高シアル酸含量のヒトトロンボポエチンを精製する方法
ヒトトロンボポエチンを発現する真核細胞を、血清がごく少量含有された無血清培地で培養し、ヒトトロンボポエチン含有培養物を生産する方法を開示する。また、本発明は、（ａ）ｈＴＰＯ含有生物学的流液を親和性クロマトグラフィーする段階と、（ｂ）段階（ａ）で得られた溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィーする段階と、（ｃ）段階（ｂ）で得られた溶出液を逆相クロマトグラフィーする段階と、（ｄ）段階（ｃ）で得られた溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーする段階とを含む、ｈＴＰＯ含有生物学的流液からｈＴＰＯを精製する方法を開示する。また、本発明は、段階（ｃ）で得られた溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに充填し、０．１５Ｍ〜０．３Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配で前記カラムから選択的に溶出された高シアル酸含量のｈＴＰＯを収集する段階を含む方法により得られた、シアル酸含量の高いヒトＴＰＯを開示する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、ヒトトロンボポエチン(human thrombopietin、ｈＴＰＯ)含有培養物の生産方法および前記培養物からｈＴＰＯを精製するための方法に関する。より具体的には、本発明は、ｈＴＰＯ含有生物学的流液からシアル酸含量の高いｈＴＰＯを分離精製する方法に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
血小板増殖因子、すなわちトロンボポエチン（ＴＰＯ）は、血液の血小板数を調節するサイトカイン(cytokine)として知られている物質である（Lok et al., Nature, 369: 565-568 (1994); De savage, F.J. et al., Nature, 369: 533-568 (1994)）。ＴＰＯは、肝または腎臓で合成されて分泌される糖タンパク質であって、巨核球前駆細胞の増進と分化を促進させ、巨核球細胞の血小板としての成熟を誘導する機能を持っている。
【０００３】
これまでは、最も一般的な血小板減少症の治療手段として血小板輸血が使用されてきた。ところが、そのような治療は、血小板輸血に必要なドナーの不足、出血副作用、各種ウィルスの汚染、および血小板の抗原性などのため、難しさが多かった。血小板増殖因子であるＴＰＯは、このような血小板輸血による副作用を減らしながら血小板関連の各種疾患を治療することに使用できるだろうと判断される。ｈＴＰＯは、１９９４年に最初にｃＤＮＡの形でクローニングされ、多数の論文と特許として公知になっている（Lok et al., Nature, 369: 565-568 (1994); De savage, F.J. et al., Nature, 369: 533-568 (1994); Miyazaki et al., Experimental hematol., 22: 828 (1994);および国際特許公開第９５／１８８５８号）。ｈＴＰＯは、骨髄細胞内に存在する血小板前駆細胞としてのコロニー形成前駆細胞に特異的に作用し、血小板の前駆細胞である巨核球細胞(megakaryocyte)の増殖および分化を誘導して究極的に血小板の数を増加させ、抗癌治療の際に誘発される血小板減少症(thrombocytopenia)、骨髄移植による血素板減少症、その他の血小板減少症に使用される有望なタンパク質であって、臨床実験で顕著な血小板増加効果と共に軽微な副作用を示したので、優れた新薬として期待されている（Shinjo et al., Leukemia, 12: 195-300 (1998); and Martin et al., J. Pediatr. Hematol. Oncol., 20(1): 36-43 (1998)）。実際、ｈＴＰＯは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．が製造して（国際特許公開第９５／１８８６８号）、現在、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎと共に臨床３床を進行中にあり、Ｋｒｉｎ社も臨床を進行中にある（国際特許公開ＷＯ９５／２１９１９号）。本発明者らは、優れた血小板減少症治療剤として期待されている、天然型ｈＴＰＯより生体内活性に優れたｈＴＰＯ誘導体を発明した（国際特許公開ＷＯ９９／００３４７号）。
【０００４】
ｈＴＰＯは、遺伝子組換え方法を用いて作製されたベクターを真核細胞に挿入し、これから目的する有用タンパク質の合成および／または分布を可能にすることにより大量生産が可能になり、トランスフェクションされた細胞を血清含有培地で培養した後、精製して医学用途に使用している。ところが、トランスフェクションされた細胞を血清含有倍地を用いて培養する場合、動物由来因子による副作用のおそれが高い。
【０００５】
現在、医学的使用に適する高純度であり、他の微生物または不純物による汚染のおそれもなく、活性の高いｈＴＰＯの製造／精製方法が切実に要求されている。
【０００６】
本発明者らは、ｈＴＰＯを発現することが可能な発現ベクターでトランスフェクションされた真核細胞を、血清がごく少量含有された無血清培地(serum-free medium)で培養することにより、動物由来因子（ウィルスなど）による副作用を最小化しながらも、高い発現効率でヒトトロンボポエチンを得ることができることを見い出した。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、ｈＴＰＯを発現することが可能な真核細胞を無血清培地で培養することによりｈＴＰＯを生成する方法を提供することにある。
【０００８】
また、ｈＴＰＯ含有生物学的流液を一連のクロマトグラフィー（親和性クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィー）に適用することにより、薬剤学的使用に適した高純粋度のｈＴＰＯを精製することに成功した。
【０００９】
したがって、本発明の他の目的は、ｈＴＰＯ含有生物学的流液を高純度で精製する方法を提供することにある。
【００１０】
治療剤として用いられる多くの糖タンパク質の場合、大部分、糖が糖タンパク質の生体内活性において重要な役割をするものと知られている（Takeuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 7819(1989)）。エリスロポエチン（ＥＰＯ）エリスロポエチン（ＥＰＯ）の場合、糖の数および構成成分、特に生体内半減期の延長のために重要な役割をするシアル酸の含量が重要であり、組換え糖タンパク質を製造するための宿主細胞を選択するとき、高い生体内活性を持つことが可能な糖化能力が最も優先的に考慮されるべきと認識されている。高シアル酸含量の糖タンパク質を精製するために、シアル酸の陰電気的性質を用いて陰イオン交換クロマトグラフィーによって高活性の分画を分離したという報告がある（Glycoconj J.,13(6): 1013-20(1996)）。ところが、トロンボポエチンの場合には、シアル酸含量と生体内活性との層間関係について未だ報告されたことがない。本発明者らは、本発明のクロマトグラフィー方法によって純粋精製された、シアル酸含量の異なるｈＴＰＯを用いて、シアル酸含量が増加するほどｈＴＰＯ活性が比例的に増加することを見い出した。
【００１１】
したがって、本発明の別の目的は、前述した精製方法によって生成された、高い生体内活性を有するシアル酸含量の高いｈＴＰＯを提供することにある。
【００１２】
〔発明の開示〕
本発明は、ヒトトロンボポエチン（ｈＴＰＯ）を発現する真核細胞を３〜６．５％血清含有培地で培養し、続いて０．５〜１．５％血清含有倍地で培養した後、血清が実質的に含有されていない無血清培地で培養することにより、ｈＴＰＯ含有培養物を生産する方法に関する。
【００１３】
前記方法において、真核細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ）が好ましく使用され、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４３４（ＫＣＴＣ ０６３０ＢＰ）、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４４９（ＫＣＴＣ ０６３１ＢＰ）およびＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４５８（ＫＣＴＣ ０６３２ＢＰ）よりなる群から選ばれる細胞株が特に好ましく使用される。また、前記真核細胞は、０．５〜１．５％血清含有培地に１．０×１０４〜１．０×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度で、より好ましくは１．５×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度で接種される。また、無血清培地にブチル酸および酵母分解物を添加した培地が好ましく使用される。
【００１４】
また、本発明は、（ａ）ｈＴＰＯ含有生物学的流液を親和性クロマトグラフィーする段階と、（ｂ）段階（ａ）で得られた溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィーする段階と、（ｃ）段階（ｂ）で得られた溶出液を逆相クロマトグラフィーする段階と、（ｄ）段階（ｃ）で得られた溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーする段階とを含む、前記ｈＴＰＯ含有生物学的流液からｈＴＰＯを精製する方法に関する。
【００１５】
段階（ｄ）において、段階（ｃ）で得られた溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに充填し、０．１５Ｍ〜０．３Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配で前記カラムから選択的に溶出されたｈＴＰＯを収集することが好ましい。また、前記精製方法は、段階（ｄ）を行った後、ゲル濾過クロマトグラフィーする段階をさらに含むことが好ましく、ｈＴＰＯ含有生物学的流液は、ｈＴＰＯを発現するベクターでトランスフェクションされた真核細胞を無血清培養培地で培養して得た培養物が好ましく使用される。また、段階（ａ）において、親和性クロマトグラフィーで使用されるカラムを１Ｍ塩化ナトリウム含有リン酸塩緩衝液で溶出させることが好ましく、段階（ｃ）において、逆相クロマトグラフィーで使用されるカラムをエタノール勾配を用いて溶出させることが好ましい。
【００１６】
また、本発明は、前述した精製方法で精製されたｈＴＰＯ含有分画に関する。
〔発明を実施するための最良の形態〕
真核細胞により生成された大部分の細胞表面および分泌タンパク質は、少なくとも一つのオリゴ糖グループによって修飾される。このような修飾を糖化といい、ポリペプチドの骨格に応じて特定の位置で発生するが、一般に２つの類型に分類される。一つの類型は、Ｏ結合型オリゴ糖がセリン（Ｓｅｒ）またはトレオニン（Ｔｈｒ）残基に結合するＯ結合型糖化であり、もう一つの類型は、Ｎ結合型オリゴ糖が配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここで、Ｘは、プロリンを除いたアミノ酸であればいずれも可能である）のアスパラギン（Ａｓｎ）残基に結合するＮ結合型糖化である。Ｏ結合型オリゴ糖とＮ結合型オリゴ糖の構造、および各類型から発見される糖残基は、お互い異なる。Ｏ結合型オリゴ糖とＮ結合型オリゴ糖の両方ともから共通に発見される糖がシアル酸である。シアル酸は、多くの糖結合体の必須成分である約３０個の天然酸性炭水化物群の一般名である（Society Transactions, 11, 270-271 (1983)）。最も代表的なシアル酸の形態はＮ−アセチルノイラミン酸であり、その次の代表的なシアル酸の形態はＮ−グリコリルノイラミン酸である（Schauer, Glycobiology, 1, 449-452 (1991)）。
【００１７】
天然型ｈＴＰＯは、細胞内で３５３個のアミノ酸からなる前駆体として発現され、この前駆体から２１個のアミノ酸のシグナル配列が切断された後、３３２個のアミノ酸からなる活性型タンパク質の形で細胞外に分泌される糖タンパク質である。ｈＴＰＯ誘導体は、天然型ｈＴＰＯとは異なる糖化パターンを持つことができ、その代表的な例としては、ｈＴＰＯをコードするｃＤＮＡにある特定の塩基を置換させてアスパラギン−Ｘ−セリン／トレオニン（ここで、Ｘはプロリンを除いたアミノ酸である）の形に突然変異させることにより、１７４個のＣ末端欠失アミノ酸からなるｈＴＰＯにＮ結合型糖鎖を少なくとも一つ導入したｈＴＰＯ誘導体（国際特許公開ＷＯ９６／２５４９８号）、完全な天然型ｈＴＰＯに糖鎖をさらに導入して糖鎖が一つ追加されたｈＴＰＯ誘導体（HL Park et al., J. Biol. Chem., 273:256-261, 1998）、天然のｈＴＰＯの１６４番、１９３番、１５７番と１６４番、１１７番と１６４番、または１０８番のアミノ酸をアスパラギンで置換してＮ結合型糖鎖を導入したｈＴＰＯ誘導体（韓国特許公開第２００１−００７８７４４号）などを挙げることができる。
【００１８】
本発明者らは、ｈＴＰＯを発現するベクターでトランスフェクションされた真核細胞を３〜６．５％血清含有培地で培養し、次いで０．５〜１．５％血清含有培地で培養した後、血清がごく少量含有された培地で培養することにより、血清由来因子による汚染要素のないｈＴＰＯ含有培養液を得ることができた。また、ｈＴＰＯの発現効率が血清含有培地でより優れた。従来の低血清含有倍地を用いた培養の場合、５％以上の血清含有培地を用いたが、本発明では、３〜６．５％血清含有培地で培養し、次いで０．５〜１．５％血清含有培養培地を用いて培養した後、最終培養段階では血清が実質的に含有されていない無血清(serum-free)培地を用いて培養することにより、多量のｈＴＰＯを、血清への汚染を最小化しながら生産することができた。
【００１９】
したがって、本発明は、一つの様態として、ｈＴＰＯを発現する真核細胞を３〜６．５％、好ましくは４〜６％、より好ましくは５％血清含有培地で培養し、続いて０．５〜１．５％、好ましくは１％血清含有培地で培養した後、血清が実質的に含有されていない無血清培地で培養してｈＴＰＯ含有培養物を生産する方法を提供する。
【００２０】
前記培養方法でｈＴＰＯを発現する真核細胞は、適切な栄養物と成長因子を含有した培地で単層培養または懸濁培養するときに成長および生存することが可能な哺乳動物由来の細胞株を示す。特定の細胞株のために必要な成長因子は、例えば文献［Mammalian Cell Culture, Mather, J. P. ed., Plenum Press, N.Y. (1984) and by Barnes and Sato, (1980) Cell, 22:649］に記述されているように、過重な実験負担なしに経験で容易に決定できる。本発明の方法に適した哺乳動物宿主細胞としては、ｈＴＰＯ誘導体を発現する、トランスフェクションされたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞、ハイブリドーマ細胞、例えばマウスハイブリドーマ細胞、ベービハムスター腎臓細胞、２９３細胞、マウスＬ細胞などを例示することができる。特に、ｈＴＰＯ誘導体を発現するＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４３４（ＫＣＴＣ ０６３０ＢＰ）、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４４９（ＫＣＴＣ ０６３１ＢＰ）、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４５８（ＫＣＴＣ ０６３２ＢＰ）が好ましく使用でき、その中でも特にＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４５８（ＫＣＴＣ ０６３２ＢＰ）が好ましい。前記培養方法において、０．５〜１．５％血清含有培地を使用した培養の際、ｈＴＰＯ発現細胞は、１×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬ以上、好ましくは１×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬ〜１×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬ、より好ましくは１．５×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度で接種できる。
【００２１】
一つの具体的実施として、本発明は、ｈＴＰＯ誘導体を発現するベクターでトランスフェクションされたチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４５８）を３〜６．５％血清含有培地でシード培養して回収し、これを１×１０４-ｃｅｌｌ／ｍＬ〜１×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬの細胞濃度で０．５〜１．５％血清含有培地に接種して培養した後、無血清培地で培養してｈＴＰＯ誘導体含有培養物を生成した。好ましくは、前述したように無血清培地で培養されたｈＴＰＯ誘導体含有培養物の培養上澄み液を本発明のｈＴＰＯ精製方法にｈＴＰＯ含有生物学的流液として使用することができる。
【００２２】
本願で使用された用語「無血清培養培地」は、哺乳動物起源の血清（例えば牛胎児血清（ＦＢＳ））を実質的に含有していない栄養液を示す。また、用語「実質的に含有していない」は、細胞培養培地が約０．５％未満の血清、好ましくは約０〜０．１％血清を含有することを意味する。前述したように、血清が実質的に含有されていない無血清培地で、ｈＴＰＯを発現する真核細胞を培養することにより、精製されたｈＴＰＯは、血清起源のウィルスなどによる副作用を最小化させることができる。細胞の成長のための栄養液は、典型的に炭水化物形態（例えば、グルコース）のエネルギー源、全ての必須アミノ酸、ビタミンおよび／またはその他の低濃度で要求される有機化合物、遊離脂肪酸、および微量元素（通常、ミクロモル範囲の最低濃度で要求される有機化合物または天然元素）を含有することができ、任意にホルモンおよびその他の成長因子（例えば、インシュリン、トランスフェリン、および表皮成長因子）、塩および緩衝液（例えば、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩）、ヌクレオシドおよび塩基（例えば、アデニン、チミジンおよびヒポキサンチン）、並びにタンパク質および組織加水分解物の中から選ばれた少なくとも一つの成分で補充できる。本発明者らは、無血清培地の添加物として非必須アミノ酸、ＺｎＳＯ４、酪酸ナトリウムおよび酵母分解物のｈＴＰＯ発現効率を観測した。図９に示すように、０．５Ｍの酪酸ナトリウムが１ｍＭの酪酸ナトリウムを添加した場合より発現効率が高く、酵母分解物を添加する場合が、非必須アミノ酸＋酪酸＋亜鉛化合物を添加した場合より著しく高い発現効率を示した。したがって、本発明者らは、無血清培養培地に酪酸および酵母分解物を添加し、その結果、血清含有培地を使用する場合に比べて発現量が増加するうえ、培養物内の血清由来の不純物も最小化することができるため、次の段階の精製過程を容易に行うことができた。
【００２３】
また、本発明者らは、ｈＴＰＯ含有生物学的流液から一連のクロマトグラフィーによって高純度のｈＴＰＯを精製することができた。具体的に、本発明者らは、（ａ）ｈＴＰＯ含有生物学的流液を親和性クロマトグラフィーする段階と、（ｂ）段階（ａ）で得られた溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィーする段階と、（ｃ）段階（ｂ）で得られた溶出液を逆相クロマトグラフィーする段階と、（ｄ）段階（ｃ）で得られた溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーする段階とを含む方法によって、高純度のｈＴＰＯが得られることを立証した。特に、（ａ）ｈＴＰＯ含有生物学的流液を親和性クロマトグラフィーする段階、（ｂ）段階（ａ）で得られた溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィーする段階と、（ｃ）段階（ｂ）で得られた溶出液を逆相クロマトグラフィーする段階と、（ｄ）段階（ｃ）で得られた溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに充填し、０．１５Ｍ〜０．３Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配で選択的に溶出されたｈＴＰＯを収集する段階とを含む方法によって、高純度の高シアル酸含量のｈＴＰＯを得ることができることを立証した。
【００２４】
したがって、本発明は、別の様態として、（ａ）ｈＴＰＯ含有生物学的流液を親和性クロマトグラフィーする段階と、（ｂ）段階（ａ）で得られた溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィーする段階と、（ｃ）段階（ｂ）で得られた溶出液を逆相クロマトグラフィーする段階と、（ｄ）段階（ｃ）で得られた溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーする段階とを含んでｈＴＰＯを精製する方法を提供する。好ましくは、段階（ｃ）で得られた溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに充填し、０．１５Ｍ〜０．３Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配で前記カラムから選択的に溶出されたｈＴＰＯを収集する段階を含んで高シアル酸含量のｈＴＰＯを精製する方法を提供する。好ましくは、前記精製方法は、陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出液をゲル濾過クロマトグラフィーして凝集体を除去する段階をさらに含むことができる。
【００２５】
本発明の培養／精製方法において、ＴＰＯは、ｈＴＰＯであって、天然型ｈＴＰＯおよびｈＴＰＯ誘導体を含み、ｈＴＰＯ誘導体は、天然型ｈＴＰＯと類似であり或いは優れた生物学的活性を持つ。前記ｈＴＰＯ誘導体は、天然型ｈＴＰＯアミノ酸配列の置換、挿入、欠失により変異した変異体を含み、天然型ｈＴＰＯとは異なる糖化パターンを持つことができ、上述したように糖鎖が追加される或いは新しい位置が糖化するｈＴＰＯ誘導体を例示することができる。
【００２６】
本願に使用された用語「生物学的流液」は、細胞、細胞構成要素または細胞産物を含有し、あるいはそれから由来した全ての流液を示し、これらに限定されるものではないが、例えば細胞培養物、細胞培養上澄み液、細胞溶解物、細胞抽出物、組織抽出物、血液、血漿、血清、ミルク、尿、これらの分画を含む。本発明のｈＴＰＯ精製方法には、ｈＴＰＯを含有する限り、前述した様々な形態の生物学的流液が精製のための出発物質として使用できる。好ましくは、前述したように無血清培養方法で得られた培養物の培養上澄み液を使用する。
【００２７】
前述した精製方法において、親和性クロマトグラフィーは、非共有結合の可逆的方式による生体分子間の特異的相互作用を含む。すなわち、この方法の原理は、物理化学的特性の差を利用するのではなく、リガントという特異的結合パートナーが一般に不溶性マトリックス（例えば、多孔性ガラス、アガロース、シリカ、セルロース、デキストランゲル）に共有結合し、成分の混合物が接触する結合システムの特異性を利用することである。好ましい親和性クロマトグラフィーは、染料−リガンドクロマトグラフィーであり、その例としてはＣＭ Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ ＢｌｕｅゲルまたはＤＥＡＥ Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｂｌｕｅゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＭＩＭＥＴＩＣ Ｒｅｄ、Ｂｌｕｅ、Ｏｒａｎｇｅ、ＹｅｌｌｏｗまたはＧｒｅｅｎ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｌｔｄ、Ｆｒｅｅｐｏｒｔ、Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ）を挙げることができる。特に好ましくは、ＣＭ Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｂｌｕｅゲルである。これは、ＣＭ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ａゲルに共有結合したチバクロンブルーＦ３ＧＡ染料を含有することができる。ＣＭ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ａゲルは、カルボキシ−末端アガロースゲルであり、この支持体は、アミノ末端リガンド、タンパク質またはスペーサアームの結合に使用される。便利には、溶出物をロードする前に親和性クロマトグラフィーカラムを中性ｐＨの水性緩衝液、好ましくは約ｐＨ７．２のリン酸塩緩衝液で平衡化させる。溶出は、水性緩衝液、好ましくは約ｐＨ７．２のリン酸塩緩衝液を用いて公知の方法によって行う。リン酸塩緩衝液は、好ましくは１Ｍ塩化ナトリウム含有緩衝液である。このような緩衝液を用いて溶出させる場合、溶出液を、２次カラムである疎水性相互作用クロマトグラフィーに追加の処理なしにそのまま適用することができる。親和性クロマトグラフィーを１次カラムとして適用させることにより、培養液の培地成分（Ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄなど）を効果的に除去することができる。
【００２８】
本発明において、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、市販の各種マトリックスに結合した疎水性、好ましくは芳香族または脂肪族の帯電しないリガンドを有するゲルで行われる。帯電しないリガンドが形成されるように、通常の結合技術によってリガンドをマトリックスに結合させることができる。このような技術として最も適した例がグリシジル−エーテル結合方法である。他の技術としては、アガロースマトリックスを水中でグリシドキシプロピルトリメトキシシランで活性化させた後、アルコール中でリガンドを固定する方法がある。別の技術としては、アガロースマトリックスを１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルなどのビス−エポキシドで活性化した後、アミノアルキルまたはアルキルメルカプタンなどのリガンドに結合させる方法がある。利用可能なさらに別の技術として、１，１−カルボニルジイミダゾール活性化およびジビニルスルホン活性化がある。前記全ての技術から得たゲルは、全体ｐＨ範囲で帯電しない。脂肪族リガンドは、例えばプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチルなどの直鎖アルキルであり、あるいはイソ−またはネオアルキルなどの側鎖アルキルであり、あるいはオリゴエチレングリコールである。芳香族リガンドは、好ましくはフェニルである。マトリックスは、いろいろの強親水性マトリックスの中から選択でき、例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）などのアガロースマトリックス、ＴＳＫ−ＧＥＬなどの有機高分子マトリックス、高多孔性有機高分子マトリックスがある。好ましいマトリックスは、アガロースマトリックスである。好ましいアガロースマトリックスは、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）のセファロースマトリックス、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）のＢｉｏ−Ｇｅｌ Ａ、Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ Ａ／Ｓ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）のＭｉｎｉｌｅａｋ（登録商標）である。好ましくは、マトリックスは、交差結合されて高速流動を許容することにより、高生産能を提供する。さらに好ましくは、本発明の疎水性相互作用クロマトグラフィーは、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのフェニルセファロース６ＦＦゲルまたはブチルセファロース４ＦＦゲルで行う。一般に、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、実施に先立ち、分画の伝導性を高めるために分画に塩を添加することができる。その後、低いイオン強度の緩衝液を用いて媒質から溶出する。本発明の実施において、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、前段階の親和性クロマトグラフィーの溶出液を前処理なしにそのままロードすることができ、ｈＴＰＯは樹脂に付着され、不純物はそのままカラムを通過し或いは洗浄段階で除去されるので、多くの不純物を効果的に除去することができる。
【００２９】
本発明において、逆相クロマトグラフィーは、疎水性によって成分を分離するためのことであって、極性の移動相と非極性の化学的に結合した固定相を利用する。好ましい逆相媒質は、Ｃ４樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、多孔性樹脂Ｏｌｉｇｏ Ｒ２（登録商標）およびＯｌｉｇｏ Ｒ３（登録商標）（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）を含む。典型的な溶媒システムは、水−エタノール、水−アセトニトリル、水−テトラヒドロフラン、へキシレングリコールなどの混合物を含み、溶出は、そのような溶媒システムの適当な濃度勾配で公知の方法によって行う。好ましくは、溶出された分画は、直ちにリン酸塩緩衝液で希釈してタンパク質の変性を防止する。具体的な様態として、本発明の精製方法は、好ましくは逆相クロマトグラフィーにＣ４逆相樹脂を使用する。特に好ましくは、溶媒システムとして水−エタノール混合物の勾配を利用する。本発明の実施において、エタノール濃度勾配を用いて逆相クロマトグラフィーした溶出液は、前段階の疎水性相互作用クロマトグラフィーした溶出液に含まれていた不純物を完全に除去する。これにより、ｈＴＰＯの純度は９８％以上である。
【００３０】
本発明において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、一般に３級または４級アミングループ（例えば、ジエチルアミノエチル、トリエチルアミノエチル、ベンジル−ジエチルアミノエチル）で誘導体化された不溶性の粒子性支持体を含む媒質を用いて行う。好ましい支持体は、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリスチレンビードなどを含む。トリエチルアミノエチルグループで誘導体化された支持体が好ましい。好ましい陰イオン交換媒質は、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｑ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｑ−ＨｙｐｅｒＤ（登録商標）（ＢｉｏＳｅｐｒａ，Ｉｎｃ．，Ｍａｒｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ−ＴＭＡＥ６５０（Ｍｅｒｃｋ）などを含む。陰イオン交換カラムは、溶出物をロードする前に、便利にはｐＨ６．０〜８．０の水性緩衝液で平衡化させることができる。溶出は、水性緩衝液、好ましくは約ｐＨ６．５〜４．５のアセテート緩衝液を用いて公知の方法によって行うことができる。或いは、リン酸ナトリウム緩衝液を用いて濃度勾配に応じて溶出することができる。好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに結合したｈＴＰＯを塩化ナトリウムの濃度勾配を用いてシアル酸含量に応じてｈＴＰＯを分画溶出させる。０．５Ｍ以下、好ましくは０．３Ｍ以下の塩化ナトリウム勾配を使用することができる。塩化ナトリウ濃度勾配が高いほど、シアル酸含量の高いｈＴＰＯが溶出された。塩化ナトリウム濃度勾配を用いて得られた溶出分画中のｈＴＰＯのシアル酸含量が図６に示されている。図６中の（ａ）および（ｂ）に示すように、０．１５Ｍ〜０．３Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配で溶出された分画にシアル酸含量の高いｈＴＰＯが含有された。本発明者らは、前述したように、精製されたｈＴＰＯを等電集束分析によってＮ−アセチルノイラミン酸(N-acetylneuraminic acid)およびＮ−グリコノイラミン酸(N-glyconeuraminic acid)を定量および定性分析してシアル酸含量を測定するとともに、シアル酸含量による生体内活性を測定し、シアル酸含量が増加するほど生体内血小板が増加することを確認した（実施例５、図７）。
【００３１】
したがって、本発明は、一つの追加様態として、（ａ）ｈＴＰＯ含有生物学的流液を親和性クロマトグラフィーする段階と、（ｂ）段階（ａ）で得られた溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィーする段階と、（ｃ）段階（ｂ）で得られた溶出液を逆相クロマトグラフィーする段階と、（ｄ）段階（ｃ）で得られた溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに充填し、０．１５Ｍ〜０．３Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配で前記カラムから選択的に溶出されたｈＴＰＯを収集する段階とを含む方法により精製された、高シアル酸含量のｈＴＰＯ含有分画を提供する。
【００３２】
本願に使用された用語「高シアル酸含量のｈＴＰＯ」は、前述したような陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから０．１５〜０．３Ｍの塩化ナトリウム勾配で溶出され、ｐＩ４．０以下のｈＴＰＯを意味する。
【００３３】
前述した一連のクロマトグラフィーによって精製されたｈＴＰＯは、ゲル濾過クロマトグラフィーによってさらに精製でき、これにより陰イオン交換クロマトグラフィーからの溶出物中の凝集体を除去することができる。ゲル濾過の好ましい媒質は、アガロース、ポリアクリルアミドまたはその他の高分子の交差結合ビードを含み、好ましくはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのセファクリル（例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標） ２００ＨＲまたはＳ−３００ＨＲ）、セファデキス（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０）またはスーパーデキス（例えば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標） ２００ＰＧまたはＳｕｐｅｒｄｅｘ７５）を挙げることができる。ＴＯＳＯ Ｈａａｓ ＧｍｂＨ（Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のゲル濾過媒質（例えば、ＴＳＫ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ５５）またはその他の製造会社で市販している類似のゲルなどが使用できる。溶出は、水性緩衝液を用いて公知の方法によって行い、ＴＰＯの特性に有害な影響を及ぼす成分を溶出するものと知られているその他の通常の溶出緩衝液が使用できる。具体的様態として、本発明の精製方法は、好ましくはゲル濾過クロマトグラフィーにスーパーデキス２００ＰＧを使用する。
【００３４】
前述したような一連のクロマトグラフィーによって精製されたｈＴＰＯは、逆相高速液体クロマトグラフィーおよびゲル濾過高速液体クロマトグラフィーの結果、９８％以上の高純度を示した（実施例３）。
【００３５】
以下、添付図面を参照しながら、本発明を下記実施例によってより具体的に説明する。ところが、当業者であれば、下記実施例が本発明を説明するために提供するものに過ぎず、本発明がこれらの実施例によって限定されるものではないことを理解するであろう。
【００３６】
〔実施例１〕
＜セルファクトリー培養器を用いた無血清大量培養＞
１５７番および１６４番のアミノ酸残基をアスパラギン酸で置換してＮ結合型糖鎖を導入したｈＴＰＯ誘導体を大量生産するための無血清セルファクトリー培養をシード培養段階と本培養段階に分けて行った。シード培養では、液体窒素タンクに保管されている製造用細胞銀行(Working Cell Bank)でヒトトロンボポエチン誘導体生産細胞株（ＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４５８）（ＫＣＴＣ ０６３２ＢＰ）５バイアル（１×１０７ｃｅｌｌ／ｍＬ）を取り出してシード培養培地（５％血清含有、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｃｏ．）で１回洗浄した。メトトレキサート(methotrexate)（Ｓｉｇｍａ社）を含有したシード培養培地を３０ｍＬずつ５個の１７５ｃｍ２Ｔ−フラスコ（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）に入れ、洗浄した細胞を接種した。ＣＯ2培養器（３７℃、５％ＣＯ２の条件）で準飽和(sub-confluency)状態になるまで培養した後、１７５ｃｍ２Ｔ−フラスコを０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液で処理して細胞を回収した。１つの１７５ｃｍ２Ｔ−フラスコから回収した細胞を、新鮮なメトトレキサート含有シード培養培地が３０ｍＬずつ入っている４個の新しい１７５ｃｍ２Ｔ−フラスコに分けて接種した後、前記と同様の条件でもう１回準飽和状態になるまで培養し、その後回収した細胞を新鮮なシード培養培地が２Ｌずつ入っている３個の１０段セルファクトリー（Ｎｕｎｃ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ ｏｆ Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）に分けて接種した。
【００３７】
３個の１０段セルファクトリーから回収した細胞を新鮮な本培養培地（１％血清含有、ＤＭＥＭ／Ｆ１２倍地、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｃｏ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）４０Ｌ入りのＭｅｄｉａ ｂａｇ（Ｓｔｅｄｉｍ Ｉｎｃ．，Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡ）に仕込んで均一に混ぜた後、５個の４０段セルファクトリーに１．５×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬで接種した。７２時間培養の後、ＰＢＳで１回洗浄し、０．５ｍＭ酪酸、酵母分解物（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｃｏ．）、各種アミノ酸入りの無血清培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２で交替した後、ＣＯ２培養器（３７℃、５％ＣＯ２の条件）で１２０時間培養した。前述した各種添加物入りの無血清(serum-free)培養方法で培養するときの培養日によるｈＴＰＯ誘導体生産細胞株の発現量を図２に示した。発現量は、無血清培地で交替した後５日目に最大（２０ｍｇ／Ｌ）であった。これは、１０％血清含有培地で確認した発現量（１０ｍｇ／Ｌ）と比較するとき、約２倍増加したものである。
【００３８】
〔実施例２〕
＜ＴＰＯ誘導体の純粋精製＞
（ａ）親和性クロマトグラフィー
ＣＭ Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｂｌｕｅ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１ＬをＶＳ１５０／５００カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）に充填させた後、緩衝液Ａ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）１０Ｌで十分洗浄した。実施例１で得た培養上澄み液４０Ｌを１３０ｍＬ／ｍｉｎの速度でカラムを通過させ、２８０ｎｍでＵＶによってモニタリングした。培養上澄み液を全て流した後、緩衝液Ｂ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ尿素、ｐＨ７．２）でＵＶ数値が基底水準となるまで洗浄した後、緩衝液Ｃ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ尿素、１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）でＴＰＯ含有樹脂に結合したタンパク質を溶出させた。
【００３９】
（ｂ）疎水性相互作用クロマトグラフィー
フェニルセファロースＦＦ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）８００ｍＬをＶＳ９０／５００カラムに充填させた後、２Ｌの緩衝液Ｃ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ尿素、１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）で十分洗浄した。ＣＭ Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｂｌｕｅ段階で得た溶出分画を４３ｍＬ／ｍｉｎの速度でカラムに適用し、２８０ｎｍでＵＶによってモニタリングした。分画を全て流した後、緩衝液Ｃ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ尿素、１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）でＵＶ数値が基底水準になるまで洗浄した後、緩衝液Ｂ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ尿素、ｐＨ７．２）でＴＰＯ含有樹脂に結合されたタンパク質を溶出させた後、この分画にＥｔＯＨを２０％添加して、次の段階であるＣ４逆相カラムクロマトグラフィー(C4 reversed phased column chromatography)に適用した。
【００４０】
（ｃ）逆相クロマトグラフィー
１５μｍサイズのＣ４逆相樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）２３ｍＬをＴＲ１０／３００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｒｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に充填させ、ｐＨ６．０の５０ｍＭリン酸ナトリウム、２０％エタノールで洗浄して平衡化させた後、７ｍＬ／ｍｉｎの速度でフェニルセファローズ段階で得た溶出分画（２０％ＥｔＯＨ添加）を注入した。ｐＨ６．０の５０ｍＭリン酸ナトリウム、４０％エタノール緩衝液でカラムを洗浄し、４０％〜８０％エタノールの濃度勾配によってタンパク質を溶出させた。ｈＴＰＯ誘導体は、約７０％エタノールの濃度勾配で大部分溶出された。Ｃ４逆相クロマトグラフィーで溶出された分画は、直ちに１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で１０倍希釈して有機溶媒によるタンパク質変性を防止した。
【００４１】
（ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィー
逆相クロマトグラフィー段階で溶出された分画をシアル酸含量によって分別するために、陰イオン交換クロマトグラフィーＱカラム（Ａｍｅｒｓｈａｒｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に１０ｍＬ／ｍｉｎの速度で注入した。１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で十分洗浄した後、０〜０．３Ｍ塩化ナトリウム勾配の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を適用して溶出した。この際、シアル酸含量の少ないｈＴＰＯは、０．１５Ｍ以下の塩化ナトリウムを用いた分画で溶出され、シアル酸含量の多いｈＴＰＯ誘導体は、０．１５〜０．３Ｍ塩化ナトリウム緩衝液で溶出された。
【００４２】
（ｅ）ゲル濾過クロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィーで溶出された高シアル酸含量のｈＴＰＯをゲル濾過クロマトグラフィーに適用して凝集体(aggregates)を除去し、最終医薬品薬剤用緩衝液として使用されるＴＮＴ（１０ｍＭトリス、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％ツイン２０）緩衝液で交替した。カラムＸＫ５０／１００（Ａｍｅｒｓｈａｒｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にゲル濾過樹脂スーパーデキス２００ＰＧ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＰＧ、Ａｍｅｒｓｈａｒｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１．４Ｌを充填させ、０．５Ｎ ＮａＯＨと０．５Ｎ ＨＣｌで洗浄した後、ＴＮＴ緩衝液７Ｌを一日中流して、樹脂にエンドトキシンが存在しないように調節した。溶出液を８ｍＬ／ｍｉｎの速度でカラムに注入し、分画収集器（ｆｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ、Ａｍｅｒｓｈａｒｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、カラムを通過したタンパク質を収集した。単量体のみを含む分画を集めて０．２２μｍフィルタで濾過した後、凍結乾燥バイアルに分注し、長期間保存のために凍結乾燥させた。
【００４３】
〔実施例３〕
＜検定＞
各段階のクロマトグラフィーで溶出された溶出液は、還元条件の下で１５％ポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）上で電気泳動した後、クマシー染色とウェスタンブロット方法で分析した。その結果は、図３に示されている。最終精製された精製産物は、逆相高速液体クロマトグラフィー(reverse phased HPLC)によって、純度が９９％以上であることを確認し（図４参照）、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー(size exclusion HPLC)によって単量体が９８％以上であることが証明された（図５参照）。
【００４４】
〔実施例４〕
＜精製したｈＴＰＯ誘導体の等電集束分析およびシアル酸の測定＞
実施例２で純粋精製した試料６μｇを取ってＩＥＦゲル（ｐＨ３〜７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードし、１００Ｖで１時間、２００Ｖで３０分、５００Ｖで１５分間展開した後、ゲルを取り出して固定液中で３０分間放置し、クマシー染色で染色することにより、等電集束分析を行った。等電集束分析の結果、Ｑカラムで塩化ナトリウム濃度勾配で溶出された分画は塩濃度が高いほど低いｐＩ値を有することが分かった（図６における（ａ））。シアル酸分析のためには、まず、０．４〜０．６ｎｍｏＬの乾燥試料に０．４ｍＬの０．１Ｎ ＨＣｌを入れて１時間８０℃でシアル酸を加水分解した。スピードバック(Speed Vac)で反応液を乾燥させ、さらに蒸留水に溶解して再乾燥させた試料の一部をＢｉｏ−ＬＣ ＤＸ−３００（Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）に注入して分析した。カラムは、直径４ｍｍ、長さ２５０ｍｍのＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラムを利用し、１５０ｍＭ塩化酢酸含有の１００ｍＭ ＮａＯＨで分析した。流速は１ｍＬ／ｍｉｎであり、標準物質としては、糖タンパク質で発見されるＮ−アセチルノイラミン酸(N-acetylneuraminic acid)とＮ−グリコノイラミン酸(N-glyconeuraminic acid)を用いて定性および定量分析を行った。その結果が図６における（ｂ）に示されている。物質のｐＩ値が低いほど、比例的にシアル酸含量が高い。これは、シアル酸含量が糖タンパク質のｐＩ値に多くの影響を及ぼしていることを示す。
【００４５】
〔実施例５〕
＜ｈＴＰＯ誘導体の生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）活性の検証＞
生体内活性試験は、動物細胞で発現されたｈＴＰＯ誘導体を投与したマウスからの血小板数を測定する方法で行った。動物は、７週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを購入して（Ｃｈａｒｌｅｘ Ｒｉｖｅｒ社、日本）恒温（２４±１℃）、恒湿（５５％）、照明時間１２時間（午前７時〜午後７時）と設定された動物室で１週間程度飼育馴化してから使用した。試験期間中にも、動物は、同一の飼育室で飼育した。１群に５匹となるように、体重を指標とした層別無作為抽出によってマウスを群分離し、それぞれｈＴＰＯ誘導体投与群、薬剤を投与しない無処理群と設定した。
【００４６】
実施例２のＱカラムで相異なる塩濃度によって分画し、シアル酸含量の異なるｈＴＰＯ誘導体を得、そのシアル酸含量によるｈＴＰＯ誘導体の生体内活性を比較するために、１０μｇ／ｋｇの濃度で１回皮下投与した。採血は、投与開始５日後に行った。エーテル麻酔の下にマウスの腹部下大静脈から全血を採取し、ＥＤＴＡ処理チューブに移した後、抹消血中の血小板数を自動血球計測器（Ｃｅｌｌ ｄｙｎｅ、Ａｂｂｏｔｔ社）を用いて測定した。その結果は、平均±標準誤差で示した。シアル酸含量が高いほど、生体内で血小板を増加させる薬効は比例的に高いことが分かった（図７ａ）。同一の試験方法で０〜０．３Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配で分離したｈＴＰＯ誘導体と０．１５〜０．３Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配で溶出した高シアル酸含有ｈＴＰＯ誘導体間の生体内活性を比較したとき（図７ｂ）、前記２つの溶出液間の生体内活性は有意的な差異を示した。
【００４７】
高シアル酸含有のｈＴＰＯ誘導体分画の投与濃度による活性を測定するために、１０、２０、４０、８０、１６０、３２０、６４０、１２８０μｇ／ｋｇの一定の濃度で１回皮下投与した。試験方法は、前記と同様にした。投与濃度による血小板数値の変化を図８に示した。ＨＴＰＯ誘導体は、血小板数の増加を刺激して８日目に最大血小板数を示し、濃度依存的に血小板数値を増加させた。
【産業上の利用の可能性】
【００４８】
以上説明したように、本発明に係る培養方法でｈＴＰＯを生産することができ、本発明の一連のクロマトグラフィーを適用した精製過程によって、高い活性を示す高シアル酸含量の高純度ｈＴＰＯを得ることができる。このような高シアル酸含量の高純度ｈＴＰＯは、医学的に非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
本発明の前記および他の目的、特徴および他の利点は添付図面を参照する以降の詳細な説明からより明らかに理解可能である。
【図１】セルファクトリーを用いた無血清培養と一連のクロマトグラフィーによってｈＴＰＯを精製する流れ図である。
【図２】セルファクトリー培養器内で無血清培養工程中のｈＴＰＯ誘導体の発現量を示す図である。
【図３】ｈＴＰＯ誘導体の精製度を確認するために、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、クマシ−染色およびウェスタンブロットを行った結果を示す図である。
【図４】逆相高速液体クロマトグラフィー(reverse phased HPLC)で精製されたｈＴＰＯ誘導体が純度９９％以上であることを検証したものである。
【図５】サイズ排除高速液体クロマトグラフィー(size exclusion HPLC)で精製されたｈＴＰＯ誘導体が９８％以上の単量体から構成されていることを検証したものである。
【図６】等電集束(isoelectrofocusing)分析によって各分画のｐＩ値とシアル酸分析結果を示す図である。
【図７ａ】シアル酸含量によるｈＴＰＯ誘導体の生体内活性を示す図である。
【図７ｂ】シアル酸含量によるｈＴＰＯ誘導体の生体内活性を示す図である。
【図８】マウスを用いて高シアル酸分画のｈＴＰＯ誘導体の生体内活性を示す図である。
【図９】無血清培地に添加される様々な成分によるｈＴＰＯ誘導体の発現率を示す図である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、ヒトトロンボポエチン(human thrombopietin、ｈＴＰＯ)含有培養物の生産方法および前記培養物からｈＴＰＯを精製するための方法に関する。より具体的には、本発明は、ｈＴＰＯ含有生物学的流液からシアル酸含量の高いｈＴＰＯを分離精製する方法に関する。
【０００２】
〔背景技術〕
血小板増殖因子、すなわちトロンボポエチン（ＴＰＯ）は、血液の血小板数を調節するサイトカイン(cytokine)として知られている物質である（Lok et al., Nature, 369: 565-568 (1994); De savage, F.J. et al., Nature, 369: 533-568 (1994)）。ＴＰＯは、肝または腎臓で合成されて分泌される糖タンパク質であって、巨核球前駆細胞の増進と分化を促進させ、巨核球細胞の血小板としての成熟を誘導する機能を持っている。
【０００３】
これまでは、最も一般的な血小板減少症の治療手段として血小板輸血が使用されてきた。ところが、そのような治療は、血小板輸血に必要なドナーの不足、出血副作用、各種ウィルスの汚染、および血小板の抗原性などのため、難しさが多かった。血小板増殖因子であるＴＰＯは、このような血小板輸血による副作用を減らしながら血小板関連の各種疾患を治療することに使用できるだろうと判断される。ｈＴＰＯは、１９９４年に最初にｃＤＮＡの形でクローニングされ、多数の論文と特許として公知になっている（Lok et al., Nature, 369: 565-568 (1994); De savage, F.J. et al., Nature, 369: 533-568 (1994); Miyazaki et al., Experimental hematol., 22: 828 (1994);および国際特許公開第９５／１８８５８号）。ｈＴＰＯは、骨髄細胞内に存在する血小板前駆細胞としてのコロニー形成前駆細胞に特異的に作用し、血小板の前駆細胞である巨核球細胞(megakaryocyte)の増殖および分化を誘導して究極的に血小板の数を増加させ、抗癌治療の際に誘発される血小板減少症(thrombocytopenia)、骨髄移植による血素板減少症、その他の血小板減少症に使用される有望なタンパク質であって、臨床実験で顕著な血小板増加効果と共に軽微な副作用を示したので、優れた新薬として期待されている（Shinjo et al., Leukemia, 12: 195-300 (1998); and Martin et al., J. Pediatr. Hematol. Oncol., 20(1): 36-43 (1998)）。実際、ｈＴＰＯは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．が製造して（国際特許公開第９５／１８８６８号）、現在、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎと共に臨床３床を進行中にあり、Ｋｒｉｎ社も臨床を進行中にある（国際特許公開ＷＯ９５／２１９１９号）。本発明者らは、優れた血小板減少症治療剤として期待されている、天然型ｈＴＰＯより生体内活性に優れたｈＴＰＯ誘導体を発明した（国際特許公開ＷＯ９９／００３４７号）。
【０００４】
ｈＴＰＯは、遺伝子組換え方法を用いて作製されたベクターを真核細胞に挿入し、これから目的する有用タンパク質の合成および／または分布を可能にすることにより大量生産が可能になり、トランスフェクションされた細胞を血清含有培地で培養した後、精製して医学用途に使用している。ところが、トランスフェクションされた細胞を血清含有倍地を用いて培養する場合、動物由来因子による副作用のおそれが高い。
【０００５】
現在、医学的使用に適する高純度であり、他の微生物または不純物による汚染のおそれもなく、活性の高いｈＴＰＯの製造／精製方法が切実に要求されている。
【０００６】
本発明者らは、ｈＴＰＯを発現することが可能な発現ベクターでトランスフェクションされた真核細胞を、血清がごく少量含有された無血清培地(serum-free medium)で培養することにより、動物由来因子（ウィルスなど）による副作用を最小化しながらも、高い発現効率でヒトトロンボポエチンを得ることができることを見い出した。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、ｈＴＰＯを発現することが可能な真核細胞を無血清培地で培養することによりｈＴＰＯを生成する方法を提供することにある。
【０００８】
また、ｈＴＰＯ含有生物学的流液を一連のクロマトグラフィー（親和性クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィー）に適用することにより、薬剤学的使用に適した高純粋度のｈＴＰＯを精製することに成功した。
【０００９】
したがって、本発明の他の目的は、ｈＴＰＯ含有生物学的流液を高純度で精製する方法を提供することにある。
【００１０】
治療剤として用いられる多くの糖タンパク質の場合、大部分、糖が糖タンパク質の生体内活性において重要な役割をするものと知られている（Takeuchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 7819(1989)）。エリスロポエチン（ＥＰＯ）エリスロポエチン（ＥＰＯ）の場合、糖の数および構成成分、特に生体内半減期の延長のために重要な役割をするシアル酸の含量が重要であり、組換え糖タンパク質を製造するための宿主細胞を選択するとき、高い生体内活性を持つことが可能な糖化能力が最も優先的に考慮されるべきと認識されている。高シアル酸含量の糖タンパク質を精製するために、シアル酸の陰電気的性質を用いて陰イオン交換クロマトグラフィーによって高活性の分画を分離したという報告がある（Glycoconj J.,13(6): 1013-20(1996)）。ところが、トロンボポエチンの場合には、シアル酸含量と生体内活性との層間関係について未だ報告されたことがない。本発明者らは、本発明のクロマトグラフィー方法によって純粋精製された、シアル酸含量の異なるｈＴＰＯを用いて、シアル酸含量が増加するほどｈＴＰＯ活性が比例的に増加することを見い出した。
【００１１】
したがって、本発明の別の目的は、前述した精製方法によって生成された、高い生体内活性を有するシアル酸含量の高いｈＴＰＯを提供することにある。
【００１２】
〔発明の開示〕
本発明は、ヒトトロンボポエチン（ｈＴＰＯ）を発現する真核細胞を３〜６．５％血清含有培地で培養し、続いて０．５〜１．５％血清含有倍地で培養した後、血清が実質的に含有されていない無血清培地で培養することにより、ｈＴＰＯ含有培養物を生産する方法に関する。
【００１３】
前記方法において、真核細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ）が好ましく使用され、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４３４（ＫＣＴＣ ０６３０ＢＰ）、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４４９（ＫＣＴＣ ０６３１ＢＰ）およびＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４５８（ＫＣＴＣ ０６３２ＢＰ）よりなる群から選ばれる細胞株が特に好ましく使用される。また、前記真核細胞は、０．５〜１．５％血清含有培地に１．０×１０４〜１．０×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度で、より好ましくは１．５×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度で接種される。また、無血清培地にブチル酸および酵母分解物を添加した培地が好ましく使用される。
【００１４】
また、本発明は、（ａ）ｈＴＰＯ含有生物学的流液を親和性クロマトグラフィーする段階と、（ｂ）段階（ａ）で得られた溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィーする段階と、（ｃ）段階（ｂ）で得られた溶出液を逆相クロマトグラフィーする段階と、（ｄ）段階（ｃ）で得られた溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーする段階とを含む、前記ｈＴＰＯ含有生物学的流液からｈＴＰＯを精製する方法に関する。
【００１５】
段階（ｄ）において、段階（ｃ）で得られた溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに充填し、０．１５Ｍ〜０．３Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配で前記カラムから選択的に溶出されたｈＴＰＯを収集することが好ましい。また、前記精製方法は、段階（ｄ）を行った後、ゲル濾過クロマトグラフィーする段階をさらに含むことが好ましく、ｈＴＰＯ含有生物学的流液は、ｈＴＰＯを発現するベクターでトランスフェクションされた真核細胞を無血清培養培地で培養して得た培養物が好ましく使用される。また、段階（ａ）において、親和性クロマトグラフィーで使用されるカラムを１Ｍ塩化ナトリウム含有リン酸塩緩衝液で溶出させることが好ましく、段階（ｃ）において、逆相クロマトグラフィーで使用されるカラムをエタノール勾配を用いて溶出させることが好ましい。
【００１６】
また、本発明は、前述した精製方法で精製されたｈＴＰＯ含有分画に関する。
〔発明を実施するための最良の形態〕
真核細胞により生成された大部分の細胞表面および分泌タンパク質は、少なくとも一つのオリゴ糖グループによって修飾される。このような修飾を糖化といい、ポリペプチドの骨格に応じて特定の位置で発生するが、一般に２つの類型に分類される。一つの類型は、Ｏ結合型オリゴ糖がセリン（Ｓｅｒ）またはトレオニン（Ｔｈｒ）残基に結合するＯ結合型糖化であり、もう一つの類型は、Ｎ結合型オリゴ糖が配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここで、Ｘは、プロリンを除いたアミノ酸であればいずれも可能である）のアスパラギン（Ａｓｎ）残基に結合するＮ結合型糖化である。Ｏ結合型オリゴ糖とＮ結合型オリゴ糖の構造、および各類型から発見される糖残基は、お互い異なる。Ｏ結合型オリゴ糖とＮ結合型オリゴ糖の両方ともから共通に発見される糖がシアル酸である。シアル酸は、多くの糖結合体の必須成分である約３０個の天然酸性炭水化物群の一般名である（Society Transactions, 11, 270-271 (1983)）。最も代表的なシアル酸の形態はＮ−アセチルノイラミン酸であり、その次の代表的なシアル酸の形態はＮ−グリコリルノイラミン酸である（Schauer, Glycobiology, 1, 449-452 (1991)）。
【００１７】
天然型ｈＴＰＯは、細胞内で３５３個のアミノ酸からなる前駆体として発現され、この前駆体から２１個のアミノ酸のシグナル配列が切断された後、３３２個のアミノ酸からなる活性型タンパク質の形で細胞外に分泌される糖タンパク質である。ｈＴＰＯ誘導体は、天然型ｈＴＰＯとは異なる糖化パターンを持つことができ、その代表的な例としては、ｈＴＰＯをコードするｃＤＮＡにある特定の塩基を置換させてアスパラギン−Ｘ−セリン／トレオニン（ここで、Ｘはプロリンを除いたアミノ酸である）の形に突然変異させることにより、１７４個のＣ末端欠失アミノ酸からなるｈＴＰＯにＮ結合型糖鎖を少なくとも一つ導入したｈＴＰＯ誘導体（国際特許公開ＷＯ９６／２５４９８号）、完全な天然型ｈＴＰＯに糖鎖をさらに導入して糖鎖が一つ追加されたｈＴＰＯ誘導体（HL Park et al., J. Biol. Chem., 273:256-261, 1998）、天然のｈＴＰＯの１６４番、１９３番、１５７番と１６４番、１１７番と１６４番、または１０８番のアミノ酸をアスパラギンで置換してＮ結合型糖鎖を導入したｈＴＰＯ誘導体（韓国特許公開第２００１−００７８７４４号）などを挙げることができる。
【００１８】
本発明者らは、ｈＴＰＯを発現するベクターでトランスフェクションされた真核細胞を３〜６．５％血清含有培地で培養し、次いで０．５〜１．５％血清含有培地で培養した後、血清がごく少量含有された培地で培養することにより、血清由来因子による汚染要素のないｈＴＰＯ含有培養液を得ることができた。また、ｈＴＰＯの発現効率が血清含有培地でより優れた。従来の低血清含有倍地を用いた培養の場合、５％以上の血清含有培地を用いたが、本発明では、３〜６．５％血清含有培地で培養し、次いで０．５〜１．５％血清含有培養培地を用いて培養した後、最終培養段階では血清が実質的に含有されていない無血清(serum-free)培地を用いて培養することにより、多量のｈＴＰＯを、血清への汚染を最小化しながら生産することができた。
【００１９】
したがって、本発明は、一つの様態として、ｈＴＰＯを発現する真核細胞を３〜６．５％、好ましくは４〜６％、より好ましくは５％血清含有培地で培養し、続いて０．５〜１．５％、好ましくは１％血清含有培地で培養した後、血清が実質的に含有されていない無血清培地で培養してｈＴＰＯ含有培養物を生産する方法を提供する。
【００２０】
前記培養方法でｈＴＰＯを発現する真核細胞は、適切な栄養物と成長因子を含有した培地で単層培養または懸濁培養するときに成長および生存することが可能な哺乳動物由来の細胞株を示す。特定の細胞株のために必要な成長因子は、例えば文献［Mammalian Cell Culture, Mather, J. P. ed., Plenum Press, N.Y. (1984) and by Barnes and Sato, (1980) Cell, 22:649］に記述されているように、過重な実験負担なしに経験で容易に決定できる。本発明の方法に適した哺乳動物宿主細胞としては、ｈＴＰＯ誘導体を発現する、トランスフェクションされたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞、ハイブリドーマ細胞、例えばマウスハイブリドーマ細胞、ベービハムスター腎臓細胞、２９３細胞、マウスＬ細胞などを例示することができる。特に、ｈＴＰＯ誘導体を発現するＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４３４（ＫＣＴＣ ０６３０ＢＰ）、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４４９（ＫＣＴＣ ０６３１ＢＰ）、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４５８（ＫＣＴＣ ０６３２ＢＰ）が好ましく使用でき、その中でも特にＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４５８（ＫＣＴＣ ０６３２ＢＰ）が好ましい。前記培養方法において、０．５〜１．５％血清含有培地を使用した培養の際、ｈＴＰＯ発現細胞は、１×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬ以上、好ましくは１×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬ〜１×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬ、より好ましくは１．５×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度で接種できる。
【００２１】
一つの具体的実施として、本発明は、ｈＴＰＯ誘導体を発現するベクターでトランスフェクションされたチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４５８）を３〜６．５％血清含有培地でシード培養して回収し、これを１×１０４-ｃｅｌｌ／ｍＬ〜１×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬの細胞濃度で０．５〜１．５％血清含有培地に接種して培養した後、無血清培地で培養してｈＴＰＯ誘導体含有培養物を生成した。好ましくは、前述したように無血清培地で培養されたｈＴＰＯ誘導体含有培養物の培養上澄み液を本発明のｈＴＰＯ精製方法にｈＴＰＯ含有生物学的流液として使用することができる。
【００２２】
本願で使用された用語「無血清培養培地」は、哺乳動物起源の血清（例えば牛胎児血清（ＦＢＳ））を実質的に含有していない栄養液を示す。また、用語「実質的に含有していない」は、細胞培養培地が約０．５％未満の血清、好ましくは約０〜０．１％血清を含有することを意味する。前述したように、血清が実質的に含有されていない無血清培地で、ｈＴＰＯを発現する真核細胞を培養することにより、精製されたｈＴＰＯは、血清起源のウィルスなどによる副作用を最小化させることができる。細胞の成長のための栄養液は、典型的に炭水化物形態（例えば、グルコース）のエネルギー源、全ての必須アミノ酸、ビタミンおよび／またはその他の低濃度で要求される有機化合物、遊離脂肪酸、および微量元素（通常、ミクロモル範囲の最低濃度で要求される有機化合物または天然元素）を含有することができ、任意にホルモンおよびその他の成長因子（例えば、インシュリン、トランスフェリン、および表皮成長因子）、塩および緩衝液（例えば、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩）、ヌクレオシドおよび塩基（例えば、アデニン、チミジンおよびヒポキサンチン）、並びにタンパク質および組織加水分解物の中から選ばれた少なくとも一つの成分で補充できる。本発明者らは、無血清培地の添加物として非必須アミノ酸、ＺｎＳＯ４、酪酸ナトリウムおよび酵母分解物のｈＴＰＯ発現効率を観測した。図９に示すように、０．５Ｍの酪酸ナトリウムが１ｍＭの酪酸ナトリウムを添加した場合より発現効率が高く、酵母分解物を添加する場合が、非必須アミノ酸＋酪酸＋亜鉛化合物を添加した場合より著しく高い発現効率を示した。したがって、本発明者らは、無血清培養培地に酪酸および酵母分解物を添加し、その結果、血清含有培地を使用する場合に比べて発現量が増加するうえ、培養物内の血清由来の不純物も最小化することができるため、次の段階の精製過程を容易に行うことができた。
【００２３】
また、本発明者らは、ｈＴＰＯ含有生物学的流液から一連のクロマトグラフィーによって高純度のｈＴＰＯを精製することができた。具体的に、本発明者らは、（ａ）ｈＴＰＯ含有生物学的流液を親和性クロマトグラフィーする段階と、（ｂ）段階（ａ）で得られた溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィーする段階と、（ｃ）段階（ｂ）で得られた溶出液を逆相クロマトグラフィーする段階と、（ｄ）段階（ｃ）で得られた溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーする段階とを含む方法によって、高純度のｈＴＰＯが得られることを立証した。特に、（ａ）ｈＴＰＯ含有生物学的流液を親和性クロマトグラフィーする段階、（ｂ）段階（ａ）で得られた溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィーする段階と、（ｃ）段階（ｂ）で得られた溶出液を逆相クロマトグラフィーする段階と、（ｄ）段階（ｃ）で得られた溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに充填し、０．１５Ｍ〜０．３Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配で選択的に溶出されたｈＴＰＯを収集する段階とを含む方法によって、高純度の高シアル酸含量のｈＴＰＯを得ることができることを立証した。
【００２４】
したがって、本発明は、別の様態として、（ａ）ｈＴＰＯ含有生物学的流液を親和性クロマトグラフィーする段階と、（ｂ）段階（ａ）で得られた溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィーする段階と、（ｃ）段階（ｂ）で得られた溶出液を逆相クロマトグラフィーする段階と、（ｄ）段階（ｃ）で得られた溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーする段階とを含んでｈＴＰＯを精製する方法を提供する。好ましくは、段階（ｃ）で得られた溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに充填し、０．１５Ｍ〜０．３Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配で前記カラムから選択的に溶出されたｈＴＰＯを収集する段階を含んで高シアル酸含量のｈＴＰＯを精製する方法を提供する。好ましくは、前記精製方法は、陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出液をゲル濾過クロマトグラフィーして凝集体を除去する段階をさらに含むことができる。
【００２５】
本発明の培養／精製方法において、ＴＰＯは、ｈＴＰＯであって、天然型ｈＴＰＯおよびｈＴＰＯ誘導体を含み、ｈＴＰＯ誘導体は、天然型ｈＴＰＯと類似であり或いは優れた生物学的活性を持つ。前記ｈＴＰＯ誘導体は、天然型ｈＴＰＯアミノ酸配列の置換、挿入、欠失により変異した変異体を含み、天然型ｈＴＰＯとは異なる糖化パターンを持つことができ、上述したように糖鎖が追加される或いは新しい位置が糖化するｈＴＰＯ誘導体を例示することができる。
【００２６】
本願に使用された用語「生物学的流液」は、細胞、細胞構成要素または細胞産物を含有し、あるいはそれから由来した全ての流液を示し、これらに限定されるものではないが、例えば細胞培養物、細胞培養上澄み液、細胞溶解物、細胞抽出物、組織抽出物、血液、血漿、血清、ミルク、尿、これらの分画を含む。本発明のｈＴＰＯ精製方法には、ｈＴＰＯを含有する限り、前述した様々な形態の生物学的流液が精製のための出発物質として使用できる。好ましくは、前述したように無血清培養方法で得られた培養物の培養上澄み液を使用する。
【００２７】
前述した精製方法において、親和性クロマトグラフィーは、非共有結合の可逆的方式による生体分子間の特異的相互作用を含む。すなわち、この方法の原理は、物理化学的特性の差を利用するのではなく、リガントという特異的結合パートナーが一般に不溶性マトリックス（例えば、多孔性ガラス、アガロース、シリカ、セルロース、デキストランゲル）に共有結合し、成分の混合物が接触する結合システムの特異性を利用することである。好ましい親和性クロマトグラフィーは、染料−リガンドクロマトグラフィーであり、その例としてはＣＭ Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ ＢｌｕｅゲルまたはＤＥＡＥ Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｂｌｕｅゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＭＩＭＥＴＩＣ Ｒｅｄ、Ｂｌｕｅ、Ｏｒａｎｇｅ、ＹｅｌｌｏｗまたはＧｒｅｅｎ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｌｔｄ、Ｆｒｅｅｐｏｒｔ、Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ）を挙げることができる。特に好ましくは、ＣＭ Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｂｌｕｅゲルである。これは、ＣＭ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ａゲルに共有結合したチバクロンブルーＦ３ＧＡ染料を含有することができる。ＣＭ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ａゲルは、カルボキシ−末端アガロースゲルであり、この支持体は、アミノ末端リガンド、タンパク質またはスペーサアームの結合に使用される。便利には、溶出物をロードする前に親和性クロマトグラフィーカラムを中性ｐＨの水性緩衝液、好ましくは約ｐＨ７．２のリン酸塩緩衝液で平衡化させる。溶出は、水性緩衝液、好ましくは約ｐＨ７．２のリン酸塩緩衝液を用いて公知の方法によって行う。リン酸塩緩衝液は、好ましくは１Ｍ塩化ナトリウム含有緩衝液である。このような緩衝液を用いて溶出させる場合、溶出液を、２次カラムである疎水性相互作用クロマトグラフィーに追加の処理なしにそのまま適用することができる。親和性クロマトグラフィーを１次カラムとして適用させることにより、培養液の培地成分（Ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄなど）を効果的に除去することができる。
【００２８】
本発明において、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、市販の各種マトリックスに結合した疎水性、好ましくは芳香族または脂肪族の帯電しないリガンドを有するゲルで行われる。帯電しないリガンドが形成されるように、通常の結合技術によってリガンドをマトリックスに結合させることができる。このような技術として最も適した例がグリシジル−エーテル結合方法である。他の技術としては、アガロースマトリックスを水中でグリシドキシプロピルトリメトキシシランで活性化させた後、アルコール中でリガンドを固定する方法がある。別の技術としては、アガロースマトリックスを１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルなどのビス−エポキシドで活性化した後、アミノアルキルまたはアルキルメルカプタンなどのリガンドに結合させる方法がある。利用可能なさらに別の技術として、１，１−カルボニルジイミダゾール活性化およびジビニルスルホン活性化がある。前記全ての技術から得たゲルは、全体ｐＨ範囲で帯電しない。脂肪族リガンドは、例えばプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチルなどの直鎖アルキルであり、あるいはイソ−またはネオアルキルなどの側鎖アルキルであり、あるいはオリゴエチレングリコールである。芳香族リガンドは、好ましくはフェニルである。マトリックスは、いろいろの強親水性マトリックスの中から選択でき、例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）などのアガロースマトリックス、ＴＳＫ−ＧＥＬなどの有機高分子マトリックス、高多孔性有機高分子マトリックスがある。好ましいマトリックスは、アガロースマトリックスである。好ましいアガロースマトリックスは、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）のセファロースマトリックス、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）のＢｉｏ−Ｇｅｌ Ａ、Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ Ａ／Ｓ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）のＭｉｎｉｌｅａｋ（登録商標）である。好ましくは、マトリックスは、交差結合されて高速流動を許容することにより、高生産能を提供する。さらに好ましくは、本発明の疎水性相互作用クロマトグラフィーは、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのフェニルセファロース６ＦＦゲルまたはブチルセファロース４ＦＦゲルで行う。一般に、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、実施に先立ち、分画の伝導性を高めるために分画に塩を添加することができる。その後、低いイオン強度の緩衝液を用いて媒質から溶出する。本発明の実施において、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、前段階の親和性クロマトグラフィーの溶出液を前処理なしにそのままロードすることができ、ｈＴＰＯは樹脂に付着され、不純物はそのままカラムを通過し或いは洗浄段階で除去されるので、多くの不純物を効果的に除去することができる。
【００２９】
本発明において、逆相クロマトグラフィーは、疎水性によって成分を分離するためのことであって、極性の移動相と非極性の化学的に結合した固定相を利用する。好ましい逆相媒質は、Ｃ４樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、多孔性樹脂Ｏｌｉｇｏ Ｒ２（登録商標）およびＯｌｉｇｏ Ｒ３（登録商標）（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）を含む。典型的な溶媒システムは、水−エタノール、水−アセトニトリル、水−テトラヒドロフラン、へキシレングリコールなどの混合物を含み、溶出は、そのような溶媒システムの適当な濃度勾配で公知の方法によって行う。好ましくは、溶出された分画は、直ちにリン酸塩緩衝液で希釈してタンパク質の変性を防止する。具体的な様態として、本発明の精製方法は、好ましくは逆相クロマトグラフィーにＣ４逆相樹脂を使用する。特に好ましくは、溶媒システムとして水−エタノール混合物の勾配を利用する。本発明の実施において、エタノール濃度勾配を用いて逆相クロマトグラフィーした溶出液は、前段階の疎水性相互作用クロマトグラフィーした溶出液に含まれていた不純物を完全に除去する。これにより、ｈＴＰＯの純度は９８％以上である。
【００３０】
本発明において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、一般に３級または４級アミングループ（例えば、ジエチルアミノエチル、トリエチルアミノエチル、ベンジル−ジエチルアミノエチル）で誘導体化された不溶性の粒子性支持体を含む媒質を用いて行う。好ましい支持体は、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリスチレンビードなどを含む。トリエチルアミノエチルグループで誘導体化された支持体が好ましい。好ましい陰イオン交換媒質は、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｑ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｑ−ＨｙｐｅｒＤ（登録商標）（ＢｉｏＳｅｐｒａ，Ｉｎｃ．，Ｍａｒｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ−ＴＭＡＥ６５０（Ｍｅｒｃｋ）などを含む。陰イオン交換カラムは、溶出物をロードする前に、便利にはｐＨ６．０〜８．０の水性緩衝液で平衡化させることができる。溶出は、水性緩衝液、好ましくは約ｐＨ６．５〜４．５のアセテート緩衝液を用いて公知の方法によって行うことができる。或いは、リン酸ナトリウム緩衝液を用いて濃度勾配に応じて溶出することができる。好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに結合したｈＴＰＯを塩化ナトリウムの濃度勾配を用いてシアル酸含量に応じてｈＴＰＯを分画溶出させる。０．５Ｍ以下、好ましくは０．３Ｍ以下の塩化ナトリウム勾配を使用することができる。塩化ナトリウ濃度勾配が高いほど、シアル酸含量の高いｈＴＰＯが溶出された。塩化ナトリウム濃度勾配を用いて得られた溶出分画中のｈＴＰＯのシアル酸含量が図６に示されている。図６中の（ａ）および（ｂ）に示すように、０．１５Ｍ〜０．３Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配で溶出された分画にシアル酸含量の高いｈＴＰＯが含有された。本発明者らは、前述したように、精製されたｈＴＰＯを等電集束分析によってＮ−アセチルノイラミン酸(N-acetylneuraminic acid)およびＮ−グリコノイラミン酸(N-glyconeuraminic acid)を定量および定性分析してシアル酸含量を測定するとともに、シアル酸含量による生体内活性を測定し、シアル酸含量が増加するほど生体内血小板が増加することを確認した（実施例５、図７）。
【００３１】
したがって、本発明は、一つの追加様態として、（ａ）ｈＴＰＯ含有生物学的流液を親和性クロマトグラフィーする段階と、（ｂ）段階（ａ）で得られた溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィーする段階と、（ｃ）段階（ｂ）で得られた溶出液を逆相クロマトグラフィーする段階と、（ｄ）段階（ｃ）で得られた溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに充填し、０．１５Ｍ〜０．３Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配で前記カラムから選択的に溶出されたｈＴＰＯを収集する段階とを含む方法により精製された、高シアル酸含量のｈＴＰＯ含有分画を提供する。
【００３２】
本願に使用された用語「高シアル酸含量のｈＴＰＯ」は、前述したような陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから０．１５〜０．３Ｍの塩化ナトリウム勾配で溶出され、ｐＩ４．０以下のｈＴＰＯを意味する。
【００３３】
前述した一連のクロマトグラフィーによって精製されたｈＴＰＯは、ゲル濾過クロマトグラフィーによってさらに精製でき、これにより陰イオン交換クロマトグラフィーからの溶出物中の凝集体を除去することができる。ゲル濾過の好ましい媒質は、アガロース、ポリアクリルアミドまたはその他の高分子の交差結合ビードを含み、好ましくはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのセファクリル（例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標） ２００ＨＲまたはＳ−３００ＨＲ）、セファデキス（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０）またはスーパーデキス（例えば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標） ２００ＰＧまたはＳｕｐｅｒｄｅｘ７５）を挙げることができる。ＴＯＳＯ Ｈａａｓ ＧｍｂＨ（Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のゲル濾過媒質（例えば、ＴＳＫ Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＨＷ５５）またはその他の製造会社で市販している類似のゲルなどが使用できる。溶出は、水性緩衝液を用いて公知の方法によって行い、ＴＰＯの特性に有害な影響を及ぼす成分を溶出するものと知られているその他の通常の溶出緩衝液が使用できる。具体的様態として、本発明の精製方法は、好ましくはゲル濾過クロマトグラフィーにスーパーデキス２００ＰＧを使用する。
【００３４】
前述したような一連のクロマトグラフィーによって精製されたｈＴＰＯは、逆相高速液体クロマトグラフィーおよびゲル濾過高速液体クロマトグラフィーの結果、９８％以上の高純度を示した（実施例３）。
【００３５】
以下、添付図面を参照しながら、本発明を下記実施例によってより具体的に説明する。ところが、当業者であれば、下記実施例が本発明を説明するために提供するものに過ぎず、本発明がこれらの実施例によって限定されるものではないことを理解するであろう。
【００３６】
〔実施例１〕
＜セルファクトリー培養器を用いた無血清大量培養＞
１５７番および１６４番のアミノ酸残基をアスパラギン酸で置換してＮ結合型糖鎖を導入したｈＴＰＯ誘導体を大量生産するための無血清セルファクトリー培養をシード培養段階と本培養段階に分けて行った。シード培養では、液体窒素タンクに保管されている製造用細胞銀行(Working Cell Bank)でヒトトロンボポエチン誘導体生産細胞株（ＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４５８）（ＫＣＴＣ ０６３２ＢＰ）５バイアル（１×１０７ｃｅｌｌ／ｍＬ）を取り出してシード培養培地（５％血清含有、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｃｏ．）で１回洗浄した。メトトレキサート(methotrexate)（Ｓｉｇｍａ社）を含有したシード培養培地を３０ｍＬずつ５個の１７５ｃｍ２Ｔ−フラスコ（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）に入れ、洗浄した細胞を接種した。ＣＯ2培養器（３７℃、５％ＣＯ２の条件）で準飽和(sub-confluency)状態になるまで培養した後、１７５ｃｍ２Ｔ−フラスコを０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液で処理して細胞を回収した。１つの１７５ｃｍ２Ｔ−フラスコから回収した細胞を、新鮮なメトトレキサート含有シード培養培地が３０ｍＬずつ入っている４個の新しい１７５ｃｍ２Ｔ−フラスコに分けて接種した後、前記と同様の条件でもう１回準飽和状態になるまで培養し、その後回収した細胞を新鮮なシード培養培地が２Ｌずつ入っている３個の１０段セルファクトリー（Ｎｕｎｃ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ ｏｆ Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）に分けて接種した。
【００３７】
３個の１０段セルファクトリーから回収した細胞を新鮮な本培養培地（１％血清含有、ＤＭＥＭ／Ｆ１２倍地、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｃｏ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）４０Ｌ入りのＭｅｄｉａ ｂａｇ（Ｓｔｅｄｉｍ Ｉｎｃ．，Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡ）に仕込んで均一に混ぜた後、５個の４０段セルファクトリーに１．５×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬで接種した。７２時間培養の後、ＰＢＳで１回洗浄し、０．５ｍＭ酪酸、酵母分解物（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｃｏ．）、各種アミノ酸入りの無血清培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２で交替した後、ＣＯ２培養器（３７℃、５％ＣＯ２の条件）で１２０時間培養した。前述した各種添加物入りの無血清(serum-free)培養方法で培養するときの培養日によるｈＴＰＯ誘導体生産細胞株の発現量を図２に示した。発現量は、無血清培地で交替した後５日目に最大（２０ｍｇ／Ｌ）であった。これは、１０％血清含有培地で確認した発現量（１０ｍｇ／Ｌ）と比較するとき、約２倍増加したものである。
【００３８】
〔実施例２〕
＜ＴＰＯ誘導体の純粋精製＞
（ａ）親和性クロマトグラフィー
ＣＭ Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｂｌｕｅ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１ＬをＶＳ１５０／５００カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）に充填させた後、緩衝液Ａ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）１０Ｌで十分洗浄した。実施例１で得た培養上澄み液４０Ｌを１３０ｍＬ／ｍｉｎの速度でカラムを通過させ、２８０ｎｍでＵＶによってモニタリングした。培養上澄み液を全て流した後、緩衝液Ｂ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ尿素、ｐＨ７．２）でＵＶ数値が基底水準となるまで洗浄した後、緩衝液Ｃ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ尿素、１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）でＴＰＯ含有樹脂に結合したタンパク質を溶出させた。
【００３９】
（ｂ）疎水性相互作用クロマトグラフィー
フェニルセファロースＦＦ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）８００ｍＬをＶＳ９０／５００カラムに充填させた後、２Ｌの緩衝液Ｃ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ尿素、１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）で十分洗浄した。ＣＭ Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｂｌｕｅ段階で得た溶出分画を４３ｍＬ／ｍｉｎの速度でカラムに適用し、２８０ｎｍでＵＶによってモニタリングした。分画を全て流した後、緩衝液Ｃ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ尿素、１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）でＵＶ数値が基底水準になるまで洗浄した後、緩衝液Ｂ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、２Ｍ尿素、ｐＨ７．２）でＴＰＯ含有樹脂に結合されたタンパク質を溶出させた後、この分画にＥｔＯＨを２０％添加して、次の段階であるＣ４逆相カラムクロマトグラフィー(C4 reversed phased column chromatography)に適用した。
【００４０】
（ｃ）逆相クロマトグラフィー
１５μｍサイズのＣ４逆相樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）２３ｍＬをＴＲ１０／３００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｒｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に充填させ、ｐＨ６．０の５０ｍＭリン酸ナトリウム、２０％エタノールで洗浄して平衡化させた後、７ｍＬ／ｍｉｎの速度でフェニルセファローズ段階で得た溶出分画（２０％ＥｔＯＨ添加）を注入した。ｐＨ６．０の５０ｍＭリン酸ナトリウム、４０％エタノール緩衝液でカラムを洗浄し、４０％〜８０％エタノールの濃度勾配によってタンパク質を溶出させた。ｈＴＰＯ誘導体は、約７０％エタノールの濃度勾配で大部分溶出された。Ｃ４逆相クロマトグラフィーで溶出された分画は、直ちに１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で１０倍希釈して有機溶媒によるタンパク質変性を防止した。
【００４１】
（ｄ）陰イオン交換クロマトグラフィー
逆相クロマトグラフィー段階で溶出された分画をシアル酸含量によって分別するために、陰イオン交換クロマトグラフィーＱカラム（Ａｍｅｒｓｈａｒｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に１０ｍＬ／ｍｉｎの速度で注入した。１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で十分洗浄した後、０〜０．３Ｍ塩化ナトリウム勾配の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を適用して溶出した。この際、シアル酸含量の少ないｈＴＰＯは、０．１５Ｍ以下の塩化ナトリウムを用いた分画で溶出され、シアル酸含量の多いｈＴＰＯ誘導体は、０．１５〜０．３Ｍ塩化ナトリウム緩衝液で溶出された。
【００４２】
（ｅ）ゲル濾過クロマトグラフィー
陰イオン交換クロマトグラフィーで溶出された高シアル酸含量のｈＴＰＯをゲル濾過クロマトグラフィーに適用して凝集体(aggregates)を除去し、最終医薬品薬剤用緩衝液として使用されるＴＮＴ（１０ｍＭトリス、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％ツイン２０）緩衝液で交替した。カラムＸＫ５０／１００（Ａｍｅｒｓｈａｒｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にゲル濾過樹脂スーパーデキス２００ＰＧ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＰＧ、Ａｍｅｒｓｈａｒｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１．４Ｌを充填させ、０．５Ｎ ＮａＯＨと０．５Ｎ ＨＣｌで洗浄した後、ＴＮＴ緩衝液７Ｌを一日中流して、樹脂にエンドトキシンが存在しないように調節した。溶出液を８ｍＬ／ｍｉｎの速度でカラムに注入し、分画収集器（ｆｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ、Ａｍｅｒｓｈａｒｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、カラムを通過したタンパク質を収集した。単量体のみを含む分画を集めて０．２２μｍフィルタで濾過した後、凍結乾燥バイアルに分注し、長期間保存のために凍結乾燥させた。
【００４３】
〔実施例３〕
＜検定＞
各段階のクロマトグラフィーで溶出された溶出液は、還元条件の下で１５％ポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）上で電気泳動した後、クマシー染色とウェスタンブロット方法で分析した。その結果は、図３に示されている。最終精製された精製産物は、逆相高速液体クロマトグラフィー(reverse phased HPLC)によって、純度が９９％以上であることを確認し（図４参照）、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー(size exclusion HPLC)によって単量体が９８％以上であることが証明された（図５参照）。
【００４４】
〔実施例４〕
＜精製したｈＴＰＯ誘導体の等電集束分析およびシアル酸の測定＞
実施例２で純粋精製した試料６μｇを取ってＩＥＦゲル（ｐＨ３〜７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードし、１００Ｖで１時間、２００Ｖで３０分、５００Ｖで１５分間展開した後、ゲルを取り出して固定液中で３０分間放置し、クマシー染色で染色することにより、等電集束分析を行った。等電集束分析の結果、Ｑカラムで塩化ナトリウム濃度勾配で溶出された分画は塩濃度が高いほど低いｐＩ値を有することが分かった（図６における（ａ））。シアル酸分析のためには、まず、０．４〜０．６ｎｍｏＬの乾燥試料に０．４ｍＬの０．１Ｎ ＨＣｌを入れて１時間８０℃でシアル酸を加水分解した。スピードバック(Speed Vac)で反応液を乾燥させ、さらに蒸留水に溶解して再乾燥させた試料の一部をＢｉｏ−ＬＣ ＤＸ−３００（Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）に注入して分析した。カラムは、直径４ｍｍ、長さ２５０ｍｍのＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラムを利用し、１５０ｍＭ塩化酢酸含有の１００ｍＭ ＮａＯＨで分析した。流速は１ｍＬ／ｍｉｎであり、標準物質としては、糖タンパク質で発見されるＮ−アセチルノイラミン酸(N-acetylneuraminic acid)とＮ−グリコノイラミン酸(N-glyconeuraminic acid)を用いて定性および定量分析を行った。その結果が図６における（ｂ）に示されている。物質のｐＩ値が低いほど、比例的にシアル酸含量が高い。これは、シアル酸含量が糖タンパク質のｐＩ値に多くの影響を及ぼしていることを示す。
【００４５】
〔実施例５〕
＜ｈＴＰＯ誘導体の生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）活性の検証＞
生体内活性試験は、動物細胞で発現されたｈＴＰＯ誘導体を投与したマウスからの血小板数を測定する方法で行った。動物は、７週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを購入して（Ｃｈａｒｌｅｘ Ｒｉｖｅｒ社、日本）恒温（２４±１℃）、恒湿（５５％）、照明時間１２時間（午前７時〜午後７時）と設定された動物室で１週間程度飼育馴化してから使用した。試験期間中にも、動物は、同一の飼育室で飼育した。１群に５匹となるように、体重を指標とした層別無作為抽出によってマウスを群分離し、それぞれｈＴＰＯ誘導体投与群、薬剤を投与しない無処理群と設定した。
【００４６】
実施例２のＱカラムで相異なる塩濃度によって分画し、シアル酸含量の異なるｈＴＰＯ誘導体を得、そのシアル酸含量によるｈＴＰＯ誘導体の生体内活性を比較するために、１０μｇ／ｋｇの濃度で１回皮下投与した。採血は、投与開始５日後に行った。エーテル麻酔の下にマウスの腹部下大静脈から全血を採取し、ＥＤＴＡ処理チューブに移した後、抹消血中の血小板数を自動血球計測器（Ｃｅｌｌ ｄｙｎｅ、Ａｂｂｏｔｔ社）を用いて測定した。その結果は、平均±標準誤差で示した。シアル酸含量が高いほど、生体内で血小板を増加させる薬効は比例的に高いことが分かった（図７ａ）。同一の試験方法で０〜０．３Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配で分離したｈＴＰＯ誘導体と０．１５〜０．３Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配で溶出した高シアル酸含有ｈＴＰＯ誘導体間の生体内活性を比較したとき（図７ｂ）、前記２つの溶出液間の生体内活性は有意的な差異を示した。
【００４７】
高シアル酸含有のｈＴＰＯ誘導体分画の投与濃度による活性を測定するために、１０、２０、４０、８０、１６０、３２０、６４０、１２８０μｇ／ｋｇの一定の濃度で１回皮下投与した。試験方法は、前記と同様にした。投与濃度による血小板数値の変化を図８に示した。ＨＴＰＯ誘導体は、血小板数の増加を刺激して８日目に最大血小板数を示し、濃度依存的に血小板数値を増加させた。
【産業上の利用の可能性】
【００４８】
以上説明したように、本発明に係る培養方法でｈＴＰＯを生産することができ、本発明の一連のクロマトグラフィーを適用した精製過程によって、高い活性を示す高シアル酸含量の高純度ｈＴＰＯを得ることができる。このような高シアル酸含量の高純度ｈＴＰＯは、医学的に非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
本発明の前記および他の目的、特徴および他の利点は添付図面を参照する以降の詳細な説明からより明らかに理解可能である。
【図１】セルファクトリーを用いた無血清培養と一連のクロマトグラフィーによってｈＴＰＯを精製する流れ図である。
【図２】セルファクトリー培養器内で無血清培養工程中のｈＴＰＯ誘導体の発現量を示す図である。
【図３】ｈＴＰＯ誘導体の精製度を確認するために、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、クマシ−染色およびウェスタンブロットを行った結果を示す図である。
【図４】逆相高速液体クロマトグラフィー(reverse phased HPLC)で精製されたｈＴＰＯ誘導体が純度９９％以上であることを検証したものである。
【図５】サイズ排除高速液体クロマトグラフィー(size exclusion HPLC)で精製されたｈＴＰＯ誘導体が９８％以上の単量体から構成されていることを検証したものである。
【図６】等電集束(isoelectrofocusing)分析によって各分画のｐＩ値とシアル酸分析結果を示す図である。
【図７ａ】シアル酸含量によるｈＴＰＯ誘導体の生体内活性を示す図である。
【図７ｂ】シアル酸含量によるｈＴＰＯ誘導体の生体内活性を示す図である。
【図８】マウスを用いて高シアル酸分画のｈＴＰＯ誘導体の生体内活性を示す図である。
【図９】無血清培地に添加される様々な成分によるｈＴＰＯ誘導体の発現率を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトトロンボポエチン（ｈＴＰＯ）を発現する真核細胞を３〜６．５％血清含有培地で培養する段階と、
続いて０．５〜１．５％血清含有培地で培養する段階と、
血清が実質的に含有されていない無血清培地で培養する段階とを含む、ｈＴＰＯ含有培養物を生産する方法。
【請求項２】
前記真核細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＨＯ細胞株が、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４３４（ＫＣＴＣ ０６３０ＢＰ）、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４４９（ＫＣＴＣ ０６３１ＢＰ）およびＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４５８（ＫＣＴＣ ０６３２ＢＰ）よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記真核細胞が、前記０．５〜１．５％血清含有培地に１．０×１０４〜１．０×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度で接種されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記真核細胞が、１．５×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度で接種されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記無血清培地にブチル酸および酵母分解物が添加されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）ｈＴＰＯ含有生物学的流液を親和性クロマトグラフィーする段階と、
（ｂ）段階（ａ）で得られた溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィーする段階と、
（ｃ）段階（ｂ）で得られた溶出液を逆相クロマトグラフィーする段階と、
（ｄ）段階（ｃ）で得られた溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーする段階とを含む、ｈＴＰＯ含有生物学的流液からｈＴＰＯを精製する方法。
【請求項８】
段階（ｃ）で得られた溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに充填し、０．１５Ｍ〜０．３Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配で前記カラムから選択的に溶出されたｈＴＰＯを収集することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
段階（ｄ）を行った後、ゲル濾過クロマトグラフィーする段階をさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ｈＴＰＯ含有生物学的流液が、請求項１記載の方法で生産された培養物の培養上澄み液であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
段階（ａ）の親和性クロマトグラフィーで使用されるカラムを１Ｍ塩化ナトリウム含有リン酸塩緩衝液で溶出させることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
段階（ｃ）の逆相クロマトグラフィーで使用されるカラムをエタノール勾配を用いて溶出させることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
請求項８に記載の方法で精製されたｈＴＰＯを含有する分画。
【請求項１】
ヒトトロンボポエチン（ｈＴＰＯ）を発現する真核細胞を３〜６．５％血清含有培地で培養する段階と、
続いて０．５〜１．５％血清含有培地で培養する段階と、
血清が実質的に含有されていない無血清培地で培養する段階とを含む、ｈＴＰＯ含有培養物を生産する方法。
【請求項２】
前記真核細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＨＯ細胞株が、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４３４（ＫＣＴＣ ０６３０ＢＰ）、ＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４４９（ＫＣＴＣ ０６３１ＢＰ）およびＣＨＯ ｄｈｆｒ−／ｐＤ４０４５８（ＫＣＴＣ ０６３２ＢＰ）よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記真核細胞が、前記０．５〜１．５％血清含有培地に１．０×１０４〜１．０×１０６ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度で接種されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記真核細胞が、１．５×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度で接種されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記無血清培地にブチル酸および酵母分解物が添加されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）ｈＴＰＯ含有生物学的流液を親和性クロマトグラフィーする段階と、
（ｂ）段階（ａ）で得られた溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィーする段階と、
（ｃ）段階（ｂ）で得られた溶出液を逆相クロマトグラフィーする段階と、
（ｄ）段階（ｃ）で得られた溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーする段階とを含む、ｈＴＰＯ含有生物学的流液からｈＴＰＯを精製する方法。
【請求項８】
段階（ｃ）で得られた溶出液を陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに充填し、０．１５Ｍ〜０．３Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配で前記カラムから選択的に溶出されたｈＴＰＯを収集することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
段階（ｄ）を行った後、ゲル濾過クロマトグラフィーする段階をさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ｈＴＰＯ含有生物学的流液が、請求項１記載の方法で生産された培養物の培養上澄み液であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
段階（ａ）の親和性クロマトグラフィーで使用されるカラムを１Ｍ塩化ナトリウム含有リン酸塩緩衝液で溶出させることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
段階（ｃ）の逆相クロマトグラフィーで使用されるカラムをエタノール勾配を用いて溶出させることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
請求項８に記載の方法で精製されたｈＴＰＯを含有する分画。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００７−５２８１９５（Ｐ２００７−５２８１９５Ａ）
【公表日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０９３３５（Ｐ２００５−５０９３３５）
【出願日】平成１５年１０月９日（２００３．１０．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００３／００２０７９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３３１３５
【国際公開日】平成１７年４月１４日（２００５．４．１４）
【出願人】（５０６１２２５１２）デウン カンパニー，リミテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１０月９日（２００３．１０．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００３／００２０７９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３３１３５
【国際公開日】平成１７年４月１４日（２００５．４．１４）
【出願人】（５０６１２２５１２）デウン カンパニー，リミテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
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