本発明は、非天然アミノ酸での修飾による修飾標的分子（例えば、治療用分子）の組成物およびその同定、修飾および作製方法を提供する。本発明の特定のある態様には、化学物質部分を標的分子に付加する方法、およびそれにより得られる組成物が含まれる。また、本発明の特定のある態様は、本明細書に記載の修飾標的分子を同定、修飾および作製するためのキットに関する。本開示の一部のある態様は、（ａ）前記分子の１つ以上のアミノ酸残基を、天然に存在する異なるアミノ酸残基で置換する工程、および（ｂ）１つ以上のアミノ酸残基を非天然アミノ酸残基で置換する工程を１ラウンド以上含み、ここで、前記分子は天然の機能を保持している、分子を修飾するための方法に関する。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾標的ポリペプチドの作製方法であって
（ａ）該標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有するベクターを含む宿主細胞を供給すること、
（ｂ）１つ以上の非天然アミノ酸コドンを該ポリヌクレオチド内に部位特異的に組み込むこと、ここで、少なくとも１つの非天然アミノ酸コドンが該標的ポリペプチドのアミノ末端の１位に対応する、
（ｃ）該標的ポリペプチドが発現されるような条件下で該宿主細胞を培養すること、ここで、標的分子は該非天然アミノ酸残基を該アミノ末端の１位に保持しており、該アミノ末端の１位の非天然アミノ酸残基は、アジド、アルキン、ビニルまたはアリールハライド基を含んでおり、それにより修飾標的ポリペプチドが生成される、
を含む、。
【請求項２】
１つ以上の非天然アミノ酸コドンが、前記標的ポリペプチドのアミノ末端の最後から２番目の位置をコードしている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ以上の非天然アミノ酸が、アジドノルロイシン、３−（１−ナフチル）アラニン、３−（２−ナフチル）アラニン、ｐ−エチニル−フェニルアラニン、ｐ−プロパルギル（ｐｒｏｐａｒｇｌｙ）−オキシ−フェニルアラニン、ｍ−エチニル−フェニルアラニン、６−エチニル−トリプトファン、５−エチニル−トリプトファン、（Ｒ）−２−アミノ−３−（４−エチニル−１Ｈ−ピロル−３−イル）プロパン酸（ｐｒｏｐａｎｉｃ ａｃｉｄ）、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−アジドフェニルアラニン、３−（６−クロロインドリル）アラニン、３−（６−ブロモインドリル）アラニン、３−（５−ブロモインドリル）アラニン、アジドホモアラニン、およびｐ−クロロフェニルアラニンからなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
化学物質部分を前記標的ポリペプチドの非天然アミノ酸残基の１つ以上に結合させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
化学物質部分を、前記標的ポリペプチドのアミノ末端の１位の非天然アミノ酸残基に結合させる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記非天然アミノ酸が、フッ素化されたもの、電気活性のもの、または不飽和のものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記化学物質部分を前記非天然アミノ酸残基に、該非天然アミノ酸と該化学物質部分間の炭素−炭素単結合、炭素−炭素二重結合、炭素−炭素三重結合、またはトリアゾール結合によって結合させる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記化学物質部分を前記非天然アミノ酸残基に、共有結合性相互作用によって結合させる、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記化学物質部分を前記非天然アミノ酸残基に、銅触媒型［３＋２］付加環化、鈴木カップリング、檜山カップリング、熊田カップリング、ヘック反応、Ｃａｄｉｏｔ−Ｃｈｏｄｋｉｅｗｉｃｚカップリング、および薗頭カップリングからなる群より選択される化学反応によって結合させる、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記化学物質部分が、細胞毒、医薬用薬物、色素または蛍光標識、求核性または求電子性の基、ケトンまたはアルデヒド、アジドまたはアルキン化合物、フォトケージ形（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）基、タグ、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、オリゴ糖、ポリエチレングリコール（任意の分子量を有し、任意のジオメトリーのもの）、ポリビニルアルコール、金属、金属錯体、ポリアミン、イミダゾール、炭水化物、脂質、生体ポリマー、粒子、固相支持体、ポリマー、標的化剤、親和性基、相補的な反応性化学物質基が結合し得る任意の薬剤、生物物理的または生化学的プローブ、アイソタイプ標識プローブ、スピン標識アミノ酸、フルオロフォア、アリールのヨウ化物および臭化物からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的ポリペプチドが、抗体、抗体断片、抗体誘導体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディ、ダイマー、トリマーまたはミニボディ、サイトカイン、細胞の成長、分化または調節をモジュレートする転写モジュレーター、発現活性化因子、炎症関連分子、増殖因子、増殖因子受容体、および癌遺伝子産物からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的ポリペプチドが、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ホリトロピン、トロンボポエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｅｉｔｉｎ）、エリスロポイエチン、ヒト成長ホルモン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−Ω、インターフェロン−τ、およびＧＬＰ−１からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
１つ以上のアミノ酸コドンの前記部位特異的組込みが、部位特異的変異誘発、エラープローンＰＣＲ、遺伝子シャッフリング、相同組換え、アンバー終止コドンの組込み、ウォッブルコドンの組込み、末端変異型アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの使用、およびバイアスコドンの組込みからなる群より選択される手法によって行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
標的ポリペプチドをコードする修飾標的ポリヌクレオチドを含む組成物であって、該標的ポリヌクレオチドが１つ以上の非天然アミノ酸コドンを含み、少なくとも１つの非天然アミノ酸コドンが、アジド、アルキン、ビニル、またはアリールハライド基を含んでおり、該標的ポリペプチドのアミノ末端の１位に対応している、組成物。
【請求項１５】
宿主細胞をさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
少なくとも１つの非天然アミノ酸コドンが、前記標的ポリペプチドのアミノ末端の最後から２番目の位置に対応している、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記標的ポリペプチドの１つ以上の非天然アミノ酸残基に結合された化学物質部分をさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
前記化学物質部分が、少なくとも前記標的ポリペプチドのアミノ末端の１位の非天然アミノ酸残基に結合されている、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
前記化学物質部分が、前記標的ポリペプチドのアミノ末端の１位に対応する非天然アミノ酸に共有結合により結合されている、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記化学物質部分が、前記標的ポリペプチドのアミノ末端の１位に対応する非天然アミノ酸に、該化学物質部分と該非天然アミノ酸間の炭素−炭素単結合、炭素−炭素二重結合、炭素−炭素三重結合、またはトリアゾール結合によって結合されている、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記化学物質部分が、細胞毒、医薬用薬物、色素または蛍光標識、求核性または求電子性の基、ケトンまたはアルデヒド、アジドまたはアルキン化合物、フォトケージ形基、タグ、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、オリゴ糖、ポリエチレングリコール（任意の分子量を有し、任意のジオメトリーのもの）、ポリビニルアルコール、金属、金属錯体、ポリアミン、イミダゾール類、炭水化物、脂質、生体ポリマー、粒子、固相支持体、ポリマー、標的化剤、親和性基、相補的な反応性化学物質基が結合し得る任意の薬剤、生物物理的または生化学的プローブ、アイソタイプ標識プローブ、スピン標識アミノ酸、フルオロフォア、アリールのヨウ化物および臭化物からなる群より選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記修飾標的ポリペプチドが、抗体、抗体断片、抗体誘導体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディ、ダイマー、トリマーまたはミニボディ、サイトカイン、細胞の成長、分化または調節をモジュレートする転写モジュレーター、発現活性化因子、炎症関連分子、増殖因子、増殖因子受容体、および癌遺伝子産物からなる群より選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記修飾標的ポリペプチドが、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ホリトロピン、トロンボポエチン、エリスロポイエチン、ヒト成長ホルモン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−Ω、インターフェロン−τ、およびＧＬＰ−１からなる群より選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記修飾標的ポリペプチドがインターフェロン−βを含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記非天然アミノ酸コドンの少なくとも１つが、前記修飾標的ポリペプチドの２、１７、３６、４０、４４、６２および１１７位からなる群より選択される位置に対応している、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
１つ以上の非天然アミノ酸残基が組み込まれた標的ポリペプチドを含む修飾標的ポリペプチドを含む医薬組成物であって、該非天然アミノ酸残基の少なくとも１つが、標的ポリペプチドのアミノ末端の１位に対応している、医薬組成物。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図１Ｃ】

【図１Ｄ】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【公表番号】特表２００９−５３５０５７（Ｐ２００９−５３５０５７Ａ）
【公表日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０９６８５（Ｐ２００９−５０９６８５）
【出願日】平成１９年５月２日（２００７．５．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１０６３１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３０４５３
【国際公開日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【出願人】（５０８３２６６６６）アロザイン，　インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】