非滲出性抗菌ペプチドを含む医療デバイスおよびコーティング
抗菌ペプチドは、細菌の膜を標的にすることにより、抗菌コーティングを開発するための代わりのアプローチを可能にする。高い比活性は、ペプチドの抗菌末端が細菌と最大に接触するように、ペプチドを配向することにより達成される。一実施形態においては、ペプチドの一末端は、基質に共有結合で直接結合する。他の実施形態においては、ペプチドはカップリング剤又は係留分子を用いて基質に固定化される。非共有結合法には、ペプチドを基盤にコーティングするか、ビオチン／アビジン又はストレプトアビジン系のような非常に特異的な相互作用を用いて、基質にペプチドを生理的に固定化することが含まれる。組成物は、実質的に非滲出性、抗汚損性、及び非溶血性である。固定化ペプチドは、暴露により細菌、ウイルス、及び／又は真菌と相互作用し、取り込むために十分な柔軟性及び移動性を維持している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、固定化した生物活性のペプチドコーティング、特に静菌性かつ殺菌性特性を示すペプチドコーティングの分野にある。
【０００２】
（関連出願）
この出願は、２００６年２月１５日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／７７４，０５０、２００６年１１月１７日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１１／５６１，２６６および２００７年１月１８日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／８８５，５７８への優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
院内感染は、薬剤耐性菌の拡散のために、ますます費用がかかり処置するのが困難になっている。外科手術の無菌性を向上させるための努力にもかかわらず、感染は普通に残っている。これらの感染は、しばしば医療デバイスと関連している。中心静脈カテーテル等の皮膚浸透器具、並びに導尿カテーテルは、身体に侵入する細菌のための経路を提供し、埋め込まれた器具は、細菌が増殖することのできるのに好都合な表面を形成する。
【０００４】
細菌が、いったん医療デバイスにコロニーを形成すると、それらは扱いにくいバイオフィルムを形成する。バイオフィルムは、保護及び接着性マトリクスの排泄物によって特徴づけられる微生物の複雑な集合体である。バイオフィルムは、しばしば、表面接着、構造的不均質、遺伝的多様性、複雑な群間相互作用、及び高分子物質の細胞外マトリクスによっても特徴づけられる。バイオフィルムは、フィルムの内部において免疫システムから細菌を保護する。全身性の抗生物質は、バイオフィルムを浸透させる限られた能力のために、このような感染の治療には効果がない。これらの理由により、器具感染の治療は、しばしば、器具の除去、抗生物質の投与、それに続く新しい器具の挿入を必要とする。この処理は費用がかかり、有痛性であり、細菌が完全に除去されない場合、新しい器具が感染されてしまう場合がある。
【０００５】
種々の制御放出型抗菌コーティング及び器具、細菌感染が特に問題となる、特に、中心静脈カテーテル（ＣＶＣ）及び創傷包帯等の装置が開発されてきた。従来の抗菌コーティングは一般に、デバイス表面又はポリマーコーティングに取り込まれる抗菌剤及び金属イオンからなる。これらの薬剤の持続放出は、細菌のコロニー形成及び増殖の抑制に役立つ局所的な毒性濃度をもたらす。
【０００６】
現在、臨床的に有意に用いられる３種類の抗菌性ＣＶＣがある。ＡＲＲＯＷｇ＋ａｒｄ（登録商標）Ｂｌｕｅカテーテル（Ａｒｒｏｗ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）は、クロルヘキシジン（Ｋｕｙｙａｋａｎｏｎｄら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏ．Ｌｅｔ．，１００（１−３），２１１−２１５（１９９２））及びスルファジアジン銀を組み合わせて含有し、これの抗菌活性は、主に電子伝達鎖及びＤＮＡ複製の銀による破壊による（Ｓｉｌｖｅｒら、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３３（７），６２７−６３４（２００６）；Ｆｏｘら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ＆ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，５（６），５８２−５８８（１９７４））。これらのカテーテルは、臨床研究においてカテーテルのコロニー形成を４４％減少することが示されている（Ｖｅｅｎｓｔｒａら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ，２８１（３），２６１−２６７（１９９９））。しかし、クロルヘキシジンは、患者内で超過敏反応をもたらすことが知られており（Ｗｕら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２７（１ｌ）：２４５０−６７（２００６））、クロルヘキシジン及びスルファジアジン銀のいずれもが菌耐性をもたらすかもしれない（Ｂｒｏｏｋｓら、Ｉｎｆ．Ｃｏｎ．Ｈｏｓ．Ｅｐｉｄｅｍ．，２３（１１）：６９２−６９５（２００２）；Ｓｉｌｖｅｒら、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，３３（７），６２７−６３４（２００６））。
【０００７】
Ｃｏｏｋ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ’ｓ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（登録商標）のカテーテルのラインは、タンパク質合成を阻害する徐放性ミノサイクリン（Ｓｐｅｅｒｓら、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．Ｒｅｖ．，５（４）：３８７−３９９（１９９２））、及びＲＮＡポリメラーゼを阻害するリファンピシン（Ｋｉｍら、Ｓｙｓ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２８（５）：３９８−４０４（２００５））を用いる。これらのカテーテルは、臨床研究においてカテーテルのコロニー形成を６９％減少することが示されている（Ｒａａｄら、Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．，１２７（４）：２６７（１９９７））。しかし、ミノサイクリン及びリファンピシンが菌耐性をもたらすことも知られている（Ｋｉｍら、Ｓｙｓ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８（５）：３９８−４０４（２００５）；Ｓｐｅｅｒｓら、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．Ｒｅｖ．，５（４）：３８７−３９９（１９９２））。
【０００８】
Ｅｄｗａｒｄｓ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ’Ｖａｎｔｅｘ（登録商標）カテーテルは、銀、炭素、及び白金イオンを放出し、抗菌活性のほとんどは銀イオンに起因する。このカテーテルは、血流におけるアルブミンによる銀イオンのｉｎ ｖｉｖｏでの金属イオン封鎖において、ある程度は制限されるカテーテルコロニー形成を約３５％減少することが示されている（Ｒａｎｕｃｃｉら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．，３１（１）：５２−５９（２００３）；Ｃｏｒｒａｌ．，ら、Ｊ．Ｈｏｓ．Ｉｎｆｅｃ．，５５（３）：２１２−２１９（２００３））。銀イオンに対する菌耐性も報告されている（Ｓｉｌｖｅｒら、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３３（７），６２７−６３４（２００６））。
【０００９】
ＣｏｎｖａＴｅｃ’ｓ Ａｑｕａｃｅｌ（登録商標）のような、大部分が銀イオンの取り込みを基礎とする、多くの抗菌創傷包帯が開発されている。他の抗菌薬は、ヨウ素カデキソマー（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｎｅｐｈｅｗ’ｓ Ｉｏｄｏｆｌｅｘ（登録商標）及びＩｏｄｏｓｏｒｂ（登録商標））、ＣＨＧ（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ’ｓ Ｂｉｏｐａｔｃｈ（登録商標））、及びＰＨＭＢ（Ｋｅｎｄａｌｌ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ’ｓ Ｋｅｒｌｉｘ（登録商標）ＡＭＤ（登録商標））を含む。
【００１０】
これらの薬剤に対する興味深い代替物は、抗菌性ペプチド（ＡｍＰ）である。ＡｍＰは、膜の特性に基づいて哺乳動物細胞及び微生物を区別することができ、高速で非特異的な攻撃メカニズムを用いて微生物を死滅させる。膜の特性を変えるためには進化上の労力は大きく、攻撃は十分に早く細菌は生存し変異する機会がほとんどないので、このメカニズムは特定の酵素を標的とする抗生物質と比較して、薬剤耐性を誘導する可能性は劇的に小さい。天然のＡｍＰは、グラム陽性及び陰性細菌、真菌、ウイルス、及びさらには癌性細胞に対して活性を有している可能性がある（Ｊｅｎｓｓｅｎ，Ｈａｍｉｌｌら、Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．，１９（３）：４９１−５１１（２００６））。
【００１１】
デバイス表面から放出されるＡｍＰは、器具関連感染を予防する能力を有していることが示されている。Ｄａｃｒｏｎ移植片を、単にＡｍｐデルマセプチン（ｄｅｒｍａｓｅｐｔｉｎ）の溶液に浸し、ラットに移植し、細菌で攻撃することにより、デバイスのコロニー形成及び感染が減少する（Ｂａｌａｂａｎら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ＆ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４８：２５４４−２５５０（２００４））。デルマセプチンの放出は、メチシリン耐性及びバンコマイシン中間体−耐性黄色ブドウ球菌に対して有効であった。Ｍｉｇｅｎｉｘ及びＣａｄｅｎｃｅの抗菌性ペプチド薬剤候補ＣＰＩ−２２６は、医療デバイス感染に関連する細菌に対する臨床試験における徐放性クリーム製剤において、ｉｎ ｖｉｖｏ有効性を有する。
【００１２】
徐放性コーティングは、いくつかの固有の限界に悩まされている。デザインに関しては、徐放性コーティングには寿命の制限がある。ＣＶＣ及び透析カテーテルを含む多くのカテーテルの用途については、臨床医から保護の延長が望まれている。更に、徐放性抗生物質は、薬剤耐性の発生を促進し得る致死量以下の濃度の隣接する領域をもたらす。薬剤を血流に放出することにより、全身毒性に対する懸念が増加する。最後に、徐放性コーティングを生成するために必要な大量の薬剤のために、器具の構造的及び性能特性が影響されるかもしれない。
【００１３】
Ｋｅｅｌｅｒらによる特許文献１、及びＷｉｌｃｏｘ らによる特許文献２；及びＷｉｌｃｏｘらによる特許文献３は、抗菌性器具を提供するための種々の物質に対するカップリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）抗菌性ペプチドを開示している。しかし、カップリング法はランダムであり、表面上のペプチドの配向性を制御することはできない。カップリング法は、抗菌性ペプチド中に頻繁に見出される塩基性側鎖内のアミンを含む、ペプチド上のいずれかのアミンによって基質にペプチドを固定する。従って、ＡｍＰは多くの異なる部位で係留され得るか、１個の分子は多くの位置で係留され得る。これは、殺菌性であることから表面を防止しないが、ペプチドの配向性及び柔軟性が、ペプチドあたりの抗菌活性を最大にし、潜在的に費用及び毒性を低くするのに適しているように、ペプチドが材料の表面に位置するかのように効果は大きい。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／００６５０７２号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／０１２６４０９号明細書
【特許文献３】欧州特許第０ ９９０ ９２４号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、本発明の目的は、微生物の結合及び増殖を防止する効果を向上する、そこに結合した抗菌ペプチドを有する材料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
特定の配向性を有する、基質上に固定化された１種以上のタイプの抗菌ペプチドを含む組成物、及びその製造及び使用方法が本明細書に開示される。抗菌ペプチドは、細菌の膜を標的とするための抗菌コーティングを開発する他のアプローチを可能にする。細菌細胞の内部でその標的に到達するように放出されなければならない従来の多くの抗生物質とは異なり、ほとんどのＡｍＰは、有効であるために、細菌の外膜又は細胞壁とのみ接触しなければならない。本明細書に開示される方法を用いて固定化されるペプチドは、基質にランダムに結合する同一のペプチドと比べ、高い特異的抗菌活性を有する。
【００１６】
ペプチドは、共有結合又は非共有結合法（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｏｒ ｎｏｎ−ｃｏｖａｌｅｎｔ ｍａｔｈｏｄ）を用いて基質に固定化することができる。高い特異的抗菌活性は、ＡｍＰの重要部分と細菌の膜との効果的な相互作用を可能にするためにペプチドを配向することによって実現される。一実施形態において、ペプチドの一端は基質と直接共有結合している。他の実施形態において、ペプチドは、カップリング剤又は係留分子（ｔｅｔｈｅｒ）を用いて基質に固定化されている。適切なカップリング剤には、有機小分子、ポリマー、及びそれらの組み合わせが含まれる。他の実施形態においては、ペプチドは、基質に塗布されるポリマー薄膜上に固定化される。更なる他の実施形態においては、ペプチドは、基質に共有結合しているポリマーに固定化される。例えば、ペプチドは、基質に結合するヒドロゲルを形成する、ポリマーブラシ、デンドリマーポリマー、又は架橋ポリマーに固定化することができる。非共有結合法には、ビオチン／アビジン又はストレプトアビジン系等の非常に高い特異的相互作用を用いた、ペプチドの基質へのコーティング、ペプチドの基質への生理化学的固定が含まれる。タンパク質の結合を減少するために設計された化学を用いて、ペプチドは所望の密度及び配向で係留され得る。一実施形態において、係留分子は、タンパク質の結合を減少するための親水性基を含む。他の実施形態において、基質は親水性ポリマーで改変され、次いでＡｍＰを係留することができる。この親水性ポリマーは、基質に共有結合するか、基質の絶縁保護コーティング（ｃｏｎｆｏｒｍａｌ ｃｏａｔｉｎｇ）からなる。好ましい実施形態において、ペプチドは、少なくとも０．００１、０．０１、０．１、０．２５、０．５、１、１．５、２．５、５、１０、２５又は５０ｍｇペプチド／基質表面積ｃｍ２の濃度で基質に結合する。
【００１７】
ペプチドは、代用血管、矯正デバイス、透析アクセス移植片、及びカテーテル等の医療用移植片；手術道具、手術用衣服；及び包帯を含む、異なる種々のタイプの基質にコーティングすることができる。基質は、金属材料、セラミック、ポリマー、繊維、シリコン等の不活性物質、及びそれらの組み合わせからなる。本明細書に開示される組成物は、実質的に非滲出性、抗汚損性、及び非溶血性である。固定化ペプチドは、ペプチドに暴露する場合、細菌、ウイルス、及び／又は真菌と相互作用するのに十分な柔軟性及び移動性を保持している。基質にペプチドを固定すると、基質表面における作用部位で高いペプチド濃度を示す一方、ペプチドの毒性及び抗菌耐性の発生に関する懸念は低減する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
１．定義
本明細書で用いられる場合、「アミノ酸残基」及び「ペプチド残基」は、そのカルボキシル基（Ｃ−末端に結合する）のＯＨ、又はそのアミノ基（Ｎ−末端に結合する）の１個のプロトンを有しないアミノ酸又はペプチド分子を意味する。一般に、アミノ酸及び保護基を命名するために本明細書で用いられる略語は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅの推奨に基づく（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７２）１１：１７２６−１７３２）。ペプチド中のアミノ酸残基は、以下のように省略される：アラニンはＡｌａ又はＡであり；システインはＣｙｓ又はＣであり；アスパラギン酸はＡｓｐ又はＤであり；グルタミン酸はＧｌｕ又はＥであり；フェニルアラニンはＰｈｅ又はＦであり；グリシンはＧｌｙ又はＧであり；ヒスチジンはＨｉｓ又はＨであり；イソロイシンはＩｌｅ又はＩであり；リジンはＬｙｓ又はＫであり；ロイシンはＬｅｕ又はＬであり；メチオニンはＭｅｔ又はＭであり；アスパラギンはＡｓｎ又はＮであり；プロリンはＰｒｏ又はＰであり；グルタミンはＧｌｎ又はＱであり；アルギニンはＡｒｇ又はＲであり；セリンはＳｅｒ又はＳであり；スレオニンはＴｈｒ又はＴであり；バリンはＶａｌ又はＶであり；トリプトファンはＴｒｐ又はＷであり；チロシンはＴｙｒ又はＹである。ホルミルメチオニンは、ｆＭｅｔ又はＦｍと省略される。「残基」なる用語は、カルボキシル基のＯＨ部分、及びα−アミノ基の１個のプロトンを除去することによる対応するα−アミノ酸に由来する基を意味する。「アミノ酸側鎖」なる用語は、Ｋ．Ｄ．Ｋｏｐｐｌｅ，”Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ”，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９６６，ｐａｇｅｓ ２ ａｎｄ ３３に定義されるように、−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨ骨格を排除した、対応するα−アミノ酸の部分を意味し、このような一般的なアミノ酸の側鎖の具体例は、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３（メチオニンの側鎖）、−ＣＨ２（ＣＨ３）−ＣＨ２ＣＨ３（イソロイシンの側鎖）、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２（ロイシンの側鎖）、又は−Ｈ（グリシンの側鎖）である。
【００１９】
本明細書で用いられる場合、「非天然アミノ酸」は、天然に検出されない、あらゆるアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸には、あらゆるＤ−アミノ酸（後述する）、天然に検出されない側鎖を有するアミノ酸、ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）が含まれる。ペプチド模倣物の具体例には、β−ペプチド、γ−ペプチド、及びδ−ペプチド；ビピリジンセグメントを利用する骨格を有する化合物、疎溶媒性相互作用を利用する骨格を有する化合物、側鎖相互作用を利用する骨格を有する化合物、水素結合相互作用を利用する骨格を有する化合物、及び金属配位を利用する骨格を有する化合物のような、らせん又はシートコンフォメーションを採用し得る骨格を有するオリゴマーが含まれる。グリシンを除く、ヒト体内における全てのアミノ酸は、同じ分子の右巻き又は左巻きのいずれかのバージョンであり、これは、いくつかのアミノ酸において、カルボキシル基及びＲ−基の位置が切り替わることを意味する。天然のアミノ酸の大半は、分子の左巻きバージョン又はＬ型である。高等生物のタンパク質には、右巻きバージョン（Ｄ−型）は検出されないが、ある種の下等生物、例えば、細菌の細胞壁においては検出される。それらは、ストレプトマイシン、アクチノマイシン、バシトラシン、及びテトラサイクリン等のある種の抗生物質においても検出される。それらの抗生物質は、生存及び再生に必要なタンパク質の形成を妨害することによって、細菌を死滅させることができる。
【００２０】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「オリゴペプチド」は、一般に、約１０個より多く、好ましくは９個より多く１５０個未満、更に好ましくは１００個未満、最も好ましくは９〜５１個のアミノ酸を有するペプチド及びタンパク質を意味する。ポリペプチドは、「異種」である「外来性」であり得、すなわち、細菌細胞によって産生されるヒトポリペプチドのような、利用される宿主細胞に対して外来性であることを意味する。また、外来性は、細胞の外部から加えられ、内因性（細胞によって生産される）でない物質を意味する。ペプチドは、天然又は合成であろうと、ペプチド結合によって化学的に連結しているアミノ酸からなる有機化合物を包含する。ペプチド結合は、１個のアミノ酸のカルボキシル（酸素を有する炭素）と第二のアミノ酸のアミノ窒素の間の単一の共有結合を含む。約１０個未満の構成アミノ酸を有する小さいペプチドは、通常オリゴペプチドと呼ばれ、１０個より多いアミノ酸を有するペプチドはポリペプチドと呼ばれる。１０，０００ダルトンを超える分子量を有する化合物（５０〜１００アミノ酸）は通常タンパク質と呼ばれる。
【００２１】
本明細書で用いられる場合、「抗菌ペプチド」（ＡｍＰ）は、細菌、酵母、真菌、マイコプラズマ、ウイルス又はウイルス感染細胞、及び／又は原虫を含む微生物を死滅させる（殺菌）か、増殖を阻害（静菌）するオリゴペプチド、ポリペプチド、又はペプチド模倣物を意味する。例えば、ＡｍＰは抗癌活性を有することが報告されている。一般に、抗菌ペプチドは、親水性領域と電荷領域とが空間的に分離されているカチオン性分子である。具体的な抗菌ペプチドには、膜内でα−ヘリカル構造を形成する線状ペプチド、又は膜内のジスルフィド結合により場合により安定化されるβ−シート構造を形成するペプチドが含まれる。代表的な抗菌ペプチドには、カテリシジン、デフェンシン、デルミシジン、特にマガイニン（ｍａｇａｉｎｉｎ）２、プロテグリン（ｐｒｏｔｅｇｒｉｎ）、プロテグリン−１、メリチン、ｌｌ−３７、デルマセプチン０１、セクロピン、カエリン（ｃａｅｒｉｎ）、オビスピリン（ｏｖｉｓｐｉｒｉｎ）、及びアラメチシン（ａｌａｍｅｔｈｉｃｉｎ）が含まれるが、これらに限定されない。天然の抗菌ペプチドには、植物、ヒト、真菌、微生物及び昆虫を含む脊椎動物及び非脊椎動物由来のペプチドが含まれる。
【００２２】
本明細書で用いられる場合、「固定化」又は「固定する」は、基質に結合する抗菌ペプチドを意味する。ペプチドは、実質的に非滲出性であるように、共有結合又は非共有結合で基質に結合し得る。固定化ペプチドは、暴露による細菌、ウイルス、及び／又は真菌と相互作用する十分な柔軟性及び移動性を維持したままである。
【００２３】
本明細書で用いられる場合、「抗菌」は、細菌、酵母、真菌、マイコプラズマ、ウイルス又はウイルス感染細胞、癌性細胞及び／又は原虫を含む微生物を死滅させる（殺菌）か、増殖を阻害する（静菌）分子を意味する。特に、本明細書で用いられる場合に、「殺菌性」は、細菌、酵母、真菌、マイコプラズマ、ウイルス又はウイルス感染細胞、及び／又は原虫を含む微生物を死滅する分子を意味する。
【００２４】
本明細書で用いられる場合、「固定化抗菌」は、表面と接触する、細菌、酵母、真菌、マイコプラズマ、ウイルス又はウイルス感染細胞、及び／又は原虫を含む微生物を死滅させる（殺菌）か、増殖を阻害する（静菌）抗菌ペプチドが固定化された表面を意味する。
特に、本明細書で用いられる場合、「固定化殺菌活性」は、表面と接触する細菌、酵母、真菌、マイコプラズマ、ウイルス又はウイルス感染細胞、及び／又は原虫を含む、生存能力のある微生物の減少を意味する。細菌の標的に関して、殺菌活性は、固定化抗菌について、ＡＳＴＭ２１４９アッセイに基づく生存能力のある細菌の減少として定量することができ、以下のように、小量の試料に縮小することができる。Ｃａｔｉｏｎ Ａｄｊｕｓｔｅｄ Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈのような培地中での標的とする細菌の一晩の培養物を、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水で、ＯＤ６００と細胞密度との間の所定のキャリブレーションを用い、約１×１０５ｃｆｕ／ｍＬに希釈する。０．５ｃｍ２の固定化抗菌表面の試料を、０．７５ｍＬの細菌懸濁液に加える。試料を液体で覆い、固体表面が液体の間を回転するのが見えるように、液体を十分な混合量で３７℃にてインキュベートすべきである。１時間インキュベーションした後、細菌懸濁液の連続希釈液を寒天プレートに播種し、生存能力のある細胞濃度を定量するために一晩増殖させる。好ましくは、細菌数（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｕｎｔ）における少なくとも１の対数減少は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の細菌のコントロールと比較して固体の試料なしで生ずる。更に好ましくは、細菌数における少なくとも２の対数減少が生ずる。更に好ましくは、細菌数における少なくとも３の対数減少が生ずる。最も好ましくは、細菌数における少なくとも４の対数減少が生ずる。
【００２５】
本明細書で用いられる場合、「実質的に非滲出性」は、組成物がｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水の存在下、溶液抗菌特性を示すか、放出した材料に由来する宿主内での毒性反応を生成するのに十分な量の抗菌ペプチドを滲出しないことを意味する。放出された材料由来の活性は、前述する固定化抗菌アッセイを実行し、上澄みを除去し、残存する細菌を遠心分離することにより評価することができる。次いで、上清を１×１０５ｃｆｕ／ｍＬ懸濁物になるように細菌を接種し、３７℃で１時間保持し、希釈及び播種により生存能力のある細胞濃度を定量する。好ましくは、生存能力のある細胞における１０％、２０％、又は５０％の減少は、１時間、３時間、１日、３日、７日又は３０日の間に発生しない。
より好ましくは、組成物は、１時間、１日、３日、７日、又は３０日の間、血液、組織、及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ環境に、溶液抗菌特性を示すか、宿主内での毒性反応を生成するのに十分な量の抗菌ペプチドを放出しない。一実施形態において、組成物は、規定された時間内に、１０μｇ／ｃｍ２を超えるペプチド、好ましくは１μｇ／ｃｍ２を超えるペプチドを放出しない。
【００２６】
本明細書で用いられる場合、「接着」は、タンパク質、細胞、又は他の物質の表面への非共有結合的接着を意味する。接着した物質の量は、表面をＴｗｅｅｎ又はＳＤＳのような適切な再懸濁剤を用いて超音波処理及び／又は洗浄し、再懸濁した物質の量を定量することによって定量することができる
本明細書で用いられる場合、「実質的に細胞傷害性」は、組成物の表面と接触する哺乳動物細胞の代謝、増殖又は生存度を変化させる組成物を意味する。これは、抽出物試験、直接接触試験及び間接接触試験を含む、物質の細胞傷害性を評価するための３種の主要な試験を定義する国際標準化機構ＩＳＯ１０９９３−５により定量することができる。
【００２７】
本明細書で用いられる場合、「実質的に非溶血性の表面」は、以下のアッセイを適用した場合に、組成物が、ヒト赤血球の５０％、２０％、１０％、５％、又は最も好ましくは１％を溶解しないことを意味する。洗浄し、プールした１０％赤血球（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）を、１５０ｍＭ ＮａＣＬ及び１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０の溶血バッファーで０．２５％に希釈する。０．５ｃｍ２の抗菌試料を０．７５ｍＬの、０．２５％赤血球懸濁液と、３７℃で１時間インキュベートする。固体試料を除去し、細胞を６０００ｇでスピンダウンし、上清を除去し、ＯＤ４１４を分光光度計で測定する。全溶血は、１０％の洗浄しプールした赤血球を無菌ＤＩ水で０．２５％に希釈し、３７℃で１時間インキュベートすることにより定義され、０％溶血は、固体試料なしで、０．２５％赤血球の溶血バッファー中での懸濁液によって定義される。
【００２８】
本明細書で用いられる場合、「実質的に非汚損性（ｆｏｕｌｉｎｇ）」は、ポリウレタンのような基準ポリマーに対する付着量と比較し、血液タンパク質、結晶、組織及び／又は細菌を含むタンパク質の基質への付着量を減少することを意味する。好ましくは、デバイス表面は、ヒト血液の存在下で、実質的に非汚損性である。好ましくは、付着量は、基準ポリマーに対し、２０％、５０％、７５％、９０％、９５％、最も好ましくは９９％減少する。
【００２９】
本明細書で用いられる場合、「実質的に非毒性」は、実質的に非溶血性及び実質的に非細胞傷害性である表面を意味する。
【００３０】
本明細書で用いられる場合、「生体適合性」は、実質的に無毒であり、免疫原性のない表面を意味する。更に広くは、生体適合性は、特定の状態において適切な宿主反応を遂行する材料の能力である（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｆ．Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ａ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８７）。
従って、生体適合性は、体内組織が、どのくらい良好に材料と相互作用するか、この相互作用が、特定の移植目的及び部位について意図される予想にどのように適合するかについての全体的な状態を表す（Ｖｏｎ Ｒｅｃｕｍ，Ａ．Ｆ．；Ｊｅｎｋｉｎｓ，ＭＥ．；Ｖｏｎ Ｒｅｃｕｍ，Ｈ．Ａ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ．Ｉｎ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｉｍｐｌａｎｔ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｖｏｎ Ｒｅｃｕｍ，Ａ．Ｆ．，Ｅｄ．；Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，１９９９，ｐｐ．１−８）。それ故、生体適合性は、絶対的概念よりもむしろ相対的であり、材料の最終的用途に大いに影響される。
【００３１】
本明細書で用いられる場合、「密度」は、基質の表面積あたりに共有結合するペプチドの質量を意味する。
【００３２】
本明細書で用いられる場合、「効果的な表面濃度」は、所望の抗菌反応を実現するのに十分な固定化ペプチドの密度を意味する。
【００３３】
本明細書で用いられる場合、「配向性」は、暴露によって、細菌、ウイルス及び／又は真菌と相互作用を表わすペプチドの部分が、与えられたペプチドの全ての固定化分子について均一であるように、ペプチドが基質表面に固定化されることを意味する。更に、ペプチドが残基によって均一に連結するようなカップリング化学の選択によって、固定化されたペプチド中のアミノ酸残基が調節される。「均一に」は、ペプチドの７０％以上、好ましくは９０％以上、好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上が残基によって係留されることを意味する。理想的には、配向したペプチドは、単一のアミノ酸残基によって結合する。しかし、複数の結合残基は、結合の「配向性」に影響を及ぼさずにペプチドの同じ領域内に含まれ得ることは当業者に理解されるだろう。通常、ペプチドのＮ−末端は、最も高い活性のための標的細胞に対して示されるべきであるが、これはペプチドに依存して変化するかもしれない。
【００３４】
本明細書で用いられる場合、「基質」は、ペプチドが固定化される材料を意味する。ペプチドは基質に直接固定化されるか、カップリング剤を用いて基質に結合してもよい。また、基質は、薄膜、膜又はゲルでコーティングされていてもよく、ペプチドは、薄膜、膜又はゲル上に固定化される。
【００３５】
本明細書で用いられる場合、「システイン」は、アミノ酸システイン、又はその合成類似体を意味し、その類似体は遊離のスルフヒドリル基を含む。
【００３６】
本明細書で用いられる場合、「コーティング」は、一時的、半永久的又は永久的のいずれかの、層、表面処理、被膜又は表面を意味する。コーティングは、下層基質の化学的改変であってもよく、基質表面への新しい材料の追加であってもよい。それには、基質への厚みの追加、又は基質の表面化学組成の変化のいずれもが含まれる。コーティングは、気相、蒸気、液相、ペースト、半固体又は固体であってもよい。更に、コーティングは液体として適用され、そして硬いコーティングへ固化し得る。コーティングの具体例には、艶出し剤、表面洗浄剤、充填材、接着剤、仕上げ、塗料、ワックス、重合可能な組成物（フェノール樹脂、シリコーンポリマー、塩化ゴム、コールタール及びエポキシの組み合わせ、エポキシ樹脂、ポリアミド樹脂、ビニル樹脂、エラストマー、アクリレートポリマー、フルオロポリマー、ポリエステル及びポリウレタン、及びラテックスを含む）が含まれる。
【００３７】
本明細書で用いられる場合、「係留分子（ｔｅｔｈｅｒ）」又は「係留剤（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）」は、分子が最終的な化学組成物の一部として残存する材料においてペプチドを共有結合的に固定化するために用いられるあらゆる分子を意味する。
【００３８】
本明細書で用いられる場合、「カップリング剤」は、ペプチド、又はそれが結合する材料のいずれかにおける化学的部分を活性化し、ペプチド間で共有結合を形成し、結合の後に最終的な組成物中で材料が残存しない、あらゆる分子又は化学物質を意味する。
【００３９】
ＩＩ．組成物
ＡｍＰは、当該技術分野において公知の種々の共有結合及び非共有結合手段を用いて、基質に結合され、又は取り込まれるように適用することができる。
【００４０】
適切な共有結合手段には、基質表面へポリマーをグラフト重合又はコーティングし、ペプチドにカップリングするための反応性官能基を形成し、基質表面にペプチドを直接結合することが含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、ペプチドと基質との間のカップリング反応は、ペプチドが医療デバイスの表面で配向するように、抗菌ペプチド中の末端チオール基を必要とする。カップリングは、カップリング剤の使用、及び／又は連結剤の使用による直接反応により実施することができる。適切な非共有結合手段には、ビオチン／アビジン又はストレプトアビジン系のような、非常に特異的な相互作用を用いた、基質へのペプチドの生理化学的固定化が含まれるがこれらに限定されない。
【００４１】
Ａ．基質
ペプチドは、種々の異なる基質に塗布、吸収又はカップリングされる。適切な材料の具体例には、金属材料、セラミック、ポリマー、ファイバー、シリコン等の不活性材料、及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００４２】
適切な金属材料には、金属及びチタンをベースとする合金（ニチノール、ニッケルチタン合金、熱記憶合金材料）、ステンレス鋼、タンタル、ニッケル−クロム、又はＥＬＧＩＬＯＹ（登録商標）及びＰＨＹＮＯＸ（登録商標）のようなコバルトークロムーニッケル合金を含む特定のコバルト合金が含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
適切なセラミック材料には、酸化チタン、酸化ハフニウム、酸化イリジウム、酸化クロム、酸化アルミニウム、及び酸化ジルコニウム等の遷移元素の酸化物、炭化物又は窒化物が含まれるが、これらに限定されない。シリカのようなケイ素をベースとする材料も用いられる。
【００４４】
適切なポリマー材料には、スチレン及び置換スチレン、エチレン、プロピレン、ポリ（ウレタン）、アクリレート及びメタクリレート、アクリルアミド及びメタクリルアミド、ポリエステル、ポリシロキサン、ポリエーテル、ポリ（オルトエステル）、ポリ（カーボネート）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）、それらのコポリマー、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
基質は、フィルム、粒子（ナノ粒子、微小粒子、又はミリメートル径ビーズ）、ファイバー（創傷包帯、包帯、ガーゼ、テープ、パッド、織物及び不織布スポンジを含むスポンジ、特に歯科用又は眼科手術用にデザインされたスポンジ）、センサー、ペースメーカーリード、カテーテル、ステント、コンタクトレンズ、骨インプラント（人工股関節、ピン、リベット、プレート、骨セメント等）、又は組織再生又は細胞培養デバイス、又は身体内又は身体と接触して用いられる医療デバイスの形態、又は形態の一部であってもよい。
【００４６】
１．有効表面積
基質の化学組成に加え、ペプチド結合に利用できる表面積を最大にするために、基質表面のマイクロ及びナノ構造が重要である。金属及びセラミック基質について、表面積の増加は、粗面処理、例えば、プラズマエッチング等のランダムプロセスによって実現することができる。また、フォトリソグラフィーを用いた、制御されたナノパターニングによって表面を改変することができる。また、ポリマー基質は、金属及びセラミック基質と同様に粗面処理することができる。更に、ペプチド結合のために利用できるポリマー基質上の表面積は、ポリマー自身の形態を調節することによって増加することができる。このアプローチの具体例には、ポリマーブラシ、デンドリマーポリマー、自己組織化ブロックコポリマー、及び形状記憶ポリマーが含まれる。
【００４７】
Ｂ．ペプチド
基質に固定化された場合に抗菌特性を示すあらゆるペプチドを、本明細書に開示される組成物及び方法において用いることができる。固定化された場合、全てのペプチドが活性を有するわけではないため、固定化後に活性について確認することが必要である。固定化した場合に抗菌活性を示すペプチドを製造する方法及びシステムは、Ｓｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓらに対する米国特許出願第２００６／００３５２８１号に開示されている。例えば、パターンＱ．ＥＡＧ．Ｌ．Ｋ．Ｋ．（配列番号１）（「．」はワイルドカードであり、パターンの位置におけるあらゆるアミノ酸で十分である）は９０％超のセクロピン（昆虫で一般的なＡｍＰ）に存在する。抗菌活性を示すペプチドのライブラリーを作成するために、ＴＥＩＲＥＳＩＡＳ等の計算ツールを用いることができる。ペプチドは、好ましくは天然のタンパク質と限られた相同性を有するが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、及びＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓを含む数種の細菌に対する強い静菌活性を有している。ペプチドは、Ｆｍｏｃ化学のような通常の方法を用いて合成することができる。いったん製造されると、設計されたタンパク質及びペプチドは実験的に評価され、必要であれば、当業者に公知の従来の方法を用いて構造、機能及び安定性について試験される。適切なペプチドは、Ｗａｎｇ，Ｚ ａｎｄ Ｇ Ｗａｎｇ，ＡＰＤ：ｔｈｅ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，Ｖｏｌ．３２，Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ Ｄ５９０−Ｄ５９２に開示されており、セクロピン−メリチンハイブリッド（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬ−アミド化）（配列番号２）、セクロピンＰ１、テンポリンＡ、Ｄ２８、Ｄ５１、デルマセプチン、ＲＩＰ、及びそれらの組み合わせが含まれるが、それらに限定されない。
【００４８】
抗菌活性を示すペプチド模倣物を用いてもよい。本明細書で用いる場合、ペプチド模倣物は、ペプチド構造を模倣する分子を意味する。ペプチド模倣物は、両親媒性のような、親構造、ポリペプチドに類似する一般的特徴を有する。このようなペプチド模倣物質の例は、Ｍｏｏｒｅら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０１（１２），３８９３−４０１２（２００１）に開示されている。ペプチド模倣物質は、以下のカテゴリー、すなわち、α−ペプチド、β−ペプチド、γ−ペプチド、及びδ−ペプチドに分類することができる。これらのペプチドのコポリマーを用いることもできる。
【００４９】
α−ペプチドペプチド模倣物には、Ｎ，Ｎ’−結合オリゴ尿素、オリゴピロリノン、オキサゾリジン−２−オン、アザチド及びアザペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
β−ペプチドの具体例には、β−ペプチドフォルダマー（ｆｏｌｄａｍｅｒ）、α−アミノオキシ酸、イオウ含有β−ペプチドアナログ、及びヒドラジノペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００５１】
γ−ペプチドの具体例には、γ−ペプチドフォルダマー、オリゴ尿素、オリゴカルバメート、及びホスホジエステルが含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
δ−ペプチドの具体例には、ピラノースをベースとするカルボペプトイド及びフラノースをベースとするカルボペプトイドのような、アルケンをベースとするδ−アミノ酸及びペプトイドが含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
ペプチド模倣物の他のクラスには、らせん又はシートコンフォメーションを採用し得る骨格を有するオリゴマーが含まれる。このような化合物の具体例には、ビピリジンセグメントを利用する骨格を有する化合物、疎溶媒性相互作用を利用する骨格を有する化合物、側鎖相互作用を利用する骨格を有する化合物、水素結合相互作用を利用する骨格を有する化合物、及び金属配位を利用する骨格を有する化合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００５４】
ビピリジンセグメントを利用する骨格を含む化合物の具体例には、オリゴ（ピリジン−ピリミジン）、ヒドラザルリンカーを有するオリゴ（ピリジン−ピリミジン）及びピリジン−ピリダジンが含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
疎溶媒性相互作用を利用する骨格を含む化合物の具体例には、オリゴグアニジン、１，４，５，８−ナフタレン−テトラカルボキシルジイミド環及び１，５−ジアルコキシナフタレン環のようなエダマー（共有結合サブユニットの芳香族電子供与体−受容体相互作用のスタック（ｓｔａｃｋｉｎｇ）特性を利用する構造）、及び置換Ｎ−ベンジルフェニルピリジニウムシクロファンのようなシクロファンが含まれるが、これらに限定されない。
【００５６】
側鎖相互作用を利用する骨格を含む化合物の具体例には、キラルなｐ−フェニル−オキサゾリン側鎖を有するオリゴチオフェンのようなオリゴチオフェン、及びオリゴ（ｍ−フェニレンのエチレン）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
水素結合相互作用を利用する骨格を含む化合物の具体例には、オリゴ（アシル化２，２’−ビピリジン−３，３’−ジアミン）及びオリゴ（２，５−ビス［２−アミノフェニル］ピラジン）のような芳香族アミド骨格、シアヌレートによって鋳型を形成するジアミノピリジン骨格、イソフタル酸によって鋳型を形成するフェニレン−ピリジン−ピリミジンエチレン骨格が含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
金属配位を利用する骨格を含む化合物の具体例には、亜鉛ビリノン、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｐｄ（ＩＩ）、Ｃｒ（ＩＩＩ）、又はＹ（ＩＩＩ）と錯体形成したオリゴピリジン、金属配位したシアノ基を含むオリゴ（ｍ−フェニレンエチニレン）及びヘキサピリンが含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
一実施形態において、ペプチドは、抗菌ペプチドＤ２８（ＦＬＧＶＶＦＫＬＡＳＫＶＦＰＡＶＦＧＫＶ）（配列番号３）及び／又はＤ５１（ＦＬＦＲＶＡＳＫＶＦＰＡＬＩＧＫＦＫＫＫ）（配列番号４）である。他の実施形態において、ペプチドは、コーティングからゆっくりと放出されるか、バイオフィルム−阻害活性を有効にする方法で共有結合しているＲＮＡ−ＩＩＩ阻害ペプチド（ＲＩＰ）のような集団感知阻害剤である。更に他の実施形態において、ペプチドは、１種以上のＡｍＰ及び／又はＲＩＰの組み合わせである。
【００６０】
ペプチドは、後述するように、溶液、懸濁液又は固定化されて提供され得る。ペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を延ばし、細網内皮系（ＲＥＳ）による取り込みを阻害するために、例えば、市販されている試薬及び方法を用いたペグ化により化学的に改変してもよい。また、ペプチドは、１種以上のタンパク質、脂質、又は化合物とカップリングすることもできる。
【００６１】
基質とカップリングした場合、抗菌ペプチドは活性であるべきである。好ましくは、ペプチドの配向性及び連結の特性は、ペプチド配列及び密度についての抗菌活性を最大にするために設計される。ペプチドは、ペプチドの活性領域が、細菌、ウイルス及び／又は真菌と相互作用することができるように配向されるべきである。例えば、ペプチドは、暴露によって、ペプチドの活性末端が細菌、ウイルス、及び／又は真菌と相互作用することができるように配向するための特定の位置にシステイン残基が位置するように、設計することができる。
【００６２】
組成物は高活性であり、広い抗菌スペクトル活性を示し、実質的に非溶血性である。組成物は、好ましくは抗汚損性であり、すなわち、組成物は、抗菌ペプチドの効果を低下することのできるタンパク質の付着を阻害する。これは、基質にペプチドをカップリングするための抗汚損特性を有するカップリング剤又は連結剤の使用によって達成することができる。また、好ましくは、組成物は、表面が、将来の感染を治療するのに再使用可能であるように、殺傷時に基質から細菌を放出すべきである。
【００６３】
Ｃ．係留分子、リンカー及びスペーサー
係留分子、リンカー及びスペーサーは、基質へのペプチドの結合、及び／又は基質にコーティングされたポリマーフィルムへのペプチドの結合の両方に利用することができる。係留分子の組成は、基質、又は基質に共有結合した又はコーティングしたポリマーの表面化学に依存して変化し得る。表面と接触する細菌とのペプチドの相互作用を最適化し、表面に対する抗汚損特性を最大にするために、係留分子の長さと組成は変化し得る。また、生物学的活性を有するために表面に存在する場合、組成は、ペプチドが正しい配向性を保持するように選択されなければならない。好ましくは、係留分子は非滲出性表面を形成すべきである。特定の係留分子は、種々のカップリング法について以下に議論される。
【００６４】
Ｄ．親水性ポリマー
抗汚損表面の製造は、医療デバイス及び移植片等の医用材料の開発における重要な要素である。このようなコーティングは、移植片と生理液との相互作用を制限する。異なるアプローチは、表面に共有結合した親水性係留分子、親水性ポリマー又はヒドロゲルの使用を含む、非汚損特性を有する表面を形成するために適用し得る。
【００６５】
１．親水性の係留分子
一実施形態において、係留分子は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）等の親水性ポリマーを含む。図１は、ＰＥＧを通して基質表面に固定化されたペプチドを示す。ポリマー中の繰り返し単位の数は４〜１００、最も好ましくは４〜１６で変化し得る。ＰＥＧは、非汚損性表面を生成することを証明する（Ｍｉｃｈｅｌら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２００５，２１，１２３２７−１２３３２）。最適化された係留分子の長さ及び組成は、基質組成及び係留した特定のペプチドの両方の関数である。多腕のＰＥＧは、抗菌ペプチド固定化のための官能基の数を増加するために用いることができる。
他の実施形態において、係留分子は、デキストラン、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、デンプン、セルロース、イヌリン、アルギン酸塩、アガロース、キサンタンのような多糖類である。好ましい実施形態において、多糖類はデキストランである。デキストランの表面コーティングは、タンパク質及び細胞の接着を制限することができる。デキストラン単層が銀表面に対するＢＳＡの吸着を減少するのに非常に効果的であり、この効果がデキストランによる表面の被覆に依存し、単層の厚みには依存しないことが証明されている（Ｆｒａｚｉｅｒら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０００，２１，９５７−９６６）。更に、Ｏｅｓｔｅｒｂｅｒｇら（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．１９９５，２９，７４１−７４７）は、アミノ化ポリスチレン表面に結合したデキストランがフィブリノーゲンの接着を減少し、ＰＥＧよりも効果的であることを示した。タンパク質吸着が高分子層の厚みに非感受性のようである。デキストランは、抗菌ペプチドの固定化のために多くのヒドロキシル基を利用できるため、係留分子としてＰＥＧよりも好ましい。
【００６６】
２．別個の固定化親水性ポリマー
非汚損表面を生成するため、ペプチドに係留されていない親水性ポリマーを基質に固定化することができる。図２は、基質表面に共有結合したＰＥＧを示す。この場合においては、親水性ポリマーは係留されないが、非汚損剤として作用する。先のセクションに記載された親水性ポリマーはこの目的のために用いることができる。
【００６７】
３．ヒドロゲル
ヒドロゲルは、基質上において非汚損コーティングとして用いることができ、又は基質自身として用いることができる。図３は、基質にコーティングされたヒドロゲルに固定化されたＡｍＰを示す。好ましい実施形態において、抗菌ペプチドは、ヒドロゲルの表面に固定化することができる。ヒドロゲルは三次元であり、親水性であり、大量の水又は体液を吸収することができるポリマー性ネットワークである（Ｐｅｐｐａｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２０００，５０，２７−４６）。これらのネットワークはホモポリマー又はコポリマーからなり、絡み合い又は結晶のような化学的架橋又は物理的架橋の存在のために不溶性である。ヒドロゲルは、側基の性質に基づき、中性又はイオン性として分類することができる。更に、それらは、非晶質、半結晶性、水素結合構造、超分子構造及びハイドロコロイド凝集体であり得る（Ｐｅｐｐａｓ，Ｎ．Ａ．Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．Ｉｎ：Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｓｃｉｅｎｃｅ：ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ；Ｒａｔｎｅｒ，Ｂ．Ｄ．，Ｈｏｆｆｍａｎ，Ａ．Ｓ．，Ｓｃｈｏｅｎ，Ｆ．Ｊ．，Ｌｅｍｏｎｓ，Ｊ．Ｅ．，Ｅｄｓ；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６，ｐｐ．６０−６４；Ｐｅｐｐａｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２０００，５０，２７−４６）。ヒドロゲルは、合成又は天然のモノマー又はポリマーから製造することができる。
【００６８】
医療デバイスは、噴霧、浸漬及びはけ塗り等の種々の技術を用いてヒドロゲルでコーティングすることができる。少量のゲル溶液（例えば、マイクロリットルの範囲）が、１ｃｍ２の表面積を処理するために用いられる。単位面積あたりのゲル溶液の量、及び対応するコーティング溶液の濃度及び塗布速度は、あらゆる特定の用途について容易に決定することができる。
【００６９】
ヒドロゲルは、特に、ポリ（アクリル酸）及びその誘導体［例えば、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート（ｐＨＥＭＡ）］、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）及びそのコポリマー及びポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）等の合成ポリマーから製造することができる（Ｂｅｌｌ，ＣＬ．； Ｐｅｐｐａｓ，Ｎ．Ａ．Ａｄｖ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ，１９９５，１２２，１２５−１７５．；Ｐｅｐｐａｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２０００，５０，２７−４６；Ｌｅｅ，Ｋ．Ｙ．；Ｍｏｏｎｅｙ，Ｄ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００１，１０１，１８６９−１８７９．）。合成ポリマーから製造されたヒドロゲルは、生理的条件下で一般的に非分解性である。ヒドロゲルは、多糖類、タンパク質及びペプチドを含むが、これらに限定されない天然のポリマーからも製造することができる。これらのネットワークは、一般的に、化学又は酵素的手段によって生理的条件下で分解される。
【００７０】
一実施形態において、ヒドロゲルでは、関連するｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ条件下で非分解性である。安定なヒドロゲルコーティングは、中心静脈カテーテルコーティング、心臓弁、ペースメーカー及びステントコーティングを含む特定の用途において必要である。他の場合において、ヒドロゲルの分解は、組織工学構築物等において好ましいアプローチである。
好ましい実施形態において、ゲルはデキストランによって生成される。デキストランは、基本的に、数％のα−１，２、α−１，３、又はα−１，４−結合の側鎖を有するα−１，６−結合Ｄ−グルコピラノース残基からなる細菌の多糖類である。デキストランは、その生体適合性、低毒性、比較的低い費用、及び単純な改変のために生物医学的応用において広く用いられている。この多糖類は、血漿増量剤、末梢血流促進剤及び抗血栓溶解剤として５０年よりも長く臨床的に用いられてきた（Ｍｅｈｖａｒ，Ｒ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ ２０００，６９，１−２５）。更に、それは、主として血液循環における治療薬の寿命を延ばすために、薬剤及びタンパク質の送達のための高分子キャリアーとして用いられてきた。デキストランは、ゲルを製造するために、化学的又は酵素的手段を用いることによりビニル基で改変することができる（Ｆｅｒｒｅｉｒａら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２００２，２３，３９５７−３９６７）。
【００７１】
デキストランをベースとするヒドロゲルは、非汚損材料として考えることができる。
デキストランをベースとするヒドロゲルは、血管内皮、平滑筋細胞、及び線維芽細胞の付着を防止し（Ｍａｓｓｉａ，Ｓ．Ｐ．；Ｓｔａｒｋ，Ｊ．Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２００１，５６，３９０−３９９．Ｆｅｒｒｅｉｒａら、２００４，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．６８Ａ，５８４−５９６）、デキストラン表面はタンパク質の吸着を防止する（Ｏｅｓｔｅｒｂｅｒｇら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．１９９５，２９，７４１−７４７）。
【００７２】
Ｅ．ポリマー微細構造
前述のように、ＡｍＰの最大の可能な表面負荷は、基質表面上における微細構造の形成によって増加することができる。ヒドロゲルネットワークを含むポリマー基質について、この表面形態は、デンドリマー及びブラシコポリマーのような適切なポリマー構造デザインを通じて形成することができる。これの１つの具体例は、デンドリマーポリマーを係留した表面の成長である。アクリル酸メチル及びエチレンジアミンの反応を交互に実施することにより、表面に存在するアミンからポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーを成長させることができる（Ｎｇｕｙｅｎら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００６，２２，７８２５−７８３２）。効率的に加えられたデンドリマーのそれぞれの生成は、ペプチド付着に利用できる部位の数を２倍にする。更に、アミド化工程の後、合成が終了した時に、得られた材料は、ポリ（エチレングリコール）と同様、抗汚損ヒドロゲルとして振る舞うことのできるアミンが存在するポリマーである（Ｃｈａｍｐｍａｎら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００１，１７，１２２５−１２３３）。
【００７３】
ＡｍＰ表面負荷を増加するためにポリマー微細構造を調整することの他の具体例は、基質表面からのポリマーブラシの成長である。これらは基質の一端に係留し、基質から周囲の媒体に広がらないポリマー鎖である。このアプローチはペプチド付着のための多くの追加の部位を形成し、その数はブラシポリマーの分子量に依存する。１つのこのような系は、ポリ（アクリル酸メチル）（ＰＭＡ）のブラシ成長である。均一に中程度の分子量のＰＭＡの重合の後、材料を官能化することができ、直接的表面結合を通じて可能なＡｍＰの表面提示よりも５０〜１００倍のＡｍＰの表面提示を導く。アミド化ブラシの基質表面への共有結合の概略図を図４に示す。
【００７４】
Ｆ．他の活性剤
抗菌ペプチドに加え、タンパク質、又は低分子量の有機又は無機分子であってもよい１種以上の治療薬、予防薬又は診断薬を基質にカップリングしてもよい。一実施形態において、基質には、固定化生物活性ペプチドと関係なく放出される生理活性剤が含まれる。
【００７５】
例えば、基質上に、封入、瘢痕、及び／又は細胞増殖を阻害する薬剤を、抗菌ペプチドと一緒に固定化してもよい。生物活性分子の他の具体例には、細胞増殖抑制剤、細胞分裂停止又は細胞傷害性化学療法剤、抗菌剤、抗炎症剤、成長因子、及び細胞接着ペプチドが含まれる。
【００７６】
他の実施形態において、薬剤が基質からゆっくりと放出されるように、例えば、医療デバイスの移植又は挿入部位に、加水分解性の結合を用いて１種以上の薬剤が基質に係留される。
【００７７】
また、１種以上の薬剤は表面に非共有結合する。例えば、１種以上の薬剤は、ヒドロゲル材料中に取り込まれ、拡散、及び／又はヒドロゲル材料の分解によって放出される。
【００７８】
ＩＩ．抗菌ペプチドの固定化方法
標的細胞内へ拡散しなければならない従来の抗生物質と異なり、ＡｍＰは、基質に共有結合又は非共有結合で係留した時に抗菌活性を保持し得る。固定化した時、細菌と相互作用することができるＡｍＰの一部は、表面の抗菌活性に影響を及ぼし得る。これは、ペプチドの配向性が、ペプチドの比活性を高めるために重要である主な理由である。
【００７９】
後述する多数の方法が、種々の表面上のＡｍＰ係留のために必要な官能部分を生成するために用いられ得る。結合する基の密度は、結合するペプチドの密度に影響を及ぼす。分岐、分岐の長さ、分岐の化学的性質を変化し得る係留分子は、殺菌性を有する様式でＡｍＰが存在する場合に、タンパク質の付着を減少するか、ＡｍＰの負荷を増加させるために用いることができる。
【００８０】
結合密度に加え、ペプチドの配向性は、固定化ＡｍＰの生物活性において重要な因子である。配向したペプチドの結合は、多くの合成アプローチによって実現することができる。１つのアプローチは、ペプチド中に存在しない化学的部分を含むアミノ酸残基をペプチド中に取り込むことである。チオール基を含むシステインは一例である。他のシステイン残基がペプチド中に存在しない場合、この残基、及びその機能的部分の付加は、ペプチド配列中で化学的にユニークな部位を形成すると思われる。次いで、表面におけるペプチドの配向した固定化についての適切なカップリング化学により、この部位を利用することができる。約７〜約８．５のｐＨで、遊離のチオール基を脱プロトン化し、高いｐＨで脱プロトン化されるアミノ酸のアミン基と比べて強い求核試薬を形成する。従って、反応条件ｐＨを調節することにより、システイン残基のチオール基を、基質又は係留分子に選択的にカップリングすることができる。
【００８１】
この追加の残基は、最も好ましくは、ペプチドのＣ−末端又はＮ−末端のいずれかに含まれ、ペプチド配列のいずれかの部位にユニークな残基が存在する場合、配向した結合を達成することもできるであろうことに注目すべきである。結合の所望の部位において一緒に配置される同じ残基の複数のコピーは、このような単一の残基として、同一の「配向した結合」に影響を及ぼすことは当業者にも明らかである。ＡｍＰの配向する結合についての一つのアプローチには、ペプチドの表面への係留における選択的使用のための、ペプチドのＮ又はＣ−末端のいずれかの、ペプチド中に天然には存在しない反応部位を用いた官能化（例えば、エポキシド環）、及び／又は所望の結合の部位における保護を除く、所定の部分の全てのコピーの保護（Ｆｍｏｃ化学のような適切な保護基を用いた）、それに続く、結合のための未保護基の反応、及び脱保護が含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
Ａ．基質へのペプチドのカップリングのための共有結合手順
１．基質表面へのペプチドの直接結合
カップリング剤又は係留分子を用いない、ペプチドの基質へのカップリング
一実施形態において、ＡｍＰは、基質表面に直接カップリングされる。基質にＡｍＰをカップリングするために用いられる化学は、基質表面の化学組成に依存する。基質表面は当該技術分野で公知の種々の方法によって処理され、所望の官能基を導入することができる。表面改変は、プラズマ、コロナ放電、火炎処理、ＵＶ／オゾン、ＵＶ及オゾンのみが含まれるが、これらに限定されない気相技術、アミノ分解、加水分解、還元、塩化トシル及びそれに続く化学作用を用いたアルコール鎖末端の活性化、化学的イニシエーションによるビニル化合物のグラフト共重合、及びビニルモノマーの存在下におけるイオンビーム処理が含まれるが、これらに限定されない湿式化学により実現することができる。例えば、基質表面は、プラズマ、マイクロ波及び／又はコロナ源で処理され、ペプチドにおける官能基と反応することができる、ヒドロキシ、アミン、及び／又はカルボン酸基を基質表面に導入することができる。
【００８３】
抗菌ペプチドは、配向させる方法において、それらのチオール基を直接に基質に固定化することができる。これは、種々の方法によって実現することができる。最初に、抗菌ペプチド中のチオール基は、共役付加反応（マイケル型付加反応とも呼ばれる）によって、医療デバイスの表面に存在する、マレイミド（Ｓｃｈｅｌｔｅら、Ｂｉｏｃｏｎ．Ｃｈｅｍ．，１１，１１８−１２３（２０００））、ビニルスルホン（Ｍａｓｒｉら、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．，１９８８，７，４９−５４；Ｍｏｒｐｕｒｇｏら、Ｂｉｏｃｏｎ．Ｃｈｅｍ．，７，３６３−３６８（１９９６））、アクリルアミド（Ｒｏｍａｎｏｗｓｋａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，２４２，９０−１０１（１９９４））及びアクリレート（Ｌｕｔｏｌｆら、Ｂｉｏｃｏｎ．Ｃｈｅｍ．，１２，１０５１−１０５６（２００１））のような、基質上の不飽和基と直接反応することができる。この反応は、生理的温度及び生理的ｐＨ（ｐＨ７．４）で実施することができ、生物学的アミンに対して選択的であると思われる（Ｅｌｂｅｒｔら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２００１，７６，１１−２５；Ｌｕｔｏｌｆら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，４，７１３−７２２（２００３））。第二に、抗菌ペプチド中のチオール基は、基質表面のエポキシド官能基と反応することができる。チオール基はエポキシドと高い反応性を示す求核試薬であり、効率的なカップリングのためには７．５〜８．５の範囲のｐＨのバッファー系を必要とする。
【００８４】
他の実施形態において、抗菌ペプチドは、ペプチド中に存在するあらゆる官能基（例えば、アミン、カルボニル、カルボキシル、アルデヒド、アルコール）によってデバイス表面に共有結合し得る。例えば、抗菌ペプチドにおける、１個以上のアミン又はアルコール又はチオール基は、イソチオシアネート、アシルアジ化物、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、アルデヒド、エポキシド、無水物、ラクトン、又はデバイス表面に導入された他の官能基と直接反応し得る。ペプチドのアミン基と器具のアルデヒド基との間に形成されたシッフ塩基は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等の試薬により還元され、加水分解に安定なアミノ結合を形成することができる（Ｆｅｒｒｅｉｒａら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ２００３，２１，１８９−１９９）。また、抗菌ペプチドの遊離のアミノ又はヒドロキシル基は、エポキシド官能基を含む表面と結合する。エポキシド官能基とヒドロキシルとの反応は、高いｐＨ条件、通常は１１〜１２のｐＨ範囲が必要である。アミン求核試薬は、更に中程度のアルカリ性ｐＨ値で反応し、通常は少なくともｐＨ９のバッファー環境を必要とする。
【００８５】
カップリング剤によるペプチドの基質へのカップリング
抗菌ペプチドは、基質表面の基を活性化する試薬又は反応の使用により基質に直接カップリングすることができ、抗菌ペプチドは、カップリング剤の導入なしでペプチド又は基質の官能基をそれぞれ反応性にする。一般に、抗菌ペプチドの固定化は配向性でない。例えば、カルボジイミドは、カルボキシレートとアミンとの間のアミド結合、及びホスフェートとアミンとの間のホスホラミデート結合の形成を媒介する。カルボジイミドの具体例は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノ−エチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、及びＮ，Ｎ’−カルボジイミダゾール（ＣＤＩ）である。Ｎ−エチル−３−フェニルイソキサゾリウム−３’−スルホネート（ウッドワード試薬）は、カルボキシレートとアミンとの縮合によるアミド結合の形成を媒介する。また、ＣＤＩはアミノ基をヒドロキシル基にカップリングさせるために用いることができる。
【００８６】
一実施形態において、末端カルボキシル基を含む器具の表面は、ｐＨ５．０のバッファー中で１５〜３０分間、ＥＤＣにより活性化され、次いで、活性化された表面は、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中、室温で２〜３時間、ペプチドと反応する。
【００８７】
係留分子を用いたペプチドの基質へのカップリング
ペプチドの基質へのカップリングは、係留分子を用いて実施することもできる。係留分子は、表面アミン及びペプチド−スルフヒドリル基と反応する末端官能基を有する。この場合、抗菌ペプチドは、配向する方法で、表面に固定化される。これらの係留分子は、可変する数の原子を含んでいてもよい。係留分子の具体例には、Ｎ−スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ、３−及び７−原子スペーサー）、長鎖−ＳＰＤＰ（１２−原子スペーサー）、（スクシニミジルオキシカルボニル−α−メチル−２−（２−ピリジルジチオ）トルエン）（ＳＭＰＴ、８−原子スペーサー）、スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）（ＳＭＣＣ、１１−原子スペーサー）及びスルホスクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、（スルホ−ＳＭＣＣ、１１−原子スペーサー）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ、９−原子スペーサー）Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ、８−原子スペーサー）、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ、８−原子スペーサー）、スクシニミジル６−（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノエート（ＳＩＡＸ、９−原子スペーサー）、スクシニミジル６−（６−（（（４−ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ）ヘキサノエート（ＳＩＡＸＸ、１６−原子スペーサー）、及びｐ−ニトロフェニルヨードアセテート（ＮＰＩＡ、２−原子スペーサー）が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、異なる原子数の他のカップリング剤も用いられることを理解するだろう。好ましい実施形態において、スルホ−ＧＭＢＳのスクシンイミド基は基質表面のアミン基と反応する。次の工程において、スルホ−ＧＭＢＳの末端マレイミド基は、ペプチドのスルフヒドリル基と反応する。スルホ−ＧＭＢＳの構造を図５に示す。
【００８８】
更に、スペーサー分子は係留分子に取り込まれ、末端における反応性官能基間の距離を広げ得る。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をスルホ−ＧＭＢＳに取り込むことができる。ＰＥＧ等の親水性分子は、共有結合した時に表面の生物汚損（ｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ）を減少させることが証明されている。
【００８９】
特定の実施形態において、抗菌ペプチドの遊離のアミン基は、反応性ヒドロキシル基を含む表面に、配向性のない様式で結合する。具体例として、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）は、イミダゾールカルバメートを同時に形成して表面のヒドロキシル基を活性化することができる。この反応は加水分解によるＣＤＩの急速な分解のため、１％未満の水の非水性環境（例えば、アセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ））において実施しなければならない。最終的に、活性化された表面は、７〜１０のｐＨのバッファー中で可溶化されるアミン含有ペプチドと反応することができる（Ｆｅｒｒｅｉｒａら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ２００３，２１，１８９−１９９）。
【００９０】
他の実施形態において、抗菌ペプチドの遊離のアミン基は、反応性アミン基を含む表面と結合する。また、この化学を用いて、ペプチドの配向性における調節はされていない。ジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）（ＤＳＰ、８−原子スペーサー）、ジスクシニミジルスベレート（ＤＳＳ、８−原子スペーサー）、グルタルアルデヒド（４−原子スペーサー）、ビス［２−（スクシニミジルオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ、９−原子スペーサー）、及び当業者によって認識される他の物質等の係留分子を、この目的のために用いることができる。
【００９１】
他の実施形態において、係留分子は、基質及びペプチドにおける官能基と反応するそれぞれの末端において、同一の官能基を含んでいてもよい。ホモ二官能性の係留分子は、最初に水溶液（例えばｐＨ７．４のＰＢＳ）中でチオール表面と反応し、次いで、第二段階でペプチドは係留分子とカップリングする。ホモ二官能性スルフヒドリル−反応性係留分子の例には、１，４−ジ−［３’，２’−ピリジルジチオ）プロピオン−アミド］ブタン（ＤＰＤＰＢ、１６−原子スペーサー）、及びビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ、１４−原子スペーサー）が含まれるが、これらに限定されない。この特定の化学は、ペプチドの配向性の調節を可能にする。
【００９２】
活性のために用いることのできる係留分子の濃度の選択は、所定の用途のために選択された容量、因子及び基質の関数として変化し、当業者によって理解されるだろう。
【００９３】
ペプチドの固定化に続き、表面を水又はリン酸緩衝生理食塩水又は他のバッファーで洗浄し、未反応の抗菌ペプチド及び溶媒を除去し得る。バッファーは、共有結合で固定化されていない抗菌ペプチドの除去を促進するため、少量の界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標））を含んでいてもよい。ペプチドの除去は、ＨＰＬＣまたはペプチド及びタンパク質の定量に用いられる市販のキット（例えば、ＳｉｇｍａのＢＣＡキット）によって監視することができる。
【００９４】
２．基質へのポリマーのグラフト化
他の実施形態において、ポリマーは基質にグラフト化され、ＡｍＰがポリマーに共有結合によりカップリングされる。ポリマーは、Ａｍｐを基質にカップリングするために用いられる所望の官能基をベースにして選択される。ポリマーにおける適切な官能基の具体例には、アミン、カルボン酸、エポキシド、及びアルデヒドが含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態において、所望の官能基を含む反応性モノマーは、化学蒸着法法（ＣＶＤ）のような技術を用いて基質に重合することができる。
【００９５】
溶液中、又は基質表面からのポリマーの成長
ポリマーは、当該技術分野において公知の種々の技術を用いて基質にグラフト化することができる。例えば、ポリマーは溶液中で成長し、次いで、基質表面にカップリングすることができる。また、ポリマーは基質表面から成長することができる。ポリマーは、フリーラジカル重合、アニオン重合、カチオン重合、及び酵素的重合が含まれるが、これらに限定されない種々の重合技術を用いて、溶液中で、又は基質から成長することができる。基質から成長するポリマーは、デンドリマー合成を用いて製造することができる。フリーラジカル重合の具体例には、自発的なＵＶ重合；１型又は２型ＵＶ開始重合；ＡＩＢＮ等の熱開始剤を用いる熱開始重合；又はレドックス対（ｒｅｄｏｘ−ｐａｉｒ）開始重合が含まれる。基質表面から成長するポリマーの場合には、表面は、通常、重合に用いられるのと同一の部分（例えば、フリーラジカル重合についてのビニル基）で官能化される。
【００９６】
適切なポリマーには、ポリ（ラクトン）、ポリ（無水物）、ポリ（ウレタン）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（エーテル）、ポリ（エステル）、ポリ（ホスファジン）、ポリ（エーテルエステル）、ポリ（アミノ酸）、合成ポリ（アミノ酸）、ポリ（カーボネート）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）、ポリ多糖類、セルロースポリマー、ゼイン、改変ゼイン、カゼイン、ゼラチン、グルテン、血清アルブミン、コラーゲン、アクチン、フェトプロテイン、グロブリン、マクログロブリン、コヘシン、ラミニン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、オステオカルシン、オステオポンチン、オステオプロテゲリンのようなタンパク質、及びそれらの混合物及びコポリマーが含まれるが、これらに限定されない。
【００９７】
一実施形態において、Ｃにおいて単一の結合点を有する、システインを取り込んだセクロピン−メリチンハイブリッドペプチド（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＣ−ＮＨ２）（配列番号５）、ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＣ−アミド（配列番号５）が、基質にカップリングしたアミド化ポリマーブラシ上に固定化された。ポリマーブラシは、ビニル基を提示する基質の存在下、ブラシモノマー、アミノエチルメタクリレートを重合することによって製造された。ペプチドは、スルホ−ＧＭＢＳ化学を用いて固定化された。
【００９８】
また、ポリマーブラシは、カテーテルを製造するために通常に用いられるシリコーン又はポリウレタン等の材料に結合することができる。前述したように、ポリマーブラシの成長は、通常、基質上のビニル部分を必要とする。シリコーン基質表面にビニル基を導入するために、シリコーンを、純粋な酸素プラズマで処理し、次いでエタノールに浸漬し、事実上純粋なヒドロキシルである表面を形成することができる。ヒドロキシル化に次いで、表面を、気化した、トリクロロビニルシラン又はトリメトキシ−ビニルシランのようなビニルシランに暴露することができる。次いで、ビニル化された基質をブラシポリマーと結合するために用いることができる。ＣＯ２、Ｏ２、及びアンモニアを用いたプラズマ処理を用いた類似の方法で、ポリウレタン基質を処理することができる。得られたヒドロキシル及び／又はアミン基をアクリル化し、基質上にビニル部分を形成し、次いで、ポリマーブラシを係留することができる。通常、ポリマーブラシは、直接表面官能化により可能なものよりも、１０〜１００倍高い表面濃度で、アミン等の反応性官能基を有する。ポリマーブラシの向上した柔軟性も、生物汚損を減少するのに役立つ。
【００９９】
化学蒸着法
モノマーは、化学蒸着法等の技術を用いて基質上に重合化することができる。化学蒸着法（ＣＶＤ）は、気相から薄膜を、基質上に直接蒸着する方法である。１００ｎｍ未満の厚みを有するフィルムは、あらゆるサイズ、形状、組成及び複雑さの基質に適用することができる。プラズマ／マイクロ波ＣＶＤ、熱フィラメントＣＶＤ、開始ＣＶＤ、光開始ＣＶＤを用いてポリマーを蒸着することができる。一実施形態において、重合可能なモノマー及び遊離のラジカル開始剤を、熱フィラメントを含むＣＶＤ反応チャンバーに同時に供給し、調節された化学のポリマー薄膜を形成する。チャンバー内で、ラジカル開始剤は、抵抗加熱フィラメントによって活性化される。得られたラジカルは、基質表面に吸収されるモノマー分子と反応してポリマー薄膜を形成する。ＣＶＤは、高い高次構造を有する、全ての形状、及びほとんど全ての組成の基質をコーティングするために用いることができる。開始剤を活性化するのに必要なフィラメント温度は、モノマー種の損傷を回避し、得られるフィルム中の反応性官能基の保持を可能にするのに十分なほど温和である。更に、基質温度は、フィルム特性、並びに広い範囲の基質への蒸着の更なる調整を独立して調節することができる。ティシュペーパーのようなデリケートな基質をコーティングするのに非常に穏和な基質条件（例えば、基質を室温に維持して）でＣＶＤコーティングを蒸着することができる。重合可能なモノマーは、ポリマーをペプチドにカップリングするのに用いられる所望の官能基に基づいて選択される。
【０１００】
コーティングされた基質は、シリコンウェハ等の基質をＣＶＤ反応器中に配置することにより製造される。ＧＭＡ等の官能化されたモノマー、及びｔｅｒｔ−アミルパーオキシド等の遊離のラジカル開始剤を反応器中に導入する。官能化されたモノマー及び開始剤の流速、並びにフィラメントの温度及び基質の温度は、薄膜の所望の厚みを実現するために独立して調節することができる。モノマーの流れは、一般に１〜５０ｓｃｃｍであり、初期の流れは、モノマーに対して１：１〜１：２０である。均一な蒸着を確実にするために、蒸着チャンバーを出る前に１０％以下のモノマーが反応するように、反応器に対する全ての流れを調節すべきである。開始剤は、１８０〜６５０℃の温度でフィラメントによって分解される。５〜２００Ｗの電力で、プラズマ又はパルス状プラズマによって開始することができる。１〜２００ｎｍ／分のフィルム蒸着が証明されるが、通常、速度は５〜５０ｎｍ／分である。これら、及び他のモノマーのＣＶＤ蒸着のために用いることのできる開始種の他の具体例には、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド、アゾ−ｔ−ブタン、及び、真空反応器中で＞０．１ｓｃｃｍの流速を確立することのできるような蒸気圧を有する他のアゾ又はペルオキシド化合物が含まれるが、これらに限定されない。蒸着後、蒸着フィルムの化学組成は、ＩＲ分光法を用いて証明することができる。係留されるＡｍＰの最終的な密度は、モノマー上の官能基の表面密度を変化させることによって調節することができる。例えば、エポキシ官能基を含まないスチレンはＧＭＡで漸増され、結合部位で所望の密度を有するフィルムを製造することができる。
【０１０１】
適切な官能化モノマーには、反応性エポキシド基、アミノエチルメタクリレート、及びエチレンイミンを含むグリシジルメタクリレート（「ＧＭＡ」）が含まれるが、これに限定されない。
【０１０２】
ペプチドの結合
感受性のある基質を損傷しない条件下における、ＣＶＤコーティングした表面へのペプチドの係留方法は、Ｍｕｒｔｈｙら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２０，４７７４−４７７６（２００４）に開示されている。
【０１０３】
ポリマーフィルムの蒸着に続き、ペプチドの結合のために、ポリマー上の官能基を活性化する。例えば、密封したガラス瓶中、エタノール中、６０℃で５時間、ｐＧＭＡ上のエポキシド基をヘキサメチレンジアミンと反応させ、遊離のアミンを生成することができる。遊離のアミンをＡＭＰ上のカルボン酸基と反応させ、ＡＭＰを基質に固定することができる。一実施形態において、ＡＭＰのカルボン酸基を基質の遊離のアミンと結合させるために、市販のグルタルアルデヒドキット（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）が用いられる。係留したＡＭＰの柔軟性は、共有結合した係留分子の長さを変えることによって最適化することができる。グルタルアルデヒド係留分子の場合においては、鎖は１２炭素原子長である（遊離のアミン及びカルボキシル基を含む）。更なる柔軟性は、例えば、機能的配列及びグルタミン酸係留基の間のペプチドの係留末端へのグリシン残基の付加により、供給することができる。所望の柔軟性を達成するために、０、４、８及び１２アミノ酸長のグリシンバッファーを加えることができる。ペプチドの表面密度は、安定な蛍光色素でペプチドを標識し、蛍光顕微鏡を用いて表面を評価することによりマッピングすることができる。
【０１０４】
ペプチドは、基質表面にペプチドを直接カップリングするための前述した、同一の化学を用いて、溶液中で成長したポリマーにカップリングするか、基質にカップリングし、又は基質表面から成長させることができる。
【０１０５】
Ｂ．ペプチドを基質にカップリングするための生理化学的方法
抗菌ペプチドは、基質又はデバイスに物理的に結合することができる。ペプチドを基質に固定化するための適切な生理化学的方法には、ビオチン／アビジン又はストレプトアビジン系のような非常に特異的な相互作用が含まれる。
【０１０６】
１．ビオチン／アビジン又はストレプトアビジン
ビオチン、及びその誘導体には、ＮＨＳ−ビオチン、ｓｕｌｆ−ＮＨＳ−ビオチン、１−ビオチンアミド−４−［４’−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキサミド］ブタン（ビオチン−ＢＭＣＣ）、Ｎ−ヨードアセチル−Ｎ−ビオチニルヘキシレンジアミン、シス−テトラヒドロ−２−オキソチエノ［３，４−ｄ］−イミダゾリン−４−吉草酸ヒドラジドが含まれるがこれらに限定されず、ペプチド中に存在するアミン（Ｈｏｆｍａｎｎら、ＰＮＡＳ１９７７，７４，２６９７−２７００；Ｇｒｅｔｃｈら、ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ．１９８７，１６３，２７０−２７７）、スルフヒドリル（Ｓｕｔｏｈら、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９８４，１７８，３２３−３３９）、カルボニル又はカルボキシル基（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９８４，８，２７３−２７７；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８６，４６，６４１−６４８）を通して抗菌ペプチドに共有結合的に取り込まれ得る。抗菌ペプチドのビオチン化は、デバイス表面で固定化された場合にその配向性を支持する。タンパク質アビジン及びストレプトアビジンとのビオチンの相互作用は、公知の非共有結合親和性の中で最も強い（Ｋａ＝１０１５Ｍ−１）。
【０１０７】
２．ポリヒスチジン−ニッケルキレートカップリング
安定した複合体は、三座のＮｉ２＋又はＮｉ２＋ニトリロ三酢酸が含まれるが、これらに限定されないキレート化ニッケルカチオンとのポリヒスチジンタグの反応によって形成することができる。一実施形態において、マトリクスは、三座のＮｉ２＋又はニトリロ三酢酸誘導体化生体分子との複合体を形成することができるポリヒスチジンタグリガンドと誘導体化することができる。
【０１０８】
３．サリチルヒドロキサム酸
サリチルヒドロキサム酸部分と結合し、それに続くペンダントフェニルボロン酸基を有する１種以上のペプチドとの結合／錯体形成するための基質の改変のために適した試薬は、以下に示す一般式：
【０１０９】
【化１】
（式中、Ｒ４はサリチルヒドロキサム酸分子とマトリクス材料との反応に適した、反応性の求電子性又は求核性部分であるか、又はレドックス法、例えば、ジスルフィド結合の形成において反応することのできる部分である）を有する。Ｒ２はＨ、アルキル、又はメチレン、又は電気陰性置換基を有するエチレン部分である。Ｒ１及びＲ３は、それぞれ独立してＨ又はヒドロキシであり、Ｚは、場合により長さにおいて０〜６炭素と同等である飽和又は不飽和鎖を含むスペーサー分子であり、少なくとも１個の中間体アミン又はジスルフィド部分を有する、長さにおいて６〜１８炭素と同等である非分岐又は分岐、飽和又は不飽和鎖、又は長さにおいて３〜１２炭素と同等であるポリエチレングリコール鎖であってもよい。一実施形態において、サリチルヒドロキサム酸リガンドは、因子サリチルヒドロキシルアミンヒドラジドを通して、表面に結合する。他の実施形態において、サリチルヒドロキサム酸リガンドは、サリチルヒドロキシルアミンＮ−ヒドロキシスクシンイミド（「ＮＨＳ」）エステル又はカルボン酸を有する表面と結合し得る。
【０１１０】
４．フェニルボロン酸
多くのものが当該技術分野において公知であるフェニルボロン酸試薬は、抗菌ペプチドに結合し、以下に示すような１種以上のペンダントフェニルボロン酸部分を有する複合体を提供することができる。
【０１１１】
【化２】
試薬には、長さにおいて６個以下の炭素と同等である脂肪族鎖、少なくともひとつの中間体アミド又はジスルフィドを有する、長さにおいて６〜１８個の炭素と同等である非分岐脂肪族鎖、又は長さにおいて３〜１２個の炭素と同等であるポリエチレンオキシド又はポリエチレングリコールのようなスペーサー分子を含む置換基が含まれる。ポリエチレンオキシド及びポリエチレングリコール等のスペーサー分子の使用は、水溶液中でのペプチドの高い移動度を可能にし得る。また、ペプチドには、スペーサー分子の不存在下で、ペプチドをフェニルボロン酸種に結合するために用いられる反応部位の一部が含まれる。フェニルボロン酸種は、芳香族環の周囲の種々の位置に結合している１、２又は３個のボロン酸基を含むことができる。
【０１１２】
ＩＩＩ．使用方法
前述した材料は、コーティングとして抗菌ペプチドが適用された医療デバイスの形態であってもよい。適切な器具には、手術用、医療用又は歯科用器具、眼科用器具、創傷治療器具（絆創膏、縫合糸、細胞足場、骨セメント、粒子）、歯列矯正器具、インプラント、足場、縫合材料、弁、ペースメーカー、ステント、カテーテル、ロッド、インプラント、骨折固定器具、ポンプ、管、配線、電極、避妊用具、婦人衛生製品、内視鏡、創傷包帯、及び組織、特にヒトの組織と接触する他の器具が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１３】
Ａ．繊維状及び粒子状材料
一実施形態において、ペプチドは繊維状材料に適用され、又は繊維状材料に取り込まれるか、繊維状材料にコーティングされる。それらには、創傷被覆剤、包帯、ガーゼ、テープ、パッド、織布及び不織布スポンジを含むスポンジ、特に歯科又は眼科手術用に設計されたもの（米国特許第４，０９８，７２８号；第４，２１１，２２７号；第４，６３６，２０８号；第５，１８０，３７５号；及び第６，７１１，８７９号を参照されたい）、外科用ドレープ、使い捨ておむつ、テープ、絆創膏、婦人用製品、縫合糸として用いられる紙又はポリマー材料、及び他の繊維状材料が含まれる。固定化されたペプチドの利点の１つは、適用時に抗菌性であるだけでなく、処理後の材料による汚染を最小化するのに役立つことがあげられる。
【０１１４】
繊維状材料は、細胞培養及び組織工学機器においても有用である。細菌及び真菌の汚染は真核細胞培養において主な問題であり、これは、培地の汚染を最小化又は除去するのに安全かつ有効な方法を提供する。
【０１１５】
ペプチドは、細胞培養及び薬物送達を含む種々の用途に用いるナノ粒子、微小粒子及びミリメートルビーズを含む粒子にも容易に結合する。
【０１１６】
Ｂ．移植及び挿入される材料
ペプチドは、また、ポリマー、金属又はセラミック基質、例えば、カテーテル、管、心臓弁、薬物ポンプ、整形外科用インプラント、及び患者に挿入、移植又は適用される他の器具にも、イオン結合、共有結合又は水素結合によって直接カップリングするか取り込まれ得る。
【０１１７】
代表的な移植可能な材料には、心臓弁、ペースメーカー、ステント、中心静脈カテーテル（ＣＶＣ）及び尿道カテーテルを含むカテーテル、補助人工心臓、骨修復器具、スクリュー、プレート、リベット、ロッド、骨セメント、及び人工関節が含まれる。
【０１１８】
研究は、ポリウレタン及びシリコーン、ＣＶＣ等の器具に用いられる主な材料へのペプチドの直接的カップリングにより高い負荷が実現することを証明する。
【０１１９】
Ｃ．コーティング、塗布、浸漬、噴霧
ペプチドは、白カビ、細菌の汚染を防止するための塗料、及び他のコーティング及びフィルター、及び抗菌活性を付与するのが望ましい他の用途に加えることもできる。
【実施例】
【０１２０】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することにより更に理解されるだろう。
【０１２１】
（実施例１）固定化抗菌ペプチドの抗菌活性
材料及び方法
抗菌ペプチドの合成
抗菌ペプチドである、システインを取り込んだセクロピン−メリチンハイブリッドペプチド（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＣ−ＮＨ２）（配列番号５）を、Ｉｎｔａｖｉｓ Ｍｕｌｔｉｐｅｐ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｉｎｔａｖｉｓ ＬＬＣから入手できる）を用いたフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学を用いて合成した。
【０１２２】
ＮＨ２−微小粒子（ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ−ＮＨ２樹脂、Ａｎａｓｐｅｃ．カタログ番号２２７９５）を、係留分子Ｎ−［γ−マレイミドブチリル−オキシ］スクシンイミドエステルを通じた、システインを取り込んだセクロピン−メリチンハイブリッドペプチド（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＣ−ＮＨ２）（配列番号５）を固定化するための基質として用いた。遊離のアミノ基の数は、ニンヒドリンアッセイを用いて定量した。約６．７ｍｇの微粒子を、１２．５ｍｇのニンヒドリン（Ｓｉｇｍａ）を含むｐＨ５．０の１Ｍ酢酸バッファー１ｍＬに懸濁させた。懸濁液を沸騰した水中に１５分間維持した。１５分後、試料を取り除き、１５ｍＬのエタノール／水混合物（１／１、ｖ／ｖ）を加えた。反応混合物を、光から離し１時間かけて室温まで冷却した。ニンヒドリンは遊離のアミノ基と反応し、青色の水溶性化合物を生成した。１時間冷却した後に、上清の吸光度を５７０ｎｍで測定することによって、分光光度的にビーズ中の遊離のアミノ基の量を測定した。グリシンを基準物質として用いた。
【０１２３】
ペプチドの係留分子−官能化ビーズへのカップリング
３．４ｍｇのスルホ−ＧＭＢＳを、ｐＨ７．４のＰＢＳ０．５ｍＬ中に懸濁した１５ｍｇのＮＨ２−微粒子と、室温で２時間、軽く撹拌しながら（ｖｏｒｔｅｘ、１００ｒｐｍ）反応させた。２時間後、ビーズを、２５００ｒｐｍで２分間遠心分離し、１ｍＬのＰＢＳバッファーで５回洗浄した。最後の洗浄において、ビーズを０．５ｍＬのＰＢＳバッファーに再懸濁し、５ｍｇのシステインを取り込んだセクロピン−メリチンハイブリッドペプチド（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＣ−ＮＨ２）（配列番号５）と、室温で一晩、軽く撹拌しながら（１００ｒｐｍ）反応させた。ビーズを、再度０．５ｍＬのＰＢＳバッファーで５回洗浄し、１ｍＬのＰＢＳで再懸濁し、４℃に一晩保持した。翌朝、上清を除去し、ビーズを１ｍＬのＰＢＳバッファーで５回洗浄した。ビーズを１ｍＬに再懸濁し、４℃に保存した。ビーズ中に固定化されたペプチドを、セクロピン−メリチンを標準物質として用いて、ＢＣＡアッセイ（Ｓｉｇｍａ）により定量した。ビーズに結合したペプチドの量を、ビーズに接触した最初の総ペプチド量と、何回かの洗浄において回収されたペプチドの量との差異から間接的に決定した。ビーズに結合したペプチドの濃度は、１５ｍｇのビーズあたり約０．９１ｍｇであり、ビーズの表面積７２．７ｍｍ２あたり０．０６０ｍｇに相当し、ビーズは無孔性であると推測される。
【０１２４】
抗菌活性
ペプチド結合体化ビーズについて、標準的なＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤキット由来の３０μＭヨウ化プロピジウム及び６μＭ ＳＹＴＯ９染色を用いて染色したＣＭＨＢ中の１×１０７ｃｆｕ／ｍＬのＫ１２ Ｅ．ｃｏｌｉとのインキュベートにより、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに対して試験した。蛍光顕微鏡により測定されるように、１時間後に、溶液中の５０％の細菌が死滅した。死滅効果が、本当に固定化ペプチドによるのかどうかを評価するため、ビーズとインキュベートした培地を３０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を除去し、上清を１時間、ＣＭＨＢ中の１×１０７ｃｆｕ／ｍＬのＥ．ｃｏｌｉで接種した。死滅は観察されなかった。これは、固定化ペプチドが細菌に対して効果のある成分であることを示す。
【０１２５】
（実施例２）平面に固定化された抗菌ペプチドは抗菌特性を示す
システインを取り込んだセクロピン−メリチンハイブリッドペプチド（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＣ−ＮＨ２）（配列番号５）を、ペプチドの固相合成に用いられる末端アミン基を有する市販の膜（ピクリン酸アッセイにより測定されるように、０．３４０μモルのＮＨ２／ｃｍ２）（Ｉｎｔａｖｉｓ製品番号３０．１００）に、固定化した。膜の末端アミン基は、スルホ−ＧＭＢＳのスクシンイミド基と反応し、次の工程において、スルホ−ＧＭＢＳのマレイミド基はシステイン取り込みペプチドのチオール基と反応した。膜に結合したペプチドの量は、ビーズに曝露させた最初の総ペプチドと、数回の洗浄で回収されたペプチド量との差異から、間接的に決定した。固定化ペプチドの量は、膜１ｃｍ２あたり約２．０ｍｇであった。このペプチドが結合した膜を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ２５９２に対して固定化抗菌活性について試験した。
【０１２６】
Ｃａｔｉｏｎ Ａｄｊｕｓｔｅｄ Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈのような培地中での標的細菌の一晩培養物を、ＯＤ６００及び細胞密度の間で予め決められたキャリブレーションを用いて、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水で約１×１０５ｃｆｕ／ｍＬに希釈した。０．５ｃｍ２の固定化抗菌表面の試料を、０．７５ｍＬの細菌懸濁液に加えた。試料を液体で覆い、固体表面が液体中で回転するのが見えるように、十分な量の混合物を用いて３７℃でインキュベートした。１時間のインキュベーション後、細菌懸濁液の連続希釈液を寒天プレートに平板培養し、生存可能な細胞濃度を定量するために、一晩増殖させた。この方法を用い、ペプチドが結合した膜は、溶液中、１時間でＥ．ｃｏｌｉの４．２の対数減少を生じた。固定化殺菌活性について結合した抗菌ペプチドを有しないアミン官能化膜の試験は、生存可能な細菌に有意な減少を示さなかった（＜０．１の対数減少）。
【０１２７】
（実施例３）平面に固定化された抗菌ペプチドは、細菌の繰り返し攻撃を経てＰＢＳ中で３週間超保存した後に抗菌特性を示す。
【０１２８】
実施例２と同じ試料を生成し、ｐＨ７．４のＰＢＳ中に３週間超保存した。このペプチド結合膜を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに対する固定化殺菌活性について試験した。１時間にわたり、溶液中の平均１．８の対数減少が生じた。次いで、試料を試験溶液から除去し、新鮮なＰＢＳに入れた。試料を１０分間の超音波処理にかけ、新鮮なＰＢＳに代え、更に３０分間超音波処理した。次いで、洗浄し再試験した。実施例２に記載したアッセイを用いて、洗浄した試料の固定化抗菌活性を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ２５９２２に対して測定し、細菌において、１時間で平均３．３の対数減少が生じた。
【０１２９】
（実施例４）抗菌活性が滲出した因子からもたらされないことの確認
実施例３で用いられた試料が非滲出性でないか判定するために試験を実施した。実施例３で用いた試料が洗浄の前後の死滅の両方のラウンドの間に非滲出性であることを示すために、上清の評価を用いた。実施例３に記載された試料及び細菌の溶液の間の１時間のインキュベーションの終わりに、０．４ｍＬの細菌溶液を取り出した。０．４ｍＬを３０００×ｇで５分間遠心分離し、残留する細菌を除去した。標準的な抗菌アッセイにおけるように、０．２ｍＬの上清の試料を除去し、０．０５ｍＬの、５×１０５ｃｆｕ／ｍＬのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ２５９２２に、最終濃度が１×１０５ｃｆｕ／ｍＬになるように加えた。この混合物を、固定化殺菌活性アッセイにおけるような混合と同じ程度で、３７℃でインキュベートし、１時間の終わりに、連続希釈液を平面培養した。
【０１３０】
死滅の１回目及び２回目のラウンドの両方に由来する上清は、死滅の測定可能な量を示さなかった（生存可能な細菌において＜０．１の対数減少）。表面は死滅を示すが、表面上の上清は何ら死滅を示さないので、固定化抗菌表面は実質的に非滲出性である。
【０１３１】
（実施例５）抗菌ペプチドは、その抗菌特性を維持しながら、ゲルに共有結合で固定化され得る
デキストランゲルを、デキストランアクリレートマクロモノマーのＵＶ架橋により製造した。２３．３％（４００ｍｇ）の置換の程度を有するデキストラン−アクリレート（詳細な製造については、Ｆｅｒｒｅｉｒａら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２００２，２３，３９５７−３９６７を参照されたい）をＰＢＳ（１．８ｍＬ）に溶解しＩｒｇａｃｕｒｅ（５ｍｇ／ｍＬ、２５０μＬ）を溶液に穏やかに加えた。１０分間にわたりＵＶ−光に暴露することによって溶液の架橋を開始した。生検パンチを用いて、得られたゲルをいくつかのディスク（直径８ｍｍ）に切断し、水で一晩洗浄した。官能化反応前に、各デキストランディスクを９５％エタノールに２０分間浸し、ゲルを収縮させた。次いで、収縮したゲルを、穏やかに撹拌しながら（ｖｏｒｔｅｘ、１００ｒｐｍ）ＰＢＳ中の過ヨウ素酸ナトリウムの溶液（５．３ｍｇ／ｍＬ、１ｍＬ）に１時間浸した。この時間の後、ディスクをＰＢＳ中で洗浄し（５回）、未反応の過ヨウ素酸ナトリウムを除去した。次いで、ディスクを二塩酸エチレンジアミンの溶液（６６ｍｇ／ｍＬ、１ｍＬ）に入れ、穏やかに撹拌しながら（ｖｏｒｔｅｘ、１００ｒｐｍ）、反応を１．５時間継続させた。この工程の後、ディスクをＰＢＳ中でよく洗浄した（５回）。ＰＢＳ中のシアノ水素化ホウ素ナトリウムの溶液（１５ｍｇ／ｍＬ、１ｍＬ）を調製し、混合した後、室温で１０分間冷却した。撹拌せずに、ディスクをシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液中で３０分間反応させ、次いで、よく洗浄し、ＰＢＳ中に一晩浸した。官能化したゲルを９５％エタノールに２０分間浸し、穏やかに撹拌しながら（ｖｏｒｔｅｘ、１００ｒｐｍ）、スルホ−ＧＭＢＳ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍＬ）に室温で２時間浸した。ＰＢＳで洗浄することにより（５回）、過剰のスルホ−ＧＭＢＳを除去した。次いで、ディスクを再び９５％エタノール中に２分間浸し、次いで、穏やかに撹拌しながら（ｖｏｒｔｅｘ、１００ｒｐｍ）、システインを取り込んだセクロピン−メリチンハイブリッドペプチド（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＣ−ＮＨ２）（配列番号５）の溶液（５ｍｇ／ｍＬ）に一晩浸した。ディスクを、２日間、１０回洗浄し（０．５ｍＬ、ＰＢＳ）、ペプチドの放出の決定のために洗浄を続けた。ＢＣＡアッセイは、３．２２ｍｇのペプチドがデキストランディスクに固定化されたことを示した。
【０１３２】
固定化された殺菌活性についてアッセイした場合、システインを取り込んだセクロピン−メリチンハイブリッドペプチドで官能化されたゲルは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ２５９２２において２．９の対数減少を示したが、セクロピン−メリチンハイブリッドペプチドを有しないゲルは、生存可能な細菌において有意な減少を示さなかった（＜０．１の対数）。
【０１３３】
（実施例６）基質上の抗菌ペプチドの共有結合による固定化における配向性は、最終的な生物活性にとって重要である。
【０１３４】
固定化ペプチドの配向性が生物活性に重要であるかどうかを調べるため、システインを取り込んだセクロピン−メリチンハイブリッドペプチド（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＣ−ＮＨ２）（配列番号５）を、カルボキシル基を含む膜表面の複数のペプチドアミン基のカップリングによってランダムな配向性で固定化した。以下のプロトコールに従った。末端アミン基を含むセルロース膜（１×１ｃｍ２）を、メチルＮ−スクシニミジルアジペート（ＭＳＡ，Ｐｉｅｒｃｅ）の溶液（ｐＨ７．４のＰＢＳ中、０．１ｍＬのＤＭＳＯ溶液中、１．５４ｍｇ（１：９、ｖ／ｖ））中、室温で２時間インキュベートした。次いで、膜をＰＢＳで数回（５×１ｍＬ）洗浄し、リン酸バッファー、ｐＨ９．５（２ｍＬ）で一晩インキュベートした。その後、膜をｐＨ７．４のＰＢＳ（５×１ｍＬ）及び０．１Ｍクエン酸バッファーｐＨ７．５（５×１ｍＬ）で洗浄した。膜を、０．５ｍＬのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチル−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）溶液（０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファーｐＨ５．０中、４．８ｍｇ／ｍＬ）と３０分間反応させ、次いで、ＰＢＳで洗浄（３×１ｍＬ）した。次いで、活性化された膜を、穏やかに撹拌しながら（１００ｒｐｍ）システインを取り込んだセクロピン−メリチンハイブリッドペプチド（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＣ−ＮＨ２）（配列番号５）（１ｍＬのＰＢＳ中、５ｍｇ）と室温で一晩反応させ、最終的にＰＢＳで洗浄（１ｍＬで洗浄を１０回）、使用するまで、ＰＢＳ中、４℃で保存した。
【０１３５】
結果は、セルロース膜の末端アミン基のほとんどがＭＳＡと反応することを示す。アミン基の含有量は、ＭＳＡ反応の前後で、それぞれ０．３４０μモル／ｃｍ２、及び０．０３９μモル／ｃｍ２であった。
【０１３６】
ＥＤＣ化学を用いて、ＭＳＡの末端ＣＯＯＨ基を、抗菌ペプチドの末端ＮＨ２基とカップリングした。膜上に固定化されたペプチドを、システインを取り込んだセクロピン−メリチンハイブリッドペプチド（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＣ−ＮＨ２）（配列番号５）を標準物質として用いて、ＢＣＡアッセイ（Ｓｉｇｍａ）により決定した。膜に結合したペプチドの量を、膜に曝露した最初の総ペプチドと、数回の洗浄において回収されたペプチドの量との差異から決定した。
【０１３７】
ペプチド含有量は１．８４±０．２７ｍｇ／ｃｍ２（ｎ＝２）であった。表面積に対するペプチド含有量は、配向したペプチド（スルホ−ＧＭＢＳ化学）を用いた固定化されたもの（１．７５±０．３６ｍｇ／ｃｍ２、ｎ＝３）と同様であった。同じ表面密度を有する、配向及び非配向の両方のペプチドを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ２５９２２に対する固定化殺菌活性について評価した。配向ペプチドは、生存可能な細菌において３．０の対数減少を示したが、非配向ペプチドはた１．６の対数減少を生成したのみであった。これは、配向する方法における抗菌ペプチドの固定化が、より高い生物比活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ）をもたらすことを示す。
【０１３８】
（実施例７）配向された固定化抗菌ペプチドは高い比活性を示す
溶液中のペプチド濃度を変えたことを除き、実施例２に記載したように、スルホ−ＧＭＢＳ化学を用いて、アミンを提示するセルロース膜に、システインを取り込んだセクロピン−メリチンハイブリッドペプチド（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＣ−ＮＨ２）（配列番号５）を固定化した。固定化工程の間の溶液中のペプチドの濃度は、０．１２５ｍｇ／ｍＬ〜５．０ｍｇ／ｍＬで変化した。実施例２に記載されたようにして、試料を、固定化殺菌活性についてアッセイした。固定化の間に５ｍｇ／ｍＬの濃度を用いた場合、得られた表面は、１時間にＥ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣの２．０の対数減少を示した。しかし、固定化の間のペプチド濃度を０．１２５ｍｇ／ｍＬに減少した場合、１．８の対数減少がなお生じ、これは、実施例６における非配向性ペプチドよりも有意に低い密度である。従って、ペプチドが配向されている場合に、用いられているペプチドの質量あたりの大きな固定化殺菌活性（高い比活性）が達成される。
【０１３９】
（実施例８）固定化抗菌ペプチド表面は実質的に非溶血性である。
【０１４０】
実施例２に記載したように、スルホ−ＧＭＢＳ化学を用いて、システインを取り込んだセクロピン−メリチンハイブリッドペプチド（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＣ−ＮＨ２）（配列番号５）を、アミンを提示するセルロース膜に固定化し、それが、実質的に非溶血性の表面であるかを判断するための試料を試験した。洗浄し、プールした１０％赤血球（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）のストックを、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０の溶血バッファーで０．２５％に希釈した。０．５ｃｍ２の抗菌試料を、０．７５ｍＬの０．２５％赤血球懸濁液で３７℃にて１時間インキュベートした。固体試料を除去し、細胞を６０００ｇでスピンダウンし、上清を除去し、分光光度計でＯＤ４１４を測定した。全溶血は、洗浄し、プールした１０％赤血球を無菌ＤＩ水で０．２５％に希釈し３７℃で１時間インキュベートすることによって定義し、０％溶血は、固体試料なしで溶血バッファー中への０．２５％赤血球の懸濁により定義される。このアッセイを用いた、ほんの４．９５％の溶血を生じるペプチド固定化試料は、試料が実質的に非溶血性の表面であることを証明する。
【０１４１】
（実施例９）抗菌ペプチドのアミド化ポリマーブラシへのカップリング
ブラシモノマー、アミノエチルメタクリレート（ＡＥＭＡ）を、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）と一緒に、緩衝化メタノール／水の溶液に入れた。溶液を、ビニルを提示する基質と、７０℃以上で１時間インキュベートした。重合したＡＥＭＡとして、基質表面上のビニル単位を、成長するポリマー鎖に導入し、これらの鎖を基質に係留した。得られる材料の概略図を図２に示す。重合に続き、表面を繰り返し洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水中で超音波処理し、グラフト化していないあらゆるポリマー鎖を除去した。次いで、試料を乾燥し、厚みを測定した。追加の超音波処理は、フィルム厚みをさらには減少しなかったが、これは、全ての残りのポリマーが共有結合で基質に結合していることを示す。ポリマー組成は、ＩＲ分光法により証明された。
【０１４２】
厚み及び組成の確認の後、システインを取り込んだセクロピン−メリチンハイブリッドペプチド（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＣ−ＮＨ２）（配列番号５）を、実施例１に記載したスルホ−ＧＭＢＳ化学を用いて表面に固定化した。ポリマーブラシ表面を用いた初期の固定化実験は、平面基質と比較し、表面積当たりの固定化ペプチドの質量において４倍の増大を示した。全ての固定化ペプチドは表面に提示され、有効ＡｍＰ濃度を劇的に増加させた。ポリマーブラシの分子量及び分岐の最適化は、固定化ペプチドの有効な表面濃度を更に増加させる。
【０１４３】
特に定義されない場合には、本明細書で用いられる全ての技術的及び化学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者に通常に理解されるのと同じ意味を有する。当業者は、通常の実験のみを用いて、本明細書に開示される発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を認識し、又は確定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】親水性係留分子により、基質表面上に固定化されたＡｍＰを示す。
【図２】基質表面に固定化された、ＡｍＰがカップリングした、又はカップリングしていない親水性係留分子を示す。
【図３】基質表面に固定化されたヒドロゲルに固定化されたＡｍＰを示す。
【図４】ビニルを提示する基質にカップリングした、アミド化したポリマーブラシの概略を示す。
【図５】Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ）の構造を示す。スルホン化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド残基は一級アミンと反応するが、マレイミド基はチオール基と反応する。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、固定化した生物活性のペプチドコーティング、特に静菌性かつ殺菌性特性を示すペプチドコーティングの分野にある。
【０００２】
（関連出願）
この出願は、２００６年２月１５日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／７７４，０５０、２００６年１１月１７日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１１／５６１，２６６および２００７年１月１８日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／８８５，５７８への優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
院内感染は、薬剤耐性菌の拡散のために、ますます費用がかかり処置するのが困難になっている。外科手術の無菌性を向上させるための努力にもかかわらず、感染は普通に残っている。これらの感染は、しばしば医療デバイスと関連している。中心静脈カテーテル等の皮膚浸透器具、並びに導尿カテーテルは、身体に侵入する細菌のための経路を提供し、埋め込まれた器具は、細菌が増殖することのできるのに好都合な表面を形成する。
【０００４】
細菌が、いったん医療デバイスにコロニーを形成すると、それらは扱いにくいバイオフィルムを形成する。バイオフィルムは、保護及び接着性マトリクスの排泄物によって特徴づけられる微生物の複雑な集合体である。バイオフィルムは、しばしば、表面接着、構造的不均質、遺伝的多様性、複雑な群間相互作用、及び高分子物質の細胞外マトリクスによっても特徴づけられる。バイオフィルムは、フィルムの内部において免疫システムから細菌を保護する。全身性の抗生物質は、バイオフィルムを浸透させる限られた能力のために、このような感染の治療には効果がない。これらの理由により、器具感染の治療は、しばしば、器具の除去、抗生物質の投与、それに続く新しい器具の挿入を必要とする。この処理は費用がかかり、有痛性であり、細菌が完全に除去されない場合、新しい器具が感染されてしまう場合がある。
【０００５】
種々の制御放出型抗菌コーティング及び器具、細菌感染が特に問題となる、特に、中心静脈カテーテル（ＣＶＣ）及び創傷包帯等の装置が開発されてきた。従来の抗菌コーティングは一般に、デバイス表面又はポリマーコーティングに取り込まれる抗菌剤及び金属イオンからなる。これらの薬剤の持続放出は、細菌のコロニー形成及び増殖の抑制に役立つ局所的な毒性濃度をもたらす。
【０００６】
現在、臨床的に有意に用いられる３種類の抗菌性ＣＶＣがある。ＡＲＲＯＷｇ＋ａｒｄ（登録商標）Ｂｌｕｅカテーテル（Ａｒｒｏｗ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）は、クロルヘキシジン（Ｋｕｙｙａｋａｎｏｎｄら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏ．Ｌｅｔ．，１００（１−３），２１１−２１５（１９９２））及びスルファジアジン銀を組み合わせて含有し、これの抗菌活性は、主に電子伝達鎖及びＤＮＡ複製の銀による破壊による（Ｓｉｌｖｅｒら、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３３（７），６２７−６３４（２００６）；Ｆｏｘら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ＆ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，５（６），５８２−５８８（１９７４））。これらのカテーテルは、臨床研究においてカテーテルのコロニー形成を４４％減少することが示されている（Ｖｅｅｎｓｔｒａら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ，２８１（３），２６１−２６７（１９９９））。しかし、クロルヘキシジンは、患者内で超過敏反応をもたらすことが知られており（Ｗｕら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２７（１ｌ）：２４５０−６７（２００６））、クロルヘキシジン及びスルファジアジン銀のいずれもが菌耐性をもたらすかもしれない（Ｂｒｏｏｋｓら、Ｉｎｆ．Ｃｏｎ．Ｈｏｓ．Ｅｐｉｄｅｍ．，２３（１１）：６９２−６９５（２００２）；Ｓｉｌｖｅｒら、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，３３（７），６２７−６３４（２００６））。
【０００７】
Ｃｏｏｋ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ’ｓ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（登録商標）のカテーテルのラインは、タンパク質合成を阻害する徐放性ミノサイクリン（Ｓｐｅｅｒｓら、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．Ｒｅｖ．，５（４）：３８７−３９９（１９９２））、及びＲＮＡポリメラーゼを阻害するリファンピシン（Ｋｉｍら、Ｓｙｓ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２８（５）：３９８−４０４（２００５））を用いる。これらのカテーテルは、臨床研究においてカテーテルのコロニー形成を６９％減少することが示されている（Ｒａａｄら、Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．，１２７（４）：２６７（１９９７））。しかし、ミノサイクリン及びリファンピシンが菌耐性をもたらすことも知られている（Ｋｉｍら、Ｓｙｓ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８（５）：３９８−４０４（２００５）；Ｓｐｅｅｒｓら、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．Ｒｅｖ．，５（４）：３８７−３９９（１９９２））。
【０００８】
Ｅｄｗａｒｄｓ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ’Ｖａｎｔｅｘ（登録商標）カテーテルは、銀、炭素、及び白金イオンを放出し、抗菌活性のほとんどは銀イオンに起因する。このカテーテルは、血流におけるアルブミンによる銀イオンのｉｎ ｖｉｖｏでの金属イオン封鎖において、ある程度は制限されるカテーテルコロニー形成を約３５％減少することが示されている（Ｒａｎｕｃｃｉら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．，３１（１）：５２−５９（２００３）；Ｃｏｒｒａｌ．，ら、Ｊ．Ｈｏｓ．Ｉｎｆｅｃ．，５５（３）：２１２−２１９（２００３））。銀イオンに対する菌耐性も報告されている（Ｓｉｌｖｅｒら、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３３（７），６２７−６３４（２００６））。
【０００９】
ＣｏｎｖａＴｅｃ’ｓ Ａｑｕａｃｅｌ（登録商標）のような、大部分が銀イオンの取り込みを基礎とする、多くの抗菌創傷包帯が開発されている。他の抗菌薬は、ヨウ素カデキソマー（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｎｅｐｈｅｗ’ｓ Ｉｏｄｏｆｌｅｘ（登録商標）及びＩｏｄｏｓｏｒｂ（登録商標））、ＣＨＧ（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ’ｓ Ｂｉｏｐａｔｃｈ（登録商標））、及びＰＨＭＢ（Ｋｅｎｄａｌｌ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ’ｓ Ｋｅｒｌｉｘ（登録商標）ＡＭＤ（登録商標））を含む。
【００１０】
これらの薬剤に対する興味深い代替物は、抗菌性ペプチド（ＡｍＰ）である。ＡｍＰは、膜の特性に基づいて哺乳動物細胞及び微生物を区別することができ、高速で非特異的な攻撃メカニズムを用いて微生物を死滅させる。膜の特性を変えるためには進化上の労力は大きく、攻撃は十分に早く細菌は生存し変異する機会がほとんどないので、このメカニズムは特定の酵素を標的とする抗生物質と比較して、薬剤耐性を誘導する可能性は劇的に小さい。天然のＡｍＰは、グラム陽性及び陰性細菌、真菌、ウイルス、及びさらには癌性細胞に対して活性を有している可能性がある（Ｊｅｎｓｓｅｎ，Ｈａｍｉｌｌら、Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．，１９（３）：４９１−５１１（２００６））。
【００１１】
デバイス表面から放出されるＡｍＰは、器具関連感染を予防する能力を有していることが示されている。Ｄａｃｒｏｎ移植片を、単にＡｍｐデルマセプチン（ｄｅｒｍａｓｅｐｔｉｎ）の溶液に浸し、ラットに移植し、細菌で攻撃することにより、デバイスのコロニー形成及び感染が減少する（Ｂａｌａｂａｎら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ＆ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，４８：２５４４−２５５０（２００４））。デルマセプチンの放出は、メチシリン耐性及びバンコマイシン中間体−耐性黄色ブドウ球菌に対して有効であった。Ｍｉｇｅｎｉｘ及びＣａｄｅｎｃｅの抗菌性ペプチド薬剤候補ＣＰＩ−２２６は、医療デバイス感染に関連する細菌に対する臨床試験における徐放性クリーム製剤において、ｉｎ ｖｉｖｏ有効性を有する。
【００１２】
徐放性コーティングは、いくつかの固有の限界に悩まされている。デザインに関しては、徐放性コーティングには寿命の制限がある。ＣＶＣ及び透析カテーテルを含む多くのカテーテルの用途については、臨床医から保護の延長が望まれている。更に、徐放性抗生物質は、薬剤耐性の発生を促進し得る致死量以下の濃度の隣接する領域をもたらす。薬剤を血流に放出することにより、全身毒性に対する懸念が増加する。最後に、徐放性コーティングを生成するために必要な大量の薬剤のために、器具の構造的及び性能特性が影響されるかもしれない。
【００１３】
Ｋｅｅｌｅｒらによる特許文献１、及びＷｉｌｃｏｘ らによる特許文献２；及びＷｉｌｃｏｘらによる特許文献３は、抗菌性器具を提供するための種々の物質に対するカップリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）抗菌性ペプチドを開示している。しかし、カップリング法はランダムであり、表面上のペプチドの配向性を制御することはできない。カップリング法は、抗菌性ペプチド中に頻繁に見出される塩基性側鎖内のアミンを含む、ペプチド上のいずれかのアミンによって基質にペプチドを固定する。従って、ＡｍＰは多くの異なる部位で係留され得るか、１個の分子は多くの位置で係留され得る。これは、殺菌性であることから表面を防止しないが、ペプチドの配向性及び柔軟性が、ペプチドあたりの抗菌活性を最大にし、潜在的に費用及び毒性を低くするのに適しているように、ペプチドが材料の表面に位置するかのように効果は大きい。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／００６５０７２号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／０１２６４０９号明細書
【特許文献３】欧州特許第０ ９９０ ９２４号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、本発明の目的は、微生物の結合及び増殖を防止する効果を向上する、そこに結合した抗菌ペプチドを有する材料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
特定の配向性を有する、基質上に固定化された１種以上のタイプの抗菌ペプチドを含む組成物、及びその製造及び使用方法が本明細書に開示される。抗菌ペプチドは、細菌の膜を標的とするための抗菌コーティングを開発する他のアプローチを可能にする。細菌細胞の内部でその標的に到達するように放出されなければならない従来の多くの抗生物質とは異なり、ほとんどのＡｍＰは、有効であるために、細菌の外膜又は細胞壁とのみ接触しなければならない。本明細書に開示される方法を用いて固定化されるペプチドは、基質にランダムに結合する同一のペプチドと比べ、高い特異的抗菌活性を有する。
【００１６】
ペプチドは、共有結合又は非共有結合法（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｏｒ ｎｏｎ−ｃｏｖａｌｅｎｔ ｍａｔｈｏｄ）を用いて基質に固定化することができる。高い特異的抗菌活性は、ＡｍＰの重要部分と細菌の膜との効果的な相互作用を可能にするためにペプチドを配向することによって実現される。一実施形態において、ペプチドの一端は基質と直接共有結合している。他の実施形態において、ペプチドは、カップリング剤又は係留分子（ｔｅｔｈｅｒ）を用いて基質に固定化されている。適切なカップリング剤には、有機小分子、ポリマー、及びそれらの組み合わせが含まれる。他の実施形態においては、ペプチドは、基質に塗布されるポリマー薄膜上に固定化される。更なる他の実施形態においては、ペプチドは、基質に共有結合しているポリマーに固定化される。例えば、ペプチドは、基質に結合するヒドロゲルを形成する、ポリマーブラシ、デンドリマーポリマー、又は架橋ポリマーに固定化することができる。非共有結合法には、ビオチン／アビジン又はストレプトアビジン系等の非常に高い特異的相互作用を用いた、ペプチドの基質へのコーティング、ペプチドの基質への生理化学的固定が含まれる。タンパク質の結合を減少するために設計された化学を用いて、ペプチドは所望の密度及び配向で係留され得る。一実施形態において、係留分子は、タンパク質の結合を減少するための親水性基を含む。他の実施形態において、基質は親水性ポリマーで改変され、次いでＡｍＰを係留することができる。この親水性ポリマーは、基質に共有結合するか、基質の絶縁保護コーティング（ｃｏｎｆｏｒｍａｌ ｃｏａｔｉｎｇ）からなる。好ましい実施形態において、ペプチドは、少なくとも０．００１、０．０１、０．１、０．２５、０．５、１、１．５、２．５、５、１０、２５又は５０ｍｇペプチド／基質表面積ｃｍ２の濃度で基質に結合する。
【００１７】
ペプチドは、代用血管、矯正デバイス、透析アクセス移植片、及びカテーテル等の医療用移植片；手術道具、手術用衣服；及び包帯を含む、異なる種々のタイプの基質にコーティングすることができる。基質は、金属材料、セラミック、ポリマー、繊維、シリコン等の不活性物質、及びそれらの組み合わせからなる。本明細書に開示される組成物は、実質的に非滲出性、抗汚損性、及び非溶血性である。固定化ペプチドは、ペプチドに暴露する場合、細菌、ウイルス、及び／又は真菌と相互作用するのに十分な柔軟性及び移動性を保持している。基質にペプチドを固定すると、基質表面における作用部位で高いペプチド濃度を示す一方、ペプチドの毒性及び抗菌耐性の発生に関する懸念は低減する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
１．定義
本明細書で用いられる場合、「アミノ酸残基」及び「ペプチド残基」は、そのカルボキシル基（Ｃ−末端に結合する）のＯＨ、又はそのアミノ基（Ｎ−末端に結合する）の１個のプロトンを有しないアミノ酸又はペプチド分子を意味する。一般に、アミノ酸及び保護基を命名するために本明細書で用いられる略語は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅの推奨に基づく（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７２）１１：１７２６−１７３２）。ペプチド中のアミノ酸残基は、以下のように省略される：アラニンはＡｌａ又はＡであり；システインはＣｙｓ又はＣであり；アスパラギン酸はＡｓｐ又はＤであり；グルタミン酸はＧｌｕ又はＥであり；フェニルアラニンはＰｈｅ又はＦであり；グリシンはＧｌｙ又はＧであり；ヒスチジンはＨｉｓ又はＨであり；イソロイシンはＩｌｅ又はＩであり；リジンはＬｙｓ又はＫであり；ロイシンはＬｅｕ又はＬであり；メチオニンはＭｅｔ又はＭであり；アスパラギンはＡｓｎ又はＮであり；プロリンはＰｒｏ又はＰであり；グルタミンはＧｌｎ又はＱであり；アルギニンはＡｒｇ又はＲであり；セリンはＳｅｒ又はＳであり；スレオニンはＴｈｒ又はＴであり；バリンはＶａｌ又はＶであり；トリプトファンはＴｒｐ又はＷであり；チロシンはＴｙｒ又はＹである。ホルミルメチオニンは、ｆＭｅｔ又はＦｍと省略される。「残基」なる用語は、カルボキシル基のＯＨ部分、及びα−アミノ基の１個のプロトンを除去することによる対応するα−アミノ酸に由来する基を意味する。「アミノ酸側鎖」なる用語は、Ｋ．Ｄ．Ｋｏｐｐｌｅ，”Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ”，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９６６，ｐａｇｅｓ ２ ａｎｄ ３３に定義されるように、−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨ骨格を排除した、対応するα−アミノ酸の部分を意味し、このような一般的なアミノ酸の側鎖の具体例は、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３（メチオニンの側鎖）、−ＣＨ２（ＣＨ３）−ＣＨ２ＣＨ３（イソロイシンの側鎖）、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２（ロイシンの側鎖）、又は−Ｈ（グリシンの側鎖）である。
【００１９】
本明細書で用いられる場合、「非天然アミノ酸」は、天然に検出されない、あらゆるアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸には、あらゆるＤ−アミノ酸（後述する）、天然に検出されない側鎖を有するアミノ酸、ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）が含まれる。ペプチド模倣物の具体例には、β−ペプチド、γ−ペプチド、及びδ−ペプチド；ビピリジンセグメントを利用する骨格を有する化合物、疎溶媒性相互作用を利用する骨格を有する化合物、側鎖相互作用を利用する骨格を有する化合物、水素結合相互作用を利用する骨格を有する化合物、及び金属配位を利用する骨格を有する化合物のような、らせん又はシートコンフォメーションを採用し得る骨格を有するオリゴマーが含まれる。グリシンを除く、ヒト体内における全てのアミノ酸は、同じ分子の右巻き又は左巻きのいずれかのバージョンであり、これは、いくつかのアミノ酸において、カルボキシル基及びＲ−基の位置が切り替わることを意味する。天然のアミノ酸の大半は、分子の左巻きバージョン又はＬ型である。高等生物のタンパク質には、右巻きバージョン（Ｄ−型）は検出されないが、ある種の下等生物、例えば、細菌の細胞壁においては検出される。それらは、ストレプトマイシン、アクチノマイシン、バシトラシン、及びテトラサイクリン等のある種の抗生物質においても検出される。それらの抗生物質は、生存及び再生に必要なタンパク質の形成を妨害することによって、細菌を死滅させることができる。
【００２０】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「オリゴペプチド」は、一般に、約１０個より多く、好ましくは９個より多く１５０個未満、更に好ましくは１００個未満、最も好ましくは９〜５１個のアミノ酸を有するペプチド及びタンパク質を意味する。ポリペプチドは、「異種」である「外来性」であり得、すなわち、細菌細胞によって産生されるヒトポリペプチドのような、利用される宿主細胞に対して外来性であることを意味する。また、外来性は、細胞の外部から加えられ、内因性（細胞によって生産される）でない物質を意味する。ペプチドは、天然又は合成であろうと、ペプチド結合によって化学的に連結しているアミノ酸からなる有機化合物を包含する。ペプチド結合は、１個のアミノ酸のカルボキシル（酸素を有する炭素）と第二のアミノ酸のアミノ窒素の間の単一の共有結合を含む。約１０個未満の構成アミノ酸を有する小さいペプチドは、通常オリゴペプチドと呼ばれ、１０個より多いアミノ酸を有するペプチドはポリペプチドと呼ばれる。１０，０００ダルトンを超える分子量を有する化合物（５０〜１００アミノ酸）は通常タンパク質と呼ばれる。
【００２１】
本明細書で用いられる場合、「抗菌ペプチド」（ＡｍＰ）は、細菌、酵母、真菌、マイコプラズマ、ウイルス又はウイルス感染細胞、及び／又は原虫を含む微生物を死滅させる（殺菌）か、増殖を阻害（静菌）するオリゴペプチド、ポリペプチド、又はペプチド模倣物を意味する。例えば、ＡｍＰは抗癌活性を有することが報告されている。一般に、抗菌ペプチドは、親水性領域と電荷領域とが空間的に分離されているカチオン性分子である。具体的な抗菌ペプチドには、膜内でα−ヘリカル構造を形成する線状ペプチド、又は膜内のジスルフィド結合により場合により安定化されるβ−シート構造を形成するペプチドが含まれる。代表的な抗菌ペプチドには、カテリシジン、デフェンシン、デルミシジン、特にマガイニン（ｍａｇａｉｎｉｎ）２、プロテグリン（ｐｒｏｔｅｇｒｉｎ）、プロテグリン−１、メリチン、ｌｌ−３７、デルマセプチン０１、セクロピン、カエリン（ｃａｅｒｉｎ）、オビスピリン（ｏｖｉｓｐｉｒｉｎ）、及びアラメチシン（ａｌａｍｅｔｈｉｃｉｎ）が含まれるが、これらに限定されない。天然の抗菌ペプチドには、植物、ヒト、真菌、微生物及び昆虫を含む脊椎動物及び非脊椎動物由来のペプチドが含まれる。
【００２２】
本明細書で用いられる場合、「固定化」又は「固定する」は、基質に結合する抗菌ペプチドを意味する。ペプチドは、実質的に非滲出性であるように、共有結合又は非共有結合で基質に結合し得る。固定化ペプチドは、暴露による細菌、ウイルス、及び／又は真菌と相互作用する十分な柔軟性及び移動性を維持したままである。
【００２３】
本明細書で用いられる場合、「抗菌」は、細菌、酵母、真菌、マイコプラズマ、ウイルス又はウイルス感染細胞、癌性細胞及び／又は原虫を含む微生物を死滅させる（殺菌）か、増殖を阻害する（静菌）分子を意味する。特に、本明細書で用いられる場合に、「殺菌性」は、細菌、酵母、真菌、マイコプラズマ、ウイルス又はウイルス感染細胞、及び／又は原虫を含む微生物を死滅する分子を意味する。
【００２４】
本明細書で用いられる場合、「固定化抗菌」は、表面と接触する、細菌、酵母、真菌、マイコプラズマ、ウイルス又はウイルス感染細胞、及び／又は原虫を含む微生物を死滅させる（殺菌）か、増殖を阻害する（静菌）抗菌ペプチドが固定化された表面を意味する。
特に、本明細書で用いられる場合、「固定化殺菌活性」は、表面と接触する細菌、酵母、真菌、マイコプラズマ、ウイルス又はウイルス感染細胞、及び／又は原虫を含む、生存能力のある微生物の減少を意味する。細菌の標的に関して、殺菌活性は、固定化抗菌について、ＡＳＴＭ２１４９アッセイに基づく生存能力のある細菌の減少として定量することができ、以下のように、小量の試料に縮小することができる。Ｃａｔｉｏｎ Ａｄｊｕｓｔｅｄ Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈのような培地中での標的とする細菌の一晩の培養物を、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水で、ＯＤ６００と細胞密度との間の所定のキャリブレーションを用い、約１×１０５ｃｆｕ／ｍＬに希釈する。０．５ｃｍ２の固定化抗菌表面の試料を、０．７５ｍＬの細菌懸濁液に加える。試料を液体で覆い、固体表面が液体の間を回転するのが見えるように、液体を十分な混合量で３７℃にてインキュベートすべきである。１時間インキュベーションした後、細菌懸濁液の連続希釈液を寒天プレートに播種し、生存能力のある細胞濃度を定量するために一晩増殖させる。好ましくは、細菌数（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｕｎｔ）における少なくとも１の対数減少は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の細菌のコントロールと比較して固体の試料なしで生ずる。更に好ましくは、細菌数における少なくとも２の対数減少が生ずる。更に好ましくは、細菌数における少なくとも３の対数減少が生ずる。最も好ましくは、細菌数における少なくとも４の対数減少が生ずる。
【００２５】
本明細書で用いられる場合、「実質的に非滲出性」は、組成物がｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水の存在下、溶液抗菌特性を示すか、放出した材料に由来する宿主内での毒性反応を生成するのに十分な量の抗菌ペプチドを滲出しないことを意味する。放出された材料由来の活性は、前述する固定化抗菌アッセイを実行し、上澄みを除去し、残存する細菌を遠心分離することにより評価することができる。次いで、上清を１×１０５ｃｆｕ／ｍＬ懸濁物になるように細菌を接種し、３７℃で１時間保持し、希釈及び播種により生存能力のある細胞濃度を定量する。好ましくは、生存能力のある細胞における１０％、２０％、又は５０％の減少は、１時間、３時間、１日、３日、７日又は３０日の間に発生しない。
より好ましくは、組成物は、１時間、１日、３日、７日、又は３０日の間、血液、組織、及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ環境に、溶液抗菌特性を示すか、宿主内での毒性反応を生成するのに十分な量の抗菌ペプチドを放出しない。一実施形態において、組成物は、規定された時間内に、１０μｇ／ｃｍ２を超えるペプチド、好ましくは１μｇ／ｃｍ２を超えるペプチドを放出しない。
【００２６】
本明細書で用いられる場合、「接着」は、タンパク質、細胞、又は他の物質の表面への非共有結合的接着を意味する。接着した物質の量は、表面をＴｗｅｅｎ又はＳＤＳのような適切な再懸濁剤を用いて超音波処理及び／又は洗浄し、再懸濁した物質の量を定量することによって定量することができる
本明細書で用いられる場合、「実質的に細胞傷害性」は、組成物の表面と接触する哺乳動物細胞の代謝、増殖又は生存度を変化させる組成物を意味する。これは、抽出物試験、直接接触試験及び間接接触試験を含む、物質の細胞傷害性を評価するための３種の主要な試験を定義する国際標準化機構ＩＳＯ１０９９３−５により定量することができる。
【００２７】
本明細書で用いられる場合、「実質的に非溶血性の表面」は、以下のアッセイを適用した場合に、組成物が、ヒト赤血球の５０％、２０％、１０％、５％、又は最も好ましくは１％を溶解しないことを意味する。洗浄し、プールした１０％赤血球（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）を、１５０ｍＭ ＮａＣＬ及び１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０の溶血バッファーで０．２５％に希釈する。０．５ｃｍ２の抗菌試料を０．７５ｍＬの、０．２５％赤血球懸濁液と、３７℃で１時間インキュベートする。固体試料を除去し、細胞を６０００ｇでスピンダウンし、上清を除去し、ＯＤ４１４を分光光度計で測定する。全溶血は、１０％の洗浄しプールした赤血球を無菌ＤＩ水で０．２５％に希釈し、３７℃で１時間インキュベートすることにより定義され、０％溶血は、固体試料なしで、０．２５％赤血球の溶血バッファー中での懸濁液によって定義される。
【００２８】
本明細書で用いられる場合、「実質的に非汚損性（ｆｏｕｌｉｎｇ）」は、ポリウレタンのような基準ポリマーに対する付着量と比較し、血液タンパク質、結晶、組織及び／又は細菌を含むタンパク質の基質への付着量を減少することを意味する。好ましくは、デバイス表面は、ヒト血液の存在下で、実質的に非汚損性である。好ましくは、付着量は、基準ポリマーに対し、２０％、５０％、７５％、９０％、９５％、最も好ましくは９９％減少する。
【００２９】
本明細書で用いられる場合、「実質的に非毒性」は、実質的に非溶血性及び実質的に非細胞傷害性である表面を意味する。
【００３０】
本明細書で用いられる場合、「生体適合性」は、実質的に無毒であり、免疫原性のない表面を意味する。更に広くは、生体適合性は、特定の状態において適切な宿主反応を遂行する材料の能力である（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｆ．Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ａ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８７）。
従って、生体適合性は、体内組織が、どのくらい良好に材料と相互作用するか、この相互作用が、特定の移植目的及び部位について意図される予想にどのように適合するかについての全体的な状態を表す（Ｖｏｎ Ｒｅｃｕｍ，Ａ．Ｆ．；Ｊｅｎｋｉｎｓ，ＭＥ．；Ｖｏｎ Ｒｅｃｕｍ，Ｈ．Ａ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ．Ｉｎ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｉｍｐｌａｎｔ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｖｏｎ Ｒｅｃｕｍ，Ａ．Ｆ．，Ｅｄ．；Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，１９９９，ｐｐ．１−８）。それ故、生体適合性は、絶対的概念よりもむしろ相対的であり、材料の最終的用途に大いに影響される。
【００３１】
本明細書で用いられる場合、「密度」は、基質の表面積あたりに共有結合するペプチドの質量を意味する。
【００３２】
本明細書で用いられる場合、「効果的な表面濃度」は、所望の抗菌反応を実現するのに十分な固定化ペプチドの密度を意味する。
【００３３】
本明細書で用いられる場合、「配向性」は、暴露によって、細菌、ウイルス及び／又は真菌と相互作用を表わすペプチドの部分が、与えられたペプチドの全ての固定化分子について均一であるように、ペプチドが基質表面に固定化されることを意味する。更に、ペプチドが残基によって均一に連結するようなカップリング化学の選択によって、固定化されたペプチド中のアミノ酸残基が調節される。「均一に」は、ペプチドの７０％以上、好ましくは９０％以上、好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上が残基によって係留されることを意味する。理想的には、配向したペプチドは、単一のアミノ酸残基によって結合する。しかし、複数の結合残基は、結合の「配向性」に影響を及ぼさずにペプチドの同じ領域内に含まれ得ることは当業者に理解されるだろう。通常、ペプチドのＮ−末端は、最も高い活性のための標的細胞に対して示されるべきであるが、これはペプチドに依存して変化するかもしれない。
【００３４】
本明細書で用いられる場合、「基質」は、ペプチドが固定化される材料を意味する。ペプチドは基質に直接固定化されるか、カップリング剤を用いて基質に結合してもよい。また、基質は、薄膜、膜又はゲルでコーティングされていてもよく、ペプチドは、薄膜、膜又はゲル上に固定化される。
【００３５】
本明細書で用いられる場合、「システイン」は、アミノ酸システイン、又はその合成類似体を意味し、その類似体は遊離のスルフヒドリル基を含む。
【００３６】
本明細書で用いられる場合、「コーティング」は、一時的、半永久的又は永久的のいずれかの、層、表面処理、被膜又は表面を意味する。コーティングは、下層基質の化学的改変であってもよく、基質表面への新しい材料の追加であってもよい。それには、基質への厚みの追加、又は基質の表面化学組成の変化のいずれもが含まれる。コーティングは、気相、蒸気、液相、ペースト、半固体又は固体であってもよい。更に、コーティングは液体として適用され、そして硬いコーティングへ固化し得る。コーティングの具体例には、艶出し剤、表面洗浄剤、充填材、接着剤、仕上げ、塗料、ワックス、重合可能な組成物（フェノール樹脂、シリコーンポリマー、塩化ゴム、コールタール及びエポキシの組み合わせ、エポキシ樹脂、ポリアミド樹脂、ビニル樹脂、エラストマー、アクリレートポリマー、フルオロポリマー、ポリエステル及びポリウレタン、及びラテックスを含む）が含まれる。
【００３７】
本明細書で用いられる場合、「係留分子（ｔｅｔｈｅｒ）」又は「係留剤（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）」は、分子が最終的な化学組成物の一部として残存する材料においてペプチドを共有結合的に固定化するために用いられるあらゆる分子を意味する。
【００３８】
本明細書で用いられる場合、「カップリング剤」は、ペプチド、又はそれが結合する材料のいずれかにおける化学的部分を活性化し、ペプチド間で共有結合を形成し、結合の後に最終的な組成物中で材料が残存しない、あらゆる分子又は化学物質を意味する。
【００３９】
ＩＩ．組成物
ＡｍＰは、当該技術分野において公知の種々の共有結合及び非共有結合手段を用いて、基質に結合され、又は取り込まれるように適用することができる。
【００４０】
適切な共有結合手段には、基質表面へポリマーをグラフト重合又はコーティングし、ペプチドにカップリングするための反応性官能基を形成し、基質表面にペプチドを直接結合することが含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、ペプチドと基質との間のカップリング反応は、ペプチドが医療デバイスの表面で配向するように、抗菌ペプチド中の末端チオール基を必要とする。カップリングは、カップリング剤の使用、及び／又は連結剤の使用による直接反応により実施することができる。適切な非共有結合手段には、ビオチン／アビジン又はストレプトアビジン系のような、非常に特異的な相互作用を用いた、基質へのペプチドの生理化学的固定化が含まれるがこれらに限定されない。
【００４１】
Ａ．基質
ペプチドは、種々の異なる基質に塗布、吸収又はカップリングされる。適切な材料の具体例には、金属材料、セラミック、ポリマー、ファイバー、シリコン等の不活性材料、及びそれらの組み合わせが含まれる。
【００４２】
適切な金属材料には、金属及びチタンをベースとする合金（ニチノール、ニッケルチタン合金、熱記憶合金材料）、ステンレス鋼、タンタル、ニッケル−クロム、又はＥＬＧＩＬＯＹ（登録商標）及びＰＨＹＮＯＸ（登録商標）のようなコバルトークロムーニッケル合金を含む特定のコバルト合金が含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
適切なセラミック材料には、酸化チタン、酸化ハフニウム、酸化イリジウム、酸化クロム、酸化アルミニウム、及び酸化ジルコニウム等の遷移元素の酸化物、炭化物又は窒化物が含まれるが、これらに限定されない。シリカのようなケイ素をベースとする材料も用いられる。
【００４４】
適切なポリマー材料には、スチレン及び置換スチレン、エチレン、プロピレン、ポリ（ウレタン）、アクリレート及びメタクリレート、アクリルアミド及びメタクリルアミド、ポリエステル、ポリシロキサン、ポリエーテル、ポリ（オルトエステル）、ポリ（カーボネート）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）、それらのコポリマー、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
基質は、フィルム、粒子（ナノ粒子、微小粒子、又はミリメートル径ビーズ）、ファイバー（創傷包帯、包帯、ガーゼ、テープ、パッド、織物及び不織布スポンジを含むスポンジ、特に歯科用又は眼科手術用にデザインされたスポンジ）、センサー、ペースメーカーリード、カテーテル、ステント、コンタクトレンズ、骨インプラント（人工股関節、ピン、リベット、プレート、骨セメント等）、又は組織再生又は細胞培養デバイス、又は身体内又は身体と接触して用いられる医療デバイスの形態、又は形態の一部であってもよい。
【００４６】
１．有効表面積
基質の化学組成に加え、ペプチド結合に利用できる表面積を最大にするために、基質表面のマイクロ及びナノ構造が重要である。金属及びセラミック基質について、表面積の増加は、粗面処理、例えば、プラズマエッチング等のランダムプロセスによって実現することができる。また、フォトリソグラフィーを用いた、制御されたナノパターニングによって表面を改変することができる。また、ポリマー基質は、金属及びセラミック基質と同様に粗面処理することができる。更に、ペプチド結合のために利用できるポリマー基質上の表面積は、ポリマー自身の形態を調節することによって増加することができる。このアプローチの具体例には、ポリマーブラシ、デンドリマーポリマー、自己組織化ブロックコポリマー、及び形状記憶ポリマーが含まれる。
【００４７】
Ｂ．ペプチド
基質に固定化された場合に抗菌特性を示すあらゆるペプチドを、本明細書に開示される組成物及び方法において用いることができる。固定化された場合、全てのペプチドが活性を有するわけではないため、固定化後に活性について確認することが必要である。固定化した場合に抗菌活性を示すペプチドを製造する方法及びシステムは、Ｓｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓらに対する米国特許出願第２００６／００３５２８１号に開示されている。例えば、パターンＱ．ＥＡＧ．Ｌ．Ｋ．Ｋ．（配列番号１）（「．」はワイルドカードであり、パターンの位置におけるあらゆるアミノ酸で十分である）は９０％超のセクロピン（昆虫で一般的なＡｍＰ）に存在する。抗菌活性を示すペプチドのライブラリーを作成するために、ＴＥＩＲＥＳＩＡＳ等の計算ツールを用いることができる。ペプチドは、好ましくは天然のタンパク質と限られた相同性を有するが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、及びＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓを含む数種の細菌に対する強い静菌活性を有している。ペプチドは、Ｆｍｏｃ化学のような通常の方法を用いて合成することができる。いったん製造されると、設計されたタンパク質及びペプチドは実験的に評価され、必要であれば、当業者に公知の従来の方法を用いて構造、機能及び安定性について試験される。適切なペプチドは、Ｗａｎｇ，Ｚ ａｎｄ Ｇ Ｗａｎｇ，ＡＰＤ：ｔｈｅ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，Ｖｏｌ．３２，Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ Ｄ５９０−Ｄ５９２に開示されており、セクロピン−メリチンハイブリッド（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬ−アミド化）（配列番号２）、セクロピンＰ１、テンポリンＡ、Ｄ２８、Ｄ５１、デルマセプチン、ＲＩＰ、及びそれらの組み合わせが含まれるが、それらに限定されない。
【００４８】
抗菌活性を示すペプチド模倣物を用いてもよい。本明細書で用いる場合、ペプチド模倣物は、ペプチド構造を模倣する分子を意味する。ペプチド模倣物は、両親媒性のような、親構造、ポリペプチドに類似する一般的特徴を有する。このようなペプチド模倣物質の例は、Ｍｏｏｒｅら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０１（１２），３８９３−４０１２（２００１）に開示されている。ペプチド模倣物質は、以下のカテゴリー、すなわち、α−ペプチド、β−ペプチド、γ−ペプチド、及びδ−ペプチドに分類することができる。これらのペプチドのコポリマーを用いることもできる。
【００４９】
α−ペプチドペプチド模倣物には、Ｎ，Ｎ’−結合オリゴ尿素、オリゴピロリノン、オキサゾリジン−２−オン、アザチド及びアザペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
β−ペプチドの具体例には、β−ペプチドフォルダマー（ｆｏｌｄａｍｅｒ）、α−アミノオキシ酸、イオウ含有β−ペプチドアナログ、及びヒドラジノペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００５１】
γ−ペプチドの具体例には、γ−ペプチドフォルダマー、オリゴ尿素、オリゴカルバメート、及びホスホジエステルが含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
δ−ペプチドの具体例には、ピラノースをベースとするカルボペプトイド及びフラノースをベースとするカルボペプトイドのような、アルケンをベースとするδ−アミノ酸及びペプトイドが含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
ペプチド模倣物の他のクラスには、らせん又はシートコンフォメーションを採用し得る骨格を有するオリゴマーが含まれる。このような化合物の具体例には、ビピリジンセグメントを利用する骨格を有する化合物、疎溶媒性相互作用を利用する骨格を有する化合物、側鎖相互作用を利用する骨格を有する化合物、水素結合相互作用を利用する骨格を有する化合物、及び金属配位を利用する骨格を有する化合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００５４】
ビピリジンセグメントを利用する骨格を含む化合物の具体例には、オリゴ（ピリジン−ピリミジン）、ヒドラザルリンカーを有するオリゴ（ピリジン−ピリミジン）及びピリジン−ピリダジンが含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
疎溶媒性相互作用を利用する骨格を含む化合物の具体例には、オリゴグアニジン、１，４，５，８−ナフタレン−テトラカルボキシルジイミド環及び１，５−ジアルコキシナフタレン環のようなエダマー（共有結合サブユニットの芳香族電子供与体−受容体相互作用のスタック（ｓｔａｃｋｉｎｇ）特性を利用する構造）、及び置換Ｎ−ベンジルフェニルピリジニウムシクロファンのようなシクロファンが含まれるが、これらに限定されない。
【００５６】
側鎖相互作用を利用する骨格を含む化合物の具体例には、キラルなｐ−フェニル−オキサゾリン側鎖を有するオリゴチオフェンのようなオリゴチオフェン、及びオリゴ（ｍ−フェニレンのエチレン）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
水素結合相互作用を利用する骨格を含む化合物の具体例には、オリゴ（アシル化２，２’−ビピリジン−３，３’−ジアミン）及びオリゴ（２，５−ビス［２−アミノフェニル］ピラジン）のような芳香族アミド骨格、シアヌレートによって鋳型を形成するジアミノピリジン骨格、イソフタル酸によって鋳型を形成するフェニレン−ピリジン−ピリミジンエチレン骨格が含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
金属配位を利用する骨格を含む化合物の具体例には、亜鉛ビリノン、Ｃｏ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｐｄ（ＩＩ）、Ｃｒ（ＩＩＩ）、又はＹ（ＩＩＩ）と錯体形成したオリゴピリジン、金属配位したシアノ基を含むオリゴ（ｍ−フェニレンエチニレン）及びヘキサピリンが含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
一実施形態において、ペプチドは、抗菌ペプチドＤ２８（ＦＬＧＶＶＦＫＬＡＳＫＶＦＰＡＶＦＧＫＶ）（配列番号３）及び／又はＤ５１（ＦＬＦＲＶＡＳＫＶＦＰＡＬＩＧＫＦＫＫＫ）（配列番号４）である。他の実施形態において、ペプチドは、コーティングからゆっくりと放出されるか、バイオフィルム−阻害活性を有効にする方法で共有結合しているＲＮＡ−ＩＩＩ阻害ペプチド（ＲＩＰ）のような集団感知阻害剤である。更に他の実施形態において、ペプチドは、１種以上のＡｍＰ及び／又はＲＩＰの組み合わせである。
【００６０】
ペプチドは、後述するように、溶液、懸濁液又は固定化されて提供され得る。ペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を延ばし、細網内皮系（ＲＥＳ）による取り込みを阻害するために、例えば、市販されている試薬及び方法を用いたペグ化により化学的に改変してもよい。また、ペプチドは、１種以上のタンパク質、脂質、又は化合物とカップリングすることもできる。
【００６１】
基質とカップリングした場合、抗菌ペプチドは活性であるべきである。好ましくは、ペプチドの配向性及び連結の特性は、ペプチド配列及び密度についての抗菌活性を最大にするために設計される。ペプチドは、ペプチドの活性領域が、細菌、ウイルス及び／又は真菌と相互作用することができるように配向されるべきである。例えば、ペプチドは、暴露によって、ペプチドの活性末端が細菌、ウイルス、及び／又は真菌と相互作用することができるように配向するための特定の位置にシステイン残基が位置するように、設計することができる。
【００６２】
組成物は高活性であり、広い抗菌スペクトル活性を示し、実質的に非溶血性である。組成物は、好ましくは抗汚損性であり、すなわち、組成物は、抗菌ペプチドの効果を低下することのできるタンパク質の付着を阻害する。これは、基質にペプチドをカップリングするための抗汚損特性を有するカップリング剤又は連結剤の使用によって達成することができる。また、好ましくは、組成物は、表面が、将来の感染を治療するのに再使用可能であるように、殺傷時に基質から細菌を放出すべきである。
【００６３】
Ｃ．係留分子、リンカー及びスペーサー
係留分子、リンカー及びスペーサーは、基質へのペプチドの結合、及び／又は基質にコーティングされたポリマーフィルムへのペプチドの結合の両方に利用することができる。係留分子の組成は、基質、又は基質に共有結合した又はコーティングしたポリマーの表面化学に依存して変化し得る。表面と接触する細菌とのペプチドの相互作用を最適化し、表面に対する抗汚損特性を最大にするために、係留分子の長さと組成は変化し得る。また、生物学的活性を有するために表面に存在する場合、組成は、ペプチドが正しい配向性を保持するように選択されなければならない。好ましくは、係留分子は非滲出性表面を形成すべきである。特定の係留分子は、種々のカップリング法について以下に議論される。
【００６４】
Ｄ．親水性ポリマー
抗汚損表面の製造は、医療デバイス及び移植片等の医用材料の開発における重要な要素である。このようなコーティングは、移植片と生理液との相互作用を制限する。異なるアプローチは、表面に共有結合した親水性係留分子、親水性ポリマー又はヒドロゲルの使用を含む、非汚損特性を有する表面を形成するために適用し得る。
【００６５】
１．親水性の係留分子
一実施形態において、係留分子は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）等の親水性ポリマーを含む。図１は、ＰＥＧを通して基質表面に固定化されたペプチドを示す。ポリマー中の繰り返し単位の数は４〜１００、最も好ましくは４〜１６で変化し得る。ＰＥＧは、非汚損性表面を生成することを証明する（Ｍｉｃｈｅｌら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２００５，２１，１２３２７−１２３３２）。最適化された係留分子の長さ及び組成は、基質組成及び係留した特定のペプチドの両方の関数である。多腕のＰＥＧは、抗菌ペプチド固定化のための官能基の数を増加するために用いることができる。
他の実施形態において、係留分子は、デキストラン、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、デンプン、セルロース、イヌリン、アルギン酸塩、アガロース、キサンタンのような多糖類である。好ましい実施形態において、多糖類はデキストランである。デキストランの表面コーティングは、タンパク質及び細胞の接着を制限することができる。デキストラン単層が銀表面に対するＢＳＡの吸着を減少するのに非常に効果的であり、この効果がデキストランによる表面の被覆に依存し、単層の厚みには依存しないことが証明されている（Ｆｒａｚｉｅｒら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０００，２１，９５７−９６６）。更に、Ｏｅｓｔｅｒｂｅｒｇら（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．１９９５，２９，７４１−７４７）は、アミノ化ポリスチレン表面に結合したデキストランがフィブリノーゲンの接着を減少し、ＰＥＧよりも効果的であることを示した。タンパク質吸着が高分子層の厚みに非感受性のようである。デキストランは、抗菌ペプチドの固定化のために多くのヒドロキシル基を利用できるため、係留分子としてＰＥＧよりも好ましい。
【００６６】
２．別個の固定化親水性ポリマー
非汚損表面を生成するため、ペプチドに係留されていない親水性ポリマーを基質に固定化することができる。図２は、基質表面に共有結合したＰＥＧを示す。この場合においては、親水性ポリマーは係留されないが、非汚損剤として作用する。先のセクションに記載された親水性ポリマーはこの目的のために用いることができる。
【００６７】
３．ヒドロゲル
ヒドロゲルは、基質上において非汚損コーティングとして用いることができ、又は基質自身として用いることができる。図３は、基質にコーティングされたヒドロゲルに固定化されたＡｍＰを示す。好ましい実施形態において、抗菌ペプチドは、ヒドロゲルの表面に固定化することができる。ヒドロゲルは三次元であり、親水性であり、大量の水又は体液を吸収することができるポリマー性ネットワークである（Ｐｅｐｐａｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２０００，５０，２７−４６）。これらのネットワークはホモポリマー又はコポリマーからなり、絡み合い又は結晶のような化学的架橋又は物理的架橋の存在のために不溶性である。ヒドロゲルは、側基の性質に基づき、中性又はイオン性として分類することができる。更に、それらは、非晶質、半結晶性、水素結合構造、超分子構造及びハイドロコロイド凝集体であり得る（Ｐｅｐｐａｓ，Ｎ．Ａ．Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．Ｉｎ：Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｓｃｉｅｎｃｅ：ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ；Ｒａｔｎｅｒ，Ｂ．Ｄ．，Ｈｏｆｆｍａｎ，Ａ．Ｓ．，Ｓｃｈｏｅｎ，Ｆ．Ｊ．，Ｌｅｍｏｎｓ，Ｊ．Ｅ．，Ｅｄｓ；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６，ｐｐ．６０−６４；Ｐｅｐｐａｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２０００，５０，２７−４６）。ヒドロゲルは、合成又は天然のモノマー又はポリマーから製造することができる。
【００６８】
医療デバイスは、噴霧、浸漬及びはけ塗り等の種々の技術を用いてヒドロゲルでコーティングすることができる。少量のゲル溶液（例えば、マイクロリットルの範囲）が、１ｃｍ２の表面積を処理するために用いられる。単位面積あたりのゲル溶液の量、及び対応するコーティング溶液の濃度及び塗布速度は、あらゆる特定の用途について容易に決定することができる。
【００６９】
ヒドロゲルは、特に、ポリ（アクリル酸）及びその誘導体［例えば、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート（ｐＨＥＭＡ）］、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）及びそのコポリマー及びポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）等の合成ポリマーから製造することができる（Ｂｅｌｌ，ＣＬ．； Ｐｅｐｐａｓ，Ｎ．Ａ．Ａｄｖ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ，１９９５，１２２，１２５−１７５．；Ｐｅｐｐａｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２０００，５０，２７−４６；Ｌｅｅ，Ｋ．Ｙ．；Ｍｏｏｎｅｙ，Ｄ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００１，１０１，１８６９−１８７９．）。合成ポリマーから製造されたヒドロゲルは、生理的条件下で一般的に非分解性である。ヒドロゲルは、多糖類、タンパク質及びペプチドを含むが、これらに限定されない天然のポリマーからも製造することができる。これらのネットワークは、一般的に、化学又は酵素的手段によって生理的条件下で分解される。
【００７０】
一実施形態において、ヒドロゲルでは、関連するｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ条件下で非分解性である。安定なヒドロゲルコーティングは、中心静脈カテーテルコーティング、心臓弁、ペースメーカー及びステントコーティングを含む特定の用途において必要である。他の場合において、ヒドロゲルの分解は、組織工学構築物等において好ましいアプローチである。
好ましい実施形態において、ゲルはデキストランによって生成される。デキストランは、基本的に、数％のα−１，２、α−１，３、又はα−１，４−結合の側鎖を有するα−１，６−結合Ｄ−グルコピラノース残基からなる細菌の多糖類である。デキストランは、その生体適合性、低毒性、比較的低い費用、及び単純な改変のために生物医学的応用において広く用いられている。この多糖類は、血漿増量剤、末梢血流促進剤及び抗血栓溶解剤として５０年よりも長く臨床的に用いられてきた（Ｍｅｈｖａｒ，Ｒ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ ２０００，６９，１−２５）。更に、それは、主として血液循環における治療薬の寿命を延ばすために、薬剤及びタンパク質の送達のための高分子キャリアーとして用いられてきた。デキストランは、ゲルを製造するために、化学的又は酵素的手段を用いることによりビニル基で改変することができる（Ｆｅｒｒｅｉｒａら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２００２，２３，３９５７−３９６７）。
【００７１】
デキストランをベースとするヒドロゲルは、非汚損材料として考えることができる。
デキストランをベースとするヒドロゲルは、血管内皮、平滑筋細胞、及び線維芽細胞の付着を防止し（Ｍａｓｓｉａ，Ｓ．Ｐ．；Ｓｔａｒｋ，Ｊ．Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２００１，５６，３９０−３９９．Ｆｅｒｒｅｉｒａら、２００４，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．６８Ａ，５８４−５９６）、デキストラン表面はタンパク質の吸着を防止する（Ｏｅｓｔｅｒｂｅｒｇら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．１９９５，２９，７４１−７４７）。
【００７２】
Ｅ．ポリマー微細構造
前述のように、ＡｍＰの最大の可能な表面負荷は、基質表面上における微細構造の形成によって増加することができる。ヒドロゲルネットワークを含むポリマー基質について、この表面形態は、デンドリマー及びブラシコポリマーのような適切なポリマー構造デザインを通じて形成することができる。これの１つの具体例は、デンドリマーポリマーを係留した表面の成長である。アクリル酸メチル及びエチレンジアミンの反応を交互に実施することにより、表面に存在するアミンからポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーを成長させることができる（Ｎｇｕｙｅｎら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００６，２２，７８２５−７８３２）。効率的に加えられたデンドリマーのそれぞれの生成は、ペプチド付着に利用できる部位の数を２倍にする。更に、アミド化工程の後、合成が終了した時に、得られた材料は、ポリ（エチレングリコール）と同様、抗汚損ヒドロゲルとして振る舞うことのできるアミンが存在するポリマーである（Ｃｈａｍｐｍａｎら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００１，１７，１２２５−１２３３）。
【００７３】
ＡｍＰ表面負荷を増加するためにポリマー微細構造を調整することの他の具体例は、基質表面からのポリマーブラシの成長である。これらは基質の一端に係留し、基質から周囲の媒体に広がらないポリマー鎖である。このアプローチはペプチド付着のための多くの追加の部位を形成し、その数はブラシポリマーの分子量に依存する。１つのこのような系は、ポリ（アクリル酸メチル）（ＰＭＡ）のブラシ成長である。均一に中程度の分子量のＰＭＡの重合の後、材料を官能化することができ、直接的表面結合を通じて可能なＡｍＰの表面提示よりも５０〜１００倍のＡｍＰの表面提示を導く。アミド化ブラシの基質表面への共有結合の概略図を図４に示す。
【００７４】
Ｆ．他の活性剤
抗菌ペプチドに加え、タンパク質、又は低分子量の有機又は無機分子であってもよい１種以上の治療薬、予防薬又は診断薬を基質にカップリングしてもよい。一実施形態において、基質には、固定化生物活性ペプチドと関係なく放出される生理活性剤が含まれる。
【００７５】
例えば、基質上に、封入、瘢痕、及び／又は細胞増殖を阻害する薬剤を、抗菌ペプチドと一緒に固定化してもよい。生物活性分子の他の具体例には、細胞増殖抑制剤、細胞分裂停止又は細胞傷害性化学療法剤、抗菌剤、抗炎症剤、成長因子、及び細胞接着ペプチドが含まれる。
【００７６】
他の実施形態において、薬剤が基質からゆっくりと放出されるように、例えば、医療デバイスの移植又は挿入部位に、加水分解性の結合を用いて１種以上の薬剤が基質に係留される。
【００７７】
また、１種以上の薬剤は表面に非共有結合する。例えば、１種以上の薬剤は、ヒドロゲル材料中に取り込まれ、拡散、及び／又はヒドロゲル材料の分解によって放出される。
【００７８】
ＩＩ．抗菌ペプチドの固定化方法
標的細胞内へ拡散しなければならない従来の抗生物質と異なり、ＡｍＰは、基質に共有結合又は非共有結合で係留した時に抗菌活性を保持し得る。固定化した時、細菌と相互作用することができるＡｍＰの一部は、表面の抗菌活性に影響を及ぼし得る。これは、ペプチドの配向性が、ペプチドの比活性を高めるために重要である主な理由である。
【００７９】
後述する多数の方法が、種々の表面上のＡｍＰ係留のために必要な官能部分を生成するために用いられ得る。結合する基の密度は、結合するペプチドの密度に影響を及ぼす。分岐、分岐の長さ、分岐の化学的性質を変化し得る係留分子は、殺菌性を有する様式でＡｍＰが存在する場合に、タンパク質の付着を減少するか、ＡｍＰの負荷を増加させるために用いることができる。
【００８０】
結合密度に加え、ペプチドの配向性は、固定化ＡｍＰの生物活性において重要な因子である。配向したペプチドの結合は、多くの合成アプローチによって実現することができる。１つのアプローチは、ペプチド中に存在しない化学的部分を含むアミノ酸残基をペプチド中に取り込むことである。チオール基を含むシステインは一例である。他のシステイン残基がペプチド中に存在しない場合、この残基、及びその機能的部分の付加は、ペプチド配列中で化学的にユニークな部位を形成すると思われる。次いで、表面におけるペプチドの配向した固定化についての適切なカップリング化学により、この部位を利用することができる。約７〜約８．５のｐＨで、遊離のチオール基を脱プロトン化し、高いｐＨで脱プロトン化されるアミノ酸のアミン基と比べて強い求核試薬を形成する。従って、反応条件ｐＨを調節することにより、システイン残基のチオール基を、基質又は係留分子に選択的にカップリングすることができる。
【００８１】
この追加の残基は、最も好ましくは、ペプチドのＣ−末端又はＮ−末端のいずれかに含まれ、ペプチド配列のいずれかの部位にユニークな残基が存在する場合、配向した結合を達成することもできるであろうことに注目すべきである。結合の所望の部位において一緒に配置される同じ残基の複数のコピーは、このような単一の残基として、同一の「配向した結合」に影響を及ぼすことは当業者にも明らかである。ＡｍＰの配向する結合についての一つのアプローチには、ペプチドの表面への係留における選択的使用のための、ペプチドのＮ又はＣ−末端のいずれかの、ペプチド中に天然には存在しない反応部位を用いた官能化（例えば、エポキシド環）、及び／又は所望の結合の部位における保護を除く、所定の部分の全てのコピーの保護（Ｆｍｏｃ化学のような適切な保護基を用いた）、それに続く、結合のための未保護基の反応、及び脱保護が含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
Ａ．基質へのペプチドのカップリングのための共有結合手順
１．基質表面へのペプチドの直接結合
カップリング剤又は係留分子を用いない、ペプチドの基質へのカップリング
一実施形態において、ＡｍＰは、基質表面に直接カップリングされる。基質にＡｍＰをカップリングするために用いられる化学は、基質表面の化学組成に依存する。基質表面は当該技術分野で公知の種々の方法によって処理され、所望の官能基を導入することができる。表面改変は、プラズマ、コロナ放電、火炎処理、ＵＶ／オゾン、ＵＶ及オゾンのみが含まれるが、これらに限定されない気相技術、アミノ分解、加水分解、還元、塩化トシル及びそれに続く化学作用を用いたアルコール鎖末端の活性化、化学的イニシエーションによるビニル化合物のグラフト共重合、及びビニルモノマーの存在下におけるイオンビーム処理が含まれるが、これらに限定されない湿式化学により実現することができる。例えば、基質表面は、プラズマ、マイクロ波及び／又はコロナ源で処理され、ペプチドにおける官能基と反応することができる、ヒドロキシ、アミン、及び／又はカルボン酸基を基質表面に導入することができる。
【００８３】
抗菌ペプチドは、配向させる方法において、それらのチオール基を直接に基質に固定化することができる。これは、種々の方法によって実現することができる。最初に、抗菌ペプチド中のチオール基は、共役付加反応（マイケル型付加反応とも呼ばれる）によって、医療デバイスの表面に存在する、マレイミド（Ｓｃｈｅｌｔｅら、Ｂｉｏｃｏｎ．Ｃｈｅｍ．，１１，１１８−１２３（２０００））、ビニルスルホン（Ｍａｓｒｉら、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．，１９８８，７，４９−５４；Ｍｏｒｐｕｒｇｏら、Ｂｉｏｃｏｎ．Ｃｈｅｍ．，７，３６３−３６８（１９９６））、アクリルアミド（Ｒｏｍａｎｏｗｓｋａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，２４２，９０−１０１（１９９４））及びアクリレート（Ｌｕｔｏｌｆら、Ｂｉｏｃｏｎ．Ｃｈｅｍ．，１２，１０５１−１０５６（２００１））のような、基質上の不飽和基と直接反応することができる。この反応は、生理的温度及び生理的ｐＨ（ｐＨ７．４）で実施することができ、生物学的アミンに対して選択的であると思われる（Ｅｌｂｅｒｔら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２００１，７６，１１−２５；Ｌｕｔｏｌｆら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，４，７１３−７２２（２００３））。第二に、抗菌ペプチド中のチオール基は、基質表面のエポキシド官能基と反応することができる。チオール基はエポキシドと高い反応性を示す求核試薬であり、効率的なカップリングのためには７．５〜８．５の範囲のｐＨのバッファー系を必要とする。
【００８４】
他の実施形態において、抗菌ペプチドは、ペプチド中に存在するあらゆる官能基（例えば、アミン、カルボニル、カルボキシル、アルデヒド、アルコール）によってデバイス表面に共有結合し得る。例えば、抗菌ペプチドにおける、１個以上のアミン又はアルコール又はチオール基は、イソチオシアネート、アシルアジ化物、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、アルデヒド、エポキシド、無水物、ラクトン、又はデバイス表面に導入された他の官能基と直接反応し得る。ペプチドのアミン基と器具のアルデヒド基との間に形成されたシッフ塩基は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等の試薬により還元され、加水分解に安定なアミノ結合を形成することができる（Ｆｅｒｒｅｉｒａら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ２００３，２１，１８９−１９９）。また、抗菌ペプチドの遊離のアミノ又はヒドロキシル基は、エポキシド官能基を含む表面と結合する。エポキシド官能基とヒドロキシルとの反応は、高いｐＨ条件、通常は１１〜１２のｐＨ範囲が必要である。アミン求核試薬は、更に中程度のアルカリ性ｐＨ値で反応し、通常は少なくともｐＨ９のバッファー環境を必要とする。
【００８５】
カップリング剤によるペプチドの基質へのカップリング
抗菌ペプチドは、基質表面の基を活性化する試薬又は反応の使用により基質に直接カップリングすることができ、抗菌ペプチドは、カップリング剤の導入なしでペプチド又は基質の官能基をそれぞれ反応性にする。一般に、抗菌ペプチドの固定化は配向性でない。例えば、カルボジイミドは、カルボキシレートとアミンとの間のアミド結合、及びホスフェートとアミンとの間のホスホラミデート結合の形成を媒介する。カルボジイミドの具体例は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノ−エチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、及びＮ，Ｎ’−カルボジイミダゾール（ＣＤＩ）である。Ｎ−エチル−３−フェニルイソキサゾリウム−３’−スルホネート（ウッドワード試薬）は、カルボキシレートとアミンとの縮合によるアミド結合の形成を媒介する。また、ＣＤＩはアミノ基をヒドロキシル基にカップリングさせるために用いることができる。
【００８６】
一実施形態において、末端カルボキシル基を含む器具の表面は、ｐＨ５．０のバッファー中で１５〜３０分間、ＥＤＣにより活性化され、次いで、活性化された表面は、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中、室温で２〜３時間、ペプチドと反応する。
【００８７】
係留分子を用いたペプチドの基質へのカップリング
ペプチドの基質へのカップリングは、係留分子を用いて実施することもできる。係留分子は、表面アミン及びペプチド−スルフヒドリル基と反応する末端官能基を有する。この場合、抗菌ペプチドは、配向する方法で、表面に固定化される。これらの係留分子は、可変する数の原子を含んでいてもよい。係留分子の具体例には、Ｎ−スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ、３−及び７−原子スペーサー）、長鎖−ＳＰＤＰ（１２−原子スペーサー）、（スクシニミジルオキシカルボニル−α−メチル−２−（２−ピリジルジチオ）トルエン）（ＳＭＰＴ、８−原子スペーサー）、スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）（ＳＭＣＣ、１１−原子スペーサー）及びスルホスクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、（スルホ−ＳＭＣＣ、１１−原子スペーサー）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ、９−原子スペーサー）Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ、８−原子スペーサー）、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ、８−原子スペーサー）、スクシニミジル６−（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノエート（ＳＩＡＸ、９−原子スペーサー）、スクシニミジル６−（６−（（（４−ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ）ヘキサノエート（ＳＩＡＸＸ、１６−原子スペーサー）、及びｐ−ニトロフェニルヨードアセテート（ＮＰＩＡ、２−原子スペーサー）が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、異なる原子数の他のカップリング剤も用いられることを理解するだろう。好ましい実施形態において、スルホ−ＧＭＢＳのスクシンイミド基は基質表面のアミン基と反応する。次の工程において、スルホ−ＧＭＢＳの末端マレイミド基は、ペプチドのスルフヒドリル基と反応する。スルホ−ＧＭＢＳの構造を図５に示す。
【００８８】
更に、スペーサー分子は係留分子に取り込まれ、末端における反応性官能基間の距離を広げ得る。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をスルホ−ＧＭＢＳに取り込むことができる。ＰＥＧ等の親水性分子は、共有結合した時に表面の生物汚損（ｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ）を減少させることが証明されている。
【００８９】
特定の実施形態において、抗菌ペプチドの遊離のアミン基は、反応性ヒドロキシル基を含む表面に、配向性のない様式で結合する。具体例として、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）は、イミダゾールカルバメートを同時に形成して表面のヒドロキシル基を活性化することができる。この反応は加水分解によるＣＤＩの急速な分解のため、１％未満の水の非水性環境（例えば、アセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ））において実施しなければならない。最終的に、活性化された表面は、７〜１０のｐＨのバッファー中で可溶化されるアミン含有ペプチドと反応することができる（Ｆｅｒｒｅｉｒａら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ２００３，２１，１８９−１９９）。
【００９０】
他の実施形態において、抗菌ペプチドの遊離のアミン基は、反応性アミン基を含む表面と結合する。また、この化学を用いて、ペプチドの配向性における調節はされていない。ジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）（ＤＳＰ、８−原子スペーサー）、ジスクシニミジルスベレート（ＤＳＳ、８−原子スペーサー）、グルタルアルデヒド（４−原子スペーサー）、ビス［２−（スクシニミジルオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ、９−原子スペーサー）、及び当業者によって認識される他の物質等の係留分子を、この目的のために用いることができる。
【００９１】
他の実施形態において、係留分子は、基質及びペプチドにおける官能基と反応するそれぞれの末端において、同一の官能基を含んでいてもよい。ホモ二官能性の係留分子は、最初に水溶液（例えばｐＨ７．４のＰＢＳ）中でチオール表面と反応し、次いで、第二段階でペプチドは係留分子とカップリングする。ホモ二官能性スルフヒドリル−反応性係留分子の例には、１，４−ジ−［３’，２’−ピリジルジチオ）プロピオン−アミド］ブタン（ＤＰＤＰＢ、１６−原子スペーサー）、及びビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ、１４−原子スペーサー）が含まれるが、これらに限定されない。この特定の化学は、ペプチドの配向性の調節を可能にする。
【００９２】
活性のために用いることのできる係留分子の濃度の選択は、所定の用途のために選択された容量、因子及び基質の関数として変化し、当業者によって理解されるだろう。
【００９３】
ペプチドの固定化に続き、表面を水又はリン酸緩衝生理食塩水又は他のバッファーで洗浄し、未反応の抗菌ペプチド及び溶媒を除去し得る。バッファーは、共有結合で固定化されていない抗菌ペプチドの除去を促進するため、少量の界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標））を含んでいてもよい。ペプチドの除去は、ＨＰＬＣまたはペプチド及びタンパク質の定量に用いられる市販のキット（例えば、ＳｉｇｍａのＢＣＡキット）によって監視することができる。
【００９４】
２．基質へのポリマーのグラフト化
他の実施形態において、ポリマーは基質にグラフト化され、ＡｍＰがポリマーに共有結合によりカップリングされる。ポリマーは、Ａｍｐを基質にカップリングするために用いられる所望の官能基をベースにして選択される。ポリマーにおける適切な官能基の具体例には、アミン、カルボン酸、エポキシド、及びアルデヒドが含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態において、所望の官能基を含む反応性モノマーは、化学蒸着法法（ＣＶＤ）のような技術を用いて基質に重合することができる。
【００９５】
溶液中、又は基質表面からのポリマーの成長
ポリマーは、当該技術分野において公知の種々の技術を用いて基質にグラフト化することができる。例えば、ポリマーは溶液中で成長し、次いで、基質表面にカップリングすることができる。また、ポリマーは基質表面から成長することができる。ポリマーは、フリーラジカル重合、アニオン重合、カチオン重合、及び酵素的重合が含まれるが、これらに限定されない種々の重合技術を用いて、溶液中で、又は基質から成長することができる。基質から成長するポリマーは、デンドリマー合成を用いて製造することができる。フリーラジカル重合の具体例には、自発的なＵＶ重合；１型又は２型ＵＶ開始重合；ＡＩＢＮ等の熱開始剤を用いる熱開始重合；又はレドックス対（ｒｅｄｏｘ−ｐａｉｒ）開始重合が含まれる。基質表面から成長するポリマーの場合には、表面は、通常、重合に用いられるのと同一の部分（例えば、フリーラジカル重合についてのビニル基）で官能化される。
【００９６】
適切なポリマーには、ポリ（ラクトン）、ポリ（無水物）、ポリ（ウレタン）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（エーテル）、ポリ（エステル）、ポリ（ホスファジン）、ポリ（エーテルエステル）、ポリ（アミノ酸）、合成ポリ（アミノ酸）、ポリ（カーボネート）、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）、ポリ多糖類、セルロースポリマー、ゼイン、改変ゼイン、カゼイン、ゼラチン、グルテン、血清アルブミン、コラーゲン、アクチン、フェトプロテイン、グロブリン、マクログロブリン、コヘシン、ラミニン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、オステオカルシン、オステオポンチン、オステオプロテゲリンのようなタンパク質、及びそれらの混合物及びコポリマーが含まれるが、これらに限定されない。
【００９７】
一実施形態において、Ｃにおいて単一の結合点を有する、システインを取り込んだセクロピン−メリチンハイブリッドペプチド（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＣ−ＮＨ２）（配列番号５）、ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＣ−アミド（配列番号５）が、基質にカップリングしたアミド化ポリマーブラシ上に固定化された。ポリマーブラシは、ビニル基を提示する基質の存在下、ブラシモノマー、アミノエチルメタクリレートを重合することによって製造された。ペプチドは、スルホ−ＧＭＢＳ化学を用いて固定化された。
【００９８】
また、ポリマーブラシは、カテーテルを製造するために通常に用いられるシリコーン又はポリウレタン等の材料に結合することができる。前述したように、ポリマーブラシの成長は、通常、基質上のビニル部分を必要とする。シリコーン基質表面にビニル基を導入するために、シリコーンを、純粋な酸素プラズマで処理し、次いでエタノールに浸漬し、事実上純粋なヒドロキシルである表面を形成することができる。ヒドロキシル化に次いで、表面を、気化した、トリクロロビニルシラン又はトリメトキシ−ビニルシランのようなビニルシランに暴露することができる。次いで、ビニル化された基質をブラシポリマーと結合するために用いることができる。ＣＯ２、Ｏ２、及びアンモニアを用いたプラズマ処理を用いた類似の方法で、ポリウレタン基質を処理することができる。得られたヒドロキシル及び／又はアミン基をアクリル化し、基質上にビニル部分を形成し、次いで、ポリマーブラシを係留することができる。通常、ポリマーブラシは、直接表面官能化により可能なものよりも、１０〜１００倍高い表面濃度で、アミン等の反応性官能基を有する。ポリマーブラシの向上した柔軟性も、生物汚損を減少するのに役立つ。
【００９９】
化学蒸着法
モノマーは、化学蒸着法等の技術を用いて基質上に重合化することができる。化学蒸着法（ＣＶＤ）は、気相から薄膜を、基質上に直接蒸着する方法である。１００ｎｍ未満の厚みを有するフィルムは、あらゆるサイズ、形状、組成及び複雑さの基質に適用することができる。プラズマ／マイクロ波ＣＶＤ、熱フィラメントＣＶＤ、開始ＣＶＤ、光開始ＣＶＤを用いてポリマーを蒸着することができる。一実施形態において、重合可能なモノマー及び遊離のラジカル開始剤を、熱フィラメントを含むＣＶＤ反応チャンバーに同時に供給し、調節された化学のポリマー薄膜を形成する。チャンバー内で、ラジカル開始剤は、抵抗加熱フィラメントによって活性化される。得られたラジカルは、基質表面に吸収されるモノマー分子と反応してポリマー薄膜を形成する。ＣＶＤは、高い高次構造を有する、全ての形状、及びほとんど全ての組成の基質をコーティングするために用いることができる。開始剤を活性化するのに必要なフィラメント温度は、モノマー種の損傷を回避し、得られるフィルム中の反応性官能基の保持を可能にするのに十分なほど温和である。更に、基質温度は、フィルム特性、並びに広い範囲の基質への蒸着の更なる調整を独立して調節することができる。ティシュペーパーのようなデリケートな基質をコーティングするのに非常に穏和な基質条件（例えば、基質を室温に維持して）でＣＶＤコーティングを蒸着することができる。重合可能なモノマーは、ポリマーをペプチドにカップリングするのに用いられる所望の官能基に基づいて選択される。
【０１００】
コーティングされた基質は、シリコンウェハ等の基質をＣＶＤ反応器中に配置することにより製造される。ＧＭＡ等の官能化されたモノマー、及びｔｅｒｔ−アミルパーオキシド等の遊離のラジカル開始剤を反応器中に導入する。官能化されたモノマー及び開始剤の流速、並びにフィラメントの温度及び基質の温度は、薄膜の所望の厚みを実現するために独立して調節することができる。モノマーの流れは、一般に１〜５０ｓｃｃｍであり、初期の流れは、モノマーに対して１：１〜１：２０である。均一な蒸着を確実にするために、蒸着チャンバーを出る前に１０％以下のモノマーが反応するように、反応器に対する全ての流れを調節すべきである。開始剤は、１８０〜６５０℃の温度でフィラメントによって分解される。５〜２００Ｗの電力で、プラズマ又はパルス状プラズマによって開始することができる。１〜２００ｎｍ／分のフィルム蒸着が証明されるが、通常、速度は５〜５０ｎｍ／分である。これら、及び他のモノマーのＣＶＤ蒸着のために用いることのできる開始種の他の具体例には、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド、アゾ−ｔ−ブタン、及び、真空反応器中で＞０．１ｓｃｃｍの流速を確立することのできるような蒸気圧を有する他のアゾ又はペルオキシド化合物が含まれるが、これらに限定されない。蒸着後、蒸着フィルムの化学組成は、ＩＲ分光法を用いて証明することができる。係留されるＡｍＰの最終的な密度は、モノマー上の官能基の表面密度を変化させることによって調節することができる。例えば、エポキシ官能基を含まないスチレンはＧＭＡで漸増され、結合部位で所望の密度を有するフィルムを製造することができる。
【０１０１】
適切な官能化モノマーには、反応性エポキシド基、アミノエチルメタクリレート、及びエチレンイミンを含むグリシジルメタクリレート（「ＧＭＡ」）が含まれるが、これに限定されない。
【０１０２】
ペプチドの結合
感受性のある基質を損傷しない条件下における、ＣＶＤコーティングした表面へのペプチドの係留方法は、Ｍｕｒｔｈｙら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２０，４７７４−４７７６（２００４）に開示されている。
【０１０３】
ポリマーフィルムの蒸着に続き、ペプチドの結合のために、ポリマー上の官能基を活性化する。例えば、密封したガラス瓶中、エタノール中、６０℃で５時間、ｐＧＭＡ上のエポキシド基をヘキサメチレンジアミンと反応させ、遊離のアミンを生成することができる。遊離のアミンをＡＭＰ上のカルボン酸基と反応させ、ＡＭＰを基質に固定することができる。一実施形態において、ＡＭＰのカルボン酸基を基質の遊離のアミンと結合させるために、市販のグルタルアルデヒドキット（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）が用いられる。係留したＡＭＰの柔軟性は、共有結合した係留分子の長さを変えることによって最適化することができる。グルタルアルデヒド係留分子の場合においては、鎖は１２炭素原子長である（遊離のアミン及びカルボキシル基を含む）。更なる柔軟性は、例えば、機能的配列及びグルタミン酸係留基の間のペプチドの係留末端へのグリシン残基の付加により、供給することができる。所望の柔軟性を達成するために、０、４、８及び１２アミノ酸長のグリシンバッファーを加えることができる。ペプチドの表面密度は、安定な蛍光色素でペプチドを標識し、蛍光顕微鏡を用いて表面を評価することによりマッピングすることができる。
【０１０４】
ペプチドは、基質表面にペプチドを直接カップリングするための前述した、同一の化学を用いて、溶液中で成長したポリマーにカップリングするか、基質にカップリングし、又は基質表面から成長させることができる。
【０１０５】
Ｂ．ペプチドを基質にカップリングするための生理化学的方法
抗菌ペプチドは、基質又はデバイスに物理的に結合することができる。ペプチドを基質に固定化するための適切な生理化学的方法には、ビオチン／アビジン又はストレプトアビジン系のような非常に特異的な相互作用が含まれる。
【０１０６】
１．ビオチン／アビジン又はストレプトアビジン
ビオチン、及びその誘導体には、ＮＨＳ−ビオチン、ｓｕｌｆ−ＮＨＳ−ビオチン、１−ビオチンアミド−４−［４’−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキサミド］ブタン（ビオチン−ＢＭＣＣ）、Ｎ−ヨードアセチル−Ｎ−ビオチニルヘキシレンジアミン、シス−テトラヒドロ−２−オキソチエノ［３，４−ｄ］−イミダゾリン−４−吉草酸ヒドラジドが含まれるがこれらに限定されず、ペプチド中に存在するアミン（Ｈｏｆｍａｎｎら、ＰＮＡＳ１９７７，７４，２６９７−２７００；Ｇｒｅｔｃｈら、ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ．１９８７，１６３，２７０−２７７）、スルフヒドリル（Ｓｕｔｏｈら、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９８４，１７８，３２３−３３９）、カルボニル又はカルボキシル基（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９８４，８，２７３−２７７；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８６，４６，６４１−６４８）を通して抗菌ペプチドに共有結合的に取り込まれ得る。抗菌ペプチドのビオチン化は、デバイス表面で固定化された場合にその配向性を支持する。タンパク質アビジン及びストレプトアビジンとのビオチンの相互作用は、公知の非共有結合親和性の中で最も強い（Ｋａ＝１０１５Ｍ−１）。
【０１０７】
２．ポリヒスチジン−ニッケルキレートカップリング
安定した複合体は、三座のＮｉ２＋又はＮｉ２＋ニトリロ三酢酸が含まれるが、これらに限定されないキレート化ニッケルカチオンとのポリヒスチジンタグの反応によって形成することができる。一実施形態において、マトリクスは、三座のＮｉ２＋又はニトリロ三酢酸誘導体化生体分子との複合体を形成することができるポリヒスチジンタグリガンドと誘導体化することができる。
【０１０８】
３．サリチルヒドロキサム酸
サリチルヒドロキサム酸部分と結合し、それに続くペンダントフェニルボロン酸基を有する１種以上のペプチドとの結合／錯体形成するための基質の改変のために適した試薬は、以下に示す一般式：
【０１０９】
【化１】
（式中、Ｒ４はサリチルヒドロキサム酸分子とマトリクス材料との反応に適した、反応性の求電子性又は求核性部分であるか、又はレドックス法、例えば、ジスルフィド結合の形成において反応することのできる部分である）を有する。Ｒ２はＨ、アルキル、又はメチレン、又は電気陰性置換基を有するエチレン部分である。Ｒ１及びＲ３は、それぞれ独立してＨ又はヒドロキシであり、Ｚは、場合により長さにおいて０〜６炭素と同等である飽和又は不飽和鎖を含むスペーサー分子であり、少なくとも１個の中間体アミン又はジスルフィド部分を有する、長さにおいて６〜１８炭素と同等である非分岐又は分岐、飽和又は不飽和鎖、又は長さにおいて３〜１２炭素と同等であるポリエチレングリコール鎖であってもよい。一実施形態において、サリチルヒドロキサム酸リガンドは、因子サリチルヒドロキシルアミンヒドラジドを通して、表面に結合する。他の実施形態において、サリチルヒドロキサム酸リガンドは、サリチルヒドロキシルアミンＮ−ヒドロキシスクシンイミド（「ＮＨＳ」）エステル又はカルボン酸を有する表面と結合し得る。
【０１１０】
４．フェニルボロン酸
多くのものが当該技術分野において公知であるフェニルボロン酸試薬は、抗菌ペプチドに結合し、以下に示すような１種以上のペンダントフェニルボロン酸部分を有する複合体を提供することができる。
【０１１１】
【化２】
試薬には、長さにおいて６個以下の炭素と同等である脂肪族鎖、少なくともひとつの中間体アミド又はジスルフィドを有する、長さにおいて６〜１８個の炭素と同等である非分岐脂肪族鎖、又は長さにおいて３〜１２個の炭素と同等であるポリエチレンオキシド又はポリエチレングリコールのようなスペーサー分子を含む置換基が含まれる。ポリエチレンオキシド及びポリエチレングリコール等のスペーサー分子の使用は、水溶液中でのペプチドの高い移動度を可能にし得る。また、ペプチドには、スペーサー分子の不存在下で、ペプチドをフェニルボロン酸種に結合するために用いられる反応部位の一部が含まれる。フェニルボロン酸種は、芳香族環の周囲の種々の位置に結合している１、２又は３個のボロン酸基を含むことができる。
【０１１２】
ＩＩＩ．使用方法
前述した材料は、コーティングとして抗菌ペプチドが適用された医療デバイスの形態であってもよい。適切な器具には、手術用、医療用又は歯科用器具、眼科用器具、創傷治療器具（絆創膏、縫合糸、細胞足場、骨セメント、粒子）、歯列矯正器具、インプラント、足場、縫合材料、弁、ペースメーカー、ステント、カテーテル、ロッド、インプラント、骨折固定器具、ポンプ、管、配線、電極、避妊用具、婦人衛生製品、内視鏡、創傷包帯、及び組織、特にヒトの組織と接触する他の器具が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１３】
Ａ．繊維状及び粒子状材料
一実施形態において、ペプチドは繊維状材料に適用され、又は繊維状材料に取り込まれるか、繊維状材料にコーティングされる。それらには、創傷被覆剤、包帯、ガーゼ、テープ、パッド、織布及び不織布スポンジを含むスポンジ、特に歯科又は眼科手術用に設計されたもの（米国特許第４，０９８，７２８号；第４，２１１，２２７号；第４，６３６，２０８号；第５，１８０，３７５号；及び第６，７１１，８７９号を参照されたい）、外科用ドレープ、使い捨ておむつ、テープ、絆創膏、婦人用製品、縫合糸として用いられる紙又はポリマー材料、及び他の繊維状材料が含まれる。固定化されたペプチドの利点の１つは、適用時に抗菌性であるだけでなく、処理後の材料による汚染を最小化するのに役立つことがあげられる。
【０１１４】
繊維状材料は、細胞培養及び組織工学機器においても有用である。細菌及び真菌の汚染は真核細胞培養において主な問題であり、これは、培地の汚染を最小化又は除去するのに安全かつ有効な方法を提供する。
【０１１５】
ペプチドは、細胞培養及び薬物送達を含む種々の用途に用いるナノ粒子、微小粒子及びミリメートルビーズを含む粒子にも容易に結合する。
【０１１６】
Ｂ．移植及び挿入される材料
ペプチドは、また、ポリマー、金属又はセラミック基質、例えば、カテーテル、管、心臓弁、薬物ポンプ、整形外科用インプラント、及び患者に挿入、移植又は適用される他の器具にも、イオン結合、共有結合又は水素結合によって直接カップリングするか取り込まれ得る。
【０１１７】
代表的な移植可能な材料には、心臓弁、ペースメーカー、ステント、中心静脈カテーテル（ＣＶＣ）及び尿道カテーテルを含むカテーテル、補助人工心臓、骨修復器具、スクリュー、プレート、リベット、ロッド、骨セメント、及び人工関節が含まれる。
【０１１８】
研究は、ポリウレタン及びシリコーン、ＣＶＣ等の器具に用いられる主な材料へのペプチドの直接的カップリングにより高い負荷が実現することを証明する。
【０１１９】
Ｃ．コーティング、塗布、浸漬、噴霧
ペプチドは、白カビ、細菌の汚染を防止するための塗料、及び他のコーティング及びフィルター、及び抗菌活性を付与するのが望ましい他の用途に加えることもできる。
【実施例】
【０１２０】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することにより更に理解されるだろう。
【０１２１】
（実施例１）固定化抗菌ペプチドの抗菌活性
材料及び方法
抗菌ペプチドの合成
抗菌ペプチドである、システインを取り込んだセクロピン−メリチンハイブリッドペプチド（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＣ−ＮＨ２）（配列番号５）を、Ｉｎｔａｖｉｓ Ｍｕｌｔｉｐｅｐ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｉｎｔａｖｉｓ ＬＬＣから入手できる）を用いたフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学を用いて合成した。
【０１２２】
ＮＨ２−微小粒子（ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓ−ＮＨ２樹脂、Ａｎａｓｐｅｃ．カタログ番号２２７９５）を、係留分子Ｎ−［γ−マレイミドブチリル−オキシ］スクシンイミドエステルを通じた、システインを取り込んだセクロピン−メリチンハイブリッドペプチド（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＣ−ＮＨ２）（配列番号５）を固定化するための基質として用いた。遊離のアミノ基の数は、ニンヒドリンアッセイを用いて定量した。約６．７ｍｇの微粒子を、１２．５ｍｇのニンヒドリン（Ｓｉｇｍａ）を含むｐＨ５．０の１Ｍ酢酸バッファー１ｍＬに懸濁させた。懸濁液を沸騰した水中に１５分間維持した。１５分後、試料を取り除き、１５ｍＬのエタノール／水混合物（１／１、ｖ／ｖ）を加えた。反応混合物を、光から離し１時間かけて室温まで冷却した。ニンヒドリンは遊離のアミノ基と反応し、青色の水溶性化合物を生成した。１時間冷却した後に、上清の吸光度を５７０ｎｍで測定することによって、分光光度的にビーズ中の遊離のアミノ基の量を測定した。グリシンを基準物質として用いた。
【０１２３】
ペプチドの係留分子−官能化ビーズへのカップリング
３．４ｍｇのスルホ−ＧＭＢＳを、ｐＨ７．４のＰＢＳ０．５ｍＬ中に懸濁した１５ｍｇのＮＨ２−微粒子と、室温で２時間、軽く撹拌しながら（ｖｏｒｔｅｘ、１００ｒｐｍ）反応させた。２時間後、ビーズを、２５００ｒｐｍで２分間遠心分離し、１ｍＬのＰＢＳバッファーで５回洗浄した。最後の洗浄において、ビーズを０．５ｍＬのＰＢＳバッファーに再懸濁し、５ｍｇのシステインを取り込んだセクロピン−メリチンハイブリッドペプチド（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＣ−ＮＨ２）（配列番号５）と、室温で一晩、軽く撹拌しながら（１００ｒｐｍ）反応させた。ビーズを、再度０．５ｍＬのＰＢＳバッファーで５回洗浄し、１ｍＬのＰＢＳで再懸濁し、４℃に一晩保持した。翌朝、上清を除去し、ビーズを１ｍＬのＰＢＳバッファーで５回洗浄した。ビーズを１ｍＬに再懸濁し、４℃に保存した。ビーズ中に固定化されたペプチドを、セクロピン−メリチンを標準物質として用いて、ＢＣＡアッセイ（Ｓｉｇｍａ）により定量した。ビーズに結合したペプチドの量を、ビーズに接触した最初の総ペプチド量と、何回かの洗浄において回収されたペプチドの量との差異から間接的に決定した。ビーズに結合したペプチドの濃度は、１５ｍｇのビーズあたり約０．９１ｍｇであり、ビーズの表面積７２．７ｍｍ２あたり０．０６０ｍｇに相当し、ビーズは無孔性であると推測される。
【０１２４】
抗菌活性
ペプチド結合体化ビーズについて、標準的なＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤキット由来の３０μＭヨウ化プロピジウム及び６μＭ ＳＹＴＯ９染色を用いて染色したＣＭＨＢ中の１×１０７ｃｆｕ／ｍＬのＫ１２ Ｅ．ｃｏｌｉとのインキュベートにより、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに対して試験した。蛍光顕微鏡により測定されるように、１時間後に、溶液中の５０％の細菌が死滅した。死滅効果が、本当に固定化ペプチドによるのかどうかを評価するため、ビーズとインキュベートした培地を３０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を除去し、上清を１時間、ＣＭＨＢ中の１×１０７ｃｆｕ／ｍＬのＥ．ｃｏｌｉで接種した。死滅は観察されなかった。これは、固定化ペプチドが細菌に対して効果のある成分であることを示す。
【０１２５】
（実施例２）平面に固定化された抗菌ペプチドは抗菌特性を示す
システインを取り込んだセクロピン−メリチンハイブリッドペプチド（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＣ−ＮＨ２）（配列番号５）を、ペプチドの固相合成に用いられる末端アミン基を有する市販の膜（ピクリン酸アッセイにより測定されるように、０．３４０μモルのＮＨ２／ｃｍ２）（Ｉｎｔａｖｉｓ製品番号３０．１００）に、固定化した。膜の末端アミン基は、スルホ−ＧＭＢＳのスクシンイミド基と反応し、次の工程において、スルホ−ＧＭＢＳのマレイミド基はシステイン取り込みペプチドのチオール基と反応した。膜に結合したペプチドの量は、ビーズに曝露させた最初の総ペプチドと、数回の洗浄で回収されたペプチド量との差異から、間接的に決定した。固定化ペプチドの量は、膜１ｃｍ２あたり約２．０ｍｇであった。このペプチドが結合した膜を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ２５９２に対して固定化抗菌活性について試験した。
【０１２６】
Ｃａｔｉｏｎ Ａｄｊｕｓｔｅｄ Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈのような培地中での標的細菌の一晩培養物を、ＯＤ６００及び細胞密度の間で予め決められたキャリブレーションを用いて、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水で約１×１０５ｃｆｕ／ｍＬに希釈した。０．５ｃｍ２の固定化抗菌表面の試料を、０．７５ｍＬの細菌懸濁液に加えた。試料を液体で覆い、固体表面が液体中で回転するのが見えるように、十分な量の混合物を用いて３７℃でインキュベートした。１時間のインキュベーション後、細菌懸濁液の連続希釈液を寒天プレートに平板培養し、生存可能な細胞濃度を定量するために、一晩増殖させた。この方法を用い、ペプチドが結合した膜は、溶液中、１時間でＥ．ｃｏｌｉの４．２の対数減少を生じた。固定化殺菌活性について結合した抗菌ペプチドを有しないアミン官能化膜の試験は、生存可能な細菌に有意な減少を示さなかった（＜０．１の対数減少）。
【０１２７】
（実施例３）平面に固定化された抗菌ペプチドは、細菌の繰り返し攻撃を経てＰＢＳ中で３週間超保存した後に抗菌特性を示す。
【０１２８】
実施例２と同じ試料を生成し、ｐＨ７．４のＰＢＳ中に３週間超保存した。このペプチド結合膜を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに対する固定化殺菌活性について試験した。１時間にわたり、溶液中の平均１．８の対数減少が生じた。次いで、試料を試験溶液から除去し、新鮮なＰＢＳに入れた。試料を１０分間の超音波処理にかけ、新鮮なＰＢＳに代え、更に３０分間超音波処理した。次いで、洗浄し再試験した。実施例２に記載したアッセイを用いて、洗浄した試料の固定化抗菌活性を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ２５９２２に対して測定し、細菌において、１時間で平均３．３の対数減少が生じた。
【０１２９】
（実施例４）抗菌活性が滲出した因子からもたらされないことの確認
実施例３で用いられた試料が非滲出性でないか判定するために試験を実施した。実施例３で用いた試料が洗浄の前後の死滅の両方のラウンドの間に非滲出性であることを示すために、上清の評価を用いた。実施例３に記載された試料及び細菌の溶液の間の１時間のインキュベーションの終わりに、０．４ｍＬの細菌溶液を取り出した。０．４ｍＬを３０００×ｇで５分間遠心分離し、残留する細菌を除去した。標準的な抗菌アッセイにおけるように、０．２ｍＬの上清の試料を除去し、０．０５ｍＬの、５×１０５ｃｆｕ／ｍＬのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ２５９２２に、最終濃度が１×１０５ｃｆｕ／ｍＬになるように加えた。この混合物を、固定化殺菌活性アッセイにおけるような混合と同じ程度で、３７℃でインキュベートし、１時間の終わりに、連続希釈液を平面培養した。
【０１３０】
死滅の１回目及び２回目のラウンドの両方に由来する上清は、死滅の測定可能な量を示さなかった（生存可能な細菌において＜０．１の対数減少）。表面は死滅を示すが、表面上の上清は何ら死滅を示さないので、固定化抗菌表面は実質的に非滲出性である。
【０１３１】
（実施例５）抗菌ペプチドは、その抗菌特性を維持しながら、ゲルに共有結合で固定化され得る
デキストランゲルを、デキストランアクリレートマクロモノマーのＵＶ架橋により製造した。２３．３％（４００ｍｇ）の置換の程度を有するデキストラン−アクリレート（詳細な製造については、Ｆｅｒｒｅｉｒａら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２００２，２３，３９５７−３９６７を参照されたい）をＰＢＳ（１．８ｍＬ）に溶解しＩｒｇａｃｕｒｅ（５ｍｇ／ｍＬ、２５０μＬ）を溶液に穏やかに加えた。１０分間にわたりＵＶ−光に暴露することによって溶液の架橋を開始した。生検パンチを用いて、得られたゲルをいくつかのディスク（直径８ｍｍ）に切断し、水で一晩洗浄した。官能化反応前に、各デキストランディスクを９５％エタノールに２０分間浸し、ゲルを収縮させた。次いで、収縮したゲルを、穏やかに撹拌しながら（ｖｏｒｔｅｘ、１００ｒｐｍ）ＰＢＳ中の過ヨウ素酸ナトリウムの溶液（５．３ｍｇ／ｍＬ、１ｍＬ）に１時間浸した。この時間の後、ディスクをＰＢＳ中で洗浄し（５回）、未反応の過ヨウ素酸ナトリウムを除去した。次いで、ディスクを二塩酸エチレンジアミンの溶液（６６ｍｇ／ｍＬ、１ｍＬ）に入れ、穏やかに撹拌しながら（ｖｏｒｔｅｘ、１００ｒｐｍ）、反応を１．５時間継続させた。この工程の後、ディスクをＰＢＳ中でよく洗浄した（５回）。ＰＢＳ中のシアノ水素化ホウ素ナトリウムの溶液（１５ｍｇ／ｍＬ、１ｍＬ）を調製し、混合した後、室温で１０分間冷却した。撹拌せずに、ディスクをシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液中で３０分間反応させ、次いで、よく洗浄し、ＰＢＳ中に一晩浸した。官能化したゲルを９５％エタノールに２０分間浸し、穏やかに撹拌しながら（ｖｏｒｔｅｘ、１００ｒｐｍ）、スルホ−ＧＭＢＳ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍＬ）に室温で２時間浸した。ＰＢＳで洗浄することにより（５回）、過剰のスルホ−ＧＭＢＳを除去した。次いで、ディスクを再び９５％エタノール中に２分間浸し、次いで、穏やかに撹拌しながら（ｖｏｒｔｅｘ、１００ｒｐｍ）、システインを取り込んだセクロピン−メリチンハイブリッドペプチド（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＣ−ＮＨ２）（配列番号５）の溶液（５ｍｇ／ｍＬ）に一晩浸した。ディスクを、２日間、１０回洗浄し（０．５ｍＬ、ＰＢＳ）、ペプチドの放出の決定のために洗浄を続けた。ＢＣＡアッセイは、３．２２ｍｇのペプチドがデキストランディスクに固定化されたことを示した。
【０１３２】
固定化された殺菌活性についてアッセイした場合、システインを取り込んだセクロピン−メリチンハイブリッドペプチドで官能化されたゲルは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ２５９２２において２．９の対数減少を示したが、セクロピン−メリチンハイブリッドペプチドを有しないゲルは、生存可能な細菌において有意な減少を示さなかった（＜０．１の対数）。
【０１３３】
（実施例６）基質上の抗菌ペプチドの共有結合による固定化における配向性は、最終的な生物活性にとって重要である。
【０１３４】
固定化ペプチドの配向性が生物活性に重要であるかどうかを調べるため、システインを取り込んだセクロピン−メリチンハイブリッドペプチド（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＣ−ＮＨ２）（配列番号５）を、カルボキシル基を含む膜表面の複数のペプチドアミン基のカップリングによってランダムな配向性で固定化した。以下のプロトコールに従った。末端アミン基を含むセルロース膜（１×１ｃｍ２）を、メチルＮ−スクシニミジルアジペート（ＭＳＡ，Ｐｉｅｒｃｅ）の溶液（ｐＨ７．４のＰＢＳ中、０．１ｍＬのＤＭＳＯ溶液中、１．５４ｍｇ（１：９、ｖ／ｖ））中、室温で２時間インキュベートした。次いで、膜をＰＢＳで数回（５×１ｍＬ）洗浄し、リン酸バッファー、ｐＨ９．５（２ｍＬ）で一晩インキュベートした。その後、膜をｐＨ７．４のＰＢＳ（５×１ｍＬ）及び０．１Ｍクエン酸バッファーｐＨ７．５（５×１ｍＬ）で洗浄した。膜を、０．５ｍＬのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチル−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）溶液（０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファーｐＨ５．０中、４．８ｍｇ／ｍＬ）と３０分間反応させ、次いで、ＰＢＳで洗浄（３×１ｍＬ）した。次いで、活性化された膜を、穏やかに撹拌しながら（１００ｒｐｍ）システインを取り込んだセクロピン−メリチンハイブリッドペプチド（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＣ−ＮＨ２）（配列番号５）（１ｍＬのＰＢＳ中、５ｍｇ）と室温で一晩反応させ、最終的にＰＢＳで洗浄（１ｍＬで洗浄を１０回）、使用するまで、ＰＢＳ中、４℃で保存した。
【０１３５】
結果は、セルロース膜の末端アミン基のほとんどがＭＳＡと反応することを示す。アミン基の含有量は、ＭＳＡ反応の前後で、それぞれ０．３４０μモル／ｃｍ２、及び０．０３９μモル／ｃｍ２であった。
【０１３６】
ＥＤＣ化学を用いて、ＭＳＡの末端ＣＯＯＨ基を、抗菌ペプチドの末端ＮＨ２基とカップリングした。膜上に固定化されたペプチドを、システインを取り込んだセクロピン−メリチンハイブリッドペプチド（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＣ−ＮＨ２）（配列番号５）を標準物質として用いて、ＢＣＡアッセイ（Ｓｉｇｍａ）により決定した。膜に結合したペプチドの量を、膜に曝露した最初の総ペプチドと、数回の洗浄において回収されたペプチドの量との差異から決定した。
【０１３７】
ペプチド含有量は１．８４±０．２７ｍｇ／ｃｍ２（ｎ＝２）であった。表面積に対するペプチド含有量は、配向したペプチド（スルホ−ＧＭＢＳ化学）を用いた固定化されたもの（１．７５±０．３６ｍｇ／ｃｍ２、ｎ＝３）と同様であった。同じ表面密度を有する、配向及び非配向の両方のペプチドを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ２５９２２に対する固定化殺菌活性について評価した。配向ペプチドは、生存可能な細菌において３．０の対数減少を示したが、非配向ペプチドはた１．６の対数減少を生成したのみであった。これは、配向する方法における抗菌ペプチドの固定化が、より高い生物比活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ）をもたらすことを示す。
【０１３８】
（実施例７）配向された固定化抗菌ペプチドは高い比活性を示す
溶液中のペプチド濃度を変えたことを除き、実施例２に記載したように、スルホ−ＧＭＢＳ化学を用いて、アミンを提示するセルロース膜に、システインを取り込んだセクロピン−メリチンハイブリッドペプチド（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＣ−ＮＨ２）（配列番号５）を固定化した。固定化工程の間の溶液中のペプチドの濃度は、０．１２５ｍｇ／ｍＬ〜５．０ｍｇ／ｍＬで変化した。実施例２に記載されたようにして、試料を、固定化殺菌活性についてアッセイした。固定化の間に５ｍｇ／ｍＬの濃度を用いた場合、得られた表面は、１時間にＥ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣの２．０の対数減少を示した。しかし、固定化の間のペプチド濃度を０．１２５ｍｇ／ｍＬに減少した場合、１．８の対数減少がなお生じ、これは、実施例６における非配向性ペプチドよりも有意に低い密度である。従って、ペプチドが配向されている場合に、用いられているペプチドの質量あたりの大きな固定化殺菌活性（高い比活性）が達成される。
【０１３９】
（実施例８）固定化抗菌ペプチド表面は実質的に非溶血性である。
【０１４０】
実施例２に記載したように、スルホ−ＧＭＢＳ化学を用いて、システインを取り込んだセクロピン−メリチンハイブリッドペプチド（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＣ−ＮＨ２）（配列番号５）を、アミンを提示するセルロース膜に固定化し、それが、実質的に非溶血性の表面であるかを判断するための試料を試験した。洗浄し、プールした１０％赤血球（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）のストックを、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．０の溶血バッファーで０．２５％に希釈した。０．５ｃｍ２の抗菌試料を、０．７５ｍＬの０．２５％赤血球懸濁液で３７℃にて１時間インキュベートした。固体試料を除去し、細胞を６０００ｇでスピンダウンし、上清を除去し、分光光度計でＯＤ４１４を測定した。全溶血は、洗浄し、プールした１０％赤血球を無菌ＤＩ水で０．２５％に希釈し３７℃で１時間インキュベートすることによって定義し、０％溶血は、固体試料なしで溶血バッファー中への０．２５％赤血球の懸濁により定義される。このアッセイを用いた、ほんの４．９５％の溶血を生じるペプチド固定化試料は、試料が実質的に非溶血性の表面であることを証明する。
【０１４１】
（実施例９）抗菌ペプチドのアミド化ポリマーブラシへのカップリング
ブラシモノマー、アミノエチルメタクリレート（ＡＥＭＡ）を、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）と一緒に、緩衝化メタノール／水の溶液に入れた。溶液を、ビニルを提示する基質と、７０℃以上で１時間インキュベートした。重合したＡＥＭＡとして、基質表面上のビニル単位を、成長するポリマー鎖に導入し、これらの鎖を基質に係留した。得られる材料の概略図を図２に示す。重合に続き、表面を繰り返し洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水中で超音波処理し、グラフト化していないあらゆるポリマー鎖を除去した。次いで、試料を乾燥し、厚みを測定した。追加の超音波処理は、フィルム厚みをさらには減少しなかったが、これは、全ての残りのポリマーが共有結合で基質に結合していることを示す。ポリマー組成は、ＩＲ分光法により証明された。
【０１４２】
厚み及び組成の確認の後、システインを取り込んだセクロピン−メリチンハイブリッドペプチド（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＣ−ＮＨ２）（配列番号５）を、実施例１に記載したスルホ−ＧＭＢＳ化学を用いて表面に固定化した。ポリマーブラシ表面を用いた初期の固定化実験は、平面基質と比較し、表面積当たりの固定化ペプチドの質量において４倍の増大を示した。全ての固定化ペプチドは表面に提示され、有効ＡｍＰ濃度を劇的に増加させた。ポリマーブラシの分子量及び分岐の最適化は、固定化ペプチドの有効な表面濃度を更に増加させる。
【０１４３】
特に定義されない場合には、本明細書で用いられる全ての技術的及び化学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者に通常に理解されるのと同じ意味を有する。当業者は、通常の実験のみを用いて、本明細書に開示される発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を認識し、又は確定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】親水性係留分子により、基質表面上に固定化されたＡｍＰを示す。
【図２】基質表面に固定化された、ＡｍＰがカップリングした、又はカップリングしていない親水性係留分子を示す。
【図３】基質表面に固定化されたヒドロゲルに固定化されたＡｍＰを示す。
【図４】ビニルを提示する基質にカップリングした、アミド化したポリマーブラシの概略を示す。
【図５】Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ）の構造を示す。スルホン化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド残基は一級アミンと反応するが、マレイミド基はチオール基と反応する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種以上の抗菌ペプチドが固定化した基質を含む組成物であって、該抗菌ペプチドが特定の配向性で均一に係留される、組成物。
【請求項２】
前記抗菌ペプチドが、共有結合、非共有結合、及び共有結合及び非共有結合の組み合わせからなる群より選択される結合によって固定化されている、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記配向性のあるペプチドの固定化抗菌活性が、特定の配向性なく前記基質にランダムに係留された、同じ表面密度及びタイプのペプチドの固定化抗菌活性よりも大きい、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記表面が、０．２ｍｇ／ｃｍ２以下、更に好ましくは０．１ｍｇ／ｃｍ２以下、更に好ましくは０．０５ｍｇ／ｃｍ２以下、及び最も好ましくは０．０１ｍｇ／ｃｍ２以下の固定化抗菌活性を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記ペプチドが、それらのＣ−末端に特異的に結合することにより配向される、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
前記ペプチドが線状ペプチドである、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、実質的に非滲出性（ｎｏｎ−ｌｅａｃｈｉｎｇ）及び生体適合性である、請求項１記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、実質的に抗汚損性である、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、実質的に非細胞傷害性である、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、実質的に非溶血性である、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗菌ペプチド配列が、９個を超え１５０個未満、好ましくは１００個未満、最も好ましくは９〜５１個のアミノ酸長である、請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗菌ペプチド配列が天然に存在しない、請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
１つより多いペプチド配列が固定化されている、請求項１記載の組成物。
【請求項１４】
前記配向性ペプチドの固定化抗菌活性が抗細菌性である、請求項１記載の組成物。
【請求項１５】
前記ペプチドが、イオン結合により前記基質に結合している、請求項１記載の組成物。
【請求項１６】
前記ペプチドが、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）及びビオチン、ポリヒスチジン−ニッケルキレートカップリング、又はサリチルヒドロキサミン酸−フェニルボロン酸の相互作用により前記基質に結合している、請求項１記載の組成物。
【請求項１７】
前記基質の表面が、プラズマ、コロナ放電、火炎処理、ＵＶ／オゾン、ＵＶ及びオゾンのみ、アミノ分解、加水分解、還元、塩化トシル及びそれに続く化学作用を用いたアルコール鎖末端の活性化、化学的イニシエーションによるビニル化合物のグラフト共重合、又はビニルモノマーの存在下におけるイオンビーム処理からなる群より選択される気相技術により改変される、請求項１記載の組成物。
【請求項１８】
前記基質表面が、前記ペプチド上の官能基と反応することができる基を該基質表面に導入するために処理され、該基質上の基が、ヒドロキシル、アミン、ハライド、エポキシド、活性化エステル、スルフヒドリル、ビニル、及びカルボン酸基からなる群より選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項１９】
前記ペプチド中のチオール又はアミノ基が、前記基質表面に存在するマレイミド、ビニルスルホン、アクリルアミド及びアクリレート等の不飽和基との共役付加反応によって直接反応することができる、請求項１記載の組成物。
【請求項２０】
前記ペプチドが、アミン、チオール、カルボニル、カルボキシル、アルデヒド、ビニル、フェニル、及びアルコールからなる群より選択される該ペプチド内に存在する官能基によって前記基質に結合している、請求項１記載の組成物。
【請求項２１】
前記ペプチド上の１個以上のアミン、アルコール又はチオール基が、イソチオシアネート、アシルアジ化物、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、アルデヒド、エポキシド、無水物、ハライド、スルフヒドリル、ビニル、及びラクトンからなる群より選択される前記基質表面上の官能基と直接反応する、請求項１記載の組成物。
【請求項２２】
前記ペプチドの１個以上の遊離のアミノ、スルフヒドリル又はヒドロキシル基が、エポキシド官能基を含む表面に結合している、請求項１記載の組成物。
【請求項２３】
前記ペプチドと基質との間に係留分子（ｔｅｔｈｅｒ）又はスペーサー分子を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項２４】
前記係留分子が親水性ポリマーである、請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
前記係留分子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
前記ペプチドが、ホモ二官能性スルフヒドリル−反応性カップリング剤を用いて前記基質に結合している、請求項２３記載の組成物。
【請求項２７】
前記ペプチドが、ヘテロ二官能性スルフヒドリル−反応性カップリング剤を用いて前記基質に結合している、請求項２３記載の組成物。
【請求項２８】
前記カップリング剤がスルホ−ＧＭＢＳである、請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
ポリマーが前記基質上にグラフトされ、前記ペプチドが該ポリマーに共有結合している、請求項１記載の組成物。
【請求項３０】
前記ポリマーが架橋してゲルを形成している、請求項２９記載の組成物。
【請求項３１】
前記架橋したポリマーがデキストランである、請求項３０記載の組成物。
【請求項３２】
前記ポリマーが、前記基質に結合したポリマーブラシである、請求項２９記載の組成物。
【請求項３３】
前記ポリマーが、前記基質に結合したデンドリマーポリマーである、請求項２９記載の組成物。
【請求項３４】
前記ポリマーが、化学蒸着法によって合成される、請求項２９記載の組成物。
【請求項３５】
前記ポリマーが、シリコーン又はポリウレタンからなる群より選択される材料から形成される基質に結合している、請求項２９記載の組成物。
【請求項３６】
前記ペプチドが、０．１２５〜５０ｍｇ／ｃｍ２の密度で前記基質に結合している、請求項１記載の組成物。
【請求項３７】
前記ペプチドが、０．５ｍｇ／ｃｍ２、更に好ましくは１ｍｇ／ｃｍ２、更に好ましくは５ｍｇ／ｃｍ２、更に好ましくは１０ｍｇ／ｃｍ２、最も好ましくは２５ｍｇ／ｃｍ２を超える密度で前記基質に結合している、請求項１記載の組成物。
【請求項３８】
使用の間に有機又は水性溶媒中で、２１日間の洗浄又は保存による繰り返し使用の間、前記抗菌活性が残存している、請求項１記載の組成物。
【請求項３９】
前記基質が、ポリマー、セラミック又は金属である、請求項１記載の組成物。
【請求項４０】
前記基質が、移植可能又は注入可能なデバイスの形態である、請求項３９記載の組成物。
【請求項４１】
前記デバイスが、ステント、カテーテル、管、針、ペースメーカー、人工器官、骨セメント、ねじ、バルブ、リベット、プレート、弁、移植片、センサー、手術器具、及びポンプからなる群より選択される、請求項４０記載の組成物。
【請求項４２】
前記基質が、組織工学又は組織培養支持体又はマトリクスである、請求項１記載の組成物。
【請求項４３】
前記基質が繊維状である、請求項１記載の組成物。
【請求項４４】
前記繊維状基質が、ガーゼ、パッド、創傷包帯、外科用ドレープ、外科用衣服、おむつ、及びスポンジからなる群より選択されるデバイスの形態である、請求項４３記載の組成物。
【請求項４５】
前記基質が膜である、請求項１記載の組成物。
【請求項４６】
前記基質が、ナノ粒子、微小粒子又はビーズの形態である、請求項１記載の組成物。
【請求項４７】
前記基質が、前記表面に共有結合的に係留されているか、独立して固定化抗菌ペプチドを放出してもよい、１種以上の治療、予防又は診断薬を更に含む、請求項１記載の組成物。
【請求項４８】
前記治療、予防又は診断薬が、抗増殖剤、細胞増殖抑制剤、又は細胞傷害性化学療法剤、抗菌剤、抗炎症剤、成長因子、抗血栓剤、及び細胞接着ペプチドからなる群より選択される、請求項４７記載の組成物。
【請求項４９】
前記治療、予防又は診断薬が前記基質からゆっくりと放出されるように、該治療、予防又は診断薬が、加水分解性結合を用いて該基質に係留されている、請求項４７記載の組成物。
【請求項１】
１種以上の抗菌ペプチドが固定化した基質を含む組成物であって、該抗菌ペプチドが特定の配向性で均一に係留される、組成物。
【請求項２】
前記抗菌ペプチドが、共有結合、非共有結合、及び共有結合及び非共有結合の組み合わせからなる群より選択される結合によって固定化されている、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記配向性のあるペプチドの固定化抗菌活性が、特定の配向性なく前記基質にランダムに係留された、同じ表面密度及びタイプのペプチドの固定化抗菌活性よりも大きい、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記表面が、０．２ｍｇ／ｃｍ２以下、更に好ましくは０．１ｍｇ／ｃｍ２以下、更に好ましくは０．０５ｍｇ／ｃｍ２以下、及び最も好ましくは０．０１ｍｇ／ｃｍ２以下の固定化抗菌活性を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記ペプチドが、それらのＣ−末端に特異的に結合することにより配向される、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
前記ペプチドが線状ペプチドである、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、実質的に非滲出性（ｎｏｎ−ｌｅａｃｈｉｎｇ）及び生体適合性である、請求項１記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、実質的に抗汚損性である、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、実質的に非細胞傷害性である、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、実質的に非溶血性である、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗菌ペプチド配列が、９個を超え１５０個未満、好ましくは１００個未満、最も好ましくは９〜５１個のアミノ酸長である、請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗菌ペプチド配列が天然に存在しない、請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
１つより多いペプチド配列が固定化されている、請求項１記載の組成物。
【請求項１４】
前記配向性ペプチドの固定化抗菌活性が抗細菌性である、請求項１記載の組成物。
【請求項１５】
前記ペプチドが、イオン結合により前記基質に結合している、請求項１記載の組成物。
【請求項１６】
前記ペプチドが、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）及びビオチン、ポリヒスチジン−ニッケルキレートカップリング、又はサリチルヒドロキサミン酸−フェニルボロン酸の相互作用により前記基質に結合している、請求項１記載の組成物。
【請求項１７】
前記基質の表面が、プラズマ、コロナ放電、火炎処理、ＵＶ／オゾン、ＵＶ及びオゾンのみ、アミノ分解、加水分解、還元、塩化トシル及びそれに続く化学作用を用いたアルコール鎖末端の活性化、化学的イニシエーションによるビニル化合物のグラフト共重合、又はビニルモノマーの存在下におけるイオンビーム処理からなる群より選択される気相技術により改変される、請求項１記載の組成物。
【請求項１８】
前記基質表面が、前記ペプチド上の官能基と反応することができる基を該基質表面に導入するために処理され、該基質上の基が、ヒドロキシル、アミン、ハライド、エポキシド、活性化エステル、スルフヒドリル、ビニル、及びカルボン酸基からなる群より選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項１９】
前記ペプチド中のチオール又はアミノ基が、前記基質表面に存在するマレイミド、ビニルスルホン、アクリルアミド及びアクリレート等の不飽和基との共役付加反応によって直接反応することができる、請求項１記載の組成物。
【請求項２０】
前記ペプチドが、アミン、チオール、カルボニル、カルボキシル、アルデヒド、ビニル、フェニル、及びアルコールからなる群より選択される該ペプチド内に存在する官能基によって前記基質に結合している、請求項１記載の組成物。
【請求項２１】
前記ペプチド上の１個以上のアミン、アルコール又はチオール基が、イソチオシアネート、アシルアジ化物、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、アルデヒド、エポキシド、無水物、ハライド、スルフヒドリル、ビニル、及びラクトンからなる群より選択される前記基質表面上の官能基と直接反応する、請求項１記載の組成物。
【請求項２２】
前記ペプチドの１個以上の遊離のアミノ、スルフヒドリル又はヒドロキシル基が、エポキシド官能基を含む表面に結合している、請求項１記載の組成物。
【請求項２３】
前記ペプチドと基質との間に係留分子（ｔｅｔｈｅｒ）又はスペーサー分子を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項２４】
前記係留分子が親水性ポリマーである、請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
前記係留分子がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
前記ペプチドが、ホモ二官能性スルフヒドリル−反応性カップリング剤を用いて前記基質に結合している、請求項２３記載の組成物。
【請求項２７】
前記ペプチドが、ヘテロ二官能性スルフヒドリル−反応性カップリング剤を用いて前記基質に結合している、請求項２３記載の組成物。
【請求項２８】
前記カップリング剤がスルホ−ＧＭＢＳである、請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
ポリマーが前記基質上にグラフトされ、前記ペプチドが該ポリマーに共有結合している、請求項１記載の組成物。
【請求項３０】
前記ポリマーが架橋してゲルを形成している、請求項２９記載の組成物。
【請求項３１】
前記架橋したポリマーがデキストランである、請求項３０記載の組成物。
【請求項３２】
前記ポリマーが、前記基質に結合したポリマーブラシである、請求項２９記載の組成物。
【請求項３３】
前記ポリマーが、前記基質に結合したデンドリマーポリマーである、請求項２９記載の組成物。
【請求項３４】
前記ポリマーが、化学蒸着法によって合成される、請求項２９記載の組成物。
【請求項３５】
前記ポリマーが、シリコーン又はポリウレタンからなる群より選択される材料から形成される基質に結合している、請求項２９記載の組成物。
【請求項３６】
前記ペプチドが、０．１２５〜５０ｍｇ／ｃｍ２の密度で前記基質に結合している、請求項１記載の組成物。
【請求項３７】
前記ペプチドが、０．５ｍｇ／ｃｍ２、更に好ましくは１ｍｇ／ｃｍ２、更に好ましくは５ｍｇ／ｃｍ２、更に好ましくは１０ｍｇ／ｃｍ２、最も好ましくは２５ｍｇ／ｃｍ２を超える密度で前記基質に結合している、請求項１記載の組成物。
【請求項３８】
使用の間に有機又は水性溶媒中で、２１日間の洗浄又は保存による繰り返し使用の間、前記抗菌活性が残存している、請求項１記載の組成物。
【請求項３９】
前記基質が、ポリマー、セラミック又は金属である、請求項１記載の組成物。
【請求項４０】
前記基質が、移植可能又は注入可能なデバイスの形態である、請求項３９記載の組成物。
【請求項４１】
前記デバイスが、ステント、カテーテル、管、針、ペースメーカー、人工器官、骨セメント、ねじ、バルブ、リベット、プレート、弁、移植片、センサー、手術器具、及びポンプからなる群より選択される、請求項４０記載の組成物。
【請求項４２】
前記基質が、組織工学又は組織培養支持体又はマトリクスである、請求項１記載の組成物。
【請求項４３】
前記基質が繊維状である、請求項１記載の組成物。
【請求項４４】
前記繊維状基質が、ガーゼ、パッド、創傷包帯、外科用ドレープ、外科用衣服、おむつ、及びスポンジからなる群より選択されるデバイスの形態である、請求項４３記載の組成物。
【請求項４５】
前記基質が膜である、請求項１記載の組成物。
【請求項４６】
前記基質が、ナノ粒子、微小粒子又はビーズの形態である、請求項１記載の組成物。
【請求項４７】
前記基質が、前記表面に共有結合的に係留されているか、独立して固定化抗菌ペプチドを放出してもよい、１種以上の治療、予防又は診断薬を更に含む、請求項１記載の組成物。
【請求項４８】
前記治療、予防又は診断薬が、抗増殖剤、細胞増殖抑制剤、又は細胞傷害性化学療法剤、抗菌剤、抗炎症剤、成長因子、抗血栓剤、及び細胞接着ペプチドからなる群より選択される、請求項４７記載の組成物。
【請求項４９】
前記治療、予防又は診断薬が前記基質からゆっくりと放出されるように、該治療、予防又は診断薬が、加水分解性結合を用いて該基質に係留されている、請求項４７記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００９−５２６８６２（Ｐ２００９−５２６８６２Ａ）
【公表日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５５４１４（Ｐ２００８−５５５４１４）
【出願日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００４３９４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９５３９３
【国際公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（５９６０６０６９７）マサチューセッツ・インスティテュート・オブ・テクノロジー (233)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月１５日（２００７．２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００４３９４
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９５３９３
【国際公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（５９６０６０６９７）マサチューセッツ・インスティテュート・オブ・テクノロジー (233)
【Ｆターム（参考）】
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