５’−イノシン酸生産性が向上したコリネバクテリウム属微生物及びこれを用いた核酸の生産方法
本発明は、プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子の発現量が内在的発現量より増加された、５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物及び向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物を培養する段階を含む５’−イノシン酸生産方法に関するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子の発現量が内在的発現量より増加された、５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物及び向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物を培養する段階を含む５’−イノシン酸生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
核酸系物質中の１つである５’−イノシン酸（５’−ｉｎｏｓｉｎｉｃ ａｃｉｄ）は、核酸生合成代謝系の中間物質であって、動植物の体内で生理的に重要な役割を果たすだけでなく、食品、医薬品及び各種医療的利用などの多方面で用いられている。５’−イノシン酸は、特に、グルタミン酸ナトリウム（ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ ｇｌｕｔａｍａｔｅ：ＭＳＧ）と共に使用すると、味の上昇効果が大きくて呈味性調味料として脚光を浴びている核酸系調味料中の１つである。
【０００３】
５’−イノシン酸を製造する方法として、酵母細胞から抽出したリボ核酸を酵素で分解する方法（日本特許公告第１６１４／１９５７号など）、発酵によって生産されたイノシンを化学的方法でリン酸化する方法（Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３６，１５１１（１９７２）など）及び５’−イノシン酸を生産できる微生物を培養して培地に蓄積されたイノシン一リン酸（ｉｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＩＭＰ）を回収する方法などがある。現在、最も多く使用されている方法は、微生物を用いて５’−イノシン酸を生産する方法である。５’−イノシン酸の生産のために用いる微生物としては、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株が広く用いられており、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）菌株を培養して５’−イノシン酸を生産する方法（大韓民国特許公開第２００３−００４２９７２号など）などが公知されている。
【０００４】
微生物を用いた５’−イノシン酸の生産の収率を高めるために、５’−イノシン酸の生合成経路または分解経路と関連された酵素の活性や発現を増加させるとかまたは低下させて改良した菌株などが開発されている。大韓民国特許第７８５２４８号は、プリン生合成経路上のホスホリボシルアミノイミダゾールサクシノカルボキシアミドシンセターゼをコーディングする遺伝子ｐｕｒＣが過発現された微生物及びこれを用いた５’−イノシン酸の生産方法を開示する。また、韓国特許第８５７３７９号は、ｐｕｒＫＥによって暗号化されるホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼ遺伝子が過発現されたコリネバクテリウム・アンモニアゲネス菌株とこれを用いてＩＭＰを高濃度及び高収率で生産する方法を開示する。
【０００５】
しかし、依然としてより高い収率で５’−イノシン酸を生産できる菌株の開発及びこれを用いた５’−イノシン酸生産方法に対する要求が存在する。
【０００６】
従って、本発明者らは、５’−イノシン酸を高い生産性で生産できる菌株に対する研究を行い、プリン生合成経路に関与する主要酵素の活性を同時に内在的活性より高める場合、５’−イノシン酸の生産性が向上するということを発見して本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物を提供することである。
【０００８】
本発明のまた他の目的は、向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物を用いて５’−イノシン酸を生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記のような目的を達成するために、本発明は、プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子の発現量が内在的発現量より増加された、５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
【００１０】
本発明のコリネバクテリウム属微生物は、プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子の発現量が内在的発現量より増加され、母菌株対比向上した５’−イノシン酸生産性を有する。
【００１１】
本発明において、“プリン生合成酵素（ｐｕｒｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｅｎｚｙｍｅ）”は、プリン塩基を最終産物として生成するプリン生合成経路に含まれた反応を触媒する酵素を意味し、ホスホリボシルピロホスフェートアミドトランスフェラーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｍｉｄｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｇｌｙｃｉｎａｍｉｄｅ ｆｏｒｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｆｏｒｍｙｌｇｌｙｃｉｎａｍｉｄｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼＩＩ（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｆｏｒｍｙｌｇｌｙｃｉｎａｍｉｄｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅＩＩ）、ホスホリボシルアミノイミダゾールシンセターゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンセターゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｓｕｃｃｉｎｏｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、イノシン酸シクロヒドロラーゼ（ｉｎｏｓｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｃｙｃｌｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、リボースホスフェートピロホスホキナーゼ（Ｒｉｂｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏ ｋｉｎａｓｅ）などを含む。
【００１２】
本発明の一具体例において、プリン生合成酵素は、ホスホリボシルピロホスフェートアミドトランスフェラーゼ、ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼＩＩ、ホスホリボシルアミノイミダゾールシンセターゼ、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼ、ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンセターゼ及びイノシン酸シクロヒドロラーゼから構成された群から選択される１つ以上の酵素と、リボースホスフェートピロホスホキナーゼから構成された組合せであり得る。
【００１３】
本発明の一具体例において、内在的水準対比発現量が増加されたプリン生合成酵素をコーディングする遺伝子は、ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号３６のｐｕｒＮ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号３７のｐｕｒＳ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼＩＩをコーディングする遺伝子である配列番号３８のｐｕｒＬ、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４０のｐｕｒＫＥ、ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号４１のｐｕｒＣ、イノシン酸シクロヒドロラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４２のｐｕｒＨ及びリボースホスフェートピロホスホキナーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４３のｐｒｓから構成された組合せであり得る。
【００１４】
本発明の一具体例において、内在的水準対比発現量が増加されたプリン生合成酵素をコーディングする遺伝子は、ホスホリボシルピロホスフェートアミドトランスフェラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号３５のｐｕｒＦ、ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号３６のｐｕｒＮ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号３７のｐｕｒＳ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼＩＩをコーディングする遺伝子である配列番号３８のｐｕｒＬ、ホスホリボシルアミノイミダゾールシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号３９のｐｕｒＭ、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４０のｐｕｒＫＥ、ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号４１のｐｕｒＣ、イノシン酸シクロヒドロラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４２のｐｕｒＨ及びリボースホスフェートピロホスホキナーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４３のｐｒｓから構成された組合せであり得る。
【００１５】
本発明において、“内在的発現量より増加された”は、微生物から自然的に発現される遺伝子の発現量、または母菌株から発現される遺伝子の発現量より高い量で発現することを意味し、当該酵素をコーディングする遺伝子の個数（コピー数）の増加及びそれに応じる発現量増加、または遺伝子の突然変異による発現量の増加またはこの両方による発現量の増加を含む。
【００１６】
本発明の一具体例において、プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子の発現量増加は、当該遺伝子が外部から更に菌株に導入されるとかまたは内在的遺伝子が増幅されて遺伝子のコピー数が増加されるとかまたは転写または翻訳調節配列に導入された変異によって転写効率または翻訳効率が増加された場合を含むが、これに限定されない。内在的遺伝子の増幅は、当業界に知られている方法、例えば、適当な選択圧力下で培養する方法などによって容易に達することができる。
【００１７】
本発明の一具体例において、プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子の発現量は、プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子が細胞外部から更に導入されとかまたはプリン生合成酵素をコーディングする内在的遺伝子が増幅されて増加されたものであり得る。
【００１８】
本発明の一具体例において、向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物で、内在的水準対比発現量が増加されたプリン生合成酵素をコーディングする遺伝子は、相応する内在的遺伝子の外に１つ以上のコピーが外部から導入されて２つ以上のコピーで存在することができる。
【００１９】
本発明の一具体例において、向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物で、プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子の外部からの導入は、相応する遺伝子の連続的に配列された２つのコピーを含む組換えベクターによる形質転換を介して達することができる。
【００２０】
本発明の一具体例において、向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物の製造のために使用された組換えベクターは、導入される遺伝子に応じてそれぞれ図２〜図７の開裂地図を有する組換えベクター、ｐＤＺ−２ｐｕｒＦＭ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＮＨ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＳＬ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＫＥ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＣ、及びｐＤＺ−２ｐｒｓから構成された群から選択され得る。
【００２１】
本発明の一具体例において、向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物は、５’−イノシン酸を生産できるコリネバクテリウム微生物から来由し得る。例えば、本発明による向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９及びこれから製造された菌株から来由し得る。
【００２２】
本発明の一具体例において、向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物は、プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子を２つのコピー以上含むことができる。
【００２３】
本発明の一具体例において、向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスであり得るし、より好ましくは、ｐｒｓ遺伝子と、ｐｕｒＦ、ｐｕｒＮ、ｐｕｒＳ、ｐｕｒＬ、ｐｕｒＭ、ｐｕｒＫＥ、ｐｕｒＣ及びｐｕｒＨ遺伝子から構成された群から選択される１つ以上の遺伝子の組合せの内在的活性が５’−イノシン酸を高濃度で生産するように増加されたものである形質転換されたコリネバクテリウム・アンモニアゲネスであり得る。
【００２４】
本発明の一具体例において、向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物は、５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１（ＫＣＣＭ−１０６１０）菌株にそれぞれ図２、３、４、５、６及び７の開裂地図を有する組換えベクターｐＤＺ−２ｐｕｒＦＭ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＮＨ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＳＬ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＫＥ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＣ、ｐＤＺ−２ｐｒｓを順にまたは組合せで導入され、導入されたｐｕｒＦ、ｐｕｒＮ、ｐｕｒＳ、ｐｕｒＬ、ｐｕｒＭ、ｐｕｒＫＥ、ｐｕｒＣ、ｐｕｒＨ及びｐｒｓ遺伝子の２つのコピーのうち、１つが相応する内在的遺伝子を相同組換えによって置換してｐｕｒＦ、ｐｕｒＮ、ｐｕｒＳ、ｐｕｒＬ、ｐｕｒＭ、ｐｕｒＫＥ、ｐｕｒＣ、ｐｕｒＨ及びｐｒｓ遺伝子がそれぞれ２つのコピーずつ染色体内に挿入された菌株であり得る。
【００２５】
本発明の一具体例において、向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物は、ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号３６のｐｕｒＮ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号３７のｐｕｒＳ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼＩＩをコーディングする遺伝子である配列番号３８のｐｕｒＬ、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４０のｐｕｒＫＥ、ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号４１のｐｕｒＣ、イノシン酸シクロヒドロラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４２のｐｕｒＨ及びリボースホスフェートピロホスホキナーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４３のｐｒｓから構成された組合せのプリン生合成酵素をコーディングする遺伝子を２つのコピーずつ含む、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスであり得るし、好ましくは、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０１−０１２０であり得る。
【００２６】
本発明の一具体例において、向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物は、ホスホリボシルピロホスフェートアミドトランスフェラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号３５のｐｕｒＦ、ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号３６のｐｕｒＮ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号３７のｐｕｒＳ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼＩＩをコーディングする遺伝子である配列番号３８のｐｕｒＬ、ホスホリボシルアミノイミダゾールシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号３９のｐｕｒＭ、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４０のｐｕｒＫＥ、ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号４１のｐｕｒＣ、イノシン酸シクロヒドロラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４２のｐｕｒＨ及びリボースホスフェートピロホスホキナーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４３のｐｒｓから構成された組合せのプリン生合成酵素をコーディングする遺伝子を２つのコピーずつ含む、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスであり得るし、好ましくは、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０１−０３１６（ＫＣＣＭ１０９９２Ｐ）であり得る。
【００２７】
また、本発明は、プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子の発現量が内在的発現量より増加された、５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物を培養する段階及び前記培養液から５’−イノシン酸を回収する段階を含む５’−イノシン酸を生産する方法を提供する。
【００２８】
本発明の５’−イノシン酸を生産する方法において、コリネバクテリウム属微生物の培養に使用される培地及びその他の培養条件は、コリネバクテリウム属微生物の培養で通常的に使用されるものと同一であり得るし、当業者が容易に選択して調節することができる。また、培養方法も当業界に知られている任意の培養方法、例えば、回分式、連続式及び流加式培養方法などが使用され得るが、これらに限定されるのではない。
【００２９】
本発明の一具体例において、５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスであり得る。
【００３０】
本発明の一具体例において、５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０１−０１２０またはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０１−０３１６（ＫＣＣＭ１０９９２Ｐ）であり得る。
【００３１】
本発明の一具体例において、コリネバクテリウム属微生物を培養する段階は、菌株を適当な炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミンなどを含有した通常の培地内において好気性条件下で温度、ｐＨなどを調節しながら培養する。
【００３２】
炭素源としては、グルコース、フルクトース（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）のような炭水化物が使用されることができ、窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムのような各種無機窒素源及びペプトン、ＮＺ−アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類またはその分解生成物、脱脂大豆ケーキまたはその分解生成物など有機窒素源が使用され得る。無機化合物としては、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどが使用されることができ、以外に必要に応じてビタミン及び栄養要求性塩基などが添加され得る。
【００３３】
培養は、好気的条件下で、例えば、振盪培養または通気撹拌培養によって、好ましくは、２８〜３６℃の温度で行われる。培地のｐＨは、培養する間にｐＨ６〜８の範囲で維持するのが好ましい。培養は、４〜６日間行われることができる。
【００３４】
以下、実施例を介して本発明をより詳細に説明する。しかし、実施例は、ただ本発明を例示するためのものであるので、本発明の範囲が実施例によって限定されることとして解釈されない。
【発明の効果】
【００３５】
本発明によるプリン生合成に関与する主な酵素をコーディングする遺伝子の発現量が内在的発現量より増加された、５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物を用いて５’−イノシン酸を高濃度及び高収率で生産することができ、これによって生産コストを節減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、コリネバクテリウム属微生物の染色体内挿入用ベクターｐＤＺベクターを示す。
【図２】図２は、コリネバクテリウム属微生物の染色体内挿入用ベクターｐＤＺ−２ｐｕｒＦＭを示す。
【図３】図３は、コリネバクテリウム属微生物の染色体内挿入用ベクターｐＤＺ−２ｐｕｒＮＨを示す。
【図４】図４は、コリネバクテリウム属微生物の染色体内挿入用ベクターｐＤＺ−２ｐｕｒＳＬを示す。
【図５】図５は、コリネバクテリウム属微生物の染色体内挿入用ベクターｐＤＺ−２ｐｕｒＫＥを示す。
【図６】図６は、コリネバクテリウム属微生物の染色体内挿入用ベクターｐＤＺ−２ｐｕｒＣを示す。
【図７】図７は、コリネバクテリウム属微生物の染色体内挿入用ベクターｐＤＺ−２ｐｒｓを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
実施例１．染色体挿入用ベクター（ｐＤＺ）を用いたプリン生合成遺伝子の挿入及びこれによる高収率５’−イノシン酸生産菌株の開発
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス菌株の染色体へ外来遺伝子を挿入するために、該当遺伝子を連続的に２つのコピーを含むｐＤＺ基盤組換えベクターを用いた。ｐＤＺベクターは、コリネバクテリウム属微生物の染色体挿入用ベクターであって、参照によって本明細書に含まれた大韓民国特許公開第２００８−００２５３５５号に開示された方法によって製造した。図１は、ｐＤＺベクターの構造を概略的に見せてくれる。
【００３８】
下記の（１）〜（６）でプリン生合成酵素をコーディングする遺伝子をコリネバクテリウム属微生物の染色体内に挿入させて各遺伝子のコピー数を２つに増加させるために利用され得る組換えベクターを製作した。各組換えベクターによる形質転換及び形質転換体の選別は、下記のように行った。
【００３９】
５’−イノシン酸生産菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１（ＫＣＣＭ−１０６１０）に所望のプリン生合成経路上の酵素をコーディングする遺伝子を含む組換えｐＤＺベクターを電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）で形質転換した後、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／ｌを含有した選別培地で染色体上の当該遺伝子と相同性組換えによってベクター内の遺伝子が染色体内に挿入された菌株を選別した。ベクターの成功的な染色体挿入は、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含んだ固体培地（肉汁１％、酵母エキス１％、ペプトン１％、塩化ナトリウム０．２５％、アデニン１％、グアニン１％、寒天１．５％）でコロニーの色によって確認した。すなわち、青色を表すコロニーをベクターが染色体に挿入された形質転換体であるものとして選別した。１次交差（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）によってベクターが染色体に挿入された菌株を栄養培地（ブドウ糖１％、肉汁１％、酵母エキス１％、ペプトン１％、塩化ナトリウム０．２５％、アデニン１％、グアニン１％）から振蘯培養（３０℃、８時間）した後、それぞれ１０−４から１０−１０まで希釈してＸ−ｇａｌを含んでいる固体培地に塗抹した。大部分のコロニーが青色を表すのに反して低い比率で表れる白色のコロニーを選別することによって、２次交差によって染色体上に挿入されたベクター配列が除去された菌株を選別した。以上のように選別された菌株を最終的に抗生剤カナマイシンに対する感受性可否の確認及びＰＣＲを介する遺伝子構造確認過程を経って最終菌株として選定した。
【００４０】
（１）ｐｕｒＦＭ遺伝子のクローニング及び組換えベクター（ｐＤＺ−２ｐｕｒＦＭ）製作
コリネバクテリウム属微生物の染色体上でｐｕｒＦ遺伝子とｐｕｒＭ遺伝子とは、近接距離に位置しているため、２つの遺伝子を同時に発現させるために前記２つの遺伝子及びプロモーター部位を含んだｐｕｒＦＭベクターを製作した。
５’−イノシン酸生産能を有するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株の染色体を分離し、これを鋳型にしてｐｕｒＦＭ、すなわち、連続的に配列されたｐｕｒＦとｐｕｒＭとを含む断片を収得するために重合酵素連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）を行った。重合酵素は、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高−信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、９６℃で３０秒の変性、５３℃で３０秒のアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）及び７２℃で２分の重合反応から構成されたサイクルを３０回繰り返した。その結果、プロモーター部位を含んだｐｕｒＦＭ遺伝子２対（ｐｕｒＦＭ−Ａ、ｐｕｒＦＭ−Ｂ）を得た。ｐｕｒＦＭ−Ａは、配列番号１と２をプライマーとして使用して増幅されたものであり、ｐｕｒＦＭ−Ｂは、配列番号３と４をプライマーとして使用して増幅されたものである。前記増幅産物をＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて大膓菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングしてそれぞれｐＣＲ−ｐｕｒＦＭ−ＡとｐＣＲ−ｐｕｒＦＭ−Ｂベクターを得た。前記ｐＣＲベクターにｐｕｒＦＭ−ＡとｐｕｒＦＭ−Ｂの各末端に含まれた制限酵素（ｐｕｒＦＭ−Ａ： ＥｃｏＲＩ＋ＸｂａＩ、ｐｕｒＦＭ−Ｂ：ＸｂａＩ＋ＨｉｎｄＩＩI）を処理して前記ｐＣＲベクターからそれぞれのｐｕｒＦＭ遺伝子を分離した。その後、制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩIとが処理されたｐＤＺベクターに３片接合（３−ｐｉｅｃｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ）を介してクローニングし、最終的に、ｐｕｒＦＭ遺伝子２つが連続的にクローニングされたｐＤＺ−２ｐｕｒＦＭ組換えベクターを製作した。図２は、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺ−２ｐｕｒＦＭを示す図である。
前記ｐＤＺ−２ｐｕｒＦＭベクターを５’−イノシン酸生産菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株に電気穿孔法によって形質転換し、２次交差過程を経って染色体上の内在的ｐｕｒＦＭ遺伝子の真横に１つのｐｕｒＦＭ遺伝子を更に挿入して総コピー数を２つに増加させた菌株を得た。連続的に挿入されたｐｕｒＦＭ遺伝子は、２つのｐｕｒＦＭ連結部品を増幅することができる配列番号５と６のプライマーを用いたＰＣＲを介して最終確認した。
【００４１】
（２）ｐｕｒＮＨ遺伝子クローニング及び組換えベクター（ｐＤＺ−２ｐｕｒＮＨ）製作、ｐｕｒＮＨ挿入菌株開発
コリネバクテリウム属微生物の染色体上でｐｕｒＮ遺伝子とｐｕｒＨ遺伝子とが近接距離に位置しているため、２つの遺伝子を同時に発現させるためにプロモーター 部位を含んだｐｕｒＮＨベクターを製作した。
５’−イノシン酸生産能を有するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株の染色体を分離し、これを鋳型にしてｐｕｒＮＨ、すなわち、連続的に配列されたｐｕｒＮとｐｕｒＨとを含む断片を収得するために重合酵素連鎖反応を行った。重合酵素は、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高−信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、９６℃で３０秒の変性、５３℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で２分の重合反応から構成されたサイクルを３０回繰り返した。その結果、プロモーター 部位を含んだｐｕｒＮＨ遺伝子２対（ｐｕｒＮＨ−Ａ、ｐｕｒＮＨ−Ｂ）を得た。ｐｕｒＮＨ−Ａは、配列番号７と８をプライマーとして使用して増幅されたものであり、ｐｕｒＮＨ−Ｂは、配列番号８と９をプライマーとして使用して増幅されたものである。前記増幅産物をＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて大膓菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングしてｐＣＲ−ｐｕｒＮＨ−ＡとｐＣＲ−ｐｕｒＮＨ−Ｂベクターを得た。前記ｐＣＲベクターにｐｕｒＮＨ−ＡとｐｕｒＮＨ−Ｂとの各末端に含まれた制限酵素（ｐｕｒＮＨ−Ａ：ＢａｍＨＩ＋ＳａｌＩ、ｐｕｒＮＨ−Ｂ：ＳａｌＩ）を処理して前記ｐＣＲベクターからそれぞれのｐｕｒＮＨ遺伝子を分離した。その後、制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩとが処理されたｐＤＺベクターに３片接合を介してクローニングし、最終的に、ｐｕｒＮＨ遺伝子２つが連続的にクローニングされたｐＤＺ−２ｐｕｒＮＨ組換えベクターを製作した。図３は、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺ−２ｐｕｒＮＨを示す図である。
前記ｐＤＺ−２ｐｕｒＮＨベクターを５’−イノシン酸生産菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株に電気穿孔法によって形質転換し、２次交差過程を経って染色体上の内在的ｐｕｒＮＨ遺伝子の真横に１つのｐｕｒＮＨ遺伝子を更に挿入して総コピー数を２つに増加させた菌株を得た。連続的に挿入されたｐｕｒＮＨ遺伝子は、２つのｐｕｒＮＨ連結部品を増幅することができる配列番号１０と１１のプライマーを用いたＰＣＲを介して最終確認した。
【００４２】
（３）ｐｕｒＳＬ遺伝子クローニング及び組換えベクター（ｐＤＺ−２ｐｕｒＳＬ）製作、ｐｕｒＳＬ挿入菌株開発
コリネバクテリウム属微生物の染色体上でｐｕｒＳ遺伝子とｐｕｒＬ遺伝子とが近接距離に位置しているため、２つの遺伝子を同時に発現させるためにプロモーター部位を含んだｐｕｒＳＬベクターを製作した。
５’−イノシン酸生産能を有するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株の染色体を分離し、これを鋳型にしてｐｕｒＳＬ、すなわち、連続的に配列されたｐｕｒＳとｐｕｒＬとを含む断片を収得するために重合酵素連鎖反応を行った。重合酵素は、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高−信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、９６℃で３０秒の変性、５３℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で２分の重合反応から構成されたサイクルを３０回繰り返した。その結果、プロモーター 部位を含んだｐｕｒＳＬ遺伝子２対（ｐｕｒＳＬ−Ａ、ｐｕｒＳＬ−Ｂ）を得た。ｐｕｒＳＬ−Ａは、配列番号１２と１３をプライマーとして使用して増幅されたものであり、ｐｕｒＳＬ−Ｂは、配列番号１４と１５をプライマーとして使用して増幅されたものである。前記増幅産物をＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて大膓菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングしてｐＣＲ−ｐｕｒＳＬ−ＡとｐＣＲ−ｐｕｒＳＬ−Ｂベクターを得た。前記ｐＣＲベクターにｐｕｒＳＬ−ＡとｐｕｒＳＬ−Ｂとの各末端に含まれた制限酵素（ｐｕｒＳＬ−Ａ：ＢａｍＨＩ＋ＳａｌＩ、ｐｕｒＳＬ−Ｂ：ＳａｌＩ＋ＢａｍＨＩ）を処理して前記ｐＣＲベクターからそれぞれのｐｕｒＳＬ遺伝子を分離した。その後、制限酵素ＢａｍＨＩが処理されたｐＤＺベクターに３片接合を介してクローニングし、最終的に、ｐｕｒＳＬ遺伝子２つが連続的にクローニングされたｐＤＺ−２ｐｕｒＳＬ組換えベクターを製作した。図４は、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺ−２ｐｕｒＳＬを示す図である。
前記ｐＤＺ−２ｐｕｒＳＬベクターを５’−イノシン酸生産菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株に電気穿孔法によって形質転換し、２次交差過程を経って染色体上の内在的ｐｕｒＳＬ遺伝子の真横に１つのｐｕｒＳＬ遺伝子を更に挿入して総コピー数を２つに増加させた菌株を得た。連続的に挿入されたｐｕｒＳＬ遺伝子は、２つのｐｕｒＳＬ連結部品を増幅することができる配列番号１６と１７のプライマーを用いたＰＣＲを介して最終確認した。
【００４３】
（４）ｐｕｒＫＥ遺伝子クローニング及び組換えベクター（ｐＤＺ−２ｐｕｒＫＥ）製作、ｐｕｒＫＥ挿入菌株開発
コリネバクテリウム属微生物の染色体上でｐｕｒＫ遺伝子とｐｕｒＥ遺伝子とが近接距離に位置しているため、２つの遺伝子を同時に発現させるためにプロモーター部位を含んだｐｕｒＫＥベクターを製作した。
５’−イノシン酸生産能を有するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株の染色体を分離し、これを鋳型にしてｐｕｒＫＥ、すなわち、連続的に配列されたｐｕｒＫとｐｕｒＨとを含む断片を収得するために重合酵素連鎖反応を行った。重合酵素は、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高−信頼ＤＮＡポリメラーゼを使用し、９６℃で３０秒の変性、５３℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で２分の重合反応から構成されたサイクルを３０回繰り返した。その結果、プロモーター部位を含んだｐｕｒＫＥ遺伝子２対（ｐｕｒＫＥ−Ａ、ｐｕｒＫＥ−Ｂ）を得た。ｐｕｒＫＥ−Ａは、配列番号１８と１９をプライマーとして使用して増幅されたものであり、ｐｕｒＫＥ−Ｂは、配列番号２０と２１をプライマーとして使用して増幅されたものである。前記増幅産物をＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて大膓菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングしてｐＣＲ−ｐｕｒＫＥ−ＡとｐＣＲ−ｐｕｒＫＥ−Ｂベクターを得た。前記ｐＣＲベクターにｐｕｒＫＥ−ＡとｐｕｒＫＥ−Ｂとの各末端に含まれた制限酵素（ｐｕｒＫＥ−Ａ：ＢａｍＨＩ＋ＫｐｎＩ、ｐｕｒＫＥ−Ｂ：ＫｐｎＩ＋ＸｂａＩ）を処理して前記ｐＣＲベクターからそれぞれのｐｕｒＫＥ遺伝子を分離した。その後、制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩとが処理されたｐＤＺベクターに３片接合を介してクローニングし、最終的に、ｐｕｒＫＥ遺伝子２つが連続的にクローニングされたｐＤＺ−２ｐｕｒＫＥ組換えベクターを製作した。図５は、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺ−２ｐｕｒＫＥを示す図である。
前記ｐＤＺ−２ｐｕｒＫＥベクターを５’−イノシン酸生産菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株に電気穿孔法によって形質転換し、２次交差過程を経って染色体上の内在的ｐｕｒＫＥ遺伝子の真横に１つのｐｕｒＫＥ遺伝子を更に挿入して総コピー数を２つに増加させた菌株を得た。連続的に挿入されたｐｕｒＫＥ遺伝子は、２つのｐｕｒＫＥ連結部品を増幅することができる配列番号２２と２３のプライマーを用いたＰＣＲを介して最終確認した。
【００４４】
（５）ｐｕｒＣ遺伝子クローニング及び組換えベクター（ｐＤＺ−２ｐｕｒＣ）製作、ｐｕｒＣ挿入菌株開発
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株の染色体を分離し、これを鋳型にしてｐｕｒＣを収得するために重合酵素連鎖反応を行った。重合酵素は、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高−信頼ＤＮＡポリメラーゼを使用し、９６℃で３０秒の変性、５３℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で２分の重合反応から構成されたサイクルを３０回繰り返した。その結果、プロモーター部位を含んだｐｕｒＣ遺伝子２対（ｐｕｒＣ−Ａ、ｐｕｒＣ−Ｂ）を得た。ｐｕｒＣ−Ａは、配列番号２４と２５をプライマーとして使用して増幅されたものであり、ｐｕｒＣ−Ｂは、配列番号２５と２６をプライマーとして使用して増幅されたものである。前記増幅産物をＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて大膓菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングしてｐＣＲ−ｐｕｒＣ−ＡとｐＣＲ−ｐｕｒＣ−Ｂベクターを得た。前記ｐＣＲベクターにｐｕｒＣ−ＡとｐｕｒＣ−Ｂとの各末端に含まれた制限酵素（ｐｕｒＣ−Ａ：ＢａｍＨＩ＋ＳａｌＩ、ｐｕｒＣ−Ｂ：ＳａｌＩ）を処理して前記ｐＣＲベクターからそれぞれのｐｕｒＣ遺伝子を分離した。その後、制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩとが処理されたｐＤＺベクターに３片接合を介してクローニングし、最終的に、ｐｕｒＣ遺伝子２つが連続的にクローニングされたｐＤＺ−２ｐｕｒＣ組換えベクターを製作した。図６は、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺ−２ｐｕｒＣを示す図である。
前記ｐＤＺ−２ｐｕｒＣベクターを５’−イノシン酸生産菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株に電気穿孔法によって形質転換し、２次交差過程を経って染色体上の内在的ｐｕｒＣ遺伝子の真横に１つのｐｕｒＣ遺伝子を更に挿入して総コピー数を２つに増加させた菌株を得た。連続的に挿入されたｐｕｒＣ遺伝子は、２つのｐｕｒＣ連結部品を増幅することができる配列番号２７と２８のプライマーを用いたＰＣＲを介して最終確認した。
【００４５】
（６）ｐｒｓ遺伝子クローニング及び組換えベクター（ｐＤＺ−２ｐｒｓ）製作、ｐｒｓ挿入菌株開発
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株の染色体を分離し、これを鋳型にしてｐｒｓを収得するために重合酵素連鎖反応を行った。重合酵素は、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高−信頼ＤＮＡポリメラーゼを使用し、９６℃で３０秒の変性、５３℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で２分の重合反応から構成されたサイクルを３０回繰り返した。その結果、プロモーター部位を含んだｐｒｓ遺伝子２対（ｐｒｓ−Ａ、ｐｒｓ−Ｂ）を得た。ｐｒｓ−Ａは、配列番号２９と３０をプライマーとして使用して増幅されたものであり、ｐｒｓ−Ｂは、配列番号３１と３２をプライマーとして使用して増幅されたものである。前記増幅産物をＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて大膓菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングしてｐＣＲ−ｐｒｓ−ＡとｐＣＲ−ｐｒｓ−Ｂベクターを得た。前記ｐＣＲベクターにｐｒｓ−Ａとｐｒｓ−Ｂとの各末端に含まれた制限酵素（ｐｒｓ−Ａ：ＢａｍＨＩ＋ＳｐｅＩ、ｐｒｓ−Ｂ：ＳｐｅＩ＋ＰｓｔＩ）を処理して前記ｐＣＲベクターからそれぞれのｐｒｓ遺伝子を分離した。その後、制限酵素ＢａｍＨＩとＰｓｔＩとが処理されたｐＤＺベクターに３片接合を介してクローニングし、最終的に、ｐｒｓ遺伝子２つが連続的にクローニングされたｐＤＺ−２ｐｒｓ組換えベクターを製作した。図７は、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺ−２ｐｒｓを示す図である。
前記ｐＤＺ−２ｐｒｓベクターを５’−イノシン酸生産菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株に電気穿孔法によって形質転換し、２次交差過程を経って染色体上の内在的ｐｒｓ遺伝子の真横に１つのｐｒｓ遺伝子を更に挿入して総コピー数を２つに増加させた菌株を得た。連続的に挿入されたｐｒｓ遺伝子は、２つのｐｒｓ連結部品を増幅することができる配列番号３３と３４のプライマーを用いたＰＣＲを介して最終確認した。
【００４６】
（７）プリン生合成遺伝子強化による高収率５’−イノシン酸生産菌株開発
前記（１）〜（６）で製作されたｐＤＺ−２ｐｕｒＦＭ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＮＨ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＳＬ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＫＥ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＣ及びｐＤＺ−２ｐｒｓベクターの組合せを５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株に導入した。ベクターの導入順序は、任意に選択し、導入方法及び確認は、前記に記載された通りである。
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１を母菌株として用い、それぞれｐＤＺ−２ｐｕｒＮＨ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＳＬ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＫＥ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＣとｐＤＺ−２ｐｒｓから構成された組合せ及びｐＤＺ−２ｐｕｒＮＨ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＳＬ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＫＥ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＣ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＦＭとｐＤＺ−２ｐｒｓから構成された組合せによる形質転換を行ってプリン生合成経路に関与する主要酵素をコーディングする遺伝子を２つのコピーずつ含むコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０１−０１２０（２ｐｕｒＮＨ＋２ｐｕｒＳＬ＋２ｐｕｒＫＥ＋２ｐｕｒＣ＋２ｐｒｓ）とコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０１−０３１６（２ｐｕｒＮＨ＋２ｐｕｒＳＬ＋２ｐｕｒＫＥ＋２ｐｕｒＣ＋２ｐｕｒＦＭ＋２ｐｒｓ）を収得した。
【００４７】
実施例２．組換えコリネバクテリウム・アンモニアゲネスの発酵力価試験
下記に表示された組成を有する種培地３ｍｌを直径１８ｍｍの試験管に分株し、加圧殺菌した後、母菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株と前記実施例１で製作されたコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０１−０１２０及びコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０１−０３１６を接種し、３０℃温度で２４時間振盪培養して種培養液として使用した。下記に表示された組成を有する発酵培地２７ｍｌを５００ｍｌ振蘯用三角フラスコに分株し、１２０℃温度で１０分間加圧殺菌した後、前記種培養液３ｍｌを接種して５〜６日間培養した。培養条件は、回転数２００ｒｐｍ、温度３２℃、ｐＨ７．２に調節した。
【００４８】
前記種培地及び発酵培地の組成は、下記の通りである。
種培地：ブドウ糖１％、ペプトン１％、肉汁１％、酵母エキス１％、塩化ナトリウム０．２５％、アデニン１００ｍｇ／ｌ、グアニン１００ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．２
フラスコ発酵培地：グルタミン酸ナトリウム０．１％、塩化アンモニウム１％、硫酸マグネシウム１．２％、塩化カルシウム０．０１％、硫酸鉄２０ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン２０ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛２０ｍｇ／ｌ、硫酸銅５ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン２３ｍｇ／ｌ、アラニン２４ｍｇ／ｌ、ニコチン酸８ｍｇ／ｌ、ビオチン４５μｇ／ｌ、チアミン塩酸５ｍｇ／ｌ、アデニン３０ｍｇ／ｌ、リン酸（８５％）１．９％、ブドウ糖４．２％、粗糖２．４％。
【００４９】
培養終了後、ＨＰＬＣを用いた方法によって５’−イノシン酸の生産量を測定し、培養液中の５’−イノシン酸の蓄積量は下記の表に示される。
【００５０】
【表１】
【００５１】
培養液内５’−イノシン酸蓄積量を母菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株と比較した結果、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０１−０１２０とコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０１−０３１６菌株などが同一の条件下で母菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株対比単位時間当りに生産する５’−イノシン酸の生産性が１０．９−１１．４％増加したことを確認した。
【００５２】
プリン生合成酵素の活性を増加させて向上した５’−イノシン酸生産性を有するものとして確認された、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０１−０３１６をブダペスト条約下でソウル西大門区弘済１洞所在の韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、 ＫＣＣＭ）に２００９年２月１９日付で受託番号ＫＣＣＭ１０９９２Ｐとして寄託した。
【００５３】
本明細書に記載された配列番号１〜配列番号４３の配列が添付された配列目録に示される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子の発現量が内在的発現量より増加された、５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物及び向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物を培養する段階を含む５’−イノシン酸生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
核酸系物質中の１つである５’−イノシン酸（５’−ｉｎｏｓｉｎｉｃ ａｃｉｄ）は、核酸生合成代謝系の中間物質であって、動植物の体内で生理的に重要な役割を果たすだけでなく、食品、医薬品及び各種医療的利用などの多方面で用いられている。５’−イノシン酸は、特に、グルタミン酸ナトリウム（ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ ｇｌｕｔａｍａｔｅ：ＭＳＧ）と共に使用すると、味の上昇効果が大きくて呈味性調味料として脚光を浴びている核酸系調味料中の１つである。
【０００３】
５’−イノシン酸を製造する方法として、酵母細胞から抽出したリボ核酸を酵素で分解する方法（日本特許公告第１６１４／１９５７号など）、発酵によって生産されたイノシンを化学的方法でリン酸化する方法（Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３６，１５１１（１９７２）など）及び５’−イノシン酸を生産できる微生物を培養して培地に蓄積されたイノシン一リン酸（ｉｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＩＭＰ）を回収する方法などがある。現在、最も多く使用されている方法は、微生物を用いて５’−イノシン酸を生産する方法である。５’−イノシン酸の生産のために用いる微生物としては、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株が広く用いられており、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）菌株を培養して５’−イノシン酸を生産する方法（大韓民国特許公開第２００３−００４２９７２号など）などが公知されている。
【０００４】
微生物を用いた５’−イノシン酸の生産の収率を高めるために、５’−イノシン酸の生合成経路または分解経路と関連された酵素の活性や発現を増加させるとかまたは低下させて改良した菌株などが開発されている。大韓民国特許第７８５２４８号は、プリン生合成経路上のホスホリボシルアミノイミダゾールサクシノカルボキシアミドシンセターゼをコーディングする遺伝子ｐｕｒＣが過発現された微生物及びこれを用いた５’−イノシン酸の生産方法を開示する。また、韓国特許第８５７３７９号は、ｐｕｒＫＥによって暗号化されるホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼ遺伝子が過発現されたコリネバクテリウム・アンモニアゲネス菌株とこれを用いてＩＭＰを高濃度及び高収率で生産する方法を開示する。
【０００５】
しかし、依然としてより高い収率で５’−イノシン酸を生産できる菌株の開発及びこれを用いた５’−イノシン酸生産方法に対する要求が存在する。
【０００６】
従って、本発明者らは、５’−イノシン酸を高い生産性で生産できる菌株に対する研究を行い、プリン生合成経路に関与する主要酵素の活性を同時に内在的活性より高める場合、５’−イノシン酸の生産性が向上するということを発見して本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物を提供することである。
【０００８】
本発明のまた他の目的は、向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物を用いて５’−イノシン酸を生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記のような目的を達成するために、本発明は、プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子の発現量が内在的発現量より増加された、５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
【００１０】
本発明のコリネバクテリウム属微生物は、プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子の発現量が内在的発現量より増加され、母菌株対比向上した５’−イノシン酸生産性を有する。
【００１１】
本発明において、“プリン生合成酵素（ｐｕｒｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｅｎｚｙｍｅ）”は、プリン塩基を最終産物として生成するプリン生合成経路に含まれた反応を触媒する酵素を意味し、ホスホリボシルピロホスフェートアミドトランスフェラーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｍｉｄｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｇｌｙｃｉｎａｍｉｄｅ ｆｏｒｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｆｏｒｍｙｌｇｌｙｃｉｎａｍｉｄｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼＩＩ（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｆｏｒｍｙｌｇｌｙｃｉｎａｍｉｄｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅＩＩ）、ホスホリボシルアミノイミダゾールシンセターゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンセターゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｓｕｃｃｉｎｏｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、イノシン酸シクロヒドロラーゼ（ｉｎｏｓｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｃｙｃｌｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、リボースホスフェートピロホスホキナーゼ（Ｒｉｂｏｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏ ｋｉｎａｓｅ）などを含む。
【００１２】
本発明の一具体例において、プリン生合成酵素は、ホスホリボシルピロホスフェートアミドトランスフェラーゼ、ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼＩＩ、ホスホリボシルアミノイミダゾールシンセターゼ、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼ、ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンセターゼ及びイノシン酸シクロヒドロラーゼから構成された群から選択される１つ以上の酵素と、リボースホスフェートピロホスホキナーゼから構成された組合せであり得る。
【００１３】
本発明の一具体例において、内在的水準対比発現量が増加されたプリン生合成酵素をコーディングする遺伝子は、ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号３６のｐｕｒＮ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号３７のｐｕｒＳ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼＩＩをコーディングする遺伝子である配列番号３８のｐｕｒＬ、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４０のｐｕｒＫＥ、ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号４１のｐｕｒＣ、イノシン酸シクロヒドロラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４２のｐｕｒＨ及びリボースホスフェートピロホスホキナーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４３のｐｒｓから構成された組合せであり得る。
【００１４】
本発明の一具体例において、内在的水準対比発現量が増加されたプリン生合成酵素をコーディングする遺伝子は、ホスホリボシルピロホスフェートアミドトランスフェラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号３５のｐｕｒＦ、ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号３６のｐｕｒＮ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号３７のｐｕｒＳ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼＩＩをコーディングする遺伝子である配列番号３８のｐｕｒＬ、ホスホリボシルアミノイミダゾールシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号３９のｐｕｒＭ、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４０のｐｕｒＫＥ、ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号４１のｐｕｒＣ、イノシン酸シクロヒドロラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４２のｐｕｒＨ及びリボースホスフェートピロホスホキナーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４３のｐｒｓから構成された組合せであり得る。
【００１５】
本発明において、“内在的発現量より増加された”は、微生物から自然的に発現される遺伝子の発現量、または母菌株から発現される遺伝子の発現量より高い量で発現することを意味し、当該酵素をコーディングする遺伝子の個数（コピー数）の増加及びそれに応じる発現量増加、または遺伝子の突然変異による発現量の増加またはこの両方による発現量の増加を含む。
【００１６】
本発明の一具体例において、プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子の発現量増加は、当該遺伝子が外部から更に菌株に導入されるとかまたは内在的遺伝子が増幅されて遺伝子のコピー数が増加されるとかまたは転写または翻訳調節配列に導入された変異によって転写効率または翻訳効率が増加された場合を含むが、これに限定されない。内在的遺伝子の増幅は、当業界に知られている方法、例えば、適当な選択圧力下で培養する方法などによって容易に達することができる。
【００１７】
本発明の一具体例において、プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子の発現量は、プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子が細胞外部から更に導入されとかまたはプリン生合成酵素をコーディングする内在的遺伝子が増幅されて増加されたものであり得る。
【００１８】
本発明の一具体例において、向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物で、内在的水準対比発現量が増加されたプリン生合成酵素をコーディングする遺伝子は、相応する内在的遺伝子の外に１つ以上のコピーが外部から導入されて２つ以上のコピーで存在することができる。
【００１９】
本発明の一具体例において、向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物で、プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子の外部からの導入は、相応する遺伝子の連続的に配列された２つのコピーを含む組換えベクターによる形質転換を介して達することができる。
【００２０】
本発明の一具体例において、向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物の製造のために使用された組換えベクターは、導入される遺伝子に応じてそれぞれ図２〜図７の開裂地図を有する組換えベクター、ｐＤＺ−２ｐｕｒＦＭ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＮＨ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＳＬ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＫＥ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＣ、及びｐＤＺ−２ｐｒｓから構成された群から選択され得る。
【００２１】
本発明の一具体例において、向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物は、５’−イノシン酸を生産できるコリネバクテリウム微生物から来由し得る。例えば、本発明による向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９及びこれから製造された菌株から来由し得る。
【００２２】
本発明の一具体例において、向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物は、プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子を２つのコピー以上含むことができる。
【００２３】
本発明の一具体例において、向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスであり得るし、より好ましくは、ｐｒｓ遺伝子と、ｐｕｒＦ、ｐｕｒＮ、ｐｕｒＳ、ｐｕｒＬ、ｐｕｒＭ、ｐｕｒＫＥ、ｐｕｒＣ及びｐｕｒＨ遺伝子から構成された群から選択される１つ以上の遺伝子の組合せの内在的活性が５’−イノシン酸を高濃度で生産するように増加されたものである形質転換されたコリネバクテリウム・アンモニアゲネスであり得る。
【００２４】
本発明の一具体例において、向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物は、５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１（ＫＣＣＭ−１０６１０）菌株にそれぞれ図２、３、４、５、６及び７の開裂地図を有する組換えベクターｐＤＺ−２ｐｕｒＦＭ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＮＨ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＳＬ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＫＥ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＣ、ｐＤＺ−２ｐｒｓを順にまたは組合せで導入され、導入されたｐｕｒＦ、ｐｕｒＮ、ｐｕｒＳ、ｐｕｒＬ、ｐｕｒＭ、ｐｕｒＫＥ、ｐｕｒＣ、ｐｕｒＨ及びｐｒｓ遺伝子の２つのコピーのうち、１つが相応する内在的遺伝子を相同組換えによって置換してｐｕｒＦ、ｐｕｒＮ、ｐｕｒＳ、ｐｕｒＬ、ｐｕｒＭ、ｐｕｒＫＥ、ｐｕｒＣ、ｐｕｒＨ及びｐｒｓ遺伝子がそれぞれ２つのコピーずつ染色体内に挿入された菌株であり得る。
【００２５】
本発明の一具体例において、向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物は、ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号３６のｐｕｒＮ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号３７のｐｕｒＳ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼＩＩをコーディングする遺伝子である配列番号３８のｐｕｒＬ、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４０のｐｕｒＫＥ、ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号４１のｐｕｒＣ、イノシン酸シクロヒドロラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４２のｐｕｒＨ及びリボースホスフェートピロホスホキナーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４３のｐｒｓから構成された組合せのプリン生合成酵素をコーディングする遺伝子を２つのコピーずつ含む、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスであり得るし、好ましくは、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０１−０１２０であり得る。
【００２６】
本発明の一具体例において、向上した５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物は、ホスホリボシルピロホスフェートアミドトランスフェラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号３５のｐｕｒＦ、ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号３６のｐｕｒＮ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号３７のｐｕｒＳ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼＩＩをコーディングする遺伝子である配列番号３８のｐｕｒＬ、ホスホリボシルアミノイミダゾールシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号３９のｐｕｒＭ、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４０のｐｕｒＫＥ、ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号４１のｐｕｒＣ、イノシン酸シクロヒドロラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４２のｐｕｒＨ及びリボースホスフェートピロホスホキナーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４３のｐｒｓから構成された組合せのプリン生合成酵素をコーディングする遺伝子を２つのコピーずつ含む、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスであり得るし、好ましくは、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０１−０３１６（ＫＣＣＭ１０９９２Ｐ）であり得る。
【００２７】
また、本発明は、プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子の発現量が内在的発現量より増加された、５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物を培養する段階及び前記培養液から５’−イノシン酸を回収する段階を含む５’−イノシン酸を生産する方法を提供する。
【００２８】
本発明の５’−イノシン酸を生産する方法において、コリネバクテリウム属微生物の培養に使用される培地及びその他の培養条件は、コリネバクテリウム属微生物の培養で通常的に使用されるものと同一であり得るし、当業者が容易に選択して調節することができる。また、培養方法も当業界に知られている任意の培養方法、例えば、回分式、連続式及び流加式培養方法などが使用され得るが、これらに限定されるのではない。
【００２９】
本発明の一具体例において、５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスであり得る。
【００３０】
本発明の一具体例において、５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０１−０１２０またはコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０１−０３１６（ＫＣＣＭ１０９９２Ｐ）であり得る。
【００３１】
本発明の一具体例において、コリネバクテリウム属微生物を培養する段階は、菌株を適当な炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミンなどを含有した通常の培地内において好気性条件下で温度、ｐＨなどを調節しながら培養する。
【００３２】
炭素源としては、グルコース、フルクトース（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）のような炭水化物が使用されることができ、窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムのような各種無機窒素源及びペプトン、ＮＺ−アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類またはその分解生成物、脱脂大豆ケーキまたはその分解生成物など有機窒素源が使用され得る。無機化合物としては、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどが使用されることができ、以外に必要に応じてビタミン及び栄養要求性塩基などが添加され得る。
【００３３】
培養は、好気的条件下で、例えば、振盪培養または通気撹拌培養によって、好ましくは、２８〜３６℃の温度で行われる。培地のｐＨは、培養する間にｐＨ６〜８の範囲で維持するのが好ましい。培養は、４〜６日間行われることができる。
【００３４】
以下、実施例を介して本発明をより詳細に説明する。しかし、実施例は、ただ本発明を例示するためのものであるので、本発明の範囲が実施例によって限定されることとして解釈されない。
【発明の効果】
【００３５】
本発明によるプリン生合成に関与する主な酵素をコーディングする遺伝子の発現量が内在的発現量より増加された、５’−イノシン酸生産性を有するコリネバクテリウム属微生物を用いて５’−イノシン酸を高濃度及び高収率で生産することができ、これによって生産コストを節減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、コリネバクテリウム属微生物の染色体内挿入用ベクターｐＤＺベクターを示す。
【図２】図２は、コリネバクテリウム属微生物の染色体内挿入用ベクターｐＤＺ−２ｐｕｒＦＭを示す。
【図３】図３は、コリネバクテリウム属微生物の染色体内挿入用ベクターｐＤＺ−２ｐｕｒＮＨを示す。
【図４】図４は、コリネバクテリウム属微生物の染色体内挿入用ベクターｐＤＺ−２ｐｕｒＳＬを示す。
【図５】図５は、コリネバクテリウム属微生物の染色体内挿入用ベクターｐＤＺ−２ｐｕｒＫＥを示す。
【図６】図６は、コリネバクテリウム属微生物の染色体内挿入用ベクターｐＤＺ−２ｐｕｒＣを示す。
【図７】図７は、コリネバクテリウム属微生物の染色体内挿入用ベクターｐＤＺ−２ｐｒｓを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
実施例１．染色体挿入用ベクター（ｐＤＺ）を用いたプリン生合成遺伝子の挿入及びこれによる高収率５’−イノシン酸生産菌株の開発
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス菌株の染色体へ外来遺伝子を挿入するために、該当遺伝子を連続的に２つのコピーを含むｐＤＺ基盤組換えベクターを用いた。ｐＤＺベクターは、コリネバクテリウム属微生物の染色体挿入用ベクターであって、参照によって本明細書に含まれた大韓民国特許公開第２００８−００２５３５５号に開示された方法によって製造した。図１は、ｐＤＺベクターの構造を概略的に見せてくれる。
【００３８】
下記の（１）〜（６）でプリン生合成酵素をコーディングする遺伝子をコリネバクテリウム属微生物の染色体内に挿入させて各遺伝子のコピー数を２つに増加させるために利用され得る組換えベクターを製作した。各組換えベクターによる形質転換及び形質転換体の選別は、下記のように行った。
【００３９】
５’−イノシン酸生産菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１（ＫＣＣＭ−１０６１０）に所望のプリン生合成経路上の酵素をコーディングする遺伝子を含む組換えｐＤＺベクターを電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）で形質転換した後、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／ｌを含有した選別培地で染色体上の当該遺伝子と相同性組換えによってベクター内の遺伝子が染色体内に挿入された菌株を選別した。ベクターの成功的な染色体挿入は、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を含んだ固体培地（肉汁１％、酵母エキス１％、ペプトン１％、塩化ナトリウム０．２５％、アデニン１％、グアニン１％、寒天１．５％）でコロニーの色によって確認した。すなわち、青色を表すコロニーをベクターが染色体に挿入された形質転換体であるものとして選別した。１次交差（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）によってベクターが染色体に挿入された菌株を栄養培地（ブドウ糖１％、肉汁１％、酵母エキス１％、ペプトン１％、塩化ナトリウム０．２５％、アデニン１％、グアニン１％）から振蘯培養（３０℃、８時間）した後、それぞれ１０−４から１０−１０まで希釈してＸ−ｇａｌを含んでいる固体培地に塗抹した。大部分のコロニーが青色を表すのに反して低い比率で表れる白色のコロニーを選別することによって、２次交差によって染色体上に挿入されたベクター配列が除去された菌株を選別した。以上のように選別された菌株を最終的に抗生剤カナマイシンに対する感受性可否の確認及びＰＣＲを介する遺伝子構造確認過程を経って最終菌株として選定した。
【００４０】
（１）ｐｕｒＦＭ遺伝子のクローニング及び組換えベクター（ｐＤＺ−２ｐｕｒＦＭ）製作
コリネバクテリウム属微生物の染色体上でｐｕｒＦ遺伝子とｐｕｒＭ遺伝子とは、近接距離に位置しているため、２つの遺伝子を同時に発現させるために前記２つの遺伝子及びプロモーター部位を含んだｐｕｒＦＭベクターを製作した。
５’−イノシン酸生産能を有するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株の染色体を分離し、これを鋳型にしてｐｕｒＦＭ、すなわち、連続的に配列されたｐｕｒＦとｐｕｒＭとを含む断片を収得するために重合酵素連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）を行った。重合酵素は、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高−信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、９６℃で３０秒の変性、５３℃で３０秒のアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）及び７２℃で２分の重合反応から構成されたサイクルを３０回繰り返した。その結果、プロモーター部位を含んだｐｕｒＦＭ遺伝子２対（ｐｕｒＦＭ−Ａ、ｐｕｒＦＭ−Ｂ）を得た。ｐｕｒＦＭ−Ａは、配列番号１と２をプライマーとして使用して増幅されたものであり、ｐｕｒＦＭ−Ｂは、配列番号３と４をプライマーとして使用して増幅されたものである。前記増幅産物をＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて大膓菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングしてそれぞれｐＣＲ−ｐｕｒＦＭ−ＡとｐＣＲ−ｐｕｒＦＭ−Ｂベクターを得た。前記ｐＣＲベクターにｐｕｒＦＭ−ＡとｐｕｒＦＭ−Ｂの各末端に含まれた制限酵素（ｐｕｒＦＭ−Ａ： ＥｃｏＲＩ＋ＸｂａＩ、ｐｕｒＦＭ−Ｂ：ＸｂａＩ＋ＨｉｎｄＩＩI）を処理して前記ｐＣＲベクターからそれぞれのｐｕｒＦＭ遺伝子を分離した。その後、制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩIとが処理されたｐＤＺベクターに３片接合（３−ｐｉｅｃｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ）を介してクローニングし、最終的に、ｐｕｒＦＭ遺伝子２つが連続的にクローニングされたｐＤＺ−２ｐｕｒＦＭ組換えベクターを製作した。図２は、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺ−２ｐｕｒＦＭを示す図である。
前記ｐＤＺ−２ｐｕｒＦＭベクターを５’−イノシン酸生産菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株に電気穿孔法によって形質転換し、２次交差過程を経って染色体上の内在的ｐｕｒＦＭ遺伝子の真横に１つのｐｕｒＦＭ遺伝子を更に挿入して総コピー数を２つに増加させた菌株を得た。連続的に挿入されたｐｕｒＦＭ遺伝子は、２つのｐｕｒＦＭ連結部品を増幅することができる配列番号５と６のプライマーを用いたＰＣＲを介して最終確認した。
【００４１】
（２）ｐｕｒＮＨ遺伝子クローニング及び組換えベクター（ｐＤＺ−２ｐｕｒＮＨ）製作、ｐｕｒＮＨ挿入菌株開発
コリネバクテリウム属微生物の染色体上でｐｕｒＮ遺伝子とｐｕｒＨ遺伝子とが近接距離に位置しているため、２つの遺伝子を同時に発現させるためにプロモーター 部位を含んだｐｕｒＮＨベクターを製作した。
５’−イノシン酸生産能を有するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株の染色体を分離し、これを鋳型にしてｐｕｒＮＨ、すなわち、連続的に配列されたｐｕｒＮとｐｕｒＨとを含む断片を収得するために重合酵素連鎖反応を行った。重合酵素は、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高−信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、９６℃で３０秒の変性、５３℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で２分の重合反応から構成されたサイクルを３０回繰り返した。その結果、プロモーター 部位を含んだｐｕｒＮＨ遺伝子２対（ｐｕｒＮＨ−Ａ、ｐｕｒＮＨ−Ｂ）を得た。ｐｕｒＮＨ−Ａは、配列番号７と８をプライマーとして使用して増幅されたものであり、ｐｕｒＮＨ−Ｂは、配列番号８と９をプライマーとして使用して増幅されたものである。前記増幅産物をＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて大膓菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングしてｐＣＲ−ｐｕｒＮＨ−ＡとｐＣＲ−ｐｕｒＮＨ−Ｂベクターを得た。前記ｐＣＲベクターにｐｕｒＮＨ−ＡとｐｕｒＮＨ−Ｂとの各末端に含まれた制限酵素（ｐｕｒＮＨ−Ａ：ＢａｍＨＩ＋ＳａｌＩ、ｐｕｒＮＨ−Ｂ：ＳａｌＩ）を処理して前記ｐＣＲベクターからそれぞれのｐｕｒＮＨ遺伝子を分離した。その後、制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩとが処理されたｐＤＺベクターに３片接合を介してクローニングし、最終的に、ｐｕｒＮＨ遺伝子２つが連続的にクローニングされたｐＤＺ−２ｐｕｒＮＨ組換えベクターを製作した。図３は、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺ−２ｐｕｒＮＨを示す図である。
前記ｐＤＺ−２ｐｕｒＮＨベクターを５’−イノシン酸生産菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株に電気穿孔法によって形質転換し、２次交差過程を経って染色体上の内在的ｐｕｒＮＨ遺伝子の真横に１つのｐｕｒＮＨ遺伝子を更に挿入して総コピー数を２つに増加させた菌株を得た。連続的に挿入されたｐｕｒＮＨ遺伝子は、２つのｐｕｒＮＨ連結部品を増幅することができる配列番号１０と１１のプライマーを用いたＰＣＲを介して最終確認した。
【００４２】
（３）ｐｕｒＳＬ遺伝子クローニング及び組換えベクター（ｐＤＺ−２ｐｕｒＳＬ）製作、ｐｕｒＳＬ挿入菌株開発
コリネバクテリウム属微生物の染色体上でｐｕｒＳ遺伝子とｐｕｒＬ遺伝子とが近接距離に位置しているため、２つの遺伝子を同時に発現させるためにプロモーター部位を含んだｐｕｒＳＬベクターを製作した。
５’−イノシン酸生産能を有するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株の染色体を分離し、これを鋳型にしてｐｕｒＳＬ、すなわち、連続的に配列されたｐｕｒＳとｐｕｒＬとを含む断片を収得するために重合酵素連鎖反応を行った。重合酵素は、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高−信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、９６℃で３０秒の変性、５３℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で２分の重合反応から構成されたサイクルを３０回繰り返した。その結果、プロモーター 部位を含んだｐｕｒＳＬ遺伝子２対（ｐｕｒＳＬ−Ａ、ｐｕｒＳＬ−Ｂ）を得た。ｐｕｒＳＬ−Ａは、配列番号１２と１３をプライマーとして使用して増幅されたものであり、ｐｕｒＳＬ−Ｂは、配列番号１４と１５をプライマーとして使用して増幅されたものである。前記増幅産物をＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて大膓菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングしてｐＣＲ−ｐｕｒＳＬ−ＡとｐＣＲ−ｐｕｒＳＬ−Ｂベクターを得た。前記ｐＣＲベクターにｐｕｒＳＬ−ＡとｐｕｒＳＬ−Ｂとの各末端に含まれた制限酵素（ｐｕｒＳＬ−Ａ：ＢａｍＨＩ＋ＳａｌＩ、ｐｕｒＳＬ−Ｂ：ＳａｌＩ＋ＢａｍＨＩ）を処理して前記ｐＣＲベクターからそれぞれのｐｕｒＳＬ遺伝子を分離した。その後、制限酵素ＢａｍＨＩが処理されたｐＤＺベクターに３片接合を介してクローニングし、最終的に、ｐｕｒＳＬ遺伝子２つが連続的にクローニングされたｐＤＺ−２ｐｕｒＳＬ組換えベクターを製作した。図４は、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺ−２ｐｕｒＳＬを示す図である。
前記ｐＤＺ−２ｐｕｒＳＬベクターを５’−イノシン酸生産菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株に電気穿孔法によって形質転換し、２次交差過程を経って染色体上の内在的ｐｕｒＳＬ遺伝子の真横に１つのｐｕｒＳＬ遺伝子を更に挿入して総コピー数を２つに増加させた菌株を得た。連続的に挿入されたｐｕｒＳＬ遺伝子は、２つのｐｕｒＳＬ連結部品を増幅することができる配列番号１６と１７のプライマーを用いたＰＣＲを介して最終確認した。
【００４３】
（４）ｐｕｒＫＥ遺伝子クローニング及び組換えベクター（ｐＤＺ−２ｐｕｒＫＥ）製作、ｐｕｒＫＥ挿入菌株開発
コリネバクテリウム属微生物の染色体上でｐｕｒＫ遺伝子とｐｕｒＥ遺伝子とが近接距離に位置しているため、２つの遺伝子を同時に発現させるためにプロモーター部位を含んだｐｕｒＫＥベクターを製作した。
５’−イノシン酸生産能を有するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株の染色体を分離し、これを鋳型にしてｐｕｒＫＥ、すなわち、連続的に配列されたｐｕｒＫとｐｕｒＨとを含む断片を収得するために重合酵素連鎖反応を行った。重合酵素は、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高−信頼ＤＮＡポリメラーゼを使用し、９６℃で３０秒の変性、５３℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で２分の重合反応から構成されたサイクルを３０回繰り返した。その結果、プロモーター部位を含んだｐｕｒＫＥ遺伝子２対（ｐｕｒＫＥ−Ａ、ｐｕｒＫＥ−Ｂ）を得た。ｐｕｒＫＥ−Ａは、配列番号１８と１９をプライマーとして使用して増幅されたものであり、ｐｕｒＫＥ−Ｂは、配列番号２０と２１をプライマーとして使用して増幅されたものである。前記増幅産物をＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて大膓菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングしてｐＣＲ−ｐｕｒＫＥ−ＡとｐＣＲ−ｐｕｒＫＥ−Ｂベクターを得た。前記ｐＣＲベクターにｐｕｒＫＥ−ＡとｐｕｒＫＥ−Ｂとの各末端に含まれた制限酵素（ｐｕｒＫＥ−Ａ：ＢａｍＨＩ＋ＫｐｎＩ、ｐｕｒＫＥ−Ｂ：ＫｐｎＩ＋ＸｂａＩ）を処理して前記ｐＣＲベクターからそれぞれのｐｕｒＫＥ遺伝子を分離した。その後、制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩとが処理されたｐＤＺベクターに３片接合を介してクローニングし、最終的に、ｐｕｒＫＥ遺伝子２つが連続的にクローニングされたｐＤＺ−２ｐｕｒＫＥ組換えベクターを製作した。図５は、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺ−２ｐｕｒＫＥを示す図である。
前記ｐＤＺ−２ｐｕｒＫＥベクターを５’−イノシン酸生産菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株に電気穿孔法によって形質転換し、２次交差過程を経って染色体上の内在的ｐｕｒＫＥ遺伝子の真横に１つのｐｕｒＫＥ遺伝子を更に挿入して総コピー数を２つに増加させた菌株を得た。連続的に挿入されたｐｕｒＫＥ遺伝子は、２つのｐｕｒＫＥ連結部品を増幅することができる配列番号２２と２３のプライマーを用いたＰＣＲを介して最終確認した。
【００４４】
（５）ｐｕｒＣ遺伝子クローニング及び組換えベクター（ｐＤＺ−２ｐｕｒＣ）製作、ｐｕｒＣ挿入菌株開発
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株の染色体を分離し、これを鋳型にしてｐｕｒＣを収得するために重合酵素連鎖反応を行った。重合酵素は、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高−信頼ＤＮＡポリメラーゼを使用し、９６℃で３０秒の変性、５３℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で２分の重合反応から構成されたサイクルを３０回繰り返した。その結果、プロモーター部位を含んだｐｕｒＣ遺伝子２対（ｐｕｒＣ−Ａ、ｐｕｒＣ−Ｂ）を得た。ｐｕｒＣ−Ａは、配列番号２４と２５をプライマーとして使用して増幅されたものであり、ｐｕｒＣ−Ｂは、配列番号２５と２６をプライマーとして使用して増幅されたものである。前記増幅産物をＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて大膓菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングしてｐＣＲ−ｐｕｒＣ−ＡとｐＣＲ−ｐｕｒＣ−Ｂベクターを得た。前記ｐＣＲベクターにｐｕｒＣ−ＡとｐｕｒＣ−Ｂとの各末端に含まれた制限酵素（ｐｕｒＣ−Ａ：ＢａｍＨＩ＋ＳａｌＩ、ｐｕｒＣ−Ｂ：ＳａｌＩ）を処理して前記ｐＣＲベクターからそれぞれのｐｕｒＣ遺伝子を分離した。その後、制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩとが処理されたｐＤＺベクターに３片接合を介してクローニングし、最終的に、ｐｕｒＣ遺伝子２つが連続的にクローニングされたｐＤＺ−２ｐｕｒＣ組換えベクターを製作した。図６は、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺ−２ｐｕｒＣを示す図である。
前記ｐＤＺ−２ｐｕｒＣベクターを５’−イノシン酸生産菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株に電気穿孔法によって形質転換し、２次交差過程を経って染色体上の内在的ｐｕｒＣ遺伝子の真横に１つのｐｕｒＣ遺伝子を更に挿入して総コピー数を２つに増加させた菌株を得た。連続的に挿入されたｐｕｒＣ遺伝子は、２つのｐｕｒＣ連結部品を増幅することができる配列番号２７と２８のプライマーを用いたＰＣＲを介して最終確認した。
【００４５】
（６）ｐｒｓ遺伝子クローニング及び組換えベクター（ｐＤＺ−２ｐｒｓ）製作、ｐｒｓ挿入菌株開発
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株の染色体を分離し、これを鋳型にしてｐｒｓを収得するために重合酵素連鎖反応を行った。重合酵素は、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高−信頼ＤＮＡポリメラーゼを使用し、９６℃で３０秒の変性、５３℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で２分の重合反応から構成されたサイクルを３０回繰り返した。その結果、プロモーター部位を含んだｐｒｓ遺伝子２対（ｐｒｓ−Ａ、ｐｒｓ−Ｂ）を得た。ｐｒｓ−Ａは、配列番号２９と３０をプライマーとして使用して増幅されたものであり、ｐｒｓ−Ｂは、配列番号３１と３２をプライマーとして使用して増幅されたものである。前記増幅産物をＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて大膓菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングしてｐＣＲ−ｐｒｓ−ＡとｐＣＲ−ｐｒｓ−Ｂベクターを得た。前記ｐＣＲベクターにｐｒｓ−Ａとｐｒｓ−Ｂとの各末端に含まれた制限酵素（ｐｒｓ−Ａ：ＢａｍＨＩ＋ＳｐｅＩ、ｐｒｓ−Ｂ：ＳｐｅＩ＋ＰｓｔＩ）を処理して前記ｐＣＲベクターからそれぞれのｐｒｓ遺伝子を分離した。その後、制限酵素ＢａｍＨＩとＰｓｔＩとが処理されたｐＤＺベクターに３片接合を介してクローニングし、最終的に、ｐｒｓ遺伝子２つが連続的にクローニングされたｐＤＺ−２ｐｒｓ組換えベクターを製作した。図７は、コリネバクテリウム染色体挿入用ベクターｐＤＺ−２ｐｒｓを示す図である。
前記ｐＤＺ−２ｐｒｓベクターを５’−イノシン酸生産菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株に電気穿孔法によって形質転換し、２次交差過程を経って染色体上の内在的ｐｒｓ遺伝子の真横に１つのｐｒｓ遺伝子を更に挿入して総コピー数を２つに増加させた菌株を得た。連続的に挿入されたｐｒｓ遺伝子は、２つのｐｒｓ連結部品を増幅することができる配列番号３３と３４のプライマーを用いたＰＣＲを介して最終確認した。
【００４６】
（７）プリン生合成遺伝子強化による高収率５’−イノシン酸生産菌株開発
前記（１）〜（６）で製作されたｐＤＺ−２ｐｕｒＦＭ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＮＨ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＳＬ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＫＥ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＣ及びｐＤＺ−２ｐｒｓベクターの組合せを５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株に導入した。ベクターの導入順序は、任意に選択し、導入方法及び確認は、前記に記載された通りである。
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１を母菌株として用い、それぞれｐＤＺ−２ｐｕｒＮＨ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＳＬ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＫＥ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＣとｐＤＺ−２ｐｒｓから構成された組合せ及びｐＤＺ−２ｐｕｒＮＨ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＳＬ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＫＥ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＣ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＦＭとｐＤＺ−２ｐｒｓから構成された組合せによる形質転換を行ってプリン生合成経路に関与する主要酵素をコーディングする遺伝子を２つのコピーずつ含むコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０１−０１２０（２ｐｕｒＮＨ＋２ｐｕｒＳＬ＋２ｐｕｒＫＥ＋２ｐｕｒＣ＋２ｐｒｓ）とコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０１−０３１６（２ｐｕｒＮＨ＋２ｐｕｒＳＬ＋２ｐｕｒＫＥ＋２ｐｕｒＣ＋２ｐｕｒＦＭ＋２ｐｒｓ）を収得した。
【００４７】
実施例２．組換えコリネバクテリウム・アンモニアゲネスの発酵力価試験
下記に表示された組成を有する種培地３ｍｌを直径１８ｍｍの試験管に分株し、加圧殺菌した後、母菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株と前記実施例１で製作されたコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０１−０１２０及びコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０１−０３１６を接種し、３０℃温度で２４時間振盪培養して種培養液として使用した。下記に表示された組成を有する発酵培地２７ｍｌを５００ｍｌ振蘯用三角フラスコに分株し、１２０℃温度で１０分間加圧殺菌した後、前記種培養液３ｍｌを接種して５〜６日間培養した。培養条件は、回転数２００ｒｐｍ、温度３２℃、ｐＨ７．２に調節した。
【００４８】
前記種培地及び発酵培地の組成は、下記の通りである。
種培地：ブドウ糖１％、ペプトン１％、肉汁１％、酵母エキス１％、塩化ナトリウム０．２５％、アデニン１００ｍｇ／ｌ、グアニン１００ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．２
フラスコ発酵培地：グルタミン酸ナトリウム０．１％、塩化アンモニウム１％、硫酸マグネシウム１．２％、塩化カルシウム０．０１％、硫酸鉄２０ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン２０ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛２０ｍｇ／ｌ、硫酸銅５ｍｇ／ｌ、Ｌ−システイン２３ｍｇ／ｌ、アラニン２４ｍｇ／ｌ、ニコチン酸８ｍｇ／ｌ、ビオチン４５μｇ／ｌ、チアミン塩酸５ｍｇ／ｌ、アデニン３０ｍｇ／ｌ、リン酸（８５％）１．９％、ブドウ糖４．２％、粗糖２．４％。
【００４９】
培養終了後、ＨＰＬＣを用いた方法によって５’−イノシン酸の生産量を測定し、培養液中の５’−イノシン酸の蓄積量は下記の表に示される。
【００５０】
【表１】
【００５１】
培養液内５’−イノシン酸蓄積量を母菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株と比較した結果、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０１−０１２０とコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０１−０３１６菌株などが同一の条件下で母菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＪＩＰ２４０１菌株対比単位時間当りに生産する５’−イノシン酸の生産性が１０．９−１１．４％増加したことを確認した。
【００５２】
プリン生合成酵素の活性を増加させて向上した５’−イノシン酸生産性を有するものとして確認された、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０１−０３１６をブダペスト条約下でソウル西大門区弘済１洞所在の韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、 ＫＣＣＭ）に２００９年２月１９日付で受託番号ＫＣＣＭ１０９９２Ｐとして寄託した。
【００５３】
本明細書に記載された配列番号１〜配列番号４３の配列が添付された配列目録に示される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子の発現量が内在的発現量より増加された、５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物であって、前記プリン生合成酵素は、ホスホリボシルピロホスフェートアミドトランスフェラーゼ、ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼＩＩ、ホスホリボシルアミノイミダゾールシンセターゼ、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼ、ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンセターゼ、及びイノシン酸シクロヒドロラーゼから構成された群から選択される１つ以上の酵素と、リボースホスフェートピロホスホキナーゼから構成された組合せである、コリネバクテリウム属微生物。
【請求項２】
前記プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子は、ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号３６のｐｕｒＮ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号３７のｐｕｒＳ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼＩＩをコーディングする遺伝子である配列番号３８のｐｕｒＬ、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４０のｐｕｒＫＥ、ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号４１のｐｕｒＣ、イノシン酸シクロヒドロラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４２のｐｕｒＨ及びリボースホスフェートピロホスホキナーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４３のｐｒｓから構成された組合せである、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項３】
前記プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子は、ホスホリボシルピロホスフェートアミドトランスフェラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号３５のｐｕｒＦ、ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号３６のｐｕｒＮ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号３７のｐｕｒＳ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼＩＩをコーディングする遺伝子である配列番号３８のｐｕｒＬ、ホスホリボシルアミノイミダゾールシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号３９のｐｕｒＭ、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４０のｐｕｒＫＥ、ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号４１のｐｕｒＣ、イノシン酸シクロヒドロラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４２のｐｕｒＨ及びリボースホスフェートピロホスホキナーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４３のｐｒｓから構成された組合せである、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項４】
前記プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子の発現量は、プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子が細胞外部から更に導入されるとかまたはプリン生合成酵素をコーディングする内在的遺伝子が増幅されて増加されたものである、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項５】
前記プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子は、相応する内在的遺伝子の外に１つ以上のコピーが外部から細胞内に導入されて２つ以上のコピーで存在するものである、請求項４に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項６】
前記プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子の細胞内への導入は、連続的に配列された相応する遺伝子の２つのコピーを含む組換えベクターによる形質転換によって達するものである、請求項５に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項７】
前記組換えベクターは、それぞれ図２〜図７の開裂地図を有する組換えベクター、ｐＤＺ−２ｐｕｒＦＭ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＮＨ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＳＬ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＫＥ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＣ、及びｐＤＺ−２ｐｒｓから構成された群から選択されるものである、請求項６に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項８】
前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスである、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項９】
前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０１−０１２０である、請求項２に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項１０】
前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０１−０３１６（ＫＣＣＭ１０９９２Ｐ）である、請求項３に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれか一項によるコリネバクテリウム属微生物を培養する段階、及び前記培養液から５’−イノシン酸を回収する段階を含む、５’−イノシン酸を生産する方法。
【請求項１】
プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子の発現量が内在的発現量より増加された、５’−イノシン酸を生産するコリネバクテリウム属微生物であって、前記プリン生合成酵素は、ホスホリボシルピロホスフェートアミドトランスフェラーゼ、ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼＩＩ、ホスホリボシルアミノイミダゾールシンセターゼ、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼ、ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンセターゼ、及びイノシン酸シクロヒドロラーゼから構成された群から選択される１つ以上の酵素と、リボースホスフェートピロホスホキナーゼから構成された組合せである、コリネバクテリウム属微生物。
【請求項２】
前記プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子は、ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号３６のｐｕｒＮ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号３７のｐｕｒＳ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼＩＩをコーディングする遺伝子である配列番号３８のｐｕｒＬ、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４０のｐｕｒＫＥ、ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号４１のｐｕｒＣ、イノシン酸シクロヒドロラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４２のｐｕｒＨ及びリボースホスフェートピロホスホキナーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４３のｐｒｓから構成された組合せである、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項３】
前記プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子は、ホスホリボシルピロホスフェートアミドトランスフェラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号３５のｐｕｒＦ、ホスホリボシルグリシンアミドホルミルトランスフェラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号３６のｐｕｒＮ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号３７のｐｕｒＳ、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンセターゼＩＩをコーディングする遺伝子である配列番号３８のｐｕｒＬ、ホスホリボシルアミノイミダゾールシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号３９のｐｕｒＭ、ホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４０のｐｕｒＫＥ、ホスホリボシルアミノイミダゾールスクシノカルボキサミドシンセターゼをコーディングする遺伝子である配列番号４１のｐｕｒＣ、イノシン酸シクロヒドロラーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４２のｐｕｒＨ及びリボースホスフェートピロホスホキナーゼをコーディングする遺伝子である配列番号４３のｐｒｓから構成された組合せである、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項４】
前記プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子の発現量は、プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子が細胞外部から更に導入されるとかまたはプリン生合成酵素をコーディングする内在的遺伝子が増幅されて増加されたものである、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項５】
前記プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子は、相応する内在的遺伝子の外に１つ以上のコピーが外部から細胞内に導入されて２つ以上のコピーで存在するものである、請求項４に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項６】
前記プリン生合成酵素をコーディングする遺伝子の細胞内への導入は、連続的に配列された相応する遺伝子の２つのコピーを含む組換えベクターによる形質転換によって達するものである、請求項５に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項７】
前記組換えベクターは、それぞれ図２〜図７の開裂地図を有する組換えベクター、ｐＤＺ−２ｐｕｒＦＭ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＮＨ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＳＬ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＫＥ、ｐＤＺ−２ｐｕｒＣ、及びｐＤＺ−２ｐｒｓから構成された群から選択されるものである、請求項６に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項８】
前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスである、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項９】
前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０１−０１２０である、請求項２に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項１０】
前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＣＮ０１−０３１６（ＫＣＣＭ１０９９２Ｐ）である、請求項３に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれか一項によるコリネバクテリウム属微生物を培養する段階、及び前記培養液から５’−イノシン酸を回収する段階を含む、５’−イノシン酸を生産する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１２−５２２５０３（Ｐ２０１２−５２２５０３Ａ）
【公表日】平成２４年９月２７日（２０１２．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０３３１１（Ｐ２０１２−５０３３１１）
【出願日】平成２２年３月２３日（２０１０．３．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００１７６０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１４２４５
【国際公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【出願人】（５１１１４８９６１）シージェイ チェイルジェダン コーポレーション (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月２７日（２０１２．９．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２３日（２０１０．３．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００１７６０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１４２４５
【国際公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【出願人】（５１１１４８９６１）シージェイ チェイルジェダン コーポレーション (7)
【Ｆターム（参考）】
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