顕微鏡装置、観察方法および試料搭載機構
【課題】簡単な光学調整および演算処理で高解像度の試料の画像を得ると共に、光軸方向に自由度を持たせた観察を行うことを目的とする。
【解決手段】本発明の顕微鏡装置１は、干渉性を有し、試料Ｓを励起させる励起光ＥＬを発振するランプ光源２と、試料Ｓに励起光ＥＬを照射したときに蛍光した戻り光ＲＬを検出する撮像素子１２と、励起光ＥＬを平行光として試料Ｓに入射させる対物レンズ８と、対物レンズ８から直接的に入射する励起光ＥＬと干渉させるための反射光を発生させる反射面９ａを対物レンズ８の焦点Ｆの範囲内に配置して、反射面９ａに試料Ｓを搭載した試料搭載部９と、を備えている。励起光ＥＬにおいて直接光と反射光とを干渉させて定在波を発生させており、戻り光ＲＬについても直接光と反射光とを干渉させている。これにより、分解能を高くすることができ、高解像度の画像を得ることができる。
【解決手段】本発明の顕微鏡装置１は、干渉性を有し、試料Ｓを励起させる励起光ＥＬを発振するランプ光源２と、試料Ｓに励起光ＥＬを照射したときに蛍光した戻り光ＲＬを検出する撮像素子１２と、励起光ＥＬを平行光として試料Ｓに入射させる対物レンズ８と、対物レンズ８から直接的に入射する励起光ＥＬと干渉させるための反射光を発生させる反射面９ａを対物レンズ８の焦点Ｆの範囲内に配置して、反射面９ａに試料Ｓを搭載した試料搭載部９と、を備えている。励起光ＥＬにおいて直接光と反射光とを干渉させて定在波を発生させており、戻り光ＲＬについても直接光と反射光とを干渉させている。これにより、分解能を高くすることができ、高解像度の画像を得ることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に照明光を照射して、試料からの戻り光を検出して試料の画像を生成する顕微鏡装置、観察方法および試料搭載機構に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
蛍光色素や蛍光タンパク等を導入した試料に対して照明光を照射して蛍光を発生させ、発生した蛍光に基づいて試料の観察を行う顕微鏡装置が従来から用いられている。この顕微鏡として、特許文献１に開示されるＩ５Ｍ顕微鏡が用いられている。Ｉ５Ｍ顕微鏡は、光軸方向に高解像度の画像を生成するために用いられる顕微鏡であり、試料を挟んで相互に反対側に対物レンズを配置している。
【０００３】
試料を挟んだ２枚の対物レンズは相互に焦点位置が重なるように対向配置している。光ファイバにより導光された光は可干渉距離の短い励起光となっており、対物レンズにより平行光にされる。そして、各対物レンズの焦点面において２つの励起光を干渉させて試料を励起させる。この干渉により、焦点面近傍で定在波が発生すると共に、中心面における光強度が極大になる。
【０００４】
試料に入射する励起光は平行光であり、相互に干渉していることから、中心面に明暗の干渉縞が発生する。このときの、明となっている縞の間隔はλ／２となっていることから、狭小な領域を照明することができ、分解能を高くしている。
【０００５】
励起光が入射した試料は蛍光色素や蛍光タンパク等が励起して蛍光が発生する。この発生した蛍光は２つの対物レンズから回収されて、撮像素子に投影がされる。これにより、試料の像を観察している。このときに、２つの対物レンズから回収された蛍光を干渉させている。これにより、光軸方向の分解能をさらに向上させている。
【０００６】
また、Ｉ５Ｍ顕微鏡以外の技術としては、特許文献２に開示されている顕微鏡がある。この顕微鏡（Standing Wave Microscopy）は、２つの干渉光を用いて焦点面の近傍に定在波を発生させている。そして、この定在波の間隔を変化させて複数の画像を取得し、取得した画像を用いて計算を行うことにより特定の断面の画像を抽出している。
【０００７】
また、光軸方向に高い分解能を得ている顕微鏡としては全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦ顕微鏡）がある。このＴＩＲＦ顕微鏡では、励起光としてエバネッセント光を用いて、エバネッセント場を利用した局所的な励起を行っている。これにより、極めて被写体の深度を浅くすることができ、光軸方向の分解能を高くしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，６７１，０８５号明細書
【特許文献２】米国特許第５，３９４，２６８号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述したＩ５Ｍ顕微鏡は、試料を挟んで対向配置した２つの対物レンズから入射する励起光を干渉させて定在波を発生させている。このために、２つの対物レンズの焦点位置が正確に重なるように配置しなければならない。また、２つの対物レンズから回収された蛍光を干渉させているため、２つの蛍光の光路を重ね合わせる必要がある。従って、顕微鏡全体の光学調整を極めて厳格に行う必要があり、過剰に高い光学調整の精度が要求される。
【００１０】
また、Standing Wave Microscopy顕微鏡においては、特定の断面の画像を抽出するために、定在波の間隔が異なる多くの画像取得が必要になる。このため、画像取得動作が煩雑になり、複雑な演算処理を行わなければならない。
【００１１】
さらに、ＴＩＲＦ顕微鏡の場合には、エバネッセント場が発生する極めて限定された領域の画像が得られる。つまり、試料の厚さ数百ナノメートルでのみ励起光によって蛍光を発生するため、観察対象となる領域は深さ方向（Ｚ方向）において非常に限定された領域になる。これにより、深さ方向における観察の自由度が低下する。
【００１２】
そこで、本発明は、簡単な光学調整および演算処理で高解像度の試料の画像を得ると共に、光軸方向に自由度を持たせた観察を行うことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
以上の課題を解決するため、本発明の顕微鏡装置は、干渉性を有し、試料を励起させる励起光を発振する光源と、前記試料に前記励起光を照射したときに蛍光した戻り光を検出する検出部と、前記励起光を平行光として前記試料に入射させる対物レンズと、この対物レンズから直接的に入射する前記励起光と干渉させるための反射光を発生させる反射面を前記対物レンズの焦点の範囲内に配置して、前記反射面に前記試料を搭載した試料搭載部と、を備えたことを特徴とする。
【００１４】
この顕微鏡装置によれば、試料搭載部に反射面を形成している。これにより、レンズから直接的に入射する平行光の励起光と反射面で反射した平行光の励起光とが干渉して、光軸方向に分解能を高くすることができる。対物レンズは１つを用いているため、簡単な光学調整で行うことができ、多くの画像を取得して複雑な演算処理を行う必要もない。また、エバネッセント光を用いていないため、光軸方向に高い自由度で観察を行うことができる。
【００１５】
また、前記励起光が集光する位置を前記対物レンズの瞳位置の中心からずれた位置に配置したことを特徴とする。これにより、干渉により励起光が強め合う領域と干渉により戻り光が強め合う領域との間にずれを生じる。よって、これらの領域が重なった領域が画像化されるため、分解能を高くすることができる。
【００１６】
また、前記対物レンズに入射する前記励起光をＳ偏光に変換する偏光変換部を備えたことを特徴とする。これにより、励起光はＳ偏光の成分のみに変換されるため、干渉の効率を向上させて、分解能を高くすることができる。
【００１７】
また、前記対物レンズの焦点の範囲内の前記戻り光のみを前記検出部に通過させるピンホールと、前記戻り光を光軸方向に直交する方向に走査する走査部と、を備えたことを特徴とする。これにより、顕微鏡装置を共焦点顕微鏡として用いることができ、光軸方向に高い分解能を得ることができる。
【００１８】
また、前記光源からの前記励起光を回折する回折格子と、この回折格子を前記励起光の光軸と直交する方向に移動および前記光軸を中心として回転させる回折格子駆動部と、この回折格子駆動部により前記回折部を移動および回転させたときに前記検出部が検出した複数の前記戻り光の像に基づいて１つの画像を生成する演算を行う演算部と、を備えたことを特徴とする。これにより、顕微鏡装置を構造化照明顕微鏡として用いることができる。従って、光軸方向に直交する方向に高い分解能を得ることができ、３次元に分解能を高くすることができる。
【００１９】
また、前記光源は、蛍光可能な状態と不可能な状態とを切り替え可能な蛍光分子が導入された前記試料に対してスイッチング用のレーザ光を発振することを特徴とする。これにより、顕微鏡装置をＰＡＬＭに適用することができる。ＰＡＬＭでは個々の蛍光分子が蛍光するため、光軸に直交する方向の分解能が高くなる。従って、３次元に分解能の高い画像生成を行うことができる。
【００２０】
また、本発明の観察方法は、干渉性を有し、試料を励起させる励起光を対物レンズにより平行光にして、平行光にされた前記励起光を前記試料に照射したときに蛍光した戻り光を検出して観察するときに、前記試料を搭載する試料搭載部に形成された反射面で反射した反射光と前記対物レンズから直接的に入射する前記励起光とを干渉させていることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明の試料搭載機項は、干渉性を有し、試料を励起させる励起光をレンズにより平行光にして、平行光にされた前記励起光を前記試料に照射したときに蛍光した戻り光を検出して観察を行うときの前記試料を搭載する試料搭載機構であって、この試料搭載機構の前記励起光が入射する側の面に前記レンズから直接的に入射する前記励起光と干渉させるための反射光を発生させる反射面を形成したことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２２】
本発明は、試料搭載部の試料を搭載する面を反射面として、対物レンズにより平行光にされた励起光を入射している。これにより、対物レンズから直接的に入射した励起光と反射面で反射した励起光とを干渉させて光軸方向の分解能を高くしている。また、戻り光においても干渉させていることから、光軸方向に高い分解能の画像を生成することができる。対物レンズは１枚を用いているため、簡単な光学調整で実現することができる。また、多くの画像を取得して複雑な演算処理を行う必要もない。さらに、エバネッセント光を用いていないため、光軸方向に高い自由度で観察を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実施形態の顕微鏡装置の構成図である。
【図２】実施形態の焦点の状態を説明した図である。
【図３】励起光の強度分布を説明した図である。
【図４】戻り光の強度分布を説明した図である。
【図５】撮像素子で検出される戻り光の強度分布を説明した図である。
【図６】変形例１の顕微鏡装置の構成図である。
【図７】変形例１の焦点の状態を説明した図である。
【図８】変形例２の顕微鏡装置の構成図である。
【図９】変形例３の顕微鏡装置の構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、図面を参照して、本発明の実施形態について説明する。図１は顕微鏡装置１を示している。顕微鏡装置１はランプ光源２と集光レンズ３とピンホール４と励起フィルタ５と投影レンズ６とダイクロイックミラー７と対物レンズ８と試料搭載部９と蛍光フィルタ１０と結像レンズ１１と撮像素子１２と計算機１３とを備えて構成している。
【００２５】
ランプ光源２は可視光の波長域の光（白色光）を励起光ＥＬとして照射する光源である。図１において、励起光ＥＬの光路は破線で示している。集光レンズ３はランプ光源２が放出した励起光ＥＬを集光させる。ピンホール４は集光レンズ３の集光点に配置されている。励起フィルタ５は励起光ＥＬの波長域の光を選択的に透過するフィルタである。
【００２６】
投影レンズ６は励起フィルタ５を透過した励起光ＥＬを集光させる。この励起光ＥＬの光路にダイクロイックミラー７を配置している。ダイクロイックミラー７は励起光ＥＬの波長域の光を透過し、後述する戻り光ＲＬの波長域の光を反射する特性を有する光学部品である。励起光ＥＬはダイクロイックミラー７を透過して対物レンズ８に入射する。
【００２７】
投影レンズ６により励起光ＥＬは集光する。このときの集光位置は対物レンズ８の瞳位置（後ろ側焦点）になる。これにより、対物レンズ８により励起光ＥＬは平行光に変換される。この平行光となった励起光ＥＬが試料搭載部９に搭載された試料Ｓに入射する。試料Ｓには蛍光色素や蛍光タンパク等が導入されており、励起光ＥＬの波長により励起されて蛍光を発生する。この蛍光が戻り光ＲＬとなる。
【００２８】
試料搭載機構としての試料搭載部９は皿状になっている。そして、励起光ＥＬが入射する側の面を反射面９ａとしており、この反射面９ａに試料Ｓを搭載している。反射面９ａは励起光ＥＬおよび戻り光ＲＬを反射（全反射）する特性を有している。従って、反射面９ａは励起光ＥＬおよび戻り光ＲＬの波長の光を反射すれば、他の波長域の光は透過するものであってもよい。反射面９ａは対物レンズ８の焦点面近傍（焦点Ｆの範囲内）に配置するようにしている。
【００２９】
反射面９ａとしてはアルミニウムや金等の金属を用いたミラーコーティングを用いることもでき、励起光ＥＬおよび戻り光ＲＬを反射する誘電体多層膜を用いることもできる。なお、反射面９ａには保護層を形成してもよい。
【００３０】
試料Ｓが蛍光して発生した戻り光ＲＬ（図１の実線の光路）は対物レンズ８によって回収される。試料Ｓは対物レンズ８の焦点Ｆ（前側の焦点）位置に配置している。このため、試料Ｓからの戻り光ＲＬは対物レンズ８により平行光に変換される。この平行光となった戻り光ＲＬはダイクロイックミラー７で反射する。そして、ダイクロイックミラー７で反射した戻り光ＲＬは蛍光フィルタ１０に入射する。
【００３１】
蛍光フィルタ１０は戻り光ＲＬ（蛍光）の波長域の光のみ透過させる。この蛍光フィルタ１０を透過した戻り光ＲＬが結像レンズ１１により撮像素子１２に結像される。撮像素子１２は相互に直交する方向にＣＣＤを配置しており、戻り光ＲＬを平面で受光する。なお、撮像素子１２はカメラ等であってもよい。
【００３２】
撮像素子１２は受光した戻り光ＲＬの像を光電変換してデジタルデータ（光量データ）を生成する検出部になる。撮像素子１２が生成する光量データは計算機１３に出力される。計算機１３は演算部であり、コンピュータ等を適用できる。計算機１３は光量データに対して所定の演算処理を行うことで、試料Ｓの画像生成を行う。
【００３３】
次に、動作について説明する。ランプ光源２は干渉性を有する励起光ＥＬを照射して、この励起光ＥＬが集光レンズ３とピンホール４と励起フィルタ５と投影レンズ６とダイクロイックミラー７とを経て、対物レンズ８に入射する。対物レンズ８により励起光ＥＬは平行光にされて試料搭載部９に搭載された試料Ｓに入射する。
【００３４】
対物レンズ８に光軸に沿った平行光を導入した際にできる焦点の形状を図２のＦに示す。このように焦点Ｆは楕円形の領域になっており、焦点Ｆの中心が反射面９ａと一致するように対物レンズ８を調整している。また、焦点Ｆの近傍では励起光ＥＬは平行光になっている。このため、励起光ＥＬは反射面９ａに直接的に入射する光（直接光）と反射面９ａで反射した光（反射光）との２つの光が生じる。これら直接光と反射光とが干渉して試料Ｓ上に定在波を発生させる。
【００３５】
反射光は反射面９ａで反射しているため、直接光に対して位相が１８０度（λ／２相当）シフトする。反射光と直接光とは相互に向きが異なるため、直接光と反射光とが干渉して定在波（定常波）が発生する。この定在波により、反射面９ａからＺ方向（光軸方向）において「λ／４」の領域（図２の領域Ｆ１）では直接光と反射光とが強め合うように干渉する。領域Ｆ１は直接光と反射光との光路差が「λ／４＋λ／４＋λ／２＝λ」と１波長分になることから定在波の「腹」になり、強度が高くなる。
【００３６】
一方、反射面９ａから光軸方向において「λ／２」の領域（図示せず）では直接光と反射光とにより弱め合うような干渉が生じる。この領域は、直接光と反射光との光路差が「λ／２＋λ／２＋λ／２＝λ」と３／２波長分になることから、定在波の「節」になる。このために、強度が弱め合って、打ち消される。これにより、当該領域では蛍光（戻り光ＲＬ）が発生しなくなる。
【００３７】
また、反射面９ａから光軸方向において「（３／４）×λ」の領域（図２の領域Ｆ２）では直接光と反射光とが干渉して強め合う。これは、領域Ｆ２では直接光と反射光との光路差が「（３／４）×λ＋（３／４）×λ＋λ／２＝２×λ」と２波長分になるためである。ただし、この領域Ｆ２の部分は反射面９ａからＦ１よりも離れた位置になっている。ここでランプ光源２から発せられる光は干渉距離が短いため、直接光と反射光とに光路差が生じるにつれて干渉強度が弱くなり、領域Ｆ２は領域Ｆ１に比べて強度が弱くなっている。従って、領域Ｆ２はＦ１よりも暗い領域となる。
【００３８】
さらに、反射面９ａから光軸方向においてλの領域（図示せず）では直接光と反射光とが弱め合うような干渉が生じ、打ち消される。つまり、当該領域では直接光と反射光との光路差が「λ＋λ＋λ／２＝（５／２）×λ」と５／２波長分となっている。これにより、弱め合って打ち消される。このため、蛍光（戻り光ＲＬ）が発生しなくなる。
【００３９】
また、反射面９ａから光軸方向において「（５／４）×λ」の領域（図２の領域Ｆ３）では直接光と反射光とが干渉して強め合う。これは、領域Ｆ３では直接光と反射光との光路差が「（５／４）×λ＋（５／４）×λ＋λ／２＝３×λ」と３波長分になるためである。ただし、この領域Ｆ３の部分は反射面９ａからＦ２よりも離れた位置になっている。ここでランプ光源２から発せられる光は干渉距離が短いため、直接光と反射光とに光路差が生じるにつれて干渉強度が弱くなり、領域Ｆ３は領域Ｆ２に比べて強度が弱くなっている。従って、領域Ｆ３はＦ２よりも暗い領域となる。
【００４０】
従って、定在波によって励起光ＥＬが強め合う領域Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３と弱め合う領域（領域Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３以外の領域）とが発生する。図２では定在波により強め合う領域はＦ１、Ｆ２、Ｆ３となっているが、これが連続して、明暗の縞を構成する。これにより、励起光ＥＬが明るくなっている領域を狭小な領域とすることができる。つまり、全体の領域に対して「明」の領域が限定的になっている。
【００４１】
従って、Ｚ方向に分解能を高くすることができる。図３は励起光ＥＬのＺ方向の光の強度分布を示しており、この図に示すように、３つの領域（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３）の強度が強くなっている。なお、図中において「光強度」は光の強度を示している。
【００４２】
一方、励起光ＥＬによって試料Ｓの蛍光色素や蛍光タンパク等が励起されて、蛍光することにより戻り光ＲＬが発生する。この戻り光ＲＬは対物レンズ８により回収されて、ダイクロイックミラー７で反射する。そして、蛍光フィルタ１０で反射して、結像レンズ１１により撮像素子１２に結像される。この撮像素子１２には対物レンズ８の焦点Ｆの範囲内で蛍光した戻り光ＲＬが検出される。
【００４３】
そして、対物レンズ８の焦点Ｆの中心が反射面９ａの中心となるようにしている。このため、試料Ｓが蛍光したときの戻り光ＲＬは直接的に対物レンズ８に入射する光（直接光）と反射面９ａで反射した後に対物レンズ８に入射する光（反射光）との２つが生じる。焦点Ｆで蛍光した戻り光ＲＬのうち領域Ｆ１およびＦ２の光は、それぞれ直接光と反射光との光路差がλおよび２×λとなる。
【００４４】
試料Ｓが蛍光した戻り光ＲＬは干渉性を有している。よって、戻り光ＲＬの直接光と反射光とが干渉して、強め合う領域と弱め合う領域とが発生する。撮像素子１２では焦点Ｆの範囲内の光を検出するため、焦点Ｆから外れた位置にある領域Ｆ３の戻り光ＲＬは撮像素子１２では検出されない。
【００４５】
従って、焦点Ｆのうち領域Ｆ１、Ｆ２の戻り光ＲＬのみが撮像素子１２に検出される。このときの戻り光ＲＬについての強度分布は図４に示すようになっている。つまり、２つの領域（Ｆ１、Ｆ２）の強度が高くなっているが、それ以外の領域での強度は低くなっている。また、領域Ｆ１の部分は領域Ｆ２よりも反射面９ａに近い位置になっている。ここで発せられる蛍光も干渉距離が短いため、直接光と反射光とに光路差が生じるにつれて干渉強度が弱くなり、領域Ｆ１は領域Ｆ２に比べて強度が強くなっている。
【００４６】
図４は戻り光ＲＬについてのみの強度分布になっている。この点、励起光ＥＬおよび戻り光ＲＬの両方について干渉の効果を生じる。そして、励起光ＥＬおよび戻り光ＲＬの両方で干渉の効果を生じた光が撮像素子１２に結像される。従って、撮像素子１２に結像される戻り光ＲＬは、励起光ＥＬおよび戻り光ＲＬの両者の相乗効果により、図５のような強度分布になる。つまり、図３および図４のガウシアン分布よりもシャープな形になり、２つの領域（Ｆ１、Ｆ２）と他の領域との強度に明確な差を生じる。
【００４７】
つまり、励起光ＥＬと戻り光ＲＬとの両者を干渉させることで、Ｚ方向に分解能を高くすることができる。また、これまでは対物レンズ８に光軸に沿った平行光を導入した際にできる焦点Ｆについて着目して説明を行ったが、これは反射面９ａに沿った焦点面についても同様の現象が発生する。これらの焦点面の情報は撮像素子１２に結像される。これにより、撮像素子１２が検出する戻り光ＲＬの分解能が高くなる。計算機１３は撮像素子１２が検出した戻り光ＲＬの光量データに基づいて画像生成を行う。よって、Ｚ方向の分解能が高くなるために、生成される試料Ｓの画像を高解像度にすることができる。
【００４８】
ところで、撮像素子１２が受光した光のうち観察対象となるのは狭小な領域Ｆ１であり、領域Ｆ２は観察対象にはなっていない。この点、図５にも示すように、領域Ｆ２についても僅かな強度が生じている。そこで、領域Ｆ２の影響を取り除くデコンボルーション処理を行う。
【００４９】
このデコンボルーション処理は、計算機１３が行う。計算機１３は撮像素子１２に受光された戻り光ＲＬについて、点像分布関数（ＰＳＦ）を用いて、領域Ｆ２を除去する演算を行う。或いは、戻り光ＲＬを実測して領域Ｆ２を除去するように処理を行う。このデコンボルーション処理を行うことで、領域Ｆ１のみの蛍光を観察することができ、より狭小な領域の戻り光ＲＬを検出できる。これにより、分解能を高くすることができる。
【００５０】
従って、Ｚ方向において高い分解能で試料Ｓを観察することができる。以上において励起光ＥＬとして単色光を用いてもよい。この場合には、ランプ光源２ではなくＬＥＤ光源等が考えられる。ＬＥＤ光源を用いる場合には、複数のＬＥＤ光源を用いて複数波長の単色光を選択的に使用可能な構成とし、蛍光色素の色に応じた波長を持つＬＥＤ光源を用いる。従って、蛍光色素の色を変えたときには、ＬＥＤ光源から発せられる単色光は蛍光色素の色に応じた波長とする。これにより、複数の色の蛍光色素の画像取得を行うことができる。また、励起光ＥＬをＳＬＤ（Super Luminescent Diode）光源としても同様の効果が得られる。
【００５１】
次に、変形例１について説明する。図６に示すように、変形例１では、ランプ光源２と集光レンズ３とピンホール４と励起フィルタ５と投影レンズ６とを一体的な励起光学ユニット２１として構成している。また、励起光学ユニット２１を光軸方向と直交する方向に移動させる集光位置移動部を光学ユニット移動機構２２として設けている。また、励起フィルタ５と投影レンズ６との間に偏光板２３を挿入している。
【００５２】
偏光変換部としての偏光板２３は励起光ＥＬをＳ偏光光に変換する光学部品である。Ｓ偏光は偏光面が入射面（励起光ＥＬと反射面９ａの法線とにより形成される面）と直交する方向の面を振動する偏光成分の光となる。偏光板２３は単体の光学部品として設けてもよいし、偏光板２３の機能（例えば、偏光分離膜）を励起フィルタ５に形成するものであってもよい。
【００５３】
光学ユニット移動機構２２は励起光学ユニット２１をＺ軸と直交する方向（図中の矢印の方向）に移動させる集光位置移動部である。励起光ＥＬは投影レンズ６により集光されており、光学ユニット移動機構２２が励起光額ユニット２１を移動させることにより、励起光ＥＬが集光する位置が対物レンズ８の瞳位置の中心から移動してずれた位置になる。これにより、励起光ＥＬはＺ方向に対して斜め方向に進行する平行光に変換される。よって、試料Ｓには斜め方向から励起光ＥＬが入射する。
【００５４】
このとき、励起光ＥＬは対物レンズ８から直接的に入射する直接光と反射面９ａで反射した反射光とが干渉して定在波を発生する。ただし、励起光ＥＬはＺ軸に対して斜めの方向から入射しているため、図７に示すように、励起光ＥＬが干渉により強め合う領域Ｆ１と領域Ｆ２との間隔は図２の場合と比較して広くなっている。
【００５５】
励起光ＥＬにより、対物レンズ８の焦点Ｆにおいて試料Ｓは蛍光する。そして、直接的に対物レンズ８に回収される直接光と反射面９ａで反射した後に対物レンズ８に回収される反射光とにより干渉が生じる。ただし、励起光ＥＬは斜め方向から試料Ｓに入射しているため、干渉する領域は図７の領域Ｆ１、Ｆ２とは一致しない。
【００５６】
図７の領域Ｆ３は励起光ＥＬの領域Ｆ１によって蛍光する戻り光ＲＬの領域になり、領域Ｆ４は励起光ＥＬの領域Ｆ２によって蛍光する戻り光ＲＬの領域になる。励起光ＥＬが斜め方向から入射しているため、領域Ｆ１とＦ３とは一致せず、領域Ｆ２とＦ４とは一致しない。つまり、焦点Ｆの領域Ｆ３、Ｆ４は領域Ｆ１、Ｆ２からＺ方向にずれた位置になっている。
【００５７】
従って、励起光ＥＬと戻り光ＲＬとで干渉する領域にずれを生じる。このため、戻り光ＲＬが実際に蛍光する領域は領域Ｆ１とＦ３とが重なった領域になる。この領域は領域Ｆ１およびＦ３と比較して狭小な領域になる。つまり、戻り光ＲＬの強め合う領域を非常に狭小な領域とすることができる。また、これは反射面９ａに沿った焦点面についても同様の現象が発生し、これらは撮像素子１２に結像される。これにより焦点面について高い分解能を得ることができ、試料Ｓの画像を高解像度にすることができる。
【００５８】
また、図７に示すように、領域Ｆ２とＦ４とは重なる領域が生じていない。従って、領域Ｆ２およびＦ４は強度が高くはならない。領域Ｆ２とＦ４とが重なる領域を生じると、この重なる領域の強度が検出されるため、ＰＳＦに基づいてデコンボルーション処理を行って、当該領域の強度を除去するようにする。
【００５９】
この点、励起光ＥＬを斜め方向から入射しているため、領域Ｆ２とＦ４とに重なりを生じない。よって、格別なデコンボルーション処理を行う必要がなくなり、演算のための手間・時間を要しなくなる。なお、領域Ｆ２とＦ４とに重なりを生じるような場合には、ＰＳＦに基づいてデコンボルーション処理を行うようにしてもよい。
【００６０】
次に、変形例２について説明する。図８は変形例２の顕微鏡装置１を示している。この変形例２の顕微鏡装置１は、図６に示した実施例１を変形した顕微鏡装置１であり、新たにリレーレンズ３１、３２と光走査ユニット３３と蛍光フィルタ３４と集光レンズ３５とピンホール３６と検出器３７とを新たに追加している。
【００６１】
リレーレンズ３１、３２はダイクロイックミラー７で反射した戻り光ＲＬをリレーする。リレーされた戻り光ＲＬの位置には光走査ユニット３３が配置されている。光走査ユニット３３はガルバノミラー３３ａ、３３ｂを有して構成されており、リレーされた戻り光ＲＬを走査する。
【００６２】
走査された戻り光ＲＬは蛍光フィルタ３４により戻り光ＲＬの波長域のみが透過され、集光レンズ３５に入射する。集光レンズ３５は戻り光ＲＬをピンホール３６に集光させるように調整しており、ピンホール３６により焦点Ｆのみの戻り光ＲＬが通過されるようにしている。
【００６３】
そして、ピンホール３６を通過した戻り光ＲＬが検出部としての検出器３７で検出される。検出器３７は前述した撮像素子１２とは異なり、点として戻り光ＲＬを受光する。例えば、検出器３７としてはフォトディテクタを適用できる。試料Ｓからの戻り光ＲＬは光走査ユニット３３により走査されて、ピンホール３６を通過して検出器３７で検出される。つまり、焦点Ｆの領域に限定した試料Ｓの画像を観察する共焦点顕微鏡として用いることができる。従って、検出器３７が検出した戻り光に基づいて共焦点画像を生成することができるため、Ｚ方向の分解能を高くすることができる。
【００６４】
次に、変形例３について説明する。変形例３では顕微鏡装置１を構造化照明顕微鏡（Structured Illumination Microscopy）として用いている。ここでは、ランプ光源２ではなくＬＥＤ４１を用いている。また、図１の実施形態の集光レンズ３とピンホール４と励起フィルタ５とを備えていないが、新たにコリメートレンズ４２と回折格子４３と回折格子駆動部４４とを備えている。
【００６５】
ＬＥＤ４１が放出した励起光ＥＬはコリメートレンズ４２に入射する。コリメートレンズ４２は励起光ＥＬを平行光に変換する。そして、平行光に変換された励起光ＥＬが回折格子４３に入射する。回折格子４３の回折効果によって、励起光ＥＬは＋１次光、０次光、−１次光の３つに分岐する。そして、分岐した３つの励起光ＥＬが試料Ｓに入射する。
【００６６】
回折された３つの励起光ＥＬは相互に干渉することによって複雑な干渉パターンを形成する。これにより、反射面９ａに平行な方向（図９の３つの励起光ＥＬが配列した方向）に干渉縞を生じる。この干渉縞の縞方向成分（干渉縞の明暗を生じる方向、つまり３つの励起光ＥＬが配列した方向）に回折限界以下のモアレを生じ、干渉縞を反射面９ａの近傍で観察できる。
【００６７】
このときに、回折格子駆動部４４は回折格子４３をＺ軸に直交する方向に移動およびＺ軸を中心とした回転を行う。回折格子駆動部４４は干渉縞の位相が１２０度ずつずれるように回折格子４３を移動させる。つまり、３回の移動を行う。また、回折格子駆動部４４はＺ軸を中心として１２０度ずつ回転させる。つまり、３回の回転を行う。
【００６８】
回折格子駆動部４４は１回の回転を行う毎に３回の移動を行う。従って、移動および回転により合計９回の回折格子４３の駆動を行う。１回の駆動ごとに撮像素子１２に結像される戻り光ＲＬの像を検出して、演算部としての計算機１３が試料Ｓの画像生成を行う。従って、合計９枚の画像が生成される。
【００６９】
計算機１３は生成された９枚の画像を用いて数学的に演算を行うことにより１枚の高分解能画像を抽出する。この抽出された試料Ｓの画像はＸＹ方向に高い分解能の画像となる。このとき、回折された３つの励起光ＥＬはそれぞれ反射面９ａで反射し、直接光と反射光とが干渉して定在波を発生する。また、戻り光ＲＬにおいても干渉をする。これにより、Ｚ方向の分解能が高くなる。
【００７０】
従って、ＸＹ方向の分解能が高くなり、Ｚ方向の分解能も高くなることから、３次元に分解能を高くすることができる。つまり、立体的に試料Ｓの高解像度の画像を得ることができる。なお、回折格子４３は励起光ＥＬを３つに分岐していたが、５つ以上に分岐するものであってもよい。
【００７１】
次に、変形例４について説明する。変形例４はＰＡＬＭ（Photoactivated localization microscope）という手法に顕微鏡装置１を適用している。ここでは、ランプ光源ではなくレーザ光源を用い、且つ当該レーザ光源は２色のレーザ光を発振するものを用いる。このうち、１つはスイッチング用のレーザ光であり、もう１つは蛍光取得用のレーザ光である。
【００７２】
また、蛍光分子を個別に発光させるために、蛍光のＯＮ（蛍光可能な状態）とＯＦＦ（蛍光不可能な状態）とを切り替えることが可能な蛍光タンパク質（蛍光プローブ）を用いる。この蛍光プローブを蛍光がＯＦＦの状態で試料Ｓに導入する。この状態で非常に微弱なスイッチング用のレーザ光で蛍光プローブのスイッチングを行う。このときに、試料Ｓの各蛍光分子の距離が充分に離れた少数の蛍光分子だけがＯＮにされる条件下でスイッチングを行う。
【００７３】
その後に、蛍光取得用のレーザ光で計測された蛍光分子の点像分布にガウス関数によるフィッティングを行う。そして、その中心位置を分子の位置として記録する。続けて、このＯＮの状態の蛍光分子を退色させた後に、別の蛍光分子のスイッチングを行い、この方法を繰り返す。これにより、ＸＹ方向の分解能が極めて優れた画像を取得することができる。
【００７４】
このときに、励起光ＥＬとしてのレーザ光が反射面９ａで反射した反射光と対物レンズ８から直接的に入射した直接光とが干渉して定在波を発生している。また、戻り光ＲＬにおいても直接光と反射光とが干渉する。これにより、Ｚ方向の分解能を高くすることができる。従って、ＸＹ方向およびＺ方向において分解能を高くすることができ、３次元に高解像度の画像を得ることができる。
【符号の説明】
【００７５】
１ 顕微鏡装置
２ ランプ光源
３ 集光レンズ
４ ピンホール
５ 励起フィルタ
６ 投影レンズ
７ ダイクロイックミラー
８ 対物レンズ
９ 試料搭載部
９ａ 反射面
１０ 蛍光フィルタ
１２ 撮像素子
１３ 計算機
２１ 励起光学ユニット
２２ 光学ユニット移動機構
２３ 偏光板
３３ 光走査ユニット
３６ ピンホール
３７ 検出器
４２ コリメートレンズ
４３ 回折格子
４４ 回折格子駆動部
ＥＬ 励起光
ＲＬ 戻り光
Ｓ 試料
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に照明光を照射して、試料からの戻り光を検出して試料の画像を生成する顕微鏡装置、観察方法および試料搭載機構に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
蛍光色素や蛍光タンパク等を導入した試料に対して照明光を照射して蛍光を発生させ、発生した蛍光に基づいて試料の観察を行う顕微鏡装置が従来から用いられている。この顕微鏡として、特許文献１に開示されるＩ５Ｍ顕微鏡が用いられている。Ｉ５Ｍ顕微鏡は、光軸方向に高解像度の画像を生成するために用いられる顕微鏡であり、試料を挟んで相互に反対側に対物レンズを配置している。
【０００３】
試料を挟んだ２枚の対物レンズは相互に焦点位置が重なるように対向配置している。光ファイバにより導光された光は可干渉距離の短い励起光となっており、対物レンズにより平行光にされる。そして、各対物レンズの焦点面において２つの励起光を干渉させて試料を励起させる。この干渉により、焦点面近傍で定在波が発生すると共に、中心面における光強度が極大になる。
【０００４】
試料に入射する励起光は平行光であり、相互に干渉していることから、中心面に明暗の干渉縞が発生する。このときの、明となっている縞の間隔はλ／２となっていることから、狭小な領域を照明することができ、分解能を高くしている。
【０００５】
励起光が入射した試料は蛍光色素や蛍光タンパク等が励起して蛍光が発生する。この発生した蛍光は２つの対物レンズから回収されて、撮像素子に投影がされる。これにより、試料の像を観察している。このときに、２つの対物レンズから回収された蛍光を干渉させている。これにより、光軸方向の分解能をさらに向上させている。
【０００６】
また、Ｉ５Ｍ顕微鏡以外の技術としては、特許文献２に開示されている顕微鏡がある。この顕微鏡（Standing Wave Microscopy）は、２つの干渉光を用いて焦点面の近傍に定在波を発生させている。そして、この定在波の間隔を変化させて複数の画像を取得し、取得した画像を用いて計算を行うことにより特定の断面の画像を抽出している。
【０００７】
また、光軸方向に高い分解能を得ている顕微鏡としては全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦ顕微鏡）がある。このＴＩＲＦ顕微鏡では、励起光としてエバネッセント光を用いて、エバネッセント場を利用した局所的な励起を行っている。これにより、極めて被写体の深度を浅くすることができ、光軸方向の分解能を高くしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，６７１，０８５号明細書
【特許文献２】米国特許第５，３９４，２６８号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述したＩ５Ｍ顕微鏡は、試料を挟んで対向配置した２つの対物レンズから入射する励起光を干渉させて定在波を発生させている。このために、２つの対物レンズの焦点位置が正確に重なるように配置しなければならない。また、２つの対物レンズから回収された蛍光を干渉させているため、２つの蛍光の光路を重ね合わせる必要がある。従って、顕微鏡全体の光学調整を極めて厳格に行う必要があり、過剰に高い光学調整の精度が要求される。
【００１０】
また、Standing Wave Microscopy顕微鏡においては、特定の断面の画像を抽出するために、定在波の間隔が異なる多くの画像取得が必要になる。このため、画像取得動作が煩雑になり、複雑な演算処理を行わなければならない。
【００１１】
さらに、ＴＩＲＦ顕微鏡の場合には、エバネッセント場が発生する極めて限定された領域の画像が得られる。つまり、試料の厚さ数百ナノメートルでのみ励起光によって蛍光を発生するため、観察対象となる領域は深さ方向（Ｚ方向）において非常に限定された領域になる。これにより、深さ方向における観察の自由度が低下する。
【００１２】
そこで、本発明は、簡単な光学調整および演算処理で高解像度の試料の画像を得ると共に、光軸方向に自由度を持たせた観察を行うことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
以上の課題を解決するため、本発明の顕微鏡装置は、干渉性を有し、試料を励起させる励起光を発振する光源と、前記試料に前記励起光を照射したときに蛍光した戻り光を検出する検出部と、前記励起光を平行光として前記試料に入射させる対物レンズと、この対物レンズから直接的に入射する前記励起光と干渉させるための反射光を発生させる反射面を前記対物レンズの焦点の範囲内に配置して、前記反射面に前記試料を搭載した試料搭載部と、を備えたことを特徴とする。
【００１４】
この顕微鏡装置によれば、試料搭載部に反射面を形成している。これにより、レンズから直接的に入射する平行光の励起光と反射面で反射した平行光の励起光とが干渉して、光軸方向に分解能を高くすることができる。対物レンズは１つを用いているため、簡単な光学調整で行うことができ、多くの画像を取得して複雑な演算処理を行う必要もない。また、エバネッセント光を用いていないため、光軸方向に高い自由度で観察を行うことができる。
【００１５】
また、前記励起光が集光する位置を前記対物レンズの瞳位置の中心からずれた位置に配置したことを特徴とする。これにより、干渉により励起光が強め合う領域と干渉により戻り光が強め合う領域との間にずれを生じる。よって、これらの領域が重なった領域が画像化されるため、分解能を高くすることができる。
【００１６】
また、前記対物レンズに入射する前記励起光をＳ偏光に変換する偏光変換部を備えたことを特徴とする。これにより、励起光はＳ偏光の成分のみに変換されるため、干渉の効率を向上させて、分解能を高くすることができる。
【００１７】
また、前記対物レンズの焦点の範囲内の前記戻り光のみを前記検出部に通過させるピンホールと、前記戻り光を光軸方向に直交する方向に走査する走査部と、を備えたことを特徴とする。これにより、顕微鏡装置を共焦点顕微鏡として用いることができ、光軸方向に高い分解能を得ることができる。
【００１８】
また、前記光源からの前記励起光を回折する回折格子と、この回折格子を前記励起光の光軸と直交する方向に移動および前記光軸を中心として回転させる回折格子駆動部と、この回折格子駆動部により前記回折部を移動および回転させたときに前記検出部が検出した複数の前記戻り光の像に基づいて１つの画像を生成する演算を行う演算部と、を備えたことを特徴とする。これにより、顕微鏡装置を構造化照明顕微鏡として用いることができる。従って、光軸方向に直交する方向に高い分解能を得ることができ、３次元に分解能を高くすることができる。
【００１９】
また、前記光源は、蛍光可能な状態と不可能な状態とを切り替え可能な蛍光分子が導入された前記試料に対してスイッチング用のレーザ光を発振することを特徴とする。これにより、顕微鏡装置をＰＡＬＭに適用することができる。ＰＡＬＭでは個々の蛍光分子が蛍光するため、光軸に直交する方向の分解能が高くなる。従って、３次元に分解能の高い画像生成を行うことができる。
【００２０】
また、本発明の観察方法は、干渉性を有し、試料を励起させる励起光を対物レンズにより平行光にして、平行光にされた前記励起光を前記試料に照射したときに蛍光した戻り光を検出して観察するときに、前記試料を搭載する試料搭載部に形成された反射面で反射した反射光と前記対物レンズから直接的に入射する前記励起光とを干渉させていることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明の試料搭載機項は、干渉性を有し、試料を励起させる励起光をレンズにより平行光にして、平行光にされた前記励起光を前記試料に照射したときに蛍光した戻り光を検出して観察を行うときの前記試料を搭載する試料搭載機構であって、この試料搭載機構の前記励起光が入射する側の面に前記レンズから直接的に入射する前記励起光と干渉させるための反射光を発生させる反射面を形成したことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２２】
本発明は、試料搭載部の試料を搭載する面を反射面として、対物レンズにより平行光にされた励起光を入射している。これにより、対物レンズから直接的に入射した励起光と反射面で反射した励起光とを干渉させて光軸方向の分解能を高くしている。また、戻り光においても干渉させていることから、光軸方向に高い分解能の画像を生成することができる。対物レンズは１枚を用いているため、簡単な光学調整で実現することができる。また、多くの画像を取得して複雑な演算処理を行う必要もない。さらに、エバネッセント光を用いていないため、光軸方向に高い自由度で観察を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実施形態の顕微鏡装置の構成図である。
【図２】実施形態の焦点の状態を説明した図である。
【図３】励起光の強度分布を説明した図である。
【図４】戻り光の強度分布を説明した図である。
【図５】撮像素子で検出される戻り光の強度分布を説明した図である。
【図６】変形例１の顕微鏡装置の構成図である。
【図７】変形例１の焦点の状態を説明した図である。
【図８】変形例２の顕微鏡装置の構成図である。
【図９】変形例３の顕微鏡装置の構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、図面を参照して、本発明の実施形態について説明する。図１は顕微鏡装置１を示している。顕微鏡装置１はランプ光源２と集光レンズ３とピンホール４と励起フィルタ５と投影レンズ６とダイクロイックミラー７と対物レンズ８と試料搭載部９と蛍光フィルタ１０と結像レンズ１１と撮像素子１２と計算機１３とを備えて構成している。
【００２５】
ランプ光源２は可視光の波長域の光（白色光）を励起光ＥＬとして照射する光源である。図１において、励起光ＥＬの光路は破線で示している。集光レンズ３はランプ光源２が放出した励起光ＥＬを集光させる。ピンホール４は集光レンズ３の集光点に配置されている。励起フィルタ５は励起光ＥＬの波長域の光を選択的に透過するフィルタである。
【００２６】
投影レンズ６は励起フィルタ５を透過した励起光ＥＬを集光させる。この励起光ＥＬの光路にダイクロイックミラー７を配置している。ダイクロイックミラー７は励起光ＥＬの波長域の光を透過し、後述する戻り光ＲＬの波長域の光を反射する特性を有する光学部品である。励起光ＥＬはダイクロイックミラー７を透過して対物レンズ８に入射する。
【００２７】
投影レンズ６により励起光ＥＬは集光する。このときの集光位置は対物レンズ８の瞳位置（後ろ側焦点）になる。これにより、対物レンズ８により励起光ＥＬは平行光に変換される。この平行光となった励起光ＥＬが試料搭載部９に搭載された試料Ｓに入射する。試料Ｓには蛍光色素や蛍光タンパク等が導入されており、励起光ＥＬの波長により励起されて蛍光を発生する。この蛍光が戻り光ＲＬとなる。
【００２８】
試料搭載機構としての試料搭載部９は皿状になっている。そして、励起光ＥＬが入射する側の面を反射面９ａとしており、この反射面９ａに試料Ｓを搭載している。反射面９ａは励起光ＥＬおよび戻り光ＲＬを反射（全反射）する特性を有している。従って、反射面９ａは励起光ＥＬおよび戻り光ＲＬの波長の光を反射すれば、他の波長域の光は透過するものであってもよい。反射面９ａは対物レンズ８の焦点面近傍（焦点Ｆの範囲内）に配置するようにしている。
【００２９】
反射面９ａとしてはアルミニウムや金等の金属を用いたミラーコーティングを用いることもでき、励起光ＥＬおよび戻り光ＲＬを反射する誘電体多層膜を用いることもできる。なお、反射面９ａには保護層を形成してもよい。
【００３０】
試料Ｓが蛍光して発生した戻り光ＲＬ（図１の実線の光路）は対物レンズ８によって回収される。試料Ｓは対物レンズ８の焦点Ｆ（前側の焦点）位置に配置している。このため、試料Ｓからの戻り光ＲＬは対物レンズ８により平行光に変換される。この平行光となった戻り光ＲＬはダイクロイックミラー７で反射する。そして、ダイクロイックミラー７で反射した戻り光ＲＬは蛍光フィルタ１０に入射する。
【００３１】
蛍光フィルタ１０は戻り光ＲＬ（蛍光）の波長域の光のみ透過させる。この蛍光フィルタ１０を透過した戻り光ＲＬが結像レンズ１１により撮像素子１２に結像される。撮像素子１２は相互に直交する方向にＣＣＤを配置しており、戻り光ＲＬを平面で受光する。なお、撮像素子１２はカメラ等であってもよい。
【００３２】
撮像素子１２は受光した戻り光ＲＬの像を光電変換してデジタルデータ（光量データ）を生成する検出部になる。撮像素子１２が生成する光量データは計算機１３に出力される。計算機１３は演算部であり、コンピュータ等を適用できる。計算機１３は光量データに対して所定の演算処理を行うことで、試料Ｓの画像生成を行う。
【００３３】
次に、動作について説明する。ランプ光源２は干渉性を有する励起光ＥＬを照射して、この励起光ＥＬが集光レンズ３とピンホール４と励起フィルタ５と投影レンズ６とダイクロイックミラー７とを経て、対物レンズ８に入射する。対物レンズ８により励起光ＥＬは平行光にされて試料搭載部９に搭載された試料Ｓに入射する。
【００３４】
対物レンズ８に光軸に沿った平行光を導入した際にできる焦点の形状を図２のＦに示す。このように焦点Ｆは楕円形の領域になっており、焦点Ｆの中心が反射面９ａと一致するように対物レンズ８を調整している。また、焦点Ｆの近傍では励起光ＥＬは平行光になっている。このため、励起光ＥＬは反射面９ａに直接的に入射する光（直接光）と反射面９ａで反射した光（反射光）との２つの光が生じる。これら直接光と反射光とが干渉して試料Ｓ上に定在波を発生させる。
【００３５】
反射光は反射面９ａで反射しているため、直接光に対して位相が１８０度（λ／２相当）シフトする。反射光と直接光とは相互に向きが異なるため、直接光と反射光とが干渉して定在波（定常波）が発生する。この定在波により、反射面９ａからＺ方向（光軸方向）において「λ／４」の領域（図２の領域Ｆ１）では直接光と反射光とが強め合うように干渉する。領域Ｆ１は直接光と反射光との光路差が「λ／４＋λ／４＋λ／２＝λ」と１波長分になることから定在波の「腹」になり、強度が高くなる。
【００３６】
一方、反射面９ａから光軸方向において「λ／２」の領域（図示せず）では直接光と反射光とにより弱め合うような干渉が生じる。この領域は、直接光と反射光との光路差が「λ／２＋λ／２＋λ／２＝λ」と３／２波長分になることから、定在波の「節」になる。このために、強度が弱め合って、打ち消される。これにより、当該領域では蛍光（戻り光ＲＬ）が発生しなくなる。
【００３７】
また、反射面９ａから光軸方向において「（３／４）×λ」の領域（図２の領域Ｆ２）では直接光と反射光とが干渉して強め合う。これは、領域Ｆ２では直接光と反射光との光路差が「（３／４）×λ＋（３／４）×λ＋λ／２＝２×λ」と２波長分になるためである。ただし、この領域Ｆ２の部分は反射面９ａからＦ１よりも離れた位置になっている。ここでランプ光源２から発せられる光は干渉距離が短いため、直接光と反射光とに光路差が生じるにつれて干渉強度が弱くなり、領域Ｆ２は領域Ｆ１に比べて強度が弱くなっている。従って、領域Ｆ２はＦ１よりも暗い領域となる。
【００３８】
さらに、反射面９ａから光軸方向においてλの領域（図示せず）では直接光と反射光とが弱め合うような干渉が生じ、打ち消される。つまり、当該領域では直接光と反射光との光路差が「λ＋λ＋λ／２＝（５／２）×λ」と５／２波長分となっている。これにより、弱め合って打ち消される。このため、蛍光（戻り光ＲＬ）が発生しなくなる。
【００３９】
また、反射面９ａから光軸方向において「（５／４）×λ」の領域（図２の領域Ｆ３）では直接光と反射光とが干渉して強め合う。これは、領域Ｆ３では直接光と反射光との光路差が「（５／４）×λ＋（５／４）×λ＋λ／２＝３×λ」と３波長分になるためである。ただし、この領域Ｆ３の部分は反射面９ａからＦ２よりも離れた位置になっている。ここでランプ光源２から発せられる光は干渉距離が短いため、直接光と反射光とに光路差が生じるにつれて干渉強度が弱くなり、領域Ｆ３は領域Ｆ２に比べて強度が弱くなっている。従って、領域Ｆ３はＦ２よりも暗い領域となる。
【００４０】
従って、定在波によって励起光ＥＬが強め合う領域Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３と弱め合う領域（領域Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３以外の領域）とが発生する。図２では定在波により強め合う領域はＦ１、Ｆ２、Ｆ３となっているが、これが連続して、明暗の縞を構成する。これにより、励起光ＥＬが明るくなっている領域を狭小な領域とすることができる。つまり、全体の領域に対して「明」の領域が限定的になっている。
【００４１】
従って、Ｚ方向に分解能を高くすることができる。図３は励起光ＥＬのＺ方向の光の強度分布を示しており、この図に示すように、３つの領域（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３）の強度が強くなっている。なお、図中において「光強度」は光の強度を示している。
【００４２】
一方、励起光ＥＬによって試料Ｓの蛍光色素や蛍光タンパク等が励起されて、蛍光することにより戻り光ＲＬが発生する。この戻り光ＲＬは対物レンズ８により回収されて、ダイクロイックミラー７で反射する。そして、蛍光フィルタ１０で反射して、結像レンズ１１により撮像素子１２に結像される。この撮像素子１２には対物レンズ８の焦点Ｆの範囲内で蛍光した戻り光ＲＬが検出される。
【００４３】
そして、対物レンズ８の焦点Ｆの中心が反射面９ａの中心となるようにしている。このため、試料Ｓが蛍光したときの戻り光ＲＬは直接的に対物レンズ８に入射する光（直接光）と反射面９ａで反射した後に対物レンズ８に入射する光（反射光）との２つが生じる。焦点Ｆで蛍光した戻り光ＲＬのうち領域Ｆ１およびＦ２の光は、それぞれ直接光と反射光との光路差がλおよび２×λとなる。
【００４４】
試料Ｓが蛍光した戻り光ＲＬは干渉性を有している。よって、戻り光ＲＬの直接光と反射光とが干渉して、強め合う領域と弱め合う領域とが発生する。撮像素子１２では焦点Ｆの範囲内の光を検出するため、焦点Ｆから外れた位置にある領域Ｆ３の戻り光ＲＬは撮像素子１２では検出されない。
【００４５】
従って、焦点Ｆのうち領域Ｆ１、Ｆ２の戻り光ＲＬのみが撮像素子１２に検出される。このときの戻り光ＲＬについての強度分布は図４に示すようになっている。つまり、２つの領域（Ｆ１、Ｆ２）の強度が高くなっているが、それ以外の領域での強度は低くなっている。また、領域Ｆ１の部分は領域Ｆ２よりも反射面９ａに近い位置になっている。ここで発せられる蛍光も干渉距離が短いため、直接光と反射光とに光路差が生じるにつれて干渉強度が弱くなり、領域Ｆ１は領域Ｆ２に比べて強度が強くなっている。
【００４６】
図４は戻り光ＲＬについてのみの強度分布になっている。この点、励起光ＥＬおよび戻り光ＲＬの両方について干渉の効果を生じる。そして、励起光ＥＬおよび戻り光ＲＬの両方で干渉の効果を生じた光が撮像素子１２に結像される。従って、撮像素子１２に結像される戻り光ＲＬは、励起光ＥＬおよび戻り光ＲＬの両者の相乗効果により、図５のような強度分布になる。つまり、図３および図４のガウシアン分布よりもシャープな形になり、２つの領域（Ｆ１、Ｆ２）と他の領域との強度に明確な差を生じる。
【００４７】
つまり、励起光ＥＬと戻り光ＲＬとの両者を干渉させることで、Ｚ方向に分解能を高くすることができる。また、これまでは対物レンズ８に光軸に沿った平行光を導入した際にできる焦点Ｆについて着目して説明を行ったが、これは反射面９ａに沿った焦点面についても同様の現象が発生する。これらの焦点面の情報は撮像素子１２に結像される。これにより、撮像素子１２が検出する戻り光ＲＬの分解能が高くなる。計算機１３は撮像素子１２が検出した戻り光ＲＬの光量データに基づいて画像生成を行う。よって、Ｚ方向の分解能が高くなるために、生成される試料Ｓの画像を高解像度にすることができる。
【００４８】
ところで、撮像素子１２が受光した光のうち観察対象となるのは狭小な領域Ｆ１であり、領域Ｆ２は観察対象にはなっていない。この点、図５にも示すように、領域Ｆ２についても僅かな強度が生じている。そこで、領域Ｆ２の影響を取り除くデコンボルーション処理を行う。
【００４９】
このデコンボルーション処理は、計算機１３が行う。計算機１３は撮像素子１２に受光された戻り光ＲＬについて、点像分布関数（ＰＳＦ）を用いて、領域Ｆ２を除去する演算を行う。或いは、戻り光ＲＬを実測して領域Ｆ２を除去するように処理を行う。このデコンボルーション処理を行うことで、領域Ｆ１のみの蛍光を観察することができ、より狭小な領域の戻り光ＲＬを検出できる。これにより、分解能を高くすることができる。
【００５０】
従って、Ｚ方向において高い分解能で試料Ｓを観察することができる。以上において励起光ＥＬとして単色光を用いてもよい。この場合には、ランプ光源２ではなくＬＥＤ光源等が考えられる。ＬＥＤ光源を用いる場合には、複数のＬＥＤ光源を用いて複数波長の単色光を選択的に使用可能な構成とし、蛍光色素の色に応じた波長を持つＬＥＤ光源を用いる。従って、蛍光色素の色を変えたときには、ＬＥＤ光源から発せられる単色光は蛍光色素の色に応じた波長とする。これにより、複数の色の蛍光色素の画像取得を行うことができる。また、励起光ＥＬをＳＬＤ（Super Luminescent Diode）光源としても同様の効果が得られる。
【００５１】
次に、変形例１について説明する。図６に示すように、変形例１では、ランプ光源２と集光レンズ３とピンホール４と励起フィルタ５と投影レンズ６とを一体的な励起光学ユニット２１として構成している。また、励起光学ユニット２１を光軸方向と直交する方向に移動させる集光位置移動部を光学ユニット移動機構２２として設けている。また、励起フィルタ５と投影レンズ６との間に偏光板２３を挿入している。
【００５２】
偏光変換部としての偏光板２３は励起光ＥＬをＳ偏光光に変換する光学部品である。Ｓ偏光は偏光面が入射面（励起光ＥＬと反射面９ａの法線とにより形成される面）と直交する方向の面を振動する偏光成分の光となる。偏光板２３は単体の光学部品として設けてもよいし、偏光板２３の機能（例えば、偏光分離膜）を励起フィルタ５に形成するものであってもよい。
【００５３】
光学ユニット移動機構２２は励起光学ユニット２１をＺ軸と直交する方向（図中の矢印の方向）に移動させる集光位置移動部である。励起光ＥＬは投影レンズ６により集光されており、光学ユニット移動機構２２が励起光額ユニット２１を移動させることにより、励起光ＥＬが集光する位置が対物レンズ８の瞳位置の中心から移動してずれた位置になる。これにより、励起光ＥＬはＺ方向に対して斜め方向に進行する平行光に変換される。よって、試料Ｓには斜め方向から励起光ＥＬが入射する。
【００５４】
このとき、励起光ＥＬは対物レンズ８から直接的に入射する直接光と反射面９ａで反射した反射光とが干渉して定在波を発生する。ただし、励起光ＥＬはＺ軸に対して斜めの方向から入射しているため、図７に示すように、励起光ＥＬが干渉により強め合う領域Ｆ１と領域Ｆ２との間隔は図２の場合と比較して広くなっている。
【００５５】
励起光ＥＬにより、対物レンズ８の焦点Ｆにおいて試料Ｓは蛍光する。そして、直接的に対物レンズ８に回収される直接光と反射面９ａで反射した後に対物レンズ８に回収される反射光とにより干渉が生じる。ただし、励起光ＥＬは斜め方向から試料Ｓに入射しているため、干渉する領域は図７の領域Ｆ１、Ｆ２とは一致しない。
【００５６】
図７の領域Ｆ３は励起光ＥＬの領域Ｆ１によって蛍光する戻り光ＲＬの領域になり、領域Ｆ４は励起光ＥＬの領域Ｆ２によって蛍光する戻り光ＲＬの領域になる。励起光ＥＬが斜め方向から入射しているため、領域Ｆ１とＦ３とは一致せず、領域Ｆ２とＦ４とは一致しない。つまり、焦点Ｆの領域Ｆ３、Ｆ４は領域Ｆ１、Ｆ２からＺ方向にずれた位置になっている。
【００５７】
従って、励起光ＥＬと戻り光ＲＬとで干渉する領域にずれを生じる。このため、戻り光ＲＬが実際に蛍光する領域は領域Ｆ１とＦ３とが重なった領域になる。この領域は領域Ｆ１およびＦ３と比較して狭小な領域になる。つまり、戻り光ＲＬの強め合う領域を非常に狭小な領域とすることができる。また、これは反射面９ａに沿った焦点面についても同様の現象が発生し、これらは撮像素子１２に結像される。これにより焦点面について高い分解能を得ることができ、試料Ｓの画像を高解像度にすることができる。
【００５８】
また、図７に示すように、領域Ｆ２とＦ４とは重なる領域が生じていない。従って、領域Ｆ２およびＦ４は強度が高くはならない。領域Ｆ２とＦ４とが重なる領域を生じると、この重なる領域の強度が検出されるため、ＰＳＦに基づいてデコンボルーション処理を行って、当該領域の強度を除去するようにする。
【００５９】
この点、励起光ＥＬを斜め方向から入射しているため、領域Ｆ２とＦ４とに重なりを生じない。よって、格別なデコンボルーション処理を行う必要がなくなり、演算のための手間・時間を要しなくなる。なお、領域Ｆ２とＦ４とに重なりを生じるような場合には、ＰＳＦに基づいてデコンボルーション処理を行うようにしてもよい。
【００６０】
次に、変形例２について説明する。図８は変形例２の顕微鏡装置１を示している。この変形例２の顕微鏡装置１は、図６に示した実施例１を変形した顕微鏡装置１であり、新たにリレーレンズ３１、３２と光走査ユニット３３と蛍光フィルタ３４と集光レンズ３５とピンホール３６と検出器３７とを新たに追加している。
【００６１】
リレーレンズ３１、３２はダイクロイックミラー７で反射した戻り光ＲＬをリレーする。リレーされた戻り光ＲＬの位置には光走査ユニット３３が配置されている。光走査ユニット３３はガルバノミラー３３ａ、３３ｂを有して構成されており、リレーされた戻り光ＲＬを走査する。
【００６２】
走査された戻り光ＲＬは蛍光フィルタ３４により戻り光ＲＬの波長域のみが透過され、集光レンズ３５に入射する。集光レンズ３５は戻り光ＲＬをピンホール３６に集光させるように調整しており、ピンホール３６により焦点Ｆのみの戻り光ＲＬが通過されるようにしている。
【００６３】
そして、ピンホール３６を通過した戻り光ＲＬが検出部としての検出器３７で検出される。検出器３７は前述した撮像素子１２とは異なり、点として戻り光ＲＬを受光する。例えば、検出器３７としてはフォトディテクタを適用できる。試料Ｓからの戻り光ＲＬは光走査ユニット３３により走査されて、ピンホール３６を通過して検出器３７で検出される。つまり、焦点Ｆの領域に限定した試料Ｓの画像を観察する共焦点顕微鏡として用いることができる。従って、検出器３７が検出した戻り光に基づいて共焦点画像を生成することができるため、Ｚ方向の分解能を高くすることができる。
【００６４】
次に、変形例３について説明する。変形例３では顕微鏡装置１を構造化照明顕微鏡（Structured Illumination Microscopy）として用いている。ここでは、ランプ光源２ではなくＬＥＤ４１を用いている。また、図１の実施形態の集光レンズ３とピンホール４と励起フィルタ５とを備えていないが、新たにコリメートレンズ４２と回折格子４３と回折格子駆動部４４とを備えている。
【００６５】
ＬＥＤ４１が放出した励起光ＥＬはコリメートレンズ４２に入射する。コリメートレンズ４２は励起光ＥＬを平行光に変換する。そして、平行光に変換された励起光ＥＬが回折格子４３に入射する。回折格子４３の回折効果によって、励起光ＥＬは＋１次光、０次光、−１次光の３つに分岐する。そして、分岐した３つの励起光ＥＬが試料Ｓに入射する。
【００６６】
回折された３つの励起光ＥＬは相互に干渉することによって複雑な干渉パターンを形成する。これにより、反射面９ａに平行な方向（図９の３つの励起光ＥＬが配列した方向）に干渉縞を生じる。この干渉縞の縞方向成分（干渉縞の明暗を生じる方向、つまり３つの励起光ＥＬが配列した方向）に回折限界以下のモアレを生じ、干渉縞を反射面９ａの近傍で観察できる。
【００６７】
このときに、回折格子駆動部４４は回折格子４３をＺ軸に直交する方向に移動およびＺ軸を中心とした回転を行う。回折格子駆動部４４は干渉縞の位相が１２０度ずつずれるように回折格子４３を移動させる。つまり、３回の移動を行う。また、回折格子駆動部４４はＺ軸を中心として１２０度ずつ回転させる。つまり、３回の回転を行う。
【００６８】
回折格子駆動部４４は１回の回転を行う毎に３回の移動を行う。従って、移動および回転により合計９回の回折格子４３の駆動を行う。１回の駆動ごとに撮像素子１２に結像される戻り光ＲＬの像を検出して、演算部としての計算機１３が試料Ｓの画像生成を行う。従って、合計９枚の画像が生成される。
【００６９】
計算機１３は生成された９枚の画像を用いて数学的に演算を行うことにより１枚の高分解能画像を抽出する。この抽出された試料Ｓの画像はＸＹ方向に高い分解能の画像となる。このとき、回折された３つの励起光ＥＬはそれぞれ反射面９ａで反射し、直接光と反射光とが干渉して定在波を発生する。また、戻り光ＲＬにおいても干渉をする。これにより、Ｚ方向の分解能が高くなる。
【００７０】
従って、ＸＹ方向の分解能が高くなり、Ｚ方向の分解能も高くなることから、３次元に分解能を高くすることができる。つまり、立体的に試料Ｓの高解像度の画像を得ることができる。なお、回折格子４３は励起光ＥＬを３つに分岐していたが、５つ以上に分岐するものであってもよい。
【００７１】
次に、変形例４について説明する。変形例４はＰＡＬＭ（Photoactivated localization microscope）という手法に顕微鏡装置１を適用している。ここでは、ランプ光源ではなくレーザ光源を用い、且つ当該レーザ光源は２色のレーザ光を発振するものを用いる。このうち、１つはスイッチング用のレーザ光であり、もう１つは蛍光取得用のレーザ光である。
【００７２】
また、蛍光分子を個別に発光させるために、蛍光のＯＮ（蛍光可能な状態）とＯＦＦ（蛍光不可能な状態）とを切り替えることが可能な蛍光タンパク質（蛍光プローブ）を用いる。この蛍光プローブを蛍光がＯＦＦの状態で試料Ｓに導入する。この状態で非常に微弱なスイッチング用のレーザ光で蛍光プローブのスイッチングを行う。このときに、試料Ｓの各蛍光分子の距離が充分に離れた少数の蛍光分子だけがＯＮにされる条件下でスイッチングを行う。
【００７３】
その後に、蛍光取得用のレーザ光で計測された蛍光分子の点像分布にガウス関数によるフィッティングを行う。そして、その中心位置を分子の位置として記録する。続けて、このＯＮの状態の蛍光分子を退色させた後に、別の蛍光分子のスイッチングを行い、この方法を繰り返す。これにより、ＸＹ方向の分解能が極めて優れた画像を取得することができる。
【００７４】
このときに、励起光ＥＬとしてのレーザ光が反射面９ａで反射した反射光と対物レンズ８から直接的に入射した直接光とが干渉して定在波を発生している。また、戻り光ＲＬにおいても直接光と反射光とが干渉する。これにより、Ｚ方向の分解能を高くすることができる。従って、ＸＹ方向およびＺ方向において分解能を高くすることができ、３次元に高解像度の画像を得ることができる。
【符号の説明】
【００７５】
１ 顕微鏡装置
２ ランプ光源
３ 集光レンズ
４ ピンホール
５ 励起フィルタ
６ 投影レンズ
７ ダイクロイックミラー
８ 対物レンズ
９ 試料搭載部
９ａ 反射面
１０ 蛍光フィルタ
１２ 撮像素子
１３ 計算機
２１ 励起光学ユニット
２２ 光学ユニット移動機構
２３ 偏光板
３３ 光走査ユニット
３６ ピンホール
３７ 検出器
４２ コリメートレンズ
４３ 回折格子
４４ 回折格子駆動部
ＥＬ 励起光
ＲＬ 戻り光
Ｓ 試料
【特許請求の範囲】
【請求項１】
干渉性を有し、試料を励起させる励起光を発振する光源と、
前記試料に前記励起光を照射したときに蛍光した戻り光を検出する検出部と、
前記励起光を平行光として前記試料に入射させる対物レンズと、
この対物レンズから直接的に入射する前記励起光と干渉させるための反射光を発生させる反射面を前記対物レンズの焦点の範囲内に配置して、前記反射面に前記試料を搭載した試料搭載部と、
を備えたことを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
前記励起光が集光する位置を前記対物レンズの瞳位置の中心からずれた位置に配置したことを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記対物レンズに入射する前記励起光をＳ偏光に変換する偏光変換部を備えたこと
を特徴とする請求項２記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記対物レンズの焦点の範囲内の前記戻り光のみを前記検出部に通過させるピンホールと、
前記戻り光を光軸方向に直交する方向に走査する走査部と、
を備えたことを特徴とする請求項３記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記光源からの前記励起光を回折する回折格子と、
この回折格子を前記励起光の光軸と直交する方向に移動および前記光軸を中心として回転させる回折格子駆動部と、
この回折格子駆動部により前記回折部を移動および回転させたときに前記検出部が検出した複数の前記戻り光の像に基づいて１つの画像を生成する演算を行う演算部と、
を備えたことを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
【請求項６】
前記光源は、蛍光可能な状態と不可能な状態とを切り替え可能な蛍光分子が導入された前記試料に対してスイッチング用のレーザ光を発振すること
を特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
【請求項７】
干渉性を有し、試料を励起させる励起光を対物レンズにより平行光にして、平行光にされた前記励起光を前記試料に照射したときに蛍光した戻り光を検出して観察するときに、
前記試料を搭載する試料搭載部に形成された反射面で反射した反射光と前記対物レンズから直接的に入射する前記励起光とを干渉させていること
を特徴とする観察方法。
【請求項８】
干渉性を有し、試料を励起させる励起光をレンズにより平行光にして、平行光にされた前記励起光を前記試料に照射したときに蛍光した戻り光を検出して観察を行うときの前記試料を搭載する試料搭載機構であって、
この試料搭載機構の前記励起光が入射する側の面に前記レンズから直接的に入射する前記励起光と干渉させるための反射光を発生させる反射面を形成したこと
を特徴とする試料搭載機構。
【請求項１】
干渉性を有し、試料を励起させる励起光を発振する光源と、
前記試料に前記励起光を照射したときに蛍光した戻り光を検出する検出部と、
前記励起光を平行光として前記試料に入射させる対物レンズと、
この対物レンズから直接的に入射する前記励起光と干渉させるための反射光を発生させる反射面を前記対物レンズの焦点の範囲内に配置して、前記反射面に前記試料を搭載した試料搭載部と、
を備えたことを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
前記励起光が集光する位置を前記対物レンズの瞳位置の中心からずれた位置に配置したことを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記対物レンズに入射する前記励起光をＳ偏光に変換する偏光変換部を備えたこと
を特徴とする請求項２記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記対物レンズの焦点の範囲内の前記戻り光のみを前記検出部に通過させるピンホールと、
前記戻り光を光軸方向に直交する方向に走査する走査部と、
を備えたことを特徴とする請求項３記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記光源からの前記励起光を回折する回折格子と、
この回折格子を前記励起光の光軸と直交する方向に移動および前記光軸を中心として回転させる回折格子駆動部と、
この回折格子駆動部により前記回折部を移動および回転させたときに前記検出部が検出した複数の前記戻り光の像に基づいて１つの画像を生成する演算を行う演算部と、
を備えたことを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
【請求項６】
前記光源は、蛍光可能な状態と不可能な状態とを切り替え可能な蛍光分子が導入された前記試料に対してスイッチング用のレーザ光を発振すること
を特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
【請求項７】
干渉性を有し、試料を励起させる励起光を対物レンズにより平行光にして、平行光にされた前記励起光を前記試料に照射したときに蛍光した戻り光を検出して観察するときに、
前記試料を搭載する試料搭載部に形成された反射面で反射した反射光と前記対物レンズから直接的に入射する前記励起光とを干渉させていること
を特徴とする観察方法。
【請求項８】
干渉性を有し、試料を励起させる励起光をレンズにより平行光にして、平行光にされた前記励起光を前記試料に照射したときに蛍光した戻り光を検出して観察を行うときの前記試料を搭載する試料搭載機構であって、
この試料搭載機構の前記励起光が入射する側の面に前記レンズから直接的に入射する前記励起光と干渉させるための反射光を発生させる反射面を形成したこと
を特徴とする試料搭載機構。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１２−２０３２７２（Ｐ２０１２−２０３２７２Ａ）
【公開日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−６９０９３（Ｐ２０１１−６９０９３）
【出願日】平成２３年３月２８日（２０１１．３．２８）
【出願人】（０００００６５０７）横河電機株式会社 (4,443)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月２８日（２０１１．３．２８）
【出願人】（０００００６５０７）横河電機株式会社 (4,443)
【Ｆターム（参考）】
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