２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物
【課題】抗癌剤や免疫調節剤として用いることが可能な脂質が結合した２−６シアリル６−スルホ糖鎖化合物又はその塩の提供。
【解決手段】脂質部分として、コレスタノール、コレステロール、セラミド、スフィンゴシン又はグリセロールが結合した２−６シアリル６−スルホ糖鎖を有する化合物又はその塩。特に、コレスタノールが結合した下記の化合物又はその塩が好ましい。
【解決手段】脂質部分として、コレスタノール、コレステロール、セラミド、スフィンゴシン又はグリセロールが結合した２−６シアリル６−スルホ糖鎖を有する化合物又はその塩。特に、コレスタノールが結合した下記の化合物又はその塩が好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、2-6シアリル6-スルホ糖鎖を有する合成化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
6-硫酸化糖鎖は体内での細胞の移動において重要な役割を演じており、白血球の体内移動やがん細胞の転移において重要な役割を演じている（非特許文献１）。例えば、2-3シアリル6-スルホ糖鎖は癌細胞で合成されていることが知られており、この糖鎖に反応する抗体は癌や非癌疾患の鑑別などに役立つことが知られている（特許文献１、２、非特許文献１）。
一方、2-6シアリル6-スルホ糖鎖は、Bリンパ球による抗体産生の主要な内因性抑制分子であるSiglec-2(CD22)の特異的リガンド糖鎖であることが、合成糖鎖を用いた試験管内研究から知られており（非特許文献２等）、このような糖鎖を有する化合物はBリンパ球に起因する癌などの研究や治療薬の開発に有用であると考えられるが、この2-6シアリル6-スルホ糖鎖を有する合成化合物は今まで知られていなかった。
【０００３】
【特許文献１】特許第3809277号
【特許文献２】US2005/0208631
【非特許文献１】J. Biol. Chem., 273: 11225-11233, 1998.
【非特許文献２】PNAS vol.101, 17033-17038 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
この発明は、2-6シアリル6-スルホ糖鎖を有する合成化合物を提供する。
【課題を解決するための手段及び発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明者らは、鋭意検討した結果、コレスタノールを基材として用いて糖鎖を結合させて上記化合物を合成することに成功し、本願発明を完成させた。
即ち、本願発明は、下記一般式
Siaα2→6Galβ1→4GlcNHR01β(6-sulfate)1→3Galβ1→4Glc−R02
（式中、Siaαはαシアル酸を表し、Galβはβガラクトースを表し、GlcNHR01βはN-置換又は非置換のβN-グルコサミンを表し、R01はアセチル基又は水素原子を表し、Glcはグルコースを表し、R02は脂質を表し、Siaα2→6GalβはSiaαの2 位とGalβの6 位とが結合することを示し、Galβ1→4GlcNHR01β は、Galβの1 位とGlcNHR01βの4 位とが結合することを示し、(6-sulfate)はGlcNHR01βの6 位に硫酸基が付加していることを示し、GlcNHR01β(6-sulfate)1→3GalβはGlcNHR01β(6-sulfate)の1位とGalβの3位とが結合することを示し、Galβ1→4GlcはGalβの1位とGlcの4位とが結合することを示す。）で表される２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物又はその塩である（本明細書において、特に断らない限り、塩であるものを含めて単に「２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物」という。）。
上記において、脂質はコレスタノール、コレステロール、セラミド、スフィンゴシン又はグリセロールであることが好ましい。
【０００６】
さらに、本願発明は、下式の何れかで表される２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物であることが好ましい。
【化１】
又は
【化２】
【０００７】
Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子又はアルカリ金属、好ましくはアルカリ金属、より好ましくはカリウム原子又はナトリウム原子を表す。
Ａｃはアセチル基（酢酸残基、CH3CO-）を表す。
式中のChorestanolは下式で表されるコレスタノールから水酸基を除いた残基を表す。
【化３】
また、本願発明の化合物を中間体として、Ｒ１〜Ｒ４（水素原子又はアルカリ金属）を任意の一価の置換基で置き換えて得られる化合物は、本願発明を利用して容易に得ることができる。
【０００８】
本願発明の２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物は、2-6シアリル6-スルホ糖鎖を有するオリゴ糖化合物であるという特徴を生かして様々な用途が考えられる。
例えば、2-6シアリル6-スルホ糖鎖が癌などで発現量が増加することが最近に研究で明らかになってきているが、当該糖鎖を検出する抗体を成分とする癌の検査薬において、標準物質として、また当該抗体を確認又はスクリーニングするための試薬として用いることができる。
更に、この2-6シアリル6-スルホ糖鎖には、Bリンパ球の抗体産生抑制分子（negative regulator）であるSiglec-2（CD22）が特異的に結合するため(非特許文献２等)、本願の２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物は、Siglec-2（CD22）の競合的拮抗剤として、例えば、Bリンパ球の抗体産生が係わる疾患等に対して使用しうる免疫調節剤として用いることができる。
【実施例】
【０００９】
以下、本願発明の２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物の製造工程を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
各製造工程の反応式を図１〜５に示す。図中の番号は各化合物の番号を示す。
【００１０】
化合物１
Ｎ−アセチルノイラミン酸（NeuAc、ナカライテスク社特級試薬）を常法（Chem.Ber., 99, 611(1966)参照）に従いメチルエステル化、アセチル化、及びクロル化することにより化合物１（Metyl(5-acetamide-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-dideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosyl chloride)onate）を得た（図4参照）。
【００１１】
化合物２
Ｄ（＋）−グルコサミン塩酸塩（D(+)-Glucosamine hydrochloride、和光純薬1級試薬）を２工程(N-フタロイル化、アセチル化)誘導して得られる化合物Ａ１（1,3,4,6-Tetra-O-acetyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranose））を５工程(Tetrahedoron Lett.,31.1597(1990)参照) (メトキシフェニルグリコシル化、脱アセチル化、4,6位ベンジリデン化、3位ベンジル化、脱ベンジリデン化)誘導し、化合物Ａ２（4-Methoxyphenyl 3-O-Benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranoside）を得た。次いでスズ化後、アリルブロミドにより6位選択的にアリル化を行うことにより、化合物Ａ３（4-Methoxyphenyl 6-O-Allyl-3-O-Benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranoside）へ変換した（図１前半参照）。
一方、1,2,3,4,6-ペンタ-O-アセチル-α-D-ガラクトピラノース（1,2,3,4,6-Penta-O-acetyl-α-D-galactopyranose、和光純薬)から、１位の脱アセチル化、同位のフッ素化を経て、化合物Ａ４（2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-D-galactopyranosyl Fluoride)を合成した。
次いで、化合物Ａ３と化合物Ａ４とをハフノセンジクロリド−銀トリフレート触媒法(Tetrahedron Lett 29:3567-70(1988)参照)により縮合し、２糖性糖鎖化合物Ａ５（4-Methoxyphenyl O-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-6-O-allyl-3-O-benzyl-2-deoxy- 2-phthalimido-β-D-glucopyranoside）を合成した。
この２糖性糖鎖化合物Ａ５を常法により、脱アセチル化した後、ガラクトースの６位をトリチル化、その他の水酸基をベンジル化、６位トリチル基の脱保護、そして同６位のレブリノイル化を行い、化合物Ａ６（4-Methoxyphenyl O-(2,3,4-Tri-O-benzyl-6-O-levulinoyl-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-6-O-allyl-3-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranoside）を得た。次いで、1位のメトキシフェニル基を除去し、同位のフッ素化を経て、目的の化合物２（O-(2,3,4-Tri-O-benzyl-6-O-levulinoyl-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-6-O-allyl-3-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl Fluoride）を得た（図１後半参照）。
【００１２】
化合物３
ラクトース(和光純薬特級試薬)を常法によりアセチル化して得られた化合物Ｂ１（Octa-acetyl-lactose）をトリメチルシリルトリフレート触媒下、β-コレスタノール（β-Cholestanol、東京化成工業）との縮合を行い化合物Ｂ２（β-Cholestanyl O-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-2,3,6-tri-O-acetyl-β-D-glucopyranoside)を合成した。
次いで、化合物Ｂ２を常法により脱アセチル化、スズ化(Tetrahedron Lett 29:4097-100(1988)参照)後、アリルブロミドにより選択的にガラクトース3位へのアリル化を行い、化合物Ｂ３（β-Cholestanyl O-(3-O-Allyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-β-D- glucopyranoside）を合成した。
この化合物Ｂ３を、ベンジル化後、イリジウムコンプレックス(Aldrich社製)により脱アリル化を行い、目的とする化合物３（β-Cholestanyl O-(2,4,6-Tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-2,3,6-tri-O-benzyl-β-D-glucopyranoside）を得た（図２参照）。
【００１３】
化合物４
アルゴンガス雰囲気下、事前に乾燥したモレキュラーシーブス４Ａ（3 g）の入った反応容器に化合物３（353.4 mg, 0.282 mmol）の１，２−ジクロロエタン溶液（5 ml）を加え、室温にて３０分間撹拌した。その後、銀トリフレート（505.1 mg, 1.97 mmol）、ハフノセンジクロリド（367.1 mg, 0.967 mmol）を加えて、氷冷下にて３０分間攪拌した。反応液を−２０℃とし、化合物２（347.1 mg, 0.357 mmol）の１，２−ジクロロエタン溶液（5 ml）を滴下し、１９０分間攪拌した。氷冷下、反応液を酢酸エチルで希釈後、飽和重曹水を加えて撹拌し、セライト濾過した。濾液を飽和重曹水、飽和食塩水にて順次洗浄し、硫酸マグネシウムにて乾燥後、濾過した濾液を減圧下溶媒留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル=7:1）にて精製し、化合物４（β-Cholestanyl O-(2,3,4-tri-O-Benzyl-6-O-levulinoyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-(6-O-allyl-3-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-(2,4,6-tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-2,3,6-tri-O-benzyl-β-D-glucopyranoside）（590.4 mg, 95 %）を得た（図３参照）。生成物の分析値（薄層クロマトグラフィー(Rf値)、NMR）を以下に記す。
【００１４】
Rf : 0.50 (トルエン：酢酸エチル=4:1)
C137H161O24N MW : 2205.76
500 MHz １H-NMR(CDCl3,TMS) δ;
2.125(s, 3 H, OLev) 2.445(t, 2 H, OLev) 2.650-2.683(m, 2 H, OLev)
3.681(d, 1 H, J=9.8 Hz) 4.652(d, 1 H, J=11.2 Hz, benzyl)
4.967(d, 1 H, J=11.7 Hz, benzyl) 5.367(d, 1 H, J1,2=8.3 Hz, H-1c)
5.725-5.794(m, 1 H, H-2All)
【００１５】
化合物５
化合物４（687.1 mg, 0.312 mmol）のn-ブタノール溶液（80 ml）にエチレンジアミン（40 ml）を加えて１１０℃にて一晩撹拌した。反応液にキシレンを加えて減圧下溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル=3:1）にて精製し、化合物５（β-Cholestanyl O-(2,3,4-tri-O-Benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-(6-O-allyl-2-amino-3-O-benzyl-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-(2,4,6-tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-2,3,6-tri-O-benzyl-β-D-glucopyranoside）（566.9 mg,92 %）を得た（図３参照）。生成物の分析値（薄層クロマトグラフィー(Rf値)、NMR）を以下に記す。
【００１６】
Rf : 0.52 (トルエン：酢酸エチル=2:1)
C124H153O20N MW : 1977.56
500 MHz １H-NMR(CDCl3,TMS) δ;
2.836(dd, 1 H, J1,2=7.8 Hz, J2,3=9.8 Hz, H-2c) 4.175(d, 1 H, J=11.7 Hz, benzyl)
4.317(d, 1 H, J=11.7 Hz, benzyl) 4.901(d, 1 H, J=10.7 Hz, benzyl)
5.185(d, 1 H, J=10.7 Hz, benzyl) 5.703-5.780(m, 1 H, H-2All)
【００１７】
化合物６
化合物５（584.2 mg, 0.295 mmol）と４−ジメチルアミノピリジン(ＤＭＡＰ)（293.5 mg, 2.40 mmol）ジクロロメタン：アセトニトリル（1:2, 12 ml）に、室温にてトリフルオロメタンスルホン酸アジド（0.665 mmol/ml Dichloromethane sol. 2.66 ml, 1.77 mmol）を滴下し、１４０分間攪拌した。反応液をトルエンにて希釈した後濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル=6:1）にて精製し、化合物６（β-Cholestanyl O-(2,3,4-tri-O-Benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-(6-O-allyl-2-azido-3-O-benzyl-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-(2,4,6-tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-2,3,6-tri-O-benzyl-β-D-glucopyranoside）（550.0 mg, 93 %）を得た（図３参照）。生成物の分析値（薄層クロマトグラフィー(Rf値)、NMR）を以下に記す。
【００１８】
Rf : 0.42 (トルエン：酢酸エチル=4:1)
C124H151O20N3 MW : 2003.56
500 MHz １H-NMR(CDCl3,TMS) δ;
4.170(d, 1 H, J=11.7 Hz, benzyl) 4.312(d, 1 H, J=11.7 Hz, benzyl)
4.445(d, 1 H, J1,2=7.8 Hz, H-1a or H-1b or H-1c or H-1d)
4.571(d, 1 H, J=11.5 Hz, benzyl) 4.593(d, 1 H, J1,2=8.0 Hz, H-1a or H-1b or H-1c or H-1d)
4.908(d, 1 H, J=10.7 Hz, benzyl) 5.048(d, 1 H, J=10.5 Hz, benzyl)
5.712-5.788(m, 1 H, H-2All)
【００１９】
化合物７
アルゴンガス雰囲気下、事前に乾燥したモレキュラーシーブス（4A 3.5 g + 3A 3.5 g）の入った反応容器に、化合物６（400.0 mg, 0.200mmol）のジクロロメタン：アセトニトリル溶液（1:2, 15 ml）を加え、氷冷下、化合物１（2224.1 mg, 4.23 mmol）、塩化第二水銀：シアン化第二水銀（1:1 (mol比), 3160.8 mg, 5.16 mmol）を加え、室温下７５時間撹拌した。反応液を氷冷し、酢酸エチルで希釈後、飽和重曹水を加えて撹拌し、セライト濾過した。濾液を飽和重曹水、飽和食塩水にて順次洗浄し、硫酸マグネシウムにて乾燥後、濾過した濾液を減圧下溶媒留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル=1:5）、バイオビーズＳＸ−１（Bio-Beads SX-1、BIO RAD）（トルエン）、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル=1.1:1）にて順次精製し、化合物７（β-Cholestanyl O-[Methyl(5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-dideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosyl)onate]-(2→6)-O-(2,3,4-tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-(6-O-allyl-2-azido-3-O-benzyl-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-(2,4,6-tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-2,3,6-tri-O-benzyl-β-D-glucopyranoside）（200.9 mg, 41 %）を得た（図４参照）。生成物の分析値（薄層クロマトグラフィー(Rf値)、NMR）を以下に記す。
【００２０】
Rf : 0.21 (トルエン：酢酸エチル=1:1)
C144H178O32N4 MW : 2476.99
500 MHz １H-NMR(CDCl3,TMS) δ;
1.877,1.933,2.023,2.057,2.069(s×5, 3 H×5, Ac×5)
2.505(dd, 1 H, J3eq,4=4.6 Hz, J3eq,3ax=12.7 Hz, H-3eeq) 3.551(s, 3 H, COOMe)
4.170(d, 1 H, J=12.0 Hz, benzyl) 4.213(dd, 1 H, J=12.5, 2.7 Hz)
4.318(d, 1 H, J=11.7 Hz, benzyl) 4.598(d, 1 H, J1,2=7.8 Hz, H-1a or H-1b or H-1c or H-1d)
4.906(d, 1 H, J=10.7 Hz, benzyl) 4.953(d, 1 H, J=11.2 Hz, benzyl)
5.058(d, 1 H, J=10.7 Hz, benzyl) 5.244-5.276(m, 1 H, H-8e)
5.299(dd, 1 H, J=2.0, 7.8 Hz, H-7e) 5.719-5.795(m, 1 H, H-2All)
【００２１】
化合物８
水素ガス雰囲気下にて活性化されたイリジウムコンプレックス[Ig(CoD)(PMePh２)２PF６]（8.1 mg, 0.0096 mmol）のテトラヒドロフラン溶液（3 ml）に、アルゴンガス雰囲気下、化合物７（40.6 mg, 0.0164 mmol）のテトラヒドロフラン溶液（3 ml）を加えて７時間攪拌した。次いで、水（0.6 ml）、ヨウ素（23.4 mg,0.184 mmol）を加えて一晩攪拌した。反応混合液を酢酸エチルで希釈後、チオ硫酸ナトリウム水、飽和重曹水、飽和食塩水にて順次洗浄し、硫酸マグネシウムにて乾燥後、濾過した濾液を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：アセトン＝2:1）にて精製した。得られた反応混合物をテトラヒドロフラン：水（30:1, 3.1 ml）に溶解し、p-トルエンスルホン酸一水和物（8.5 mg, 0.0447 mmol）を加え、５０分間攪拌した。反応液を樹脂（アンバーリストA-21（Rohm and Haas社））にて中和し、濾過後、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：アセトン＝4:1）にて精製し、化合物８（β-Cholestanyl O-[Methyl(5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-dideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosyl)onate]-(2→6)-O-(2,3,4-tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-(2-azido-3-O-benzyl-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-(2,4,6-tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-2,3,6-tri-O-benzyl-β-D-glucopyranoside）（32.0 mg, 80 %）を得た（図４参照）。生成物の分析値（薄層クロマトグラフィー(Rf値)、NMR）を以下に記す。
【００２２】
Rf : 0.37 （トルエン：アセトン＝3:1)
C141H174O32N4 MW : 2436.92
500 MHz １H-NMR(CDCl3:CD3OD=1:1,TMS) δ;
1.861,1.934,2.019,2.072,2.082(s×5, 3 H×5, Ac×5)
2.616(dd, 1 H, J3eq,3ax=12.7 Hz, J3eq,4=4.6 Hz, H-3eeq) 3.613(s, 3 H, COOMe)
4.209(d, 1 H, J=12.0 Hz, benzyl) 4.253(dd, 1 H, J=9.0, 11.5 Hz)
4.904(d, 1 H, J=11.0 Hz, benzyl) 5.072(d, 1 H, J=10.7 Hz, benzyl)
【００２３】
化合物９
アルゴンガス雰囲気下、トリエチルアミン硫酸コンプレックス（75.2 mg, 0.415 mmol）のN,N-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（1.5 ml）に化合物８（31.9 mg, 0.0707 mmol）を溶解し、５０℃にて４５分間攪拌した。反応液をセファデックスＬＨ−２０（SephadexTM LH-20、Amersham Biosciences）（クロロホルム：メタノール＝1:1）にて精製し、DOWEX(登録商標、ダウケミカル社)(Na+)バッチ及びDOWEX(登録商標)(Na+)カラム（クロロホルム：メタノール：水＝5:5:1）にて対カチオンをナトリウムに変換した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝12:1）にて精製し、化合物９（β-Cholestanyl O-[Methyl(5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-dideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosyl)onate]-(2→6)-O-(2,3,4-tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-(2-azido-3-O-benzyl-2-deoxy-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-(2,4,6-tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-2,3,6-tri-O-benzyl-β-D-glucopyranoside sodium salt）（29.9 mg, 90 %）を得た（図５参照）。生成物の分析値（薄層クロマトグラフィー(Rf値)、NMR）を以下に記す。
【００２４】
Rf : 0.40 （クロロホルム：メタノール＝11:1)
C141H173O35N4NaS MW : 2538.97
500 MHz １H-NMR(CDCl3:CD3OD=1:1,TMS) δ;
1.856,1.947,2.012,2.076,2.085(s×5, 3 H×5, Ac×5)
2.612(dd, 1 H, J3eq,4=4.4 Hz, J3eq,3ax=12.5 Hz, H-3eeq) 3.568(s, 3 H, COOMe)
4.188(d, 1 H, J=12.0 Hz, benzyl) 4.248(dd, 1 H, J=2.7, 12.5 Hz)
4.312(bd, 1 H) 4.462(dd, 1 H, J=10.7, 3.9 Hz) 4.894(d, 1 H, J=11.0 Hz, benzyl)
5.278(dd, 1 H, J=2.0, 8.1 Hz, H-7e) 5.313-5.345(m, 1 H, H-8e)
【００２５】
化合物１０
アルゴンガス雰囲気下、化合物９（29.9 mg, 0.0118 mmol）をテトラヒドロフラン：メタノール（1:1, 4 ml）に溶解し、ナトリウムメトキシド（21.1 mg, 0.391 mmol）を加えて室温にて２２５分間攪拌した。反応液を約0.5 mlに濃縮し、ジクロロメタン：メタノール：水（5:5:1, 3 ml）を加えて溶解し、一晩攪拌した。さらに反応液に水酸化ナトリウム水溶液（2N, 20μl）を加えて１時間撹拌した。その後反応容器を４０℃に加熱し、室温にて８５分間撹拌した。反応液をセファデックスＬＨ−２０（クロロホルム：メタノール：水＝5:5:1）、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝3:1）にて順次精製し、化合物１０（β-Cholestanyl O-[Sodium(5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosyl)onate]-(2→6)-O-(2,3,4-tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-(2-azido-3-O-benzyl-2-deoxy-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-(2,4,6-tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-2,3,6-tri-O-benzyl-β-D-glucopyranoside sodium salt）（29.5 mg, qu.）を得た（図５参照）。生成物の分析値（薄層クロマトグラフィー(Rf値)、NMR）を以下に記す。
【００２６】
Rf : 0.13 （クロロホルム：メタノール＝3:1)
C132H162O31N4Na2S MW : 2378.78
500 MHz １H-NMR(CDCl3:CD3OD=1:1,TMS) δ;
2.014(s, 3 H, NAc) 2.795(dd, 1 H, J3eq,4=4.6 Hz, J3eq,3ax=12.7 Hz, H-3eeq)
4.054(t, 1 H, J=9.3 Hz) 4.239(d, 1 H, J=9.5 Hz) 4.367(d, 1 H, J=12.0 Hz, benzyl)
4.852(d, 1 H, J=10.5 Hz, benzyl) 4.895(d, 1 H, J=10.7 Hz, benzyl)
4.934(d, 1 H, J=11.0 Hz, benzyl) 4.960(d, 1 H, J=11.5 Hz, benzyl)
4.986(d, 1 H, J=10.5 Hz, benzyl) 5.033(d, 1 H, J=10.5 Hz, benzyl)
【００２７】
化合物１１
化合物１０（17.4 mg, 0.00731 mmol）を酢酸エチル：メタノール：水（14:9:6, 3.1 ml）に溶解し、２０％水酸化パラジウム炭素（40.2 mg）を加え、反応系内を水素で置換し、室温にて２４時間攪拌した。反応容器に溶媒（酢酸エチル：メタノール：水=14:9:6, 1.0 ml）を加えて、さらに３日間撹拌した。反応混合物をセライト濾過し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣を溶媒（クロロホルム：メタノール：水＝2:3:1）に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液（0.4 N）を滴下して強塩基性とした後、セファデックスＬＨ−２０（クロロホルム：メタノール：水＝2:3:1）、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール：水=6:4:1）、セファデックスＬＨ−２０（クロロホルム：メタノール：水＝2:3:1）にて順次精製し、前記式化１で示される化合物１１（β-Cholestanyl O-[Sodium(5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosyl)onate]-(2→6)-O-(β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-(2-amino-2-deoxy-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-(β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-β-D-glucopyranoside sodium salt）（4.5 mg, 42 %）を得た（図５参照）。生成物の分析値（薄層クロマトグラフィー(Rf値)、NMR）を以下に記す。
【００２８】
Rf : 0.31 （クロロホルム：メタノール：水=6:4:1)
C62H104O31N2Na2S MW : 1451.53
500 MHz １H-NMR(CDCl3:CD3OD:D2O=2:3:1,TMS) δ;
2.022(s, 3 H, NAc) 2.743(dd, 1 H, J3eq,4=4.6 Hz, J3eq,3ax=12.5 Hz, H-3eeq)
2.961(bt, 1 H, H-2c) 3.256(dd, 1 H, J=8.1, 9.3 Hz)
4.243(dd, 1 H, J5,6=5.6 Hz, J6,6'=11.2 Hz, H-6c) 4.371(bd, 1 H, H-6'c)
4.402(d, 1 H, J1,2=7.6 Hz, H-1a or H-1b H-1d)
4.446-4.477(m, 2 H, H-1a or H-1b or H-1d) 4.729(bd, H-1c)
【００２９】
化合物１２
化合物１１（3.2 mg, 0.00220mmol）をジクロロメタン：メタノール：水（4:3:0.8, 1.5 ml）に溶解し、氷冷下、トリエチルアミン（15.3μl, 0.110 mmol）、無水酢酸（10.4μl, 0.110 mmol）を加えた後、室温で７０分間攪拌した。反応液を再び氷冷し、トリエチルアミン（15.3μl, 0.110 mmol）、無水酢酸（10.4μl, 0.110 mmol）を加えた後、室温で７０分間攪拌した。再度反応液を氷冷し、水酸化ナトリウム水溶液（2N, 0.3 ml）、メタノール（0.5 ml）を加えて室温にて５．５時間攪拌した。反応液をセファデックスＬＨ−２０（クロロホルム：メタノール：水＝2:3:1）、DOWEX(登録商標)(Na+)カラム（クロロホルム：メタノール：水＝2:3:1）、セファデックスＬＨ−２０（クロロホルム：メタノール：水＝2:3:1）にて順次精製し、前記式化２で示される化合物１２（β-Cholestanyl O-[Sodium(5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosyl)onate]-(2→6)-O-(β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-(2-acetamido-2-deoxy-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-(β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-β-D-glucopyranoside sodium salt）（3.1 mg, 94 %）を得た（図５参照）。生成物の分析値（薄層クロマトグラフィー(Rf値)、NMR）を以下に記す。
【００３０】
Rf : 0.29 （クロロホルム：メタノール：水=6:4:1)
C64H106O32N2Na2S MW : 1493.57
500 MHz １H-NMR(CDCl3:CD3OD:D2O=2:3:1,TMS) δ;
2.023(s, 3 H, NAc) 2.032(s, 3 H, NAc) 2.710(dd, 1 H, J3eq,4=4.4 Hz, J3eq,3ax=12.0 Hz, H-3eeq)
3.250(dd, 1 H, J=8.1, 9.0 Hz) 4.133(d, 1 H, J=1.7 Hz)
4.244(dd, 1 H, J5,6=5.4 Hz, J6,6'=11.0 Hz, H-6c) 4.376(bd, 1 H, H-6'c)
4.414(d, 2 H, J1,2=7.6 Hz, H-1a or H-1b or H-1c or H-1d)
4.450(d, 1 H, J1,2=7.8 Hz, H-1a or H-1b or H-1c or H-1d)
4.740(d, 1 H, J1,2=7.8 Hz, H-1a or H-1b or H-1c or H-1d)
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物の製造工程（その１）を示す図である。Ａｃは酢酸残基、ＭＰはメトキシフェニル基、Ｐｈｔｈはフタロイル基、Ａｌｌはアリル基、Ｌｅｖはレブリノイル基を表す。
【図２】２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物の製造工程（その２）を示す図である。Ｂｎはベンジル基を表す。
【図３】２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物の製造工程（その３）を示す図である。
【図４】２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物の製造工程（その４）を示す図である。ＮｅｕＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸、Ｍｅはメチル基を表す。
【図５】２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物の製造工程（その５）を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、2-6シアリル6-スルホ糖鎖を有する合成化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
6-硫酸化糖鎖は体内での細胞の移動において重要な役割を演じており、白血球の体内移動やがん細胞の転移において重要な役割を演じている（非特許文献１）。例えば、2-3シアリル6-スルホ糖鎖は癌細胞で合成されていることが知られており、この糖鎖に反応する抗体は癌や非癌疾患の鑑別などに役立つことが知られている（特許文献１、２、非特許文献１）。
一方、2-6シアリル6-スルホ糖鎖は、Bリンパ球による抗体産生の主要な内因性抑制分子であるSiglec-2(CD22)の特異的リガンド糖鎖であることが、合成糖鎖を用いた試験管内研究から知られており（非特許文献２等）、このような糖鎖を有する化合物はBリンパ球に起因する癌などの研究や治療薬の開発に有用であると考えられるが、この2-6シアリル6-スルホ糖鎖を有する合成化合物は今まで知られていなかった。
【０００３】
【特許文献１】特許第3809277号
【特許文献２】US2005/0208631
【非特許文献１】J. Biol. Chem., 273: 11225-11233, 1998.
【非特許文献２】PNAS vol.101, 17033-17038 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
この発明は、2-6シアリル6-スルホ糖鎖を有する合成化合物を提供する。
【課題を解決するための手段及び発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明者らは、鋭意検討した結果、コレスタノールを基材として用いて糖鎖を結合させて上記化合物を合成することに成功し、本願発明を完成させた。
即ち、本願発明は、下記一般式
Siaα2→6Galβ1→4GlcNHR01β(6-sulfate)1→3Galβ1→4Glc−R02
（式中、Siaαはαシアル酸を表し、Galβはβガラクトースを表し、GlcNHR01βはN-置換又は非置換のβN-グルコサミンを表し、R01はアセチル基又は水素原子を表し、Glcはグルコースを表し、R02は脂質を表し、Siaα2→6GalβはSiaαの2 位とGalβの6 位とが結合することを示し、Galβ1→4GlcNHR01β は、Galβの1 位とGlcNHR01βの4 位とが結合することを示し、(6-sulfate)はGlcNHR01βの6 位に硫酸基が付加していることを示し、GlcNHR01β(6-sulfate)1→3GalβはGlcNHR01β(6-sulfate)の1位とGalβの3位とが結合することを示し、Galβ1→4GlcはGalβの1位とGlcの4位とが結合することを示す。）で表される２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物又はその塩である（本明細書において、特に断らない限り、塩であるものを含めて単に「２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物」という。）。
上記において、脂質はコレスタノール、コレステロール、セラミド、スフィンゴシン又はグリセロールであることが好ましい。
【０００６】
さらに、本願発明は、下式の何れかで表される２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物であることが好ましい。
【化１】
又は
【化２】
【０００７】
Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子又はアルカリ金属、好ましくはアルカリ金属、より好ましくはカリウム原子又はナトリウム原子を表す。
Ａｃはアセチル基（酢酸残基、CH3CO-）を表す。
式中のChorestanolは下式で表されるコレスタノールから水酸基を除いた残基を表す。
【化３】
また、本願発明の化合物を中間体として、Ｒ１〜Ｒ４（水素原子又はアルカリ金属）を任意の一価の置換基で置き換えて得られる化合物は、本願発明を利用して容易に得ることができる。
【０００８】
本願発明の２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物は、2-6シアリル6-スルホ糖鎖を有するオリゴ糖化合物であるという特徴を生かして様々な用途が考えられる。
例えば、2-6シアリル6-スルホ糖鎖が癌などで発現量が増加することが最近に研究で明らかになってきているが、当該糖鎖を検出する抗体を成分とする癌の検査薬において、標準物質として、また当該抗体を確認又はスクリーニングするための試薬として用いることができる。
更に、この2-6シアリル6-スルホ糖鎖には、Bリンパ球の抗体産生抑制分子（negative regulator）であるSiglec-2（CD22）が特異的に結合するため(非特許文献２等)、本願の２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物は、Siglec-2（CD22）の競合的拮抗剤として、例えば、Bリンパ球の抗体産生が係わる疾患等に対して使用しうる免疫調節剤として用いることができる。
【実施例】
【０００９】
以下、本願発明の２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物の製造工程を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
各製造工程の反応式を図１〜５に示す。図中の番号は各化合物の番号を示す。
【００１０】
化合物１
Ｎ−アセチルノイラミン酸（NeuAc、ナカライテスク社特級試薬）を常法（Chem.Ber., 99, 611(1966)参照）に従いメチルエステル化、アセチル化、及びクロル化することにより化合物１（Metyl(5-acetamide-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-dideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosyl chloride)onate）を得た（図4参照）。
【００１１】
化合物２
Ｄ（＋）−グルコサミン塩酸塩（D(+)-Glucosamine hydrochloride、和光純薬1級試薬）を２工程(N-フタロイル化、アセチル化)誘導して得られる化合物Ａ１（1,3,4,6-Tetra-O-acetyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranose））を５工程(Tetrahedoron Lett.,31.1597(1990)参照) (メトキシフェニルグリコシル化、脱アセチル化、4,6位ベンジリデン化、3位ベンジル化、脱ベンジリデン化)誘導し、化合物Ａ２（4-Methoxyphenyl 3-O-Benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranoside）を得た。次いでスズ化後、アリルブロミドにより6位選択的にアリル化を行うことにより、化合物Ａ３（4-Methoxyphenyl 6-O-Allyl-3-O-Benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranoside）へ変換した（図１前半参照）。
一方、1,2,3,4,6-ペンタ-O-アセチル-α-D-ガラクトピラノース（1,2,3,4,6-Penta-O-acetyl-α-D-galactopyranose、和光純薬)から、１位の脱アセチル化、同位のフッ素化を経て、化合物Ａ４（2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-D-galactopyranosyl Fluoride)を合成した。
次いで、化合物Ａ３と化合物Ａ４とをハフノセンジクロリド−銀トリフレート触媒法(Tetrahedron Lett 29:3567-70(1988)参照)により縮合し、２糖性糖鎖化合物Ａ５（4-Methoxyphenyl O-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-6-O-allyl-3-O-benzyl-2-deoxy- 2-phthalimido-β-D-glucopyranoside）を合成した。
この２糖性糖鎖化合物Ａ５を常法により、脱アセチル化した後、ガラクトースの６位をトリチル化、その他の水酸基をベンジル化、６位トリチル基の脱保護、そして同６位のレブリノイル化を行い、化合物Ａ６（4-Methoxyphenyl O-(2,3,4-Tri-O-benzyl-6-O-levulinoyl-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-6-O-allyl-3-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranoside）を得た。次いで、1位のメトキシフェニル基を除去し、同位のフッ素化を経て、目的の化合物２（O-(2,3,4-Tri-O-benzyl-6-O-levulinoyl-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-6-O-allyl-3-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl Fluoride）を得た（図１後半参照）。
【００１２】
化合物３
ラクトース(和光純薬特級試薬)を常法によりアセチル化して得られた化合物Ｂ１（Octa-acetyl-lactose）をトリメチルシリルトリフレート触媒下、β-コレスタノール（β-Cholestanol、東京化成工業）との縮合を行い化合物Ｂ２（β-Cholestanyl O-(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-2,3,6-tri-O-acetyl-β-D-glucopyranoside)を合成した。
次いで、化合物Ｂ２を常法により脱アセチル化、スズ化(Tetrahedron Lett 29:4097-100(1988)参照)後、アリルブロミドにより選択的にガラクトース3位へのアリル化を行い、化合物Ｂ３（β-Cholestanyl O-(3-O-Allyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-β-D- glucopyranoside）を合成した。
この化合物Ｂ３を、ベンジル化後、イリジウムコンプレックス(Aldrich社製)により脱アリル化を行い、目的とする化合物３（β-Cholestanyl O-(2,4,6-Tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-2,3,6-tri-O-benzyl-β-D-glucopyranoside）を得た（図２参照）。
【００１３】
化合物４
アルゴンガス雰囲気下、事前に乾燥したモレキュラーシーブス４Ａ（3 g）の入った反応容器に化合物３（353.4 mg, 0.282 mmol）の１，２−ジクロロエタン溶液（5 ml）を加え、室温にて３０分間撹拌した。その後、銀トリフレート（505.1 mg, 1.97 mmol）、ハフノセンジクロリド（367.1 mg, 0.967 mmol）を加えて、氷冷下にて３０分間攪拌した。反応液を−２０℃とし、化合物２（347.1 mg, 0.357 mmol）の１，２−ジクロロエタン溶液（5 ml）を滴下し、１９０分間攪拌した。氷冷下、反応液を酢酸エチルで希釈後、飽和重曹水を加えて撹拌し、セライト濾過した。濾液を飽和重曹水、飽和食塩水にて順次洗浄し、硫酸マグネシウムにて乾燥後、濾過した濾液を減圧下溶媒留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル=7:1）にて精製し、化合物４（β-Cholestanyl O-(2,3,4-tri-O-Benzyl-6-O-levulinoyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-(6-O-allyl-3-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-(2,4,6-tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-2,3,6-tri-O-benzyl-β-D-glucopyranoside）（590.4 mg, 95 %）を得た（図３参照）。生成物の分析値（薄層クロマトグラフィー(Rf値)、NMR）を以下に記す。
【００１４】
Rf : 0.50 (トルエン：酢酸エチル=4:1)
C137H161O24N MW : 2205.76
500 MHz １H-NMR(CDCl3,TMS) δ;
2.125(s, 3 H, OLev) 2.445(t, 2 H, OLev) 2.650-2.683(m, 2 H, OLev)
3.681(d, 1 H, J=9.8 Hz) 4.652(d, 1 H, J=11.2 Hz, benzyl)
4.967(d, 1 H, J=11.7 Hz, benzyl) 5.367(d, 1 H, J1,2=8.3 Hz, H-1c)
5.725-5.794(m, 1 H, H-2All)
【００１５】
化合物５
化合物４（687.1 mg, 0.312 mmol）のn-ブタノール溶液（80 ml）にエチレンジアミン（40 ml）を加えて１１０℃にて一晩撹拌した。反応液にキシレンを加えて減圧下溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル=3:1）にて精製し、化合物５（β-Cholestanyl O-(2,3,4-tri-O-Benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-(6-O-allyl-2-amino-3-O-benzyl-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-(2,4,6-tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-2,3,6-tri-O-benzyl-β-D-glucopyranoside）（566.9 mg,92 %）を得た（図３参照）。生成物の分析値（薄層クロマトグラフィー(Rf値)、NMR）を以下に記す。
【００１６】
Rf : 0.52 (トルエン：酢酸エチル=2:1)
C124H153O20N MW : 1977.56
500 MHz １H-NMR(CDCl3,TMS) δ;
2.836(dd, 1 H, J1,2=7.8 Hz, J2,3=9.8 Hz, H-2c) 4.175(d, 1 H, J=11.7 Hz, benzyl)
4.317(d, 1 H, J=11.7 Hz, benzyl) 4.901(d, 1 H, J=10.7 Hz, benzyl)
5.185(d, 1 H, J=10.7 Hz, benzyl) 5.703-5.780(m, 1 H, H-2All)
【００１７】
化合物６
化合物５（584.2 mg, 0.295 mmol）と４−ジメチルアミノピリジン(ＤＭＡＰ)（293.5 mg, 2.40 mmol）ジクロロメタン：アセトニトリル（1:2, 12 ml）に、室温にてトリフルオロメタンスルホン酸アジド（0.665 mmol/ml Dichloromethane sol. 2.66 ml, 1.77 mmol）を滴下し、１４０分間攪拌した。反応液をトルエンにて希釈した後濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル=6:1）にて精製し、化合物６（β-Cholestanyl O-(2,3,4-tri-O-Benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-(6-O-allyl-2-azido-3-O-benzyl-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-(2,4,6-tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-2,3,6-tri-O-benzyl-β-D-glucopyranoside）（550.0 mg, 93 %）を得た（図３参照）。生成物の分析値（薄層クロマトグラフィー(Rf値)、NMR）を以下に記す。
【００１８】
Rf : 0.42 (トルエン：酢酸エチル=4:1)
C124H151O20N3 MW : 2003.56
500 MHz １H-NMR(CDCl3,TMS) δ;
4.170(d, 1 H, J=11.7 Hz, benzyl) 4.312(d, 1 H, J=11.7 Hz, benzyl)
4.445(d, 1 H, J1,2=7.8 Hz, H-1a or H-1b or H-1c or H-1d)
4.571(d, 1 H, J=11.5 Hz, benzyl) 4.593(d, 1 H, J1,2=8.0 Hz, H-1a or H-1b or H-1c or H-1d)
4.908(d, 1 H, J=10.7 Hz, benzyl) 5.048(d, 1 H, J=10.5 Hz, benzyl)
5.712-5.788(m, 1 H, H-2All)
【００１９】
化合物７
アルゴンガス雰囲気下、事前に乾燥したモレキュラーシーブス（4A 3.5 g + 3A 3.5 g）の入った反応容器に、化合物６（400.0 mg, 0.200mmol）のジクロロメタン：アセトニトリル溶液（1:2, 15 ml）を加え、氷冷下、化合物１（2224.1 mg, 4.23 mmol）、塩化第二水銀：シアン化第二水銀（1:1 (mol比), 3160.8 mg, 5.16 mmol）を加え、室温下７５時間撹拌した。反応液を氷冷し、酢酸エチルで希釈後、飽和重曹水を加えて撹拌し、セライト濾過した。濾液を飽和重曹水、飽和食塩水にて順次洗浄し、硫酸マグネシウムにて乾燥後、濾過した濾液を減圧下溶媒留去した。得られた残渣を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル=1:5）、バイオビーズＳＸ−１（Bio-Beads SX-1、BIO RAD）（トルエン）、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル=1.1:1）にて順次精製し、化合物７（β-Cholestanyl O-[Methyl(5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-dideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosyl)onate]-(2→6)-O-(2,3,4-tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-(6-O-allyl-2-azido-3-O-benzyl-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-(2,4,6-tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-2,3,6-tri-O-benzyl-β-D-glucopyranoside）（200.9 mg, 41 %）を得た（図４参照）。生成物の分析値（薄層クロマトグラフィー(Rf値)、NMR）を以下に記す。
【００２０】
Rf : 0.21 (トルエン：酢酸エチル=1:1)
C144H178O32N4 MW : 2476.99
500 MHz １H-NMR(CDCl3,TMS) δ;
1.877,1.933,2.023,2.057,2.069(s×5, 3 H×5, Ac×5)
2.505(dd, 1 H, J3eq,4=4.6 Hz, J3eq,3ax=12.7 Hz, H-3eeq) 3.551(s, 3 H, COOMe)
4.170(d, 1 H, J=12.0 Hz, benzyl) 4.213(dd, 1 H, J=12.5, 2.7 Hz)
4.318(d, 1 H, J=11.7 Hz, benzyl) 4.598(d, 1 H, J1,2=7.8 Hz, H-1a or H-1b or H-1c or H-1d)
4.906(d, 1 H, J=10.7 Hz, benzyl) 4.953(d, 1 H, J=11.2 Hz, benzyl)
5.058(d, 1 H, J=10.7 Hz, benzyl) 5.244-5.276(m, 1 H, H-8e)
5.299(dd, 1 H, J=2.0, 7.8 Hz, H-7e) 5.719-5.795(m, 1 H, H-2All)
【００２１】
化合物８
水素ガス雰囲気下にて活性化されたイリジウムコンプレックス[Ig(CoD)(PMePh２)２PF６]（8.1 mg, 0.0096 mmol）のテトラヒドロフラン溶液（3 ml）に、アルゴンガス雰囲気下、化合物７（40.6 mg, 0.0164 mmol）のテトラヒドロフラン溶液（3 ml）を加えて７時間攪拌した。次いで、水（0.6 ml）、ヨウ素（23.4 mg,0.184 mmol）を加えて一晩攪拌した。反応混合液を酢酸エチルで希釈後、チオ硫酸ナトリウム水、飽和重曹水、飽和食塩水にて順次洗浄し、硫酸マグネシウムにて乾燥後、濾過した濾液を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：アセトン＝2:1）にて精製した。得られた反応混合物をテトラヒドロフラン：水（30:1, 3.1 ml）に溶解し、p-トルエンスルホン酸一水和物（8.5 mg, 0.0447 mmol）を加え、５０分間攪拌した。反応液を樹脂（アンバーリストA-21（Rohm and Haas社））にて中和し、濾過後、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン：アセトン＝4:1）にて精製し、化合物８（β-Cholestanyl O-[Methyl(5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-dideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosyl)onate]-(2→6)-O-(2,3,4-tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-(2-azido-3-O-benzyl-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-(2,4,6-tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-2,3,6-tri-O-benzyl-β-D-glucopyranoside）（32.0 mg, 80 %）を得た（図４参照）。生成物の分析値（薄層クロマトグラフィー(Rf値)、NMR）を以下に記す。
【００２２】
Rf : 0.37 （トルエン：アセトン＝3:1)
C141H174O32N4 MW : 2436.92
500 MHz １H-NMR(CDCl3:CD3OD=1:1,TMS) δ;
1.861,1.934,2.019,2.072,2.082(s×5, 3 H×5, Ac×5)
2.616(dd, 1 H, J3eq,3ax=12.7 Hz, J3eq,4=4.6 Hz, H-3eeq) 3.613(s, 3 H, COOMe)
4.209(d, 1 H, J=12.0 Hz, benzyl) 4.253(dd, 1 H, J=9.0, 11.5 Hz)
4.904(d, 1 H, J=11.0 Hz, benzyl) 5.072(d, 1 H, J=10.7 Hz, benzyl)
【００２３】
化合物９
アルゴンガス雰囲気下、トリエチルアミン硫酸コンプレックス（75.2 mg, 0.415 mmol）のN,N-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（1.5 ml）に化合物８（31.9 mg, 0.0707 mmol）を溶解し、５０℃にて４５分間攪拌した。反応液をセファデックスＬＨ−２０（SephadexTM LH-20、Amersham Biosciences）（クロロホルム：メタノール＝1:1）にて精製し、DOWEX(登録商標、ダウケミカル社)(Na+)バッチ及びDOWEX(登録商標)(Na+)カラム（クロロホルム：メタノール：水＝5:5:1）にて対カチオンをナトリウムに変換した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝12:1）にて精製し、化合物９（β-Cholestanyl O-[Methyl(5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-dideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosyl)onate]-(2→6)-O-(2,3,4-tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-(2-azido-3-O-benzyl-2-deoxy-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-(2,4,6-tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-2,3,6-tri-O-benzyl-β-D-glucopyranoside sodium salt）（29.9 mg, 90 %）を得た（図５参照）。生成物の分析値（薄層クロマトグラフィー(Rf値)、NMR）を以下に記す。
【００２４】
Rf : 0.40 （クロロホルム：メタノール＝11:1)
C141H173O35N4NaS MW : 2538.97
500 MHz １H-NMR(CDCl3:CD3OD=1:1,TMS) δ;
1.856,1.947,2.012,2.076,2.085(s×5, 3 H×5, Ac×5)
2.612(dd, 1 H, J3eq,4=4.4 Hz, J3eq,3ax=12.5 Hz, H-3eeq) 3.568(s, 3 H, COOMe)
4.188(d, 1 H, J=12.0 Hz, benzyl) 4.248(dd, 1 H, J=2.7, 12.5 Hz)
4.312(bd, 1 H) 4.462(dd, 1 H, J=10.7, 3.9 Hz) 4.894(d, 1 H, J=11.0 Hz, benzyl)
5.278(dd, 1 H, J=2.0, 8.1 Hz, H-7e) 5.313-5.345(m, 1 H, H-8e)
【００２５】
化合物１０
アルゴンガス雰囲気下、化合物９（29.9 mg, 0.0118 mmol）をテトラヒドロフラン：メタノール（1:1, 4 ml）に溶解し、ナトリウムメトキシド（21.1 mg, 0.391 mmol）を加えて室温にて２２５分間攪拌した。反応液を約0.5 mlに濃縮し、ジクロロメタン：メタノール：水（5:5:1, 3 ml）を加えて溶解し、一晩攪拌した。さらに反応液に水酸化ナトリウム水溶液（2N, 20μl）を加えて１時間撹拌した。その後反応容器を４０℃に加熱し、室温にて８５分間撹拌した。反応液をセファデックスＬＨ−２０（クロロホルム：メタノール：水＝5:5:1）、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝3:1）にて順次精製し、化合物１０（β-Cholestanyl O-[Sodium(5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosyl)onate]-(2→6)-O-(2,3,4-tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-(2-azido-3-O-benzyl-2-deoxy-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-(2,4,6-tri-O-benzyl-β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-2,3,6-tri-O-benzyl-β-D-glucopyranoside sodium salt）（29.5 mg, qu.）を得た（図５参照）。生成物の分析値（薄層クロマトグラフィー(Rf値)、NMR）を以下に記す。
【００２６】
Rf : 0.13 （クロロホルム：メタノール＝3:1)
C132H162O31N4Na2S MW : 2378.78
500 MHz １H-NMR(CDCl3:CD3OD=1:1,TMS) δ;
2.014(s, 3 H, NAc) 2.795(dd, 1 H, J3eq,4=4.6 Hz, J3eq,3ax=12.7 Hz, H-3eeq)
4.054(t, 1 H, J=9.3 Hz) 4.239(d, 1 H, J=9.5 Hz) 4.367(d, 1 H, J=12.0 Hz, benzyl)
4.852(d, 1 H, J=10.5 Hz, benzyl) 4.895(d, 1 H, J=10.7 Hz, benzyl)
4.934(d, 1 H, J=11.0 Hz, benzyl) 4.960(d, 1 H, J=11.5 Hz, benzyl)
4.986(d, 1 H, J=10.5 Hz, benzyl) 5.033(d, 1 H, J=10.5 Hz, benzyl)
【００２７】
化合物１１
化合物１０（17.4 mg, 0.00731 mmol）を酢酸エチル：メタノール：水（14:9:6, 3.1 ml）に溶解し、２０％水酸化パラジウム炭素（40.2 mg）を加え、反応系内を水素で置換し、室温にて２４時間攪拌した。反応容器に溶媒（酢酸エチル：メタノール：水=14:9:6, 1.0 ml）を加えて、さらに３日間撹拌した。反応混合物をセライト濾過し、減圧下溶媒を留去した。得られた残渣を溶媒（クロロホルム：メタノール：水＝2:3:1）に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液（0.4 N）を滴下して強塩基性とした後、セファデックスＬＨ−２０（クロロホルム：メタノール：水＝2:3:1）、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール：水=6:4:1）、セファデックスＬＨ−２０（クロロホルム：メタノール：水＝2:3:1）にて順次精製し、前記式化１で示される化合物１１（β-Cholestanyl O-[Sodium(5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosyl)onate]-(2→6)-O-(β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-(2-amino-2-deoxy-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-(β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-β-D-glucopyranoside sodium salt）（4.5 mg, 42 %）を得た（図５参照）。生成物の分析値（薄層クロマトグラフィー(Rf値)、NMR）を以下に記す。
【００２８】
Rf : 0.31 （クロロホルム：メタノール：水=6:4:1)
C62H104O31N2Na2S MW : 1451.53
500 MHz １H-NMR(CDCl3:CD3OD:D2O=2:3:1,TMS) δ;
2.022(s, 3 H, NAc) 2.743(dd, 1 H, J3eq,4=4.6 Hz, J3eq,3ax=12.5 Hz, H-3eeq)
2.961(bt, 1 H, H-2c) 3.256(dd, 1 H, J=8.1, 9.3 Hz)
4.243(dd, 1 H, J5,6=5.6 Hz, J6,6'=11.2 Hz, H-6c) 4.371(bd, 1 H, H-6'c)
4.402(d, 1 H, J1,2=7.6 Hz, H-1a or H-1b H-1d)
4.446-4.477(m, 2 H, H-1a or H-1b or H-1d) 4.729(bd, H-1c)
【００２９】
化合物１２
化合物１１（3.2 mg, 0.00220mmol）をジクロロメタン：メタノール：水（4:3:0.8, 1.5 ml）に溶解し、氷冷下、トリエチルアミン（15.3μl, 0.110 mmol）、無水酢酸（10.4μl, 0.110 mmol）を加えた後、室温で７０分間攪拌した。反応液を再び氷冷し、トリエチルアミン（15.3μl, 0.110 mmol）、無水酢酸（10.4μl, 0.110 mmol）を加えた後、室温で７０分間攪拌した。再度反応液を氷冷し、水酸化ナトリウム水溶液（2N, 0.3 ml）、メタノール（0.5 ml）を加えて室温にて５．５時間攪拌した。反応液をセファデックスＬＨ−２０（クロロホルム：メタノール：水＝2:3:1）、DOWEX(登録商標)(Na+)カラム（クロロホルム：メタノール：水＝2:3:1）、セファデックスＬＨ−２０（クロロホルム：メタノール：水＝2:3:1）にて順次精製し、前記式化２で示される化合物１２（β-Cholestanyl O-[Sodium(5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosyl)onate]-(2→6)-O-(β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-(2-acetamido-2-deoxy-6-O-sulfo-β-D-glucopyranosyl)-(1→3)-O-(β-D-galactopyranosyl)-(1→4)-O-β-D-glucopyranoside sodium salt）（3.1 mg, 94 %）を得た（図５参照）。生成物の分析値（薄層クロマトグラフィー(Rf値)、NMR）を以下に記す。
【００３０】
Rf : 0.29 （クロロホルム：メタノール：水=6:4:1)
C64H106O32N2Na2S MW : 1493.57
500 MHz １H-NMR(CDCl3:CD3OD:D2O=2:3:1,TMS) δ;
2.023(s, 3 H, NAc) 2.032(s, 3 H, NAc) 2.710(dd, 1 H, J3eq,4=4.4 Hz, J3eq,3ax=12.0 Hz, H-3eeq)
3.250(dd, 1 H, J=8.1, 9.0 Hz) 4.133(d, 1 H, J=1.7 Hz)
4.244(dd, 1 H, J5,6=5.4 Hz, J6,6'=11.0 Hz, H-6c) 4.376(bd, 1 H, H-6'c)
4.414(d, 2 H, J1,2=7.6 Hz, H-1a or H-1b or H-1c or H-1d)
4.450(d, 1 H, J1,2=7.8 Hz, H-1a or H-1b or H-1c or H-1d)
4.740(d, 1 H, J1,2=7.8 Hz, H-1a or H-1b or H-1c or H-1d)
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物の製造工程（その１）を示す図である。Ａｃは酢酸残基、ＭＰはメトキシフェニル基、Ｐｈｔｈはフタロイル基、Ａｌｌはアリル基、Ｌｅｖはレブリノイル基を表す。
【図２】２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物の製造工程（その２）を示す図である。Ｂｎはベンジル基を表す。
【図３】２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物の製造工程（その３）を示す図である。
【図４】２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物の製造工程（その４）を示す図である。ＮｅｕＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸、Ｍｅはメチル基を表す。
【図５】２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物の製造工程（その５）を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式
Siaα2→6Galβ1→4GlcNHR01β(6-sulfate)1→3Galβ1→4Glc−R02
（式中、Siaαはαシアル酸を表し、Galβはβガラクトースを表し、GlcNHR01βはN-置換又は非置換のβN-グルコサミンを表し、R01はアセチル基又は水素原子を表し、Glcはグルコースを表し、R02は脂質を表し、Siaα2→6GalβはSiaαの2 位とGalβの6 位とが結合することを示し、Galβ1→4GlcNHR01β は、Galβの1 位とGlcNHR01βの4 位とが結合することを示し、(6-sulfate)はGlcNHR01βの6 位に硫酸基が付加していることを示し、GlcNHR01β(6-sulfate)1→3GalβはGlcNHR01β(6-sulfate)の1位とGalβの3位とが結合することを示し、Galβ1→4GlcはGalβの1位とGlcの4位とが結合することを示す。）で表される２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物又はその塩。
【請求項２】
脂質が、コレスタノール、コレステロール、セラミド、スフィンゴシン又はグリセロールである請求項１に記載の２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物又はその塩。
【請求項３】
下記の何れかの化学式で表される請求項１又は２に記載の２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物又はその塩。
【化１】
又は
【化２】
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子又はアルカリ金属を表し、Acはアセチル基を表し、Cholestanolはコレスタノール残基を表す。）
【請求項１】
下記一般式
Siaα2→6Galβ1→4GlcNHR01β(6-sulfate)1→3Galβ1→4Glc−R02
（式中、Siaαはαシアル酸を表し、Galβはβガラクトースを表し、GlcNHR01βはN-置換又は非置換のβN-グルコサミンを表し、R01はアセチル基又は水素原子を表し、Glcはグルコースを表し、R02は脂質を表し、Siaα2→6GalβはSiaαの2 位とGalβの6 位とが結合することを示し、Galβ1→4GlcNHR01β は、Galβの1 位とGlcNHR01βの4 位とが結合することを示し、(6-sulfate)はGlcNHR01βの6 位に硫酸基が付加していることを示し、GlcNHR01β(6-sulfate)1→3GalβはGlcNHR01β(6-sulfate)の1位とGalβの3位とが結合することを示し、Galβ1→4GlcはGalβの1位とGlcの4位とが結合することを示す。）で表される２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物又はその塩。
【請求項２】
脂質が、コレスタノール、コレステロール、セラミド、スフィンゴシン又はグリセロールである請求項１に記載の２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物又はその塩。
【請求項３】
下記の何れかの化学式で表される請求項１又は２に記載の２−６シアリル６−スルホラクトサミン糖鎖含有化合物又はその塩。
【化１】
又は
【化２】
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子又はアルカリ金属を表し、Acはアセチル基を表し、Cholestanolはコレスタノール残基を表す。）
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−１９５６６７（Ｐ２００８−１９５６６７Ａ）
【公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３３６７５（Ｐ２００７−３３６７５）
【出願日】平成１９年２月１４日（２００７．２．１４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００６年８月２８日 日本癌学会発行の「第６５回 日本癌学会学術総会記事」に発表
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（３０４０３１４２７）愛知県 (36)
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月１４日（２００７．２．１４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００６年８月２８日 日本癌学会発行の「第６５回 日本癌学会学術総会記事」に発表
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（３０４０３１４２７）愛知県 (36)
【出願人】（０００１９５５２４）生化学工業株式会社 (143)
【Ｆターム（参考）】
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