非対称二本鎖ＲＮＡによる特異的阻害のための、方法および組成物
本発明は、非対称末端構造を有するダイサー基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）剤の使用によって、ＫＲＡＳ標的ＲＮＡおよびタンパク質レベルを減少させるのに有用な、化合物、組成物、および方法に関する。
Notice: Undefined index: DEJ in /mnt/www/gzt_disp.php on line 298
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１および第２の核酸鎖ならびに少なくとも２５個の塩基対の二重鎖領域を含む単離された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡの前記第２の鎖は、その３’末端に１〜５個の一本鎖ヌクレオチドを含み、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖は、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９個のヌクレオチドかつ多くとも３５個のヌクレオチドに沿って、配列番号１４１〜１８６から成る群から選択される標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡ配列と十分に相補的であり、前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入される場合、ＫＲＡＳ標的遺伝子発現を減少させる、単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項２】
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の最初のヌクレオチド（１位）から始めて、１、２、および／または３位が、修飾ヌクレオチドで置換される、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項３】
前記第１の鎖の前記３’末端および前記第２の鎖の前記５’末端は、平滑末端を形成する、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項４】
前記第１の鎖は、２５ヌクレオチド長であり、かつ前記第２の鎖は、２７ヌクレオチド長である、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項５】
前記第２の鎖は、配列番号１１〜５０および１３５〜１４０から成る群から選択される配列を含む、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項６】
前記第１の鎖は、配列番号５、８、および９１〜１３４から成る群から選択される配列を含む、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項７】
配列番号５／配列番号１４、配列番号８／配列番号４３、配列番号１３２／配列番号１３８、配列番号９１／配列番号１１、配列番号１２９／配列番号１３５、配列番号９２／配列番号１２、配列番号１３０／配列番号１３６、配列番号９３／配列番号１３、配列番号１３１／配列番号１３７、配列番号９４／配列番号１５、配列番号１３３／配列番号１３９、配列番号９５／配列番号１６、配列番号９６／配列番号１７、配列番号９７／配列番号１８、配列番号９８／配列番号１９、配列番号９９／配列番号２０、配列番号１００／配列番号２１、配列番号１０１／配列番号２２、配列番号１０２／配列番号２３、配列番号１０３／配列番号２４、配列番号１０４／配列番号２５、配列番号１０５／配列番号２６、配列番号１０６／配列番号２７、配列番号１０７／配列番号２８、配列番号１０８／配列番号２９、配列番号１０９／配列番号３０、配列番号１１０／配列番号３１、配列番号１１１／配列番号３２、配列番号１１２／配列番号３３、配列番号１１３／配列番号３４、配列番号１１４／配列番号３５、配列番号１１５／配列番号３６、配列番号１１６／配列番号３７、配列番号１１７／配列番号３８、配列番号１１８／配列番号３９、配列番号１１９／配列番号４０、配列番号１３４／配列番号１４０、配列番号１２０／配列番号４１、配列番号１２１／配列番号４２、配列番号１２２／配列番号４４、配列番号１２３／配列番号４５、配列番号１２４／配列番号４６、配列番号１２５／配列番号４７、配列番号１２６／配列番号４８、配列番号１２７／配列番号４９、および配列番号１２８／配列番号５０から成る群から選択される１対の第１の鎖／第２の鎖の配列を含む、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項８】
前記第１の鎖および前記第２の鎖のそれぞれは、少なくとも２６ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項９】
前記第１の鎖の前記３’末端の前記修飾ヌクレオチド残基は、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、および蛍光分子から成る群から選択される、請求項２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項１０】
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖の前記３’末端の１位は、デオキシリボヌクレオチドである、請求項２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項１１】
前記３’オーバーハングの前記ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項１２】
前記３’オーバーハングの前記修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである、請求項１１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項１３】
前記３’オーバーハングの全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項１４】
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖および第２のオリゴヌクレオチド鎖のうちの一方または両方が、５’リン酸塩を含む、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項１５】
前記修飾ヌクレオチド残基は、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、２−アミノ、および２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）から成る群から選択される、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項１６】
前記３’オーバーハングは、１〜３ヌクレオチド長である、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項１７】
前記３’オーバーハングは、１〜２ヌクレオチド長である、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項１８】
前記３’オーバーハングは、２ヌクレオチド長であり、前記３’オーバーハングの前記修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドである、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項１９】
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖は、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖の前記５’末端ヌクレオチド残基と相補的な前記第２の鎖の前記ヌクレオチド残基から始めて、交互の修飾および非修飾ヌクレオチド残基を含む、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項２０】
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖は、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端ヌクレオチド残基と相補的な前記第２の鎖のヌクレオチド残基から始めて、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の１８位から５’末端までの全ての位置において、非修飾ヌクレオチド残基を含む、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項２１】
前記第１の鎖および前記第２の鎖のそれぞれは、少なくとも２６かつ多くとも３０ヌクレオチド長を有する、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項２２】
前記ｄｓＲＮＡは、前記細胞においてダイサーによって内因的に切断される、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項２３】
前記標的遺伝子の発現を減少させるのに十分である前記単離された二本鎖核酸の量は、前記細胞の環境において、１ナノモル以下、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下、１０ピコモル以下、５ピコモル以下、２ピコモル以下、および１ピコモル以下から成る群から選択される、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項２４】
前記単離されたｄｓＲＮＡは、１ナノモル以下の細胞環境内有効濃度で、哺乳動物細胞においてインビトロでアッセイされる場合、標的ＫＲＡＳ遺伝子発現の減少において、前記標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９個のヌクレオチドを対象とする単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも高い効力を有する、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項２５】
前記単離されたｄｓＲＮＡは、前記細胞の環境において、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下、１０ピコモル以下、５ピコモル以下、２ピコモル以下、および１ピコモル以下から成る群から選択される細胞環境内有効濃度で、哺乳動物細胞においてインビトロでアッセイされる場合、標的ＫＲＡＳ遺伝子発現の減少において、前記標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９個のヌクレオチドを対象とする単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも高い効力を有する、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項２６】
前記単離されたｄｓＲＮＡは、前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入される場合、少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０〜９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％から成る群から選択される（％によって表現される）量、ＫＲＡＳ標的遺伝子発現を減少させるように、前記標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡ配列と十分に相補的である、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項２７】
前記第１の鎖および第２の鎖は、化学的リンカーによって結合される、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項２８】
前記第１の鎖の前記３’末端および前記第２の鎖の前記５’末端は、化学的リンカーによって結合される、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項２９】
前記第２の鎖または第１の鎖のヌクレオチドは、ダイサー切断の配向を導く修飾ヌクレオチドで置換される、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項３０】
デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシミジン（ｄ４Ｔ）、３’−アジド−３’−デオキシミジン（ＡＺＴ）および２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）の一リン酸ヌクレオチド、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチド、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−（３−アミノアリル）−ウラシル、２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−アミノリボヌクレオチド、２’−フルオロリボヌクレオチド、ならびにロックされた核酸から成る群から選択される修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項３１】
ホスホネート、ホスホロチオアート、およびホスホトリエステルから成る群から選択されるリン酸骨格修飾を含む、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項３２】
哺乳動物細胞において、標的ＫＲＡＳ遺伝子の発現を減少させるための方法であって、哺乳動物細胞を、前記細胞内の標的ＫＲＡＳ遺伝子の発現を減少させるのに十分な量の請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡと、インビトロで接触させることを含む、方法。
【請求項３３】
標的ＫＲＡＳ遺伝子発現は、少なくとも１０％、少なくとも５０％、および少なくとも８０〜９０％から成る群から選択される（％によって表現される）量減少する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＫＲＡＳ ｍＲＮＡレベルは、前記細胞を前記ｄｓＲＮＡと接触させてから少なくとも８日後、少なくとも９０％（％によって表現される）の量減少する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
ＫＲＡＳ ｍＲＮＡレベルは、前記細胞を前記ｄｓＲＮＡと接触させてから少なくとも１０日後、少なくとも７０％（％によって表現される）の量減少する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
哺乳動物において、標的ＫＲＡＳ遺伝子の発現を減少させるための方法であって、前記哺乳動物内の標的ＫＲＡＳ遺伝子の発現を減少させるのに十分な量で、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡを哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項３７】
前記単離されたｄｓＲＮＡは、１日当たり前記哺乳動物のキログラム当たり１マイクログラム〜５ミリグラム、キログラム当たり１００マイクログラム〜０．５ミリグラム、キログラム当たり０．００１〜０．２５ミリグラム、キログラム当たり０．０１〜２０マイクログラム、キログラム当たり０．０１〜１０マイクログラム、キログラム当たり０．１０〜５マイクログラム、およびキログラム当たり０．１〜２．５マイクログラム、から成る群から選択される用量で投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記単離されたｄｓＲＮＡは、１ナノモル以下の細胞環境内有効濃度で、哺乳動物細胞においてインビトロでアッセイされる場合、標的ＫＲＡＳ遺伝子発現の減少において、前記標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９個のヌクレオチドを対象とする単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも高い効力を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記投与ステップは、静脈注射、筋肉注射、腹腔内注射、点滴、皮下注射、経皮、エアロゾル、直腸、膣内、局所、経口、および吸入送達から成る群から選択される様式を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
細胞の増殖を選択的に阻害するための方法であって、前記細胞の増殖を阻害するのに十分な量の請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡと、細胞を接触させることを含む、方法。
【請求項４１】
前記細胞は、対象の腫瘍細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞は、インビトロの腫瘍細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞は、ヒト細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記ｄｓＲＮＡは、前記ｄｓＲＮＡが哺乳動物細胞にインビトロで導入される場合、少なくとも１０％、少なくとも５０％、および少なくとも８０〜９０％から成る群から選択される（％によって表現される）量、標的ＫＲＡＳ ＲＮＡレベルを減少させるのに有効な量で存在し、前記ｄｓＲＮＡは、１ナノモル以下の細胞環境内有効濃度で、哺乳動物細胞においてインビトロでアッセイされる場合、標的ＫＲＡＳ ＲＮＡレベルの減少において、前記標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９個のヌクレオチドを対象とする単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも高い効力を有する、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡを含む製剤。
【請求項４５】
前記有効量は、前記細胞の環境において、１ナノモル以下、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下、１０ピコモル以下、５ピコモル以下、２ピコモル以下、および１ピコモル以下から成る群から選択される、請求項４４に記載の製剤。
【請求項４６】
前記ｄｓＲＮＡは、前記ｄｓＲＮＡが哺乳動物対象の細胞に導入される場合、少なくとも１０％、少なくとも５０％、および少なくとも８０〜９０％から成る群から選択される（％によって表現される）量、標的ＲＮＡレベルを減少させるのに有効な量で存在し、前記ｄｓＲＮＡは、１ナノモル以下の細胞環境内有効濃度で、哺乳動物細胞においてインビトロでアッセイされる場合、標的ＫＲＡＳ ＲＮＡレベルの減少において、前記標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９個のヌクレオチドを対象とする単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも高い効力を有する、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡを含む製剤。
【請求項４７】
前記有効量は、１日当たり前記対象のキログラム当たり１マイクログラム〜５ミリグラム、キログラム当たり１００マイクログラム〜０．５ミリグラム、キログラム当たり０．００１〜０．２５ミリグラム、キログラム当たり０．０１〜２０マイクログラム、キログラム当たり０．０１〜１０マイクログラム、キログラム当たり０．１０〜５マイクログラム、およびキログラム当たり０．１〜２．５マイクログラム、から成る群から選択される用量である、請求項４６に記載の製剤。
【請求項４８】
請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡを含む、哺乳動物細胞。
【請求項４９】
請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項５０】
請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡおよびその使用のための取扱説明書を含む、キット。
【請求項５１】
第１のおよび第２の核酸鎖ならびに少なくとも２５個の塩基対の二重鎖領域を含む単離された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）から本質的に成るＫＲＡＳ阻害活性を有する組成物であって、前記ｄｓＲＮＡの前記第２の鎖は、その３’末端に１〜５個の一本鎖ヌクレオチドを含み、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖は、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９個のヌクレオチドかつ多くとも３５個のヌクレオチドに沿って、配列番号１４１〜１８６から成る群から選択される標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡ配列と十分に相補的であり、前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入される場合、ＫＲＡＳ標的遺伝子発現を減少させる、組成物。
【請求項５２】
第１のおよび第２の核酸鎖ならびに少なくとも２５個の塩基対の二重鎖領域を含む単離された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡの前記第２の鎖は、その３’末端に１〜５個の一本鎖ヌクレオチドを含み、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖は、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９個のヌクレオチドかつ多くとも３５個のヌクレオチドに沿って、配列番号１５９５〜２２９７および３７０４〜４４０６から成る群から選択される標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡ配列と十分に相補的であり、前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入される場合、ＫＲＡＳ標的遺伝子発現を減少させる、単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項５３】
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の最初のヌクレオチド（１位）から始めて、１、２、および／または３位が、修飾ヌクレオチドで置換される、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項５４】
前記第１の鎖の前記３’末端および前記第２の鎖の前記５’末端は、平滑末端を形成する、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項５５】
前記第１の鎖は、２５ヌクレオチド長であり、かつ前記第２の鎖は、２７ヌクレオチド長である、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項５６】
前記第２の鎖は、配列番号１８９〜８９１および２２９８〜３０００から成る群から選択される配列を含む、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項５７】
前記第１の鎖は、配列番号８９２〜１５９４および３００１〜３７０３から成る群から選択される配列を含む、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項５８】
表４〜５に示されるＤｓｉＲＮＡ剤から成る群から選択される１対の第１の鎖／第２の鎖の配列を含む、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項５９】
前記第１の鎖および前記第２の鎖のそれぞれは、少なくとも２６ヌクレオチドの長さを有する、請求項５２に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項６０】
前記第１の鎖の前記３’末端の前記修飾ヌクレオチド残基は、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、および蛍光分子から成る群から選択される、請求項５３に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項６１】
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖の前記３’末端の１位は、デオキシリボヌクレオチドである、請求項５３に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項６２】
前記３’オーバーハングの前記ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含む、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項６３】
前記３’オーバーハングの前記修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである、請求項６２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項６４】
前記３’オーバーハングの全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項６５】
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖および第２のオリゴヌクレオチド鎖のうちの一方または両方が、５’リン酸塩を含む、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項６６】
前記修飾ヌクレオチド残基は、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、２−アミノ、および２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）から成る群から選択される、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項６７】
前記３’オーバーハングは、１〜３ヌクレオチド長である、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項６８】
前記３’オーバーハングは、１〜２ヌクレオチド長である、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項６９】
前記３’オーバーハングは、２ヌクレオチド長であり、前記３’オーバーハングの前記修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドである、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項７０】
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖の前記５’末端ヌクレオチド残基と相補的な前記第２の鎖の前記ヌクレオチド残基から始めて、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が、交互の修飾および非修飾ヌクレオチド残基を含む、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項７１】
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端ヌクレオチド残基と相補的な前記第２の鎖のヌクレオチド残基から始めて、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の１８位から５’末端までの全ての位置において、非修飾ヌクレオチド残基を含む、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項７２】
前記第１の鎖および前記第２の鎖のそれぞれは、少なくとも２６かつ多くとも３０ヌクレオチド長を有する、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項７３】
前記ｄｓＲＮＡは、前記細胞においてダイサーによって内因的に切断される、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項７４】
前記単離された二本鎖核酸の量は、前記細胞の環境において、１ナノモル以下、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下、１０ピコモル以下、５ピコモル以下、２ピコモル以下、および１ピコモル以下から成る群から選択される、前記標的遺伝子の発現を減少させるのに十分である、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項７５】
前記単離されたｄｓＲＮＡは、１ナノモル以下の細胞環境内有効濃度で、哺乳動物細胞においてインビトロでアッセイされる場合、標的ＫＲＡＳ遺伝子発現の減少において、前記標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９個のヌクレオチドを対象とする単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも高い効力を有する、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項７６】
前記単離されたｄｓＲＮＡは、前記細胞の環境において、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下、１０ピコモル以下、５ピコモル以下、２ピコモル以下、および１ピコモル以下から成る群から選択される細胞環境内有効濃度で、哺乳動物細胞においてインビトロでアッセイされる場合、標的ＫＲＡＳ遺伝子発現の減少において、前記標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９個のヌクレオチドを対象とする単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも高い効力を有する、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項７７】
前記単離されたｄｓＲＮＡは、前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入される場合、少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０〜９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％から成る群から選択される（％によって表現される）量、ＫＲＡＳ標的遺伝子発現を減少させるように、前記標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡ配列と十分に相補的である、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項７８】
前記第１の鎖および第２の鎖は、化学的リンカーによって結合される、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項７９】
前記第１の鎖の前記３’末端および前記第２の鎖の前記５’末端は、化学的リンカーによって結合される、請求項５２に記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項８０】
前記第２の鎖または第１の鎖のヌクレオチドは、ダイサー切断の配向を導く修飾ヌクレオチドで置換される、請求項５２に記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項８１】
デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシミジン（ｄ４Ｔ）、３’−アジド−３’−デオキシミジン（ＡＺＴ）および２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）の一リン酸ヌクレオチド、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチド、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−（３−アミノアリル）−ウラシル、２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−アミノリボヌクレオチド、２’−フルオロリボヌクレオチド、ならびにロックされた核酸から成る群から選択される修飾ヌクレオチドを含む、請求項５２に記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項８２】
ホスホネート、ホスホロチオアート、およびホスホトリエステルから成る群から選択されるリン酸骨格修飾を含む、請求項５２に記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項８３】
哺乳動物細胞において、標的ＫＲＡＳ遺伝子の発現を減少させるための方法であって、哺乳動物細胞を、前記細胞内の標的ＫＲＡＳ遺伝子の発現を減少させるのに十分な量の請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡと、インビトロで接触させることを含む、方法。
【請求項８４】
標的ＫＲＡＳ遺伝子発現は、少なくとも１０％、少なくとも５０％、および少なくとも８０〜９０％から成る群から選択される（％によって表現される）量減少する、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
ＫＲＡＳ ｍＲＮＡレベルは、前記細胞を前記ｄｓＲＮＡと接触させてから少なくとも８日後、少なくとも９０％の（％によって表現される）量減少する、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
ＫＲＡＳ ｍＲＮＡレベルは、前記細胞を前記ｄｓＲＮＡと接触させてから少なくとも１０日後、少なくとも７０％の（％によって表現される）量減少する、請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
哺乳動物において、標的ＫＲＡＳ遺伝子の発現を減少させるための方法であって、前記哺乳動物内の標的ＫＲＡＳ遺伝子の発現を減少させるのに十分な量で、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡを哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項８８】
前記単離されたｄｓＲＮＡは、１日当たり前記哺乳動物のキログラム当たり１マイクログラム〜５ミリグラム、キログラム当たり１００マイクログラム〜０．５ミリグラム、キログラム当たり０．００１〜０．２５ミリグラム、キログラム当たり０．０１〜２０マイクログラム、キログラム当たり０．０１〜１０マイクログラム、キログラム当たり０．１０〜５マイクログラム、およびキログラム当たり０．１〜２．５マイクログラム、から成る群から選択される用量で投与される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記単離されたｄｓＲＮＡは、１ナノモル以下の細胞環境内有効濃度で、哺乳動物細胞においてインビトロでアッセイされる場合、標的ＫＲＡＳ遺伝子発現の減少において、前記標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９個のヌクレオチドを対象とする単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも高い効力を有する、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記投与ステップは、静脈注射、筋肉注射、腹腔内注射、点滴、皮下注射、経皮、エアロゾル、直腸、膣内、局所、経口、および吸入送達から成る群から選択される様式を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
細胞の増殖を選択的に阻害するための方法であって、前記細胞の増殖を阻害するのに十分な量の請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡと、細胞を接触させることを含む、方法。
【請求項９２】
前記細胞は、対象の腫瘍細胞である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記細胞は、インビトロの腫瘍細胞である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記細胞は、ヒト細胞である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９５】
前記ｄｓＲＮＡは、前記ｄｓＲＮＡが哺乳動物細胞にインビトロで導入される場合、少なくとも１０％、少なくとも５０％、および少なくとも８０〜９０％から成る群から選択される（％によって表現される）量、標的ＫＲＡＳ ＲＮＡレベルを減少させるのに有効な量で存在し、前記ｄｓＲＮＡは、１ナノモル以下の細胞環境内有効濃度で、哺乳動物細胞においてインビトロでアッセイされる場合、標的ＫＲＡＳ ＲＮＡレベルの減少において、前記標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９個のヌクレオチドを対象とする単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも高い効力を有する、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡを含む製剤。
【請求項９６】
前記有効量は、前記細胞の環境において、１ナノモル以下、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下、１０ピコモル以下、５ピコモル以下、２ピコモル以下、および１ピコモル以下から成る群から選択される、請求項９５に記載の製剤。
【請求項９７】
前記ｄｓＲＮＡは、前記ｄｓＲＮＡが哺乳動物対象の細胞に導入される場合、少なくとも１０％、少なくとも５０％、および少なくとも８０〜９０％から成る群から選択される（％によって表現される）量、標的ＲＮＡレベルを減少させるのに有効な量で存在し、前記ｄｓＲＮＡは、１ナノモル以下の細胞環境内有効濃度で、哺乳動物細胞においてインビトロでアッセイされる場合、標的ＫＲＡＳ ＲＮＡレベルの減少において、前記標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９個のヌクレオチドを対象とする単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも高い効力を有する、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡを含む製剤。
【請求項９８】
前記有効量は、１日当たり前記対象のキログラム当たり１マイクログラム〜５ミリグラム、キログラム当たり１００マイクログラム〜０．５ミリグラム、キログラム当たり０．００１〜０．２５ミリグラム、キログラム当たり０．０１〜２０マイクログラム、キログラム当たり０．０１〜１０マイクログラム、キログラム当たり０．１０〜５マイクログラム、およびキログラム当たり０．１〜２．５マイクログラム、から成る群から選択される用量である、請求項９７に記載の製剤。
【請求項９９】
請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡを含む、哺乳動物細胞。
【請求項１００】
請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項１０１】
請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡおよびその使用のための取扱説明書を含む、キット。
【請求項１０２】
第１のおよび第２の核酸鎖ならびに少なくとも２５個の塩基対の二重鎖領域を含む単離された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）から本質的に成るＫＲＡＳ阻害活性を有する組成物であって、前記ｄｓＲＮＡの前記第２の鎖は、その３’末端に１〜５の一本鎖ヌクレオチドを含み、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖は、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９個のヌクレオチドかつ多くとも３５個のヌクレオチドに沿って、配列番号１５９５〜２２９７および３７０４〜４４０６から成る群から選択される標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡ配列と十分に相補的であり、前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入される場合、ＫＲＡＳ標的遺伝子発現を減少させる、組成物。
【請求項１】
第１および第２の核酸鎖ならびに少なくとも２５個の塩基対の二重鎖領域を含む単離された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡの前記第２の鎖は、その３’末端に１〜５個の一本鎖ヌクレオチドを含み、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖は、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９個のヌクレオチドかつ多くとも３５個のヌクレオチドに沿って、配列番号１４１〜１８６から成る群から選択される標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡ配列と十分に相補的であり、前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入される場合、ＫＲＡＳ標的遺伝子発現を減少させる、単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項２】
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の最初のヌクレオチド（１位）から始めて、１、２、および／または３位が、修飾ヌクレオチドで置換される、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項３】
前記第１の鎖の前記３’末端および前記第２の鎖の前記５’末端は、平滑末端を形成する、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項４】
前記第１の鎖は、２５ヌクレオチド長であり、かつ前記第２の鎖は、２７ヌクレオチド長である、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項５】
前記第２の鎖は、配列番号１１〜５０および１３５〜１４０から成る群から選択される配列を含む、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項６】
前記第１の鎖は、配列番号５、８、および９１〜１３４から成る群から選択される配列を含む、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項７】
配列番号５／配列番号１４、配列番号８／配列番号４３、配列番号１３２／配列番号１３８、配列番号９１／配列番号１１、配列番号１２９／配列番号１３５、配列番号９２／配列番号１２、配列番号１３０／配列番号１３６、配列番号９３／配列番号１３、配列番号１３１／配列番号１３７、配列番号９４／配列番号１５、配列番号１３３／配列番号１３９、配列番号９５／配列番号１６、配列番号９６／配列番号１７、配列番号９７／配列番号１８、配列番号９８／配列番号１９、配列番号９９／配列番号２０、配列番号１００／配列番号２１、配列番号１０１／配列番号２２、配列番号１０２／配列番号２３、配列番号１０３／配列番号２４、配列番号１０４／配列番号２５、配列番号１０５／配列番号２６、配列番号１０６／配列番号２７、配列番号１０７／配列番号２８、配列番号１０８／配列番号２９、配列番号１０９／配列番号３０、配列番号１１０／配列番号３１、配列番号１１１／配列番号３２、配列番号１１２／配列番号３３、配列番号１１３／配列番号３４、配列番号１１４／配列番号３５、配列番号１１５／配列番号３６、配列番号１１６／配列番号３７、配列番号１１７／配列番号３８、配列番号１１８／配列番号３９、配列番号１１９／配列番号４０、配列番号１３４／配列番号１４０、配列番号１２０／配列番号４１、配列番号１２１／配列番号４２、配列番号１２２／配列番号４４、配列番号１２３／配列番号４５、配列番号１２４／配列番号４６、配列番号１２５／配列番号４７、配列番号１２６／配列番号４８、配列番号１２７／配列番号４９、および配列番号１２８／配列番号５０から成る群から選択される１対の第１の鎖／第２の鎖の配列を含む、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項８】
前記第１の鎖および前記第２の鎖のそれぞれは、少なくとも２６ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項９】
前記第１の鎖の前記３’末端の前記修飾ヌクレオチド残基は、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、および蛍光分子から成る群から選択される、請求項２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項１０】
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖の前記３’末端の１位は、デオキシリボヌクレオチドである、請求項２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項１１】
前記３’オーバーハングの前記ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項１２】
前記３’オーバーハングの前記修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである、請求項１１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項１３】
前記３’オーバーハングの全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項１４】
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖および第２のオリゴヌクレオチド鎖のうちの一方または両方が、５’リン酸塩を含む、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項１５】
前記修飾ヌクレオチド残基は、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、２−アミノ、および２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）から成る群から選択される、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項１６】
前記３’オーバーハングは、１〜３ヌクレオチド長である、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項１７】
前記３’オーバーハングは、１〜２ヌクレオチド長である、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項１８】
前記３’オーバーハングは、２ヌクレオチド長であり、前記３’オーバーハングの前記修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドである、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項１９】
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖は、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖の前記５’末端ヌクレオチド残基と相補的な前記第２の鎖の前記ヌクレオチド残基から始めて、交互の修飾および非修飾ヌクレオチド残基を含む、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項２０】
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖は、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端ヌクレオチド残基と相補的な前記第２の鎖のヌクレオチド残基から始めて、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の１８位から５’末端までの全ての位置において、非修飾ヌクレオチド残基を含む、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項２１】
前記第１の鎖および前記第２の鎖のそれぞれは、少なくとも２６かつ多くとも３０ヌクレオチド長を有する、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項２２】
前記ｄｓＲＮＡは、前記細胞においてダイサーによって内因的に切断される、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項２３】
前記標的遺伝子の発現を減少させるのに十分である前記単離された二本鎖核酸の量は、前記細胞の環境において、１ナノモル以下、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下、１０ピコモル以下、５ピコモル以下、２ピコモル以下、および１ピコモル以下から成る群から選択される、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項２４】
前記単離されたｄｓＲＮＡは、１ナノモル以下の細胞環境内有効濃度で、哺乳動物細胞においてインビトロでアッセイされる場合、標的ＫＲＡＳ遺伝子発現の減少において、前記標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９個のヌクレオチドを対象とする単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも高い効力を有する、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項２５】
前記単離されたｄｓＲＮＡは、前記細胞の環境において、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下、１０ピコモル以下、５ピコモル以下、２ピコモル以下、および１ピコモル以下から成る群から選択される細胞環境内有効濃度で、哺乳動物細胞においてインビトロでアッセイされる場合、標的ＫＲＡＳ遺伝子発現の減少において、前記標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９個のヌクレオチドを対象とする単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも高い効力を有する、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項２６】
前記単離されたｄｓＲＮＡは、前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入される場合、少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０〜９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％から成る群から選択される（％によって表現される）量、ＫＲＡＳ標的遺伝子発現を減少させるように、前記標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡ配列と十分に相補的である、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項２７】
前記第１の鎖および第２の鎖は、化学的リンカーによって結合される、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項２８】
前記第１の鎖の前記３’末端および前記第２の鎖の前記５’末端は、化学的リンカーによって結合される、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項２９】
前記第２の鎖または第１の鎖のヌクレオチドは、ダイサー切断の配向を導く修飾ヌクレオチドで置換される、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項３０】
デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシミジン（ｄ４Ｔ）、３’−アジド−３’−デオキシミジン（ＡＺＴ）および２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）の一リン酸ヌクレオチド、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチド、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−（３−アミノアリル）−ウラシル、２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−アミノリボヌクレオチド、２’−フルオロリボヌクレオチド、ならびにロックされた核酸から成る群から選択される修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項３１】
ホスホネート、ホスホロチオアート、およびホスホトリエステルから成る群から選択されるリン酸骨格修飾を含む、請求項１に記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項３２】
哺乳動物細胞において、標的ＫＲＡＳ遺伝子の発現を減少させるための方法であって、哺乳動物細胞を、前記細胞内の標的ＫＲＡＳ遺伝子の発現を減少させるのに十分な量の請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡと、インビトロで接触させることを含む、方法。
【請求項３３】
標的ＫＲＡＳ遺伝子発現は、少なくとも１０％、少なくとも５０％、および少なくとも８０〜９０％から成る群から選択される（％によって表現される）量減少する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＫＲＡＳ ｍＲＮＡレベルは、前記細胞を前記ｄｓＲＮＡと接触させてから少なくとも８日後、少なくとも９０％（％によって表現される）の量減少する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
ＫＲＡＳ ｍＲＮＡレベルは、前記細胞を前記ｄｓＲＮＡと接触させてから少なくとも１０日後、少なくとも７０％（％によって表現される）の量減少する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
哺乳動物において、標的ＫＲＡＳ遺伝子の発現を減少させるための方法であって、前記哺乳動物内の標的ＫＲＡＳ遺伝子の発現を減少させるのに十分な量で、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡを哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項３７】
前記単離されたｄｓＲＮＡは、１日当たり前記哺乳動物のキログラム当たり１マイクログラム〜５ミリグラム、キログラム当たり１００マイクログラム〜０．５ミリグラム、キログラム当たり０．００１〜０．２５ミリグラム、キログラム当たり０．０１〜２０マイクログラム、キログラム当たり０．０１〜１０マイクログラム、キログラム当たり０．１０〜５マイクログラム、およびキログラム当たり０．１〜２．５マイクログラム、から成る群から選択される用量で投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記単離されたｄｓＲＮＡは、１ナノモル以下の細胞環境内有効濃度で、哺乳動物細胞においてインビトロでアッセイされる場合、標的ＫＲＡＳ遺伝子発現の減少において、前記標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９個のヌクレオチドを対象とする単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも高い効力を有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記投与ステップは、静脈注射、筋肉注射、腹腔内注射、点滴、皮下注射、経皮、エアロゾル、直腸、膣内、局所、経口、および吸入送達から成る群から選択される様式を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
細胞の増殖を選択的に阻害するための方法であって、前記細胞の増殖を阻害するのに十分な量の請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡと、細胞を接触させることを含む、方法。
【請求項４１】
前記細胞は、対象の腫瘍細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞は、インビトロの腫瘍細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞は、ヒト細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記ｄｓＲＮＡは、前記ｄｓＲＮＡが哺乳動物細胞にインビトロで導入される場合、少なくとも１０％、少なくとも５０％、および少なくとも８０〜９０％から成る群から選択される（％によって表現される）量、標的ＫＲＡＳ ＲＮＡレベルを減少させるのに有効な量で存在し、前記ｄｓＲＮＡは、１ナノモル以下の細胞環境内有効濃度で、哺乳動物細胞においてインビトロでアッセイされる場合、標的ＫＲＡＳ ＲＮＡレベルの減少において、前記標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９個のヌクレオチドを対象とする単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも高い効力を有する、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡを含む製剤。
【請求項４５】
前記有効量は、前記細胞の環境において、１ナノモル以下、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下、１０ピコモル以下、５ピコモル以下、２ピコモル以下、および１ピコモル以下から成る群から選択される、請求項４４に記載の製剤。
【請求項４６】
前記ｄｓＲＮＡは、前記ｄｓＲＮＡが哺乳動物対象の細胞に導入される場合、少なくとも１０％、少なくとも５０％、および少なくとも８０〜９０％から成る群から選択される（％によって表現される）量、標的ＲＮＡレベルを減少させるのに有効な量で存在し、前記ｄｓＲＮＡは、１ナノモル以下の細胞環境内有効濃度で、哺乳動物細胞においてインビトロでアッセイされる場合、標的ＫＲＡＳ ＲＮＡレベルの減少において、前記標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９個のヌクレオチドを対象とする単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも高い効力を有する、請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡを含む製剤。
【請求項４７】
前記有効量は、１日当たり前記対象のキログラム当たり１マイクログラム〜５ミリグラム、キログラム当たり１００マイクログラム〜０．５ミリグラム、キログラム当たり０．００１〜０．２５ミリグラム、キログラム当たり０．０１〜２０マイクログラム、キログラム当たり０．０１〜１０マイクログラム、キログラム当たり０．１０〜５マイクログラム、およびキログラム当たり０．１〜２．５マイクログラム、から成る群から選択される用量である、請求項４６に記載の製剤。
【請求項４８】
請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡを含む、哺乳動物細胞。
【請求項４９】
請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項５０】
請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡおよびその使用のための取扱説明書を含む、キット。
【請求項５１】
第１のおよび第２の核酸鎖ならびに少なくとも２５個の塩基対の二重鎖領域を含む単離された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）から本質的に成るＫＲＡＳ阻害活性を有する組成物であって、前記ｄｓＲＮＡの前記第２の鎖は、その３’末端に１〜５個の一本鎖ヌクレオチドを含み、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖は、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９個のヌクレオチドかつ多くとも３５個のヌクレオチドに沿って、配列番号１４１〜１８６から成る群から選択される標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡ配列と十分に相補的であり、前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入される場合、ＫＲＡＳ標的遺伝子発現を減少させる、組成物。
【請求項５２】
第１のおよび第２の核酸鎖ならびに少なくとも２５個の塩基対の二重鎖領域を含む単離された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡの前記第２の鎖は、その３’末端に１〜５個の一本鎖ヌクレオチドを含み、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖は、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９個のヌクレオチドかつ多くとも３５個のヌクレオチドに沿って、配列番号１５９５〜２２９７および３７０４〜４４０６から成る群から選択される標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡ配列と十分に相補的であり、前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入される場合、ＫＲＡＳ標的遺伝子発現を減少させる、単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項５３】
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の最初のヌクレオチド（１位）から始めて、１、２、および／または３位が、修飾ヌクレオチドで置換される、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項５４】
前記第１の鎖の前記３’末端および前記第２の鎖の前記５’末端は、平滑末端を形成する、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項５５】
前記第１の鎖は、２５ヌクレオチド長であり、かつ前記第２の鎖は、２７ヌクレオチド長である、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項５６】
前記第２の鎖は、配列番号１８９〜８９１および２２９８〜３０００から成る群から選択される配列を含む、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項５７】
前記第１の鎖は、配列番号８９２〜１５９４および３００１〜３７０３から成る群から選択される配列を含む、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項５８】
表４〜５に示されるＤｓｉＲＮＡ剤から成る群から選択される１対の第１の鎖／第２の鎖の配列を含む、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項５９】
前記第１の鎖および前記第２の鎖のそれぞれは、少なくとも２６ヌクレオチドの長さを有する、請求項５２に記載の単離ｄｓＲＮＡ。
【請求項６０】
前記第１の鎖の前記３’末端の前記修飾ヌクレオチド残基は、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、および蛍光分子から成る群から選択される、請求項５３に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項６１】
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖の前記３’末端の１位は、デオキシリボヌクレオチドである、請求項５３に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項６２】
前記３’オーバーハングの前記ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含む、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項６３】
前記３’オーバーハングの前記修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである、請求項６２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項６４】
前記３’オーバーハングの全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項６５】
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖および第２のオリゴヌクレオチド鎖のうちの一方または両方が、５’リン酸塩を含む、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項６６】
前記修飾ヌクレオチド残基は、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、２−アミノ、および２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）から成る群から選択される、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項６７】
前記３’オーバーハングは、１〜３ヌクレオチド長である、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項６８】
前記３’オーバーハングは、１〜２ヌクレオチド長である、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項６９】
前記３’オーバーハングは、２ヌクレオチド長であり、前記３’オーバーハングの前記修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドである、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項７０】
前記第１のオリゴヌクレオチド鎖の前記５’末端ヌクレオチド残基と相補的な前記第２の鎖の前記ヌクレオチド残基から始めて、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が、交互の修飾および非修飾ヌクレオチド残基を含む、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項７１】
前記第２のオリゴヌクレオチド鎖が、前記第１のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端ヌクレオチド残基と相補的な前記第２の鎖のヌクレオチド残基から始めて、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖の１８位から５’末端までの全ての位置において、非修飾ヌクレオチド残基を含む、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項７２】
前記第１の鎖および前記第２の鎖のそれぞれは、少なくとも２６かつ多くとも３０ヌクレオチド長を有する、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項７３】
前記ｄｓＲＮＡは、前記細胞においてダイサーによって内因的に切断される、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項７４】
前記単離された二本鎖核酸の量は、前記細胞の環境において、１ナノモル以下、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下、１０ピコモル以下、５ピコモル以下、２ピコモル以下、および１ピコモル以下から成る群から選択される、前記標的遺伝子の発現を減少させるのに十分である、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項７５】
前記単離されたｄｓＲＮＡは、１ナノモル以下の細胞環境内有効濃度で、哺乳動物細胞においてインビトロでアッセイされる場合、標的ＫＲＡＳ遺伝子発現の減少において、前記標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９個のヌクレオチドを対象とする単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも高い効力を有する、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項７６】
前記単離されたｄｓＲＮＡは、前記細胞の環境において、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下、１０ピコモル以下、５ピコモル以下、２ピコモル以下、および１ピコモル以下から成る群から選択される細胞環境内有効濃度で、哺乳動物細胞においてインビトロでアッセイされる場合、標的ＫＲＡＳ遺伝子発現の減少において、前記標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９個のヌクレオチドを対象とする単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも高い効力を有する、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項７７】
前記単離されたｄｓＲＮＡは、前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入される場合、少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０〜９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％から成る群から選択される（％によって表現される）量、ＫＲＡＳ標的遺伝子発現を減少させるように、前記標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡ配列と十分に相補的である、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項７８】
前記第１の鎖および第２の鎖は、化学的リンカーによって結合される、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡ。
【請求項７９】
前記第１の鎖の前記３’末端および前記第２の鎖の前記５’末端は、化学的リンカーによって結合される、請求項５２に記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項８０】
前記第２の鎖または第１の鎖のヌクレオチドは、ダイサー切断の配向を導く修飾ヌクレオチドで置換される、請求項５２に記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項８１】
デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシミジン（ｄ４Ｔ）、３’−アジド−３’−デオキシミジン（ＡＺＴ）および２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）の一リン酸ヌクレオチド、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチド、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−（３−アミノアリル）−ウラシル、２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−アミノリボヌクレオチド、２’−フルオロリボヌクレオチド、ならびにロックされた核酸から成る群から選択される修飾ヌクレオチドを含む、請求項５２に記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項８２】
ホスホネート、ホスホロチオアート、およびホスホトリエステルから成る群から選択されるリン酸骨格修飾を含む、請求項５２に記載の単離された二本鎖核酸。
【請求項８３】
哺乳動物細胞において、標的ＫＲＡＳ遺伝子の発現を減少させるための方法であって、哺乳動物細胞を、前記細胞内の標的ＫＲＡＳ遺伝子の発現を減少させるのに十分な量の請求項１に記載の単離されたｄｓＲＮＡと、インビトロで接触させることを含む、方法。
【請求項８４】
標的ＫＲＡＳ遺伝子発現は、少なくとも１０％、少なくとも５０％、および少なくとも８０〜９０％から成る群から選択される（％によって表現される）量減少する、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
ＫＲＡＳ ｍＲＮＡレベルは、前記細胞を前記ｄｓＲＮＡと接触させてから少なくとも８日後、少なくとも９０％の（％によって表現される）量減少する、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
ＫＲＡＳ ｍＲＮＡレベルは、前記細胞を前記ｄｓＲＮＡと接触させてから少なくとも１０日後、少なくとも７０％の（％によって表現される）量減少する、請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
哺乳動物において、標的ＫＲＡＳ遺伝子の発現を減少させるための方法であって、前記哺乳動物内の標的ＫＲＡＳ遺伝子の発現を減少させるのに十分な量で、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡを哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項８８】
前記単離されたｄｓＲＮＡは、１日当たり前記哺乳動物のキログラム当たり１マイクログラム〜５ミリグラム、キログラム当たり１００マイクログラム〜０．５ミリグラム、キログラム当たり０．００１〜０．２５ミリグラム、キログラム当たり０．０１〜２０マイクログラム、キログラム当たり０．０１〜１０マイクログラム、キログラム当たり０．１０〜５マイクログラム、およびキログラム当たり０．１〜２．５マイクログラム、から成る群から選択される用量で投与される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記単離されたｄｓＲＮＡは、１ナノモル以下の細胞環境内有効濃度で、哺乳動物細胞においてインビトロでアッセイされる場合、標的ＫＲＡＳ遺伝子発現の減少において、前記標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９個のヌクレオチドを対象とする単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも高い効力を有する、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記投与ステップは、静脈注射、筋肉注射、腹腔内注射、点滴、皮下注射、経皮、エアロゾル、直腸、膣内、局所、経口、および吸入送達から成る群から選択される様式を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
細胞の増殖を選択的に阻害するための方法であって、前記細胞の増殖を阻害するのに十分な量の請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡと、細胞を接触させることを含む、方法。
【請求項９２】
前記細胞は、対象の腫瘍細胞である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記細胞は、インビトロの腫瘍細胞である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記細胞は、ヒト細胞である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９５】
前記ｄｓＲＮＡは、前記ｄｓＲＮＡが哺乳動物細胞にインビトロで導入される場合、少なくとも１０％、少なくとも５０％、および少なくとも８０〜９０％から成る群から選択される（％によって表現される）量、標的ＫＲＡＳ ＲＮＡレベルを減少させるのに有効な量で存在し、前記ｄｓＲＮＡは、１ナノモル以下の細胞環境内有効濃度で、哺乳動物細胞においてインビトロでアッセイされる場合、標的ＫＲＡＳ ＲＮＡレベルの減少において、前記標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９個のヌクレオチドを対象とする単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも高い効力を有する、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡを含む製剤。
【請求項９６】
前記有効量は、前記細胞の環境において、１ナノモル以下、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下、１０ピコモル以下、５ピコモル以下、２ピコモル以下、および１ピコモル以下から成る群から選択される、請求項９５に記載の製剤。
【請求項９７】
前記ｄｓＲＮＡは、前記ｄｓＲＮＡが哺乳動物対象の細胞に導入される場合、少なくとも１０％、少なくとも５０％、および少なくとも８０〜９０％から成る群から選択される（％によって表現される）量、標的ＲＮＡレベルを減少させるのに有効な量で存在し、前記ｄｓＲＮＡは、１ナノモル以下の細胞環境内有効濃度で、哺乳動物細胞においてインビトロでアッセイされる場合、標的ＫＲＡＳ ＲＮＡレベルの減少において、前記標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡの同一の少なくとも１９個のヌクレオチドを対象とする単離された２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡよりも高い効力を有する、請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡを含む製剤。
【請求項９８】
前記有効量は、１日当たり前記対象のキログラム当たり１マイクログラム〜５ミリグラム、キログラム当たり１００マイクログラム〜０．５ミリグラム、キログラム当たり０．００１〜０．２５ミリグラム、キログラム当たり０．０１〜２０マイクログラム、キログラム当たり０．０１〜１０マイクログラム、キログラム当たり０．１０〜５マイクログラム、およびキログラム当たり０．１〜２．５マイクログラム、から成る群から選択される用量である、請求項９７に記載の製剤。
【請求項９９】
請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡを含む、哺乳動物細胞。
【請求項１００】
請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項１０１】
請求項５２に記載の単離されたｄｓＲＮＡおよびその使用のための取扱説明書を含む、キット。
【請求項１０２】
第１のおよび第２の核酸鎖ならびに少なくとも２５個の塩基対の二重鎖領域を含む単離された二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）から本質的に成るＫＲＡＳ阻害活性を有する組成物であって、前記ｄｓＲＮＡの前記第２の鎖は、その３’末端に１〜５の一本鎖ヌクレオチドを含み、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖は、前記第２のオリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも１９個のヌクレオチドかつ多くとも３５個のヌクレオチドに沿って、配列番号１５９５〜２２９７および３７０４〜４４０６から成る群から選択される標的ＫＲＡＳ ｃＤＮＡ配列と十分に相補的であり、前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入される場合、ＫＲＡＳ標的遺伝子発現を減少させる、組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１２−５３１８８８（Ｐ２０１２−５３１８８８Ａ）
【公表日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０３７７３（Ｐ２０１２−５０３７７３）
【出願日】平成２２年４月５日（２０１０．４．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２９９９２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１５２０６
【国際公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【出願人】（５１１０７２７４７）ダイセルナ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (6)
【氏名又は名称原語表記】ＤＩＣＥＲＮＡ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月５日（２０１０．４．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２９９９２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１５２０６
【国際公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【出願人】（５１１０７２７４７）ダイセルナ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (6)
【氏名又は名称原語表記】ＤＩＣＥＲＮＡ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]