魚類類結節症ワクチン
【課題】 魚類類結節症ワクチンを提供する。
【解決手段】 フォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシーダの対数増殖期の不活化菌体又はその成分を有効成分とする魚類類結節症ワクチン。
【解決手段】 フォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシーダの対数増殖期の不活化菌体又はその成分を有効成分とする魚類類結節症ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は魚類類結節症ワクチン及びこれを用いた魚類類結節症の予防法に関する。
【背景技術】
【０００２】
類結節症は、ブリ、カンパチ、マダイ、ヒラメ等に春〜秋の比較的高水温期に発病する病気である。以前は、ブリ類にのみ発生が見られた疾病であったが、近年、養殖魚種拡大に伴い、感染魚種は広がりつつある。死亡率はほぼ１００％である。
【０００３】
類結節症の治療手段としては、アミノベンジルペニシリン、オキソリン酸、ホスホマイシン、ビコザマイシン、フロルフェニコール等の経口投与が行われているが、長期間の治療を必要とする為、経済的負担も大きく、一方で耐性菌出現も懸念される。
【０００４】
類結節症の原因菌はフォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシ−ダ(Photobacterium damselae subsp.piscicida)であることが判明している。しかし日本では現在までこれに対するワクチンは販売されていない。なお、フォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシ−ダはパスツレラ ピシシーダと呼ばれることもある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は魚類類結節症ワクチンを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで発明者は類結節症の原因菌であるフォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシ−ダの各種培養条件による病原性及びワクチン活性について検討してきたところ、全く意外にも定常期の菌体よりも対数増殖期の菌体を用いた場合に特にワクチン活性が高いことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、フォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシ−ダの対数増殖期の不活化菌体又はその成分を有効成分とする魚類類結節症ワクチンを提供するものである。
【０００８】
また本発明は、フォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシ−ダの対数増殖期の不活化菌体又はその成分を含有する魚類類結節症ワクチン組成物を提供するものである。
【０００９】
さらに本発明は、フォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシ−ダの対数増殖期の不活化菌体又はその成分の有効量を投与することを特徴とする魚類類結節症の予防法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のワクチンを用いれば、ブリ、カンパチ等のブリ属魚類、マダイ、ヒラメ等の類結節症が効率的に予防できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のワクチンは、フォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシ−ダ(以下本菌ということがある)の対数増殖期の不活化菌体又はその成分を用いる。通常、細菌を培養した場合、誘導期、対数増殖期、定常期、死滅期及び生残期に分けられる。
【００１２】
本発明のワクチンに用いる菌体は、本菌を常法により培養し、対数増殖期に採取することにより得られる。本菌の培養は、本菌を適当な培地に接種し常法に従って培養すればよい。培養中には、資化し得る炭素源及び窒素源を適当量含有させておくのが好ましい。
【００１３】
この炭素源及び窒素源については特に制限はないが、その例としては、窒素源としてトリプトン、各種動物血清、コーングルテンミール、大豆粉、コーンスチープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、イワシミール、肉エキス、ペプトン、ハイプロ、アジパワー、コーンミール、ソイビーンミール、コーヒー粕、綿実油粕、カルチベータ、アミフレックス及びアジプロン、ゼスト、アジックスなどが挙げられる。また、炭素源としては資化し得る炭素源、例えば、アラビノース、キシロース、グルコース、マンノース、蔗糖、麦芽糖、可溶性デンプン、乳糖、廃糖蜜や資化し得る有機酸、例えば酢酸等が挙げられる。また、その他、リン酸、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Co2+、Na+、K+等の無機塩や、必要であれば、無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加することもできる。
またNaCl濃度を2.0%に調製したBHI培地を用いることもできる。
【００１４】
培養条件は、NaCl濃度2.0％、pH7.2〜7.6、25℃とするのが好ましい。
【００１５】
本菌が対数増殖期にあるか否かの確認は、595nmでの光学密度を測定することにより行われる。すなわち595nmでの光学密度が急激に上昇する時期が対数増殖期である。例えばpH7.2、25℃で培養した場合、培養12〜24時間が対数増殖期である。
【００１６】
対数増殖期にある本菌を遠心分離、濾過等により分離するか、培養物をそのまま不活化する。不活化処理としては加熱処理、ホルマリン処理等が挙げられる。
【００１７】
本菌の成分には、菌体の膜成分及び分泌物が含まれる。これらの成分を採取するには、不活化菌体の超音波破砕等により行うのが好ましい。
【００１８】
得られた不活化菌体又はその成分は、濾過、エバポレーション、濃縮、凍結乾燥等により濃縮して用いるのが好ましい。
【００１９】
本菌の不活化菌体又はその成分は、そのままワクチンとして使用してもよいが、薬学的に許容される液状又は固体状の担体とともにワクチン組成物として使用してもよい。当該ワクチン組成物の形態としては注射用組成物、経口投与組成物、魚類浸漬用組成物、飼料組成物等が挙げられる。液状の担体としては、リン酸緩衝液が挙げられる。固体状の担体としては、タルク、シュークロースなどの賦形剤が挙げられる。飼料組成物とするには、通常の魚類の飼料に本菌の不活化菌体又はその成分を混合すればよい。また、これらのワクチン組成物にはアジュバントを添加して抗原性を高めてもよい。
【００２０】
本発明のワクチン又はワクチン組成物の投与は、成魚でもよいが類結節症に罹患する前、例えば稚魚の段階が好ましい。その投与量は、１尾あたり不活化菌又はその成分として約１０8〜１０10CFUが好ましい。投与回数は1回でもよいが、２回が好ましく、また、２回目の投与までの間隔は３週間以上あけてから接種したほうが良い。
【００２１】
本発明のワクチン又はワクチン組成物の対象魚種としては、本菌による類結節症になる魚類であれば制限されず、例えばブリ、カンパチ等のブリ属魚類の他、マダイ、ヒラメ等が挙げられる。
【実施例】
【００２２】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【００２３】
実施例１
(1) フォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシ−ダP3529(以下でもこの株を使用した。)の凍結保存した菌0.2mLを200mLの2％NaCl加BHI液体培地に接種し25℃で静置培養した。培養時間と菌体数及び595nmにおける光学密度(OD)との関係を図1に示す。図1から明らかなように、本菌は0〜12時間までが誘導期であり、12〜20時間までが対数増殖期であり、20時間以降が定常期であることがわかる。
【００２４】
(2) 本菌の各種培養条件によるブリに対する病原性の差異について検討した。すなわち、対数増殖中期、対数増殖後期、定常期及び死滅期の本菌をブリ1尾あたり103〜105CFUとなるように腹腔内注射し、病原性を検討した。なお、対照としたブリは20〜24gであり、水槽の温度は25℃とした。その結果、図2、3、4及び5に示すように、生残率が、対数増殖中期の本菌感染群では25.0〜6.6％、対数増殖後期では13.3〜1.6％、定常期では53.3〜26.7％、死滅期では80.0〜43.3％であり、対数増殖後期の菌の病原性が高いことが判明した。
【００２５】
実施例２
フォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシ−ダP3529の0.2mLを三角フラスコ中で200mLの2%NaCl加BHI培地に接種し、25℃で培養した。OD595nmが0.85から0.95のものを対数増殖菌体として用いた。すなわち、培養19〜21時間の間の培養物を0.3％ホルマリン中で25℃、1日間インキュベーションして不活化菌体とし、次いで4℃で8,000〜10,000×ｇで遠心分離して菌体を採取した。得られた菌体をさらに0.3％ホルマリン生理食塩水に再懸濁し、本菌の不活化菌体を含むワクチン組成物を得た。また、対照として培養32時間後（OD595nm＝0.95）の培養物を同様に不活化して定常期不活化菌体を含むワクチン組成物を得た。
【００２６】
平均体重23.6gのブリに、上記で得たワクチン組成物を用いてワクチン効果を検討した。すなわち、ワクチンを1尾あたり0.1mL腹腔内注射し、2週間免疫活性を上昇させる為に飼育した。
2週間後、これらの免疫したブリに対して腹腔内注射攻撃試験を行った。対照として等量のＰＢＳを腹腔内注射したブリを同様に試験に供試した。なお、攻撃菌には、対数増殖期及び定常期の菌体を用いた。その結果を表1、図6及び7に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】
その結果、対数増殖期群が定常期群及び対照群に対して生存率に有意差があり、ワクチンとして有用であることが判明した。
【００２９】
本試験期間中に死亡魚について、2％NaCl加ＢＨＩ平板培地を用いて腎臓および脾臓より菌分離を行った。本菌による死亡か否かを分離菌と抗血清による凝集にて確認した結果、全ての死亡魚からの分離菌が抗血清と凝集した。このことから、本試験期間中に死亡した試験魚は、本菌感染を原因とするものであることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本菌培養時間と595nmにおける光学密度(OD)及び菌数(CFU/mL)との関係を示す図である。
【図２】本菌の対数増殖中期の菌体によるブリに対する病原性(生残率)を示す図である。
【図３】本菌の対数増殖後期の菌体によるブリに対する病原性(生残率)を示す図である。
【図４】本菌の定常期の菌体によるブリに対する病原性(生残率)を示す図である。
【図５】本菌の死滅期の菌体によるブリに対する病原性(生残率)を示す図である。
【図６】攻撃1(攻撃量2.0×104CFU/mL)における生残率を示す図である。
【図７】攻撃2(攻撃量4.0×104CFU/mL)における生残率を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は魚類類結節症ワクチン及びこれを用いた魚類類結節症の予防法に関する。
【背景技術】
【０００２】
類結節症は、ブリ、カンパチ、マダイ、ヒラメ等に春〜秋の比較的高水温期に発病する病気である。以前は、ブリ類にのみ発生が見られた疾病であったが、近年、養殖魚種拡大に伴い、感染魚種は広がりつつある。死亡率はほぼ１００％である。
【０００３】
類結節症の治療手段としては、アミノベンジルペニシリン、オキソリン酸、ホスホマイシン、ビコザマイシン、フロルフェニコール等の経口投与が行われているが、長期間の治療を必要とする為、経済的負担も大きく、一方で耐性菌出現も懸念される。
【０００４】
類結節症の原因菌はフォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシ−ダ(Photobacterium damselae subsp.piscicida)であることが判明している。しかし日本では現在までこれに対するワクチンは販売されていない。なお、フォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシ−ダはパスツレラ ピシシーダと呼ばれることもある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は魚類類結節症ワクチンを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで発明者は類結節症の原因菌であるフォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシ−ダの各種培養条件による病原性及びワクチン活性について検討してきたところ、全く意外にも定常期の菌体よりも対数増殖期の菌体を用いた場合に特にワクチン活性が高いことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、フォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシ−ダの対数増殖期の不活化菌体又はその成分を有効成分とする魚類類結節症ワクチンを提供するものである。
【０００８】
また本発明は、フォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシ−ダの対数増殖期の不活化菌体又はその成分を含有する魚類類結節症ワクチン組成物を提供するものである。
【０００９】
さらに本発明は、フォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシ−ダの対数増殖期の不活化菌体又はその成分の有効量を投与することを特徴とする魚類類結節症の予防法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のワクチンを用いれば、ブリ、カンパチ等のブリ属魚類、マダイ、ヒラメ等の類結節症が効率的に予防できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のワクチンは、フォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシ−ダ(以下本菌ということがある)の対数増殖期の不活化菌体又はその成分を用いる。通常、細菌を培養した場合、誘導期、対数増殖期、定常期、死滅期及び生残期に分けられる。
【００１２】
本発明のワクチンに用いる菌体は、本菌を常法により培養し、対数増殖期に採取することにより得られる。本菌の培養は、本菌を適当な培地に接種し常法に従って培養すればよい。培養中には、資化し得る炭素源及び窒素源を適当量含有させておくのが好ましい。
【００１３】
この炭素源及び窒素源については特に制限はないが、その例としては、窒素源としてトリプトン、各種動物血清、コーングルテンミール、大豆粉、コーンスチープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、イワシミール、肉エキス、ペプトン、ハイプロ、アジパワー、コーンミール、ソイビーンミール、コーヒー粕、綿実油粕、カルチベータ、アミフレックス及びアジプロン、ゼスト、アジックスなどが挙げられる。また、炭素源としては資化し得る炭素源、例えば、アラビノース、キシロース、グルコース、マンノース、蔗糖、麦芽糖、可溶性デンプン、乳糖、廃糖蜜や資化し得る有機酸、例えば酢酸等が挙げられる。また、その他、リン酸、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Co2+、Na+、K+等の無機塩や、必要であれば、無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加することもできる。
またNaCl濃度を2.0%に調製したBHI培地を用いることもできる。
【００１４】
培養条件は、NaCl濃度2.0％、pH7.2〜7.6、25℃とするのが好ましい。
【００１５】
本菌が対数増殖期にあるか否かの確認は、595nmでの光学密度を測定することにより行われる。すなわち595nmでの光学密度が急激に上昇する時期が対数増殖期である。例えばpH7.2、25℃で培養した場合、培養12〜24時間が対数増殖期である。
【００１６】
対数増殖期にある本菌を遠心分離、濾過等により分離するか、培養物をそのまま不活化する。不活化処理としては加熱処理、ホルマリン処理等が挙げられる。
【００１７】
本菌の成分には、菌体の膜成分及び分泌物が含まれる。これらの成分を採取するには、不活化菌体の超音波破砕等により行うのが好ましい。
【００１８】
得られた不活化菌体又はその成分は、濾過、エバポレーション、濃縮、凍結乾燥等により濃縮して用いるのが好ましい。
【００１９】
本菌の不活化菌体又はその成分は、そのままワクチンとして使用してもよいが、薬学的に許容される液状又は固体状の担体とともにワクチン組成物として使用してもよい。当該ワクチン組成物の形態としては注射用組成物、経口投与組成物、魚類浸漬用組成物、飼料組成物等が挙げられる。液状の担体としては、リン酸緩衝液が挙げられる。固体状の担体としては、タルク、シュークロースなどの賦形剤が挙げられる。飼料組成物とするには、通常の魚類の飼料に本菌の不活化菌体又はその成分を混合すればよい。また、これらのワクチン組成物にはアジュバントを添加して抗原性を高めてもよい。
【００２０】
本発明のワクチン又はワクチン組成物の投与は、成魚でもよいが類結節症に罹患する前、例えば稚魚の段階が好ましい。その投与量は、１尾あたり不活化菌又はその成分として約１０8〜１０10CFUが好ましい。投与回数は1回でもよいが、２回が好ましく、また、２回目の投与までの間隔は３週間以上あけてから接種したほうが良い。
【００２１】
本発明のワクチン又はワクチン組成物の対象魚種としては、本菌による類結節症になる魚類であれば制限されず、例えばブリ、カンパチ等のブリ属魚類の他、マダイ、ヒラメ等が挙げられる。
【実施例】
【００２２】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【００２３】
実施例１
(1) フォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシ−ダP3529(以下でもこの株を使用した。)の凍結保存した菌0.2mLを200mLの2％NaCl加BHI液体培地に接種し25℃で静置培養した。培養時間と菌体数及び595nmにおける光学密度(OD)との関係を図1に示す。図1から明らかなように、本菌は0〜12時間までが誘導期であり、12〜20時間までが対数増殖期であり、20時間以降が定常期であることがわかる。
【００２４】
(2) 本菌の各種培養条件によるブリに対する病原性の差異について検討した。すなわち、対数増殖中期、対数増殖後期、定常期及び死滅期の本菌をブリ1尾あたり103〜105CFUとなるように腹腔内注射し、病原性を検討した。なお、対照としたブリは20〜24gであり、水槽の温度は25℃とした。その結果、図2、3、4及び5に示すように、生残率が、対数増殖中期の本菌感染群では25.0〜6.6％、対数増殖後期では13.3〜1.6％、定常期では53.3〜26.7％、死滅期では80.0〜43.3％であり、対数増殖後期の菌の病原性が高いことが判明した。
【００２５】
実施例２
フォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシ−ダP3529の0.2mLを三角フラスコ中で200mLの2%NaCl加BHI培地に接種し、25℃で培養した。OD595nmが0.85から0.95のものを対数増殖菌体として用いた。すなわち、培養19〜21時間の間の培養物を0.3％ホルマリン中で25℃、1日間インキュベーションして不活化菌体とし、次いで4℃で8,000〜10,000×ｇで遠心分離して菌体を採取した。得られた菌体をさらに0.3％ホルマリン生理食塩水に再懸濁し、本菌の不活化菌体を含むワクチン組成物を得た。また、対照として培養32時間後（OD595nm＝0.95）の培養物を同様に不活化して定常期不活化菌体を含むワクチン組成物を得た。
【００２６】
平均体重23.6gのブリに、上記で得たワクチン組成物を用いてワクチン効果を検討した。すなわち、ワクチンを1尾あたり0.1mL腹腔内注射し、2週間免疫活性を上昇させる為に飼育した。
2週間後、これらの免疫したブリに対して腹腔内注射攻撃試験を行った。対照として等量のＰＢＳを腹腔内注射したブリを同様に試験に供試した。なお、攻撃菌には、対数増殖期及び定常期の菌体を用いた。その結果を表1、図6及び7に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】
その結果、対数増殖期群が定常期群及び対照群に対して生存率に有意差があり、ワクチンとして有用であることが判明した。
【００２９】
本試験期間中に死亡魚について、2％NaCl加ＢＨＩ平板培地を用いて腎臓および脾臓より菌分離を行った。本菌による死亡か否かを分離菌と抗血清による凝集にて確認した結果、全ての死亡魚からの分離菌が抗血清と凝集した。このことから、本試験期間中に死亡した試験魚は、本菌感染を原因とするものであることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本菌培養時間と595nmにおける光学密度(OD)及び菌数(CFU/mL)との関係を示す図である。
【図２】本菌の対数増殖中期の菌体によるブリに対する病原性(生残率)を示す図である。
【図３】本菌の対数増殖後期の菌体によるブリに対する病原性(生残率)を示す図である。
【図４】本菌の定常期の菌体によるブリに対する病原性(生残率)を示す図である。
【図５】本菌の死滅期の菌体によるブリに対する病原性(生残率)を示す図である。
【図６】攻撃1(攻撃量2.0×104CFU/mL)における生残率を示す図である。
【図７】攻撃2(攻撃量4.0×104CFU/mL)における生残率を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシーダの対数増殖期の不活化菌体又はその成分を有効成分とする魚類類結節症ワクチン。
【請求項２】
フォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシーダの対数増殖期の不活化菌体又はその成分を含有する魚類類結節症ワクチン組成物。
【請求項３】
フォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシーダの対数増殖期の不活化菌体又はその成分の有効量を投与することを特徴とする魚類類結節症の予防法。
【請求項１】
フォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシーダの対数増殖期の不活化菌体又はその成分を有効成分とする魚類類結節症ワクチン。
【請求項２】
フォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシーダの対数増殖期の不活化菌体又はその成分を含有する魚類類結節症ワクチン組成物。
【請求項３】
フォトバクテリウム ダムセラ サブスピース ピシシーダの対数増殖期の不活化菌体又はその成分の有効量を投与することを特徴とする魚類類結節症の予防法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００６−１８４９（Ｐ２００６−１８４９Ａ）
【公開日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−１７７６８３（Ｐ２００４−１７７６８３）
【出願日】平成１６年６月１６日（２００４．６．１６）
【出願人】（５０４１７４１８０）国立大学法人高知大学 (174)
【出願人】（５９１０２４６３８）川崎三鷹製薬株式会社 (5)
【出願人】（５０４２３２１９２）財団法人 松岡科学研究所 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月１６日（２００４．６．１６）
【出願人】（５０４１７４１８０）国立大学法人高知大学 (174)
【出願人】（５９１０２４６３８）川崎三鷹製薬株式会社 (5)
【出願人】（５０４２３２１９２）財団法人 松岡科学研究所 (1)
【Ｆターム（参考）】
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