６７ｋＤａラミニン・レセプターを用いた薬物のスクリーニング方法及びそれにより得られる薬物
【課題】６７ｋＤａラミニン・レセプターを用いた薬物の新規なスクリーニング方法及びそれにより得られる薬物を提供する。
【解決手段】被験化合物と６７ｋＤａラミニン・レセプターとの結合の度合いを定性的または定量的に測定し、その測定結果より被験化合物が６７ｋＤａラミニン・レセプターに結合する場合にはその被験化合物が細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転位活性阻害作用、神経保護作用、抗アレルギー作用、抗動脈硬化作用、及び／または、クロイツフェルトヤコブ病感染阻害作用を有する薬物であると判断する工程を含む、細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転位活性阻害作用、神経保護作用、抗アレルギー作用、抗動脈硬化作用、及び／または、クロイツフェルトヤコブ病感染阻害作用を有する薬物のスクリーニング方法、並びに、それにより得られる薬物。
【解決手段】被験化合物と６７ｋＤａラミニン・レセプターとの結合の度合いを定性的または定量的に測定し、その測定結果より被験化合物が６７ｋＤａラミニン・レセプターに結合する場合にはその被験化合物が細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転位活性阻害作用、神経保護作用、抗アレルギー作用、抗動脈硬化作用、及び／または、クロイツフェルトヤコブ病感染阻害作用を有する薬物であると判断する工程を含む、細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転位活性阻害作用、神経保護作用、抗アレルギー作用、抗動脈硬化作用、及び／または、クロイツフェルトヤコブ病感染阻害作用を有する薬物のスクリーニング方法、並びに、それにより得られる薬物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は６７ｋＤａラミニン・レセプターを用いた薬物のスクリーニング方法及びそれにより得られる薬物に関する。
【背景技術】
【０００２】
６７ｋＤａラミニン・レセプター（以下、「６７ＬＲ」と称することもある。）は、２９５個のアミノ酸をコードするｍＲＮＡから翻訳された３７ｋＤａ前駆体蛋白質が、細胞内で脂肪酸等によるアシル化重合反応を受けてホモ二量体またはヘテロ二量体化により６７ｋＤａとなった蛋白質であり、それがインテグリン類とともに細胞膜表面へ移行してはじめてラミニン・レセプターとして機能する（非特許文献１および２）。
【０００３】
また、３７ｋＤａ前駆体蛋白質は、リボソーム関連蛋白質ｐ４０として蛋白合成に関与していることが、さらには多剤耐性関与蛋白質（ＭＧｒ１−Ａｇ）として報告されていたものと同一であることが明らかにされている（非特許文献３）。このラミニン・レセプターの多くの癌細胞での高発現というデータにより、汎腫瘍特異的移植抗原としてのＴ細胞の免疫原として、腫瘍胎児抗原であると見なされている（非特許文献４）。ラミニン・レセプターは既に６７ＬＲ以外に１０数種類報告されているが、その中でも６７ＬＲの癌との関連が強く示唆されている。
【０００４】
６７ＬＲは多くの癌において癌細胞での検出の有無から、ヒト癌患者の悪性度を示す重要な予後因子として知られており（非特許文献５〜９）、動物モデル等では癌細胞の増殖、移動、浸潤、転移等に関与することが示唆されている。
【０００５】
たとえば、乳癌患者においては６７ＬＲポジティブの患者の生存率はネガティブな患者より有為に低いことが報告されている。６７ＬＲのリガンドであるラミニンの発現は予後には影響ないが、レセプター６７ＬＲの発現は予後に負の結果をもたらすことが示されている（非特許文献５）。
【０００６】
これらの知見を下に、６７ＬＲの発現を抑制することで抗腫瘍効果を示すことを期待して行われた実験が幾つか報告されている。６７ＬＲのアンチセンスＲＮＡを癌細胞株に導入して作製した６７ＬＲ低発現細胞株は、元の親株細胞よりもマウスのインビボにおいて有為に腫瘍増殖能の低下並びに転移能の低下が起こり、その結果マウス個体の生存率が改善することが報告されている（非特許文献９）。
【０００７】
さらには、低６７ＬＲ発現細胞株は親株よりも腫瘍血管新生の低下並びに血管新生促進因子であるＶＥＧＦの産生そのものも低下していることが報告されている（非特許文献１０）。同様に、６７ＬＲに対する抗体を用いた腫瘍転移実験においても、アンチセンス実験と同様な効果が見とめられている（非特許文献１１）。
【０００８】
非腫瘍関連においても、６７ＬＲの機能について幾つか報告がなされている。虚血動物モデルにおいて誘導される新生血管の増生が６７ＬＲと結合するラミニン由来ペプタイド（システイン−アスパラギン酸−プロリン−グリシン−チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン）や、ＥＧＦ由来ペプタイド（システイン−バリン−イソロイシン−グリシン−チロシン−セリン−グリシン−アスパラギン酸−アルギニン−システイン）によって抑制されることが報告されている（非特許文献１２）。
【０００９】
血管内皮細胞に対する剪断力によって誘導される動脈硬化との関与が指摘されているｅＮＯＳ発現とＮＯ産生が、６７ＬＲと結合するラミニン由来ペンタペプタイド（チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン）によって抑制することが報告されている（非特許文献１３）。
【００１０】
最近の報告では、６７ＬＲがクロイツフェルトヤコブ病の病因と考えられているプリオン蛋白質のレセプターとして働き、プリオンが結合してインタナリゼーションされることが、その結合とインタナリゼーションが膜ドメインを欠いたミュータント６７ＬＲの分泌によって阻害されることが報告されている（非特許文献１４）。
【００１１】
６７ＬＲはまた、Ｔ細胞のサブセットであるＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ４５ＲＡ−のメモリー細胞のＣＤ４＋ＣＤ８−またはＣＤ４−ＣＤ８＋のサブセット群で発現していることが報告され、６７ＬＲの免疫系への作用が示唆されている（非特許文献１５）。
【００１２】
６７ＬＲのｍＲＮＡ発現に関する報告も幾つか存在する。癌抑制因子であるｐ５３や抗癌因子であるＴＮＦ−アルファー、ＩＦＮ−ガンマーによってその発現が抑制されることが報告されている（非特許文献１６）。ただし、このような多用な機能に関与すると推定されている６７ＬＲに対する低分子化合物の報告はない。
【００１３】
一方、カテキン類のうち、エピガロカテキンガレート（以下、「ＥＧＣＧ」と称することもある。）は、茶のカテキンの約５０％を占める主用成分である。他に、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピカテキン（以下それぞれ、「ＥＧＣ］、「ＥＣＧ］、「ＥＣ」と称することもある）等が含まれる。
【００１４】
茶は古来より薬として用いられて来た古い歴史があり、近代よりその効能と成分の関係が解析されてきた。そのうちＥＧＣＧは１９４７年、Ａ．Ｂｒａｄｆｉｅｌｄらによって発見された成分である（非特許文献１７）。
【００１５】
ＥＧＣＧを含めて茶のカテキン類の生理作用としては、抗酸化、抗癌、血漿コレステロール上昇抑制、血圧上昇抑制、血小板凝集抑制、血糖上昇抑制、痴呆予防、抗潰瘍、抗炎症、抗アレルギー、抗菌・抗虫歯、抗ウイルス、解毒、腸内フローラ改善、消臭等が報告されている（非特許文献１８）。
【００１６】
このうち、抗癌作用は非常に多く報告されており、抗変異作用、抗発癌プロモーション作用、抗腫瘍増殖抑制作用、抗浸潤・転移阻害作用、抗血管新生阻害作用がある。最近の報告では、ＥＧＣＧは白血病細胞のＤＮＡ合成を阻害しアポトーシスを誘導することが（非特許文献１９）、またＥＧＣＧが乳癌細胞株の増殖を抑制することが報告されている（非特許文献２０）。
【００１７】
さらには、ＥＧＣＧが正常細胞と比べて癌細胞の増殖を強く抑制するなどの報告がなされている（非特許文献２１）。
【００１８】
浸潤・転移に関しては、カテキン類がマトリゲルを用いた浸潤試験で高転移性細胞の浸潤を抑制することが、また、癌細胞のフィブロネクチンやラミニンへの接着をＥＧＣＧが阻害することが報告されている（非特許文献２２−２４）。
【００１９】
さらに、これらカテキン作用の分子レベルの解析が最近報告されてきている。たとえば、ＥＧＣＧは癌との関連が示唆されているＨｅｒ−２抗原高発現細胞の増殖を濃度依存的に抑制する。その作用機序はＨｅｒ−２のリン酸化抑制によるその下流シグナル伝達の阻害だと報告されている（非特許文献２５）。
【００２０】
また、腫瘍増殖と密接な関連がある血管新生をＥＧＣＧ等カテキンが阻害することが報告されている。そのメカニズムはカテキンが血管内皮細胞の増殖因子であるＶＥＧＦのレセプターＶＥＧＦＲ−１のリン酸化を抑制することにあると示されている。これはカテキンの抗酸化・抗ラジカル活性には依存しないと報告されている（非特許文献２６）。
【００２１】
同様に、他の増殖因子であるＰＤＧＦ−ＢＢによる血管平滑筋細胞でのＰＤＧＦ−Ｒベータのリン酸化をカテキン類が抑制することで、血管の肥厚を抑制することが報告されている（非特許文献２７）。
【００２２】
さらに、ＥＧＦ−２によるインビボでの血管新生並びに内皮細胞の増殖をＥＧＣＧが抑制することが報告されている（非特許文献２８）。ＥＧＣＧがアポトーシスを誘導するＦａｓ蛋白質と結合するという報告があるが（非特許文献２９）、上記ＥＧＣＧの作用がＦａｓを関与したものなのか明らかにされておらず、他にＥＧＣＧと相互作用する因子の存在が示唆されている。
【００２３】
カテキンには抗腫瘍効果以外にも、種々の生理作用が分子レベルで明らかになってきている。ＥＧＣＧは肝細胞でのグルコース産生を抑制し、かつインスリンレセプターとＩＲＳ−１のチロシンリン酸化を促進することで抗糖尿病的作用が報告されている（非特許文献３０）。
【００２４】
また、パーキンソン モデル マウスにおいてＥＧＣＧは強く神経保護作用を示す報告から（非特許文献３１）、多くの神経障害を抑制することが期待されている。アレルギーの要因である好塩基球でのＦｃイプシロンＲＩの発現をＥＧＣＧやそのメチル化体が抑制することを（非特許文献３２）、さらには軟骨においてＩＬ−１ベータによって誘導されるＣＯＸ−２やＮＯ合成酵素２の発現をＥＧＣＧが抑制することが報告されている（非特許文献３３）。
【００２５】
しかし、本発明者らが知る限り、ＥＧＣＧが６７ＬＲを介して細胞増殖抑制因子等として機能すること、また、６７ＬＲをターゲットとして細胞増殖抑制作用等を有する低分子化合物の薬物スクリーニングに利用可能なことに関しては、今まで一切報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２６】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，３４：１１２７６−１１２８７
【非特許文献２】Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９８，６９：２４４−２５１
【非特許文献３】Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，２００２，５９：１５７７−１５８３
【非特許文献４】Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９，１９：５５３５−５５４２
【非特許文献５】Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，１９９８，５２：１３７−１４５
【非特許文献６】Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７， ３：２２７−２３１
【非特許文献７】Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９６， ２：１７７７−１７８０
【非特許文献８】Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，１９９１，８３：２９−３６
【非特許文献９】Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，１９９８，５２：１３７−１４５
【非特許文献１０】Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，１９９９，８０：１１１５−１１２２
【非特許文献１１】Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０００，１５３：１６１−１６８
【非特許文献１２】Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９９，９０：４２５−４３１
【非特許文献１３】Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ，２００２，１６０：３０７−３１３
【非特許文献１４】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，２７４：１５９９６−１６００２
【非特許文献１５】ＥＭＢＯ Ｊ，２００１，２０：５８６３−５８７５
【非特許文献１６】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９９，１６３：３４３０−３４４０
【非特許文献１７】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，２５１：５６４−５６９
【非特許文献１８】Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９４７，３２：２２４９
【非特許文献１９】茶の機能、村松敬一郎ら編、学会出版センター、２００２
【非特許文献２０】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２００１，７：６４５−６５２
【非特許文献２１】Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００１，８２：３８７−３９８
【非特許文献２２】Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，２０００，３７６：３３８−３４６
【非特許文献２３】Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．，１９９５，９８：２７−３１
【非特許文献２４】Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．，１９９３，１７：５５９−５６４
【非特許文献２５】Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．，２００１，１７３：１５−２０
【非特許文献２６】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００２，６２：６５２−６５５
【非特許文献２７】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００２，６２：３８１−３８５
【非特許文献２８】ＦＡＳＥＢ Ｊ，２００２，１６：８９３−８９５
【非特許文献２９】Ｎａｔｕｒｅ，１９９９，３８９：３８１
【非特許文献３０】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，２００１，２８５：１１０２−１１０６
【非特許文献３１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００２，２７７：３４９３３−３４９４０
【非特許文献３２】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００２，２７７：３０５７４−３０５８０
【非特許文献３３】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，２００２，５０：５７２９−５７３４
【非特許文献３４】Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎ，２００２，３３：１０９７−２００２
【発明の概要】
【００２７】
本発明者は、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、６７ＬＲが細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転移活性阻害作用、神経保護作用、抗アレルギー作用、抗動脈硬化作用、及び／または、クロイツフェルトヤコブ病感染阻害作用を有する薬物のターゲットとして使用可能なことを見出し本発明を完成するに至った。
【００２８】
即ち本発明は下記の通りである。
１．６７ｋＤａラミニン・レセプターと結合するカテキン類であって、該６７ｋＤａラミニン・レセプターと結合することにより癌細胞の増殖または転移活性を阻害するカテキン類。
２．ガロイル基を有するカテキン類である前項１記載の化合物。
３．エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）及びその３−メチル置換体、並びにエピカテキンガレート（ＥＣＧ）から選ばれる少なくとも１である前項１または２記載の化合物。
４．癌細胞が６７ｋＤａラミニン・レセプターを強発現している細胞である前項１から３のいずれか１項に記載の化合物。
５．前項１から４のいずれか１項に記載の化合物を含む細胞増殖抑制剤。
６．前項１から４のいずれか１項に記載の化合物を含む血管新生阻害剤。
７．前項１から４のいずれか１項に記載の化合物を含む癌細胞の転移活性阻害剤。
８．前項１から４のいずれか１項に記載の化合物を含む抗癌剤。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】実施例１の表面プラズモン共鳴センサによる測定結果を示す図である。
【図２】実施例１の細胞増殖試験の結果を示す図である。
【図３】実施例１の細胞増殖試験の結果を示す図である。
【図４】実施例２のフローサイトメトリーによる解析結果を示す図である。
【図５】実施例３の細胞増殖試験の結果を示す図である。
【図６】実施例３の表面プラズモン共鳴センサによる測定結果を示す図である。
【図７】実施例４の表面プラズモン共鳴センサによる測定結果を示す図である。
【図８】実施例４の細胞増殖試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下本発明について詳細に説明する。
【００３１】
本発明は、６７ＬＲをターゲットとする薬物の新たなスクリーニング方法を提供するものである。
【００３２】
本発明の一つの態様としては、被験化合物と６７ＬＲとの結合の度合いを定性的または定量的に測定し、その測定結果より被験化合物が６７ＬＲに結合する場合にはその被験化合物が細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転移活性阻害作用、神経保護作用、抗アレルギー作用、抗動脈硬化作用、及び／または、クロイツフェルトヤコブ病感染阻害作用を有する薬物であると判断する工程を含む、細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転移活性阻害作用、神経保護作用、抗アレルギー作用、抗動脈硬化作用、及び／または、クロイツフェルトヤコブ病感染阻害作用を有する薬物のスクリーニング方法が挙げられる。
【００３３】
本発明で用いられる６７ＬＲはそれ自体公知の蛋白質であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２２９５登録ｃＤＮＡ配列をもとに、常法に従い本蛋白質をコードする配列を挟み込むようにして種々のライブラリーをテンプレートとしてＰＣＲを行うことで、６７ＬＲのｃＤＮＡを取得することが容易に可能である。また、ここで得られたｃＤＮＡを市販の種々のｖｅｃｔｏｒに蛋白発現が可能な形で挿入することで、容易に本蛋白質を発現する細胞株構築ならびに本蛋白質本体の取得が可能である。これ以外にいくつかのｃＤＮＡ取得と蛋白質発現の報告がある（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５：６３９４，Ｈ．Ｙｏｕら、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，１９９９，８０：１１１５−１１２２，Ｋ．Ｓａｔｏｈら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，３４：１１２７６−１１２８７，Ｔ．Ｈ．Ｌａｎｄｏｗｓｋｉら）。
【００３４】
なお、６７ＬＲは、遺伝子としては３７ｋＤａの４０Ｓリボソーム結合蛋白質であるが、膜に発現する場合には６７ｋＤａとなることが知られている。本発明においては、膜に発現する場合には６７ｋＤａとなる蛋白質であって、ラミニンと結合する接着性を有する蛋白質であれば、すべて本発明における６７ＬＲとして定義され、完全な蛋白質だけでなく、その部分ペプチドを用いることも可能である。また、６７ＬＲは、スクリーニングの手段に応じて、例えば、精製した蛋白質として、可溶型蛋白質として、担体に結合させた形態として、また、他の蛋白質との融合蛋白質として、適宜用いることができる。
【００３５】
本発明においては被験化合物と６７ＬＲとを結合させることにより、細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転移活性阻害作用、神経保護作用、抗アレルギー作用、抗動脈硬化作用、及び／または、クロイツフェルトヤコブ病感染阻害作用を有する薬物をスクリーニングする。このとき、被験化合物の形態としては、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、生物抽出物、植物抽出物、精製または粗精製蛋白質、ペプチド、非ペブチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物、遺伝子ライブラリー等、通常薬物のスクリーニングに使用される形態であれば良く、特に制限はされない。
【００３６】
被験化合物と６７ＬＲとの結合は、被験化合物の形態に応じて適した手段が選択されるが、例えば、被験化合物を６７ＬＲ発現細胞培養液中へ添加する方法等で行うことができる。
【００３７】
上記のようにして、被験化合物と６７ＬＲとの結合の度合いを測定するが、ここで用いられる測定方法は、定性的手段及び定量的手段のいずれも用いることが可能である。結合度合いを測定する手段の一例としては、後述の実施例で示すような表面プラズモン共鳴センサを用いる方法が挙げられる。
【００３８】
こうして結合度合いを測定した結果、被験化合物が６７ＬＲに実質的に結合する場合には、その被験化合物が、細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転移活性阻害作用、神経保護作用、抗アレルギー作用、抗動脈硬化作用、及び／または、クロイツフェルトヤコブ病感染阻害作用を有する薬物であると判定される。なかでも、本発明のスクリーニング方法は、細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、及び／または、癌細胞の転移活性阻害作用を有する薬物のスクリーニングに用いることが好適である。
【００３９】
後述の実施例に示すように、細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転移活性阻害作用、神経保護作用、抗アレルギー作用、抗動脈硬化作用、及び／または、クロイツフェルトヤコブ病感染阻害作用を有することが示唆されているガロイル基を有する化合物が、６７ＬＲに結合し、その細胞増殖を著しく抑制している。
【００４０】
このことから、ガロイル基を有する化合物は、６７ＬＲを介して細胞増殖因子として機能することが示唆され、さらに、ガロイル基を有する化合物と同様に６７ＬＲに結合する物質は、ガロイル基を有する化合物と同様の作用、すなわち、細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転移活性阻害作用、神経保護作用、抗アレルギー作用、抗動脈硬化作用、及び／または、クロイツフェルトヤコブ病感染阻害作用を有すると考えられる。
【００４１】
従って、本発明のスクリーニング方法において、６７ＬＲと結合する被験化合物は、細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転移活性阻害作用、神経保護作用、抗アレルギー作用、抗動脈硬化作用、及び、クロイツフェルトヤコブ病感染阻害作用を有する薬物であると判断できる。
【００４２】
なお、上記で挙げたガロイル基を有する化合物としては、エピガロカテキン ガレート及びその３−メチル置換体やエピカテキン ガレート等のガロイル基を有するカテキン類、ガロイル基を有するポリフェノール類、トリガロイルグルコース、ペンタガロイルグルコース、ストリクチニン、ピロガロール等が挙げられ、好適には、エピガロカテキン ガレートが挙げられる。
【００４３】
次に本発明のスクリーニング方法として、別の態様について説明する。
【００４４】
本発明における別の態様としては、６７ＬＲに加え、さらにガロイル基を有する化合物を用いた薬物のスクリーニング方法を提供する。すなわち、ガロイル基を有する化合物及び被験化合物と６７ＬＲとの結合の度合いを定性的または定量的に測定し、その測定結果より被験化合物と６７ＬＲとの結合の度合いが、ガロイル基を有する化合物と６７ＬＲとの結合の度合いを上回る場合には、その被験化合物がガロイル基を有する化合物が有する薬理学的作用と同一の作用を有する薬物であると判断する工程を含む、薬物のスクリーニング方法が挙げられる。
【００４５】
また、ガロイル基を有する化合物の６７ｋＤａラミニン・レセプターに対する結合と、被験化合物の６７ｋＤａラミニン・レセプターに対する結合とを競合させた結果、被験化合物の６７ｋＤａラミニン・レセプターへの結合するサイトと、ガロイル基を有する化合物の６７ｋＤａラミニン・レセプターへの結合するサイトとが、同一の場合には、その被験化合物は、ガロイル基を有する化合物が有する薬理学的作用と同一の作用を有する薬物であると判断する工程を含む、薬物のスクリーニング方法が挙げられる。
【００４６】
後述の実施例に示すように、６７ＬＲに対するモノクローナル抗体は、ガロイル基を有する化合物の６７ＬＲへの結合を阻害し、その結果ガロイル基を有する化合物の細胞増殖抑制効果を阻害している。逆に、ガロイル基を有する化合物は抗６７ＬＲ抗体の６７ＬＲへの結合を阻害している。即ち、ガロイル基を有する化合物の結合部位と抗体認識部位が重なっている。このことから、ガロイル基を有する化合物及び被験化合物を、６７ＬＲへの競合反応に供することにより、被験化合物がガロイル基を有する化合物と同一のサイトに結合する場合には、その被験化合物はガロイル基が有する化合物が有する作用と同一の作用を有すると考えられる。
【００４７】
本発明の別の態様である、ガロイル基を有する化合物を使用しないスクリーニング方法についての詳細な説明を前述したが、それらの記載は、ガロイル基を有する化合物を使用する本発明の態様の場合にも適用される。なお、ここで述べる本発明の態様においてスクリーニングに供されるガロイル基を有する化合物は、例えば、後述の実施例に示すようにＰＢＳ等のＢｕｆｆｅｒで適宜希釈して使用することが可能である。また、被験化合物とガロイル基を有する化合物とを、６７ＬＲ発現細胞培養液中へ添加することによりそれらの競合反応をおこさせる場合において、被験化合物とガロイル基を有する化合物の添加順序に特に制限はない。
【００４８】
上記のようにしてスクリーニングされた薬物は、細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転移活性阻害作用、神経保護作用、抗アレルギー作用、抗動脈硬化作用、及び／または、クロイツフェルトヤコブ病感染阻害作用により予防及び／または治療し得る疾患のための薬物として使用可能である。これらの疾患のうち、本発明において最も好適な疾患としては癌が挙げられる。
【００４９】
なお、本発明においては、一旦薬物がスクリーニングによって選択された後は、その薬物は通常の化学合成方法等により製造することが可能である。また、薬学的に許容され得る担体を配合することも可能である。すなわち、本発明においては、上記で示したスクリーニング方法により得られる薬物を、化学合成方法によって製造する工程、及び、薬学的に許容される担体を配合する工程を含む、医薬組成物の製造方法、並びに、当該製造方法により得られる医薬組成物もその要旨に含まれる。
【００５０】
医薬組成物として用いる場合において、薬学的に許容される担体としては、例えば、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定化剤などが挙げられ、これらと薬物とを適宜組合わせて製剤化して提供することが可能である。また、患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、経口的投与も可能であり、薬物に応じて、また、患者の体重や年齢、症状等により適宜選択することができる。投与量についても同様に、薬物に応じて、または、患者の体重や年齢、症状等に応じて、適当な投与量を選択することが可能である。なお、被験化合物がＤＮＡによりコードされ得るものであれば、当該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも可能である。
【００５１】
本発明においては、６７ＬＲと結合する化合物であって、ガロイル基を有する化合物が該６７ＬＲに結合するサイトと同一のサイトで結合する化合物も本発明のその要旨に含まれる。これらは、後述の実施例に示すように、６７ＬＲに対するモノクローナル抗体は、ガロイル基を有する化合物の６７ＬＲへの結合を阻害し、その結果ガロイル基を有する化合物の細胞増殖抑制効果を阻害していること；逆に、ガロイル基を有する化合物は抗６７ＬＲ抗体の６７ＬＲへの結合を阻害していること；即ち、ガロイル基を有する化合物の結合部位と抗体認識部位が重なっていることにより、十分裏付けられている。これらの化合物は、ガロイル基を有する化合物が有する作用と同一の作用を有することが考えられるため、細胞増殖抑制剤、血管新生阻害剤、癌細胞の転移活性阻害剤、すなわち、抗癌剤としての使用が可能である。
【実施例】
【００５２】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５３】
材料および方法
（１）．細胞および細胞培養
本実験に用いたヒト肺がん細胞株Ａ５４９（ＡＴＣＣ Ｎｕｍｂｅｒ：ＣＣＬ−１８５）は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏ Ｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）添加ＥＲＤＦ培地（極東製薬）で３７℃、水蒸気飽和した５％ＣＯ２条件下で継代、維持した。ＥＲＤＦ培地１Ｌ中に１．１２５ｇのＮａＨＣＯ３（和光純薬，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を加えた。細胞は対数増殖期で培養維持した。
【００５４】
ヒトバーキットリンパ腫細胞株ＤＮＤ３９は、５％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｎｉｓｓｕｉ，Ｊａｐａｎ）で３７℃、水蒸気飽和した５％ＣＯ２条件下で継代、維持した。ＲＰＭＩ−１６４０培地中には１００Ｕ／ｍＬペニシリン（Ｍｅｉｊｉ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｍｅｉｊｉ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、１２．５ｍＭ ＮａＨＣＯ３（和光純薬）、そして１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（和光純薬）を添加した。
【００５５】
（２）．緑茶カテキン
緑茶カテキンｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−０−ｇａｌｌａｔｅ（ＥＧＣＧ）、ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ−３−０−ｇａｌｌａｔｅ（ＥＣＧ）、ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ（ＥＧＣ）、ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ（ＥＣ）、ｃａｔｅｃｈｉｎ（Ｃ）、ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−（３−０−ｍｅｔｈｙｌ）−ｇａｌｌａｔｅ（ＥＧＣＧ３″Ｍｅ）は５ｍＭの濃度となるようにリン酸バッファー（ＰＢＳ）に溶解した。使用する際には適宜解凍して用いた。ＰＢＳは、超純水１Ｌに対し、ＮａＣｌ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．）８．０ｇ、ＫＣｌ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．）０．２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．）１．１５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．）０．２ｇを溶解し調製した。
【００５６】
ＣａｆｆｅｉｎｅおよびｑｕｅｒｃｅｔｉｎはＮａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．より購入し、前者はＰＢＳに後者はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．）に５ｍＭの濃度となるように懸濁し調製した。
【００５７】
（３）．試薬および機器
トリパンブルー（和光純薬）を１％の濃度となるようにＰＢＳに懸濁し、１２１℃、２０分オートクレーブ滅菌した。Ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ（ＡＴＲＡ）はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より購入しエタノールに溶解した。
【００５８】
ＲＮＡ抽出に用いたＴＲＩｚｏｌはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）より購入した。０．１％ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）水はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ＲＮＡ溶解に用いたＤＥＰＣ溶液はＤＥＰＣが終濃度０．１％となるように蒸留水に加えて２時間攪拌した後、オートクレーブして調製した。
【００５９】
Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０およびヒト胎盤由来ＲＮａｓｅインヒビターはＴａｋａｒａ（Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）より、Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ（ＭＭＬＶ）−逆転写酵素はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）より購入した。プライマー等のオリゴヌクレオチドはＢＩＯＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｊａｐａｎ）に合成を依頼した。Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはＦｅｒｍｅｎｔａｓ（Ｖｉｌｎｉｕｓ，Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）、Ｅｘ ＴａｑはＴａｋａｒａより購入した。Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）はＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００（Ｐａｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用した。アガロースはウルトラピュアアガロース（Ｓａｗａｄａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用した。
【００６０】
クローニングのベクターは、ｐＴＡＲＧＥＴＴＭ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いた。精製にはＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔまたは、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（ともにＱＩＡＧＥＮ）を用いた。
【００６１】
ＬＢ培地はＢａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）１０ｇおよびＢａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを超純水で１Ｌに溶解し、オートクレーブした。６０℃に冷ましてから、１５０ｍｇ／ｍＬのアンピシリン（アンピシリンナトリウム（和光純薬）を１５０ｍｇ／ｍＬとなるように超純水に溶解後、フィルター滅菌した）を１０００ｍＬ加えた。ＬＢプレートはＢａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ ２ｇ、Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １ｇ、ＮａＣｌ ２ｇ、Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ（ＤＩＦＣＯ）５ｇ加え、超純水２００ｍＬに溶解しオートクレーブした。６０℃に冷ましてから、１５０ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを２００ｍＬ加え、１０ｍＬ ｄｉｓｈ（Ｆａｌｃｏｎ）に１０ｍＬずつ分注した。Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂ−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）は和光純薬より購入し、０．１Ｍになるように調製した。
【００６２】
５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−ｂ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｘ−ｇａｌ）（和光純薬）を２０ｍｇ／ｍＬとなるようにＮ−Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（和光純薬）に溶解した。ＳＯＣは、Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ ３ｇ、Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ０．７５ｇ、ＮａＣｌ ０．０７８ｇ、ＫＣｌ ０．０２７ｇ、Ｈ２Ｏを全量が１４８．５ｍＬになるまで加えた。この溶液をオートクレーブした。これとは別にオートクレーブした２Ｍ Ｍｇ２＋液（１２．３２４ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０．１６５ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏを超純水に混ぜ５０ｍＬにした）を１．５ｍＬ加えた。この溶液１００ｍＬに１ｍＬの２Ｍグルコースを加えて作成した。
【００６３】
ＤＮＡシーケンサーはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用い、その際、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢｉｇＤｙｅＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＳＲ）はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより購入した。
【００６４】
遺伝子導入には、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｉｓｔｉｃｓ Ｇｍｂｈ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。
【００６５】
フローサイトメトリー解析用の抗ヒトＬａｍｉｎｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ抗体はＮＥＯＭＡＲＫＥＲＳ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）より購入した。ネガティブコントロール抗体のマウスＩｇＭ抗体はＺｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を用いた。Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）標識抗マウスＩｇＭヤギ抗体はＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）より購入した。
フローサイトメーターには、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用した。
【００６６】
（４）．ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成
あらかじめ１ｍＭ ＡＴＲＡで３７℃、２４時間処理した細胞をＰＢＳで洗浄した後、１ ｘ １０７ｃｅｌｌｓに対し１ｍＬのＴｒｉｚｏｌを加えて速やかに懸濁して完全に溶解させた。室温に５分間静置後、０．２ｍＬのクロロホルムを添加して激しく転倒攪拌した。室温に３分間静置後、１２０００ｘｇ、４℃で１５分間遠心した。遠心上清に０．５ｍＬの２−プロパノールを添加して激しく転倒攪拌し、室温に１０分間静置後、１２０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心した。この上清を除去し、１ｍＬの７５％エタノールで沈殿をリンスした。１２０００ｘｇ、４℃で５分間遠心後、上清のエタノールを出来る限り除去し、沈殿したトータルＲＮＡを２０ｍＬのＤＥＰＣ水に溶解させた。ｃＤＮＡ合成は以下に示すようにした。まず、１０ｍｇのトータルＲＮＡに０．５ｍｇ／ｍＬの（ｄＴ）２０プライマーを１ｍＬ加え、７０℃に１０分間置いた後、直ちに氷冷することでアニーリングを行った。次に、１０ｍＭ ｄＮＴＰを２ｍＬ、ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを０．１ｍＬ、ＭＭＬＶ−逆転写酵素に添付された５ｘバッファーを４ｍＬ加え、ＤＥＰＣ水で全量が２０ｍＬとなるようにした。この混合液を３７℃に１時間置きｃＤＮＡを合成し、９７℃に５分間置き酵素を失活させた。
【００６７】
（５）．６７ｋＤａ Ｌａｍｉｎｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（６７ＬＲ）発現ベクターの構築
ＤＮＤ３９細胞を１ｍＭ ＡＴＲＡで３７℃、２４時間処理した後、ＲＮＡ抽出を行いｃＤＮＡを合成した。Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ（Ｙｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８５：６３９４−６３９８（１９８８））を参考にしてプライマーを作成した［Ｈ−ＬａｍｉｎｉｎＲ−Ｆ；５’−ＡＴＧＴＣＣＧＧＡＧＣＣＣＴＴＧＡＴＧＴＣＣ−３’（配列番号１）、Ｈ−ＬａｍｉｎｉｎＲ−Ｒ；５’−ＴＴＡＡＧＡＣＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＴＴＧＣＴＣ−３’（配列番号２）］。プライマーは２０ｍＭに調整した。
【００６８】
合成したｃＤＮＡ １ｍＬ、Ｅｘ Ｔａｑ ０．１ｍＬ、１０ ｘ Ｔａｑバッファー２ｍＬ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ １．６ｍＬ、プライマーをおのおの０．５ｍＬ、ｄＨ２０ １４．３ｍＬを懸濁して、ＰＣＲを行った。条件は、初期変性９５℃で５分間、変性反応９４℃で３０秒間、アニーリング５８℃で３０秒間、伸長反応７２℃で３０秒間行い、変性反応、アニーリングおよび伸長反応を２５サイクル行った。１．２％アガロースゲルで電気泳動を行い、目的のバンドをＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。このシーケンスを行い、目的ものであることを確認した。Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ １０ ｘ ｂｕｆｆｅｒ １ｍＬ、ｐＴＡＲＧＥＴＴＭ Ｖｅｃｔｏｒ １ｍＬ、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ １ｍＬおよびＰＣＲ産物２．８２ｍＬ、ｄＨ２０ ４．１８ｍＬ加えて４℃に一晩置きライゲーションを行った。以下は、サブクローニングと同様の操作を行った。コロニーＰＣＲで正逆判定を行い、コロニーを白金耳で拾ってＬＢ培地に移し、３７℃、１５０ｒｐｍで一晩振とう培養した。これを集菌し、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔで精製した。このシーケンスを行い、６７ＬＲであることを確認した。
【００６９】
（６）．６７ＬＲの一過性発現系の構築
構築した６７ＬＲ発現ベクター（ｐＴＡＲＧＥＴ−ｈＬａｍｉｎｉｎＲ）をＦｕＧＥＮＥＴＭ６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを用いてＡ５４９細胞に導入した。詳細は以下に述べるとおりである。細胞を１ ｘ １０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地）に調整して播き込んだ。２４時間、３７℃に置き細胞を接着させた後、チューブに新たにＥＲＤＦ培地を取りＦｕＧＥＮＥＴＭ６（遺伝子量の３倍）を直接加え、穏やかに混ぜた。次にｐＴＡＲＧＥＴ−ｈＬａｍｉｎｉｎＲを加え穏やかに混ぜ、室温に３０分間置いた。これを、培地中に加え４８時間、３７℃に置いた。培地で洗浄後、新鮮な培地に変えた。
【００７０】
（７）．６７ＬＲ強制発現細胞に及ぼす各種成分の影響
６７ＬＲ一過性発現細胞に対して、各種成分を種々の濃度添加し、５％ＦＢＳ含有ＥＲＤＦ培地で３７℃、４８時間処理した。処理後、細胞数の計測およびトリパンブルー染色法による生存率の測定を行った。
また、ＥＧＣＧ前処理に関しては、終濃度１０μｇ／ｍＬ（１％ＦＢＳ含有ＥＲＤＦ培地）の抗６７ＬＲ抗体を３７℃、３０分間処理した後、ＥＧＣＧ処理を行い、抗体処理細胞に対する影響も検討した。ネガティブコントロールとしてマウスＩｇＭでも同様の処理を行った。
【００７１】
（８）．６７ＬＲ強制発現細胞に対する各種成分の結合性解析
各種成分５μＭと細胞との結合性を表面プラズモン共鳴センサＳＰＲ６７０（Ｎｉｐｐｏｎ Ｌａｓｅｒ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｌａｂ．，Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）により測定した。測定はまず、タンパク質等の標準的な固定化法を用いて細胞を金膜（Ｎｉｐｐｏｎ Ｌａｓｅｒ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｌａｂ．）に固定した。
【００７２】
１０ｍＭの４，４−Ｄｉｔｈｉｏ ｄｉｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ；ＤＤＡ（東京化成工業，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）エタノール溶液（１０ｍＬの９９％エタノール中に２．３８ｍｇのＤＤＡを溶解し、エタノールでさらに１／１００に希釈した）に金膜を浸して（金の面を上に）穏やかに室温で３０分間攪拌した。次に、エタノールで２回、金表面に水圧をかけないように洗浄し自己組織化膜（ＳＡ膜）を導入した。２５ｍｇ水溶性カルボジイミド；ＥＤＣ（和光純薬）を１ｍＬ超純水に、１５ｍｇ Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ；ＮＨＳ（和光純薬）を９ｍＬ １，４−Ｄｉｏｘａｎｅ（Ｎａｃａｌａｉｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．）にそれぞれ溶解した。それぞれの溶液を混合し、ＳＡ膜処理済の金膜を浸して、穏やかに室温で１０分間攪拌した。これに１０ｍＬの超純水を加え、さらに室温で５分間攪拌した。超純水で２回、金表面に水圧をかけないように洗浄し、乾燥（風乾）させてカートリッジにマウントした。細胞を３ ｘ １０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（フローバッファーであるＰＢＳ）に調整し、金膜上に２０μＬ滴下し３０分間室温において細胞を固定化した。その後、ＰＢＳで１、１０、２５、５０μＭに希釈した緑茶カテキンを注入し、表面プラズモン共鳴角度（Ａｎｇｌｅ）の変化を測定することで細胞への結合性をモニターした。
【００７３】
また、ＥＧＣＧと抗６７ＬＲ抗体との結合競合性試験は、終濃度１０μｇ／ｍＬ（１％ＦＢＳ含有ＥＲＤＦ培地）の抗６７ＬＲ抗体を３７℃、３０分間処理した後、細胞を金膜に固定化し表面プラズモン共鳴センサを用いて上記同様に行った。この際、ネガティブコントロールとしてマウスＩｇＭでも同様の処理を行い測定した。
【００７４】
（９）．フローサイトメトリー解析
６７ＬＲは細胞表面に発現していることが知られているので、細胞表面上に発現した６７ＬＲを抗ヒトＬａｍｉｎｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＬＲ）抗体を用いたフローサイトメトリー解析により検出した。細胞を回収し、１．５ｍＬエッペンドルフチューブで総量１００μＬの１％ＦＢＳ−ＰＢＳ中に細胞が１ ｘ １０６ｃｅｌｌｓ含まれるように調整し、１次抗体として抗ヒトＬＲ抗体を終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加した。４℃で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで一回洗浄した。次に、２次抗体としてＬＲ抗体のアイソタイプを認識する抗マウスＩｇＭ ＦＩＴＣ標識抗体を総量２５μＬの１％ＦＢＳ−ＰＢＳ中で終濃度１２．５μｇ／ｍＬとなるように添加した。４℃で３０分間インキュベートした後にＰＢＳで２回洗浄し、再び、ＰＢＳに再懸濁しフローサイトメーターにより解析を行った。ネガティブコントロールＩｇＭ抗体を同じ濃度（１０μｇ／ｍＬ）で反応させた。細胞表面６７ＬＲ発現量はＬＲの蛍光強度の中央値で示した。
【００７５】
また、ＥＧＣＧ処理が６７ＬＲ細胞表面発現に及ぼす影響を検討するために、１次抗体を作用させる前に、終濃度５０μＭとなるように調製したＥＧＣＧ添加１％ＦＢＳ−ＰＢＳで細胞を処理し、３７℃に３０分間置いた。これを、ＰＢＳで一度洗浄した。以降は上述の作用を１次抗体から行い、測定を行った。また、ＥＧＣＧを含まない１％ＦＢＳ−ＰＢＳでも処理を行い、対照群とした。
【００７６】
（１０）．統計計算
実験結果の統計処理には、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ，ｔ検定を用いた。
実施例１ ＥＧＣＧの細胞結合性および増殖活性に及ぼす６７ＬＲ遺伝子導入の影響
６７ＬＲ発現ベクター（ｐＴＡＲＧＥＴ−ｈＬａｍｉｎｉｎＲ）をＦｕＧＥＮＥＴＭ６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて以下の方法によりＡ５４９細胞に導入した。細胞を１ ｘ １０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地）に調整して播種した。２４時間後、チューブに新たにＥＲＤＦ培地を取りＦｕＧＥＮＥＴＭ６（遺伝子量の３倍）を直接加え、穏やかに混ぜた。次に種々の濃度でｐＴＡＲＧＥＴ−ｈＬａｍｉｎｉｎＲを加え穏やかに混ぜ、室温に３０分間置いた。これを、培地中に加え４８時間、３７℃に培養を継続した。この６７ＬＲ一過性発現細胞に対して、ＥＧＣＧを各種濃度で添加し、５％ＦＢＳ含有ＥＲＤＦ培地で３７℃、４８時間処理した。処理後、細胞数の計測およびトリパンブルー染色法による生存率の測定を行った。
【００７７】
結果、６７ＬＲを一過性に発現させた細胞においてＥＧＣＧ濃度依存的に細胞増殖抑制が認められた。また、細胞に導入させた６７ＬＲ遺伝子量に比例して細胞増殖の抑制も認められた。
【００７８】
６７ＬＲは細胞膜に存在する膜タンパク質であり、この遺伝子の発現ベクターを導入した細胞でＥＧＣＧの効果が増強されたことは、ＥＧＣＧの結合性が増大したためではないかと考えられる。そこで、この細胞に対するＥＧＣＧの結合性を表面プラズモン共鳴センサにより測定した。ＥＧＣＧは５μＭで用いた。
【００７９】
まず、空ベクターを導入したＡ５４９細胞では、若干のＡｎｇｌｅの変化（結合量）しか観察されなかったのに対し、６７ＬＲ発現ベクターを導入した細胞では、０．２５μｇ導入細胞ですでにＡｎｇｌｅの大幅な増大が認められ、さらに０．５μｇ導入した細胞ではよりいっそうの増大が認められた。このことにより、６７ＬＲ発現ベクター導入によりＥＧＣＧの細胞表面への結合性が増大することが示された。
【００８０】
実施例１の結果を図１、図２及び図３に示す。
【００８１】
実施例２ ６７ＬＲの細胞表面発現量の測定
６７ＬＲ発現ベクターを導入することで、ＥＧＣＧの細胞表面への結合性が増大することは示された。そこで、この結合性の増大が実際に細胞膜上に６７ＬＲ発現が増大したためであるかフローサイトメトリーを用いて検討した。
【００８２】
まず、細胞表面の６７ＬＲの発現量の測定を行った。コントロールのＡ５４９細胞で若干の発現が認められた。この細胞に空ベクター（０．５μｇ）を導入した細胞ではその発現量にほとんど影響は認められなかった。ところが、６７ＬＲ発現ベクター（０．５μｇ）を導入した細胞では、発現量が大幅に増えており、このことから、細胞表面に６７ＬＲが発現していることが明らかになった。
【００８３】
さらに、ＥＧＣＧがこの６７ＬＲを介して結合しているかを明白にするため、抗６７ＬＲ抗体を作用させる前にＥＧＣＧを作用させた。すると、コントロール細胞で認められていた６７ＬＲの発現が見かけ上、無くなっていた。また、この現象は、空ベクターを導入した細胞でも同様であった。さらに、６７ＬＲ導入細胞でも同様であった。このことは、ＥＧＣＧをあらかじめ細胞に作用させることで、細胞表面の６７ＬＲにＥＧＣＧが先に結合してしまい、抗６７ＬＲ抗体が細胞膜上の６７ＬＲに結合できなくなったため、みかけ上６７ＬＲの発現が検出されなかったと考えられる。
【００８４】
これらの結果から、６７ＬＲ発現ベクターを導入することで細胞表面の６７ＬＲ発現が増大することが明らかになり、ＥＧＣＧの結合性の増大が６７ＬＲの細胞膜発現増大であることが示された。また、この６７ＬＲを介してＥＧＣＧは細胞へ結合することが示唆された。すなわち、６７ＬＲがＥＧＣＧの受容体であると示された。
【００８５】
実施例２の結果を図４に示す。
【００８６】
実施例３ ＥＧＣＧの結合性および増殖抑制活性に及ぼす抗６７ＬＲ抗体の影響
ここまでで、６７ＬＲを介してＥＧＣＧが細胞へ結合し、増殖抑制活性を発現していることが示された。これをより明らかにするため、今度は６７ＬＲ強制発現細胞に抗６７ＬＲ抗体であらかじめ処理を行った上で、ＥＧＣＧの結合性および増殖抑制活性に影響が認められないか検討を行った。
【００８７】
まずは、結合性に及ぼす抗体の影響を表面プラズモン共鳴センサにより検討した。抗６７ＬＲ抗体を作用させると、Ａｎｇｌｅの変化量からＥＧＣＧの結合速度および結合量自体の減少が認められた。そうした効果は陰性コントロール抗体では見られなかった。
【００８８】
また、ＥＧＣＧのがん細胞増殖抑制に及ぼす抗体の影響も検討した。６７ＬＲ強制発現細胞ではわずか０．１μＭの濃度のＥＧＣＧでも増殖抑制活性が認められるが、ＥＧＣＧを作用させる前に抗体処理を行ったところ、その増殖抑制効果が消失した。この時、生存率には影響は認められなかった。この結果より、ＥＧＣＧの結合のみならず、増殖抑制活性も６７ＬＲへのＥＧＣＧの結合を介して行われることが示された。
【００８９】
実施例３の結果を図５及び図６に示す。
【００９０】
実施例４ 他の茶成分の結合性および増殖抑制活性に及ぼす６７ＬＲ発現の影響
ＥＧＣＧが６７ＬＲを介して細胞膜に結合すること、また、がん細胞増殖抑制活性を発現していることを示してきた。この６７ＬＲを介した効果がＥＧＣＧ特有のものか検討を行った。そこで、他の茶成分として、主要な緑茶カテキンとしてＥＣＧ、ＥＧＣ、ＥＣ、Ｃおよび強い抗アレルギー作用を持ち生体内で安定に存在すると報告があるＥＧＣＧ３″Ｍｅを用いた。カテキン同様に様々な生理機能を有しているｃａｆｆｅｉｎｅ、また、同様に多くの生理機能が報告されているフラバノール類の一種であるｑｕｅｒｃｅｔｉｎも検討した。
【００９１】
まず、６７ＬＲ強制発現細胞の増殖に及ぼす影響を検討した。これまでと同様に、０．５μｇのｐＴＡＲＧＥＴ−ｈＬａｍｉｎｉｎＲをＡ５４９細胞にリポフェクション法により導入し、４８時間、３７℃で培養後の細胞に対して各種の茶成分を終濃度５μＭとなるように作用させた。この状態で、さらに３７℃で４８時間培養後の細胞数および生存率の測定を行った。その結果、Ｃ、ＥＣ、ＥＧＣ、ｃａｆｆｅｉｎｅおよびｑｕｅｒｃｅｔｉｎでは遺伝子の導入の有無に関わらず、生存率および細胞数には影響は認められなかった。一方、ＥＧＣＧ同様にガロイル基を有しているＥＣＧおよびＥＧＣＧ３″Ｍｅでは、ＥＧＣＧ同様な増殖抑制効果が認められた。この結果から、ガロイル基を有するような成分は６７ＬＲ強制発現細胞で増殖抑制活性を発現することが示唆された。
【００９２】
また、６７ＬＲ強制発現細胞への各種茶成分の結合性を表面プラズモン共鳴バイオセンサにより測定した。Ａ５４９細胞に対してＣ、ＥＣ、ＥＧＣは結合性を示さず、これは６７ＬＲ強制発現細胞でも変化は認められなかった。また、ｃａｆｆｅｉｎｅおよびＱｕｅｒｃｅｔｉｎも細胞結合性を示さず、強制発現細胞でも変化は認められなかった。ＥＣＧおよびＥＧＣＧ″３ＭｅはいずれもＥＧＣＧほどではないものの、細胞結合性を示しており、６７ＬＲ強制発現細胞ではこの結合性が増大することが明らかになった。
【００９３】
実施例４の結果を図７及び図８に示す。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明によれば、６７ｋＤａラミニン・レセプターをターゲットとする薬物の新規なスクリーニング方法が提供可能である。
【００９５】
なお、本出願は、特願２００３−０９７６５２号を優先権主張して出願されたものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は６７ｋＤａラミニン・レセプターを用いた薬物のスクリーニング方法及びそれにより得られる薬物に関する。
【背景技術】
【０００２】
６７ｋＤａラミニン・レセプター（以下、「６７ＬＲ」と称することもある。）は、２９５個のアミノ酸をコードするｍＲＮＡから翻訳された３７ｋＤａ前駆体蛋白質が、細胞内で脂肪酸等によるアシル化重合反応を受けてホモ二量体またはヘテロ二量体化により６７ｋＤａとなった蛋白質であり、それがインテグリン類とともに細胞膜表面へ移行してはじめてラミニン・レセプターとして機能する（非特許文献１および２）。
【０００３】
また、３７ｋＤａ前駆体蛋白質は、リボソーム関連蛋白質ｐ４０として蛋白合成に関与していることが、さらには多剤耐性関与蛋白質（ＭＧｒ１−Ａｇ）として報告されていたものと同一であることが明らかにされている（非特許文献３）。このラミニン・レセプターの多くの癌細胞での高発現というデータにより、汎腫瘍特異的移植抗原としてのＴ細胞の免疫原として、腫瘍胎児抗原であると見なされている（非特許文献４）。ラミニン・レセプターは既に６７ＬＲ以外に１０数種類報告されているが、その中でも６７ＬＲの癌との関連が強く示唆されている。
【０００４】
６７ＬＲは多くの癌において癌細胞での検出の有無から、ヒト癌患者の悪性度を示す重要な予後因子として知られており（非特許文献５〜９）、動物モデル等では癌細胞の増殖、移動、浸潤、転移等に関与することが示唆されている。
【０００５】
たとえば、乳癌患者においては６７ＬＲポジティブの患者の生存率はネガティブな患者より有為に低いことが報告されている。６７ＬＲのリガンドであるラミニンの発現は予後には影響ないが、レセプター６７ＬＲの発現は予後に負の結果をもたらすことが示されている（非特許文献５）。
【０００６】
これらの知見を下に、６７ＬＲの発現を抑制することで抗腫瘍効果を示すことを期待して行われた実験が幾つか報告されている。６７ＬＲのアンチセンスＲＮＡを癌細胞株に導入して作製した６７ＬＲ低発現細胞株は、元の親株細胞よりもマウスのインビボにおいて有為に腫瘍増殖能の低下並びに転移能の低下が起こり、その結果マウス個体の生存率が改善することが報告されている（非特許文献９）。
【０００７】
さらには、低６７ＬＲ発現細胞株は親株よりも腫瘍血管新生の低下並びに血管新生促進因子であるＶＥＧＦの産生そのものも低下していることが報告されている（非特許文献１０）。同様に、６７ＬＲに対する抗体を用いた腫瘍転移実験においても、アンチセンス実験と同様な効果が見とめられている（非特許文献１１）。
【０００８】
非腫瘍関連においても、６７ＬＲの機能について幾つか報告がなされている。虚血動物モデルにおいて誘導される新生血管の増生が６７ＬＲと結合するラミニン由来ペプタイド（システイン−アスパラギン酸−プロリン−グリシン−チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン）や、ＥＧＦ由来ペプタイド（システイン−バリン−イソロイシン−グリシン−チロシン−セリン−グリシン−アスパラギン酸−アルギニン−システイン）によって抑制されることが報告されている（非特許文献１２）。
【０００９】
血管内皮細胞に対する剪断力によって誘導される動脈硬化との関与が指摘されているｅＮＯＳ発現とＮＯ産生が、６７ＬＲと結合するラミニン由来ペンタペプタイド（チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン）によって抑制することが報告されている（非特許文献１３）。
【００１０】
最近の報告では、６７ＬＲがクロイツフェルトヤコブ病の病因と考えられているプリオン蛋白質のレセプターとして働き、プリオンが結合してインタナリゼーションされることが、その結合とインタナリゼーションが膜ドメインを欠いたミュータント６７ＬＲの分泌によって阻害されることが報告されている（非特許文献１４）。
【００１１】
６７ＬＲはまた、Ｔ細胞のサブセットであるＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ４５ＲＡ−のメモリー細胞のＣＤ４＋ＣＤ８−またはＣＤ４−ＣＤ８＋のサブセット群で発現していることが報告され、６７ＬＲの免疫系への作用が示唆されている（非特許文献１５）。
【００１２】
６７ＬＲのｍＲＮＡ発現に関する報告も幾つか存在する。癌抑制因子であるｐ５３や抗癌因子であるＴＮＦ−アルファー、ＩＦＮ−ガンマーによってその発現が抑制されることが報告されている（非特許文献１６）。ただし、このような多用な機能に関与すると推定されている６７ＬＲに対する低分子化合物の報告はない。
【００１３】
一方、カテキン類のうち、エピガロカテキンガレート（以下、「ＥＧＣＧ」と称することもある。）は、茶のカテキンの約５０％を占める主用成分である。他に、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピカテキン（以下それぞれ、「ＥＧＣ］、「ＥＣＧ］、「ＥＣ」と称することもある）等が含まれる。
【００１４】
茶は古来より薬として用いられて来た古い歴史があり、近代よりその効能と成分の関係が解析されてきた。そのうちＥＧＣＧは１９４７年、Ａ．Ｂｒａｄｆｉｅｌｄらによって発見された成分である（非特許文献１７）。
【００１５】
ＥＧＣＧを含めて茶のカテキン類の生理作用としては、抗酸化、抗癌、血漿コレステロール上昇抑制、血圧上昇抑制、血小板凝集抑制、血糖上昇抑制、痴呆予防、抗潰瘍、抗炎症、抗アレルギー、抗菌・抗虫歯、抗ウイルス、解毒、腸内フローラ改善、消臭等が報告されている（非特許文献１８）。
【００１６】
このうち、抗癌作用は非常に多く報告されており、抗変異作用、抗発癌プロモーション作用、抗腫瘍増殖抑制作用、抗浸潤・転移阻害作用、抗血管新生阻害作用がある。最近の報告では、ＥＧＣＧは白血病細胞のＤＮＡ合成を阻害しアポトーシスを誘導することが（非特許文献１９）、またＥＧＣＧが乳癌細胞株の増殖を抑制することが報告されている（非特許文献２０）。
【００１７】
さらには、ＥＧＣＧが正常細胞と比べて癌細胞の増殖を強く抑制するなどの報告がなされている（非特許文献２１）。
【００１８】
浸潤・転移に関しては、カテキン類がマトリゲルを用いた浸潤試験で高転移性細胞の浸潤を抑制することが、また、癌細胞のフィブロネクチンやラミニンへの接着をＥＧＣＧが阻害することが報告されている（非特許文献２２−２４）。
【００１９】
さらに、これらカテキン作用の分子レベルの解析が最近報告されてきている。たとえば、ＥＧＣＧは癌との関連が示唆されているＨｅｒ−２抗原高発現細胞の増殖を濃度依存的に抑制する。その作用機序はＨｅｒ−２のリン酸化抑制によるその下流シグナル伝達の阻害だと報告されている（非特許文献２５）。
【００２０】
また、腫瘍増殖と密接な関連がある血管新生をＥＧＣＧ等カテキンが阻害することが報告されている。そのメカニズムはカテキンが血管内皮細胞の増殖因子であるＶＥＧＦのレセプターＶＥＧＦＲ−１のリン酸化を抑制することにあると示されている。これはカテキンの抗酸化・抗ラジカル活性には依存しないと報告されている（非特許文献２６）。
【００２１】
同様に、他の増殖因子であるＰＤＧＦ−ＢＢによる血管平滑筋細胞でのＰＤＧＦ−Ｒベータのリン酸化をカテキン類が抑制することで、血管の肥厚を抑制することが報告されている（非特許文献２７）。
【００２２】
さらに、ＥＧＦ−２によるインビボでの血管新生並びに内皮細胞の増殖をＥＧＣＧが抑制することが報告されている（非特許文献２８）。ＥＧＣＧがアポトーシスを誘導するＦａｓ蛋白質と結合するという報告があるが（非特許文献２９）、上記ＥＧＣＧの作用がＦａｓを関与したものなのか明らかにされておらず、他にＥＧＣＧと相互作用する因子の存在が示唆されている。
【００２３】
カテキンには抗腫瘍効果以外にも、種々の生理作用が分子レベルで明らかになってきている。ＥＧＣＧは肝細胞でのグルコース産生を抑制し、かつインスリンレセプターとＩＲＳ−１のチロシンリン酸化を促進することで抗糖尿病的作用が報告されている（非特許文献３０）。
【００２４】
また、パーキンソン モデル マウスにおいてＥＧＣＧは強く神経保護作用を示す報告から（非特許文献３１）、多くの神経障害を抑制することが期待されている。アレルギーの要因である好塩基球でのＦｃイプシロンＲＩの発現をＥＧＣＧやそのメチル化体が抑制することを（非特許文献３２）、さらには軟骨においてＩＬ−１ベータによって誘導されるＣＯＸ−２やＮＯ合成酵素２の発現をＥＧＣＧが抑制することが報告されている（非特許文献３３）。
【００２５】
しかし、本発明者らが知る限り、ＥＧＣＧが６７ＬＲを介して細胞増殖抑制因子等として機能すること、また、６７ＬＲをターゲットとして細胞増殖抑制作用等を有する低分子化合物の薬物スクリーニングに利用可能なことに関しては、今まで一切報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２６】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，３４：１１２７６−１１２８７
【非特許文献２】Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９８，６９：２４４−２５１
【非特許文献３】Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，２００２，５９：１５７７−１５８３
【非特許文献４】Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９，１９：５５３５−５５４２
【非特許文献５】Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，１９９８，５２：１３７−１４５
【非特許文献６】Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７， ３：２２７−２３１
【非特許文献７】Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９６， ２：１７７７−１７８０
【非特許文献８】Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，１９９１，８３：２９−３６
【非特許文献９】Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，１９９８，５２：１３７−１４５
【非特許文献１０】Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，１９９９，８０：１１１５−１１２２
【非特許文献１１】Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０００，１５３：１６１−１６８
【非特許文献１２】Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９９，９０：４２５−４３１
【非特許文献１３】Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ，２００２，１６０：３０７−３１３
【非特許文献１４】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，２７４：１５９９６−１６００２
【非特許文献１５】ＥＭＢＯ Ｊ，２００１，２０：５８６３−５８７５
【非特許文献１６】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９９，１６３：３４３０−３４４０
【非特許文献１７】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，２５１：５６４−５６９
【非特許文献１８】Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９４７，３２：２２４９
【非特許文献１９】茶の機能、村松敬一郎ら編、学会出版センター、２００２
【非特許文献２０】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２００１，７：６４５−６５２
【非特許文献２１】Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００１，８２：３８７−３９８
【非特許文献２２】Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，２０００，３７６：３３８−３４６
【非特許文献２３】Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．，１９９５，９８：２７−３１
【非特許文献２４】Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．，１９９３，１７：５５９−５６４
【非特許文献２５】Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．，２００１，１７３：１５−２０
【非特許文献２６】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００２，６２：６５２−６５５
【非特許文献２７】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００２，６２：３８１−３８５
【非特許文献２８】ＦＡＳＥＢ Ｊ，２００２，１６：８９３−８９５
【非特許文献２９】Ｎａｔｕｒｅ，１９９９，３８９：３８１
【非特許文献３０】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，２００１，２８５：１１０２−１１０６
【非特許文献３１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００２，２７７：３４９３３−３４９４０
【非特許文献３２】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００２，２７７：３０５７４−３０５８０
【非特許文献３３】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，２００２，５０：５７２９−５７３４
【非特許文献３４】Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎ，２００２，３３：１０９７−２００２
【発明の概要】
【００２７】
本発明者は、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、６７ＬＲが細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転移活性阻害作用、神経保護作用、抗アレルギー作用、抗動脈硬化作用、及び／または、クロイツフェルトヤコブ病感染阻害作用を有する薬物のターゲットとして使用可能なことを見出し本発明を完成するに至った。
【００２８】
即ち本発明は下記の通りである。
１．６７ｋＤａラミニン・レセプターと結合するカテキン類であって、該６７ｋＤａラミニン・レセプターと結合することにより癌細胞の増殖または転移活性を阻害するカテキン類。
２．ガロイル基を有するカテキン類である前項１記載の化合物。
３．エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）及びその３−メチル置換体、並びにエピカテキンガレート（ＥＣＧ）から選ばれる少なくとも１である前項１または２記載の化合物。
４．癌細胞が６７ｋＤａラミニン・レセプターを強発現している細胞である前項１から３のいずれか１項に記載の化合物。
５．前項１から４のいずれか１項に記載の化合物を含む細胞増殖抑制剤。
６．前項１から４のいずれか１項に記載の化合物を含む血管新生阻害剤。
７．前項１から４のいずれか１項に記載の化合物を含む癌細胞の転移活性阻害剤。
８．前項１から４のいずれか１項に記載の化合物を含む抗癌剤。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】実施例１の表面プラズモン共鳴センサによる測定結果を示す図である。
【図２】実施例１の細胞増殖試験の結果を示す図である。
【図３】実施例１の細胞増殖試験の結果を示す図である。
【図４】実施例２のフローサイトメトリーによる解析結果を示す図である。
【図５】実施例３の細胞増殖試験の結果を示す図である。
【図６】実施例３の表面プラズモン共鳴センサによる測定結果を示す図である。
【図７】実施例４の表面プラズモン共鳴センサによる測定結果を示す図である。
【図８】実施例４の細胞増殖試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下本発明について詳細に説明する。
【００３１】
本発明は、６７ＬＲをターゲットとする薬物の新たなスクリーニング方法を提供するものである。
【００３２】
本発明の一つの態様としては、被験化合物と６７ＬＲとの結合の度合いを定性的または定量的に測定し、その測定結果より被験化合物が６７ＬＲに結合する場合にはその被験化合物が細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転移活性阻害作用、神経保護作用、抗アレルギー作用、抗動脈硬化作用、及び／または、クロイツフェルトヤコブ病感染阻害作用を有する薬物であると判断する工程を含む、細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転移活性阻害作用、神経保護作用、抗アレルギー作用、抗動脈硬化作用、及び／または、クロイツフェルトヤコブ病感染阻害作用を有する薬物のスクリーニング方法が挙げられる。
【００３３】
本発明で用いられる６７ＬＲはそれ自体公知の蛋白質であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２２９５登録ｃＤＮＡ配列をもとに、常法に従い本蛋白質をコードする配列を挟み込むようにして種々のライブラリーをテンプレートとしてＰＣＲを行うことで、６７ＬＲのｃＤＮＡを取得することが容易に可能である。また、ここで得られたｃＤＮＡを市販の種々のｖｅｃｔｏｒに蛋白発現が可能な形で挿入することで、容易に本蛋白質を発現する細胞株構築ならびに本蛋白質本体の取得が可能である。これ以外にいくつかのｃＤＮＡ取得と蛋白質発現の報告がある（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５：６３９４，Ｈ．Ｙｏｕら、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，１９９９，８０：１１１５−１１２２，Ｋ．Ｓａｔｏｈら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，３４：１１２７６−１１２８７，Ｔ．Ｈ．Ｌａｎｄｏｗｓｋｉら）。
【００３４】
なお、６７ＬＲは、遺伝子としては３７ｋＤａの４０Ｓリボソーム結合蛋白質であるが、膜に発現する場合には６７ｋＤａとなることが知られている。本発明においては、膜に発現する場合には６７ｋＤａとなる蛋白質であって、ラミニンと結合する接着性を有する蛋白質であれば、すべて本発明における６７ＬＲとして定義され、完全な蛋白質だけでなく、その部分ペプチドを用いることも可能である。また、６７ＬＲは、スクリーニングの手段に応じて、例えば、精製した蛋白質として、可溶型蛋白質として、担体に結合させた形態として、また、他の蛋白質との融合蛋白質として、適宜用いることができる。
【００３５】
本発明においては被験化合物と６７ＬＲとを結合させることにより、細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転移活性阻害作用、神経保護作用、抗アレルギー作用、抗動脈硬化作用、及び／または、クロイツフェルトヤコブ病感染阻害作用を有する薬物をスクリーニングする。このとき、被験化合物の形態としては、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、生物抽出物、植物抽出物、精製または粗精製蛋白質、ペプチド、非ペブチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物、遺伝子ライブラリー等、通常薬物のスクリーニングに使用される形態であれば良く、特に制限はされない。
【００３６】
被験化合物と６７ＬＲとの結合は、被験化合物の形態に応じて適した手段が選択されるが、例えば、被験化合物を６７ＬＲ発現細胞培養液中へ添加する方法等で行うことができる。
【００３７】
上記のようにして、被験化合物と６７ＬＲとの結合の度合いを測定するが、ここで用いられる測定方法は、定性的手段及び定量的手段のいずれも用いることが可能である。結合度合いを測定する手段の一例としては、後述の実施例で示すような表面プラズモン共鳴センサを用いる方法が挙げられる。
【００３８】
こうして結合度合いを測定した結果、被験化合物が６７ＬＲに実質的に結合する場合には、その被験化合物が、細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転移活性阻害作用、神経保護作用、抗アレルギー作用、抗動脈硬化作用、及び／または、クロイツフェルトヤコブ病感染阻害作用を有する薬物であると判定される。なかでも、本発明のスクリーニング方法は、細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、及び／または、癌細胞の転移活性阻害作用を有する薬物のスクリーニングに用いることが好適である。
【００３９】
後述の実施例に示すように、細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転移活性阻害作用、神経保護作用、抗アレルギー作用、抗動脈硬化作用、及び／または、クロイツフェルトヤコブ病感染阻害作用を有することが示唆されているガロイル基を有する化合物が、６７ＬＲに結合し、その細胞増殖を著しく抑制している。
【００４０】
このことから、ガロイル基を有する化合物は、６７ＬＲを介して細胞増殖因子として機能することが示唆され、さらに、ガロイル基を有する化合物と同様に６７ＬＲに結合する物質は、ガロイル基を有する化合物と同様の作用、すなわち、細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転移活性阻害作用、神経保護作用、抗アレルギー作用、抗動脈硬化作用、及び／または、クロイツフェルトヤコブ病感染阻害作用を有すると考えられる。
【００４１】
従って、本発明のスクリーニング方法において、６７ＬＲと結合する被験化合物は、細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転移活性阻害作用、神経保護作用、抗アレルギー作用、抗動脈硬化作用、及び、クロイツフェルトヤコブ病感染阻害作用を有する薬物であると判断できる。
【００４２】
なお、上記で挙げたガロイル基を有する化合物としては、エピガロカテキン ガレート及びその３−メチル置換体やエピカテキン ガレート等のガロイル基を有するカテキン類、ガロイル基を有するポリフェノール類、トリガロイルグルコース、ペンタガロイルグルコース、ストリクチニン、ピロガロール等が挙げられ、好適には、エピガロカテキン ガレートが挙げられる。
【００４３】
次に本発明のスクリーニング方法として、別の態様について説明する。
【００４４】
本発明における別の態様としては、６７ＬＲに加え、さらにガロイル基を有する化合物を用いた薬物のスクリーニング方法を提供する。すなわち、ガロイル基を有する化合物及び被験化合物と６７ＬＲとの結合の度合いを定性的または定量的に測定し、その測定結果より被験化合物と６７ＬＲとの結合の度合いが、ガロイル基を有する化合物と６７ＬＲとの結合の度合いを上回る場合には、その被験化合物がガロイル基を有する化合物が有する薬理学的作用と同一の作用を有する薬物であると判断する工程を含む、薬物のスクリーニング方法が挙げられる。
【００４５】
また、ガロイル基を有する化合物の６７ｋＤａラミニン・レセプターに対する結合と、被験化合物の６７ｋＤａラミニン・レセプターに対する結合とを競合させた結果、被験化合物の６７ｋＤａラミニン・レセプターへの結合するサイトと、ガロイル基を有する化合物の６７ｋＤａラミニン・レセプターへの結合するサイトとが、同一の場合には、その被験化合物は、ガロイル基を有する化合物が有する薬理学的作用と同一の作用を有する薬物であると判断する工程を含む、薬物のスクリーニング方法が挙げられる。
【００４６】
後述の実施例に示すように、６７ＬＲに対するモノクローナル抗体は、ガロイル基を有する化合物の６７ＬＲへの結合を阻害し、その結果ガロイル基を有する化合物の細胞増殖抑制効果を阻害している。逆に、ガロイル基を有する化合物は抗６７ＬＲ抗体の６７ＬＲへの結合を阻害している。即ち、ガロイル基を有する化合物の結合部位と抗体認識部位が重なっている。このことから、ガロイル基を有する化合物及び被験化合物を、６７ＬＲへの競合反応に供することにより、被験化合物がガロイル基を有する化合物と同一のサイトに結合する場合には、その被験化合物はガロイル基が有する化合物が有する作用と同一の作用を有すると考えられる。
【００４７】
本発明の別の態様である、ガロイル基を有する化合物を使用しないスクリーニング方法についての詳細な説明を前述したが、それらの記載は、ガロイル基を有する化合物を使用する本発明の態様の場合にも適用される。なお、ここで述べる本発明の態様においてスクリーニングに供されるガロイル基を有する化合物は、例えば、後述の実施例に示すようにＰＢＳ等のＢｕｆｆｅｒで適宜希釈して使用することが可能である。また、被験化合物とガロイル基を有する化合物とを、６７ＬＲ発現細胞培養液中へ添加することによりそれらの競合反応をおこさせる場合において、被験化合物とガロイル基を有する化合物の添加順序に特に制限はない。
【００４８】
上記のようにしてスクリーニングされた薬物は、細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転移活性阻害作用、神経保護作用、抗アレルギー作用、抗動脈硬化作用、及び／または、クロイツフェルトヤコブ病感染阻害作用により予防及び／または治療し得る疾患のための薬物として使用可能である。これらの疾患のうち、本発明において最も好適な疾患としては癌が挙げられる。
【００４９】
なお、本発明においては、一旦薬物がスクリーニングによって選択された後は、その薬物は通常の化学合成方法等により製造することが可能である。また、薬学的に許容され得る担体を配合することも可能である。すなわち、本発明においては、上記で示したスクリーニング方法により得られる薬物を、化学合成方法によって製造する工程、及び、薬学的に許容される担体を配合する工程を含む、医薬組成物の製造方法、並びに、当該製造方法により得られる医薬組成物もその要旨に含まれる。
【００５０】
医薬組成物として用いる場合において、薬学的に許容される担体としては、例えば、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定化剤などが挙げられ、これらと薬物とを適宜組合わせて製剤化して提供することが可能である。また、患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、経口的投与も可能であり、薬物に応じて、また、患者の体重や年齢、症状等により適宜選択することができる。投与量についても同様に、薬物に応じて、または、患者の体重や年齢、症状等に応じて、適当な投与量を選択することが可能である。なお、被験化合物がＤＮＡによりコードされ得るものであれば、当該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも可能である。
【００５１】
本発明においては、６７ＬＲと結合する化合物であって、ガロイル基を有する化合物が該６７ＬＲに結合するサイトと同一のサイトで結合する化合物も本発明のその要旨に含まれる。これらは、後述の実施例に示すように、６７ＬＲに対するモノクローナル抗体は、ガロイル基を有する化合物の６７ＬＲへの結合を阻害し、その結果ガロイル基を有する化合物の細胞増殖抑制効果を阻害していること；逆に、ガロイル基を有する化合物は抗６７ＬＲ抗体の６７ＬＲへの結合を阻害していること；即ち、ガロイル基を有する化合物の結合部位と抗体認識部位が重なっていることにより、十分裏付けられている。これらの化合物は、ガロイル基を有する化合物が有する作用と同一の作用を有することが考えられるため、細胞増殖抑制剤、血管新生阻害剤、癌細胞の転移活性阻害剤、すなわち、抗癌剤としての使用が可能である。
【実施例】
【００５２】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５３】
材料および方法
（１）．細胞および細胞培養
本実験に用いたヒト肺がん細胞株Ａ５４９（ＡＴＣＣ Ｎｕｍｂｅｒ：ＣＣＬ−１８５）は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏ Ｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）添加ＥＲＤＦ培地（極東製薬）で３７℃、水蒸気飽和した５％ＣＯ２条件下で継代、維持した。ＥＲＤＦ培地１Ｌ中に１．１２５ｇのＮａＨＣＯ３（和光純薬，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を加えた。細胞は対数増殖期で培養維持した。
【００５４】
ヒトバーキットリンパ腫細胞株ＤＮＤ３９は、５％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｎｉｓｓｕｉ，Ｊａｐａｎ）で３７℃、水蒸気飽和した５％ＣＯ２条件下で継代、維持した。ＲＰＭＩ−１６４０培地中には１００Ｕ／ｍＬペニシリン（Ｍｅｉｊｉ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｍｅｉｊｉ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、１２．５ｍＭ ＮａＨＣＯ３（和光純薬）、そして１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（和光純薬）を添加した。
【００５５】
（２）．緑茶カテキン
緑茶カテキンｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−０−ｇａｌｌａｔｅ（ＥＧＣＧ）、ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ−３−０−ｇａｌｌａｔｅ（ＥＣＧ）、ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ（ＥＧＣ）、ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ（ＥＣ）、ｃａｔｅｃｈｉｎ（Ｃ）、ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−（３−０−ｍｅｔｈｙｌ）−ｇａｌｌａｔｅ（ＥＧＣＧ３″Ｍｅ）は５ｍＭの濃度となるようにリン酸バッファー（ＰＢＳ）に溶解した。使用する際には適宜解凍して用いた。ＰＢＳは、超純水１Ｌに対し、ＮａＣｌ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．）８．０ｇ、ＫＣｌ（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．）０．２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．）１．１５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．）０．２ｇを溶解し調製した。
【００５６】
ＣａｆｆｅｉｎｅおよびｑｕｅｒｃｅｔｉｎはＮａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．より購入し、前者はＰＢＳに後者はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．）に５ｍＭの濃度となるように懸濁し調製した。
【００５７】
（３）．試薬および機器
トリパンブルー（和光純薬）を１％の濃度となるようにＰＢＳに懸濁し、１２１℃、２０分オートクレーブ滅菌した。Ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ（ＡＴＲＡ）はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より購入しエタノールに溶解した。
【００５８】
ＲＮＡ抽出に用いたＴＲＩｚｏｌはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）より購入した。０．１％ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）水はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ＲＮＡ溶解に用いたＤＥＰＣ溶液はＤＥＰＣが終濃度０．１％となるように蒸留水に加えて２時間攪拌した後、オートクレーブして調製した。
【００５９】
Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０およびヒト胎盤由来ＲＮａｓｅインヒビターはＴａｋａｒａ（Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）より、Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ（ＭＭＬＶ）−逆転写酵素はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）より購入した。プライマー等のオリゴヌクレオチドはＢＩＯＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｊａｐａｎ）に合成を依頼した。Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはＦｅｒｍｅｎｔａｓ（Ｖｉｌｎｉｕｓ，Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）、Ｅｘ ＴａｑはＴａｋａｒａより購入した。Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）はＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００（Ｐａｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用した。アガロースはウルトラピュアアガロース（Ｓａｗａｄａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用した。
【００６０】
クローニングのベクターは、ｐＴＡＲＧＥＴＴＭ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いた。精製にはＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔまたは、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（ともにＱＩＡＧＥＮ）を用いた。
【００６１】
ＬＢ培地はＢａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）１０ｇおよびＢａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣＯ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）５ｇ、ＮａＣｌ ５ｇを超純水で１Ｌに溶解し、オートクレーブした。６０℃に冷ましてから、１５０ｍｇ／ｍＬのアンピシリン（アンピシリンナトリウム（和光純薬）を１５０ｍｇ／ｍＬとなるように超純水に溶解後、フィルター滅菌した）を１０００ｍＬ加えた。ＬＢプレートはＢａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ ２ｇ、Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １ｇ、ＮａＣｌ ２ｇ、Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ（ＤＩＦＣＯ）５ｇ加え、超純水２００ｍＬに溶解しオートクレーブした。６０℃に冷ましてから、１５０ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを２００ｍＬ加え、１０ｍＬ ｄｉｓｈ（Ｆａｌｃｏｎ）に１０ｍＬずつ分注した。Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂ−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）は和光純薬より購入し、０．１Ｍになるように調製した。
【００６２】
５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−ｂ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｘ−ｇａｌ）（和光純薬）を２０ｍｇ／ｍＬとなるようにＮ−Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（和光純薬）に溶解した。ＳＯＣは、Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ ３ｇ、Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ０．７５ｇ、ＮａＣｌ ０．０７８ｇ、ＫＣｌ ０．０２７ｇ、Ｈ２Ｏを全量が１４８．５ｍＬになるまで加えた。この溶液をオートクレーブした。これとは別にオートクレーブした２Ｍ Ｍｇ２＋液（１２．３２４ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０．１６５ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏを超純水に混ぜ５０ｍＬにした）を１．５ｍＬ加えた。この溶液１００ｍＬに１ｍＬの２Ｍグルコースを加えて作成した。
【００６３】
ＤＮＡシーケンサーはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用い、その際、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢｉｇＤｙｅＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＳＲ）はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより購入した。
【００６４】
遺伝子導入には、ＦｕＧＥＮＥＴＭ６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｉｓｔｉｃｓ Ｇｍｂｈ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。
【００６５】
フローサイトメトリー解析用の抗ヒトＬａｍｉｎｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ抗体はＮＥＯＭＡＲＫＥＲＳ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）より購入した。ネガティブコントロール抗体のマウスＩｇＭ抗体はＺｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を用いた。Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）標識抗マウスＩｇＭヤギ抗体はＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）より購入した。
フローサイトメーターには、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用した。
【００６６】
（４）．ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成
あらかじめ１ｍＭ ＡＴＲＡで３７℃、２４時間処理した細胞をＰＢＳで洗浄した後、１ ｘ １０７ｃｅｌｌｓに対し１ｍＬのＴｒｉｚｏｌを加えて速やかに懸濁して完全に溶解させた。室温に５分間静置後、０．２ｍＬのクロロホルムを添加して激しく転倒攪拌した。室温に３分間静置後、１２０００ｘｇ、４℃で１５分間遠心した。遠心上清に０．５ｍＬの２−プロパノールを添加して激しく転倒攪拌し、室温に１０分間静置後、１２０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心した。この上清を除去し、１ｍＬの７５％エタノールで沈殿をリンスした。１２０００ｘｇ、４℃で５分間遠心後、上清のエタノールを出来る限り除去し、沈殿したトータルＲＮＡを２０ｍＬのＤＥＰＣ水に溶解させた。ｃＤＮＡ合成は以下に示すようにした。まず、１０ｍｇのトータルＲＮＡに０．５ｍｇ／ｍＬの（ｄＴ）２０プライマーを１ｍＬ加え、７０℃に１０分間置いた後、直ちに氷冷することでアニーリングを行った。次に、１０ｍＭ ｄＮＴＰを２ｍＬ、ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを０．１ｍＬ、ＭＭＬＶ−逆転写酵素に添付された５ｘバッファーを４ｍＬ加え、ＤＥＰＣ水で全量が２０ｍＬとなるようにした。この混合液を３７℃に１時間置きｃＤＮＡを合成し、９７℃に５分間置き酵素を失活させた。
【００６７】
（５）．６７ｋＤａ Ｌａｍｉｎｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（６７ＬＲ）発現ベクターの構築
ＤＮＤ３９細胞を１ｍＭ ＡＴＲＡで３７℃、２４時間処理した後、ＲＮＡ抽出を行いｃＤＮＡを合成した。Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ（Ｙｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８５：６３９４−６３９８（１９８８））を参考にしてプライマーを作成した［Ｈ−ＬａｍｉｎｉｎＲ−Ｆ；５’−ＡＴＧＴＣＣＧＧＡＧＣＣＣＴＴＧＡＴＧＴＣＣ−３’（配列番号１）、Ｈ−ＬａｍｉｎｉｎＲ−Ｒ；５’−ＴＴＡＡＧＡＣＣＡＧＴＣＡＧＴＧＧＴＴＧＣＴＣ−３’（配列番号２）］。プライマーは２０ｍＭに調整した。
【００６８】
合成したｃＤＮＡ １ｍＬ、Ｅｘ Ｔａｑ ０．１ｍＬ、１０ ｘ Ｔａｑバッファー２ｍＬ、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ １．６ｍＬ、プライマーをおのおの０．５ｍＬ、ｄＨ２０ １４．３ｍＬを懸濁して、ＰＣＲを行った。条件は、初期変性９５℃で５分間、変性反応９４℃で３０秒間、アニーリング５８℃で３０秒間、伸長反応７２℃で３０秒間行い、変性反応、アニーリングおよび伸長反応を２５サイクル行った。１．２％アガロースゲルで電気泳動を行い、目的のバンドをＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。このシーケンスを行い、目的ものであることを確認した。Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ １０ ｘ ｂｕｆｆｅｒ １ｍＬ、ｐＴＡＲＧＥＴＴＭ Ｖｅｃｔｏｒ １ｍＬ、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ １ｍＬおよびＰＣＲ産物２．８２ｍＬ、ｄＨ２０ ４．１８ｍＬ加えて４℃に一晩置きライゲーションを行った。以下は、サブクローニングと同様の操作を行った。コロニーＰＣＲで正逆判定を行い、コロニーを白金耳で拾ってＬＢ培地に移し、３７℃、１５０ｒｐｍで一晩振とう培養した。これを集菌し、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔで精製した。このシーケンスを行い、６７ＬＲであることを確認した。
【００６９】
（６）．６７ＬＲの一過性発現系の構築
構築した６７ＬＲ発現ベクター（ｐＴＡＲＧＥＴ−ｈＬａｍｉｎｉｎＲ）をＦｕＧＥＮＥＴＭ６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを用いてＡ５４９細胞に導入した。詳細は以下に述べるとおりである。細胞を１ ｘ １０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地）に調整して播き込んだ。２４時間、３７℃に置き細胞を接着させた後、チューブに新たにＥＲＤＦ培地を取りＦｕＧＥＮＥＴＭ６（遺伝子量の３倍）を直接加え、穏やかに混ぜた。次にｐＴＡＲＧＥＴ−ｈＬａｍｉｎｉｎＲを加え穏やかに混ぜ、室温に３０分間置いた。これを、培地中に加え４８時間、３７℃に置いた。培地で洗浄後、新鮮な培地に変えた。
【００７０】
（７）．６７ＬＲ強制発現細胞に及ぼす各種成分の影響
６７ＬＲ一過性発現細胞に対して、各種成分を種々の濃度添加し、５％ＦＢＳ含有ＥＲＤＦ培地で３７℃、４８時間処理した。処理後、細胞数の計測およびトリパンブルー染色法による生存率の測定を行った。
また、ＥＧＣＧ前処理に関しては、終濃度１０μｇ／ｍＬ（１％ＦＢＳ含有ＥＲＤＦ培地）の抗６７ＬＲ抗体を３７℃、３０分間処理した後、ＥＧＣＧ処理を行い、抗体処理細胞に対する影響も検討した。ネガティブコントロールとしてマウスＩｇＭでも同様の処理を行った。
【００７１】
（８）．６７ＬＲ強制発現細胞に対する各種成分の結合性解析
各種成分５μＭと細胞との結合性を表面プラズモン共鳴センサＳＰＲ６７０（Ｎｉｐｐｏｎ Ｌａｓｅｒ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｌａｂ．，Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）により測定した。測定はまず、タンパク質等の標準的な固定化法を用いて細胞を金膜（Ｎｉｐｐｏｎ Ｌａｓｅｒ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｌａｂ．）に固定した。
【００７２】
１０ｍＭの４，４−Ｄｉｔｈｉｏ ｄｉｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ；ＤＤＡ（東京化成工業，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）エタノール溶液（１０ｍＬの９９％エタノール中に２．３８ｍｇのＤＤＡを溶解し、エタノールでさらに１／１００に希釈した）に金膜を浸して（金の面を上に）穏やかに室温で３０分間攪拌した。次に、エタノールで２回、金表面に水圧をかけないように洗浄し自己組織化膜（ＳＡ膜）を導入した。２５ｍｇ水溶性カルボジイミド；ＥＤＣ（和光純薬）を１ｍＬ超純水に、１５ｍｇ Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ；ＮＨＳ（和光純薬）を９ｍＬ １，４−Ｄｉｏｘａｎｅ（Ｎａｃａｌａｉｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．）にそれぞれ溶解した。それぞれの溶液を混合し、ＳＡ膜処理済の金膜を浸して、穏やかに室温で１０分間攪拌した。これに１０ｍＬの超純水を加え、さらに室温で５分間攪拌した。超純水で２回、金表面に水圧をかけないように洗浄し、乾燥（風乾）させてカートリッジにマウントした。細胞を３ ｘ １０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（フローバッファーであるＰＢＳ）に調整し、金膜上に２０μＬ滴下し３０分間室温において細胞を固定化した。その後、ＰＢＳで１、１０、２５、５０μＭに希釈した緑茶カテキンを注入し、表面プラズモン共鳴角度（Ａｎｇｌｅ）の変化を測定することで細胞への結合性をモニターした。
【００７３】
また、ＥＧＣＧと抗６７ＬＲ抗体との結合競合性試験は、終濃度１０μｇ／ｍＬ（１％ＦＢＳ含有ＥＲＤＦ培地）の抗６７ＬＲ抗体を３７℃、３０分間処理した後、細胞を金膜に固定化し表面プラズモン共鳴センサを用いて上記同様に行った。この際、ネガティブコントロールとしてマウスＩｇＭでも同様の処理を行い測定した。
【００７４】
（９）．フローサイトメトリー解析
６７ＬＲは細胞表面に発現していることが知られているので、細胞表面上に発現した６７ＬＲを抗ヒトＬａｍｉｎｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＬＲ）抗体を用いたフローサイトメトリー解析により検出した。細胞を回収し、１．５ｍＬエッペンドルフチューブで総量１００μＬの１％ＦＢＳ−ＰＢＳ中に細胞が１ ｘ １０６ｃｅｌｌｓ含まれるように調整し、１次抗体として抗ヒトＬＲ抗体を終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加した。４℃で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで一回洗浄した。次に、２次抗体としてＬＲ抗体のアイソタイプを認識する抗マウスＩｇＭ ＦＩＴＣ標識抗体を総量２５μＬの１％ＦＢＳ−ＰＢＳ中で終濃度１２．５μｇ／ｍＬとなるように添加した。４℃で３０分間インキュベートした後にＰＢＳで２回洗浄し、再び、ＰＢＳに再懸濁しフローサイトメーターにより解析を行った。ネガティブコントロールＩｇＭ抗体を同じ濃度（１０μｇ／ｍＬ）で反応させた。細胞表面６７ＬＲ発現量はＬＲの蛍光強度の中央値で示した。
【００７５】
また、ＥＧＣＧ処理が６７ＬＲ細胞表面発現に及ぼす影響を検討するために、１次抗体を作用させる前に、終濃度５０μＭとなるように調製したＥＧＣＧ添加１％ＦＢＳ−ＰＢＳで細胞を処理し、３７℃に３０分間置いた。これを、ＰＢＳで一度洗浄した。以降は上述の作用を１次抗体から行い、測定を行った。また、ＥＧＣＧを含まない１％ＦＢＳ−ＰＢＳでも処理を行い、対照群とした。
【００７６】
（１０）．統計計算
実験結果の統計処理には、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ，ｔ検定を用いた。
実施例１ ＥＧＣＧの細胞結合性および増殖活性に及ぼす６７ＬＲ遺伝子導入の影響
６７ＬＲ発現ベクター（ｐＴＡＲＧＥＴ−ｈＬａｍｉｎｉｎＲ）をＦｕＧＥＮＥＴＭ６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて以下の方法によりＡ５４９細胞に導入した。細胞を１ ｘ １０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（１０％ＦＢＳ−ＥＲＤＦ培地）に調整して播種した。２４時間後、チューブに新たにＥＲＤＦ培地を取りＦｕＧＥＮＥＴＭ６（遺伝子量の３倍）を直接加え、穏やかに混ぜた。次に種々の濃度でｐＴＡＲＧＥＴ−ｈＬａｍｉｎｉｎＲを加え穏やかに混ぜ、室温に３０分間置いた。これを、培地中に加え４８時間、３７℃に培養を継続した。この６７ＬＲ一過性発現細胞に対して、ＥＧＣＧを各種濃度で添加し、５％ＦＢＳ含有ＥＲＤＦ培地で３７℃、４８時間処理した。処理後、細胞数の計測およびトリパンブルー染色法による生存率の測定を行った。
【００７７】
結果、６７ＬＲを一過性に発現させた細胞においてＥＧＣＧ濃度依存的に細胞増殖抑制が認められた。また、細胞に導入させた６７ＬＲ遺伝子量に比例して細胞増殖の抑制も認められた。
【００７８】
６７ＬＲは細胞膜に存在する膜タンパク質であり、この遺伝子の発現ベクターを導入した細胞でＥＧＣＧの効果が増強されたことは、ＥＧＣＧの結合性が増大したためではないかと考えられる。そこで、この細胞に対するＥＧＣＧの結合性を表面プラズモン共鳴センサにより測定した。ＥＧＣＧは５μＭで用いた。
【００７９】
まず、空ベクターを導入したＡ５４９細胞では、若干のＡｎｇｌｅの変化（結合量）しか観察されなかったのに対し、６７ＬＲ発現ベクターを導入した細胞では、０．２５μｇ導入細胞ですでにＡｎｇｌｅの大幅な増大が認められ、さらに０．５μｇ導入した細胞ではよりいっそうの増大が認められた。このことにより、６７ＬＲ発現ベクター導入によりＥＧＣＧの細胞表面への結合性が増大することが示された。
【００８０】
実施例１の結果を図１、図２及び図３に示す。
【００８１】
実施例２ ６７ＬＲの細胞表面発現量の測定
６７ＬＲ発現ベクターを導入することで、ＥＧＣＧの細胞表面への結合性が増大することは示された。そこで、この結合性の増大が実際に細胞膜上に６７ＬＲ発現が増大したためであるかフローサイトメトリーを用いて検討した。
【００８２】
まず、細胞表面の６７ＬＲの発現量の測定を行った。コントロールのＡ５４９細胞で若干の発現が認められた。この細胞に空ベクター（０．５μｇ）を導入した細胞ではその発現量にほとんど影響は認められなかった。ところが、６７ＬＲ発現ベクター（０．５μｇ）を導入した細胞では、発現量が大幅に増えており、このことから、細胞表面に６７ＬＲが発現していることが明らかになった。
【００８３】
さらに、ＥＧＣＧがこの６７ＬＲを介して結合しているかを明白にするため、抗６７ＬＲ抗体を作用させる前にＥＧＣＧを作用させた。すると、コントロール細胞で認められていた６７ＬＲの発現が見かけ上、無くなっていた。また、この現象は、空ベクターを導入した細胞でも同様であった。さらに、６７ＬＲ導入細胞でも同様であった。このことは、ＥＧＣＧをあらかじめ細胞に作用させることで、細胞表面の６７ＬＲにＥＧＣＧが先に結合してしまい、抗６７ＬＲ抗体が細胞膜上の６７ＬＲに結合できなくなったため、みかけ上６７ＬＲの発現が検出されなかったと考えられる。
【００８４】
これらの結果から、６７ＬＲ発現ベクターを導入することで細胞表面の６７ＬＲ発現が増大することが明らかになり、ＥＧＣＧの結合性の増大が６７ＬＲの細胞膜発現増大であることが示された。また、この６７ＬＲを介してＥＧＣＧは細胞へ結合することが示唆された。すなわち、６７ＬＲがＥＧＣＧの受容体であると示された。
【００８５】
実施例２の結果を図４に示す。
【００８６】
実施例３ ＥＧＣＧの結合性および増殖抑制活性に及ぼす抗６７ＬＲ抗体の影響
ここまでで、６７ＬＲを介してＥＧＣＧが細胞へ結合し、増殖抑制活性を発現していることが示された。これをより明らかにするため、今度は６７ＬＲ強制発現細胞に抗６７ＬＲ抗体であらかじめ処理を行った上で、ＥＧＣＧの結合性および増殖抑制活性に影響が認められないか検討を行った。
【００８７】
まずは、結合性に及ぼす抗体の影響を表面プラズモン共鳴センサにより検討した。抗６７ＬＲ抗体を作用させると、Ａｎｇｌｅの変化量からＥＧＣＧの結合速度および結合量自体の減少が認められた。そうした効果は陰性コントロール抗体では見られなかった。
【００８８】
また、ＥＧＣＧのがん細胞増殖抑制に及ぼす抗体の影響も検討した。６７ＬＲ強制発現細胞ではわずか０．１μＭの濃度のＥＧＣＧでも増殖抑制活性が認められるが、ＥＧＣＧを作用させる前に抗体処理を行ったところ、その増殖抑制効果が消失した。この時、生存率には影響は認められなかった。この結果より、ＥＧＣＧの結合のみならず、増殖抑制活性も６７ＬＲへのＥＧＣＧの結合を介して行われることが示された。
【００８９】
実施例３の結果を図５及び図６に示す。
【００９０】
実施例４ 他の茶成分の結合性および増殖抑制活性に及ぼす６７ＬＲ発現の影響
ＥＧＣＧが６７ＬＲを介して細胞膜に結合すること、また、がん細胞増殖抑制活性を発現していることを示してきた。この６７ＬＲを介した効果がＥＧＣＧ特有のものか検討を行った。そこで、他の茶成分として、主要な緑茶カテキンとしてＥＣＧ、ＥＧＣ、ＥＣ、Ｃおよび強い抗アレルギー作用を持ち生体内で安定に存在すると報告があるＥＧＣＧ３″Ｍｅを用いた。カテキン同様に様々な生理機能を有しているｃａｆｆｅｉｎｅ、また、同様に多くの生理機能が報告されているフラバノール類の一種であるｑｕｅｒｃｅｔｉｎも検討した。
【００９１】
まず、６７ＬＲ強制発現細胞の増殖に及ぼす影響を検討した。これまでと同様に、０．５μｇのｐＴＡＲＧＥＴ−ｈＬａｍｉｎｉｎＲをＡ５４９細胞にリポフェクション法により導入し、４８時間、３７℃で培養後の細胞に対して各種の茶成分を終濃度５μＭとなるように作用させた。この状態で、さらに３７℃で４８時間培養後の細胞数および生存率の測定を行った。その結果、Ｃ、ＥＣ、ＥＧＣ、ｃａｆｆｅｉｎｅおよびｑｕｅｒｃｅｔｉｎでは遺伝子の導入の有無に関わらず、生存率および細胞数には影響は認められなかった。一方、ＥＧＣＧ同様にガロイル基を有しているＥＣＧおよびＥＧＣＧ３″Ｍｅでは、ＥＧＣＧ同様な増殖抑制効果が認められた。この結果から、ガロイル基を有するような成分は６７ＬＲ強制発現細胞で増殖抑制活性を発現することが示唆された。
【００９２】
また、６７ＬＲ強制発現細胞への各種茶成分の結合性を表面プラズモン共鳴バイオセンサにより測定した。Ａ５４９細胞に対してＣ、ＥＣ、ＥＧＣは結合性を示さず、これは６７ＬＲ強制発現細胞でも変化は認められなかった。また、ｃａｆｆｅｉｎｅおよびＱｕｅｒｃｅｔｉｎも細胞結合性を示さず、強制発現細胞でも変化は認められなかった。ＥＣＧおよびＥＧＣＧ″３ＭｅはいずれもＥＧＣＧほどではないものの、細胞結合性を示しており、６７ＬＲ強制発現細胞ではこの結合性が増大することが明らかになった。
【００９３】
実施例４の結果を図７及び図８に示す。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明によれば、６７ｋＤａラミニン・レセプターをターゲットとする薬物の新規なスクリーニング方法が提供可能である。
【００９５】
なお、本出願は、特願２００３−０９７６５２号を優先権主張して出願されたものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
６７ｋＤａラミニン・レセプターと結合するカテキン類であって、該６７ｋＤａラミニン・レセプターと結合することにより癌細胞の増殖または転移活性を阻害するカテキン類。
【請求項２】
ガロイル基を有するカテキン類である請求項１記載の化合物。
【請求項３】
エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）及びその３−メチル置換体、並びにエピカテキンガレート（ＥＣＧ）から選ばれる少なくとも１である請求項１または２記載の化合物。
【請求項４】
癌細胞が６７ｋＤａラミニン・レセプター陽性細胞である請求項１から３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の化合物を含む細胞増殖抑制剤。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか１項に記載の化合物を含む血管新生阻害剤。
【請求項７】
請求項１から４のいずれか１項に記載の化合物を含む癌細胞の転移活性阻害剤。
【請求項８】
請求項１から４のいずれか１項に記載の化合物を含む抗癌剤。
【請求項１】
６７ｋＤａラミニン・レセプターと結合するカテキン類であって、該６７ｋＤａラミニン・レセプターと結合することにより癌細胞の増殖または転移活性を阻害するカテキン類。
【請求項２】
ガロイル基を有するカテキン類である請求項１記載の化合物。
【請求項３】
エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）及びその３−メチル置換体、並びにエピカテキンガレート（ＥＣＧ）から選ばれる少なくとも１である請求項１または２記載の化合物。
【請求項４】
癌細胞が６７ｋＤａラミニン・レセプター陽性細胞である請求項１から３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の化合物を含む細胞増殖抑制剤。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか１項に記載の化合物を含む血管新生阻害剤。
【請求項７】
請求項１から４のいずれか１項に記載の化合物を含む癌細胞の転移活性阻害剤。
【請求項８】
請求項１から４のいずれか１項に記載の化合物を含む抗癌剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１０−２４８２０１（Ｐ２０１０−２４８２０１Ａ）
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１２４５６９（Ｐ２０１０−１２４５６９）
【出願日】平成２２年５月３１日（２０１０．５．３１）
【分割の表示】特願２００５−５０５２３９（Ｐ２００５−５０５２３９）の分割
【原出願日】平成１６年４月１日（２００４．４．１）
【出願人】（８００００００３５）株式会社産学連携機構九州 (34)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月３１日（２０１０．５．３１）
【分割の表示】特願２００５−５０５２３９（Ｐ２００５−５０５２３９）の分割
【原出願日】平成１６年４月１日（２００４．４．１）
【出願人】（８００００００３５）株式会社産学連携機構九州 (34)
【Ｆターム（参考）】
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