飼料添加剤としてのジペプチド
本発明は、ジペプチド又はその塩を含有する飼料添加剤、この添加剤を含有する飼料混合物及びジペプチドの製法に関し、この際、ジペプチドの１個のアミノ酸残基は、ＤＬ‐メチオニル基であり、かつジペプチドの他のアミノ酸残基は、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン及びシスチンの群から選択されるＬ‐立体配置のアミノ酸である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のメチオニン結合した非天然及び天然の、必須制限アミノ酸、例えば、リジン、スレオニン及びトリプトファン、硫黄含有アミノ酸、システイン及びシスチンのジペプチド、及びその合成及び有用動物、例えば、鶏、豚、反芻動物の、しかし殊にまた、水産養殖からの魚及び甲殻類の飼育用の飼料添加剤としての使用に関する。
【０００２】
公知技術水準
必須アミノ酸（ＥＡＡ）メチオニン、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン及びアルギニン、及び２種の硫黄含有アミノ酸システイン及びシスチンは、飼料における極めて重要な成分であり、有用動物、例えば、鶏、豚及び反芻動物の経済的飼育で重要な役割を果たす。この際、特に、ＥＡＡｓの最適分配及び十分な供給が決定的である。天然たんぱく質給源、例えば、大豆、トウモロコシ及び小麦からの飼料は、大抵、一定のＥＡＡｓが欠失しているので、一方で、動物のより早い成長又は高生産乳牛におけるより高い乳生産のために、しかしまた他方で全飼料のより有効な利用のために、合成のＥＡＡｓ、例えば、ＤＬ‐メチオニン、Ｌ‐リジン、Ｌ‐スレオニン又はＬ‐トリプトファンを照準的に補充することが可能である。このことは極めて大きな経済的利点である。飼料添加剤の市場は、大きな工業的及び経済的な重要性を有する。更にこれは、特に、例えば、中国及びインドのような国の増大する重要性に帰し得る強力な成長市場である。
【０００３】
多種動物にとって、Ｌ‐メチオニン（（Ｓ）‐２‐アミノ‐４‐メチルチオ酪酸）は、全てのＥＡＡｓの第一制限アミノ酸であり、従って、動物栄養において及び飼料添加剤として重要な役割を果たす（Rosenberg et al., J. Agr. Food Chem. 1957, 5, 694-700）。しかしメチオニンは、古典的な化学合成では、ラセミ化合物、Ｄ‐メチオニン及びＬ‐メチオニンからの５０：５０混合物として生じる。このラセミ化合物のＤＬ‐メチオニンを、飼料添加剤として直接使用することができるが、それというのも、数種の動物では、生体内（in vivo）条件下にメチオニンの非天然のＤ‐エナンチオマーを天然Ｌ‐エナンチオマーに転換させる転換機構が成り立つからである。この際、Ｄ‐メチオニンは、非特異的Ｄ‐オキシダーゼによって、先ずα‐ケト‐メチオニンに脱アミン化され、引き続いて更にＬ‐トランスアミナーゼでＬ‐メチオニンに転換される（Baker, D. H. "Amino acids in farm animal nutrition"中, D' Mello, J. P. F. (ed.), Wallingford (UK), CAB‐International, 1994, 37-61）。それによって、成長のために動物が有効に利用し得るＬ‐メチオニンの有効量が生物体中で高められる。Ｄ‐メチオニンからＬ‐メチオニンへの酵素的転換は、鶏、豚及び乳牛で、しかし殊に魚、小エビ及び車エビでも確認された。即ち、例えば、Sveier et al. (Aquacult. Nutr. 2001, 7(3), 169-181）及びKim et al. (Aquaculture 1992, 101(1-2), 95-103）は、Ｄ‐メチオニンからＬ‐メチオニンへの転換が肉食性タイセイヨウサケ及びニジマスで可能であることを示し得た。同様のことが、Robinson et al. (J. Nutr. 1978, 108(12), 1932-1936）及びSchwarz et al. (Aquaculture 1998, 161, 121-129）によって、雑食種の魚、例えば、ナマズ及びコイについて示され得た。更に、Forster及びDominy(J. World Aquacult. Soc. 2006, 37(4), 474-480）は、Litopenaeus vannamei種の雑食性小エビの飼育試験で、ＤＬ‐メチオニンが、Ｌ‐メチオニンと同様の有効性を有することを示し得た。２００７年には、世界的に、結晶性ＤＬ‐メチオニン又はラセミ化合物の液体のメチオニン‐ヒドロキシ同族体（ＭＨＡ、rac‐２‐ヒドロキシ‐４‐（メチルチオ）ブタン酸（ＨＭＢ））及び固体のカルシウム‐ＭＨＡ７００００トン（ｔ）以上が生産され、単一胃動物、例えば、鶏及び豚において飼料添加剤として直接有効に使用された。
【０００４】
メチオニンに対して、リジン、スレオニン及びトリプトファンについては、各々の場合に、Ｌ‐エナンチオマーのみを飼料添加剤として使用することができ、それというのも、これらの３種の必須及び制限アミノ酸の各Ｄ‐エナンチオマーは、生物体によって生理学的条件下に、相応するＬ‐エナンチオマーに転換され得ないからである。即ち、Ｌ‐リジン、第一制限アミノ酸の世界市場だけは、例えば、豚においては、２００７年には１００万トン以上であった。他の２種の制限必須アミノ酸、Ｌ‐スレオニン及びＬ‐トリプトファンについては、世界市場は、２００７年では、１０００００ｔ以上又は僅かに３０００ｔ以下であった。
【０００５】
単胃動物、例えば、家禽及び豚では、通常、ＤＬ‐メチオニン、ＭＨＡが、しかしＬ‐リジン、Ｌ‐スレオニン及びＬ‐トリプトファンも、飼料添加剤として直接使用される。これに対して、反芻動物におけるＥＡＡｓ、例えば、メチオニン、リジン、スレオニン又は同様にＭＨＡの飼料の補充は、その主要量が反芻動物の第一胃中で微生物によって分解されるので有効ではない。従って、この分解に基づき、補充ＥＡＡｓの断片のみが動物の小腸に到達し、そこで一般に血液中への吸収が行なわれる。反芻動物では、ＥＡＡｓの内で、特にメチオニンが決定的な役割を果たし、それというのも、高い乳生産は最適な供給でのみ保証されるからである。反芻動物に、メチオニンを高効率で利用させ得るためには、第一胃耐性保護の形態が使用されるべきである。この際、この特性をＤＬ‐メチオニン又はrac‐ＭＨＡに与える幾つかの可能性がある。１つの可能性は、好適な保護層の塗布又は保護マトリックス中のメチオニンの分配によって高い第一胃耐性を達成することにある。それによって、メチオニンは実際に損失なしに第一胃を通過することができる。次いで更に経過して、例えば、反芻動物の第四胃で、保護層は酸性加水分解によって除去され、更に遊離メチオニンは小腸で吸収され得る。商業的に得られる製品は、例えば、Firma Evonik DegussaのMepron（Ｒ）及びFirma AdisseoのSmartamine（ＴＭ）である。メチオニンの製造又は被覆は、技術的に複雑でかつ経費のかかる方法であり、従って、高価である。更に、完成ペレットの表面被覆は、飼料を加工する間に、機械的負荷及び磨耗によって容易に損傷され、このことは保護被覆の減少又は完全な損失にまで成り得る。従って、保護メチオニンペレットをより大きな混合飼料ペレットに加工することも、それによって再び保護層が機械的応力によって崩壊されるので同様に不可能である。このことはそのような生成物の使用を制限する。第一胃耐性の向上のためのもう１つの可能性は、メチオニン又はＭＨＡの化学的誘導体化である。この際、分子の官能基を好適な保護基で誘導体化させる。これは、例えば、カルボン酸官能基とアルコールとのエステル化によって行われ得る。それによって、第一胃中の微生物による分解が減少され得る。商業的に得られる化学的保護製品は、例えば、Metasmart（ＴＭ）、ＭＨＡのラセミ化合物イソ‐プロピルエステル（ＨＭＢｉ）である。ＷＯ００／２８８３５に、反芻動物において、ＨＭＢｉについて少なくとも５０％の生物有効性が公開された。メチオニン又はＭＨＡの化学的誘導体化の欠点は、しばしば、より悪化された生物有効性及び比較的低い作用物質含量にある。
【０００６】
しかし、反芻動物における補充ＥＡＡｓ、例えば、メチオニン、リジン又はスレオニンの、第一胃中での分解の問題の他に、魚及び甲殻類においても、飼料へのＥＡＡｓの補充の際に様々な問題が生じ得る。近年この分野において、高工業化水産養殖での魚養殖及び甲殻類養殖の急激な経済的発展により、必須かつ制限アミノ酸の最適で、経済的かつ有効的な補充可能性が益々重要な役割を果たしている（Food and Agriculture Organization of the United Nation (FAO) Fisheries Department "State of World Aquaculture 2006", 2006, Rome. international Food Policy Research institute (IFPRI) "Fish 2020: Supply and Demand Changing Markets", 2003, Washington, D. C.）。しかしこの際、飼料添加剤として結晶性ＥＡＡｓの使用で、鶏及び豚に対して、一定の魚種及び甲殻類種で様々な問題が生じ得る。即ち、Rumsey及びKetola (J. Fish. Res. Bd. Can. 1975, 32, 422-426）は、個々の補充された結晶性アミノ酸と関連した大豆粉の使用が、ニジマスでは成長上昇を導かないことを報告している。Murai et al. (Bull. Japan. Soc. Sci. Fish. 1984, 50 (11), 1957）は、コイにおいて、補充された結晶性アミノ酸を毎日高い割当量で魚餌飼育するにより、遊離アミノ酸の４０％以上がエラ及び腎臓を介して排泄されることを示した。飼料摂取直後に、補充アミノ酸の急速な吸収に基づき、魚の血漿中でアミノ酸濃度の極めて急速な上昇が起きる（高速応答（Fast-Response））。しかしこの時点で、天然たんぱく質給源、例えば、大豆粉からの他のアミノ酸は未だ血漿中に存在せず、これは重要な全アミノ酸の同時取得の非同時性に成り得る。従って、高濃度のアミノ酸の一部は急速に排泄され、又は生物体中で急速に代謝され、かつ、例えば、純粋なエネルギー源として利用される。それによって、コイの場合には、飼料添加剤として結晶性アミノ酸を使用した場合に、成長上昇が低くなり、又は成長上昇がないことになるだけである（Aoe et al., Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 1970, 36, 407-413）。甲殻類では、結晶性ＥＡＡｓの補充は更に他の問題を生じさせ得る。一定の甲殻類、例えば、Litopenaeus Vannamei種の小エビの遅速な食い特性によって、飼料が水下で長時間滞留することにより、補充された水溶性ＥＡＡｓの溶出（Leaching）が起こり、このことは海洋の富栄養化を導き、かつ動物の成長上昇に結びつかない（Alam et al., Aquaculture 2005, 248, 13-16）。従って、水産養殖で保持される魚及び甲殻類の有効な養殖は、一定の方法及び適用について、ＥＡＡｓの特殊な生産形態、例えば、相応する化学的又は物理的に保護された形態を要求する。この際、目的は、一方で、生成物が水性環境での飼育中に十分に安定したままで、飼料から溶出しないことである。他方で、最終的に動物によって摂取されたアミノ酸生成物が動物の生体で最適かつ高い効率で使用され得ることである。
【０００７】
過去に、魚及び甲殻類用の、特に必須アミノ酸メチオニン及びリジンをベースとする好適な飼料添加剤を開発するために多くの努力が行なわれた。即ち、例えば、ＷＯ８９０６４９７に、魚及び甲殻類用の飼料添加剤として、ジペプチド及びトリペプチドの使用が記載されている。それによって、動物の成長が促進されるとのことである。しかしこの場合には、多くの植物性たんぱく質給源中に十二分に存在している、非必須及び同様に非制限のアミノ酸、例えば、グリシン、アラニン及びセリンからのジペプチド及びトリペプチドが有利に使用された。メチオニン含有ジペプチドとして、ＤＬ‐アラニル‐ＤＬ‐メチオニン及びＤＬ‐メチオニル‐ＤＬ‐グリシンが記載されただけである。しかしそれにより、ジペプチド中に作用物質５０％（モル／モル）だけが有効に含有されていて、このことは、経済的観点下では、極めて不利であると見なすべきである。ＷＯ０２０８８６６７に、特に同様に魚及び甲殻類の飼料添加剤として、ＭＨＡ及びアミノ酸、例えば、メチオニンからのオリゴマーのエナンチオ選択的合成及び使用が記載されている。それによって、より急速な成長が達成され得るとのことである。記載されたオリゴマーは、酵素触媒反応によって構成され、かつ個々のオリゴマーの極めて広範な鎖長分布を有する。それによって、この方法は、実施及び精製において、非選択的で、高価でかつ経費がかかる。Dabrowski et al.は、ＵＳ２００３００９９６８９に、水生動物の成長促進のための飼料添加剤として、合成ペプチドの使用を記載している。この場合には、ペプチドは、全飼料組成物の６〜５０％の質量割合になり得る。合成ペプチドは、有利にＥＡＡｓから成る。しかし、そのような合成オリゴペプチド及びポリペプチドのエナンチオ選択的合成は極めて経費がかかり、高価でかつ大工業的に反応が困難である。更に、個々のアミノ酸のポリペプチドの有効性は異論があり、それというのも、これは、生理学的条件下にしばしば極めて徐々にしか遊離アミノ酸に変換しない又は全く変換しないからである。即ち、例えば、Baker et al. (J. Nutr. 1982, 112, 1130-1132）は、ポリ‐Ｌ‐メチオニンが、絶対的な水不溶性であることに基づき、生物体の吸収が不可能であるので、鶏の場合には、生物学的価値を示さないことを記載している。
【０００８】
新規のＥＡＡｓ化学的誘導体、例えば、メチオニン含有ペプチド及びオリゴマーの使用のほかに、様々な物理的保護可能性、例えば、コーティング又は保護マトリックス中へのＥＡＡの埋床も調査された。即ち、例えばAlam et al. (Aquacult. Nutr. 2004, 10, 309-316及びAquaculture 2005, 248, 13-19）は、被覆メチオニン及びリジンが、非被覆に比べて、幼クルマエビの成長への極めて陽性の影響を有することを示すことができた。特殊な被覆が、飼料ペレットからのメチオニン及びリジンの溶出を抑制し得たとしても、若干の深刻な欠点がある。アミノ酸の製造又は被覆は、大抵は技術的に煩雑で経費のかかる方法であり、従って高価である。更に、仕上げ被覆されたアミノ酸の表面被覆は、飼料を加工する間に、機械的負荷及び磨耗によって容易に損傷され、このことは物理的保護被覆の減少又は完全な損失にまで成り得る。更に、コーティング又はマトリックス物質の使用によって、アミノ酸含量は減少し、従ってしばしば不経済となる。
【０００９】
発明の課題
一般的課題は、新規のメチオニン含有補充物質をベースとする、動物飼育用の飼料又は飼料添加剤を製造することであり、この際、メチオニンは、必須及び制限アミノ酸、例えば、Ｌ‐リジン、Ｌ‐スレオニン及びＬ‐トリプトファンに結合していて、かつこの物質は、有用動物、例えば、鶏、豚、反芻動物、しかし殊にまた水産養殖の魚及び甲殻類の飼育用の飼料添加剤として使用され得る。
【００１０】
公知技術水準の欠点の背景に対して、特に、様々な有用動物、例えば、鶏、豚及び反芻動物用の、しかし又、塩水又は淡水中に生息している多くの雑食性、草食性及び肉食性の魚類及び甲殻類用の、ＤＬ‐メチオニン＋ＥＡＡ、例えば、Ｌ‐リジン、Ｌ‐スレオニン又はＬ‐トリプトファンからの共有結合組成物を含む化学的に保護された生成物を製造することが課題であった。この生成物は、メチオニン給源としての機能のほかに、他の全てのＥＡＡｓ給源としても作用すべきである。殊に、この生成物は、"徐放（Slow Release）"機構、要するに、生理学的な条件下に遊離メチオニン及びＥＡＡのゆっくりした連続的な放出を有するべきである。更に、メチオニン及びＥＡＡの化学的に保護された生成物形態は第一胃耐性であり、従って全ての反芻動物に好適であるべきである。魚及び甲殻類用の飼料添加剤として使用するために、生成物形態は、水中における全飼料ペレット又は全飼料押出物からの低い溶解特性（Leaching）を有するべきである。
【００１１】
もう１つの課題は、混合飼料加工、殊にペレット化及び押出の通常の条件下で、良好な取扱可能性及び貯蔵性及び安定性を有するべきである、極めて高い生物学的価値を有する飼料又は飼料添加剤としての結晶性ＥＡＡｓの補充物質を見出すことであった。
【００１２】
この方法で、例えば、鶏、豚、反芻動物、魚及び甲殻類は、結晶性ＥＡＡｓのほかに、できるだけ公知製品の欠点を示さない又は減らされた範囲でしか示さない、他の有効な必須アミノ酸給源を得るべきである。
【００１３】
更に、１個だけのメチオニン基を含有するジペプチド、殊にＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（I）及びＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）の、様々な新規で融通の利く合成法を開発すべきである。この際、技術的ＤＬ‐メチオニン製法からの典型的な前駆生成物及び副生成物が、１合成法のために出発物質として使用されるべきである。
【００１４】
発明の説明
この課題は、ジペプチド又はその塩を含有する飼料添加剤によって解明され、この際、ジペプチドの１個のアミノ酸残基は、ＤＬ‐メチオニル基であり、かつジペプチドの他のアミノ酸残基は、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン及びシスチンの群から選択されるＬ‐立体配置のアミノ酸である。
【００１５】
有利な方法で、飼料添加剤は、一般式 ＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（＝Ｄ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ及びＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡを含む混合物）及び／又はＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（＝Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン及びＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐メチオニンを含む混合物）のジペプチドを含有し、この際、Ｌ‐ＥＡＡは、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン及びシスチンの群から選択されるＬ‐立体配置のアミノ酸である。
【００１６】
更に、本発明の目的は、前記の飼料添加剤を含有する飼料混合物である。
【００１７】
Ｌ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン及び／又はＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ及びその塩を含有する飼料添加剤は、家禽、豚、反芻動物用、しかし殊にまた水産養殖の魚及び甲殻類用の飼料混合物中の飼料添加剤として好適である。
【００１８】
有利な方法で、飼料混合物は、Ｌ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン及び／又はＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ０．０１〜５質量％、有利に０．０５〜０．５質量％を含有する。
【００１９】
この際、Ｌ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン及びＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡの使用は、これらのジペプチドが低い溶解性に基づく良好な溶出特性を有するので、特に有利であると実証された。
【００２０】
更に、この化合物は、飼料製造の際に良好なペレット化安定性及び押出安定性を示す。ジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン及びＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡは、通常の成分及び飼料、例えば、穀物（例えば、トウモロコシ、小麦、ライ小麦、大麦、キビ等）、植物性又は動物性たんぱく質担体（例えば、大豆及び菜種及びその更に処理した生成物、豆類（例えば、エンドウ豆、インゲン豆、ルピナス等）、魚粉等）と混合して、及び補充必須アミノ酸、たんぱく質、ペプチド、炭水化物、ビタミン、ミネラル、脂肪及び油と混合して安定している。
【００２１】
更に、ＤＬ‐メチオニン及びＬ‐ＥＡＡに比較して、物質１ｋｇ当たりのＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン及びＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡの作用物質の高い割合によって、Ｌ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン及びＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ１モル当たり水１モルが節約されることが有利である。
【００２２】
有利な１使用で、飼料混合物は、有利に魚粉、大豆粉又はトウモロコシ粉をベースとするたんぱく質及び炭水化物を含有し、かつ必須アミノ酸、たんぱく質、ペプチド、ビタミン、ミネラル、炭水化物、脂肪及び油で補充されていてよい。
【００２３】
殊に、飼料混合物中に、ＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ及びＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニンが、単独でＤ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ、Ｌ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐メチオニンとして、相互に混合物として、又は同様にＤ‐メチオニル‐Ｄ‐ＥＡＡ、Ｌ‐メチオニル‐Ｄ‐ＥＡＡ、Ｄ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン又はＤ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐メチオニンとの混合物として、有利に各々付加的に、ＤＬ‐メチオニンと、有利に、ＤＬ‐メチオニン０．０１〜９０質量％、有利に０．１〜５０質量％、特に有利に１〜３０質量％の割合と混合して、有利に各々付加的に、Ｌ‐ＥＡＡ、例えば、Ｌ‐リジンと、有利に、Ｌ‐ＥＡＡ０．０１〜９０質量％、有利に０．１〜５０質量％、特に有利に１〜３０質量％の割合と混合して存在することが有利である。
【００２４】
有利な１使用で、水産養殖で保持される動物は、コイ、マス、サケ、ナマズ、スズキ、ヒラメ、チョウザメ、マグロ、ウナギ、ブリーム、タラ、小エビ、オキアミ及び車エビ、極めて特に、ハクレン（Hypophthalmichthys molitrix）、ソウギョ（Ctenopharyngoden‐Idella）、有鱗のコイ（Cyprinus carpio）及びビッグヘッドカープ（Aristichthys nobilis）、フナ（Carassius carassius）、カトラ（Catla Catla）、ロホラベロ（Labeo rohita）、太平洋サケ及び大西洋サケ（Salmon salar及びOncorhynchus kisutch）、ニジマス（Oncorhynchus mykiss）、アメリカナマズ（Ictalurus punctatus）、アフリカナマズ（Clar Iａs gariepinus）、バサ（Pangasius bocourti及びPangasius hypothalamus）、ナイルティラピア（Oreochromis niloticus）、ミルクフィッシュ（Chanos chanos）、スギ（Rachycentron canadum）、バナメイ（Litopenaeus vannamei）、ブラックタイガー小エビ（Penaeus monodon）及びオニテナガエビ（Macrobrachium rosenbergii）を含む群から選択される、淡水魚及び塩水魚及び淡水甲殻類及び塩水甲殻類である。
【００２５】
本発明により、Ｌ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（Ｌ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐Ｍｅｔ）（I）及びＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ）（II）又はそのアルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩、例えば、難溶性カルシウム塩又は亜鉛塩は、飼料混合物中の添加剤として、Ｄ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ、Ｌ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐メチオニンとして、又は各々のジアステレオマー混合物中で、単独で又はＤＬ‐メチオニンと混合して、単独で又はＬ‐ＥＡＡと混合して、有利に家禽、豚、反芻動物用に、及び特に有利に魚及び甲殻類用に使用される：
【化１】
【００２６】
この際、Ｌ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（I）から、２種のジアステレオマー、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）が存在する。同様に、ジペプチド、ＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）から、各々２種の異なった立体異性体、Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）及びＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）が生じる。この際、２種のジアステレオマー、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）及びＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）だけが天然であるが、２種の他のＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）は非天然である（図式１参照）。
【００２７】
【化２】
【００２８】
この際、ＥＡＡの基Ｒは、次のものを表わす：
Iａ又はIIａ：Ｒ＝１‐メチルエチル‐ （バリン）
Iｂ又はIIｂ：Ｒ＝２‐メチルプロピル‐ （ロイシン）
Ｉｃ又はIIｃ：Ｒ＝（１Ｓ）‐１‐メチルプロピル‐ （イソロイシン）
Iｄ又はIIｄ：Ｒ＝（１Ｒ）‐１‐ヒドロキシエチル‐ （スレオニン）
Iｅ又はIIｅ：Ｒ＝４‐アミノブチル‐ （リジン）
Iｆ又はIIｆ：Ｒ＝３‐［（アミノイミノメチル）‐アミノ］プロピル‐
（アルギニン）
Iｇ又はIIｇ：Ｒ＝ベンジル‐ （フェニルアラニン）
Iｈ又はIIｈ：Ｒ＝（１Ｈ‐イミダゾル‐４‐イル）メチル‐ （ヒスチジン）
Iｊ又はIIｊ：Ｒ＝（１Ｈ‐インドル‐３‐イル）メチル‐ （トリプトファン）。
【００２９】
この際、立体異性体Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐メチオニン（ＬＬ‐I）、Ｄ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）及びＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）は、単独で又は相互に混合して、有利に家禽、豚、反芻動物、魚、甲殻類及び家畜用に、飼料添加剤として使用され得る。
【００３０】
本発明の主要目的は、Ｌ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（I）及びＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）の新規合成製法の開発の他に、Ｄ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）及びＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）を含む混合物又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）及びＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐メチオニン（ＬＬ‐I）の混合物からのジアステレオマー混合物として、又は個々のジアステレオマーＤ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）、Ｌ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐メチオニン（ＬＬ‐I）として、家禽、豚、反芻動物用の、しかし同様に水産養殖における雑食性、肉食性及び草食性の魚及び甲殻類用のＩ及びIIの使用である。更に、飼料添加剤として、Ｌ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（I）又はＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）の使用によって、高生産率乳牛での乳生産を上昇させることができる。
【００３１】
即ち、Ｌ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（I）又はＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）が、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）及び Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐メチオニン（ＬＬ‐I）の５０：５０混合物からの、又はＤ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）及びＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）の５０：５０混合物からのジアステレオマー混合物として、又は各々、単独のジアステレオマーとして、生理学的条件下に酵素的に、鶏、豚、乳牛、魚、例えば、コイ及びマスから、しかし甲殻類、例えば、Litopenaeus vannamei（バナメイ）及びMacrobrachium Rosenbergii（オニテナガエビ）からも、遊離のＤ‐メチオニン又はＬ‐メチオニン及び各々Ｌ‐ＥＡＡに分解され得ることを発明的に示すことができた（図式２参照）。
【００３２】
そのために、相応する消化酵素を、例えば、鶏、雑食性コイ、肉食性マス及び雑食性バナメイ（Litopenaeus vannamei）から分離し、かつ最適化試験管内（in vitro）試験で、生理学的に比較可能な条件下に、Ｄ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）及びＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）の５０：５０混合物からのジアステレオマー混合物として、ＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）と、又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）及びＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐メチオニン（ＬＬ‐I）の５０：５０混合物からのＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（I）又は各々単独のジアステレオマーとして、Ｄ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）、Ｌ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐メチオニン（ＬＬ‐I）と反応させる。Ｌ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（I）又はＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）の分解の本発明による特殊性は、２種の天然ジアステレオマーＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐メチオニン（ＬＬ‐I）及びＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）のほかに、２種の非天然ジアステレオマー、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）及びＤ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）を生理学的条件下に分解させることもできることにある（図１〜１７参照）。このことは、Ｄ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）及びＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）の混合物、Ｄ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）及びＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）の混合物（図１２参照）又はＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）及びＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）の混合物（図１２参照）、しかし又全ジアステレオマーの全混合物の使用にも、各々単一のジアステレオマーにも当てはまる（図１〜１１及び１３〜１７参照）。
【００３３】
【化３】
【００３４】
天然ジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）及びＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）を、肉食性ニジマス、雑食性カガミゴイ、雑食性バナメイ及び鶏からの消化酵素で消化した（表１参照）。
【００３５】
【表１】
【００３６】
そのために、魚及び小エビの消化管から酵素を分離した。引き続いて、ジペプチド、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）及びＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）を、取得した酵素溶液で消化した。様々な種類のジペプチドの消化性のより良好な比較可能性のために、試験管内消化検査について同一条件を選択した（３７℃、ｐＨ９）。
【００３７】
全ての天然ジペプチドを、肉食性ニジマス（図３及び４参照）、雑食性カガミゴイ（図１及び２参照）、雑食性バナメイ（図５及び６参照）及び鶏（図１６参照）の消化酵素によって分解した。Ｌ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）の分解は、類似のＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）ジペプチドの分解よりも、通常はやや遅く経過する。
【００３８】
様々な種類の魚の消化酵素による、非天然のペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）の酵素分解を、できるだけ包括して示すために、実験マトリックスを試験した（表２参照）。
【００３９】
【表２】
【００４０】
そのために、魚及び小エビの消化管から酵素を分離した。引き続いて、化学的合成ジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）を、取得した酵素溶液と反応させた。様々な種類のジペプチドの消化性のより良好な比較可能性のために、試験管内消化検査について同一条件を選択した（３７℃、ｐＨ９）。
【００４１】
全ての非天然ジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）を、雑食性カガミゴイ（図７参照）、草食性ソウギョ（図８参照）、肉食性ニジマス（図１１参照）、雑食性バナメイ（図１０参照）及び鶏（図１７参照）の消化酵素により分解した。Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）の分解は、類似のＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）ジペプチドの分解よりもやや遅く経過した。それに対して、ティラピア（図９参照）の消化酵素では、Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）は、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）ジペプチドよりも早く分解される。ジペプチドＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｌｙｓ（ＤＬ‐IIｅ）及びＬ‐Ｌｙｓ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐Iｅ）が特に速く消化される。５時間後に既に、試験管内反応条件下に、リジンを含むジペプチドの大部分が使用された全消化酵素によって分解された。
【００４２】
得られた結果から、各々使用された非天然ジペプチド（図７〜１１及び１７参照）が、様々な種類の魚、小エビ及び鶏の消化酵素によって分解され得ることが明らかである。この際、肉食性ニジマス、雑食性カガミゴイ、ティラピア、バナメイ、草食性ソウギョ及び鶏からの酵素の使用によって、非天然ジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）が、試験管内で、明らかに異なった消化系が賦与されている全ての動物によって分解され得ることが実証された。飼料へのＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及び／又はＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）ジペプチドの添加によって、欠失した必須アミノ酸（ＤＬ‐Ｍｅｔ及びＬ‐ＥＡＡ）を同様に照準的に供給することができる。
【００４３】
アミノ酸Ｌ‐トリプトファン及びＤＬ‐メチオニンからのジペプチドの例で、天然及び非天然ジペプチドを含むジペプチド混合物の分解を試験した。２種の非天然ジペプチドＬ‐Ｔｒｐ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐Iｊ）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｔｒｐ（ＤＬ‐IIｊ）を含むジアステレオマー混合物は、天然ジペプチドＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｔｒｐ（ＬＬ‐IIｊ）及び非天然ジペプチドＬ‐Ｔｒｐ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐Iｊ）を含む混合物と全く同様に完全に分解され得た。"徐放"効果は、ＬＤ‐Iｊ／ＤＬ‐IIｊ混合物では、ＬＤ‐Iｊ／ＬＬ‐IIｊ混合物におけるよりももっと明らかに顕著であり、即ち、アミノ酸トリプトファン及びメチオニンは、ジペプチドの酵素的消化によって、比較的に相互により遅く、かつより長い時間に渡って遊離される。
【００４４】
更に課題は、一般式 ＤＬ‐メチオニル‐ＤＬ‐ＥＡＡ又はＤＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニンのジペプチド又はその塩によって解明され、この際、ＥＡＡは、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン及びシスチンの群から選択される、有利にＬ‐立体配置のアミノ酸である。この際、Ｄ‐立体配置又はＬ‐立体配置のメチオニル基が同様に有利である。これには、各々立体配置ＤＤ、ＬＤ、ＤＬ及びＬＬのジペプチドＭｅｔ‐Ｌｙｓ、Ｍｅｔ‐Ｔｈｒ、Ｍｅｔ‐Ｔｒｐ、Ｍｅｔ‐Ｈｉｓ、Ｍｅｔ‐Ｖａｌ、Ｍｅｔ‐Ｌｅｕ、Ｍｅｔ‐Ｉｌｅ、Ｍｅｔ‐Ｐｈｅ、Ｍｅｔ‐Ａｒｇ、Ｍｅｔ‐Ｃｙｓ及びＭｅｔ‐Ｃｙｓｔｉｎ、及び各々立体配置ＤＤ、ＬＤ、ＤＬ及びＬＬのＬｙｓ‐Ｍｅｔ、Ｔｈｒ‐Ｍｅｔ、Ｔｒｐ‐Ｍｅｔ、Ｈｉｓ‐Ｍｅｔ、Ｖａｌ‐Ｍｅｔ、Ｌｅｕ‐Ｍｅｔ、Ｉｌｅ‐Ｍｅｔ、Ｐｈｅ‐Ｍｅｔ、Ａｒｇ‐Ｍｅｔ、Ｃｙｓ‐Ｍｅｔ及びＣｙｓｔｉｎ‐Ｍｅｔが属する。
【００４５】
更に課題は、式 ＤＤ／ＬＬ／ＤＬ／ＬＤ‐I又はＤＤ／ＬＬ／ＤＬ／ＬＤ‐II：
【化４】
による１個だけのメチオニル基を含有するジペプチドを、アミノ酸と一般式III〜V：
【化５】
の尿素誘導体との反応によって製造する方法によって解明される［式中、Ｒは、次のように定義される：
Iａ〜Vａ： Ｒ＝１‐メチルエチル‐ （バリン）
Iｂ〜Vｂ： Ｒ＝２‐メチルプロピル‐ （ロイシン）
Ｉｃ〜Vｃ： Ｒ＝（１Ｓ）‐１‐メチルプロピル‐ （イソロイシン）
Iｄ〜Vｄ： Ｒ＝（１Ｒ）‐１‐ヒドロキシエチル‐ （スレオニン）
Ｉｅ〜Vｅ： Ｒ＝４‐アミノブチル‐ （リジン）
Iｆ〜Vｆ： Ｒ＝３‐［（アミノイミノメチル）‐アミノ］プロピル‐
（アルギニン）
Iｇ〜Vｇ： Ｒ＝ベンジル‐ （フェニルアラニン）
Iｈ〜Vｈ： Ｒ＝（１Ｈ‐イミダゾル‐４‐イル）メチル‐ （ヒスチジン）
Iｊ〜Vｊ： Ｒ＝（１Ｈ‐インドル‐３‐イル）メチル‐ （トリプトファン）
Iｋ〜Vｋ： Ｒ＝‐ＣＨ２‐ＳＨ （システイン）
Iｍ〜Vｍ： Ｒ＝‐ＣＨ２‐Ｓ‐Ｓ‐ＣＨ２‐ＣＮＨ２‐ＣＯＯＨ （シスチン）
IIIｎ〜Vｎ： Ｒ＝‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐Ｓ‐ＣＨ３ （メチオニン）、
この際、尿素誘導体III、IV及びV中の基Ｒ１及びＲ２は、次のように定義される：
IIIａ‐ｎ：Ｒ１＝ＣＯＯＨ、Ｒ２＝ＮＨＣＯＮＨ２
IVａ‐ｎ：Ｒ１＝ＣＯＮＨ２、Ｒ２＝ＮＨＣＯＮＨ２
Vａ‐ｎ：Ｒ１‐Ｒ２＝‐ＣＯＮＨＣＯＮＨ‐
及び
この際、Ｒはメチオニル基を表わし、かつ添加されるアミノ酸は、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン又はシスチンの群から選択されるか、又は、
添加されるアミノ酸はメチオニンであり、かつＲは、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン又はシスチンの群から選択されるアミノ酸残基である］。
【００４６】
有利な１実施態様で、メチオニンヒダントイン又はリジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン、シスチンの群から選択されるアミノ酸のヒダントインが、出発生成物として使用される又は中間生成物として中間的に生成される。
【００４７】
本発明による方法の１実施態様で、メチオニンヒダントイン（Vｎ）及び水を含む溶液をアミノ酸と塩基性条件下に反応させる、又はリジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン、シスチンの群から選択されるアミノ酸のヒダントイン及び水を含有する溶液をメチオニンと塩基性条件下に反応させることが有利である。
【００４８】
この際、本発明による方法のもう１つの実施態様で、メチオニンヒダントイン（Vｎ）を出発生成物として使用する、又は中間生成物として中間的に生成させることが有利である。図式３に、メチオニンヒダントイン（Vｎ）、Ｎ‐カルバモイルメチオニン（IIIｎ）又はＮ‐カルバモイルメチオニンアミド（IVｎ）から直接、ＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）の有利な製造が示されていて、かつ方法Ａが包含されている。
【００４９】
【化６】
【００５０】
更に、尿素誘導体を含有する溶液のｐＨ値を、７〜１４、有利に８〜１３及び極めて特に有利に９〜１２に調整することが有利である。
【００５１】
有利な方法で、反応は、３０〜２００℃の温度で、有利に８０〜１７０℃の温度で及び特に有利に１２０〜１６０℃の温度で行なわれる。
【００５２】
更に、反応は、圧力下に、有利に２〜１００バールの圧力で、特に有利に４〜６０バールの圧力で、極めて特に有利に８〜４０バールの圧力で実施されることが有利である。
【００５３】
もう１つの有利な方法で、メチオニンヒダントイン及び水を含有する溶液又はリジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン、シスチンの群から選択されるアミノ酸のヒダントイン及び水を含有する溶液を、１種以上の化合物IIIａ‐ｎ、IVａ‐ｎ及びVａ‐ｎから前以て生成させておく。
【００５４】
選択的に、相応するアミノニトリル、シアンヒドリン又は相応するアルデヒド、青酸及びアンモニアを含む混合物又は相応するアルデヒド、アンモニウム塩及びシアニド塩を含む混合物を同様にヒダントイン前駆体として使用することもできる。
【００５５】
本発明による方法のもう１つの有利な実施態様は、次の段階を包含する：
ａ）式IIIａ‐ｎ、IVａ‐ｎ又はVａ‐ｎによる尿素誘導体とアミノ酸との、式：
【化７】
［式中、Ｒは前記と同様に定義される］のジケトピペラジンVIａ‐ｍへの反応；
ｂ）ジケトピペラジンVIの、式 ＤＤ／ＬＬ／ＤＬ／ＬＤ‐I及びＤＤ／ＬＬ／ＤＬ／ＬＤ‐II：
【化８】
［式中、Ｒは前記と同様に定義される］を有するジペプチドを含む混合物への反応。
【００５６】
式IIIｎ、IVｎ及びVｎによる尿素誘導体の、ジケトピペラジンVIａ‐ｍへの反応及びジケトピペラジンの、有利なジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（I）及びＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）を有するジアステレオマー混合物への更なる反応は、図式４に記載されている：
【化９】
【００５７】
ジケトピペラジンVIａ‐ｍの、有利なジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（I）及びＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）を含む混合物への反応。この方法は、図式４に示された方法Ｂ、Ｃ及びＤを包含する。これらの方法で、各々ジケトピペラジンVIａ‐ｍは、中間生成物として生成される。
【００５８】
尿素誘導体とアミノ酸とのジケトピペラジンへの反応は、２０℃〜２００℃、有利に４０℃〜１８０℃及び特に有利に１００℃〜１７０℃で実施されることが有利である。
【００５９】
有利な１方法で、尿素誘導体とアミノ酸とのジケトピペラジンへの反応は、圧力下に、有利に２〜９０バールの圧力で、特に有利に４〜７０バールの圧力で、極めて特に有利に５〜５０バールの圧力で行なわれる。
【００６０】
尿素誘導体とアミノ酸とのジケトピペラジンへの反応は、有利に塩基が存在して行なわれる。この際、塩基は、窒素含有塩基、ＮＨ４ＨＣＯ３、（ＮＨ４）２ＣＯ３、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＮＨ４ＯＨ／ＣＯ２混合物、カルバメート塩、アルカリ金属塩基及びアルカリ土類金属塩基の群から選択されることが有利である。
【００６１】
もう１つの有利な方法で、ジケトピペラジンへの反応は、式：
【化１０】
［式中、Ｒは、メチオニル基を表わす］の尿素誘導体と、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン又はシスチンの群から選択されるアミノ酸との反応によって、又は式：
【化１１】
［式中、Ｒは、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン又はシスチンの群から選択されるアミノ酸残基である］の尿素誘導体とアミノ酸メチオニンとの反応によって行なわれる。
【００６２】
尿素誘導体のジケトピペラジンへの変換がメチオニンとの反応によって行なわれる有利な方法で、尿度誘導体対メチオニンの１：１００〜１：０．５の比率が特に有利である。
【００６３】
もう１つの有利な方法で、ジケトピペラジンの、式I及びIIのジペプチドを含む混合物への変換は、酸性加水分解によって行なわれる。ジケトピペラジンの、Ｌ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（I）及びＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）を含む混合物への変換は、酸性加水分解によって有利に行なわれる。
【００６４】
この際、酸性加水分解は、鉱酸、ＨＣｌ、Ｈ２ＣＯ３、ＣＯ２／Ｈ２Ｏ、Ｈ２ＳＯ４、燐酸、カルボン酸及びヒドロキシカルボン酸の群から有利に選択される酸が存在して実施される。
【００６５】
本発明による方法の他の１実施態様で、ジケトピペラジンの、式（I）及び（II）のジペプチドを含む混合物への変換は、塩基性加水分解によって行なわれる。ジケトピペラジンから、Ｌ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（I）及びＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）を含む混合物への変換は、塩基性加水分解によって有利に行なわれる。
【００６６】
塩基性加水分解は、有利にｐＨ７〜１４、特に有利にｐＨ８〜１３、極めて特に有利にｐＨ９〜１２で実施される。この際、完全なラセミ化が起こり得る。塩基性条件は、窒素含有塩基、ＮＨ４ＨＣＯ３、（ＮＨ４）２ＣＯ３、ＮＨ４ＯＨ／ＣＯ２混合物、カルバメート塩、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、カルボネート、アルカリ金属塩基及びアルカリ土類金属塩基の群から有利に選択される物質の使用下に調整され得る。
【００６７】
酸性又は塩基性加水分解は、５０℃〜２００℃、有利に８０℃〜１８０℃及び特に有利に９０°〜１６０℃の温度で有利に実施される。
【００６８】
有利な１方法で、尿素誘導体III〜Vのアミノ酸残基は、Ｄ‐立体配置又はＬ‐立体配置で、又はＤ‐立体配置及びＬ‐立体配置を含む混合物で存在し、尿素誘導体がメチオニンから誘導されている場合には、Ｄ‐立体配置及びＬ‐立体配置を含む混合物で有利に存在する。
【００６９】
もう１つの有利な方法で、尿素誘導体III〜Vのアミノ酸残基は、Ｄ‐立体配置又はＬ‐立体配置で、又はＤ‐立体配置及びＬ‐立体配置を含む混合物であり、尿素誘導体が、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン、シスチンの群から選択されるアミノ酸から誘導されている場合には、有利にＬ‐立体配置である。
【００７０】
もう１つの有利な方法で、ＬＬ、ＤＬ、ＬＤ及びＤＤの混合物として、有利にＬＬ、ＬＤ、ＤＬの混合物として存在するジペプチドが得られる。
【００７１】
有利な１方法で、ジケトピペラジンを加水分解の前に分離させる。この際、ジケトピペラジンを、有利に−３０〜１２０℃の温度で、特に有利に１０〜７０℃の温度で反応溶液から結晶化によって分離させることが有利である。
【００７２】
塩基性反応溶液から、式 ＤＤ／ＬＬ／ＤＬ／ＬＤ‐（I）及びＤＤ／ＬＬ／ＤＬ／ＬＤ‐（II）のジペプチドのジアステレオマー混合物、有利にＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（I）及びＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）を含むジアステレオマー混合物を分離させるために、これを酸性化させ、かつ結晶化又は沈殿によって取得する。この際、２〜１０のｐＨ値が有利であり、３〜９のｐＨ値が特に有利であり、式I及びIIの各ジペプチドの相応する等電点が極めて特に有利である。この際、有利に、鉱酸、ＨＣｌ、Ｈ２ＣＯ３、ＣＯ２／Ｈ２Ｏ、Ｈ２ＳＯ４、燐酸、カルボン酸及びヒドロキシカルボン酸の群からの酸を酸性化のために使用することができる。
【００７３】
酸性反応溶液から、式 ＤＤ／ＬＬ／ＤＬ／ＬＤ‐（I）及びＤＤ／ＬＬ／ＤＬ／ＬＤ‐（II）のジペプチドのジアステレオマー混合物、有利にＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（I）及びＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）を含むジアステレオマー混合物を分離させるために、塩基の添加によって中和させ、かつ結晶化又は沈殿によって取得する。この際、２〜１０のｐＨ値が有利であり、３〜９のｐＨ値が特に有利であり、式I及びIIの各ジペプチドの相応する等電点が極めて特に有利である。この際、中和のために、ＮＨ４ＨＣＯ３、（ＮＨ４）２ＣＯ３、窒素含有塩基、ＮＨ４ＯＨ、カルバメート塩、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、カルボネート、アルカリ金属塩基及びアルカリ土類金属塩基の群からの塩基が有利に使用される。
【００７４】
本発明による方法のもう１つの択一的実施態様は、保護基技法の使用下に、非天然ジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニンIａ‐Iｊ又はＤ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡIIａ‐IIｊの合成を包含する。即ち、ジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）の合成のために、遊離Ｌ‐ＥＡＡのアミノ基を、先ずＢＯＣ‐保護基（ｔ‐ブトキシカルボニル‐）で保護した。択一的に、Ｚ‐保護基（ベンゾキシカルボニル‐）を効果的に使用することもできた。Ｄ‐メチオニンをメタノールでエステル化させ、それによって、酸官能基を保護した。引き続いて、ＢＯＣ‐保護又はＺ‐保護のＬ‐ＥＡＡと、Ｄ‐メチオニンメチルエステルとのカップリング反応を、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）の使用下に実施した（図式５参照）。
【００７５】
【化１２】
【００７６】
ＢＯＣ‐Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン‐ＯＭｅ又はＺ‐Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン‐ＯＭｅの精製後に、緩和な塩基性条件下に、先ずメチルエステルを分離させた。最後に、ＢＯＣ‐保護基又はＺ‐保護基を氷酢酸中のＨＢｒで酸性的に離脱させ、遊離ジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）を再沈殿及び再結晶によって精製した（図式６）。
【００７７】
【化１３】
【００７８】
択一的に、ＢＯＣ‐保護のジペプチドメチルエステルＢＯＣ‐Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン‐ＯＭｅを、同様に先ず氷酢酸中のＨＢｒと反応させ、そうしてＢＯＣ‐保護基を除去することもできた。蒸発後に、引き続いて、メチルエステルを希塩酸溶液の添加によって分離させることができた。次いで、遊離ジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）を再び再沈殿及び再結晶によって精製することができた（図式６参照）。
【００７９】
全工程をジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニンIａ‐Iｊにも応用することができた。この際、Ｌ‐ＥＡＡ及びＢＯＣ‐保護又はＺ‐保護のＤ‐メチオニンのメチルエステルを使用した。
【００８０】
挙げられた全ての本発明の方法は、有利に水性媒体中で実施される。
【００８１】
更に、本発明の方法は、当業者に公知のバッチ法で、又は連続法で実施され得る。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】カガミゴイからの酵素を用いたＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）ジペプチドの分解を示す。
【図２】カガミゴイからの酵素を用いたＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）ジペプチドの分解を示す。
【図３】ニジマスの酵素を用いたＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）ジペプチドの分解を示す。
【図４】ニジマスの酵素を用いたＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）ジペプチドの分解を示す。
【図５】バナメイの酵素を用いたＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）ジペプチドの分解を示す。
【図６】バナメイの酵素を用いたＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）ジペプチドの分解を示す。
【図７】カガミゴイの酵素を用いたＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）ジペプチドの分解を示す。
【図８】ソウギョの酵素を用いたＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）ジペプチドの分解を示す。
【図９】ティラピアの酵素を用いたＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）ジペプチドの分解を示す。
【図１０】バナメイの酵素を用いたＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）ジペプチドの分解を示す。
【図１１】ニジマスの酵素を用いたＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）ジペプチドの分解を示す。
【図１２】カガミゴイの酵素を用いたＬ‐Ｔｒｐ‐Ｄ‐Ｍｅｔ／Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｔｒｐ（ＬＤ‐Iｊ／ＤＬ‐IIｊ）及びＬ‐Ｔｒｐ‐Ｄ‐Ｍｅｔ／Ｌ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｔｒｐ（ＬＤ‐Iｊ／ＬＬ‐IIｊ）を含む混合物の分解を示す。
【図１３】カガミゴイからの１％の酵素溶液での天然Ｌ‐Ｉｌｅ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐Iｃ）又はＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｉｌｅ（ＬＬ‐IIｃ）ジペプチドの、及び１０％の酵素溶液での非天然Ｌ‐Ｉｌｅ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐Iｃ）又はＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｉｌｅ（ＤＬ‐IIｃ）ジペプチドの試験管内分解を示す。
【図１４】カガミゴイからの１％の酵素溶液での天然Ｌ‐Ｔｈｒ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐Iｄ）又はＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｔｈｒ（ＬＬ‐IIｄ）ジペプチドの、及び１０％の酵素溶液での非天然Ｌ‐Ｔｈｒ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐Iｄ）又はＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｔｈｒ（ＤＬ‐IIｄ）ジペプチドの試験管内分解を示す。
【図１５】カガミゴイからの１％の酵素溶液での天然Ｌ‐Ｌｙｓ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐Iｅ）又はＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｌｙｓ（ＬＬ‐IIｅ）ジペプチドの、及び１０％の酵素溶液での非天然Ｌ‐Ｌｙｓ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐Iｅ）又はＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｌｙｓ（ＤＬ‐IIｅ）ジペプチドの試験管内分解を示す。
【図１６】鶏からの酵素を用いたＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）ジペプチドの分解を示す。
【図１７】鶏からの酵素を用いたＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）ジペプチドの分解を示す。
【実施例】
【００８３】
例１：
保護基技法の使用下での、非天然ジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニンIａ‐Iｊ又はＤ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡIIａ‐IIｊの一般的合成法
この際、ジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）の合成のために、遊離Ｌ‐ＥＡＡのアミノ基を先ずＢＯＣ‐保護基（ｔ‐ブトキシカルボニル‐）で保護した。択一的に、Ｚ‐保護基（ベンゾキシカルボニル‐）も効果的に使用することができた。Ｄ‐メチオニンをメタノールでエステル化させ、それによって、酸官能基を保護した。続いて、ＢＯＣ‐保護又はＺ‐保護のＬ‐ＥＡＡとＤ‐メチオニンメチルエステルとのカップリング反応を、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）の使用下に実施した（図式５参照）。
【００８４】
【化１４】
【００８５】
ＢＯＣ‐Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン‐ＯＭｅ又はＺ‐Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン‐ＯＭｅの精製後に、緩和な塩基性条件下に、先ずメチルエステルを分離した。最終的にＢＯＣ‐保護基又はＺ‐保護基を、氷酢酸中のＨＢｒで酸性的に離脱させ、遊離ジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）を再沈殿及び再結晶によって精製した（図式６参照）。
【００８６】
【化１５】
【００８７】
択一的に、ＢＯＣ‐保護のジペプチドメチルエステルＢＯＣ‐Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン‐ＯＭｅを同様に先ず氷酢酸中のＨＢｒと反応させ、そうしてＢＯＣ‐保護基を除去することができた。蒸発後に、引き続き、メチルエステルを希塩酸溶液の添加によって分離することができた。次いで、遊離ジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）を再び再沈殿及び再結晶によって精製することができた（図式６参照）。
【００８８】
全工程をジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニンIａ‐Iｊにも応用することができた。この際、Ｌ‐ＥＡＡ及びＢＯＣ‐保護又はＺ‐保護のＤ‐メチオニンのメチルエステルを使用した。
【００８９】
例２：
ａ）Ｚ‐Ｄ‐Ｍｅｔの合成法
Ｄ‐メチオニン３０．０ｇ（０．２０１モル）及びＮａ２ＣＯ３ ４２．４ｇ（０．４モル）を、水２００ｍｌ中に前以て入れ、氷浴中０℃に冷却した。その後に、カルボキシベンジルオキシクロリド（Ｃｂｚ‐Ｃｌ）５１．２ｇ（０．３モル）を徐々に添加し、反応混合物を室温で３時間攪拌した。引き続き、希塩酸で酸性化させ、反応溶液を各々ＭＴＢＥ５０ｍｌで３回抽出した。合一した有機相をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、回転蒸発器で濃縮させた。取得した残渣をジエチルエーテル／エチルアセテートから再結晶させ、真空中３０℃で乾燥させた。カルボキシベンジルオキシ‐Ｄ‐メチオニン（Ｚ‐Ｄ‐Ｍｅｔ）３６．４ｇ（６４％）を、白色結晶性固体として単離した。
【００９０】
ｂ）Ｚ‐Ｌ‐ＥＡＡの一般的合成法
Ｌ‐ＥＡＡ５０ミリモル及びＮａ２ＣＯ３ １０．６ｇ（１００ミリモル）を、水５０ｍｌ中に前以て入れ、氷浴中０℃に冷却した。その後に、カルボキシベンジルオキシクロリド（Ｃｂｚ‐Ｃｌ）１２．８ｇ（７５ミリモル）を徐々に添加し、反応混合物を室温で３時間攪拌した。引き続き、希塩酸で酸性化させ、反応溶液を各々ＭＴＢＥ２５ｍｌで３回抽出した。合一した有機相をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、回転蒸発器で濃縮させた。取得した残渣を再結晶させ、真空中３０℃で乾燥させた。
【００９１】
例３：
Ｄ‐Ｍｅｔ‐ＯＭｅ ｘ ＨＣｌの合成法
Ｄ‐メチオニン５０．０ｇ（０．３３５モル）を、メタノール５００ｍｌ中に懸濁させ、適度な速度のＨＣｌガスを飽和まで流通させた。この際、メチオニンが溶解し、溶液は５５℃に発熱した。引き続き、反応混合物を１晩室温で攪拌した。翌朝に、混合物を回転蒸発器上４０℃で濃縮乾固させ、取得した残渣をジエチルエーテルから２回再結晶させた。Ｄ‐メチオニンメチルエステル塩酸塩４７．１ｇ（８６％）を白色結晶性固体として単離した。
【００９２】
例４：
Ｌ‐ＥＡＡ‐ＯＭｅ ｘ ＨＣｌの一般的合成法
Ｌ‐ＥＡＡ０．３モルを、メタノール５００ｍｌ中に懸濁させ、適度な速度のＨＣｌガスを飽和まで流通させた。この際、アミノ酸が溶解し、溶液は５０〜６０℃に発熱した。引き続き、反応混合物を１晩室温で攪拌した。翌朝に、混合物を回転蒸発器上４０℃で濃縮乾固させ、取得した残渣をジエチルエーテル又はジエチルエーテル／メタノール混合物から２回再結晶させた。
【００９３】
例５：
ＰＧ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ−ＥＡＡ‐ＯＭｅ（ＰＧ‐ＤＬ‐II‐ＯＭｅ）群の化合物の一般的合成法（カップリング反応）
Ｌ‐ＥＡＡ‐ＯＭｅ塩酸塩２０．０ミリモルを、クロロホルム３０ｍｌ及びメタノール５ｍｌを含む混合物中に懸濁させ、Ｋ２ＣＯ３ ４．１５ｇ（３０ミリモル）を加え、室温で１時間攪拌した。引き続いて、塩を濾過し、少量のクロロホルムで洗浄した。濾液の濃縮後に、取得した残渣をテトラヒドロフラン５０ｍｌ中に入れ、ＤＣＣ４．３７ｇ（２１．０ミリモル；１．０５当量（ｅｑ．））及びＺ‐Ｄ‐メチオニン５．６６ｇ（２０．０ミリモル）を加え、室温で１６時間（ｈ）に渡り攪拌した。その後に、反応混合物に氷酢酸３ｍｌを加え、３０分間攪拌し、生じた白色固体（Ｎ，Ｎ’‐ジシクロヘキシル尿素）を濾過した。濾液を回転蒸発器で濃縮させ、場合により生じるＮ，Ｎ’‐ジシクロヘキシル尿素を濾過した。引き続いて、油状残渣をクロロホルム／ｎ‐ヘキサンから再結晶させ、油ポンプ真空中で乾燥させた。
【００９４】
ＰＧ：保護基（Ｚ‐保護基又はＢＯＣ‐保護基）
５ａ）Ｚ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｖａｌ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＤＬ‐IIａ‐ＯＭｅ）
【化１６】
【００９５】
実験式：Ｃ１９Ｈ２８Ｎ２Ｏ５Ｓ（３９６．５０ｇ／モル）、収量：４．６０ｇ（５８％）、純度：９７％、白色固体。
【００９６】
【００９７】
５ｂ）Ｚ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｌｅｕ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＤＬ‐IIｂ‐ＯＭｅ）
【化１７】
【００９８】
実験式：Ｃ２０Ｈ３０Ｎ２Ｏ５Ｓ（４１０．５３ｇ／モル）、収量：５．４０ｇ（６６％）、純度：９７％、白色固体。
【００９９】
【０１００】
５ｃ）Ｚ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｉｌｅ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＤＬ‐IIｃ‐ＯＭｅ）
【化１８】
【０１０１】
実験式：Ｃ２０Ｈ３０Ｎ２Ｏ５Ｓ（４１０．５３ｇ／モル）、収量：５．０９ｇ（６２％）、純度：９７％、白色固体。
【０１０２】
【０１０３】
５ｄ）Ｚ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｔｈｒ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＤＬ‐IIｄ‐ＯＭｅ）
【化１９】
【０１０４】
実験式：Ｃ１８Ｈ２６Ｎ２Ｏ６Ｓ（３９８．４７ｇ／モル）、収量：２．１４ｇ（３６％）、純度：９８％、やや帯黄色の固体。
【０１０５】
【０１０６】
５ｅ）Ｚ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＤＬ‐IIｅ（Ｂｏｃ‐ＯＭｅ）
【化２０】
【０１０７】
実験式：Ｃ２５Ｈ３９Ｎ３Ｏ７Ｓ（５２５．６６ｇ／モル）、収量：１０．８６ｇ（３３％）、純度：９５％、やや帯黄色の固体。
【０１０８】
【０１０９】
５ｆ）Ｚ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｐｈｅ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＤＬ‐IIｇ‐ＯＭｅ）
【化２１】
【０１１０】
実験式：Ｃ２３Ｈ２８Ｎ２Ｏ５Ｓ（４４４．５４ｇ／モル）、収量：３．７３ｇ（４２％）、純度：９５％（ＨＰＬＣ）、白色固体。
【０１１１】
【０１１２】
５ｇ）Ｚ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｈｉｓ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＤＬ‐IIｈ‐ＯＭｅ）
【化２２】
【０１１３】
実験式：Ｃ２０Ｈ２６Ｎ４Ｏ５Ｓ（４３４．５１ｇ／モル）、収量：２．３５ｇ（２７％）、純度：９５％（ＨＰＬＣ）、やや帯黄色の固体。
【０１１４】
【０１１５】
５ｈ）Ｚ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｔｒｐ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＤＬ‐IIｊ‐ＯＭｅ）
【化２３】
【０１１６】
実験式：Ｃ２５Ｈ２９Ｎ３Ｏ５Ｓ（４８３．５８ｇ／モル）、収量：５．７１ｇ（５９％）、純度：９８％（ＨＰＬＣ）、やや帯黄色の固体。
【０１１７】
【０１１８】
例６：
ＰＧ‐Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐ＯＭｅ（ＰＧ‐ＬＤ‐I‐ＯＭｅ）群の化合物の一般的合成法（カップリング反応）
Ｄ‐メチオニンメチルエステル塩酸塩３．９９ｇ（２０．０ミリモル）を、クロロホルム３０ｍｌ及びメタノール５ｍｌを含む混合物中で懸濁させ、Ｋ２ＣＯ３ ４．１５ｇ（３０ミリモル）を加え、室温で１時間攪拌した。引き続いて、塩を濾過し、少量のクロロホルムで洗浄した。濾液の濃縮後に、取得した残渣をテトラヒドロフラン５０ｍｌ中に入れ、ＤＣＣ４．３７ｇ（２１．０ミリモル；１．０５当量）及び相応するＰＧ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＰＧ‐Ｌ‐アミノ酸）２０．０ミリモルを加え、室温で１６時間に渡り攪拌した。その後に、反応混合物に氷酢酸３ｍｌを加え、３０分間攪拌し、生じた白色固体（Ｎ，Ｎ’‐ジシクロヘキシル尿素）を濾過した。濾液を回転蒸発器で濃縮させ、場合により生じるＮ，Ｎ’‐ジシクロヘキシル尿素を濾過した。引き続いて、油状残渣をクロロホルム／ｎ‐ヘキサンから２回再結晶させ、油ポンプ真空中で乾燥させた。
【０１１９】
ＰＧ：保護基（Ｚ‐保護基又はＢＯＣ‐保護基）
６ａ）Ｚ‐Ｌ‐Ｖａｌ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＬＤ‐Iａ‐ＯＭｅ）
【化２４】
【０１２０】
実験式：Ｃ１９Ｈ２８Ｎ２Ｏ５Ｓ（３９６．５０ｇ／モル）、収量：３．０１ｇ（３８％）、純度：９５％（ＨＰＬＣ）、白色固体。
【０１２１】
【０１２２】
６ｂ）Ｚ‐Ｌ‐Ｌｅｕ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＬＤ‐Iｂ‐ＯＭｅ）
【化２５】
【０１２３】
実験式：Ｃ２０Ｈ３０Ｎ２Ｏ５Ｓ（４１０．５３ｇ／モル）、収量：４．４８ｇ（５５％）、純度：９６％（ＨＰＬＣ）、白色固体。
【０１２４】
【０１２５】
６ｃ）Ｚ‐Ｌ‐Ｉｌｅ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＬＤ‐Iｃ‐ＯＭｅ）
【化２６】
【０１２６】
実験式：Ｃ２０Ｈ３０Ｎ２Ｏ５Ｓ（４１０．５３ｇ／モル）、収量：３．８９ｇ（４７％）、純度：９７％（ＨＰＬＣ）、白色固体。
【０１２７】
【０１２８】
６ｄ）Ｚ‐Ｌ‐Ｔｈｒ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＬＤ‐Iｄ‐ＯＭｅ）
【化２７】
【０１２９】
実験式：Ｃ１８Ｈ２６Ｎ２Ｏ６Ｓ（３９８．４７ｇ／モル）、収量：２．４７ｇ（３１％）、純度：９９％（ＨＰＬＣ）、やや帯黄色の固体。
【０１３０】
【０１３１】
６ｅ）ＢＯＣ‐Ｌ‐Ｌｙｓ（ＢＯＣ）‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐ＯＭｅ（ＢＯＣ‐ＬＤ‐Iｅ（ＢＯＣ）‐ＯＭｅ）
【化２８】
【０１３２】
実験式：Ｃ２２Ｈ４１Ｎ３Ｏ７Ｓ（４９１．６４ｇ／モル）、収量：５．２２ｇ（５３．１％）、純度：９７％（ＨＰＬＣ）、白色無定形固体。
【０１３３】
【０１３４】
６ｆ）Ｚ‐Ｌ‐Ｐｈｅ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＬＤ‐Iｇ‐ＯＭｅ）
【化２９】
【０１３５】
実験式：Ｃ２３Ｈ２８Ｎ２Ｏ５Ｓ（４４４．５４ｇ／モル）、収量：３．５１ｇ（４０％）、純度：９９％（ＨＰＬＣ）、白色固体。
【０１３６】
【０１３７】
６ｇ）ＢＯＣ‐Ｌ‐Ｐｈｅ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐ＯＭｅ（ＢＯＣ‐ＬＤ‐Iｇ‐ＯＭｅ）
【化３０】
【０１３８】
実験式：Ｃ２０Ｈ３０Ｎ２Ｏ５Ｓ（４１０．５３ｇ／モル）、収量：４．０３ｇ（４９％）、純度：９８％（ＨＰＬＣ）、白色固体。
【０１３９】
【０１４０】
６ｈ）Ｚ‐Ｌ‐Ｈｉｓ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＬＤ‐Iｈ‐ＯＭｅ）
【化３１】
【０１４１】
実験式：Ｃ２０Ｈ２６Ｎ４Ｏ５Ｓ（４３４．５１ｇ／モル）、収量：１．６５ｇ（１９％）、純度：９５％（ＨＰＬＣ）、やや帯黄色の固体。
【０１４２】
【０１４３】
６ｉ）Ｚ‐Ｌ‐Ｔｒｐ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＬＤ‐Iｊ‐ＯＭｅ）
【化３２】
【０１４４】
実験式：Ｃ２５Ｈ２９Ｎ３Ｏ５Ｓ（４８３．５８ｇ／モル）、収量：５．５０ｇ（５７％）、純度：９９％（ＨＰＬＣ）、やや帯黄色の固体。
【０１４５】
【０１４６】
６ｊ）ＢＯＣ‐Ｌ‐Ｔｒｐ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐ＯＭｅ（ＢＯＣ‐ＬＤ‐Iｊ‐ＯＭｅ）
【化３３】
【０１４７】
実験式：Ｃ２２Ｈ３１Ｎ３Ｏ５Ｓ（４４９．５６ｇ／モル）、収量：５．９１ｇ（６６％）、純度：９９％（ＨＰＬＣ）、白色固体。
【０１４８】
【０１４９】
例７：
ＰＧ‐Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＰＧ‐ＬＤ‐I）及びＰＧ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＰＧ‐ＤＬ‐II）群の化合物の一般的合成法（メチルエステル分離）
ＰＧ‐Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐ＯＭｅ（ＰＧ‐ＬＤ‐I‐ＯＭｅ）又はＰＧ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ‐ＯＭｅ（ＰＧ‐ＤＬ‐II‐ＯＭｅ）１０．０ミリモルを、水１５ｍｌ及びメタノール２００ｍｌ中で懸濁させ、ＮａＯＨ１．２当量（１２．０ミリモル）を加える（１Ｎ ＮａＯＨ１２．０ｍｌ）。２時間の攪拌後に、均質の反応溶液を希塩酸で酸性化させ、メタノールを回転蒸発器で溜去させる。ここで晶出する白色固体を濾過し、水２０ｍｌで洗浄しかつ再結晶させる。
【０１５０】
ＰＧ：保護基（Ｚ‐保護基又はＢＯＣ‐保護基）
例８：
Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）群の化合物の一般的合成法（Ｎ‐末端のＺ‐保護基分離）
Ｚ‐Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（Ｚ‐ＬＤ‐I）又はＺ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（Ｚ‐ＬＤ‐II）５．０ミリモルを、氷酢酸５０ｍｌ中に溶かし、ジメチルスルフィド１８．５ｍｌ（１５．６ｇ；２５０ミリモル；５０当量）及び酢酸中３３％のＨＢｒ（１．６５ｇ；４．０当量）５．０ｇ（３．６ｍｌ）を加えた。反応の終了後に、反応溶液を回転蒸発器で濃縮させた。残渣をメタノール約５０ｍｌ中に溶かし、ナトリウムメタンチオレート３．５ｇ（５０ミリモル；１０当量）を加えた。室温で２０分間攪拌後に、溶液を濃塩酸で中和させ、溶液を回転蒸発器で濃縮させた。残渣を水４０ｍｌ中に入れ、各ジエチルエーテル４０ｍｌで３回抽出した。水相を回転蒸発器で濃縮させ、この際、嵩張った白色固体が生じた。ジペプチドを吸引濾過し、少量の水で洗浄しかつ真空で乾燥させた。
【０１５１】
例９：
Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）群の化合物の一般的合成法（Ｎ‐末端のＢＯＣ‐保護基分離）
ＢＯＣ‐Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＢＯＣ‐ＬＤ‐I）又はＢＯＣ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＢＯＣ‐ＬＤ‐II）５．０ミリモルを、氷酢酸５０ｍｌ中に溶かし、酢酸中３３％のＨＢｒ（１．６５ｇ；４．０当量）５．０ｇ（３．６ｍｌ）を加えた。反応の終了後に、反応溶液を回転蒸発器で濃縮させた。残渣を水４０ｍｌ中に入れ、各ジエチルエーテル４０ｍｌで３回抽出した。水相を氷浴中での連続冷却中に徐々に２０％のＮａＯＨ溶液で中和した。溶液を各ジエチルエーテル４０ｍｌで３回洗浄し、水相を回転蒸発器で濃縮させ、この際、嵩張った白色固体が生じた。ジペプチドを吸引濾過し、少量の水で洗浄しかつ真空で乾燥させた。
【０１５２】
９ａ）Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｌｅｕ（ＤＬ‐IIｂ）
【化３４】
【０１５３】
収量：８６０ｍｇ（６６％）、純度：９８％（ＨＰＬＣ）、嵩張った白色固体。
【０１５４】
【０１５５】
９ｂ）Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｉｌｅ（ＤＬ‐IIｃ）
【化３５】
【０１５６】
収量：９００ｍｇ（６９％）。純度：９９％（ＨＰＬＣ）、嵩張った白色固体
【０１５７】
９ｃ）Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｔｈｒ（ＤＬ‐IIｄ）
【化３６】
【０１５８】
収量：６４０ｍｇ（５１％）、純度：９８％（ＨＰＬＣ）、嵩張った白色固体
【０１５９】
９ｄ）Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｌｙｓ ｘ ２ＨＣｌ（ＤＬ‐IIｅ‐２ＨＣｌ）
【化３７】
【０１６０】
収量：６１３ｍｇ（４９％）、純度：９７％（ＨＰＬＣ）、帯黄色固体
【０１６１】
９ｅ）Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｐｈｅ（ＤＬ‐IIｇ）
【化３８】
【０１６２】
収量：９３０ｍｇ（６３％）、純度：９８％（ＨＰＬＣ）、嵩張った白色固体
【０１６３】
９ｆ）Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｔｒｐ（ＤＬ‐IIｊ）
【化３９】
【０１６４】
収量：１．３８ｇ（８２％）、純度：９８％（ＨＰＬＣ）、嵩張った白色固体
【０１６５】
９ｇ）Ｌ‐Ｌｅｕ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐Iｂ）
【化４０】
【０１６６】
収量：７１０ｍｇ（５４％）、純度：９９％（ＨＰＬＣ）、嵩張った白色固体
【０１６７】
９ｈ）Ｌ‐Ｉｌｅ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐Iｃ）
【化４１】
【０１６８】
収量：７９０ｍｇ（５９％）、純度：９７％（ＨＰＬＣ）、嵩張った白色固体
【０１６９】
９ｉ）Ｌ‐Ｔｈｒ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐Iｄ）
【化４２】
【０１７０】
収量：６９０ｍｇ（５５％）、純度：９９％（ＨＰＬＣ）、嵩張った白色固体
【０１７１】
９ｊ）Ｌ‐Ｌｙｓ‐Ｄ‐Ｍｅｔ ｘ ２ＨＣｌ（ＬＤ‐Iｅ‐２ＨＣｌ）
【化４３】
【０１７２】
収量：６７６ｍｇ（５４％）、純度：９６％（ＨＰＬＣ）、無色結晶
【０１７３】
９ｋ）Ｌ‐Ｐｈｅ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐Iｇ）
【化４４】
【０１７４】
収量：８８０ｍｇ（５９％）、純度：９８％（ＨＰＬＣ）、嵩張った白色固体
【０１７５】
９ｌ）Ｌ‐Ｔｒｐ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐Iｊ）
【化４５】
【０１７６】
収量：１．４０ｇ（８３％）、純度：９８％（ＨＰＬＣ）、嵩張った白色固体
【０１７７】
例１０：
ＫＯＨを用いた、５‐［２‐（メチルチオ）エチル］‐２，４‐イミダゾリジンジオン（メチオニンヒダントイン）（Vｎ）及びＬ‐イソロイシンからＭｅｔ‐Ｉｌｅ（IIｃ）のジアステレオマー混合物の化学合成
Ｌ‐イソロイシン１１．８ｇ（０．０９モル）、５‐［２‐（メチルチオ）エチル］‐２，４‐イミダゾリジンジオン（Vｎ）１７．２ｇ（０．０９モル、純度：９１％）及び８５％のＫＯＨ１１．９ｇ（０．８モル）を水１５０ｍｌ中に溶かし、磁気攪拌を伴うRoth社の２００ｍｌ入り鋼製オートクレーブ中１５０℃で５時間攪拌し、この際、圧力は８バールに上昇した。反応の終了後に、オートクレーブを冷却し、生じた固体を濾過し、少量の水で洗浄した。濾液に、適度なＣＯ２流を流通させた。ここで生じる固体を再び吸引濾過し、少量の冷水で洗浄し、油ポンプ真空中３０℃で数時間乾燥させた。秤量：白色固体７．３ｇ（理論値の３１％）。１Ｈ‐ＮＭＲは、Ｌ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｉｌｅ（ＬＬ‐IIｃ）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｉｌｅ（ＤＬ‐IIｃ）の重層した１Ｈ‐ＮＭＲスペクトルと一致した。（例９ｂ参照）。
【０１７８】
例１１：
ＫＯＨを用いた、Ｎ‐カルバモイルメチオニン（IIIｎ）及びＬ‐イソロイシンから、Ｍｅｔ‐Ｉｌｅ（IIｃ）のジアステレオマー混合物の化学合成
Ｌ‐イソロイシン１１．８ｇ（０．０９モル）、Ｎ‐カルバモイルメチオニン（IIIｎ）１７．５ｇ（０．０９モル、純度：９９％）及び８５％のＫＯＨ１１．９ｇ（０．１８モル）を水１５０ｍｌ中に溶かし、磁気攪拌を伴うRoth社の２００ｍｌ入り鋼製オートクレーブ中１５０℃で５時間攪拌し、この際、圧力は７バールに上昇した。反応の終了後に、オートクレーブを冷却し、生じた固体を濾過し、少量の水で洗浄した。濾液を１０％の硫酸で中和し、ここで生じる固体を吸引濾過し、少量の冷水で洗浄しかつ油ポンプ真空中３０℃で数時間乾燥させた。秤量：白色固体６．４ｇ（理論値の２７％）。１Ｈ‐ＮＭＲは、Ｌ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｉｌｅ（ＬＬ‐IIｃ）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｉｌｅ（ＤＬ‐IIｃ）の重層した１Ｈ‐ＮＭＲスペクトルと一致した。（例９ｂ参照）。
【０１７９】
例１２：
ＫＯＨを用いた、２‐［（アミノカルボニル）アミノ］‐４‐（メチルチオ）ブタン酸アミド（Ｎ‐カルバモイルメチオニンアミド）（IVｎ）及びＬ‐イソロイシンから、Ｍｅｔ‐Ｉｌｅ（IIｃ）のジアステレオマー混合物の化学合成
Ｌ‐イソロイシン１１．８ｇ（０．０９モル）、２‐［（アミノカルボニル）アミノ］‐４‐（メチルチオ）ブタン酸アミド（IVｎ）１７．４ｇ（９０ミリモル、純度：９８．５％）及び８５％のＫＯＨ１１．９ｇ（０．８モル）を水１５０ｍｌ中に溶かし、磁気攪拌を伴うRoth社の２００ｍｌ入り鋼製オートクレーブ中１５０℃で５時間攪拌し、この際、圧力は７バールに上昇した。反応の終了後に、オートクレーブを冷却し、生じた固体を濾過し、少量の水で洗浄した。濾液を半濃塩酸で中和し、ここで生じる固体を吸引濾過し、少量の冷水で洗浄し、油ポンプ真空中３０℃で数時間乾燥させた。秤量：白色固体８．０ｇ（理論値の３４％）。１Ｈ‐ＮＭＲは、Ｌ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｉｌｅ（ＬＬ‐IIｃ）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｉｌｅ（ＤＬ‐IIｃ）の重層した１Ｈ‐ＮＭＲスペクトルと一致した。（例９ｂ参照）。
【０１８０】
例１３：
５‐［２‐（メチルチオ）エチル］‐２，４‐イミダゾリジンジオン（メチオニンヒダントイン）（Vｎ）及びＬ‐イソロイシンから、３‐［２‐（メチルチオ）エチル］‐６‐（１‐メチル）プロピル）‐２，５‐ピペラジンジオン（VIｃ）の化学合成
Ｌ‐イソロイシン１１．８ｇ（０．０９モル）、５‐［２‐（メチルチオ）エチル］‐２，４‐イミダゾリジンジオン（Vｎ）１７．２ｇ（０．０９モル、純度：９１％）及び（ＮＨ４）ＨＣＯ３ ７．１ｇ（０．９モル）を、水１５０ｍｌ中に溶かし、磁気攪拌を伴うRoth社の２００ｍｌ入り鋼製オートクレーブ中１５０℃で５時間攪拌し、この際、圧力は上昇した。時折、ガスを放出させることによって、圧力を８バールに一定保持した。反応の終了後に、オートクレーブを氷浴中で冷却した。得られる懸濁液を引き続いて濾過し、濾過した固体を水で数回洗浄し、油ポンプ真空中３０℃で数時間乾燥させた。秤量：白色固体としてVIｃ９．９ｇ（理論値の４５％）。
【０１８１】
【化４６】
【０１８２】
【０１８３】
例１４：
Ｎ‐カルバモイルメチオニン（IIIｎ）及びＬ‐イソロイシンから、３‐［２‐（メチルチオ）エチル］‐６‐（１‐メチル）プロピル）‐２，５‐ピペラジンジオン（VIｃ）の化学合成
Ｌ‐イソロイシン１１．８ｇ（０．０９モル）、Ｎ‐カルバモイルメチオニン（IIIｎ）１７．５ｇ（０．０９モル、純度：９９％）及び（ＮＨ４）ＨＣＯ３ ７．１ｇ（０．９モル）を、水１５０ｍｌ中に溶かし、磁気攪拌を伴うRoth社の２００ｍｌ入り鋼製オートクレーブ中１５０℃で５時間攪拌し、この際、圧力は上昇した。時折、ガスを放出させることによって、圧力を８バールに一定保持した。反応の終了後に、オートクレーブを氷浴中で冷却した。得られる懸濁液を引き続いて濾過し、濾過した固体を水で数回洗浄し、油ポンプ真空中３０℃で数時間乾燥させた。秤量：白色固体として化合物VIｃ９．１ｇ（理論値の４１．３％）。ＮＭＲは、例１３からのＮＭＲと一致した。
【０１８４】
例１５：
２‐［（アミノカルボニル）アミノ］‐４‐（メチルチオ）ブタン酸アミド（Ｎ‐カルバモイルメチオニンアミド）（IVｎ）及びＬ‐イソロイシンから、３‐［２‐（メチルチオ）エチル］‐６‐（１‐メチル）プロピル）‐２，５‐ピペラジンジオン（VIｃ）の化学合成
Ｌ‐イソロイシン１１．８ｇ（０．０９モル）、２‐［（アミノカルボニル）アミノ］‐４‐（メチルチオ）ブタン酸アミド（IVｎ）１７．４ｇ（９０ミリモル、純度：９８．５％）及び（ＮＨ４）ＨＣＯ３ ７．１ｇ（０．９モル）を、水１５０ｍｌ中に溶かし、磁気攪拌を伴うRoth社の２００ｍｌ入り鋼製オートクレーブ中１５０℃で５時間攪拌し、この際、圧力は上昇した。時折、ガスを放出させることによって、圧力を８バールに一定保持した。反応の終了後に、オートクレーブを氷浴中で冷却した。得られる懸濁液を引き続いて濾過し、濾過した固体を水で数回洗浄し、油ポンプ真空中３０℃で数時間乾燥させた。秤量：白色固体IVｃ１０．３ｇ（理論値の４７％）。ＮＭＲは、例１３からのＮＭＲと一致した。
【０１８５】
例１６：
濃塩酸を用いた、３‐［２‐（メチルチオ）エチル］‐６‐（１‐メチル）プロピル）‐２，５‐ピペラジンジオン（VIｃ）から、Ｉｌｅ‐Ｍｅｔ（Iｃ）Ｍｅｔ‐Ｉｌｅ（IIｃ）のジアステレオマー混合物の合成
３‐［２‐（メチルチオ）エチル］‐６‐（１‐メチル）プロピル）‐２，５‐ピペラジンジオン（VIｃ）２４．４ｇ（１００ミリモル）を、水６６ｇと懸濁させる。攪拌下に濃塩酸１１ｇを徐々に滴加して、引き続いて慎重に、強力な攪拌下に還流加熱した。反応混合物を８時間還流加熱し、それによって全ての固体は溶解した。引き続いて冷却する間に、少量の未反応のジケトピペラジンが生じ、それを濾過した。引き続いて、濾液を、氷浴を備えたフラスコ中で３２％のアンモニア水でｐＨ５〜６に調整した。この際、ＤＬ‐Ｍｅｔ‐ＤＬ‐Ｉｌｅ（IIｃのジアステレオマー混合物）及びＤＬ‐Ｉｌｅ‐ＤＬ‐Ｍｅｔ（Iｃのジアステレオマー混合物）の混合物が嵩張った白色固体として生じた。固体を乾燥箱中水流ポンプ真空で４０℃で乾燥させた。収量２１．５ｇ（８２．０％）。
【０１８６】
例１７：
アンモニアを用いたアルカリ条件で、３‐［２‐（メチルチオ）エチル］‐６‐（１‐メチル）プロピル）‐２，５‐ピペラジンジオン（VIｃ）から、Ｉｌｅ‐Ｍｅｔ（Iｃ）及びＭｅｔ‐Ｉｌｅ（IIｃ）のジアステレオマー混合物の合成
３‐［２‐（メチルチオ）エチル］‐６‐（１‐メチル）プロピル）‐２，５‐ピペラジンジオン（VIｃ）１９．６ｇ（０．８モル）、２５％のアンモニア溶液２２．４ｍｌ及び水１６０ｍｌを、オートクレーブ中１５０℃に２時間加熱する。冷却後に、未反応のジケトピペラジンを濾過する。これを次の成分に再び使用することができる。濾液を回転蒸発器中水温８０℃で、最初の結晶が生じるまで濃縮させた。冷却及び１晩放置後に、濾過及び乾燥後に、ＤＬ‐Ｍｅｔ‐ＤＬ‐Ｉｌｅ（IIｃのジアステレオマー混合物）及びＤＬ‐Ｉｌｅ‐ＤＬ‐Ｍｅｔ（Iｃのジアステレオマー混合物）の混合物を、嵩張った白色固体として分離することができた。収量：１２．２ｇ（５８％）。
【０１８７】
例１８：
雑食性コイからの消化酵素を用いた、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）又はＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）の試験管内消化試験
ａ）カガミゴイ（Cyprinus carpio morpha noblis）から消化酵素の分離
消化酵素の分離は、EID及びMATTYの方法（Aquaculture 1989, 79, 111-119）により実施した。そのために、一年生のカガミゴイ（Cyprinus carpio morpha noblis）５匹の腸を取り出し、水で洗浄し、縦に切開し、かつ各々腸粘膜をかき取った。これを砕氷と一緒に混合機で砕細した。未だ完全な細胞を砕解するために、得られた懸濁液を超音波棒で処理した。細胞成分及び脂肪の分離のために、懸濁液を４℃で３０分間遠心分離にかけ、均質液をデカントし、チメロサールの痕跡量で滅菌した。カガミゴイ５匹から腸粘膜の酵素溶液２９６．３ｍｌを取得した。溶液を４℃の暗所で貯蔵した。
【０１８８】
ｂ）試験管内消化試験の実施
Ｌ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｔ（ＬＬ‐I）を、ＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液に入れ、酵素溶液を加えた。比較として、及び純化学的分離速度の評価のために、各々酵素溶液を含まない盲値を設定した（表３参照）。時折、試料を取り出し、その組成を目盛付きＨＰＬＣで検定し、かつ量定した。変換率を、メチオニンの含量及びＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）の含量の商として測定した（図１及び２参照）。
【０１８９】
【表３】
【０１９０】
例１９
雑食性コイからの消化酵素を用いた、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）又はＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）の試験管内消化試験
ａ）カガミゴイ（Cyprinus carpio morpha noblis）から消化酵素の分離
消化酵素の分離は、EID及びMATTYの方法（Aquaculture 1989, 79, 111-119）により実施した。そのために、一年生のカガミゴイ（Cyprinus carpio morpha noblis）５匹の腸を取り出し、例１８に記載したように処理した。
【０１９１】
ｂ）試験管内消化試験の実施
Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｔ（ＬＤ‐I）を、ＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液に入れ、酵素溶液を加えた。比較として、及び純化学的分離速度の評価のために、各々酵素溶液を含まない盲値を設定した（表４参照）。時折、試料を取り出し、その組成を目盛付きＨＰＬＣで検定し、かつ量定した。変換率を、メチオニンの面積及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）の面積の商として測定した（図７参照）。
【０１９２】
【表４】
【０１９３】
例２０：
肉食性マスからの消化酵素を用いた、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）又はＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）の試験管内消化試験
ａ）ニジマス（Oncorhynchus mykiss）からの消化酵素の分離
消化酵素の分離は、EID及びMATTYの方法（Aquaculture 1989, 79, 111-119）により実施した。そのために、一年生のニジマス（Oncorhynchus mykiss）６匹の腸を取り出し、例１８に記載したように処理した。
【０１９４】
ｂ）試験管内消化試験の実施
試験管内試験を、例１８と同様に実施した（表５、図３及び４参照）。
【０１９５】
【表５】
【０１９６】
例２１：
肉食性マスからの消化酵素を用いた、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）又はＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）の試験管内消化試験
ａ）ニジマス（Oncorhynchus mykiss）からの消化酵素の分離
消化酵素の分離は、EID及びMATTYの方法（Aquaculture 1989, 79, 111-119）により実施した。そのために、一年生のニジマス（Oncorhynchus mykiss）６匹の腸を取り出し、例１８に記載したように処理した。
【０１９７】
ｂ）試験管内消化試験の実施
試験管内試験を、例１９と同様に実施した（表６、図１１参照）。
【０１９８】
【表６】
【０１９９】
例２２：
雑食性の小エビからの消化酵素を用いた、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）又はＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）の試験管内消化試験
ａ）バナメイ（Litopenaeus Vannamei）からの消化酵素の分離
消化酵素の分離は、Ezquerra及びGarcia-Carrenoの方法（J. Food Biochem. 1999, 23, 59-74）により実施した。そのために、バナメイ（Litopenaeus Vannamei）５ｋｇから肝膵臓を取り出し、砕氷と一緒に混合機で砕細した。更なる処理は、例１８と同様に実施した。
【０２００】
ｂ）試験管内消化試験の実施
試験管内試験を、例１８と同様に実施した（表７、図５及び６参照）。
【０２０１】
【表７】
【０２０２】
例２３：
雑食性小エビからの消化酵素を用いた、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）又はＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）の試験管内消化試験
ａ）バナメイ（Litopenaeus Vannamei）からの消化酵素の分離
消化酵素の分離は、Ezquerra及びGarcia-Carrenoの方法（J. Food Biochem. 1999, 23, 59-74）により実施した。そのために、バナメイ（Litopenaeus Vannamei）５ｋｇから肝膵臓を取り出し、砕氷と一緒に混合機で砕細した。更なる処理は例１８と同様に実施した。
【０２０３】
ｂ）試験管内消化試験の実施
試験管内試験を、例１９と同様に実施した（表８、図１０参照）。
【０２０４】
【表８】
【０２０５】
例２４：
鶏からの消化酵素を用いた、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）又はＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）の試験管内消化試験
ａ）消化酵素の分離は、EID及びMATTYの方法（Aquaculture 1989, 79, 111-119）により実施した。そのために、鶏の腸を取り出し、水で洗浄し、縦に切開し、かつ各々腸粘膜をかき取った。これを砕氷と一緒に混合機で砕細した。未だ完全な細胞を砕解するために、得られた懸濁液を超音波棒で処理した。細胞成分及び脂肪の分離のために、懸濁液を４℃で３０分間遠心分離にかけ、均質液をデカントし、チメロサールの痕跡量で滅菌した。鶏から腸粘膜の酵素溶液１１８．９ｍｌを取得し、溶液を４℃の暗所で貯蔵した。
【０２０６】
ｂ）試験管内消化試験の実施
Ｌ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）を、ＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液に入れ、酵素溶液を加えた。比較として、及び純化学的分離速度の評価のために、各々酵素溶液を含まない盲値を設定した。時折、試料を取り出し、その組成を目盛付きＨＰＬＣで検定し、かつ量定した。変換率を、メチオニンの含量及びＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）の含量の商として測定した（図９、図１６参照）。
【０２０７】
【表９】
【０２０８】
例２５：
鶏からの消化酵素を用いた、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）又はＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）の試験管内消化試験
ａ）鶏からの消化酵素の分離
消化酵素の分離は、EID及びMATTYの方法（Aquaculture 1989, 79, 111-119）により実施した。そのために、鶏の腸を取り出し、例２４に記載したように処理した。
【０２０９】
ｂ）試験管内消化試験の実施
Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）を、ＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液に入れ、酵素溶液を加えた。比較として、及び純化学的分離速度の評価のために、各々酵素溶液を含まない盲値を設定した。時折、試料を取り出し、その組成を目盛付きＨＰＬＣで検定し、かつ量定した。変換率を、メチオニンの面積及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）の面積の商として測定した（表１０、図１７参照）。
【０２１０】
【表１０】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のメチオニン結合した非天然及び天然の、必須制限アミノ酸、例えば、リジン、スレオニン及びトリプトファン、硫黄含有アミノ酸、システイン及びシスチンのジペプチド、及びその合成及び有用動物、例えば、鶏、豚、反芻動物の、しかし殊にまた、水産養殖からの魚及び甲殻類の飼育用の飼料添加剤としての使用に関する。
【０００２】
公知技術水準
必須アミノ酸（ＥＡＡ）メチオニン、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン及びアルギニン、及び２種の硫黄含有アミノ酸システイン及びシスチンは、飼料における極めて重要な成分であり、有用動物、例えば、鶏、豚及び反芻動物の経済的飼育で重要な役割を果たす。この際、特に、ＥＡＡｓの最適分配及び十分な供給が決定的である。天然たんぱく質給源、例えば、大豆、トウモロコシ及び小麦からの飼料は、大抵、一定のＥＡＡｓが欠失しているので、一方で、動物のより早い成長又は高生産乳牛におけるより高い乳生産のために、しかしまた他方で全飼料のより有効な利用のために、合成のＥＡＡｓ、例えば、ＤＬ‐メチオニン、Ｌ‐リジン、Ｌ‐スレオニン又はＬ‐トリプトファンを照準的に補充することが可能である。このことは極めて大きな経済的利点である。飼料添加剤の市場は、大きな工業的及び経済的な重要性を有する。更にこれは、特に、例えば、中国及びインドのような国の増大する重要性に帰し得る強力な成長市場である。
【０００３】
多種動物にとって、Ｌ‐メチオニン（（Ｓ）‐２‐アミノ‐４‐メチルチオ酪酸）は、全てのＥＡＡｓの第一制限アミノ酸であり、従って、動物栄養において及び飼料添加剤として重要な役割を果たす（Rosenberg et al., J. Agr. Food Chem. 1957, 5, 694-700）。しかしメチオニンは、古典的な化学合成では、ラセミ化合物、Ｄ‐メチオニン及びＬ‐メチオニンからの５０：５０混合物として生じる。このラセミ化合物のＤＬ‐メチオニンを、飼料添加剤として直接使用することができるが、それというのも、数種の動物では、生体内（in vivo）条件下にメチオニンの非天然のＤ‐エナンチオマーを天然Ｌ‐エナンチオマーに転換させる転換機構が成り立つからである。この際、Ｄ‐メチオニンは、非特異的Ｄ‐オキシダーゼによって、先ずα‐ケト‐メチオニンに脱アミン化され、引き続いて更にＬ‐トランスアミナーゼでＬ‐メチオニンに転換される（Baker, D. H. "Amino acids in farm animal nutrition"中, D' Mello, J. P. F. (ed.), Wallingford (UK), CAB‐International, 1994, 37-61）。それによって、成長のために動物が有効に利用し得るＬ‐メチオニンの有効量が生物体中で高められる。Ｄ‐メチオニンからＬ‐メチオニンへの酵素的転換は、鶏、豚及び乳牛で、しかし殊に魚、小エビ及び車エビでも確認された。即ち、例えば、Sveier et al. (Aquacult. Nutr. 2001, 7(3), 169-181）及びKim et al. (Aquaculture 1992, 101(1-2), 95-103）は、Ｄ‐メチオニンからＬ‐メチオニンへの転換が肉食性タイセイヨウサケ及びニジマスで可能であることを示し得た。同様のことが、Robinson et al. (J. Nutr. 1978, 108(12), 1932-1936）及びSchwarz et al. (Aquaculture 1998, 161, 121-129）によって、雑食種の魚、例えば、ナマズ及びコイについて示され得た。更に、Forster及びDominy(J. World Aquacult. Soc. 2006, 37(4), 474-480）は、Litopenaeus vannamei種の雑食性小エビの飼育試験で、ＤＬ‐メチオニンが、Ｌ‐メチオニンと同様の有効性を有することを示し得た。２００７年には、世界的に、結晶性ＤＬ‐メチオニン又はラセミ化合物の液体のメチオニン‐ヒドロキシ同族体（ＭＨＡ、rac‐２‐ヒドロキシ‐４‐（メチルチオ）ブタン酸（ＨＭＢ））及び固体のカルシウム‐ＭＨＡ７００００トン（ｔ）以上が生産され、単一胃動物、例えば、鶏及び豚において飼料添加剤として直接有効に使用された。
【０００４】
メチオニンに対して、リジン、スレオニン及びトリプトファンについては、各々の場合に、Ｌ‐エナンチオマーのみを飼料添加剤として使用することができ、それというのも、これらの３種の必須及び制限アミノ酸の各Ｄ‐エナンチオマーは、生物体によって生理学的条件下に、相応するＬ‐エナンチオマーに転換され得ないからである。即ち、Ｌ‐リジン、第一制限アミノ酸の世界市場だけは、例えば、豚においては、２００７年には１００万トン以上であった。他の２種の制限必須アミノ酸、Ｌ‐スレオニン及びＬ‐トリプトファンについては、世界市場は、２００７年では、１０００００ｔ以上又は僅かに３０００ｔ以下であった。
【０００５】
単胃動物、例えば、家禽及び豚では、通常、ＤＬ‐メチオニン、ＭＨＡが、しかしＬ‐リジン、Ｌ‐スレオニン及びＬ‐トリプトファンも、飼料添加剤として直接使用される。これに対して、反芻動物におけるＥＡＡｓ、例えば、メチオニン、リジン、スレオニン又は同様にＭＨＡの飼料の補充は、その主要量が反芻動物の第一胃中で微生物によって分解されるので有効ではない。従って、この分解に基づき、補充ＥＡＡｓの断片のみが動物の小腸に到達し、そこで一般に血液中への吸収が行なわれる。反芻動物では、ＥＡＡｓの内で、特にメチオニンが決定的な役割を果たし、それというのも、高い乳生産は最適な供給でのみ保証されるからである。反芻動物に、メチオニンを高効率で利用させ得るためには、第一胃耐性保護の形態が使用されるべきである。この際、この特性をＤＬ‐メチオニン又はrac‐ＭＨＡに与える幾つかの可能性がある。１つの可能性は、好適な保護層の塗布又は保護マトリックス中のメチオニンの分配によって高い第一胃耐性を達成することにある。それによって、メチオニンは実際に損失なしに第一胃を通過することができる。次いで更に経過して、例えば、反芻動物の第四胃で、保護層は酸性加水分解によって除去され、更に遊離メチオニンは小腸で吸収され得る。商業的に得られる製品は、例えば、Firma Evonik DegussaのMepron（Ｒ）及びFirma AdisseoのSmartamine（ＴＭ）である。メチオニンの製造又は被覆は、技術的に複雑でかつ経費のかかる方法であり、従って、高価である。更に、完成ペレットの表面被覆は、飼料を加工する間に、機械的負荷及び磨耗によって容易に損傷され、このことは保護被覆の減少又は完全な損失にまで成り得る。従って、保護メチオニンペレットをより大きな混合飼料ペレットに加工することも、それによって再び保護層が機械的応力によって崩壊されるので同様に不可能である。このことはそのような生成物の使用を制限する。第一胃耐性の向上のためのもう１つの可能性は、メチオニン又はＭＨＡの化学的誘導体化である。この際、分子の官能基を好適な保護基で誘導体化させる。これは、例えば、カルボン酸官能基とアルコールとのエステル化によって行われ得る。それによって、第一胃中の微生物による分解が減少され得る。商業的に得られる化学的保護製品は、例えば、Metasmart（ＴＭ）、ＭＨＡのラセミ化合物イソ‐プロピルエステル（ＨＭＢｉ）である。ＷＯ００／２８８３５に、反芻動物において、ＨＭＢｉについて少なくとも５０％の生物有効性が公開された。メチオニン又はＭＨＡの化学的誘導体化の欠点は、しばしば、より悪化された生物有効性及び比較的低い作用物質含量にある。
【０００６】
しかし、反芻動物における補充ＥＡＡｓ、例えば、メチオニン、リジン又はスレオニンの、第一胃中での分解の問題の他に、魚及び甲殻類においても、飼料へのＥＡＡｓの補充の際に様々な問題が生じ得る。近年この分野において、高工業化水産養殖での魚養殖及び甲殻類養殖の急激な経済的発展により、必須かつ制限アミノ酸の最適で、経済的かつ有効的な補充可能性が益々重要な役割を果たしている（Food and Agriculture Organization of the United Nation (FAO) Fisheries Department "State of World Aquaculture 2006", 2006, Rome. international Food Policy Research institute (IFPRI) "Fish 2020: Supply and Demand Changing Markets", 2003, Washington, D. C.）。しかしこの際、飼料添加剤として結晶性ＥＡＡｓの使用で、鶏及び豚に対して、一定の魚種及び甲殻類種で様々な問題が生じ得る。即ち、Rumsey及びKetola (J. Fish. Res. Bd. Can. 1975, 32, 422-426）は、個々の補充された結晶性アミノ酸と関連した大豆粉の使用が、ニジマスでは成長上昇を導かないことを報告している。Murai et al. (Bull. Japan. Soc. Sci. Fish. 1984, 50 (11), 1957）は、コイにおいて、補充された結晶性アミノ酸を毎日高い割当量で魚餌飼育するにより、遊離アミノ酸の４０％以上がエラ及び腎臓を介して排泄されることを示した。飼料摂取直後に、補充アミノ酸の急速な吸収に基づき、魚の血漿中でアミノ酸濃度の極めて急速な上昇が起きる（高速応答（Fast-Response））。しかしこの時点で、天然たんぱく質給源、例えば、大豆粉からの他のアミノ酸は未だ血漿中に存在せず、これは重要な全アミノ酸の同時取得の非同時性に成り得る。従って、高濃度のアミノ酸の一部は急速に排泄され、又は生物体中で急速に代謝され、かつ、例えば、純粋なエネルギー源として利用される。それによって、コイの場合には、飼料添加剤として結晶性アミノ酸を使用した場合に、成長上昇が低くなり、又は成長上昇がないことになるだけである（Aoe et al., Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 1970, 36, 407-413）。甲殻類では、結晶性ＥＡＡｓの補充は更に他の問題を生じさせ得る。一定の甲殻類、例えば、Litopenaeus Vannamei種の小エビの遅速な食い特性によって、飼料が水下で長時間滞留することにより、補充された水溶性ＥＡＡｓの溶出（Leaching）が起こり、このことは海洋の富栄養化を導き、かつ動物の成長上昇に結びつかない（Alam et al., Aquaculture 2005, 248, 13-16）。従って、水産養殖で保持される魚及び甲殻類の有効な養殖は、一定の方法及び適用について、ＥＡＡｓの特殊な生産形態、例えば、相応する化学的又は物理的に保護された形態を要求する。この際、目的は、一方で、生成物が水性環境での飼育中に十分に安定したままで、飼料から溶出しないことである。他方で、最終的に動物によって摂取されたアミノ酸生成物が動物の生体で最適かつ高い効率で使用され得ることである。
【０００７】
過去に、魚及び甲殻類用の、特に必須アミノ酸メチオニン及びリジンをベースとする好適な飼料添加剤を開発するために多くの努力が行なわれた。即ち、例えば、ＷＯ８９０６４９７に、魚及び甲殻類用の飼料添加剤として、ジペプチド及びトリペプチドの使用が記載されている。それによって、動物の成長が促進されるとのことである。しかしこの場合には、多くの植物性たんぱく質給源中に十二分に存在している、非必須及び同様に非制限のアミノ酸、例えば、グリシン、アラニン及びセリンからのジペプチド及びトリペプチドが有利に使用された。メチオニン含有ジペプチドとして、ＤＬ‐アラニル‐ＤＬ‐メチオニン及びＤＬ‐メチオニル‐ＤＬ‐グリシンが記載されただけである。しかしそれにより、ジペプチド中に作用物質５０％（モル／モル）だけが有効に含有されていて、このことは、経済的観点下では、極めて不利であると見なすべきである。ＷＯ０２０８８６６７に、特に同様に魚及び甲殻類の飼料添加剤として、ＭＨＡ及びアミノ酸、例えば、メチオニンからのオリゴマーのエナンチオ選択的合成及び使用が記載されている。それによって、より急速な成長が達成され得るとのことである。記載されたオリゴマーは、酵素触媒反応によって構成され、かつ個々のオリゴマーの極めて広範な鎖長分布を有する。それによって、この方法は、実施及び精製において、非選択的で、高価でかつ経費がかかる。Dabrowski et al.は、ＵＳ２００３００９９６８９に、水生動物の成長促進のための飼料添加剤として、合成ペプチドの使用を記載している。この場合には、ペプチドは、全飼料組成物の６〜５０％の質量割合になり得る。合成ペプチドは、有利にＥＡＡｓから成る。しかし、そのような合成オリゴペプチド及びポリペプチドのエナンチオ選択的合成は極めて経費がかかり、高価でかつ大工業的に反応が困難である。更に、個々のアミノ酸のポリペプチドの有効性は異論があり、それというのも、これは、生理学的条件下にしばしば極めて徐々にしか遊離アミノ酸に変換しない又は全く変換しないからである。即ち、例えば、Baker et al. (J. Nutr. 1982, 112, 1130-1132）は、ポリ‐Ｌ‐メチオニンが、絶対的な水不溶性であることに基づき、生物体の吸収が不可能であるので、鶏の場合には、生物学的価値を示さないことを記載している。
【０００８】
新規のＥＡＡｓ化学的誘導体、例えば、メチオニン含有ペプチド及びオリゴマーの使用のほかに、様々な物理的保護可能性、例えば、コーティング又は保護マトリックス中へのＥＡＡの埋床も調査された。即ち、例えばAlam et al. (Aquacult. Nutr. 2004, 10, 309-316及びAquaculture 2005, 248, 13-19）は、被覆メチオニン及びリジンが、非被覆に比べて、幼クルマエビの成長への極めて陽性の影響を有することを示すことができた。特殊な被覆が、飼料ペレットからのメチオニン及びリジンの溶出を抑制し得たとしても、若干の深刻な欠点がある。アミノ酸の製造又は被覆は、大抵は技術的に煩雑で経費のかかる方法であり、従って高価である。更に、仕上げ被覆されたアミノ酸の表面被覆は、飼料を加工する間に、機械的負荷及び磨耗によって容易に損傷され、このことは物理的保護被覆の減少又は完全な損失にまで成り得る。更に、コーティング又はマトリックス物質の使用によって、アミノ酸含量は減少し、従ってしばしば不経済となる。
【０００９】
発明の課題
一般的課題は、新規のメチオニン含有補充物質をベースとする、動物飼育用の飼料又は飼料添加剤を製造することであり、この際、メチオニンは、必須及び制限アミノ酸、例えば、Ｌ‐リジン、Ｌ‐スレオニン及びＬ‐トリプトファンに結合していて、かつこの物質は、有用動物、例えば、鶏、豚、反芻動物、しかし殊にまた水産養殖の魚及び甲殻類の飼育用の飼料添加剤として使用され得る。
【００１０】
公知技術水準の欠点の背景に対して、特に、様々な有用動物、例えば、鶏、豚及び反芻動物用の、しかし又、塩水又は淡水中に生息している多くの雑食性、草食性及び肉食性の魚類及び甲殻類用の、ＤＬ‐メチオニン＋ＥＡＡ、例えば、Ｌ‐リジン、Ｌ‐スレオニン又はＬ‐トリプトファンからの共有結合組成物を含む化学的に保護された生成物を製造することが課題であった。この生成物は、メチオニン給源としての機能のほかに、他の全てのＥＡＡｓ給源としても作用すべきである。殊に、この生成物は、"徐放（Slow Release）"機構、要するに、生理学的な条件下に遊離メチオニン及びＥＡＡのゆっくりした連続的な放出を有するべきである。更に、メチオニン及びＥＡＡの化学的に保護された生成物形態は第一胃耐性であり、従って全ての反芻動物に好適であるべきである。魚及び甲殻類用の飼料添加剤として使用するために、生成物形態は、水中における全飼料ペレット又は全飼料押出物からの低い溶解特性（Leaching）を有するべきである。
【００１１】
もう１つの課題は、混合飼料加工、殊にペレット化及び押出の通常の条件下で、良好な取扱可能性及び貯蔵性及び安定性を有するべきである、極めて高い生物学的価値を有する飼料又は飼料添加剤としての結晶性ＥＡＡｓの補充物質を見出すことであった。
【００１２】
この方法で、例えば、鶏、豚、反芻動物、魚及び甲殻類は、結晶性ＥＡＡｓのほかに、できるだけ公知製品の欠点を示さない又は減らされた範囲でしか示さない、他の有効な必須アミノ酸給源を得るべきである。
【００１３】
更に、１個だけのメチオニン基を含有するジペプチド、殊にＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（I）及びＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）の、様々な新規で融通の利く合成法を開発すべきである。この際、技術的ＤＬ‐メチオニン製法からの典型的な前駆生成物及び副生成物が、１合成法のために出発物質として使用されるべきである。
【００１４】
発明の説明
この課題は、ジペプチド又はその塩を含有する飼料添加剤によって解明され、この際、ジペプチドの１個のアミノ酸残基は、ＤＬ‐メチオニル基であり、かつジペプチドの他のアミノ酸残基は、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン及びシスチンの群から選択されるＬ‐立体配置のアミノ酸である。
【００１５】
有利な方法で、飼料添加剤は、一般式 ＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（＝Ｄ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ及びＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡを含む混合物）及び／又はＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（＝Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン及びＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐メチオニンを含む混合物）のジペプチドを含有し、この際、Ｌ‐ＥＡＡは、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン及びシスチンの群から選択されるＬ‐立体配置のアミノ酸である。
【００１６】
更に、本発明の目的は、前記の飼料添加剤を含有する飼料混合物である。
【００１７】
Ｌ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン及び／又はＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ及びその塩を含有する飼料添加剤は、家禽、豚、反芻動物用、しかし殊にまた水産養殖の魚及び甲殻類用の飼料混合物中の飼料添加剤として好適である。
【００１８】
有利な方法で、飼料混合物は、Ｌ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン及び／又はＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ０．０１〜５質量％、有利に０．０５〜０．５質量％を含有する。
【００１９】
この際、Ｌ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン及びＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡの使用は、これらのジペプチドが低い溶解性に基づく良好な溶出特性を有するので、特に有利であると実証された。
【００２０】
更に、この化合物は、飼料製造の際に良好なペレット化安定性及び押出安定性を示す。ジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン及びＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡは、通常の成分及び飼料、例えば、穀物（例えば、トウモロコシ、小麦、ライ小麦、大麦、キビ等）、植物性又は動物性たんぱく質担体（例えば、大豆及び菜種及びその更に処理した生成物、豆類（例えば、エンドウ豆、インゲン豆、ルピナス等）、魚粉等）と混合して、及び補充必須アミノ酸、たんぱく質、ペプチド、炭水化物、ビタミン、ミネラル、脂肪及び油と混合して安定している。
【００２１】
更に、ＤＬ‐メチオニン及びＬ‐ＥＡＡに比較して、物質１ｋｇ当たりのＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン及びＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡの作用物質の高い割合によって、Ｌ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン及びＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ１モル当たり水１モルが節約されることが有利である。
【００２２】
有利な１使用で、飼料混合物は、有利に魚粉、大豆粉又はトウモロコシ粉をベースとするたんぱく質及び炭水化物を含有し、かつ必須アミノ酸、たんぱく質、ペプチド、ビタミン、ミネラル、炭水化物、脂肪及び油で補充されていてよい。
【００２３】
殊に、飼料混合物中に、ＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ及びＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニンが、単独でＤ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ、Ｌ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐メチオニンとして、相互に混合物として、又は同様にＤ‐メチオニル‐Ｄ‐ＥＡＡ、Ｌ‐メチオニル‐Ｄ‐ＥＡＡ、Ｄ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン又はＤ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐メチオニンとの混合物として、有利に各々付加的に、ＤＬ‐メチオニンと、有利に、ＤＬ‐メチオニン０．０１〜９０質量％、有利に０．１〜５０質量％、特に有利に１〜３０質量％の割合と混合して、有利に各々付加的に、Ｌ‐ＥＡＡ、例えば、Ｌ‐リジンと、有利に、Ｌ‐ＥＡＡ０．０１〜９０質量％、有利に０．１〜５０質量％、特に有利に１〜３０質量％の割合と混合して存在することが有利である。
【００２４】
有利な１使用で、水産養殖で保持される動物は、コイ、マス、サケ、ナマズ、スズキ、ヒラメ、チョウザメ、マグロ、ウナギ、ブリーム、タラ、小エビ、オキアミ及び車エビ、極めて特に、ハクレン（Hypophthalmichthys molitrix）、ソウギョ（Ctenopharyngoden‐Idella）、有鱗のコイ（Cyprinus carpio）及びビッグヘッドカープ（Aristichthys nobilis）、フナ（Carassius carassius）、カトラ（Catla Catla）、ロホラベロ（Labeo rohita）、太平洋サケ及び大西洋サケ（Salmon salar及びOncorhynchus kisutch）、ニジマス（Oncorhynchus mykiss）、アメリカナマズ（Ictalurus punctatus）、アフリカナマズ（Clar Iａs gariepinus）、バサ（Pangasius bocourti及びPangasius hypothalamus）、ナイルティラピア（Oreochromis niloticus）、ミルクフィッシュ（Chanos chanos）、スギ（Rachycentron canadum）、バナメイ（Litopenaeus vannamei）、ブラックタイガー小エビ（Penaeus monodon）及びオニテナガエビ（Macrobrachium rosenbergii）を含む群から選択される、淡水魚及び塩水魚及び淡水甲殻類及び塩水甲殻類である。
【００２５】
本発明により、Ｌ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（Ｌ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐Ｍｅｔ）（I）及びＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ）（II）又はそのアルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩、例えば、難溶性カルシウム塩又は亜鉛塩は、飼料混合物中の添加剤として、Ｄ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ、Ｌ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐メチオニンとして、又は各々のジアステレオマー混合物中で、単独で又はＤＬ‐メチオニンと混合して、単独で又はＬ‐ＥＡＡと混合して、有利に家禽、豚、反芻動物用に、及び特に有利に魚及び甲殻類用に使用される：
【化１】
【００２６】
この際、Ｌ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（I）から、２種のジアステレオマー、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）が存在する。同様に、ジペプチド、ＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）から、各々２種の異なった立体異性体、Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）及びＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）が生じる。この際、２種のジアステレオマー、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）及びＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）だけが天然であるが、２種の他のＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）は非天然である（図式１参照）。
【００２７】
【化２】
【００２８】
この際、ＥＡＡの基Ｒは、次のものを表わす：
Iａ又はIIａ：Ｒ＝１‐メチルエチル‐ （バリン）
Iｂ又はIIｂ：Ｒ＝２‐メチルプロピル‐ （ロイシン）
Ｉｃ又はIIｃ：Ｒ＝（１Ｓ）‐１‐メチルプロピル‐ （イソロイシン）
Iｄ又はIIｄ：Ｒ＝（１Ｒ）‐１‐ヒドロキシエチル‐ （スレオニン）
Iｅ又はIIｅ：Ｒ＝４‐アミノブチル‐ （リジン）
Iｆ又はIIｆ：Ｒ＝３‐［（アミノイミノメチル）‐アミノ］プロピル‐
（アルギニン）
Iｇ又はIIｇ：Ｒ＝ベンジル‐ （フェニルアラニン）
Iｈ又はIIｈ：Ｒ＝（１Ｈ‐イミダゾル‐４‐イル）メチル‐ （ヒスチジン）
Iｊ又はIIｊ：Ｒ＝（１Ｈ‐インドル‐３‐イル）メチル‐ （トリプトファン）。
【００２９】
この際、立体異性体Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐メチオニン（ＬＬ‐I）、Ｄ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）及びＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）は、単独で又は相互に混合して、有利に家禽、豚、反芻動物、魚、甲殻類及び家畜用に、飼料添加剤として使用され得る。
【００３０】
本発明の主要目的は、Ｌ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（I）及びＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）の新規合成製法の開発の他に、Ｄ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）及びＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）を含む混合物又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）及びＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐メチオニン（ＬＬ‐I）の混合物からのジアステレオマー混合物として、又は個々のジアステレオマーＤ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）、Ｌ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐メチオニン（ＬＬ‐I）として、家禽、豚、反芻動物用の、しかし同様に水産養殖における雑食性、肉食性及び草食性の魚及び甲殻類用のＩ及びIIの使用である。更に、飼料添加剤として、Ｌ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（I）又はＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）の使用によって、高生産率乳牛での乳生産を上昇させることができる。
【００３１】
即ち、Ｌ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（I）又はＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）が、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）及び Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐メチオニン（ＬＬ‐I）の５０：５０混合物からの、又はＤ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）及びＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）の５０：５０混合物からのジアステレオマー混合物として、又は各々、単独のジアステレオマーとして、生理学的条件下に酵素的に、鶏、豚、乳牛、魚、例えば、コイ及びマスから、しかし甲殻類、例えば、Litopenaeus vannamei（バナメイ）及びMacrobrachium Rosenbergii（オニテナガエビ）からも、遊離のＤ‐メチオニン又はＬ‐メチオニン及び各々Ｌ‐ＥＡＡに分解され得ることを発明的に示すことができた（図式２参照）。
【００３２】
そのために、相応する消化酵素を、例えば、鶏、雑食性コイ、肉食性マス及び雑食性バナメイ（Litopenaeus vannamei）から分離し、かつ最適化試験管内（in vitro）試験で、生理学的に比較可能な条件下に、Ｄ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）及びＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）の５０：５０混合物からのジアステレオマー混合物として、ＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）と、又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）及びＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐メチオニン（ＬＬ‐I）の５０：５０混合物からのＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（I）又は各々単独のジアステレオマーとして、Ｄ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）、Ｌ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐メチオニン（ＬＬ‐I）と反応させる。Ｌ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（I）又はＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）の分解の本発明による特殊性は、２種の天然ジアステレオマーＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐メチオニン（ＬＬ‐I）及びＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）のほかに、２種の非天然ジアステレオマー、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）及びＤ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）を生理学的条件下に分解させることもできることにある（図１〜１７参照）。このことは、Ｄ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）及びＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）の混合物、Ｄ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）及びＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）の混合物（図１２参照）又はＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）及びＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）の混合物（図１２参照）、しかし又全ジアステレオマーの全混合物の使用にも、各々単一のジアステレオマーにも当てはまる（図１〜１１及び１３〜１７参照）。
【００３３】
【化３】
【００３４】
天然ジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）及びＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）を、肉食性ニジマス、雑食性カガミゴイ、雑食性バナメイ及び鶏からの消化酵素で消化した（表１参照）。
【００３５】
【表１】
【００３６】
そのために、魚及び小エビの消化管から酵素を分離した。引き続いて、ジペプチド、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）及びＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）を、取得した酵素溶液で消化した。様々な種類のジペプチドの消化性のより良好な比較可能性のために、試験管内消化検査について同一条件を選択した（３７℃、ｐＨ９）。
【００３７】
全ての天然ジペプチドを、肉食性ニジマス（図３及び４参照）、雑食性カガミゴイ（図１及び２参照）、雑食性バナメイ（図５及び６参照）及び鶏（図１６参照）の消化酵素によって分解した。Ｌ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）の分解は、類似のＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）ジペプチドの分解よりも、通常はやや遅く経過する。
【００３８】
様々な種類の魚の消化酵素による、非天然のペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）の酵素分解を、できるだけ包括して示すために、実験マトリックスを試験した（表２参照）。
【００３９】
【表２】
【００４０】
そのために、魚及び小エビの消化管から酵素を分離した。引き続いて、化学的合成ジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）を、取得した酵素溶液と反応させた。様々な種類のジペプチドの消化性のより良好な比較可能性のために、試験管内消化検査について同一条件を選択した（３７℃、ｐＨ９）。
【００４１】
全ての非天然ジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）を、雑食性カガミゴイ（図７参照）、草食性ソウギョ（図８参照）、肉食性ニジマス（図１１参照）、雑食性バナメイ（図１０参照）及び鶏（図１７参照）の消化酵素により分解した。Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）の分解は、類似のＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）ジペプチドの分解よりもやや遅く経過した。それに対して、ティラピア（図９参照）の消化酵素では、Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）は、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）ジペプチドよりも早く分解される。ジペプチドＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｌｙｓ（ＤＬ‐IIｅ）及びＬ‐Ｌｙｓ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐Iｅ）が特に速く消化される。５時間後に既に、試験管内反応条件下に、リジンを含むジペプチドの大部分が使用された全消化酵素によって分解された。
【００４２】
得られた結果から、各々使用された非天然ジペプチド（図７〜１１及び１７参照）が、様々な種類の魚、小エビ及び鶏の消化酵素によって分解され得ることが明らかである。この際、肉食性ニジマス、雑食性カガミゴイ、ティラピア、バナメイ、草食性ソウギョ及び鶏からの酵素の使用によって、非天然ジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）が、試験管内で、明らかに異なった消化系が賦与されている全ての動物によって分解され得ることが実証された。飼料へのＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及び／又はＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）ジペプチドの添加によって、欠失した必須アミノ酸（ＤＬ‐Ｍｅｔ及びＬ‐ＥＡＡ）を同様に照準的に供給することができる。
【００４３】
アミノ酸Ｌ‐トリプトファン及びＤＬ‐メチオニンからのジペプチドの例で、天然及び非天然ジペプチドを含むジペプチド混合物の分解を試験した。２種の非天然ジペプチドＬ‐Ｔｒｐ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐Iｊ）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｔｒｐ（ＤＬ‐IIｊ）を含むジアステレオマー混合物は、天然ジペプチドＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｔｒｐ（ＬＬ‐IIｊ）及び非天然ジペプチドＬ‐Ｔｒｐ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐Iｊ）を含む混合物と全く同様に完全に分解され得た。"徐放"効果は、ＬＤ‐Iｊ／ＤＬ‐IIｊ混合物では、ＬＤ‐Iｊ／ＬＬ‐IIｊ混合物におけるよりももっと明らかに顕著であり、即ち、アミノ酸トリプトファン及びメチオニンは、ジペプチドの酵素的消化によって、比較的に相互により遅く、かつより長い時間に渡って遊離される。
【００４４】
更に課題は、一般式 ＤＬ‐メチオニル‐ＤＬ‐ＥＡＡ又はＤＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニンのジペプチド又はその塩によって解明され、この際、ＥＡＡは、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン及びシスチンの群から選択される、有利にＬ‐立体配置のアミノ酸である。この際、Ｄ‐立体配置又はＬ‐立体配置のメチオニル基が同様に有利である。これには、各々立体配置ＤＤ、ＬＤ、ＤＬ及びＬＬのジペプチドＭｅｔ‐Ｌｙｓ、Ｍｅｔ‐Ｔｈｒ、Ｍｅｔ‐Ｔｒｐ、Ｍｅｔ‐Ｈｉｓ、Ｍｅｔ‐Ｖａｌ、Ｍｅｔ‐Ｌｅｕ、Ｍｅｔ‐Ｉｌｅ、Ｍｅｔ‐Ｐｈｅ、Ｍｅｔ‐Ａｒｇ、Ｍｅｔ‐Ｃｙｓ及びＭｅｔ‐Ｃｙｓｔｉｎ、及び各々立体配置ＤＤ、ＬＤ、ＤＬ及びＬＬのＬｙｓ‐Ｍｅｔ、Ｔｈｒ‐Ｍｅｔ、Ｔｒｐ‐Ｍｅｔ、Ｈｉｓ‐Ｍｅｔ、Ｖａｌ‐Ｍｅｔ、Ｌｅｕ‐Ｍｅｔ、Ｉｌｅ‐Ｍｅｔ、Ｐｈｅ‐Ｍｅｔ、Ａｒｇ‐Ｍｅｔ、Ｃｙｓ‐Ｍｅｔ及びＣｙｓｔｉｎ‐Ｍｅｔが属する。
【００４５】
更に課題は、式 ＤＤ／ＬＬ／ＤＬ／ＬＤ‐I又はＤＤ／ＬＬ／ＤＬ／ＬＤ‐II：
【化４】
による１個だけのメチオニル基を含有するジペプチドを、アミノ酸と一般式III〜V：
【化５】
の尿素誘導体との反応によって製造する方法によって解明される［式中、Ｒは、次のように定義される：
Iａ〜Vａ： Ｒ＝１‐メチルエチル‐ （バリン）
Iｂ〜Vｂ： Ｒ＝２‐メチルプロピル‐ （ロイシン）
Ｉｃ〜Vｃ： Ｒ＝（１Ｓ）‐１‐メチルプロピル‐ （イソロイシン）
Iｄ〜Vｄ： Ｒ＝（１Ｒ）‐１‐ヒドロキシエチル‐ （スレオニン）
Ｉｅ〜Vｅ： Ｒ＝４‐アミノブチル‐ （リジン）
Iｆ〜Vｆ： Ｒ＝３‐［（アミノイミノメチル）‐アミノ］プロピル‐
（アルギニン）
Iｇ〜Vｇ： Ｒ＝ベンジル‐ （フェニルアラニン）
Iｈ〜Vｈ： Ｒ＝（１Ｈ‐イミダゾル‐４‐イル）メチル‐ （ヒスチジン）
Iｊ〜Vｊ： Ｒ＝（１Ｈ‐インドル‐３‐イル）メチル‐ （トリプトファン）
Iｋ〜Vｋ： Ｒ＝‐ＣＨ２‐ＳＨ （システイン）
Iｍ〜Vｍ： Ｒ＝‐ＣＨ２‐Ｓ‐Ｓ‐ＣＨ２‐ＣＮＨ２‐ＣＯＯＨ （シスチン）
IIIｎ〜Vｎ： Ｒ＝‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐Ｓ‐ＣＨ３ （メチオニン）、
この際、尿素誘導体III、IV及びV中の基Ｒ１及びＲ２は、次のように定義される：
IIIａ‐ｎ：Ｒ１＝ＣＯＯＨ、Ｒ２＝ＮＨＣＯＮＨ２
IVａ‐ｎ：Ｒ１＝ＣＯＮＨ２、Ｒ２＝ＮＨＣＯＮＨ２
Vａ‐ｎ：Ｒ１‐Ｒ２＝‐ＣＯＮＨＣＯＮＨ‐
及び
この際、Ｒはメチオニル基を表わし、かつ添加されるアミノ酸は、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン又はシスチンの群から選択されるか、又は、
添加されるアミノ酸はメチオニンであり、かつＲは、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン又はシスチンの群から選択されるアミノ酸残基である］。
【００４６】
有利な１実施態様で、メチオニンヒダントイン又はリジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン、シスチンの群から選択されるアミノ酸のヒダントインが、出発生成物として使用される又は中間生成物として中間的に生成される。
【００４７】
本発明による方法の１実施態様で、メチオニンヒダントイン（Vｎ）及び水を含む溶液をアミノ酸と塩基性条件下に反応させる、又はリジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン、シスチンの群から選択されるアミノ酸のヒダントイン及び水を含有する溶液をメチオニンと塩基性条件下に反応させることが有利である。
【００４８】
この際、本発明による方法のもう１つの実施態様で、メチオニンヒダントイン（Vｎ）を出発生成物として使用する、又は中間生成物として中間的に生成させることが有利である。図式３に、メチオニンヒダントイン（Vｎ）、Ｎ‐カルバモイルメチオニン（IIIｎ）又はＮ‐カルバモイルメチオニンアミド（IVｎ）から直接、ＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）の有利な製造が示されていて、かつ方法Ａが包含されている。
【００４９】
【化６】
【００５０】
更に、尿素誘導体を含有する溶液のｐＨ値を、７〜１４、有利に８〜１３及び極めて特に有利に９〜１２に調整することが有利である。
【００５１】
有利な方法で、反応は、３０〜２００℃の温度で、有利に８０〜１７０℃の温度で及び特に有利に１２０〜１６０℃の温度で行なわれる。
【００５２】
更に、反応は、圧力下に、有利に２〜１００バールの圧力で、特に有利に４〜６０バールの圧力で、極めて特に有利に８〜４０バールの圧力で実施されることが有利である。
【００５３】
もう１つの有利な方法で、メチオニンヒダントイン及び水を含有する溶液又はリジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン、シスチンの群から選択されるアミノ酸のヒダントイン及び水を含有する溶液を、１種以上の化合物IIIａ‐ｎ、IVａ‐ｎ及びVａ‐ｎから前以て生成させておく。
【００５４】
選択的に、相応するアミノニトリル、シアンヒドリン又は相応するアルデヒド、青酸及びアンモニアを含む混合物又は相応するアルデヒド、アンモニウム塩及びシアニド塩を含む混合物を同様にヒダントイン前駆体として使用することもできる。
【００５５】
本発明による方法のもう１つの有利な実施態様は、次の段階を包含する：
ａ）式IIIａ‐ｎ、IVａ‐ｎ又はVａ‐ｎによる尿素誘導体とアミノ酸との、式：
【化７】
［式中、Ｒは前記と同様に定義される］のジケトピペラジンVIａ‐ｍへの反応；
ｂ）ジケトピペラジンVIの、式 ＤＤ／ＬＬ／ＤＬ／ＬＤ‐I及びＤＤ／ＬＬ／ＤＬ／ＬＤ‐II：
【化８】
［式中、Ｒは前記と同様に定義される］を有するジペプチドを含む混合物への反応。
【００５６】
式IIIｎ、IVｎ及びVｎによる尿素誘導体の、ジケトピペラジンVIａ‐ｍへの反応及びジケトピペラジンの、有利なジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（I）及びＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）を有するジアステレオマー混合物への更なる反応は、図式４に記載されている：
【化９】
【００５７】
ジケトピペラジンVIａ‐ｍの、有利なジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（I）及びＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）を含む混合物への反応。この方法は、図式４に示された方法Ｂ、Ｃ及びＤを包含する。これらの方法で、各々ジケトピペラジンVIａ‐ｍは、中間生成物として生成される。
【００５８】
尿素誘導体とアミノ酸とのジケトピペラジンへの反応は、２０℃〜２００℃、有利に４０℃〜１８０℃及び特に有利に１００℃〜１７０℃で実施されることが有利である。
【００５９】
有利な１方法で、尿素誘導体とアミノ酸とのジケトピペラジンへの反応は、圧力下に、有利に２〜９０バールの圧力で、特に有利に４〜７０バールの圧力で、極めて特に有利に５〜５０バールの圧力で行なわれる。
【００６０】
尿素誘導体とアミノ酸とのジケトピペラジンへの反応は、有利に塩基が存在して行なわれる。この際、塩基は、窒素含有塩基、ＮＨ４ＨＣＯ３、（ＮＨ４）２ＣＯ３、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＮＨ４ＯＨ／ＣＯ２混合物、カルバメート塩、アルカリ金属塩基及びアルカリ土類金属塩基の群から選択されることが有利である。
【００６１】
もう１つの有利な方法で、ジケトピペラジンへの反応は、式：
【化１０】
［式中、Ｒは、メチオニル基を表わす］の尿素誘導体と、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン又はシスチンの群から選択されるアミノ酸との反応によって、又は式：
【化１１】
［式中、Ｒは、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン又はシスチンの群から選択されるアミノ酸残基である］の尿素誘導体とアミノ酸メチオニンとの反応によって行なわれる。
【００６２】
尿素誘導体のジケトピペラジンへの変換がメチオニンとの反応によって行なわれる有利な方法で、尿度誘導体対メチオニンの１：１００〜１：０．５の比率が特に有利である。
【００６３】
もう１つの有利な方法で、ジケトピペラジンの、式I及びIIのジペプチドを含む混合物への変換は、酸性加水分解によって行なわれる。ジケトピペラジンの、Ｌ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（I）及びＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）を含む混合物への変換は、酸性加水分解によって有利に行なわれる。
【００６４】
この際、酸性加水分解は、鉱酸、ＨＣｌ、Ｈ２ＣＯ３、ＣＯ２／Ｈ２Ｏ、Ｈ２ＳＯ４、燐酸、カルボン酸及びヒドロキシカルボン酸の群から有利に選択される酸が存在して実施される。
【００６５】
本発明による方法の他の１実施態様で、ジケトピペラジンの、式（I）及び（II）のジペプチドを含む混合物への変換は、塩基性加水分解によって行なわれる。ジケトピペラジンから、Ｌ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（I）及びＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）を含む混合物への変換は、塩基性加水分解によって有利に行なわれる。
【００６６】
塩基性加水分解は、有利にｐＨ７〜１４、特に有利にｐＨ８〜１３、極めて特に有利にｐＨ９〜１２で実施される。この際、完全なラセミ化が起こり得る。塩基性条件は、窒素含有塩基、ＮＨ４ＨＣＯ３、（ＮＨ４）２ＣＯ３、ＮＨ４ＯＨ／ＣＯ２混合物、カルバメート塩、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、カルボネート、アルカリ金属塩基及びアルカリ土類金属塩基の群から有利に選択される物質の使用下に調整され得る。
【００６７】
酸性又は塩基性加水分解は、５０℃〜２００℃、有利に８０℃〜１８０℃及び特に有利に９０°〜１６０℃の温度で有利に実施される。
【００６８】
有利な１方法で、尿素誘導体III〜Vのアミノ酸残基は、Ｄ‐立体配置又はＬ‐立体配置で、又はＤ‐立体配置及びＬ‐立体配置を含む混合物で存在し、尿素誘導体がメチオニンから誘導されている場合には、Ｄ‐立体配置及びＬ‐立体配置を含む混合物で有利に存在する。
【００６９】
もう１つの有利な方法で、尿素誘導体III〜Vのアミノ酸残基は、Ｄ‐立体配置又はＬ‐立体配置で、又はＤ‐立体配置及びＬ‐立体配置を含む混合物であり、尿素誘導体が、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン、シスチンの群から選択されるアミノ酸から誘導されている場合には、有利にＬ‐立体配置である。
【００７０】
もう１つの有利な方法で、ＬＬ、ＤＬ、ＬＤ及びＤＤの混合物として、有利にＬＬ、ＬＤ、ＤＬの混合物として存在するジペプチドが得られる。
【００７１】
有利な１方法で、ジケトピペラジンを加水分解の前に分離させる。この際、ジケトピペラジンを、有利に−３０〜１２０℃の温度で、特に有利に１０〜７０℃の温度で反応溶液から結晶化によって分離させることが有利である。
【００７２】
塩基性反応溶液から、式 ＤＤ／ＬＬ／ＤＬ／ＬＤ‐（I）及びＤＤ／ＬＬ／ＤＬ／ＬＤ‐（II）のジペプチドのジアステレオマー混合物、有利にＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（I）及びＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）を含むジアステレオマー混合物を分離させるために、これを酸性化させ、かつ結晶化又は沈殿によって取得する。この際、２〜１０のｐＨ値が有利であり、３〜９のｐＨ値が特に有利であり、式I及びIIの各ジペプチドの相応する等電点が極めて特に有利である。この際、有利に、鉱酸、ＨＣｌ、Ｈ２ＣＯ３、ＣＯ２／Ｈ２Ｏ、Ｈ２ＳＯ４、燐酸、カルボン酸及びヒドロキシカルボン酸の群からの酸を酸性化のために使用することができる。
【００７３】
酸性反応溶液から、式 ＤＤ／ＬＬ／ＤＬ／ＬＤ‐（I）及びＤＤ／ＬＬ／ＤＬ／ＬＤ‐（II）のジペプチドのジアステレオマー混合物、有利にＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン（I）及びＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ（II）を含むジアステレオマー混合物を分離させるために、塩基の添加によって中和させ、かつ結晶化又は沈殿によって取得する。この際、２〜１０のｐＨ値が有利であり、３〜９のｐＨ値が特に有利であり、式I及びIIの各ジペプチドの相応する等電点が極めて特に有利である。この際、中和のために、ＮＨ４ＨＣＯ３、（ＮＨ４）２ＣＯ３、窒素含有塩基、ＮＨ４ＯＨ、カルバメート塩、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、カルボネート、アルカリ金属塩基及びアルカリ土類金属塩基の群からの塩基が有利に使用される。
【００７４】
本発明による方法のもう１つの択一的実施態様は、保護基技法の使用下に、非天然ジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニンIａ‐Iｊ又はＤ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡIIａ‐IIｊの合成を包含する。即ち、ジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）の合成のために、遊離Ｌ‐ＥＡＡのアミノ基を、先ずＢＯＣ‐保護基（ｔ‐ブトキシカルボニル‐）で保護した。択一的に、Ｚ‐保護基（ベンゾキシカルボニル‐）を効果的に使用することもできた。Ｄ‐メチオニンをメタノールでエステル化させ、それによって、酸官能基を保護した。引き続いて、ＢＯＣ‐保護又はＺ‐保護のＬ‐ＥＡＡと、Ｄ‐メチオニンメチルエステルとのカップリング反応を、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）の使用下に実施した（図式５参照）。
【００７５】
【化１２】
【００７６】
ＢＯＣ‐Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン‐ＯＭｅ又はＺ‐Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン‐ＯＭｅの精製後に、緩和な塩基性条件下に、先ずメチルエステルを分離させた。最後に、ＢＯＣ‐保護基又はＺ‐保護基を氷酢酸中のＨＢｒで酸性的に離脱させ、遊離ジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）を再沈殿及び再結晶によって精製した（図式６）。
【００７７】
【化１３】
【００７８】
択一的に、ＢＯＣ‐保護のジペプチドメチルエステルＢＯＣ‐Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン‐ＯＭｅを、同様に先ず氷酢酸中のＨＢｒと反応させ、そうしてＢＯＣ‐保護基を除去することもできた。蒸発後に、引き続いて、メチルエステルを希塩酸溶液の添加によって分離させることができた。次いで、遊離ジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）を再び再沈殿及び再結晶によって精製することができた（図式６参照）。
【００７９】
全工程をジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニンIａ‐Iｊにも応用することができた。この際、Ｌ‐ＥＡＡ及びＢＯＣ‐保護又はＺ‐保護のＤ‐メチオニンのメチルエステルを使用した。
【００８０】
挙げられた全ての本発明の方法は、有利に水性媒体中で実施される。
【００８１】
更に、本発明の方法は、当業者に公知のバッチ法で、又は連続法で実施され得る。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】カガミゴイからの酵素を用いたＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）ジペプチドの分解を示す。
【図２】カガミゴイからの酵素を用いたＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）ジペプチドの分解を示す。
【図３】ニジマスの酵素を用いたＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）ジペプチドの分解を示す。
【図４】ニジマスの酵素を用いたＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）ジペプチドの分解を示す。
【図５】バナメイの酵素を用いたＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）ジペプチドの分解を示す。
【図６】バナメイの酵素を用いたＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）ジペプチドの分解を示す。
【図７】カガミゴイの酵素を用いたＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）ジペプチドの分解を示す。
【図８】ソウギョの酵素を用いたＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）ジペプチドの分解を示す。
【図９】ティラピアの酵素を用いたＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）ジペプチドの分解を示す。
【図１０】バナメイの酵素を用いたＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）ジペプチドの分解を示す。
【図１１】ニジマスの酵素を用いたＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）ジペプチドの分解を示す。
【図１２】カガミゴイの酵素を用いたＬ‐Ｔｒｐ‐Ｄ‐Ｍｅｔ／Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｔｒｐ（ＬＤ‐Iｊ／ＤＬ‐IIｊ）及びＬ‐Ｔｒｐ‐Ｄ‐Ｍｅｔ／Ｌ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｔｒｐ（ＬＤ‐Iｊ／ＬＬ‐IIｊ）を含む混合物の分解を示す。
【図１３】カガミゴイからの１％の酵素溶液での天然Ｌ‐Ｉｌｅ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐Iｃ）又はＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｉｌｅ（ＬＬ‐IIｃ）ジペプチドの、及び１０％の酵素溶液での非天然Ｌ‐Ｉｌｅ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐Iｃ）又はＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｉｌｅ（ＤＬ‐IIｃ）ジペプチドの試験管内分解を示す。
【図１４】カガミゴイからの１％の酵素溶液での天然Ｌ‐Ｔｈｒ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐Iｄ）又はＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｔｈｒ（ＬＬ‐IIｄ）ジペプチドの、及び１０％の酵素溶液での非天然Ｌ‐Ｔｈｒ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐Iｄ）又はＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｔｈｒ（ＤＬ‐IIｄ）ジペプチドの試験管内分解を示す。
【図１５】カガミゴイからの１％の酵素溶液での天然Ｌ‐Ｌｙｓ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐Iｅ）又はＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｌｙｓ（ＬＬ‐IIｅ）ジペプチドの、及び１０％の酵素溶液での非天然Ｌ‐Ｌｙｓ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐Iｅ）又はＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｌｙｓ（ＤＬ‐IIｅ）ジペプチドの試験管内分解を示す。
【図１６】鶏からの酵素を用いたＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）ジペプチドの分解を示す。
【図１７】鶏からの酵素を用いたＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）ジペプチドの分解を示す。
【実施例】
【００８３】
例１：
保護基技法の使用下での、非天然ジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニンIａ‐Iｊ又はＤ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡIIａ‐IIｊの一般的合成法
この際、ジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）の合成のために、遊離Ｌ‐ＥＡＡのアミノ基を先ずＢＯＣ‐保護基（ｔ‐ブトキシカルボニル‐）で保護した。択一的に、Ｚ‐保護基（ベンゾキシカルボニル‐）も効果的に使用することができた。Ｄ‐メチオニンをメタノールでエステル化させ、それによって、酸官能基を保護した。続いて、ＢＯＣ‐保護又はＺ‐保護のＬ‐ＥＡＡとＤ‐メチオニンメチルエステルとのカップリング反応を、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）の使用下に実施した（図式５参照）。
【００８４】
【化１４】
【００８５】
ＢＯＣ‐Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン‐ＯＭｅ又はＺ‐Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン‐ＯＭｅの精製後に、緩和な塩基性条件下に、先ずメチルエステルを分離した。最終的にＢＯＣ‐保護基又はＺ‐保護基を、氷酢酸中のＨＢｒで酸性的に離脱させ、遊離ジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）を再沈殿及び再結晶によって精製した（図式６参照）。
【００８６】
【化１５】
【００８７】
択一的に、ＢＯＣ‐保護のジペプチドメチルエステルＢＯＣ‐Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン‐ＯＭｅを同様に先ず氷酢酸中のＨＢｒと反応させ、そうしてＢＯＣ‐保護基を除去することができた。蒸発後に、引き続き、メチルエステルを希塩酸溶液の添加によって分離することができた。次いで、遊離ジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン（ＬＤ‐I）を再び再沈殿及び再結晶によって精製することができた（図式６参照）。
【００８８】
全工程をジペプチドＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニンIａ‐Iｊにも応用することができた。この際、Ｌ‐ＥＡＡ及びＢＯＣ‐保護又はＺ‐保護のＤ‐メチオニンのメチルエステルを使用した。
【００８９】
例２：
ａ）Ｚ‐Ｄ‐Ｍｅｔの合成法
Ｄ‐メチオニン３０．０ｇ（０．２０１モル）及びＮａ２ＣＯ３ ４２．４ｇ（０．４モル）を、水２００ｍｌ中に前以て入れ、氷浴中０℃に冷却した。その後に、カルボキシベンジルオキシクロリド（Ｃｂｚ‐Ｃｌ）５１．２ｇ（０．３モル）を徐々に添加し、反応混合物を室温で３時間攪拌した。引き続き、希塩酸で酸性化させ、反応溶液を各々ＭＴＢＥ５０ｍｌで３回抽出した。合一した有機相をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、回転蒸発器で濃縮させた。取得した残渣をジエチルエーテル／エチルアセテートから再結晶させ、真空中３０℃で乾燥させた。カルボキシベンジルオキシ‐Ｄ‐メチオニン（Ｚ‐Ｄ‐Ｍｅｔ）３６．４ｇ（６４％）を、白色結晶性固体として単離した。
【００９０】
ｂ）Ｚ‐Ｌ‐ＥＡＡの一般的合成法
Ｌ‐ＥＡＡ５０ミリモル及びＮａ２ＣＯ３ １０．６ｇ（１００ミリモル）を、水５０ｍｌ中に前以て入れ、氷浴中０℃に冷却した。その後に、カルボキシベンジルオキシクロリド（Ｃｂｚ‐Ｃｌ）１２．８ｇ（７５ミリモル）を徐々に添加し、反応混合物を室温で３時間攪拌した。引き続き、希塩酸で酸性化させ、反応溶液を各々ＭＴＢＥ２５ｍｌで３回抽出した。合一した有機相をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、回転蒸発器で濃縮させた。取得した残渣を再結晶させ、真空中３０℃で乾燥させた。
【００９１】
例３：
Ｄ‐Ｍｅｔ‐ＯＭｅ ｘ ＨＣｌの合成法
Ｄ‐メチオニン５０．０ｇ（０．３３５モル）を、メタノール５００ｍｌ中に懸濁させ、適度な速度のＨＣｌガスを飽和まで流通させた。この際、メチオニンが溶解し、溶液は５５℃に発熱した。引き続き、反応混合物を１晩室温で攪拌した。翌朝に、混合物を回転蒸発器上４０℃で濃縮乾固させ、取得した残渣をジエチルエーテルから２回再結晶させた。Ｄ‐メチオニンメチルエステル塩酸塩４７．１ｇ（８６％）を白色結晶性固体として単離した。
【００９２】
例４：
Ｌ‐ＥＡＡ‐ＯＭｅ ｘ ＨＣｌの一般的合成法
Ｌ‐ＥＡＡ０．３モルを、メタノール５００ｍｌ中に懸濁させ、適度な速度のＨＣｌガスを飽和まで流通させた。この際、アミノ酸が溶解し、溶液は５０〜６０℃に発熱した。引き続き、反応混合物を１晩室温で攪拌した。翌朝に、混合物を回転蒸発器上４０℃で濃縮乾固させ、取得した残渣をジエチルエーテル又はジエチルエーテル／メタノール混合物から２回再結晶させた。
【００９３】
例５：
ＰＧ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ−ＥＡＡ‐ＯＭｅ（ＰＧ‐ＤＬ‐II‐ＯＭｅ）群の化合物の一般的合成法（カップリング反応）
Ｌ‐ＥＡＡ‐ＯＭｅ塩酸塩２０．０ミリモルを、クロロホルム３０ｍｌ及びメタノール５ｍｌを含む混合物中に懸濁させ、Ｋ２ＣＯ３ ４．１５ｇ（３０ミリモル）を加え、室温で１時間攪拌した。引き続いて、塩を濾過し、少量のクロロホルムで洗浄した。濾液の濃縮後に、取得した残渣をテトラヒドロフラン５０ｍｌ中に入れ、ＤＣＣ４．３７ｇ（２１．０ミリモル；１．０５当量（ｅｑ．））及びＺ‐Ｄ‐メチオニン５．６６ｇ（２０．０ミリモル）を加え、室温で１６時間（ｈ）に渡り攪拌した。その後に、反応混合物に氷酢酸３ｍｌを加え、３０分間攪拌し、生じた白色固体（Ｎ，Ｎ’‐ジシクロヘキシル尿素）を濾過した。濾液を回転蒸発器で濃縮させ、場合により生じるＮ，Ｎ’‐ジシクロヘキシル尿素を濾過した。引き続いて、油状残渣をクロロホルム／ｎ‐ヘキサンから再結晶させ、油ポンプ真空中で乾燥させた。
【００９４】
ＰＧ：保護基（Ｚ‐保護基又はＢＯＣ‐保護基）
５ａ）Ｚ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｖａｌ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＤＬ‐IIａ‐ＯＭｅ）
【化１６】
【００９５】
実験式：Ｃ１９Ｈ２８Ｎ２Ｏ５Ｓ（３９６．５０ｇ／モル）、収量：４．６０ｇ（５８％）、純度：９７％、白色固体。
【００９６】
【００９７】
５ｂ）Ｚ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｌｅｕ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＤＬ‐IIｂ‐ＯＭｅ）
【化１７】
【００９８】
実験式：Ｃ２０Ｈ３０Ｎ２Ｏ５Ｓ（４１０．５３ｇ／モル）、収量：５．４０ｇ（６６％）、純度：９７％、白色固体。
【００９９】
【０１００】
５ｃ）Ｚ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｉｌｅ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＤＬ‐IIｃ‐ＯＭｅ）
【化１８】
【０１０１】
実験式：Ｃ２０Ｈ３０Ｎ２Ｏ５Ｓ（４１０．５３ｇ／モル）、収量：５．０９ｇ（６２％）、純度：９７％、白色固体。
【０１０２】
【０１０３】
５ｄ）Ｚ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｔｈｒ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＤＬ‐IIｄ‐ＯＭｅ）
【化１９】
【０１０４】
実験式：Ｃ１８Ｈ２６Ｎ２Ｏ６Ｓ（３９８．４７ｇ／モル）、収量：２．１４ｇ（３６％）、純度：９８％、やや帯黄色の固体。
【０１０５】
【０１０６】
５ｅ）Ｚ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＤＬ‐IIｅ（Ｂｏｃ‐ＯＭｅ）
【化２０】
【０１０７】
実験式：Ｃ２５Ｈ３９Ｎ３Ｏ７Ｓ（５２５．６６ｇ／モル）、収量：１０．８６ｇ（３３％）、純度：９５％、やや帯黄色の固体。
【０１０８】
【０１０９】
５ｆ）Ｚ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｐｈｅ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＤＬ‐IIｇ‐ＯＭｅ）
【化２１】
【０１１０】
実験式：Ｃ２３Ｈ２８Ｎ２Ｏ５Ｓ（４４４．５４ｇ／モル）、収量：３．７３ｇ（４２％）、純度：９５％（ＨＰＬＣ）、白色固体。
【０１１１】
【０１１２】
５ｇ）Ｚ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｈｉｓ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＤＬ‐IIｈ‐ＯＭｅ）
【化２２】
【０１１３】
実験式：Ｃ２０Ｈ２６Ｎ４Ｏ５Ｓ（４３４．５１ｇ／モル）、収量：２．３５ｇ（２７％）、純度：９５％（ＨＰＬＣ）、やや帯黄色の固体。
【０１１４】
【０１１５】
５ｈ）Ｚ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｔｒｐ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＤＬ‐IIｊ‐ＯＭｅ）
【化２３】
【０１１６】
実験式：Ｃ２５Ｈ２９Ｎ３Ｏ５Ｓ（４８３．５８ｇ／モル）、収量：５．７１ｇ（５９％）、純度：９８％（ＨＰＬＣ）、やや帯黄色の固体。
【０１１７】
【０１１８】
例６：
ＰＧ‐Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐ＯＭｅ（ＰＧ‐ＬＤ‐I‐ＯＭｅ）群の化合物の一般的合成法（カップリング反応）
Ｄ‐メチオニンメチルエステル塩酸塩３．９９ｇ（２０．０ミリモル）を、クロロホルム３０ｍｌ及びメタノール５ｍｌを含む混合物中で懸濁させ、Ｋ２ＣＯ３ ４．１５ｇ（３０ミリモル）を加え、室温で１時間攪拌した。引き続いて、塩を濾過し、少量のクロロホルムで洗浄した。濾液の濃縮後に、取得した残渣をテトラヒドロフラン５０ｍｌ中に入れ、ＤＣＣ４．３７ｇ（２１．０ミリモル；１．０５当量）及び相応するＰＧ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＰＧ‐Ｌ‐アミノ酸）２０．０ミリモルを加え、室温で１６時間に渡り攪拌した。その後に、反応混合物に氷酢酸３ｍｌを加え、３０分間攪拌し、生じた白色固体（Ｎ，Ｎ’‐ジシクロヘキシル尿素）を濾過した。濾液を回転蒸発器で濃縮させ、場合により生じるＮ，Ｎ’‐ジシクロヘキシル尿素を濾過した。引き続いて、油状残渣をクロロホルム／ｎ‐ヘキサンから２回再結晶させ、油ポンプ真空中で乾燥させた。
【０１１９】
ＰＧ：保護基（Ｚ‐保護基又はＢＯＣ‐保護基）
６ａ）Ｚ‐Ｌ‐Ｖａｌ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＬＤ‐Iａ‐ＯＭｅ）
【化２４】
【０１２０】
実験式：Ｃ１９Ｈ２８Ｎ２Ｏ５Ｓ（３９６．５０ｇ／モル）、収量：３．０１ｇ（３８％）、純度：９５％（ＨＰＬＣ）、白色固体。
【０１２１】
【０１２２】
６ｂ）Ｚ‐Ｌ‐Ｌｅｕ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＬＤ‐Iｂ‐ＯＭｅ）
【化２５】
【０１２３】
実験式：Ｃ２０Ｈ３０Ｎ２Ｏ５Ｓ（４１０．５３ｇ／モル）、収量：４．４８ｇ（５５％）、純度：９６％（ＨＰＬＣ）、白色固体。
【０１２４】
【０１２５】
６ｃ）Ｚ‐Ｌ‐Ｉｌｅ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＬＤ‐Iｃ‐ＯＭｅ）
【化２６】
【０１２６】
実験式：Ｃ２０Ｈ３０Ｎ２Ｏ５Ｓ（４１０．５３ｇ／モル）、収量：３．８９ｇ（４７％）、純度：９７％（ＨＰＬＣ）、白色固体。
【０１２７】
【０１２８】
６ｄ）Ｚ‐Ｌ‐Ｔｈｒ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＬＤ‐Iｄ‐ＯＭｅ）
【化２７】
【０１２９】
実験式：Ｃ１８Ｈ２６Ｎ２Ｏ６Ｓ（３９８．４７ｇ／モル）、収量：２．４７ｇ（３１％）、純度：９９％（ＨＰＬＣ）、やや帯黄色の固体。
【０１３０】
【０１３１】
６ｅ）ＢＯＣ‐Ｌ‐Ｌｙｓ（ＢＯＣ）‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐ＯＭｅ（ＢＯＣ‐ＬＤ‐Iｅ（ＢＯＣ）‐ＯＭｅ）
【化２８】
【０１３２】
実験式：Ｃ２２Ｈ４１Ｎ３Ｏ７Ｓ（４９１．６４ｇ／モル）、収量：５．２２ｇ（５３．１％）、純度：９７％（ＨＰＬＣ）、白色無定形固体。
【０１３３】
【０１３４】
６ｆ）Ｚ‐Ｌ‐Ｐｈｅ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＬＤ‐Iｇ‐ＯＭｅ）
【化２９】
【０１３５】
実験式：Ｃ２３Ｈ２８Ｎ２Ｏ５Ｓ（４４４．５４ｇ／モル）、収量：３．５１ｇ（４０％）、純度：９９％（ＨＰＬＣ）、白色固体。
【０１３６】
【０１３７】
６ｇ）ＢＯＣ‐Ｌ‐Ｐｈｅ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐ＯＭｅ（ＢＯＣ‐ＬＤ‐Iｇ‐ＯＭｅ）
【化３０】
【０１３８】
実験式：Ｃ２０Ｈ３０Ｎ２Ｏ５Ｓ（４１０．５３ｇ／モル）、収量：４．０３ｇ（４９％）、純度：９８％（ＨＰＬＣ）、白色固体。
【０１３９】
【０１４０】
６ｈ）Ｚ‐Ｌ‐Ｈｉｓ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＬＤ‐Iｈ‐ＯＭｅ）
【化３１】
【０１４１】
実験式：Ｃ２０Ｈ２６Ｎ４Ｏ５Ｓ（４３４．５１ｇ／モル）、収量：１．６５ｇ（１９％）、純度：９５％（ＨＰＬＣ）、やや帯黄色の固体。
【０１４２】
【０１４３】
６ｉ）Ｚ‐Ｌ‐Ｔｒｐ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐ＯＭｅ（Ｚ‐ＬＤ‐Iｊ‐ＯＭｅ）
【化３２】
【０１４４】
実験式：Ｃ２５Ｈ２９Ｎ３Ｏ５Ｓ（４８３．５８ｇ／モル）、収量：５．５０ｇ（５７％）、純度：９９％（ＨＰＬＣ）、やや帯黄色の固体。
【０１４５】
【０１４６】
６ｊ）ＢＯＣ‐Ｌ‐Ｔｒｐ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐ＯＭｅ（ＢＯＣ‐ＬＤ‐Iｊ‐ＯＭｅ）
【化３３】
【０１４７】
実験式：Ｃ２２Ｈ３１Ｎ３Ｏ５Ｓ（４４９．５６ｇ／モル）、収量：５．９１ｇ（６６％）、純度：９９％（ＨＰＬＣ）、白色固体。
【０１４８】
【０１４９】
例７：
ＰＧ‐Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＰＧ‐ＬＤ‐I）及びＰＧ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＰＧ‐ＤＬ‐II）群の化合物の一般的合成法（メチルエステル分離）
ＰＧ‐Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐ＯＭｅ（ＰＧ‐ＬＤ‐I‐ＯＭｅ）又はＰＧ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ‐ＯＭｅ（ＰＧ‐ＤＬ‐II‐ＯＭｅ）１０．０ミリモルを、水１５ｍｌ及びメタノール２００ｍｌ中で懸濁させ、ＮａＯＨ１．２当量（１２．０ミリモル）を加える（１Ｎ ＮａＯＨ１２．０ｍｌ）。２時間の攪拌後に、均質の反応溶液を希塩酸で酸性化させ、メタノールを回転蒸発器で溜去させる。ここで晶出する白色固体を濾過し、水２０ｍｌで洗浄しかつ再結晶させる。
【０１５０】
ＰＧ：保護基（Ｚ‐保護基又はＢＯＣ‐保護基）
例８：
Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）群の化合物の一般的合成法（Ｎ‐末端のＺ‐保護基分離）
Ｚ‐Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（Ｚ‐ＬＤ‐I）又はＺ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（Ｚ‐ＬＤ‐II）５．０ミリモルを、氷酢酸５０ｍｌ中に溶かし、ジメチルスルフィド１８．５ｍｌ（１５．６ｇ；２５０ミリモル；５０当量）及び酢酸中３３％のＨＢｒ（１．６５ｇ；４．０当量）５．０ｇ（３．６ｍｌ）を加えた。反応の終了後に、反応溶液を回転蒸発器で濃縮させた。残渣をメタノール約５０ｍｌ中に溶かし、ナトリウムメタンチオレート３．５ｇ（５０ミリモル；１０当量）を加えた。室温で２０分間攪拌後に、溶液を濃塩酸で中和させ、溶液を回転蒸発器で濃縮させた。残渣を水４０ｍｌ中に入れ、各ジエチルエーテル４０ｍｌで３回抽出した。水相を回転蒸発器で濃縮させ、この際、嵩張った白色固体が生じた。ジペプチドを吸引濾過し、少量の水で洗浄しかつ真空で乾燥させた。
【０１５１】
例９：
Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）群の化合物の一般的合成法（Ｎ‐末端のＢＯＣ‐保護基分離）
ＢＯＣ‐Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＢＯＣ‐ＬＤ‐I）又はＢＯＣ‐Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＢＯＣ‐ＬＤ‐II）５．０ミリモルを、氷酢酸５０ｍｌ中に溶かし、酢酸中３３％のＨＢｒ（１．６５ｇ；４．０当量）５．０ｇ（３．６ｍｌ）を加えた。反応の終了後に、反応溶液を回転蒸発器で濃縮させた。残渣を水４０ｍｌ中に入れ、各ジエチルエーテル４０ｍｌで３回抽出した。水相を氷浴中での連続冷却中に徐々に２０％のＮａＯＨ溶液で中和した。溶液を各ジエチルエーテル４０ｍｌで３回洗浄し、水相を回転蒸発器で濃縮させ、この際、嵩張った白色固体が生じた。ジペプチドを吸引濾過し、少量の水で洗浄しかつ真空で乾燥させた。
【０１５２】
９ａ）Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｌｅｕ（ＤＬ‐IIｂ）
【化３４】
【０１５３】
収量：８６０ｍｇ（６６％）、純度：９８％（ＨＰＬＣ）、嵩張った白色固体。
【０１５４】
【０１５５】
９ｂ）Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｉｌｅ（ＤＬ‐IIｃ）
【化３５】
【０１５６】
収量：９００ｍｇ（６９％）。純度：９９％（ＨＰＬＣ）、嵩張った白色固体
【０１５７】
９ｃ）Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｔｈｒ（ＤＬ‐IIｄ）
【化３６】
【０１５８】
収量：６４０ｍｇ（５１％）、純度：９８％（ＨＰＬＣ）、嵩張った白色固体
【０１５９】
９ｄ）Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｌｙｓ ｘ ２ＨＣｌ（ＤＬ‐IIｅ‐２ＨＣｌ）
【化３７】
【０１６０】
収量：６１３ｍｇ（４９％）、純度：９７％（ＨＰＬＣ）、帯黄色固体
【０１６１】
９ｅ）Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｐｈｅ（ＤＬ‐IIｇ）
【化３８】
【０１６２】
収量：９３０ｍｇ（６３％）、純度：９８％（ＨＰＬＣ）、嵩張った白色固体
【０１６３】
９ｆ）Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｔｒｐ（ＤＬ‐IIｊ）
【化３９】
【０１６４】
収量：１．３８ｇ（８２％）、純度：９８％（ＨＰＬＣ）、嵩張った白色固体
【０１６５】
９ｇ）Ｌ‐Ｌｅｕ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐Iｂ）
【化４０】
【０１６６】
収量：７１０ｍｇ（５４％）、純度：９９％（ＨＰＬＣ）、嵩張った白色固体
【０１６７】
９ｈ）Ｌ‐Ｉｌｅ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐Iｃ）
【化４１】
【０１６８】
収量：７９０ｍｇ（５９％）、純度：９７％（ＨＰＬＣ）、嵩張った白色固体
【０１６９】
９ｉ）Ｌ‐Ｔｈｒ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐Iｄ）
【化４２】
【０１７０】
収量：６９０ｍｇ（５５％）、純度：９９％（ＨＰＬＣ）、嵩張った白色固体
【０１７１】
９ｊ）Ｌ‐Ｌｙｓ‐Ｄ‐Ｍｅｔ ｘ ２ＨＣｌ（ＬＤ‐Iｅ‐２ＨＣｌ）
【化４３】
【０１７２】
収量：６７６ｍｇ（５４％）、純度：９６％（ＨＰＬＣ）、無色結晶
【０１７３】
９ｋ）Ｌ‐Ｐｈｅ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐Iｇ）
【化４４】
【０１７４】
収量：８８０ｍｇ（５９％）、純度：９８％（ＨＰＬＣ）、嵩張った白色固体
【０１７５】
９ｌ）Ｌ‐Ｔｒｐ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐Iｊ）
【化４５】
【０１７６】
収量：１．４０ｇ（８３％）、純度：９８％（ＨＰＬＣ）、嵩張った白色固体
【０１７７】
例１０：
ＫＯＨを用いた、５‐［２‐（メチルチオ）エチル］‐２，４‐イミダゾリジンジオン（メチオニンヒダントイン）（Vｎ）及びＬ‐イソロイシンからＭｅｔ‐Ｉｌｅ（IIｃ）のジアステレオマー混合物の化学合成
Ｌ‐イソロイシン１１．８ｇ（０．０９モル）、５‐［２‐（メチルチオ）エチル］‐２，４‐イミダゾリジンジオン（Vｎ）１７．２ｇ（０．０９モル、純度：９１％）及び８５％のＫＯＨ１１．９ｇ（０．８モル）を水１５０ｍｌ中に溶かし、磁気攪拌を伴うRoth社の２００ｍｌ入り鋼製オートクレーブ中１５０℃で５時間攪拌し、この際、圧力は８バールに上昇した。反応の終了後に、オートクレーブを冷却し、生じた固体を濾過し、少量の水で洗浄した。濾液に、適度なＣＯ２流を流通させた。ここで生じる固体を再び吸引濾過し、少量の冷水で洗浄し、油ポンプ真空中３０℃で数時間乾燥させた。秤量：白色固体７．３ｇ（理論値の３１％）。１Ｈ‐ＮＭＲは、Ｌ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｉｌｅ（ＬＬ‐IIｃ）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｉｌｅ（ＤＬ‐IIｃ）の重層した１Ｈ‐ＮＭＲスペクトルと一致した。（例９ｂ参照）。
【０１７８】
例１１：
ＫＯＨを用いた、Ｎ‐カルバモイルメチオニン（IIIｎ）及びＬ‐イソロイシンから、Ｍｅｔ‐Ｉｌｅ（IIｃ）のジアステレオマー混合物の化学合成
Ｌ‐イソロイシン１１．８ｇ（０．０９モル）、Ｎ‐カルバモイルメチオニン（IIIｎ）１７．５ｇ（０．０９モル、純度：９９％）及び８５％のＫＯＨ１１．９ｇ（０．１８モル）を水１５０ｍｌ中に溶かし、磁気攪拌を伴うRoth社の２００ｍｌ入り鋼製オートクレーブ中１５０℃で５時間攪拌し、この際、圧力は７バールに上昇した。反応の終了後に、オートクレーブを冷却し、生じた固体を濾過し、少量の水で洗浄した。濾液を１０％の硫酸で中和し、ここで生じる固体を吸引濾過し、少量の冷水で洗浄しかつ油ポンプ真空中３０℃で数時間乾燥させた。秤量：白色固体６．４ｇ（理論値の２７％）。１Ｈ‐ＮＭＲは、Ｌ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｉｌｅ（ＬＬ‐IIｃ）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｉｌｅ（ＤＬ‐IIｃ）の重層した１Ｈ‐ＮＭＲスペクトルと一致した。（例９ｂ参照）。
【０１７９】
例１２：
ＫＯＨを用いた、２‐［（アミノカルボニル）アミノ］‐４‐（メチルチオ）ブタン酸アミド（Ｎ‐カルバモイルメチオニンアミド）（IVｎ）及びＬ‐イソロイシンから、Ｍｅｔ‐Ｉｌｅ（IIｃ）のジアステレオマー混合物の化学合成
Ｌ‐イソロイシン１１．８ｇ（０．０９モル）、２‐［（アミノカルボニル）アミノ］‐４‐（メチルチオ）ブタン酸アミド（IVｎ）１７．４ｇ（９０ミリモル、純度：９８．５％）及び８５％のＫＯＨ１１．９ｇ（０．８モル）を水１５０ｍｌ中に溶かし、磁気攪拌を伴うRoth社の２００ｍｌ入り鋼製オートクレーブ中１５０℃で５時間攪拌し、この際、圧力は７バールに上昇した。反応の終了後に、オートクレーブを冷却し、生じた固体を濾過し、少量の水で洗浄した。濾液を半濃塩酸で中和し、ここで生じる固体を吸引濾過し、少量の冷水で洗浄し、油ポンプ真空中３０℃で数時間乾燥させた。秤量：白色固体８．０ｇ（理論値の３４％）。１Ｈ‐ＮＭＲは、Ｌ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｉｌｅ（ＬＬ‐IIｃ）及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐Ｉｌｅ（ＤＬ‐IIｃ）の重層した１Ｈ‐ＮＭＲスペクトルと一致した。（例９ｂ参照）。
【０１８０】
例１３：
５‐［２‐（メチルチオ）エチル］‐２，４‐イミダゾリジンジオン（メチオニンヒダントイン）（Vｎ）及びＬ‐イソロイシンから、３‐［２‐（メチルチオ）エチル］‐６‐（１‐メチル）プロピル）‐２，５‐ピペラジンジオン（VIｃ）の化学合成
Ｌ‐イソロイシン１１．８ｇ（０．０９モル）、５‐［２‐（メチルチオ）エチル］‐２，４‐イミダゾリジンジオン（Vｎ）１７．２ｇ（０．０９モル、純度：９１％）及び（ＮＨ４）ＨＣＯ３ ７．１ｇ（０．９モル）を、水１５０ｍｌ中に溶かし、磁気攪拌を伴うRoth社の２００ｍｌ入り鋼製オートクレーブ中１５０℃で５時間攪拌し、この際、圧力は上昇した。時折、ガスを放出させることによって、圧力を８バールに一定保持した。反応の終了後に、オートクレーブを氷浴中で冷却した。得られる懸濁液を引き続いて濾過し、濾過した固体を水で数回洗浄し、油ポンプ真空中３０℃で数時間乾燥させた。秤量：白色固体としてVIｃ９．９ｇ（理論値の４５％）。
【０１８１】
【化４６】
【０１８２】
【０１８３】
例１４：
Ｎ‐カルバモイルメチオニン（IIIｎ）及びＬ‐イソロイシンから、３‐［２‐（メチルチオ）エチル］‐６‐（１‐メチル）プロピル）‐２，５‐ピペラジンジオン（VIｃ）の化学合成
Ｌ‐イソロイシン１１．８ｇ（０．０９モル）、Ｎ‐カルバモイルメチオニン（IIIｎ）１７．５ｇ（０．０９モル、純度：９９％）及び（ＮＨ４）ＨＣＯ３ ７．１ｇ（０．９モル）を、水１５０ｍｌ中に溶かし、磁気攪拌を伴うRoth社の２００ｍｌ入り鋼製オートクレーブ中１５０℃で５時間攪拌し、この際、圧力は上昇した。時折、ガスを放出させることによって、圧力を８バールに一定保持した。反応の終了後に、オートクレーブを氷浴中で冷却した。得られる懸濁液を引き続いて濾過し、濾過した固体を水で数回洗浄し、油ポンプ真空中３０℃で数時間乾燥させた。秤量：白色固体として化合物VIｃ９．１ｇ（理論値の４１．３％）。ＮＭＲは、例１３からのＮＭＲと一致した。
【０１８４】
例１５：
２‐［（アミノカルボニル）アミノ］‐４‐（メチルチオ）ブタン酸アミド（Ｎ‐カルバモイルメチオニンアミド）（IVｎ）及びＬ‐イソロイシンから、３‐［２‐（メチルチオ）エチル］‐６‐（１‐メチル）プロピル）‐２，５‐ピペラジンジオン（VIｃ）の化学合成
Ｌ‐イソロイシン１１．８ｇ（０．０９モル）、２‐［（アミノカルボニル）アミノ］‐４‐（メチルチオ）ブタン酸アミド（IVｎ）１７．４ｇ（９０ミリモル、純度：９８．５％）及び（ＮＨ４）ＨＣＯ３ ７．１ｇ（０．９モル）を、水１５０ｍｌ中に溶かし、磁気攪拌を伴うRoth社の２００ｍｌ入り鋼製オートクレーブ中１５０℃で５時間攪拌し、この際、圧力は上昇した。時折、ガスを放出させることによって、圧力を８バールに一定保持した。反応の終了後に、オートクレーブを氷浴中で冷却した。得られる懸濁液を引き続いて濾過し、濾過した固体を水で数回洗浄し、油ポンプ真空中３０℃で数時間乾燥させた。秤量：白色固体IVｃ１０．３ｇ（理論値の４７％）。ＮＭＲは、例１３からのＮＭＲと一致した。
【０１８５】
例１６：
濃塩酸を用いた、３‐［２‐（メチルチオ）エチル］‐６‐（１‐メチル）プロピル）‐２，５‐ピペラジンジオン（VIｃ）から、Ｉｌｅ‐Ｍｅｔ（Iｃ）Ｍｅｔ‐Ｉｌｅ（IIｃ）のジアステレオマー混合物の合成
３‐［２‐（メチルチオ）エチル］‐６‐（１‐メチル）プロピル）‐２，５‐ピペラジンジオン（VIｃ）２４．４ｇ（１００ミリモル）を、水６６ｇと懸濁させる。攪拌下に濃塩酸１１ｇを徐々に滴加して、引き続いて慎重に、強力な攪拌下に還流加熱した。反応混合物を８時間還流加熱し、それによって全ての固体は溶解した。引き続いて冷却する間に、少量の未反応のジケトピペラジンが生じ、それを濾過した。引き続いて、濾液を、氷浴を備えたフラスコ中で３２％のアンモニア水でｐＨ５〜６に調整した。この際、ＤＬ‐Ｍｅｔ‐ＤＬ‐Ｉｌｅ（IIｃのジアステレオマー混合物）及びＤＬ‐Ｉｌｅ‐ＤＬ‐Ｍｅｔ（Iｃのジアステレオマー混合物）の混合物が嵩張った白色固体として生じた。固体を乾燥箱中水流ポンプ真空で４０℃で乾燥させた。収量２１．５ｇ（８２．０％）。
【０１８６】
例１７：
アンモニアを用いたアルカリ条件で、３‐［２‐（メチルチオ）エチル］‐６‐（１‐メチル）プロピル）‐２，５‐ピペラジンジオン（VIｃ）から、Ｉｌｅ‐Ｍｅｔ（Iｃ）及びＭｅｔ‐Ｉｌｅ（IIｃ）のジアステレオマー混合物の合成
３‐［２‐（メチルチオ）エチル］‐６‐（１‐メチル）プロピル）‐２，５‐ピペラジンジオン（VIｃ）１９．６ｇ（０．８モル）、２５％のアンモニア溶液２２．４ｍｌ及び水１６０ｍｌを、オートクレーブ中１５０℃に２時間加熱する。冷却後に、未反応のジケトピペラジンを濾過する。これを次の成分に再び使用することができる。濾液を回転蒸発器中水温８０℃で、最初の結晶が生じるまで濃縮させた。冷却及び１晩放置後に、濾過及び乾燥後に、ＤＬ‐Ｍｅｔ‐ＤＬ‐Ｉｌｅ（IIｃのジアステレオマー混合物）及びＤＬ‐Ｉｌｅ‐ＤＬ‐Ｍｅｔ（Iｃのジアステレオマー混合物）の混合物を、嵩張った白色固体として分離することができた。収量：１２．２ｇ（５８％）。
【０１８７】
例１８：
雑食性コイからの消化酵素を用いた、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）又はＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）の試験管内消化試験
ａ）カガミゴイ（Cyprinus carpio morpha noblis）から消化酵素の分離
消化酵素の分離は、EID及びMATTYの方法（Aquaculture 1989, 79, 111-119）により実施した。そのために、一年生のカガミゴイ（Cyprinus carpio morpha noblis）５匹の腸を取り出し、水で洗浄し、縦に切開し、かつ各々腸粘膜をかき取った。これを砕氷と一緒に混合機で砕細した。未だ完全な細胞を砕解するために、得られた懸濁液を超音波棒で処理した。細胞成分及び脂肪の分離のために、懸濁液を４℃で３０分間遠心分離にかけ、均質液をデカントし、チメロサールの痕跡量で滅菌した。カガミゴイ５匹から腸粘膜の酵素溶液２９６．３ｍｌを取得した。溶液を４℃の暗所で貯蔵した。
【０１８８】
ｂ）試験管内消化試験の実施
Ｌ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｔ（ＬＬ‐I）を、ＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液に入れ、酵素溶液を加えた。比較として、及び純化学的分離速度の評価のために、各々酵素溶液を含まない盲値を設定した（表３参照）。時折、試料を取り出し、その組成を目盛付きＨＰＬＣで検定し、かつ量定した。変換率を、メチオニンの含量及びＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）の含量の商として測定した（図１及び２参照）。
【０１８９】
【表３】
【０１９０】
例１９
雑食性コイからの消化酵素を用いた、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）又はＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）の試験管内消化試験
ａ）カガミゴイ（Cyprinus carpio morpha noblis）から消化酵素の分離
消化酵素の分離は、EID及びMATTYの方法（Aquaculture 1989, 79, 111-119）により実施した。そのために、一年生のカガミゴイ（Cyprinus carpio morpha noblis）５匹の腸を取り出し、例１８に記載したように処理した。
【０１９１】
ｂ）試験管内消化試験の実施
Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｔ（ＬＤ‐I）を、ＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液に入れ、酵素溶液を加えた。比較として、及び純化学的分離速度の評価のために、各々酵素溶液を含まない盲値を設定した（表４参照）。時折、試料を取り出し、その組成を目盛付きＨＰＬＣで検定し、かつ量定した。変換率を、メチオニンの面積及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）の面積の商として測定した（図７参照）。
【０１９２】
【表４】
【０１９３】
例２０：
肉食性マスからの消化酵素を用いた、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）又はＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）の試験管内消化試験
ａ）ニジマス（Oncorhynchus mykiss）からの消化酵素の分離
消化酵素の分離は、EID及びMATTYの方法（Aquaculture 1989, 79, 111-119）により実施した。そのために、一年生のニジマス（Oncorhynchus mykiss）６匹の腸を取り出し、例１８に記載したように処理した。
【０１９４】
ｂ）試験管内消化試験の実施
試験管内試験を、例１８と同様に実施した（表５、図３及び４参照）。
【０１９５】
【表５】
【０１９６】
例２１：
肉食性マスからの消化酵素を用いた、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）又はＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）の試験管内消化試験
ａ）ニジマス（Oncorhynchus mykiss）からの消化酵素の分離
消化酵素の分離は、EID及びMATTYの方法（Aquaculture 1989, 79, 111-119）により実施した。そのために、一年生のニジマス（Oncorhynchus mykiss）６匹の腸を取り出し、例１８に記載したように処理した。
【０１９７】
ｂ）試験管内消化試験の実施
試験管内試験を、例１９と同様に実施した（表６、図１１参照）。
【０１９８】
【表６】
【０１９９】
例２２：
雑食性の小エビからの消化酵素を用いた、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）又はＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）の試験管内消化試験
ａ）バナメイ（Litopenaeus Vannamei）からの消化酵素の分離
消化酵素の分離は、Ezquerra及びGarcia-Carrenoの方法（J. Food Biochem. 1999, 23, 59-74）により実施した。そのために、バナメイ（Litopenaeus Vannamei）５ｋｇから肝膵臓を取り出し、砕氷と一緒に混合機で砕細した。更なる処理は、例１８と同様に実施した。
【０２００】
ｂ）試験管内消化試験の実施
試験管内試験を、例１８と同様に実施した（表７、図５及び６参照）。
【０２０１】
【表７】
【０２０２】
例２３：
雑食性小エビからの消化酵素を用いた、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）又はＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）の試験管内消化試験
ａ）バナメイ（Litopenaeus Vannamei）からの消化酵素の分離
消化酵素の分離は、Ezquerra及びGarcia-Carrenoの方法（J. Food Biochem. 1999, 23, 59-74）により実施した。そのために、バナメイ（Litopenaeus Vannamei）５ｋｇから肝膵臓を取り出し、砕氷と一緒に混合機で砕細した。更なる処理は例１８と同様に実施した。
【０２０３】
ｂ）試験管内消化試験の実施
試験管内試験を、例１９と同様に実施した（表８、図１０参照）。
【０２０４】
【表８】
【０２０５】
例２４：
鶏からの消化酵素を用いた、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）又はＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）の試験管内消化試験
ａ）消化酵素の分離は、EID及びMATTYの方法（Aquaculture 1989, 79, 111-119）により実施した。そのために、鶏の腸を取り出し、水で洗浄し、縦に切開し、かつ各々腸粘膜をかき取った。これを砕氷と一緒に混合機で砕細した。未だ完全な細胞を砕解するために、得られた懸濁液を超音波棒で処理した。細胞成分及び脂肪の分離のために、懸濁液を４℃で３０分間遠心分離にかけ、均質液をデカントし、チメロサールの痕跡量で滅菌した。鶏から腸粘膜の酵素溶液１１８．９ｍｌを取得し、溶液を４℃の暗所で貯蔵した。
【０２０６】
ｂ）試験管内消化試験の実施
Ｌ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）を、ＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液に入れ、酵素溶液を加えた。比較として、及び純化学的分離速度の評価のために、各々酵素溶液を含まない盲値を設定した。時折、試料を取り出し、その組成を目盛付きＨＰＬＣで検定し、かつ量定した。変換率を、メチオニンの含量及びＬ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＬＬ‐II）又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐Ｍｅｔ（ＬＬ‐I）の含量の商として測定した（図９、図１６参照）。
【０２０７】
【表９】
【０２０８】
例２５：
鶏からの消化酵素を用いた、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）又はＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）の試験管内消化試験
ａ）鶏からの消化酵素の分離
消化酵素の分離は、EID及びMATTYの方法（Aquaculture 1989, 79, 111-119）により実施した。そのために、鶏の腸を取り出し、例２４に記載したように処理した。
【０２０９】
ｂ）試験管内消化試験の実施
Ｄ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）を、ＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液に入れ、酵素溶液を加えた。比較として、及び純化学的分離速度の評価のために、各々酵素溶液を含まない盲値を設定した。時折、試料を取り出し、その組成を目盛付きＨＰＬＣで検定し、かつ量定した。変換率を、メチオニンの面積及びＤ‐Ｍｅｔ‐Ｌ‐ＥＡＡ（ＤＬ‐II）又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐Ｍｅｔ（ＬＤ‐I）の面積の商として測定した（表１０、図１７参照）。
【０２１０】
【表１０】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジペプチド又はその塩を含有する飼料添加剤において、ジペプチドの１個のアミノ酸残基はＤＬ‐メチオニル基であり、かつジペプチドの他のアミノ酸残基は、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン及びシスチンの群から選択される、Ｌ‐立体配置のアミノ酸である飼料添加剤。
【請求項２】
一般式 ＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ及び／又はＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン のジペプチドを含有する飼料添加剤において、Ｌ‐ＥＡＡは、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン及びシスチンの群から選択される、Ｌ‐立体配置のアミノ酸である、請求項１に記載の飼料添加剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の飼料添加剤を含有する飼料混合物。
【請求項４】
ＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ及び／又はＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニンを、単独でＤ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ、Ｌ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐メチオニンとして、相互の混合物として又は同様にＤ‐メチオニル‐Ｄ‐ＥＡＡ、Ｌ‐メチオニル‐Ｄ‐ＥＡＡ、Ｄ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン又はＤ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐メチオニンとの混合物として、有利に各々付加的に、ＤＬ‐メチオニンと、有利に、ＤＬ‐メチオニン０．０１〜９０質量％、有利に０．１〜５０質量％、特に有利に１〜３０質量％の割合と混合して、有利に各々付加的に、Ｌ‐ＥＡＡ、例えば、Ｌ‐リジンと、有利に、Ｌ‐ＥＡＡ０．０１〜９０質量％、有利に０．１〜５０質量％、特に有利に１〜３０質量％の割合と混合して含有する、請求項３に記載の飼料混合物。
【請求項５】
一般式 ＤＬ‐メチオニル‐ＤＬ‐ＥＡＡ又はＤＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン ［式中、ＥＡＡは、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン及びシスチンの群から選択される、有利にＬ‐立体配置のアミノ酸である］のジペプチド又はその塩。
【請求項６】
式 ＤＤ／ＬＬ／ＤＬ／ＬＤ‐I又はＤＤ／ＬＬ／ＤＬ／ＬＤ‐II：
【化１】
による１個だけのメチオニル基を含有するジペプチドを、アミノ酸と、一般式III〜V：
【化２】
［式中、Ｒは、次のように定義される：
Iａ〜Vａ： Ｒ＝１‐メチルエチル‐ （バリン）
Iｂ〜Vｂ： Ｒ＝２‐メチルプロピル‐ （ロイシン）
Ｉｃ〜Vｃ： Ｒ＝（１Ｓ）‐１‐メチルプロピル‐ （イソロイシン）
Iｄ〜Vｄ： Ｒ＝（１Ｒ）‐１‐ヒドロキシエチル‐ （スレオニン）
Ｉｅ〜Vｅ： Ｒ＝４‐アミノブチル‐ （リジン）
Iｆ〜Vｆ： Ｒ＝３‐［（アミノイミノメチル）‐アミノ］プロピル‐
（アルギニン）
Iｇ〜Vｇ： Ｒ＝ベンジル‐ （フェニルアラニン）
Iｈ〜Vｈ： Ｒ＝（１Ｈ‐イミダゾル‐４‐イル）メチル‐ （ヒスチジン）
Iｊ〜Vｊ： Ｒ＝（１Ｈ‐インドル‐３‐イル）メチル‐ （トリプトファン）
Iｋ〜Vｋ： Ｒ＝‐ＣＨ２‐ＳＨ （システイン）
Iｍ〜Vｍ： Ｒ＝‐ＣＨ２‐Ｓ‐Ｓ‐ＣＨ２‐ＣＮＨ２‐ＣＯＯＨ （シスチン）
IIIｎ〜Vｎ： Ｒ＝‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐Ｓ‐ＣＨ３ （メチオニン）、
この際、尿素誘導体III、IV及びV中のＲ１及びＲ２は、次のように定義される：
IIIａ‐ｎ：Ｒ１〜ＣＯＯＨ、Ｒ２＝ＮＨＣＯＮＨ２
IVａ‐ｎ：Ｒ１＝ＣＯＮＨ２、Ｒ２＝ＮＨＣＯＮＨ２
Vａ‐ｎ：Ｒ１‐Ｒ２＝‐ＣＯＮＨＣＯＮＨ‐
及び
この際、Ｒはメチオニル基を表わし、かつ添加されるアミノ酸は、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン又はシスチンの群から選択されるか、又は、
添加されるアミノ酸はメチオニンであり、かつＲは、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン又はシスチンの群から選択されるアミノ酸残基である］の尿素誘導体との反応によって製造するための方法。
【請求項７】
出発生成物として、メチオニンヒダントイン又はリジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン、シスチンの群から選択されるアミノ酸のヒダントインを使用する又は中間生成物として中間的に生成させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
メチオニンヒダントイン及び水を含有する溶液を、アミノ酸と、塩基性条件下に反応させる、又はリジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン、シスチンの群から選択されるアミノ酸のヒダントイン及び水を含有する溶液を、メチオニンと、塩基性条件下に反応させる、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
尿素誘導体を含有する溶液のｐＨ値を、７〜１４に調整し、及び／又は反応を３０〜２００℃の温度で実施し、及び／又は反応を２〜１００バールの圧力で実施する、請求項６から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
メチオニンヒダントイン及び水を含有する溶液又はリジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン、シスチンの群から選択されるアミノ酸のヒダントイン及び水を含有する溶液を、前以て、１種以上の化合物III、IV及びVから生成させる、請求項６から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
次の段階を包含する、請求項６に記載の方法：
ａ）式III、IV又はVによる尿素誘導体と、アミノ酸との、式：
【化３】
［式中、Ｒは、請求項６に記載したように定義される］のジケトピペラジンVIへの反応、
ｂ）ジケトピペラジンVIの、式 ＤＤ／ＬＬ／ＤＬ／ＬＤ‐I及びＤＤ／ＬＬ／ＤＬ／ＬＤ‐II：
【化４】
［式中、Ｒは請求項６に記載したように定義される］を有するジペプチドを含む混合物への反応。
【請求項１２】
尿素誘導体とアミノ酸とのジケトピペラジンへの反応は、２０℃〜２００℃の温度で及び／又は加圧下に、有利に２〜９０バールの圧力で行なわれる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
尿素誘導体とアミノ酸とのジケトピペラジンへの反応は、塩基、有利に、窒素含有塩基、ＮＨ４ＨＣＯ３、（ＮＨ４）２ＣＯ３、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＮＨ４ＯＨ／ＣＯ２混合物、カルバメート塩、アルカリ金属塩基及びアルカリ土類金属塩基の群から選択される塩基が存在して行なわれる、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
ジケトピペラジンへの反応は、式：
【化５】
［式中、Ｒは、メチオニル基を表わす］の尿素誘導体と、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン又はシスチンの群から選択されるアミノ酸との反応によって、又は
式：
【化６】
［式中、Ｒは、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン又はシスチンの群から選択されるアミノ酸残基である］の尿素誘導体とアミノ酸メチオニンとの反応によって行なわれる、請求項１１から１３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ジケトピペラジンの、式I及びIIのジペプチドを含む混合物への反応は、酸性加水分解によって、有利に、鉱酸、ＨＣｌ、Ｈ２ＣＯ３、ＣＯ２／Ｈ２Ｏ、Ｈ２ＳＯ４、燐酸、カルボン酸及びヒドロキシカルボン酸の群から選択される酸が存在して行なわれる、請求項１１から１４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ジケトピペラジンの、式I及びIIのジペプチドを含む混合物への反応は、塩基性加水分解によって行われ、有利にｐＨ７〜１４で、有利に窒素含有塩基、ＮＨ４ＨＣＯ３、（ＮＨ４）２ＣＯ３、ＮＨ４ＯＨ／ＣＯ２混合物、カルバメート塩、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、カルボネート、アルカリ金属塩基及びアルカリ土類金属塩基の群からの塩基を使用して実施される、請求項１１から１４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
尿素誘導体III〜Vは、Ｄ‐立体配置で、Ｌ‐立体配置で又はＤ‐立体配置及びＬ‐立体配置を含む混合物で存在し、尿素誘導体がメチオニン（IIIｎ〜Vｎ）から誘導されている場合には、有利にＤ‐立体配置及びＬ‐立体配置を含む混合物で存在し、又は
この際、尿素誘導体III〜Vは、Ｄ‐立体配置で、Ｌ‐立体配置で又はＤ‐立体配置及びＬ‐立体配置を含む混合物で存在し、尿素誘導体III〜Vが、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン、シスチンの群から選択されるアミノ酸から誘導されている場合には、有利にＬ‐立体配置で存在する、請求項６から１６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法により取得した塩基性反応溶液から、結晶化によって、式I及びIIのジペプチドのジアステレオマー混合物を分離するために、溶液を、酸で、有利にｐＨ値２〜１０、特に有利にｐＨ値３〜９、極めて特に有利に式I又はIIの各ジペプチドの相応する等電点に調整し、かつｐＨ調整を、有利に、鉱酸、ＨＣｌ、Ｈ２ＣＯ３、ＣＯ２／Ｈ２Ｏ、Ｈ２ＳＯ４、燐酸、カルボン酸及びヒドロキシカルボン酸の群から選択される酸で行なうことによる方法。
【請求項１９】
請求項１５に記載の方法により取得した酸性反応溶液から、結晶化によって、式I及びIIのジペプチドのジアステレオマー混合物を分離するために、溶液を塩基の添加により、有利にｐＨ値２〜１０、特に有利にｐＨ値３〜９、極めて特に有利に式I及びIIの各ジペプチドの相応する等電点に調整し、この際、塩基は、有利に、ＮＨ４ＨＣＯ３、（ＮＨ４）２ＣＯ３、窒素含有塩基、ＮＨ４ＯＨ、カルバメート塩、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、カルボネート、アルカリ金属塩基及びアルカリ土類金属塩基の群から選択されることによる方法。
【請求項２０】
有用動物用の、有利に家禽、豚、反芻動物、淡水魚又は海水魚、甲殻類又は家畜用の飼料添加剤としての、請求項６に記載の化合物I及びIIの使用。
【請求項１】
ジペプチド又はその塩を含有する飼料添加剤において、ジペプチドの１個のアミノ酸残基はＤＬ‐メチオニル基であり、かつジペプチドの他のアミノ酸残基は、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン及びシスチンの群から選択される、Ｌ‐立体配置のアミノ酸である飼料添加剤。
【請求項２】
一般式 ＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ及び／又はＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン のジペプチドを含有する飼料添加剤において、Ｌ‐ＥＡＡは、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン及びシスチンの群から選択される、Ｌ‐立体配置のアミノ酸である、請求項１に記載の飼料添加剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の飼料添加剤を含有する飼料混合物。
【請求項４】
ＤＬ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ及び／又はＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニンを、単独でＤ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ、Ｌ‐メチオニル‐Ｌ‐ＥＡＡ、Ｌ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン又はＬ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐メチオニンとして、相互の混合物として又は同様にＤ‐メチオニル‐Ｄ‐ＥＡＡ、Ｌ‐メチオニル‐Ｄ‐ＥＡＡ、Ｄ‐ＥＡＡ‐Ｄ‐メチオニン又はＤ‐ＥＡＡ‐Ｌ‐メチオニンとの混合物として、有利に各々付加的に、ＤＬ‐メチオニンと、有利に、ＤＬ‐メチオニン０．０１〜９０質量％、有利に０．１〜５０質量％、特に有利に１〜３０質量％の割合と混合して、有利に各々付加的に、Ｌ‐ＥＡＡ、例えば、Ｌ‐リジンと、有利に、Ｌ‐ＥＡＡ０．０１〜９０質量％、有利に０．１〜５０質量％、特に有利に１〜３０質量％の割合と混合して含有する、請求項３に記載の飼料混合物。
【請求項５】
一般式 ＤＬ‐メチオニル‐ＤＬ‐ＥＡＡ又はＤＬ‐ＥＡＡ‐ＤＬ‐メチオニン ［式中、ＥＡＡは、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン及びシスチンの群から選択される、有利にＬ‐立体配置のアミノ酸である］のジペプチド又はその塩。
【請求項６】
式 ＤＤ／ＬＬ／ＤＬ／ＬＤ‐I又はＤＤ／ＬＬ／ＤＬ／ＬＤ‐II：
【化１】
による１個だけのメチオニル基を含有するジペプチドを、アミノ酸と、一般式III〜V：
【化２】
［式中、Ｒは、次のように定義される：
Iａ〜Vａ： Ｒ＝１‐メチルエチル‐ （バリン）
Iｂ〜Vｂ： Ｒ＝２‐メチルプロピル‐ （ロイシン）
Ｉｃ〜Vｃ： Ｒ＝（１Ｓ）‐１‐メチルプロピル‐ （イソロイシン）
Iｄ〜Vｄ： Ｒ＝（１Ｒ）‐１‐ヒドロキシエチル‐ （スレオニン）
Ｉｅ〜Vｅ： Ｒ＝４‐アミノブチル‐ （リジン）
Iｆ〜Vｆ： Ｒ＝３‐［（アミノイミノメチル）‐アミノ］プロピル‐
（アルギニン）
Iｇ〜Vｇ： Ｒ＝ベンジル‐ （フェニルアラニン）
Iｈ〜Vｈ： Ｒ＝（１Ｈ‐イミダゾル‐４‐イル）メチル‐ （ヒスチジン）
Iｊ〜Vｊ： Ｒ＝（１Ｈ‐インドル‐３‐イル）メチル‐ （トリプトファン）
Iｋ〜Vｋ： Ｒ＝‐ＣＨ２‐ＳＨ （システイン）
Iｍ〜Vｍ： Ｒ＝‐ＣＨ２‐Ｓ‐Ｓ‐ＣＨ２‐ＣＮＨ２‐ＣＯＯＨ （シスチン）
IIIｎ〜Vｎ： Ｒ＝‐ＣＨ２‐ＣＨ２‐Ｓ‐ＣＨ３ （メチオニン）、
この際、尿素誘導体III、IV及びV中のＲ１及びＲ２は、次のように定義される：
IIIａ‐ｎ：Ｒ１〜ＣＯＯＨ、Ｒ２＝ＮＨＣＯＮＨ２
IVａ‐ｎ：Ｒ１＝ＣＯＮＨ２、Ｒ２＝ＮＨＣＯＮＨ２
Vａ‐ｎ：Ｒ１‐Ｒ２＝‐ＣＯＮＨＣＯＮＨ‐
及び
この際、Ｒはメチオニル基を表わし、かつ添加されるアミノ酸は、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン又はシスチンの群から選択されるか、又は、
添加されるアミノ酸はメチオニンであり、かつＲは、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン又はシスチンの群から選択されるアミノ酸残基である］の尿素誘導体との反応によって製造するための方法。
【請求項７】
出発生成物として、メチオニンヒダントイン又はリジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン、シスチンの群から選択されるアミノ酸のヒダントインを使用する又は中間生成物として中間的に生成させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
メチオニンヒダントイン及び水を含有する溶液を、アミノ酸と、塩基性条件下に反応させる、又はリジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン、シスチンの群から選択されるアミノ酸のヒダントイン及び水を含有する溶液を、メチオニンと、塩基性条件下に反応させる、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
尿素誘導体を含有する溶液のｐＨ値を、７〜１４に調整し、及び／又は反応を３０〜２００℃の温度で実施し、及び／又は反応を２〜１００バールの圧力で実施する、請求項６から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
メチオニンヒダントイン及び水を含有する溶液又はリジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン、シスチンの群から選択されるアミノ酸のヒダントイン及び水を含有する溶液を、前以て、１種以上の化合物III、IV及びVから生成させる、請求項６から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
次の段階を包含する、請求項６に記載の方法：
ａ）式III、IV又はVによる尿素誘導体と、アミノ酸との、式：
【化３】
［式中、Ｒは、請求項６に記載したように定義される］のジケトピペラジンVIへの反応、
ｂ）ジケトピペラジンVIの、式 ＤＤ／ＬＬ／ＤＬ／ＬＤ‐I及びＤＤ／ＬＬ／ＤＬ／ＬＤ‐II：
【化４】
［式中、Ｒは請求項６に記載したように定義される］を有するジペプチドを含む混合物への反応。
【請求項１２】
尿素誘導体とアミノ酸とのジケトピペラジンへの反応は、２０℃〜２００℃の温度で及び／又は加圧下に、有利に２〜９０バールの圧力で行なわれる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
尿素誘導体とアミノ酸とのジケトピペラジンへの反応は、塩基、有利に、窒素含有塩基、ＮＨ４ＨＣＯ３、（ＮＨ４）２ＣＯ３、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＮＨ４ＯＨ／ＣＯ２混合物、カルバメート塩、アルカリ金属塩基及びアルカリ土類金属塩基の群から選択される塩基が存在して行なわれる、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
ジケトピペラジンへの反応は、式：
【化５】
［式中、Ｒは、メチオニル基を表わす］の尿素誘導体と、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン又はシスチンの群から選択されるアミノ酸との反応によって、又は
式：
【化６】
［式中、Ｒは、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン又はシスチンの群から選択されるアミノ酸残基である］の尿素誘導体とアミノ酸メチオニンとの反応によって行なわれる、請求項１１から１３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ジケトピペラジンの、式I及びIIのジペプチドを含む混合物への反応は、酸性加水分解によって、有利に、鉱酸、ＨＣｌ、Ｈ２ＣＯ３、ＣＯ２／Ｈ２Ｏ、Ｈ２ＳＯ４、燐酸、カルボン酸及びヒドロキシカルボン酸の群から選択される酸が存在して行なわれる、請求項１１から１４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ジケトピペラジンの、式I及びIIのジペプチドを含む混合物への反応は、塩基性加水分解によって行われ、有利にｐＨ７〜１４で、有利に窒素含有塩基、ＮＨ４ＨＣＯ３、（ＮＨ４）２ＣＯ３、ＮＨ４ＯＨ／ＣＯ２混合物、カルバメート塩、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、カルボネート、アルカリ金属塩基及びアルカリ土類金属塩基の群からの塩基を使用して実施される、請求項１１から１４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
尿素誘導体III〜Vは、Ｄ‐立体配置で、Ｌ‐立体配置で又はＤ‐立体配置及びＬ‐立体配置を含む混合物で存在し、尿素誘導体がメチオニン（IIIｎ〜Vｎ）から誘導されている場合には、有利にＤ‐立体配置及びＬ‐立体配置を含む混合物で存在し、又は
この際、尿素誘導体III〜Vは、Ｄ‐立体配置で、Ｌ‐立体配置で又はＤ‐立体配置及びＬ‐立体配置を含む混合物で存在し、尿素誘導体III〜Vが、リジン、スレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、システイン、シスチンの群から選択されるアミノ酸から誘導されている場合には、有利にＬ‐立体配置で存在する、請求項６から１６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法により取得した塩基性反応溶液から、結晶化によって、式I及びIIのジペプチドのジアステレオマー混合物を分離するために、溶液を、酸で、有利にｐＨ値２〜１０、特に有利にｐＨ値３〜９、極めて特に有利に式I又はIIの各ジペプチドの相応する等電点に調整し、かつｐＨ調整を、有利に、鉱酸、ＨＣｌ、Ｈ２ＣＯ３、ＣＯ２／Ｈ２Ｏ、Ｈ２ＳＯ４、燐酸、カルボン酸及びヒドロキシカルボン酸の群から選択される酸で行なうことによる方法。
【請求項１９】
請求項１５に記載の方法により取得した酸性反応溶液から、結晶化によって、式I及びIIのジペプチドのジアステレオマー混合物を分離するために、溶液を塩基の添加により、有利にｐＨ値２〜１０、特に有利にｐＨ値３〜９、極めて特に有利に式I及びIIの各ジペプチドの相応する等電点に調整し、この際、塩基は、有利に、ＮＨ４ＨＣＯ３、（ＮＨ４）２ＣＯ３、窒素含有塩基、ＮＨ４ＯＨ、カルバメート塩、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、カルボネート、アルカリ金属塩基及びアルカリ土類金属塩基の群から選択されることによる方法。
【請求項２０】
有用動物用の、有利に家禽、豚、反芻動物、淡水魚又は海水魚、甲殻類又は家畜用の飼料添加剤としての、請求項６に記載の化合物I及びIIの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２０１２−５２１７７３（Ｐ２０１２−５２１７７３Ａ）
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０２５７１（Ｐ２０１２−５０２５７１）
【出願日】平成２２年３月２２日（２０１０．３．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５３７２２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１２３６５
【国際公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【出願人】（５０１０７３８６２）エボニック デグサ ゲーエムベーハー (837)
【氏名又は名称原語表記】Ｅｖｏｎｉｋ Ｄｅｇｕｓｓａ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｒｅｌｌｉｎｇｈａｕｓｅｒ Ｓｔｒａｓｓｅ １−１１， Ｄ−４５１２８ Ｅｓｓｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２２日（２０１０．３．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５３７２２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１２３６５
【国際公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【出願人】（５０１０７３８６２）エボニック デグサ ゲーエムベーハー (837)
【氏名又は名称原語表記】Ｅｖｏｎｉｋ Ｄｅｇｕｓｓａ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｒｅｌｌｉｎｇｈａｕｓｅｒ Ｓｔｒａｓｓｅ １−１１， Ｄ−４５１２８ Ｅｓｓｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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