麹菌、その育種法及び醤油の製造法
【課題】１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌を育種する。また、その麹菌を用いて窒素利用率が高く、総窒素及びグルタミン酸含量の多い醤油を得る。
【解決手段】アスペルギルス属に属する菌株に、重イオンビームを照射し、その照射体又はその培養物から、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌を分離し、課題の麹菌を得る。また、該麹菌を醤油麹原料に接種培養して麹を造り、この麹を用いて仕込みを行ない課題の醤油を得る。
【解決手段】アスペルギルス属に属する菌株に、重イオンビームを照射し、その照射体又はその培養物から、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌を分離し、課題の麹菌を得る。また、該麹菌を醤油麹原料に接種培養して麹を造り、この麹を用いて仕込みを行ない課題の醤油を得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌、その育種法に関する。また該麹菌を用いて総窒素及びグルタミン酸含量の多い醤油を得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
醤油はアミノ酸やペプチドを呈味成分とする調味料であるために、醤油の醸造において、窒素の利用率を向上して、呈味成分として重要なアミノ酸及びペプチドの生成量を多くし、またグルタミン酸の生成量を多くして旨味の強い醤油を得る意義は大きく、そのため強力なプロテアーゼ及びグルタミナーゼを生産し得る麹菌の出現が醤油業界にとって強く望まれていた。
【０００３】
しかしながら、高濃度食塩水中で原料の酵素分解を行う醤油の製造法において、醤油諸味中に窒素、ペプチド及びグルタミン酸を著量遊離蓄積せしめることは、極めて困難である。この解決法の一つとして従来から酵素作用の阻害を考慮して仕込み当初の食塩水濃度を調節したり、あるいは諸味中に種々の微生物起源のグルタミナーゼを添加したりして、醤油諸味中に窒素及びグルタミン酸などを著量蓄積せしめようとする方法が行われているが、いずれも余分な工程を必要とし、操作が煩雑となり、特に後者のグルタミナーゼを添加する方法は、酵素製造のための設備費と人件費が余分にかかり、経済的に必ずしも得策ではない。
【０００４】
本発明者らは、以上の現状を考慮して、醤油諸味中に著量の窒素とグルタミン酸を遊離蓄積する能力を有する醤油麹菌を取得し、この麹菌を用いて醤油麹を造り、これを食塩水に仕込み、醤油諸味中に著量の窒素及びグルタミン酸を生成蓄積させることができれば、醤油業界にとって極めて大きな貢献となることに着目し、多くの麹菌を対象として、プロテアーゼ生産能が高く、しかもグルタミナーゼ生産能も高い麹菌の育種法について検討した。
【０００５】
一般に醤油の製造に使用されている麹菌は、５００〜６５０Ｕ（単位又はユニットともいうことがある）／ｇ麹の高いプロテアーゼ生産能を有する菌株はグルタミナーゼ生産能が０．２５〜１．５Ｕ／ｇ麹のように低く、また３．０〜８．０Ｕ／ｇ麹の高いグルタミナーゼ生産能を有する菌株はプロテアーゼ生産能が１００〜４００Ｕ／ｇ麹のように低いという傾向があった（図１参照）。
このため、これまでの醤油の製造では、プロテアーゼ生産能の高い菌株を使用すると、醤油原料の可溶性窒素の溶解利用率は向上するが、グルタミナーゼ生産能が低いために諸味液汁におけるグルタミン酸の生成が少なく、旨味の豊富な醤油が得がたい傾向あり、またグルタミナーゼ生産能の高い菌株を使用すると、プロテアーゼ生産能が低いために醤油の可溶性窒素の溶解利用率を向上することができない問題点を有していた。
【０００６】
これまで、プロテアーゼ生産能及びグルタミナーゼ生産能の高い、優秀な麹菌を得るために、麹菌を人工変異処理することが試みられたが（特許文献１）、この方法では、得られる変異株は、アルカリプロテアーゼ生産能が親株（元株）に比べて約３倍以上向上するが、反対にグルタミナーゼ生産能は半分以下に減少することが知られており、グルタミナーゼ生産能を殆ど低下させることなくプロテアーゼ生産能を顕著に向上した変異株を育種することは非常に困難であった。
【０００７】
従来この欠点を解消する方法として、アスペルギルス・ソーヤに属する、高プロテアーゼ生産株と高グルタミナーゼ生産株とをプロトプラスト融合させ、該融合２倍体株を半数体化処理して、課題の変異株を取得する方法（例えば特許文献２参照）が知られている。
しかし、この方法においては、６５０Ｕ／ｇ麹よりも高いプロテアーゼ生産能及び３．５Ｕ／ｇ麹よりも高いグルタミナーゼ生産能を有する麹菌を育種できることが記載されているが、得られた麹菌は、プロテアーゼ生産能については最も高くても６７３Ｕ／ｇ麹の生産能を有するアスペルギルス・ソーヤＢｅｎ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−７５２２）であって、これ以上の高プロテアーゼ生産能を有する麹菌の育種については知られていない。
【特許文献１】特公平３−３７，９１３号公報
【特許文献２】特公平３−７３，２７１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、１，１００Ｕ／ｇ麹よりも高いプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上グルタミナーゼ生産能を有する麹菌を育種することを課題とする。また、その麹菌を用いて総窒素及びグルタミン酸含量の多い醤油を得ることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意研究を重ねた結果、アスペルギルス属に属しグルタミナーゼ生産能の高い菌株（例えばアスペルギルス・ソーヤ ＡＴＣＣ４２２５１）の分生子にC、Ｎｅ、Ｈｅなどをイオン源とした重イオンビームを照射すると、得られた分生子の中に、グルタミナーゼ生産能が高く、しかも親株に比べてプロテアーゼ生産能が著しく高い菌株のあることを発見し、この知見に基づいて本発明を完成した。
【００１０】
本発明は、以下に示す麹菌及びその育種法である。
（１）アスペルギルス属に属する菌株であって、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌。
（２）アスペルギルス属する菌株が、アスペルギルス・ソーヤに属する菌株である前記（１）に記載の麹菌。
（３）アスペルギルス・ソーヤに属する菌株がアスペルギルス・ソーヤ Ｉ６７−１（ＮＩＴＥ ＡＰ−４３０）である前記（２）に記載の麹菌。
（４）アスペルギルス属に属する菌株に、重イオンビームを照射し、その照射体又はその培養物から、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌を分離することを特徴とする麹菌の育種法。
（５）アスペルギルス属に属する菌株に、重イオンビームを照射し、その照射体又はその培養物から、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌を分離し、得られた麹菌を醤油麹原料に接種培養して麹を造り、この麹を用いて仕込みを行うことを特徴とする醤油の製造法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌を得ることができる。またこの麹菌によれば、窒素利用率が高く、総窒素及びグルタミン酸含量の多い醤油を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
アスペルギルス属に属する菌株としては、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ等に属する任意の菌株が挙げられるが、そのうちグルタミナーゼ生産能の高い、アスペルギルス・ソーヤ及びアスペルギルス・オリゼに属する黄麹菌が好ましい。
このような菌株としては、従来の醤油、味噌又は清酒の醸造に使用する麹菌の中から２．５Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する菌株を分離することによって入手することができる。このほか、アスペルギルス・ソーヤ ２６２（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８８）、アスペルギルス・ソーヤ ２１６５（ＦＥＲＭ Ｐ−７２８０）及びアスペルギルス・オリゼ（ＩＡＭ２６３８）、アスペルギルス・ソーヤ ＡＴＣＣ４２２５１の各菌株等を利用することができる。
【００１３】
次に、重イオンビームを照射するには、上記菌株の胞子懸濁液を、通常の寒天平板培養培地、例えばマルツ培地（マルツエキス９％、酵母エキス０．５％、寒天２％ ｐＨ６）等に０．２〜２０×１０6個塗布し、12Ｃ5+をイオン源として２５〜２，５００Ｇｙの強度で照射を行う。
この重イオンビームの照射は、例えば独立行政法人日本原子力研究開発機構 高崎量子応用研究所のＴＩＡＲＡを用いることができる。
【００１４】
照射後は、同培地で２５〜３５℃で２〜６日間培養し、分生子を着生させ、この分生子を回収し、カゼインプレートによる高プロテアーゼ変異株のスクリーニングを行なう。
【００１５】
このようにして、培養物から、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌を分離する。
【００１６】
このようにして、本発明によれば目的とする麹菌、アスペルギルス・ソーヤ I６７−１（ＮＩＴＥ ＡＰ−４３０）を容易に得ることができる。
【００１７】
次に、こうして得られた麹菌を、通常の醤油麹原料に接種培養して麹をつくる。
例えば、撒水し、蒸煮した大豆と炒熬割砕した小麦の混合物にアスペルギルス・ソーヤ Ｉ６７−１（ＮＩＴＥ ＡＰ−４３０）を接種混合し、２５〜３５℃で３〜４日培養し、醤油麹をつくる。なお、醤油麹原料としては醤油の製造に用いることが知られている全ての原料を使用することができる。
【００１８】
次に、上記醤油麹を醤油醸造における通常の仕込み割合にて適当濃度の食塩水に仕込み、醤油醸造の常法に従い、適宜攪拌して３〜６カ月間発酵熟成を行ない、水溶性窒素及びグルタミン酸を著量含有する醤油諸味を得る。
【００１９】
次に上記のようにして得られた熟成諸味は、通常の圧搾、濾過、火入、オリ引き等を行って製品醤油とする。
【００２０】
なお、プロテアーゼ活性及びグルタミナーゼ活性の測定法は、以下の方法による。
（プロテアーゼ活性の測定法）
麹に１０倍量の蒸留水を加え、よく混合し、２時間室温で放置した。これをＮＯ．２の濾紙（アドバンテック社製）で濾過し、得られた抽出液を酵素サンプルとして、「しょうゆ試験法」（財団法人 日本醤油研究所 昭和６０年）に記載の方法に従って測定した。
表１及び図１のプロテアーゼ活性は、麹１ｇ当り１分間に１μモルのチロシンを生成する活性を１Ｕ（ユニット又は単位）として示した。
【００２１】
（グルタミナーゼ活性の測定法）
麹に５０倍量の蒸留水を加え、ポリトロンで１分間破砕したものを酵素サンプルとした。この酵素サンプル７ｍｌに０．１Ｍ Ｌ−グルタミン溶液（１Ｍトリス、０．１Ｍ塩酸ヒドロキシアミン ｐＨ８）５ｍｌを加え、よく混合した後、３０℃で１時間反応させた。反応は、停止液（５０ｇ塩化第二鉄／１０００ｍｌ８．４Ｎ塩酸）２ｍｌを入れることで停止した。この液をＮＯ．５Ｃの濾紙（アドバンテック社製）で濾過した。この濾液の吸光度を４２０ｎｍで測定した。活性は、テストの吸光度から酵素ブランク、水ブランクの吸光度を引いた後、係数として６．０３をかけてＵ／ｇ麹とした。表１及び図１のグルタミナーゼ活性は、麹１ｇ当り１分間に１μモルのグルタミン酸量を生成する活性を１Ｕ（ユニット又は単位）として示した。
【００２２】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、何らこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２３】
（重イオンビーム照射に麹菌の育種）
親株としてアスペルギルス・ソーヤＡＴＣＣ４２２５１を使用した。
この菌株は、５５１単位／ｇ麹のプロテアーゼ生産能を有し、２．６２単位／ｇ麹のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌であった。
この菌株の分生子をマルツ培地（マルツエキス９％、酵母エキス０．５％、寒天２％ ｐＨ６）に約２×１０6個塗布し、12Ｃ5+をイオン源として２５０Ｇｙの強度で照射を行った。
重イオンビームの照射は独立行政法人日本原子力研究開発機構 高崎量子応用研究所のＴＩＡＲＡを用いて行った。
照射後、３０℃で４日間培養し、分生子を着生させた。この分生子を回収し、カゼインプレートによる高プロテアーゼ変異株のスクリーニングを行った。
【００２４】
（カゼイン培地によるスクリーニング）
回収した分生子を約４００個／ｍｌになるように滅菌水で希釈し、この希釈液を５０μｌずつカゼイン培地（ミルクカゼイン０．４％、カザミノ酸０．０５％、リン酸１カリウム０．３６％、リン酸２ナトリウム１．４３％、硫酸マグネシウム０．５％、硫酸第二鉄０．００２％、寒天２％ ｐH６．５）に塗布し、３０℃で４日間培養した。
培養後、コロニーの周りにできるクリアゾーンの大きい株を選択し、アスペルギルス・ソーヤ Ｉ６７−１（ＮＩＴＥ ＡＰ−４３０）を育種した。
この麹菌株は、１，９２９Ｕ／ｇ麹のプロテアーゼ生産能を有し且つ２．３８Ｕ／ｇ麹のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌であった。
【実施例２】
【００２５】
（醤油麹の製造例）
蒸煮した脱脂大豆と炒熬割砕小麦を５０：５０の割合で混合し、ここに種麹０．１％（ｗ／ｗ）加え、３日麹で製麹し、得られた醤油麹の分析結果を表１に示す。なお、Ｂｅｎ−１、ＰＦＡ−１１８は特公平３−７３，２７１号に記載の菌株であり、データも同特許から転載した。
【００２６】
【表１】
【００２７】
表１の結果から、本発明によれば、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌が得られることが判る。
【実施例３】
【００２８】
（醤油麹の消化度試験）
実施例２で得られた醤油麹の消化度を常法により測定した。結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】
表２の結果から、アスペルギルス・ソーヤＩ６７−１の麹菌は他の菌株よりも高い消化度を示すことがわかる。このことから本発明によれば、醤油原料の窒素利用率が高く、高窒素濃度の醤油を製造できることが判る。
【実施例４】
【００３１】
（醤油の製造例）
上記実施例１で得られた本発明の麹菌アスペルギルス・ソーヤＩ６７−１(本発明株）を用いて以下の通り醤油の製造試験を行った。また比較のため、本発明株に代えて、その親株アスペルギルス・ソーヤＡＴＣＣ４２２５１を用いる以外は全く同様にして醤油の製造試験を行った。
蒸煮した脱脂大豆と炒熬割砕小麦を５０：５０の割合で混合し、ここに種麹０．１％（ｗ／ｗ）加え、３日麹で製麹し、通常の醤油の製造法にしたがって、醤油麹と食塩水を混和して仕込み、３０℃で５カ月発酵熟成させ、圧搾して醤油を得た。得られた醤油について、総窒素％（ｗ／ｖ）（ＴＮと略記する）、グルタミン酸％（ｗ／ｖ）（Ｇｌｕと略記する）、Ｇｌｕ／ＴＮ及び窒素利用率（％）を測定した。
その結果を表３に示す。
【００３２】
【表３】
【００３３】
表３の結果から、本発明で得られた麹菌（本発明株）を用いて製麹し、醤油を製造すると、醤油原料が頗るよく分解されて窒素利用率が、約３％も増大し、また総窒素濃度が高く、またグルタミン酸含量が多く、窒素そのものの質が向上し、非常に旨味の強い醤油を得ることが判る。
【実施例５】
【００３４】
（麹菌のプロテアーゼ生産能とグルタミナーゼ生産能の相関図）
麹菌アスペルギルス・ソーヤ ＡＴＣＣ４２２５１（親株）及び実施例１で育種した本発明の麹菌アスペルギルス・ソーヤ Ｉ６７−１（ＮＩＴＥ ＡＰ−４３０）のプロテアーゼ生産能とグルタミナーゼ生産能を測定し、図１を作製した。
また、比較のため、従来のアスペルギルス・ソーヤに属する麹菌（従来株）のプロテアーゼ生産能とグルタミナーゼ生産能の関係を調べた。その結果を図１に合わせて記載した。
【００３５】
図１の結果から、従来公知の麹菌は、５００〜６５０Ｕ／ｇ麹の高いプロテアーゼ生産能を有する菌株はグルタミナーゼ生産能が０．２５〜１．５Ｕ／ｇ麹のように低く、また３．０〜８．０Ｕ／ｇ麹の高いグルタミナーゼ生産能を有する菌株はプロテアーゼ生産能が１００〜４００Ｕ／ｇ麹のように低いという傾向があることが判る。また、アスペルギルス・ソーヤに属する、高プロテアーゼ生産能株と高グルタミナーゼ生産株とをプロトプラスト融合させ、該融合２倍体株を半数体化処理すると、６５０単位／ｇ麹よりも高いプロテアーゼ生産能及び３．５単位／ｇ麹よりも高いグルタミナーゼ生産能を有する麹菌を育種できることが判る。しかし、得られた麹菌は、プロテアーゼ生産能については最も高くても６７３単位／ｇ麹の生産能を有するアスペルギルス・ソーヤＢｅｎ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−７５２２）であることが判る。これに対し、本発明によれば１，１００Ｕ／ｇ麹よりも高いプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌を得ることが判る。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、各麹菌のプロテアーゼ生産能とグルタミナーゼ生産能の相関を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌、その育種法に関する。また該麹菌を用いて総窒素及びグルタミン酸含量の多い醤油を得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
醤油はアミノ酸やペプチドを呈味成分とする調味料であるために、醤油の醸造において、窒素の利用率を向上して、呈味成分として重要なアミノ酸及びペプチドの生成量を多くし、またグルタミン酸の生成量を多くして旨味の強い醤油を得る意義は大きく、そのため強力なプロテアーゼ及びグルタミナーゼを生産し得る麹菌の出現が醤油業界にとって強く望まれていた。
【０００３】
しかしながら、高濃度食塩水中で原料の酵素分解を行う醤油の製造法において、醤油諸味中に窒素、ペプチド及びグルタミン酸を著量遊離蓄積せしめることは、極めて困難である。この解決法の一つとして従来から酵素作用の阻害を考慮して仕込み当初の食塩水濃度を調節したり、あるいは諸味中に種々の微生物起源のグルタミナーゼを添加したりして、醤油諸味中に窒素及びグルタミン酸などを著量蓄積せしめようとする方法が行われているが、いずれも余分な工程を必要とし、操作が煩雑となり、特に後者のグルタミナーゼを添加する方法は、酵素製造のための設備費と人件費が余分にかかり、経済的に必ずしも得策ではない。
【０００４】
本発明者らは、以上の現状を考慮して、醤油諸味中に著量の窒素とグルタミン酸を遊離蓄積する能力を有する醤油麹菌を取得し、この麹菌を用いて醤油麹を造り、これを食塩水に仕込み、醤油諸味中に著量の窒素及びグルタミン酸を生成蓄積させることができれば、醤油業界にとって極めて大きな貢献となることに着目し、多くの麹菌を対象として、プロテアーゼ生産能が高く、しかもグルタミナーゼ生産能も高い麹菌の育種法について検討した。
【０００５】
一般に醤油の製造に使用されている麹菌は、５００〜６５０Ｕ（単位又はユニットともいうことがある）／ｇ麹の高いプロテアーゼ生産能を有する菌株はグルタミナーゼ生産能が０．２５〜１．５Ｕ／ｇ麹のように低く、また３．０〜８．０Ｕ／ｇ麹の高いグルタミナーゼ生産能を有する菌株はプロテアーゼ生産能が１００〜４００Ｕ／ｇ麹のように低いという傾向があった（図１参照）。
このため、これまでの醤油の製造では、プロテアーゼ生産能の高い菌株を使用すると、醤油原料の可溶性窒素の溶解利用率は向上するが、グルタミナーゼ生産能が低いために諸味液汁におけるグルタミン酸の生成が少なく、旨味の豊富な醤油が得がたい傾向あり、またグルタミナーゼ生産能の高い菌株を使用すると、プロテアーゼ生産能が低いために醤油の可溶性窒素の溶解利用率を向上することができない問題点を有していた。
【０００６】
これまで、プロテアーゼ生産能及びグルタミナーゼ生産能の高い、優秀な麹菌を得るために、麹菌を人工変異処理することが試みられたが（特許文献１）、この方法では、得られる変異株は、アルカリプロテアーゼ生産能が親株（元株）に比べて約３倍以上向上するが、反対にグルタミナーゼ生産能は半分以下に減少することが知られており、グルタミナーゼ生産能を殆ど低下させることなくプロテアーゼ生産能を顕著に向上した変異株を育種することは非常に困難であった。
【０００７】
従来この欠点を解消する方法として、アスペルギルス・ソーヤに属する、高プロテアーゼ生産株と高グルタミナーゼ生産株とをプロトプラスト融合させ、該融合２倍体株を半数体化処理して、課題の変異株を取得する方法（例えば特許文献２参照）が知られている。
しかし、この方法においては、６５０Ｕ／ｇ麹よりも高いプロテアーゼ生産能及び３．５Ｕ／ｇ麹よりも高いグルタミナーゼ生産能を有する麹菌を育種できることが記載されているが、得られた麹菌は、プロテアーゼ生産能については最も高くても６７３Ｕ／ｇ麹の生産能を有するアスペルギルス・ソーヤＢｅｎ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−７５２２）であって、これ以上の高プロテアーゼ生産能を有する麹菌の育種については知られていない。
【特許文献１】特公平３−３７，９１３号公報
【特許文献２】特公平３−７３，２７１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、１，１００Ｕ／ｇ麹よりも高いプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上グルタミナーゼ生産能を有する麹菌を育種することを課題とする。また、その麹菌を用いて総窒素及びグルタミン酸含量の多い醤油を得ることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意研究を重ねた結果、アスペルギルス属に属しグルタミナーゼ生産能の高い菌株（例えばアスペルギルス・ソーヤ ＡＴＣＣ４２２５１）の分生子にC、Ｎｅ、Ｈｅなどをイオン源とした重イオンビームを照射すると、得られた分生子の中に、グルタミナーゼ生産能が高く、しかも親株に比べてプロテアーゼ生産能が著しく高い菌株のあることを発見し、この知見に基づいて本発明を完成した。
【００１０】
本発明は、以下に示す麹菌及びその育種法である。
（１）アスペルギルス属に属する菌株であって、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌。
（２）アスペルギルス属する菌株が、アスペルギルス・ソーヤに属する菌株である前記（１）に記載の麹菌。
（３）アスペルギルス・ソーヤに属する菌株がアスペルギルス・ソーヤ Ｉ６７−１（ＮＩＴＥ ＡＰ−４３０）である前記（２）に記載の麹菌。
（４）アスペルギルス属に属する菌株に、重イオンビームを照射し、その照射体又はその培養物から、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌を分離することを特徴とする麹菌の育種法。
（５）アスペルギルス属に属する菌株に、重イオンビームを照射し、その照射体又はその培養物から、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌を分離し、得られた麹菌を醤油麹原料に接種培養して麹を造り、この麹を用いて仕込みを行うことを特徴とする醤油の製造法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌を得ることができる。またこの麹菌によれば、窒素利用率が高く、総窒素及びグルタミン酸含量の多い醤油を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
アスペルギルス属に属する菌株としては、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ等に属する任意の菌株が挙げられるが、そのうちグルタミナーゼ生産能の高い、アスペルギルス・ソーヤ及びアスペルギルス・オリゼに属する黄麹菌が好ましい。
このような菌株としては、従来の醤油、味噌又は清酒の醸造に使用する麹菌の中から２．５Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する菌株を分離することによって入手することができる。このほか、アスペルギルス・ソーヤ ２６２（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８８）、アスペルギルス・ソーヤ ２１６５（ＦＥＲＭ Ｐ−７２８０）及びアスペルギルス・オリゼ（ＩＡＭ２６３８）、アスペルギルス・ソーヤ ＡＴＣＣ４２２５１の各菌株等を利用することができる。
【００１３】
次に、重イオンビームを照射するには、上記菌株の胞子懸濁液を、通常の寒天平板培養培地、例えばマルツ培地（マルツエキス９％、酵母エキス０．５％、寒天２％ ｐＨ６）等に０．２〜２０×１０6個塗布し、12Ｃ5+をイオン源として２５〜２，５００Ｇｙの強度で照射を行う。
この重イオンビームの照射は、例えば独立行政法人日本原子力研究開発機構 高崎量子応用研究所のＴＩＡＲＡを用いることができる。
【００１４】
照射後は、同培地で２５〜３５℃で２〜６日間培養し、分生子を着生させ、この分生子を回収し、カゼインプレートによる高プロテアーゼ変異株のスクリーニングを行なう。
【００１５】
このようにして、培養物から、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌を分離する。
【００１６】
このようにして、本発明によれば目的とする麹菌、アスペルギルス・ソーヤ I６７−１（ＮＩＴＥ ＡＰ−４３０）を容易に得ることができる。
【００１７】
次に、こうして得られた麹菌を、通常の醤油麹原料に接種培養して麹をつくる。
例えば、撒水し、蒸煮した大豆と炒熬割砕した小麦の混合物にアスペルギルス・ソーヤ Ｉ６７−１（ＮＩＴＥ ＡＰ−４３０）を接種混合し、２５〜３５℃で３〜４日培養し、醤油麹をつくる。なお、醤油麹原料としては醤油の製造に用いることが知られている全ての原料を使用することができる。
【００１８】
次に、上記醤油麹を醤油醸造における通常の仕込み割合にて適当濃度の食塩水に仕込み、醤油醸造の常法に従い、適宜攪拌して３〜６カ月間発酵熟成を行ない、水溶性窒素及びグルタミン酸を著量含有する醤油諸味を得る。
【００１９】
次に上記のようにして得られた熟成諸味は、通常の圧搾、濾過、火入、オリ引き等を行って製品醤油とする。
【００２０】
なお、プロテアーゼ活性及びグルタミナーゼ活性の測定法は、以下の方法による。
（プロテアーゼ活性の測定法）
麹に１０倍量の蒸留水を加え、よく混合し、２時間室温で放置した。これをＮＯ．２の濾紙（アドバンテック社製）で濾過し、得られた抽出液を酵素サンプルとして、「しょうゆ試験法」（財団法人 日本醤油研究所 昭和６０年）に記載の方法に従って測定した。
表１及び図１のプロテアーゼ活性は、麹１ｇ当り１分間に１μモルのチロシンを生成する活性を１Ｕ（ユニット又は単位）として示した。
【００２１】
（グルタミナーゼ活性の測定法）
麹に５０倍量の蒸留水を加え、ポリトロンで１分間破砕したものを酵素サンプルとした。この酵素サンプル７ｍｌに０．１Ｍ Ｌ−グルタミン溶液（１Ｍトリス、０．１Ｍ塩酸ヒドロキシアミン ｐＨ８）５ｍｌを加え、よく混合した後、３０℃で１時間反応させた。反応は、停止液（５０ｇ塩化第二鉄／１０００ｍｌ８．４Ｎ塩酸）２ｍｌを入れることで停止した。この液をＮＯ．５Ｃの濾紙（アドバンテック社製）で濾過した。この濾液の吸光度を４２０ｎｍで測定した。活性は、テストの吸光度から酵素ブランク、水ブランクの吸光度を引いた後、係数として６．０３をかけてＵ／ｇ麹とした。表１及び図１のグルタミナーゼ活性は、麹１ｇ当り１分間に１μモルのグルタミン酸量を生成する活性を１Ｕ（ユニット又は単位）として示した。
【００２２】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、何らこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２３】
（重イオンビーム照射に麹菌の育種）
親株としてアスペルギルス・ソーヤＡＴＣＣ４２２５１を使用した。
この菌株は、５５１単位／ｇ麹のプロテアーゼ生産能を有し、２．６２単位／ｇ麹のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌であった。
この菌株の分生子をマルツ培地（マルツエキス９％、酵母エキス０．５％、寒天２％ ｐＨ６）に約２×１０6個塗布し、12Ｃ5+をイオン源として２５０Ｇｙの強度で照射を行った。
重イオンビームの照射は独立行政法人日本原子力研究開発機構 高崎量子応用研究所のＴＩＡＲＡを用いて行った。
照射後、３０℃で４日間培養し、分生子を着生させた。この分生子を回収し、カゼインプレートによる高プロテアーゼ変異株のスクリーニングを行った。
【００２４】
（カゼイン培地によるスクリーニング）
回収した分生子を約４００個／ｍｌになるように滅菌水で希釈し、この希釈液を５０μｌずつカゼイン培地（ミルクカゼイン０．４％、カザミノ酸０．０５％、リン酸１カリウム０．３６％、リン酸２ナトリウム１．４３％、硫酸マグネシウム０．５％、硫酸第二鉄０．００２％、寒天２％ ｐH６．５）に塗布し、３０℃で４日間培養した。
培養後、コロニーの周りにできるクリアゾーンの大きい株を選択し、アスペルギルス・ソーヤ Ｉ６７−１（ＮＩＴＥ ＡＰ−４３０）を育種した。
この麹菌株は、１，９２９Ｕ／ｇ麹のプロテアーゼ生産能を有し且つ２．３８Ｕ／ｇ麹のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌であった。
【実施例２】
【００２５】
（醤油麹の製造例）
蒸煮した脱脂大豆と炒熬割砕小麦を５０：５０の割合で混合し、ここに種麹０．１％（ｗ／ｗ）加え、３日麹で製麹し、得られた醤油麹の分析結果を表１に示す。なお、Ｂｅｎ−１、ＰＦＡ−１１８は特公平３−７３，２７１号に記載の菌株であり、データも同特許から転載した。
【００２６】
【表１】
【００２７】
表１の結果から、本発明によれば、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌が得られることが判る。
【実施例３】
【００２８】
（醤油麹の消化度試験）
実施例２で得られた醤油麹の消化度を常法により測定した。結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】
表２の結果から、アスペルギルス・ソーヤＩ６７−１の麹菌は他の菌株よりも高い消化度を示すことがわかる。このことから本発明によれば、醤油原料の窒素利用率が高く、高窒素濃度の醤油を製造できることが判る。
【実施例４】
【００３１】
（醤油の製造例）
上記実施例１で得られた本発明の麹菌アスペルギルス・ソーヤＩ６７−１(本発明株）を用いて以下の通り醤油の製造試験を行った。また比較のため、本発明株に代えて、その親株アスペルギルス・ソーヤＡＴＣＣ４２２５１を用いる以外は全く同様にして醤油の製造試験を行った。
蒸煮した脱脂大豆と炒熬割砕小麦を５０：５０の割合で混合し、ここに種麹０．１％（ｗ／ｗ）加え、３日麹で製麹し、通常の醤油の製造法にしたがって、醤油麹と食塩水を混和して仕込み、３０℃で５カ月発酵熟成させ、圧搾して醤油を得た。得られた醤油について、総窒素％（ｗ／ｖ）（ＴＮと略記する）、グルタミン酸％（ｗ／ｖ）（Ｇｌｕと略記する）、Ｇｌｕ／ＴＮ及び窒素利用率（％）を測定した。
その結果を表３に示す。
【００３２】
【表３】
【００３３】
表３の結果から、本発明で得られた麹菌（本発明株）を用いて製麹し、醤油を製造すると、醤油原料が頗るよく分解されて窒素利用率が、約３％も増大し、また総窒素濃度が高く、またグルタミン酸含量が多く、窒素そのものの質が向上し、非常に旨味の強い醤油を得ることが判る。
【実施例５】
【００３４】
（麹菌のプロテアーゼ生産能とグルタミナーゼ生産能の相関図）
麹菌アスペルギルス・ソーヤ ＡＴＣＣ４２２５１（親株）及び実施例１で育種した本発明の麹菌アスペルギルス・ソーヤ Ｉ６７−１（ＮＩＴＥ ＡＰ−４３０）のプロテアーゼ生産能とグルタミナーゼ生産能を測定し、図１を作製した。
また、比較のため、従来のアスペルギルス・ソーヤに属する麹菌（従来株）のプロテアーゼ生産能とグルタミナーゼ生産能の関係を調べた。その結果を図１に合わせて記載した。
【００３５】
図１の結果から、従来公知の麹菌は、５００〜６５０Ｕ／ｇ麹の高いプロテアーゼ生産能を有する菌株はグルタミナーゼ生産能が０．２５〜１．５Ｕ／ｇ麹のように低く、また３．０〜８．０Ｕ／ｇ麹の高いグルタミナーゼ生産能を有する菌株はプロテアーゼ生産能が１００〜４００Ｕ／ｇ麹のように低いという傾向があることが判る。また、アスペルギルス・ソーヤに属する、高プロテアーゼ生産能株と高グルタミナーゼ生産株とをプロトプラスト融合させ、該融合２倍体株を半数体化処理すると、６５０単位／ｇ麹よりも高いプロテアーゼ生産能及び３．５単位／ｇ麹よりも高いグルタミナーゼ生産能を有する麹菌を育種できることが判る。しかし、得られた麹菌は、プロテアーゼ生産能については最も高くても６７３単位／ｇ麹の生産能を有するアスペルギルス・ソーヤＢｅｎ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−７５２２）であることが判る。これに対し、本発明によれば１，１００Ｕ／ｇ麹よりも高いプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌を得ることが判る。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、各麹菌のプロテアーゼ生産能とグルタミナーゼ生産能の相関を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスペルギルス属に属する菌株であって、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌。
【請求項２】
アスペルギルス属に属する菌株が、アスペルギルス・ソーヤに属する菌株である請求項１に記載の麹菌。
【請求項３】
アスペルギルス・ソーヤに属する菌株がアスペルギルス・ソーヤ Ｉ６７−１（ＮＩＴＥ ＡＰ−４３０）である請求項２に記載の麹菌。
【請求項４】
アスペルギルス属に属する菌株に、重イオンビームを照射し、その照射体又はその培養物から、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌を分離することを特徴とする麹菌の育種法。
【請求項５】
アスペルギルス属に属する菌株に、重イオンビームを照射し、その照射体又はその培養物から、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌を分離育種し、得られた麹菌を醤油麹原料に接種培養して麹を造り、この麹を用いて仕込みを行うことを特徴とする醤油の製造法。
【請求項１】
アスペルギルス属に属する菌株であって、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌。
【請求項２】
アスペルギルス属に属する菌株が、アスペルギルス・ソーヤに属する菌株である請求項１に記載の麹菌。
【請求項３】
アスペルギルス・ソーヤに属する菌株がアスペルギルス・ソーヤ Ｉ６７−１（ＮＩＴＥ ＡＰ−４３０）である請求項２に記載の麹菌。
【請求項４】
アスペルギルス属に属する菌株に、重イオンビームを照射し、その照射体又はその培養物から、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌を分離することを特徴とする麹菌の育種法。
【請求項５】
アスペルギルス属に属する菌株に、重イオンビームを照射し、その照射体又はその培養物から、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌を分離育種し、得られた麹菌を醤油麹原料に接種培養して麹を造り、この麹を用いて仕込みを行うことを特徴とする醤油の製造法。
【図１】
【公開番号】特開２００９−９５２７９（Ｐ２００９−９５２７９Ａ）
【公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２６９９５４（Ｐ２００７−２６９９５４）
【出願日】平成１９年１０月１７日（２００７．１０．１７）
【出願人】（０００００４４７７）キッコーマン株式会社 (212)
【出願人】（５０５３７４７８３）独立行政法人 日本原子力研究開発機構 (727)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月１７日（２００７．１０．１７）
【出願人】（０００００４４７７）キッコーマン株式会社 (212)
【出願人】（５０５３７４７８３）独立行政法人 日本原子力研究開発機構 (727)
【Ｆターム（参考）】
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