５’−グアノシン一リン酸生産能が向上されたコリネバクテリアおよびそれを用いた５’−グアノシン一リン酸の生産方法
【課題】本発明は、野生型より高いリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有して向上したＡＴＰ生産能を示す新規微生物を用いて５’−グアノシン一リン酸を生産する方法に関する。
【解決手段】また、新規微生物が開示される。前記の方法は、内在的活性よりもリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性が増進され、ＡＴＰを高収率で生産するコリネバクテリア（Corynebacteria）菌株の微生物を培養する段階；培養液からＸＭＰを生産する段階；培養液にＸＭＰアミノ化活性を有する酵素または微生物を添加する段階；および培養液からＧＭＰを収得する段階を含む。
【解決手段】また、新規微生物が開示される。前記の方法は、内在的活性よりもリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性が増進され、ＡＴＰを高収率で生産するコリネバクテリア（Corynebacteria）菌株の微生物を培養する段階；培養液からＸＭＰを生産する段階；培養液にＸＭＰアミノ化活性を有する酵素または微生物を添加する段階；および培養液からＧＭＰを収得する段階を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内在的リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性よりも高い活性を有することによって、ＡＴＰをより高い収率で生産できるコリネバクテリア菌株(Corynebacteria strain)に関する。また、本発明は、アミノ化活性を有する酵素または微生物と共にコリネバクテリア菌株を用いる５’−グアノシン一リン酸の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
５’−グアノシン一リン酸(5'-guanosine monophosphate：以下、“ＧＭＰ”という)は、イノシン一リン酸(inosine monophosphate：以下、“ＩＭＰ”という)のような香味増進剤として広く使用される食品添加剤である。ＧＭＰは、うま味を引き出し、その使用は、また使用されるグルタミン酸一ナトリウム(ＭＳＧ)に左右される。これは、普通にＩＭＰと共に使用され、ＭＳＧのうま味の強さを増加させる。
【０００３】
今まで知られているＧＭＰの製造方法の例には、（１）酵母ＲＮＡの酵素的分解法、（２）ＧＭＰへの直接微生物発酵法、（３）グアノシンへの微生物発酵に続いて化学的リン酸化する方法、（４）グアノシンへの微生物発酵に続いて酵素的リン酸化する方法、（５）キサントシン５’−一リン酸(xanthosine 5’-monophosphate：以下、“ＸＭＰ”という)への微生物発酵に続いてコリネバクテリア菌株によってＧＭＰに転換する方法、（６）ＸＭＰへの微生物発酵に続いてアミナーゼ活性を有するエシェリキア・コリ(Escherichia coli)によってＸＭＰをＧＭＰに転換する方法が含まれる。このうち、方法（１）は、物質供給の困難さがあり、経済的に無益であり、方法（２）は、ＧＭＰの膜透過性によって低い収率の短所がある。したがって、他の方法が産業的適用で広く用いられる。
【０００４】
ＸＭＰを生産してＧＭＰに転換させる方法（６）に対して、補助因子としてＡＴＰを供給するのが重要である。ＸＭＰのＧＭＰへの転換で使用されるＡＴＰの大部分は、ＸＭＰ生産菌株から供給される。転換アプローチで、キシレンは重要な役割を果たすが、なぜならば、これはＡＴＰおよびＸＭＰに対する膜透過性を増加させるためである。培地中のキシレンは、ＡＴＰおよびＸＭＰがＧＭＰ生産菌株に浸透するようにしてＸＭＰをＧＭＰに転換させるようにする。したがって、ＧＭＰ生産のアプローチは、ＡＴＰ生産性を増加させる戦略である。
【０００５】
ＸＭＰのＧＭＰへの転換は、下記の反応式によって表される。
ＸＭＰ＋ＡＴＰ＋ＮＨ３−−−−−−−−−−−−＞ＧＭＰ＋ＡＭＰ＋ＰＰｉ
ＸＭＰアミナーゼ
【０００６】
すなわち、一次的にＸＭＰ生産菌株によってＸＭＰを生産し、これをＸＭＰアミナーゼ活性を有する酵素または微生物の存在下でＧＭＰに転換させるＧＭＰ生産過程において、補助因子として作用するＡＴＰの持続的な供給は必須的である。したがって、ＸＭＰ生産菌株のＡＴＰ生産能を増進させるのは非常に重要である。転換過程で生産されたＡＭＰは、ＡＴＰ生産のための基質として再使用される。事実上、アデニンベースのヌクレオチドは、ＡＴＰの生産のためにリサイクルされる。
【０００７】
したがって、ＸＭＰ生産菌株の増加されたＡＴＰ生産は、高収率のＧＭＰ生産のために必要である。リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性は、ＡＴＰの生産に莫大な影響を及ぼす。しかし、ＧＭＰ生産収率を増加させるためのリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性増進のために考案された微生物および方法に対する言及は先行文献のどこにもなかった。
【０００８】
前記２段階の転換に優先してＧＭＰ収率を増加させるためにＸＭＰ生産菌株のＡＴＰ生産を増加させるのが重要であるということを念頭に置いて、本発明者らは、集中的な研究を行い、増加させる遺伝子を発見した。また、ＸＭＰアミナーゼと共に使用する場合、遺伝子の２つのコピーを並んで運ぶ組換えベクターで形質転換されたコリネバクテリア菌株は、ＸＭＰおよびＡＴＰを高収率で生産することができ、したがって、ＧＭＰ生産も増加させることを明らかにした。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の目的は、内在的リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性よりも高い活性を有することによって、ＡＴＰを高収率で生産できるコリネバクテリア菌株を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記形質転換された微生物を培養する段階；前記培養物でＸＭＰを生産する段階；前記培養物にＸＭＰアミノ化活性を有する酵素または微生物を添加する段階；および前記培養物からＧＭＰを収得する段階を含むＧＭＰの生産方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、一態様により、本発明は、内在的リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性よりも増進されることによって、ＡＴＰを高収率で生産できるコリネバクテリア菌株に関する。本発明のコリネバクテリア菌株は、内在的リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性よりも高いリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有することによって、ＡＴＰ生産が向上するように変形される。
【００１２】
本願で使用される用語“リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(malate dehydrogenase)”は、脱水素化によるリンゴ酸のオキザロ酢酸への転換を促進する酵素を意味する。この酵素は、乳酸デヒドロゲナーゼと共に生物の非常に広い領域で発見され、その活性のために補助因子として、普通乳酸デヒドロゲナーゼを伴うＤＰＮおよびＮＡＤを必要とする。本発明によるコリネバクテリア菌株において、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性は増加されてＡＴＰを高収率で生産し、その結果、ＧＭＰ生産能の増大を招く。
【００１３】
本願で使用されたような用語“内在的活性(endogenous activity)”は、野生型微生物中の関心のある酵素活性を表そうとするものである。用語“内在的活性よりも高い活性”は、酵素それ自体による活性増加からもたらされたものでもまたは、内在的遺伝子または外来遺伝子による活性増加からもたらされたものでも、内在的変種の活性と比較して増加された酵素活性を意味する。例えば、酵素活性の増加は、これに制限されないが、遺伝子コピー数の増加または減少、関心のあるプロモーターの代替、変形または突然変異などをはじめとする、技術分野において十分公知の任意の方法によって達成しても良い。
【００１４】
本発明によりその活性を増加させようとする標的酵素であるリンゴ酸デヒドロゲナーゼは、コリネバクテリアのｍｑｏ遺伝子によってエンコードされる。ｍｑｏ遺伝子と生物学的に同一であるとか、符合する限り、任意の変異体または類似体が本発明で使用されても良い。すなわち、遺伝子の活性がｍｑｏ遺伝子の活性と実質的に同一であるとか、類似する場合、ｍｑｏ遺伝子の範囲内に属する任意の遺伝子が本発明で有用である。有利には、本発明に有用な遺伝子は、ｍｑｏ遺伝子配列と好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性、より一層好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有する。より有利には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、配列番号７のヌクレオチド配列によってエンコードされる。遺伝子コピーの増加は、外来遺伝子の導入および／または内在的遺伝子の増幅によって達成され得る。遺伝子のコピー数は、必要および目的に応じて当業者によって容易に決定され得る。内在的遺伝子の増幅は、また、当業界に公知の方法、例えば、圧力下で適当な選択培地で培養する方法を用いて行うことができる。好ましい例において、リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を運ぶベクターをコリネバクテリア菌株へ導入して、内在的活性よりも増進された活性を有する形質転換された微生物を生成した。
【００１５】
当業界に公知され、コリネバクテリア属微生物に属する限り、任意の菌株が制限なく本発明で使用され得る。好ましくは、本発明に有用なコリネバクテリア菌株の例としては、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)、およびブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム(Brevibacterium lactofermentum)が含まれるが、これらに制限されない。詳細には、コリネバクテリア菌株中で、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ ６８７２、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes) ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９、コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ １３０３２、コリネバクテリウム・グルタミクム Ｒ、ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ １４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム ＡＴＣＣ １３８６９およびこれらの誘導体がある。好ましいのは、コリネバクテリア・アンモニアゲネス ＫＣＣＭ−１０５３０から形質転換されたコリネバクテリウム・アンモニアゲネス ＫＣＪ−１３０４である。
【００１６】
ＡＴＰを高収率で生産できる微生物を生成するために、ｍｑｏ遺伝子を運ぶ組換えベクターが使用され得る。
【００１７】
本願で使用される用語“ｍｑｏ遺伝子”は、“リンゴ酸：キノン酸化還元酵素(malate:quinone oxidoreductase)”遺伝子の略語であって、リンゴ酸をオキサロ酢酸に酸化させる役割を果たすリンゴ酸オキサロ酢酸をコードする遺伝子を意味する。
【００１８】
ｍｑｏ遺伝子を運ぶ限り、任意の通常的組換えベクターが本発明で制限なく使用され得る。好ましいのは、ｐＤＺ−ｍｑｏである。本発明の好ましい例において、配列番号７を含有するｍｑｏ遺伝子を用いて組換えｐＤＺ−ｍｑｏベクターを構築した（図１参照）。
【００１９】
本願で使用されたような用語“ベクター”は、外部遺伝物質を適合な宿主細胞に運ぶ媒介体(vehicle)として使用されるＤＮＡ分子を意味し、転移遺伝子が宿主ゲノムと組換わるように許容する調節要素を含有するＤＮＡ作製物である。好ましくは、本発明によるｍｑｏベクターを運ぶ組換えベクターは、図１の切断地図に示された構造を有することができる。
図１の切断地図によって示されたベクターは、コリネバクテリアに順次にまたは、同時に導入され得る。本発明の好ましい実施態様により、組換えベクターは、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ＫＣＣＭ−１０５３０中に形質転換された後、選択培地で培養して２つのコピーのｍｑｏ遺伝子を相同組換えを介して宿主のゲノムに統合させ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ＫＣＪ−１３０４と命名したコリネバクテリウム・アンモニアゲネス突然変異体を生成する。これを受託番号 ＫＣＣＭ１０９７２Ｐとして寄託した。
【００２０】
本発明のまた他の態様により、本発明は、ｍｑｏ遺伝子を運ぶ組換えベクターで形質転換されたコリネバクテリア菌株に関する。コリネバクテリア由来のｍｑｏ遺伝子は、当業界に公知の形質転換法を用いて制限なく使用され得る。好ましくは、ｍｑｏ遺伝子はベクターにクローン化されて細胞中に形質転換される。
【００２１】
形質転換には当業界に公知の任意の方法が使用され得る。本願に使用されたような用語“形質転換”とは、外部ＤＮＡの導入、ゲノム統合および発現による細胞の遺伝的変更を意味する。一般的な形質転換方法には、ＣａＣｌ２沈殿法、ＣａＣｌ２方法にＤＭＳＯ(ジメチルスルホキシド)を使用することによって効率を高めたハナハン(Hanahan)方法、電気穿孔法、リン酸カルシウム形質移入法、原形質体融合法、シリコンカーバイド繊維媒介形質転換法、アグロバクテリウム媒介形質転換法、ＰＥＧを用いた形質転換法、デキストラン硫酸塩、リポフェクタミン、および乾燥／抑制媒介形質転換法などがある。本発明によるｐＤＺ−ｍｑｏを用いた形質転換は、前記例などに限定されず、当業界に公知の任意の方法を制限なく使用して行うことができる。
【００２２】
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスに図１の切断地図に示された構造を有するベクターｐＤＺ−ｍｑｏが導入された受託番号ＫＣＣＭ１０９７２Ｐ菌株は、これを選択培地で培養することによって、２つのコピーのｍｑｏ遺伝子が内在的遺伝子を相同組換えによって置換されることによって２つのコピーのｍｑｏ遺伝子がゲノム内に挿入されている菌株である。
【００２３】
また他の一つの様態として、本発明は、（ａ）前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性が内在的活性よりも増加されることによってＡＴＰ生産能が向上されたコリネバクテリア属由来の微生物を培養する段階；（ｂ）前記培養液からＸＭＰを生産する段階；（ｃ）前記培養液にＸＭＰアミノ化活性を有する酵素または微生物を添加する段階；および（ｄ）前記培養液からＧＭＰを収得する段階を含むＧＭＰの生産方法に関する。本発明は、前述された形質転換された微生物を用いてＸＭＰを高収率で生産した後、ＸＭＰアミナーゼまたはＸＭＰアミノ化活性を有する微生物の存在下でＧＭＰに転換させる。好ましくは、形質転換された微生物は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性が内在的活性よりも増加されたコリネバクテリア属由来の微生物である。
【００２４】
本発明においてＸＭＰまたはＧＭＰを生産できる菌株の培養に使用される培地は、当業界で通常的に使用される培地が制限なく使用され得る。好ましくは、培地は、炭素源としてグルコースおよび任意選択で様々なその他の炭素源を含む。関心の微生物の培養に使用するために、培地はその微生物の成長のための要件を満たさなければならない。コリネバクテリア菌株に対する培養培地は公知されている(例えば、文献[Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C.、USA,1981]参照)。コリネバクテリア菌株に有用な炭素源には、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースのような糖および炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ヤシ油などのようなオイルおよび脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノレン酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これらの炭素源は、個別的にまたは混合物として使用され得る。培地で使用され得る窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、牛肉抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆粕のような有機窒素源、および尿素、および無機化合物、例えば、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も個別にまたは混合物として使用することができる。リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウム、または相応するナトリウム塩がリン源として使用することができる。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有することができる。また、前記物質に加えてアミノ酸および/またはビタミンのような必須成長物質が使用され得る。また、培養培地に適切な前駆体などが使用され得る。前記の原料などは、培養過程において培養物に適切な方式によって回分式または連続式に添加され得る。
【００２５】
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような塩基性化合物または、リン酸または硫酸のような酸性化合物を使用して培養物のｐＨを調節することができる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して培養中に気泡の生成を防止することができる。好気状態を維持するために培養物内に酸素または酸素含有気体(例えば、空気)を注入するか、嫌気状態を維持するために窒素、水素または二酸化炭素気体を注入することができる。培養温度は、普通２０℃〜４５℃、好ましくは３０℃〜３５℃である。培養は、ＸＭＰまたはＧＭＰの生成量が最大で得られる時まで継続する。このような目的で普通１０〜１６０時間が要求される。
【００２６】
本発明に有用なＸＭＰアミノ化活性を有する微生物は、エシェリキア・コリ(E.coli)であり得る。ＸＭＰアミノ化活性を有するエシェリキア・コリを培養する方法は、当業界で通常的に使用されるエシェリキア・コリの培養方法を制限なく使用することができる。エシェリキア・コリ培養用培地は、様々な栄養分としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムのような各種無機窒素源およびペプトン、ＮＺ−アミン、牛肉抽出物、酵母抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類または魚粉、脱脂大豆ケーキ、または、大豆粕のような有機窒素源、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどのような無機化合物が含まれ得る。必要により、ビタミンおよび栄養要求性塩基が添加され得る。培養は、好気的条件下で、例えば、振盪培養または、通気攪拌培養によって３０〜４５℃、好ましくは３７〜４０℃の温度で行うことができる。培地のｐＨは、培養中に中性水準で維持することが好ましく、培養は１〜２日間行うことができ、前記培養によって培地中にＸＭＰアミノ化活性を有する微生物が蓄積され得る。
【００２７】
本発明において、ＧＭＰは前記培養によってＸＭＰが生産された培養液をＸＭＰアミノ化活性を有するエシェリキア・コリ培養液に添加してＸＭＰをＧＭＰに転換させることによって製造され得る。ＸＭＰのＧＭＰへの転換は、キシレンのようなＸＭＰの膜透過性を増加させる物質を培地中に添加してＸＭＰがＧＭＰ生産菌株内によく流入するようにした後、ＸＭＰをＧＭＰに転換させることによって行える。ＸＭＰの膜透過性を増加させる物質は、当業界で良く知られている。このような化合物の例示には、キシレンのような疎水性物質（例えば、トルエン、ベンゼン、酢酸エチル）、界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンステアリルアミン、セチルトリメチルアンモニウム臭化物、カチオンＦＢ、カチオンＦ２−４０Ｅなどの陽イオン性界面活性剤、ナトリウムオレイルアミド硫酸、ニューレックス(Newrex)ＴＡＢおよびラビゾール８０などの陰イオン性界面活性剤）、金属イオン（例えば、カルシウム、マグネシウムイオン）などが含まれるが、これらに限定されるのではない。前記したＸＭＰの細胞膜透過性を増進させる物質の使用量は、選択される物質に応じて変われるし、当業者ならば、適切に調節して使用することができる。
【００２８】
これで、生産されたＧＭＰは、培養培地中で排出されるか、細胞中に含まれていることができる。本発明のＧＭＰを生産する方法は、細胞または培養培地からＧＭＰを回収する段階を含む。細胞または培養培地からＧＭＰを回収する方法は、当業界でよく知られている。前記のＧＭＰ回収方法には、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化およびＨＰＬＣなどが使用され得るが、これらの例に限定されるのではない。
【００２９】
本発明において使用される用語“グアノシン一リン酸(guanosine monophosphate)”とは、グアノシンとリン酸が結合したヌクレオチドの一つであって、核酸を構成し、その位置に応じて５’−フォーム、３’−フォームおよび２’−フォームの３種類に分かれる。本発明で生産される５’−グアノシン一リン酸は、無色の針状結晶であって、生体内に遊離(free)状態で存在する。分子式は、Ｃ１０Ｈ１４Ｎ５Ｏ８Ｐであり、グアニル酸二ナトリウム、グアニル酸二カリウムおよびグアニル酸カルシウムのようなその塩形態であるグアノシン一リン酸は、キノコの味があり、核酸系調味料として使用される物質である。好ましくは本発明は、形質転換された微生物を用いてこのようなＧＭＰを高収率で得ることができる方法を明らかにし、従来の微生物を用いた方法よりもＧＭＰの濃度が約８．５％増加されることを確認した。
【発明の効果】
【００３０】
本発明による組換えベクターで形質転換されたコリネバクテリア菌株は、増進されたリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を示して増加した収率でＡＴＰを生産する。ＸＭＰからＧＭＰへの転換反応に適用する場合、本発明の形質転換菌株は通常的な微生物に比べてより高い生産能でＧＭＰを生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、ｐＤＺベクターに２つのコピーのｍｑｏ遺伝子を挿入した組換えｐＤＺ−ｍｑｏベクター構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下で本発明を実施例を介してより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に実施するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるのではない。
【００３３】
実施例１：ＸＭＰ生産菌株コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＣＣＭ−１０５３０由来ｍｑｏのクローニングおよびゲノム統合のための組換えベクター（ｐＤＺ−ｍｑｏ）の構築
ｍｑｏ遺伝子のヌクレオチド配列(NCBI ID_3345228)をＮＩＨジェンバンク(GenBank)のデータから得た。前記の配列に基づいて２対のプライマー(配列番号１〜４)を合成した。
コリネバクテリウムＫＣＣＭ−１０５３０を鋳型としながら、高信頼ＤＮＡポリメラーゼ ＰｆｕΜｌｔｒａＴＭ(ストラタジーン(Stratagene))の存在下で前記配列番号１〜４のプライマーを使用して９５℃で３０秒間変性させ、５５℃で３０秒間アニーリングさせ；６８℃で２分間伸長させることを２５回繰り返した。こうして得たＰＣＲ生成物は、それぞれ２．１ｋｂのｍｑｏ遺伝子２つのコピー(ｍｑｏ−Ａ、ｍｑｏ−Ｂ)であり、これを配列番号１と２、および配列番号３と４の２つのセットをそれぞれ使用して増幅させた。
配列番号１ ｇｃｔｃｔａｇａＡＴＣＧＧＴＣＡＴＴＣＣＡＴＧＡＡＣＣＣ
配列番号２ ｃｇｃｇｇａｔｃｃＣＡＴＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡ
配列番号３ ｃｇｃｇｇａｔｃｃＡＴＣＧＧＴＣＡＴＴＣＣＡＴＧＡＡＣＣＣ
配列番号４ ｇｃｔｃｔａｇａＣＡＴＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡ
適合した制限酵素で処理した後に（ｍｑｏ−Ａ：ＸｂａＩ＋ＢａｍＨＩ、ｍｑｏ−Ｂ：ＢａｍＨＩ＋ＸｂａＩ）、ＰＣＲ生成物であるｍｑｏ−Ａおよびｍｑｏ−Ｂを３片接合を介してＸｂａＩとエビアルカリ性リン酸加水分解酵素で以前に処理したｐＤＺベクターへ挿入した(大韓民国特許出願第１０−２００７−９４４３３号参考)。最終的に、ｍｑｏ遺伝子２つのコピーが連続的にクローン化された組換えｐＤＺ−ｍｑｏベクターを得た。図１は、コリネバクテリウムゲノムに統合させるための組換えｐＤＺ−ｍｑｏベクターの構造を示す模式図である。
【００３４】
実施例２：ｍｑｏ挿入された菌株の生成
前記ｐＤＺ−ｍｑｏベクターをＫＣＣＭ−１０５３０菌株に形質転換し、ゲノム上のｍｑｏ遺伝子に隣接した位置で一つのｍｑｏ遺伝子を挿入するためにゲノムと相同組換えを行った。したがって、そのゲノム上に２つのコピーのｍｑｏ遺伝子を有する、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＣＪ−１３０４と命名した新規ＸＭＰ生産菌株を得た。２つコピーのｍｑｏ遺伝子の連続的挿入は、２つコピーのｍｑｏ遺伝子のヌクレオチド配列の上流と下流を標的とするプライマーセット(配列５および６)を用いたＰＣＲで確認した。
配列番号５ ＣＴＴＴＴＣＧＡＴＧＡＣＧＣＣＣＡＡ
配列番号６ ＣＣＡＣＴＴＴＡＴＣＧＧＧＴＧＡＧＡＣＣＡ
【００３５】
実施例３：ｍｑｏ挿入された菌株のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性
実施例２で製造されたＸＭＰ生産コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＣＪ−１３０４を下記のようにリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性に対して分析した。前記菌株をバクトペプトン１０ｇ／ｌ、バクト牛肉抽出物５ｇ／ｌ、バクト酵母抽出物５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ２．５ｇ／ｌ、アデニン５０ｍｇ／ｌ、およびグアニン５０ｍｇ／ｌを含有した培地に接種し、３０℃で１２時間ＯＤ１０が得られるまでインキュベーションさせた。細胞培養液１０ｍｌを回収して５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ 酢酸カリウム、１０ｍＭ ＣａＣｌ２および１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む緩衝液で２回洗浄し、同じ緩衝液１ｍｌに懸濁させた。超音波粉砕機(sonicator)を用いて中断させた後、細胞溶解物を遠心分離させた。上澄液を再び遠心分離してペレットを得た後、これを緩衝液１００μｌに懸濁させた。この懸濁液のうち、１０μｌを酵素液として使用した。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ酢酸カリウムおよび５０μＭ２，６−ジクロロインドフェノール(Cl2Ind)を混合して反応緩衝液を製造した。Ｃｌ２Ｉｎｄは、解凍させて反応直前に混合した。前記反応混合物９８０μｌに基質として１００ｍＭリンゴ酸１０μｌおよび酵素液１０μｌを添加した後、３０℃で１５分間振盪しながらインキュベーションさせた。酵素活性は、還元されたＣｌ２Ｉｎｄの濃度を測定することによって決定した。Ｃｌ２Ｉｎｄは、６００ｎｍで２２ｃｍ−１ｍＭ−１の吸収係数を有した。
【００３６】
【表１】
【００３７】
表１に示されたように、ＫＣＪ−１３０４は、母菌株ＫＣＣＭ−１０５３０に比べてリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性が３０．６％増加したことが観察された。
【００３８】
実施例４：ｍｑｏ挿入された菌株のＡＴＰ水準
実施例２で製造されたＸＭＰ生産菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＣＪ−１３０４を下記のように細胞内ＡＴＰ水準に対して測定した。
母菌株コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＣＣＭ−１０５３０と変異株ＫＣＪ−１３０４をそれぞれ下記の種培地３ｍｌを含有する１４ｍｌチューブにそれぞれ接種し、３０℃で２０時間２００ｒｐｍで振盪しながらインキュベーションさせた。続いて、種培養液を０．４ｍｌの量でそれぞれ２５０ｍｌコーナーバッフル(corner-baffle)フラスコ中の種培地２５ｍｌに添加した後、３０℃で２３０ｒｐｍで２０時間振盪培養した。細胞培養液をＯＤおよび細胞内ＡＴＰ水準に対して測定した。前記変異株ＫＣＪ−１３０４は、母菌株ＫＣＣＭ−１０５３０に比べてＯＤ当たりにより高い割合でＡＴＰを生産することが明らかになり、これは本発明の変異株が母菌株に比べてより高いＧＭＰ生産を示すことを示唆する。結果は下記の表２に要約した。
【００３９】
【表２】
【００４０】
表２に示されたように、ＫＣＪ−１３０４のＯＤ当たり細胞内ＡＴＰ水準は、母菌株ＫＣＣＭ−１０５３０に比べて約１０４％増加された。
【００４１】
実施例５：ｍｑｏ挿入された菌株のＸＭＰ発酵およびＧＭＰ生産
実施例２で製造されたＸＭＰ生産菌株コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＣＪ−１３０４をＧＭＰ生産のために下記のように培養した。母菌株コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＣＣＭ−１０５３０および変異株ＫＣＪ−１３０４を下記種培地３ｍｌをそれぞれ含有する１４ｍｌチューブにそれぞれ接種し、３０℃で２０時間２００ｒｐｍで振盪しながらインキュベーションさせた。続いて、種培養液を０．４ｍｌの量でそれぞれ２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコ中の下記生産培地３２ｍｌ(本培地２４ｍｌ＋Ａ培地８ｍｌ)に添加し、３０℃で２３０ｒｐｍで９６時間振盪培養した。これで生成されたＸＭＰのＧＭＰへの転換を行うために、下記の転換添加物およびエシェリキア・コリＸＭＰアミナーゼをエルレンマイヤー(Erlenmeyer)フラスコに添加した後、４０℃で４時間転換反応を行った。変異株ＫＣＪ−１３０４は、母菌株ＫＣＣＭ−１０５３０に比べて転換率が増加されたと明らかになったが、これは消耗されたＸＭＰ当りＧＭＰ生成量として説明される。すなわち、本発明の変異株は、既存菌株と比較してＧＭＰ生産で向上された。結果は、下記表３に要約された。
【００４２】
【表３】
【００４３】
表３のデータから明らかなように、ＫＣＪ−１３０４は、母菌株ＫＣＣＭ−１０５３０に比べて転換率が２．４％、ＧＭＰ水準が８．５％増加したことが明らかになった。
種培地：グルコース３０ｇ／ｌ、ペプトン１５ｇ／ｌ、酵母抽出物１５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ２．５ｇ／ｌ、尿素３ｇ／ｌ、アデニン１５０ｍｇ／ｌ、グアニン１５０ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．２
生産培地（本培地）：グルコース８０ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム１０ｇ／ｌ、硫酸鉄２０ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛１０ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン１０ｍｇ／ｌ、アデニン３０ｍｇ／ｌ、グアニン３０ｍｇ／ｌ、ビオチン１００μｇ／ｌ、硫酸銅１ｍｇ／ｌ、塩化チアミン５ｍｇ／ｌ、塩化カルシウム１０ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．２
生産培地（Ａ培地）：リン酸一水素カリウム１０ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム１０ｇ／ｌ、尿素７ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／ｌ
転換添加物：フィチン酸(phytic acid)１．８ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４４．８ｇ／ｌ、ナイミーン(nymeen)３ｍｌ／ｌ、キシレン２％、アデニン１００ｍｇ／ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４７．７ｇ／ｌ、グルコース４６ｇ／ｌ。
【００４４】
本発明の好ましい実施態様が例示的な目的のために開示されたが、当業者は添付された請求項に開示されたような本発明のカテゴリーおよび趣旨を逸脱することなく、様々な変更、付加および代替が可能であることが理解されよう。
【００４５】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内在的リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性よりも高い活性を有することによって、ＡＴＰをより高い収率で生産できるコリネバクテリア菌株(Corynebacteria strain)に関する。また、本発明は、アミノ化活性を有する酵素または微生物と共にコリネバクテリア菌株を用いる５’−グアノシン一リン酸の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
５’−グアノシン一リン酸(5'-guanosine monophosphate：以下、“ＧＭＰ”という)は、イノシン一リン酸(inosine monophosphate：以下、“ＩＭＰ”という)のような香味増進剤として広く使用される食品添加剤である。ＧＭＰは、うま味を引き出し、その使用は、また使用されるグルタミン酸一ナトリウム(ＭＳＧ)に左右される。これは、普通にＩＭＰと共に使用され、ＭＳＧのうま味の強さを増加させる。
【０００３】
今まで知られているＧＭＰの製造方法の例には、（１）酵母ＲＮＡの酵素的分解法、（２）ＧＭＰへの直接微生物発酵法、（３）グアノシンへの微生物発酵に続いて化学的リン酸化する方法、（４）グアノシンへの微生物発酵に続いて酵素的リン酸化する方法、（５）キサントシン５’−一リン酸(xanthosine 5’-monophosphate：以下、“ＸＭＰ”という)への微生物発酵に続いてコリネバクテリア菌株によってＧＭＰに転換する方法、（６）ＸＭＰへの微生物発酵に続いてアミナーゼ活性を有するエシェリキア・コリ(Escherichia coli)によってＸＭＰをＧＭＰに転換する方法が含まれる。このうち、方法（１）は、物質供給の困難さがあり、経済的に無益であり、方法（２）は、ＧＭＰの膜透過性によって低い収率の短所がある。したがって、他の方法が産業的適用で広く用いられる。
【０００４】
ＸＭＰを生産してＧＭＰに転換させる方法（６）に対して、補助因子としてＡＴＰを供給するのが重要である。ＸＭＰのＧＭＰへの転換で使用されるＡＴＰの大部分は、ＸＭＰ生産菌株から供給される。転換アプローチで、キシレンは重要な役割を果たすが、なぜならば、これはＡＴＰおよびＸＭＰに対する膜透過性を増加させるためである。培地中のキシレンは、ＡＴＰおよびＸＭＰがＧＭＰ生産菌株に浸透するようにしてＸＭＰをＧＭＰに転換させるようにする。したがって、ＧＭＰ生産のアプローチは、ＡＴＰ生産性を増加させる戦略である。
【０００５】
ＸＭＰのＧＭＰへの転換は、下記の反応式によって表される。
ＸＭＰ＋ＡＴＰ＋ＮＨ３−−−−−−−−−−−−＞ＧＭＰ＋ＡＭＰ＋ＰＰｉ
ＸＭＰアミナーゼ
【０００６】
すなわち、一次的にＸＭＰ生産菌株によってＸＭＰを生産し、これをＸＭＰアミナーゼ活性を有する酵素または微生物の存在下でＧＭＰに転換させるＧＭＰ生産過程において、補助因子として作用するＡＴＰの持続的な供給は必須的である。したがって、ＸＭＰ生産菌株のＡＴＰ生産能を増進させるのは非常に重要である。転換過程で生産されたＡＭＰは、ＡＴＰ生産のための基質として再使用される。事実上、アデニンベースのヌクレオチドは、ＡＴＰの生産のためにリサイクルされる。
【０００７】
したがって、ＸＭＰ生産菌株の増加されたＡＴＰ生産は、高収率のＧＭＰ生産のために必要である。リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性は、ＡＴＰの生産に莫大な影響を及ぼす。しかし、ＧＭＰ生産収率を増加させるためのリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性増進のために考案された微生物および方法に対する言及は先行文献のどこにもなかった。
【０００８】
前記２段階の転換に優先してＧＭＰ収率を増加させるためにＸＭＰ生産菌株のＡＴＰ生産を増加させるのが重要であるということを念頭に置いて、本発明者らは、集中的な研究を行い、増加させる遺伝子を発見した。また、ＸＭＰアミナーゼと共に使用する場合、遺伝子の２つのコピーを並んで運ぶ組換えベクターで形質転換されたコリネバクテリア菌株は、ＸＭＰおよびＡＴＰを高収率で生産することができ、したがって、ＧＭＰ生産も増加させることを明らかにした。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の目的は、内在的リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性よりも高い活性を有することによって、ＡＴＰを高収率で生産できるコリネバクテリア菌株を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記形質転換された微生物を培養する段階；前記培養物でＸＭＰを生産する段階；前記培養物にＸＭＰアミノ化活性を有する酵素または微生物を添加する段階；および前記培養物からＧＭＰを収得する段階を含むＧＭＰの生産方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、一態様により、本発明は、内在的リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性よりも増進されることによって、ＡＴＰを高収率で生産できるコリネバクテリア菌株に関する。本発明のコリネバクテリア菌株は、内在的リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性よりも高いリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有することによって、ＡＴＰ生産が向上するように変形される。
【００１２】
本願で使用される用語“リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(malate dehydrogenase)”は、脱水素化によるリンゴ酸のオキザロ酢酸への転換を促進する酵素を意味する。この酵素は、乳酸デヒドロゲナーゼと共に生物の非常に広い領域で発見され、その活性のために補助因子として、普通乳酸デヒドロゲナーゼを伴うＤＰＮおよびＮＡＤを必要とする。本発明によるコリネバクテリア菌株において、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性は増加されてＡＴＰを高収率で生産し、その結果、ＧＭＰ生産能の増大を招く。
【００１３】
本願で使用されたような用語“内在的活性(endogenous activity)”は、野生型微生物中の関心のある酵素活性を表そうとするものである。用語“内在的活性よりも高い活性”は、酵素それ自体による活性増加からもたらされたものでもまたは、内在的遺伝子または外来遺伝子による活性増加からもたらされたものでも、内在的変種の活性と比較して増加された酵素活性を意味する。例えば、酵素活性の増加は、これに制限されないが、遺伝子コピー数の増加または減少、関心のあるプロモーターの代替、変形または突然変異などをはじめとする、技術分野において十分公知の任意の方法によって達成しても良い。
【００１４】
本発明によりその活性を増加させようとする標的酵素であるリンゴ酸デヒドロゲナーゼは、コリネバクテリアのｍｑｏ遺伝子によってエンコードされる。ｍｑｏ遺伝子と生物学的に同一であるとか、符合する限り、任意の変異体または類似体が本発明で使用されても良い。すなわち、遺伝子の活性がｍｑｏ遺伝子の活性と実質的に同一であるとか、類似する場合、ｍｑｏ遺伝子の範囲内に属する任意の遺伝子が本発明で有用である。有利には、本発明に有用な遺伝子は、ｍｑｏ遺伝子配列と好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性、より一層好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有する。より有利には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、配列番号７のヌクレオチド配列によってエンコードされる。遺伝子コピーの増加は、外来遺伝子の導入および／または内在的遺伝子の増幅によって達成され得る。遺伝子のコピー数は、必要および目的に応じて当業者によって容易に決定され得る。内在的遺伝子の増幅は、また、当業界に公知の方法、例えば、圧力下で適当な選択培地で培養する方法を用いて行うことができる。好ましい例において、リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を運ぶベクターをコリネバクテリア菌株へ導入して、内在的活性よりも増進された活性を有する形質転換された微生物を生成した。
【００１５】
当業界に公知され、コリネバクテリア属微生物に属する限り、任意の菌株が制限なく本発明で使用され得る。好ましくは、本発明に有用なコリネバクテリア菌株の例としては、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)、およびブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム(Brevibacterium lactofermentum)が含まれるが、これらに制限されない。詳細には、コリネバクテリア菌株中で、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ ６８７２、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes) ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９、コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ １３０３２、コリネバクテリウム・グルタミクム Ｒ、ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ １４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム ＡＴＣＣ １３８６９およびこれらの誘導体がある。好ましいのは、コリネバクテリア・アンモニアゲネス ＫＣＣＭ−１０５３０から形質転換されたコリネバクテリウム・アンモニアゲネス ＫＣＪ−１３０４である。
【００１６】
ＡＴＰを高収率で生産できる微生物を生成するために、ｍｑｏ遺伝子を運ぶ組換えベクターが使用され得る。
【００１７】
本願で使用される用語“ｍｑｏ遺伝子”は、“リンゴ酸：キノン酸化還元酵素(malate:quinone oxidoreductase)”遺伝子の略語であって、リンゴ酸をオキサロ酢酸に酸化させる役割を果たすリンゴ酸オキサロ酢酸をコードする遺伝子を意味する。
【００１８】
ｍｑｏ遺伝子を運ぶ限り、任意の通常的組換えベクターが本発明で制限なく使用され得る。好ましいのは、ｐＤＺ−ｍｑｏである。本発明の好ましい例において、配列番号７を含有するｍｑｏ遺伝子を用いて組換えｐＤＺ−ｍｑｏベクターを構築した（図１参照）。
【００１９】
本願で使用されたような用語“ベクター”は、外部遺伝物質を適合な宿主細胞に運ぶ媒介体(vehicle)として使用されるＤＮＡ分子を意味し、転移遺伝子が宿主ゲノムと組換わるように許容する調節要素を含有するＤＮＡ作製物である。好ましくは、本発明によるｍｑｏベクターを運ぶ組換えベクターは、図１の切断地図に示された構造を有することができる。
図１の切断地図によって示されたベクターは、コリネバクテリアに順次にまたは、同時に導入され得る。本発明の好ましい実施態様により、組換えベクターは、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ＫＣＣＭ−１０５３０中に形質転換された後、選択培地で培養して２つのコピーのｍｑｏ遺伝子を相同組換えを介して宿主のゲノムに統合させ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ＫＣＪ−１３０４と命名したコリネバクテリウム・アンモニアゲネス突然変異体を生成する。これを受託番号 ＫＣＣＭ１０９７２Ｐとして寄託した。
【００２０】
本発明のまた他の態様により、本発明は、ｍｑｏ遺伝子を運ぶ組換えベクターで形質転換されたコリネバクテリア菌株に関する。コリネバクテリア由来のｍｑｏ遺伝子は、当業界に公知の形質転換法を用いて制限なく使用され得る。好ましくは、ｍｑｏ遺伝子はベクターにクローン化されて細胞中に形質転換される。
【００２１】
形質転換には当業界に公知の任意の方法が使用され得る。本願に使用されたような用語“形質転換”とは、外部ＤＮＡの導入、ゲノム統合および発現による細胞の遺伝的変更を意味する。一般的な形質転換方法には、ＣａＣｌ２沈殿法、ＣａＣｌ２方法にＤＭＳＯ(ジメチルスルホキシド)を使用することによって効率を高めたハナハン(Hanahan)方法、電気穿孔法、リン酸カルシウム形質移入法、原形質体融合法、シリコンカーバイド繊維媒介形質転換法、アグロバクテリウム媒介形質転換法、ＰＥＧを用いた形質転換法、デキストラン硫酸塩、リポフェクタミン、および乾燥／抑制媒介形質転換法などがある。本発明によるｐＤＺ−ｍｑｏを用いた形質転換は、前記例などに限定されず、当業界に公知の任意の方法を制限なく使用して行うことができる。
【００２２】
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスに図１の切断地図に示された構造を有するベクターｐＤＺ−ｍｑｏが導入された受託番号ＫＣＣＭ１０９７２Ｐ菌株は、これを選択培地で培養することによって、２つのコピーのｍｑｏ遺伝子が内在的遺伝子を相同組換えによって置換されることによって２つのコピーのｍｑｏ遺伝子がゲノム内に挿入されている菌株である。
【００２３】
また他の一つの様態として、本発明は、（ａ）前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性が内在的活性よりも増加されることによってＡＴＰ生産能が向上されたコリネバクテリア属由来の微生物を培養する段階；（ｂ）前記培養液からＸＭＰを生産する段階；（ｃ）前記培養液にＸＭＰアミノ化活性を有する酵素または微生物を添加する段階；および（ｄ）前記培養液からＧＭＰを収得する段階を含むＧＭＰの生産方法に関する。本発明は、前述された形質転換された微生物を用いてＸＭＰを高収率で生産した後、ＸＭＰアミナーゼまたはＸＭＰアミノ化活性を有する微生物の存在下でＧＭＰに転換させる。好ましくは、形質転換された微生物は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性が内在的活性よりも増加されたコリネバクテリア属由来の微生物である。
【００２４】
本発明においてＸＭＰまたはＧＭＰを生産できる菌株の培養に使用される培地は、当業界で通常的に使用される培地が制限なく使用され得る。好ましくは、培地は、炭素源としてグルコースおよび任意選択で様々なその他の炭素源を含む。関心の微生物の培養に使用するために、培地はその微生物の成長のための要件を満たさなければならない。コリネバクテリア菌株に対する培養培地は公知されている(例えば、文献[Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C.、USA,1981]参照)。コリネバクテリア菌株に有用な炭素源には、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースのような糖および炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ヤシ油などのようなオイルおよび脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノレン酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これらの炭素源は、個別的にまたは混合物として使用され得る。培地で使用され得る窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、牛肉抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆粕のような有機窒素源、および尿素、および無機化合物、例えば、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も個別にまたは混合物として使用することができる。リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウム、または相応するナトリウム塩がリン源として使用することができる。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有することができる。また、前記物質に加えてアミノ酸および/またはビタミンのような必須成長物質が使用され得る。また、培養培地に適切な前駆体などが使用され得る。前記の原料などは、培養過程において培養物に適切な方式によって回分式または連続式に添加され得る。
【００２５】
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような塩基性化合物または、リン酸または硫酸のような酸性化合物を使用して培養物のｐＨを調節することができる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して培養中に気泡の生成を防止することができる。好気状態を維持するために培養物内に酸素または酸素含有気体(例えば、空気)を注入するか、嫌気状態を維持するために窒素、水素または二酸化炭素気体を注入することができる。培養温度は、普通２０℃〜４５℃、好ましくは３０℃〜３５℃である。培養は、ＸＭＰまたはＧＭＰの生成量が最大で得られる時まで継続する。このような目的で普通１０〜１６０時間が要求される。
【００２６】
本発明に有用なＸＭＰアミノ化活性を有する微生物は、エシェリキア・コリ(E.coli)であり得る。ＸＭＰアミノ化活性を有するエシェリキア・コリを培養する方法は、当業界で通常的に使用されるエシェリキア・コリの培養方法を制限なく使用することができる。エシェリキア・コリ培養用培地は、様々な栄養分としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムのような各種無機窒素源およびペプトン、ＮＺ−アミン、牛肉抽出物、酵母抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類または魚粉、脱脂大豆ケーキ、または、大豆粕のような有機窒素源、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどのような無機化合物が含まれ得る。必要により、ビタミンおよび栄養要求性塩基が添加され得る。培養は、好気的条件下で、例えば、振盪培養または、通気攪拌培養によって３０〜４５℃、好ましくは３７〜４０℃の温度で行うことができる。培地のｐＨは、培養中に中性水準で維持することが好ましく、培養は１〜２日間行うことができ、前記培養によって培地中にＸＭＰアミノ化活性を有する微生物が蓄積され得る。
【００２７】
本発明において、ＧＭＰは前記培養によってＸＭＰが生産された培養液をＸＭＰアミノ化活性を有するエシェリキア・コリ培養液に添加してＸＭＰをＧＭＰに転換させることによって製造され得る。ＸＭＰのＧＭＰへの転換は、キシレンのようなＸＭＰの膜透過性を増加させる物質を培地中に添加してＸＭＰがＧＭＰ生産菌株内によく流入するようにした後、ＸＭＰをＧＭＰに転換させることによって行える。ＸＭＰの膜透過性を増加させる物質は、当業界で良く知られている。このような化合物の例示には、キシレンのような疎水性物質（例えば、トルエン、ベンゼン、酢酸エチル）、界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンステアリルアミン、セチルトリメチルアンモニウム臭化物、カチオンＦＢ、カチオンＦ２−４０Ｅなどの陽イオン性界面活性剤、ナトリウムオレイルアミド硫酸、ニューレックス(Newrex)ＴＡＢおよびラビゾール８０などの陰イオン性界面活性剤）、金属イオン（例えば、カルシウム、マグネシウムイオン）などが含まれるが、これらに限定されるのではない。前記したＸＭＰの細胞膜透過性を増進させる物質の使用量は、選択される物質に応じて変われるし、当業者ならば、適切に調節して使用することができる。
【００２８】
これで、生産されたＧＭＰは、培養培地中で排出されるか、細胞中に含まれていることができる。本発明のＧＭＰを生産する方法は、細胞または培養培地からＧＭＰを回収する段階を含む。細胞または培養培地からＧＭＰを回収する方法は、当業界でよく知られている。前記のＧＭＰ回収方法には、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化およびＨＰＬＣなどが使用され得るが、これらの例に限定されるのではない。
【００２９】
本発明において使用される用語“グアノシン一リン酸(guanosine monophosphate)”とは、グアノシンとリン酸が結合したヌクレオチドの一つであって、核酸を構成し、その位置に応じて５’−フォーム、３’−フォームおよび２’−フォームの３種類に分かれる。本発明で生産される５’−グアノシン一リン酸は、無色の針状結晶であって、生体内に遊離(free)状態で存在する。分子式は、Ｃ１０Ｈ１４Ｎ５Ｏ８Ｐであり、グアニル酸二ナトリウム、グアニル酸二カリウムおよびグアニル酸カルシウムのようなその塩形態であるグアノシン一リン酸は、キノコの味があり、核酸系調味料として使用される物質である。好ましくは本発明は、形質転換された微生物を用いてこのようなＧＭＰを高収率で得ることができる方法を明らかにし、従来の微生物を用いた方法よりもＧＭＰの濃度が約８．５％増加されることを確認した。
【発明の効果】
【００３０】
本発明による組換えベクターで形質転換されたコリネバクテリア菌株は、増進されたリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を示して増加した収率でＡＴＰを生産する。ＸＭＰからＧＭＰへの転換反応に適用する場合、本発明の形質転換菌株は通常的な微生物に比べてより高い生産能でＧＭＰを生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、ｐＤＺベクターに２つのコピーのｍｑｏ遺伝子を挿入した組換えｐＤＺ−ｍｑｏベクター構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下で本発明を実施例を介してより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に実施するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるのではない。
【００３３】
実施例１：ＸＭＰ生産菌株コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＣＣＭ−１０５３０由来ｍｑｏのクローニングおよびゲノム統合のための組換えベクター（ｐＤＺ−ｍｑｏ）の構築
ｍｑｏ遺伝子のヌクレオチド配列(NCBI ID_3345228)をＮＩＨジェンバンク(GenBank)のデータから得た。前記の配列に基づいて２対のプライマー(配列番号１〜４)を合成した。
コリネバクテリウムＫＣＣＭ−１０５３０を鋳型としながら、高信頼ＤＮＡポリメラーゼ ＰｆｕΜｌｔｒａＴＭ(ストラタジーン(Stratagene))の存在下で前記配列番号１〜４のプライマーを使用して９５℃で３０秒間変性させ、５５℃で３０秒間アニーリングさせ；６８℃で２分間伸長させることを２５回繰り返した。こうして得たＰＣＲ生成物は、それぞれ２．１ｋｂのｍｑｏ遺伝子２つのコピー(ｍｑｏ−Ａ、ｍｑｏ−Ｂ)であり、これを配列番号１と２、および配列番号３と４の２つのセットをそれぞれ使用して増幅させた。
配列番号１ ｇｃｔｃｔａｇａＡＴＣＧＧＴＣＡＴＴＣＣＡＴＧＡＡＣＣＣ
配列番号２ ｃｇｃｇｇａｔｃｃＣＡＴＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡ
配列番号３ ｃｇｃｇｇａｔｃｃＡＴＣＧＧＴＣＡＴＴＣＣＡＴＧＡＡＣＣＣ
配列番号４ ｇｃｔｃｔａｇａＣＡＴＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡ
適合した制限酵素で処理した後に（ｍｑｏ−Ａ：ＸｂａＩ＋ＢａｍＨＩ、ｍｑｏ−Ｂ：ＢａｍＨＩ＋ＸｂａＩ）、ＰＣＲ生成物であるｍｑｏ−Ａおよびｍｑｏ−Ｂを３片接合を介してＸｂａＩとエビアルカリ性リン酸加水分解酵素で以前に処理したｐＤＺベクターへ挿入した(大韓民国特許出願第１０−２００７−９４４３３号参考)。最終的に、ｍｑｏ遺伝子２つのコピーが連続的にクローン化された組換えｐＤＺ−ｍｑｏベクターを得た。図１は、コリネバクテリウムゲノムに統合させるための組換えｐＤＺ−ｍｑｏベクターの構造を示す模式図である。
【００３４】
実施例２：ｍｑｏ挿入された菌株の生成
前記ｐＤＺ−ｍｑｏベクターをＫＣＣＭ−１０５３０菌株に形質転換し、ゲノム上のｍｑｏ遺伝子に隣接した位置で一つのｍｑｏ遺伝子を挿入するためにゲノムと相同組換えを行った。したがって、そのゲノム上に２つのコピーのｍｑｏ遺伝子を有する、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＣＪ−１３０４と命名した新規ＸＭＰ生産菌株を得た。２つコピーのｍｑｏ遺伝子の連続的挿入は、２つコピーのｍｑｏ遺伝子のヌクレオチド配列の上流と下流を標的とするプライマーセット(配列５および６)を用いたＰＣＲで確認した。
配列番号５ ＣＴＴＴＴＣＧＡＴＧＡＣＧＣＣＣＡＡ
配列番号６ ＣＣＡＣＴＴＴＡＴＣＧＧＧＴＧＡＧＡＣＣＡ
【００３５】
実施例３：ｍｑｏ挿入された菌株のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性
実施例２で製造されたＸＭＰ生産コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＣＪ−１３０４を下記のようにリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性に対して分析した。前記菌株をバクトペプトン１０ｇ／ｌ、バクト牛肉抽出物５ｇ／ｌ、バクト酵母抽出物５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ２．５ｇ／ｌ、アデニン５０ｍｇ／ｌ、およびグアニン５０ｍｇ／ｌを含有した培地に接種し、３０℃で１２時間ＯＤ１０が得られるまでインキュベーションさせた。細胞培養液１０ｍｌを回収して５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ 酢酸カリウム、１０ｍＭ ＣａＣｌ２および１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む緩衝液で２回洗浄し、同じ緩衝液１ｍｌに懸濁させた。超音波粉砕機(sonicator)を用いて中断させた後、細胞溶解物を遠心分離させた。上澄液を再び遠心分離してペレットを得た後、これを緩衝液１００μｌに懸濁させた。この懸濁液のうち、１０μｌを酵素液として使用した。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ酢酸カリウムおよび５０μＭ２，６−ジクロロインドフェノール(Cl2Ind)を混合して反応緩衝液を製造した。Ｃｌ２Ｉｎｄは、解凍させて反応直前に混合した。前記反応混合物９８０μｌに基質として１００ｍＭリンゴ酸１０μｌおよび酵素液１０μｌを添加した後、３０℃で１５分間振盪しながらインキュベーションさせた。酵素活性は、還元されたＣｌ２Ｉｎｄの濃度を測定することによって決定した。Ｃｌ２Ｉｎｄは、６００ｎｍで２２ｃｍ−１ｍＭ−１の吸収係数を有した。
【００３６】
【表１】
【００３７】
表１に示されたように、ＫＣＪ−１３０４は、母菌株ＫＣＣＭ−１０５３０に比べてリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性が３０．６％増加したことが観察された。
【００３８】
実施例４：ｍｑｏ挿入された菌株のＡＴＰ水準
実施例２で製造されたＸＭＰ生産菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＣＪ−１３０４を下記のように細胞内ＡＴＰ水準に対して測定した。
母菌株コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＣＣＭ−１０５３０と変異株ＫＣＪ−１３０４をそれぞれ下記の種培地３ｍｌを含有する１４ｍｌチューブにそれぞれ接種し、３０℃で２０時間２００ｒｐｍで振盪しながらインキュベーションさせた。続いて、種培養液を０．４ｍｌの量でそれぞれ２５０ｍｌコーナーバッフル(corner-baffle)フラスコ中の種培地２５ｍｌに添加した後、３０℃で２３０ｒｐｍで２０時間振盪培養した。細胞培養液をＯＤおよび細胞内ＡＴＰ水準に対して測定した。前記変異株ＫＣＪ−１３０４は、母菌株ＫＣＣＭ−１０５３０に比べてＯＤ当たりにより高い割合でＡＴＰを生産することが明らかになり、これは本発明の変異株が母菌株に比べてより高いＧＭＰ生産を示すことを示唆する。結果は下記の表２に要約した。
【００３９】
【表２】
【００４０】
表２に示されたように、ＫＣＪ−１３０４のＯＤ当たり細胞内ＡＴＰ水準は、母菌株ＫＣＣＭ−１０５３０に比べて約１０４％増加された。
【００４１】
実施例５：ｍｑｏ挿入された菌株のＸＭＰ発酵およびＧＭＰ生産
実施例２で製造されたＸＭＰ生産菌株コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＣＪ−１３０４をＧＭＰ生産のために下記のように培養した。母菌株コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＣＣＭ−１０５３０および変異株ＫＣＪ−１３０４を下記種培地３ｍｌをそれぞれ含有する１４ｍｌチューブにそれぞれ接種し、３０℃で２０時間２００ｒｐｍで振盪しながらインキュベーションさせた。続いて、種培養液を０．４ｍｌの量でそれぞれ２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコ中の下記生産培地３２ｍｌ(本培地２４ｍｌ＋Ａ培地８ｍｌ)に添加し、３０℃で２３０ｒｐｍで９６時間振盪培養した。これで生成されたＸＭＰのＧＭＰへの転換を行うために、下記の転換添加物およびエシェリキア・コリＸＭＰアミナーゼをエルレンマイヤー(Erlenmeyer)フラスコに添加した後、４０℃で４時間転換反応を行った。変異株ＫＣＪ−１３０４は、母菌株ＫＣＣＭ−１０５３０に比べて転換率が増加されたと明らかになったが、これは消耗されたＸＭＰ当りＧＭＰ生成量として説明される。すなわち、本発明の変異株は、既存菌株と比較してＧＭＰ生産で向上された。結果は、下記表３に要約された。
【００４２】
【表３】
【００４３】
表３のデータから明らかなように、ＫＣＪ−１３０４は、母菌株ＫＣＣＭ−１０５３０に比べて転換率が２．４％、ＧＭＰ水準が８．５％増加したことが明らかになった。
種培地：グルコース３０ｇ／ｌ、ペプトン１５ｇ／ｌ、酵母抽出物１５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ２．５ｇ／ｌ、尿素３ｇ／ｌ、アデニン１５０ｍｇ／ｌ、グアニン１５０ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．２
生産培地（本培地）：グルコース８０ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム１０ｇ／ｌ、硫酸鉄２０ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛１０ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン１０ｍｇ／ｌ、アデニン３０ｍｇ／ｌ、グアニン３０ｍｇ／ｌ、ビオチン１００μｇ／ｌ、硫酸銅１ｍｇ／ｌ、塩化チアミン５ｍｇ／ｌ、塩化カルシウム１０ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．２
生産培地（Ａ培地）：リン酸一水素カリウム１０ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム１０ｇ／ｌ、尿素７ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／ｌ
転換添加物：フィチン酸(phytic acid)１．８ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４４．８ｇ／ｌ、ナイミーン(nymeen)３ｍｌ／ｌ、キシレン２％、アデニン１００ｍｇ／ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４７．７ｇ／ｌ、グルコース４６ｇ／ｌ。
【００４４】
本発明の好ましい実施態様が例示的な目的のために開示されたが、当業者は添付された請求項に開示されたような本発明のカテゴリーおよび趣旨を逸脱することなく、様々な変更、付加および代替が可能であることが理解されよう。
【００４５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性よりも高い活性を有することによって、増進されたＡＴＰ生産能を示すコリネバクテリア菌株。
【請求項２】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性がｍｑｏ発現量増加によって増進されたものである請求項１に記載のコリネバクテリア菌株。
【請求項３】
図１の切断地図に示された構造を有するベクターが前記菌株に含まれるものである請求項１に記載のコリネバクテリア菌株。
【請求項４】
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＣＣＭ１０９７２Ｐである請求項３に記載のコリネバクテリア菌株。
【請求項５】
（ａ）請求項１のコリネバクテリア菌株を培養する段階；
（ｂ）前記培養液で５’−キサントシン一リン酸（ＸＭＰ）を生産する段階；
（ｃ）前記培養液にＸＭＰアミノ化活性を有する酵素または微生物を添加する段階；および
（ｄ）前記培養液から５’−グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）を収得する段階を含むＧＭＰの生産方法。
【請求項１】
野生型のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性よりも高い活性を有することによって、増進されたＡＴＰ生産能を示すコリネバクテリア菌株。
【請求項２】
リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性がｍｑｏ発現量増加によって増進されたものである請求項１に記載のコリネバクテリア菌株。
【請求項３】
図１の切断地図に示された構造を有するベクターが前記菌株に含まれるものである請求項１に記載のコリネバクテリア菌株。
【請求項４】
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＣＣＭ１０９７２Ｐである請求項３に記載のコリネバクテリア菌株。
【請求項５】
（ａ）請求項１のコリネバクテリア菌株を培養する段階；
（ｂ）前記培養液で５’−キサントシン一リン酸（ＸＭＰ）を生産する段階；
（ｃ）前記培養液にＸＭＰアミノ化活性を有する酵素または微生物を添加する段階；および
（ｄ）前記培養液から５’−グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）を収得する段階を含むＧＭＰの生産方法。
【図１】
【公表番号】特表２０１２−５１１９２４（Ｐ２０１２−５１１９２４Ａ）
【公表日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４２００８（Ｐ２０１１−５４２００８）
【出願日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００７５５８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７１３６６
【国際公開日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【出願人】（５１１１４８９６１）シージェイ チェイルジェダン コーポレーション (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００７５５８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７１３６６
【国際公開日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【出願人】（５１１１４８９６１）シージェイ チェイルジェダン コーポレーション (7)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]