（Ｒ）−特異的ω−トランスアミナーゼの同定および調製方法
本発明は、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼのスクリーニング、調製および特性解析方法、それによって得られたトランスアミナーゼ、ならびに各種のアミノ基転移方法におけるそれらの使用に関するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、(R)-特異的なω-トランスアミナーゼのスクリーニング、特性解析および調製方法、それによって得られたω-トランスアミナーゼ、ならびに各種のアミノ基転移方法におけるそれらの使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
キラルなアミンは医薬、農薬および化学業界において重要な役割を果たしている。それらは、セファロスポリンまたはピロリジン誘導体などの、さまざまな生理学的に(例えば薬学的に)活性な物質を製造するための中間体またはシントンとして頻繁に使用されている。多くのキラルアミン類のさまざまな用途では、ただ1つの特定の光学活性体、(R)または(S)エナンチオマーのいずれかに生理活性がある。したがって、キラルアミンを光学活性な形態で製造する方法を提供する必要がある。
【０００３】
こうしたニーズは、キラルなカルボン酸の添加を介したジアステレオマー塩の結晶化によるキラルアミンの調製によって、部分的に満たされる(Breuer et al., Angewandte Chemie (2004) 116, 806-843)。他の化学的方法では、C=N-二重結合をもつプロキラルな前駆物質を還元することによるエナンチオ選択的合成が用いられる。
【０００４】
光学活性なアミノ酸およびアミンの合成に利用されているいくつかの酵素的方法のうち、ω-トランスアミナーゼ(ω-TAs)は、多数の医薬品の製造用のビルディングブロックとして頻繁に用いられる光学活性アミンの不斉合成におけるそれらの潜在能力のため、最近大きな注目を集めている。
【０００５】
ω-トランスアミナーゼは、アミノ基転移反応を触媒するPLP(ピリドキサールリン酸)依存性酵素である。ω-トランスアミナーゼを利用する場合、いわゆるエナンチオ富化されたおよび/または純粋な光学活性アミンは主に2つの反応戦略を経て製造することができる：(i)ケトンから出発する不斉合成、および(ii)ラセミ体のアミンから出発する速度論的分割。ω-トランスアミナーゼは一般に良好なエナンチオ選択性を示すが、それらは不斉合成に(この場合には100％の収率が理論的に可能であるにもかかわらず)頻繁には使用されていない。ω-トランスアミナーゼを利用する不斉合成での1つの特定要件は、生成物側に平衡をシフトすることであり、特にアミノ供与体としてアラニンのようなアミノ酸を用いる場合にはそうである。というのは、この場合には、平衡が基質(ケトン、アラニン)の側にあって、生成物(アミン、ピルビン酸)の側にないからである。もう1つの要件は、酵素の立体選択性が完璧でなければならない、ということであるが、ω-トランスアミナーゼの場合は必ずしもそうとは限らない。したがって、ω-トランスアミナーゼは主にラセミ体アミンの速度論的分割に用いられ、この場合にはエナンチオ選択性が必ずしも完璧である必要はない。こうして、ラセミ体アミンの速度論的分割が検討されてきたものの、最大収率50％の制限がそれらの応用を大幅に妨げている。一方、不斉合成には、不利な平衡を、光学的に純粋なアミンの単一エナンチオマーの合成の方へシフトする方法が必要であり、そのためにいくつかの方法が開発されたが、このことは、工業的規模でのトランスアミナーゼの使用を可能にする効率的な方法の1つの重要な前提条件となっている。そのような方法がWO 2007/093372に開示されている。
【０００６】
EP 0 987 332 A1は、光学活性アミノ化合物、すなわち(R)-アミノ化合物を、微生物の酵素、特にアルスロバクター属細菌(Arthrobacter sp.)に由来する(R)-選択的ω-トランスアミナーゼを用いて、製造する方法を開示している。EP 1 038 953 A1は、さらに他の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼを開示しているが、これはマイコバクテリウム・オーラム(Mycobacterium aurum)に由来するものである。
【０００７】
Iwasakiら(Biotechnol. Let. 2003 (25), 1843-1846)、Koszelewskiら(Adv. Synth. Catal. 2008 (350), 2761-2766)およびIwasakiら(Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006 (69), 499-505)は、アルスロバクター属細菌由来のR-特異的トランスアミナーゼを開示している。有用な(S)-または(R)-選択的トランスアミナーゼを提供する微生物の同定は、通常、例えば土壌サンプルから得られた微生物を選別して、それらを培養下で増やすことにより行われる(Jun et al., App. Microbiol. Biotechnol. 2004 (70), 2529-2534およびShin et al. (Biosc. Biotechnol. Biochem. 2001 (65), 1782-1788))。特に、上記のR-選択的ω-トランスアミナーゼはすべてが集積培養によって得られたものである。こうした方法には多大な時間が必要である。なぜなら、効率的な方法では、多くの場合、大腸菌(Escherichia coli)のような異種生物内で酵素を過剰発現させることが好適であるからである。これは野生型生物からの遺伝子配列の単離を必要とするが、DNA配列のクローニングはいつも成功するとは限らず、しかも非常に時間のかかるプロセスである。
【０００８】
特に、プロセスの開発中または新規ω-TAの同定では、酵素の精製とそれらの酵素的特性の解析に大きな関心が寄せられる。ところが、ω-TA活性は通常、HPLCまたはキャピラリー電気泳動(CE)などの低スループットの方法で測定されるので、酵素的特性の測定がむしろ律速段階となることが多い。
【０００９】
一般的に、(S)-選択的ω-トランスアミナーゼに比較して、入手可能な(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの数ははるかに限られている。このことは、各種キラルアミンの(R)-エナンチオマーの不斉合成にとって非常に望ましい(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの高い需要とは際立って対照的である。かくして、さらなる(R)-選択的ω-トランスアミナーゼを提供する必要性、ならびにこれまで全く入手できないか、経済的に実現可能な方法で、好ましくは工業的規模で、入手できなかった、(R)-エナンチオマー、特に光学活性アミン、例えば医薬または農薬への応用のための光学活性アミンを製造するために、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼを取得する手段および方法を提供する必要性、が依然として存在している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明は、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼ、特に目的の(R)-エナンチオマーを好ましくは光学的に純粋な形で生成するための(R)-選択的ω-トランスアミナーゼを同定、特性解析および取得するための、好ましくは工業的規模での同定、特性解析および調製に適する、単純で、迅速で、信頼性の高い手段および方法を提供するという技術的課題に基づいている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、その技術的課題を、独立請求項の教示を提供することによって、特に特許請求の範囲に記載された方法、それにより得られる生成物および使用を提供することによって、解決するものである。
【００１２】
かくして、本教示は、特定の実施形態において、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼ(ω-TAともいう)の調製方法を提供し、この方法は以下のステップを含む：
a) 少なくとも1種のトランスアミナーゼまたはリアーゼ(好ましくは、PLP依存性酵素のフォールドタイプIVに属するトランスアミナーゼまたはリアーゼ)の少なくとも1つのクエリー生体分子配列および少なくとも1つの生体分子バンクを提供するステップ；
b) その生体分子バンクをクエリー生体分子配列で検索して第1の標的生体分子配列のグループを同定するステップであって、第1の標的生体分子配列は、アミノ酸レベルで計算して、クエリー生体分子配列に対して少なくとも20％、好ましくは32％の配列同一性の程度を有する、上記ステップ；
c) 第1の標的生体分子配列のグループにおいて、アミノ酸レベルで、次のアミノ酸配列モチーフc1)〜c3)：
c1) 95〜97位のアミノ酸配列Tyr Xa1 Xa2(ここでXa1はアミノ酸Ile、Val、Leu、Met、Pheであり、Xa2はアミノ酸ArgもしくはLysである)、または
c2) 97〜99位のアミノ酸配列Tyr Xaa Gln(ここでXaaはアミノ酸、好ましくは通常のアミノ酸である)および105〜111位の領域中の(好ましくは107〜109位の)アミノ酸配列Arg Xaa Xa3(ここでXa3はアミノ酸、好ましくはHisである)、または
c3) 38位のThr、97位のLysおよび107〜109位のアミノ酸配列Arg Xa4 Xa5(ここでXa4はアミノ酸、好ましくはGlyであり、Xa5はアミノ酸、好ましくはTyrである)
の少なくとも1つを含まず、かつ
c4) 95位のTyr、Arg、Lys以外の別のアミノ酸、または95位のTyr、ただし97位のArgもしくはLysの非存在、および
c5) 40位のLysまたはArgの非存在、および
c6) 161〜165位の領域中の(好ましくは163位の)Lys
を含む、第2の生体分子標的配列のグループを選択して、第2の標的生体分子配列のグループを同定するステップ；および
d) ステップc)で同定された第2の生体分子標的配列を有し、かつ(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの活性を有するタンパク質であるか、または該タンパク質を少なくとも部分的にコードする生体分子を提供する(好ましくは調製する)ステップ。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】標準的な合成によって得られたB3APiのクロマトグラムを示す。
【図２】本発明による不斉合成によって得られたB3APiのクロマトグラムを示す。
【図３】本発明による不斉合成によって得られたC3APのクロマトグラムを示す。
【図４】本発明による不斉合成によって得られたMPPAのクロマトグラムを示す。
【図５】本発明による不斉合成によって得られたB3APのクロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
用語「タンパク質であるか、または該タンパク質を少なくとも部分的にコードする生体分子」は、好ましくは、その生体分子が(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの活性を有するタンパク質であるか、または生体分子がヌクレオチド配列である場合には、そのヌクレオチド配列の少なくとも一部が前記タンパク質、好ましくは全長タンパク質をコードする、ことを意味する。したがって、提供される生体分子がヌクレオチド配列分子である場合には、そのヌクレオチド配列分子の少なくとも一部が(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの活性を有するタンパク質をコードしており、それによって、おそらく該ヌクレオチド配列のさらなる部分が他の何らかの機能、例えば調節または複製機能を有している。こうして、用語「ステップc)で同定された第2の生体分子標的配列を有し、かつ(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの活性を有するタンパク質であるか、または該タンパク質を少なくとも部分的にコードする生体分子を提供する」は、好ましくは、用語「(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの活性を有するタンパク質であり得るか、またはタンパク質が(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの活性を有する限りでは前記タンパク質をコードする配列を含むヌクレオチド配列分子であり得る、ステップc)で同定された第2の生体分子標的配列を有する生体分子を提供する」に等しい。
【００１５】
本発明の一実施形態では、ステップc2)において、Arg Xaa Xa3モチーフの位置は、107〜109位から1〜2アミノ酸だけ変化することがあり、すなわち、105〜111位であり得る。
【００１６】
本発明の一実施形態では、ステップc6)において、Lysの位置は163位で1〜2アミノ酸だけ変化することがあり、すなわち、161〜165位であり得る。
【００１７】
本発明に関して、所定の各アミノ酸配列、特にアミノ酸配列モチーフ、またはDNA配列もしくはDNA配列モチーフは、どちらが適用されるにしても、特に指定のない限り、アミノ末端からカルボキシ末端の方向で、または5’から3’方向で示される。好ましくは、所定の方向で示された配列は、どちらが適用されるにしても、介在するヌクレオチドまたはアミノ酸を含まない一続きの配列として示される。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態において、ステップa)で用いられる少なくとも1種のトランスアミナーゼの少なくとも1つのクエリー生体分子配列は、好ましくは、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼである。さらに好ましい実施形態では、ステップa)で用いられる少なくとも1種のトランスアミナーゼの少なくとも1つのクエリー生体分子配列は、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼ、分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ(BCAT)およびD-アミノ酸トランスアミナーゼ(DATA)からなる群より選択される。好ましくは、分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼは大腸菌由来である。本発明の好ましい実施形態において、ステップa)で用いられる少なくとも1種のリアーゼの少なくとも1つのクエリー生体分子配列は、アミノデオキシコリスミン酸リアーゼ(amino deoxychorismatlyase)(ADCL)である。
【００１９】
本発明は、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼを迅速で、効率的で、単純で、信頼性の高い、簡便な方法で調製する方法を提供する。したがって、本発明は、以前には知られていなかったか入手できなかった(R)-選択的ω-トランスアミナーゼを同定して調製することを可能にし、キラルアミン、好ましくは(R)-エナンチオマーを、特に非常に効率のよい不斉合成経路で提供するための多数の方法を開拓するものである。既知の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼに対する配列同一性の程度が予想に反して低い(例えば、たったの35％の)タンパク質でさえ、実際には(R)-選択的ω-トランスアミナーゼである、ということがわかって、成功する可能性がある。特に有利な予期せざる方法において、本発明は、好ましくは、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)およびメソリゾビウム・ロティ(Mesorhizobium loti)由来の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼを提供することを可能にし、そのために、アスペルギルス由来のトランスアミナーゼは最初の真核生物ω-トランスアミナーゼであり、また、それは(R)-選択性でもって基質を変換する。
【００２０】
基本的に、本発明は次の技術的教示に基づいている：タンパク質またはそのコードヌクレオチド配列は、既知のトランスアミナーゼまたはリアーゼ、特に(R)-選択的ω-トランスアミナーゼに対する配列同一性の程度が低いものでさえ、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼを同定して調製するための潜在的供給源として使用することができ、その場合に、推定上の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼは、望ましくない配列モチーフを識別し、それによりアミノ酸配列中に特定の配列モチーフ(望ましい酵素活性に寄与する)を示すタンパク質を積極的に選択することによって、スクリーニングおよび調製される。こうして、本発明は特に、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼを同定して調製するために、特定の構造的特徴、特に推定上の(R)-選択的ω-TA中の特定のアミノ酸の存在および非存在を使用するものである。
【００２１】
したがって、本方法の最初のステップa)では、少なくとも1種のトランスアミナーゼもしくはリアーゼ(例えば既知の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼ)のクエリー生体分子配列、またはそのようなリアーゼもしくはトランスアミナーゼ(好ましくは(R)-特異的ω-トランスアミナーゼ)の少なくとも特徴的配列部分、好ましくは特にフォールドタイプIVのPLP依存性酵素を同定できるもの、が少なくとも1つの生体分子バンクと共に提供される。好ましくは、クエリー生体分子配列は、トランスアミナーゼまたはリアーゼの、特に(R)-選択的ω-TAのORF(オープンリーディングフレーム)、コードヌクレオチド配列、またはその特徴的部分である。別の実施形態では、クエリー生体分子配列がORF-アミノ酸配列それ自体またはその特徴的部分である。
【００２２】
本発明に関して、少なくとも1種のトランスアミナーゼまたはリアーゼ(特に既知の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼ)のクエリー生体分子配列の特徴的部分は、そのDNA配列分子の形で、全長クエリー生体分子配列(特にORFのDNA配列)に以下の条件下でハイブリダイズする生体分子配列である。
【００２３】
DNAなどの核酸のハイブリダイゼーションの方法はよく知られており、例えば、Molecular Cloning, 第3版(2001); Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press (1994); Immunology methods manual, Academic Press (Molecular)、および他の多くの標準的な教科書に記載されている。
【００２４】
ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションの例は次のとおりである。フィルター上に固定させた核酸およびプローブとして用いる核酸を、50％ホルムアミド、5×SSC (750mM塩化ナトリウムおよび75mMクエン酸ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハルト液、10％デキストラン硫酸および20μg/l変性サケ精子DNAを含む溶液中で42℃にて一晩インキュベートする。インキュベーション後、フィルターを0.2×SSC溶液(約65℃)中で洗浄する。こうしたストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、ホルムアミドの濃度を調整することによって(ホルムアミドの濃度が低下するにつれて、より低いストリンジェントな条件になる)、また、塩濃度と温度条件を変えることによって、変更することができる。
【００２５】
より低いストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを実施するには、例えば、フィルター上に固定させた核酸およびプローブとして用いる核酸を、6×SSCE (20×SSCE: 3mol/l塩化ナトリウム、0.2mol/lリン酸二水素ナトリウムおよび0.02mol/l EDTA、pH7.4)、0.5％SDS、30％ホルムアミドおよび100μg/l変性サケ精子DNAを含む溶液中で37℃にて一晩インキュベートし、そのフィルターを0.1％SDS含有1×SSC溶液(50℃)で洗浄する。
【００２６】
特に好ましい実施形態において、本発明では、用語「少なくとも1種のトランスアミナーゼまたはリアーゼの少なくとも1つのクエリー生体分子配列」のもとで、生体分子配列は、本明細書中で特定した配列モチーフc1)〜c6)の存在または非存在に従って生体分子配列を選択するのに適するもの、と理解される。したがって、そのようなクエリー生体分子配列は、アミノ酸レベルでアミノ酸配列モチーフc1)〜c3)の少なくとも1つを含まず、かつアミノ酸レベルで配列モチーフc4)、c5)およびc6)を含む生体分子配列をスクリーニングして同定する配列である。そうしたクエリー生体分子配列は、アミノ酸配列情報として、またはDNA配列分子もしくはDNA配列情報として具体化することができる。
【００２７】
好ましい実施形態において、ステップa)で用いるクエリー生体分子配列の特徴的部分は、トランスアミナーゼ、好ましくは(R)-選択的ω-トランスアミナーゼ、またはリアーゼのORFの30位から170位まで、最も好ましくは30位から120位までの領域を包含し、好ましくは該領域からなる。
【００２８】
生体分子バンクは、後続のステップb)で、クエリー生体分子配列を用いて検索され、アミノ酸レベルに基づいて、そのクエリー生体分子配列に対して少なくとも最低限度の配列同一性、すなわち、少なくとも20％、好ましくは25％、好ましくは32％、好ましくは少なくとも33％、最も好ましくは34％、少なくとも35％、少なくとも36％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも95％の配列同一性を示す、第1の標的生体分子配列のグループを同定する；ここにおいて、前記の第1の標的生体分子配列のグループは、ステップa)で用いられる生体分子バンクからの1次選択を表す。前記配列同一性の程度は、好ましくは、クエリー生体分子配列のORFの少なくとも特徴的部分、好ましくは本質的に完全なORF、特に完全なORFと、スクリーニングされる生体分子配列のORFの少なくとも特徴的部分、好ましくは本質的に完全なORF、特に完全なORFとの間の配列同一性である。ステップb)に続いて、この第1の標的生体分子配列のグループにおいて、ステップc)で、配列モチーフc1)として95〜97位にアミノ酸配列Tyr Xa1 Xa2(ここでXa1はアミノ酸Ile、Val、Leu、Met、Pheであり、Xa2はアミノ酸ArgまたはLysである)を含まないか、または配列モチーフc2)として97〜99位にアミノ酸配列Tyr Xaa Gln(ここでXaaはアミノ酸、好ましくは通常のアミノ酸である)および105〜111位の領域中に(好ましくは107〜109位に)アミノ酸配列Arg Xaa Xa3(ここでXa3はアミノ酸、好ましくは通常のアミノ酸、好ましくはHisである)を含まないか、または配列モチーフc3)として38位にThr、97位にLysおよび107〜109位にアミノ酸配列Arg Xa4 Xa5(ここでXa4はアミノ酸、好ましくは通常のアミノ酸、好ましくはGlyであり、Xa5はアミノ酸、好ましくは通常のアミノ酸、好ましくはTyrである)を含まない、配列を選択し、それによって、上記の配列モチーフc1)、c2)またはc3)の少なくとも1つを示す配列を識別して排除する。さらに後続のまたは同時の選択において、配列モチーフc4)に従って95位にTyr、Arg、Lys以外の別のアミノ酸を示すか、または95位にTyrを示すが、97位にArgおよびLysを示さず、かつ配列モチーフc5)に従って40位にLysおよびArgを示さず、かつ配列モチーフc6)に従って161〜165位の領域に少なくとも1個のLys、好ましくは1個のLys、好ましくは163位にLysを有する、生体分子配列を選択し、それによって、第2の生体分子標的配列のグループを選択して同定する。上記の配列モチーフについて同定およびスクリーニングされた第2の標的生体分子配列のグループは、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの活性を有するタンパク質であるか、または該タンパク質をコードする、生体分子配列を表し、それによって(R)-選択的ω-トランスアミナーゼが提供される。
【００２９】
本発明に関して、トランスアミナーゼは、好ましくはフォールドタイプIVに分類される、アミノ基の転移を触媒するピリドキサールリン酸依存性の酵素である。トランスアミナーゼはE.C. 2.6.1.Xに分類される。本発明の特に好ましい実施形態では、トランスアミナーゼが(R)-選択的トランスアミナーゼであり、特に、好ましい実施形態ではω-トランスアミナーゼである。本発明に関して、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの活性を有するタンパク質は、適切な反応条件下で、供与体から受容体へのアミノ基のような窒素含有基の転移を触媒することができるタンパク質であり、例えば(R)-選択的ω(オメガ)-トランスアミナーゼ(β-アラニン-ピルビン酸トランスアミナーゼ)はそうすることが可能である。本発明に関して、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼは好ましくは分類コードE.C.2.6.1.18を有する酵素である。
【００３０】
本発明に関して、用語「光学活性なキラルアミン」は、用語「鏡像異性的に活性なキラルアミン」と同じ内容に関係している。これらの用語は特に、不要なエナンチオマーが本質的に含まれない調製物、さらに好ましい実施形態では、不要なエナンチオマーが含まれない調製物をさす。したがって、光学活性なキラルアミンは本質的に一方のエナンチオマーを過剰に含むか、または一方のエナンチオマーのみからなることさえある。
【００３１】
特に、本発明に関して、光学活性なキラルアミンは、少なくとも70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.8、特に少なくとも99.9％の光学純度を有する。
【００３２】
本発明において、光学純度は、一方のエナンチオマーの他方のエナンチオマーに対する過剰％で示される。したがって、％で表される光学純度は、(R)および(S)エナンチオマーの濃度の差と、両エナンチオマーの濃度の合計の、比率である(％でのAの光学純度＝([A]-[B])：([A]+[B])×100、ここでAおよびBは(R)および(S)エナンチオマーの濃度またはその逆を表す)。
【００３３】
本発明に関して、生体分子バンクは、生体分子そのものの供給源、または生体分子の配列データ(特にポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列データ)のコレクションである。
【００３４】
本発明に関して、生体分子は好ましくは遺伝情報を担うポリヌクレオチド分子、特にDNA分子である。本発明のさらに好ましい実施形態では、生体分子はいくつかのアミノ酸で構成されるポリペプチド、特にタンパク質である。したがって、生体分子バンクは、生体分子の物理的供給源、特に遺伝子バンク、特にcDNAもしくはゲノムライブラリーであるか、または該生体分子についての情報のコレクション、特に配列データ、特にアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列、特にDNA配列のコレクションであるか、のいずれかであり得る。
【００３５】
本発明はまた、生体分子配列、アミノ酸配列、ポリヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列についても言及し、そのために、前記表現は、一方ではタンパク質、ポリペプチドまたはDNA分子を意味する物理的存在そのものを指し、他方では前記化学物質の情報内容を指す；その情報内容は、ポリヌクレオチドが言及される場合には、そのヌクレオチドの種類、順序および数であり、また、ポリペプチドが言及される場合には、そのポリペプチドを形成する単一アミノ酸の種類、順序および数である。
【００３６】
本発明に関して、用語「生体分子」、「DNA分子」、「ポリヌクレオチド分子」、「ポリペプチド」または「タンパク質」は化学物質そのものを指す。本発明がアミノ酸配列情報、DNA配列情報、ポリヌクレオチド配列情報または生体分子配列情報について特に言及する場合は、それは生体分子の物理的形状を指すのではなく、それに含まれる情報、すなわち、その構成成分(つまりアミノ酸またはヌクレオチド)の種類、順序および数のことを指している。
【００３７】
本発明は、好ましい実施形態A)において、そのステップa)〜c)で、一実施形態ではポリヌクレオチド配列(特にDNA配列)の、別の実施形態ではアミノ酸配列の、配列データのコレクションである生体分子バンクに適用され、これらの両配列がステップb)で配列アライメントツール、好ましくは例えばBLAST(基本的局所アライメント検索ツールである)により検索されて、第1の標的生体分子配列のグループが同定される(Altschul, S.F. et al. 1990. J. Mol. Biol. 215:403; Altschul, S.F. et al. 1997. Nucleic Acid Res. 25:3389-3402)。他の適当なプログラムとしては、Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI, USA)のGAP、BESTFITおよびFASTAが挙げられる。さらにステップc)では、同定された第1の生体分子配列のグループがさらなる選択ステップに供され、その過程では、特定の配列モチーフを用いて、配列モチーフc1)〜c3)で消極的に、また、配列モチーフc4)〜c6)で積極的に、目的の生体分子配列を同定して選択する。第2のグループの生体分子配列が同定されると、本発明では、前記配列情報を用いて、対応するオリゴ-またはポリヌクレオチド分子(例えばハイブリダイゼーションプライマー)を調製し、物理的形状の生体分子バンクにおいて、第2のグループ中の同定された酵素をコードするDNA配列分子をスクリーニングして選択する。こうして、好ましい実施形態では、ステップc)で得られた配列情報を、対応する遺伝子のゲノムDNAまたはcDNAライブラリーからのクローニングと、そのタンパク質の例えば大腸菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)または他の細胞内での発現のために使用することができる。本発明の別の好ましい実施形態では、ステップc)で得られた配列情報が、目的の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼのデノボ合成のために用いられる。そのような好ましい実施形態では、ステップc)で得られた配列情報を、例えばコドン使用頻度の最適化とmRNAの安定性を考慮した、遺伝子の合成のために、また、そのような遺伝子のクローニングおよび発現のために、使用することが可能である。そうした好ましい実施形態によれば、ステップa)における少なくとも1つの生体分子バンクとして、DNA配列情報またはアミノ酸配列情報のいずれかを含む生体分子バンクを用いることができる。生体分子バンクがDNA配列情報を含む場合は、その情報は、アミノ酸配列がクエリー生体分子配列としておよびアミノ酸配列モチーフとして用いられるステップb)〜c)に従って処理するために、アミノ酸配列情報に翻訳される必要があり、あるいは、ステップb)〜c)は、DNA配列情報に戻して翻訳されたクエリー生体分子配列および配列モチーフc1)〜c6)を用いてDNA配列バンクにおいて実施される。
【００３８】
本発明の別の好ましい実施形態では、本教示は、ステップa)における実施形態B)において、物理的形状の遺伝子バンクとして存在する生体分子バンク、特に遺伝子ライブラリー、例えばcDNAライブラリー、メタゲノムライブラリーまたはゲノムライブラリーに適用され、少なくとも1種の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの全部または少なくとも特徴的部分をコードするDNA分子を用いて、アミノ酸レベルで計算して、クエリーDNA配列分子に対して少なくとも20％、好ましくは32％の配列同一性の程度を有する第1の生体分子配列のグループ、特にDNA配列分子を検索し、同定して選択する。後続のステップc)は、好ましくは、所望の配列モチーフc1)〜c6)を同定して積極的および消極的に選択するヌクレオチド分子プライマーを用いて、前記の第1のDNA分子のグループにおいて実施される。
【００３９】
本発明に関して、用語「配列モチーフ」とは、特許請求の範囲に記載された方法のステップc)で特定された推定上の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼのアミノ酸配列の特定の選択的特徴を指す。特に、第1の配列モチーフc1)は、95〜97位にアミノ酸配列Tyr Xa1 Xa2(ここでXa1はアミノ酸Ile、Val、Leu、Met、Pheであり、Xa2はアミノ酸ArgまたはLysである)としてこの順序で同定される配列モチーフであり、この配列モチーフは、本発明によれば、最終的に選択される生体分子配列中に存在してはならない。第2の配列モチーフc2)は、97〜99位にアミノ酸配列Tyr Xaa Gln(ここでXaaはアミノ酸である)としてこの順序で、および105〜111位の領域中に(好ましくは107〜109位に)アミノ酸配列Arg Xaa Xa3(ここでXaaはアミノ酸であり、Xa3はアミノ酸、好ましくはHisである)としてこの順序で同定される配列モチーフであり、これらの配列モチーフもまた、最終的に選択される生体分子配列中に存在してはならない。第3の配列モチーフc3)は、38位のThr、97位のLysおよび107〜109位のアミノ酸配列Arg Xa4 Xa5(ここでXa4はアミノ酸、好ましくはGlyであり、Xa5はアミノ酸、好ましくはTyrである)の存在によって特徴づけられる配列モチーフであり、このモチーフc3)は最終的に選択される生体分子配列中に存在してはならない。
【００４０】
第4の配列モチーフc4)は、95位にTyr、Arg、Lys以外の別のアミノ酸が存在するか、または95位にTyrが存在するが、97位にArgもしくはLysが存在しない、ことを要求し、この配列モチーフは本発明により調製される推定上の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼに必要な資格を与える。第5の配列モチーフc5)は、40位にLysおよびArgが最終的に調製および同定される推定上の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼ中に存在しない、ことを要求する。第6の配列モチーフc6)は、161〜165位の領域中に少なくとも1個のLys、好ましくは1個のLys、好ましくは163位にLys、が最終的に調製および同定される(R)-選択的ω-TA中に存在する、ことを要求する。
【００４１】
本発明に関して、アミノ酸位置の識別および位置決定は次のように決定される。第1の標的生体分子配列を、互いとおよびクエリー生体分子配列とアライメントし、好ましくは多重アライメントする。アライメントは従来のアライメントソフトウェア、例えばSTRAP、特にClustalW、好ましくはClustalW3Dを用いて行うことができる。別の実施形態では、配列同士をペアワイズでアライメントすること、すなわち、それぞれの第1の標的生体分子配列をクエリー生体分子配列とアライメントすることも可能である。好ましい実施形態では、第1の標的生体分子配列が大腸菌のBCATとアライメントされる。別の好ましい実施形態では、第1の標的生体分子配列が本発明で用いる別のクエリー生体分子配列、例えば(R)-選択的ω-トランスアミナーゼとアライメントされる。
【００４２】
本発明で示されるアミノ酸位置のアノテーションは、位置基準として用いられるクエリー生体分子配列中の対応する配列モチーフの位置によって決定される。上記のアライメントは、クエリー生体分子配列中に存在する配列モチーフに対して、第1の標的生体分子配列の対応するアミノ酸位置をアライメントする。
【００４３】
一例として、アミノ酸位置のアノテーションの基準として大腸菌のBCATを用いると、92〜100位の既知の大腸菌BCATアミノ酸配列、すなわちTSAYIRPLI(配列番号9)が推定上のω-トランスアミナーゼの95〜99位を同定するために使用され、この位置は配列モチーフc1)、c2)、c3)の非存在およびc4)の存在について分析される。大腸菌BCATの35〜42位の既知アミノ酸配列、すなわちVFEGIRCY(配列番号10)は、配列モチーフc3)およびc5)のために38位のGの位置をマークする。大腸菌BCATアミノ酸配列中のアミノ酸配列DVGMGVNP(配列番号11)は、105〜111位の配列モチーフc3)のために104〜111位をマークする。既知の大腸菌BCATの159〜167位のアミノ酸配列PTAAKAGGN(配列番号12)は、配列モチーフc6)のためにKとしての163位をマークする。
【００４４】
こうして、本発明の好ましい実施形態では、生体分子がタンパク質であって、生体分子配列がアミノ酸配列である。したがって、好ましい実施形態において、生体分子バンクは、さまざまなタンパク質に関する情報、特にアミノ酸配列の情報が収集されているバンク、特にデータベースである。好ましいデータベースバンクはNCBIタンパク質データバンク、UniProtKB/SwissProtおよびUniProtKB/TrEMBLデータバンクである。
【００４５】
好ましい実施形態では、生体分子がDNA分子であって、生体分子配列がDNA配列である場合もある。したがって、好ましい一実施形態において、生体分子バンクは、さまざまなポリヌクレオチド配列、特にDNA配列に関する情報を収集したバンク、特にデータベースである。
【００４６】
好ましい実施形態において、本発明は、生体分子バンクが生体分子データベースであって、その生体分子データベースをステップb)で生体分子配列アライメントプログラム、特にBLASTにより検索する、上記の方法を使用する。好ましい実施形態では、生体分子バンクが生体分子データベースである場合、その生体分子データベースを、ステップb)で、生体分子データベースがアミノ酸配列データベースであるときはアミノ酸配列で検索し、生体分子データベースがDNA配列データベースであるときはDNA配列で検索することが想定される。
【００４７】
本発明は、最終的にステップd)で、生体分子、好ましくはDNA分子またはアミノ酸配列分子(すなわちタンパク質)を、トランスアミナーゼのデノボ合成によって、または第2の生体分子配列に基づいて規定されるプライマーの助けをかりて目的のトランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチドを物理的遺伝子バンクから単離することによって、取得することを想定している。得られたポリヌクレオチド、特にDNA配列分子は、目的のトランスアミナーゼを適切な条件下に適切な培地中で発現させるために使用される。
【００４８】
本発明はまた、上記のステップa)〜c)を含む、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼのスクリーニングおよび同定方法に関し、その方法は特に、少なくとも1種の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの少なくとも1つのクエリー生体分子配列および少なくとも1つの生体分子バンクを提供するステップ、生体分子バンクをクエリー生体分子配列で検索して第1の標的生体分子配列のグループを同定するステップであって、第1の生体分子配列は、アミノ酸レベルで計算して、クエリー生体分子配列に対して少なくとも20％、好ましくは25％、好ましくは32％の配列同一性の程度を有するものである、上記ステップ、第1の標的生体分子配列のグループにおいて、アミノ酸レベルで、配列モチーフc1)〜c3)のどれかを含まず[ここでc1)は95〜97位のアミノ酸配列Tyr Xa1 Xa2(ここでXa1はアミノ酸Ile、Val、Leu、Met、Pheであり、Xa2はアミノ酸ArgもしくはLysである)であり、またはc2)は97〜99位のアミノ酸配列Tyr Xaa Gln(ここでXaaはアミノ酸である)および105〜111位の領域中の(好ましくは107〜109位の)アミノ酸配列Arg Xaa Xa3(ここでXa3はアミノ酸、好ましくはHisである)であり、またはc3)は38位のThr、97位のLysおよび107〜109位のアミノ酸配列Arg Xa4 Xa5(ここでXa4はアミノ酸、好ましくはGlyであり、Xa5はアミノ酸、好ましくはTyrである)である]、かつ配列モチーフc4)、c5)およびc6)を含む[ここでc4)はアミノ酸レベルで95位のTyr、Arg、Lys以外の別のアミノ酸であるか、または95位のTyrであるが、97位のArgもしくはLysの非存在であり、c5)は40位のLysまたはArgの非存在であり、c6)は161〜165位の領域中の(好ましくは163位の)Lysである]生体分子配列を選択して、(R)-選択的ω-TAの生体分子配列である第2の生体分子配列のグループを同定するステップを含む。
【００４９】
本発明のさらに好ましい実施形態において、本教示は、本発明の調製方法により得られる(R)-選択的ω-トランスアミナーゼを提供する。特に、本発明は、メソリゾビウム・ロティおよびアスペルギルス・テレウス由来のタンパク質、ならびに該タンパク質をコードするDNA配列、特にDNA分子を提供し、メソリゾビウム・ロティについては配列番号1および2で、アスペルギルス・テレウスについては配列番号3および4で特定される。本発明は特に、最も好ましい実施形態において、次の教示を提供する：本発明により取得または調製される(R)-選択的ω-トランスアミナーゼ(例えば、配列番号1および3で特定されるもの)はアミノ基転移反応に用いることができ、特に、少なくとも1種のアミノ受容体と少なくとも1種のアミノ供与体を本発明による(特に配列番号1または3の)(R)-選択的ω-トランスアミナーゼと反応させて光学活性なキラルアミンを得ることを含む、光学活性なキラルアミン(好ましくは、キラルアミンの(R)-エナンチオマー)の調製方法に使用することができる。好ましい実施形態において、光学活性なキラルアミンの調製方法は、ケト基含有化合物としてのケトンおよびアミノ供与体を用いる不斉合成である。別の好ましい実施形態では、前記調製方法が速度論的分割反応を利用するものである。その場合のアミノ供与体は好ましくはラセミ体アミンの混合物であり、アミノ受容体は好ましくはエダクトとしてのケトンである。
【００５０】
ケトンから出発する不斉合成において本発明の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼを用いることによって光学活性なキラルアミンが合成される本発明の好ましい実施形態によれば、目的の光学活性キラルアミン、すなわち(R)-エナンチオマーへの好ましい変換率は、少なくとも70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、最も好ましくは100％である。
【００５１】
本発明の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼがラセミ体アミンから出発する速度論的分割反応において用いられる別の好ましい実施形態によれば、光学活性キラルアミン、好ましくは(S)-エナンチオマーへの好ましい変換率は、少なくとも30、40、45、46、47、48、49、特に50％である。
【００５２】
光学純度および変換率を解析するための濃度は、例えばHPLC、キャピラリー電気泳動(CE)、ガスクロマトグラフィー(GC)、または光度もしくは蛍光光度測定法を用いて、決定することができる。
【００５３】
こうして、好ましい実施形態において、本発明は、光学活性なキラルアミンの製造方法に関し、この方法は、ケト基を含むアミノ受容体化合物およびアミンのラセミ混合物を、トランスアミナーゼ、特に(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの存在下で、好ましくは本発明の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの存在下で反応させて、キラルアミンの(S)-エナンチオマーを取得することを含む。
【００５４】
本発明の別の好ましい実施形態では、光学活性なキラルアミン、特に前記アミンの(R)-エナンチオマーの製造方法が提供され、その方法は、ケト基を含むアミノ受容体化合物およびアミノ供与体を、特に本発明により得られる(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの存在下で反応させて、アミンの(R)-エナンチオマーを取得することを含む。
【００５５】
本発明に関して、アミノ受容体は、トランスアミナーゼ、特にω-トランスアミナーゼによってアミノ供与体から転移されるアミノ基を受け入れることができる分子である。本発明の特に好ましい実施形態では、アミノ受容体がケトン官能基を含むものである。
【００５６】
本発明の特に好ましい実施形態において、アミノ受容体は、フェニルピルビン酸、その塩、ピルビン酸、その塩、アセトフェノン、2-ケトグルタル酸、3-オキソ酪酸、2-ブタノン、3-オキソピロリジン(3-OP)、3-ピリジルメチルケトン(3-PMK)、3-オキソ酪酸エチルエステル(3-OBEE)、3-オキソペンタン酸メチルエステル(3-OPME)、N-1-boc-オキソピペリジノン、N-1-boc-3-オキソピロリジン(B3OP)、3-オキソ-ピペリジン、N-1-boc-3-オキソピペリジン(B3OPi)、1-Cbz-3-オキソピペリジン(C3OPi)、1-Cbz-3-オキソピロリジン(C3OP)、アルキル-3-オキソ-ブタン酸（butonoate）、メトキシアセトンおよび1-オキソテトラロンからなる群より選択される。
【００５７】
本発明に関して、アミノ供与体は、トランスアミナーゼ、特にω-トランスアミナーゼを用いて、アミノ受容体にアミノ基を供与することができる分子である。特に好ましい実施形態では、アミノ供与体がアミンまたはアミノ酸である。
【００５８】
特に好ましい実施形態において、アミノ供与体は、β-アラニン、アラニン、α-メチルベンジルアミン(α-MBA)、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、3-アミノ酪酸、イソプロピルアミン、2-アミノブタンおよびγ-アミノ酪酸またはそれらのいずれかの塩、例えば塩化物からなる群より選択される。特に好ましい実施形態では、得られるケトン生成物がフェニルピルビン酸、その塩、ピルビン酸、その塩、グリオキシル酸、その塩、アセトフェノン、2-ケトグルタル酸、アセトン、3-オキソ酪酸、2-ブタノン、3-オキソピロリジン(3-OP)、3-ピリジルメチルケトン(3-PMK)、3-オキソ酪酸エチルエステル(3-OBEE)、3-オキソペンタン酸メチルエステル(3-OPME)、N-1-boc-オキソピペリジノンおよびN-1-boc-3-オキソピロリジン(B3OP)またはそれらのいずれかの塩、例えば塩化物であり得る。
【００５９】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、光学活性アミノ基をもつアミン、特にアルキル基、分枝アルキル基またはアリールアルキル基をもつアミンの群から選択される光学活性キラルアミンの製造方法に関する。特に、これらのアミン、とりわけ単環式または二環式アミンは、特に5〜6員環式またはS-、O-もしくはN-置換複素環式炭化水素のアミンまたは芳香族アミン、特にアルキル-もしくはアルコキシ-置換芳香族アミンである。好ましい実施形態では、得られるキラルアミンはフェニルアラニン、アラニン、3-アミノピペリジン、アルキル-3-アミノ-ブタン酸、3-アミノピロリジン(3-AP)、3-ピリジル-1-エチルアミン(3-PEA)、N-1-boc-3-アミノピロリジン(B3AP)、N-1-boc-3-アミノピペリジン(B3APi)、1-Cbz-3-アミノピペリジン(C3APi)、1-Cbz-3-アミノピロリジン(C3AP)、3-アミノ酪酸エチルエステル(3-ABEE)、3-アミノペンタン酸メチルエステル(3-APME)、α-メチルベンジルアミン(α-MBA)、1-アミノテトラリン、3,4-ジメトキシフェニルアセトン、α-メチル-4-(3-ピリジル)-ブタンアミン、γ-アミノ酪酸、グルタミン酸、イソプロピルアミン、β-アミノ酪酸、sec-ブチルアミン、メトキシイソプロピルアミン、3-アミノピロリジンの誘導体、1-N-Boc-3-アミノピペリジン、セファロスポリンおよびセファロスポリンの誘導体からなる群より選択される。
【００６０】
特に好ましい実施形態において、本発明は、それゆえ、3OPを(R)-選択的ω-トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて光学活性(R)-3APを取得することを想定している。
【００６１】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、3-PMKを(R)-選択的ω-トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて光学活性(R)3-PEAを取得することを想定している。
【００６２】
本発明のさらに好ましい実施形態において、本発明は、3-OBEEを(R)-選択的ω-トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて光学活性(R)3-ABEEを取得することを想定している。
【００６３】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、3-OPMEを(R)-選択的ω-トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて光学活性(R)3-APMEを取得することを想定している。
【００６４】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、B3OPを(R)-選択的ω-トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて光学活性(R)-B3APを取得することを想定している。
【００６５】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、B3OPiを(R)-選択的ω-トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて光学活性(R)-B3APiを取得することを想定している。
【００６６】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、C3OPiを(R)-選択的ω-トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて光学活性(R)-C3APiを取得することを想定している。
【００６７】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、C3OPを(R)-選択的ω-トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて光学活性(R)-C3APを取得することを想定している。
【００６８】
本発明のさらに好ましい実施形態において、本発明は、アセトフェノンを(R)-選択的ω-トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて光学活性(R)α-MBAを取得することを想定している。
【００６９】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、アミノ受容体、特に単環式または二環式の、オキソ基を含有する5〜6員環式またはS-、O-もしくはN-置換複素環式炭化水素または芳香族化合物、特にアルキル-もしくはアルコキシ-置換芳香族化合物を、アミノ供与体および(R)-選択的ω-トランスアミナーゼと反応させて、アミン、特に単環式または二環式アミン、特に5〜6員環式またはS-、O-もしくはN-置換複素環式炭化水素のアミンまたは芳香族アミン、特にアルキル-もしくはアルコキシ-置換芳香族アミンを、特に(R)体の形で、取得することを想定している。
【００７０】
本発明の特に好ましい実施形態においては、アミノ受容体とアミノ供与体を水性媒体、例えば生理学的緩衝液中で、トランスアミナーゼと反応させる。特に好ましい実施形態では、アミノ基転移反応を5〜9のpH範囲、特に7〜8.5のpHで実施する。特に好ましい実施形態では、この反応を10〜65℃、好ましくは20〜50℃、特に18〜25℃の温度範囲、好ましくは室温または34〜39℃、特に37℃で実施する。本発明のさらに好ましい実施形態では、アミノ受容体とアミノ供与体を1：1〜1：5のモル比、特に1：1〜1：2のモル比で提供する。本発明の好ましい実施形態では、酵素活性が1〜20.000μmol/分であり得る。
【００７１】
本発明はまた、トランスアミナーゼの解析方法、特にトランスアミナーゼの特性の解析方法に関し、この方法は以下のステップを含む：
i. 荷電したアミノ受容体、荷電したアミノ供与体およびトランスアミナーゼ、好ましくはω-トランスアミナーゼ、最も好ましくは本発明により得られる(R)-選択的ω-トランスアミナーゼを提供するステップ；
ii. そのアミノ受容体およびアミノ供与体をトランスアミナーゼと反応媒体中で反応させるステップ；それにより、
iii. 第1セットの反応条件下で該反応媒体の導電率を測定するステップ；および
iv. ステップiii)に続いて、第2セットの反応条件下で該反応媒体の導電率を測定し、それによりトランスアミナーゼの特性を反映する少なくとも2つの導電率の値を得るステップ。
【００７２】
荷電基質であるアミノ供与体(好ましくはアミン)とアミノ受容体(好ましくはケト酸、例えばピルビン酸)とのトランスアミナーゼ(好ましくはω-TA)触媒反応の過程では、非荷電ケトンと両性イオンアミノ成分(好ましくはアミノ酸、例えばアラニン)が形成されるため、導電率が低下する。
【化１】
【００７３】
本発明の解析方法は反応進行の簡便な測定を可能にする。好ましくは、低導電率の緩衝液、特に低導電性CHES(N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸)緩衝液が、高すぎる初期導電率を回避するために最も適している。好ましくは、導電率測定法のキャリブレーションを異なる変換反応のシミュレーションによって行うことができる。例として、標準的な基質ペアであるα-メチルベンジルアミンとピルビン酸の場合、1mM変換が44μSの変化に対応する。キャピラリー電気泳動で測定した反応速度を比較することによって本方法を検証したところ、すぐれた一致性が得られた。細胞抽出物が本方法を有意に妨げることはない。ピルビン酸はほぼすべてのω-TAの共通のアミノ受容体であるので、本方法は、さまざまなアミノ供与体に対するトランスアミナーゼ活性を検討するために使用できる。さらに、この酵素のエナンチオ選択性についての情報も取得できる。
【００７４】
この実施形態において、本発明は、トランスアミナーゼの解析方法、特にトランスアミナーゼの特性の解析方法を提供し、それによって、例えば反応媒体のpH値もしくは温度に依存するトランスアミナーゼの活性を解析したり、または反応の安定性、添加剤もしくは緩衝液組成物の効果を解析したりすることが可能である。
【００７５】
本解析方法によれば、反応媒体の第1の導電率測定を第1セットの反応条件下で実施し、その後反応媒体の少なくとも1回の第2の導電率測定を実施することによって、得られた両方の導電率の値を比較し、試験したトランスアミナーゼの活性および特性に関する結論を導き出すことができる。導電率の低下は、本発明によるトランスアミナーゼ反応において、そのトランスアミナーゼの活性を示している。導電率の低下の減速、低下の加速または低下なしを見分けることによって、トランスアミナーゼの特性に関する結論を導き出すことが可能である。
【００７６】
本発明に関して、反応条件のセットは、好ましくは、その条件が反応媒体の温度、pH値および組成からなる群より選択される反応条件のセットであり、好ましくはエダクトおよび生成物の濃度を除いた上記の反応条件である。本発明の一実施形態では、反応条件のセットが反応時間を通して一定に保たれる。本発明の別の実施形態では、反応条件のセットが反応時間を通して異なることがある。
【００７７】
好ましい実施形態において、本発明は、それゆえ、反応媒体が低導電率の緩衝液である、トランスアミナーゼのそのような解析方法にも関係する。この方法の特に好ましい実施形態では、荷電したアミノ受容体がピルビン酸である。
【００７８】
本発明の好ましい実施形態において、トランスアミナーゼを解析するための本方法は、本発明の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの調製方法に続いて使用され、また、本発明の教示を新しい有利な(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの提供へと拡大適用するだけでなく、それらの特性の測定をも可能にする。
【００７９】
本発明のさらに好ましい実施形態は従属請求項の主題である。
【００８０】
本発明は、以下の実施例および添付の配列表において、より詳細に説明される。
【００８１】
配列番号1は、メソリゾビウム・ロティ由来の(R)-選択的ω-TAの全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号2は、配列番号1をコードするDNA配列を示す；
配列番号3は、アスペルギルス・テレウス由来の(R)-選択的ω-TAの全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号4は、配列番号3をコードするDNA配列を示す；
配列番号5は、マイコバクテリウム・オーラム由来の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号6は、配列番号5をコードするDNA配列を示す；
配列番号7は、アルスロバクター属細菌由来の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号8は、配列番号7をコードするDNA配列を示す；
配列番号9は、95〜99位の確認のために用いられる大腸菌BCATの配列モチーフを示す；
配列番号10は、38位の確認のために用いられる大腸菌BCATの配列モチーフを示す；
配列番号11は、107位の確認のために用いられる大腸菌BCATの配列モチーフを示す；
配列番号12は、163位の確認のために用いられる大腸菌BCATの配列モチーフを示す；
配列番号13は、ペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号14は、配列番号13の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号15は、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号16は、配列番号15の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号17は、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号18は、配列番号17の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号19は、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号20は、配列番号19の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号21は、ネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号22は、配列番号21の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号23は、ジベレラ・ゼアエ(Gibberella zeae)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号24は、配列番号23の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号25は、ハイフォモナス・ネプチュニウム(Hyphomonas neptunium)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号26は、配列番号25の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号27は、メソリゾビウム・ロティMAFF303099由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号28は、配列番号27の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号29は、ロゼオバクター属細菌(Roseobacter sp.)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号30は、配列番号29の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号31は、マリノモナス属細菌(Marinomonas sp.)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号32は、配列番号31の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号33は、リゾビウム・エトリ(Rhizobium etli)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号34は、配列番号33の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号35は、ロドフェラックス・フェリレデューセンス(Rhodoferax ferrireducens)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号36は、配列番号35の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号37は、ジャナスキア属細菌(Jannaschia sp.)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号38は、配列番号37の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号39は、ラブレンジア・アレキサンドリイ(Labrenzia alexandrii)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号40は、配列番号39の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号41は、バークホルデリア属細菌(Burkholderia sp.)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号42は、配列番号41の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号43は、バークホルデリア・セノセパシア(Burkholderia cenocepacia)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号44は、配列番号43の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号45は、アルファプロテオバクテリア(alpha proteobacterium)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号46は、配列番号45の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号47は、ガンマプロテオバクテリア(gamma proteobacterium)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号48は、配列番号47の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号49は、マイコバクテリウム・バンバアレニイ(Mycobacterium vanbaalenii)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；および
配列番号50は、配列番号49の全アミノ酸配列(ORF)を示す。
【実施例】
【００８２】
実施例１ − (R)-選択的ω-トランスアミナーゼの同定
EP 1 038 953 A1に示されるマイコバクテリウム・オーラムの(R)-選択的ω-TAのアミノ酸配列(配列番号5)およびEP 0 987 332 A1に示されるアルスロバクター属細菌の(R)-選択的ω-TAのアミノ酸配列(配列番号7)をクエリー生体分子配列として使用する。この実施例で用いる生体分子バンクはNCBIのpubmedタンパク質データバンク(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed (2009年7月13日))である。
【００８３】
M.オーラムまたはアルスロバクター属細菌のω-TAからのアミノ酸配列(配列番号5または7)をクエリーとして用いて、標準パラメーター(BLOSUM62 scoring matrix, word size：3, gap costs：existence - 11, extension - 1)によるBLAST検索を行って、さまざまな生物に由来する100の各種アミノ酸配列の第1のグループを同定したが、それらはすべてがクエリー配列に対して最低限度30％の配列同一性を有する。
【００８４】
BLASTでは、「non-redundant protein sequences (nr)」(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome)が2009年7月13日時点で使用された。第1の標的生体分子配列を表す100の各種アミノ酸配列のこの第1グループにおいて、配列モチーフc1)、c2)またはc3)を示さずかつ配列モチーフc4)、c5)およびc6)を示す配列を、配列モチーフ検索によって検索し同定した。21のORFを同定することができた。それらを下記の表1に示す。
【表１】
【００８５】
実施例２ − アスペルギルス・テレウス、マイコバクテリウム・バンバアレニイおよびメソリゾビウム・ロティのトランスアミナーゼの調製および解析
2.1 表1のエントリー9のマイコバクテリウム・バンバアレニイ由来のω-TA(配列番号49および50)、表1のエントリー1のアスペルギルス・テレウス由来のω-TA(配列番号3および4)、および表1のエントリー11のメソリゾビウム・ロティ由来のω-TA(配列番号1および2)を取得して、大腸菌内でこれらの酵素を発現させるためにコドン使用頻度を(大腸菌に)適応させた形で使用した。以下では、マイコバクテリウム・バンバアレニイのトランスアミナーゼをMva-TAと呼び、アスペルギルス・テレウスのトランスアミナーゼをAte-TAと呼び、メソリゾビウム・ロティのトランスアミナーゼをMlo-TAと呼ぶ。
【００８６】
2.2 アセトフェノンアッセイ
Mva-TAおよびAte-TAは、2.5mMアミンと2.5mMピルビン酸をpH7.5、30℃で用いるアセトフェノンアッセイにおいて、(R)-α-MBAを(S)-エナンチオマーより少なくとも100倍速く変換した。
【００８７】
アッセイ：反応中に生成されたアセトフェノンの吸収率の増加を245nmでモニターした。
【００８８】
Mlo-TAは、(R)-α-MBAまたは(S)-α-MBAのいずれも変換しなかった。
【００８９】
以下では、アミノ受容体としてのピルビン酸またはα-ケトグルタル酸の存在下で、さらなるアミン類を試験した(10mMアミン、10mMピルビン酸、0.1mM PLP、リン酸緩衝液pH7.5、30℃で24時間のインキュベーション、薄層クロマトグラフィーにより分析)。
【００９０】
変換は、2-アミノヘプタン、2-アミノペンタン、1,3-ジメチルブチルアミンおよび4-フェニル-2-アミノブタンについて認められた。さらに、イソプロピルアミンの最小限の変換を検出することができた。
【００９１】
他のアミン供与体、例えばD-アラニン、L-バリン、γ-アミノ酪酸、エチルアミン、ベンジルアミン、プトレシン、2-アミノ-3-メチルブタンおよび3,3-ジメチル-2-アミノブタンの場合には、変換が検出されなかった。
【００９２】
したがって、3種のタンパク質はすべてがω-TAであることが判明した。
【００９３】
特に、(R)-および(S)-2-アミノヘキサンを基質として用いると、(R)-エナンチオマーだけが顕著に変換された。かくして、Mlo-TAは(R)-選択的なω-TAでもある。DATA (D-アミノ酸トランスアミナーゼ)またはBCAT (分枝鎖アミノトランスフェラーゼ)活性は3種すべてのタンパク質に認められなかった。
【００９４】
2.3 導電率アッセイ
さらに、1-N-boc-3-アミノピロリジン(B3AP)、1-N-boc-3-アミノピペリジン(B3APi)および1-Cbz-3-アミノピペリジン(C3APi)を基質として用いて、モデル基質α-MBAに対するこれらの物質の相対活性を調べた。
【００９５】
アミンとピルビン酸(pH7.5で両基質とも荷電する)をアラニンとケトン(ケトンは電荷をもたず、アラニンは両性イオン化合物であって導電率に寄与しない)へと反応させている間に、導電率の動態をモニタリングすると、変換率に関する結論を導き出すことができる。
【００９６】
反応を開始する前に、アラニン、ピルビン酸、ケトンおよびアミンのさまざまな濃度に依存して相違する変換率を測定することによって、キャリブレーションを実施した。
【００９７】
導電率の低下は、α-MBA、B3AP、B3APiおよびC3APiの変換mMあたり44μS、50μS、48.5μSおよび49.3μSであった。
【００９８】
3種の組換え的に発現されたトランスアミナーゼに加えて、Codexis社から市販されている(R)-選択的ATA-117を、次の反応条件を用いて試験した：50mM CHES緩衝液、pH7.5、BIS-TRIS (＝ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ-トリス(ヒドロキシメチル)メタン)によりpH調整、0.1mM PLP、5〜6mMのアミンおよびピルビン酸、25℃で反応。
【００９９】
基質の変換はAte-TAの場合に示された。相対活性は、(R)-α-MBAと比較して(R)-B3APと(R,S)-C3APiについてが2％、(R)-B3APiについてが1％であった。
【０１００】
2.4 アスペルギルス・テレウスおよびメソリゾビウム・ロティ由来の両(R)-選択的ω-TAのアミンの不斉合成によるエナンチオ選択性の確認
独立した方法によって、MloおよびAte-TAは(R)-選択的であり、基質を目的の生成物にすぐれたエナンチオ選択性で変換することが示される。
【０１０１】
両トランスアミナーゼの(R)-エナンチオ選択性の決定的証拠のために、さまざまなアミン類の不斉合成を実施して、それらの光学純度を測定した。
【０１０２】
アミノ供与体として100倍過剰のアラニンを使用した。変換率については正確な測定を行わずに、概算した。さらなる実験において、変換率(PDC)を高めるためのさまざまな方法を開発できると考えられる。高い〜すぐれたエナンチオ選択性が両トランスアミナーゼにより得られたが、C3APiの場合には非常に低いエナンチオ選択性が得られた。
【表２】
【０１０３】
方法：
トランスアミナーゼを大腸菌BL21内で発現させた。
【０１０４】
0.5の光学密度(OD)が得られたとき、培地(50ml LD-Amp培地)を0.2％ラムノースにより誘導し、25℃で12時間培養した。その後、細胞をリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、遠心分離し、1mlリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)中に懸濁して、200μlアリコートで凍結させた。
【０１０５】
生体触媒反応のために、5μlの500mMケトンのDMSO溶液、22mgのD-アラニンおよび10μlの10mM PLPをこれらのアリコートに添加した。この反応混合物に50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を加えて総容量を500μlとした。その反応混合物を25℃、500rpmで一晩インキュベートした。CEによるエナンチオマー過剰率の測定のため、200μlの1N NaOHを400μlのサンプルに添加し、400μlのジクロロメタンで抽出し、有機相を分離した。次に、その有機相を100μlの5mMリン酸トリエチルアンモニウム緩衝液(pH3)で抽出した。その後、得られた水相をCEに注入した。
【０１０６】
分離のプログラム：
CE-Capillare 30cm、内径50μm、温度15℃
- リン酸トリエチルアンモニウム緩衝液pH3を用いて1分、30psiで洗浄する
- 5％高硫酸化シクロデキストリン(HSαCDまたはHSγCD)を用いて1分、10psiで洗浄する
- 注入：5〜10s、1psi
- 水浸漬
- 分離：電圧10または15kV
- 検出：200nmでMPPA、C3APおよびC3APi；190nmでB3AP、B3APi
【表３】
【０１０７】
実施例４ − 表1に記載したすべてのトランスアミナーゼの調製および解析
4.1 トランスアミナーゼの発現および精製
表1のエントリー番号1、2、3、4、8、9、11、13、14、15、17、18および21のタンパク質をコードするコドン最適化オープンリーディングフレームを、ライゲーション非依存的クローニング(ligation independent cloning)戦略を用いて、pGASTONのNdeIおよびBamHI制限部位間に挿入した。その他のすべてのタンパク質をコードするコドン最適化ORFは、すでにpET-22bにサブクローニングされたものを注文した。形質転換した大腸菌BL21 (DE3)株はアンピシリン(100μg/ml)を添加したLB培地400ml中で増殖させた。OD600が0.7に達するまで、最初は細胞を旋回シェーカー上で37℃にてインキュベートした。次に0.2％ラムノース(pGASTON)または0.1mM IPTG (pET-22b)をそれぞれ添加して細胞を誘導し、同時にインキュベーション温度を20℃に下げた。誘導後、インキュベーションをさらに20時間続けた。発現を追跡するために、誘導後のいくつかの時点でアリコートを取り出した。
【０１０８】
細胞ペレット(約3g湿重量)は、4℃で0.1mM PLPを含むリン酸緩衝液(pH7.5、50mM)を用いて2回洗浄した。破砕(フレンチプレス)後、細胞懸濁液を遠心分離(4000×g、30分)して、得られた上清をクロマトグラフィーの前に0.5μmフィルターを通過させた。クロマトグラフィーはAKTA Purifier(GE Healthcare社)を用いて行った。濾過した細胞抽出物をIMAC Sepharose(商標)6 Fast Flow(GE Healthcare社)の5mlカラムにアプライした。カラムは、5ml/分の流速で、300mM NaCl、0.1mM PLPおよび30mMイミダゾール(非特異的結合を回避するため)を含む10倍カラム容量の50mMリン酸緩衝液pH7.5で洗浄し、300mM NaCl、0.1mM PLPおよび300mMイミダゾールを含む10倍カラム容量のリン酸緩衝液(pH7.5、50mM)でATA活性を溶出した(5ml/分の流速)。活性含有画分をプールし、0.01mM PLPを含む20mMトリシン緩衝液pH7.5を用いたゲル-クロマトグラフィーにより脱塩した。精製した酵素を4℃で保存した。
【０１０９】
約3gの細胞(湿重量)から精製された各タンパク質の量を下記の表4に示す。
【表４】
【０１１０】
4.2 (R)-選択的ω-TAの基質特異性の解析
発現タンパク質の初期スクリーニングでα-メチルベンジルアミン(α-MBA)に対する活性を調べるために、アセトフェノンベースのアッセイを採用した：2.5mM (R)または(S)-α-MBAとピルビン酸の溶液を精製酵素の存在下で反応させ、245nmでの吸光度の増加をアセトフェノンの生成に相関させた。アミン類2-アミノヘキサン、4-フェニル-2-アミノブタンおよび1-N-Boc-3-アミノピロリジンの変換は導電率アッセイを用いてモニターした：10mMアミンとピルビン酸を含む溶液を精製アミントランスアミナーゼの存在下で反応させ、導電率の低下を基質の変換に関連させた。
【０１１１】
DATA活性およびBCAT活性を検討するために、デヒドロゲナーゼ共役アッセイを用いて、NADHの減少を340nmで分光光度的に測定した：DATA活性を測定するため、5mMα-ケトグルタル酸とD-アラニンの溶液を、精製トランスアミナーゼ、1U/ml乳酸デヒドロゲナーゼおよび0.5mM NADHの存在下で反応させた。BCAT活性を測定するためには、5mM 3-メチル-2-オキソ酪酸とL-グルタミン酸を含む溶液、10mM塩化アンモニウム、1U/mlグルタミン酸デヒドロゲナーゼおよび0.5mM NADHを用いた。
【０１１２】
すべての反応は0.01mM PLPを含む20mMトリシン緩衝液pH7.5中で行った。緩衝液のpHは1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エンで調整した。
【０１１３】
結果を下記の表5に示す。
【表５】
【０１１４】
4.3 アスペルギルス・テレウス、メソリゾビウム・ロティおよびマイコバクテリウム・バンバアレニイ由来のω-TAによる(R)-アミン類1〜4(上記表5の説明文参照)の不斉合成
不斉合成は、1.5mlエッペンドルフチューブ内で、ピリドキサール-5’-リン酸(PLP)一水和物(1mM)とNAD+ (1mM)を含むリン酸ナトリウム緩衝液(100mM、pH7)中で30℃にて24時間行った。
【化２】
【０１１５】
反応混合物は50mMケトン、L-アラニン(5当量、250mM)、ウシ心臓由来の乳酸デヒドロゲナーゼ(90U)、グルコース(150mM)およびグルコースデヒドロゲナーゼ(15U)を含んでいた。アスペルギルス・テレウス、メソリゾビウム・ロティおよびマイコバクテリウム・バンバアレニイ由来のω-TA(表1のエントリー1、11および9)は上記のように大腸菌BL21で発現させ、アリコートで凍結させ、さらに精製することなく全細胞生体触媒として直接使用した。変換率は生成されたアミンを検出することで測定した(1、ガスクロマトグラフィー(GC)；2〜4、キャピラリー電気泳動(CE))。2〜4のキラル分析は上記のようにCEを用いて行った。1のエナンチオマー過剰率(％ee)の値はGCで分析した。アミンを酢酸エチルで抽出した後、20倍過剰のトリフルオロ酢酸無水物を添加することによってトリフルオロアセトアミドへの誘導体化を行った。窒素でパージして過剰の無水物と残留トリフルオロ酢酸を除去したあと、誘導体化した化合物を酢酸エチル(50μl)中に溶解し、ヘプタキス-(2,3-ジ-O-アセチル-6-O-tert-ブチルジメチルシリル)-β-シクロデキストリンカラム(25m×0.25mm)を備えた島津GC14Aを用いることによってベースライン分離した。保持時間は80℃/10分//20℃//180℃/10分のオーブン温度勾配で16.0分((S)-1)および16.2分((S)-2)であった。
【０１１６】
結果を下記の表6に示す。
【表６】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、(R)-特異的なω-トランスアミナーゼのスクリーニング、特性解析および調製方法、それによって得られたω-トランスアミナーゼ、ならびに各種のアミノ基転移方法におけるそれらの使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
キラルなアミンは医薬、農薬および化学業界において重要な役割を果たしている。それらは、セファロスポリンまたはピロリジン誘導体などの、さまざまな生理学的に(例えば薬学的に)活性な物質を製造するための中間体またはシントンとして頻繁に使用されている。多くのキラルアミン類のさまざまな用途では、ただ1つの特定の光学活性体、(R)または(S)エナンチオマーのいずれかに生理活性がある。したがって、キラルアミンを光学活性な形態で製造する方法を提供する必要がある。
【０００３】
こうしたニーズは、キラルなカルボン酸の添加を介したジアステレオマー塩の結晶化によるキラルアミンの調製によって、部分的に満たされる(Breuer et al., Angewandte Chemie (2004) 116, 806-843)。他の化学的方法では、C=N-二重結合をもつプロキラルな前駆物質を還元することによるエナンチオ選択的合成が用いられる。
【０００４】
光学活性なアミノ酸およびアミンの合成に利用されているいくつかの酵素的方法のうち、ω-トランスアミナーゼ(ω-TAs)は、多数の医薬品の製造用のビルディングブロックとして頻繁に用いられる光学活性アミンの不斉合成におけるそれらの潜在能力のため、最近大きな注目を集めている。
【０００５】
ω-トランスアミナーゼは、アミノ基転移反応を触媒するPLP(ピリドキサールリン酸)依存性酵素である。ω-トランスアミナーゼを利用する場合、いわゆるエナンチオ富化されたおよび/または純粋な光学活性アミンは主に2つの反応戦略を経て製造することができる：(i)ケトンから出発する不斉合成、および(ii)ラセミ体のアミンから出発する速度論的分割。ω-トランスアミナーゼは一般に良好なエナンチオ選択性を示すが、それらは不斉合成に(この場合には100％の収率が理論的に可能であるにもかかわらず)頻繁には使用されていない。ω-トランスアミナーゼを利用する不斉合成での1つの特定要件は、生成物側に平衡をシフトすることであり、特にアミノ供与体としてアラニンのようなアミノ酸を用いる場合にはそうである。というのは、この場合には、平衡が基質(ケトン、アラニン)の側にあって、生成物(アミン、ピルビン酸)の側にないからである。もう1つの要件は、酵素の立体選択性が完璧でなければならない、ということであるが、ω-トランスアミナーゼの場合は必ずしもそうとは限らない。したがって、ω-トランスアミナーゼは主にラセミ体アミンの速度論的分割に用いられ、この場合にはエナンチオ選択性が必ずしも完璧である必要はない。こうして、ラセミ体アミンの速度論的分割が検討されてきたものの、最大収率50％の制限がそれらの応用を大幅に妨げている。一方、不斉合成には、不利な平衡を、光学的に純粋なアミンの単一エナンチオマーの合成の方へシフトする方法が必要であり、そのためにいくつかの方法が開発されたが、このことは、工業的規模でのトランスアミナーゼの使用を可能にする効率的な方法の1つの重要な前提条件となっている。そのような方法がWO 2007/093372に開示されている。
【０００６】
EP 0 987 332 A1は、光学活性アミノ化合物、すなわち(R)-アミノ化合物を、微生物の酵素、特にアルスロバクター属細菌(Arthrobacter sp.)に由来する(R)-選択的ω-トランスアミナーゼを用いて、製造する方法を開示している。EP 1 038 953 A1は、さらに他の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼを開示しているが、これはマイコバクテリウム・オーラム(Mycobacterium aurum)に由来するものである。
【０００７】
Iwasakiら(Biotechnol. Let. 2003 (25), 1843-1846)、Koszelewskiら(Adv. Synth. Catal. 2008 (350), 2761-2766)およびIwasakiら(Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006 (69), 499-505)は、アルスロバクター属細菌由来のR-特異的トランスアミナーゼを開示している。有用な(S)-または(R)-選択的トランスアミナーゼを提供する微生物の同定は、通常、例えば土壌サンプルから得られた微生物を選別して、それらを培養下で増やすことにより行われる(Jun et al., App. Microbiol. Biotechnol. 2004 (70), 2529-2534およびShin et al. (Biosc. Biotechnol. Biochem. 2001 (65), 1782-1788))。特に、上記のR-選択的ω-トランスアミナーゼはすべてが集積培養によって得られたものである。こうした方法には多大な時間が必要である。なぜなら、効率的な方法では、多くの場合、大腸菌(Escherichia coli)のような異種生物内で酵素を過剰発現させることが好適であるからである。これは野生型生物からの遺伝子配列の単離を必要とするが、DNA配列のクローニングはいつも成功するとは限らず、しかも非常に時間のかかるプロセスである。
【０００８】
特に、プロセスの開発中または新規ω-TAの同定では、酵素の精製とそれらの酵素的特性の解析に大きな関心が寄せられる。ところが、ω-TA活性は通常、HPLCまたはキャピラリー電気泳動(CE)などの低スループットの方法で測定されるので、酵素的特性の測定がむしろ律速段階となることが多い。
【０００９】
一般的に、(S)-選択的ω-トランスアミナーゼに比較して、入手可能な(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの数ははるかに限られている。このことは、各種キラルアミンの(R)-エナンチオマーの不斉合成にとって非常に望ましい(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの高い需要とは際立って対照的である。かくして、さらなる(R)-選択的ω-トランスアミナーゼを提供する必要性、ならびにこれまで全く入手できないか、経済的に実現可能な方法で、好ましくは工業的規模で、入手できなかった、(R)-エナンチオマー、特に光学活性アミン、例えば医薬または農薬への応用のための光学活性アミンを製造するために、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼを取得する手段および方法を提供する必要性、が依然として存在している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明は、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼ、特に目的の(R)-エナンチオマーを好ましくは光学的に純粋な形で生成するための(R)-選択的ω-トランスアミナーゼを同定、特性解析および取得するための、好ましくは工業的規模での同定、特性解析および調製に適する、単純で、迅速で、信頼性の高い手段および方法を提供するという技術的課題に基づいている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、その技術的課題を、独立請求項の教示を提供することによって、特に特許請求の範囲に記載された方法、それにより得られる生成物および使用を提供することによって、解決するものである。
【００１２】
かくして、本教示は、特定の実施形態において、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼ(ω-TAともいう)の調製方法を提供し、この方法は以下のステップを含む：
a) 少なくとも1種のトランスアミナーゼまたはリアーゼ(好ましくは、PLP依存性酵素のフォールドタイプIVに属するトランスアミナーゼまたはリアーゼ)の少なくとも1つのクエリー生体分子配列および少なくとも1つの生体分子バンクを提供するステップ；
b) その生体分子バンクをクエリー生体分子配列で検索して第1の標的生体分子配列のグループを同定するステップであって、第1の標的生体分子配列は、アミノ酸レベルで計算して、クエリー生体分子配列に対して少なくとも20％、好ましくは32％の配列同一性の程度を有する、上記ステップ；
c) 第1の標的生体分子配列のグループにおいて、アミノ酸レベルで、次のアミノ酸配列モチーフc1)〜c3)：
c1) 95〜97位のアミノ酸配列Tyr Xa1 Xa2(ここでXa1はアミノ酸Ile、Val、Leu、Met、Pheであり、Xa2はアミノ酸ArgもしくはLysである)、または
c2) 97〜99位のアミノ酸配列Tyr Xaa Gln(ここでXaaはアミノ酸、好ましくは通常のアミノ酸である)および105〜111位の領域中の(好ましくは107〜109位の)アミノ酸配列Arg Xaa Xa3(ここでXa3はアミノ酸、好ましくはHisである)、または
c3) 38位のThr、97位のLysおよび107〜109位のアミノ酸配列Arg Xa4 Xa5(ここでXa4はアミノ酸、好ましくはGlyであり、Xa5はアミノ酸、好ましくはTyrである)
の少なくとも1つを含まず、かつ
c4) 95位のTyr、Arg、Lys以外の別のアミノ酸、または95位のTyr、ただし97位のArgもしくはLysの非存在、および
c5) 40位のLysまたはArgの非存在、および
c6) 161〜165位の領域中の(好ましくは163位の)Lys
を含む、第2の生体分子標的配列のグループを選択して、第2の標的生体分子配列のグループを同定するステップ；および
d) ステップc)で同定された第2の生体分子標的配列を有し、かつ(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの活性を有するタンパク質であるか、または該タンパク質を少なくとも部分的にコードする生体分子を提供する(好ましくは調製する)ステップ。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】標準的な合成によって得られたB3APiのクロマトグラムを示す。
【図２】本発明による不斉合成によって得られたB3APiのクロマトグラムを示す。
【図３】本発明による不斉合成によって得られたC3APのクロマトグラムを示す。
【図４】本発明による不斉合成によって得られたMPPAのクロマトグラムを示す。
【図５】本発明による不斉合成によって得られたB3APのクロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
用語「タンパク質であるか、または該タンパク質を少なくとも部分的にコードする生体分子」は、好ましくは、その生体分子が(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの活性を有するタンパク質であるか、または生体分子がヌクレオチド配列である場合には、そのヌクレオチド配列の少なくとも一部が前記タンパク質、好ましくは全長タンパク質をコードする、ことを意味する。したがって、提供される生体分子がヌクレオチド配列分子である場合には、そのヌクレオチド配列分子の少なくとも一部が(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの活性を有するタンパク質をコードしており、それによって、おそらく該ヌクレオチド配列のさらなる部分が他の何らかの機能、例えば調節または複製機能を有している。こうして、用語「ステップc)で同定された第2の生体分子標的配列を有し、かつ(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの活性を有するタンパク質であるか、または該タンパク質を少なくとも部分的にコードする生体分子を提供する」は、好ましくは、用語「(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの活性を有するタンパク質であり得るか、またはタンパク質が(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの活性を有する限りでは前記タンパク質をコードする配列を含むヌクレオチド配列分子であり得る、ステップc)で同定された第2の生体分子標的配列を有する生体分子を提供する」に等しい。
【００１５】
本発明の一実施形態では、ステップc2)において、Arg Xaa Xa3モチーフの位置は、107〜109位から1〜2アミノ酸だけ変化することがあり、すなわち、105〜111位であり得る。
【００１６】
本発明の一実施形態では、ステップc6)において、Lysの位置は163位で1〜2アミノ酸だけ変化することがあり、すなわち、161〜165位であり得る。
【００１７】
本発明に関して、所定の各アミノ酸配列、特にアミノ酸配列モチーフ、またはDNA配列もしくはDNA配列モチーフは、どちらが適用されるにしても、特に指定のない限り、アミノ末端からカルボキシ末端の方向で、または5’から3’方向で示される。好ましくは、所定の方向で示された配列は、どちらが適用されるにしても、介在するヌクレオチドまたはアミノ酸を含まない一続きの配列として示される。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態において、ステップa)で用いられる少なくとも1種のトランスアミナーゼの少なくとも1つのクエリー生体分子配列は、好ましくは、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼである。さらに好ましい実施形態では、ステップa)で用いられる少なくとも1種のトランスアミナーゼの少なくとも1つのクエリー生体分子配列は、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼ、分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ(BCAT)およびD-アミノ酸トランスアミナーゼ(DATA)からなる群より選択される。好ましくは、分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼは大腸菌由来である。本発明の好ましい実施形態において、ステップa)で用いられる少なくとも1種のリアーゼの少なくとも1つのクエリー生体分子配列は、アミノデオキシコリスミン酸リアーゼ(amino deoxychorismatlyase)(ADCL)である。
【００１９】
本発明は、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼを迅速で、効率的で、単純で、信頼性の高い、簡便な方法で調製する方法を提供する。したがって、本発明は、以前には知られていなかったか入手できなかった(R)-選択的ω-トランスアミナーゼを同定して調製することを可能にし、キラルアミン、好ましくは(R)-エナンチオマーを、特に非常に効率のよい不斉合成経路で提供するための多数の方法を開拓するものである。既知の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼに対する配列同一性の程度が予想に反して低い(例えば、たったの35％の)タンパク質でさえ、実際には(R)-選択的ω-トランスアミナーゼである、ということがわかって、成功する可能性がある。特に有利な予期せざる方法において、本発明は、好ましくは、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)およびメソリゾビウム・ロティ(Mesorhizobium loti)由来の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼを提供することを可能にし、そのために、アスペルギルス由来のトランスアミナーゼは最初の真核生物ω-トランスアミナーゼであり、また、それは(R)-選択性でもって基質を変換する。
【００２０】
基本的に、本発明は次の技術的教示に基づいている：タンパク質またはそのコードヌクレオチド配列は、既知のトランスアミナーゼまたはリアーゼ、特に(R)-選択的ω-トランスアミナーゼに対する配列同一性の程度が低いものでさえ、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼを同定して調製するための潜在的供給源として使用することができ、その場合に、推定上の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼは、望ましくない配列モチーフを識別し、それによりアミノ酸配列中に特定の配列モチーフ(望ましい酵素活性に寄与する)を示すタンパク質を積極的に選択することによって、スクリーニングおよび調製される。こうして、本発明は特に、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼを同定して調製するために、特定の構造的特徴、特に推定上の(R)-選択的ω-TA中の特定のアミノ酸の存在および非存在を使用するものである。
【００２１】
したがって、本方法の最初のステップa)では、少なくとも1種のトランスアミナーゼもしくはリアーゼ(例えば既知の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼ)のクエリー生体分子配列、またはそのようなリアーゼもしくはトランスアミナーゼ(好ましくは(R)-特異的ω-トランスアミナーゼ)の少なくとも特徴的配列部分、好ましくは特にフォールドタイプIVのPLP依存性酵素を同定できるもの、が少なくとも1つの生体分子バンクと共に提供される。好ましくは、クエリー生体分子配列は、トランスアミナーゼまたはリアーゼの、特に(R)-選択的ω-TAのORF(オープンリーディングフレーム)、コードヌクレオチド配列、またはその特徴的部分である。別の実施形態では、クエリー生体分子配列がORF-アミノ酸配列それ自体またはその特徴的部分である。
【００２２】
本発明に関して、少なくとも1種のトランスアミナーゼまたはリアーゼ(特に既知の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼ)のクエリー生体分子配列の特徴的部分は、そのDNA配列分子の形で、全長クエリー生体分子配列(特にORFのDNA配列)に以下の条件下でハイブリダイズする生体分子配列である。
【００２３】
DNAなどの核酸のハイブリダイゼーションの方法はよく知られており、例えば、Molecular Cloning, 第3版(2001); Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press (1994); Immunology methods manual, Academic Press (Molecular)、および他の多くの標準的な教科書に記載されている。
【００２４】
ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションの例は次のとおりである。フィルター上に固定させた核酸およびプローブとして用いる核酸を、50％ホルムアミド、5×SSC (750mM塩化ナトリウムおよび75mMクエン酸ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハルト液、10％デキストラン硫酸および20μg/l変性サケ精子DNAを含む溶液中で42℃にて一晩インキュベートする。インキュベーション後、フィルターを0.2×SSC溶液(約65℃)中で洗浄する。こうしたストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、ホルムアミドの濃度を調整することによって(ホルムアミドの濃度が低下するにつれて、より低いストリンジェントな条件になる)、また、塩濃度と温度条件を変えることによって、変更することができる。
【００２５】
より低いストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを実施するには、例えば、フィルター上に固定させた核酸およびプローブとして用いる核酸を、6×SSCE (20×SSCE: 3mol/l塩化ナトリウム、0.2mol/lリン酸二水素ナトリウムおよび0.02mol/l EDTA、pH7.4)、0.5％SDS、30％ホルムアミドおよび100μg/l変性サケ精子DNAを含む溶液中で37℃にて一晩インキュベートし、そのフィルターを0.1％SDS含有1×SSC溶液(50℃)で洗浄する。
【００２６】
特に好ましい実施形態において、本発明では、用語「少なくとも1種のトランスアミナーゼまたはリアーゼの少なくとも1つのクエリー生体分子配列」のもとで、生体分子配列は、本明細書中で特定した配列モチーフc1)〜c6)の存在または非存在に従って生体分子配列を選択するのに適するもの、と理解される。したがって、そのようなクエリー生体分子配列は、アミノ酸レベルでアミノ酸配列モチーフc1)〜c3)の少なくとも1つを含まず、かつアミノ酸レベルで配列モチーフc4)、c5)およびc6)を含む生体分子配列をスクリーニングして同定する配列である。そうしたクエリー生体分子配列は、アミノ酸配列情報として、またはDNA配列分子もしくはDNA配列情報として具体化することができる。
【００２７】
好ましい実施形態において、ステップa)で用いるクエリー生体分子配列の特徴的部分は、トランスアミナーゼ、好ましくは(R)-選択的ω-トランスアミナーゼ、またはリアーゼのORFの30位から170位まで、最も好ましくは30位から120位までの領域を包含し、好ましくは該領域からなる。
【００２８】
生体分子バンクは、後続のステップb)で、クエリー生体分子配列を用いて検索され、アミノ酸レベルに基づいて、そのクエリー生体分子配列に対して少なくとも最低限度の配列同一性、すなわち、少なくとも20％、好ましくは25％、好ましくは32％、好ましくは少なくとも33％、最も好ましくは34％、少なくとも35％、少なくとも36％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも95％の配列同一性を示す、第1の標的生体分子配列のグループを同定する；ここにおいて、前記の第1の標的生体分子配列のグループは、ステップa)で用いられる生体分子バンクからの1次選択を表す。前記配列同一性の程度は、好ましくは、クエリー生体分子配列のORFの少なくとも特徴的部分、好ましくは本質的に完全なORF、特に完全なORFと、スクリーニングされる生体分子配列のORFの少なくとも特徴的部分、好ましくは本質的に完全なORF、特に完全なORFとの間の配列同一性である。ステップb)に続いて、この第1の標的生体分子配列のグループにおいて、ステップc)で、配列モチーフc1)として95〜97位にアミノ酸配列Tyr Xa1 Xa2(ここでXa1はアミノ酸Ile、Val、Leu、Met、Pheであり、Xa2はアミノ酸ArgまたはLysである)を含まないか、または配列モチーフc2)として97〜99位にアミノ酸配列Tyr Xaa Gln(ここでXaaはアミノ酸、好ましくは通常のアミノ酸である)および105〜111位の領域中に(好ましくは107〜109位に)アミノ酸配列Arg Xaa Xa3(ここでXa3はアミノ酸、好ましくは通常のアミノ酸、好ましくはHisである)を含まないか、または配列モチーフc3)として38位にThr、97位にLysおよび107〜109位にアミノ酸配列Arg Xa4 Xa5(ここでXa4はアミノ酸、好ましくは通常のアミノ酸、好ましくはGlyであり、Xa5はアミノ酸、好ましくは通常のアミノ酸、好ましくはTyrである)を含まない、配列を選択し、それによって、上記の配列モチーフc1)、c2)またはc3)の少なくとも1つを示す配列を識別して排除する。さらに後続のまたは同時の選択において、配列モチーフc4)に従って95位にTyr、Arg、Lys以外の別のアミノ酸を示すか、または95位にTyrを示すが、97位にArgおよびLysを示さず、かつ配列モチーフc5)に従って40位にLysおよびArgを示さず、かつ配列モチーフc6)に従って161〜165位の領域に少なくとも1個のLys、好ましくは1個のLys、好ましくは163位にLysを有する、生体分子配列を選択し、それによって、第2の生体分子標的配列のグループを選択して同定する。上記の配列モチーフについて同定およびスクリーニングされた第2の標的生体分子配列のグループは、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの活性を有するタンパク質であるか、または該タンパク質をコードする、生体分子配列を表し、それによって(R)-選択的ω-トランスアミナーゼが提供される。
【００２９】
本発明に関して、トランスアミナーゼは、好ましくはフォールドタイプIVに分類される、アミノ基の転移を触媒するピリドキサールリン酸依存性の酵素である。トランスアミナーゼはE.C. 2.6.1.Xに分類される。本発明の特に好ましい実施形態では、トランスアミナーゼが(R)-選択的トランスアミナーゼであり、特に、好ましい実施形態ではω-トランスアミナーゼである。本発明に関して、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの活性を有するタンパク質は、適切な反応条件下で、供与体から受容体へのアミノ基のような窒素含有基の転移を触媒することができるタンパク質であり、例えば(R)-選択的ω(オメガ)-トランスアミナーゼ(β-アラニン-ピルビン酸トランスアミナーゼ)はそうすることが可能である。本発明に関して、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼは好ましくは分類コードE.C.2.6.1.18を有する酵素である。
【００３０】
本発明に関して、用語「光学活性なキラルアミン」は、用語「鏡像異性的に活性なキラルアミン」と同じ内容に関係している。これらの用語は特に、不要なエナンチオマーが本質的に含まれない調製物、さらに好ましい実施形態では、不要なエナンチオマーが含まれない調製物をさす。したがって、光学活性なキラルアミンは本質的に一方のエナンチオマーを過剰に含むか、または一方のエナンチオマーのみからなることさえある。
【００３１】
特に、本発明に関して、光学活性なキラルアミンは、少なくとも70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.6、99.7、99.8、特に少なくとも99.9％の光学純度を有する。
【００３２】
本発明において、光学純度は、一方のエナンチオマーの他方のエナンチオマーに対する過剰％で示される。したがって、％で表される光学純度は、(R)および(S)エナンチオマーの濃度の差と、両エナンチオマーの濃度の合計の、比率である(％でのAの光学純度＝([A]-[B])：([A]+[B])×100、ここでAおよびBは(R)および(S)エナンチオマーの濃度またはその逆を表す)。
【００３３】
本発明に関して、生体分子バンクは、生体分子そのものの供給源、または生体分子の配列データ(特にポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列データ)のコレクションである。
【００３４】
本発明に関して、生体分子は好ましくは遺伝情報を担うポリヌクレオチド分子、特にDNA分子である。本発明のさらに好ましい実施形態では、生体分子はいくつかのアミノ酸で構成されるポリペプチド、特にタンパク質である。したがって、生体分子バンクは、生体分子の物理的供給源、特に遺伝子バンク、特にcDNAもしくはゲノムライブラリーであるか、または該生体分子についての情報のコレクション、特に配列データ、特にアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列、特にDNA配列のコレクションであるか、のいずれかであり得る。
【００３５】
本発明はまた、生体分子配列、アミノ酸配列、ポリヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列についても言及し、そのために、前記表現は、一方ではタンパク質、ポリペプチドまたはDNA分子を意味する物理的存在そのものを指し、他方では前記化学物質の情報内容を指す；その情報内容は、ポリヌクレオチドが言及される場合には、そのヌクレオチドの種類、順序および数であり、また、ポリペプチドが言及される場合には、そのポリペプチドを形成する単一アミノ酸の種類、順序および数である。
【００３６】
本発明に関して、用語「生体分子」、「DNA分子」、「ポリヌクレオチド分子」、「ポリペプチド」または「タンパク質」は化学物質そのものを指す。本発明がアミノ酸配列情報、DNA配列情報、ポリヌクレオチド配列情報または生体分子配列情報について特に言及する場合は、それは生体分子の物理的形状を指すのではなく、それに含まれる情報、すなわち、その構成成分(つまりアミノ酸またはヌクレオチド)の種類、順序および数のことを指している。
【００３７】
本発明は、好ましい実施形態A)において、そのステップa)〜c)で、一実施形態ではポリヌクレオチド配列(特にDNA配列)の、別の実施形態ではアミノ酸配列の、配列データのコレクションである生体分子バンクに適用され、これらの両配列がステップb)で配列アライメントツール、好ましくは例えばBLAST(基本的局所アライメント検索ツールである)により検索されて、第1の標的生体分子配列のグループが同定される(Altschul, S.F. et al. 1990. J. Mol. Biol. 215:403; Altschul, S.F. et al. 1997. Nucleic Acid Res. 25:3389-3402)。他の適当なプログラムとしては、Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI, USA)のGAP、BESTFITおよびFASTAが挙げられる。さらにステップc)では、同定された第1の生体分子配列のグループがさらなる選択ステップに供され、その過程では、特定の配列モチーフを用いて、配列モチーフc1)〜c3)で消極的に、また、配列モチーフc4)〜c6)で積極的に、目的の生体分子配列を同定して選択する。第2のグループの生体分子配列が同定されると、本発明では、前記配列情報を用いて、対応するオリゴ-またはポリヌクレオチド分子(例えばハイブリダイゼーションプライマー)を調製し、物理的形状の生体分子バンクにおいて、第2のグループ中の同定された酵素をコードするDNA配列分子をスクリーニングして選択する。こうして、好ましい実施形態では、ステップc)で得られた配列情報を、対応する遺伝子のゲノムDNAまたはcDNAライブラリーからのクローニングと、そのタンパク質の例えば大腸菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)または他の細胞内での発現のために使用することができる。本発明の別の好ましい実施形態では、ステップc)で得られた配列情報が、目的の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼのデノボ合成のために用いられる。そのような好ましい実施形態では、ステップc)で得られた配列情報を、例えばコドン使用頻度の最適化とmRNAの安定性を考慮した、遺伝子の合成のために、また、そのような遺伝子のクローニングおよび発現のために、使用することが可能である。そうした好ましい実施形態によれば、ステップa)における少なくとも1つの生体分子バンクとして、DNA配列情報またはアミノ酸配列情報のいずれかを含む生体分子バンクを用いることができる。生体分子バンクがDNA配列情報を含む場合は、その情報は、アミノ酸配列がクエリー生体分子配列としておよびアミノ酸配列モチーフとして用いられるステップb)〜c)に従って処理するために、アミノ酸配列情報に翻訳される必要があり、あるいは、ステップb)〜c)は、DNA配列情報に戻して翻訳されたクエリー生体分子配列および配列モチーフc1)〜c6)を用いてDNA配列バンクにおいて実施される。
【００３８】
本発明の別の好ましい実施形態では、本教示は、ステップa)における実施形態B)において、物理的形状の遺伝子バンクとして存在する生体分子バンク、特に遺伝子ライブラリー、例えばcDNAライブラリー、メタゲノムライブラリーまたはゲノムライブラリーに適用され、少なくとも1種の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの全部または少なくとも特徴的部分をコードするDNA分子を用いて、アミノ酸レベルで計算して、クエリーDNA配列分子に対して少なくとも20％、好ましくは32％の配列同一性の程度を有する第1の生体分子配列のグループ、特にDNA配列分子を検索し、同定して選択する。後続のステップc)は、好ましくは、所望の配列モチーフc1)〜c6)を同定して積極的および消極的に選択するヌクレオチド分子プライマーを用いて、前記の第1のDNA分子のグループにおいて実施される。
【００３９】
本発明に関して、用語「配列モチーフ」とは、特許請求の範囲に記載された方法のステップc)で特定された推定上の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼのアミノ酸配列の特定の選択的特徴を指す。特に、第1の配列モチーフc1)は、95〜97位にアミノ酸配列Tyr Xa1 Xa2(ここでXa1はアミノ酸Ile、Val、Leu、Met、Pheであり、Xa2はアミノ酸ArgまたはLysである)としてこの順序で同定される配列モチーフであり、この配列モチーフは、本発明によれば、最終的に選択される生体分子配列中に存在してはならない。第2の配列モチーフc2)は、97〜99位にアミノ酸配列Tyr Xaa Gln(ここでXaaはアミノ酸である)としてこの順序で、および105〜111位の領域中に(好ましくは107〜109位に)アミノ酸配列Arg Xaa Xa3(ここでXaaはアミノ酸であり、Xa3はアミノ酸、好ましくはHisである)としてこの順序で同定される配列モチーフであり、これらの配列モチーフもまた、最終的に選択される生体分子配列中に存在してはならない。第3の配列モチーフc3)は、38位のThr、97位のLysおよび107〜109位のアミノ酸配列Arg Xa4 Xa5(ここでXa4はアミノ酸、好ましくはGlyであり、Xa5はアミノ酸、好ましくはTyrである)の存在によって特徴づけられる配列モチーフであり、このモチーフc3)は最終的に選択される生体分子配列中に存在してはならない。
【００４０】
第4の配列モチーフc4)は、95位にTyr、Arg、Lys以外の別のアミノ酸が存在するか、または95位にTyrが存在するが、97位にArgもしくはLysが存在しない、ことを要求し、この配列モチーフは本発明により調製される推定上の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼに必要な資格を与える。第5の配列モチーフc5)は、40位にLysおよびArgが最終的に調製および同定される推定上の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼ中に存在しない、ことを要求する。第6の配列モチーフc6)は、161〜165位の領域中に少なくとも1個のLys、好ましくは1個のLys、好ましくは163位にLys、が最終的に調製および同定される(R)-選択的ω-TA中に存在する、ことを要求する。
【００４１】
本発明に関して、アミノ酸位置の識別および位置決定は次のように決定される。第1の標的生体分子配列を、互いとおよびクエリー生体分子配列とアライメントし、好ましくは多重アライメントする。アライメントは従来のアライメントソフトウェア、例えばSTRAP、特にClustalW、好ましくはClustalW3Dを用いて行うことができる。別の実施形態では、配列同士をペアワイズでアライメントすること、すなわち、それぞれの第1の標的生体分子配列をクエリー生体分子配列とアライメントすることも可能である。好ましい実施形態では、第1の標的生体分子配列が大腸菌のBCATとアライメントされる。別の好ましい実施形態では、第1の標的生体分子配列が本発明で用いる別のクエリー生体分子配列、例えば(R)-選択的ω-トランスアミナーゼとアライメントされる。
【００４２】
本発明で示されるアミノ酸位置のアノテーションは、位置基準として用いられるクエリー生体分子配列中の対応する配列モチーフの位置によって決定される。上記のアライメントは、クエリー生体分子配列中に存在する配列モチーフに対して、第1の標的生体分子配列の対応するアミノ酸位置をアライメントする。
【００４３】
一例として、アミノ酸位置のアノテーションの基準として大腸菌のBCATを用いると、92〜100位の既知の大腸菌BCATアミノ酸配列、すなわちTSAYIRPLI(配列番号9)が推定上のω-トランスアミナーゼの95〜99位を同定するために使用され、この位置は配列モチーフc1)、c2)、c3)の非存在およびc4)の存在について分析される。大腸菌BCATの35〜42位の既知アミノ酸配列、すなわちVFEGIRCY(配列番号10)は、配列モチーフc3)およびc5)のために38位のGの位置をマークする。大腸菌BCATアミノ酸配列中のアミノ酸配列DVGMGVNP(配列番号11)は、105〜111位の配列モチーフc3)のために104〜111位をマークする。既知の大腸菌BCATの159〜167位のアミノ酸配列PTAAKAGGN(配列番号12)は、配列モチーフc6)のためにKとしての163位をマークする。
【００４４】
こうして、本発明の好ましい実施形態では、生体分子がタンパク質であって、生体分子配列がアミノ酸配列である。したがって、好ましい実施形態において、生体分子バンクは、さまざまなタンパク質に関する情報、特にアミノ酸配列の情報が収集されているバンク、特にデータベースである。好ましいデータベースバンクはNCBIタンパク質データバンク、UniProtKB/SwissProtおよびUniProtKB/TrEMBLデータバンクである。
【００４５】
好ましい実施形態では、生体分子がDNA分子であって、生体分子配列がDNA配列である場合もある。したがって、好ましい一実施形態において、生体分子バンクは、さまざまなポリヌクレオチド配列、特にDNA配列に関する情報を収集したバンク、特にデータベースである。
【００４６】
好ましい実施形態において、本発明は、生体分子バンクが生体分子データベースであって、その生体分子データベースをステップb)で生体分子配列アライメントプログラム、特にBLASTにより検索する、上記の方法を使用する。好ましい実施形態では、生体分子バンクが生体分子データベースである場合、その生体分子データベースを、ステップb)で、生体分子データベースがアミノ酸配列データベースであるときはアミノ酸配列で検索し、生体分子データベースがDNA配列データベースであるときはDNA配列で検索することが想定される。
【００４７】
本発明は、最終的にステップd)で、生体分子、好ましくはDNA分子またはアミノ酸配列分子(すなわちタンパク質)を、トランスアミナーゼのデノボ合成によって、または第2の生体分子配列に基づいて規定されるプライマーの助けをかりて目的のトランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチドを物理的遺伝子バンクから単離することによって、取得することを想定している。得られたポリヌクレオチド、特にDNA配列分子は、目的のトランスアミナーゼを適切な条件下に適切な培地中で発現させるために使用される。
【００４８】
本発明はまた、上記のステップa)〜c)を含む、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼのスクリーニングおよび同定方法に関し、その方法は特に、少なくとも1種の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの少なくとも1つのクエリー生体分子配列および少なくとも1つの生体分子バンクを提供するステップ、生体分子バンクをクエリー生体分子配列で検索して第1の標的生体分子配列のグループを同定するステップであって、第1の生体分子配列は、アミノ酸レベルで計算して、クエリー生体分子配列に対して少なくとも20％、好ましくは25％、好ましくは32％の配列同一性の程度を有するものである、上記ステップ、第1の標的生体分子配列のグループにおいて、アミノ酸レベルで、配列モチーフc1)〜c3)のどれかを含まず[ここでc1)は95〜97位のアミノ酸配列Tyr Xa1 Xa2(ここでXa1はアミノ酸Ile、Val、Leu、Met、Pheであり、Xa2はアミノ酸ArgもしくはLysである)であり、またはc2)は97〜99位のアミノ酸配列Tyr Xaa Gln(ここでXaaはアミノ酸である)および105〜111位の領域中の(好ましくは107〜109位の)アミノ酸配列Arg Xaa Xa3(ここでXa3はアミノ酸、好ましくはHisである)であり、またはc3)は38位のThr、97位のLysおよび107〜109位のアミノ酸配列Arg Xa4 Xa5(ここでXa4はアミノ酸、好ましくはGlyであり、Xa5はアミノ酸、好ましくはTyrである)である]、かつ配列モチーフc4)、c5)およびc6)を含む[ここでc4)はアミノ酸レベルで95位のTyr、Arg、Lys以外の別のアミノ酸であるか、または95位のTyrであるが、97位のArgもしくはLysの非存在であり、c5)は40位のLysまたはArgの非存在であり、c6)は161〜165位の領域中の(好ましくは163位の)Lysである]生体分子配列を選択して、(R)-選択的ω-TAの生体分子配列である第2の生体分子配列のグループを同定するステップを含む。
【００４９】
本発明のさらに好ましい実施形態において、本教示は、本発明の調製方法により得られる(R)-選択的ω-トランスアミナーゼを提供する。特に、本発明は、メソリゾビウム・ロティおよびアスペルギルス・テレウス由来のタンパク質、ならびに該タンパク質をコードするDNA配列、特にDNA分子を提供し、メソリゾビウム・ロティについては配列番号1および2で、アスペルギルス・テレウスについては配列番号3および4で特定される。本発明は特に、最も好ましい実施形態において、次の教示を提供する：本発明により取得または調製される(R)-選択的ω-トランスアミナーゼ(例えば、配列番号1および3で特定されるもの)はアミノ基転移反応に用いることができ、特に、少なくとも1種のアミノ受容体と少なくとも1種のアミノ供与体を本発明による(特に配列番号1または3の)(R)-選択的ω-トランスアミナーゼと反応させて光学活性なキラルアミンを得ることを含む、光学活性なキラルアミン(好ましくは、キラルアミンの(R)-エナンチオマー)の調製方法に使用することができる。好ましい実施形態において、光学活性なキラルアミンの調製方法は、ケト基含有化合物としてのケトンおよびアミノ供与体を用いる不斉合成である。別の好ましい実施形態では、前記調製方法が速度論的分割反応を利用するものである。その場合のアミノ供与体は好ましくはラセミ体アミンの混合物であり、アミノ受容体は好ましくはエダクトとしてのケトンである。
【００５０】
ケトンから出発する不斉合成において本発明の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼを用いることによって光学活性なキラルアミンが合成される本発明の好ましい実施形態によれば、目的の光学活性キラルアミン、すなわち(R)-エナンチオマーへの好ましい変換率は、少なくとも70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、最も好ましくは100％である。
【００５１】
本発明の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼがラセミ体アミンから出発する速度論的分割反応において用いられる別の好ましい実施形態によれば、光学活性キラルアミン、好ましくは(S)-エナンチオマーへの好ましい変換率は、少なくとも30、40、45、46、47、48、49、特に50％である。
【００５２】
光学純度および変換率を解析するための濃度は、例えばHPLC、キャピラリー電気泳動(CE)、ガスクロマトグラフィー(GC)、または光度もしくは蛍光光度測定法を用いて、決定することができる。
【００５３】
こうして、好ましい実施形態において、本発明は、光学活性なキラルアミンの製造方法に関し、この方法は、ケト基を含むアミノ受容体化合物およびアミンのラセミ混合物を、トランスアミナーゼ、特に(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの存在下で、好ましくは本発明の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの存在下で反応させて、キラルアミンの(S)-エナンチオマーを取得することを含む。
【００５４】
本発明の別の好ましい実施形態では、光学活性なキラルアミン、特に前記アミンの(R)-エナンチオマーの製造方法が提供され、その方法は、ケト基を含むアミノ受容体化合物およびアミノ供与体を、特に本発明により得られる(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの存在下で反応させて、アミンの(R)-エナンチオマーを取得することを含む。
【００５５】
本発明に関して、アミノ受容体は、トランスアミナーゼ、特にω-トランスアミナーゼによってアミノ供与体から転移されるアミノ基を受け入れることができる分子である。本発明の特に好ましい実施形態では、アミノ受容体がケトン官能基を含むものである。
【００５６】
本発明の特に好ましい実施形態において、アミノ受容体は、フェニルピルビン酸、その塩、ピルビン酸、その塩、アセトフェノン、2-ケトグルタル酸、3-オキソ酪酸、2-ブタノン、3-オキソピロリジン(3-OP)、3-ピリジルメチルケトン(3-PMK)、3-オキソ酪酸エチルエステル(3-OBEE)、3-オキソペンタン酸メチルエステル(3-OPME)、N-1-boc-オキソピペリジノン、N-1-boc-3-オキソピロリジン(B3OP)、3-オキソ-ピペリジン、N-1-boc-3-オキソピペリジン(B3OPi)、1-Cbz-3-オキソピペリジン(C3OPi)、1-Cbz-3-オキソピロリジン(C3OP)、アルキル-3-オキソ-ブタン酸（butonoate）、メトキシアセトンおよび1-オキソテトラロンからなる群より選択される。
【００５７】
本発明に関して、アミノ供与体は、トランスアミナーゼ、特にω-トランスアミナーゼを用いて、アミノ受容体にアミノ基を供与することができる分子である。特に好ましい実施形態では、アミノ供与体がアミンまたはアミノ酸である。
【００５８】
特に好ましい実施形態において、アミノ供与体は、β-アラニン、アラニン、α-メチルベンジルアミン(α-MBA)、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、3-アミノ酪酸、イソプロピルアミン、2-アミノブタンおよびγ-アミノ酪酸またはそれらのいずれかの塩、例えば塩化物からなる群より選択される。特に好ましい実施形態では、得られるケトン生成物がフェニルピルビン酸、その塩、ピルビン酸、その塩、グリオキシル酸、その塩、アセトフェノン、2-ケトグルタル酸、アセトン、3-オキソ酪酸、2-ブタノン、3-オキソピロリジン(3-OP)、3-ピリジルメチルケトン(3-PMK)、3-オキソ酪酸エチルエステル(3-OBEE)、3-オキソペンタン酸メチルエステル(3-OPME)、N-1-boc-オキソピペリジノンおよびN-1-boc-3-オキソピロリジン(B3OP)またはそれらのいずれかの塩、例えば塩化物であり得る。
【００５９】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、光学活性アミノ基をもつアミン、特にアルキル基、分枝アルキル基またはアリールアルキル基をもつアミンの群から選択される光学活性キラルアミンの製造方法に関する。特に、これらのアミン、とりわけ単環式または二環式アミンは、特に5〜6員環式またはS-、O-もしくはN-置換複素環式炭化水素のアミンまたは芳香族アミン、特にアルキル-もしくはアルコキシ-置換芳香族アミンである。好ましい実施形態では、得られるキラルアミンはフェニルアラニン、アラニン、3-アミノピペリジン、アルキル-3-アミノ-ブタン酸、3-アミノピロリジン(3-AP)、3-ピリジル-1-エチルアミン(3-PEA)、N-1-boc-3-アミノピロリジン(B3AP)、N-1-boc-3-アミノピペリジン(B3APi)、1-Cbz-3-アミノピペリジン(C3APi)、1-Cbz-3-アミノピロリジン(C3AP)、3-アミノ酪酸エチルエステル(3-ABEE)、3-アミノペンタン酸メチルエステル(3-APME)、α-メチルベンジルアミン(α-MBA)、1-アミノテトラリン、3,4-ジメトキシフェニルアセトン、α-メチル-4-(3-ピリジル)-ブタンアミン、γ-アミノ酪酸、グルタミン酸、イソプロピルアミン、β-アミノ酪酸、sec-ブチルアミン、メトキシイソプロピルアミン、3-アミノピロリジンの誘導体、1-N-Boc-3-アミノピペリジン、セファロスポリンおよびセファロスポリンの誘導体からなる群より選択される。
【００６０】
特に好ましい実施形態において、本発明は、それゆえ、3OPを(R)-選択的ω-トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて光学活性(R)-3APを取得することを想定している。
【００６１】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、3-PMKを(R)-選択的ω-トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて光学活性(R)3-PEAを取得することを想定している。
【００６２】
本発明のさらに好ましい実施形態において、本発明は、3-OBEEを(R)-選択的ω-トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて光学活性(R)3-ABEEを取得することを想定している。
【００６３】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、3-OPMEを(R)-選択的ω-トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて光学活性(R)3-APMEを取得することを想定している。
【００６４】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、B3OPを(R)-選択的ω-トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて光学活性(R)-B3APを取得することを想定している。
【００６５】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、B3OPiを(R)-選択的ω-トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて光学活性(R)-B3APiを取得することを想定している。
【００６６】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、C3OPiを(R)-選択的ω-トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて光学活性(R)-C3APiを取得することを想定している。
【００６７】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、C3OPを(R)-選択的ω-トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて光学活性(R)-C3APを取得することを想定している。
【００６８】
本発明のさらに好ましい実施形態において、本発明は、アセトフェノンを(R)-選択的ω-トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて光学活性(R)α-MBAを取得することを想定している。
【００６９】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、アミノ受容体、特に単環式または二環式の、オキソ基を含有する5〜6員環式またはS-、O-もしくはN-置換複素環式炭化水素または芳香族化合物、特にアルキル-もしくはアルコキシ-置換芳香族化合物を、アミノ供与体および(R)-選択的ω-トランスアミナーゼと反応させて、アミン、特に単環式または二環式アミン、特に5〜6員環式またはS-、O-もしくはN-置換複素環式炭化水素のアミンまたは芳香族アミン、特にアルキル-もしくはアルコキシ-置換芳香族アミンを、特に(R)体の形で、取得することを想定している。
【００７０】
本発明の特に好ましい実施形態においては、アミノ受容体とアミノ供与体を水性媒体、例えば生理学的緩衝液中で、トランスアミナーゼと反応させる。特に好ましい実施形態では、アミノ基転移反応を5〜9のpH範囲、特に7〜8.5のpHで実施する。特に好ましい実施形態では、この反応を10〜65℃、好ましくは20〜50℃、特に18〜25℃の温度範囲、好ましくは室温または34〜39℃、特に37℃で実施する。本発明のさらに好ましい実施形態では、アミノ受容体とアミノ供与体を1：1〜1：5のモル比、特に1：1〜1：2のモル比で提供する。本発明の好ましい実施形態では、酵素活性が1〜20.000μmol/分であり得る。
【００７１】
本発明はまた、トランスアミナーゼの解析方法、特にトランスアミナーゼの特性の解析方法に関し、この方法は以下のステップを含む：
i. 荷電したアミノ受容体、荷電したアミノ供与体およびトランスアミナーゼ、好ましくはω-トランスアミナーゼ、最も好ましくは本発明により得られる(R)-選択的ω-トランスアミナーゼを提供するステップ；
ii. そのアミノ受容体およびアミノ供与体をトランスアミナーゼと反応媒体中で反応させるステップ；それにより、
iii. 第1セットの反応条件下で該反応媒体の導電率を測定するステップ；および
iv. ステップiii)に続いて、第2セットの反応条件下で該反応媒体の導電率を測定し、それによりトランスアミナーゼの特性を反映する少なくとも2つの導電率の値を得るステップ。
【００７２】
荷電基質であるアミノ供与体(好ましくはアミン)とアミノ受容体(好ましくはケト酸、例えばピルビン酸)とのトランスアミナーゼ(好ましくはω-TA)触媒反応の過程では、非荷電ケトンと両性イオンアミノ成分(好ましくはアミノ酸、例えばアラニン)が形成されるため、導電率が低下する。
【化１】
【００７３】
本発明の解析方法は反応進行の簡便な測定を可能にする。好ましくは、低導電率の緩衝液、特に低導電性CHES(N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸)緩衝液が、高すぎる初期導電率を回避するために最も適している。好ましくは、導電率測定法のキャリブレーションを異なる変換反応のシミュレーションによって行うことができる。例として、標準的な基質ペアであるα-メチルベンジルアミンとピルビン酸の場合、1mM変換が44μSの変化に対応する。キャピラリー電気泳動で測定した反応速度を比較することによって本方法を検証したところ、すぐれた一致性が得られた。細胞抽出物が本方法を有意に妨げることはない。ピルビン酸はほぼすべてのω-TAの共通のアミノ受容体であるので、本方法は、さまざまなアミノ供与体に対するトランスアミナーゼ活性を検討するために使用できる。さらに、この酵素のエナンチオ選択性についての情報も取得できる。
【００７４】
この実施形態において、本発明は、トランスアミナーゼの解析方法、特にトランスアミナーゼの特性の解析方法を提供し、それによって、例えば反応媒体のpH値もしくは温度に依存するトランスアミナーゼの活性を解析したり、または反応の安定性、添加剤もしくは緩衝液組成物の効果を解析したりすることが可能である。
【００７５】
本解析方法によれば、反応媒体の第1の導電率測定を第1セットの反応条件下で実施し、その後反応媒体の少なくとも1回の第2の導電率測定を実施することによって、得られた両方の導電率の値を比較し、試験したトランスアミナーゼの活性および特性に関する結論を導き出すことができる。導電率の低下は、本発明によるトランスアミナーゼ反応において、そのトランスアミナーゼの活性を示している。導電率の低下の減速、低下の加速または低下なしを見分けることによって、トランスアミナーゼの特性に関する結論を導き出すことが可能である。
【００７６】
本発明に関して、反応条件のセットは、好ましくは、その条件が反応媒体の温度、pH値および組成からなる群より選択される反応条件のセットであり、好ましくはエダクトおよび生成物の濃度を除いた上記の反応条件である。本発明の一実施形態では、反応条件のセットが反応時間を通して一定に保たれる。本発明の別の実施形態では、反応条件のセットが反応時間を通して異なることがある。
【００７７】
好ましい実施形態において、本発明は、それゆえ、反応媒体が低導電率の緩衝液である、トランスアミナーゼのそのような解析方法にも関係する。この方法の特に好ましい実施形態では、荷電したアミノ受容体がピルビン酸である。
【００７８】
本発明の好ましい実施形態において、トランスアミナーゼを解析するための本方法は、本発明の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの調製方法に続いて使用され、また、本発明の教示を新しい有利な(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの提供へと拡大適用するだけでなく、それらの特性の測定をも可能にする。
【００７９】
本発明のさらに好ましい実施形態は従属請求項の主題である。
【００８０】
本発明は、以下の実施例および添付の配列表において、より詳細に説明される。
【００８１】
配列番号1は、メソリゾビウム・ロティ由来の(R)-選択的ω-TAの全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号2は、配列番号1をコードするDNA配列を示す；
配列番号3は、アスペルギルス・テレウス由来の(R)-選択的ω-TAの全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号4は、配列番号3をコードするDNA配列を示す；
配列番号5は、マイコバクテリウム・オーラム由来の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号6は、配列番号5をコードするDNA配列を示す；
配列番号7は、アルスロバクター属細菌由来の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号8は、配列番号7をコードするDNA配列を示す；
配列番号9は、95〜99位の確認のために用いられる大腸菌BCATの配列モチーフを示す；
配列番号10は、38位の確認のために用いられる大腸菌BCATの配列モチーフを示す；
配列番号11は、107位の確認のために用いられる大腸菌BCATの配列モチーフを示す；
配列番号12は、163位の確認のために用いられる大腸菌BCATの配列モチーフを示す；
配列番号13は、ペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号14は、配列番号13の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号15は、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号16は、配列番号15の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号17は、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号18は、配列番号17の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号19は、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号20は、配列番号19の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号21は、ネオサルトリア・フィスケリ(Neosartorya fischeri)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号22は、配列番号21の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号23は、ジベレラ・ゼアエ(Gibberella zeae)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号24は、配列番号23の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号25は、ハイフォモナス・ネプチュニウム(Hyphomonas neptunium)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号26は、配列番号25の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号27は、メソリゾビウム・ロティMAFF303099由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号28は、配列番号27の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号29は、ロゼオバクター属細菌(Roseobacter sp.)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号30は、配列番号29の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号31は、マリノモナス属細菌(Marinomonas sp.)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号32は、配列番号31の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号33は、リゾビウム・エトリ(Rhizobium etli)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号34は、配列番号33の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号35は、ロドフェラックス・フェリレデューセンス(Rhodoferax ferrireducens)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号36は、配列番号35の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号37は、ジャナスキア属細菌(Jannaschia sp.)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号38は、配列番号37の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号39は、ラブレンジア・アレキサンドリイ(Labrenzia alexandrii)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号40は、配列番号39の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号41は、バークホルデリア属細菌(Burkholderia sp.)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号42は、配列番号41の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号43は、バークホルデリア・セノセパシア(Burkholderia cenocepacia)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号44は、配列番号43の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号45は、アルファプロテオバクテリア(alpha proteobacterium)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号46は、配列番号45の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号47は、ガンマプロテオバクテリア(gamma proteobacterium)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；
配列番号48は、配列番号47の全アミノ酸配列(ORF)を示す；
配列番号49は、マイコバクテリウム・バンバアレニイ(Mycobacterium vanbaalenii)由来の(R)-選択的ω-TAをコードするDNA配列を示す；および
配列番号50は、配列番号49の全アミノ酸配列(ORF)を示す。
【実施例】
【００８２】
実施例１ − (R)-選択的ω-トランスアミナーゼの同定
EP 1 038 953 A1に示されるマイコバクテリウム・オーラムの(R)-選択的ω-TAのアミノ酸配列(配列番号5)およびEP 0 987 332 A1に示されるアルスロバクター属細菌の(R)-選択的ω-TAのアミノ酸配列(配列番号7)をクエリー生体分子配列として使用する。この実施例で用いる生体分子バンクはNCBIのpubmedタンパク質データバンク(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed (2009年7月13日))である。
【００８３】
M.オーラムまたはアルスロバクター属細菌のω-TAからのアミノ酸配列(配列番号5または7)をクエリーとして用いて、標準パラメーター(BLOSUM62 scoring matrix, word size：3, gap costs：existence - 11, extension - 1)によるBLAST検索を行って、さまざまな生物に由来する100の各種アミノ酸配列の第1のグループを同定したが、それらはすべてがクエリー配列に対して最低限度30％の配列同一性を有する。
【００８４】
BLASTでは、「non-redundant protein sequences (nr)」(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome)が2009年7月13日時点で使用された。第1の標的生体分子配列を表す100の各種アミノ酸配列のこの第1グループにおいて、配列モチーフc1)、c2)またはc3)を示さずかつ配列モチーフc4)、c5)およびc6)を示す配列を、配列モチーフ検索によって検索し同定した。21のORFを同定することができた。それらを下記の表1に示す。
【表１】
【００８５】
実施例２ − アスペルギルス・テレウス、マイコバクテリウム・バンバアレニイおよびメソリゾビウム・ロティのトランスアミナーゼの調製および解析
2.1 表1のエントリー9のマイコバクテリウム・バンバアレニイ由来のω-TA(配列番号49および50)、表1のエントリー1のアスペルギルス・テレウス由来のω-TA(配列番号3および4)、および表1のエントリー11のメソリゾビウム・ロティ由来のω-TA(配列番号1および2)を取得して、大腸菌内でこれらの酵素を発現させるためにコドン使用頻度を(大腸菌に)適応させた形で使用した。以下では、マイコバクテリウム・バンバアレニイのトランスアミナーゼをMva-TAと呼び、アスペルギルス・テレウスのトランスアミナーゼをAte-TAと呼び、メソリゾビウム・ロティのトランスアミナーゼをMlo-TAと呼ぶ。
【００８６】
2.2 アセトフェノンアッセイ
Mva-TAおよびAte-TAは、2.5mMアミンと2.5mMピルビン酸をpH7.5、30℃で用いるアセトフェノンアッセイにおいて、(R)-α-MBAを(S)-エナンチオマーより少なくとも100倍速く変換した。
【００８７】
アッセイ：反応中に生成されたアセトフェノンの吸収率の増加を245nmでモニターした。
【００８８】
Mlo-TAは、(R)-α-MBAまたは(S)-α-MBAのいずれも変換しなかった。
【００８９】
以下では、アミノ受容体としてのピルビン酸またはα-ケトグルタル酸の存在下で、さらなるアミン類を試験した(10mMアミン、10mMピルビン酸、0.1mM PLP、リン酸緩衝液pH7.5、30℃で24時間のインキュベーション、薄層クロマトグラフィーにより分析)。
【００９０】
変換は、2-アミノヘプタン、2-アミノペンタン、1,3-ジメチルブチルアミンおよび4-フェニル-2-アミノブタンについて認められた。さらに、イソプロピルアミンの最小限の変換を検出することができた。
【００９１】
他のアミン供与体、例えばD-アラニン、L-バリン、γ-アミノ酪酸、エチルアミン、ベンジルアミン、プトレシン、2-アミノ-3-メチルブタンおよび3,3-ジメチル-2-アミノブタンの場合には、変換が検出されなかった。
【００９２】
したがって、3種のタンパク質はすべてがω-TAであることが判明した。
【００９３】
特に、(R)-および(S)-2-アミノヘキサンを基質として用いると、(R)-エナンチオマーだけが顕著に変換された。かくして、Mlo-TAは(R)-選択的なω-TAでもある。DATA (D-アミノ酸トランスアミナーゼ)またはBCAT (分枝鎖アミノトランスフェラーゼ)活性は3種すべてのタンパク質に認められなかった。
【００９４】
2.3 導電率アッセイ
さらに、1-N-boc-3-アミノピロリジン(B3AP)、1-N-boc-3-アミノピペリジン(B3APi)および1-Cbz-3-アミノピペリジン(C3APi)を基質として用いて、モデル基質α-MBAに対するこれらの物質の相対活性を調べた。
【００９５】
アミンとピルビン酸(pH7.5で両基質とも荷電する)をアラニンとケトン(ケトンは電荷をもたず、アラニンは両性イオン化合物であって導電率に寄与しない)へと反応させている間に、導電率の動態をモニタリングすると、変換率に関する結論を導き出すことができる。
【００９６】
反応を開始する前に、アラニン、ピルビン酸、ケトンおよびアミンのさまざまな濃度に依存して相違する変換率を測定することによって、キャリブレーションを実施した。
【００９７】
導電率の低下は、α-MBA、B3AP、B3APiおよびC3APiの変換mMあたり44μS、50μS、48.5μSおよび49.3μSであった。
【００９８】
3種の組換え的に発現されたトランスアミナーゼに加えて、Codexis社から市販されている(R)-選択的ATA-117を、次の反応条件を用いて試験した：50mM CHES緩衝液、pH7.5、BIS-TRIS (＝ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ-トリス(ヒドロキシメチル)メタン)によりpH調整、0.1mM PLP、5〜6mMのアミンおよびピルビン酸、25℃で反応。
【００９９】
基質の変換はAte-TAの場合に示された。相対活性は、(R)-α-MBAと比較して(R)-B3APと(R,S)-C3APiについてが2％、(R)-B3APiについてが1％であった。
【０１００】
2.4 アスペルギルス・テレウスおよびメソリゾビウム・ロティ由来の両(R)-選択的ω-TAのアミンの不斉合成によるエナンチオ選択性の確認
独立した方法によって、MloおよびAte-TAは(R)-選択的であり、基質を目的の生成物にすぐれたエナンチオ選択性で変換することが示される。
【０１０１】
両トランスアミナーゼの(R)-エナンチオ選択性の決定的証拠のために、さまざまなアミン類の不斉合成を実施して、それらの光学純度を測定した。
【０１０２】
アミノ供与体として100倍過剰のアラニンを使用した。変換率については正確な測定を行わずに、概算した。さらなる実験において、変換率(PDC)を高めるためのさまざまな方法を開発できると考えられる。高い〜すぐれたエナンチオ選択性が両トランスアミナーゼにより得られたが、C3APiの場合には非常に低いエナンチオ選択性が得られた。
【表２】
【０１０３】
方法：
トランスアミナーゼを大腸菌BL21内で発現させた。
【０１０４】
0.5の光学密度(OD)が得られたとき、培地(50ml LD-Amp培地)を0.2％ラムノースにより誘導し、25℃で12時間培養した。その後、細胞をリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、遠心分離し、1mlリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)中に懸濁して、200μlアリコートで凍結させた。
【０１０５】
生体触媒反応のために、5μlの500mMケトンのDMSO溶液、22mgのD-アラニンおよび10μlの10mM PLPをこれらのアリコートに添加した。この反応混合物に50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)を加えて総容量を500μlとした。その反応混合物を25℃、500rpmで一晩インキュベートした。CEによるエナンチオマー過剰率の測定のため、200μlの1N NaOHを400μlのサンプルに添加し、400μlのジクロロメタンで抽出し、有機相を分離した。次に、その有機相を100μlの5mMリン酸トリエチルアンモニウム緩衝液(pH3)で抽出した。その後、得られた水相をCEに注入した。
【０１０６】
分離のプログラム：
CE-Capillare 30cm、内径50μm、温度15℃
- リン酸トリエチルアンモニウム緩衝液pH3を用いて1分、30psiで洗浄する
- 5％高硫酸化シクロデキストリン(HSαCDまたはHSγCD)を用いて1分、10psiで洗浄する
- 注入：5〜10s、1psi
- 水浸漬
- 分離：電圧10または15kV
- 検出：200nmでMPPA、C3APおよびC3APi；190nmでB3AP、B3APi
【表３】
【０１０７】
実施例４ − 表1に記載したすべてのトランスアミナーゼの調製および解析
4.1 トランスアミナーゼの発現および精製
表1のエントリー番号1、2、3、4、8、9、11、13、14、15、17、18および21のタンパク質をコードするコドン最適化オープンリーディングフレームを、ライゲーション非依存的クローニング(ligation independent cloning)戦略を用いて、pGASTONのNdeIおよびBamHI制限部位間に挿入した。その他のすべてのタンパク質をコードするコドン最適化ORFは、すでにpET-22bにサブクローニングされたものを注文した。形質転換した大腸菌BL21 (DE3)株はアンピシリン(100μg/ml)を添加したLB培地400ml中で増殖させた。OD600が0.7に達するまで、最初は細胞を旋回シェーカー上で37℃にてインキュベートした。次に0.2％ラムノース(pGASTON)または0.1mM IPTG (pET-22b)をそれぞれ添加して細胞を誘導し、同時にインキュベーション温度を20℃に下げた。誘導後、インキュベーションをさらに20時間続けた。発現を追跡するために、誘導後のいくつかの時点でアリコートを取り出した。
【０１０８】
細胞ペレット(約3g湿重量)は、4℃で0.1mM PLPを含むリン酸緩衝液(pH7.5、50mM)を用いて2回洗浄した。破砕(フレンチプレス)後、細胞懸濁液を遠心分離(4000×g、30分)して、得られた上清をクロマトグラフィーの前に0.5μmフィルターを通過させた。クロマトグラフィーはAKTA Purifier(GE Healthcare社)を用いて行った。濾過した細胞抽出物をIMAC Sepharose(商標)6 Fast Flow(GE Healthcare社)の5mlカラムにアプライした。カラムは、5ml/分の流速で、300mM NaCl、0.1mM PLPおよび30mMイミダゾール(非特異的結合を回避するため)を含む10倍カラム容量の50mMリン酸緩衝液pH7.5で洗浄し、300mM NaCl、0.1mM PLPおよび300mMイミダゾールを含む10倍カラム容量のリン酸緩衝液(pH7.5、50mM)でATA活性を溶出した(5ml/分の流速)。活性含有画分をプールし、0.01mM PLPを含む20mMトリシン緩衝液pH7.5を用いたゲル-クロマトグラフィーにより脱塩した。精製した酵素を4℃で保存した。
【０１０９】
約3gの細胞(湿重量)から精製された各タンパク質の量を下記の表4に示す。
【表４】
【０１１０】
4.2 (R)-選択的ω-TAの基質特異性の解析
発現タンパク質の初期スクリーニングでα-メチルベンジルアミン(α-MBA)に対する活性を調べるために、アセトフェノンベースのアッセイを採用した：2.5mM (R)または(S)-α-MBAとピルビン酸の溶液を精製酵素の存在下で反応させ、245nmでの吸光度の増加をアセトフェノンの生成に相関させた。アミン類2-アミノヘキサン、4-フェニル-2-アミノブタンおよび1-N-Boc-3-アミノピロリジンの変換は導電率アッセイを用いてモニターした：10mMアミンとピルビン酸を含む溶液を精製アミントランスアミナーゼの存在下で反応させ、導電率の低下を基質の変換に関連させた。
【０１１１】
DATA活性およびBCAT活性を検討するために、デヒドロゲナーゼ共役アッセイを用いて、NADHの減少を340nmで分光光度的に測定した：DATA活性を測定するため、5mMα-ケトグルタル酸とD-アラニンの溶液を、精製トランスアミナーゼ、1U/ml乳酸デヒドロゲナーゼおよび0.5mM NADHの存在下で反応させた。BCAT活性を測定するためには、5mM 3-メチル-2-オキソ酪酸とL-グルタミン酸を含む溶液、10mM塩化アンモニウム、1U/mlグルタミン酸デヒドロゲナーゼおよび0.5mM NADHを用いた。
【０１１２】
すべての反応は0.01mM PLPを含む20mMトリシン緩衝液pH7.5中で行った。緩衝液のpHは1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エンで調整した。
【０１１３】
結果を下記の表5に示す。
【表５】
【０１１４】
4.3 アスペルギルス・テレウス、メソリゾビウム・ロティおよびマイコバクテリウム・バンバアレニイ由来のω-TAによる(R)-アミン類1〜4(上記表5の説明文参照)の不斉合成
不斉合成は、1.5mlエッペンドルフチューブ内で、ピリドキサール-5’-リン酸(PLP)一水和物(1mM)とNAD+ (1mM)を含むリン酸ナトリウム緩衝液(100mM、pH7)中で30℃にて24時間行った。
【化２】
【０１１５】
反応混合物は50mMケトン、L-アラニン(5当量、250mM)、ウシ心臓由来の乳酸デヒドロゲナーゼ(90U)、グルコース(150mM)およびグルコースデヒドロゲナーゼ(15U)を含んでいた。アスペルギルス・テレウス、メソリゾビウム・ロティおよびマイコバクテリウム・バンバアレニイ由来のω-TA(表1のエントリー1、11および9)は上記のように大腸菌BL21で発現させ、アリコートで凍結させ、さらに精製することなく全細胞生体触媒として直接使用した。変換率は生成されたアミンを検出することで測定した(1、ガスクロマトグラフィー(GC)；2〜4、キャピラリー電気泳動(CE))。2〜4のキラル分析は上記のようにCEを用いて行った。1のエナンチオマー過剰率(％ee)の値はGCで分析した。アミンを酢酸エチルで抽出した後、20倍過剰のトリフルオロ酢酸無水物を添加することによってトリフルオロアセトアミドへの誘導体化を行った。窒素でパージして過剰の無水物と残留トリフルオロ酢酸を除去したあと、誘導体化した化合物を酢酸エチル(50μl)中に溶解し、ヘプタキス-(2,3-ジ-O-アセチル-6-O-tert-ブチルジメチルシリル)-β-シクロデキストリンカラム(25m×0.25mm)を備えた島津GC14Aを用いることによってベースライン分離した。保持時間は80℃/10分//20℃//180℃/10分のオーブン温度勾配で16.0分((S)-1)および16.2分((S)-2)であった。
【０１１６】
結果を下記の表6に示す。
【表６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの調製方法：
a) 少なくとも1種のトランスアミナーゼまたはリアーゼの少なくとも1つのクエリー生体分子配列および少なくとも1つの生体分子バンクを提供するステップ；
b) 生体分子バンクをクエリー生体分子配列で検索して第1の標的生体分子配列のグループを同定するステップであって、第1の標的生体分子配列は、アミノ酸レベルで計算して、クエリー生体分子配列に対して少なくとも20％の配列同一性の程度を有する、上記ステップ；
c) 第1の標的生体分子配列のグループにおいて、アミノ酸レベルで、次のアミノ酸配列モチーフc1)〜c3)：
c1) 95〜97位のアミノ酸配列Tyr Xa1 Xa2(ここでXa1はアミノ酸Ile、Val、Leu、Met、Pheであり、Xa2はアミノ酸ArgもしくはLysである)、または
c2) 97〜99位のアミノ酸配列Tyr Xaa Gln(ここでXaaはアミノ酸である)および105〜111位の領域中のアミノ酸配列Arg Xaa Xa3(ここでXa3はアミノ酸、好ましくはHisである)、または
c3) 38位のThr、97位のLysおよび107〜109位のアミノ酸配列Arg Xa4 Xa5(ここでXa4はアミノ酸、好ましくはGlyであり、Xa5はアミノ酸、好ましくはTyrである)
の少なくとも1つを含まず、かつ
c4) 95位のTyr、Arg、Lys以外の別のアミノ酸、または95位のTyr、ただし97位のArgもしくはLysの非存在、および
c5) 40位のLysまたはArgの非存在、および
c6) 161〜165位の領域中のLys
を含む、第2の生体分子標的配列のグループを選択して、第2の標的生体分子配列のグループを同定するステップ；および
d) ステップc)で同定された第2の生体分子標的配列を有し、かつ(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの活性を有するタンパク質であるか、または該タンパク質を少なくとも部分的にコードする、生体分子を提供するステップ。
【請求項２】
請求項1のステップa)〜c)を含む、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼのスクリーニング方法。
【請求項３】
生体分子がタンパク質であって、生体分子配列がアミノ酸配列である、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
生体分子がDNA分子であって、生体分子配列がDNA配列である、請求項1または2記載の方法。
【請求項５】
生体分子バンクが生体分子データベースであり、その生体分子データベースがステップb)で生体分子配列アライメントツール、特にBLAST、により検索される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ステップd)で提供されるタンパク質またはDNA分子がデノボ合成によって提供される、請求項1、3、4および5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
生体分子バンクが遺伝子バンクであり、その遺伝子バンクがステップb)でクエリーDNA配列分子により検索される、請求項1、2および4のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
ステップc)でDNA配列プライマーを用いて、第2の生体分子配列のグループを選択する、請求項7記載の方法。
【請求項９】
クエリー生体分子配列が機能性(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの全部または一部を表す配列である、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
請求項1および3〜9の方法のいずれか1つに従って得ることができ、好ましくは配列番号1、2、3および4からなる生体分子配列の群から選択される、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼ。
【請求項１１】
以下のステップを含む、トランスアミナーゼの解析方法、特にトランスアミナーゼの特性の解析方法：
i) 荷電したアミノ受容体、荷電したアミノ供与体およびトランスアミナーゼを提供するステップ；
ii) そのアミノ受容体およびアミノ供与体をトランスアミナーゼと反応媒体中で反応させるステップ；それにより、
iii) 第1セットの反応条件下で該反応媒体の導電率を測定するステップ；および
iv) ステップiii)に続いて、第2セットの反応条件下で該反応媒体の導電率を測定し、それによりトランスアミナーゼの特性を反映する少なくとも2つの導電率の値を得るステップ。
【請求項１２】
反応媒体の導電率が少なくとも第3セットの反応条件下で少なくとも3回測定される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記セットの反応条件が同じである、請求項11または12記載の方法。
【請求項１４】
反応媒体が低導電率の緩衝液である、請求項11〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
荷電したアミノ受容体がピルビン酸である、請求項11〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
(R)-選択的ω-トランスアミナーゼのスクリーニングまたは調製の後で、請求項11〜15のいずれか一項記載のトランスアミナーゼの解析方法を実施する、請求項1〜9のいずれか一項記載の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼのスクリーニングまたは調製方法。
【請求項１７】
光学活性キラルアミンの製造方法であって、少なくとも1種のアミノ受容体および少なくとも1種のアミノ供与体を請求項10記載の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼと反応させ、光学活性なキラルアミンを取得することを含む方法。
【請求項１】
以下のステップを含む、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの調製方法：
a) 少なくとも1種のトランスアミナーゼまたはリアーゼの少なくとも1つのクエリー生体分子配列および少なくとも1つの生体分子バンクを提供するステップ；
b) 生体分子バンクをクエリー生体分子配列で検索して第1の標的生体分子配列のグループを同定するステップであって、第1の標的生体分子配列は、アミノ酸レベルで計算して、クエリー生体分子配列に対して少なくとも20％の配列同一性の程度を有する、上記ステップ；
c) 第1の標的生体分子配列のグループにおいて、アミノ酸レベルで、次のアミノ酸配列モチーフc1)〜c3)：
c1) 95〜97位のアミノ酸配列Tyr Xa1 Xa2(ここでXa1はアミノ酸Ile、Val、Leu、Met、Pheであり、Xa2はアミノ酸ArgもしくはLysである)、または
c2) 97〜99位のアミノ酸配列Tyr Xaa Gln(ここでXaaはアミノ酸である)および105〜111位の領域中のアミノ酸配列Arg Xaa Xa3(ここでXa3はアミノ酸、好ましくはHisである)、または
c3) 38位のThr、97位のLysおよび107〜109位のアミノ酸配列Arg Xa4 Xa5(ここでXa4はアミノ酸、好ましくはGlyであり、Xa5はアミノ酸、好ましくはTyrである)
の少なくとも1つを含まず、かつ
c4) 95位のTyr、Arg、Lys以外の別のアミノ酸、または95位のTyr、ただし97位のArgもしくはLysの非存在、および
c5) 40位のLysまたはArgの非存在、および
c6) 161〜165位の領域中のLys
を含む、第2の生体分子標的配列のグループを選択して、第2の標的生体分子配列のグループを同定するステップ；および
d) ステップc)で同定された第2の生体分子標的配列を有し、かつ(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの活性を有するタンパク質であるか、または該タンパク質を少なくとも部分的にコードする、生体分子を提供するステップ。
【請求項２】
請求項1のステップa)〜c)を含む、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼのスクリーニング方法。
【請求項３】
生体分子がタンパク質であって、生体分子配列がアミノ酸配列である、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
生体分子がDNA分子であって、生体分子配列がDNA配列である、請求項1または2記載の方法。
【請求項５】
生体分子バンクが生体分子データベースであり、その生体分子データベースがステップb)で生体分子配列アライメントツール、特にBLAST、により検索される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ステップd)で提供されるタンパク質またはDNA分子がデノボ合成によって提供される、請求項1、3、4および5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
生体分子バンクが遺伝子バンクであり、その遺伝子バンクがステップb)でクエリーDNA配列分子により検索される、請求項1、2および4のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
ステップc)でDNA配列プライマーを用いて、第2の生体分子配列のグループを選択する、請求項7記載の方法。
【請求項９】
クエリー生体分子配列が機能性(R)-選択的ω-トランスアミナーゼの全部または一部を表す配列である、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
請求項1および3〜9の方法のいずれか1つに従って得ることができ、好ましくは配列番号1、2、3および4からなる生体分子配列の群から選択される、(R)-選択的ω-トランスアミナーゼ。
【請求項１１】
以下のステップを含む、トランスアミナーゼの解析方法、特にトランスアミナーゼの特性の解析方法：
i) 荷電したアミノ受容体、荷電したアミノ供与体およびトランスアミナーゼを提供するステップ；
ii) そのアミノ受容体およびアミノ供与体をトランスアミナーゼと反応媒体中で反応させるステップ；それにより、
iii) 第1セットの反応条件下で該反応媒体の導電率を測定するステップ；および
iv) ステップiii)に続いて、第2セットの反応条件下で該反応媒体の導電率を測定し、それによりトランスアミナーゼの特性を反映する少なくとも2つの導電率の値を得るステップ。
【請求項１２】
反応媒体の導電率が少なくとも第3セットの反応条件下で少なくとも3回測定される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記セットの反応条件が同じである、請求項11または12記載の方法。
【請求項１４】
反応媒体が低導電率の緩衝液である、請求項11〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
荷電したアミノ受容体がピルビン酸である、請求項11〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
(R)-選択的ω-トランスアミナーゼのスクリーニングまたは調製の後で、請求項11〜15のいずれか一項記載のトランスアミナーゼの解析方法を実施する、請求項1〜9のいずれか一項記載の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼのスクリーニングまたは調製方法。
【請求項１７】
光学活性キラルアミンの製造方法であって、少なくとも1種のアミノ受容体および少なくとも1種のアミノ供与体を請求項10記載の(R)-選択的ω-トランスアミナーゼと反応させ、光学活性なキラルアミンを取得することを含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１３−５０３６１０（Ｐ２０１３−５０３６１０Ａ）
【公表日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２７２１３（Ｐ２０１２−５２７２１３）
【出願日】平成２２年８月１３日（２０１０．８．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００４９６１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２６５５６
【国際公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（５１２０５４０３４）ロンザ アーゲー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月１３日（２０１０．８．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００４９６１
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２６５５６
【国際公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（５１２０５４０３４）ロンザ アーゲー (1)
【Ｆターム（参考）】
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