ＡＤＡＭＴＳタンパク質発現のための細胞培養培地
本発明は、ＡＤＡＭＴＳ１３等の、ＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現に有用である培養培地を提供する。ＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現および精製のための方法も提供する。一部の実施形態において、本発明の培地および方法は、高比活性を有するＡＤＡＭＴＳタンパク質の発現に有用である。本明細書に提供される方法に従い発現され、精製される、高比活性を有するＡＤＡＭＴＳ、例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質組成物もまた提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）タンパク質を発現させるための方法であって、少なくとも約２μＭの濃度の亜鉛、または少なくとも約０．５ｍＭの濃度のカルシウムのうちの少なくとも１つを含む培養培地中で、ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む、方法。
【請求項２】
前記培養培地は、少なくとも約２μＭの亜鉛を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培養培地は、約２μＭ〜約１２μＭの間の亜鉛を含有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記培養培地は、少なくとも約５μＭの亜鉛を含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記培養培地は、約５μＭ〜約１２μＭの間の亜鉛を含有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記培養培地は、少なくとも約０．５ｍＭのカルシウムを含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記培養培地は、約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭの間のカルシウムを含有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記培養培地は、少なくとも２μＭの亜鉛と、少なくとも約０．５ｍＭのカルシウムと、を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記培養培地は、少なくとも約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記培養培地は、少なくとも約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養培地は、約２ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌの間のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記培養培地は、少なくとも約０．５ｍｇ／Ｌのポリアミンをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリアミンは、プトレシンである、請求項１２に記載の応法。
【請求項１４】
前記培養培地は、約２ｍｇ／Ｌ〜約８ｍｇ／Ｌの間のプトレシンを含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記培養培地は、動物性タンパク質を含まない、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記培養培地は、既知組成培地である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞は、バクテリア細胞、酵母細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、および哺乳類細胞から成る群より選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳類細胞は、ヒト細胞系、ハムスター細胞系、およびマウス細胞系から成る群より選択される細胞系である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞系は、ＣＨＯ細胞系、ＢＨＫ細胞系、およびＨＥＫ細胞系から成る群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞系は、ＣＨＯ細胞系である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする前記核酸は、誘導性プロモーターをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法は、回分細胞培養法を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記回分細胞培養は、反復回分細胞培養である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記回分細胞培養は、流加回分細胞培養である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法は、連続細胞培養を含む、請求項１〜２１および２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記連続細胞培養は、連続浮遊細胞培養を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記連続細胞培養は、連続付着細胞培養を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記培養は、ケモスタット様式で実施される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記培養は、灌流様式で実施される、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞を培養するためにマイクロキャリアが使用される、請求項２７または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記マイクロキャリアは、多孔質マイクロキャリアである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記培養は、少なくとも７日間維持される、請求項２３および２５〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記培養は、少なくとも１ヶ月間維持される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記培養は、少なくとも２ヶ月間維持される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記培養は、約３５℃〜約３７℃の間の温度で維持される、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記培養は、約６．９〜約７．３の間のｐＨで維持される、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記培養は、約７．０５〜約７．１５の間のｐＨで維持される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＡＤＡＭＴＳタンパク質はＡＤＡＭＴＳ１３である、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記培養培地中の前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の比活性は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質当り少なくとも約６００Ｕである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記培養培地中の前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の比活性は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質当り少なくとも約８００Ｕである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記培養は、１日につき１Ｌの培養物当り少なくとも約４００ＵのＡＤＡＭＴＳ１３活性（Ｕ／Ｌ／Ｄ）をもたらす、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記培養は、１日につき１Ｌの培養物当り少なくとも約８００ＵのＡＤＡＭＴＳ１３活性（Ｕ／Ｌ／Ｄ）をもたらす、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＡＤＡＭＴＳ組成物を産生するための方法であって、
（ａ）動物性タンパク質を含まない培養培地中で、ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養するステップと、
（ｂ）前記培養物から上清の分画を除去するステップと、
（ｃ）あらゆる残留細胞を除去するために、濾過または遠心分離のステップを実施するステップと、
（ｄ）前記ＡＤＡＭＴＳタンパク質を濃縮するために、限外濾過ステップを実施するステップと、
（ｅ）少なくとも約０．５μＭｎの亜鉛と、少なくとも約０．１ｍＭのカルシウムとを含む緩衝液を用いて、透析濾過を実施し、それによってＡＤＡＭＴＳ組成物を調製するステップと、を含む、方法。
【請求項４４】
細胞を培養する前記ステップは、回分細胞培養を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
細胞を培養する前記ステップは、連続細胞培養を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記培養培地は、カルシウムを含有する、請求項４３〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記培養培地は、少なくとも０．５ｍＭのカルシウムを含有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記培養培地は、亜鉛を含有する、請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記培養培地は、少なくとも２μＭの亜鉛を含有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記培養培地は、ニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する、請求項４３〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記培養培地は、少なくとも２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記透析緩衝液は、少なくとも約５μＭの亜鉛と、少なくとも約２ｍＭのカルシウムと、を含有する、請求項４３〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＡＤＡＭＴＳタンパク質はＡＤＡＭＴＳ１３である、請求項４３〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＡＤＡＭＴＳ１３の比活性の約２０％未満が、前記ステップ（ｃ）の終わりと前記ステップ（ｅ）の終わりの間に失われる、請求項４３〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＡＤＡＭＴＳ１３の比活性の約１０％未満が、前記ステップ（ｃ）の終わりと前記ステップ（ｅ）の終わりの間に失われる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも約１０００Ｕ／ｍｇの比活性を有する、請求項４３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも約１５００Ｕ／ｍｇの比活性を有する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法に従って、細胞培養物中にＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させることを含む方法により調製される、ＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物。
【請求項５９】
請求項４３〜５７のいずれか１項に記載の方法に従う方法により調製される、ＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物。
【請求項１】
トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）タンパク質を発現させるための方法であって、少なくとも約２μＭの濃度の亜鉛、または少なくとも約０．５ｍＭの濃度のカルシウムのうちの少なくとも１つを含む培養培地中で、ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養することを含む、方法。
【請求項２】
前記培養培地は、少なくとも約２μＭの亜鉛を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培養培地は、約２μＭ〜約１２μＭの間の亜鉛を含有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記培養培地は、少なくとも約５μＭの亜鉛を含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記培養培地は、約５μＭ〜約１２μＭの間の亜鉛を含有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記培養培地は、少なくとも約０．５ｍＭのカルシウムを含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記培養培地は、約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭの間のカルシウムを含有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記培養培地は、少なくとも２μＭの亜鉛と、少なくとも約０．５ｍＭのカルシウムと、を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記培養培地は、少なくとも約２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記培養培地は、少なくとも約７ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養培地は、約２ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌの間のニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記培養培地は、少なくとも約０．５ｍｇ／Ｌのポリアミンをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリアミンは、プトレシンである、請求項１２に記載の応法。
【請求項１４】
前記培養培地は、約２ｍｇ／Ｌ〜約８ｍｇ／Ｌの間のプトレシンを含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記培養培地は、動物性タンパク質を含まない、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記培養培地は、既知組成培地である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞は、バクテリア細胞、酵母細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、および哺乳類細胞から成る群より選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳類細胞は、ヒト細胞系、ハムスター細胞系、およびマウス細胞系から成る群より選択される細胞系である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞系は、ＣＨＯ細胞系、ＢＨＫ細胞系、およびＨＥＫ細胞系から成る群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞系は、ＣＨＯ細胞系である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする前記核酸は、誘導性プロモーターをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法は、回分細胞培養法を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記回分細胞培養は、反復回分細胞培養である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記回分細胞培養は、流加回分細胞培養である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法は、連続細胞培養を含む、請求項１〜２１および２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記連続細胞培養は、連続浮遊細胞培養を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記連続細胞培養は、連続付着細胞培養を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記培養は、ケモスタット様式で実施される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記培養は、灌流様式で実施される、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞を培養するためにマイクロキャリアが使用される、請求項２７または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記マイクロキャリアは、多孔質マイクロキャリアである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記培養は、少なくとも７日間維持される、請求項２３および２５〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記培養は、少なくとも１ヶ月間維持される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記培養は、少なくとも２ヶ月間維持される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記培養は、約３５℃〜約３７℃の間の温度で維持される、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記培養は、約６．９〜約７．３の間のｐＨで維持される、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記培養は、約７．０５〜約７．１５の間のｐＨで維持される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＡＤＡＭＴＳタンパク質はＡＤＡＭＴＳ１３である、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記培養培地中の前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の比活性は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質当り少なくとも約６００Ｕである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記培養培地中の前記ＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質の比活性は、１ｍｇのＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質当り少なくとも約８００Ｕである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記培養は、１日につき１Ｌの培養物当り少なくとも約４００ＵのＡＤＡＭＴＳ１３活性（Ｕ／Ｌ／Ｄ）をもたらす、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記培養は、１日につき１Ｌの培養物当り少なくとも約８００ＵのＡＤＡＭＴＳ１３活性（Ｕ／Ｌ／Ｄ）をもたらす、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＡＤＡＭＴＳ組成物を産生するための方法であって、
（ａ）動物性タンパク質を含まない培養培地中で、ＡＤＡＭＴＳタンパク質をコードする核酸を持つ細胞を培養するステップと、
（ｂ）前記培養物から上清の分画を除去するステップと、
（ｃ）あらゆる残留細胞を除去するために、濾過または遠心分離のステップを実施するステップと、
（ｄ）前記ＡＤＡＭＴＳタンパク質を濃縮するために、限外濾過ステップを実施するステップと、
（ｅ）少なくとも約０．５μＭｎの亜鉛と、少なくとも約０．１ｍＭのカルシウムとを含む緩衝液を用いて、透析濾過を実施し、それによってＡＤＡＭＴＳ組成物を調製するステップと、を含む、方法。
【請求項４４】
細胞を培養する前記ステップは、回分細胞培養を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
細胞を培養する前記ステップは、連続細胞培養を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記培養培地は、カルシウムを含有する、請求項４３〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記培養培地は、少なくとも０．５ｍＭのカルシウムを含有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記培養培地は、亜鉛を含有する、請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記培養培地は、少なくとも２μＭの亜鉛を含有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記培養培地は、ニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する、請求項４３〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記培養培地は、少なくとも２ｍｇ／Ｌのニコチンアミド（ビタミンＢ３）を含有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記透析緩衝液は、少なくとも約５μＭの亜鉛と、少なくとも約２ｍＭのカルシウムと、を含有する、請求項４３〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＡＤＡＭＴＳタンパク質はＡＤＡＭＴＳ１３である、請求項４３〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＡＤＡＭＴＳ１３の比活性の約２０％未満が、前記ステップ（ｃ）の終わりと前記ステップ（ｅ）の終わりの間に失われる、請求項４３〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＡＤＡＭＴＳ１３の比活性の約１０％未満が、前記ステップ（ｃ）の終わりと前記ステップ（ｅ）の終わりの間に失われる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも約１０００Ｕ／ｍｇの比活性を有する、請求項４３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、少なくとも約１５００Ｕ／ｍｇの比活性を有する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法に従って、細胞培養物中にＡＤＡＭＴＳタンパク質を発現させることを含む方法により調製される、ＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物。
【請求項５９】
請求項４３〜５７のいずれか１項に記載の方法に従う方法により調製される、ＡＤＡＭＴＳタンパク質組成物。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１３−５００７２４（Ｐ２０１３−５００７２４Ａ）
【公表日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２３１１０（Ｐ２０１２−５２３１１０）
【出願日】平成２２年７月３０日（２０１０．７．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４４０２０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１４８３８
【国際公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月１０日（２０１３．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月３０日（２０１０．７．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４４０２０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０１４８３８
【国際公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【出願人】（５９１０１３２２９）バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド (448)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＮＣＯＲＰ０ＲＡＴＥＤ
【出願人】（５０１４５３１８９）バクスター・ヘルスケヤー・ソシエテ・アノニム (289)
【氏名又は名称原語表記】ＢＡＸＴＥＲ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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