Ａβの効果を低減する方法およびそのための組成物
本発明は、ニューロン細胞死およびタウリン酸化などのＡβの効果の抑制に関する方法および材料を提供する。例えば、本発明は、Ａβ効果（例えば、哺乳動物におけるニューロン細胞死）を抑制するためのポリペプチド類、ポリペプチド類を含有する組成物、トランスジェニック動物、および方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２００４年８月１１日に出願された米国特許仮出願第６０／６００，９８７号、２００４年１０月２２日に出願された同第６０／６２１，５９６号および２００５年１月４日に出願された同第６０／６４１，６８３号に対する優先権を主張する。すべての出願は、引用により本明細書に組み込まれる。
【連邦政府の支援による研究または開発に関する記載】
【０００２】
本発明は、ＮＩＨの助成番号ＥＳ０１００４２及びＥＳ００８０８９により与えられた連邦政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【発明の背景】
【０００３】
一般に、本発明は、Ａβの効果（例えば、ニューロン細胞死）の低減に関与する方法および材料に関する。
【０００４】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、β−アミロイド（Ａβ）蓄積およびプラーク形成、微小管結合タンパク質タウの異常なリン酸化および凝集、ならびに大量のニューロン減少を特徴とする。ＡＤの遺伝型ならびに充分な動物モデル及びインビトロデータにおいて同定された変異は、ＡＤの発症を誘発する主要な因子として、Ａβおよびこれが由来するポリペプチドであるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を強く示す（Ｈａｒｄｙ及びＳｅｌｋｏｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７：３５３−３５６（２００２））。β−セクレターゼ及びγ−セクレターゼによるＡＰＰの切断によりＡβが生成する。α−セクレターゼによるＡＰＰの切断は、Ａβ配列内で起こり、したがってＡβ形成が妨げられ、一方でＮＨ2末端が生成し、ｓＡＰＰαと称する分泌ポリペプチドが生成する（Ｅｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８（４９５９）：１１２２−１１２４，１９９０）。
【０００５】
内生タウのリン酸化およびインビボニューロン減少などの主要なＡＤ神経病理であるＡβ誘導は、まだ納得のいく立証がされていない。実際、ＡＰＰの変異型形態を過剰発現するマウスでは高レベルのＡβが蓄積されるが、これらは、ＡＤにおいて観察されるタウリン酸化または深刻なニューロン減少を示さない（Ｉｒｉｚａｒｒｙら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５６：９６５−９７３（１９９７）；Ｉｒｉｚａｒｒｙら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１７：７０５３−７０５９（１９９７））；及びＴａｋｅｕｃｈｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ，１５７：３３１−３３９（２０００））。
【発明の簡単な概要】
【０００６】
一実施態様では、本発明は、Ａβ効果の低減または抑制に有用な単離されたペプチドであって、該ペプチドは、式Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄを含み、式中、Ａは、アミノ酸残基Ｄ、Ｅ、Ｎ及びＱからなる群から選択され；式中、Ｂは、アミノ酸残基Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｇ及びＰからなる群から選択され；式中、Ｃは、アミノ酸残基Ｅ、Ｄ、Ｎ及びＱからなる群から選択され；式中、Ｄは、アミノ酸残基Ｆ及びＹからなる群から選択され；該ペプチドは、哺乳動物細胞においてＡβの効果を低減または抑制し、及び該ペプチドは、４〜１６の間の残基長である。好ましい型では、該ペプチドはポリペプチド安定化単位をさらに含む。
【０００７】
別の実施態様では、該ペプチドは、さらにアミノ酸残基をカルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかに、前記ペプチドの式が、Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｚとなるように含み、式中、Ｘ及びＺは、ＤＡＥＦと連続的なｓＡＰＰαタンパク質配列由来の残基である。好ましくは、該ペプチドは、ＤＡＥＦ（配列番号：２）、ＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：３）、ＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：４）、ＥＡＤＦ（配列番号：５）、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：１）、Ｒ９ＤＡＥＦ（配列番号：６）、及びａｃＤＡＥＦ（配列番号：２）からなる群から選択される。
【０００８】
別の実施態様では、本発明は、Ａβの効果の低減および抑制に有用な単離されたペプチドであって、該ペプチドは、ＤＡＥＦ（残基５９７〜６００）を含むｓＡＰＰα配列の単離された４〜１６残基セグメントを含む。
【０００９】
別の実施態様では、本発明は、哺乳動物細胞に、Ａβの効果が低減または抑制されるような有効量の本発明のペプチドを供給する工程を含む、哺乳動物細胞においてＡβの効果を低減または抑制する方法である。
【００１０】
別の実施態様では、本発明は、哺乳動物細胞に、ニューロン細胞死が抑制されるような有効量の本発明のペプチドを供給する工程を含む、ニューロン細胞死を抑制する方法である。
【００１１】
別の実施態様では、本発明は、Ａβの効果を低減させる能力を有する化合物を同定する方法である。脳組織を、Ａβペプチドの存在下で試験化合物と接触させる工程およびＡβの効果を測定する工程を含み、好ましくは、Ａβの効果を低減させる試験化合物の能力を、Ａβの効果を低減させる本発明のペプチドの能力と比較する工程をさらに含む。
【００１２】
特に定義のない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が関連する技術分野における当業者が一般的に理解しているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または等価な方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好適な方法および材料は下記のものである。矛盾する場合は、定義を含む本明細書に支配される。また、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定を意図しない。
【００１３】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載から、および特許請求の範囲から自明となろう。
【００１４】
本出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（１つまたは複数）を有するこの特許出願公開公報の複写は、請求および必要な費用の支払いを行うと、特許庁によって提供される。
【発明の詳細な説明】
【００１５】
（概説）
本発明は、Ａβの効果、例えば、ニューロン細胞死およびタウリン酸化などを低減または抑制することに関連する方法および材料に関する。例えば、本発明は、ポリペプチド類、ポリペプチド類を含有する組成物、トランスジェニック動物、およびＡβの効果（例えば、哺乳動物におけるニューロン細胞死）を抑制するための方法を提供する。かかるポリペプチド類及びポリペプチド類を含有する組成物は、アミノ酸配列を細胞に、Ａβの効果が低減または抑制されるように提供するために使用され得る。Ａβの効果を低減または抑制することにより、科学者達が、ＡＤの発症においてＡβ以外のポリペプチド類の関与を調べることが可能となり得る。また、Ａβの効果を低減または抑制することは、臨床医が、ＡＤを患っているかまたはＡＤの発症のリスクがあるヒトを処置することが可能になる。例えば、本明細書において提供されるポリペプチドはＡＤ患者に、未処置のＡＤ患者において典型的に観察されるニューロン細胞死またはタウリン酸化が、処置されたＡＤ患者において低減または抑制されるように投与され得る。
【００１６】
以下の本発明のポリペプチドの記載は、Ａβの効果を低減または抑制するのに特に有用なｓＡＰＰαの特定のポリペプチド断片を我々が見出したことから導かれたものである。このポリペプチドＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：１）は、ｓＡＰＰα配列の残基５９２〜６０１である。我々は、該１０残基ペプチド内の４残基のペプチドＤＡＥＦが、それ自体でＡβの効果を低減または抑制するのに充分であることを見出した。この出願で使用する残基番号システムは、ＡＰＰ６９５を基準にしている。Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｐ０５０６７−４を参照。（また、Ｋａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３２５：７３３−７３６，１９８７；Ｌｅｍａｉｒｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：５１７−５２２，１９８９も参照のこと）。これは、脳内の主要なアイソフォームであり、したがって、我々が選択する番号付けシステムの基準とする。
【００１７】
（本発明のポリペプチド）
この記載の一態様では、下記式：
Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ（配列番号：２４）
（式中、Ａは、アミノ酸残基Ｄ、Ｅならびに保存的置換、例えば、Ｎ及びＱからなる群から選択され；
式中、Ｂは、アミノ酸残基Ａならびに保存的置換、例えば、Ｔ、Ｓ、Ｇ及びＰからなる群から選択され；
式中、Ｃは、アミノ酸残基Ｅ、Ｄならびに保存的置換、例えば、Ｎ及びＱからなる群から選択され；及び
式中、Ｄは、アミノ酸残基Ｆならびに保存的置換、例えば、Ｙからなる群から選択され；
該ペプチドは、哺乳動物細胞においてＡβの効果を低減または抑制する）
で規定される４〜１６残基ポリペプチドを特色とする。
【００１８】
「保存的置換(conservative substitutions)」によって、我々は、側鎖の特徴に従ってアミノ酸をグループ分けすることを意図する。保存的置換の予測は、充分な程度の自由度が明らかに存在する大きなタンパク質の構造領域について容易に行われ得る。最良の方法は、進化的変異の研究から誘導される。２つのよく知られた方法はＰＡＭ２５０及びＢｌｏｓｕｍである（Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ら、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５（３）：３４５−３５２，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，１９７８；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９，１９９２を参照のこと）。
【００１９】
以下は、本発明の好ましいペプチド類の１つを含む残基について、ＰＡＭ２５０及びＢｌｏｓｕｍ法によって予測される最も保存的な置換を表にまとめたものである。
【００２０】
【表１】
【００２１】
本発明のポリペプチドは、４〜１６の間の残基長のアミノ酸である。好ましくは、該ポリペプチドは１０〜４の間のアミノ酸残基長である。以下に記載のように、さらなる安定化ペプチド類を該分子のいずれかの終端に付加することが望まれることがあり得る。その実施態様では、ポリペプチド全体は、実際には１６アミノ酸より長くなり得る。
【００２２】
以下に記載するように、数種類の様式で該ポリペプチドの終端を修飾することが望まれることがあり得る。これらの修飾もまた、上記及び下記のポリペプチドの範囲に含まれる。例えば、アセアレート(acealated)終端を提供することが望まれることがあり得る。さらに、前記の本発明のポリペプチド類を、哺乳動物細胞においてＡβの効果を低減または抑制するその能力に影響しない様式で修飾することが望まれることがあり得る。これらの卑小な修飾もまた、本発明のポリペプチドの範囲内である。
【００２３】
本発明の好ましい形態では、該ポリペプチドは、式；Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ
（式中、Ａは、アミノ酸残基Ｄ及びＥからなる群から選択され；
式中、Ｂは、アミノ酸残基Ａからなる群から選択され；
式中、Ｃは、アミノ酸残基Ｅ及びＤからなる群から選択され；ならびに
式中、Ｄは、アミノ酸残基Ｆからなる群から選択される）
によって規定される。
【００２４】
本発明の特に好ましい形態では、ポリペプチドは、本質的に上記の本発明の実施態様のいずれかにおいて規定されるＡ−Ｂ−Ｃ−Ｄからなる。
【００２５】
本発明の他の実施態様では、該ポリペプチドは下記式によって規定され：
Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｚ
式中、Ｘ及びＺは、ＤＡＥＦ（配列番号：２）と連続的なｓＡＰＰα由来の残基である。「連続的な(contiguous)」により、我々は、残基が、天然に存在するＤＡＥＦ（配列番号：２）配列（残基５９７〜６００）と自然状態で接することを意味する。例えば、ポリペプチドＥＶＫＭ（配列番号：２３）−ＡＢＣＤは、アミノ酸残基ＥＶＫＭ（残基５９３−５９６）が、天然に(natively)存在するＤＡＥＦ配列と接するため、本発明のペプチドであり得る。ＡＢＣＤ−Ｒは、同じ理由のため本発明のペプチドであり得る。
【００２６】
好ましい実施態様では、該ポリペプチドは、以下のｓＡＡＰα断片または修飾された断片：ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：１）、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦ（配列番号：７）；ＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：３）；ＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：４）；ＤＡＥＦ（配列番号：２）、ａｃＤＡＥＦ（配列番号：２）、ＭＥＡＤＦ（配列番号：８）、ＥＡＤＦＲ（配列番号：９）、ＥＡＥＦ（配列番号：１０）、またはＥＡＤＦ（配列番号：５）の１つを含むか、または該断片の１つからなるものであり得る。該ポリペプチドは、ＤＡＥＦ（配列番号：２）セグメントを含むｓＡＰＰαの任意の４〜１６残基断片であり得る。
【００２７】
本発明に対する他の実施態様では、該ポリペプチドは、上記の保存的アミノ酸置換を有する先の配列の任意の１つを含み得る。
【００２８】
また、本明細書において提供されるポリペプチド類は、ポリペプチド安定化単位を含有し得る。本明細書で用いられる用語「ポリペプチド安定化単位」は、該ポリペプチドに共有結合または非共有結合したとき、哺乳動物の血清内での該ポリペプチドの安定性を増大させる、及び／又は細胞内への該ポリペプチドの取り込みを助長し得る化学的部分をいう。
【００２９】
数多くのプロテアーゼ類が、血清内の分子に接近可能であり、これらの分子を破壊または代謝し得る。ポリペプチド安定化単位は、本明細書において提供されるポリペプチド類の脳内への侵入を助長することに加え、その酵素的分解を低減または抑制し得る。ポリペプチド安定化単位は、アミド結合もしくはペプチド結合などの共有結合によって、またはアビジンとビオチン間などの相互作用によって、他のポリペプチドに結合されたポリペプチドであり得る。該結合としては、制御された加水分解速度で脳内で切断される結合、例えば、−Ｓ−Ｓ−、エステル、または立体障害エステル(stearically hindered ester)が挙げられ得る。
【００３０】
安定化単位はまた、アルキル（メチレン）、アルコキシ（エーテル）、またはグリコールの鎖であり得るリンカーによって結合させてもよい。また、該ポリペプチドはポリペプチド安定化単位に、ポリエチレングリコールリンカーによって結合させ得る。上記のように、リンカーとしては、−Ｓ−Ｓ−などの脳内で切断される結合が挙げられ得る。これらの場合において、安定化されるポリペプチドとポリペプチド安定化単位とが、より大きなキメラポリペプチドを形成し得る。
【００３１】
ポリペプチド安定化単位として使用され得るアミノ酸配列の例としては、制限されず、血漿タンパク質トランスフェリン、トランスフェリンの断片、トランスフェリン受容体に対する抗体（例えば、ＯＸ２６または８Ｄ３）、インスリン、インスリン受容体に対する抗体（例えば、８３１４）（Ｃｏｌｏｍａら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１７：２６６−７４（２０００））、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、及びカチオン化されたアルブミンが挙げられる。いくつかの実施態様では、ポリペプチド安定化単位はハプテン以外の部分であり得る。例えば、ポリペプチド安定化単位はＤＮＰ以外の部分であり得る。
【００３２】
ポリペプチド安定化単位は、細胞および／または脳内へのポリペプチドの取り込みを助長し得る。ポリペプチド安定化単位は、親油性−親水性バランスを増大させるため、およびＢＢＢを構成する脳内皮細胞の脂質膜を越える単純な受動拡散を達成するのを補助するために機能し得る。例えば、ステアリン酸などの長鎖脂肪酸（好ましくは炭素数１６個未満）、またはステリル(steryl)アルコールなどの長鎖アルコール（好ましくは炭素数１６個未満）が、好ましいものであり得る。かかるポリペプチド安定化単位の例としては、制限されず、ＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質の塩基性ドメイン（例えば、Ｔａｔ49〜57；ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：１１）、Ｌ−もしくはＤ−アルギニンの９量体（Ｒ９）、または他のペプトイドアナログ、例えば、グアニジン頭部基と主鎖との間に６個のメチレンのスペーサーを含有するもの（Ｗｅｎｄｅｒら、ＰＮＡＳ，９７：１３００３−１３００８（２０００））が挙げられる。ポリペプチド安定化単位として使用され得る他のアミノ酸配列または部分は、ＰＣＴ／ＵＳ９９／２３７３１；Ｌａｒａｓら、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．３：６１２−６１８，２００５；Ｍｉｓｒａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓｃｉ．６（２）：２５２−２７３，２００３；Ｄａｌｐｉａｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４：２５９−２６９，２００５；Ｑｕｅｌｅｖｅｒら、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．３：２４５０−２４５７，２００５，及びＰＣＴ／ＥＰ０２／０２２３４に見出され得る。
【００３３】
安定化された単位は、血液脳関門を越える受容体（受容体媒介性輸送−ＲＭＴ）を利用するものであり得る（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，ＮｅｕｒｏＲＸ ２：３−１４，２００５）。例としては：輸送またはトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）抗体、（好ましくは、完全にヒトのＭＡｂ）；インスリンまたはインスリン受容体抗体（好ましくは、完全にヒトのＭＡｂ）；１型スカベンジャー受容体（ＳＲ−ＶＩ）（修飾されたＬＤＬ）；リポソーム類（ペグ化された(pegylated)イムノリポソーム類）（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３７３：５０７−５２８，２００３）；ナノ粒子（Ｏｌｉｖｉｅｒ，ＮｅｕｒｏＲｘ ２：１０８−１１９，２００５；Ｏｌｉｖｉｅｒら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９：１１３７−１１４３，２００２）；ＩＧＦ−１；ＩＧＦ−２；カチオン化されたアルブミン；及びＨＩＶのＴａｔタンパク質が挙げられる。
【００３４】
ポリペプチド安定化単位は、血液脳関門を越えるペプチドの輸送媒介性透過を達成する天然の脳輸送体の基質となり得（Ｔｓｕｊｉ，ＮｅｕｒｏＲｘ ２：５４−６２，２００５）、担体媒介性輸送−ＣＭＴとしても知られ（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，前出，２００５）、これは、溶質担体（ＳＬＣ）遺伝子ファミリー（１００遺伝子を超える）の輸送体を利用するものであり得る（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，前出，２００５）。これらの輸送体としては：Ｌ系（大型、中性アミノ酸−Ｆ、Ｙ、Ｌ）輸送体ファミリー；ヘキソース（グルコース）輸送体ファミリー；モノカルボキシレート（短鎖脂肪酸）輸送ファミリー）有機アニオン輸送ファミリー；有機カチオン輸送ファミリー；アスコルビン酸輸送ファミリー（ある種のヘキソース輸送体を含む、Ｄａｌｐｉａｚら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．２４：２５９−２６９，２００５；Ｍａｎｆｒｅｄｉｎｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：５５９−５６２，２００２；Ｍａｎｆｒｅｄｉｎｉら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１２：５４５３−５４６３，２００４；Ｑｕｅｌｅｖｅｒら、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．３：２４５７−２４５７，２００５，ＰＣＴ ＷＯ０２／０７０４９９）；ペプチド（エンケファリン、レプチン、グレリン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン）輸送ファミリー；及びＳＬＣ遺伝子ファミリーの未だキャラクタライズされていない輸送体が挙げられ得る。
【００３５】
ポリペプチド安定化単位は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）タンパク質の大ファミリーを含む能動排出輸送(Active Efflux Transport)ファミリーの一構成員、例えば、ｐ−糖タンパク質（多剤耐性；ＭＤＲ；ＡＢＣ−Ｂｌ遺伝子）ポンプまたはＢＢＢにおいて重要な役割を果たす他のポンプ（Ｖａａｌｂｕｒｇら、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２００５；ｄｅ Ｂｏｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．４３：６２９−６５６，２００３；Ｆｒｏｍｍ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２５：４２３−４２９，２００４）によって、該ポリペプチドが脳から排出されることを妨げ得る。
【００３６】
ポリペプチド安定化単位としては、化学的送達系またはレドックス送達系、例えば、ジヒドロニコチニル部分（Ｌａｒａｓら、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．３：６１２−６１８，２００５）または１，４−ジヒドロトリゴネリネート(trigonellinate)部分（Ｂｏｄｏｒ，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５０７：２８９−３０６，１９８７；Ｂｏｄｏｒ及びＢｕｃｈｗａｌｄ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．３６：２２９０−２５４，１９９９；Ｂｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：１６９８−１７００，１９９２）が挙げられ得る。
【００３７】
いくつかの研究により、プロリン残基は、ペプチダーゼ類に対してより抵抗性であることが示唆されている（Ｙａｒｏｎ及びＮａｉｄｅｒ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８：３１−８１，１９９３；Ｖａｎｈｏｏｆら、Ｆａｓｅｂ．Ｊ．９：７３６−７４４，１９９５；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＯ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３４３：１６０−１８６，１９９７）。したがって、ポリペプチド安定化単位は、１つまたはそれ以上のプロリンアミノ酸残基であり得る。かかる残基は、ＮＨ2末端残基、ＣＯＯＨ末端残基、または両方であり得る。実際、研究の１つでは、ＮＨ2−またはＣＯＯＨ−末端の終端へのアミノ酸アラニン、プロリン、プロリン（ＡＰＰ）またはＰＰＡの付加により、短いペプチド断片が安定化されることが示された（Ｗａｌｋｅｒら、Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．６２：２１４−２２６、２００３）。アミノ酸ＡＰＰは、単一のＰよりも大きな安定性を付与したＰＰよりも大きな安定性を付与した。また、ＮＨ2末端の終端の保護は、ＣＯＯＨ終端よりも大きな安定性を付与し、カルボキシペプチダーゼ類よりもアミノペプチダーゼ類の方が多くあるという考えと一致した。実際、アミノ酸ＡＰＰの付加は、アミド化またはアセチル化よりも大きな安定性を付与し、エキソペプチダーゼ類が遊離ＮＨ2末端に接近するのを完全に抑制する環化とほぼ同様に有効であった（Ｗａｌｋｅｒ，前出，２００３）。かかる安定性残基は、Ｎ末端残基またはＣ末端残基であり得る。例えば、ＤＡＥＦ配列を含有するポリペプチドのＮ末端は、２つのプロリン残基であり得る。いくつかの実施態様では、ポリペプチドは、Ｎ末端プロリン残基とＣ末端プロリン残基の両方を含有するものであり得る（例えば、ＰＰＤＡＥＦＰＰ（配列番号：１２）、ＰＤＡＥＦＰＰ（配列番号：１３）、ＰＰＤＡＥＦＰ（配列番号：１４）、及びＰＤＡＥＦＰ（配列番号：１５））。
【００３８】
ＡＰＰにおけるスウェーデン変異（Ｎに対してＫ５９５及びＬに対してＭ５９６）は、ＡＰＰ残基５９６と５９７間の結合においてβ−セクレターゼによる切断をもたらす。したがって、β−セクレターゼ切断部位を含むペプチドにおいて、この変化を組み込むことは、同時に、ＤＡＥＦ（配列番号：２）を含有する、より小さな神経保護ペプチドの生成が助長され、β−セクレターゼが競合的に阻害される。
【００３９】
ポリペプチド安定化単位は、アミノ酸配列またはアミノ酸残基以外の化学的部分であり得る。例えば、ポリペプチド安定化単位は、安定化させるポリペプチドに共有結合または非共有結合したポリ（エチレングリコール）、ポリ（スチレンマレイン酸）、非天然のアミノ酸（例えば、アルギニンアナログ及びリシンアナログ（Ｋｅｎｎｅｄｙら、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．，５５：３４８−３５８（２０００）；Ａｒｇｏｌｙｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）、エステル類（例えば、芳香族ベンゾイルエステル類もしくは分枝鎖第３級ブチルエステル類）、脂肪酸もしくはコレステロールエステル、アミド基、アビジンもしくはストレプトアビジン、またはビオチン化学基であり得る。いくつかの実施態様では、脂質二重層内に挿入されたポリ（エチレングリコール）を有するか、または有しないリポソーム類またはイムノリポソーム類（Ｈｕｗｙｌｅｒら、ＰＮＡＳ，９３：１４１６４−６９（１９９６）及びＣｅｒｌｅｔｔｉら、Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ，８：４３５−４６（２０００））が、ポリペプチド安定化単位として、及びポリペプチド類を脳内に輸送するための方法として使用され得る。例えば、トランスフェリン受容体に対する抗体を含有するリポソームが、ポリペプチド安定化単位として使用され得る。フェニルアラニンのトリメチル化を含むメチル化、アセチル化、アシル化、アルキル化、ハロゲン化、及びグリコシル化などの修飾が、ポリペプチドを安定化させるため、及びバイオアベイラビリティを増大させるために使用され得る。これら及び他の修飾は、脂質の溶解度（脂質化）またはカチオン化を増大するための機能を果たし得る。Ｎ−アシル化またはピログルタミル残基によるアミノ末端の修飾は、該ポリペプチドをタンパク質分解性切断から保護し得る。
【００４０】
本発明のポリペプチド類は、実質的に純粋であり得る。ポリペプチドに関して本明細書で用いられる用語「実質的に純粋な」は、該ポリペプチドが、自然状態では会合している他のポリペプチド類、脂質、炭水化物および核酸を実質的に含まないことを意味する。例えば、実質的に純粋なポリペプチドは、その天然の環境から取り出されており、少なくとも６０パーセント純粋である任意のポリペプチドである。ポリペプチドに関して本明細書で用いられる用語「実質的に純粋な」はまた、化学的に合成されたポリペプチド類及びポリペプチド組成物を包含する。典型的には、実質的に純粋なポリペプチドは、非還元性ポリアクリルアミドゲル上に、単一の主要バンドをもたらす。
【００４１】
ビタミンＣ（アスコルビン酸−「ＡＡ」）輸送系は、これを利用しない場合はＢＢＢを越えることができない薬物を脳内に輸送するために利用され得る（Ｄａｌｐｉａｚら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．２４：２５９−２６９，２００５；Ｍａｎｆｒｅｄｉｎｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：５５９−５６２，２００２；Ｍａｎｆｒｅｄｉｎｉ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１２：５４５３−５４６３，２００４；Ｑｕｅｌｅｖｅｒら、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．３：２４５０−２４５７，２００５，ＰＣＴ ＷＯ０２／０７０４９９）。この系の利点は、脳内で潜在的に達成され得る高濃度のＡＡ−ペプチドコンジュゲートである。ＳＶＣＴ２系の利点は、普通の食事をしている人における低レベルの競合性天然のアスコルビン酸リガンド、及び脳を浸している(bathing)ＤＳＦ内へのコンジュゲートの直接送達である。ＧＬＵＴ１系の利点は、非常に高い輸送能（Ｔｓｕｊｉ，ＮｅｕｒｏＲｘ ２：５４−６２，２００５）、脈絡叢毛細管の表面積と比べて脳毛細管の非常に高い表面積が、より高い輸送能および、より重要なことには薬物がニューロンに接近するのに拡散するために必要とされるさらにより短い間隔距離（＜５０マイクロメートル）を提供し（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，ＮｅｕｒｏＲｘ ２：３−１４，２００５）、すべてのニューロンが薬物に接触されるのを確実にすることである。ＧＬＵＴ１系の不都合点は、血糖正常の人における相対的に高濃度のＤ−グルコースがＡＡ−リンカー−ペプチドコンジュゲートの輸送と競合し得ることである（Ａｇｕｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：２８４２−２８４８，１９９７）。ＰＣＴ ＷＯ ０２／０７０４９９には、エステル、チオエステルまたはアミド結合によってリンカーのカルボキシル基に結合している−ＯＨ、−ＳＨまたは−ＮＨ基を有する活性物質を含有するＡＡ−リンカー−薬物コンジュゲートが記載されている。
【００４２】
好ましいＡＡ系ポリペプチド安定化単位の一例は、アスコルビン酸もしくは６−ハロ−アスコルビン酸または薬学的に許容可能な誘導体およびリンカーを含む。リンカーは、（ｉ）該ペプチドに対する連結を提供するための化学基を有する部分（ｉｉ）ＡＡの５−または６−ＯＨに対する連結を提供するための化学基および（ｉｉｉ）スペーサー単位を含有するものであり得る。該連結の一方または両方は、代謝に不安定な、例えば、エステルまたはチオエステルであり得る（そのため、神経保護ペプチドが脳内に放出され得る）。リンカーはペプチドに、α−カルボキシルもしくはα−アミノ基を介して、または任意の側鎖基（例えば、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、フェノール性−ＯＨ）を介して結合され得る。リンカーはまた、相対的に代謝に安定な、例えばアミド結合であり得る。スペーサー単位は、任意の数のメチレンの鎖であり得るが、好ましくは１６未満で、任意選択で、リンカーの一部に結合された神経保護ペプチドが脳内に放出され得るような１つまたはそれ以上の代謝により切断され得る結合、例えば−Ｓ−Ｓ−を含有する。リンカーの一部が神経保護ペプチドに結合されたままである任意の状況において、このリンカーの一部は、その全体が生物学的に活性、すなわち神経保護性となるように選択されなければならず、理想的には、その全体が該ペプチド単独よりも活性となるように選択されなければならない。
【００４３】
ＡＡ系ポリペプチド安定化単位の一例は、Ｒａ−ＡＡ（エステル結合によってＡＡの５−及び／又は６−ＯＨに結合される）であり、式中、（１ａ）Ｒ＝ＨＯ(ＣＨ2)ｘＣＯ−及びａ＝１もしくは２及びｘ＝１〜１６である、または（１ｂ）Ｈ2Ｎ(ＣＨ2)ｘＣＯ−及びａ＝１もしくは２及びｘ＝１〜１６である。
【００４４】
ＡＡ系ポリペプチド安定化単位の別の例は、上記のとおりであって、式中、（２ａ）Ｒ＝ＨＯ(ＣＨ2)ｙ−Ｓ−Ｓ−(ＣＨ2)ｚＣＯ−及びｙ＝１〜１５、Ｚ＝１〜１５及びｙ＋ｚは、好ましくは１６より大きくない、または（２ｂ）Ｒ＝Ｈ2Ｎ(ＣＨ2)ｙ−Ｓ−Ｓ−(ＣＨ2)zＣＯ−及びｙ＝１〜１５、ｚ＝１〜１５及びｙ＋ｚは、好ましくは１６より大きくない。
【００４５】
好適な神経保護ペプチド−ポリペプチド安定化単位は、以下のように選択される：（ｉ）一連の活性な神経保護ペプチド類または該ペプチドにおそらく、代謝に安定に結合されたリンカーの任意の一部を含有する神経保護ペプチドの誘導体（上記の例１ｂの場合では、−ＨＮ(ＣＨ2)ｘＣＯ2Ｈであり得、または例２ｂでは、−ＨＮ(ＣＨ2)yＳＨであり得る）は、この出願書類のどこかに記載した適当なアッセイを用いることにより選択され得る、（ｉｉ）これらは、適当な保護試薬およびカップリング試薬を用い、アスコルビン酸に化学的にカップリングさせ得る、（ｉｉｉ）得られたコンジュゲートを、ＧＬＵＴ１及びＳＶＣＴ２輸送体によって細胞膜を越えて輸送するその能力についてインビトロで試験し、（ｉｉｉ）次いで、この出願書類のどこかに記載したようにしてインビボで試験し得る、及び（ｉｖ）許容可能なインビボ効力、活性および作用持続期間を有するコンジュゲートが、追加調査およびさらなる開発のために選択され得る。
【００４６】
任意の方法を用いて、実質的に純粋なポリペプチドが得られ得る。例えば、アフィニティクロマトグラフィー及びＨＰＬＣならびにポリペプチド合成技術などの一般的なポリペプチド精製技術が使用され得る。また、任意の材料が、実質的に純粋なポリペプチドを得るための供給源として使用され得る。例えば、野生型またはトランスジェニック動物由来の組織が、供給源材料として使用され得る。また、目的の特定のポリペプチドを過剰発現するように遺伝子操作された培養細胞を用いて、実質的に純粋なポリペプチドが得られ得る。ポリペプチドは、該ポリペプチドが親和性マトリックス上に捕捉されるのを可能にするアミノ酸配列を含むように設計され得る。例えば、ｃ−ｍｙｃ、血球凝集素、ポリヒスチジンまたはＦｌａｇ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ）などのタグが、ポリペプチド精製を補助するために使用され得る。かかるタグは、該ポリペプチド内のどこにでも、例えば、カルボキシルまたはアミノ末端にいずれかに挿入され得る。有用であり得る他の融合体としては、該ポリペプチドの検出を補助する酵素、例えば、アルカリホスファターゼが挙げられる。
【００４７】
（処置方法）
他の１つの態様において、本発明は、ニューロン細胞死を抑制するための方法を特徴とする。該方法は、ニューロン細胞をポリペプチドと接触させることを含み、該ポリペプチドは、本発明のアミノ酸配列を含む。ニューロン細胞は海馬の細胞であり得る。上記のように、該ポリペプチドは、好ましくは１６〜４のアミノ酸残基長であり、該ポリペプチドは、ポリペプチド安定化単位を含有し得る。
【００４８】
本明細書において提供されるポリペプチド類は、Ａβの効果を低減、阻害または抑制することにより、ニューロン細胞死を抑制する。例えば、本発明のポリペプチドは、Ａβ誘導性タウリン酸化のレベルを少なくとも２０パーセント低減させるために使用され得る。本明細書において提供されるポリペプチド類はまた、哺乳動物においてＡβ効果を引き起こすＡβの能力を低減させ得る。例えば、本発明のポリペプチドは、哺乳動物内で細胞（例えば、ニューロン）を死滅させるＡβの能力を低減させるために使用され得る。Ａβ効果を引きこす、Ａβの効果における低減またはＡβの能力における低減は、完全な低減（例えば、１００パーセント低減）または不完全な低減（例えば、１００パーセント未満の低減）であり得る。例えば、該実施態様では、低減は、２０パーセントまたはそれ以上の低減であり得る。別の実施態様では、低減は４０パーセントであり得る。
【００４９】
Ａβ効果としては、制限されず、タウリン酸化、神経細線維もつれの形成、ニューロン細胞死、ニューロンの機能不全、シナプスの減少、酸化的ストレスによる細胞の損傷、及び小グリア細胞活性化が挙げられる。かかる効果は、一般的な分子生物学技術を用いて検出または測定され得る。例えば、抗リン酸化抗体によるイムノブロッティングおよび免疫細胞化学技術を用い、タウリン酸化が評価され得る（Ａｕｇｕｓｔｉｎａｃｋら、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，１０３：２６−３５（２００２））。電子顕微鏡検査、チオフラビンＳ組織化学、及び銀染色を用い、タウ病理の進行した病期が検出され得る（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ及びＤａｖｉｅｓ，ＰＮＡＳ，８７：５８２７−３１（１９９０）、Ｂａｎｃｈｅｒら，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，４７７：９０−９９（１９８９）、及びＵｃｈｉｈａｒａら、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ，１０２：４６２−６（２００１））。免疫細胞化学技術を用い、酸化的ストレス（Ａｂｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，７０：４４７−５０（２００２）、ならびにＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ及びＬａｕｄｅｒｂａｃｋ，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，３２：１０５０−６０（２００２））、小グリア細胞活性化（Ｓａｓａｋｉら、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ，９４：３１６−２２（１９９７）及びＥｇｅｎｓｐｅｒｇｅｒら、Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ，８：４３９−４７（１９９８））、シナプスの減少（Ｔｉｒａｂｏｓｃｈｉら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５５：１２７８−８３（２０００）、Ｑｉｎら、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ，１０７：２０９−１５（２００３）、及びＨａｔａｎｐａａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ，５８：６３７−４３（１９９９））、ならびにニューロン細胞死（Ｓｕら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，５：２５２９−３３（１９９４）及びＳｔａｄｅｌｍａｎｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１５５：１４５９−６６（１９９９））が検出され得る。ＤＮＡに結合したときエチジウムホモ二量体によって放たれる蛍光の測定は、哺乳動物内でのニューロン細胞死を検出するために使用され得る。アポトーシスと一致する形態学的特徴（例えば、クロマチンの凝集）を探すためのＮｉｓｓｌ染色と組み合わせたＴＵＮＥＬにより、アポトーシスプロセスにより死亡しつつあるニューロンが検出され得る（Ｓｈｅｎｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５７：３２３−２８（１９９８）及びＰｏｍｐｌら、Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ．，６０：３６９−７６（２００３））。電気生理学を用い、ニューロンの機能不全を暗示し得る長期増強作用の不足が検出され得る（Ｔｒｉｎｃｈｅｓｅら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５５：８０１−１４（２００４））。
【００５０】
いくつかの実施態様では、本明細書において提供されるポリペプチドまたは組成物は、Ａβによって通常誘導されるＡβ効果の程度（例えば、ニューロン細胞死の量）が低減された条件下の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、サル、またはヒト）に投与され得る。本明細書に記載のように、Ａβの効果における低減またはＡβ効果を引き起こすＡβの能力における低減は、完全な低減（例えば、１００パーセント低減）または不完全な低減（例えば、１００パーセント未満の低減）であり得る。例えば、低減は２０パーセントまたは４０パーセントの低減であり得る。
【００５１】
本明細書において提供されるポリペプチド類または組成物は、局所または全身の処置のいずれが所望されるか及び処置される領域に応じて、いくつかの方法によって投与され得る。例えば、本明細書において提供されるポリペプチドまたは組成物は、経口、皮下、くも膜下、脳室内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内または頭蓋内に投与され得る。投与は、即効的（例えば、注射により）であり得るか、またはある期間にわたって行われるもの（例えば、低速注入または低速放出製剤の投与により）であり得る。中枢神経系の組織の処置では、本明細書において提供されるポリペプチド類または組成物は、注射または注入によって脳脊髄液中に、好ましくは、血液脳関門を越える透過を促進できる１種類またはそれ以上の薬剤とともに投与され得る。かかる薬剤の例としては、制限されず、血漿タンパク質トランスフェリン、トランスフェリン受容体に対する抗体（例えば、ＯＸ２６）、インスリン、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、カチオン化されたアルブミン、ＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質の塩基性ドメイン（例えば、Ｔａｔ49〜57）、Ｌ−もしくはＤ−アルギニンの９量体（Ｒ９）、または他のペプトイドアナログ、例えば、グアニジン頭部基と主鎖との間に６個のメチレンのスペーサーを含有するもの（Ｗｅｎｄｅｒら、ＰＮＡＳ，９７：１３００３−１３００８（２０００））が挙げられる。経口投与では、本明細書において提供されるポリペプチド類または組成物は、粉剤もしくは顆粒剤、水もしくは非水性媒体中での懸濁剤もしくは溶液、カプセル、サシェ剤、または錠剤に製剤化され得る。かかる製剤には、増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が組み込まれ得る。
【００５２】
鼻腔内送達について、これは、ペプチド類を血流内に注射の必要性なく送達する方法である。ある種の薬物とともに、該送達は、血液脳関門を迂回するため、及び嗅神経および三叉神経による脳透過を達成するために使用され(sued)得る。該送達では、鼻腔内液状製剤がスプレーとして使用され得るかまたは粉末であり得、いずれも、制御された粒径をもたらすために機械的システムを用いて投与され得る。任意選択で、該送達は、定量エアロゾル系などの定量用量形態であり得る（Ｆｒｅｙ，Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．Ｔｅｃｈ．２（５）：４６−４９，２００２；ＤｉＰｉｅｔｒｉｏ及びＷｏｌｌｅｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔ．Ｃｈｅｍ．，ｐｐ．１９−２２，２００３を参照のこと）。該用量は、１種類またはそれ以上の賦形剤、例えば、凝集阻害剤；電荷調整剤；ｐＨ調整剤；分解酵素阻害剤；粘膜溶解性または粘液除去(mucus clearing)剤；膜透過増強剤、例えば、界面活性剤；血管拡張剤；密着結合調節剤；送達用ビヒクルまたは担体など含んでいてもよい。
【００５３】
埋め込み可能な薬物注入系および脳神経外科用カテーテルを配置できることは、脳への直接的な薬物送達を可能にする。これにより、全身性薬物副作用、末梢での薬物代謝および不活化、血清タンパク質結合、ならびに血液脳関門透過が回避される（Ｈａｒｂａｕｇｈ，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｕｌｌ．２２：１０６−１０９，１９８６）。かかる系は、全身性安定性およびＢＢＢ透過が特に問題であるペプチド系薬物に、理想的に適したものであり得る。脳脊髄液（ＣＳＦ）は、利用可能な区画(accessible compartment)内に含まれ、脳全体を浸しており、それを薬物送達のための理想的な標的としている。カテーテルは、ＣＳＦが脳室から腹膜内に流れるのを可能にする脳室腹腔短絡術として、水頭を有する患者の側脳室内に常套的に配置される。脳室吻合術は、バンコマイシン及びゲンタマイシンなどの抗生物質を感染した患者のＣＳＦに送達するために使用される（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ． １１：６５−６９，１９９１）。また、ｔＰＡは、側脳室内に脳室造瘻術によって、脳室内出血の処置として送達されている（Ｄｅｕｔｓｃｈら、Ｓｕｒｇ．Ｎｅｕｒｏｌ．６１−４６０−４６３，２００４）。また、脳室内注入は、腫瘍の処置のための化学療法剤を用いて行われる（Ｄａｋｈｉｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｐ．６５：４０１−４１１，１９８１；Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｃｋら、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．４４：１−３１，２００５）。またさらに、カテーテルは、腰内臓神経のくも膜下腔の空間内に配置され、痙縮および慢性の痛みの処置のためのバクロフェンまたはモルヒネを送達する埋め込み可能なポンプ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に結合される。
【００５４】
本明細書に記載のポリペプチドまたは任意の組成物を送達するための好ましい方法の１つは、化合物を直接脳室内に、脳室造瘻術によって注射または注入を行うことである。投薬は、０．０１μｇ〜１ｍｇ／体重ｋｇであり得、毎日、毎週１回またはそれ以上またはより低頻度で行われ得る。化合物は側脳室内に、注射、または埋め込み可能なポンプを連続的に用いることによって送達され得る。ポンプは、皮下に鎖骨下窩内に埋め込まれ得、設定された速度の化合物をカテーテルによって脳室造瘻術レザバーに、及び側脳室内に送達し得る。該化合物の投与は等容量的であり得る、すなわち、投与される化合物の容量に相当するＣＳＦの量が、化合物注射の前に取り出される。化合物は、生理食塩水中に溶解および／または希釈させ得る。あるいはまた、化合物を人工脳脊髄液（１４７ｍＭ Ｎａ、２．８８ｍＭ Ｋ、１２７ｍＭ Ｃｌ、１．０ｍＭ リン酸塩、１．１５ｍＭ Ｃａ、１．１０ｍＭ Ｍｇ、１．１０ｍＭ ＳＯ4、２３．１９ｍＭ ＨＣＯ3、５，４１０ｍｇ／Ｌグルコース；３００ｍＯｓｍ／ｋｇ）中で希釈してもよい。
【００５５】
任意の方法を用いて、本明細書において提供されるポリペプチドまたは組成物を製剤化し、その後、投与し得る。投薬は、一般的に、処置される疾患状態の重篤度および応答性に依存性であり、処置過程は、数日間〜数ヶ月間、または治癒が奏効するか、もしくは疾患状態の減衰が達成されるまで持続させる。常套的な方法を用いて、最適な投薬量、投薬方法論、および反復率が決定され得る。最適な投薬量は、個々のポリペプチド類の相対的な効力に応じて異なり得、一般的に、インビトロおよび／またはインビボ動物モデルにおいて有効であることがわかったＥＣ50値に基づいて概算され得る。典型的には、投薬量は、体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ〜約１００ｇであり、毎日、毎週１回またはそれ以上またはより低頻度で与え得る。成功裡の処置後、疾患状態の再発を防ぐため、患者に維持療法を受けさせるのが望ましいことがあり得る。例えば、好ましい経口用量は２００〜４０００ｍｇであり得、好ましくは、１日あたり４回の用量に分割する。
【００５６】
（組成物）
本明細書において提供されるポリペプチド類は、さらなる成分を含有するポリペプチド組成物に製剤化され得る。例えば、本明細書において提供されるポリペプチドは、ポリペプチド安定化分子と組み合わされ得る。ポリペプチド組成物に関して本明細書で用いられる用語「ポリペプチド安定化分子」は、該組成物が哺乳動物の血清に曝露されたとき、該ポリペプチド組成物内での該ポリペプチドの安定性を増大させる化学的部分をいう。ポリペプチド安定化分子は、本明細書において提供されるポリペプチド類の酵素的分解を低減または抑制し得ることに加え、脳内へのその侵入を助長し得る。ポリペプチド安定化分子の例としては、制限されず、リポソーム類、イムノリポソーム類（例えば、トランスフェリンに結合する抗体などの抗体含有リポソーム類）、血漿タンパク質トランスフェリン、トランスフェリンの断片、トランスフェリン(transferring)受容体に対する抗体（例えば、ＯＸ２６）、インスリン、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、及びカチオン化されたアルブミンが挙げられる。ポリペプチド安定化分子は、細胞および／または脳内への該ポリペプチドの取り込みを助長し得る。これらの例としては、制限されず、ＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質の塩基性ドメイン（例えば、Ｔａｔ49〜57）、Ｌ−もしくはＤ−アルギニンの９量体（ｒ９）、または他のペプトイドアナログ、例えば、グアニジン頭部基と主鎖との間に６個のメチレンのスペーサーを含有するもの（Ｗｅｎｄｅｒら、ＰＮＡＳ、９７：１３００３−１３００８（２０００））が挙げられる。いくつかの実施態様では、ポリペプチド安定化分子はハプテン以外の部分であり得る。例えば、ポリペプチド安定化分子はＤＮＰ以外の部分であり得る。
【００５７】
ポリペプチド安定化分子は、ポリペプチド組成物内のポリペプチドに結合された（例えば、共有結合もしくは非共有結合された）もの、または結合されていないものであり得る。例えば、組成物は、該組成物内で該ポリペプチド類に結合されていないポリペプチド安定化分子を含有し得る。該組成物は、１種類またはそれ以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種、またはそれ以上）異なるポリペプチド安定化分子を含有し得る。例えば、組成物は、ＤＡＥＦポリペプチドおよび３種の異なるポリペプチド安定化分子を含有し得る。いくつかの実施態様では、組成物のポリペプチドは同一であり得る。他の実施態様では、いくつかの異なるポリペプチド調製物が組成物内に存在し得る。例えば、組成物は、各々が異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド類を２、３、４、５、６、７、８、９、１０種、またはそれ以上を含有し得る。
【００５８】
ポリペプチド安定化分子は、治療上許容可能なものであり得る。ポリペプチド安定化分子に関して本明細書で用いられる用語「治療上許容可能な」は、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、サル、またはヒト）に投与したとき、その哺乳動物に対して有意な毒性を誘導しないポリペプチド安定化分子をいう。標準的な試験プロトコルを用いて、分子が、哺乳動物に投与したとき有意な毒性を誘導するか否かを判定し得る。
【００５９】
本明細書において提供されるポリペプチド類の１つまたはそれ以上を含有する組成物は、１つまたはそれ以上の薬学的に許容可能な担体、例えば、薬学的に許容可能な溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルを含有し得る。薬学的に許容可能な担体は、液状または固体であり得、所望のかさ、粘稠度、ならびに他の適切な輸送および化学的性質が提供されるように意図された投与の計画された様式により選択され得る。典型的な薬学的に許容可能な担体としては、制限されず、水；生理食塩水溶液；結合剤（例えば、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖類、ゼラチン、または硫酸カルシウム）；滑沢剤（例えば、デンプン、ポリエチレングリコール、または酢酸ナトリウム）；崩壊剤（例えば、デンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）が挙げられる。
【００６０】
医薬組成物は、上記に開示したペプチド類の１つまたはそれ以上を含み得る。本発明により記載される化合物から医薬組成物を調製するために、不活性で薬学的に許容可能な担体は、固形または液状のいずれかであり得る。固体調製物としては、粉剤、錠剤、分散可能な顆粒剤、カプセル、カシェ剤および坐剤が挙げられる。粉剤および錠剤は、約５〜約９５パーセントの活性な化合物で構成され得る。好適な固体担体は、当該技術分野で知られており、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖またはラクトースである。錠剤、粉剤、カシェ剤およびカプセルは、経口投与に適した固体投薬形態として使用され得る。薬学的に許容可能な担体および種々の組成物の製造方法の例は、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，（１９９０），Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａに見られ得る。
【００６１】
液状調製物としては、液剤、懸濁剤および乳剤が挙げられる。例は、非経口注射、または経口液剤、懸濁剤および乳剤用の甘味剤および乳白剤の添加のための水または水−プロピレングリコール溶液であり得る。液状調製物はまた、鼻腔内投与のための液剤を含み得る。
【００６２】
吸入に適したエアロゾル調製物は、溶液および粉末形態の固形物を含み得、これは、不活性な圧縮ガス、例えば、窒素などの薬学的に許容可能な担体と組み合わせてもよい。また、経口または非経口投与いずれかのために、使用直前に、液状調製物に変換されることが意図される固体調製物も含まれる。かかる液状形態としては、液剤、懸濁剤および乳剤が挙げられる。また、本発明の化合物は、経皮的に送達可能なものであり得る。経皮用組成物は、クリーム、ローション、エアロゾルおよび／またはエマルジョンの形態をとり得、この目的のために当該技術分野において慣用的なマトリックス型またはレザバー型の経皮用パッチ内に含め得る。また、本発明の化合物は、皮下送達可能なものであり得る。
【００６３】
好ましくは、医薬調製物は単位投薬形態である。かかる形態において、調製物は、活性化合物の適切な量、例えば、所望の目的を達成するための有効量を含有する、適当な大きさにした単位用量に再分される。単位用量の調製物中の活性化合物の量は、特定の適用に従って、約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ〜約７５０ｍｇ、より好ましくは約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇ、最も好ましくは約０．０１ｍｇ〜約２５０ｍｇで異なり得るか、または調整し得る。用いられる実際の投薬量は、患者の要件および処置される状態の重篤度に応じて異なり得る。具体的な状況のための適正な投薬レジメン(regimen)の決定は、当該技術分野の技量の範囲内である。都合上、全１日投薬量は、必要に応じて、１日の間で複数の部分に分割して投与してもよい。本発明の化合物および／または薬学的に許容可能なその塩の投与の量および頻度は、担当医師が患者の年齢、状態および体格ならびに処置される症状の重篤度などの要素を考慮した判断に従って調節される。経口投与のための典型的な推奨１日投薬レジメンは、１〜４回に分けた用量で約０．０４ｍｇ／日〜約４０００ｍｇ／日の範囲であり得る。
【００６４】
（化合物の同定）
本発明は、本明細書に記載された効果などのＡβの効果の低減させる能力を有する化合物を同定するための方法および材料を提供する。例えば、本明細書において提供される方法および材料を用いて、Ａβによって誘導されるニューロン細胞死のレベルを低減させることができる化合物が同定され得る。一実施態様では、細胞（例えば、脳組織または脳薄片）を、Ａβペプチドの存在下で試験化合物と接触させ得、Ａβの効果レベルが測定され得る。この測定されたレベルを、試験化合物の不存在下でＡβペプチドと接触させた対照細胞を用いて測定されたレベルと比較し得る。対照細胞で観察されるものと比べて、より少ないＡβ効果（例えば、ニューロン細胞死）が、試験化合物およびＡβペプチドと接触させた細胞で観察されるならば、試験化合物は、Ａβの効果を低減させる能力を有し得る。
【００６５】
かかる低減の陽性対照は、ＤＡＥＦ含有ポリペプチド（例えば、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：１）、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦ（配列番号：７）、ＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：３）、ＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：４）、ＤＡＥＦ（配列番号：２）または任意の本発明のポリペプチド類）およびＡβペプチドと接触させた細胞であり得る。他の対照としては、未処理の細胞および／またはβ−アミロイド1〜42またはリバース(reverse)Ａβ（Ａβ42〜1）で処理した細胞が挙げられ得る。いくつかの実施態様では、試験化合物を、脳薄片培養物において、ｓＡＰＰα、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲまたはＤＡＥＦのものと同等の効果を誘導するその能力について評価する。
【００６６】
任意の試験化合物が使用され得る。例えば、試験化合物は、ポリペプチド、脂質、エステル、トリグリセリド、ステロイド、脂肪酸、または小さな分子であり得る。いくつかの実施態様では、試験化合物は、ＤＡＥＦ含有ポリペプチド（例えば、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：１）、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦ（配列番号：７）、ＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：３）、ＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：４）、またはＤＡＥＦ（配列番号：２））などのポリペプチドの構造および／または機能を模倣するように設計された分子であり得る。例えば、試験化合物は、ＤＡＥＦ含有ポリペプチドのペプチド模倣物(peptidomimetic)であり得る。かかるペプチド模倣物は、アミド結合イソスター(isoter)および／または他のペプチド主鎖修飾を含有し得る。例えば、ヘテロ原子が、タンパク質分解性分解を妨げるために使用され得る。いくつかの場合(cased)では、ペプチド模倣物は、例えば、αヘリックスおよび／またはβシートなどの二次構造特性を有し得る。例えば、Ｇｅｌｌｍａｎ，ＳＨ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，３１：１７３−１８０（１９９８）を参照のこと。任意の方法を用いて、別途概説されたものを含む、候補ペプチド模倣物化合物が設計され得る。（Ｆｉｓｈｅｒ，ＰＭ，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，４（５）：３３９−５６（２００３）ならびにＰａｔｃｈ及びＢａｒｒｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６：８７２−８７７（２００２））。いくつかの実施態様では、多数のペプチド模倣物化合物のコンビナトリアルライブラリーを作製し得る。これらの場合において、例えば、比色または蛍光読み出しに基づくハイスループットアッセイを用い、Ａβの効果を低減させる能力を有する化合物が同定され得る。他の場合では、試験化合物のライブラリーをアレイの形態で提供し、化合物を同定するためのハイスループットスクリーニングに供し得る。例えば、Ｇｏｏｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，６０：２２９−２４５（２００１）及びａｌ−Ｏｂｅｉｄｉら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９：２０５−２２３（１９９８）を参照のこと。
【００６７】
Ａβの効果を低減もしくは抑制し得るか、または哺乳動物においてＡβ効果を引き起こすＡβの能力を低減させ得る試験化合物は、一般的な分子生物学技術を用いて得られ得る。例えば、Ａβ効果を検出または測定するための本明細書において提供される技術は、Ａβ効果を低減させる能力を有するポリペプチド類を同定するために使用され得る。一実施態様では、細胞（例えば、培養されたニューロン）を、試験ポリペプチドで前処理した後、Ａβで処理する。処理された細胞を、次いで、細胞死について評価する。試験ポリペプチドで前処理した細胞が、試験ポリペプチド前処理していない対照細胞よりも少ない細胞死を示すならば、試験ポリペプチドは、Ａβ効果を誘導するＡβの能力を低減させるポリペプチドであり得る。
【００６８】
本明細書において提供される試験ポリペプチドの各アミノ酸残基は、２０個の通常の(conventional)アミノ酸残基のうちの１つであり得る。いくつかの実施態様では、該ポリペプチド類は、ポリペプチド内に組み込まれ得る修飾されたアミノ酸残基または任意の他の化学構造の１つまたはそれ以上、例えば、制限されないが、オルニチン、シトルリン、ε−アミノヘキサン酸、ヒドロキシル化アミノ酸（例えば、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、（５Ｒ）−５−ヒドロキシ−Ｌ−リシン、アロ−ヒドロキシリシン、または５−ヒドロキシ−Ｌ−ノルバリン）、グリコシル化アミノ酸（例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、もしくはその組合せを含有するアミノ酸）、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニンもしくはβ−アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−ジアミノ酪酸、デスモシン、２，２−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、６−Ｎ−メチルリシン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、アルギニンのオルニチン修飾、アルギニンのシトルリン修飾、単一もしくは複数の脱酸素化を伴うβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−５−ヒドロキシ−Ｌ−リシン、および単一もしくは複数の脱酸素化を伴う２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−５−ヒドロキシ−Ｌ−リシンを含有し得る。また、アミノ酸残基または化学構造の１つまたはそれ以上のヒドロキシル基をフッ素に置き換えてもよい。例えば、３−フルオロプロリンを創出するために３−ヒドロキシプロリンのヒドロキシ基をフッ素に置き換えることができ、または４−フルオロプロリンを創出するために４−ヒドロキシプロリンのヒドロキシ基をフッ素に置き換えることができる。さらに、アミノ酸残基または化学構造は、Ｃ−またはＳ−またはＯ−グリコシド結合を有するものであり得る。単一のポリペプチドが、かかるアミノ酸残基および化学構造の任意の組合せを含有し得る。例えば、単一のポリペプチドが、１２個の通常のアミノ酸残基、８個のヒドロキシル化アミノ酸、２個のグリコシル化アミノ酸、および１個のオルニチンを任意の順序で含有し得る。
【００６９】
典型的には、本明細書において提供される試験ポリペプチドは、アミド結合（−ＣＯＮＨ−）によって連結されたアミノ酸残基を含有する。いくつかの実施態様では、ポリペプチドは、他の結合、例えば、制限されないが、Ｎ−メチル化（−ＣＯＮＭｅ−）、Ｎ−アルキル化（−ＣＯＮＲ−）、または還元（−ＣＨ2ＮＨ−）によって修飾されたものなどの修飾されたアミド結合、ならびに等配電子体（イソスター）結合、例えば、メチレンエーテル結合（−ＣＨ2Ｏ−）、メチレンチオエーテル結合（−ＣＨ2Ｓ−）、ビニル基結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、エチレン基結合（−ＣＨ2ＣＨ2−）、ケトメチレン基結合（−ＣＯＣＨ2−）、チオアミド結合（−ＣＳＮＨ−）、及びスルホン結合（−ＣＨ2ＳＯ−）によって連結されたアミノ酸残基または化学構造を含有し得る。単一のポリペプチドは、結合の任意の組合せによって連結されたアミノ酸残基または化学構造の配列を含有し得る。例えば、単一のポリペプチドは、全くアミド結合のみによって、またはアミド結合、メチレンエーテル結合およびスルホン結合の組合せによって連結されたアミノ酸残基の配列を含有し得る。
【００７０】
本明細書において提供される試験ポリペプチド類は、遊離のＮ−及びＣ−末端を有するように線状ポリペプチド類であり得る。該ポリペプチド類は、ジスルフィド結合を含有するように遺伝子操作されたものであり得るか、または別途記載（Ｅｇｌｅｔｏｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １８：１４３１−３９（１９９７）ならびにＩｗａｉ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４５９（２）：１６６−７２（１９９９））のように環化されるように設計されたものであり得る。例えば、ＤＡＥＦ配列を含有するポリペプチドは、１つまたはそれ以上のジスルフィド結合が該ポリペプチド内に形成されるように、２個またはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上）のシステイン残基を含有し得る。ジスルフィド結合を含有するポリペプチド類は、ジスルフィド結合を欠く類似のポリペプチド類よりも分解に対してより安定であり得る。２つまたはそれ以上のポリペプチド類が、ヒドラジド架橋によって連結され得る。ヒドラジド架橋は、カルボキシペプチダーゼ活性による分解を防御し得る。ポリペプチド類は、該ポリペプチドが環化されるようにジスルフィド架橋（例えば、２個のＤ−ペニシラミン残基による）を含有し得る。環化されたポリペプチド類は、環化されていない類似のポリペプチド類よりも分解に対してより安定であり得る。
【００７１】
本明細書において提供される試験ポリペプチド類は、さらなるアミノ酸配列、例えば、一般的にタグとして用いられるもの（例えば、ポリ−ヒスチジンタグ、ｍｙｃタグ、ＧＦＰタグ、及びＧＳＴタグ）を含有し得る。例えば、ＤＡＥＦ配列を含有するｓＡＰＰαポリペプチドの５０アミノ酸断片は、蛍光ポリペプチド（例えば、ＧＦＰ）のアミノ酸配列を含有し得る。
【００７２】
任意の型の細胞が使用され得る。例えば、１つの好ましい実施態様では、ニューロン細胞培養物または脳組織試料（例えば、脳薄片）が使用され得る。また、該方法はインビボまたはインビトロで行われ得る。例えば、マウス内のニューロン細胞を、試験化合物をマウスの脳内に注射することにより、試験化合物と接触させ得る。
【００７３】
Ａβペプチドは、任意の型のＡβペプチド、例えばヒトβアミロイド1〜42であり得る。また、任意の方法を用いて、細胞をＡβペプチドと接触させ得る。例えば、Ａβペプチドを、培養中の細胞に投与し得る。いくつかの実施態様では、細胞を、Ａβペプチドをエンコードする核酸を含有する細胞によって発現されるＡβペプチドと接触させ得る。例えば、ニューロン細胞は、Ａβペプチドを放出することがわかっているＡＰＰ配列をエンコードする核酸を含有するように設計され得る。任意の方法を用いて、Ａβの効果を低減させる試験化合物の能力を評価し得る。例えば、本明細書に記載のものなどの染色手法は、細胞死を評価するために使用され得る。
【００７４】
本明細書において提供される方法および材料はまた、神経保護性ポリペプチド、例えば、ＴＴＲ及びＩＧＦ−２などの発現を増大できる化合物を同定するために使用され得る。例えば、細胞（例えば、脳組織または脳薄片）を試験化合物と接触させ得、神経保護性ポリペプチドをエンコードする核酸の発現レベルを、該ポリペプチドレベル及び／又はｍＲＮＡレベルを測定することにより決定することができる。任意の方法がポリペプチドレベルを測定するために使用され得、例えば、制限されないが、ＥＬＩＳＡ手法、抗体染色手法、及び生物学的活性アッセイが挙げられる。また、任意の方法がｍＲＮＡレベルを測定するために使用され得、例えば、制限されないが、ＲＴ−ＰＣＲ技術および発現アレイ技術が挙げられる。
【００７５】
ポリペプチドまたはｍＲＮＡの発現のレベルを、試験化合物と接触させていない対照細胞について測定されたポリペプチドまたはｍＲＮＡの発現レベルと比較し得る。対照脳組織で観察されるものと比べて、より少ないポリペプチドまたはｍＲＮＡ発現が試験化合物と接触させた細胞で観察されるならば、試験化合物は、Ａβの効果を低減させる能力を有し得る。かかる低減の陽性対照は、ＤＡＥＦ含有ポリペプチド（例えば、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：１）、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦ（配列番号：７）、ＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：３）、ＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：４）、またはＤＡＥＦ（配列番号：２））と接触させた細胞であり得る。他の対照としては、未処理の細胞（例えば、未処理の脳組織）が挙げられ得る。
【００７６】
神経保護性ポリペプチドをエンコードする核酸の発現レベルを増大させる試験化合物の有効性は、試験化合物と接触させた細胞で観察される発現レベルをＤＡＥＦ含有ポリペプチドと接触させた細胞で観察される発現レベルと比較することにより測定され得る。ＤＡＥＦ含有ポリペプチドと接触させた細胞で観察されるものと比べ、試験化合物と接触させた細胞で同等または高いレベルの発現が観察されることは、試験化合物が、神経保護性ポリペプチド発現の強力な活性化物質であることを示し得る。
【００７７】
本明細書において提供される方法および材料は、ｓＡＰＰαの存在に応答して、細胞によるその発現を改変させることができるポリペプチドの発現を増大または減少できる化合物を同定するために使用され得る。例えば、細胞（例えば、ニューロン細胞）を、試験化合物と接触させ、試験化合物と接触させていない対照細胞による該ポリペプチドの発現と比べて、ｓＡＰＰαの存在に応答した細胞によるその発現を改変させることができるポリペプチドの改変された（例えば、増大または減少した）発現が示されているか否かを調べるために評価し得る。かかるポリペプチド類の例としては、制限されず、ＴＴＲポリペプチド類及びＩＧＦ−２ポリペプチド類が挙げられる。ポリペプチドの発現の増加または減少は、ポリペプチドレベル及び／又はｍＲＮＡレベルを測定することにより決定され得る。
【実施例】
【００７８】
（実施例１−方法および材料）
（動物）
Ｔｇ２５７６マウスを、既報のＨｓｉａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：９９−１０２（１９９６））のとおりにして作出した。簡単には、これらは、二重変異Ｋ６７０Ｎ及びＭ６７１Ｌ（スウェーデン変異）を有し、プリオンタンパク質プロモーターによって駆動されるヒトアミロイド前駆体タンパク質６９５を含む。この試験では、トランスジェニック及び非トランスジェニック対照マウスを、Ｃ５７Ｂ６／ＳＪＬ種畜に対して戻し交配したＣ５７Ｂ６／ＳＪＬ Ｎ２世代Ｔｇ２５７６マウスから作製した。マウスを１２及び１８ヶ月齢で致死させた。
【００７９】
（海馬器官型培養物）
Ｃ５７Ｂ６／ＳＪＬマウスの子に対し、生後第１５日に麻酔して断頭した。脳を取り出し、氷冷解剖(dissecting)培地（５０％最少必須培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、５０％ハンクス平衡塩溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及び３６ｍＭグルコース）中に入れた。両方の海馬を解剖顕微鏡下で解剖し、Ｍｃｌｌｗａｉｎティッシュチョッパーにて４００μｍに切断した。薄片をばらばらにし、６ウェル培養プレート内に保持した３０ｍｍ直径及び０．４μｍフィルター孔サイズを有するフィルターインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上に配置した。最初の３日間、薄片を、Ｂ−２７サプリメント、１ｍＭグルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中に維持した。続いて、抗生物質を含まない培地を用い、培地を３日毎に交換した。器官型培養物を加湿インキュベーター内に、３７℃で５％Ｏ2及び５％ＣＯ2中、１４〜２１日間維持した。
【００８０】
細胞死および生存能力を、生薄片において、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ’ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｋｉｔの蛍光プローブを用いて測定した。カルセインＡＭ（１：４００）及びエチジウムホモ二量体（１：１０００）含有リン酸緩衝生理食塩水中で４０分間のインキュベーション後、薄片を、Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ ２００倒立顕微鏡により２００×倍率で、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＭＲＣ−１０２４ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌシステム（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて可視化した。ニューロン野の無作為の画像を、各プローブの発光スペクトルにおいて取り込み、Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を用いて生細胞および死細胞の数を定量した。各薄片について、ニューロン野を含む少なくとも３つの領域をイメージングし、死滅のパーセントを調べた。死滅のパーセントは、ＥｔｈＤ−１陽性細胞の数をＥｔｈＤ−１及びカルセインＡＭ陽性細胞の総数で除算して算出した。
【００８１】
（ＴＵＮＥＬ及びＮｉｓｓｌ染色による細胞死の検出）
１つの処置あたり３例の動物由来の海馬薄片の凍結切片を、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介型ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）で染色した。ＤＮＡ断片化を有する細胞を、ＤＮＡ内へのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−１２−ｄＵＴＰのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ取り込みによって測定した（Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）。他の切片は酢酸クレシルバイオレットで染色し、健常な核を有するニューロンならびに凝縮および凝集したクロマチンを有するニューロンをニューロン野内で計測した。
【００８２】
（免疫組織化学）
マウスをＣＯ2で致死させ、速やかに、心臓を介してリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を灌流した。右半球を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中に一晩固定し、３０％スクロース中に浸漬させ、ＯＣＴ包埋培地中で凍結させた。海馬薄片を４％ＰＦＡ中で２０分間固定し、３０％スクロース中で一晩インキュベートし、ＯＣＴ包埋培地中で凍結させた。１０μｍの幅の凍結切片を海馬から採取した。死後ヒト組織をホルマリン固定し、１０μｍに切断し、抗原回復のために１０分間、１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ １）中で煮沸した。ＩＧＦ−２及びＴＴＲは、ＩＧＦ−２（Ｆ−２０）またはＴＴＲ（Ｃ−２０；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）に対するポリクローナル抗体の１：２００希釈物により検出された。ホスホ−ＢＡＤ（Ｓｅｒｌ １２；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、及びＢＡＤ（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）は、それぞれのポリクローナル抗体の１：２５０希釈物により検出された。リン酸化されたタウは、モノクローナルＡＴ８抗体（１：２００；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）及び抗ホスホ−タウ（Ｔｈｒ２３１）（１：５００；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により検出された。対照として、免疫前ウサギもしくはマウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）またはヤギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を、一次抗体の代わりに用いた。ビオチン化抗ヤギＩｇＧ、抗ウサギＩｇＧ、または抗マウスＩｇＧを二次抗体として用いた。最後に、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８または５６８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）のいずれかにコンジュゲートさせたチラミドを用い、抗体染色を可視化した。抗ＮｅｕＮ（１：２５０；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）及び４Ｇ８（１：２５０；Ｓｉｇｎｅｔ，Ｄｅｄｈａｍ，ＭＡ）を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８にコンジュゲートさせた抗マウスＩｇＧ二次抗体とともに用い、ＮｅｕＮ及びＡβを検出した。ＤＮＡ結合色素ＴｏＰｒｏ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）またはＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて核を可視化した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌシステムまたはエピ蛍光（Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）のいずれかを用いて切片をイメージングした。代表的な図を、３例のＡＰＰSwマウス及び３例の非トランスジェニック対照、海馬薄片の１処理につき３例の動物、または４例のヤギＩｇＧ及び４例の抗ＴＴＲ抗体注入マウスから得た。
【００８３】
（電子顕微鏡）
５０μＭ ＡβまたはリバースＡβで２４時間の処理後、海馬薄片培養物を、０．１Ｍ Ｓｏｒｅｎｓｏｎｓリン酸塩バッファー（ｐＨ ７．４）中２％ＰＦＡ／２．５％グルタルアルデヒドの混合物で１時間固定し、次いで、同じバッファー中２％四酸化オスミウムにおいて１時間、後固定した。次いで、薄片を、エタノール系列で脱水し、Ｅｐｏｎエポキシ樹脂内に包埋した。極薄切片をＲｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇミクロトームにて切断し、銅グリッド上に配置し、慣用濃度の酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色した。Ｐｈｉｌｉｐｓ ＣＭ１２０電子顕微鏡により顕微鏡写真を撮影した。
【００８４】
（処理）
β−アミロイド1〜42及びリバースＡβ（Ａβ42〜1）を、ＢＡＣＨＥＭ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）から入手した。これらのポリペプチド類を０．１％ＮＨ3ＯＨに２２２μＭで溶解した。処理のため、Ａβを５０μＭで、Ｂ−２７サプリメント及び１ｍＭグルタミンを加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で３７°Ｃにて２４時間凝集させた。次いで、薄片培養培地を除去し、薄片を、１ｍＬの２５μＭもしくは５０μＭ Ａβ、リバースＡβ、またはビヒクルで２４時間処理した。ヒトＴＴＲ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）またはＩＧＦ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を薄片に、Ａβ処理とともに３μＭ（ＴＴＲ）または５００ｎＭ（ＩＧＦ−２）の最終濃度で添加した。ｓＡＰＰαは、既報（Ｍａｔｔｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｎ，１０：２４３−２５４（１９９３））のとおりにして調製した。
【００８５】
特に記載のない限り、すべてのｓＡＰＰα処理は、１ｎＭで、Ａβ添加前に４８時間行った。ＴＴＲ（Ｃ−２０）またはＩＧＦ−２（Ｆ−２０；４μｇ／ｍＬ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）またはｓＡＰＰα（６Ｅ１０；１０μｇ／ｍＬ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に対する抗体を薄片に、ｓＡＰＰα処理とともに添加した。ヤギＩｇＧ（４μｇ／ｍＬ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）またはマウスＩｇＧ1（１０μｇ／ｍＬ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を、対照として添加した。ｓＡＰＰαのカルボキシル末端領域の１０アミノ酸断片（ＡＰＰ６９５の５９２〜６０１；ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ；配列番号：１；Ｓｉｇｍａ）を、ｓＡＰＰαと同じプロトコルに従って付加した。
【００８６】
ＳｉＲＮＡを、マウスｍＲＮＡ配列に基に、Ａｍｂｉｏｎ Ｓｉｌｅｎｃｅｒ ｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いて創出した。数種類のｓｉＲＮＡを、各サイレンス化遺伝子についてインビトロ転写によって創出した。ビヒクル、またはＡｍｂｉｏｎ ｓｉＰＯＲＴアミントランスフェクション薬剤中でポリアミン類と組み合わせた２５ｎＭ ｓｉＲＮＡを用いたｓＡＰＰα処理の前に、トランスフェクションを４時間３７℃で行った。トランスフェクションは、１ｍＭグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で行った。成功裡のｍＲＮＡ標的配列は以下のとおりである。
【００８７】
【化１】
【００８８】
（マイクロアレイ解析）
全ＲＮＡを、ビヒクルまたは１ｎＭ ｓＡＰＰαのいずれかで２４時間処理した雄非トランスジェニックマウスの海馬薄片から抽出した。全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により単離し、既報（Ｓｔｅｉｎ及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２２：７３８０−７３８８（２００２））のとおりにしてｃＲＮＡを合成するために使用した。
【００８９】
１５μｇの断片化したｃＲＮＡを、１６時間４５℃で、ＭＧ−Ｕ７４Ａｖ２アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）にハイブリダイズさせた。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ ５．０を用いてスキャンし、各遺伝子の相対存在度を強度シグナル値から解析した。有意に変化した遺伝子を、各比較でウィルコクソンのサインランク検定を用いて測定した。ｐ値＜０．０１を有するプローブセットを増大／減少と称し、０．０１＜ｐ値＜０．０５の範囲のｐ値を有するプローブセットをわずかに増大／減少と称し、残りのプローブセットを変化なしと称した。変化なし＝０、わずかな増大／減少＝１／−１、及び増大／減少＝２／−２（Ｌｉ及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，９：１３７−１４４（２００２））であるさらなるレベルのランキングを用いて多数の比較を組み入れた。最終のランクは、９つの比較のランクの合計に等しいものであり、該値は、海馬薄片における３×３の比較で、−１８〜１８までで異なった。増大または減少した遺伝子発現の最終の測定値のカットオフ値は、増大した遺伝子ではランク≧９及びＦＣ≧１．２、ならびに減少した遺伝子ではランク≦−９及びＦＣ≦−１．２と設定した。遺伝子発現の強度値を平均＝０及び分散＝１に対して標準化し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ Ｔｏｏｌの自己組織化マップ（ＳＯＭ）アルゴリズムを用いてクラスター化した。
【００９０】
（注入）
１８ヶ月齢のＡＰＰSwマウスに、イソフルランガス麻酔系で深く麻酔し、定位固定装置（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ，Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ，ＩＬ）内に配置した。切除を行って頭蓋を露出させ、Ｄｒｅｍｅｌドリルを用いて頭骨に孔をあけた。Ａｌｚｅｔ Ｂｒａｉｎ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｌｚｅｔ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）のカニューレを定位的に、ＡＰＰSwマウスの右海馬内に埋め込み（ブレグマに対する座標：前後軸＝−２．７ｍｍ，内外方向＝−３．０ｍｍ，及び背腹方向＝−３．０ｍｍ）、シアノアクリレートで所定の位置にセメント固定した。２００μＬの１００μｇ／ｍＬヤギＩｇＧまたは抗ＴＴＲ抗体（Ｃ−２０，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を含む浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ）を、皮下の中肩甲部(mid-scapular)領域内に挿入した（流速０．５μＬ／時間）。処理液を、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ2、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ4、２．０ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4、及び１０．０ｍＭグルコースを含有する人工ＣＳＦ（ｐＨ７．４）中で希釈した。頭皮を縫合し、マウスをそのホームケージに戻した。２週間後、ヤギＩｇＧ及び抗ＴＴＲ注入マウスを致死させ、速やかに心臓を介して氷冷ＰＢＳを、その後４％ＰＦＡを、灌流した。
【００９１】
（立体解析学）
４例のヤギＩｇＧ及び４例の抗ＴＴＲ抗体注入マウスを、海馬全体を５０μｍの厚さで切片にした。第６切片毎にクレシルバイオレットで染色し、ＣＡ１錐体ニューロン野内の健常な核およびインタクトな核を有するニューロンを、光学的分画採取(fractionator)技術（Ｗｅｓｔ及びＧｕｎｄｅｒｓｅｎ，１９９０）を用いて計測した。凝集したクロマチンを保有するＣＡ１錐体ニューロン野内の細胞を個々に計測した。計測は、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ ２顕微鏡（Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において１０００×倍率で行った。各光学的解剖器具は、拡張排除ライン(extended exclusion line)、１９μｍの高さ、ならびに３μｍの上部及び下部ガードゾーンを有する３０×３０μｍ計算盤から構成された。ニューロン及び核濃縮細胞の総計測数は、ＣＡ１全体の体系的無作為試料採取から、Ｍｉｃｒｏｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ Ｓｔｅｒｅｏ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウェア（Ｃｏｌｃｈｅｓｔｅｒ，ＶＴ）を用いて得た。
【００９２】
（統計学的解析）
示したすべての実験データは、少なくとも３回繰返したものとした。結果を平均±ＳＥＭとして示す。特に記載のない限り、統計学的有意性は、対応のない(unpaired)両側スチューデントｔ検定を用いて決定し、ｐ値＜０．０５を有意であるとみなした。
【００９３】
（実施例２−Ａβは、器官型海馬培養物においてニューロン死を誘導する）
器官型海馬培養物は、海馬の構造を維持し、成熟シナプス特性、例えば、別途（Ｂａｈｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４２：２９４−３０５（１９９５）及びＭｕｌｌｅｒら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，７１：９３−１００（１９９３））記載のような長期増強作用を有するシナプス結合を含んだ。典型的には胚の脳に由来する解離培養物と比べ、薄片は、インタクトな成体脳のより関連性のあるモデルを表す。したがって、このモデルを用い、ｓＡＰＰαによるＡβ誘導性のニューロン毒性および保護を試験した。２週間後、培養状態で、アンモン角（ＣＡ）ニューロン野は保存され、分裂後期ニューロンマーカーＮｅｕＮで陽性に染色された。
【００９４】
エチジウムホモ二量体（ＥｔｈＤ−１）は、インタクトな原形質膜を有する生細胞から消去される膜不透過性ＤＮＡ結合色素である。カルセインＡＭは、機能性細胞内エステラーゼを有する生細胞において蛍光を発する細胞不透過性色素である。リバースＡβで処理した生薄片をＥｔｈＤ−１及びカルセインＡＭとともにインキュベートすると、海馬のニューロン野内の多くのニューロンがカルセインＡＭに対して陽性に染色されたが、ＥｔｈＤ−１で陽性に染色されたのはほんの少数であった。しかしながら、２５μＭもしくは５０μＭ Ａβのいずれかでの処理により、膜完全性を失ったニューロン（ＥｔｈＤ−１陽性）の数の劇的な増加がもたらされた。
【００９５】
ニューロン死と一致して、リバースＡβではなく、２５μＭもしくは５０μＭ Ａβいずれかでの処理によりＤＮＡ鎖破断がもたらされ、これは、ＴＵＮＥＬによって示された。レーザー走査共焦点システムからの透過イメージにより、ＴＵＮＥＬ陽性細胞はニューロン野内に位置することが示された。最後に、アポトーシスの割合を、Ｎｉｓｓｌ染色した薄片のＣＡニューロン野内で測定した（図１）。健常なニューロンでは、クロマチンが分散し、クレシルバイオレットで強く染色されなかった。しかしながら、アポトーシスの重要な特徴であるクロマチンの凝集が起こった死滅中の細胞では、強い染色が観察された。２５μＭもしくは５０μＭ Ａβでの処理により、クロマチンの凝集を伴うニューロンの割合の有意な増加がもたらされた。１ｎＭ ｓＡＰＰαでの４８時間の前処理により、Ａβ誘導性ＴＵＮＥＬ染色および核濃縮が抑制された（図１）。
【００９６】
（実施例３−Ａβはタウリン酸化を誘導する）
モノクローナル抗体ＡＴ８は、時として、対合したらせん状のフィラメント（ＰＨＦ）として凝集するリン酸化タウを認識する。そのエピトープは、アミノ酸２０２にリン酸化セリンを含む。ＡＤ患者内の多くのニューロンは、ＡＴ８抗体によって認識されるＰＨＦを含有する。ビヒクル及びリバースＡβ処理海馬薄片は、門部周囲および放射線維層内の一部の細胞のＡＴ８染色を示した。また、これらの細胞の一部は、マウスＩｇＧを一次抗体として用いた場合、陽性に染色され、この染色が、非特異的抗原の存在またはマウスＩｇＧ様タンパク質の発現によるものであり得ることを示す。しかしながら、対照マウスＩｇＧでは、海馬のニューロン野内での染色は起こらなかった。ＡＴ８抗体での染色では、ビヒクルまたはリバースＡβ処理薄片のＣＡまたは歯状回海馬のニューロン野において、陽性に染色されたニューロンはほとんどもたらされなかった。対照的に、２５μＭ Ａβまたは５０μＭ Ａβで処理した場合、海馬のニューロン野内の多くのニューロンがＡＴ８陽性であった。これらのニューロンはまた、ＥｔｈＤ−１でも陽性に染色され、Ａβ誘導性細胞の損傷を示す。ＡＴ８染色により、ＡＤ患者において起こるタウ病理と類似するタウのニューロン細胞体および樹状細胞での再分布が示された。さらに、多くのＡＴ８陽性ニューロンにより、ニューロンの変性と一致する数珠状形成(beaded)プロセスが示された。ｓＡＰＰαでの前処理により海馬のニューロン野内でのＡβ誘導性ＡＴ８染色が抑制された。
【００９７】
トレオニン２３１においてリン酸化されたタウに関して陽性のニューロンを含むビヒクルまたはリバースＡβ処理薄片はなかった。しかしながら、２５μＭ Ａβまたは５０μＭ Ａβで処理した薄片では、いくつかのニューロンがその細胞体内および過程(process)においてホスホ−タウ（Ｔｈｒ−２３１）に対して陽性に染色された。これらのニューロンはまた、ニューロンの変性を示す広範性のＮｅｕＮ染色および濃縮した核を有した。１ｎＭ ｓＡＰＰαでの前処理により、ホスホ−タウ（Ｔｈｒ−２３１）のＡβ誘導性蓄積が抑制された。ホスホ−タウ（Ｔｈｒ−２３１）に関するイムノブロットを、５０μＭ リバースＡβ、５０μＭ Ａβ、及び１ｎＭ ｓＡＰＰα＋５０μＭ Ａβで処理した薄片において行った。各処理には、４例の動物に由来する１６個の薄片を含めた。免疫組織化学結果と同様、５０μＭ Ａβでの処理により、海馬薄片内でのリン酸化タウのレベルが増大した。Ａβ誘導性タウリン酸化は、１ｎＭ ｓＡＰＰαでの前処理によって抑制された。電子顕微鏡検査により、５０μＭ Ａβで処理した海馬薄片由来のいくつかのニューロンの細胞質内で、長いまっすぐなフィラメントの存在が示された。フィラメントの多くは対合しており、直径が約１５〜２９ｎｍで、多くの場合、凝集したクロマチンを伴う断片化された核に隣接して観察された。一部の対合したフィラメントは、早期もつれ形成と一致して、約６０〜１２０ｎｍの周期性で捩れていた。これらのフィラメントは、５０μＭ リバースＡβで処理した薄片においては観察されなかった。
【００９８】
高レベルのＡβは、マウス海馬薄片において、タウリン酸化、対合したフィラメントの形成、及びニューロン死を誘導した。しかしながら、変異型ＡＰＰを過剰発現し、マイクロモルレベルのＡβを含むマウスは、これらの病理を発現しない。これが神経保護性ポリペプチドの発現によるものであるか否かを調べるため、ＡＰＰSwを過剰発現するマウス系統を調べた。
【００９９】
（実施例４−神経保護性遺伝子およびポリペプチドは、老齢ＡＰＰSwマウスでは増加しているが、ＡＤ患者では増加していない）
ＡＤにおける遺伝子発現レベルとは対照的に、数種類の成長因子およびトランスチレチン（ＴＴＲ、アミロイド分離(sequestration)ポリペプチド）のｍＲＮＡレベルは、１２ヶ月齢ＡＰＰSwマウスにおいて上方調節される（表１）。簡単には、１２ヶ月齢の雄非トランスジェニック（ｎ＝２）マウス及びＡＰＰSwマウス（ｎ＝２）由来の海馬を、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド解析用に加工処理した。変化の平均倍数を２×２クロス(cross)から算出し、有意に変化した遺伝子を、各比較でウィルコクソンのサインランク検定を用いて調べた。ｐ値＜０．００１を有するプローブセットを増大／減少と称し、０．００１＜ｐ値＜０．００５の範囲のｐ値を有するプローブセットをわずかに増大／減少と称し、残りのプローブセットを変化なしと称した。変化なし＝０、わずかな増大／減少＝１／−１、及び増大／減少＝２／−２であるさらなるレベルのランキングを用いて多数の比較を組み入れた。最終のランクは、４つの比較のランクの合計に等しいものであり、該値は、−８〜８までで異なった。増大または減少した遺伝子発現の最終の測定値のカットオフ値は、増大した遺伝子ではランク≧４及びＦＣ≧１．５、ならびに減少した遺伝子ではランク≦−４及びＦＣ≦−１．５と設定した。
【０１００】
インスリン様成長因子２は、ＡＰＰSwマウスにおいて、６ヶ月齢（プラーク前；Ｓｔｅｉｎ及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２２：７３８０−７３８８（２００２））ならびに１２ヶ月齢（プラーク後；表１）の両方で上方調節される。１２ヶ月齢では、インスリンは、ＡＰＰSwマウスの海馬内で１１倍上方調節される（表１）。ＩＧＦ−２及びインスリンの両方が、ＩＧＦ−１受容体に結合し得、ＢＡＤリン酸化において最高点に達する生存経路を活性化し得る。
【０１０１】
【表２−１】
【０１０２】
【表２−２】
【０１０３】
【表２−３】
【０１０４】
【表２−４】
【０１０５】
タンパク質レベルでは、１２ヶ月齢ＡＰＰSwマウスは、海馬の細胞外空間および特にニューロン野周囲で、劇的に増大したレベルのＴＴＲ及びＩＧＦ−２を有した。また、ＩＧＦ−２は、一部のニューロンの周囲およびニューロン過程に局在する。ＢＡＤは、その非リン酸化状態においてプロアポトーシス性ポリペプチドである。しかしながら、セリン１１２または１３６においてリン酸化されると、ＢＡＤポリペプチド類は、１４−３−３タンパク質に結合し、抗アポトーシス性ＢＣＬ−２ファミリーメンバーであるＢＣＬ−２及びＢＣＬ−ＸLを放出する。ホスホ−ＢＡＤ（１１２）の免疫組織化学により、非トランスジェニック対照と比較した場合、海馬のニューロン野のＮｅｕＮ陽性ニューロン内での増加が示された。対照的に、海馬のニューロン内の全ＢＡＤのレベルは、非トランスジェニックとＡＰＰSwマウスとの間で変化はなかった。
【０１０６】
ＡＤでは、これらの変化の多くは起こらず、実際は、反対であり得る。例えば、全ＢＡＤのレベルは、ＡＤ側頭皮質内で増加し得る（Ｋｉｔａｍｕｒａら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，７８０：２６０−２６９（１９９８））。他方において、免疫組織化学により、海馬の錐体ニューロン内において、対照（ｎ＝５）とＡＤ（ｎ＝６）患者との間で変わらない全ＢＡＤのレベルが示された。ＩＧＦ−２レベルは、海馬のニューロン野の錐体ニューロンの周囲で検出可能であり、対照とＡＤ患者との間で一貫して異ならなかった。ＴＴＲレベルは、ＡＤ患者のＣＳＦ内で低下していることが示されている（Ｓｅｒｏｔら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，６３：５０６−５０８（１９９７））。ＴＴＲは、死後脳の免疫組織化学によって検出したとき、対照またはＡＤ患者の海馬のニューロン野内または周囲でほとんどないし全く観察されなかった。しかしながら、ＴＴＲ沈着物は、すべてのＡＤ患者の海馬内で多くのＡβプラークと同時局在した。ＡＤ患者においてＡβプラークを染色するＩＧＦ−２及び対照ヤギＩｇＧは、いずれも観察されなかった。また、ＡＤ患者の海馬内のまばらに存在するニューロンには、ＴＴＲと同時局在する高レベルの細胞内Ａβが含まれた。垂直な切片により、ＡβとのＴＴＲの明確な同時局在が示された。これらの結果は、５例の対照（平均年齢＝７１．４±２．９歳）及び６例のＡＤ患者（平均年齢＝７７．３±３．８歳）から得られたものを代表する。
【０１０７】
（実施例５−ｓＡＰＰα駆動型の遺伝子およびポリペプチド発現）
マウスモデルとヒトＡＤとの大きな違いの１つは、完全長ＡＰＰの過剰発現であり、これは、マウスにおいて５倍またはそれ以上であり得る（Ｈｓｉａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：９９−１０２（１９９６））。したがって、ＡＤの場合と異なり、ＡＰＰのすべての切断生成物は、おそらく、変異型ＡＰＰを過剰発現するマウスモデルにおいて上方調節される。本明細書において示すように、ｓＡＰＰαは、Ａβ誘導性タウリン酸化およびニューロン死を防御し得る。したがって、ＡＰＰSwマウスにおける高レベルのｓＡＰＰαは、神経保護性ＴＴＲ、ＩＧＦ−２、及びホスホＢＡＤの増大レベルの一因であり得る。
【０１０８】
簡単には、４例のＡＰＰSwマウス及び４例の非トランスジェニック対照に由来の切除された海馬を、溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ４０、１Ｍ ＰＭＳＦ、３ｍＭベンズアミジン、２００μＭロイペプチン、２０μＭアプロチニン、１００μＭオルトバナジン酸ナトリウム、２ｍＭジチオトレイトール）中で個々にホモジナイズした。１２０００×ｇで１０分間遠心分離した後、可溶性画分を採取した。全タンパク質レベルを、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）比色アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて測定した。ＳＤＳ−還元バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルー、ｐＨ ６．８）を組織ライセートに添加し、試料を９５°Ｃまで１０分間加熱した。１ウェルあたり５０μｇの全タンパク質を載置し、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。ゲルをポリビニリデンジフルオリド膜に移し、膜を、ｓＡＰＰαに対するモノクローナル抗体である６Ｅ１０（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）の１：２００希釈物を用いてイムノブロッティングした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体（１：２０００）及びＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光性基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてバンドを可視化した。バンドを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ３００ Ａ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて定量した。海馬のｓＡＰＰα濃度を推定するため、標準曲線をｓＡＰＰαに関して作成し、２３μＬの推定マウス海馬容積を用いた（海馬の重量に対して）。
【０１０９】
非トランスジェニックマウスは、海馬内で事実上、検出不可能なレベルのｓＡＰＰαを有することがわかったが、ＡＰＰSwマウスは、有意に高い量を有した（図２）。４Ｇ８抗体は、完全長ＡＰＰ及びＡβに結合するが、ｓＡＰＰαには結合せず、図２に示すようなバンドは認識しない。しかしながら、ＡＰＰSwマウスにおいて、完全長ＡＰＰを表す約１３０ｋＤａにおける弱いバンドが、６Ｅ１０及び４Ｇ８抗体によって認識された。このバンドは、ｓＡＰＰαのバンドと比べて弱く、ＡＰＰの大部分がα−またはβ−セクレターゼによって切断されることを示す。イムノブロッティングを用い、ＡＰＰSwマウス海馬内のｓＡＰＰαの平均濃度は、１．２±０．７μＭであると測定された。
【０１１０】
次に、器官型海馬薄片をビヒクルまたは１ｎＭ ｓＡＰＰαで２４時間処理し、ＲＮＡを単離し、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ解析を行った。試料は、ビヒクル（ｎ＝３）またはｓＡＰＰα（ｎ＝３）で処理した薄片で構成されるものであった。各試料は、４例の動物由来の８〜１２個の薄片をプールしたものとした。変化の平均倍数を３×３比較から算出した。ｓＡＰＰαでの処理により、４５個の遺伝子およびＥＳＴの発現レベルにおける有意な増加（ランク≧９）がもたらされた（表２）。ｓＡＰＰα処理によって有意に減少した遺伝子またはＥＳＴはなかった。成体ＡＰＰSwマウスと同様に、ｔｔｒは、最大倍数変化（８．９倍）を伴う遺伝子の１つであった。また、ｉｇｆ−２及びインスリン様成長因子結合タンパク質２（ｉｇｆｂｐ２）のｍＲＮＡレベルは、ｓＡＰＰαによって増大した。アポトーシス阻害、解毒およびレチノール輸送などの保護経路に関与する数種類の他の遺伝子が、ｓＡＰＰαによって上方調節された（表２）。
【０１１１】
【表３−１】
【０１１２】
【表３−２】
【０１１３】
免疫組織化学により、１ｎＭ ｓＡＰＰα処理海馬薄片の細胞外空間内で、ＴＴＲ及びＩＧＦ−２の両方における劇的な増加が示された。ポリペプチドレベルは、海馬のニューロン野周囲で最高のようであった。ＩＧＦ−２における増大と一致して、及び成体ＡＰＰSwマウスと同様に、ホスホＢＡＤのレベルは、ｓＡＰＰα処理海馬薄片のＮｅｕＮ陽性ニューロン内で増大した。
【０１１４】
海馬薄片培養物においてｓＡＰＰα処理によって増大した遺伝子の相対発現レベルを、６ヶ月齢および１２ヶ月齢の非トランスジェニック及びＡＰＰSwマウスの発現プロフィールとともにクラスター化した。自己組織化マップ（ＳＯＭ）のクラスター化により、４つのクラスターが得られた。クラスター４（図３、右下パネル）は、ビヒクル処理薄片、６ヶ月齢対照マウス及び１２ヶ月齢対照マウスにおいて低発現レベルを、ならびにｓＡＰＰα処理薄片、６ヶ月齢ＡＰＰSwマウス及び１２ヶ月齢ＡＰＰSwマウスにおいて高発現レベルを有する遺伝子およびＥＳＴ類を含む。したがって、これは、ｓＡＰＰαによってエキソビボ及びおそらくインビボで増大する遺伝子のクラスターである。このクラスター内の遺伝子としては、ｔｔｒ、ｉｇｆ−２、及びｉｇｆｂｐ２が挙げられる（図３）。
【０１１５】
（実施例６−ＴＴＲ及びＩＧＦ−２はＡβ毒性に対するｓＡＰＰα誘導性保護に関与する）
器官型海馬培養物を、エチジウムホモ二量体（ＥｔｈＤ−１）及びカルセインＡＭで処理し、ともにインキュベートした。Ａβ誘導性ＥｔｈＤ−１染色を海馬のニューロン野のＮｅｕＮ陽性ニューロン内で行った。ここで、各蛍光プローブで染色された細胞の数を計測し、ＥｔｈＤ−１陽性であり、したがって膜完全性を失った細胞のパーセントとして示した（％死滅；図４）。２５μＭまたは５０μＭ Ａβいずれかでの処理により、５０μＭリバースＡβ処理と比べ、死滅のパーセントにおける劇的な増加がもたらされた。１ｎＭ ｓＡＰＰαでの４８時間の前処理は、Ａβ誘導性死を完全に防御した。Ａβとともに添加したとき、３μＭ ＴＴＲもまたＡβを完全に防御したが、５００ｎＭ ＩＧＦ−２の外的添加はＡβを一部防御した（図４Ａ）。さらに、ｓＡＰＰαのＣＯＯＨ末端の１７アミノ酸を認識する抗体（抗体６Ｅ１０）の添加により、ｓＡＰＰαの保護効果が抑制された。この領域は、Ａβ配列の一部を含み、α−セクレターゼ対β−セクレターゼによって切断されるＡＰＰに特有である。また、この配列の部分に対応する１０アミノ酸断片での処理により、ｓＡＰＰαの保護効果が模倣される（図４Ａ）。
【０１１６】
ＴＴＲ及びＩＧＦ−２はともに分泌タンパク質であるため、これらに対して生成させた抗体を添加することにより、これらの機能を妨害することが可能である。ｓＡＰＰαとの対照ヤギＩｇＧの添加では、Ａβに対するｓＡＰＰα誘導性保護は妨害されなかった。しかしながら、ＴＴＲまたはＩＧＦ−２に対して指向される抗体の添加は、ｓＡＰＰαによる保護を抑制した（図４Ｂ）。このことを支持して、ＴＴＲまたはＩＧＦ−２のｓｉＲＮＡノックダウンにより、Ａβに対するｓＡＰＰα誘導性保護が一部抑制された（図４Ｃ）。ＩＧＦ−２は、ＩＧＦ−１受容体を活性化してＢＡＤのリン酸化を引き起こすことにより、細胞を保護し得る。例えば、ＩＧＦ−１ＲのｓｉＲＮＡノックダウンによってもまた、ｓＡＰＰαによる保護が抑制された（図４Ｃ）。すべてのノックダウンを免疫組織化学によって確認し、ＩＧＦ−２またはＩＧＦ−１ＲのいずれかのｓｉＲＮＡが、ｓＡＰＰαによって誘導されるＢＡＤリン酸化を抑制した。ＴＴＲポリペプチド類またはＩＧＦ−２ポリペプチド類のいずれかの阻害またはノックダウンにより保護が有意に阻止されたという事実は、ＴＴＲポリペプチド類及びＩＧＦ−２ポリペプチド類の両方の誘導が、Ａβに対する最大保護に関与することを示す。
【０１１７】
（実施例７−ＴＴＲはＡＰＰSwマウスを神経変性から保護する）
Ａβの分離を抑制するための試みにおいて、ＴＴＲに対する抗体を、ＡＰＰSwマウス海馬のＣＡ１領域内に直接注入した。浸透圧ポンプを用い、２週間の期間にわたって抗ＴＴＲ抗体の連続的な注入を行った。これにより、注入を受けた海馬の細胞外空間内に抗ＴＴＲ抗体の劇的な沈着がもたらされたが、注入を受けなかった海馬ではもたらされなかった。対照ヤギＩｇＧの注入ではヤギＩｇＧ沈着はもたらされなかった。またさらに、抗ＴＴＲ抗体を注入されたＡＰＰSwマウスは、ヤギＩｇＧまたは注入を受けなかった海馬と比べた場合、海馬のニューロン野内および周囲で著しく増大されたレベルのＡβを示した。これは、抗ＴＴＲ抗体が、ＡβのＴＴＲポリペプチド結合を破壊し、局所的に増大されたＡβ負荷をもたらしたことを示す。抗ＴＴＲ注入された海馬内の多くのプラークを、Ａβ及び抗ＴＴＲ抗体で同時染色し、ＡＰＰSwマウスにおいてＴＴＲポリペプチド類がＡβプラークにインビボで結合することが示された。非トランスジェニックマウスは、その海馬において、なんら検出可能なＴＴＲポリペプチドを生成または保有しなかった。実際、非トランスジェニックマウス内への抗ＴＴＲ抗体の注入は、該抗体またはＡβのいずれの蓄積ももたらさず、タウリン酸化は検出され得なかった。
【０１１８】
ＣＡ１ニューロン野周囲でＡβ蓄積を引き起こすことに加え、抗ＴＴＲ抗体の注入は、多くのＣＡ１ニューロン内でタウリン酸化をもたらした。ＡＴ８抗体に関して免疫陽性のいくつかのニューロンが、抗ＴＴＲ注入された海馬のＣＡ１野内に存在したが、ヤギＩｇＧ注入されたまたは注入を受けなかった海馬では、陽性に染色された細胞はなかった。ＡＴ８陽性ニューロンは、多くの場合、変性を示す濃縮した核を含んだ。Ｔｈｒ２３１においてリン酸化されたタウを認識する抗体もまた、抗ＴＴＲ注入された海馬においてＣＡ１ニューロンを染色した。これらのリン酸化タウ陽性ニューロンは、ニューロンマーカーＮｅｕＮで同時染色された。ホスホ−タウ（Ｔｈｒ２３１）陽性細胞の数および染色の強度は、ヤギＩｇＧ及び注入を受けなかった海馬では改変されなかった。
【０１１９】
ＣＡ１において抗ＴＴＲ抗体注入後、アポトーシス性細胞が増加し、健常なニューロンの総数が減少したか否かを調べるため、光学的分画装置を用いた不偏立体解析を行った。アポトーシス性ニューロンは、インビボ神経系において７２時間以内に消去される（Ｈｕら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１７：３９８１−３９８９（１９９７））。このことにもかかわらず、２週間のヤギＩｇＧの連続的注入後、濃縮した核を有する一部の細胞をＣＡ１錐体ニューロン野内で計測した。抗ＴＴＲ抗体の注入により、ＣＡ１内の濃縮した核を有する細胞の総数が有意に増大した（表３及び図５Ａ）。対照として、注入なしの対照マウスでは、濃縮核の細胞は観察され得なかった。ニューロンのアポトーシスの増大と一致して、ＣＡ１錐体ニューロンの総数は、ヤギＩｇＧを注入されたマウスと比べ、抗ＴＴＲ抗体を注入されたマウスにおいて１７．１±５．３％有意に減少した（表２及び図５Ｂ）。
【０１２０】
【表４】
【０１２１】
要約すると、ＡＤは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の異常なプロセッシング及びβ−アミロイド（Ａβ）の蓄積によって引き起こされ得る。しかしながら、変異型ＡＰＰを過剰発現するマウスは、そのヒト疾患の特徴であるタウリン酸化またはニューロン減少を示さない。本明細書に記載のように、Ａβ処理によってタウのリン酸化およびニューロン死がもたらされるようにマウス海馬のエキソビボモデルを開発した。対照的に、α−セクレターゼ切断ＡＰＰ（ｓＡＰＰα）は、これらのＡβ誘導性病理を防御し、いくつかの神経保護性遺伝子の発現レベルを増大させる。トランスチレチン及びインスリン様成長因子２のｓＡＰＰα駆動型発現は、器官型海馬培養物におけるＡβ誘導性ニューロン死に対する防御に関与する。ＡＰＰSwを過剰発現するマウスの海馬内へのトランスチレチンに対する抗体の長期注入により、Ａβの増加、タウリン酸化、ならびにＣＡ１ニューロン野内でのニューロン減少及びアポトーシスがもたらされる。したがって、トランスチレチンの発現の上昇は、ｓＡＰＰαによって媒介され、ＡＤにおいて観察される多くの神経病理の発現からＡＰＰSwマウスを保護する。このモデル系は、インタクトな脳の構造および化学をより厳密に表し、凝集したＡβが、ＡＤの主要な病理学的特徴のいくつかを誘導し得ることを示した。また、本明細書において提供される薄片培養物により、科学者達が、Ａβにより内生タウのリン酸化およびニューロン死をもたらされる正確な機構を探求することが可能となり得る。
【０１２２】
また一方、Ａβは、タウリン酸化およびアポトーシスをマウス海馬のエキソビボモデルにおいて誘導する能力がある。これらの病理はまた、Ａβ−結合タンパク質ＴＴＲに対して指向される抗体をＡＰＰSwマウス内に注入した場合、インビボでも観察される。本明細書に提示する結果は、ｓＡＰＰα代用(replacement)またはｓＡＰＰα誘導経路の活性化は、Ａβの毒性およびＡＤの発症の抑制を補助し得ることを示す。
【０１２３】
（実施例８−成体ヒト由来の器官型皮質培養物において誘導された神経病理学および保護）
（被験体）
難治性癲癇を有し、側頭葉切除を受けるために選出された４例の患者を、この試験のために集めた。これらの患者は、多くの場合、硬化症を伴う海馬を有する。しかしながら、上に重なっている側頭皮質は正常である。被験体の年齢は、２０〜４９歳の範囲であった。脳組織は、すべての患者からインフォームドコンセントを伴って入手した。
【０１２４】
（ヒト器官型培養物）
脳組織を、大きなインタクトな一部分において電気焼灼器によって取り出した。側頭皮質から得た組織は、およそ３ｃｍ×２ｃｍ×１．５〜２ｃｍであった。取り出した直後、組織を、ＣＯ2非依存性移送保持用培地である氷冷Ｎｅｕｒｅｇｅｎ−Ｉ培地（Ｂｒａｉｎｂｉｔｓ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＩＬ）中に入れ、組織培養研究室に移送した。各脳回ができるだけインタクトに維持され、皮質層が保存されるように、メスで組織を切断して約０．５〜１ｃｍ3塊を作製する前に髄膜を除去した。前述のように、切除は、脳回の長軸に対して垂直に白質に沿って行った（Ｖｅｒｗｅｒら、Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．，３８：１６７−１７２（２００３））。ビブラトームを用い、脳回の長軸に対して垂直な平面で４００μｍ厚の薄片を切断した。したがって、すべての皮質層および少量の白質が薄片内に含まれた。あるいはまた、海馬から通常通りに得た小組織片を、Ｍｃｌｌｗａｉｎティッシュチョッパーを用いて４００μｍに切断した。２つ以下の薄片を、６ウェル培養プレート内に保持した３０ｍｍ直径および０．４μｍフィルター孔サイズを有するフィルターインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上に配置した。最初の１２時間は、薄片を、Ｂ−２７サプリメント、０．５ｍＭグルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む１〜１．２ｍＬのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中に維持した。続いて、培地を２日毎に、抗生物質を含まない１ｍＬの培地を用いて交換した。器官型培養物を加湿インキュベーター内に、３７℃で５％Ｏ2、５％ＣＯ2及び９０％Ｎ中、４〜２８日間維持した。
【０１２５】
細胞死および生存能力を、生薄片において、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ’ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｋｉｔの蛍光プローブを用いて測定した。カルセインＡＭ（１：４００）及びエチジウムホモ二量体（１：１０００）含有リン酸緩衝生理食塩水中で４０分間のインキュベーション後、薄片をＮｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ ２００倒立顕微鏡により２００×倍率で、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＭＲＣ−１０２４ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌシステム（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて可視化した。無作為の画像を、各プローブの発光スペクトルにおいて取り込み、Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を用いて生細胞および死細胞の数を定量した。少なくとも３つの領域をイメージングし、各薄片について死滅のパーセントを調べた。死滅のパーセントは、ＥｔｈＤ−１陽性細胞の数をＥｔｈＤ−１及びカルセインＡＭ陽性細胞の総数で除算して算出した。
【０１２６】
（処理）
β−アミロイド1〜42及びリバースＡβ（Ａβ42〜1）を、ＢＡＣＨＥＭ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）から入手した。これらのペプチドを０．１％ＮＨ3ＯＨに２２２μＭで溶解した。処理のため、ＡβまたはリバースＡβを５０μＭで、Ｂ−２７サプリメント及び０．５ｍＭグルタミンを加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中に３７℃にて２４時凝集させた。次いで、薄片培養培地を除去し、薄片を、１ｍＬの２５μＭもしくは５０μＭのＡβ、リバースＡβまたはビヒクルで２４時間処理した。ヒトＴＴＲ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、Ａβ処理とともに薄片に０．０３、０．３及び３μＭ ＴＴＲの最終濃度で添加した。ｓＡＰＰαはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。特に記載のない限り、すべてのｓＡＰＰα処理は、１ｎＭで、Ａβの添加前に４８時間行った。ｓＡＰＰαのカルボキシル末端領域の１０アミノ酸断片（ＡＰＰ６９５の５９２〜６０１；ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ）を、ｓＡＰＰαと同じプロトコルに従って付加した。各患者から異なる量の組織を得たため、すべての患者に対してすべての処理を行ったとは限らなかった。
【０１２７】
（ＴＵＮＥＬ染色による細胞死の検出）
皮質薄片の凍結切片を、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ−媒介型ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）及び抗ＮｅｕＮ抗体で染色した。ＤＮＡ断片化を有する細胞を、ＤＮＡ内へのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−１２−ｄＵＴＰのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ取込みによって調べた（Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット、Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）。６００×倍率での共焦点解析によって、薄片１つあたり少なくとも３つの無作為の画像を作成した。次いで、ＴＵＮＥＬ陽性、ＮｅｕＮ陽性、ならびにＴＵＮＥＬ及びＮｅｕＮの両方が陽性の細胞の数を定量した。
【０１２８】
（免疫組織化学）
薄片を４％ＰＦＡ中に２０分間固定し、３０％スクロース含有リン酸緩衝生理食塩水中で一晩インキュベートし、ＯＣＴ包埋培地中で凍結させた。１０μｍの幅を有する凍結切片を各薄片から採取した。リン酸化されたタウを、モノクローナルＡＴ８抗体（１：２００；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）及び抗ホスホ−タウ（Ｔｈｒ２３１）（１：５００；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により検出した。対照として、免疫前ウサギまたはマウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を一次抗体の代わりに用いた。ビオチン化抗ウサギＩｇＧまたは抗マウスＩｇＧを二次抗体として用いた。Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８または５６８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）のいずれかにコンジュゲートさせたチラミドを、抗体染色を可視化するために使用した。抗ＮｅｕＮ（１：２５０；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７にコンジュゲートさせた抗マウスＩｇＧ二次抗体とともに用い、ニューロンマーカーＮｅｕＮを検出した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌシステムまたはエピ蛍光（Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）のいずれかを用いて切片をイメージングした。
【０１２９】
（統計学的解析）
結果を平均±ＳＥＭとして示す。統計学的有意性は、対応のない両側スチューデントのｔ検定を用いて決定し、ｐ値＜０．０５を有意であるとみなした。
【０１３０】
（結果）
成体ヒトの側頭皮質由来の薄片を、培地中に４〜２１日間維持した。エチジウムホモ二量体（ＥｔｈＤ−１）は、インタクトな原形質膜を有する生細胞から消去される膜不透過性ＤＮＡ結合色素である。カルセインＡＭは、機能性細胞内エステラーゼを有する生細胞において蛍光を発する細胞不透過性色素である。培養状態で最初の３日間に、多数のＥｔｈＤ−１陽性細胞が対照薄片において観察された。これらは、おそらく、外科処置またはその後の薄片化の際に損傷された細胞である。第４日までに、ＥｔｈＤ−１陽性細胞の割合は、平均レベル２０％に低下した。多数のカルセインＡＭ陽性細胞が、培養中の２１日間に存在した。カルセインＡＭ細胞の大部分は直径がおよそ２０μｍであった。また、多くの細胞がニューロンマーカーＮｅｕＮで陽性に染色され、大きな皮質ニューロンの存在を示す。
【０１３１】
薄片にてＡＤをモデル化する試みにおいて、薄片を凝集させたＡβで処理した。５０μＭ Ａβでの処理により、膜完全性を失った細胞の数の劇的な増加がもたらされた。１ｎＭ ｓＡＰＰαで４８時間の前処理により、Ａβ誘導性ＥｔｈＤ−１染色が抑制された。５０μＭ Ａβでの処理により、死滅のパーセントが有意に増大され、一方、１ｎＭ ｓＡＰＰαでの前処理により、Ａβ誘導性死が有意に防御された（図６Ａ）。ｓＡＰＰαのＣＯＯＨ末端領域に対応する１０アミノ酸断片もまた、４例の被験体において有意な保護を示した（ｐ値＜０．０５；図６Ａ）。また、１例の被験体由来の試料を、４アミノ酸断片（ＤＡＥＦ；配列番号：２）で処理した。この断片は、５０μＭ Ａβ毒性を防御した（図６Ａ）。
【０１３２】
また、５０μＭ Ａβでの処理により、ＤＮＡ鎖破断がもたらされ、これは、ＴＵＮＥＬによって示された。これらのＴＵＮＥＬ陽性細胞の多くは、ＮｅｕＮで同時標識された。１ｎＭ ｓＡＰＰαでの前処理により、ＴＵＮＥＬ陽性ニューロンにおいてＡβ−誘導性の増加が抑制された。
【０１３３】
ＴＵＮＥＬに対して染色されたＮｅｕＮ及びＴＵＮＥＬ陽性細胞の合計の割合（％ＴＵＮＥＬ）を１例の被験体について定量した。また、ＮｅｕＮ及びＴＵＮＥＬで同時染色された全ＮｅｕＮ陽性細胞の割合を調べた（図６Ｂ）。全ＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合およびＴＵＮＥＬ陽性であるニューロン割合はともに、Ａβでの処理後に増大した（図６Ｂ）。
【０１３４】
ＴＴＲポリペプチド発現はｓＡＰＰαによって誘導され、Ａβ毒性からの保護に関与する。０．３または３μＭ ＴＴＲポリペプチドでのヒト皮質薄片の同時処理は、Ａβ誘導性ＥｔｈＤ−１染色を防御したが、０．０３μＭ ＴＴＲポリペプチドでは防御されなかった（図６Ｃ）。
【０１３５】
モノクローナル抗体ＡＴ８は、Ｓｅｒ２０２においてリン酸化されたタウを認識し、ＡＤにおける早期および成熟もつれを染色するために一般に使用されている。５０μＭ リバースＡβで処理した皮質薄片は、ＡＴ８陽性細胞を全く保有しなかった。しかしながら、５０μＭ Ａβでの処理では、早期タウ病理に特徴的な細胞体樹状突起の再分布を伴ういくつかのＡＴ８陽性細胞がもたらされた。５０μＭリバースＡβで処理した薄片は、ＮｅｕＮ陽性細胞の過程(process)内で、Ｔｈｒ２３１においてリン酸化された一部のタウを示したが、細胞体では示されず、タウの通常な分布と一致した。対照的に、５０μＭ Ａβでの処理では、高レベルの体性ホスホ−タウ（Ｔｈｒ２３１）を有するいくつかのＮｅｕＮ陽性ニューロンがもたらされた。１ｎＭ ｓＡＰＰαでの前処理により、Ａβ誘導性タウリン酸化が抑制された。また、５０μＭ Ａβで１週間処理した薄片の電子顕微鏡検査では、樹状突起に見られるもつれ様構造を有する少数のニューロンが示された。
【０１３６】
要約すると、これらの結果は、癲癇患者から取り出した皮質組織は、器官型薄片培養物として２１日間まで維持され得ること、およびヒト皮質のＡβ処理は、細胞膜完全性の減損、ニューロンのＤＮＡ断片化およびタウリン酸化をもたらすことを示す。Ａβは、タウリン酸化、およびもつれ様構造が電子顕微鏡検査によって確認され得るニューロンの細胞体樹状突起の区画に対する再分布を誘導した。ｓＡＰＰαでの前処理により、これらの神経変性変化が抑制された。この保護は、１０アミノ酸ｓＡＰＰα断片によって模倣される。また、ＴＴＲポリペプチドそれ自体が、正常ヒトＣＳＦにおいて見られるＴＴＲ０．３μＭ以上の濃度でＡβ毒性を防御し得る（Ｓｃｈｗａｒｚｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１：８３６８−８３７２（１９９４））。これらの結果は、脳においてｓＡＰＰα、ｓＡＰＰαの断片および／またはＴＴＲポリペプチドの量が増加することにより、ＡＤの発症が遅滞または予防され得ることを示す。これらの結果はまた、Ａβが、ヒト薄片培養物において、ＡＤと関連する神経変性を誘導し得ることを示す。開発したこのエキソビボモデルは、組織が、（ａ）動物ではなくヒトである、（ｂ）胚性、胎児性または早期生後ではなく成体である、（ｃ）切除されたものではなくインタクトである、および（ｄ）トランスジェニック、不死化または腫瘍性ではなく遺伝子学的に正常であるという点において、他のモデルと比べ、ＡＤに対して特に重要である。
【０１３７】
（実施例９−マウス海馬薄片培養物におけるポリペプチド保護）
（海馬の器官型培養物）
Ｃ５７Ｂ６／ＳＪＬマウスの子に対し、生後第１５日に麻酔して断頭した。脳を取り出し、氷冷解離培地（５０％最少必須培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、５０％ハンクス平衡塩溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及び３６ｍＭグルコース）中に入れた。両方の海馬を解剖顕微鏡下で解剖し、Ｍｃｌｌｗａｉｎティッシュチョッパーにて４００μｍに切断した。薄片をばらばらにし、６ウェル培養プレート内に保持した３０ｍｍ直径および０．４μｍフィルター孔サイズを有するフィルターインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上に配置した。最初の３日間、薄片を、Ｂ−２７サプリメント、１ｍＭグルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中に維持した。続いて、抗生物質を含まない培地を用い、培地を３日毎に交換した。器官型培養物を加湿インキュベーター内に、３７℃で５％Ｏ2及び５％ＣＯ2中、１４〜２１日間維持した。
【０１３８】
細胞死および生存能力を、生薄片において、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ’ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｋｉｔの蛍光プローブを用いて測定した。カルセインＡＭ（１：４００）及びエチジウムホモ二量体（１：１０００）含有リン酸緩衝生理食塩水中で４０分間のインキュベーション後、薄片を、Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ ２００倒立顕微鏡により２００×倍率で、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＭＲＣ−１０２４ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌシステム（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて可視化した。ニューロン野の無作為の画像を、各プローブの発光スペクトルにおいて取り込み、Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を用いて生細胞および死細胞の数を定量した。各薄片について、ニューロン野を含む少なくとも３つの領域をイメージングし、死滅のパーセントを調べた。死滅のパーセントは、ＥｔｈＤ−１陽性細胞の数をＥｔｈＤ−１及びカルセインＡＭ陽性細胞の総数で除算して算出した。
【０１３９】
（処理）
β−アミロイド1〜42及びリバースＡβ（Ａβ42〜1）を、ＢＡＣＨＥＭ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）から入手した。これらのペプチドを０．１％ＮＨ3ＯＨに２２２μＭで溶解した。処理のため、Ａβを５０μＭで、Ｂ−２７サプリメント及び１ｍＭグルタミンを加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で３７°Ｃにて２４時間凝集させた。次いで、薄片培養培地を除去し、薄片を１ｍＬの２５μＭ Ａβまたはビヒクルで２４時間処理した。ｓＡＰＰαのカルボキシル末端領域に対応するタンパク質断片（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸによって合成）を１ｎＭの最終濃度まで、Ａβの添加の４８時間前に添加した。
【０１４０】
（結果）
器官型海馬培養物を、エチジウムホモ二量体（ＥｔｈＤ−１）及びカルセインＡＭで処理し、ともにインキュベートした。各蛍光プローブで染色された細胞の数を計測し、ＥｔｈＤ−１陽性であり、したがって膜完全性を失った細胞のパーセントとして示した（％死滅、図７）。２５μＭ Ａβでの処理により、ビヒクルでの処理と比べ、死滅のパーセントの劇的で有意な増加がもたらされた。１ｎＭ のｓＡＰＰαのカルボキシル−末端領域の部分に対応する１０アミノ酸断片（ＡＰＰ７７０の６６７〜６７６；ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：１））での４８時間の前処理により、Ａβ誘導性死が完全に防御された。この防御は、カルボキシルアルギニンを除去した場合（ＳＥＶＫＭＤＡＥＦ（配列番号：７））、維持された。しかしながら、アルギニンとフェニルアラニンの両方の除去（ＳＥＶＫＭＤＡＥ（配列番号：２２））では、Ａβに対する防御が反転された。アミノ末端の終端において、セリン除去（ＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：３））とセリン及びグルタミン酸除去（ＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：４））の両方を有する断片は、２５μＭ Ａβ処理を有意に防御した（図７）。１ｎＭの４アミノ酸断片（ＤＡＥＦ）での海馬薄片の前処理もまた、Ａβ誘導性細胞死を防御するのに充分であった（図７）。
【０１４１】
（実施例１０−インビボポリペプチド保護）
以下の実験は、ｓＡＰＰα及び１０アミノ酸断片（ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：１））が、マウスの海馬内への定位注射により、インビボでＡβ誘導性毒性に抗する細胞生存経路を活性化する能力を試験するために行った。乱雑化した(scrambled)形態の１０アミノ酸断片を用い、経路活性化が該ペプチド配列に依存性であることを示した。
【０１４２】
（定位注射）
１０週齢Ｂ６／ＳＪＬマウスの海馬の右側に、ｓＡＰＰα、１０アミノ酸断片または乱雑化した１０量体を推定１ｎＭ海馬内濃度まで、定位的に注射した。反対側には人工脳脊髄液を注射した。各注射は、１０分の間にわたって送達させる１．５ｍＬの溶液で構成した。手術の４８時間後、マウスに冷ＰＢＳを灌流し、その海馬を切除し、後のＲＮＡ抽出用に安定化溶液中で保存した。
【０１４３】
（量的ＰＣＲ）
ＲＮＡを海馬の試料から抽出し、ＤＮアーゼ処理し、逆転写した。次いで、ｃＤＮＡを、ＳＹＢＲグリーンを用いてＲｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒシステムにおいて行う定量的リアルタイムＰＣＲに使用した。また、各ＲＮＡ試料の一部を非ＲＴ伝統的ＰＣＲ反応に使用し、ＤＮＡ侠雑物の不存在を確認した。
【０１４４】
（免疫組織化学）
注射の４８時間後、マウスを４％ＰＦＡで灌流した。脳を回収し、半側切除し、４％ＰＦＡ中で一晩固定した。次いで、これらを３０％スクロース中に２４時間浸漬し、凍結し、切片にした。注射部位の形態学的確認のため、切片をクレシルバイオレットで染色した。他の切片を、ヤギ抗ＴＴＲ及びビオチン化二次抗体で染色すると、ＴＴＲタンパク質発現、及び核マーカーとしてＴｏＰｒｏ３が示された。非特異的染色のための対照は、ヤギＩｇＧを用いて行った。
【０１４５】
（結果）
１ｎＭ ｓＡＰＰα及び１０アミノ酸断片はともに、成長因子ＩＧＦ２及びＩＧＦＢＰ２の発現における増大を誘導し（図８、９及び１０）、これにより、Ａβ毒性がインビトロで防御され得る。また、ｓＡＰＰα及び１０アミノ酸断片により、処理した海馬内でＴＴＲのレベルの増大がもたらされ、これによって、Ａβを分離されることにより毒性が防御され得る。これらの結果は、Ａβ毒性に抗する神経保護的経路（例えば、図１１を参照）は、マウスにおいてインビボで活性化され得ることを示す。これらの結果はまた、神経保護的経路の活性化が、アルツハイマー病の予防における処置として使用され得ることを示す。
【０１４６】
（実施例１１（予言的）−Ａβの効果を低減させる能力に関するインビボまたはインビトロでの化合物の同定）
試験化合物を、インビボまたはインビトロである脳組織に適用する。また、脳組織を、外的に適用するか脳組織内の細胞によって発現されるＡβと接触させる。簡単には、培養のための脳組織を得るため、実施例８に記載のようにして、脳組織を大きなインタクトな一部分（ほぼ３ｃｍ×２ｃｍ×２ｃｍ）において電気焼灼器によって取り出す。
【０１４７】
脳組織を試験化合物と接触させた後、細胞死および／または細胞生存能力を、生薄片で、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ’ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｋｉｔの蛍光プローブを用いて測定する。カルセインＡＭ（１：４００）及びエチジウムホモ二量体（１：１０００）含有リン酸緩衝生理食塩水中で４０分間のインキュベーション後、薄片を、例えば、Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ ２００倒立顕微鏡により２００×倍率で、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＭＲＣ−１０２４ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌシステム（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて可視化する。無作為の画像を、各プローブの発光スペクトルにおいて取り込み、Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を用いて生細胞および死細胞の数を定量する。各薄片について、少なくとも３つの領域をイメージングし、死滅のパーセントを調べる。死滅のパーセントは、ＥｔｈＤ−１陽性細胞の数をＥｔｈＤ−１及びカルセインＡＭ陽性細胞の総数で除算して算出する。場合によっては、細胞死をＴＵＮＥＬ染色によって調べる。簡単には、皮質薄片の凍結切片を、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ−媒介型ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）及び抗ＮｅｕＮ抗体で染色する。ＤＮＡ断片化を有する細胞を、ＤＮＡ内へのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−１２−ｄＵＴＰのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ取込みによって調べる（Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット、Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）。６００×倍率での共焦点解析によって、薄片１つあたり少なくとも３つの無作為の画像を作成する。次いで、ＴＵＮＥＬ陽性、ＮｅｕＮ陽性、ならびにＴＵＮＥＬ及びＮｅｕＮの両方が陽性の細胞の数を定量する。
【０１４８】
細胞死のパーセントを、試験化合物の不存在下でＡβと接触させた対照脳組織で測定された細胞死のパーセントと比較する。Ａβのみと接触させた脳組織で観察されるものと比べ、試験化合物およびＡβと接触させた脳組織で少ない細胞死が観察されるならば、試験化合物は、Ａβの効果を低減させる能力を有し得る。かかる低減の陽性対照は、ＤＡＥＦ含有ポリペプチド（例えば、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：１）、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦ（配列番号：７）、ＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：３）、ＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：４）、またはＤＡＥＦ（配列番号：２））とＡβとに接触させた脳組織である。他の対照としては、未処理の脳組織およびβ−アミロイド1〜42またはリバースＡβ（Ａβ42〜1）で処理した脳組織が挙げられる。
【０１４９】
試験化合物およびＡβと接触させた脳組織で観察された細胞死のパーセントを、ＤＡＥＦ含有ポリペプチド及びＡβと接触させた脳組織で観察された細胞死のパーセントと比較することにより、Ａβの効果を低減させる試験化合物の有効性を調べる。ＤＡＥＦ含有ポリペプチド及びＡβと接触させた脳組織で観察されるものと比べ、試験化合物およびＡβと接触させた脳組織で観察される同等または低いレベルの細胞死は、試験化合物がＡβの効果の強力なインヒビターであることを示し得る。
【０１５０】
（実施例１２（予言的）−Ａβの効果を低減させる能力に関する化合物の同定）
試験化合物を、インビボまたはインビトロである脳組織に適用する。簡単には、培養のための脳組織を得るため、実施例８に記載のようにして、脳組織を大きなインタクトな一部分（ほぼ３ｃｍ×２ｃｍ×２ｃｍ）において電気焼灼器によって取り出す。
【０１５１】
脳組織を試験化合物と接触させた後、ＴＴＲ及びＩＧＦ−２などの神経保護性ポリペプチドをエンコードする核酸の発現レベルを、該ポリペプチドレベル及び／又はｍＲＮＡレベルを測定することにより決定する。簡単には、ＥＬＩＳＡを用いて神経保護性ポリペプチド発現のレベルが測定され、一方、ＲＴ−ＰＣＲまたは発現アレイ技術（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）から入手可能なアレイ）を用いて、神経保護性ポリペプチドをエンコードする核酸のｍＲＮＡ発現のレベルが測定される。
【０１５２】
ポリペプチドまたはｍＲＮＡの発現のレベルを、試験化合物と接触させていない対照脳組織について決定された該ポリペプチドまたはｍＲＮＡの発現レベルと比較する。対照脳組織で観察されるものと比べて、より少ないポリペプチドまたはｍＲＮＡ発現が試験化合物と接触させた細胞で観察されるならば、試験化合物は、Ａβの効果を低減させる能力を有し得る。かかる低減の陽性対照は、ＤＡＥＦ含有ポリペプチド（例えば、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：１）、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦ（配列番号：７）、ＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：３）、ＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：４）、またはＤＡＥＦ（配列番号：２））と接触させた脳組織である。他の対照としては未処理の脳組織が挙げられる。
【０１５３】
神経保護性ポリペプチドをエンコードする核酸の発現レベルを増大させる試験化合物の有効性は、試験化合物と接触させた脳組織で観察された発現レベルを、ＤＡＥＦ含有ポリペプチドと接触させた脳組織で観察された発現レベルと比較することにより決定される。ＤＡＥＦ含有ポリペプチドと接触させた脳組織で観察されるものと比べ、試験化合物と接触させた脳組織で同等または高いレベルの発現が観察されることは、試験化合物が、神経保護性ポリペプチド発現の強力な活性化物質であることを示し得る。
【０１５４】
（実施例１３−ポリペプチド類の評価）
図１２Ａ及びＢは、種々の処理条件下での細胞死のパーセントを示す一組の棒グラフである。図１２Ａに関して、テトラペプチドＤＡＥＦ単独およびそのＮＨ2末端の終端上に修飾をしたものは、海馬薄片培養物においてＡβ誘導性死に対する防御を示す。
【０１５５】
各処理での死滅のパーセントを、膜透過性ＥｔｈＤ−１陽性細胞の数ならびにカルセインＡＭで陽性に染色された生細胞の数を計測することにより、生海馬薄片のニューロン野において定量した。データを平均±ＳＥＭ（１処理あたりｎ＝３〜５薄片）として示す。Ａβは、死滅のパーセントの有意な増加をもたらすが、１ｎＭのテトラペプチド（ＤＡＥＦ）は、Ａβ誘導性毒性を防御する。アセチル化ＤＡＥＦ（配列番号：２）は、Ａβに対する有意な防御を示す。また、テトラペプチド（Ｒ（９）−ＤＡＥＦ）のＮＨ2末端の終端への９個のアルギニンの付加により、Ａβ誘導性細胞死が有意に防御される。さらに図１２Ａに関して、＃ ビヒクルと比べてｐ値＜０．０１、＊ ２５μＭ Ａβと比べてｐ値＜０．０５、対応のない両側ｔ−検定。
【０１５６】
（結果）
器官型海馬培養物を、エチジウムホモ二量体（ＥｔｈＤ−１）及びカルセインＡＭで処理し、ともにインキュベートした。エチジウムホモ二量体（ＥｔｈＤ−１）は、インタクトな原形質膜を有する生細胞から消去される膜不透過性ＤＮＡ結合色素である。カルセインＡＭは、機能性細胞内エステラーゼを有する生細胞において蛍光を発する細胞不透過性色素である。ここで、各蛍光プローブで染色された細胞の数を計測し、ＥｔｈＤ−１陽性であり、したがって膜完全性を失った細胞のパーセントとして示した（％死滅、図）。２５μＭ Ａβでの処理により、ビヒクルでの処理と比べ、死滅のパーセントの劇的で有意な増加がもたらされた。１ｎＭの該４量体での４８時間の前処理により、Ａβ誘導性死が完全に防御された。この防御は、ＮＨ2末端の終端がアセチル化されている場合（アセチル−ＤＡＥＦ）は維持されたが、この分子は、非修飾テトラペプチドと同程度には防御しなかった。最後に、９個のアルギニンをそのＮＨ2末端の終端上に保有するように修飾したテトラペプチド（Ｒ（９）−ＤＡＥＦ）もまた、Ａβ処理を有意に防御した。
【０１５７】
（実験手順）
（海馬の器官型培養物）
Ｃ５７Ｂ６／ＳＪＬマウスの子に対し、生後第１５日に麻酔して断頭した。脳を取り出し、氷冷解離培地（５０％最少必須培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、５０％ハンクス平衡塩溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及び３６ｍＭグルコース）中に入れた。両方の海馬を解剖顕微鏡下で解剖し、Ｍｃｌｌｗａｉｎティッシュチョッパーにて４００μｍに切断した。薄片をばらばらにし、６ウェル培養プレート内に保持した３０ｍｍ直径および０．４μｍフィルター孔サイズを有するフィルターインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上に配置した。最初の３日間、薄片を、Ｂ−２７サプリメント、１ｍＭグルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中に維持した。続いて、抗生物質を含まない培地を用い、培地を３日毎に交換した。器官型培養物を加湿インキュベーター内に、３７℃で５％Ｏ2及び５％ＣＯ2中、１４〜２１日間維持した。
【０１５８】
細胞死および生存能力を、生薄片において、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ’ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｋｉｔの蛍光プローブを用いて測定した。カルセインＡＭ（１：４００）及びエチジウムホモ二量体（１：１０００）含有リン酸緩衝生理食塩水中で４０分間のインキュベーション後、薄片を、Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ ２００倒立顕微鏡により２００×倍率で、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＭＲＣ−１０２４ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌシステム（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて可視化した。ニューロン野の無作為の画像を、各プローブの発光スペクトルにおいて取り込み、Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を用いて生細胞および死細胞の数を定量した。各薄片について、ニューロン野を含む少なくとも３つの領域をイメージングし、死滅のパーセントを調べた。死滅のパーセントは、ＥｔｈＤ−１陽性細胞の数をＥｔｈＤ−１及びカルセインＡＭ陽性細胞の総数で除算して算出した。
【０１５９】
（処理）
β−アミロイド1〜42及びリバースＡβ（Ａβ42〜1）を、ＢＡＣＨＥＭ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）から入手した。これらのペプチドを０．１％ＮＨ3ＯＨに２２２μＭで溶解した。処理のため、Ａβを５０μＭで、Ｂ−２７サプリメント及び１ｍＭグルタミンを加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で３７°Ｃにて２４時間凝集させた。次いで、薄片培養培地を除去し、薄片を１ｍＬの２５μＭ Ａβまたはビヒクルで２４時間処理した。該ペプチド及び修飾ペプチド（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸによって合成）を１ｎＭの最終濃度まで、Ａβの添加の４８時間前に添加した。
【０１６０】
図１２Ｂは、各処理での死滅のパーセントを、膜透過性ＥｔｈＤ−１陽性細胞の数およびカルセインＡＭで陽性に染色された生細胞の数を計測することにより、生海馬薄片のニューロン野において定量したものを示す。データを平均±ＳＥＭ（１処理あたりｎ＝３〜５薄片）として示す。Ａβは、死滅のパーセントの有意な増加をもたらすが、１ｎＭのテトラペプチド（ＤＡＥＦ、配列番号：２）は、Ａβ誘導性毒性を防御する。ＤのＤ−異性体［（ｄＤ）ＡＥＦ］、ＡのＤ−異性体［Ｄ（ｄＡ）ＥＦ］またはＦのＤ−異性体［ＤＡＥ（ｄＦ）］を含有するテトラペプチド化合物は、Ａβ誘導性死を有意に防御しない。交換されたアミノ酸アスパラギン酸およびグルタミン酸およびＣＯＯＨ−末端に結合させたアミド基（ＥＡＤＦ（配列番号：５）−アミド）を有する化合物は、有意にＡβ誘導性死を防御するが、ＮＨ2−末端上にアセチル基を有するＥＡＤＦ（配列番号：５）配列（アセチル−ＥＡＤＦ（配列番号：５））は防御しない。図１２Ｂに関して、＃ ビヒクルと比べてｐ値＜０．０５、＊ ２５μＭ Ａβと比べてｐ値＜０．０５、対応のない両側ｔ−検定。
【０１６１】
（結果）
器官型海馬培養物を、エチジウムホモ二量体（ＥｔｈＤ−１）及びカルセインＡＭで処理し、ともにインキュベートした。エチジウムホモ二量体（ＥｔｈＤ−１）は、インタクトな原形質膜を有する生細胞から消去される膜不透過性ＤＮＡ結合色素である。カルセインＡＭは、機能性細胞内エステラーゼを有する生細胞において蛍光を発する細胞不透過性色素である。ここで、各蛍光プローブで染色された細胞の数を計測し、ＥｔｈＤ−１陽性であり、したがって膜完全性を失った細胞のパーセントとして示した（％死滅、図）。２５μＭ Ａβでの処理により、ビヒクルでの処理と比べ、死滅のパーセントの劇的で有意な増加がもたらされた。１ｎＭの該４量体での４８時間の前処理により、Ａβ誘導性死が完全に防御された。この防御は、アミノ酸Ｄ、Ａ及びＦの代わりにＤ−異性体を用いることにより消去された。
【０１６２】
（実験手順）
（海馬の器官型培養物）
Ｃ５７Ｂ６／ＳＪＬマウスの子に対し、生後第１５日に麻酔して断頭した。脳を取り出し、氷冷解離培地（５０％最少必須培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、５０％ハンクス平衡塩溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及び３６ｍＭグルコース）中に入れた。両方の海馬を解剖顕微鏡下で解剖し、Ｍｃｌｌｗａｉｎティッシュチョッパーにて４００μｍに切断した。薄片をばらばらにし、６ウェル培養プレート内に保持した３０ｍｍ直径および０．４μｍフィルター孔サイズを有するフィルターインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上に配置した。最初の３日間、薄片を、Ｂ−２７サプリメント、１ｍＭグルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中に維持した。続いて、抗生物質を含まない培地を用い、培地を３日毎に交換した。器官型培養物を加湿インキュベーター内に、３７℃で５％Ｏ2及び５％ＣＯ2中、１４〜２１日間維持した。
【０１６３】
細胞死および生存能力を、生薄片において、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ’ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｋｉｔの蛍光プローブを用いて測定した。カルセインＡＭ（１：４００）及びエチジウムホモ二量体（１：１０００）含有リン酸緩衝生理食塩水中で４０分間のインキュベーション後、薄片を、Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ ２００倒立顕微鏡により２００×倍率で、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＭＲＣ−１０２４ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌシステム（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて可視化した。ニューロン野の無作為の画像を、各プローブの発光スペクトルにおいて取り込み、Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を用いて生細胞および死細胞の数を定量した。各薄片について、ニューロン野を含む少なくとも３つの領域をイメージングし、死滅のパーセントを調べた。死滅のパーセントは、ＥｔｈＤ−１陽性細胞の数をＥｔｈＤ−１及びカルセインＡＭ陽性細胞の総数で除算して算出した。
【０１６４】
（処理）
β−アミロイド1〜42及びリバースＡβ（Ａβ42〜1）を、ＢＡＣＨＥＭ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）から入手した。これらのペプチドを０．１％ＮＨ3ＯＨに２２２μＭで溶解した。処理のため、Ａβを５０μＭで、Ｂ−２７サプリメント及び１ｍＭグルタミンを加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で３７°Ｃにて２４時間凝集させた。次いで、薄片培養培地を除去し、薄片を、１ｍＬの２５μＭ Ａβまたはビヒクルで２４時間処理した。該ペプチド及び修飾ペプチド（ＵＷ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩによって合成）を１ｎＭの最終濃度まで、Ａβの添加の４８時間前に添加した。
【０１６５】
（実施例１４−海馬内へのポリペプチドの注射）
図１３は、海馬内へのｓＡＰＰα１０量体の定位注射が、正常マウス脳でＴＴＲの発現を誘導することを示す一組の染色の顕微鏡写真を示す。ｓＡＰＰα由来の１ｎＭのデカペプチドは、以前に、Ａβ毒性に抗して器官型海馬薄片培養物を保護することが示されていた。人工脳脊髄液（ＣＳＦ）で調製した１．５μＬの１５．３ｎＭ溶液の注射を行い、海馬内においての１ｎＭの最終濃度に近似させた。反対側には人工ＣＳＦのみを注射し、対照として用いた。ＴＴＲの免疫組織化学では、デカペプチドの注射により、反対側のＣＳＦ注射海馬（図１３Ａ）と比べ、ＣＡ１海馬のニューロン（図１３Ｂ）内および周囲でＴＴＲの量の増大が示された。ＤＮＡ結合色素ＴｏＰｒｏ３を用いて核を可視化した（青）。予備データでもまた、ｓＡＰＰαおよび該４量体の注射によりＴＴＲの増大が示された。
【０１６６】
（他の実施態様）
本発明を、その詳細な説明に関して説明したが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲に規定される本発明を例示することが意図され、その範囲を制限することを意図しないことを理解されたい。他の態様、利点および変形は、以下の特許請求の範囲の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】表示したポリペプチドで処理した海馬薄片のニューロン野内のＮｉｓｓｌ染色されたニューロンについてアポトーシスのパーセントをプロットした棒グラフである。データを１処理あたり３薄片の平均±ＳＥＭとして示す。＊は、５０μＭリバースＡβ処理と比べてｐ値＜０．０５を示す。＃は、２５μＭ Ａβ処理と比べてｐ値＜０．０５を示す。
【０１６８】
【図２】６Ｅ１０抗体を用いた、トランスジェニック及び非トランスジェニックマウス由来の組織のイムノブロットの写真を含む。図２はまた、ｓＡＰＰαの相対強度レベルをプロットした棒グラフを含む。値を平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）として示す。＊は、非トランスジェニックマウスと比べてｐ値＜０．０５を示す。
【０１６９】
【図３】自己組織化マップ（ＳＯＭ）である。海馬薄片培養物において１ｎＭ ｓＡＰＰαによって有意に増大された（ランク≧９）遺伝子およびＥＳＴの発現レベルを、クラスター化し、発現のパターンを特定した。発現パターンは、ビヒクル処理（ｎ＝３）及びｓＡＰＰα処理（ｎ＝３）海馬薄片、６ヶ月齢非トランスジェニック対照（ｎ＝３）及びＡＰＰSw（ｎ＝３）マウス、ならびに１２ヶ月齢非トランスジェニック対照（ｎ＝２）及びＡＰＰSw（ｎ＝２）マウスにおいて調べた。遺伝子の各クラスターの平均発現レベルを縦座標にプロットしている（白丸）。他方の線（白くない丸）は、各クラスターの標準偏差を示す。クラスター４（右下パネル）は、ｓＡＰＰα処理によってならびに６及び１２ヶ月齢ＡＰＰSwマウスにおいて上方調節された遺伝子を示す。
【０１７０】
【図４】図４Ａ、Ｂ及びＣは、ＴＴＲ及びＩＧＦ−２ポリペプチドがｓＡＰＰα誘導型のＡβに対する防御に関与することを示す棒グラフである。各処理での死滅のパーセントを生海馬薄片のニューロン野において、膜透過性ＥｔｈＤ−１陽性細胞の数ならびにカルセインＡＭで陽性に染色された生細胞の数を計測することにより定量した。データを平均±ＳＥＭ（１処理あたりｎ＝３〜５薄片）として示す。図４Ａにおいて、生海馬薄片は表示のとおりに処理した。６Ｅ１０は、ｓＡＰＰαのＣＯＯＨ末端領域に対して指向される抗体である。ｓＡＰＰα断片は、ｓＡＰＰαの保護効果を模倣することがわかったｓＡＰＰαのＣＯＯＨ−末端断片である（ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ，配列番号：１）。＊は、５０μＭリバースＡβと比べてｐ値＜０．０５を示す；＃は、５０μＭ Ａβと比べてｐ値＜０．０１を示す；＊＊は、１ｎＭ ｓＡＰＰα＋マウスＩｇＧ＋２５μＭ Ａβと比べてｐ値＜０．０５を示す；＃＃は、２５μＭ Ａβと比べてｐ値＜０．０５を示す。図４Ｂにおいて、生海馬薄片は、ビヒクル、ＡβまたはｓＡＰＰα＋Ａβとともに、表示した抗体（ヤギＩｇＧ、抗ＴＴＲまたは抗ＩＧＦ−２）で処理した。＊は、対応するビヒクル処理薄片と比べてｐ値＜０．０１を示す；＃は、１ｎＭ ｓＡＰＰα＋ヤギＩｇＧ＋２５μＭ Ａβと比べてｐ値＜０．０１を示す。図４Ｃにおいて、生海馬薄片は、ビヒクル、Ａβ、またはｓＡＰＰα＋Ａβとともに、ＴＴＲ、ＩＧＦ−２またはインスリン様成長因子−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）配列を標的化するｓｉＲＮＡ分子で処理した。＊は、対応するビヒクル処理薄片と比べてｐ値＜０．０５を示す；＃は、１ｎＭ ｓＡＰＰα＋乱雑化したＧＡＤＰＨ＋２５μＭ Ａβと比べてｐ値＜０．０５を示す。
【０１７１】
【図５】図５Ａは、ヤギＩｇＧ（ｎ＝４）及び抗ＴＴＲ（ｎ＝４）注入マウスの、注入を受けたＣＡ１錐体ニューロン野内の濃縮した核を有する細胞の総数をプロットした棒グラフである。＊はｐ値＜０．０１を示す（両側ウィルコクソンのサインランク検定）。図５Ｂは、ヤギＩｇＧ（ｎ＝４）及び抗ＴＴＲ（ｎ＝４）注入マウスにおけるＣＡ１ニューロンの総数をプロットした棒グラフである。＊はｐ値＜０．０５を示す（両側ウィルコクソンのサインランク検定）。
【０１７２】
【図６】図６Ａは、表示のとおりに処理した皮質薄片での死滅のパーセントをプロットした棒グラフである。各処理での死滅のパーセントを生皮質薄片において、膜透過性ＥｔｈＤ−１陽性細胞の数ならびにカルセインＡＭで陽性に染色された生細胞の数を計測することにより定量した。データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝４被験体）として示す。＊は、５０μＭリバースＡβと比べてｐ値＜０．０５を示す；＃は、５０μＭ Ａβと比べてｐ値＜０．０５を示す。図６Ｂは、表示した処理での、ＴＵＮＥＬ陽性である全細胞のパーセント（％ＴＵＮＥＬ）またはＴＵＮＥＬ及びＮｅｕＮの両方が陽性であるＮｅｕＮ陽性細胞のパーセント（％ＴＵＮＥＬ／ＮｅｕＮ）をプロットした棒グラフである。データは、単一の被験体のものであり、平均±ＳＥＭ（１処理あたりｎ＝２〜４薄片）として示す。図６Ｃは、表示した処理での死滅のパーセントをプロットした棒グラフである。各処理での死滅のパーセントは生皮質薄片において、膜透過性ＥｔｈＤ−１陽性細胞の数ならびにカルセインＡＭで陽性に染色された生細胞の数を計測することにより定量した。データは３例の被験体のものであり、平均±ＳＥＭとして示す。
【０１７３】
【図７】表示した処理での海馬薄片培養物における死滅のパーセントをプロットした棒グラフである。データを平均±ＳＥＭ（１処理あたりｎ＝３〜７薄片）として示す。＃は、ビヒクルと比べたｐ値＜０．０１を示す；＊は、２５μＭ Ａβと比べてｐ値＜０．０１を示す；対応のない両側ｔ−検定。
【０１７４】
【図８】図８は、海馬の処理側および対照側におけるＩＧＦＢＰ２の発現の相対レベルにおける変化倍数をプロットした棒グラフである。レベルをβ−アクチンレベルに対して標準化した。乱雑化実験での試料の数は３であり、一方、他の実験での試料の数は４であった。
【０１７５】
【図９】海馬の処理側および対照側におけるプロラクチン受容体の発現の相対レベルにおける変化倍数をプロットした棒グラフである。レベルをβ−アクチンレベルに対して標準化した。
【０１７６】
【図１０】海馬の処理側および対照側におけるＩＧＦ２の発現の相対レベルにおける変化倍数をプロットした棒グラフである。レベルをβ−アクチンレベルに対して標準化した。
【０１７７】
【図１１】提案される神経保護的経路の図表である。
【０１７８】
【図１２】図１２Ａ及びＢは、表示した処理での海馬薄片培養物における死滅のパーセントをプロットした棒グラフである。
【０１７９】
【図１３】図１３Ａ及びＢは、海馬内へのｓＡＰＰ１０量体の定位注射の海馬内へのｓＡＰＰαデカペプチドの定位注射後のＴＴＲ免疫染色を示す一組の顕微鏡写真である。
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２００４年８月１１日に出願された米国特許仮出願第６０／６００，９８７号、２００４年１０月２２日に出願された同第６０／６２１，５９６号および２００５年１月４日に出願された同第６０／６４１，６８３号に対する優先権を主張する。すべての出願は、引用により本明細書に組み込まれる。
【連邦政府の支援による研究または開発に関する記載】
【０００２】
本発明は、ＮＩＨの助成番号ＥＳ０１００４２及びＥＳ００８０８９により与えられた連邦政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【発明の背景】
【０００３】
一般に、本発明は、Ａβの効果（例えば、ニューロン細胞死）の低減に関与する方法および材料に関する。
【０００４】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、β−アミロイド（Ａβ）蓄積およびプラーク形成、微小管結合タンパク質タウの異常なリン酸化および凝集、ならびに大量のニューロン減少を特徴とする。ＡＤの遺伝型ならびに充分な動物モデル及びインビトロデータにおいて同定された変異は、ＡＤの発症を誘発する主要な因子として、Ａβおよびこれが由来するポリペプチドであるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を強く示す（Ｈａｒｄｙ及びＳｅｌｋｏｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７：３５３−３５６（２００２））。β−セクレターゼ及びγ−セクレターゼによるＡＰＰの切断によりＡβが生成する。α−セクレターゼによるＡＰＰの切断は、Ａβ配列内で起こり、したがってＡβ形成が妨げられ、一方でＮＨ2末端が生成し、ｓＡＰＰαと称する分泌ポリペプチドが生成する（Ｅｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８（４９５９）：１１２２−１１２４，１９９０）。
【０００５】
内生タウのリン酸化およびインビボニューロン減少などの主要なＡＤ神経病理であるＡβ誘導は、まだ納得のいく立証がされていない。実際、ＡＰＰの変異型形態を過剰発現するマウスでは高レベルのＡβが蓄積されるが、これらは、ＡＤにおいて観察されるタウリン酸化または深刻なニューロン減少を示さない（Ｉｒｉｚａｒｒｙら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５６：９６５−９７３（１９９７）；Ｉｒｉｚａｒｒｙら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１７：７０５３−７０５９（１９９７））；及びＴａｋｅｕｃｈｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ，１５７：３３１−３３９（２０００））。
【発明の簡単な概要】
【０００６】
一実施態様では、本発明は、Ａβ効果の低減または抑制に有用な単離されたペプチドであって、該ペプチドは、式Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄを含み、式中、Ａは、アミノ酸残基Ｄ、Ｅ、Ｎ及びＱからなる群から選択され；式中、Ｂは、アミノ酸残基Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｇ及びＰからなる群から選択され；式中、Ｃは、アミノ酸残基Ｅ、Ｄ、Ｎ及びＱからなる群から選択され；式中、Ｄは、アミノ酸残基Ｆ及びＹからなる群から選択され；該ペプチドは、哺乳動物細胞においてＡβの効果を低減または抑制し、及び該ペプチドは、４〜１６の間の残基長である。好ましい型では、該ペプチドはポリペプチド安定化単位をさらに含む。
【０００７】
別の実施態様では、該ペプチドは、さらにアミノ酸残基をカルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかに、前記ペプチドの式が、Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｚとなるように含み、式中、Ｘ及びＺは、ＤＡＥＦと連続的なｓＡＰＰαタンパク質配列由来の残基である。好ましくは、該ペプチドは、ＤＡＥＦ（配列番号：２）、ＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：３）、ＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：４）、ＥＡＤＦ（配列番号：５）、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：１）、Ｒ９ＤＡＥＦ（配列番号：６）、及びａｃＤＡＥＦ（配列番号：２）からなる群から選択される。
【０００８】
別の実施態様では、本発明は、Ａβの効果の低減および抑制に有用な単離されたペプチドであって、該ペプチドは、ＤＡＥＦ（残基５９７〜６００）を含むｓＡＰＰα配列の単離された４〜１６残基セグメントを含む。
【０００９】
別の実施態様では、本発明は、哺乳動物細胞に、Ａβの効果が低減または抑制されるような有効量の本発明のペプチドを供給する工程を含む、哺乳動物細胞においてＡβの効果を低減または抑制する方法である。
【００１０】
別の実施態様では、本発明は、哺乳動物細胞に、ニューロン細胞死が抑制されるような有効量の本発明のペプチドを供給する工程を含む、ニューロン細胞死を抑制する方法である。
【００１１】
別の実施態様では、本発明は、Ａβの効果を低減させる能力を有する化合物を同定する方法である。脳組織を、Ａβペプチドの存在下で試験化合物と接触させる工程およびＡβの効果を測定する工程を含み、好ましくは、Ａβの効果を低減させる試験化合物の能力を、Ａβの効果を低減させる本発明のペプチドの能力と比較する工程をさらに含む。
【００１２】
特に定義のない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が関連する技術分野における当業者が一般的に理解しているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または等価な方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好適な方法および材料は下記のものである。矛盾する場合は、定義を含む本明細書に支配される。また、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定を意図しない。
【００１３】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載から、および特許請求の範囲から自明となろう。
【００１４】
本出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（１つまたは複数）を有するこの特許出願公開公報の複写は、請求および必要な費用の支払いを行うと、特許庁によって提供される。
【発明の詳細な説明】
【００１５】
（概説）
本発明は、Ａβの効果、例えば、ニューロン細胞死およびタウリン酸化などを低減または抑制することに関連する方法および材料に関する。例えば、本発明は、ポリペプチド類、ポリペプチド類を含有する組成物、トランスジェニック動物、およびＡβの効果（例えば、哺乳動物におけるニューロン細胞死）を抑制するための方法を提供する。かかるポリペプチド類及びポリペプチド類を含有する組成物は、アミノ酸配列を細胞に、Ａβの効果が低減または抑制されるように提供するために使用され得る。Ａβの効果を低減または抑制することにより、科学者達が、ＡＤの発症においてＡβ以外のポリペプチド類の関与を調べることが可能となり得る。また、Ａβの効果を低減または抑制することは、臨床医が、ＡＤを患っているかまたはＡＤの発症のリスクがあるヒトを処置することが可能になる。例えば、本明細書において提供されるポリペプチドはＡＤ患者に、未処置のＡＤ患者において典型的に観察されるニューロン細胞死またはタウリン酸化が、処置されたＡＤ患者において低減または抑制されるように投与され得る。
【００１６】
以下の本発明のポリペプチドの記載は、Ａβの効果を低減または抑制するのに特に有用なｓＡＰＰαの特定のポリペプチド断片を我々が見出したことから導かれたものである。このポリペプチドＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：１）は、ｓＡＰＰα配列の残基５９２〜６０１である。我々は、該１０残基ペプチド内の４残基のペプチドＤＡＥＦが、それ自体でＡβの効果を低減または抑制するのに充分であることを見出した。この出願で使用する残基番号システムは、ＡＰＰ６９５を基準にしている。Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ Ｐ０５０６７−４を参照。（また、Ｋａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３２５：７３３−７３６，１９８７；Ｌｅｍａｉｒｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：５１７−５２２，１９８９も参照のこと）。これは、脳内の主要なアイソフォームであり、したがって、我々が選択する番号付けシステムの基準とする。
【００１７】
（本発明のポリペプチド）
この記載の一態様では、下記式：
Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ（配列番号：２４）
（式中、Ａは、アミノ酸残基Ｄ、Ｅならびに保存的置換、例えば、Ｎ及びＱからなる群から選択され；
式中、Ｂは、アミノ酸残基Ａならびに保存的置換、例えば、Ｔ、Ｓ、Ｇ及びＰからなる群から選択され；
式中、Ｃは、アミノ酸残基Ｅ、Ｄならびに保存的置換、例えば、Ｎ及びＱからなる群から選択され；及び
式中、Ｄは、アミノ酸残基Ｆならびに保存的置換、例えば、Ｙからなる群から選択され；
該ペプチドは、哺乳動物細胞においてＡβの効果を低減または抑制する）
で規定される４〜１６残基ポリペプチドを特色とする。
【００１８】
「保存的置換(conservative substitutions)」によって、我々は、側鎖の特徴に従ってアミノ酸をグループ分けすることを意図する。保存的置換の予測は、充分な程度の自由度が明らかに存在する大きなタンパク質の構造領域について容易に行われ得る。最良の方法は、進化的変異の研究から誘導される。２つのよく知られた方法はＰＡＭ２５０及びＢｌｏｓｕｍである（Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ら、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５（３）：３４５−３５２，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，１９７８；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９，１９９２を参照のこと）。
【００１９】
以下は、本発明の好ましいペプチド類の１つを含む残基について、ＰＡＭ２５０及びＢｌｏｓｕｍ法によって予測される最も保存的な置換を表にまとめたものである。
【００２０】
【表１】
【００２１】
本発明のポリペプチドは、４〜１６の間の残基長のアミノ酸である。好ましくは、該ポリペプチドは１０〜４の間のアミノ酸残基長である。以下に記載のように、さらなる安定化ペプチド類を該分子のいずれかの終端に付加することが望まれることがあり得る。その実施態様では、ポリペプチド全体は、実際には１６アミノ酸より長くなり得る。
【００２２】
以下に記載するように、数種類の様式で該ポリペプチドの終端を修飾することが望まれることがあり得る。これらの修飾もまた、上記及び下記のポリペプチドの範囲に含まれる。例えば、アセアレート(acealated)終端を提供することが望まれることがあり得る。さらに、前記の本発明のポリペプチド類を、哺乳動物細胞においてＡβの効果を低減または抑制するその能力に影響しない様式で修飾することが望まれることがあり得る。これらの卑小な修飾もまた、本発明のポリペプチドの範囲内である。
【００２３】
本発明の好ましい形態では、該ポリペプチドは、式；Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ
（式中、Ａは、アミノ酸残基Ｄ及びＥからなる群から選択され；
式中、Ｂは、アミノ酸残基Ａからなる群から選択され；
式中、Ｃは、アミノ酸残基Ｅ及びＤからなる群から選択され；ならびに
式中、Ｄは、アミノ酸残基Ｆからなる群から選択される）
によって規定される。
【００２４】
本発明の特に好ましい形態では、ポリペプチドは、本質的に上記の本発明の実施態様のいずれかにおいて規定されるＡ−Ｂ−Ｃ−Ｄからなる。
【００２５】
本発明の他の実施態様では、該ポリペプチドは下記式によって規定され：
Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｚ
式中、Ｘ及びＺは、ＤＡＥＦ（配列番号：２）と連続的なｓＡＰＰα由来の残基である。「連続的な(contiguous)」により、我々は、残基が、天然に存在するＤＡＥＦ（配列番号：２）配列（残基５９７〜６００）と自然状態で接することを意味する。例えば、ポリペプチドＥＶＫＭ（配列番号：２３）−ＡＢＣＤは、アミノ酸残基ＥＶＫＭ（残基５９３−５９６）が、天然に(natively)存在するＤＡＥＦ配列と接するため、本発明のペプチドであり得る。ＡＢＣＤ−Ｒは、同じ理由のため本発明のペプチドであり得る。
【００２６】
好ましい実施態様では、該ポリペプチドは、以下のｓＡＡＰα断片または修飾された断片：ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：１）、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦ（配列番号：７）；ＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：３）；ＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：４）；ＤＡＥＦ（配列番号：２）、ａｃＤＡＥＦ（配列番号：２）、ＭＥＡＤＦ（配列番号：８）、ＥＡＤＦＲ（配列番号：９）、ＥＡＥＦ（配列番号：１０）、またはＥＡＤＦ（配列番号：５）の１つを含むか、または該断片の１つからなるものであり得る。該ポリペプチドは、ＤＡＥＦ（配列番号：２）セグメントを含むｓＡＰＰαの任意の４〜１６残基断片であり得る。
【００２７】
本発明に対する他の実施態様では、該ポリペプチドは、上記の保存的アミノ酸置換を有する先の配列の任意の１つを含み得る。
【００２８】
また、本明細書において提供されるポリペプチド類は、ポリペプチド安定化単位を含有し得る。本明細書で用いられる用語「ポリペプチド安定化単位」は、該ポリペプチドに共有結合または非共有結合したとき、哺乳動物の血清内での該ポリペプチドの安定性を増大させる、及び／又は細胞内への該ポリペプチドの取り込みを助長し得る化学的部分をいう。
【００２９】
数多くのプロテアーゼ類が、血清内の分子に接近可能であり、これらの分子を破壊または代謝し得る。ポリペプチド安定化単位は、本明細書において提供されるポリペプチド類の脳内への侵入を助長することに加え、その酵素的分解を低減または抑制し得る。ポリペプチド安定化単位は、アミド結合もしくはペプチド結合などの共有結合によって、またはアビジンとビオチン間などの相互作用によって、他のポリペプチドに結合されたポリペプチドであり得る。該結合としては、制御された加水分解速度で脳内で切断される結合、例えば、−Ｓ−Ｓ−、エステル、または立体障害エステル(stearically hindered ester)が挙げられ得る。
【００３０】
安定化単位はまた、アルキル（メチレン）、アルコキシ（エーテル）、またはグリコールの鎖であり得るリンカーによって結合させてもよい。また、該ポリペプチドはポリペプチド安定化単位に、ポリエチレングリコールリンカーによって結合させ得る。上記のように、リンカーとしては、−Ｓ−Ｓ−などの脳内で切断される結合が挙げられ得る。これらの場合において、安定化されるポリペプチドとポリペプチド安定化単位とが、より大きなキメラポリペプチドを形成し得る。
【００３１】
ポリペプチド安定化単位として使用され得るアミノ酸配列の例としては、制限されず、血漿タンパク質トランスフェリン、トランスフェリンの断片、トランスフェリン受容体に対する抗体（例えば、ＯＸ２６または８Ｄ３）、インスリン、インスリン受容体に対する抗体（例えば、８３１４）（Ｃｏｌｏｍａら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１７：２６６−７４（２０００））、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、及びカチオン化されたアルブミンが挙げられる。いくつかの実施態様では、ポリペプチド安定化単位はハプテン以外の部分であり得る。例えば、ポリペプチド安定化単位はＤＮＰ以外の部分であり得る。
【００３２】
ポリペプチド安定化単位は、細胞および／または脳内へのポリペプチドの取り込みを助長し得る。ポリペプチド安定化単位は、親油性−親水性バランスを増大させるため、およびＢＢＢを構成する脳内皮細胞の脂質膜を越える単純な受動拡散を達成するのを補助するために機能し得る。例えば、ステアリン酸などの長鎖脂肪酸（好ましくは炭素数１６個未満）、またはステリル(steryl)アルコールなどの長鎖アルコール（好ましくは炭素数１６個未満）が、好ましいものであり得る。かかるポリペプチド安定化単位の例としては、制限されず、ＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質の塩基性ドメイン（例えば、Ｔａｔ49〜57；ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号：１１）、Ｌ−もしくはＤ−アルギニンの９量体（Ｒ９）、または他のペプトイドアナログ、例えば、グアニジン頭部基と主鎖との間に６個のメチレンのスペーサーを含有するもの（Ｗｅｎｄｅｒら、ＰＮＡＳ，９７：１３００３−１３００８（２０００））が挙げられる。ポリペプチド安定化単位として使用され得る他のアミノ酸配列または部分は、ＰＣＴ／ＵＳ９９／２３７３１；Ｌａｒａｓら、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．３：６１２−６１８，２００５；Ｍｉｓｒａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓｃｉ．６（２）：２５２−２７３，２００３；Ｄａｌｐｉａｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４：２５９−２６９，２００５；Ｑｕｅｌｅｖｅｒら、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．３：２４５０−２４５７，２００５，及びＰＣＴ／ＥＰ０２／０２２３４に見出され得る。
【００３３】
安定化された単位は、血液脳関門を越える受容体（受容体媒介性輸送−ＲＭＴ）を利用するものであり得る（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，ＮｅｕｒｏＲＸ ２：３−１４，２００５）。例としては：輸送またはトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）抗体、（好ましくは、完全にヒトのＭＡｂ）；インスリンまたはインスリン受容体抗体（好ましくは、完全にヒトのＭＡｂ）；１型スカベンジャー受容体（ＳＲ−ＶＩ）（修飾されたＬＤＬ）；リポソーム類（ペグ化された(pegylated)イムノリポソーム類）（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３７３：５０７−５２８，２００３）；ナノ粒子（Ｏｌｉｖｉｅｒ，ＮｅｕｒｏＲｘ ２：１０８−１１９，２００５；Ｏｌｉｖｉｅｒら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９：１１３７−１１４３，２００２）；ＩＧＦ−１；ＩＧＦ−２；カチオン化されたアルブミン；及びＨＩＶのＴａｔタンパク質が挙げられる。
【００３４】
ポリペプチド安定化単位は、血液脳関門を越えるペプチドの輸送媒介性透過を達成する天然の脳輸送体の基質となり得（Ｔｓｕｊｉ，ＮｅｕｒｏＲｘ ２：５４−６２，２００５）、担体媒介性輸送−ＣＭＴとしても知られ（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，前出，２００５）、これは、溶質担体（ＳＬＣ）遺伝子ファミリー（１００遺伝子を超える）の輸送体を利用するものであり得る（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，前出，２００５）。これらの輸送体としては：Ｌ系（大型、中性アミノ酸−Ｆ、Ｙ、Ｌ）輸送体ファミリー；ヘキソース（グルコース）輸送体ファミリー；モノカルボキシレート（短鎖脂肪酸）輸送ファミリー）有機アニオン輸送ファミリー；有機カチオン輸送ファミリー；アスコルビン酸輸送ファミリー（ある種のヘキソース輸送体を含む、Ｄａｌｐｉａｚら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．２４：２５９−２６９，２００５；Ｍａｎｆｒｅｄｉｎｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：５５９−５６２，２００２；Ｍａｎｆｒｅｄｉｎｉら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１２：５４５３−５４６３，２００４；Ｑｕｅｌｅｖｅｒら、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．３：２４５７−２４５７，２００５，ＰＣＴ ＷＯ０２／０７０４９９）；ペプチド（エンケファリン、レプチン、グレリン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン）輸送ファミリー；及びＳＬＣ遺伝子ファミリーの未だキャラクタライズされていない輸送体が挙げられ得る。
【００３５】
ポリペプチド安定化単位は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）タンパク質の大ファミリーを含む能動排出輸送(Active Efflux Transport)ファミリーの一構成員、例えば、ｐ−糖タンパク質（多剤耐性；ＭＤＲ；ＡＢＣ−Ｂｌ遺伝子）ポンプまたはＢＢＢにおいて重要な役割を果たす他のポンプ（Ｖａａｌｂｕｒｇら、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２００５；ｄｅ Ｂｏｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．４３：６２９−６５６，２００３；Ｆｒｏｍｍ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２５：４２３−４２９，２００４）によって、該ポリペプチドが脳から排出されることを妨げ得る。
【００３６】
ポリペプチド安定化単位としては、化学的送達系またはレドックス送達系、例えば、ジヒドロニコチニル部分（Ｌａｒａｓら、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．３：６１２−６１８，２００５）または１，４−ジヒドロトリゴネリネート(trigonellinate)部分（Ｂｏｄｏｒ，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５０７：２８９−３０６，１９８７；Ｂｏｄｏｒ及びＢｕｃｈｗａｌｄ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．３６：２２９０−２５４，１９９９；Ｂｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：１６９８−１７００，１９９２）が挙げられ得る。
【００３７】
いくつかの研究により、プロリン残基は、ペプチダーゼ類に対してより抵抗性であることが示唆されている（Ｙａｒｏｎ及びＮａｉｄｅｒ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８：３１−８１，１９９３；Ｖａｎｈｏｏｆら、Ｆａｓｅｂ．Ｊ．９：７３６−７４４，１９９５；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＯ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３４３：１６０−１８６，１９９７）。したがって、ポリペプチド安定化単位は、１つまたはそれ以上のプロリンアミノ酸残基であり得る。かかる残基は、ＮＨ2末端残基、ＣＯＯＨ末端残基、または両方であり得る。実際、研究の１つでは、ＮＨ2−またはＣＯＯＨ−末端の終端へのアミノ酸アラニン、プロリン、プロリン（ＡＰＰ）またはＰＰＡの付加により、短いペプチド断片が安定化されることが示された（Ｗａｌｋｅｒら、Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．６２：２１４−２２６、２００３）。アミノ酸ＡＰＰは、単一のＰよりも大きな安定性を付与したＰＰよりも大きな安定性を付与した。また、ＮＨ2末端の終端の保護は、ＣＯＯＨ終端よりも大きな安定性を付与し、カルボキシペプチダーゼ類よりもアミノペプチダーゼ類の方が多くあるという考えと一致した。実際、アミノ酸ＡＰＰの付加は、アミド化またはアセチル化よりも大きな安定性を付与し、エキソペプチダーゼ類が遊離ＮＨ2末端に接近するのを完全に抑制する環化とほぼ同様に有効であった（Ｗａｌｋｅｒ，前出，２００３）。かかる安定性残基は、Ｎ末端残基またはＣ末端残基であり得る。例えば、ＤＡＥＦ配列を含有するポリペプチドのＮ末端は、２つのプロリン残基であり得る。いくつかの実施態様では、ポリペプチドは、Ｎ末端プロリン残基とＣ末端プロリン残基の両方を含有するものであり得る（例えば、ＰＰＤＡＥＦＰＰ（配列番号：１２）、ＰＤＡＥＦＰＰ（配列番号：１３）、ＰＰＤＡＥＦＰ（配列番号：１４）、及びＰＤＡＥＦＰ（配列番号：１５））。
【００３８】
ＡＰＰにおけるスウェーデン変異（Ｎに対してＫ５９５及びＬに対してＭ５９６）は、ＡＰＰ残基５９６と５９７間の結合においてβ−セクレターゼによる切断をもたらす。したがって、β−セクレターゼ切断部位を含むペプチドにおいて、この変化を組み込むことは、同時に、ＤＡＥＦ（配列番号：２）を含有する、より小さな神経保護ペプチドの生成が助長され、β−セクレターゼが競合的に阻害される。
【００３９】
ポリペプチド安定化単位は、アミノ酸配列またはアミノ酸残基以外の化学的部分であり得る。例えば、ポリペプチド安定化単位は、安定化させるポリペプチドに共有結合または非共有結合したポリ（エチレングリコール）、ポリ（スチレンマレイン酸）、非天然のアミノ酸（例えば、アルギニンアナログ及びリシンアナログ（Ｋｅｎｎｅｄｙら、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．，５５：３４８−３５８（２０００）；Ａｒｇｏｌｙｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．）、エステル類（例えば、芳香族ベンゾイルエステル類もしくは分枝鎖第３級ブチルエステル類）、脂肪酸もしくはコレステロールエステル、アミド基、アビジンもしくはストレプトアビジン、またはビオチン化学基であり得る。いくつかの実施態様では、脂質二重層内に挿入されたポリ（エチレングリコール）を有するか、または有しないリポソーム類またはイムノリポソーム類（Ｈｕｗｙｌｅｒら、ＰＮＡＳ，９３：１４１６４−６９（１９９６）及びＣｅｒｌｅｔｔｉら、Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ，８：４３５−４６（２０００））が、ポリペプチド安定化単位として、及びポリペプチド類を脳内に輸送するための方法として使用され得る。例えば、トランスフェリン受容体に対する抗体を含有するリポソームが、ポリペプチド安定化単位として使用され得る。フェニルアラニンのトリメチル化を含むメチル化、アセチル化、アシル化、アルキル化、ハロゲン化、及びグリコシル化などの修飾が、ポリペプチドを安定化させるため、及びバイオアベイラビリティを増大させるために使用され得る。これら及び他の修飾は、脂質の溶解度（脂質化）またはカチオン化を増大するための機能を果たし得る。Ｎ−アシル化またはピログルタミル残基によるアミノ末端の修飾は、該ポリペプチドをタンパク質分解性切断から保護し得る。
【００４０】
本発明のポリペプチド類は、実質的に純粋であり得る。ポリペプチドに関して本明細書で用いられる用語「実質的に純粋な」は、該ポリペプチドが、自然状態では会合している他のポリペプチド類、脂質、炭水化物および核酸を実質的に含まないことを意味する。例えば、実質的に純粋なポリペプチドは、その天然の環境から取り出されており、少なくとも６０パーセント純粋である任意のポリペプチドである。ポリペプチドに関して本明細書で用いられる用語「実質的に純粋な」はまた、化学的に合成されたポリペプチド類及びポリペプチド組成物を包含する。典型的には、実質的に純粋なポリペプチドは、非還元性ポリアクリルアミドゲル上に、単一の主要バンドをもたらす。
【００４１】
ビタミンＣ（アスコルビン酸−「ＡＡ」）輸送系は、これを利用しない場合はＢＢＢを越えることができない薬物を脳内に輸送するために利用され得る（Ｄａｌｐｉａｚら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．２４：２５９−２６９，２００５；Ｍａｎｆｒｅｄｉｎｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５：５５９−５６２，２００２；Ｍａｎｆｒｅｄｉｎｉ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１２：５４５３−５４６３，２００４；Ｑｕｅｌｅｖｅｒら、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．３：２４５０−２４５７，２００５，ＰＣＴ ＷＯ０２／０７０４９９）。この系の利点は、脳内で潜在的に達成され得る高濃度のＡＡ−ペプチドコンジュゲートである。ＳＶＣＴ２系の利点は、普通の食事をしている人における低レベルの競合性天然のアスコルビン酸リガンド、及び脳を浸している(bathing)ＤＳＦ内へのコンジュゲートの直接送達である。ＧＬＵＴ１系の利点は、非常に高い輸送能（Ｔｓｕｊｉ，ＮｅｕｒｏＲｘ ２：５４−６２，２００５）、脈絡叢毛細管の表面積と比べて脳毛細管の非常に高い表面積が、より高い輸送能および、より重要なことには薬物がニューロンに接近するのに拡散するために必要とされるさらにより短い間隔距離（＜５０マイクロメートル）を提供し（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，ＮｅｕｒｏＲｘ ２：３−１４，２００５）、すべてのニューロンが薬物に接触されるのを確実にすることである。ＧＬＵＴ１系の不都合点は、血糖正常の人における相対的に高濃度のＤ−グルコースがＡＡ−リンカー−ペプチドコンジュゲートの輸送と競合し得ることである（Ａｇｕｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：２８４２−２８４８，１９９７）。ＰＣＴ ＷＯ ０２／０７０４９９には、エステル、チオエステルまたはアミド結合によってリンカーのカルボキシル基に結合している−ＯＨ、−ＳＨまたは−ＮＨ基を有する活性物質を含有するＡＡ−リンカー−薬物コンジュゲートが記載されている。
【００４２】
好ましいＡＡ系ポリペプチド安定化単位の一例は、アスコルビン酸もしくは６−ハロ−アスコルビン酸または薬学的に許容可能な誘導体およびリンカーを含む。リンカーは、（ｉ）該ペプチドに対する連結を提供するための化学基を有する部分（ｉｉ）ＡＡの５−または６−ＯＨに対する連結を提供するための化学基および（ｉｉｉ）スペーサー単位を含有するものであり得る。該連結の一方または両方は、代謝に不安定な、例えば、エステルまたはチオエステルであり得る（そのため、神経保護ペプチドが脳内に放出され得る）。リンカーはペプチドに、α−カルボキシルもしくはα−アミノ基を介して、または任意の側鎖基（例えば、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、フェノール性−ＯＨ）を介して結合され得る。リンカーはまた、相対的に代謝に安定な、例えばアミド結合であり得る。スペーサー単位は、任意の数のメチレンの鎖であり得るが、好ましくは１６未満で、任意選択で、リンカーの一部に結合された神経保護ペプチドが脳内に放出され得るような１つまたはそれ以上の代謝により切断され得る結合、例えば−Ｓ−Ｓ−を含有する。リンカーの一部が神経保護ペプチドに結合されたままである任意の状況において、このリンカーの一部は、その全体が生物学的に活性、すなわち神経保護性となるように選択されなければならず、理想的には、その全体が該ペプチド単独よりも活性となるように選択されなければならない。
【００４３】
ＡＡ系ポリペプチド安定化単位の一例は、Ｒａ−ＡＡ（エステル結合によってＡＡの５−及び／又は６−ＯＨに結合される）であり、式中、（１ａ）Ｒ＝ＨＯ(ＣＨ2)ｘＣＯ−及びａ＝１もしくは２及びｘ＝１〜１６である、または（１ｂ）Ｈ2Ｎ(ＣＨ2)ｘＣＯ−及びａ＝１もしくは２及びｘ＝１〜１６である。
【００４４】
ＡＡ系ポリペプチド安定化単位の別の例は、上記のとおりであって、式中、（２ａ）Ｒ＝ＨＯ(ＣＨ2)ｙ−Ｓ−Ｓ−(ＣＨ2)ｚＣＯ−及びｙ＝１〜１５、Ｚ＝１〜１５及びｙ＋ｚは、好ましくは１６より大きくない、または（２ｂ）Ｒ＝Ｈ2Ｎ(ＣＨ2)ｙ−Ｓ−Ｓ−(ＣＨ2)zＣＯ−及びｙ＝１〜１５、ｚ＝１〜１５及びｙ＋ｚは、好ましくは１６より大きくない。
【００４５】
好適な神経保護ペプチド−ポリペプチド安定化単位は、以下のように選択される：（ｉ）一連の活性な神経保護ペプチド類または該ペプチドにおそらく、代謝に安定に結合されたリンカーの任意の一部を含有する神経保護ペプチドの誘導体（上記の例１ｂの場合では、−ＨＮ(ＣＨ2)ｘＣＯ2Ｈであり得、または例２ｂでは、−ＨＮ(ＣＨ2)yＳＨであり得る）は、この出願書類のどこかに記載した適当なアッセイを用いることにより選択され得る、（ｉｉ）これらは、適当な保護試薬およびカップリング試薬を用い、アスコルビン酸に化学的にカップリングさせ得る、（ｉｉｉ）得られたコンジュゲートを、ＧＬＵＴ１及びＳＶＣＴ２輸送体によって細胞膜を越えて輸送するその能力についてインビトロで試験し、（ｉｉｉ）次いで、この出願書類のどこかに記載したようにしてインビボで試験し得る、及び（ｉｖ）許容可能なインビボ効力、活性および作用持続期間を有するコンジュゲートが、追加調査およびさらなる開発のために選択され得る。
【００４６】
任意の方法を用いて、実質的に純粋なポリペプチドが得られ得る。例えば、アフィニティクロマトグラフィー及びＨＰＬＣならびにポリペプチド合成技術などの一般的なポリペプチド精製技術が使用され得る。また、任意の材料が、実質的に純粋なポリペプチドを得るための供給源として使用され得る。例えば、野生型またはトランスジェニック動物由来の組織が、供給源材料として使用され得る。また、目的の特定のポリペプチドを過剰発現するように遺伝子操作された培養細胞を用いて、実質的に純粋なポリペプチドが得られ得る。ポリペプチドは、該ポリペプチドが親和性マトリックス上に捕捉されるのを可能にするアミノ酸配列を含むように設計され得る。例えば、ｃ−ｍｙｃ、血球凝集素、ポリヒスチジンまたはＦｌａｇ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ）などのタグが、ポリペプチド精製を補助するために使用され得る。かかるタグは、該ポリペプチド内のどこにでも、例えば、カルボキシルまたはアミノ末端にいずれかに挿入され得る。有用であり得る他の融合体としては、該ポリペプチドの検出を補助する酵素、例えば、アルカリホスファターゼが挙げられる。
【００４７】
（処置方法）
他の１つの態様において、本発明は、ニューロン細胞死を抑制するための方法を特徴とする。該方法は、ニューロン細胞をポリペプチドと接触させることを含み、該ポリペプチドは、本発明のアミノ酸配列を含む。ニューロン細胞は海馬の細胞であり得る。上記のように、該ポリペプチドは、好ましくは１６〜４のアミノ酸残基長であり、該ポリペプチドは、ポリペプチド安定化単位を含有し得る。
【００４８】
本明細書において提供されるポリペプチド類は、Ａβの効果を低減、阻害または抑制することにより、ニューロン細胞死を抑制する。例えば、本発明のポリペプチドは、Ａβ誘導性タウリン酸化のレベルを少なくとも２０パーセント低減させるために使用され得る。本明細書において提供されるポリペプチド類はまた、哺乳動物においてＡβ効果を引き起こすＡβの能力を低減させ得る。例えば、本発明のポリペプチドは、哺乳動物内で細胞（例えば、ニューロン）を死滅させるＡβの能力を低減させるために使用され得る。Ａβ効果を引きこす、Ａβの効果における低減またはＡβの能力における低減は、完全な低減（例えば、１００パーセント低減）または不完全な低減（例えば、１００パーセント未満の低減）であり得る。例えば、該実施態様では、低減は、２０パーセントまたはそれ以上の低減であり得る。別の実施態様では、低減は４０パーセントであり得る。
【００４９】
Ａβ効果としては、制限されず、タウリン酸化、神経細線維もつれの形成、ニューロン細胞死、ニューロンの機能不全、シナプスの減少、酸化的ストレスによる細胞の損傷、及び小グリア細胞活性化が挙げられる。かかる効果は、一般的な分子生物学技術を用いて検出または測定され得る。例えば、抗リン酸化抗体によるイムノブロッティングおよび免疫細胞化学技術を用い、タウリン酸化が評価され得る（Ａｕｇｕｓｔｉｎａｃｋら、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．，１０３：２６−３５（２００２））。電子顕微鏡検査、チオフラビンＳ組織化学、及び銀染色を用い、タウ病理の進行した病期が検出され得る（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ及びＤａｖｉｅｓ，ＰＮＡＳ，８７：５８２７−３１（１９９０）、Ｂａｎｃｈｅｒら，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，４７７：９０−９９（１９８９）、及びＵｃｈｉｈａｒａら、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ，１０２：４６２−６（２００１））。免疫細胞化学技術を用い、酸化的ストレス（Ａｂｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，７０：４４７−５０（２００２）、ならびにＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ及びＬａｕｄｅｒｂａｃｋ，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，３２：１０５０−６０（２００２））、小グリア細胞活性化（Ｓａｓａｋｉら、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ，９４：３１６−２２（１９９７）及びＥｇｅｎｓｐｅｒｇｅｒら、Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ，８：４３９−４７（１９９８））、シナプスの減少（Ｔｉｒａｂｏｓｃｈｉら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５５：１２７８−８３（２０００）、Ｑｉｎら、Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ，１０７：２０９−１５（２００３）、及びＨａｔａｎｐａａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ，５８：６３７−４３（１９９９））、ならびにニューロン細胞死（Ｓｕら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，５：２５２９−３３（１９９４）及びＳｔａｄｅｌｍａｎｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１５５：１４５９−６６（１９９９））が検出され得る。ＤＮＡに結合したときエチジウムホモ二量体によって放たれる蛍光の測定は、哺乳動物内でのニューロン細胞死を検出するために使用され得る。アポトーシスと一致する形態学的特徴（例えば、クロマチンの凝集）を探すためのＮｉｓｓｌ染色と組み合わせたＴＵＮＥＬにより、アポトーシスプロセスにより死亡しつつあるニューロンが検出され得る（Ｓｈｅｎｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５７：３２３−２８（１９９８）及びＰｏｍｐｌら、Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ．，６０：３６９−７６（２００３））。電気生理学を用い、ニューロンの機能不全を暗示し得る長期増強作用の不足が検出され得る（Ｔｒｉｎｃｈｅｓｅら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５５：８０１−１４（２００４））。
【００５０】
いくつかの実施態様では、本明細書において提供されるポリペプチドまたは組成物は、Ａβによって通常誘導されるＡβ効果の程度（例えば、ニューロン細胞死の量）が低減された条件下の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、サル、またはヒト）に投与され得る。本明細書に記載のように、Ａβの効果における低減またはＡβ効果を引き起こすＡβの能力における低減は、完全な低減（例えば、１００パーセント低減）または不完全な低減（例えば、１００パーセント未満の低減）であり得る。例えば、低減は２０パーセントまたは４０パーセントの低減であり得る。
【００５１】
本明細書において提供されるポリペプチド類または組成物は、局所または全身の処置のいずれが所望されるか及び処置される領域に応じて、いくつかの方法によって投与され得る。例えば、本明細書において提供されるポリペプチドまたは組成物は、経口、皮下、くも膜下、脳室内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内または頭蓋内に投与され得る。投与は、即効的（例えば、注射により）であり得るか、またはある期間にわたって行われるもの（例えば、低速注入または低速放出製剤の投与により）であり得る。中枢神経系の組織の処置では、本明細書において提供されるポリペプチド類または組成物は、注射または注入によって脳脊髄液中に、好ましくは、血液脳関門を越える透過を促進できる１種類またはそれ以上の薬剤とともに投与され得る。かかる薬剤の例としては、制限されず、血漿タンパク質トランスフェリン、トランスフェリン受容体に対する抗体（例えば、ＯＸ２６）、インスリン、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、カチオン化されたアルブミン、ＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質の塩基性ドメイン（例えば、Ｔａｔ49〜57）、Ｌ−もしくはＤ−アルギニンの９量体（Ｒ９）、または他のペプトイドアナログ、例えば、グアニジン頭部基と主鎖との間に６個のメチレンのスペーサーを含有するもの（Ｗｅｎｄｅｒら、ＰＮＡＳ，９７：１３００３−１３００８（２０００））が挙げられる。経口投与では、本明細書において提供されるポリペプチド類または組成物は、粉剤もしくは顆粒剤、水もしくは非水性媒体中での懸濁剤もしくは溶液、カプセル、サシェ剤、または錠剤に製剤化され得る。かかる製剤には、増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が組み込まれ得る。
【００５２】
鼻腔内送達について、これは、ペプチド類を血流内に注射の必要性なく送達する方法である。ある種の薬物とともに、該送達は、血液脳関門を迂回するため、及び嗅神経および三叉神経による脳透過を達成するために使用され(sued)得る。該送達では、鼻腔内液状製剤がスプレーとして使用され得るかまたは粉末であり得、いずれも、制御された粒径をもたらすために機械的システムを用いて投与され得る。任意選択で、該送達は、定量エアロゾル系などの定量用量形態であり得る（Ｆｒｅｙ，Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．Ｔｅｃｈ．２（５）：４６−４９，２００２；ＤｉＰｉｅｔｒｉｏ及びＷｏｌｌｅｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔ．Ｃｈｅｍ．，ｐｐ．１９−２２，２００３を参照のこと）。該用量は、１種類またはそれ以上の賦形剤、例えば、凝集阻害剤；電荷調整剤；ｐＨ調整剤；分解酵素阻害剤；粘膜溶解性または粘液除去(mucus clearing)剤；膜透過増強剤、例えば、界面活性剤；血管拡張剤；密着結合調節剤；送達用ビヒクルまたは担体など含んでいてもよい。
【００５３】
埋め込み可能な薬物注入系および脳神経外科用カテーテルを配置できることは、脳への直接的な薬物送達を可能にする。これにより、全身性薬物副作用、末梢での薬物代謝および不活化、血清タンパク質結合、ならびに血液脳関門透過が回避される（Ｈａｒｂａｕｇｈ，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｕｌｌ．２２：１０６−１０９，１９８６）。かかる系は、全身性安定性およびＢＢＢ透過が特に問題であるペプチド系薬物に、理想的に適したものであり得る。脳脊髄液（ＣＳＦ）は、利用可能な区画(accessible compartment)内に含まれ、脳全体を浸しており、それを薬物送達のための理想的な標的としている。カテーテルは、ＣＳＦが脳室から腹膜内に流れるのを可能にする脳室腹腔短絡術として、水頭を有する患者の側脳室内に常套的に配置される。脳室吻合術は、バンコマイシン及びゲンタマイシンなどの抗生物質を感染した患者のＣＳＦに送達するために使用される（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ． １１：６５−６９，１９９１）。また、ｔＰＡは、側脳室内に脳室造瘻術によって、脳室内出血の処置として送達されている（Ｄｅｕｔｓｃｈら、Ｓｕｒｇ．Ｎｅｕｒｏｌ．６１−４６０−４６３，２００４）。また、脳室内注入は、腫瘍の処置のための化学療法剤を用いて行われる（Ｄａｋｈｉｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｐ．６５：４０１−４１１，１９８１；Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｃｋら、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．４４：１−３１，２００５）。またさらに、カテーテルは、腰内臓神経のくも膜下腔の空間内に配置され、痙縮および慢性の痛みの処置のためのバクロフェンまたはモルヒネを送達する埋め込み可能なポンプ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に結合される。
【００５４】
本明細書に記載のポリペプチドまたは任意の組成物を送達するための好ましい方法の１つは、化合物を直接脳室内に、脳室造瘻術によって注射または注入を行うことである。投薬は、０．０１μｇ〜１ｍｇ／体重ｋｇであり得、毎日、毎週１回またはそれ以上またはより低頻度で行われ得る。化合物は側脳室内に、注射、または埋め込み可能なポンプを連続的に用いることによって送達され得る。ポンプは、皮下に鎖骨下窩内に埋め込まれ得、設定された速度の化合物をカテーテルによって脳室造瘻術レザバーに、及び側脳室内に送達し得る。該化合物の投与は等容量的であり得る、すなわち、投与される化合物の容量に相当するＣＳＦの量が、化合物注射の前に取り出される。化合物は、生理食塩水中に溶解および／または希釈させ得る。あるいはまた、化合物を人工脳脊髄液（１４７ｍＭ Ｎａ、２．８８ｍＭ Ｋ、１２７ｍＭ Ｃｌ、１．０ｍＭ リン酸塩、１．１５ｍＭ Ｃａ、１．１０ｍＭ Ｍｇ、１．１０ｍＭ ＳＯ4、２３．１９ｍＭ ＨＣＯ3、５，４１０ｍｇ／Ｌグルコース；３００ｍＯｓｍ／ｋｇ）中で希釈してもよい。
【００５５】
任意の方法を用いて、本明細書において提供されるポリペプチドまたは組成物を製剤化し、その後、投与し得る。投薬は、一般的に、処置される疾患状態の重篤度および応答性に依存性であり、処置過程は、数日間〜数ヶ月間、または治癒が奏効するか、もしくは疾患状態の減衰が達成されるまで持続させる。常套的な方法を用いて、最適な投薬量、投薬方法論、および反復率が決定され得る。最適な投薬量は、個々のポリペプチド類の相対的な効力に応じて異なり得、一般的に、インビトロおよび／またはインビボ動物モデルにおいて有効であることがわかったＥＣ50値に基づいて概算され得る。典型的には、投薬量は、体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ〜約１００ｇであり、毎日、毎週１回またはそれ以上またはより低頻度で与え得る。成功裡の処置後、疾患状態の再発を防ぐため、患者に維持療法を受けさせるのが望ましいことがあり得る。例えば、好ましい経口用量は２００〜４０００ｍｇであり得、好ましくは、１日あたり４回の用量に分割する。
【００５６】
（組成物）
本明細書において提供されるポリペプチド類は、さらなる成分を含有するポリペプチド組成物に製剤化され得る。例えば、本明細書において提供されるポリペプチドは、ポリペプチド安定化分子と組み合わされ得る。ポリペプチド組成物に関して本明細書で用いられる用語「ポリペプチド安定化分子」は、該組成物が哺乳動物の血清に曝露されたとき、該ポリペプチド組成物内での該ポリペプチドの安定性を増大させる化学的部分をいう。ポリペプチド安定化分子は、本明細書において提供されるポリペプチド類の酵素的分解を低減または抑制し得ることに加え、脳内へのその侵入を助長し得る。ポリペプチド安定化分子の例としては、制限されず、リポソーム類、イムノリポソーム類（例えば、トランスフェリンに結合する抗体などの抗体含有リポソーム類）、血漿タンパク質トランスフェリン、トランスフェリンの断片、トランスフェリン(transferring)受容体に対する抗体（例えば、ＯＸ２６）、インスリン、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、及びカチオン化されたアルブミンが挙げられる。ポリペプチド安定化分子は、細胞および／または脳内への該ポリペプチドの取り込みを助長し得る。これらの例としては、制限されず、ＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質の塩基性ドメイン（例えば、Ｔａｔ49〜57）、Ｌ−もしくはＤ−アルギニンの９量体（ｒ９）、または他のペプトイドアナログ、例えば、グアニジン頭部基と主鎖との間に６個のメチレンのスペーサーを含有するもの（Ｗｅｎｄｅｒら、ＰＮＡＳ、９７：１３００３−１３００８（２０００））が挙げられる。いくつかの実施態様では、ポリペプチド安定化分子はハプテン以外の部分であり得る。例えば、ポリペプチド安定化分子はＤＮＰ以外の部分であり得る。
【００５７】
ポリペプチド安定化分子は、ポリペプチド組成物内のポリペプチドに結合された（例えば、共有結合もしくは非共有結合された）もの、または結合されていないものであり得る。例えば、組成物は、該組成物内で該ポリペプチド類に結合されていないポリペプチド安定化分子を含有し得る。該組成物は、１種類またはそれ以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種、またはそれ以上）異なるポリペプチド安定化分子を含有し得る。例えば、組成物は、ＤＡＥＦポリペプチドおよび３種の異なるポリペプチド安定化分子を含有し得る。いくつかの実施態様では、組成物のポリペプチドは同一であり得る。他の実施態様では、いくつかの異なるポリペプチド調製物が組成物内に存在し得る。例えば、組成物は、各々が異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド類を２、３、４、５、６、７、８、９、１０種、またはそれ以上を含有し得る。
【００５８】
ポリペプチド安定化分子は、治療上許容可能なものであり得る。ポリペプチド安定化分子に関して本明細書で用いられる用語「治療上許容可能な」は、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、サル、またはヒト）に投与したとき、その哺乳動物に対して有意な毒性を誘導しないポリペプチド安定化分子をいう。標準的な試験プロトコルを用いて、分子が、哺乳動物に投与したとき有意な毒性を誘導するか否かを判定し得る。
【００５９】
本明細書において提供されるポリペプチド類の１つまたはそれ以上を含有する組成物は、１つまたはそれ以上の薬学的に許容可能な担体、例えば、薬学的に許容可能な溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルを含有し得る。薬学的に許容可能な担体は、液状または固体であり得、所望のかさ、粘稠度、ならびに他の適切な輸送および化学的性質が提供されるように意図された投与の計画された様式により選択され得る。典型的な薬学的に許容可能な担体としては、制限されず、水；生理食塩水溶液；結合剤（例えば、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖類、ゼラチン、または硫酸カルシウム）；滑沢剤（例えば、デンプン、ポリエチレングリコール、または酢酸ナトリウム）；崩壊剤（例えば、デンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）が挙げられる。
【００６０】
医薬組成物は、上記に開示したペプチド類の１つまたはそれ以上を含み得る。本発明により記載される化合物から医薬組成物を調製するために、不活性で薬学的に許容可能な担体は、固形または液状のいずれかであり得る。固体調製物としては、粉剤、錠剤、分散可能な顆粒剤、カプセル、カシェ剤および坐剤が挙げられる。粉剤および錠剤は、約５〜約９５パーセントの活性な化合物で構成され得る。好適な固体担体は、当該技術分野で知られており、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖またはラクトースである。錠剤、粉剤、カシェ剤およびカプセルは、経口投与に適した固体投薬形態として使用され得る。薬学的に許容可能な担体および種々の組成物の製造方法の例は、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，（１９９０），Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａに見られ得る。
【００６１】
液状調製物としては、液剤、懸濁剤および乳剤が挙げられる。例は、非経口注射、または経口液剤、懸濁剤および乳剤用の甘味剤および乳白剤の添加のための水または水−プロピレングリコール溶液であり得る。液状調製物はまた、鼻腔内投与のための液剤を含み得る。
【００６２】
吸入に適したエアロゾル調製物は、溶液および粉末形態の固形物を含み得、これは、不活性な圧縮ガス、例えば、窒素などの薬学的に許容可能な担体と組み合わせてもよい。また、経口または非経口投与いずれかのために、使用直前に、液状調製物に変換されることが意図される固体調製物も含まれる。かかる液状形態としては、液剤、懸濁剤および乳剤が挙げられる。また、本発明の化合物は、経皮的に送達可能なものであり得る。経皮用組成物は、クリーム、ローション、エアロゾルおよび／またはエマルジョンの形態をとり得、この目的のために当該技術分野において慣用的なマトリックス型またはレザバー型の経皮用パッチ内に含め得る。また、本発明の化合物は、皮下送達可能なものであり得る。
【００６３】
好ましくは、医薬調製物は単位投薬形態である。かかる形態において、調製物は、活性化合物の適切な量、例えば、所望の目的を達成するための有効量を含有する、適当な大きさにした単位用量に再分される。単位用量の調製物中の活性化合物の量は、特定の適用に従って、約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ〜約７５０ｍｇ、より好ましくは約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇ、最も好ましくは約０．０１ｍｇ〜約２５０ｍｇで異なり得るか、または調整し得る。用いられる実際の投薬量は、患者の要件および処置される状態の重篤度に応じて異なり得る。具体的な状況のための適正な投薬レジメン(regimen)の決定は、当該技術分野の技量の範囲内である。都合上、全１日投薬量は、必要に応じて、１日の間で複数の部分に分割して投与してもよい。本発明の化合物および／または薬学的に許容可能なその塩の投与の量および頻度は、担当医師が患者の年齢、状態および体格ならびに処置される症状の重篤度などの要素を考慮した判断に従って調節される。経口投与のための典型的な推奨１日投薬レジメンは、１〜４回に分けた用量で約０．０４ｍｇ／日〜約４０００ｍｇ／日の範囲であり得る。
【００６４】
（化合物の同定）
本発明は、本明細書に記載された効果などのＡβの効果の低減させる能力を有する化合物を同定するための方法および材料を提供する。例えば、本明細書において提供される方法および材料を用いて、Ａβによって誘導されるニューロン細胞死のレベルを低減させることができる化合物が同定され得る。一実施態様では、細胞（例えば、脳組織または脳薄片）を、Ａβペプチドの存在下で試験化合物と接触させ得、Ａβの効果レベルが測定され得る。この測定されたレベルを、試験化合物の不存在下でＡβペプチドと接触させた対照細胞を用いて測定されたレベルと比較し得る。対照細胞で観察されるものと比べて、より少ないＡβ効果（例えば、ニューロン細胞死）が、試験化合物およびＡβペプチドと接触させた細胞で観察されるならば、試験化合物は、Ａβの効果を低減させる能力を有し得る。
【００６５】
かかる低減の陽性対照は、ＤＡＥＦ含有ポリペプチド（例えば、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：１）、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦ（配列番号：７）、ＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：３）、ＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：４）、ＤＡＥＦ（配列番号：２）または任意の本発明のポリペプチド類）およびＡβペプチドと接触させた細胞であり得る。他の対照としては、未処理の細胞および／またはβ−アミロイド1〜42またはリバース(reverse)Ａβ（Ａβ42〜1）で処理した細胞が挙げられ得る。いくつかの実施態様では、試験化合物を、脳薄片培養物において、ｓＡＰＰα、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲまたはＤＡＥＦのものと同等の効果を誘導するその能力について評価する。
【００６６】
任意の試験化合物が使用され得る。例えば、試験化合物は、ポリペプチド、脂質、エステル、トリグリセリド、ステロイド、脂肪酸、または小さな分子であり得る。いくつかの実施態様では、試験化合物は、ＤＡＥＦ含有ポリペプチド（例えば、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：１）、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦ（配列番号：７）、ＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：３）、ＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：４）、またはＤＡＥＦ（配列番号：２））などのポリペプチドの構造および／または機能を模倣するように設計された分子であり得る。例えば、試験化合物は、ＤＡＥＦ含有ポリペプチドのペプチド模倣物(peptidomimetic)であり得る。かかるペプチド模倣物は、アミド結合イソスター(isoter)および／または他のペプチド主鎖修飾を含有し得る。例えば、ヘテロ原子が、タンパク質分解性分解を妨げるために使用され得る。いくつかの場合(cased)では、ペプチド模倣物は、例えば、αヘリックスおよび／またはβシートなどの二次構造特性を有し得る。例えば、Ｇｅｌｌｍａｎ，ＳＨ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，３１：１７３−１８０（１９９８）を参照のこと。任意の方法を用いて、別途概説されたものを含む、候補ペプチド模倣物化合物が設計され得る。（Ｆｉｓｈｅｒ，ＰＭ，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，４（５）：３３９−５６（２００３）ならびにＰａｔｃｈ及びＢａｒｒｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，６：８７２−８７７（２００２））。いくつかの実施態様では、多数のペプチド模倣物化合物のコンビナトリアルライブラリーを作製し得る。これらの場合において、例えば、比色または蛍光読み出しに基づくハイスループットアッセイを用い、Ａβの効果を低減させる能力を有する化合物が同定され得る。他の場合では、試験化合物のライブラリーをアレイの形態で提供し、化合物を同定するためのハイスループットスクリーニングに供し得る。例えば、Ｇｏｏｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，６０：２２９−２４５（２００１）及びａｌ−Ｏｂｅｉｄｉら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９：２０５−２２３（１９９８）を参照のこと。
【００６７】
Ａβの効果を低減もしくは抑制し得るか、または哺乳動物においてＡβ効果を引き起こすＡβの能力を低減させ得る試験化合物は、一般的な分子生物学技術を用いて得られ得る。例えば、Ａβ効果を検出または測定するための本明細書において提供される技術は、Ａβ効果を低減させる能力を有するポリペプチド類を同定するために使用され得る。一実施態様では、細胞（例えば、培養されたニューロン）を、試験ポリペプチドで前処理した後、Ａβで処理する。処理された細胞を、次いで、細胞死について評価する。試験ポリペプチドで前処理した細胞が、試験ポリペプチド前処理していない対照細胞よりも少ない細胞死を示すならば、試験ポリペプチドは、Ａβ効果を誘導するＡβの能力を低減させるポリペプチドであり得る。
【００６８】
本明細書において提供される試験ポリペプチドの各アミノ酸残基は、２０個の通常の(conventional)アミノ酸残基のうちの１つであり得る。いくつかの実施態様では、該ポリペプチド類は、ポリペプチド内に組み込まれ得る修飾されたアミノ酸残基または任意の他の化学構造の１つまたはそれ以上、例えば、制限されないが、オルニチン、シトルリン、ε−アミノヘキサン酸、ヒドロキシル化アミノ酸（例えば、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、（５Ｒ）−５−ヒドロキシ−Ｌ−リシン、アロ−ヒドロキシリシン、または５−ヒドロキシ−Ｌ−ノルバリン）、グリコシル化アミノ酸（例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、もしくはその組合せを含有するアミノ酸）、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アラニンもしくはβ−アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−ジアミノ酪酸、デスモシン、２，２−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、６−Ｎ−メチルリシン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、アルギニンのオルニチン修飾、アルギニンのシトルリン修飾、単一もしくは複数の脱酸素化を伴うβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−５−ヒドロキシ−Ｌ−リシン、および単一もしくは複数の脱酸素化を伴う２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−５−ヒドロキシ−Ｌ−リシンを含有し得る。また、アミノ酸残基または化学構造の１つまたはそれ以上のヒドロキシル基をフッ素に置き換えてもよい。例えば、３−フルオロプロリンを創出するために３−ヒドロキシプロリンのヒドロキシ基をフッ素に置き換えることができ、または４−フルオロプロリンを創出するために４−ヒドロキシプロリンのヒドロキシ基をフッ素に置き換えることができる。さらに、アミノ酸残基または化学構造は、Ｃ−またはＳ−またはＯ−グリコシド結合を有するものであり得る。単一のポリペプチドが、かかるアミノ酸残基および化学構造の任意の組合せを含有し得る。例えば、単一のポリペプチドが、１２個の通常のアミノ酸残基、８個のヒドロキシル化アミノ酸、２個のグリコシル化アミノ酸、および１個のオルニチンを任意の順序で含有し得る。
【００６９】
典型的には、本明細書において提供される試験ポリペプチドは、アミド結合（−ＣＯＮＨ−）によって連結されたアミノ酸残基を含有する。いくつかの実施態様では、ポリペプチドは、他の結合、例えば、制限されないが、Ｎ−メチル化（−ＣＯＮＭｅ−）、Ｎ−アルキル化（−ＣＯＮＲ−）、または還元（−ＣＨ2ＮＨ−）によって修飾されたものなどの修飾されたアミド結合、ならびに等配電子体（イソスター）結合、例えば、メチレンエーテル結合（−ＣＨ2Ｏ−）、メチレンチオエーテル結合（−ＣＨ2Ｓ−）、ビニル基結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、エチレン基結合（−ＣＨ2ＣＨ2−）、ケトメチレン基結合（−ＣＯＣＨ2−）、チオアミド結合（−ＣＳＮＨ−）、及びスルホン結合（−ＣＨ2ＳＯ−）によって連結されたアミノ酸残基または化学構造を含有し得る。単一のポリペプチドは、結合の任意の組合せによって連結されたアミノ酸残基または化学構造の配列を含有し得る。例えば、単一のポリペプチドは、全くアミド結合のみによって、またはアミド結合、メチレンエーテル結合およびスルホン結合の組合せによって連結されたアミノ酸残基の配列を含有し得る。
【００７０】
本明細書において提供される試験ポリペプチド類は、遊離のＮ−及びＣ−末端を有するように線状ポリペプチド類であり得る。該ポリペプチド類は、ジスルフィド結合を含有するように遺伝子操作されたものであり得るか、または別途記載（Ｅｇｌｅｔｏｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １８：１４３１−３９（１９９７）ならびにＩｗａｉ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４５９（２）：１６６−７２（１９９９））のように環化されるように設計されたものであり得る。例えば、ＤＡＥＦ配列を含有するポリペプチドは、１つまたはそれ以上のジスルフィド結合が該ポリペプチド内に形成されるように、２個またはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上）のシステイン残基を含有し得る。ジスルフィド結合を含有するポリペプチド類は、ジスルフィド結合を欠く類似のポリペプチド類よりも分解に対してより安定であり得る。２つまたはそれ以上のポリペプチド類が、ヒドラジド架橋によって連結され得る。ヒドラジド架橋は、カルボキシペプチダーゼ活性による分解を防御し得る。ポリペプチド類は、該ポリペプチドが環化されるようにジスルフィド架橋（例えば、２個のＤ−ペニシラミン残基による）を含有し得る。環化されたポリペプチド類は、環化されていない類似のポリペプチド類よりも分解に対してより安定であり得る。
【００７１】
本明細書において提供される試験ポリペプチド類は、さらなるアミノ酸配列、例えば、一般的にタグとして用いられるもの（例えば、ポリ−ヒスチジンタグ、ｍｙｃタグ、ＧＦＰタグ、及びＧＳＴタグ）を含有し得る。例えば、ＤＡＥＦ配列を含有するｓＡＰＰαポリペプチドの５０アミノ酸断片は、蛍光ポリペプチド（例えば、ＧＦＰ）のアミノ酸配列を含有し得る。
【００７２】
任意の型の細胞が使用され得る。例えば、１つの好ましい実施態様では、ニューロン細胞培養物または脳組織試料（例えば、脳薄片）が使用され得る。また、該方法はインビボまたはインビトロで行われ得る。例えば、マウス内のニューロン細胞を、試験化合物をマウスの脳内に注射することにより、試験化合物と接触させ得る。
【００７３】
Ａβペプチドは、任意の型のＡβペプチド、例えばヒトβアミロイド1〜42であり得る。また、任意の方法を用いて、細胞をＡβペプチドと接触させ得る。例えば、Ａβペプチドを、培養中の細胞に投与し得る。いくつかの実施態様では、細胞を、Ａβペプチドをエンコードする核酸を含有する細胞によって発現されるＡβペプチドと接触させ得る。例えば、ニューロン細胞は、Ａβペプチドを放出することがわかっているＡＰＰ配列をエンコードする核酸を含有するように設計され得る。任意の方法を用いて、Ａβの効果を低減させる試験化合物の能力を評価し得る。例えば、本明細書に記載のものなどの染色手法は、細胞死を評価するために使用され得る。
【００７４】
本明細書において提供される方法および材料はまた、神経保護性ポリペプチド、例えば、ＴＴＲ及びＩＧＦ−２などの発現を増大できる化合物を同定するために使用され得る。例えば、細胞（例えば、脳組織または脳薄片）を試験化合物と接触させ得、神経保護性ポリペプチドをエンコードする核酸の発現レベルを、該ポリペプチドレベル及び／又はｍＲＮＡレベルを測定することにより決定することができる。任意の方法がポリペプチドレベルを測定するために使用され得、例えば、制限されないが、ＥＬＩＳＡ手法、抗体染色手法、及び生物学的活性アッセイが挙げられる。また、任意の方法がｍＲＮＡレベルを測定するために使用され得、例えば、制限されないが、ＲＴ−ＰＣＲ技術および発現アレイ技術が挙げられる。
【００７５】
ポリペプチドまたはｍＲＮＡの発現のレベルを、試験化合物と接触させていない対照細胞について測定されたポリペプチドまたはｍＲＮＡの発現レベルと比較し得る。対照脳組織で観察されるものと比べて、より少ないポリペプチドまたはｍＲＮＡ発現が試験化合物と接触させた細胞で観察されるならば、試験化合物は、Ａβの効果を低減させる能力を有し得る。かかる低減の陽性対照は、ＤＡＥＦ含有ポリペプチド（例えば、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：１）、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦ（配列番号：７）、ＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：３）、ＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：４）、またはＤＡＥＦ（配列番号：２））と接触させた細胞であり得る。他の対照としては、未処理の細胞（例えば、未処理の脳組織）が挙げられ得る。
【００７６】
神経保護性ポリペプチドをエンコードする核酸の発現レベルを増大させる試験化合物の有効性は、試験化合物と接触させた細胞で観察される発現レベルをＤＡＥＦ含有ポリペプチドと接触させた細胞で観察される発現レベルと比較することにより測定され得る。ＤＡＥＦ含有ポリペプチドと接触させた細胞で観察されるものと比べ、試験化合物と接触させた細胞で同等または高いレベルの発現が観察されることは、試験化合物が、神経保護性ポリペプチド発現の強力な活性化物質であることを示し得る。
【００７７】
本明細書において提供される方法および材料は、ｓＡＰＰαの存在に応答して、細胞によるその発現を改変させることができるポリペプチドの発現を増大または減少できる化合物を同定するために使用され得る。例えば、細胞（例えば、ニューロン細胞）を、試験化合物と接触させ、試験化合物と接触させていない対照細胞による該ポリペプチドの発現と比べて、ｓＡＰＰαの存在に応答した細胞によるその発現を改変させることができるポリペプチドの改変された（例えば、増大または減少した）発現が示されているか否かを調べるために評価し得る。かかるポリペプチド類の例としては、制限されず、ＴＴＲポリペプチド類及びＩＧＦ−２ポリペプチド類が挙げられる。ポリペプチドの発現の増加または減少は、ポリペプチドレベル及び／又はｍＲＮＡレベルを測定することにより決定され得る。
【実施例】
【００７８】
（実施例１−方法および材料）
（動物）
Ｔｇ２５７６マウスを、既報のＨｓｉａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：９９−１０２（１９９６））のとおりにして作出した。簡単には、これらは、二重変異Ｋ６７０Ｎ及びＭ６７１Ｌ（スウェーデン変異）を有し、プリオンタンパク質プロモーターによって駆動されるヒトアミロイド前駆体タンパク質６９５を含む。この試験では、トランスジェニック及び非トランスジェニック対照マウスを、Ｃ５７Ｂ６／ＳＪＬ種畜に対して戻し交配したＣ５７Ｂ６／ＳＪＬ Ｎ２世代Ｔｇ２５７６マウスから作製した。マウスを１２及び１８ヶ月齢で致死させた。
【００７９】
（海馬器官型培養物）
Ｃ５７Ｂ６／ＳＪＬマウスの子に対し、生後第１５日に麻酔して断頭した。脳を取り出し、氷冷解剖(dissecting)培地（５０％最少必須培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、５０％ハンクス平衡塩溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及び３６ｍＭグルコース）中に入れた。両方の海馬を解剖顕微鏡下で解剖し、Ｍｃｌｌｗａｉｎティッシュチョッパーにて４００μｍに切断した。薄片をばらばらにし、６ウェル培養プレート内に保持した３０ｍｍ直径及び０．４μｍフィルター孔サイズを有するフィルターインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上に配置した。最初の３日間、薄片を、Ｂ−２７サプリメント、１ｍＭグルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中に維持した。続いて、抗生物質を含まない培地を用い、培地を３日毎に交換した。器官型培養物を加湿インキュベーター内に、３７℃で５％Ｏ2及び５％ＣＯ2中、１４〜２１日間維持した。
【００８０】
細胞死および生存能力を、生薄片において、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ’ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｋｉｔの蛍光プローブを用いて測定した。カルセインＡＭ（１：４００）及びエチジウムホモ二量体（１：１０００）含有リン酸緩衝生理食塩水中で４０分間のインキュベーション後、薄片を、Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ ２００倒立顕微鏡により２００×倍率で、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＭＲＣ−１０２４ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌシステム（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて可視化した。ニューロン野の無作為の画像を、各プローブの発光スペクトルにおいて取り込み、Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を用いて生細胞および死細胞の数を定量した。各薄片について、ニューロン野を含む少なくとも３つの領域をイメージングし、死滅のパーセントを調べた。死滅のパーセントは、ＥｔｈＤ−１陽性細胞の数をＥｔｈＤ−１及びカルセインＡＭ陽性細胞の総数で除算して算出した。
【００８１】
（ＴＵＮＥＬ及びＮｉｓｓｌ染色による細胞死の検出）
１つの処置あたり３例の動物由来の海馬薄片の凍結切片を、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介型ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）で染色した。ＤＮＡ断片化を有する細胞を、ＤＮＡ内へのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−１２−ｄＵＴＰのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ取り込みによって測定した（Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）。他の切片は酢酸クレシルバイオレットで染色し、健常な核を有するニューロンならびに凝縮および凝集したクロマチンを有するニューロンをニューロン野内で計測した。
【００８２】
（免疫組織化学）
マウスをＣＯ2で致死させ、速やかに、心臓を介してリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を灌流した。右半球を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中に一晩固定し、３０％スクロース中に浸漬させ、ＯＣＴ包埋培地中で凍結させた。海馬薄片を４％ＰＦＡ中で２０分間固定し、３０％スクロース中で一晩インキュベートし、ＯＣＴ包埋培地中で凍結させた。１０μｍの幅の凍結切片を海馬から採取した。死後ヒト組織をホルマリン固定し、１０μｍに切断し、抗原回復のために１０分間、１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ １）中で煮沸した。ＩＧＦ−２及びＴＴＲは、ＩＧＦ−２（Ｆ−２０）またはＴＴＲ（Ｃ−２０；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）に対するポリクローナル抗体の１：２００希釈物により検出された。ホスホ−ＢＡＤ（Ｓｅｒｌ １２；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、及びＢＡＤ（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）は、それぞれのポリクローナル抗体の１：２５０希釈物により検出された。リン酸化されたタウは、モノクローナルＡＴ８抗体（１：２００；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）及び抗ホスホ−タウ（Ｔｈｒ２３１）（１：５００；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により検出された。対照として、免疫前ウサギもしくはマウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）またはヤギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を、一次抗体の代わりに用いた。ビオチン化抗ヤギＩｇＧ、抗ウサギＩｇＧ、または抗マウスＩｇＧを二次抗体として用いた。最後に、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８または５６８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）のいずれかにコンジュゲートさせたチラミドを用い、抗体染色を可視化した。抗ＮｅｕＮ（１：２５０；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）及び４Ｇ８（１：２５０；Ｓｉｇｎｅｔ，Ｄｅｄｈａｍ，ＭＡ）を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８にコンジュゲートさせた抗マウスＩｇＧ二次抗体とともに用い、ＮｅｕＮ及びＡβを検出した。ＤＮＡ結合色素ＴｏＰｒｏ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）またはＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて核を可視化した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌシステムまたはエピ蛍光（Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）のいずれかを用いて切片をイメージングした。代表的な図を、３例のＡＰＰSwマウス及び３例の非トランスジェニック対照、海馬薄片の１処理につき３例の動物、または４例のヤギＩｇＧ及び４例の抗ＴＴＲ抗体注入マウスから得た。
【００８３】
（電子顕微鏡）
５０μＭ ＡβまたはリバースＡβで２４時間の処理後、海馬薄片培養物を、０．１Ｍ Ｓｏｒｅｎｓｏｎｓリン酸塩バッファー（ｐＨ ７．４）中２％ＰＦＡ／２．５％グルタルアルデヒドの混合物で１時間固定し、次いで、同じバッファー中２％四酸化オスミウムにおいて１時間、後固定した。次いで、薄片を、エタノール系列で脱水し、Ｅｐｏｎエポキシ樹脂内に包埋した。極薄切片をＲｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇミクロトームにて切断し、銅グリッド上に配置し、慣用濃度の酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色した。Ｐｈｉｌｉｐｓ ＣＭ１２０電子顕微鏡により顕微鏡写真を撮影した。
【００８４】
（処理）
β−アミロイド1〜42及びリバースＡβ（Ａβ42〜1）を、ＢＡＣＨＥＭ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）から入手した。これらのポリペプチド類を０．１％ＮＨ3ＯＨに２２２μＭで溶解した。処理のため、Ａβを５０μＭで、Ｂ−２７サプリメント及び１ｍＭグルタミンを加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で３７°Ｃにて２４時間凝集させた。次いで、薄片培養培地を除去し、薄片を、１ｍＬの２５μＭもしくは５０μＭ Ａβ、リバースＡβ、またはビヒクルで２４時間処理した。ヒトＴＴＲ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）またはＩＧＦ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を薄片に、Ａβ処理とともに３μＭ（ＴＴＲ）または５００ｎＭ（ＩＧＦ−２）の最終濃度で添加した。ｓＡＰＰαは、既報（Ｍａｔｔｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｎ，１０：２４３−２５４（１９９３））のとおりにして調製した。
【００８５】
特に記載のない限り、すべてのｓＡＰＰα処理は、１ｎＭで、Ａβ添加前に４８時間行った。ＴＴＲ（Ｃ−２０）またはＩＧＦ−２（Ｆ−２０；４μｇ／ｍＬ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）またはｓＡＰＰα（６Ｅ１０；１０μｇ／ｍＬ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に対する抗体を薄片に、ｓＡＰＰα処理とともに添加した。ヤギＩｇＧ（４μｇ／ｍＬ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）またはマウスＩｇＧ1（１０μｇ／ｍＬ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）を、対照として添加した。ｓＡＰＰαのカルボキシル末端領域の１０アミノ酸断片（ＡＰＰ６９５の５９２〜６０１；ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ；配列番号：１；Ｓｉｇｍａ）を、ｓＡＰＰαと同じプロトコルに従って付加した。
【００８６】
ＳｉＲＮＡを、マウスｍＲＮＡ配列に基に、Ａｍｂｉｏｎ Ｓｉｌｅｎｃｅｒ ｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いて創出した。数種類のｓｉＲＮＡを、各サイレンス化遺伝子についてインビトロ転写によって創出した。ビヒクル、またはＡｍｂｉｏｎ ｓｉＰＯＲＴアミントランスフェクション薬剤中でポリアミン類と組み合わせた２５ｎＭ ｓｉＲＮＡを用いたｓＡＰＰα処理の前に、トランスフェクションを４時間３７℃で行った。トランスフェクションは、１ｍＭグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で行った。成功裡のｍＲＮＡ標的配列は以下のとおりである。
【００８７】
【化１】
【００８８】
（マイクロアレイ解析）
全ＲＮＡを、ビヒクルまたは１ｎＭ ｓＡＰＰαのいずれかで２４時間処理した雄非トランスジェニックマウスの海馬薄片から抽出した。全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により単離し、既報（Ｓｔｅｉｎ及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２２：７３８０−７３８８（２００２））のとおりにしてｃＲＮＡを合成するために使用した。
【００８９】
１５μｇの断片化したｃＲＮＡを、１６時間４５℃で、ＭＧ−Ｕ７４Ａｖ２アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）にハイブリダイズさせた。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ ５．０を用いてスキャンし、各遺伝子の相対存在度を強度シグナル値から解析した。有意に変化した遺伝子を、各比較でウィルコクソンのサインランク検定を用いて測定した。ｐ値＜０．０１を有するプローブセットを増大／減少と称し、０．０１＜ｐ値＜０．０５の範囲のｐ値を有するプローブセットをわずかに増大／減少と称し、残りのプローブセットを変化なしと称した。変化なし＝０、わずかな増大／減少＝１／−１、及び増大／減少＝２／−２（Ｌｉ及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，９：１３７−１４４（２００２））であるさらなるレベルのランキングを用いて多数の比較を組み入れた。最終のランクは、９つの比較のランクの合計に等しいものであり、該値は、海馬薄片における３×３の比較で、−１８〜１８までで異なった。増大または減少した遺伝子発現の最終の測定値のカットオフ値は、増大した遺伝子ではランク≧９及びＦＣ≧１．２、ならびに減少した遺伝子ではランク≦−９及びＦＣ≦−１．２と設定した。遺伝子発現の強度値を平均＝０及び分散＝１に対して標準化し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ Ｔｏｏｌの自己組織化マップ（ＳＯＭ）アルゴリズムを用いてクラスター化した。
【００９０】
（注入）
１８ヶ月齢のＡＰＰSwマウスに、イソフルランガス麻酔系で深く麻酔し、定位固定装置（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ，Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ，ＩＬ）内に配置した。切除を行って頭蓋を露出させ、Ｄｒｅｍｅｌドリルを用いて頭骨に孔をあけた。Ａｌｚｅｔ Ｂｒａｉｎ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｌｚｅｔ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）のカニューレを定位的に、ＡＰＰSwマウスの右海馬内に埋め込み（ブレグマに対する座標：前後軸＝−２．７ｍｍ，内外方向＝−３．０ｍｍ，及び背腹方向＝−３．０ｍｍ）、シアノアクリレートで所定の位置にセメント固定した。２００μＬの１００μｇ／ｍＬヤギＩｇＧまたは抗ＴＴＲ抗体（Ｃ−２０，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を含む浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ）を、皮下の中肩甲部(mid-scapular)領域内に挿入した（流速０．５μＬ／時間）。処理液を、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ2、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ4、２．０ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4、及び１０．０ｍＭグルコースを含有する人工ＣＳＦ（ｐＨ７．４）中で希釈した。頭皮を縫合し、マウスをそのホームケージに戻した。２週間後、ヤギＩｇＧ及び抗ＴＴＲ注入マウスを致死させ、速やかに心臓を介して氷冷ＰＢＳを、その後４％ＰＦＡを、灌流した。
【００９１】
（立体解析学）
４例のヤギＩｇＧ及び４例の抗ＴＴＲ抗体注入マウスを、海馬全体を５０μｍの厚さで切片にした。第６切片毎にクレシルバイオレットで染色し、ＣＡ１錐体ニューロン野内の健常な核およびインタクトな核を有するニューロンを、光学的分画採取(fractionator)技術（Ｗｅｓｔ及びＧｕｎｄｅｒｓｅｎ，１９９０）を用いて計測した。凝集したクロマチンを保有するＣＡ１錐体ニューロン野内の細胞を個々に計測した。計測は、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ ２顕微鏡（Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において１０００×倍率で行った。各光学的解剖器具は、拡張排除ライン(extended exclusion line)、１９μｍの高さ、ならびに３μｍの上部及び下部ガードゾーンを有する３０×３０μｍ計算盤から構成された。ニューロン及び核濃縮細胞の総計測数は、ＣＡ１全体の体系的無作為試料採取から、Ｍｉｃｒｏｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ Ｓｔｅｒｅｏ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウェア（Ｃｏｌｃｈｅｓｔｅｒ，ＶＴ）を用いて得た。
【００９２】
（統計学的解析）
示したすべての実験データは、少なくとも３回繰返したものとした。結果を平均±ＳＥＭとして示す。特に記載のない限り、統計学的有意性は、対応のない(unpaired)両側スチューデントｔ検定を用いて決定し、ｐ値＜０．０５を有意であるとみなした。
【００９３】
（実施例２−Ａβは、器官型海馬培養物においてニューロン死を誘導する）
器官型海馬培養物は、海馬の構造を維持し、成熟シナプス特性、例えば、別途（Ｂａｈｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４２：２９４−３０５（１９９５）及びＭｕｌｌｅｒら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，７１：９３−１００（１９９３））記載のような長期増強作用を有するシナプス結合を含んだ。典型的には胚の脳に由来する解離培養物と比べ、薄片は、インタクトな成体脳のより関連性のあるモデルを表す。したがって、このモデルを用い、ｓＡＰＰαによるＡβ誘導性のニューロン毒性および保護を試験した。２週間後、培養状態で、アンモン角（ＣＡ）ニューロン野は保存され、分裂後期ニューロンマーカーＮｅｕＮで陽性に染色された。
【００９４】
エチジウムホモ二量体（ＥｔｈＤ−１）は、インタクトな原形質膜を有する生細胞から消去される膜不透過性ＤＮＡ結合色素である。カルセインＡＭは、機能性細胞内エステラーゼを有する生細胞において蛍光を発する細胞不透過性色素である。リバースＡβで処理した生薄片をＥｔｈＤ−１及びカルセインＡＭとともにインキュベートすると、海馬のニューロン野内の多くのニューロンがカルセインＡＭに対して陽性に染色されたが、ＥｔｈＤ−１で陽性に染色されたのはほんの少数であった。しかしながら、２５μＭもしくは５０μＭ Ａβのいずれかでの処理により、膜完全性を失ったニューロン（ＥｔｈＤ−１陽性）の数の劇的な増加がもたらされた。
【００９５】
ニューロン死と一致して、リバースＡβではなく、２５μＭもしくは５０μＭ Ａβいずれかでの処理によりＤＮＡ鎖破断がもたらされ、これは、ＴＵＮＥＬによって示された。レーザー走査共焦点システムからの透過イメージにより、ＴＵＮＥＬ陽性細胞はニューロン野内に位置することが示された。最後に、アポトーシスの割合を、Ｎｉｓｓｌ染色した薄片のＣＡニューロン野内で測定した（図１）。健常なニューロンでは、クロマチンが分散し、クレシルバイオレットで強く染色されなかった。しかしながら、アポトーシスの重要な特徴であるクロマチンの凝集が起こった死滅中の細胞では、強い染色が観察された。２５μＭもしくは５０μＭ Ａβでの処理により、クロマチンの凝集を伴うニューロンの割合の有意な増加がもたらされた。１ｎＭ ｓＡＰＰαでの４８時間の前処理により、Ａβ誘導性ＴＵＮＥＬ染色および核濃縮が抑制された（図１）。
【００９６】
（実施例３−Ａβはタウリン酸化を誘導する）
モノクローナル抗体ＡＴ８は、時として、対合したらせん状のフィラメント（ＰＨＦ）として凝集するリン酸化タウを認識する。そのエピトープは、アミノ酸２０２にリン酸化セリンを含む。ＡＤ患者内の多くのニューロンは、ＡＴ８抗体によって認識されるＰＨＦを含有する。ビヒクル及びリバースＡβ処理海馬薄片は、門部周囲および放射線維層内の一部の細胞のＡＴ８染色を示した。また、これらの細胞の一部は、マウスＩｇＧを一次抗体として用いた場合、陽性に染色され、この染色が、非特異的抗原の存在またはマウスＩｇＧ様タンパク質の発現によるものであり得ることを示す。しかしながら、対照マウスＩｇＧでは、海馬のニューロン野内での染色は起こらなかった。ＡＴ８抗体での染色では、ビヒクルまたはリバースＡβ処理薄片のＣＡまたは歯状回海馬のニューロン野において、陽性に染色されたニューロンはほとんどもたらされなかった。対照的に、２５μＭ Ａβまたは５０μＭ Ａβで処理した場合、海馬のニューロン野内の多くのニューロンがＡＴ８陽性であった。これらのニューロンはまた、ＥｔｈＤ−１でも陽性に染色され、Ａβ誘導性細胞の損傷を示す。ＡＴ８染色により、ＡＤ患者において起こるタウ病理と類似するタウのニューロン細胞体および樹状細胞での再分布が示された。さらに、多くのＡＴ８陽性ニューロンにより、ニューロンの変性と一致する数珠状形成(beaded)プロセスが示された。ｓＡＰＰαでの前処理により海馬のニューロン野内でのＡβ誘導性ＡＴ８染色が抑制された。
【００９７】
トレオニン２３１においてリン酸化されたタウに関して陽性のニューロンを含むビヒクルまたはリバースＡβ処理薄片はなかった。しかしながら、２５μＭ Ａβまたは５０μＭ Ａβで処理した薄片では、いくつかのニューロンがその細胞体内および過程(process)においてホスホ−タウ（Ｔｈｒ−２３１）に対して陽性に染色された。これらのニューロンはまた、ニューロンの変性を示す広範性のＮｅｕＮ染色および濃縮した核を有した。１ｎＭ ｓＡＰＰαでの前処理により、ホスホ−タウ（Ｔｈｒ−２３１）のＡβ誘導性蓄積が抑制された。ホスホ−タウ（Ｔｈｒ−２３１）に関するイムノブロットを、５０μＭ リバースＡβ、５０μＭ Ａβ、及び１ｎＭ ｓＡＰＰα＋５０μＭ Ａβで処理した薄片において行った。各処理には、４例の動物に由来する１６個の薄片を含めた。免疫組織化学結果と同様、５０μＭ Ａβでの処理により、海馬薄片内でのリン酸化タウのレベルが増大した。Ａβ誘導性タウリン酸化は、１ｎＭ ｓＡＰＰαでの前処理によって抑制された。電子顕微鏡検査により、５０μＭ Ａβで処理した海馬薄片由来のいくつかのニューロンの細胞質内で、長いまっすぐなフィラメントの存在が示された。フィラメントの多くは対合しており、直径が約１５〜２９ｎｍで、多くの場合、凝集したクロマチンを伴う断片化された核に隣接して観察された。一部の対合したフィラメントは、早期もつれ形成と一致して、約６０〜１２０ｎｍの周期性で捩れていた。これらのフィラメントは、５０μＭ リバースＡβで処理した薄片においては観察されなかった。
【００９８】
高レベルのＡβは、マウス海馬薄片において、タウリン酸化、対合したフィラメントの形成、及びニューロン死を誘導した。しかしながら、変異型ＡＰＰを過剰発現し、マイクロモルレベルのＡβを含むマウスは、これらの病理を発現しない。これが神経保護性ポリペプチドの発現によるものであるか否かを調べるため、ＡＰＰSwを過剰発現するマウス系統を調べた。
【００９９】
（実施例４−神経保護性遺伝子およびポリペプチドは、老齢ＡＰＰSwマウスでは増加しているが、ＡＤ患者では増加していない）
ＡＤにおける遺伝子発現レベルとは対照的に、数種類の成長因子およびトランスチレチン（ＴＴＲ、アミロイド分離(sequestration)ポリペプチド）のｍＲＮＡレベルは、１２ヶ月齢ＡＰＰSwマウスにおいて上方調節される（表１）。簡単には、１２ヶ月齢の雄非トランスジェニック（ｎ＝２）マウス及びＡＰＰSwマウス（ｎ＝２）由来の海馬を、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド解析用に加工処理した。変化の平均倍数を２×２クロス(cross)から算出し、有意に変化した遺伝子を、各比較でウィルコクソンのサインランク検定を用いて調べた。ｐ値＜０．００１を有するプローブセットを増大／減少と称し、０．００１＜ｐ値＜０．００５の範囲のｐ値を有するプローブセットをわずかに増大／減少と称し、残りのプローブセットを変化なしと称した。変化なし＝０、わずかな増大／減少＝１／−１、及び増大／減少＝２／−２であるさらなるレベルのランキングを用いて多数の比較を組み入れた。最終のランクは、４つの比較のランクの合計に等しいものであり、該値は、−８〜８までで異なった。増大または減少した遺伝子発現の最終の測定値のカットオフ値は、増大した遺伝子ではランク≧４及びＦＣ≧１．５、ならびに減少した遺伝子ではランク≦−４及びＦＣ≦−１．５と設定した。
【０１００】
インスリン様成長因子２は、ＡＰＰSwマウスにおいて、６ヶ月齢（プラーク前；Ｓｔｅｉｎ及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２２：７３８０−７３８８（２００２））ならびに１２ヶ月齢（プラーク後；表１）の両方で上方調節される。１２ヶ月齢では、インスリンは、ＡＰＰSwマウスの海馬内で１１倍上方調節される（表１）。ＩＧＦ−２及びインスリンの両方が、ＩＧＦ−１受容体に結合し得、ＢＡＤリン酸化において最高点に達する生存経路を活性化し得る。
【０１０１】
【表２−１】
【０１０２】
【表２−２】
【０１０３】
【表２−３】
【０１０４】
【表２−４】
【０１０５】
タンパク質レベルでは、１２ヶ月齢ＡＰＰSwマウスは、海馬の細胞外空間および特にニューロン野周囲で、劇的に増大したレベルのＴＴＲ及びＩＧＦ−２を有した。また、ＩＧＦ−２は、一部のニューロンの周囲およびニューロン過程に局在する。ＢＡＤは、その非リン酸化状態においてプロアポトーシス性ポリペプチドである。しかしながら、セリン１１２または１３６においてリン酸化されると、ＢＡＤポリペプチド類は、１４−３−３タンパク質に結合し、抗アポトーシス性ＢＣＬ−２ファミリーメンバーであるＢＣＬ−２及びＢＣＬ−ＸLを放出する。ホスホ−ＢＡＤ（１１２）の免疫組織化学により、非トランスジェニック対照と比較した場合、海馬のニューロン野のＮｅｕＮ陽性ニューロン内での増加が示された。対照的に、海馬のニューロン内の全ＢＡＤのレベルは、非トランスジェニックとＡＰＰSwマウスとの間で変化はなかった。
【０１０６】
ＡＤでは、これらの変化の多くは起こらず、実際は、反対であり得る。例えば、全ＢＡＤのレベルは、ＡＤ側頭皮質内で増加し得る（Ｋｉｔａｍｕｒａら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，７８０：２６０−２６９（１９９８））。他方において、免疫組織化学により、海馬の錐体ニューロン内において、対照（ｎ＝５）とＡＤ（ｎ＝６）患者との間で変わらない全ＢＡＤのレベルが示された。ＩＧＦ−２レベルは、海馬のニューロン野の錐体ニューロンの周囲で検出可能であり、対照とＡＤ患者との間で一貫して異ならなかった。ＴＴＲレベルは、ＡＤ患者のＣＳＦ内で低下していることが示されている（Ｓｅｒｏｔら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，６３：５０６−５０８（１９９７））。ＴＴＲは、死後脳の免疫組織化学によって検出したとき、対照またはＡＤ患者の海馬のニューロン野内または周囲でほとんどないし全く観察されなかった。しかしながら、ＴＴＲ沈着物は、すべてのＡＤ患者の海馬内で多くのＡβプラークと同時局在した。ＡＤ患者においてＡβプラークを染色するＩＧＦ−２及び対照ヤギＩｇＧは、いずれも観察されなかった。また、ＡＤ患者の海馬内のまばらに存在するニューロンには、ＴＴＲと同時局在する高レベルの細胞内Ａβが含まれた。垂直な切片により、ＡβとのＴＴＲの明確な同時局在が示された。これらの結果は、５例の対照（平均年齢＝７１．４±２．９歳）及び６例のＡＤ患者（平均年齢＝７７．３±３．８歳）から得られたものを代表する。
【０１０７】
（実施例５−ｓＡＰＰα駆動型の遺伝子およびポリペプチド発現）
マウスモデルとヒトＡＤとの大きな違いの１つは、完全長ＡＰＰの過剰発現であり、これは、マウスにおいて５倍またはそれ以上であり得る（Ｈｓｉａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：９９−１０２（１９９６））。したがって、ＡＤの場合と異なり、ＡＰＰのすべての切断生成物は、おそらく、変異型ＡＰＰを過剰発現するマウスモデルにおいて上方調節される。本明細書において示すように、ｓＡＰＰαは、Ａβ誘導性タウリン酸化およびニューロン死を防御し得る。したがって、ＡＰＰSwマウスにおける高レベルのｓＡＰＰαは、神経保護性ＴＴＲ、ＩＧＦ−２、及びホスホＢＡＤの増大レベルの一因であり得る。
【０１０８】
簡単には、４例のＡＰＰSwマウス及び４例の非トランスジェニック対照に由来の切除された海馬を、溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ４０、１Ｍ ＰＭＳＦ、３ｍＭベンズアミジン、２００μＭロイペプチン、２０μＭアプロチニン、１００μＭオルトバナジン酸ナトリウム、２ｍＭジチオトレイトール）中で個々にホモジナイズした。１２０００×ｇで１０分間遠心分離した後、可溶性画分を採取した。全タンパク質レベルを、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）比色アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて測定した。ＳＤＳ−還元バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルー、ｐＨ ６．８）を組織ライセートに添加し、試料を９５°Ｃまで１０分間加熱した。１ウェルあたり５０μｇの全タンパク質を載置し、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。ゲルをポリビニリデンジフルオリド膜に移し、膜を、ｓＡＰＰαに対するモノクローナル抗体である６Ｅ１０（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）の１：２００希釈物を用いてイムノブロッティングした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体（１：２０００）及びＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光性基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてバンドを可視化した。バンドを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ３００ Ａ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて定量した。海馬のｓＡＰＰα濃度を推定するため、標準曲線をｓＡＰＰαに関して作成し、２３μＬの推定マウス海馬容積を用いた（海馬の重量に対して）。
【０１０９】
非トランスジェニックマウスは、海馬内で事実上、検出不可能なレベルのｓＡＰＰαを有することがわかったが、ＡＰＰSwマウスは、有意に高い量を有した（図２）。４Ｇ８抗体は、完全長ＡＰＰ及びＡβに結合するが、ｓＡＰＰαには結合せず、図２に示すようなバンドは認識しない。しかしながら、ＡＰＰSwマウスにおいて、完全長ＡＰＰを表す約１３０ｋＤａにおける弱いバンドが、６Ｅ１０及び４Ｇ８抗体によって認識された。このバンドは、ｓＡＰＰαのバンドと比べて弱く、ＡＰＰの大部分がα−またはβ−セクレターゼによって切断されることを示す。イムノブロッティングを用い、ＡＰＰSwマウス海馬内のｓＡＰＰαの平均濃度は、１．２±０．７μＭであると測定された。
【０１１０】
次に、器官型海馬薄片をビヒクルまたは１ｎＭ ｓＡＰＰαで２４時間処理し、ＲＮＡを単離し、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ解析を行った。試料は、ビヒクル（ｎ＝３）またはｓＡＰＰα（ｎ＝３）で処理した薄片で構成されるものであった。各試料は、４例の動物由来の８〜１２個の薄片をプールしたものとした。変化の平均倍数を３×３比較から算出した。ｓＡＰＰαでの処理により、４５個の遺伝子およびＥＳＴの発現レベルにおける有意な増加（ランク≧９）がもたらされた（表２）。ｓＡＰＰα処理によって有意に減少した遺伝子またはＥＳＴはなかった。成体ＡＰＰSwマウスと同様に、ｔｔｒは、最大倍数変化（８．９倍）を伴う遺伝子の１つであった。また、ｉｇｆ−２及びインスリン様成長因子結合タンパク質２（ｉｇｆｂｐ２）のｍＲＮＡレベルは、ｓＡＰＰαによって増大した。アポトーシス阻害、解毒およびレチノール輸送などの保護経路に関与する数種類の他の遺伝子が、ｓＡＰＰαによって上方調節された（表２）。
【０１１１】
【表３−１】
【０１１２】
【表３−２】
【０１１３】
免疫組織化学により、１ｎＭ ｓＡＰＰα処理海馬薄片の細胞外空間内で、ＴＴＲ及びＩＧＦ−２の両方における劇的な増加が示された。ポリペプチドレベルは、海馬のニューロン野周囲で最高のようであった。ＩＧＦ−２における増大と一致して、及び成体ＡＰＰSwマウスと同様に、ホスホＢＡＤのレベルは、ｓＡＰＰα処理海馬薄片のＮｅｕＮ陽性ニューロン内で増大した。
【０１１４】
海馬薄片培養物においてｓＡＰＰα処理によって増大した遺伝子の相対発現レベルを、６ヶ月齢および１２ヶ月齢の非トランスジェニック及びＡＰＰSwマウスの発現プロフィールとともにクラスター化した。自己組織化マップ（ＳＯＭ）のクラスター化により、４つのクラスターが得られた。クラスター４（図３、右下パネル）は、ビヒクル処理薄片、６ヶ月齢対照マウス及び１２ヶ月齢対照マウスにおいて低発現レベルを、ならびにｓＡＰＰα処理薄片、６ヶ月齢ＡＰＰSwマウス及び１２ヶ月齢ＡＰＰSwマウスにおいて高発現レベルを有する遺伝子およびＥＳＴ類を含む。したがって、これは、ｓＡＰＰαによってエキソビボ及びおそらくインビボで増大する遺伝子のクラスターである。このクラスター内の遺伝子としては、ｔｔｒ、ｉｇｆ−２、及びｉｇｆｂｐ２が挙げられる（図３）。
【０１１５】
（実施例６−ＴＴＲ及びＩＧＦ−２はＡβ毒性に対するｓＡＰＰα誘導性保護に関与する）
器官型海馬培養物を、エチジウムホモ二量体（ＥｔｈＤ−１）及びカルセインＡＭで処理し、ともにインキュベートした。Ａβ誘導性ＥｔｈＤ−１染色を海馬のニューロン野のＮｅｕＮ陽性ニューロン内で行った。ここで、各蛍光プローブで染色された細胞の数を計測し、ＥｔｈＤ−１陽性であり、したがって膜完全性を失った細胞のパーセントとして示した（％死滅；図４）。２５μＭまたは５０μＭ Ａβいずれかでの処理により、５０μＭリバースＡβ処理と比べ、死滅のパーセントにおける劇的な増加がもたらされた。１ｎＭ ｓＡＰＰαでの４８時間の前処理は、Ａβ誘導性死を完全に防御した。Ａβとともに添加したとき、３μＭ ＴＴＲもまたＡβを完全に防御したが、５００ｎＭ ＩＧＦ−２の外的添加はＡβを一部防御した（図４Ａ）。さらに、ｓＡＰＰαのＣＯＯＨ末端の１７アミノ酸を認識する抗体（抗体６Ｅ１０）の添加により、ｓＡＰＰαの保護効果が抑制された。この領域は、Ａβ配列の一部を含み、α−セクレターゼ対β−セクレターゼによって切断されるＡＰＰに特有である。また、この配列の部分に対応する１０アミノ酸断片での処理により、ｓＡＰＰαの保護効果が模倣される（図４Ａ）。
【０１１６】
ＴＴＲ及びＩＧＦ−２はともに分泌タンパク質であるため、これらに対して生成させた抗体を添加することにより、これらの機能を妨害することが可能である。ｓＡＰＰαとの対照ヤギＩｇＧの添加では、Ａβに対するｓＡＰＰα誘導性保護は妨害されなかった。しかしながら、ＴＴＲまたはＩＧＦ−２に対して指向される抗体の添加は、ｓＡＰＰαによる保護を抑制した（図４Ｂ）。このことを支持して、ＴＴＲまたはＩＧＦ−２のｓｉＲＮＡノックダウンにより、Ａβに対するｓＡＰＰα誘導性保護が一部抑制された（図４Ｃ）。ＩＧＦ−２は、ＩＧＦ−１受容体を活性化してＢＡＤのリン酸化を引き起こすことにより、細胞を保護し得る。例えば、ＩＧＦ−１ＲのｓｉＲＮＡノックダウンによってもまた、ｓＡＰＰαによる保護が抑制された（図４Ｃ）。すべてのノックダウンを免疫組織化学によって確認し、ＩＧＦ−２またはＩＧＦ−１ＲのいずれかのｓｉＲＮＡが、ｓＡＰＰαによって誘導されるＢＡＤリン酸化を抑制した。ＴＴＲポリペプチド類またはＩＧＦ−２ポリペプチド類のいずれかの阻害またはノックダウンにより保護が有意に阻止されたという事実は、ＴＴＲポリペプチド類及びＩＧＦ−２ポリペプチド類の両方の誘導が、Ａβに対する最大保護に関与することを示す。
【０１１７】
（実施例７−ＴＴＲはＡＰＰSwマウスを神経変性から保護する）
Ａβの分離を抑制するための試みにおいて、ＴＴＲに対する抗体を、ＡＰＰSwマウス海馬のＣＡ１領域内に直接注入した。浸透圧ポンプを用い、２週間の期間にわたって抗ＴＴＲ抗体の連続的な注入を行った。これにより、注入を受けた海馬の細胞外空間内に抗ＴＴＲ抗体の劇的な沈着がもたらされたが、注入を受けなかった海馬ではもたらされなかった。対照ヤギＩｇＧの注入ではヤギＩｇＧ沈着はもたらされなかった。またさらに、抗ＴＴＲ抗体を注入されたＡＰＰSwマウスは、ヤギＩｇＧまたは注入を受けなかった海馬と比べた場合、海馬のニューロン野内および周囲で著しく増大されたレベルのＡβを示した。これは、抗ＴＴＲ抗体が、ＡβのＴＴＲポリペプチド結合を破壊し、局所的に増大されたＡβ負荷をもたらしたことを示す。抗ＴＴＲ注入された海馬内の多くのプラークを、Ａβ及び抗ＴＴＲ抗体で同時染色し、ＡＰＰSwマウスにおいてＴＴＲポリペプチド類がＡβプラークにインビボで結合することが示された。非トランスジェニックマウスは、その海馬において、なんら検出可能なＴＴＲポリペプチドを生成または保有しなかった。実際、非トランスジェニックマウス内への抗ＴＴＲ抗体の注入は、該抗体またはＡβのいずれの蓄積ももたらさず、タウリン酸化は検出され得なかった。
【０１１８】
ＣＡ１ニューロン野周囲でＡβ蓄積を引き起こすことに加え、抗ＴＴＲ抗体の注入は、多くのＣＡ１ニューロン内でタウリン酸化をもたらした。ＡＴ８抗体に関して免疫陽性のいくつかのニューロンが、抗ＴＴＲ注入された海馬のＣＡ１野内に存在したが、ヤギＩｇＧ注入されたまたは注入を受けなかった海馬では、陽性に染色された細胞はなかった。ＡＴ８陽性ニューロンは、多くの場合、変性を示す濃縮した核を含んだ。Ｔｈｒ２３１においてリン酸化されたタウを認識する抗体もまた、抗ＴＴＲ注入された海馬においてＣＡ１ニューロンを染色した。これらのリン酸化タウ陽性ニューロンは、ニューロンマーカーＮｅｕＮで同時染色された。ホスホ−タウ（Ｔｈｒ２３１）陽性細胞の数および染色の強度は、ヤギＩｇＧ及び注入を受けなかった海馬では改変されなかった。
【０１１９】
ＣＡ１において抗ＴＴＲ抗体注入後、アポトーシス性細胞が増加し、健常なニューロンの総数が減少したか否かを調べるため、光学的分画装置を用いた不偏立体解析を行った。アポトーシス性ニューロンは、インビボ神経系において７２時間以内に消去される（Ｈｕら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１７：３９８１−３９８９（１９９７））。このことにもかかわらず、２週間のヤギＩｇＧの連続的注入後、濃縮した核を有する一部の細胞をＣＡ１錐体ニューロン野内で計測した。抗ＴＴＲ抗体の注入により、ＣＡ１内の濃縮した核を有する細胞の総数が有意に増大した（表３及び図５Ａ）。対照として、注入なしの対照マウスでは、濃縮核の細胞は観察され得なかった。ニューロンのアポトーシスの増大と一致して、ＣＡ１錐体ニューロンの総数は、ヤギＩｇＧを注入されたマウスと比べ、抗ＴＴＲ抗体を注入されたマウスにおいて１７．１±５．３％有意に減少した（表２及び図５Ｂ）。
【０１２０】
【表４】
【０１２１】
要約すると、ＡＤは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の異常なプロセッシング及びβ−アミロイド（Ａβ）の蓄積によって引き起こされ得る。しかしながら、変異型ＡＰＰを過剰発現するマウスは、そのヒト疾患の特徴であるタウリン酸化またはニューロン減少を示さない。本明細書に記載のように、Ａβ処理によってタウのリン酸化およびニューロン死がもたらされるようにマウス海馬のエキソビボモデルを開発した。対照的に、α−セクレターゼ切断ＡＰＰ（ｓＡＰＰα）は、これらのＡβ誘導性病理を防御し、いくつかの神経保護性遺伝子の発現レベルを増大させる。トランスチレチン及びインスリン様成長因子２のｓＡＰＰα駆動型発現は、器官型海馬培養物におけるＡβ誘導性ニューロン死に対する防御に関与する。ＡＰＰSwを過剰発現するマウスの海馬内へのトランスチレチンに対する抗体の長期注入により、Ａβの増加、タウリン酸化、ならびにＣＡ１ニューロン野内でのニューロン減少及びアポトーシスがもたらされる。したがって、トランスチレチンの発現の上昇は、ｓＡＰＰαによって媒介され、ＡＤにおいて観察される多くの神経病理の発現からＡＰＰSwマウスを保護する。このモデル系は、インタクトな脳の構造および化学をより厳密に表し、凝集したＡβが、ＡＤの主要な病理学的特徴のいくつかを誘導し得ることを示した。また、本明細書において提供される薄片培養物により、科学者達が、Ａβにより内生タウのリン酸化およびニューロン死をもたらされる正確な機構を探求することが可能となり得る。
【０１２２】
また一方、Ａβは、タウリン酸化およびアポトーシスをマウス海馬のエキソビボモデルにおいて誘導する能力がある。これらの病理はまた、Ａβ−結合タンパク質ＴＴＲに対して指向される抗体をＡＰＰSwマウス内に注入した場合、インビボでも観察される。本明細書に提示する結果は、ｓＡＰＰα代用(replacement)またはｓＡＰＰα誘導経路の活性化は、Ａβの毒性およびＡＤの発症の抑制を補助し得ることを示す。
【０１２３】
（実施例８−成体ヒト由来の器官型皮質培養物において誘導された神経病理学および保護）
（被験体）
難治性癲癇を有し、側頭葉切除を受けるために選出された４例の患者を、この試験のために集めた。これらの患者は、多くの場合、硬化症を伴う海馬を有する。しかしながら、上に重なっている側頭皮質は正常である。被験体の年齢は、２０〜４９歳の範囲であった。脳組織は、すべての患者からインフォームドコンセントを伴って入手した。
【０１２４】
（ヒト器官型培養物）
脳組織を、大きなインタクトな一部分において電気焼灼器によって取り出した。側頭皮質から得た組織は、およそ３ｃｍ×２ｃｍ×１．５〜２ｃｍであった。取り出した直後、組織を、ＣＯ2非依存性移送保持用培地である氷冷Ｎｅｕｒｅｇｅｎ−Ｉ培地（Ｂｒａｉｎｂｉｔｓ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＩＬ）中に入れ、組織培養研究室に移送した。各脳回ができるだけインタクトに維持され、皮質層が保存されるように、メスで組織を切断して約０．５〜１ｃｍ3塊を作製する前に髄膜を除去した。前述のように、切除は、脳回の長軸に対して垂直に白質に沿って行った（Ｖｅｒｗｅｒら、Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．，３８：１６７−１７２（２００３））。ビブラトームを用い、脳回の長軸に対して垂直な平面で４００μｍ厚の薄片を切断した。したがって、すべての皮質層および少量の白質が薄片内に含まれた。あるいはまた、海馬から通常通りに得た小組織片を、Ｍｃｌｌｗａｉｎティッシュチョッパーを用いて４００μｍに切断した。２つ以下の薄片を、６ウェル培養プレート内に保持した３０ｍｍ直径および０．４μｍフィルター孔サイズを有するフィルターインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上に配置した。最初の１２時間は、薄片を、Ｂ−２７サプリメント、０．５ｍＭグルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む１〜１．２ｍＬのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中に維持した。続いて、培地を２日毎に、抗生物質を含まない１ｍＬの培地を用いて交換した。器官型培養物を加湿インキュベーター内に、３７℃で５％Ｏ2、５％ＣＯ2及び９０％Ｎ中、４〜２８日間維持した。
【０１２５】
細胞死および生存能力を、生薄片において、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ’ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｋｉｔの蛍光プローブを用いて測定した。カルセインＡＭ（１：４００）及びエチジウムホモ二量体（１：１０００）含有リン酸緩衝生理食塩水中で４０分間のインキュベーション後、薄片をＮｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ ２００倒立顕微鏡により２００×倍率で、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＭＲＣ−１０２４ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌシステム（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて可視化した。無作為の画像を、各プローブの発光スペクトルにおいて取り込み、Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を用いて生細胞および死細胞の数を定量した。少なくとも３つの領域をイメージングし、各薄片について死滅のパーセントを調べた。死滅のパーセントは、ＥｔｈＤ−１陽性細胞の数をＥｔｈＤ−１及びカルセインＡＭ陽性細胞の総数で除算して算出した。
【０１２６】
（処理）
β−アミロイド1〜42及びリバースＡβ（Ａβ42〜1）を、ＢＡＣＨＥＭ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）から入手した。これらのペプチドを０．１％ＮＨ3ＯＨに２２２μＭで溶解した。処理のため、ＡβまたはリバースＡβを５０μＭで、Ｂ−２７サプリメント及び０．５ｍＭグルタミンを加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中に３７℃にて２４時凝集させた。次いで、薄片培養培地を除去し、薄片を、１ｍＬの２５μＭもしくは５０μＭのＡβ、リバースＡβまたはビヒクルで２４時間処理した。ヒトＴＴＲ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、Ａβ処理とともに薄片に０．０３、０．３及び３μＭ ＴＴＲの最終濃度で添加した。ｓＡＰＰαはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。特に記載のない限り、すべてのｓＡＰＰα処理は、１ｎＭで、Ａβの添加前に４８時間行った。ｓＡＰＰαのカルボキシル末端領域の１０アミノ酸断片（ＡＰＰ６９５の５９２〜６０１；ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ）を、ｓＡＰＰαと同じプロトコルに従って付加した。各患者から異なる量の組織を得たため、すべての患者に対してすべての処理を行ったとは限らなかった。
【０１２７】
（ＴＵＮＥＬ染色による細胞死の検出）
皮質薄片の凍結切片を、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ−媒介型ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）及び抗ＮｅｕＮ抗体で染色した。ＤＮＡ断片化を有する細胞を、ＤＮＡ内へのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−１２−ｄＵＴＰのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ取込みによって調べた（Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット、Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）。６００×倍率での共焦点解析によって、薄片１つあたり少なくとも３つの無作為の画像を作成した。次いで、ＴＵＮＥＬ陽性、ＮｅｕＮ陽性、ならびにＴＵＮＥＬ及びＮｅｕＮの両方が陽性の細胞の数を定量した。
【０１２８】
（免疫組織化学）
薄片を４％ＰＦＡ中に２０分間固定し、３０％スクロース含有リン酸緩衝生理食塩水中で一晩インキュベートし、ＯＣＴ包埋培地中で凍結させた。１０μｍの幅を有する凍結切片を各薄片から採取した。リン酸化されたタウを、モノクローナルＡＴ８抗体（１：２００；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）及び抗ホスホ−タウ（Ｔｈｒ２３１）（１：５００；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により検出した。対照として、免疫前ウサギまたはマウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を一次抗体の代わりに用いた。ビオチン化抗ウサギＩｇＧまたは抗マウスＩｇＧを二次抗体として用いた。Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８または５６８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）のいずれかにコンジュゲートさせたチラミドを、抗体染色を可視化するために使用した。抗ＮｅｕＮ（１：２５０；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７にコンジュゲートさせた抗マウスＩｇＧ二次抗体とともに用い、ニューロンマーカーＮｅｕＮを検出した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌシステムまたはエピ蛍光（Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）のいずれかを用いて切片をイメージングした。
【０１２９】
（統計学的解析）
結果を平均±ＳＥＭとして示す。統計学的有意性は、対応のない両側スチューデントのｔ検定を用いて決定し、ｐ値＜０．０５を有意であるとみなした。
【０１３０】
（結果）
成体ヒトの側頭皮質由来の薄片を、培地中に４〜２１日間維持した。エチジウムホモ二量体（ＥｔｈＤ−１）は、インタクトな原形質膜を有する生細胞から消去される膜不透過性ＤＮＡ結合色素である。カルセインＡＭは、機能性細胞内エステラーゼを有する生細胞において蛍光を発する細胞不透過性色素である。培養状態で最初の３日間に、多数のＥｔｈＤ−１陽性細胞が対照薄片において観察された。これらは、おそらく、外科処置またはその後の薄片化の際に損傷された細胞である。第４日までに、ＥｔｈＤ−１陽性細胞の割合は、平均レベル２０％に低下した。多数のカルセインＡＭ陽性細胞が、培養中の２１日間に存在した。カルセインＡＭ細胞の大部分は直径がおよそ２０μｍであった。また、多くの細胞がニューロンマーカーＮｅｕＮで陽性に染色され、大きな皮質ニューロンの存在を示す。
【０１３１】
薄片にてＡＤをモデル化する試みにおいて、薄片を凝集させたＡβで処理した。５０μＭ Ａβでの処理により、膜完全性を失った細胞の数の劇的な増加がもたらされた。１ｎＭ ｓＡＰＰαで４８時間の前処理により、Ａβ誘導性ＥｔｈＤ−１染色が抑制された。５０μＭ Ａβでの処理により、死滅のパーセントが有意に増大され、一方、１ｎＭ ｓＡＰＰαでの前処理により、Ａβ誘導性死が有意に防御された（図６Ａ）。ｓＡＰＰαのＣＯＯＨ末端領域に対応する１０アミノ酸断片もまた、４例の被験体において有意な保護を示した（ｐ値＜０．０５；図６Ａ）。また、１例の被験体由来の試料を、４アミノ酸断片（ＤＡＥＦ；配列番号：２）で処理した。この断片は、５０μＭ Ａβ毒性を防御した（図６Ａ）。
【０１３２】
また、５０μＭ Ａβでの処理により、ＤＮＡ鎖破断がもたらされ、これは、ＴＵＮＥＬによって示された。これらのＴＵＮＥＬ陽性細胞の多くは、ＮｅｕＮで同時標識された。１ｎＭ ｓＡＰＰαでの前処理により、ＴＵＮＥＬ陽性ニューロンにおいてＡβ−誘導性の増加が抑制された。
【０１３３】
ＴＵＮＥＬに対して染色されたＮｅｕＮ及びＴＵＮＥＬ陽性細胞の合計の割合（％ＴＵＮＥＬ）を１例の被験体について定量した。また、ＮｅｕＮ及びＴＵＮＥＬで同時染色された全ＮｅｕＮ陽性細胞の割合を調べた（図６Ｂ）。全ＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合およびＴＵＮＥＬ陽性であるニューロン割合はともに、Ａβでの処理後に増大した（図６Ｂ）。
【０１３４】
ＴＴＲポリペプチド発現はｓＡＰＰαによって誘導され、Ａβ毒性からの保護に関与する。０．３または３μＭ ＴＴＲポリペプチドでのヒト皮質薄片の同時処理は、Ａβ誘導性ＥｔｈＤ−１染色を防御したが、０．０３μＭ ＴＴＲポリペプチドでは防御されなかった（図６Ｃ）。
【０１３５】
モノクローナル抗体ＡＴ８は、Ｓｅｒ２０２においてリン酸化されたタウを認識し、ＡＤにおける早期および成熟もつれを染色するために一般に使用されている。５０μＭ リバースＡβで処理した皮質薄片は、ＡＴ８陽性細胞を全く保有しなかった。しかしながら、５０μＭ Ａβでの処理では、早期タウ病理に特徴的な細胞体樹状突起の再分布を伴ういくつかのＡＴ８陽性細胞がもたらされた。５０μＭリバースＡβで処理した薄片は、ＮｅｕＮ陽性細胞の過程(process)内で、Ｔｈｒ２３１においてリン酸化された一部のタウを示したが、細胞体では示されず、タウの通常な分布と一致した。対照的に、５０μＭ Ａβでの処理では、高レベルの体性ホスホ−タウ（Ｔｈｒ２３１）を有するいくつかのＮｅｕＮ陽性ニューロンがもたらされた。１ｎＭ ｓＡＰＰαでの前処理により、Ａβ誘導性タウリン酸化が抑制された。また、５０μＭ Ａβで１週間処理した薄片の電子顕微鏡検査では、樹状突起に見られるもつれ様構造を有する少数のニューロンが示された。
【０１３６】
要約すると、これらの結果は、癲癇患者から取り出した皮質組織は、器官型薄片培養物として２１日間まで維持され得ること、およびヒト皮質のＡβ処理は、細胞膜完全性の減損、ニューロンのＤＮＡ断片化およびタウリン酸化をもたらすことを示す。Ａβは、タウリン酸化、およびもつれ様構造が電子顕微鏡検査によって確認され得るニューロンの細胞体樹状突起の区画に対する再分布を誘導した。ｓＡＰＰαでの前処理により、これらの神経変性変化が抑制された。この保護は、１０アミノ酸ｓＡＰＰα断片によって模倣される。また、ＴＴＲポリペプチドそれ自体が、正常ヒトＣＳＦにおいて見られるＴＴＲ０．３μＭ以上の濃度でＡβ毒性を防御し得る（Ｓｃｈｗａｒｚｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１：８３６８−８３７２（１９９４））。これらの結果は、脳においてｓＡＰＰα、ｓＡＰＰαの断片および／またはＴＴＲポリペプチドの量が増加することにより、ＡＤの発症が遅滞または予防され得ることを示す。これらの結果はまた、Ａβが、ヒト薄片培養物において、ＡＤと関連する神経変性を誘導し得ることを示す。開発したこのエキソビボモデルは、組織が、（ａ）動物ではなくヒトである、（ｂ）胚性、胎児性または早期生後ではなく成体である、（ｃ）切除されたものではなくインタクトである、および（ｄ）トランスジェニック、不死化または腫瘍性ではなく遺伝子学的に正常であるという点において、他のモデルと比べ、ＡＤに対して特に重要である。
【０１３７】
（実施例９−マウス海馬薄片培養物におけるポリペプチド保護）
（海馬の器官型培養物）
Ｃ５７Ｂ６／ＳＪＬマウスの子に対し、生後第１５日に麻酔して断頭した。脳を取り出し、氷冷解離培地（５０％最少必須培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、５０％ハンクス平衡塩溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及び３６ｍＭグルコース）中に入れた。両方の海馬を解剖顕微鏡下で解剖し、Ｍｃｌｌｗａｉｎティッシュチョッパーにて４００μｍに切断した。薄片をばらばらにし、６ウェル培養プレート内に保持した３０ｍｍ直径および０．４μｍフィルター孔サイズを有するフィルターインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上に配置した。最初の３日間、薄片を、Ｂ−２７サプリメント、１ｍＭグルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中に維持した。続いて、抗生物質を含まない培地を用い、培地を３日毎に交換した。器官型培養物を加湿インキュベーター内に、３７℃で５％Ｏ2及び５％ＣＯ2中、１４〜２１日間維持した。
【０１３８】
細胞死および生存能力を、生薄片において、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ’ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｋｉｔの蛍光プローブを用いて測定した。カルセインＡＭ（１：４００）及びエチジウムホモ二量体（１：１０００）含有リン酸緩衝生理食塩水中で４０分間のインキュベーション後、薄片を、Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ ２００倒立顕微鏡により２００×倍率で、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＭＲＣ−１０２４ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌシステム（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて可視化した。ニューロン野の無作為の画像を、各プローブの発光スペクトルにおいて取り込み、Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を用いて生細胞および死細胞の数を定量した。各薄片について、ニューロン野を含む少なくとも３つの領域をイメージングし、死滅のパーセントを調べた。死滅のパーセントは、ＥｔｈＤ−１陽性細胞の数をＥｔｈＤ−１及びカルセインＡＭ陽性細胞の総数で除算して算出した。
【０１３９】
（処理）
β−アミロイド1〜42及びリバースＡβ（Ａβ42〜1）を、ＢＡＣＨＥＭ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）から入手した。これらのペプチドを０．１％ＮＨ3ＯＨに２２２μＭで溶解した。処理のため、Ａβを５０μＭで、Ｂ−２７サプリメント及び１ｍＭグルタミンを加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で３７°Ｃにて２４時間凝集させた。次いで、薄片培養培地を除去し、薄片を１ｍＬの２５μＭ Ａβまたはビヒクルで２４時間処理した。ｓＡＰＰαのカルボキシル末端領域に対応するタンパク質断片（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸによって合成）を１ｎＭの最終濃度まで、Ａβの添加の４８時間前に添加した。
【０１４０】
（結果）
器官型海馬培養物を、エチジウムホモ二量体（ＥｔｈＤ−１）及びカルセインＡＭで処理し、ともにインキュベートした。各蛍光プローブで染色された細胞の数を計測し、ＥｔｈＤ−１陽性であり、したがって膜完全性を失った細胞のパーセントとして示した（％死滅、図７）。２５μＭ Ａβでの処理により、ビヒクルでの処理と比べ、死滅のパーセントの劇的で有意な増加がもたらされた。１ｎＭ のｓＡＰＰαのカルボキシル−末端領域の部分に対応する１０アミノ酸断片（ＡＰＰ７７０の６６７〜６７６；ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：１））での４８時間の前処理により、Ａβ誘導性死が完全に防御された。この防御は、カルボキシルアルギニンを除去した場合（ＳＥＶＫＭＤＡＥＦ（配列番号：７））、維持された。しかしながら、アルギニンとフェニルアラニンの両方の除去（ＳＥＶＫＭＤＡＥ（配列番号：２２））では、Ａβに対する防御が反転された。アミノ末端の終端において、セリン除去（ＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：３））とセリン及びグルタミン酸除去（ＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：４））の両方を有する断片は、２５μＭ Ａβ処理を有意に防御した（図７）。１ｎＭの４アミノ酸断片（ＤＡＥＦ）での海馬薄片の前処理もまた、Ａβ誘導性細胞死を防御するのに充分であった（図７）。
【０１４１】
（実施例１０−インビボポリペプチド保護）
以下の実験は、ｓＡＰＰα及び１０アミノ酸断片（ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：１））が、マウスの海馬内への定位注射により、インビボでＡβ誘導性毒性に抗する細胞生存経路を活性化する能力を試験するために行った。乱雑化した(scrambled)形態の１０アミノ酸断片を用い、経路活性化が該ペプチド配列に依存性であることを示した。
【０１４２】
（定位注射）
１０週齢Ｂ６／ＳＪＬマウスの海馬の右側に、ｓＡＰＰα、１０アミノ酸断片または乱雑化した１０量体を推定１ｎＭ海馬内濃度まで、定位的に注射した。反対側には人工脳脊髄液を注射した。各注射は、１０分の間にわたって送達させる１．５ｍＬの溶液で構成した。手術の４８時間後、マウスに冷ＰＢＳを灌流し、その海馬を切除し、後のＲＮＡ抽出用に安定化溶液中で保存した。
【０１４３】
（量的ＰＣＲ）
ＲＮＡを海馬の試料から抽出し、ＤＮアーゼ処理し、逆転写した。次いで、ｃＤＮＡを、ＳＹＢＲグリーンを用いてＲｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒシステムにおいて行う定量的リアルタイムＰＣＲに使用した。また、各ＲＮＡ試料の一部を非ＲＴ伝統的ＰＣＲ反応に使用し、ＤＮＡ侠雑物の不存在を確認した。
【０１４４】
（免疫組織化学）
注射の４８時間後、マウスを４％ＰＦＡで灌流した。脳を回収し、半側切除し、４％ＰＦＡ中で一晩固定した。次いで、これらを３０％スクロース中に２４時間浸漬し、凍結し、切片にした。注射部位の形態学的確認のため、切片をクレシルバイオレットで染色した。他の切片を、ヤギ抗ＴＴＲ及びビオチン化二次抗体で染色すると、ＴＴＲタンパク質発現、及び核マーカーとしてＴｏＰｒｏ３が示された。非特異的染色のための対照は、ヤギＩｇＧを用いて行った。
【０１４５】
（結果）
１ｎＭ ｓＡＰＰα及び１０アミノ酸断片はともに、成長因子ＩＧＦ２及びＩＧＦＢＰ２の発現における増大を誘導し（図８、９及び１０）、これにより、Ａβ毒性がインビトロで防御され得る。また、ｓＡＰＰα及び１０アミノ酸断片により、処理した海馬内でＴＴＲのレベルの増大がもたらされ、これによって、Ａβを分離されることにより毒性が防御され得る。これらの結果は、Ａβ毒性に抗する神経保護的経路（例えば、図１１を参照）は、マウスにおいてインビボで活性化され得ることを示す。これらの結果はまた、神経保護的経路の活性化が、アルツハイマー病の予防における処置として使用され得ることを示す。
【０１４６】
（実施例１１（予言的）−Ａβの効果を低減させる能力に関するインビボまたはインビトロでの化合物の同定）
試験化合物を、インビボまたはインビトロである脳組織に適用する。また、脳組織を、外的に適用するか脳組織内の細胞によって発現されるＡβと接触させる。簡単には、培養のための脳組織を得るため、実施例８に記載のようにして、脳組織を大きなインタクトな一部分（ほぼ３ｃｍ×２ｃｍ×２ｃｍ）において電気焼灼器によって取り出す。
【０１４７】
脳組織を試験化合物と接触させた後、細胞死および／または細胞生存能力を、生薄片で、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ’ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｋｉｔの蛍光プローブを用いて測定する。カルセインＡＭ（１：４００）及びエチジウムホモ二量体（１：１０００）含有リン酸緩衝生理食塩水中で４０分間のインキュベーション後、薄片を、例えば、Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ ２００倒立顕微鏡により２００×倍率で、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＭＲＣ−１０２４ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌシステム（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて可視化する。無作為の画像を、各プローブの発光スペクトルにおいて取り込み、Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を用いて生細胞および死細胞の数を定量する。各薄片について、少なくとも３つの領域をイメージングし、死滅のパーセントを調べる。死滅のパーセントは、ＥｔｈＤ−１陽性細胞の数をＥｔｈＤ−１及びカルセインＡＭ陽性細胞の総数で除算して算出する。場合によっては、細胞死をＴＵＮＥＬ染色によって調べる。簡単には、皮質薄片の凍結切片を、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ−媒介型ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）及び抗ＮｅｕＮ抗体で染色する。ＤＮＡ断片化を有する細胞を、ＤＮＡ内へのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−１２−ｄＵＴＰのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ取込みによって調べる（Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット、Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）。６００×倍率での共焦点解析によって、薄片１つあたり少なくとも３つの無作為の画像を作成する。次いで、ＴＵＮＥＬ陽性、ＮｅｕＮ陽性、ならびにＴＵＮＥＬ及びＮｅｕＮの両方が陽性の細胞の数を定量する。
【０１４８】
細胞死のパーセントを、試験化合物の不存在下でＡβと接触させた対照脳組織で測定された細胞死のパーセントと比較する。Ａβのみと接触させた脳組織で観察されるものと比べ、試験化合物およびＡβと接触させた脳組織で少ない細胞死が観察されるならば、試験化合物は、Ａβの効果を低減させる能力を有し得る。かかる低減の陽性対照は、ＤＡＥＦ含有ポリペプチド（例えば、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：１）、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦ（配列番号：７）、ＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：３）、ＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：４）、またはＤＡＥＦ（配列番号：２））とＡβとに接触させた脳組織である。他の対照としては、未処理の脳組織およびβ−アミロイド1〜42またはリバースＡβ（Ａβ42〜1）で処理した脳組織が挙げられる。
【０１４９】
試験化合物およびＡβと接触させた脳組織で観察された細胞死のパーセントを、ＤＡＥＦ含有ポリペプチド及びＡβと接触させた脳組織で観察された細胞死のパーセントと比較することにより、Ａβの効果を低減させる試験化合物の有効性を調べる。ＤＡＥＦ含有ポリペプチド及びＡβと接触させた脳組織で観察されるものと比べ、試験化合物およびＡβと接触させた脳組織で観察される同等または低いレベルの細胞死は、試験化合物がＡβの効果の強力なインヒビターであることを示し得る。
【０１５０】
（実施例１２（予言的）−Ａβの効果を低減させる能力に関する化合物の同定）
試験化合物を、インビボまたはインビトロである脳組織に適用する。簡単には、培養のための脳組織を得るため、実施例８に記載のようにして、脳組織を大きなインタクトな一部分（ほぼ３ｃｍ×２ｃｍ×２ｃｍ）において電気焼灼器によって取り出す。
【０１５１】
脳組織を試験化合物と接触させた後、ＴＴＲ及びＩＧＦ−２などの神経保護性ポリペプチドをエンコードする核酸の発現レベルを、該ポリペプチドレベル及び／又はｍＲＮＡレベルを測定することにより決定する。簡単には、ＥＬＩＳＡを用いて神経保護性ポリペプチド発現のレベルが測定され、一方、ＲＴ−ＰＣＲまたは発現アレイ技術（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）から入手可能なアレイ）を用いて、神経保護性ポリペプチドをエンコードする核酸のｍＲＮＡ発現のレベルが測定される。
【０１５２】
ポリペプチドまたはｍＲＮＡの発現のレベルを、試験化合物と接触させていない対照脳組織について決定された該ポリペプチドまたはｍＲＮＡの発現レベルと比較する。対照脳組織で観察されるものと比べて、より少ないポリペプチドまたはｍＲＮＡ発現が試験化合物と接触させた細胞で観察されるならば、試験化合物は、Ａβの効果を低減させる能力を有し得る。かかる低減の陽性対照は、ＤＡＥＦ含有ポリペプチド（例えば、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：１）、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦ（配列番号：７）、ＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：３）、ＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：４）、またはＤＡＥＦ（配列番号：２））と接触させた脳組織である。他の対照としては未処理の脳組織が挙げられる。
【０１５３】
神経保護性ポリペプチドをエンコードする核酸の発現レベルを増大させる試験化合物の有効性は、試験化合物と接触させた脳組織で観察された発現レベルを、ＤＡＥＦ含有ポリペプチドと接触させた脳組織で観察された発現レベルと比較することにより決定される。ＤＡＥＦ含有ポリペプチドと接触させた脳組織で観察されるものと比べ、試験化合物と接触させた脳組織で同等または高いレベルの発現が観察されることは、試験化合物が、神経保護性ポリペプチド発現の強力な活性化物質であることを示し得る。
【０１５４】
（実施例１３−ポリペプチド類の評価）
図１２Ａ及びＢは、種々の処理条件下での細胞死のパーセントを示す一組の棒グラフである。図１２Ａに関して、テトラペプチドＤＡＥＦ単独およびそのＮＨ2末端の終端上に修飾をしたものは、海馬薄片培養物においてＡβ誘導性死に対する防御を示す。
【０１５５】
各処理での死滅のパーセントを、膜透過性ＥｔｈＤ−１陽性細胞の数ならびにカルセインＡＭで陽性に染色された生細胞の数を計測することにより、生海馬薄片のニューロン野において定量した。データを平均±ＳＥＭ（１処理あたりｎ＝３〜５薄片）として示す。Ａβは、死滅のパーセントの有意な増加をもたらすが、１ｎＭのテトラペプチド（ＤＡＥＦ）は、Ａβ誘導性毒性を防御する。アセチル化ＤＡＥＦ（配列番号：２）は、Ａβに対する有意な防御を示す。また、テトラペプチド（Ｒ（９）−ＤＡＥＦ）のＮＨ2末端の終端への９個のアルギニンの付加により、Ａβ誘導性細胞死が有意に防御される。さらに図１２Ａに関して、＃ ビヒクルと比べてｐ値＜０．０１、＊ ２５μＭ Ａβと比べてｐ値＜０．０５、対応のない両側ｔ−検定。
【０１５６】
（結果）
器官型海馬培養物を、エチジウムホモ二量体（ＥｔｈＤ−１）及びカルセインＡＭで処理し、ともにインキュベートした。エチジウムホモ二量体（ＥｔｈＤ−１）は、インタクトな原形質膜を有する生細胞から消去される膜不透過性ＤＮＡ結合色素である。カルセインＡＭは、機能性細胞内エステラーゼを有する生細胞において蛍光を発する細胞不透過性色素である。ここで、各蛍光プローブで染色された細胞の数を計測し、ＥｔｈＤ−１陽性であり、したがって膜完全性を失った細胞のパーセントとして示した（％死滅、図）。２５μＭ Ａβでの処理により、ビヒクルでの処理と比べ、死滅のパーセントの劇的で有意な増加がもたらされた。１ｎＭの該４量体での４８時間の前処理により、Ａβ誘導性死が完全に防御された。この防御は、ＮＨ2末端の終端がアセチル化されている場合（アセチル−ＤＡＥＦ）は維持されたが、この分子は、非修飾テトラペプチドと同程度には防御しなかった。最後に、９個のアルギニンをそのＮＨ2末端の終端上に保有するように修飾したテトラペプチド（Ｒ（９）−ＤＡＥＦ）もまた、Ａβ処理を有意に防御した。
【０１５７】
（実験手順）
（海馬の器官型培養物）
Ｃ５７Ｂ６／ＳＪＬマウスの子に対し、生後第１５日に麻酔して断頭した。脳を取り出し、氷冷解離培地（５０％最少必須培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、５０％ハンクス平衡塩溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及び３６ｍＭグルコース）中に入れた。両方の海馬を解剖顕微鏡下で解剖し、Ｍｃｌｌｗａｉｎティッシュチョッパーにて４００μｍに切断した。薄片をばらばらにし、６ウェル培養プレート内に保持した３０ｍｍ直径および０．４μｍフィルター孔サイズを有するフィルターインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上に配置した。最初の３日間、薄片を、Ｂ−２７サプリメント、１ｍＭグルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中に維持した。続いて、抗生物質を含まない培地を用い、培地を３日毎に交換した。器官型培養物を加湿インキュベーター内に、３７℃で５％Ｏ2及び５％ＣＯ2中、１４〜２１日間維持した。
【０１５８】
細胞死および生存能力を、生薄片において、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ’ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｋｉｔの蛍光プローブを用いて測定した。カルセインＡＭ（１：４００）及びエチジウムホモ二量体（１：１０００）含有リン酸緩衝生理食塩水中で４０分間のインキュベーション後、薄片を、Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ ２００倒立顕微鏡により２００×倍率で、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＭＲＣ−１０２４ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌシステム（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて可視化した。ニューロン野の無作為の画像を、各プローブの発光スペクトルにおいて取り込み、Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を用いて生細胞および死細胞の数を定量した。各薄片について、ニューロン野を含む少なくとも３つの領域をイメージングし、死滅のパーセントを調べた。死滅のパーセントは、ＥｔｈＤ−１陽性細胞の数をＥｔｈＤ−１及びカルセインＡＭ陽性細胞の総数で除算して算出した。
【０１５９】
（処理）
β−アミロイド1〜42及びリバースＡβ（Ａβ42〜1）を、ＢＡＣＨＥＭ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）から入手した。これらのペプチドを０．１％ＮＨ3ＯＨに２２２μＭで溶解した。処理のため、Ａβを５０μＭで、Ｂ−２７サプリメント及び１ｍＭグルタミンを加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で３７°Ｃにて２４時間凝集させた。次いで、薄片培養培地を除去し、薄片を１ｍＬの２５μＭ Ａβまたはビヒクルで２４時間処理した。該ペプチド及び修飾ペプチド（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ，Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸによって合成）を１ｎＭの最終濃度まで、Ａβの添加の４８時間前に添加した。
【０１６０】
図１２Ｂは、各処理での死滅のパーセントを、膜透過性ＥｔｈＤ−１陽性細胞の数およびカルセインＡＭで陽性に染色された生細胞の数を計測することにより、生海馬薄片のニューロン野において定量したものを示す。データを平均±ＳＥＭ（１処理あたりｎ＝３〜５薄片）として示す。Ａβは、死滅のパーセントの有意な増加をもたらすが、１ｎＭのテトラペプチド（ＤＡＥＦ、配列番号：２）は、Ａβ誘導性毒性を防御する。ＤのＤ−異性体［（ｄＤ）ＡＥＦ］、ＡのＤ−異性体［Ｄ（ｄＡ）ＥＦ］またはＦのＤ−異性体［ＤＡＥ（ｄＦ）］を含有するテトラペプチド化合物は、Ａβ誘導性死を有意に防御しない。交換されたアミノ酸アスパラギン酸およびグルタミン酸およびＣＯＯＨ−末端に結合させたアミド基（ＥＡＤＦ（配列番号：５）−アミド）を有する化合物は、有意にＡβ誘導性死を防御するが、ＮＨ2−末端上にアセチル基を有するＥＡＤＦ（配列番号：５）配列（アセチル−ＥＡＤＦ（配列番号：５））は防御しない。図１２Ｂに関して、＃ ビヒクルと比べてｐ値＜０．０５、＊ ２５μＭ Ａβと比べてｐ値＜０．０５、対応のない両側ｔ−検定。
【０１６１】
（結果）
器官型海馬培養物を、エチジウムホモ二量体（ＥｔｈＤ−１）及びカルセインＡＭで処理し、ともにインキュベートした。エチジウムホモ二量体（ＥｔｈＤ−１）は、インタクトな原形質膜を有する生細胞から消去される膜不透過性ＤＮＡ結合色素である。カルセインＡＭは、機能性細胞内エステラーゼを有する生細胞において蛍光を発する細胞不透過性色素である。ここで、各蛍光プローブで染色された細胞の数を計測し、ＥｔｈＤ−１陽性であり、したがって膜完全性を失った細胞のパーセントとして示した（％死滅、図）。２５μＭ Ａβでの処理により、ビヒクルでの処理と比べ、死滅のパーセントの劇的で有意な増加がもたらされた。１ｎＭの該４量体での４８時間の前処理により、Ａβ誘導性死が完全に防御された。この防御は、アミノ酸Ｄ、Ａ及びＦの代わりにＤ−異性体を用いることにより消去された。
【０１６２】
（実験手順）
（海馬の器官型培養物）
Ｃ５７Ｂ６／ＳＪＬマウスの子に対し、生後第１５日に麻酔して断頭した。脳を取り出し、氷冷解離培地（５０％最少必須培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、５０％ハンクス平衡塩溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、及び３６ｍＭグルコース）中に入れた。両方の海馬を解剖顕微鏡下で解剖し、Ｍｃｌｌｗａｉｎティッシュチョッパーにて４００μｍに切断した。薄片をばらばらにし、６ウェル培養プレート内に保持した３０ｍｍ直径および０．４μｍフィルター孔サイズを有するフィルターインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）上に配置した。最初の３日間、薄片を、Ｂ−２７サプリメント、１ｍＭグルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中に維持した。続いて、抗生物質を含まない培地を用い、培地を３日毎に交換した。器官型培養物を加湿インキュベーター内に、３７℃で５％Ｏ2及び５％ＣＯ2中、１４〜２１日間維持した。
【０１６３】
細胞死および生存能力を、生薄片において、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ’ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｋｉｔの蛍光プローブを用いて測定した。カルセインＡＭ（１：４００）及びエチジウムホモ二量体（１：１０００）含有リン酸緩衝生理食塩水中で４０分間のインキュベーション後、薄片を、Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ ２００倒立顕微鏡により２００×倍率で、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＭＲＣ−１０２４ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌシステム（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて可視化した。ニューロン野の無作為の画像を、各プローブの発光スペクトルにおいて取り込み、Ｓｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を用いて生細胞および死細胞の数を定量した。各薄片について、ニューロン野を含む少なくとも３つの領域をイメージングし、死滅のパーセントを調べた。死滅のパーセントは、ＥｔｈＤ−１陽性細胞の数をＥｔｈＤ−１及びカルセインＡＭ陽性細胞の総数で除算して算出した。
【０１６４】
（処理）
β−アミロイド1〜42及びリバースＡβ（Ａβ42〜1）を、ＢＡＣＨＥＭ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）から入手した。これらのペプチドを０．１％ＮＨ3ＯＨに２２２μＭで溶解した。処理のため、Ａβを５０μＭで、Ｂ−２７サプリメント及び１ｍＭグルタミンを加えたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中で３７°Ｃにて２４時間凝集させた。次いで、薄片培養培地を除去し、薄片を、１ｍＬの２５μＭ Ａβまたはビヒクルで２４時間処理した。該ペプチド及び修飾ペプチド（ＵＷ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩによって合成）を１ｎＭの最終濃度まで、Ａβの添加の４８時間前に添加した。
【０１６５】
（実施例１４−海馬内へのポリペプチドの注射）
図１３は、海馬内へのｓＡＰＰα１０量体の定位注射が、正常マウス脳でＴＴＲの発現を誘導することを示す一組の染色の顕微鏡写真を示す。ｓＡＰＰα由来の１ｎＭのデカペプチドは、以前に、Ａβ毒性に抗して器官型海馬薄片培養物を保護することが示されていた。人工脳脊髄液（ＣＳＦ）で調製した１．５μＬの１５．３ｎＭ溶液の注射を行い、海馬内においての１ｎＭの最終濃度に近似させた。反対側には人工ＣＳＦのみを注射し、対照として用いた。ＴＴＲの免疫組織化学では、デカペプチドの注射により、反対側のＣＳＦ注射海馬（図１３Ａ）と比べ、ＣＡ１海馬のニューロン（図１３Ｂ）内および周囲でＴＴＲの量の増大が示された。ＤＮＡ結合色素ＴｏＰｒｏ３を用いて核を可視化した（青）。予備データでもまた、ｓＡＰＰαおよび該４量体の注射によりＴＴＲの増大が示された。
【０１６６】
（他の実施態様）
本発明を、その詳細な説明に関して説明したが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲に規定される本発明を例示することが意図され、その範囲を制限することを意図しないことを理解されたい。他の態様、利点および変形は、以下の特許請求の範囲の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】表示したポリペプチドで処理した海馬薄片のニューロン野内のＮｉｓｓｌ染色されたニューロンについてアポトーシスのパーセントをプロットした棒グラフである。データを１処理あたり３薄片の平均±ＳＥＭとして示す。＊は、５０μＭリバースＡβ処理と比べてｐ値＜０．０５を示す。＃は、２５μＭ Ａβ処理と比べてｐ値＜０．０５を示す。
【０１６８】
【図２】６Ｅ１０抗体を用いた、トランスジェニック及び非トランスジェニックマウス由来の組織のイムノブロットの写真を含む。図２はまた、ｓＡＰＰαの相対強度レベルをプロットした棒グラフを含む。値を平均±ＳＥＭ（ｎ＝４）として示す。＊は、非トランスジェニックマウスと比べてｐ値＜０．０５を示す。
【０１６９】
【図３】自己組織化マップ（ＳＯＭ）である。海馬薄片培養物において１ｎＭ ｓＡＰＰαによって有意に増大された（ランク≧９）遺伝子およびＥＳＴの発現レベルを、クラスター化し、発現のパターンを特定した。発現パターンは、ビヒクル処理（ｎ＝３）及びｓＡＰＰα処理（ｎ＝３）海馬薄片、６ヶ月齢非トランスジェニック対照（ｎ＝３）及びＡＰＰSw（ｎ＝３）マウス、ならびに１２ヶ月齢非トランスジェニック対照（ｎ＝２）及びＡＰＰSw（ｎ＝２）マウスにおいて調べた。遺伝子の各クラスターの平均発現レベルを縦座標にプロットしている（白丸）。他方の線（白くない丸）は、各クラスターの標準偏差を示す。クラスター４（右下パネル）は、ｓＡＰＰα処理によってならびに６及び１２ヶ月齢ＡＰＰSwマウスにおいて上方調節された遺伝子を示す。
【０１７０】
【図４】図４Ａ、Ｂ及びＣは、ＴＴＲ及びＩＧＦ−２ポリペプチドがｓＡＰＰα誘導型のＡβに対する防御に関与することを示す棒グラフである。各処理での死滅のパーセントを生海馬薄片のニューロン野において、膜透過性ＥｔｈＤ−１陽性細胞の数ならびにカルセインＡＭで陽性に染色された生細胞の数を計測することにより定量した。データを平均±ＳＥＭ（１処理あたりｎ＝３〜５薄片）として示す。図４Ａにおいて、生海馬薄片は表示のとおりに処理した。６Ｅ１０は、ｓＡＰＰαのＣＯＯＨ末端領域に対して指向される抗体である。ｓＡＰＰα断片は、ｓＡＰＰαの保護効果を模倣することがわかったｓＡＰＰαのＣＯＯＨ−末端断片である（ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ，配列番号：１）。＊は、５０μＭリバースＡβと比べてｐ値＜０．０５を示す；＃は、５０μＭ Ａβと比べてｐ値＜０．０１を示す；＊＊は、１ｎＭ ｓＡＰＰα＋マウスＩｇＧ＋２５μＭ Ａβと比べてｐ値＜０．０５を示す；＃＃は、２５μＭ Ａβと比べてｐ値＜０．０５を示す。図４Ｂにおいて、生海馬薄片は、ビヒクル、ＡβまたはｓＡＰＰα＋Ａβとともに、表示した抗体（ヤギＩｇＧ、抗ＴＴＲまたは抗ＩＧＦ−２）で処理した。＊は、対応するビヒクル処理薄片と比べてｐ値＜０．０１を示す；＃は、１ｎＭ ｓＡＰＰα＋ヤギＩｇＧ＋２５μＭ Ａβと比べてｐ値＜０．０１を示す。図４Ｃにおいて、生海馬薄片は、ビヒクル、Ａβ、またはｓＡＰＰα＋Ａβとともに、ＴＴＲ、ＩＧＦ−２またはインスリン様成長因子−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）配列を標的化するｓｉＲＮＡ分子で処理した。＊は、対応するビヒクル処理薄片と比べてｐ値＜０．０５を示す；＃は、１ｎＭ ｓＡＰＰα＋乱雑化したＧＡＤＰＨ＋２５μＭ Ａβと比べてｐ値＜０．０５を示す。
【０１７１】
【図５】図５Ａは、ヤギＩｇＧ（ｎ＝４）及び抗ＴＴＲ（ｎ＝４）注入マウスの、注入を受けたＣＡ１錐体ニューロン野内の濃縮した核を有する細胞の総数をプロットした棒グラフである。＊はｐ値＜０．０１を示す（両側ウィルコクソンのサインランク検定）。図５Ｂは、ヤギＩｇＧ（ｎ＝４）及び抗ＴＴＲ（ｎ＝４）注入マウスにおけるＣＡ１ニューロンの総数をプロットした棒グラフである。＊はｐ値＜０．０５を示す（両側ウィルコクソンのサインランク検定）。
【０１７２】
【図６】図６Ａは、表示のとおりに処理した皮質薄片での死滅のパーセントをプロットした棒グラフである。各処理での死滅のパーセントを生皮質薄片において、膜透過性ＥｔｈＤ−１陽性細胞の数ならびにカルセインＡＭで陽性に染色された生細胞の数を計測することにより定量した。データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝４被験体）として示す。＊は、５０μＭリバースＡβと比べてｐ値＜０．０５を示す；＃は、５０μＭ Ａβと比べてｐ値＜０．０５を示す。図６Ｂは、表示した処理での、ＴＵＮＥＬ陽性である全細胞のパーセント（％ＴＵＮＥＬ）またはＴＵＮＥＬ及びＮｅｕＮの両方が陽性であるＮｅｕＮ陽性細胞のパーセント（％ＴＵＮＥＬ／ＮｅｕＮ）をプロットした棒グラフである。データは、単一の被験体のものであり、平均±ＳＥＭ（１処理あたりｎ＝２〜４薄片）として示す。図６Ｃは、表示した処理での死滅のパーセントをプロットした棒グラフである。各処理での死滅のパーセントは生皮質薄片において、膜透過性ＥｔｈＤ−１陽性細胞の数ならびにカルセインＡＭで陽性に染色された生細胞の数を計測することにより定量した。データは３例の被験体のものであり、平均±ＳＥＭとして示す。
【０１７３】
【図７】表示した処理での海馬薄片培養物における死滅のパーセントをプロットした棒グラフである。データを平均±ＳＥＭ（１処理あたりｎ＝３〜７薄片）として示す。＃は、ビヒクルと比べたｐ値＜０．０１を示す；＊は、２５μＭ Ａβと比べてｐ値＜０．０１を示す；対応のない両側ｔ−検定。
【０１７４】
【図８】図８は、海馬の処理側および対照側におけるＩＧＦＢＰ２の発現の相対レベルにおける変化倍数をプロットした棒グラフである。レベルをβ−アクチンレベルに対して標準化した。乱雑化実験での試料の数は３であり、一方、他の実験での試料の数は４であった。
【０１７５】
【図９】海馬の処理側および対照側におけるプロラクチン受容体の発現の相対レベルにおける変化倍数をプロットした棒グラフである。レベルをβ−アクチンレベルに対して標準化した。
【０１７６】
【図１０】海馬の処理側および対照側におけるＩＧＦ２の発現の相対レベルにおける変化倍数をプロットした棒グラフである。レベルをβ−アクチンレベルに対して標準化した。
【０１７７】
【図１１】提案される神経保護的経路の図表である。
【０１７８】
【図１２】図１２Ａ及びＢは、表示した処理での海馬薄片培養物における死滅のパーセントをプロットした棒グラフである。
【０１７９】
【図１３】図１３Ａ及びＢは、海馬内へのｓＡＰＰ１０量体の定位注射の海馬内へのｓＡＰＰαデカペプチドの定位注射後のＴＴＲ免疫染色を示す一組の顕微鏡写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａβの効果を低減または抑制するのに有用な単離されたペプチドであって、該ペプチドは、下記式
Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ
（式中、Ａは、アミノ酸残基Ｄ、Ｅ、Ｎ及びＱからなる群から選択され；
式中、Ｂは、アミノ酸残基Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｇ及びＰからなる群から選択され；
式中、Ｃは、アミノ酸残基Ｅ、Ｄ、Ｎ及びＱからなる群から選択され；ならびに
式中、Ｄは、アミノ酸残基Ｆ及びＹからなる群から選択される）
を含み、
該ペプチドは、哺乳動物細胞においてＡβの効果を低減または抑制し、該ペプチドは、４〜１６の間の残基長である、
Ａβの効果を低減または抑制するのに有用な単離されたペプチド。
【請求項２】
本質的にＡ−Ｂ−Ｃ−Ｄからなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ポリペプチド安定化単位をさらに含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
さらにアミノ酸残基を、カルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかに、前記ペプチドの式が
Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｚ
（式中、Ｘ及びＺは、ＤＡＥＦと連続的なｓＡＰＰαタンパク質配列由来の残基である）
となるように含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ｓＡＰＰα残基が、ｓＡＰＰαの５８５〜５９５及び６０１〜６００から選択される、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
Ａ−Ｂ−Ｃ−ＤがＡＰＰスウェーデン変異に隣接し、Ｘが、Ａと隣接する残基Ｎ−Ｌを含む、請求項４に記載のペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドが、ＤＡＥＦ（配列番号：２）、ＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：３）、ＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：４）、ＥＡＤＦ（配列番号：２）、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：７）、Ｒ9ＤＡＥＦ（配列番号：２）、ＭＥＡＤＦ（配列番号：８）、ＥＡＤＦＲ（配列番号：９）、ＥＡＥＦ（配列番号：１０）、及びａｃＤＡＥＦ（配列番号：２）からなる群から選択される、請求項３に記載のペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドが、ＰＰＤＡＥＦＰＰ（配列番号：１２）、ＰＤＡＥＦＰＰ（配列番号：１３）、ＰＰＤＡＥＦＰ（配列番号：１４）及びＰＤＡＥＦＰ（配列番号：１５）からなる群から選択される、請求項３に記載のペプチド。
【請求項９】
Ａβの効果を低減および抑制するのに有用な単離されたペプチドであって、該ペプチドが、ＤＡＥＦ（配列番号：２）（残基５９７〜６００）を含むｓＡＰＰα配列の単離された４〜１６残基セグメントを含む、Ａβの効果を低減および抑制するのに有用な単離されたペプチド。
【請求項１０】
式中、Ａが、アミノ酸残基Ｄ及びＥから選択され；
式中、Ｂが、アミノ酸残基Ａであり；
式中、Ｃが、アミノ酸残基Ｅ及びＤから選択され；ならびに
式中、Ｄアミノ酸残基がＦである、
請求項１に記載のペプチド。
【請求項１１】
薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１２】
薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項３に記載のペプチド。
【請求項１３】
薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項９に記載のペプチド。
【請求項１４】
哺乳動物細胞に、Ａβの効果が低減または抑制されるような有効量の請求項１に記載のペプチドを供給する工程を含む、哺乳動物細胞においてＡβの効果を低減または抑制する方法。
【請求項１５】
哺乳動物細胞に、Ａβの効果が低減または抑制されるような有効量の請求項３に記載のペプチドを供給する工程を含む、哺乳動物細胞においてＡβの効果を低減または抑制する方法。
【請求項１６】
哺乳動物細胞に、Ａβの効果が低減または抑制されるような有効量の請求項８に記載のペプチドを供給する工程を含む、哺乳動物細胞においてＡβの効果を低減または抑制する方法。
【請求項１７】
Ａβの効果がＡβ誘導性タウリン酸化である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記効果がニューロン細胞死である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記ペプチドがＡＤ患者に供給される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物細胞に、ニューロン細胞死が抑制されるような有効量の請求項１に記載のペプチドを供給する工程を含む、ニューロン細胞死を抑制する方法。
【請求項２１】
哺乳動物細胞に、ニューロン細胞死が抑制されるような有効量の請求項３に記載のペプチドを供給する工程を含む、ニューロン細胞死を抑制する方法。
【請求項２２】
哺乳動物細胞に、ニューロン細胞死が抑制されるような有効量の請求項９に記載のペプチドを供給する工程を含む、ニューロン細胞死を抑制する方法。
【請求項２３】
前記ペプチドがＡＤ患者に供給される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
脳組織を、Ａβペプチドの存在下で試験化合物と接触させる工程およびＡβの効果を測定する工程を含む、Ａβの効果を低減する能力を有する化合物を同定する方法。
【請求項２５】
Ａβの効果を低減させる試験化合物の能力を、Ａβの効果を低減させる請求項１に記載のペプチドの能力と比較する工程をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ペプチドがＤＡＥＦ（配列番号：２）またはＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：１）である、請求項２５に記載の方法。
【請求項１】
Ａβの効果を低減または抑制するのに有用な単離されたペプチドであって、該ペプチドは、下記式
Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ
（式中、Ａは、アミノ酸残基Ｄ、Ｅ、Ｎ及びＱからなる群から選択され；
式中、Ｂは、アミノ酸残基Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｇ及びＰからなる群から選択され；
式中、Ｃは、アミノ酸残基Ｅ、Ｄ、Ｎ及びＱからなる群から選択され；ならびに
式中、Ｄは、アミノ酸残基Ｆ及びＹからなる群から選択される）
を含み、
該ペプチドは、哺乳動物細胞においてＡβの効果を低減または抑制し、該ペプチドは、４〜１６の間の残基長である、
Ａβの効果を低減または抑制するのに有用な単離されたペプチド。
【請求項２】
本質的にＡ−Ｂ−Ｃ−Ｄからなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ポリペプチド安定化単位をさらに含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
さらにアミノ酸残基を、カルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかに、前記ペプチドの式が
Ｘ−Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｚ
（式中、Ｘ及びＺは、ＤＡＥＦと連続的なｓＡＰＰαタンパク質配列由来の残基である）
となるように含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ｓＡＰＰα残基が、ｓＡＰＰαの５８５〜５９５及び６０１〜６００から選択される、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
Ａ−Ｂ−Ｃ−ＤがＡＰＰスウェーデン変異に隣接し、Ｘが、Ａと隣接する残基Ｎ−Ｌを含む、請求項４に記載のペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドが、ＤＡＥＦ（配列番号：２）、ＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：３）、ＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：４）、ＥＡＤＦ（配列番号：２）、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：７）、Ｒ9ＤＡＥＦ（配列番号：２）、ＭＥＡＤＦ（配列番号：８）、ＥＡＤＦＲ（配列番号：９）、ＥＡＥＦ（配列番号：１０）、及びａｃＤＡＥＦ（配列番号：２）からなる群から選択される、請求項３に記載のペプチド。
【請求項８】
前記ペプチドが、ＰＰＤＡＥＦＰＰ（配列番号：１２）、ＰＤＡＥＦＰＰ（配列番号：１３）、ＰＰＤＡＥＦＰ（配列番号：１４）及びＰＤＡＥＦＰ（配列番号：１５）からなる群から選択される、請求項３に記載のペプチド。
【請求項９】
Ａβの効果を低減および抑制するのに有用な単離されたペプチドであって、該ペプチドが、ＤＡＥＦ（配列番号：２）（残基５９７〜６００）を含むｓＡＰＰα配列の単離された４〜１６残基セグメントを含む、Ａβの効果を低減および抑制するのに有用な単離されたペプチド。
【請求項１０】
式中、Ａが、アミノ酸残基Ｄ及びＥから選択され；
式中、Ｂが、アミノ酸残基Ａであり；
式中、Ｃが、アミノ酸残基Ｅ及びＤから選択され；ならびに
式中、Ｄアミノ酸残基がＦである、
請求項１に記載のペプチド。
【請求項１１】
薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１２】
薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項３に記載のペプチド。
【請求項１３】
薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項９に記載のペプチド。
【請求項１４】
哺乳動物細胞に、Ａβの効果が低減または抑制されるような有効量の請求項１に記載のペプチドを供給する工程を含む、哺乳動物細胞においてＡβの効果を低減または抑制する方法。
【請求項１５】
哺乳動物細胞に、Ａβの効果が低減または抑制されるような有効量の請求項３に記載のペプチドを供給する工程を含む、哺乳動物細胞においてＡβの効果を低減または抑制する方法。
【請求項１６】
哺乳動物細胞に、Ａβの効果が低減または抑制されるような有効量の請求項８に記載のペプチドを供給する工程を含む、哺乳動物細胞においてＡβの効果を低減または抑制する方法。
【請求項１７】
Ａβの効果がＡβ誘導性タウリン酸化である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記効果がニューロン細胞死である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記ペプチドがＡＤ患者に供給される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物細胞に、ニューロン細胞死が抑制されるような有効量の請求項１に記載のペプチドを供給する工程を含む、ニューロン細胞死を抑制する方法。
【請求項２１】
哺乳動物細胞に、ニューロン細胞死が抑制されるような有効量の請求項３に記載のペプチドを供給する工程を含む、ニューロン細胞死を抑制する方法。
【請求項２２】
哺乳動物細胞に、ニューロン細胞死が抑制されるような有効量の請求項９に記載のペプチドを供給する工程を含む、ニューロン細胞死を抑制する方法。
【請求項２３】
前記ペプチドがＡＤ患者に供給される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
脳組織を、Ａβペプチドの存在下で試験化合物と接触させる工程およびＡβの効果を測定する工程を含む、Ａβの効果を低減する能力を有する化合物を同定する方法。
【請求項２５】
Ａβの効果を低減させる試験化合物の能力を、Ａβの効果を低減させる請求項１に記載のペプチドの能力と比較する工程をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ペプチドがＤＡＥＦ（配列番号：２）またはＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号：１）である、請求項２５に記載の方法。
【図１】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図２】
【図１１】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図２】
【図１１】
【公表番号】特表２００８−５０９９１５（Ｐ２００８−５０９９１５Ａ）
【公表日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２５７５５（Ｐ２００７−５２５７５５）
【出願日】平成１７年８月１０日（２００５．８．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２８３８６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０３１３３０
【国際公開日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【出願人】（３９００２３６４１）ウイスコンシン アラムナイ リサーチ フオンデーシヨン (61)
【氏名又は名称原語表記】ＷＩＳＣＯＮＳＩＮ ＡＬＵＭＮＩ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月１０日（２００５．８．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２８３８６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０３１３３０
【国際公開日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【出願人】（３９００２３６４１）ウイスコンシン アラムナイ リサーチ フオンデーシヨン (61)
【氏名又は名称原語表記】ＷＩＳＣＯＮＳＩＮ ＡＬＵＭＮＩ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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