはテットオフ（ｔｅｔ ｏｆｆ）系におけるテット反応エレメント（ＴＲＥ）を有するプロモーター（Ｃｌｏｎ ＴｅｃｈおよびＢＡＳＦ）、ベータアクチンプロモーターおよびある種の金属塩の転化によって上方調節されることができるメタロチオニンプロモーターを含む。プロモーター配列は、発現の目的のために特定の真菌によって認識されるＤＮＡ配列である。これは、変異体ＣＢＨ２ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に機能しうるように連結されている。かかる連結は、本開示発明の発現ベクター中の変異体ＣＢＨ２ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の開始コドンに関してのプロモーターの位置決めを含む。プロモーター配列は、変異体ＣＢＨ２ポリペプチドの発現を媒介する転写および翻訳制御配列を有する。この例は、アスペルギルスニガー、アスペルギルスアワモリまたはアスペルギルスオリザエグルコアミラーゼ、アルファアミラーゼまたはアルファグルコシダーゼをコードする遺伝子；アスペルギルスニジュランスｇｐｄＡまたはｔｒｐＣ遺伝子；ニューロスポーラクラッサｃｂｈ１またはｔｒｐ１遺伝子；アスペルギルスニガーまたはリゾムコールミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテアーゼをコードする遺伝子；ハイポクレアジェコリーナ（トリコデルマリーゼイ）ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２または他のセルラーゼをコードする遺伝子由来のプロモーターを含む。
【０１２２】
適当な選択可能マーカーの選択は宿主細胞に依存し、異なる宿主のための適切なマーカーは従来技術で周知である。典型的な選択可能マーカー遺伝子は、アスペルギルスニジュランスまたはトリコデルマリーゼイ由来のａｒｇＢ、アスペルギルスニジュランス由来のａｍｄＳ、ニューロスポーラクラッサまたはトリコデルマリーゼイ由来のｐｙｒ４、アスペルギルスニガーまたはアスペルギルスニジュランス由来のｐｙｒＧを含む。さらなる典型的な選択可能マーカーは、以下のものに限定されることなく、ｔｒｐｃ、ｔｒｐ１、ｏｌｉＣ３１、ｎｉａＤまたはｌｅｕ２を含み、これらは変異体株、たとえばｔｒｐ−、ｐｙｒ−、ｌｅｕ−等を形質転換するために用いられる非相同核酸構成体に包含される。
【０１２３】
かかる選択可能マーカーは、真菌によっては普通、代謝されない代謝産物を利用する能力を形質転換体に与える。たとえば、酵素アセタミダーゼをコードする、ハイポクレアジェコリーナ由来のａｍｄＳ遺伝子は、形質転換体細胞にＡｃｅｔａｍｉｄｅを窒素源としてその上で成長することを可能にする。選択可能マーカー（たとえば、ｐｙｒＧ）は、選択的最少培地上で成長する能力を栄養要求性変異体株に回復することができ、または選択可能マーカー（たとえば、ｏｌｉｃ３１）は、阻害剤もしくは抗生物質の存在下に成長する能力を形質転換体に与えることができる。
【０１２４】
選択可能マーカーをコードする配列は、従来技術で用いられる一般的な方法を使用して任意の適当なプラスミド中にクローン化される。典型的なプラスミドは、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＲＡＸおよびｐＵＣ１００を含む。ｐＲＡＸプラスミドはアスペルギルスニジュランス由来のＡＭＡＬ配列を有し、これはアスペルギルスニガー中で複製することを可能にする。
【０１２５】
本開示発明の実施は、特に示されない限り、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の慣用の手法を用い、これらは当業者の技能の範囲内である。かかる手法は文献に完全に説明されている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年；Ｆｒｅｓｈｌｅｙ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、１９８７年；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９３年；およびＣｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９１年参照。
Ｂ．ＣＢＨ２産生のための宿主細胞および培養条件
（ｉ）真菌
【０１２６】
かくして、本開示発明は、対応する非形質転換真菌と比較して、変異体ＣＢＨ２の産生または発現をもたらすのに有効な様式で修飾され、選択されおよび培養された細胞を含む真菌を提供する。
【０１２７】
変異体ＣＢＨ２の発現のために処理されおよび／または修飾されることができる親真菌の種の例は、以下のものに限定されることなく、トリコデルマ、たとえばトリコデルマリーゼイ、トリコデルマロンギブラキアタム、トリコデルマビリデ、トリコデルマコニンギ；ペニシリウム種、フミコーラ種、たとえばフミコーラインソレンス；アスペルギルス種、クリソスポリウムフサリウム種およびエメリセラ種を含む。
【０１２８】
ＣＢＨ２発現細胞は、親真菌株を培養するために典型的に用いられる条件下に培養される。一般に、細胞は、生理的塩および栄養素、たとえばＰｏｕｒｑｕｉｅ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ、Ａｕｂｅｒｔ，Ｊ．Ｐ．ら編、１９８８年、ｐ．７１−８６、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、およびＩｌｍｅｎ，Ｍ．ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９７７年、第６３巻、ｐ．１２９８−１３０６に記載されているようなものを含有する標準的な培地中で培養される。培養条件も標準的であり、たとえば培養物は振とう培養器または発酵槽中２８℃で、所望のレベルのＣＢＨ２の発現が達成されるまで温置される。
【０１２９】
所与の真菌のための好まれる培養条件は、科学文献中におよび／または真菌源、たとえばアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）から見出されることができる。真菌の成長が達成された後、この細胞は、変異体ＣＢＨ２の発現を生じさせまたは可能にするために有効な条件に曝露される。
【０１３０】
ＣＢＨ２をコードする配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合には、誘発剤、たとえば糖、金属塩または抗生物質が、ＣＢＨ２発現を誘発するのに有効な濃度で培地に添加される。
【０１３１】
１の実施態様では、株はアスペルギルスニガーを含み、これは過剰発現されたタンパク質を得るために有用な株である。たとえば、アスペルギルスニガーバールアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｖａｒ ａｗａｍｏｒｉ）ｄｇｒ２４６は、高められた量の分泌型セルラーゼを分泌することが知られている（Ｇｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ、２００２年、第４１巻、ｐ．８９−９８）。アスペルギルスニガーバールアワモリの他の株、たとえばＧＣＤＡＰ３、ＧＣＤＡＰ４およびＧＡＰ３−４が知られている（Ｗａｒｄら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９３年、第３９巻、ｐ．７３８−７４３）。
【０１３２】
他の実施態様では、株はトリコデルマリーゼイを含み、これは過剰発現されたタンパク質を得るために有用な株である。たとえば、Ｓｈｅｒ−Ｎｅｉｓｓら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９８４年、第２０巻、ｐ．４６−５３によって記載されたＲＬ−Ｐ３７は、高められた量のセルラーゼ酵素を分泌することが知られている。ＲＬ−Ｐ３７の機能的同等物は、リコデルマリーゼイ株ＲＵＴ−Ｃ３０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．５６７６５）および株ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６９２１）を含む。これらの株は変異体ＣＢＨ２を過剰発現するのに有用であろうと予想される。
【０１３３】
潜在的に有害な天然のセルロース分解活性のない変異体ＣＢＨ２を得ることが望まれるときは、変異体ＣＢＨ２をコードするＤＮＡ断片を有するＤＮＡ構成体またはプラスミドの導入前に１以上のセルラーゼ遺伝子を欠失させたトリコデルマ宿主細胞株を得ることが有用である。かかる株は、米国特許第５，２４６，８５３号および国際公開第９２／０６２０９号に開示された方法によって調製されることができ、これらの開示内容は参照によって本明細書に取り込まれる。宿主微生物中に１以上のセルラーゼ遺伝子を欠いている変異体ＣＢＨ２セルラーゼを発現することによって、同定およびその後の精製の手順が簡略化される。クローン化されたトリコデルマ種由来の任意の遺伝子、たとえばｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１およびｅｇｌ２遺伝子、ならびにＥＧ IIIおよび／またはＥＧＶタンパク質をコードする遺伝子が欠失されることができる（たとえば、それぞれ、米国特許第５，４７５，１０１号および国際公開第９４／２８１１７号参照）。
【０１３４】
遺伝子の欠失は、従来技術で知られた方法によって、欠失または分離されるべき所望の遺伝子の型をプラスミド中に挿入することによって達成されることができる。欠失プラスミドは次に、所望の遺伝子コーディング領域の内側の適切な１または複数の制限酵素部位で切断され、そしてその遺伝子コーディング配列またはその一部が選択可能マーカーで置き換えられる。欠失または分離されるべき遺伝子の遺伝子座からのフランキングＤＮＡ配列、好ましくは約０．５〜２．０ｋｂのものが、選択可能マーカー遺伝子の両側に残る。適切な欠失プラスミドは、一般にその中に存在する特有の制限酵素部位を有し、フランキングＤＮＡ配列を含む欠失された遺伝子を有する断片および選択可能マーカー遺伝子が、単一の直鎖状片として除かれることを可能にする。
【０１３５】
選択可能マーカーは、形質転換された微生物の検知を可能にするように選択されなければならない。選択された微生物中に発現されている任意の選択可能マーカー遺伝子が適当である。たとえば、アスペルギルス種では、選択可能マーカーは、形質転換体中の該選択可能マーカーの存在がその特性に有意に影響を与えないように選択される。かかる選択可能マーカーは、アッセイ可能な産生物をコードする遺伝子であることができる。たとえば、アスペルギルス種遺伝子の機能性コピーが用いられることができ、これは、宿主株中に欠けているならば、栄養要求性表現型を示す宿主株をもたらす。同様に、選択可能マーカーはトリコデルマ種についても存在する。
【０１３６】
１の実施態様では、アスペルギルス種のｐｙｒＧ−誘導体株は、機能性ｐｙｒＧ遺伝子によって形質転換され、これはかくして形質転換のための選択可能マーカーを提供する。ｐｙｒＧ−誘導体株は、フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）に耐性であるアスペルギルス種株の選択によって得られることができる。ｐｙｒＧ遺伝子は、ウリジンの生合成に要求される酵素であるオロチジン−５’−モノホスフェートデカルボキシラーゼをコードする。無傷ｐｙｒＧ遺伝子を有する株は、ウリジンを欠いているがフルオロオロチン酸に敏感である培地中で成長する。ＦＯＡ耐性を選び出すことによって、機能性のオロチジンモノホスフェートデカルボキシラーゼ酵素を欠いており成長のためにウリジンを要求するｐｙｒＧ−誘導体株を選択することが可能である。ＦＯＡ選択手法を用いて、機能性オロテートピロホスホリボシルトランスフェラーゼを欠いているウリジン要求株を得ることも可能である。この酵素をコードする遺伝子の機能性コピーを有するこれらの細胞を形質転換することが可能である（ＢｅｒｇｅｓおよびＢａｒｒｅａｕ、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９１年、第１９巻、ｐ．３５９−３６５、およびＨａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔら、ｐｙｒＧ遺伝子に基づくアスペルギルスニガーのための相同性形質転換系の開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｙｒＧ）、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１９８６年、第２０６巻、ｐ．７１−７５）。誘導体株の選択は、上で言及したＦＯＡ耐性手法を用いて容易に実施され、したがってｐｙｒＧ遺伝子が選択可能マーカーとして好ましくは用いられる。
【０１３７】
第２の実施態様では、ハイポクレア種（ハイポクレア種（トリコデルマ種））のｐｙｒ４−誘導体株が機能性ｐｙｒ４遺伝子によって形質転換され、これはかくして形質転換のための選択可能マーカーを提供する。ｐｙｒ４⁻誘導体株は、フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）に耐性であるハイポクレア種（トリコデルマ種）の選択によって得られることができる。ｐｙｒ４遺伝子は、ウリジンの生合成に要求される酵素であるオロチジン−５’−モノホスフェートデカルボキシラーゼをコードする。無傷ｐｙｒ４遺伝子を有する株は、ウリジンを欠いているがフルオロオロチン酸に敏感である培地中で成長する。ＦＯＡ耐性を選び出すことによって、機能性のオロチジンモノホスフェートデカルボキシラーゼ酵素を欠いており成長のためにウリジンを要求するｐｙｒ４⁻誘導体株を選択することが可能である。ＦＯＡ選択手法を用いて、機能性オロテートピロホスホリボシルトランスフェラーゼを欠いているウリジン要求株を得ることも可能である。この酵素をコードする遺伝子の機能性コピーを有するこれらの細胞を形質転換することが可能である（ＢｅｒｇｅｓおよびＢａｒｒｅａｕ、１９９１年）。誘導体株の選択は、上で言及したＦＯＡ耐性手法を用いて容易に実施されることができ、したがってｐｙｒ４遺伝子が選択可能マーカーとして好ましくは用いられる。
【０１３８】
１以上のセルラーゼ遺伝子を発現する能力を欠くようにｐｙｒＧ−アスペルギルス種またはｐｙｒ４−ハイポクレア種（トリコデルマ種）を形質転換するために、分離されたまたは欠失されたセルラーゼ遺伝子を含む単一のＤＮＡ断片が、次に欠失プラスミドから単離され、そして適切なｐｙｒ−アスペルギルスまたはｐｙｒ−トリコデルマ宿主を形質転換するために用いられる。形質転換体は次に、それぞれ、ｐｙｒＧまたはｐｙｒ４遺伝子産物を発現するそれらの能力に基づいて同定され選択され、かくして宿主株のウリジン栄養要求性を相補する。得られた形質転換体についてサザンブロット分析が次に実施されて、適切なｐｙｒ４選択可能マーカーによって欠失されるべき遺伝子のゲノムコピーのコーディング領域の一部またはすべてを置き換える二重クロスオーバー組み込み事象を特定しおよび確認する。
【０１３９】
上記の特定のプラスミドベクターはｐｙｒ−形質転換体の調製に関するものであるけれども、本開示発明はこれらのベクターに限定されない。各種の遺伝子が、上記の手法を用いてアスペルギルス種またはハイポクレア種（トリコデルマ種）の株中で欠失され、置き換えられることができる。さらに、任意の入手可能な選択可能マーカーが上記のとおりに用いられることができる。事実、クローン化されかくして同定された任意の宿主、たとえばアスペルギルス種またはハイポクレア種の遺伝子が、上記の戦略を用いてゲノムから欠失されることができる。
【０１４０】
上記のように、用いられる宿主株は、非機能性遺伝子または選択された選択可能マーカーに相当する遺伝子を欠くかまたは有するハイポクレア種（トリコデルマ種）の誘導体であることができる。たとえば、アスペルギルス種のためにｐｙｒＧの選択可能マーカーが選択されると、特定のｐｙｒＧ−誘導体株が形質転換手順において受容体として用いられる。また、たとえばハイポクレア種のためにｐｙｒ４の選択可能マーカーが選択されると、特定のｐｙｒ４−誘導体株が形質転換手順において受容体として用いられる。同様に、アスペルギルスニジュランスの遺伝子、ａｍｄＳ、ｒｇＢ、ｔｒｐＣ、ｎｉａＤと同等なハイポクレア種（トリコデルマ種）の遺伝子を含む選択可能マーカーが用いられてよい。対応する受容体株は、よって、誘導体株、たとえばそれぞれ、ａｒｇＢ−、ｔｒｐＣ−、ｎｉａＤ−でなければならない。
【０１４１】
ＣＢＨ２変異体をコードするＤＮＡが、次に適当な微生物中への挿入のために調製される。本開示発明によれば、ＣＢＨ２変異体をコードするＤＮＡは、機能するセルロース分解活性を有するタンパク質をコードするのに必要なＤＮＡを含む。ＣＢＨ２変異体をコードするＤＮＡ断片は、真菌のプロモーター配列、たとえばアスペルギルス中のｇｌａＡ遺伝子のプロモーターまたはトリコデルマ中のｅｇｌ１遺伝子のプロモーターに機能しうるように結合されることができる。
【０１４２】
ＣＢＨ２変異体をコードするＤＮＡの１より多いコピーが株の中で組換えられて、過剰発現を促進することができることも意図される。ＣＢＨ２変異体をコードするＤＮＡは、該変異体をコードするＤＮＡを有する発現ベクターの構築によって調製されてよい。ＣＢＨ２変異体をコードする挿入されたＤＮＡ断片を有する発現ベクターは、所与の宿主生物中で自律的に複製する能力があるか、又は該宿主のＤＮＡ中に組み込まれる能力がある任意のベクターであることができ、典型的にはプラスミドである。好まれる態様では、遺伝子の発現を得るための２種類の発現ベクターが検討される。第１は、その中でプロモーター、遺伝子コーディング領域およびターミネーター配列の全てが発現されるべき遺伝子に由来する、ＤＮＡ配列を含む。遺伝子の末端削除は、不所望のＤＮＡ配列（たとえば、望まないドメインをコードする配列）を欠失することによって、それ自身の転写および翻訳調節配列の制御下で発現されるべきドメインを残すことが望まれる場合に、得られることができる。選択可能なマーカーも該ベクター上に含まれることができ、新規の遺伝子配列の複数コピーの宿主中への組み込みのための選択を可能にする。
【０１４３】
第２の種類の発現ベクターは予め組み立てられており、高レベルの転写に要求される配列および選択可能マーカーを含む。遺伝子またはその一部のコーディング領域が、この汎用の発現ベクター中に、発現カセットプロモーターおよびターミネーター配列の転写制御下にあるように挿入されることができることが検討される。
【０１４４】
たとえば、アスペルギルスでは、ｐＲＡＸはかかる汎用の発現ベクターである。遺伝子またはその一部は、強いｇｌａａプロモーターの下流に挿入されることができる。
【０１４５】
たとえば、ハイポクレアでは、ｐＴＥＸはかかる汎用の発現ベクターである。遺伝子またはその一部は、強いｇｌａａプロモーターの下流に挿入されることができる。
【０１４６】
上記のベクターでは、本開示発明のＣＢＨ２変異体をコードするＤＮＡ配列は、構造遺伝子へのリ−ディングフレームにおいて、転写および翻訳配列、すなわち適当なプロモーター配列およびシグナル配列と機能しうるように連結されなければならない。プロモーターは、宿主細胞中で転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であることができ、また宿主細胞と相同か、あるいは非相同のタンパク質をコードする遺伝子に由来することができる。任意的なシグナルペプチドは、ＣＢＨ２変異体の細胞外産生をもたらす。シグナル配列をコードするＤＮＡ配列は、好ましくは発現されるべき遺伝子に天然に付随しているものである。しかしながら、任意の適当な源、たとえばトリコデルマ由来のエキソセロビオヒドラーゼまたはエンドグルカナーゼからのシグナル配列が、本開示発明において意図される。
【０１４７】
本開示発明の変異体ＣＢＨ２をコードするＤＮＡ配列とプロモーターとの結合および適当なベクター中への挿入に用いられる手法は、従来技術で周知である。
【０１４８】
上記のＤＮＡベクターまたは構成体は、公知の技術、たとえば形質転換、トランスフェクション、マイクロインジェクション、マイクロポレーション、バイオリスティック砲撃等に従って宿主細胞に導入されることができる。
【０１４９】
好まれる形質転換技術では、ハイポクレア種（トリコデルマ種）中のＤＮＡへの細胞壁の透過性が非常に低いことが考慮されなければならない。したがって、所望のＤＮＡ配列、遺伝子または遺伝子断片の取り込みは、よくても最小量である。形質転換プロセスの前に、誘導体株（すなわち、用いられた選択可能マーカーに相当する機能性遺伝子を欠いている）中のハイポクレア種（トリコデルマ種）の細胞壁の透過性を増加させるための多数の方法が存在する。
【０１５０】
形質転換のためにアスペルギルス種またはハイポクレア種（トリコデルマ種）を調製するための本開示発明において好まれる方法は、真菌の菌糸体由来のプロトプラストの調製を含む。Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ Ａ．ｎｉｇｅｒ ｕｓｉｎｇ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｎｉａＤ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、１９８９年、第１６巻、ｐ．５３−５６参照。菌糸体は、出芽した生長性胞子から得られることができる。菌糸体は、細胞壁を消化する酵素で処理されてプロトプラストをもたらす。プロトプラストは、次に懸濁媒質中で浸透圧スタビライザーの存在によって保護される。これらのスタビライザーは、ソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム等を含む。通常、これらのスタビライザーの濃度は０．８Ｍ〜１．２Ｍ間で様々である。懸濁媒質中で約１．２Ｍのソルビトール溶液を用いることが好ましい。
【０１５１】
宿主株（アスペルギルス種またはハイポクレア種（トリコデルマ種））中へのＤＮＡの取り込みは、カルシウムイオン濃度に依存する。通常、約１０ｍＭのＣａＣｌ_２〜５０ｍＭのＣａＣｌ_２が取り込み溶液において用いられる。取り込み溶液中にカルシウムイオンが必要なことの他に、一般的に含まれる他の成分は、緩衝系、たとえばＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ ７．４；１ｍＭのＥＤＴＡ）または１０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ ６．０緩衝液（モルフォリンプロパンスルホン酸）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ポリエチレングリコールは細胞膜を融解する作用をし、かくして媒質の含有物が宿主細胞、例としてアスペルギルス種あるいはハイポクレア種の株の細胞質へ送入されることを可能にし、またプラスミドＤＮＡが核に移入されると考えられている。この融解はしばしば、宿主染色体中に組み込まれたプラスミドＤＮＡの複数コピーを残す。
【０１５２】
通常、１０^５〜１０^６／ｍＬ、好ましくは２×１０^５／ｍＬの密度にて透過性処理に付されたアスペルギルス種のプロトプラストまたは細胞を含む懸濁液が、形質転換に用いられる。同様に、１０^８〜１０^９／ｍＬ、好ましくは２×１０^８／ｍＬの密度にて透過性処理に付されたハイポクレア種（トリコデルマ種）のプロトプラストまたは細胞を含む懸濁液が、形質転換に用いられる。適当な溶液（たとえば、１．２Ｍソルビトール；５０ｍＭのＣａＣｌ_２）中のこれらのプロトプラストまたは細胞の１００μＬの量が、所望のＤＮＡと混合される。一般に、高濃度のＰＥＧが取り込み溶液に添加される。２５％ＰＥＧ ４０００の０．１〜１の量が、プロトプラスト懸濁液に添加されることができる。しかし、プロトプラスト懸濁液に約０．２５の量を添加することが好ましい。添加物、たとえばジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム等も取り込み溶液に添加され、形質転換を補助してもよい。
【０１５３】
一般に、上記混合物は次に、１０〜３０分間、約０℃において培養される。追加のＰＥＧが次に混合物に添加され、所望の遺伝子またはＤＮＡ配列の取り込みをさらに増加する。２５％ＰＥＧ４０００は、一般に形質転換混合物の量の５〜１５倍の量で添加される。しかし、これより多いおよび少ない量が適当であることもある。２５％ＰＥＧ４０００は、好ましくは形質転換混合物の量の約１０倍である。ＰＥＧが添加された後、形質転換混合物は次に室温か、あるいは氷上において培養され、その後ソルビトールおよびＣａＣｌ_２溶液が添加される。プロトプラスト懸濁物が次に、さらに成長培地の融解アリコートに添加される。この成長培地は、形質転換体の成長のみを許容する。所望の形質転換体を生育するのに適している任意の成長培地が、本開示発明に用いられることができる。しかし、Ｐｙｒ^＋形質転換体が選択されるならば、ウリジンを含んでいない成長培地を用いることが好ましい。その後のコロニーが、ウリジンを含んでいない成長培地上に移され精製される。
【０１５４】
この段階では、安定な形質転換体は、不安定な形質転換体よりも速い成長速度、および、たとえばトリコデルマではウリジンを含んでいない固形成長培養培地上の不規則ではなくて滑らかな輪郭を有する円形のコロニーの形成によって、不安定な形質転換体とは識別されることができる。さらに、ある場合には、安定性のさらなる試験が、固形非選択（すなわち、ウリジンを含んでいる）培地上で形質転換体を成長させ、この培養培地から胞子を回収し、そしてのちにウリジンを含んでいない選択培地上で出芽し成長するであろうこれらの胞子のパーセントを測定することによって、行われることができる。
【０１５５】
上記の方法の特定の態様では、１または複数のＣＢＨ２変異体は、液状培地中における成長の後に、該ＣＢＨ２変異体の適切な翻訳後プロセシングの結果として、宿主細胞から活性型で回収される。
（ii）酵母
【０１５６】
本開示発明は、ＣＢＨ２産生のための宿主細胞として酵母の使用も意図する。加水分解性酵素をコードするいくつかの他の遺伝子が、酵母サッカロマイセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の様々な株に発現されている。これらは、２のエンドグルカナーゼ（Ｐｅｎｔｉｌｌａら、Ｙｅａｓｔ、１９８７年、第３巻、ｐ．１７５−１８５）、２のセロビオヒドロラーゼ（Ｐｅｎｔｉｌｌａら、Ｇｅｎｅ、１９８８年、第６３巻、ｐ．１０３−１１２）およびトリコデルマリーゼイ由来の１のベータ−グルコシダーゼ（ＣｕｍｍｉｎｇｓおよびＦｏｗｌｅｒ、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９６年、第２９巻、ｐ．２２７−２３３）、アウレオバシジウムプルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）由来のキシラナーゼ（ＬｉおよびＬｊｕｎｇｄａｈｌ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９６年、第６２巻、第１号、ｐ．２０９−２１３）、小麦由来のアルファアミラーゼ（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら、Ｇｅｎｅ、１９８７年、第５５巻、ｐ．３５３−３５６）等をコードする配列を含む。さらに、ブチリビリオフィブリソルベンスエンド−［ベータ］−１，４−グルカナーゼ（ＥＮＤ１）、ファネロキーテクリソスポリウムセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ１）、ルミノコッカスフラベファシエンスセロデキストリナーゼ（ＣＥＬ１）およびエンドマイセスフィブリゼルセロビアーゼ（Ｂｇｌ１）をコードするセルラーゼ遺伝子カセットが、サッカロマイセスセレビシエの実験室株中で成功裡に発現された（Ｖａｎ Ｒｅｎｓｂｕｒｇら、Ｙｅａｓｔ、１９９８年、第１４巻、ｐ．６７−７６）。
Ｃ．宿主細胞中へのＣＢＨ２をコードする核酸配列の導入
【０１５７】
本開示発明はさらに、遺伝子操作されて、細胞外に供給された変異体ＣＢＨ２をコードする核酸配列を含む細胞および細胞組成物を提供する。親細胞または細胞株は、クローニングベクターまたは発現ベクターを用いて遺伝子操作される（すなわち、形質導入され、形質転換されまたはトランスフェクトされる）ことができる。ベクターは、さらに記載されるように、たとえばプラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形態をしていることができる。
【０１５８】
本開示発明の形質転換の方法は、真菌のゲノムへの形質転換ベクターのすべてまたは一部の安定な取り込みをもたらすことができる。しかし、自己複製染色体外形質転換ベクターの維持をもたらす形質転換も意図される。
【０１５９】
多くの標準的なトランスフェクション方法が、大量の非相同タンパク質を発現するトリコデルマリーゼイ細胞株を産生するために用いられることができる。ＤＮＡ構成体をトリコデルマのセルラーゼ産生株中に導入するための公表された方法のいくつかは、Ｌｏｒｉｔｏ、Ｈａｙｅｓ、ＤｉＰｉｅｔｒｏおよびＨａｒｍａｎ、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９３年、第２４巻、ｐ．３４９−３５６；Ｇｏｌｄｍａｎ、ＶａｎＭｏｎｔａｇｕおよびＨｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９０年、第１７巻、ｐ．１６９−１７４；Ｐｅｎｔｉｌｌａ、Ｎｅｖａｌａｉｎｅｍ、Ｒａｔｔｏ、ＳａｌｍｉｎｅｎおよびＫｎｏｗｌｅｓ、Ｇｅｎｅ、１９８７年、第６巻、ｐ．１５５−１６４を、アスペルギルスイェルトンについて、ＨａｍｅｒおよびＴｉｍｂｅｒｌａｋｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８４年、第８１巻、ｐ．１４７０−１４７４を、フサリウムバジャーについて、ＰｏｄｉｌａおよびＫｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９１年、第８８巻、ｐ．８２０２−８２１２を、ストレプトマイセスについて、Ｈｏｐｗｏｏｄら、Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、１９８５年、英国、Ｎｏｒｗｉｃｈを、およびバチルスビリギジについて、ＤｅＲｏｓｓｉ、Ｂｅｒｔａｒｉｎｉ、ＲｉｃｃａｒｄｉおよびＭａｔｔｅｕｚｚｉ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１９９０年、第５５巻、ｐ．１３５−１３８を含む。
【０１６０】
非相同核酸構成体（発現ベクター）を真菌（たとえば、ハイポクレアジェコリーナ）中に導入する他の方法は、以下のものに限定されることなく、粒子または遺伝子銃の使用、形質転換工程前の真菌細胞壁の透過性向上（たとえば、高濃度のアルカリ、たとえば０．０５Ｍ〜０．４ＭのＣａＣｌ_２または酢酸リチウムの使用によって）、プロトプラスト融合またはアグロバクテリウムを介した形質転換を含む。ポリエチレングリコールおよびＣａＣｌ_２を用いたプロトプラストまたはスフェロプラストの処理による真菌の形質転換の典型的な方法は、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｅ．Ｉ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、１９８９年、第１６巻、ｐ．５３−５６、およびＰｅｎｔｉｌｌａ、Ｇｅｎｅ、１９８８年、第６３巻、ｐ．１１−２２に記載されている。
【０１６１】
外来の核酸配列を宿主細胞中に導入するための周知の方法のいずれも用いられることができる。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、生物言語学、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウイルスベクターおよびクローン化されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来の遺伝子物質を宿主細胞中に導入するための他の周知の方法のいずれかの使用を含む（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上掲参照）。同様に用いられるのは、米国特許第６，２５５，１１５号に記載されたアグロバクテリウムを介したトランスフェクション法である。用いられる特定の遺伝子組換え方法が、非相同遺伝子を発現する能力のある宿主細胞中に少なくとも１の遺伝子を成功裡に導入することができることのみが必要である。
【０１６２】
さらに、変異体ＣＢＨ２をコードする核酸配列を含む非相同核酸構成体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されることができ、そして得られたＲＮＡが周知の方法、たとえばイインジェクションによって宿主細胞中に導入されることができる。
【０１６３】
本開示発明はさらに、真菌セルラーゼ組成物を産生するのに用いられる、糸状菌、たとえばハイポクレアジェコリーナおよびアスペルギルスニガーの新規かつ有用な形質転換体を含む。本開示発明は、糸状菌、とりわけ変異体ＣＢＨ２コーディング配列、または内因性ｃｂｈコーディング配列の欠失を含む糸状菌の形質転換体を含む。
【０１６４】
変異体ｃｂｈ２のコーディング配列を含む非相同核酸構成体の導入に引き続いて、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、またはＣＢＨ２をコードする核酸配列の発現を増幅するのに適当なように修飾された慣用の栄養培地中で、この遺伝子組換えによって修飾された細胞が培養されることができる。培養条件、たとえば温度、ｐＨ等は、発現のために選択された宿主細胞についてすでに用いられたものであり、当業者には明らかであろう。
【０１６５】
かかる非相同核酸構成体がその中に導入された細胞の子孫は、一般にこの非相同核酸構成体中に認められる変異体ＣＢＨ２をコードする核酸配列を含むと考えられる。
【０１６６】
本開示発明はさらに、真菌セルラーゼ組成物を産生するのに用いられる糸状菌、たとえばハイポクレアジェコリーナの新規かつ有用な形質転換体を含む。アスペルギルスニガーも、変異体ＣＢＨ２を産生するのに用いられることができる。本開示発明は、糸状菌、とりわけ変異体ｃｂｈ２コーディング配列、または内因性ｃｂｈ２コーディング配列の欠失を含む糸状菌の形質転換体を含む。
【０１６７】
糸状菌の安定な形質転換体は、一般に不安定な形質転換体よりも速い成長速度、および、たとえばトリコデルマでは固形成長培養培地上の不規則ではなくて滑らかな輪郭を有する円形のコロニーの形成によって、不安定な形質転換体とは識別されることができる。さらに、ある場合には、安定性のさらなる試験が、固形非選択培地上で形質転換体を成長させ、この培養培地から胞子を回収し、そしてのちに選択培地上で出芽し成長するであろうこれらの胞子のパーセントを測定することによって、行われることができる。
VI．組換えＣＢＨ２タンパク質の単離および精製
【０１６８】
一般に、細胞培養で産生された変異体ＣＢＨ２タンパク質は培地中に分泌され、たとえば、細胞培地から望ましくない成分を除くことによって精製され単離されることができる。しかし、ある場合には、変異体ＣＢＨ２タンパク質は、細胞溶解物からの回収を必要とする細胞型で産生されることができる。かかる場合には、変異体ＣＢＨ２タンパク質は、当業者によってルーチンに用いられる技術を使用して、その中で産生された細胞から精製される。その例は、以下のものに限定されることなく、親和性クロマトグラフィー（Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９８４年、第１６巻、ｐ．２１５）、イオン交換クロマトグラフ法（Ｇｏｙａｌら、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｎｏｌ．、１９９１年、第３６巻、ｐ．３７−５０；Ｆｌｉｅｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９８３年、第１７巻、ｐ．３１４−３１８；Ｂｈｉｋｈａｂｈａｉら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８４年、第６巻、ｐ．３３６−３４５；Ｅｌｌｏｕｚら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、１９８７年、第３９６巻、ｐ．３０７−３１７）、たとえば高分解能を有する物質を用いるイオン交換（Ｍｅｄｖｅら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、１９９８年、第Ａ８０８巻、ｐ．１５３−１６５）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＴｏｍａｚおよびＱｕｅｉｒｏｚ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、１９９９年、第Ａ８６５巻、ｐ．１２３−１２８）、および二相分配法（Ｂｒｕｍｂａｕｅｒら、Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ、１９９９年、第７巻、ｐ．２８７−２９５）を含む。
【０１６９】
典型的には、変異体ＣＢＨ２タンパク質は、選択された特性、たとえば特定の結合剤、たとえば抗体もしくは受容体への結合親和性を有するタンパク質、または選択された分子量範囲もしくは等電点範囲を有するタンパク質を分離するために分画される。
【０１７０】
所与の変異体ＣＢＨ２タンパク質の発現が達成されると、それによって産生されたＣＢＨ２タンパク質は細胞または細胞培養物から精製される。かかる精製に適した典型的な手順は以下のもの、すなわち抗体−親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー；エタノール沈降；逆相ＨＰＬＣ；シリカ上またはカチオン交換樹脂、たとえばＤＥＡＥ上のクロマトグラフィー；クロマト分画；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈降；および、たとえばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を用いるゲルろ過を含む。タンパク質精製の各種の方法が用いられることができ、かかる方法は従来技術で知られており、たとえばＤｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｉｇｙ、１９９０年、第１８２巻、第５７号、ｐ．７７９；Ｓｃｏｐｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９８２年、第９０巻、ｐ．４７９−４９１に記載されている。選択される１または複数の精製段階は、たとえば用いられた産生工程および産生された特定のタンパク質の性質に依存する。
VII．ｃｂｈ２およびＣＢＨ２の用途
【０１７１】
変異体ｃｂｈ２核酸、変異体ＣＢＨ２タンパク質および変異体ＣＢＨ２タンパク質活性を含む組成物は、多種多様な用途への利用が見出され、これらの一部が以下に記載される。
【０１７２】
様々な量のＢＧ型、ＥＧ型および変異体ＣＢＨ型セルラーゼを含む新規かつ改善されたセルラーゼ組成物は、高められた清浄化能力、柔軟化剤としてのおよび／または綿布地の感触を改善する機能（たとえば、「ストーンウォッシング」または「バイオポリシング」）を示す洗剤組成物へ、木材パルプを糖に分解するための組成物へ（たとえば、バイオエタノールの製造のために）および／または飼料組成物への利用を見出す。各型のセルラーゼの単離および特性解析は、かかる組成物の側面を調節する能力を提供する。
【０１７３】
１の方法では、本開示発明のセルラーゼは洗剤組成物へまたは感触および概観を改善する布地の処理への利用を見出す。
【０１７４】
セルラーゼ分解産生物の加水分解の速度は、ゲノムに挿入されたｃｂｈ遺伝子の少なくとも１の追加のコピーを有する形質転換体を用いることによって増加されることができるので、セルロースまたはヘテログリカンを有する産生物は、より速い速度分解でおよびより高い程度まで分解されることができる。セルロースからの産生物、たとえば紙、綿、セルロースダイアパー等は、埋立地中でより効率的に分解されることができる。したがって、形質転換体から得られることができる発酵産生物または形質転換体そのものが、過密な埋立地に加重される多様なセルロース産生物の分解を液化によって促進するために組成物中に用いられることができる。
【０１７５】
分離された糖化および発酵は、それによってバイオマス中に存在するセルロース、たとえばトウモロコシ茎葉がグルコースに転化されそしてその後酵母株がグルコースをエタノールに転化するプロセスである。同時の糖化および発酵は、それによってバイオマス中に存在するセルロース、たとえばトウモロコシ茎葉がグルコースに転化されかつ同時におよび同じ反応器中で酵母株がグルコースをエタノールに転化するプロセスである。したがって、他の方法では、本開示発明の変異体ＣＢＨ型セルラーゼは、バイオマスからエタノールへの分解に利用を見出す。セルロースの容易に利用可能な源からのエタノールの産生は、安定な再生可能燃料源をもたらす。
【０１７６】
セルロースに基づいた供給原料は、農業廃棄物、草木および他の低価値バイオマス、たとえば都市ごみ（たとえば、古紙、木花ごみ等）から構成される。任意のこれらのセルロース供給原料の発酵からも、エタノールは産生されることができる。しかし、セルロースはまず糖に転化されなければならず、その後で初めてエタノールへの転化ができる。
【０１７７】
非常に多彩な供給原料が、本発明の変異体ＣＢＨに用いられることができ、使用のために選択されるものは、転化が行われる地域に依存することができる。たとえば、米国中西部では、農業廃棄物、たとえば麦わら、トウモロコシ茎葉およびバガスが優位を占めるだろうし、他方、カリフォルニアではコメわらが優位を占めるだろう。しかし、任意の入手可能なセルロース性バイオマスが、任意の地域で用いられることができることが理解されなければならない。
【０１７８】
本開示発明の方法は、有機生産物、化学製品および燃料、プラスチックおよび他の生産物または中間品のための、化学供給原料としてのまたは微生物のための発酵供給原料としての、単糖、二糖および多糖の産生に用いられることができる。特に、処理残留物（乾燥ディスティラーズグレイン、醸造使用済み穀粒、サトウキビバガス等）の価値は、セルロースまたはヘミセルロースの部分的または完全な溶解によって上げられることができる。エタノールに加えて、セルロースおよびヘミセルロースから産生されることができる一部の化学製品は、アセトン、アセテート、グリシン、リシン、有機酸、（たとえば、乳酸）、１，３−プロパンジオール、ブタンジオール、グリセロール、エチレングリコール、フルフラール、ポリヒドロキシアルカノエート、シス，シス−ムコン酸、動物飼料およびキシロースを含む。
【０１７９】
高められた量のセロビオヒドロラーゼを有するセルラーゼ組成物は、エタノール産生への利用を見出す。このプロセスからのエタノールはさらに、オクタン価向上剤としてまたは直接、ガソリンの代わりに用いられることができ、燃料としてのエタノールは石油由来の生産物よりも環境に優しいのでこのことは有利である。エタノールの使用は空気の品質を改善し可能性として地域的なオゾンレベルおよびスモッグを低減することが知られている。その上、ガソリンの代わりとしてのエタノールの使用は、非再生可能エネルギーおよび石油化学供給原料への突然の移行の衝撃を和らげる上で戦略的に重要であるといえる。
【０１８０】
セルロース性バイオマス、たとえば木、草本植物、都市固形廃棄物および農林業廃棄物からの糖化および発酵プロセスによって、エタノールは産生されることができる。しかし、微生物によって産生された天然に存在するセルラーゼ混合物内の個々のセルラーゼ酵素の割合は、バイオマス中のセルロースからグルコースへの急速な転化のためにはもっとも効率的というわけではないかもしれない。エンドグルカナーゼは新しいセルロース鎖末端を生成する作用をし、該新しいセルロース鎖末端自体はセロビオヒドロラーゼの作用のための基質となり、それによって全セルロース系の加水分解の効率を改善することが知られている。したがって、増加されたまたは最適化されたセロビオヒドロラーゼ活性は、エタノールの産生を大幅に高めることができる。
【０１８１】
したがって、本発明のセロビオヒドロラーゼは、セルロースからその糖成分への加水分解に用途を見出す。１の実施態様では、変異体セロビオヒドロラーゼは、発酵性有機体の添加の前にバイオマスに添加される。第２の実施態様では、変異体セロビオヒドロラーゼは、発酵性有機体と同時にバイオマスに添加される。任意的に、他のセルロース成分がどちらの実施態様でも存在することができる。
【０１８２】
他の実施態様では、セルロース性供給原料は前処理されてもよい。前処理は、高められた温度および希酸、濃酸または希釈アリカリ溶液の添加によることができる。前処理溶液は、ヘミセルロース成分を少なくとも部分的に加水分解し、そして次に中和されるのに十分な時間添加される。
【０１８３】
セルロースへのＣＢＨ２の作用の主要産物はセロビオースであり、これは（たとえば、真菌セルラーゼ産生物中の）ＢＧ活性によるグルコースへの転化に利用可能である。セルロース性バイオマスの前処理によってか、あるいはバイオマスへの酵素作用によって、グルコースおよびセロビオースに加えて他の糖がバイオマスから入手可能にされることができる。バイオマスのセミセルロース含有量は、（セミセルロースによって）糖、たとえばキシロース、ガラクトース、マンノースおよびアラビノースに転換されることができる。かくして、バイオマス転化プロセスでは、酵素的糖化は、他の中間体または最終産生物への生物学的または化学的転化に利用可能にされる糖を産生することができる。したがって、バイオマスから生成された糖は、エタノールの生成に加えて多様なプロセスに用途を見出す。かかる転化の例はグルコースからエタノールへの発酵（Ｍ．Ｅ．Ｈｉｍｍｅｌら、「Ｆｕｅｌｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｆｒｏｍ Ｂｉｏｍａｓｓ」中のｐ．２−４５、１９９７年、ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ６６６、Ｂ．Ｃ．ＳａｈａおよびＪ．Ｗｏｏｄｗａｒｄ編）およびグルコースから２，５−ジケト−Ｄ−グルコース（米国特許第６，５９９，７２２号）、乳酸（Ｒ．ＤａｔｔａおよびＳ−Ｐ．Ｔｓａｉ、ｐ．２２４−２３６、上掲）、サクシネート（Ｒ．Ｒ．Ｇｏｋａｒｎ、Ｍ．Ａ．ＥｉｔｅｍａｎおよびＪ．Ｓｒｉｇｈｅｒ、ｐ．２３７−２６３、上掲）、１，３−プロパンジオール（Ａ−Ｐ．Ｚｈｅｎｇ、Ｈ．ＢｉｅｂｌおよびＷ−Ｄ．Ｄｅｃｋｗａｒ、ｐ．２６４−２７９、上掲）、２，３−ブタンジオール（Ｃ．Ｓ．Ｇｏｎｇ、Ｎ．ＣａｏおよびＧ．Ｔ．Ｔｓａｏ、ｐ．２８０−２９３、上掲）への他の生物学的転化、およびキシロールからキシリトール（Ｂ．Ｃ．ＳａｈａおよびＲ．Ｊ．Ｂｏｔｈａｓｔ、ｐ．３０７−３１９、上掲）への化学的および生物学的転化である。また、たとえば国際公開第９８／２１３３９号参照。
【０１８４】
本開示発明の洗剤組成物は、（セロビオヒドロラーゼ含有量にかかわらず、すなわちセロビオヒドロラーゼのない、実質的にセロビオヒドロラーゼのないまたはセロビオヒドロラーゼが高められた）セルラーゼ組成物に加えて、界面活性剤、たとえばアニオン性、非イオン性および両性界面活性剤、ヒドロラーゼ、ビルダー、漂白剤、青味剤および蛍光染料、ケーキ防止剤、溶解剤、カチオン性界面活性剤等を用いることができる。すべてのこれらの成分は洗剤分野で知られている。上記のセルラーゼ成分は、液状希釈剤で、顆粒で、乳剤で、ゲルで、ペースト等で洗剤組成物に添加されることができる。かかる形態は当業者に周知である。固形洗剤組成物が用いられるときは、セルラーゼ組成物は、好ましくは顆粒として配合される。好ましくは、顆粒はセルラーゼ保護剤を含有するように配合されることができる。より完全な議論のためには、「ＣＢＨ２型成分の欠けたセルラーゼ組成物を含有する洗剤組成物」の表題の米国特許第６，１６２，７８２号参照。この内容は参照によって本明細書に取り込まれる。
【０１８５】
好ましくは、セルラーゼ組成物は全洗剤組成物に対して約０．００００５重量パーセント〜約５重量パーセント用いられる。より好ましくは、セルラーゼ組成物は全洗剤組成物に対して約０．０００２重量パーセント〜約２重量パーセント用いられる。
【０１８６】
さらに、変異体ＣＢＨ２核酸配列は、関連した核酸配列の同定および特性解析への利用を見出す。関連した遺伝子または遺伝子産物を測定（予測または確認）するのに有用な多数の手法は、以下のものに限定されることなく、（Ａ）ＤＮＡ／ＲＮＡ分析、たとえば（１）過剰発現、異所性発現および他の種における発現；（２）遺伝子ノックアウト（逆遺伝学、標的ノックアウト、ウイルス誘発遺伝子抑制（ＶＩＧＳ）（Ｂａｕｌｃｏｍｂ、１００ Ｙｅａｒｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ＣａｌｉｓｈｅｒおよびＫｏｒｉｚｉｎｅｋ編、１９９９年、第１５巻、ｐ．１８９−２０１、米国、ニューヨ−ク州、ニューヨ−ク、Ｓｐｒｉｎｇ−Ｖｅｒｌａｇ社参照）；（３）遺伝子のメチル化状態の分析、とりわけフランキング調節領域；および（４）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション；（Ｂ）遺伝子産物分析、たとえば（１）組換えタンパク質発現；（２）抗血清産生、（３）免疫学的局在決定；（４）触媒活性または他の活性の生化学アッセイ；（５）リン酸化状態；および（６）酵母２ハイブリッド分析による他のタンパク質との相互作用；（Ｃ）経路解析、たとえば遺伝子もしくは遺伝子産物をその過剰発現表現型に基づいてまたは関連した遺伝子との配列相同性によって特定の生化学的もしくシグナル経路内に置くこと；および（Ｄ）特定の代謝またはシグナル経路における単離遺伝子およびその産物の関与を測定または確認するために実施されることもでき、また遺伝子の機能を測定するのに役立つ他の分析を含む。
実験
【０１８７】
本開示発明は、特許請求された本開示発明の範囲を限定する意図は決してない以下の実施例においてさらに詳細に記載される。添付された図面は、本開示発明の明細事項および記載と一体部分とみなされることが意図される。以下の実施例は特許請求された本開示発明を例示するが、限定しないために提供される。
【０１８８】
以下に続く実験の開示では、以下の略号が適用される：Ｍ（モル濃度）、ｍＭ（ミリモル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）モル（ｍｏｌ）（モル数）；ｍｍｏｌ（ミリモル数）；μｍｏｌ（マイクロモル数）；ｎｍｏｌ（ナノモル数）；ｇｍ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｐｇ（ピコグラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；μｌおよびμＬ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；Ｕ（単位）；Ｖ（ボルト）；ＭＷ（分子量）；ｓｅｃ（秒）；ｍｉｎ（ｓ）（分）；ｈ（ｓ）およびｈｒ（ｓ）（時）；℃（摂氏度）；ＱＳ（十分量）；ＮＤ（行われていない）；ＮＡ（適用不可）；ｒｐｍ（毎分回転数）；Ｈ_２Ｏ（水）；ｄＨ_２Ｏ（脱イオン水）；ＨＣｌ（塩酸）；ａａ（アミノ酸）；ｂｐ（塩基対）；ｋｂ（キロ塩基対）；ｋＤ（キロダルトン）；ｃＤＮＡ（コピーまたは相補的ＤＮＡ）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）；ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）；ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ＭｇＣｌ_２（塩化マグネシウム）；ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）；ｗ／ｖ（重量対体積）：ｇ（重力）；ＯＤ（光学密度）；ＣＮＰＧ（クロロニトロフェニル−ベータ−Ｄ−グルコシド）；ＣＮＰ（２−クロロ−４−ニトロフェノール）；ＡＰＢ（酸前処理バガス）；ＰＡＳＣ（リン酸膨潤セルロース）；ＰＣＳ（酸前処理トウモロコシ茎葉）；ｐｉまたはＰＩ（性能指数）；ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）；ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）；およびＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）。
【実施例１】
【０１８９】
トリコデルマ種セルラーゼ調製物の化学修飾およびＣＢＨ２変異体を試験するためのアッセイ
この実験は、市販のトリコデルマ種セルラーゼ調製物（ＬＡＭＩＮＥＸ ＢＧ酵素複合体（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ社）、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ部門、）のコハク酸無水物によって処理してリシン残基をアセチル化することを記載する。ＬＡＭＩＮＥＸ ＢＧ酵素複合体のリシン残基のアセチル化は、このタンパク質の正味電荷を変える（たとえば、負電荷の増加）。他の類似した化学修飾が用いられて、リシンの正電荷を負に帯電した基に（たとえば、アセトキシコハク酸無水物、マレイン無水物、酒石酸無水物およびフタル酸無水物処理）、またはさらに２の負電荷に（たとえば、トリメリット酸無水物、シス−アコニット酸無水物および４−ニトロフタル酸無水物処理）変えることもできる。他の化学修飾が用いられて、リシン残基の正電荷を除いて非帯電の残基をもたらすことができる（たとえば、酢酸無水物、ブチル酸無水物、イソブチル酸無水物、ヘキサン酸無水物、吉草酸無水物、イソ吉草酸無水物およびピバル酸無水物処理）。
【０１９０】
セルラーゼ調製物上のリシン残基は、コハク酸無水物を用いて、公表された方法（Ｌｕｎｄｂｌａｄ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐｔｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｌｕｎｄｂｌａｄ編、１９８４年、第３版、ＣＲＣプレス社）の変形を使用して修飾された。この反応のために、ＬＡＭＩＮＥＸ ＢＧ酵素複合体の２３６ｇのサンプルが、１ｍＬの５００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ８中で調製された。コハク酸無水物（Ａｌｄｒｉｃｈ社）溶液がその粉体をＤＭＳＯ中に５００ｍｇ／ｍＬの最終濃度となるように溶解することによって調製され、その後に酵素複合体が添加された。＞１：１００のリシンとコハク酸との比が反応管中で達成されるように、コハク酸無水物のアリコートが添加された。非修飾タンパク質参照物とするために、他の反応管がＤＭＳＯおよび酵素のみで同様の量を用いて準備された。両反応管は渦流攪拌され一晩室温に置かれた。翌日、１：１０の量の１ＭのグリシンｐＨ３が各反応管に添加されてコハク酸無水物反応が停止された。
【０１９１】
修飾および非修飾タンパク質を天然ゲル上で比較することによって、化学修飾は確認された。各反応からのアリコート（化学修飾物および非修飾物）は、１００ボルトにおいてｐＨ８．８で操作される傾斜８〜２５％の天然ゲル上で分析された（Ｐｈａｓｔ Ｓｙｓｔｅｍゲル、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）。タンパク質はゲルのＣｏｏｍａｓｓｉｅ青染色後に目視化されて、この修飾が成功したことを確認した。染色はタンパク質バンド移行の変化を示し、セルラーゼ調製物の各種のタンパク質の電荷の変化を確認した。トリコデルマ種セルラーゼ調製物の修飾サンプルは、非修飾サンプルよりも負に帯電していた。
【０１９２】
修飾および非修飾（対照）タンパク質を単離するために、各サンプルの８０μｌアリコートがスピン脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて脱塩された。脱塩サンプル（修飾なしの対照を含む。）の２８０ｎｍの吸光度がＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ社）を用いて測定され、サンプルの全タンパク質濃度を測定するために１：１０のサンプル希釈の後繰り返して測定された。
ゼータ電位測定
【０１９３】
この実施例は、酵素および基質のゼータ電位の測定を記載する。粒子表面上の電荷の存在は、取り巻く界面領域内のイオンの分布に影響を与える。その結果は、この粒子表面の近傍の粒子の電荷と反対の電荷の対イオン濃度の増加である。イオンが粒子表面から離れると、イオンの不均一分布は最終的に均一になる。均一分布が得られる距離はデバイ長（１／κ）またはスクリーニング長と呼ばれ、下の式に示されるようにイオン強度に依存する。この式で、ε_０は自由空間の誘電率（９．８５４ｘ１０^−１２ＦＭ^−１）であり、ε_ｒは液体の誘電率であり、ｋはボルツマン定数（１．３８ｘ１０^−２３ＪＫ^−１）であり、Ｔはケルビン単位の温度であり、ｅは電荷（１．６０２２ｘ１０^−２９Ｃ）であり、Ｉはモルイオン強度であり、ＮＡはアボガドロ定数（６．０２２ｘ１０^２３モル^−１）である。
【数１】

モルイオン強度は、下の式から計算されることができ、この式でＣ_ｉはイオン種濃度であり、Ｚ_ｉは価数である。
【数２】

２９８Ｋにおける水の場合、デバイ長の式は下の形に単純化される。
【数３】

粒子を取り囲む液体層は２の部分として存在する。すなわち、イオンが強く結合されている内側領域（Ｓｔｅｒｎ層）およびイオンがより低度の強さで結合されている外側（拡散）領域である。拡散層内には境界があり、その内側ではイオンおよび粒子が安定な一体を形成する。粒子が移動すると、この境界内のイオンはそれとともに移動する。境界外のイオンは粒子とともには移動しない。この境界は流体力学的せん断面とも呼ばれ、ここにおける電位はゼータ電位と定義される。
【０１９４】
電気泳動光散乱では、ゼータ電位ｚは、下に示されたヘンリーの式を用いて測定された電気泳動移動度ｕから計算され、この式でεは誘電定数であり、ｈは溶液粘度であり、κはデバイ長の逆数であり、ａは粒子半径であり、ｆ（κａ）はヘンリー関数である。
【数４】

【０１９５】
κの単位は長さの逆数であり、１／κは電気二重層（デバイ長）の「厚さ」である。パラメータａは粒子半径を表し、したがってκａは粒子半径と電気二重層厚さとの比である。ヘンリー関数ｆ（κａ）は粒子形状に依存するが、球については知られている。上記の式で、ｆ（κａ）はｆ（０）＝１（ヒュッケル限界）からｆ（・）＝１．５（スモルコフスキー限界）までの範囲にある。低誘電性（または低イオン強度）媒質中の小粒子、たとえばタンパク質の場合、ｆ（κａ）＝１のヒュッケル限界がより適切なモデルである。
【０１９６】
タンパク質のゼータ電位は、上で概説された原理に従ってＺｅｔａｓｉｚｅｒ ＮＳ（英国、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて測定された。ＢＭＩ染色された布地のゼータ電位は、ＳｕｒＰａｓｓ（オーストリア国、Ａｎｔｏｎ−Ｐａｒｒ社）を用いて、上記の原理の流動電位実施を使用して測定された。普通、クーロン単位で表される表面電荷の定義から、
【数５】

これは、正味電荷ｚ掛ける素電荷ｅ（１．６ｘ１０^−１９Ｃ）としても表される。
【数６】

したがって、正味電荷の増加によるゼータ電位の予測される変化は、下に示される。
【数７】

実施例１に記載されたように、天然ゲル手法を用いてゼータ電位を測定することも可能である（Ｓｐａｒｋｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９２年、第３３巻、ｐ．１２３−１３０）。天然ゲルを用いて測定される電気泳動移動度は、ゲルマトリクスに起因する遅延のために溶液中におけるよりも普通、より少ない。このようにして計算されたゼータ電位は、溶液に基づいた方法に比較して普通、より低い。したがって、本発明者らは、これらが天然ゲル手法によって得られたときは見掛けゼータ電位と呼ぶ。
【０１９７】
所与の配合物の有効電荷は、そのゼータ電位として計数される。ゼータ電位を共通の電荷尺度として用いることは、関心の対象となっている条件（たとえば、ＡＡＴＣＣ ＨＤＬ洗剤）下に、異なる折り畳み（たとえば、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ等）、ならびに異なる基質（たとえば、ＢＭＩマイクロスウォッチ）との相互作用を有する酵素変異体間の比較を可能にする。異なるタンパク質折り畳みを比較するためにはゼータ電位が好まれるけれども、電気泳動移動度または測定された電荷も絶対的尺度を提供し、比較のために適当である。酵素ゼータ電位の関数としてのＢＭＩ性能は、実線によって示された標準正規分布によって十分に記述され、−９．６８ｍＶに等しい平均値μ、１１．３９ｍＶの標準偏差σおよび０．４０５６のピーク値を持つ［Ａ６００−バックグラウンド］。上のＸ軸上のＺスコアの関数としての、右のｙ軸上のＢＭＩ活性をピーク値で割ったものによって、標準的な誘導座標に、この分布は示される。Ｚスコアは通常、（Ｘ−μ）／σと定義され、Ｘはこの場合ゼータ電位である。
【表２】

【０１９８】
正規分布は、所与の反応条件（ｐＨ、導電度、塩の種類、洗剤キレーター等）下に各基質染色物に特有である。異なる利益または好ましい成果が、たとえばＡＳＰおよびＮｐｒＥ電荷ラダー型変異体の発現レベルおよびゼータ電位の場合のように、様々な折り畳みからの酵素にわたって成立する物理的特性を有する正規分布に付随する。正規分布では、ピーク値は平均値で生じる。共通のゼータ電位尺度上での酵素および基質の電荷の比較は、同じ条件下に測定された、この場合−９．６８ｍＶである平均酵素ゼータ電位がこの場合−８．９７ｍＶである基質染色物ゼータ電位と本質的に一致するときに、最適ＢＭＩ性能が生じることを示す。
【０１９９】
標準正規分布の性能レベルは、表１−１に示されたようにそのｚスコアによって好都合に記述される（ＡｂｒａｍｏｗｉｔｚおよびＳｔｅｇｕｎ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｆｏｒｍｕｌａｓ，Ｇｒａｐｈｉｃｓ，ａｎｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｔａｂｌｅｓ、１９６４年、第９版、米国、ニューヨーク州、Ｄｏｖｅｒ参照）。所与の適用についての分布を定義する平均値および標準偏差を知れば、ゼータ電位への換算は直接的である。この実施例では、あるタンパク質の折り畳みについて測定された清浄化性能は、−４０ｍＶ〜＋２０ｍＶのゼータ電位値に限定される。その折り畳み最適値（すなわち、ｚ=±０．６５）の８０％超の清浄化性能を有する変異体は−１７．０８ｍＶ〜−２．２８ｍＶのゼータ電位値に限定される。その折り畳み最適値（すなわち、ｚ=±０．４６）の９０％超の清浄化性能を有する変異体は−１４．９２ｍＶ〜−４．４４ｍＶのゼータ電位値に限定される。
【０２００】
異なる基質染色物（たとえば、草、体表汚れ、トマト）は同じ配合下に異なるゼータ電位を有し、同じ基質染色物は異なる配合下に異なるゼータ電位を有する（たとえば、北米のＨＤＬ、欧州の粉体皿洗い機用洗剤）。とにかく、基質染色物の電荷は変動するけれども、正規分布の標準偏差は一定を保つと予測される。所与の洗剤配合物の酵素および基質のゼータ電位を知れば、その変異体の予測される性能レベル、ならびに最適の性能レベルを達成するために必要な電荷変化の方向および大きさの迅速な特定が可能になる。所望の反応媒体中のゼータ電位の測定は、その媒体中の粒子状基質上の酵素反応の最適化を可能にする。任意の媒体中の任意の酵素反応が、同様のプロセスを用いて最適化されることができる。
様々な電荷を示す基質上の反応の最適化
【０２０１】
セルロース転化が従来技術で知られた技術によって評価された（たとえば、Ｂａｋｅｒら、Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９９８年、第７０−７２巻、ｐ．３９５−４０３参照）。標準的なセルロース転化アッセイが実験に用いられた。このアッセイでは、酵素および緩衝かされた基質が容器に入れられ、ある温度である時間培養された。反応は十分な１００ｍＭグリシンｐＨ１１で停止され、反応混合物のｐＨが少なくともｐＨ１０にされた。反応が停止されると、反応混合物のアリコートが０．２ミクロン膜を通してろ過されて固形分が除かれた。ろ過された溶液は次に、上記のＢａｋｅｒらに記載された方法に従ってＨＰＬＣによって可溶性糖質の有無を分析された。
前処理トウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）のゼータ電位の測定
【０２０２】
トウモロコシ茎葉が記載のように２重量／重量％Ｈ_２ＳＯ_４で前処理され（Ｓｃｈｅｌｌら、Ｊ．Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００３年、第１０５巻、ｐ．６９−８６）、引き続いて脱イオン水で複数回洗われて４．５のｐＨが得られた。酢酸ナトリウムが添加されて５０ｍＭの最終濃度とされ、そしてこの溶液がｐＨ５．０まで滴定された。反応混合物中のセルロース濃度は約７％であった。
【０２０３】
市販のセルラーゼ混合物、Ｓｐｅｚｙｍｅ ＣＰおよびＩｎｄｉａｇｅ ４４Ｌ、による糖化の前後のＰＣＳのアリコートが、１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離管中に施量され、その体積の１／３を占めた。サンプルは６，０００ｒｐｍで５分間遠心分離され、上清がミリＱ（商標）水で交換され、この工程が５回繰り返された。ミリＱ（商標）水中１００ｍｇ／ｍＬのストック溶液が、すすがれたトウモロコシ茎葉から調製された。このストックは、５０ｍＬの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０中に１ｍｇ／ｍＬまで希釈され、ゼータ電位測定用とされた。各基質サンプルの１ｍＬアリコートが、汚れのない（英国）Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｒｕｍｅｎｔｓ社の使い捨てＺｅｔａｓｉｚｅｒ ＮＳ（商標）キュベットに移された。
【０２０４】
表１−２は、糖化反応の進行全体を通して、ゼータ電位で表されたＰＣＳ基質の電荷がほとんど２倍の負になったことを示す。理論に束縛されることなく、負の正味電荷の増加についての多くの説明ができ、たとえば以下に限定されることなく、リグニンの濃縮、この基質の非反応性部分、ならびにセルロース全体および他のタンパク質の非生産的結合またはファウリングによる説明ができる。性能（たとえば、反応の程度または反応速度）のための最適の酵素ゼータ電位があり、これは反応媒体条件下の基質ゼータ電位に一致する。異なるバイオマス前処理物は、初期基質電荷に劇的に影響を与えることがある。該酵素または該基質が反応の進行全体を通してゼータ電位において不一致であると、酵素−基質相互作用はもはや最適でなくなる。ほぼ１０ｍＶの変化の場合にこの効果は劇的になり、これはバイオマス転化についてそうである。
【表３】

【０２０５】
この状況を改善する戦略は、以下に限定されることなく、様々な電荷にわたる酵素ブレンドを供給すること；新しい最適値における異なる電荷を処理する酵素が異なる反応時間および／または転化度において供給される流加バッチプロセス手法；配合助剤、とりわけ界面活性剤（イオン性および非イオン性）または他のタンパク質の添加による基質表面電荷の調節；ｐＨ調整による基質表面電荷の調節；酵素電荷最適値をずらすための反応全体を通してのイオン強度調整；反応全体を通してイオン強度を調節するための膜ろ過、とりわけ逆浸透ろ過およびナノろ過；塩を除去してイオン強度を調節するためのキレーターの添加；および前処理プロセスによるバイオマス基質電荷の調節を含む。
【０２０６】
下記の実施例では以下のアッセイが用いられた。以下に与えられた手順からの何らかの逸脱は、実施例に示されている。これらの実験では、反応の完了後に生成された産生物の吸光度を測定するために、分光光度計が用いられた。
残留グルコースの測定のためのヘキソキナーゼアッセイ
【０２０７】
ＣＢＨ２変異体を発現するハイポクレアジェコリーナ培養物上清からの残留グルコースが、ヘキソキナーゼアッセイを用いて測定された。５μｌの量の上清が、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ平底ＰＳ）中の１９５μｌのグルコースヘキソキナーゼアッセイ（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、蘭国、Ｂｒｅｄａ）に加えられた。このプレートは室温で１５分間培養された。培養後、吸光度が３４０ｎｍＯＤで測定された。残留グルコースを発現する培養物の上清が、さらなる検討のために合体物から除かれた。
タンパク質含有量測定のためのＨＰＬＣ
【０２０８】
集められた培養物上清からのＣＢＨ２変異体タンパク質の濃度が、Ｐｒｏｓｗｉｆｔ ＲＰ ２Ｈカラム（Ｄｉｏｎｅｘ社）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００（Ｈｅｗｌｅｔ Ｐａｃｋａｒｄ社）ＨＰＬＣを用いて測定された。１０マイクロリットルのサンプルが、ろ過された脱イオン水中の５０μｌの１０％アセトニトリルと混合されて、０．０１％トリフルオロ酢酸を含有する１０％アセトニトリルで平衡化された後のＨＰＬＣカラムに注入された。化合物は１０％〜３０％アセトニトリルで０．３分〜１分の傾斜を用いて、引き続いて３０％〜６５％で１分〜４分の傾斜によって溶出された。ＣＢＨ２変異体のタンパク質濃度は、精製野生型ＣＢＨ２を用いて生成された較正曲線から決定された（６．２５、１２．５、２５、５０μｇ／ｍｌ）。性能指数（ＰｉまたはＰＩ）を計算するために、変異体によって産生された（平均）総タンパク質と、同じ施量において野生型によって産生された（平均）総タンパク質との比が、平均化された。
リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）による比活性の決定
加水分解アッセイ
【０２０９】
セルロースの加水分解：リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）が、公表された方法に従ってＡｖｉｃｅｌから調製された（Ｗａｌｓｅｔｈ、Ｔａｐｐｉ、１９７１年、第３５巻、ｐ．２２８；およびＷｏｏｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ、１９７１年、第１２１巻、ｐ．３５３−３６２）。この物質は、酢酸ナトリウムの最終濃度が５０ｍＭ、ｐＨ５．０となるように緩衝液および水で１ｗ／ｖ％混合物になるまで希釈された。５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中のＰＡＳＣの１％懸濁物の１００マイクロリットルが、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ平底ＰＳ）中に分注された。ＣＢＨ２欠失株からの１０マイクロリットルの５ｍｇ／ｍｌ培養物上清がこのＰＡＳＣに添加され、そして野生型ＣＢＨ２か、あるいは変異体ＣＢＨ２を発現するハイポクレアジェコリーナ細胞からの５、１０、１５または２０μｌの集められた培養物上清がそれに添加された。ハイポクレアジェコリーナ（トリコデルマリーゼイとも呼ばれる。）由来のＣＢＨ２遺伝子の欠失は、米国特許第５，８６１，２７１号および第５，６５０，３２２号に記載されている。酢酸塩緩衝液の分注量は、総量における差を埋めるように添加された。マイクロタイタープレートは密封され、熱電対付き培養器中５０℃で９００ｒｐｍの連続振とう下に培養された。２時間後に加水分解反応は、各ウェルに１００μｌのグリシン緩衝液、ｐＨ１０の添加によって停止された。加水分解反応生成物はＰＡＨＢＡＨアッセイによって分析された。
【０２１０】
ＰＡＨＢＡＨアッセイ：ＰＡＨＢＡＨ還元糖（５ｗ／ｖ％ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド）（ＰＡＨＢＡＨ、Ｓｉｇｍａ社＃Ｈ９８８２，０．５Ｎ ＨＣｌ中溶解物）、（Ｌｅｖｅｒ、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９７２年、第４７巻、ｐ．２７３−２７９）の１５０μｌのアリコートが、空のマイクロタイタープレートのすべてのウェルに添加された。１０マイクロリットルの加水分解反応上清がＰＡＨＢＡＨ反応プレートに添加された。すべてのプレートは密封され、６９℃で９００ｒｐｍの連続振とう下に培養された。１時間後にプレートは氷上に５分間置かれ、そして室温で５分間７２０ｘｇで遠心分離された。生成されたＰＡＨＢＡＨ反応混合物の８０μＬのサンプルは、汚れていない（読み取り）プレートに移され、分光光度計において４１０ｎｍで吸光度が測定された。セロビオース標準物が対照として含められた。施量応答曲線が野生型ＣＢＨ２タンパク質について作られた。性能指数（ＰｉまたはＰＩ）を計算するために、変異体によって産生された（平均）全糖と、同じ施量で野生型において産生された（平均）全糖との比が、平均化された。
希酸前処理トウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）の加水分解による比活性の測定
【０２１１】
前処理トウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）：トウモロコシ茎葉が記載されたように２ｗ／ｗ％Ｈ_２ＳＯ_４で前処理され（Ｓｃｈｅｌｌら、Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００３年、第１０５巻、ｐ．６９−８６）、脱イオン水で複数回洗われて４．５のｐＨを有するペーストが得られた。酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）が次に５０ｍＭの酢酸ナトリウムの最終濃度まで添加され、そして必要によりこの混合物は次に１Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ５．０まで滴定された。反応混合物中のセルロース濃度は、約７％であった。６５マイクロリットルのこのセルロース懸濁物は、９６ウェルマイクロタイタープレートにウェルごとに添加された（Ｎｕｎｃ社平底ＰＳ）。ＣＢＨ２欠失株からの１０マイクロリットルの５ｍｇ／ｍｌ培養物上清がＰＣＳに添加され、そして野生型ＣＢＨ２か、あるいは変異体ＣＢＨ２を発現するハイポクレアジェコリーナ細胞からの５、１０、１５または２０μｌの集められた培養物上清がそれに添加された。酢酸塩緩衝液の埋め合わせ量が、総量における差を埋めるように添加された。プレートの密封後、このプレートは熱電対付き培養器中に５０℃で１３００ｒｐｍの連続振とう下に５分間置かれた。このプレートは次に乾燥を防止するために８０％湿度下に２２０ｒｐｍで振とうされながら５０℃で培養された。７日後にプレートは氷上に５分間置かれ、加水分解反応が、各ウェルに１００μｌのグリシン緩衝液、ｐＨ１０の添加によって停止された。加水分解反応生成物はＰＡＨＢＡＨアッセイによって分析された。
【０２１２】
ＰＡＨＢＡＨアッセイ：ＰＡＨＢＡＨ還元糖試薬（５ｗ／ｖ％ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド）（ＰＡＨＢＡＨ、Ｓｉｇｍａ社＃Ｈ９８８２，０．５Ｎ ＨＣｌ中溶解物）、（Ｌｅｖｅｒ、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９７２年、第４７巻、ｐ．２７３−２７９）の１５０μｌのアリコートが、空のマイクロタイタープレートのすべてのウェルに添加された。１０マイクロリットルの加水分解反応上清がＰＡＨＢＡＨ反応プレートに添加された。すべてのプレートは密封され、６９℃で９００ｒｐｍの連続振とう下に培養された。１時間後にプレートは氷上に５分間置かれ、そして室温で５分間７２０ｘｇで遠心分離された。生成されたＰＡＨＢＡＨ反応混合物の８０μＬのサンプルは、汚れていない（読み取り）プレートに移され、分光光度計において４１０ｎｍで吸光度が測定された。セロビオース標準物が対照として含められた。施量応答曲線が野生型ＣＢＨ２タンパク質について作られた。性能指数（ＰｉまたはＰＩ）を計算するために、変異体によって産生された（平均）全糖と、同じ施量で野生型によって産生された（平均）全糖との比が、平均化された。
エタノールの存在下における変異体ＣＢＨ２の安定性
【０２１３】
野生型ＣＢＨ２およびＣＢＨ２変異体の安定性が、４９℃において４．５%エタノールの存在下に試験された。ＣＢＨ２変異体を発現するハイポクレアジェコリーナ細胞の培養物上清の集合物（８０μｌ）が、ウェルごとに１０μｌの４０．５％ＥｔＯＨを含む９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社Ｖ底ＰＳ）に添加された。このプレートは密封され、熱電対付き培養器中４９℃で１６時間９００ｒｐｍで振とうされながら培養された。培養後にプレートは氷上に５分間置かれた。残留ＣＢＨ２活性が、上記のリン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）加水分解アッセイを用いて測定された。
【０２１４】
残留活性を計算するために、５、１０、１５および２０μｌのＥｔＯＨ培養されたＣＢＨ２の残留活性ＰＡＳＣアッセイへの添加によって生成された産生物の値が、５、１０、１５および２０μｌのＥｔＯＨを含まないＣＢＨ２のＰＡＳＣアッセイへの添加によって生成された産生物の値によって割られた。これらの４の比の個々の値は、次に平均化されて平均残留活性を与えた。変異体についてのＰＩを決定するために、変異体についての平均残留活性の値が次に野生型ＣＢＨ２対照の残留活性の平均によって割られた。
ＣＢＨ２変異体の熱安定性
【０２１５】
野生型ＣＢＨ２およびＣＢＨ２変異体の熱安定性が、５３℃で試験された。ＣＢＨ２変異体を発現するハイポクレアジェコリーナ細胞の培養物上清の集合物（８０μＬ）が、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社Ｖ底ＰＳ）に添加された。このプレートは密封され、熱電対付き培養器中５３℃で１６時間９００ｒｐｍで振とうされながら培養された。培養後にプレートは氷上に５分間置かれた。残留ＣＢＨ２活性が、上記のリン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）加水分解アッセイを用いて測定された。
【０２１６】
残留活性を計算するために、５、１０、１５および２０μｌの熱処理されたＣＢＨ２の残留活性ＰＡＳＣアッセイへの添加によって生成された産生物の値が、５、１０、１５および２０μｌの加熱されていないＣＢＨ２のＰＡＳＣアッセイへの添加によって生成された産生物の値によって割られた。これらの４の比の個々の値は、次に平均化されて平均残留活性を与えた。変異体についてのＰＩを決定するために、変異体についての平均残留活性の値が次に野生型ＣＢＨ２対照の残留活性の平均によって割られた。
【実施例２】
【０２１７】
リグニン結合の評価
フェニルプロパノイドの複雑なバイオポリマーであるリグニンは、セルロース繊維に結合して植物の細胞壁を固化し強化する、木の主要な非炭水化物成分である。これは他の細胞壁成分に架橋されているので、リグニンはセルロースおよびヘミセルロースのセルロース分解酵素への近づきやすさを最小にする。したがって、リグニンは一般にすべての植物バイオマスの消化性と関連している。特に、セルラーゼのリグニンへの結合は、セルラーゼによるセルロースの分解を低減する。リグニンは疎水性であり、見掛け上負に帯電している。したがって、セルラーゼへの負電荷の添加は、そのリグニンへの結合を低減すると考えられる。
【０２１８】
本明細書に記載されるように、トリコデルマ種セルラーゼ調製物が植物ポリマー成分、すなわちリグニンと結合する能力への化学修飾の効果を測定するための反応が組まれた。リグニンが、セルラーゼによる酸前処理サトウキビバガスの本格的な蒸解によって回収され（１００ｍｇＬａｍｉｎｅｘ ＢＧ／１ｇセルロース）、引き続いて正確にＢｅｒｌｉｎら（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００５年、第１２１巻、ｐ．１６３−１７０）によって記載されたように、ただし、超音波処理、乾燥、粉砕および篩分は行われず、プロテアーゼを除く酸処理（０．１Ｎ ＨＣｌ）および引き続く酢酸塩緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５）による繰り返し洗浄をしてサンプルをｐＨ５に戻すことが手順に追加されたことを除いて、非特異性セリンプロテアーゼによって該セルラーゼが加水分解された。手短にいえば、５０μｌの１．１６％リグニン（バガスの完全糖化から回収された）が５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５緩衝液中に調製され、脱塩修飾されまたはた修飾されていないトリコデルマ種セルラーゼ調製物の４μｌと一緒にされた。この反応混合物を含むマイクロ遠心管が室温で１時間培養され、次に高速度で遠心分離されて不溶性物質から可溶性分が分離された。この反応管は再混合され、さらに２時間培養され、その後各管からの上清の１０μｌの第二のアリコートが集められた。上清サンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。修飾されたトリコデルマ種セルラーゼ調製物のバンド強度の低下は、リグニン結合の低下を表していた。
【実施例３】
【０２１９】
バガス結合の評価
バガスは、サトウキビが粉砕されてその絞り汁が抽出された後に残るバイオマスである。バガスのセルロース（酸処理済、固形分２８％、グリカン５７％）２％を含む溶液が、５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５で調製された。修飾されていないまたは化学修飾されたトリコデルマ種セルラーゼ調製物が、同じ酢酸ナトリウム緩衝液中に１０倍に希釈された。希釈された酵素のアリコートがバガス溶液か、あるいは緩衝液単独と混合され、室温で１時間培養された。上清が集められ、セルラーゼの成分、すなわちベータ−グルコシダーゼの活性について分析された。
【０２２０】
ベータ−グルコシダーゼ活性は、クロロ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−グルコシダーゼ（ＣＮＰＧ）アッセイを用いて測定された。ＣＮＰＧアッセイは、β−グルコシダーゼがＣＮＰＧを着色産生物２−クロロ−４−ニトロフェノール（ＣＮＰ）に転化する動的アッセイである。ＯＤが、４０５ｎｍにおいて３７℃で１０分間にわたって測定される。速度が、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘソフトウェアを用いてＶｍａｘとして得られ、そして次に比活性に換算される（μＭ ＣＮＰ／秒／ｍｇタンパク質）。手短に言えば、２００μｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０が、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに添加された。プレートは覆われ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ中に３７℃で１５分間置かれて、温度と平衡化された。５μｌの酵素サンプルが、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０で連続的に希釈され、平衡化後に各ウェルに添加された。１０mＭのＣＮＰＧストック溶液は５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０を用いて１：５に希釈され、次に２０μｌの希釈ＣＮＰＧ溶液（２ｍＭ）が酵素サンプルを有する各ウェルに添加された。マイクロタイタープレートは、３７℃に設定された分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ、３４０型、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）に移され、ＯＤが９秒間間隔以下の読み込みで４０５ｎｍで０〜１５分間読まれた。
【０２２１】
バガス基質に結合されないままのセルラーゼ酵素サンプルのベータ−グルコシダーゼ活性量は、化学修飾されたトリコデルマ種セルラーゼ調製物の場合に比較的にかなり大きかった。特に、ＣＮＰＧアッセイによって測定されたように、修飾されていないベータ−グルコシダーゼの５０％未満はバガス基質に結合されないままであり（たとえば、５０％結合されており）、他方、修飾されたｂｇｌｕの約８０％はバガス基質に結合されないままであった（たとえば、２０％結合されていた）。総合すれば、修飾されたセルラーゼの結合データは、セルラーゼ上の正電荷を減少すると、より負に帯電した植物ポリマー基質への結合が減少することを示す。この場合、酸処理バイオマス中に残っている植物ポリマー基質はリグニンであった。類似した化学成分の植物バイオポリマーであるトウモロコシ茎葉からの酸処理バイオマスは、ゼータ電位の測定によって判明したように（表１−２参照）、糖化の課程でますますより負に帯電することを選ぶことが証明された。
【実施例４】
【０２２２】
酸処理バガスの糖化
様々な量のさらにあるリグニンを含む酸処理バガス（ＡＰＢ）中に存在するセルロースの糖化が、化学修飾されたおよび修飾されていないトリコデルマ種セルラーゼ調製物を用いて評価され、そしてＨＰＬＣによって分析されて、ＤＰ１〜ＤＰ７の糖の放出が監視された。結果がポリマー基質の転化率パーセントとして図１に示される。マイクロタイタープレートに、２００μｌのＡＰＢ（３．５％グルカン）がｐＨ５の５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で調製され、様々な量のリグニンに調整された。２０マイクロリットルのセルラーゼ酵素溶液（修飾されていないまたは修飾されたＬＡＭＩＮＥＸ ＢＧ）がウェルに添加された。このプレートはアルミニウムプレートシーラーで覆われ、５０℃で振とうされながら２４時間または４８時間培養器中に置かれた。反応は、１００μｌの１００ｍＭグリシンｐＨ１０を各ウェルに添加することによって停止された。完全な混合に続いて、マイクロタイタープレートウェルの内容物がＭｉｌｌｉｐｏｒｅ９６ウェルフィルタープレート（０．４５μｍ、ＰＥＳ）を通してろ過された。ろ液は、１００μｌの１０ｍＭグリシンｐＨ１０を含むプレート中に希釈され、産生された可溶性糖（ＤＰ１〜ＤＰ７）の量が測定された。Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズのＨＰＬＣが、灰分除去／保護用カラム（Ｂｉｏｒａｄ社カタログ番号１２５−０１１８）およびＡｍｉｎｅｘ社ＬＥＡＤベース炭水化物カラム（Ａｍｉｎｅｘ社カタログ番号ＨＰＸ−８７Ｐ）を装着された。用いられた移動相は０．６ｍｌ／分の流量の水であった。Ｓｉｇｍａ社から入手した可溶性糖標準物（ＤＰ１〜ＤＰ７）はすべてミリＱ水で１００ｍｌ／ｍＬまで希釈され、個々の糖のピーク面積を実際の糖濃度に換算するために用いられた。転化率パーセントは、ＨＰＬＣによって測定された糖をセルロースからグルコースへの１００％転化率で割ることによって計算された。
【０２２３】
セルラーゼのリグニンへの結合は、セルロースを分解するその効率を減少するだろう。これは、糖化反応中に存在する増加するリグニン量の存在下におけるセルロース転化率の低減として証明される。この傾向は修飾されたセルラーゼ調製物について成立する。しかし、修飾されていないセルラーゼサンプルと比較して、修飾されたセルラーゼサンプルではセルロース転化率が１０％増加する。この結果は、セルラーゼの負電荷を増加することはセルラーゼのリグニンへの非産生的結合を低減することを示す。
【実施例５】
【０２２４】
化学修飾されたＣＢＨ２はＡＰＢの糖化を増加
精製トリコデルマＣＢＨ１、ＣＢＨ２変異体、ＥＧ１、ＥＧ２およびベータ−グルコシダーゼが、実施例１に記載されたように化学修飾された。この実験に用いられたＣＢＨ２変異体は、米国特許出願公開第２００６／０２０５０４２号に記載されたように複数の置換（Ｐ９８Ｌ／Ｍ１３４Ｖ／Ｔ１５４Ａ／Ｉ２１１２Ｖ／Ｓ３１６Ｐ／Ｓ４１３Ｙ）を有し、数字は野生型成熟ＣＢＨ２セルラーゼに対応する。成熟ＣＢＨ２変異体のアミノ酸配列は以下の通りである。
QACSSVWGQCGGQNWSGPTCCASGSTCVYSNDYYSQCLPGAASSSSSTRAA STTSRVSPTTSRSSSATPPPGSTTTRVPPVGSGTATYSGNPFVGVTLWANAYYASEVS SLAIPSLTGAMATAAAAVAKVPSFVWLDTLDKTPLMEQTLADIRAANKNGGNYAG QFVVYDLPDRDCAALASNGEYSIADGGVAKYKNYIDTIRQIVVEYSDVRTLLVIEPDS
LANL VTNLGTPKCANAQSAYLECINYA VTQLNLPNV AMYLDAGHAGWLGWPANQ DPAAQLFANVYKNASSPRALRGLATNVANYNGWNITSPPPYTQGNAVYNEKLYIHA IGPLLANHGWSNAFFITDQGRSGKQPTGQQQWGDWCNVIGTGFGIRPSANTGDSLLD
SFVWVKPGGECDGTSDSSAPRFD YHCALPDALQPAPQAGAWFQA YFVQLLTNANPS
FL（配列番号１４）
【０２２５】
ＣＢＨ１、ＣＢＨ２変異体、ＥＧ１、ＥＧ２およびベータ−グルコシダーゼの化学修飾は、修飾されていないタンパク質と比較した天然ゲル上のこれらの移動度のシフトによって検証された。修飾されたＣＢＨ１、ＣＢＨ２変異体、ＥＧ１、ＥＧ２およびベータ−グルコシダーゼは、より多くの負電荷を有する。すべてのタンパク質濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ社）を用いて測定された。糖化反応はマイクロタイタープレート中で行われ、マイクロタイタープレートの各ウェルに１５０μｌのＡＰＢ（７％グルカンがＰＣＳについて上記されたように調製された。）が５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５で準備され、２１μｌの総タンパク質の２０μｌの酵素混合物が、各ウェル中の最終タンパク質とセルロースとの比が２０ｍｇ／ｇとなるように添加された。修飾されたまたは修飾されていない精製されたＢｇｌｕ、ＣＢＨ２変異体、ＥＧ１またはＥＧ２をトリコデルマバックグラウンドに添加することによって６の酵素混合物がつくられ、その中のセロビオヒドロラーゼI（ＣＢＨI、Ｃｅｌ７ａ）、セロビオヒドロラーゼI I（ＣＢＨI I、Ｃｅｌ６ａ）、エンドグルカナーゼI（ＥＧI、Ｃｅｌ７ｂ）およびエンドグルカナーゼI I（ＥＧI I、Ｃｅｌ５ａ）をコードする遺伝子が不活性化されていた（米国特許出願公開第２００７／０１２８６９０号参照）。各混合物中に、７２．５％トリコデルマリーゼイバックグラウンド、２．５％Ｂｇｌｕ、１５％ＣＢＨ２変異体、５％ＥＧ１、５％ＥＧ２が添加され、最初の４の混合物は修飾されていない１のタンパク質を有し、第５の混合物は修飾されていないすべてのタンパク質を有し、および第６の混合物は修飾されたすべてのタンパク質を有している。プレートは５０℃で７２時間培養された。反応は、各ウェルに１００μｌの１００ｍＭグリシンｐＨ１０を添加することによって停止された。完全な混合に続いて、マイクロタイタープレートウェルの内容物がＭｉｌｌｉｐｏｒｅ９６ウェルフィルタープレート（０．４５μｍ、ＰＥＳ）を通してろ過された。ろ液は、１００μｌの１０ｍＭグリシンｐＨ１０を含むプレート中に希釈され、産生された可溶性糖（ＤＰ１〜ＤＰ７）の量がＨＰＬＣによって測定された。Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズのＨＰＬＣが、灰分除去／保護用カラム（Ｂｉｏｒａｄ社カタログ番号１２５−０１１８）およびＡｍｉｎｅｘ社のＬＥＡＤベース炭水化物カラム（Ａｍｉｎｅｘ社カタログ番号ＨＰＸ−８７Ｐ）を装着された。用いられた移動相は０．６ｍｌ／分の流量の水であった。Ｓｉｇｍａ社から入手した可溶性糖標準物（ＤＰ１〜ＤＰ７）はすべてミリＱ水で１００ｍｌ／ｍＬまで希釈され、個々の糖のピーク面積を実際の糖濃度に換算するために用いられた。転化率パーセントは、ＨＰＬＣによって測定された糖をセルロースからグルコースへの１００％転化率で割ることによって計算された。
【０２２６】
図２Ａは、全てのタンパク質が修飾された第６の酵素混合物（修飾されたＥＧ２、ＥＧ１、ＣＢＨ２変異体およびベータ−グルコシダーゼ）がもっとも高いセルロ−ス転化率を有し、全てのタンパク質が非修飾の第５の酵素混合物がもっとも低い転化率を有することを示す。最初の四つの酵素混合物を比較すると、非修飾ＣＢＨ２を有する第２の酵素混合物が次にもっとも低い転化率を与えた。図２Ｂは、セルロ−ス転化における非修飾タンパク質を超える修飾タンパク質の優位性を示す。
【実施例６】
【０２２７】
トリコデルマリーゼイＣＢＨ２電荷ラダー変異体の調製
本開示発明の開発の間に判明したように、ＣＢＨ２の表面リシン残基のサクシニル化はＡＰＢについておよび前処理トウモロコシ茎葉についての性能を改善した。修飾ＣＢＨ２変異体の電荷は、修飾されていないＣＢＨ２変異体と比較して約−１７であった。この点を考慮して、ＣＢＨ２の電荷ラダーが、セルラーゼ性能の適用における最適表面電荷の決定のために設計された。
【０２２８】
以下の配列番号１は、参照ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２をコードするＤＮＡ配列を記載する。
atgattgtcggcattctcaccacgctggctacgctggccacactcgcagctagtgtgcctctagaggagcggcaagcttgctcaagcgt ctggggccaatgtggtggccagaattggtcgggtccgacttgctgtgcttccggaagcacatgcgtctactccaacgactattactccc agtgtcttcccggcgctgcaagctcaagctcgtccacgcgcgccgcgtcgacgacttctcgagtatcccccacaacatcccggtcga gctccgcgacgcctccacctggttctactactaccagagtacctccagtcggatcgggaaccgctacgtattcaggcaacccttttgttg gggtcactccttgggccaatgcatattacgcctctgaagttagcagcctcgctattcctagcttgactggagccatggccactgctgcag cagctgtcgcaaaggttccctcttttatgtggctagatactcttgacaagacccctctcatggagcaaaccttggccgacatccgcaccg ccaacaagaatggcggtaactatgccggacagtttgtggtgtatgacttgccggatcgcgattgcgctgcccttgcctcgaatggcgaa tactctattgccgatggtggcgtcgccaaatataagaactatatcgacaccattcgtcaaattgtcgtggaatattccgatatccggaccct cctggttattgagcctgactctcttgccaacctggtgaccaacctcggtactccaaagtgtgccaatgctcagtcagcctaccttgagtgc atcaactacgccgtcacacagctgaaccttccaaatgttgcgatgtatttggacgctggccatgcaggatggcttggctggccggcaaa ccaagacccggccgctcagctatttgcaaatgtttacaagaatgcatcgtctccgagagctcttcgcggattggcaaccaatgtcgcca actacaacgggtggaacattaccagccccccatcgtacacgcaaggcaacgctgtctacaacgagaagctgtacatccacgctattg gacctcttcttgccaatcacggctggtccaacgccttcttcatcactgatcaaggtcgatcgggaaagcagcctaccggacagcaaca gtggggagactggtgcaatgtgatcggcaccggatttggtattcgcccatccgcaaacactggggactcgttgctggattcgtttgtctg ggtcaagccaggcggcgagtgtgacggcaccagcgacagcagtgcgccacgatttgactcccactgtgcgctcccagatgccttgc aaccggcgcctcaagctggtgcttggttccaagcctactttgtgcagcttctcacaaacgcaaacccatcgttcctgtaa*
【０２２９】
以下の配列番号２は、ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２の完全長タンパク質配列を記載する。
MIVGILTTLATLATLAASVPLEERQACSSVWGQCGGQNWSGPTCCASGSTCVYSNDYYSQCL PGAASSSSSTRAASTTSRVSPTTSRSSSATPPPGSTTTRVPPVGSGTATYSGNPFVGVTPWA NAYYASEVSSLAIPSLTGAMATAAAAVAKVPSFMWLDTLDKTPLMEQTLADIRTANKNGGNY AGQFVVYDLPDRDCAALASNGEYSIADGGVAKYKNYIDTIRQIVVEYSDIRTLLVIEPDSLA NLVTNLGTPKCANAQSAYLECINYAVTQLNLPNVAMYLDAGHAGWLGWPANQDPAAQLFANV YKNASSPRALRGLATNVANYNGWNITSPPSYTQGNAVYNEKLYIHAIGPLLANHGWSNAFFI TDQGRSGKQPTGQQQWGDWCNVIGTGFGIRPSANTGDSLLDSFVWVKPGGECDGTSDSSAPR FDSHCALPDALQPAPQAGAWFQAYFVQLLTNANPSFL*
【０２３０】
以下の配列番号３は、ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２の成熟タンパク質配列を記載する。
QACSSVWGQCGGQNWSGPTCCASGSTCVYSNDYYSQCLPGAASSSSSTRAASTTSRVSPTTS RSSSATPPPGSTTTRVPPVGSGTATYSGNPFVGVTPWANAYYASEVSSLAIPSLTGAMATAA AAVAKVPSFMWLDTLDKTPLMEQTLADIRTANKNGGNYAGQFVVYDLPDRDCAALASNGEYS IADGGVAKYKNYIDTIRQIVVEYSDIRTLLVIEPDSLANLVTNLGTPKCANAQSAYLECINY AVTQLNLPNVAMYLDAGHAGWLGWPANQDPAAQLFANVYKNASSPRALRGLATNVANYNGWN ITSPPSYTQGNAVYNEKLYIHAIGPLLANHGWSNAFFITDQGRSGKQPTGQQQWGDWCNVIG TGFGIRPSANTGDSLLDSFVWVKPGGECDGTSDSSAPRFDSHCALPDALQPAPQAGAWFQAY
FVQLLTNANPSFL*
【０２３１】
変異されるべく選択された残基は、保存されていない露出したリシン、アルギニン、アスパラギンおよびグルタミン残基であり、これらは負電荷を導入する置換のために選ばれた。修飾ＣＢＨ２のサクシニル化リシンは質量分析法によって同定され、グルタメートへの変異誘発のために選択され、１置換について−２の電荷の差をもたらした。他の残基は、相同のＣＢＨ２配列のアミノ酸アラインメントと一緒にされたＣＢＨ２の三次元構造の解析によって置換のために選ばれた（たとえば、米国特許出願公開第２００６／０２０５０４２号の図３参照、本出願公開は参照によって本明細書に取り込まれる）。ＣＢＨ２アミノ酸配列アラインメントにおいて非常に活性である表面残基は、変異誘発の候補であった。しかし、ごく接近した置換の集積は避けられた。アルギニンはグルタメート（電荷−１）と置き換えられ、グルタミンおよびアスパラギンはそれぞれのカルボキシル変異体（電荷−１）によって置換された。さらに、アスパラテートおよびグルタメート残基は、電荷ラダーの完成のためにそれぞれのアミン残基への置換のために選ばれた（電荷＋１）。具体的なＣＢＨ２の置換は表６−１に示され、ＣＢＨ２触媒ドメインに位置するすべての位置がＲ６３およびＲ７７を除いて示されている。負に帯電した残基の除去によってかあるいは正に帯電した残基の導入によって、正味の正電荷が生成されることができる。同様に、正に帯電した残基の除去によってかあるいは負に帯電した残基の導入によって、正味の負電荷が生成されることができる。
【表４】

【０２３２】
ＣＢＨ２の電荷ラダーの調製のために、表６−２に示された４段差の野生型ＣＢＨ２と比較して、＋８〜−３２の電荷範囲にわたる１０のＣＢＨ２電荷変異体（Ｃ−１〜Ｃ−１０）が設計された。
【表５】

【０２３３】
変異体のアミノ酸配列が、ＧｅｎｅＤｅｓｉｇｎｅｒソフトウェア（ＤＮＡ２．０）を用いてトリコデルマリーゼイにおける発現に最適化されたＤＮＡおよびコドンに逆翻訳された。コドン最適化ｃｂｈ２変異体遺伝子が合成され、ＣＢＨ２表面電荷変異体（ＳＣＶ）のＤＮＡが、プライマー：ＧＧＨＫ２２順方向５'−ＣＡＣＣＡＴＧＡＴＣＧＴＧＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＴＡＣＴＣ−３'（配列番号１５）およびＧＧＴＨＫ２３逆方向５'−ＣＴＡＣＡＡＡＡＡＣＧＡＡＧＧＧＴＴＣＧＣＡＴＴ−３'（配列番号１６）を用いてＰＣＲによってＤＮＡ２．０構成体から増幅された。１の実験では、部位特異的変異誘発法が用いられて、Ｋ１２９ＥおよびＫ１５７Ｅ突然変異（ｃｂｈ２電荷変異体Ｃ−３）が野生型ＣＢＨ２のゲノムＤＮＡ中に導入された。ＣＢＨ２電荷変異体Ｃ−３は、以下のようにｐＴｒｅｘ３ＧＭ中にクローン化され発現された。
【０２３４】
ＰＣＲ産生物は精製され、大腸菌ＴＯＰ１０細胞の形質転換のためにｐＥＮＴＲ／ＴＯＰＯ中にクローン化された。プラスミドＤＮＡは単一コロニーから単離され、正しい配列が検証された。ＣＢＨ２ ＳＣＶは、表６-３に示されたようにｐＴｒｅｘ３ＧＭ、ｐＴＴＴｐｙｒ（ｐｃｂｈ１）およびｐＴＴＴｐｙｒ（ｐｓｔｐ１）中にクローン化された。
【表６】

【０２３５】
トリコデルマリーゼイ中のＣＢＨ２表面電荷変異体（ＳＣＶ）。（Ｋ１２９ＥおよびＫ１５７Ｅ変異体とともに）ｃｂｈ２電荷変異体Ｃ３読み取り枠を有するｐＴｒｅｘ３ＧＭ発現ベクターを用いたトリコデルマリーゼイの遺伝子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）形質転換法が、以下の手順を用いて実施された。その中のセロビオヒドロラーゼI（ＣＢＨI、Ｃｅｌ７ａ）、セロビオヒドロラーゼI I（ＣＢＨI I、Ｃｅｌ６ａ）、エンドグルカナーゼI（ＥＧI、Ｃｅｌ７ｂ）およびエンドグルカナーゼI I（ＥＧI I、Ｃｅｌ５ａ）をコードする遺伝子が不活性化されているトリコデルマリーゼイが用いられた。遺伝子銃（バイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ））形質転換法によるコデルマリーゼイ株の形質転換が、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社（米国、カリフォルニア州、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）からのＢｉｏｌｉｓｔｉｃ（商標）ＰＤＳ−１０００／ｈｅ粒子送達系（Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、製造業者の指示（国際公開第０５／００１０３６号および米国特許出願公開第２００６／０００３４０８号参照）に従って実施された。形質転換体は新しいＡｃｅｔａｍｉｄｅ選択プレートに移された。安定な形質転換体が、２００μｌ／ウェルのグリシン最少培地（６．０ｇ／Ｌグリシン；４．７ｇ／Ｌ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４；５．０ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４；１．０ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；３３．０ｇ／Ｌ ＰＩＰＰＳ；ｐＨ５．５）を含むフィルターマイクロタイタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中に接種され、炭素源としての約２％のグルコース／ソホローズ混合物、１０ｍｌ／Ｌの１００ｇ／ＬのＣａＣｌ_２、２．５ｍｌ／Ｌのトリコデルマリーゼイ微量元素（４００）：１７５ｇ／Ｌ無水クエン酸；２００ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；１６ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；３．２ｇ／Ｌ ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ；１．４ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ；０．８ｇ／Ｌ Ｈ_３ＢＯ_３の滅菌後添加をされた。形質転換体は、２８℃の培養器に内蔵されたＯ_２を豊富に含む室中で５日間液状培養物中で育成された。フィルターマイクロタイタープレートからの上清サンプルが真空連結管を用いることによって得られた。サンプルは、製造業者の指示に従って４〜１２％ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にかけられた。このゲルはＳｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって染色された。さらなるＣＢＨ２表面電荷変異体の発現はこの方法を用いて実施されることができる。
【実施例７】
【０２３６】
トリコデルマリーゼイにおけるＣＢＨ２電荷変異体の生成
ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２タンパク質をコードする配列（配列番号１）を有するＴＴＴｐｙｒ−ｃｂｈ２プラスミドが、部位評価ライブラリー（Ｓｉｔｅ Ｅｖａｕａｔｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｙ）（ＳＥＬ）を作成するためにＢＡＳＦＣｌｅａｒ社（蘭国、Ｌｅｉｄｅｎ）、ＧｅｎｅＡｒｔ社（独国、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ）およびＳｌｏｎｉｎｇ Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（独国、Ｐｕｃｈｈｅｉｍ）に送られた。ＴＴＴｐｙｒ−ｃｂｈ２のプラスミドマップは図５に示される。ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２成熟タンパク質（配列番号３）のそれぞれの部位における位置ライブラリーの作成が、上記業者に要求された。ＣＢＨ２完全長タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２に示される。
【０２３７】
以下の配列番号１は、参照ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２をコードするＤＮＡ配列を記載する。
atgattgtcggcattctcaccacgctggctacgctggccacactcgcagctagtgtgcctctagaggagcggcaagcttgctcaagcgt ctggggccaatgtggtggccagaattggtcgggtccgacttgctgtgcttccggaagcacatgcgtctactccaacgactattactccc agtgtcttcccggcgctgcaagctcaagctcgtccacgcgcgccgcgtcgacgacttctcgagtatcccccacaacatcccggtcga gctccgcgacgcctccacctggttctactactaccagagtacctccagtcggatcgggaaccgctacgtattcaggcaacccttttgttg gggtcactccttgggccaatgcatattacgcctctgaagttagcagcctcgctattcctagcttgactggagccatggccactgctgcag cagctgtcgcaaaggttccctcttttatgtggctagatactcttgacaagacccctctcatggagcaaaccttggccgacatccgcaccg ccaacaagaatggcggtaactatgccggacagtttgtggtgtatgacttgccggatcgcgattgcgctgcccttgcctcgaatggcgaa tactctattgccgatggtggcgtcgccaaatataagaactatatcgacaccattcgtcaaattgtcgtggaatattccgatatccggaccct cctggttattgagcctgactctcttgccaacctggtgaccaacctcggtactccaaagtgtgccaatgctcagtcagcctaccttgagtgc atcaactacgccgtcacacagctgaaccttccaaatgttgcgatgtatttggacgctggccatgcaggatggcttggctggccggcaaa ccaagacccggccgctcagctatttgcaaatgtttacaagaatgcatcgtctccgagagctcttcgcggattggcaaccaatgtcgcca actacaacgggtggaacattaccagccccccatcgtacacgcaaggcaacgctgtctacaacgagaagctgtacatccacgctattg gacctcttcttgccaatcacggctggtccaacgccttcttcatcactgatcaaggtcgatcgggaaagcagcctaccggacagcaaca gtggggagactggtgcaatgtgatcggcaccggatttggtattcgcccatccgcaaacactggggactcgttgctggattcgtttgtctg ggtcaagccaggcggcgagtgtgacggcaccagcgacagcagtgcgccacgatttgactcccactgtgcgctcccagatgccttgc aaccggcgcctcaagctggtgcttggttccaagcctactttgtgcagcttctcacaaacgcaaacccatcgttcctgtaa*
【０２３８】
以下の配列番号２は、ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２完全長タンパク質配列を記載する。
MIVGILTTLATLATLAASVPLEERQACSSVWGQCGGQNWSGPTCCASGSTCVYSNDYYSQCL PGAASSSSSTRAASTTSRVSPTTSRSSSATPPPGSTTTRVPPVGSGTATYSGNPFVGVTPWA NAYYASEVSSLAIPSLTGAMATAAAAVAKVPSFMWLDTLDKTPLMEQTLADIRTANKNGGNY AGQFVVYDLPDRDCAALASNGEYSIADGGVAKYKNYIDTIRQIVVEYSDIRTLLVIEPDSLA NLVTNLGTPKCANAQSAYLECINYAVTQLNLPNVAMYLDAGHAGWLGWPANQDPAAQLFANV YKNASSPRALRGLATNVANYNGWNITSPPSYTQGNAVYNEKLYIHAIGPLLANHGWSNAFFI TDQGRSGKQPTGQQQWGDWCNVIGTGFGIRPSANTGDSLLDSFVWVKPGGECDGTSDSSAPR FDSHCALPDALQPAPQAGAWFQAYFVQLLTNANPSFL*
【０２３９】
以下の配列番号３は、ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２成熟タンパク質配列を記載する。
QACSSVWGQCGGQNWSGPTCCASGSTCVYSNDYYSQCLPGAASSSSSTRAASTTSRVSPTTS
RSSSATPPPGSTTTRVPPVGSGTATYSGNPFVGVTPWANAYYASEVSSLAIPSLTGAMATAA AAVAKVPSFMWLDTLDKTPLMEQTLADIRTANKNGGNYAGQFVVYDLPDRDCAALASNGEYS
IADGGVAKYKNYIDTIRQIVVEYSDIRTLLVIEPDSLANLVTNLGTPKCANAQSAYLECINY
AVTQLNLPNVAMYLDAGHAGWLGWPANQDPAAQLFANVYKNASSPRALRGLATNVANYNGWN
ITSPPSYTQGNAVYNEKLYIHAIGPLLANHGWSNAFFITDQGRSGKQPTGQQQWGDWCNVIG
TGFGIRPSANTGDSLLDSFVWVKPGGECDGTSDSSAPRFDSHCALPDALQPAPQAGAWFQAY
FVQLLTNANPSFL*
【０２４０】
ＣＢＨ２変異体配列をコードする読み取り枠を有する精製ｐＴＴＴｐｙｒ−ｃｂｈ２プラスミド（ｐ_ｃｂｈ１、Ａｍｐ（商標）、Ａｃｅｔａｍｉｄｅ（商標））が、上で特定した業者から得られた。ハイポクレアジェコリーナ株（Δｅｇ１、Δｅｇ２、Δｃｂｈ１、Δｃｂｈ２）のプロトプラストがｐＴＴＴｐｙｒ構成体によって形質転換され、Ａｃｅｔａｍｉｄｅを含む選択寒天培地上で２８℃で７日間育成された。手短に言うと、ハイポクレアジェコリーナのバイオリスティック形質転換は以下の手順およびその中のセロビオヒドロラーゼI（ＣＢＨI、Ｃｅｌ７ａ）、セロビオヒドロラーゼI I（ＣＢＨI I、Ｃｅｌ６ａ）、エンドグルカナーゼI（ＥＧI、Ｃｅｌ７ｂ）およびエンドグルカナーゼI I（ＥＧI I、Ｃｅｌ５ａ）をコードする遺伝子が不活性化されている株を用いて実施された。バイオリスティック形質転換法によるこのハイポクレアジェコリーナの形質転換は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社（米国、カリフォルニア州、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）からのＢｉｏｌｉｓｔｉｃ（商標）ＰＤＳ−１０００／ｈｅ粒子送達系を用いて、製造業者の指示（国際公開第０５／００１０３６号および米国特許出願公開第２００６／０００３４０８号参照）に従って達成された。胞子が収穫され、Ａｃｅｔａｍｉｄｅ寒天上に移され、２８℃で７日間培養された。胞子は１５５グリセロール中に収穫され、さらなる使用のために−２０℃で貯蔵された。ＣＢＨ２変異体タンパク質の産生のために、１０μｌの胞子懸濁物が、ＰＶＤＦフィルタープレート中の２％のグルコース／ソホローズ混合物；６．０ｇ／Ｌグリシン、４．７ｇ／Ｌ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４；５．０ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４；１．０ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；３３．０ｇ／Ｌ ＰＩＰＰＳ；ｐＨ５．５を補充された２００μｌのグリシン最少培地に添加され、炭素源としての約２％のグルコース／ソホローズ混合物、１０ｍｌ／Ｌの１００ｇ／ＬのＣａＣｌ_２、２．５ｍｌ／Ｌのトリコデルマリーゼイ微量元素（４００Ｘ）：１７５ｇ／Ｌ無水クエン酸；２００ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；１６ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；３．２ｇ／Ｌ ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ；１．４ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ；０．８ｇ／Ｌ Ｈ_３ＢＯ_３の滅菌後添加をされた。各ＣＢＨ２変異体は正副４通りに育成された。プレートを酸素透過性膜でシールした後、プレートは２２０ｒｐｍで振とうされながら２８℃で６時間培養された。培地を低圧力下にマイクロタイタープレートに移すことによって、上清が収穫され、実施例１に記載されたヘキソキナーゼアッセイを用いて残留グルコースの有無について試験された。
【実施例８】
【０２４１】
ＣＢＨ２変異体の発現、活性および性能
ハイポクレアジェコリーナ電荷変異体が、関心の対象である様々な特性について試験された。特に、セルラーゼ変異体が、実施例１に記載されたようにＨＰＬＣアッセイ（ＨＰＬＣ）を用いてタンパク質の発現について、ＰＡＳＣ加水分解アッセイ（活性ＰＡＳＣ）およびＰＣＳ加水分解アッセイ（活性ＰＣＳ）を用いて比活性について、エタノールの存在下における安定性（ＥｔＯＨ比率）および熱安定性（熱比率）について試験された。ＣＢＨ２電荷変異体の性能データが表８−１に示される。性能指数（ＰＩ）は、変異体セルラーゼの性能と親セルラーゼまたは参照セルラーゼの性能との比である。下に記載される様々な項が突然変異を記述するのに用いられる。すなわち、アップ突然変異はＰＩ＞１を有し、中立突然変異はＰＩ≧０．５を有し、非有害突然変異はＰＩ＞０．０５を有し、有害突然変異はＰＩ＝０．０５を有し、合体可能突然変異は変異体が少なくとも１の特性について性能指数値≧０．５を有するような突然変異である。合体可能突然変異は、合体されて１以上の所望の特性について適切な性能指数を有するタンパク質を産み出すことができる突然変異である。突然変異が起きる位置は以下のように分類される。すなわち、非制限位置は少なくとも１の特性について２０％以上の中立突然変異を有し、制限位置は活性および安定性について２０％未満の中立突然変異を有する。完全制限位置は活性または安定性について中立突然変異を有しない。
【表７】







【０２４２】
これらのデータは、任意のＣＢＨ２を遺伝子操作するために用いられることができる。たとえ遺伝子操作されるべきＣＢＨ２が特定の位置においてハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２のアミノ酸とは異なるアミノ酸を有していても、最良の選択である置換、たとえばハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２野生型アミノ酸への置換を特定することによって、これらのデータが所望の特性を変える置換を見出すために用いられることができる。
【０２４３】
表８−１は、ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２の変異体についての性能指数値（ＰｉまたはＰＩ）を示す。０．０５以下の性能指数は０．０５に固定され、同表中にボールドイタリック体で示される。
【実施例９】
【０２４４】
ＣＢＨ２変異体活性への電荷の変化の効果
この実施例では、セルラーゼ活性の前処理トウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）アッセイにおける、ＣＢＨ２活性への電荷の変化の効果が評価された。手短に言うと、ＣＢＨ２ ＣＥＬ中のＰＣＳウィナーの数が、正味電荷特性の変化として測定された。表９−１では、ＰＣＳアッセイでの実測されたウィナーと予測されたウィナーとの比（ｏ／ｅ）が測定された。ボールドイタリック体の値は、それぞれの列に列挙された１０個のランダム分布の平均値プラスマイナス標準偏差値（ｓｄ）とは有意に異なっている。
【表８】

【０２４５】
表９−１および図４に示されたように、電荷の減少（たとえば、−１、−２）はＰＣＳアッセイにおけるＣＢＨ２ウィナーの優位に高い度数をもたらし、他方、電荷の増加（たとえば、＋１）はＰＣＳアッセイにおけるＣＢＨ２ウィナーの優位に低い度数をもたらす。結論として、ＰＣＳに基くＣＢＨ２活性は電荷の減少と相関している。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離セルラーゼ変異体であって、当該変異体がセルラーゼ活性を有しならびに６３、７７、１２９、１４７、１５３、１５７、１６１、１９４、１９７、２０３、２３７、２３９、２４７、２５４、２８１、２８５、２８８、２８９、２９４、３２７、３３９、３４４、３５６、３７８および３８２からなる群から選択された１以上の位置における置換を含む成熟型であり、該位置が配列番号３として記載された参照セロビオヒドロラーゼII（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して数えられ、該１以上の位置における置換が該セルラーゼ変異体に該参照ＣＢＨ２と比較してより負の正味電荷を生じさせるものである、単離セルラーゼ変異体。
【請求項２】
１以上の位置における置換が、１以上の正電荷の除去を含むものである、請求項１に記載の単離セルラーゼ変異体。
【請求項３】
１以上の正電荷の除去が、リシンまたはアルギニンを中性アミノ酸によって置き換えることを含むものである、請求項２に記載の単離セルラーゼ変異体。
【請求項４】
１以上の位置における置換が、１以上の負電荷の付加を含むものである、請求項１に記載の単離セルラーゼ変異体。
【請求項５】
１以上の負電荷の付加が、中性アミノ酸を負に帯電したアミノ酸によって置き換えることを含むものである、請求項４に記載の単離セルラーゼ変異体。
【請求項６】
１以上の位置における置換が、１以上の正電荷の除去および１以上の負電荷の付加を含むものである、請求項１に記載の単離セルラーゼ変異体。
【請求項７】
１以上の正電荷の除去および１以上の負電荷の付加が、リシンまたはアルギニンを負に帯電したアミノ酸によって置き換えることを含むものである、請求項６に記載の単離セルラーゼ変異体。
【請求項８】
１以上の位置における置換が、Ｋ１２９Ｅ、Ｋ１５７Ｅ、Ｋ１９４Ｅ、Ｋ２８８Ｅ、Ｋ３２７Ｅ、Ｋ３５６Ｅ、Ｒ６３Ｑ、Ｒ７７Ｑ、Ｒ１５３Ｑ、Ｒ２０３Ｑ、Ｒ２９４Ｑ、Ｒ３７８Ｑ、Ｎ１６１Ｄ、Ｎ１９７Ｄ、Ｎ２３７Ｄ、Ｎ２４７Ｄ、Ｎ２５４Ｄ、Ｎ２８５Ｄ、Ｎ２８９Ｄ、Ｎ３３９Ｄ、Ｎ３４４Ｄ、Ｎ３８２Ｄ、Ｑ１４７Ｅ、Ｑ２０４Ｅ、Ｑ２３９ＥおよびＱ２８１Ｅからなる群のうちの１以上を含み、該位置が配列番号３として記載された参照セロビオヒドロラーゼII（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して数えられるものである、請求項１に記載の単離セルラーゼ変異体。
【請求項９】
変異体が、１４６、１５１、１８９、２０８、２１１、２４４、２７７および４０５からなる群から選択された１以上のさらなる位置におけるさらなる置換を含み、該さらなる位置は、配列番号３として記載された参照セロビオヒドロラーゼII（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して数えられるものである、請求項１に記載の単離セルラーゼ変異体。
【請求項１０】
１以上のさらなる位置におけるさらなる置換が、アスパラギン酸またはグルタミン酸を中性アミノ酸で置き換えることを含むものである、請求項９に記載の単離セルラーゼ変異体。
【請求項１１】
１以上のさらなる位置におけるさらなる置換が、Ｄ１５１Ｎ、Ｄ１８９Ｎ、Ｄ２１１Ｎ、Ｄ２７７Ｎ、Ｄ４０５Ｎ、Ｅ１４６Ｑ、Ｅ２０８ＱおよびＥ２４４Ｑからなる群のうちの１以上を含み、該位置が配列番号３として記載された参照セロビオヒドロラーゼII（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して数えられるものである、請求項９に記載の単離セルラーゼ変異体。
【請求項１２】
１以上の位置における置換が、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０個の位置からなる群から選択されるものである、請求項１に記載の単離セルラーゼ変異体。
【請求項１３】
セルラーゼ変異体が、ハイポクレアジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ）ＣＢＨ２、ハイポクレアコニンギ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）ＣＢＨ２、フミコーラインソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）ＣＢＨ２、アクレモニウムセルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＣＢＨ２、アガリカスビスポラス（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ）ＣＢＨ２、フサリウムオシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｓｙｓｐｏｒｕｍ）ＥＧ、ファネロキーテクリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）ＣＢＨ２、タラロマイセスエメルソニ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）ＣＢＨ２、サーモビフィダフスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ）６Ｂ／Ｅ３ ＣＢＨ２、サーモビフィダフスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ）６Ａ／Ｅ２ ＥＧおよびセルロモナスフィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｆｉｍｉ）ＣｅｎＡ ＥＧからなる群から選択された親セルラーゼに由来するものである、請求項１に記載の単離セルラーゼ変異体。
【請求項１４】
セルラーゼ変異体が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３からなる群の構成員とアミノ酸配列が少なくとも７５％同一である親セルラーゼに由来するものである、請求項１に記載の単離セルラーゼ変異体。
【請求項１５】
より負の正味電荷が、該参照ＣＢＨ２と比較して−１または−２である、請求項１に記載の単離セルラーゼ変異体。
【請求項１６】
バイオマスを糖に転化する方法であって、当該バイオマスを請求項１に記載のセルラーゼ変異体に接触させる工程を含む、方法。
【請求項１７】
燃料を製造する方法であって、
バイオマス組成物を、請求項１に記載のセルラーゼ変異体を含む酵素組成物に接触させて、糖溶液を生成する工程、および
該糖溶液を、燃料を製造するのに十分な条件下に発酵性微生物とともに温置する工程
を含む、方法。
【請求項１８】
セルラーゼ活性を有し、かつリシン残基を化学修飾して該リシン残基の正電荷が除かれている、成熟型である、セルラーゼ変異体。
【請求項１９】
化学修飾が、無水コハク酸、無水アセトキシコハク酸、無水マレイン酸、無水酒石酸、無水フタル酸、無水トリメリット酸、無水シス−アコニット酸、無水ｔ−ニトロフタル酸、無水酢酸、無水酪酸、無水イソ酪酸、無水ヘキサン酸、無水吉草酸、無水イソ吉草酸および無水ピバル酸からなる群から選択された化合物による処理を含むものである、請求項１８に記載のセルラーゼ変異体。
【請求項２０】
セルラーゼ変異体が、ハイポクレアジェコリーナセロビオヒドロラーゼＩ、ハイポクレアジェコリーナセロビオヒドロラーゼII、ハイポクレアジェコリーナエンドグルカナーゼＩ、ハイポクレアジェコリーナエンドグルカナーゼIIおよびハイポクレアジェコリーナベータグルコシダーゼからなる群から選択された親セルラーゼに由来するものである、請求項１８に記載のセルラーゼ変異体。
【請求項２１】
セルラーゼ変異体が、ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２、ハイポクレアコニンギＣＢＨ２、フミコーラインソレンスＣＢＨ２、アクレモニウムセルロリティカスＣＢＨ２、アガリカスビスポラスＣＢＨ２、フサリウムオシスポラムＥＧ、ファネロキーテクリソスポリウムＣＢＨ２、タラロマイセスエメルソニＣＢＨ２、サーモビフィダフスカ６Ｂ／Ｅ３ ＣＢＨ２、サーモビフィダフスカ６Ａ／Ｅ２ ＥＧおよびセルロモナスフィミＣｅｎＡ ＥＧからなる群から選択された親セルラーゼに由来するものである、請求項１８に記載のセルラーゼ変異体。
【請求項２２】
セルラーゼ変異体が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３からなる群の構成員とアミノ酸配列が少なくとも７５％同一である親セルラーゼに由来するものである、請求項１８に記載の単離セルラーゼ変異体。
【請求項２３】
セルラーゼ変異体が、６３、７７、１２９、１４７、１５３、１５７、１６１、１９４、１９７、２０３、２３７、２３９、２４７、２５４、２８１、２８５、２８８、２８９、２９４、３２７、３３９、３４４、３５６、３７８および３８２からなる群から選択された１以上の位置における置換を含み、該位置が配列番号３として記載された参照セロビオヒドロラーゼII（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列に対応して数えられるものである、請求項１８に記載の単離セルラーゼ変異体。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図３−１】

【図３−２】

【図３−３】

【図４】

【図５】

【公表番号】特表２０１１−５２３８５４（Ｐ２０１１−５２３８５４Ａ）
【公表日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１２６２２（Ｐ２０１１−５１２６２２）
【出願日】平成２１年６月３日（２００９．６．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４６１５９
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４９２０２
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５０９２４０４７９）ダニスコ・ユーエス・インク (81)
【Ｆターム（参考）】