Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドならびにＨＢＶ侵入インヒビターおよびＨＤＶ侵入インヒビターとしてのそれらの使用
本発明は、ＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサス配列に由来する、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドに関し、Ｎ末端が好ましくはアシル化され、必要に応じて、Ｃ末端が改変されている。これらＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、非常に有効なＨＢＶ侵入インヒビターおよびＨＤＶ侵入インヒビターであり、従って、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染の阻害、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶの一次感染の防止、ならびに（慢性）Ｂ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎の処置に適している。本発明はさらに、ＨＢＶのこれら疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドを含む、薬学的組成物およびワクチン組成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサス配列に由来し、Ｎ末端が好ましくはアシル化され、そして必要に応じてＣ末端が改変されている、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドに関する。これらＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、非常に効率的なＨＢＶ侵入インヒビター、ならびにＨＤＶ侵入インヒビターであり、従って、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染の阻害、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶの一次感染の予防、ならびに（慢性）Ｂ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎の処置に適している。本発明はさらに、これらＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドを含む、薬学的組成物およびワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
今日、約２０億もの人々が、ＨＢＶの血清学的マーカーを有している。そのうちの約４億人が、ＨＢＶに慢性的に感染している。疾病管理予防センター（ＣＤＣ）によれば、慢性ＨＢＶ感染者のうちの１５〜２５％は、適切な処置を受けなければ、１０年以内に肝細胞癌（ＨＣＣ）を発症させる傾向がある（１）。ＨＢＶ関連ＨＣＣは、予後不良であり、従って、ＨＢＶは、世界保健機関（ＷＨＯ）によって、もっとも重要な天然に存在するヒトの発癌物質として分類された。予防的ワクチンの存在にも関わらず、感染数は、世界人口の増加および経済的に困窮した国々における予防の限界に起因して、来るべき１０年間において上昇する。
【０００３】
先進国において、ＨＢＶは、非経口経路を介して主に伝染する。実際に感染した、免疫能のある固体のうちの９０〜９５％は、このウイルスを一掃し、それによって、寿命の長さの免疫防御を得る。彼らのうちの約５〜１０％は、慢性Ｂ型肝炎を発症させる（ドイツにおいて３００，０００〜５００，０００人）。対照的に、非常に蔓延した地域（特に、中央アフリカおよび東アジア）においては、伝染の主な態様は、母から子への垂直感染である。不運なことに、完全に免疫能があるわけではない子供の感染は、この疾患について、９０〜９８％の慢性経過をたどる。Ｂ型肝炎関連ＨＣＣは、従って、これらの国々においてもっとも一般的な悪性疾患である。
【０００４】
慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の処置について現在承認されている治療レジメンは、すでに確立された感染の後にウイルス・ゲノムの複製工程に対処する（ラミブジン、アデフォビル、エンテカビル）か、または免疫系のモジュレーターとして作用する（インターフェロンα）かのいずれかである。不運なことに、上記患者のうちのわずか１０〜２５％が、このような治療に対して持続したウイルス学的応答を残しているに過ぎず、これは、とりわけ、ヌクレオチド（ヌクレオシド）耐性変異体の素早い選択を示している。予防的ワクチンの利用可能性にもかかわらず、その結果、これまで影響を受けていない複製工程（例えば、ウイルス侵入）を標的とする新規な治療剤を開発することは、最も重要である。
【０００５】
ウイルス侵入の特異的阻害は、急性および慢性感染を制御しかつ最終的に排除するための魅力的な治療概念である。ＨＩＶについては、ウイルス侵入への介入は、３６アミノ酸（Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標））からなるｇｐ４１タンパク質由来ペプチドによって首尾よく達成されてきた。このペプチドは、ウイルス膜と細胞膜との融合を妨げる（２）。
【０００６】
予防的ワクチンおよび逆転写酵素（ＲＴ）インヒビターの利用可能性にもかかわらず、ＨＢＶ感染の人数および全世界でのＨＢＶ関連の死亡数（現在では約５００，０００人／年）は、増加しつつある。原発性肝臓癌の約２／３は、持続性のＨＢＶ感染に特徴がある（３）。
【０００７】
現在の処置は、２つのストラテジーを追求する：（ｉ）インターフェロン（ＩＦＮα）処置は、ＨＢＶに対する免疫応答を調節し、直接的な抗ウイルス効果を示す。このことは、上記ウイルスの根絶なしに、処置した患者のうちの約３０％において、長期の臨床的利益をもたらす；（ｉｉ）ウイルス逆転写酵素インヒビターの投与は、ウイルス複製を抑制し、１年間の処置の後に、顕著な生化学的かつ組織学的改善が付随する。しかし、長期の処置は、耐性ウイルス株の出現と関連している（４）。
【０００８】
ＨＢＶは、哺乳動物およびトリの小さなエンベロープに包まれたＤＮＡウイルスファミリーのプロトタイプである（５）。上記ＨＢＶエンベロープは、Ｌ−（大）、Ｍ−（中）およびＳ−（小）といわれる３つのタンパク質を包んでいる（図１Ａを参照のこと）。これらは、４つの膜貫通領域とＣ末端のＳドメインを共有している。上記Ｍ−タンパク質およびＬ−タンパク質は、５５アミノ酸（ｐｒｅＳ２）、および遺伝子型に依存して、１０７アミノ酸もしくは１１８アミノ酸（ｐｒｅＳ１）のさらなるＮ末端伸長を有している（図１Ｂを参照のこと）。ビリオンにおいて、Ｌ、ＭおよびＳの化学量論比は、約１：１：４である一方で、より豊富に分泌される非感染性サブウイルス粒子（ＳＶＰ）は、ほぼもっぱらＳ−タンパク質および極微量のＬ−タンパク質を含む（６）。合成の間に、上記ＬのｐｒｅＳ１ドメインは、ミリストイル化され、ＥＲを介して場所を変えられる。この改変は、ＨＢＶ感染性にとって必須である（７，８）。
【０００９】
ＨＢＶ感染の初期事象の研究は、制限されてきた。なぜなら、細胞培養系も、小動物モデルも、近年まで利用可能でなかったからである（９）（非特許文献１）。上記ＨＢＶ感受性細胞株ＨｅｐａＲＧの開発は、ＨＢＶ侵入の体系的調査を促進し、エンベロープタンパク質由来侵入インヒビターの発見をもたらした（１０）（非特許文献２）。
【００１０】
さらに、今日までに、サテライトウイルソイドが肝細胞への侵入のためにＨＢＶエンベロープタンパク質を利用するＨＤＶ感染の有効な治療は存在しない（１５，１７，２０）（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。ＨＤＶ感染に対する有効な治療を提供することが当該分野では必要である。
【００１１】
従って、本発明は、先行技術において存在する場合、ＨＢＶ感染および他のＨＢＶ関連疾患の阻害、予防および／もしくは処置のための方法および手段を改善することを目的とし、従って、本発明の目的は、ＨＢＶ感染およびＨＢＶ関連疾患の標的とされかつ効率的な阻害、予防および／もしくは処置を可能にする改善された方法および手段を提供することである。
【００１２】
さらなる本発明の目的は、ＨＤＶ感染およびＨＤＶ関連疾患の上記感染、予防および／もしくは処置のための方法および手段を提供することである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｇｌｅｂｅ， Ｄ．およびＵｒｂａｎ， Ｓ． Ｖｉｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｈｅｐａｄｎａｖｉｒａｌ ｅｎｔｒｙ． Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ（２００７）１３， ２２−３８
【非特許文献２】Ｇｒｉｐｏｎ， Ｐ．ら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｂｙ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ（２００２）９９， １５６５５−１５６６０
【非特許文献３】Ｅｎｇｅｌｋｅ， Ｍ．ら、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ａｎｄ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｄｅｌｔａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ． Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（２００６）４３， ７５０−７６０
【非特許文献４】Ｂａｒｒｅｒａ， Ａ．、Ｇｕｅｒｒａ， Ｂ．、Ｎｏｔｖａｌｌ， Ｌ．およびＬａｎｆｏｒｄ， Ｒ．Ｅ． Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｐｒｅ−Ｓ１ ｄｏｍａｉｎ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ（２００５）７９， ９７８６−９７９８
【非特許文献５】Ｔａｙｌｏｒ， Ｊ．Ｍ． Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｄｅｌｔａ ｖｉｒｕｓ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００６）３４４， ７１−７６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明によれば、この目的は、ＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドを提供することによって解決される。
【００１５】
上記疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、以下の一般式：
Ｈｍ−Ｐ−Ｒｎ，
を有し、
Ｐは、上記ｐｒｅＳ由来ペプチドであり、ＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサス配列のアミノ酸配列もしくはその改変体を含む。
【００１６】
Ｈは、上記ｐｒｅＳ由来ペプチド Ｐの疎水性改変であり、上記疎水性改変は、ＰのＮ末端のものであり、疎水性部分のアシル化および付加から選択される；ここでｍは、少なくとも１である。
【００１７】
Ｒは、必要に応じて、上記ｐｒｅＳ由来ペプチド ＰのＣ末端改変である（すなわち、ｎは、０もしくは少なくとも１である）。
【００１８】
本発明によれば、この目的は、本明細書に定義される少なくとも１個のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド、ならびに必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアおよび／もしくは賦形剤を含む薬学的組成物を提供することによって、さらに解決される。
【００１９】
本発明によれば、この目的は、上記ＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドおよび／もしくは疾患の診断、予防および／もしくは処置のための、本発明のそれぞれの薬学的組成物を提供することによってさらに解決される。
【００２０】
本発明によれば、この目的は、上記ＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド、またはＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染の阻害のための；ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶの一次感染の予防のための、および／もしくはＢ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎の処置のための、本発明の薬学的組成物を提供することによって、さらに解決される。
【００２１】
本発明によれば、この目的は、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染の阻害のための；ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶの一次感染の予防のための、ならびに／または（慢性）Ｂ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎の処置のための、医薬の製造のために上記ＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは本発明の薬学的組成物を使用することによって、さらに解決される。
【００２２】
本発明によれば、この目的は、ＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは本発明の薬学的組成物を利用することによる、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染を阻害するための方法；ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶの一次感染を阻害するための方法、および／もしくは（慢性）Ｂ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎を処置するための方法によって、さらに解決される。
【００２３】
本発明によれば、この目的は、本明細書で定義される少なくとも１つのＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド、ならびに必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアおよび／もしくは賦形剤を含むワクチン組成物を提供することによって、さらに解決される。
【００２４】
以下の実施例および図面は、本発明を例示するが、本発明に対する限定ではない。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ＨＢＶ粒子、ならびにＨＢＶ Ｌ−タンパク質、Ｍ−タンパク質およびＳ−タンパク質の模式図である。（Ａ）部分的二本鎖ＤＮＡは、末端タンパク質（ＴＰ）、逆転写酵素（ＲＴ）およびＲＮａｓｅＨからなるウイルスポリメラーゼ複合体と供給結合している。そのゲノムは、１２０個のコアタンパク質ダイマーから作られる二十面体の殻によって包まれている。上記３個のＨＢＶ表面タンパク質Ｌ−、Ｍ−およびＳ−は、ＥＲ由来脂質二重層へと埋め込まれる。上記Ｌ−タンパク質およびＭ−タンパク質は、膜アンカーとして働く完全Ｓドメインを含む。（Ｂ）上記３個のＨＢＶ表面タンパク質Ｌ、ＭおよびＳのドメイン構造。上記Ｌ−タンパク質は、Ｎ末端がミリストイル化された１０７個アミノ酸のｐｒｅＳ１−ドメイン、５５個アミノ酸のｐｒｅＳ２−ドメイン、および４回膜貫通セグメント（Ｉ〜ＩＶ）を含むＳ−ドメインを含む。
【図２】図２は、ＨＢＶ ｐｒｅＳ１コンセンサス配列である。一番上：そのｐｒｅＳ１、ｐｒｅＳ２およびＳ−ドメインを有する上記ＨＢＶ Ｌ−タンパク質が示される。そのＮ末端は、ミリストイル化されている。下のアラインメントは、アミノ酸２〜５０を含む、コンセンサス配列（コンセンサス）および８個のＨＢＶ 遺伝子型（Ａ〜Ｈ）、ならびにウーリーモンキーＨＢＶ（ＷＭＨＢＶ） ｐｒｅＳ配列を示す。上記遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、ＧおよびＨは、それらのＮ末端において１１個のさらなるアミノ酸を有し、遺伝子型Ｆは、１０個のさらなるアミノ酸残基を有することに注意のこと。一番下において、既知の機能的サブドメインが示される。ＨＢＶ 遺伝子型Ｃとは、ＨＢＶ 遺伝子型Ｃ Ｑ４６Ｋをいうことにも注意のこと。
【図３】図３は、上記２つの遺伝子型ＣおよびＤのミリストイル化およびステアロイル化したＨＢＶｐｒｅＳ由来ペプチドの比較感染阻害アッセイである。ＨｅｐａＲＧ細胞を、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ミリストイル（Ｄ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ミリストイル（Ｃ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／（−１１）−４８ミリストイル（Ｃ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｃ）およびＨＢＶｐｒｅＳ／（−１１）−４８ステアロイル（Ｃ）の非存在（０ｎＭ）下、およびこれらの１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭおよび２０００ｎＭの存在下で、いずれかに感染させた。感染性接種物（遺伝子型ＤのＨＢＶ）および上記ペプチドを、一晩インキュベートした。洗浄後、細胞を、さらに１２日間にわたって維持して、ウイルス遺伝子発現を可能にした。８〜１２日目の細胞培養上清を採取し、市販の定量的ＥＬＩＳＡを使用して、分泌ＨＢＳＡｇについて分析した。それぞれの不完全感染からのＨＢｓＡｇ値を、１００％に設定し、感染阻害の程度を、不完全感染の％単位で与える。ここで（Ｃ）もしくは遺伝子型Ｃは、ＨＢＶ 遺伝子型Ｃ Ｑ４６Ｋをいう。
【図４】図４は、コンセンサス配列を有する、ミリストイル化およびステアロイル化したＨＢＶｐｒｅＳ由来ペプチドの感染阻害アッセイである。ＨｅｐａＲＧ細胞を、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ミリストイル（コンセンサス）およびＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（コンセンサス）の非存在（０ｎＭ）下、もしくはこれらの０．１２５ｎＭ；０．２５ｎＭ；０．５ｎＭ；０．７５ｎＭおよび１ｎＭの存在下のいずれかで、感染させた。感染性接種物（遺伝子型ＤのＨＢＶ）および上記ペプチドを、一晩インキュベートした。洗浄後、細胞を、さらに１２日間にわたって維持して、ウイルス遺伝子発現を可能にした。８〜１２日目の細胞培養上清を採取し、市販の定量的ＥＬＩＳＡを使用して、分泌ＨＢＳＡｇについて分析した。それぞれの不完全感染からのＨＢｓＡｇ値を、１００％に設定し、感染阻害の程度を、不完全感染の％単位で与える。
【図５】図５は、遺伝子型ＤのＣ末端が欠失したステアロイル化ＨＢＶｐｒｅＳ由来ペプチドの比較感染阻害アッセイである。ＨｅｐａＲＧ細胞を、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｄ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−１５ステアロイル（Ｄ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−２１ステアロイル（Ｄ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−２６ステアロイル（Ｄ）およびＨＢＶｐｒｅＳ／２−３３ステアロイル（Ｄ）の非存在（０ｎＭ）下、ならびにこれらの１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎＭの存在下のいずれかで、感染させた。感染性接種物（遺伝子型ＤのＨＢＶ）および上記ペプチドを一晩インキュベートした。洗浄後、細胞を、さらに１２日間にわたって維持して、ウイルス遺伝子発現を可能にした。８〜１２日目の細胞培養上清を採取し、市販の定量的ＥＬＩＳＡを使用して、分泌ＨＢＳＡｇについて分析した。それぞれの不完全感染からのＨＢｓＡｇ値を、１００％に設定し、感染阻害の程度を、不完全感染の％単位で与える。
【図６】図６は、遺伝子型ＤのＮ末端およびＣ末端が欠失したステアロイル化ＨＢＶｐｒｅＳ由来ペプチドの比較感染阻害アッセイである。ＨｅｐａＲＧ細胞を、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｄ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−３３ステアロイル（Ｄ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／５−３３ステアロイル（Ｄ）、およびＨＢＶｐｒｅＳ／５−４８ステアロイル（Ｄ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／９−３３ステアロイル（Ｄ）およびＨＢＶｐｒｅＳ／９−４８ステアロイル（Ｄ）の非存在（０ｎＭ）下、もしくはこれらの１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎＭの存在下のいずれかで、感染させた。感染性接種物（遺伝子型ＤのＨＢＶ）および上記ペプチドを一晩インキュベートした。洗浄後、細胞を、さらに１２日間にわたって維持して、ウイルス遺伝子発現を可能にした。８〜１２日目の細胞培養上清を採取し、市販の定量的ＥＬＩＳＡを使用して、分泌ＨＢＳＡｇについて分析した。それぞれの不完全感染からのＨＢｓＡｇ値を、１００％に設定し、感染阻害の程度を、不完全感染の％単位で与える。
【図７】図７は、遺伝子型Ｄの内部変異したステアロイル化ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ペプチドの比較感染阻害アッセイである。ＨｅｐａＲＧ細胞を、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｄ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｄ−ＡＳ１１−１５）（Ｄ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ａｌａ１１−１５）（Ｄ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Δ１７−２１）（Ｄ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ａｌａ１７−２１）（Ｄ）およびＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ａｌａ２−９）（Ｄ）の非存在（０ｎＭ）下、もしくはこれらの１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎＭの存在下のいずれかで、感染させた。感染性接種物（遺伝子型ＤのＨＢＶ）および上記ペプチドを一晩インキュベートした。洗浄後、細胞を、さらに１２日間にわたって維持して、ウイルス遺伝子発現を可能にした。８〜１２日目の細胞培養上清を採取し、市販の定量的ＥＬＩＳＡを使用して、分泌ＨＢＳＡｇについて分析した。それぞれの不完全感染からのＨＢｓＡｇ値を、１００％に設定し、感染阻害の程度を、不完全感染の％単位で与える。
【図８】図８は、遺伝子型Ｄの内部変異したステアロイル化ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ペプチドの比較感染阻害アッセイである。ＨｅｐａＲＧ細胞を、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（レトロインベルゾ）（Ｄ）およびＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ａｌａ２１，２３，２９，３０）（Ｄ）の非存在（０ｎＭ）下、もしくはこれらの１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎＭの存在下のいずれかで、感染させた。感染性接種物（遺伝子型ＤのＨＢＶ）および上記ペプチドを一晩インキュベートした。洗浄後、細胞を、さらに１２日間にわたって維持して、ウイルス遺伝子発現を可能にした。８〜１２日目の細胞培養上清を採取し、市販の定量的ＥＬＩＳＡを使用して、分泌ＨＢＳＡｇについて分析した。それぞれの不完全感染からのＨＢｓＡｇ値を、１００％に設定し、感染阻害の程度を、不完全感染の％単位で与える。
【図９】図９は、遺伝子型Ｄの内部変異したステアロイル化ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ペプチドのさらなる比較感染阻害アッセイである。ＨｅｐａＲＧ細胞を、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ａｌａ１８）（Ｄ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Δ１１−１５）（Ｄ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｓｅｒ１３）（Ｄ）およびＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ａｒｇ１１）（Ｄ）の非存在（０ｎＭ）、もしくはこれらの１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎＭの存在下のいずれかで、感染させた。感染性接種物（遺伝子型ＤのＨＢＶ）および上記ペプチドを一晩インキュベートした。洗浄後、細胞を、さらに１２日間にわたって維持して、ウイルス遺伝子発現を可能にした。８〜１２日目の細胞培養上清を採取し、市販の定量的ＥＬＩＳＡを使用して、分泌ＨＢＳＡｇについて分析した。それぞれの不完全感染からのＨＢｓＡｇ値を、１００％に設定し、感染阻害の程度を、不完全感染の％単位で与える。
【図１０】図１０は、本発明において使用される遺伝子型Ｄのステアロイル化ＨＢＶｐｒｅＳ由来ペプチドである。
【図１１】図１１は、本発明の疎水性改変ｐｒｅＳペプチドがインビボ肝臓向性を示すことを示す。Ａ マウスにおけるＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ Ｔｙｒステアロイル（Ｄ）の生体分布。Ｂ マウスにおけるＨＢＶｐｒｅＳ／５−４８ Ｄ−Ｔｙｒステアロイル（Ｄ）の生体分布。Ｃ マウスにおけるＨＢＶｐｒｅＳ／２−３３−Ｄ Ｔｙｒステアロイル（Ｄ）の生体分布。
【図１２】図１２は、Ｍｙｒｃｌｕｄｅｘ ＢによるＨｅｐａＲＧ細胞に対するＨＢＶ感染、アシル化の効果である。Ｍｙｒｃｌｕｄｅｘ Ｂとは、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８（Ｃ）（ここで（Ｃ）とは、ＨＢＶ 遺伝子型Ｃ Ｑ４６Ｋをいう）をいう。ステアロイル化およびミリストイル化したＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８（Ｃ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ミリストイル（Ｃ）およびＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｃ）を比較する、競合アッセイ。試験した濃度は、完全な競合を有しないように、１ｎＭ未満であった。示されるのは、ＨＢｅＡｇ測定値（接種後７〜１４日目）である。図３〜９に示される実験と同じ反応および感染条件。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（本発明の好ましい実施形態の説明）
本発明が以下により詳細に記載される前に、本発明が本明細書に記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されないことが理解されるきである。なぜなら、これらは変化し得るからである。本明細書で使用される用語法が、記載されている特定の実施形態のみを目的とし、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図しないこともまた、理解されるべきである。別段定義されなければ、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の目的のために、本明細書で引用されるすべての参考文献は、それらの全体が本明細書に参考として援用される。
【００２７】
（ＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド）
上記で概説されるように、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドを提供する。
【００２８】
ＨＢＶのエンベロープは、Ｌ（大）、Ｍ（中）およびＳ（小）といわれる３つのタンパク質を包んでいる（図１Ａを参照のこと）。それらは、４つの膜貫通領域とＣ末端のＳドメインを共有している。上記Ｍ−タンパク質およびＬ−タンパク質は、５５アミノ酸、および遺伝子型に依存して、１０７アミノ酸もしくは１１８アミノ酸（ｐｒｅＳ２およびｐｒｅＳ１）のさらなるＮ末端伸長を有している（図１Ｂを参照のこと）。
【００２９】
従って、表現、本発明に従うＨＢＶの「ｐｒｅＳ由来」ペプチドとは、ＨＢＶ（ｐｒｅＳ１）のＬ−タンパク質のＮ末端伸長、好ましくは、上記種および遺伝子型Ａ〜Ｈの、ならびにウーリーモンキー（ＷＭＨＢＶ）、チンパンジーおよびゴリラＢ型肝炎ウイルスのコンセンサス配列に対応するアミノ酸配列を有するペプチドをいうが、その改変体（好ましくは、Ｎ末端および／もしくはＣ末端が短縮された改変体、アミノ酸置換改変体）をもいう。
【００３０】
配列番号１は、上記種および遺伝子型Ａ〜Ｈ、ならびにウーリーモンキー（ＷＭＨＢＶ）のＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサスアミノ酸配列を示す。
【００３１】
アミノ酸２〜４８を示す、上記ＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサス配列（コンセンサス）および上記８つのＨＢＶ 遺伝子型（Ａ〜Ｈ）、ならびにウーリーモンキーＨＢＶ（ＷＭＨＢＶ）ｐｒｅＳ配列を示す、図２におけるアラインメントを参照のこと。遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨは、それらのＮ末端において最大１１個までのさらなるアミノ酸を有することに注意のこと。
【００３２】
本願内の上記ＨＢＶ「遺伝子型Ｃ」のアミノ酸配列は、４６位（以下に記載されるような番号に従って）が、Ｇｅｎｂａｎｋ配列におけるようなＧｌｎ（Ｑ）の代わりに、本発明の遺伝子型ＣにおいてＬｙｓ（Ｋ）であることを除いて、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢＶ０２８５０．１に示されるように、上記ＨＢＶ 遺伝子型Ｃに対応するかもしくはこれと同一である人工配列をいう；本願のＨＢＶ 遺伝子型Ｃ配列はまた、「ＨＢＶ 遺伝子型Ｃ Ｑ４６Ｋ」といわれ得る。配列番号４、１２、２１〜２７をまた参照のこと。
【００３３】
図２はまた、上記ＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサス配列のアミノ酸残基の番号付けを示す。この番号付けは、本明細書全体を通して言及される。
【００３４】
アミノ酸残基番号１は、遺伝子型Ｄ（以前は、サブタイプａｙｗと記載されていた。配列番号５もまた参照のこと）のメチオニン（Ｍｅｔ１）であるのに対して、アミノ酸残基番号（−１１）は、遺伝子型Ｃ（配列番号４）のメチオニン（Ｍｅｔ（−１１））である。インビボで、それぞれ、Ｍｅｔ１もしくはＭｅｔ（−１１）は、細胞のメチオニルアミノペプチダーゼによって切断され、ミリストイル−ＣｏＡから、それぞれ、アミノ酸残基番号２のグリシン（Ｇｌｙ２）もしくはアミノ酸残基番号（−１０）グリシン（Ｇｌｙ（−１０））へのＮ−ミリストイルトランスフェラーゼによるミリストイル残基のその後の転移によって、改変される。遺伝子型Ｄの上記Ｎ末端アミノ酸残基は、天然のアミノ酸グリシン（Ｇｌｙ２）であり、Ｌの基礎をなすオープンリーディングフレーム（もしくは、例えば、遺伝子型ＣについてはＧｌｙ（−１０））のコドンからのそれぞれの番号付けに従って、２に番号付けされる。
【００３５】
上記ＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサス配列はまた、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨの上記さらなるＮ末端アミノ酸（「−」位において示される）を含む。従って、ＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサス配列のうちのすべてにおいて、（−１１）〜４８位が含まれる。
【００３６】
従って、配列番号１におけるアミノ酸の上記の番号付けと実際の列挙との間には差異が存在する。例えば、
Ｍｅｔ（−１１）、残基番号（−１１）は、配列番号１においてアミノ酸残基１として列挙され；
Ｇｌｙ（−１０）、残基番号（−１０）は、配列番号１においてアミノ酸残基２として列挙され；
Ｍｅｔ １、残基番号１は、配列番号１においてアミノ酸残基１２として列挙され；
Ｇｌｙ ２、残基番号２は、配列番号１においてアミノ酸残基１３として列挙され；
Ｇｌｙ ４８、残基番号４８は、配列番号１においてアミノ酸残基５８として列挙される。
【００３７】
【化１−１】
【００３８】
【化１−２】
本発明に従うＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、以下の式を有する：
Ｈｍ−Ｐ−Ｒｎ，
ここで
Ｐは、上記ｐｒｅＳ由来ペプチドであり；
Ｈは、Ｐの疎水性改変であり；
Ｒは、ＰのＣ末端改変であり；
ｍは、少なくとも１であり；
ｎは、０もしくは少なくとも１である。
【００３９】
本発明に従うＨＢＶのｐｒｅＳ由来ペプチド、Ｐは、以下を含む：
−配列番号１に示されるような上記ＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサス配列のアミノ酸配列、もしくは
−その改変体。
【００４０】
「改変体」は、好ましくは、Ｎ末端および／もしくはＣ末端が短縮された改変体、アミノ酸置換もしくは欠失改変体、または長くされた改変体である。改変体は、改変アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはペプチド模倣物、またはペプチド骨格／構造を模倣し得るさらなる化合物を含むアミノ酸配列をさらに含む。
【００４１】
好ましくは、改変体は、配列番号１のＮ末端および／もしくはＣ末端が短縮された改変体；アミノ酸置換もしくは欠失改変体；改変アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはペプチド模倣物、またはペプチド骨格／構造を模倣し得るさらなる化合物を含む改変体から選択される。
【００４２】
本発明によれば、疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドの改変体は、配列番号１の少なくとも１０個もしくは２０個連続するアミノ酸を含み、そして配列番号１の１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個以上のアミノ酸もしくはその改変体からなり得る。
【００４３】
Ｎ末端および／もしくはＣ末端が短縮された改変体は、好ましくは、配列番号１の少なくとも４８個連続するアミノ酸（好ましくは、残基２〜４８）、より好ましくは、配列番号１の少なくとも１７個連続するアミノ酸（好ましくは、残基５〜２１）または配列番号１の少なくとも２０個連続するアミノ酸（好ましくは、残基２〜２１）を含む。
【００４４】
用語「改変体」はまた、ヘパドナウイルス属の異なるウイルス種、株もしくはサブタイプ（例えば、ＨＢＶ株α１、ＨＢＶ株ＬＳＨ（チンパンジー分離株）、ウーリーモンキーＨＢＶ（ＷＭＨＢＶ）、または上記ＨＢＶ 遺伝子型Ａ〜Ｈからなる群より選択される株、ならびに本明細書で定義される上記ＨＢＶ 遺伝子型Ｃ、Ｑ４６Ｋ（例えば、配列番号４））において見いだされる相同な配列をいう。
【００４５】
用語「改変体」はまた、配列番号１もしくは本明細書で開示される任意の他のアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは、７０％、より好ましくは、８０％、さらにより好ましくは、９０％もしくは９５％の配列同一性を示す相同な配列をいう。
【００４６】
従って、本発明に従う、好ましい疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドにおいて、Ｐは、異なるウイルス種、株もしくはサブタイプの（好ましくは、上記ＨＢＶの遺伝子型のもしくはウーリーモンキーＨＢＶ（ＷＭＨＢＶ）の、またはこれらの改変体の）アミノ酸配列を有する、配列番号１の改変体を含む。
【００４７】
好ましくは、Ｐは、配列番号２〜１０から選択されるアミノ酸配列もしくはこれらの改変体（図２もまた参照のこと）を含み得る。
【００４８】
好ましい実施形態において、本発明に従う疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドにおいて、Ｐは、以下から選択されるアミノ酸配列を有する配列番号１の改変体を含む：
配列番号１に示されるＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサス配列の
アミノ酸残基２〜２１、
アミノ酸残基５〜２１、
アミノ酸残基５〜１５もしくは
アミノ酸残基９〜１５（［配列番号１５］もまた参照のこと）。
【００４９】
より好ましくは、Ｐは、配列番号１の残基９〜２２におけるアミノ酸置換および／もしくは欠失（例えば、残基１７〜２１を欠失させることによる）を含まない。
【００５０】
より好ましくは、Ｐは、配列番号１の残基９〜１５においてアミノ酸置換および／もしくは欠失を含まない。
【００５１】
より好ましくは、配列モチーフ ＮＰＬＧＦＦＰ［配列番号１５］（配列番号１の残基９〜１５に対応する）は、中断されてもいないし、改変されてもいない（例えば、残基１１〜１５をＤアミノ酸で置換することによって）。
【００５２】
より好ましくは、本発明に従う疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドにおいて、Ｐは、以下から選択されるアミノ酸配列を有する配列番号１の改変体を含む：
上記コンセンサス配列のアミノ酸残基２〜４８ ［配列番号１１］；
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜４８ ［配列番号１２］；
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜２１ ［配列番号１３］；
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基５〜２１ ［配列番号１４］；
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基９〜１５ ［配列番号１５］；
遺伝子型Ｄのアミノ酸残基２〜４８ ［配列番号１６］；
遺伝子型Ｄのアミノ酸残基５〜４８ ［配列番号１７］；
遺伝子型Ｄのアミノ酸残基２〜３３ ［配列番号１８］
遺伝子型Ｄのアミノ酸残基５〜３３ ［配列番号１９］
遺伝子型Ｄのアミノ酸残基２〜２１ ［配列番号２０］；
遺伝子型Ｄのアミノ酸残基９〜１５ ［配列番号１５］。
【００５３】
従って、好ましくは、Ｐは、配列番号１１〜２０から選択されるアミノ酸配列もしくはその改変体を含む。
【００５４】
Ｐの好ましいアミノ酸配列については、以下の表１〜７、図面および実施例を参照のこと。
【００５５】
配列番号１の「改変体」はまた、上記配列が１０μＭ未満の、および好ましくは、１μＭ未満のペプチド濃度でのＨＢＶ感染の７０％阻害を誘発する限りにおいて、アミノ酸欠失、アミノ酸置換（例えば、他のアミノ酸もしくは等配電子体（タンパク質のアミノ酸に対して近い構造的かつ空間的類似性を有する改変アミノ酸）による保存的もしくは比保存的な置換、アミノ酸付加または等配電子体付加）を含む改変体もしくは「アナログ」を含む。
【００５６】
保存的アミノ酸置換は、代表的には、同じクラスのアミノ酸の中での置換をいう。これらクラスとしては、例えば、以下が挙げられる：
−非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびチロシン）；
−塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、およびヒスチジン）；
−酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）；および
−非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、およびシステイン）。
【００５７】
本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、好ましくは、増大した免疫原性特性を有するように改変され得る。このような増大した免疫原性特性とは、例えば、免疫した後に誘発される抗体の範囲を増大させること、または種々のウイルス株による感染を中和し得る抗体の生成を可能にすることをいう。
【００５８】
別の実施形態において、本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、好ましくは、それらの免疫原性特性を低下させるように改変され得る。このような疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、悪影響を回避もしくは制限しながら、インビボでのＨＢＶ感染を阻害するための治療適用において特に有用である。
【００５９】
従って、置換および／もしくは欠失によって改変されるべき好ましい配列モチーフは、上記免疫原性をになう配列（例えば、Ｂ細胞エピトープおよび／もしくはＴ細胞エピトープ、さらには、抗体認識モチーフ）である。
【００６０】
ＨＢＶのＢ細胞エピトープは、好ましくは、配列番号１のアミノ酸残基２０〜２３（モチーフ ＤＰＡＦ）およびアミノ酸残基２６〜３２、上記コンセンサス配列（配列番号１）のモチーフ ＮＳＮＮＰＤＷおよび遺伝子型Ｃ（配列番号４）、もしくは遺伝子型ＤのＮＴＡＮＰＤＷ（配列番号５）である。
【００６１】
好ましい実施形態において、配列番号１のアミノ酸残基２０〜２３は、好ましくは、アミノ酸置換によって改変され、そして／または上記アミノ酸残基２６〜３２は、好ましくは、アミノ酸置換および／もしくは欠失によって改変され得る。
【００６２】
好ましくは、配列番号１のアミノ酸残基２０〜２３（モチーフ ＤＰＡＦ）は、アラニンアミノ酸置換によって、好ましくは、モチーフ ＡＰＡＦへと改変される。
【００６３】
好ましくは、配列番号１のアミノ酸残基２６〜３２は、アラニンアミノ酸置換によって、好ましくは、モチーフ ＮＡＮＡＰＤＷもしくはＮＡＡＡＰＤＷへと改変される。
【００６４】
好ましい実施形態において、Ｐは、配列番号２１〜２８から選択されるアミノ酸配列もしくはこれらの改変体を含む。
【００６５】
以下の表２、表７、ならびにそれぞれの図面および実施例もまた参照のこと。
【００６６】
より好ましい実施形態において、Ｐは、以下から選択されるアミノ酸配列を含む：
配列番号１１ （上記コンセンサス配列の残基２〜４８）、
配列番号１２ （遺伝子型Ｃの残基２〜４８）、
配列番号１３ （遺伝子型Ｃの残基２〜２１）、
配列番号４ （遺伝子型Ｃの残基（−１１）〜４８）、および
配列番号２０ （遺伝子型Ｄの残基２〜２１）。
【００６７】
上記ｐｒｅＳ由来ペプチドＰの疎水性改変（Ｈ）は、ＰのＮ末端にある。
【００６８】
「Ｎ末端の」とは、Ｎ末端（すなわち、それぞれの第１のアミノ酸残基（例えば、Ｇｌｙ ２））における疎水性改変をいうが、Ｎ末端付近（例えば、それぞれのアミノ酸残基（−４）、（−３）、（−２）、（−１）、１、２、または３もしくは４）における疎水性改変も含む。従って、上記疎水性改変は、ＰのＮ末端付近の部位において疎水性部分を結合することによってさらに得られ得る。
【００６９】
本発明のＨＢＶのｐｒｅＳ由来ペプチドの上記疎水性改変は、上記ペプチドに疎水性部分を付加する。
【００７０】
さらに、ｍは、少なくとも１（すなわち、少なくとも１個の疎水性部分もしくは基での改変）である。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態において、ｍは、１、２、３、４もしくはこれ以上である。すなわち、Ｐは、１個より多い疎水性部分もしくは基（例えば、２個）で改変され得る。上記疎水性部分もしくは基は、互いに同じでもあってもよいし、異なっていてもよい。
【００７２】
本発明に従うＨＢＶのｐｒｅＳ由来ペプチドの上記疎水性改変は、以下から選択される：
−アシル化；
−疎水性部分の付加。
【００７３】
アシル化は、好ましくは、カルボン酸、脂肪酸、脂肪族側鎖を有するアミノ酸でのアシル化から選択される。
【００７４】
好ましい脂肪酸は、飽和もしくは不飽和の脂肪酸、分枝状もしくは非分枝状の脂肪酸、好ましくは、８〜２２個の炭素原子（Ｃ８〜Ｃ２２）を有するものである。
【００７５】
より好ましくは、アシル化による上記疎水性改変は、ミリストイル（Ｃ１４）、パルミトイル（Ｃ１６）もしくはステアロイル（Ｃ１８）でのアシル化から選択される。
【００７６】
上記疎水性部分の付加は、好ましくは、コレステロール、コレステロールの誘導体、リン脂質、糖脂質、グリセロールエステル、ステロイド、セラミド、イソプレン誘導体、アダマンタン、ファルネソール、脂肪族基、多環式芳香族化合物（ｐｏｌｙａｒｏｍａｔｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の付加から選択される。
【００７７】
上記疎水性部分の結合は、好ましくは、共有結合によるものであり、これは、カルバメート、アミド、エーテル、ジスルフィド、もしくは当業者の技術範囲内の任意の他の連結を介して達成され得る。
【００７８】
従って、本発明の、疎水性改変された、好ましくは、アシル化ｐｒｅＳ由来ペプチドは、好ましくは、それらのＮ末端親油性もしくは疎水性の基／部分に起因して、リポペプチドである。
【００７９】
好ましい疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドについては、表１および表２もまた参照のこと。
【００８０】
より好ましい本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、以下のものである：
Ｐは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号４、および配列番号２０から選択されるアミノ酸配列を含み、そして
Ｈは、ミリストイル（Ｃ１４）もしくはステアロイル（Ｃ１８）、好ましくは、ステアロイル（Ｃ１８）でのアシル化による疎水性改変である。
【００８１】
従って、より好ましい本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、以下である：
【００８２】
【化２】
ここで（Ｃ）は、ＨＢＶ 遺伝子型Ｃ Ｑ４６Ｋをいう。
【００８３】
（遺伝子型Ｃ配列の好ましい実施形態）
本発明の非常に好ましい実施形態において、本発明に従う疎水性改変ｐｒｅＳペプチドにおいて、Ｐは、遺伝子型Ｃに由来するアミノ酸配列を含む。
【００８４】
遺伝子型Ｃに由来する本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、ＨＢＶ感染を、その対応する遺伝子型Ｄのものより強力に阻害する。図３および表３もまた参照のこと。
【００８５】
上記で議論されるように、本願の範囲内のＨＢＶ 「遺伝子型Ｃ」のアミノ酸配列とは、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢＶ０２８５０．１に示されるように、上記ＨＢＶ 遺伝子型Ｃに対応するかもしくはこれと同一である人工配列である。ただし、４６位（以下に記載されるような番号付けに従う）は、Ｇｅｎｂａｎｋ配列におけるようなＧｌｎ（Ｑ）の代わりに、本発明の上記遺伝子型ＣにおいてＬｙｓ（Ｋ）である；本願のＨＢＶ 遺伝子型Ｃ配列はまた、「ＨＢＶ 遺伝子型Ｃ Ｑ４６Ｋ」といわれ得る。配列番号４、１２、２１〜２７もまた参照のこと。
【００８６】
上記ＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサス配列について上記に記載されるようなものと同じ番号付けが、上記遺伝子型Ｃ配列のアミノ酸残基の番号付けのために使用され（図２もまた参照のこと）。例えば、
Ｍｅｔ （−１１）、残基番号（−１１）は、配列番号４においてアミノ酸残基１として列挙され；
Ｇｌｙ （−１０）、残基番号（−１０）は、配列番号４においてアミノ酸残基２として列挙され；
Ｍｅｔ １、残基番号１は、配列番号４においてアミノ酸残基１２として列挙され；
Ｇｌｙ ２、残基番号２は、配列番号４においてアミノ酸残基１３として列挙され、そして配列番号１２においてアミノ酸残基１として列挙され；
Ｇｌｙ ４８、残基番号４８は、配列番号４においてアミノ酸残基５８として列挙され、そして配列番号１２においてアミノ酸残基４７として列挙される。
【００８７】
配列番号１２ アミノ酸配列（これは、４６位が、Ｇｌｎ（Ｑ）の代わりにＬｙｓ（Ｋ）；Ｑ４６Ｋであることを除いて、ＨＢＶ 遺伝子型Ｃの２〜４８位に対応する）
【００８８】
【化３】
Ｐは、好ましくは、以下から選択され得る：
配列番号１２ （遺伝子型Ｃの残基２〜４８）、
配列番号４ （遺伝子型Ｃの残基（−１１）〜４８）
配列番号１３ （遺伝子型Ｃの残基２〜２１），
配列番号１４ （遺伝子型Ｃの残基５〜２１）、および
配列番号１５ （遺伝子型Ｃの残基９〜１５）。
【００８９】
遺伝子型Ｃ配列の好ましい実施形態において、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、以下の式のものである：
Ｈｍ−Ｐ−Ｒｎ，
ここで、好ましくは、
Ｐは、配列番号１２のアミノ酸配列または少なくとも１０個連続するアミノ酸のこの配列のＮ末端および／もしくはＣ末端が短縮された改変体、またはこれらの改変アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはペプチド模倣物を含む誘導体を含む、ｐｒｅＳ由来ペプチドであり；
Ｈは、上記ｐｒｅＳ由来ペプチド Ｐの疎水性改変であり、上記疎水性改変は、ＰのＮ末端のものあり、かつアシル化および疎水性部分の付加から選択され；
Ｒは、上記ｐｒｅＳ由来ペプチド ＰのＣ末端改変であり；
ｍは、少なくとも１であり；そして
ｎは、０または少なくとも１である。
【００９０】
本発明の好ましいペプチドは、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染の阻害のために、急性ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染の予防のために、ならびに／またはＢ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎の処置のために、特に有効である。
【００９１】
好ましくは、Ｐは、配列番号１２のアミノ酸配列（遺伝子型Ｃの残基２〜４８）を含むか、またはこれからなる。
【００９２】
また、好ましくは、Ｐは、配列番号１２のアミノ酸配列の改変体を含み、ここで改変体は、配列番号１２の少なくとも１０個連続するアミノ酸残基（好ましくは、残基９〜１８）、より好ましくは、１５個もしくは２０個連続するアミノ酸配列を含み、配列番号１２の１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個もしくはこれ以上のアミノ酸残基からなり得る。
【００９３】
好ましくは、Ｐ中に含まれる配列番号１２の連続するアミノ酸残基は、以下から選択される：
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基９〜１５ ［＝配列番号１５］、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜１５、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基９〜１８、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜１８、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜２０、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜２１ ［＝配列番号１３］、
遺伝子型Ｃアミノ酸残基５〜２１ ［＝配列番号１４］、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜２５、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜３０、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜３５、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜４０、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜４５、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜４６、もしくは
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜４８ ［＝配列番号１２］。
【００９４】
一実施形態において、Ｐは、配列番号１２のそれぞれ残りのアミノ酸残基、すなわち、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基１６〜４８、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基１９〜４８、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２１〜４８、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２２〜４８、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２６〜４８、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基３１〜４８、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基３６〜４８、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基４１〜４８、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基４６〜４８、もしくは
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基４７〜４８、
を含み、これらは、配列番号１２のそれぞれのアミノ酸残基に同一であるか、またはそれらの誘導体であるかのいずれかである。
ここで誘導体は、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、改変アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはペプチド模倣物から選択される少なくとも１個の改変を含み、
ここで上記少なくとも１個の改変は、１個、２個、３個、４個、５個もしくはこれ以上の改変である。
【００９５】
好ましいアミノ酸置換は、本明細書に記載されている。
【００９６】
好ましくは、Ｐは、以下から選択されるアミノ酸配列を含む：
−配列番号１２のアミノ酸残基２〜１５、およびこれに隣接して、配列番号１２のアミノ酸残基１６〜４８の誘導体を含むアミノ酸配列；
−配列番号１２のアミノ酸残基２〜２０、およびこれに隣接して、配列番号１２のアミノ酸残基２１〜４８の誘導体を含むアミノ酸配列；
−配列番号１２のアミノ酸残基２〜２５、およびこれに隣接して、配列番号１２のアミノ酸残基２６〜４８の誘導体を含むアミノ酸配列；
−配列番号１２のアミノ酸残基２〜３０、およびこれに隣接して、配列番号１２のアミノ酸残基３１〜４８の誘導体を含むアミノ酸配列；
−配列番号１２のアミノ酸残基２〜３５、およびこれに隣接して、配列番号１２のアミノ酸残基３６〜４８の誘導体を含むアミノ酸配列；
−配列番号１２のアミノ酸残基２〜４０、およびこれに隣接して、配列番号１２のアミノ酸残基４１〜４８の誘導体を含むアミノ酸配列；
−配列番号１２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列；
ここで誘導体は、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、改変アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはペプチド模倣物から選択される少なくとも１個の改変を含み、
ここで上記少なくとも１個の改変は、１個、２個、３個、４個、５個もしくはこれ以上の改変である。
【００９７】
遺伝子型Ｃ配列の好ましい実施形態において：
Ｐは、配列番号１２、またはそれぞれに記載される改変体／誘導体／改変から選択されるアミノ酸配列を含み、
Ｈは、ミリストイル（Ｃ１４）もしくはステアロイル（Ｃ１８）、好ましくは、ミリストイル（Ｃ１４）でのアシル化による疎水性改変である。
【００９８】
ミリストイル化による改変は、その高い安全性（例えば、ステアロイル基の悪影響（先天的免疫応答など）がない）に起因して、インビボおよび医学的適用で好ましい。
【００９９】
従って、本発明のより好ましい疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、
ＨＢＶｐｒｅＳ／（−１１）−４８ミリストイル（Ｃ） ［配列番号４］
ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ミリストイル（Ｃ） ［配列番号１２］
ＨＢＶｐｒｅＳ／２−２１ミリストイル（Ｃ） ［配列番号１３］
ＨＢＶｐｒｅＳ／５−２１ミリストイル（Ｃ） ［配列番号１４］
ＨＢＶｐｒｅＳ／９−１５ミリストイル（Ｃ） ［配列番号１５］、
であり：もっとも好ましくは、
ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ミリストイル（Ｃ） ［配列番号１２］
である。
【０１００】
上記ｐｒｅＳ由来ペプチドＰの上記Ｃ末端改変（Ｒ）は、好ましくは、分解（例えば、インビボでの分解）から保護する部分での改変である。
【０１０１】
「Ｃ末端のもの」は、Ｃ末端（すなわち、それぞれの最後のアミノ酸残基）における改変をいうが、上記Ｃ末端付近（例えば、最後から２番目のアミノ酸残基、最後から４番目のアミノ酸残基しくはそれ以降のアミノ酸残基における改変（例えば、酵素分解（例えば、カルボキシペプチダーゼの作用による）からキャリアを保護する１個のＤアミノ酸の導入）もまた含む。
【０１０２】
当業者は、それぞれの適用に依存して、それぞれの適した部分を選択し得る。
【０１０３】
分解から保護する好ましい部分は、アミド、Ｄ−アミノ酸、改変アミノ酸、環状アミノ酸；天然および合成のポリマー（例えば、ＰＥＧ、ｇｌｙｃａｎｅ）から選択される。
【０１０４】
一実施形態において、Ｐは、ペプチドもしくはタンパク質（好ましくは、アルブミン、ヒトＩｇＧのＦｃドメインから選択される）に融合される。
【０１０５】
上記融合は、好ましくは、ＰのＣ末端のものである。
【０１０６】
さらに、ｎは、０または少なくとも１である（すなわち、Ｃ末端改変（Ｒ）は、選択肢的である）。
【０１０７】
好ましくは、ｎは、１である。
【０１０８】
本発明のさらなる実施形態において、ｎは、１、２、３、４もしくはこれ以上である。すなわち、上記ＰのＣ末端もしくはその付近は、１個より多くの部分もしくは基（例えば、２個）で改変され得る。上記部分もしくは基は、互いに同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【０１０９】
本発明の一実施形態において、Ｈおよび／もしくはＲは、リンカーもしくはスペーサーを介してＰに連結される。
【０１１０】
リンカーもしくはスペーサーは、当業者に公知であり、例えば、ポリアラニン、ポリグリシン、糖質、（ＣＨ２）ｎ基がある。
【０１１１】
当業者は、従って、それぞれの適用に依存して、それぞれの適切なリンカーもしくはスペーサーを選択し得る。
【０１１２】
好ましい実施形態において、本発明に従う疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、標識もしくはタグ（好ましくは、蛍光色素、放射性同位体および造影剤から選択される）を有する。
【０１１３】
好ましい放射性同位体は、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９９ｍＴｃ、１８Ｆ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、１７７Ｌｕである。
【０１１４】
好ましい蛍光色素は、Ａｌｅｘａ色素、ローダミンおよびフルオレセインの誘導体、Ｃｙ−色素である。
【０１１５】
好ましい造影剤は、ガドリニウム（Ｇｄ）錯体、超磁性鉄（Ｆｅ）錯体および粒子、より高い原子番号の原子を含む化合物（すなわち、コンピュータートモグラフィー（ＣＴ）用のヨウ素、マイクロバブルおよびキャリア（例えば、これら造影剤を含むリポソーム）である。
【０１１６】
本発明のペプチドは、当業者に公知の種々の手順によって、一般に、合成化学手順および／もしくは遺伝子操作手順によって、調製され得る。
【０１１７】
合成化学手順としては、より具体的には、固相逐次合成およびブロック合成（１１）が挙げられる。上記固相逐次手順は、確立された自動化方法を使用して（例えば、自動化ペプチド合成器の使用によって）行われ得る。この手順において、α−アミノ保護されたアミノ酸は、樹脂支持体に結合される。上記使用される樹脂支持体は、（ポリ）ペプチドの固相調製のために当該分野で従来から使用されている任意の適切な樹脂（好ましくは、ポリオキシエチレンと共重合化されて、最初に導入されたｏ−編みの保護されたアミノ酸とエステル形成のための部位を提供するポリスチレン）であり得る。この最適化された方法は、本発明者らによって適用され、明確に記載されてきた（例えば、１２を参照のこと）。上記アミノ酸は、１個ずつ（段階的に）導入される。１個のアミノ酸の導入に対応する各合成サイクルは、脱保護工程、連続洗浄抗体、上記アミノ酸の活性化を伴うカップリング工程、およびその後の洗浄工程を包含する。これら工程の各々似続いて、濾過が行われる。カップリングのための反応性薬剤は、（ポリ）ペプチド合成のための伝統的な反応性薬剤（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ヒドロキシベンゾトリアゾール、ベンゾトリアジル−１−イル−オキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、およびジフェニルホスホリルアジド）である。上記樹脂上でのポリペプチドの合成の後に、上記ポリペプチドは、アニソール、エタンジチオールもしくは２−メチルインドールの存在下で、強酸（例えば、トリフルオロ酢酸）で処理することによって、上記樹脂から分離される。次いで、上記化合物は、伝統的な精製技術（特に、ＨＰＬＣ）によって精製される。
【０１１８】
本発明のペプチドはまた、選択的に保護されている（ポリ）ペプチドフラグメントをカップリングすることによって、得られ得、このカップリングは、例えば、溶液中で行われる。
【０１１９】
上記ペプチドはさらに、例えば、当業者に公知の遺伝子操作技術によってさらに生成され得る。真核生物発現系（例えば、バキュロウイルス系）は、特に適している。この手順によれば、タンパク質は、異種タンパク質をコードする核酸配列および調節核酸配列（例えば、プロモーター）を含む組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞において発現される。いくつかの細胞株は、組換えバキュロウイルスでの感染に利用可能である（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手可能な細胞株Ｓｆ−９（ＣＲＬ １７１１））。原核生物発現系（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現はまた、特に適している。
【０１２０】
上記ペプチドへの上記疎水性部分の導入は、当業者に容易に公知である種々の手順（合成および遺伝子操作アプローチが挙げられる）によって達成され得る。
【０１２１】
あるいは、上記ペプチドおよび／もしくは融合ペプチド（すなわち、疎水性改変ペプチド）は、ＣＨＯおよび当該分野で公知であり、かつ通常ワクチンなどを生成するために使用される他の細胞株のような、安定にトランスフェクトした真核生物細胞株によって生成され得る。Ｎ末端の４７個のｐｒｅＳ１アミノ酸が、ミリストイル化タンパク質／ペプチドの分泌を促進するというその本質的な特性に起因して、上記生物学的に活性な疎水性改変ペプチドは、細胞培養上清から抽出され得る。
【０１２２】
（本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドの特徴）
本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、融通の利く肝炎ウイルス侵入インヒビターであり、また、肝臓向性（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｓｍ）／肝臓向性（ｌｉｖｅｒ ｔｒｏｐｉｓｍ）（すなわち、それらは、肝臓を標的とする）を示す。上記肝臓向性は、特に、図１１に示される。
【０１２３】
上記肝臓向性は、本発明者らの対応米国仮特許出願（同日に出願され、その全体が本明細書に参考として援用される、発明の名称「Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｅＳ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ （ＨＢＶ） ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ａｓ ｖｅｈｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｔｏ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ」）においてさらに開示されている。
【０１２４】
本発明のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、インビトロ（例えば、肝細胞へのＨＢＶ粒子の結合および／もしくはインターナリゼーションを防止することによって）またはインビボかのいずれかで、ＨＢＶの非常に適切かつ有効な侵入インヒビターであるが、ＨＤＶについても同様である。
【０１２５】
図面および実施例から認められ得るように、本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、高い阻害活性を有し、すなわち、これらは、非常に低用量において、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染を効率的に阻害する。上記より好ましい実施形態のＩＣ５０値は、０．０１〜５００ｎＭ、好ましくは、０．０２５〜５０ｎＭ、より好ましくは、０．０５〜２５ｎＭの範囲内である。表１もまた参照のこと。
【０１２６】
遺伝子型Ｃに由来する本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、その対応する遺伝子型Ｄのものよりも強力にＨＢＶ感染を阻害する。
【０１２７】
さらに、本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、免疫原性エピトープを含まないが、強い阻害活性をなお示すように、調節され得る（例えば、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−２１ステアロイル）。これは、その配列中に上記免疫原性エピトープを含まないが、約８ｎＭのＩＣ５０をなお有する。
【０１２８】
本発明のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドはまた、ＨＢＶ 遺伝子型ＣおよびＤを交叉予防し得る。なぜなら、遺伝子型Ｃに由来するペプチド（例えば、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−２１ステアロイル（Ｃ）もしくはＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ミリストイル（Ｃ））は、ＨＢＶ遺伝子型Ｄの侵入を阻害し得るからである。
【０１２９】
（薬学的組成物およびワクチン組成物）
上記で概説されるように、本発明は、本明細書で定義される少なくとも１つのＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド、ならびに必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアおよび／もしくは賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。
【０１３０】
本発明に従う薬学的組成物は、以下を含む：
−本明細書で定義される少なくとも１つのＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド；
−本明細書で定義される結合体；および
−必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアおよび／もしくは賦形剤。
【０１３１】
本発明に従う薬学的組成物は、本明細書で記載される使用および方法のすべてに非常によく適している。
【０１３２】
上記で概説されるように、本発明は、本明細書で定義される少なくとも１つのＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド、ならびに必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアおよび／もしくは賦形剤を含むワクチン組成物を提供する。
【０１３３】
本発明に従うワクチン組成物は、本明細書に記載される使用および方法に非常によく適している。
【０１３４】
「薬学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤」とは、本発明に従う薬学的組成物もしくはワクチン組成物がそこでもしくは一緒に処方され得る任意のビヒクルをいう。これは、生理食塩水（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水）を含む。一般に、希釈剤もしくはキャリアは、投与の態様および経路、ならびに標準的な薬学的実務に基づいて選択される。
【０１３５】
（医学的適用）
上記で概説されるように、本発明は、ＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドおよび／もしくは本発明のそれぞれの薬学的組成物の第１の医療用途を提供する。
【０１３６】
従って、本発明に従うＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは薬学的組成物は、疾患の診断、予防および／もしくは処置のために適切であり、従って、そのために提供される。
【０１３７】
上記で概説されるように、本発明は、特定の疾患の診断、予防および／もしくは処置のために、本発明のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドおよび／もしくはそれぞれの薬学的組成物をさらに提供する。
【０１３８】
好ましい実施形態において、本発明のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは薬学的組成物は、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染の阻害ために；ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶの一次感染の予防のために、ならびに／またはＢ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎の処置のために、好ましくは、慢性Ｂ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎の処置のために、提供される。
【０１３９】
好ましい実施形態において、本発明のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは薬学的組成物は、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染の阻害のための；ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶの一次感染の予防のための、ならびに／またはＢ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎の処置のための医薬の製造のために、使用される。
【０１４０】
好ましくは、本発明のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは薬学的組成物は、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染の阻害のために提供される。
【０１４１】
好ましくは、本発明のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは薬学的組成物は、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶの一次感染の予防のために提供される。
【０１４２】
好ましくは、ＨＢＶの任意の遺伝子型のＨＢＶ感染が、阻害されるかもしくは予防される。
【０１４３】
本発明のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、ＨＢＶ 遺伝子型ＣおよびＤを交叉予防し得る。なぜなら遺伝子型Ｃに由来するペプチド（例えば、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−２１ステアロイル（Ｃ）もしくはＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ミリストイル（Ｃ））は、ＨＢＶ 遺伝子型Ｄの侵入を阻害し得るからである。
【０１４４】
好ましい実施形態において、本発明のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは薬学的組成物は、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶの侵入インヒビターとして使用される／提供される。
【０１４５】
好ましくは、本発明のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは薬学的組成物は、Ｂ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎の、特に慢性Ｂ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎の処置のために提供される。
【０１４６】
本発明のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、インビトロ（例えば、肝細胞へのＨＢＶ粒子の結合および／もしくはインターナリゼーションを防止することによって）またはインビボのいずれかで、ＨＢＶ、しかしまた、ＨＤＶの非常に適切かつ有効な侵入インヒビターである。
【０１４７】
さらに、本発明は、ＨＢＶによる肝細胞感染のインビトロ阻害のための方法を提供し、上記方法は、上記疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは薬学的組成物を使用する工程を包含する。
【０１４８】
適切な肝細胞としては、ヒト初代肝細胞もしくは肝癌由来細胞株ＨｅｐａＲＧ（２２）（特許出願ＦＲ ０１０９０４４に記載される）、Ｔｕｐａｉａ ｂｅｌａｎｇｅｒｉ由来の肝細胞（２３）が挙げられ、これらはまた、ＨＢＶ感染に感受性である。
【０１４９】
さらに、および上記で概説されるように、本発明は、本発明のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは薬学的組成物を利用することによって、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染を阻害するための方法；ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶの一次感染を予防するための方法、ならびに／または（慢性）Ｂ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎を処置するための方法を提供する。
【０１５０】
（投与経路）
好ましくは、本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは薬学的組成物の投与経路は、皮下、静脈内、経口、経鼻、筋肉内、経皮、吸入可能なもの、坐剤によるものから選択される。
【０１５１】
経鼻投与もしくは適用のための好ましい実施形態は、鼻用スプレーである。
【０１５２】
（治療上有効な量）
本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは薬学的組成物は、それらが上記薬学的組成物で、治療上有効な量の上記疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドを含むように、提供される。
【０１５３】
本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは薬学的組成物の「治療上有効な量」とは、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染を阻害するために；ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶの一次感染を予防するために；Ｂ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎を処理するために、そして／あるいはインビボでＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶに対するワクチン接種する、ならびに／またはその侵入を阻害するのに十分である量をいう。
【０１５４】
好ましい、治療上有効な量は、１ｋｇ 体重あたり、１０μｇ〜１ｍｇ、好ましくは、１０μｇ〜１００μｇの範囲内である。
【０１５５】
ワクチンとしての本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドの使用については、上記好ましい治療上有効な量は、１ｋｇ体重あたり、１０μｇ〜１ｍｇの範囲内である。
【０１５６】
約１０ｎＭという、使用される疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドのＩＣ５０値の場合、好ましい治療上有効な量は、約１００μｇ／ｋｇ体重であるか、または患者１名あたり１〜５ｍｇの範囲内である。患者１名あたり１〜５ｍｇの範囲内の上記好ましい治療上有効な量は、１日に１階投与され得るか、または他の実施形態においては、わずか２〜３日ごとに１階投与され得る。
【０１５７】
上記好ましい治療上有効な量は、それぞれの適用、および望ましい阻害、処置もしくはワクチン接種の結果に依存する。
【０１５８】
当業者は、適切な治療上有効な量を決定し得る。
【０１５９】
（ＨＢＶレセプターの同定）
本発明はさらに、ＨＢＶの結合および／もしくは侵入に関与する肝細胞レセプターのインビトロおよび／もしくはインビボでの同定、ならびに／または上記の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドを使用する工程を包含する、上記レセプターの発現の定量のための方法に関する。
【０１６０】
上記肝細胞レセプターは、哺乳動物もしくはそれぞれの動物モデル（好ましくは、マウスもしくはヒト）において同定され得る。
【０１６１】
特に、上記方法は、以下の工程を包含する：
−肝臓生検物もしくは肝細胞と、本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドとを、肝細胞の表面において発現されるレセプターへの上記ペプチドの特異的結合を可能にするに十分な条件下および期間にわたって、接触させる工程；
−レセプターへの上記ペプチドの結合を決定する工程；および
−上記レセプターを同定する工程。
【０１６２】
これは、当業者によって周知の古典的手順に従って達成され得る。例えば、これは、本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドの放射活性標識、酵素標識もしくは経口標識、および適切な方法でのその後の検出を包含し得る。多くの蛍光物質が公知であり、標識として利用され得る。これらとしては、例えば、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＤＩＧＥ標識が挙げられる。酵素標識は、目的の分子（例えば、ポリペプチド）への酵素の結合体化を含み、比色的技術、分光光度的技術、もしくは蛍光分光光度的技術のいずれかによって検出され得る。
【０１６３】
本発明者らは、インビトロおよびインビボでＨＢＶ侵入を効率的にブロックする、ＨＢＶ−ｐｒｅＳ１−表面タンパク質由来リポペプチドを同定した。これら阻害性ペプチドに関する本発明の生体分布研究は、上記ペプチドが、肝臓中に選択的に蓄積され、ここで肝細胞へ結合し、そしておそらく肝細胞へ侵入することを明らかにした。この肝細胞向性は、上記ペプチドのＮ末端アシル化を要し、Ｎ末端の４７個のｐｒｅＳ１アミノ酸内の（すなわち、上記アミノ酸残基２〜２１（もしくは好ましくは、残基９〜１５の最小配列）内の）特定のＨＢＶ ｐｒｅＳ配列モチーフに依存する。このペプチド配列が、形質膜を横断してさらに完全な融合タンパク質の輸送を促進する膜移動シグナル（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）をさらに有する（未発表結果）という本発明者らの観察は、任意の種の薬物を、肝細胞の形質膜へ特異的に送達するか、またはこの細胞へすら選択的に送達するという可能性を開く。
【０１６４】
本発明者らは、ＨＢＶ ｐｒｅＳ１由来リポペプチドが、移植されたｕＰＡ−ＲＡＧ−１マウスモデルにおいて、非常に低用量でＨＢＶ感染を完全に予防し得ることを示した。これらＨＢＶｐｒｅＳ由来侵入インヒビターに関する薬物動態研究はさらに、並外れて高い血清安定性（ｔ１／２ 約６０時間）と合わせて、顕著な肝臓向性、および標的器官における長期の半減期（ｔ１／２ 約２４時間）を示した。Ｎ末端アシル化および上記ペプチドの特定のアミノ酸配列の完全性の両方が、必要である。上記ペプチドは、従って、肝細胞の感染を抑えるために、または肝細胞癌を処置するために、肝臓特異的薬物標的化のための融通の利くベクターとしても使用され得る（同日付で出願された発明の名称「Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｅＳ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ （ＨＢＶ） ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ａｓ ｖｅｈｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｔｏ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ」の本発明者らの対応米国仮特許出願もまた参照のこと）。
【０１６５】
本発明者らは、ＷＭＨＢＶ感染が、インビボでのＨＢＶエンベロープタンパク質由来ペプチドの皮下適用を介して効率的にブロックされ得るという原理をさらに証明した。このことは、急性ＨＢＶ感染の予防および慢性Ｂ型肝炎の治療選択肢のための新たな展望を開く。本発明において使用される上記ｕＰＡ／ＲＡＧ−２／Ｐｆｐマウスは、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞を欠いているので、感受性肝細胞に対する上記ペプチドの直接的阻害効果が評価される。このことは、肝臓におけるアシル化ｐｒｅＳ由来ペプチドの効率的蓄積、続いて、胆管経路をおそらく介するゆっくりとしたクリアランスによって裏付けられる。両方の特性が、非常に低用量かつ低頻度での皮下適用を可能にする。５日以内で０．２ｍｇ／ｋｇ ＨＢＶ／ｐｒｅＳ２−４８ミリストイルの５回の注射が、ＷＭＨＢＶ感染の樹立の予防を生じたと仮定すると、約３０倍以上の活性ペプチドＨＢＶ／ｐｒｅＳ２−４８ステアロイルの連続投与は、７μｇ／ｋｇ未満の用量において、毎日もしくは２日ごとに与えられる場合には約１３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で有効であり得る。マウスにおいて得られた体重あたり、効率的な薬理学的用量が、約１０倍してヒトについて較正されなければならない（１３）ことを考慮に入れると、一人あたりの有効用量は、１００μｇ／日より低いと予測される。
【０１６６】
慢性ＨＢＶ感染の処置のためのヌクレオシド（ヌクレオチド）アナログベースのレジメンは、しばしば、耐性変異体の選択を生じた（４，１４）。このことは、ＨＢＶ複製サイクルの異なる工程に対処する、代替のストラテジーおよび新たな薬物を要求する。ＨＢＶリポペプチドでの侵入阻害は、このようなアプローチを代表する。作用様式に依存して、本発明者らは、任意の種のヌクレオシド（ヌクレオチド）耐性変異体に対する有効性を想定する。さらに、上記ペプチドの活性は、上記ｐｒｅＳ１ドメインにおける保存された配列を要する（１５）ので、上記ペプチドは、任意のＨＢＶ−遺伝子型に対して活性である。ＨＩＶ ｇｐ４１タンパク質を標的とし、従って、分子内代償変異の出現を可能にするＦｕｚｅｏｎ（登録商標）とは対照的に、以前の研究は、アシル化ＨＢＶ−リポペプチドが、細胞成分に対処して、ＨＢＶとそのレセプターとの相互作用を防止することを示す（１６，１７）。従って、耐性変異体の出現は、ありそうにないようである。
【０１６７】
ＨＢＶｐｒｅＳ由来リポペプチドの臨床的適用のための明らかな適応症は、まだ樹立されていないＨＢＶ感染の予防（例えば、曝露後予防、垂直伝播もしくは肝臓移植の再感染の予防）である。しかし、侵入インヒビターはまた、例えば、インターフェロンαもしくはウイルスＲＴのインヒビターとの組み合わせにおいて、慢性的に感染した患者において有効である。ＨＢＶ慢性感染の維持は、一方では、免疫系によって一掃された感染肝細胞の動的ターンオーバーに、および他方では、治癒した細胞／未感染細胞（ｎａｉｖｅ ｃｅｌｌ）の（再）感染に依存し得る（１８）ので、感染の広がりを抑制し、かつ抗ウイルス処置かで耐性株の出現を抑制するために、ｕＰＡキメラ系におけるこのような治療アプローチの効力を評価することは、興味深い（１９）。
【０１６８】
ＨＢＶｐｒｅＳ由来リポペプチドはまた、ＨＤＶ（肝細胞への侵入のためにＨＢＶエンベロープタンパク質を利用するサテライトウイルソイド）のインビトロ感染を阻害する（１５，１７，２０）。今日までに、ＨＤＶ乾癬の有効な治療は存在しなかったので、ｐｒｅＳ由来リポペプチドは、このしばしば複雑化した肝臓疾患の第１の選択的治療を代表する。
【０１６９】
免疫能のある患者におけるＨＢＶｐｒｅＳ由来リポペプチドの適用は、細胞性免疫反応および体液性免疫反応を誘発する。このことは、治療結果にとって有益である。なぜなら、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８のエピトープを認識する抗体は、インビトロでのＨＢＶ感染を中和することが公知だからである（２１）。さらに、天然の感染におけるウイルス排除は、ＨＢＶｐｒｅＳ特異的免疫の連続的確立を要することが推測された。従って、ウイルス侵入の直接的介入に加えて、上記ペプチドによるｐｒｅＳ特異的免疫応答の刺激は、細胞溶解性もしくは非細胞溶解性免疫反応を介して、特に、ＩＦＮαと組み合わせて、ウイルス排除に寄与し得る。
【０１７０】
【表１−１】
【０１７１】
【表１−２】
ミリストイルとは、上記Ｎ末端のミリストイル化をいう；
パルミトイルとは、Ｎ末端のパルミトイル化をいう；
ステアロイルとは、Ｎ末端のステアロイル化をいう；
（Ｃ）とは、遺伝子型Ｃ（配列番号４におけるように、Ｑ４６Ｋを有する）をいう；
（Ｄ）とは、遺伝子型Ｄをいう；
＊ペプチドは、図に示される；
＊＊最小配列。
【０１７２】
【表２】
ミリストイルとは、Ｎ末端のミリストイル化をいう；
ステアロイルとは、Ｎ末端のステアロイル化をいう；
（Ｃ）とは、遺伝子型Ｃ（配列番号４におけるように、Ｑ４６Ｋを有する）をいう；
（Ｄ）とは、遺伝子型Ｄをいう。
【０１７３】
【表３】
図３もまた参照のこと。
ここで（Ｃ）とは、ＨＢＶ 遺伝子型Ｃ Ｑ４６Ｋをいう。
【０１７４】
【表４】
図４もまた、参照のこと。
【０１７５】
【表５】
図５もまた、参照のこと。
【０１７６】
【表６】
図６もまた、参照のこと。
【０１７７】
【表７】
図７もまた参照のこと。
【０１７８】
【表８】
配列番号１６のレトロインベルゾアミノ酸配列は、Ｃ末端からＮ末端の方向。
図８もまた参照のこと。
【０１７９】
【表９】
図９もまた参照のこと。
【実施例】
【０１８０】
（方法）
（ＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドの合成）
合成を、例えば、（１６）に記載されるように行った。
【０１８１】
（細胞株および初代細胞培養物）
ＨｅｐａＲＧ細胞を、ウイリアムのＥ培地（１０％ ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００ユニット／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、５μｇ／ｍｌ インスリンおよび５×１０−５Ｍ ヒドロコルチゾンヘミスクシネートを補充）中で増殖させた（１６）。細胞を、２週間ごとにトリプシン処理によって１／５を継代した。感染の２〜３週間前に、細胞分化を、２％ ＤＭＳＯを維持培地に添加することによって誘導した。上記培地を、２〜３日ごとに交換した。
【０１８２】
（感染競合アッセイ）
感染性接種物として、制限なしの供給および一定の品質があるので、ＨｅｐＧ２クローン２．２．１５（２３）細胞の５０倍濃縮した培養培地を使用した。これを、新たに集めた上清から、６％ ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００の存在下でウイルス粒子を沈殿させることによって調製した。そのペレットを、２５％ ＦＣＳを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で懸濁した。アリコートを、−８０℃において保存した。分化したＨｅｐａＲＧ細胞もしくはＰＨＨを、２０時間にわたって３７℃において、４％ ＰＥＧ ８０００（Ｓｉｇｍａ）を補充した培養培地中で１０倍希釈した上記濃縮した感染源とともにインキュベートした。上記インキュベーションの最後に、細胞を、上記培養培地で３回洗浄し、２％ ＤＭＳＯおよび５×１０−５Ｍ ヒドロコルチゾンヘミスクシネートの存在下で維持し、示された時間において採取した。
【０１８３】
競合実験を、１２ウェルプレートにおいて行った。約１×１０６細胞を最初に、３０分間にわたって、化学的に合成したＨＢＶ由来ペプチドとともに予備インキュベートし、続いて、細胞と、ペプチドおよびウイルスとを２０時間にわたって同時インキュベートした。すべての競合シリーズを、少なくとも２回行い、１つの代表的実験の結果を、各場合において示す（図３〜７を参照のこと）。
【０１８４】
ＨｅｐａＲＧ細胞を、以下の非存在（０ｎＭ）下もしくは存在下でいずれかに感染させた：
−以下を１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭ、および２０００ｎＭ
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ミリストイル（Ｄ）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ミリストイル（Ｃ）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／（−１１）−４８ミリストイル（Ｃ）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｃ）および
・ＨＢＶｐｒｅＳ／（−１１）−４８ステアロイル（Ｃ）；または
−以下を０．１２５ｎＭ；０．２５ｎＭ；０．５ｎＭ；０．７５ｎＭおよび１ｎＭ
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ミリストイル（コンセンサス）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ ステアロイル（コンセンサス）、
−以下を１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭおよび１０００ｎＭ
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｄ）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−１５ステアロイル（Ｄ）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−２１ステアロイル（Ｄ）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−２６ステアロイル（Ｄ）および
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−３３ステアロイル（Ｄ）；または
−以下を１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎＭ
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｄ），
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−３３ステアロイル（Ｄ），
・ＨＢＶｐｒｅＳ／５−３３ステアロイル（Ｄ），
・ＨＢＶｐｒｅＳ／５−４８ステアロイル（Ｄ），
・ＨＢＶｐｒｅＳ／９−３３ステアロイル（Ｄ）および
・ＨＢＶｐｒｅＳ／９−４８ステアロイル（Ｄ）；または
−以下を１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎＭ
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｄ）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｄ−ＡＳ１１−１５）（Ｄ）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ａｌａ１１−１５）（Ｄ）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Δ１７−２１）（Ｄ）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ａｌａ１７−２１）（Ｄ）；または
−以下を１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎＭ
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（レトロインベルソ）（Ｄ）および
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ａｌａ２１，２３，２９，３０）（Ｄ）；または
−以下を１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎＭ
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ａｌａ１８）（Ｄ）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Δ１１−１５）（Ｄ）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｓｅｒ１３）（Ｄ）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ａｒｇ１１）（Ｄ）；または
−以下を５０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２５０ｎＭ、および１０００ｐＭ（０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．２５ｎＭ、および１ｎＭ）
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ミリストイル（Ｃ）および
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｃ）、
ここで（Ｃ）とは、ＨＢＶ 遺伝子型Ｃ Ｑ４６Ｋをいう。
【０１８５】
感染性接種物（遺伝子型ＤのＨＢＶ）および上記ペプチドを一晩インキュベートした。洗浄後、細胞を、さらに１２日間にわたって維持して、ウイルス遺伝子発現を可能にした。８〜１２日目の細胞培養上清を採取し、市販の定量的ＥＬＩＳＡを使用して、分泌ＨＢＳＡｇについて分析した。それぞれの不完全感染からのＨＢｓＡｇ値を、１００％に設定し、感染阻害の程度を、不完全感染の％単位で与える。
【０１８６】
結果を、図３〜９および図１２、同様に、表３〜９に示す。
【０１８７】
（疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドの生体分布）
上記疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドの生体分布を、雄性ＮＭＲＩマウスにおいて研究した。すべての実験を、ドイツ法に従って行った。Ｃ末端においてさらなるＴｙｒ−残基を含む上記ペプチドを、１３１Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で、クロラミン−Ｔ法によって標識し、ＨＰＬＣによって精製した。上記標識ペプチドを、５０％ ＤＭＳＯ中の溶液の注射によって皮下注射した。選択した時間において、マウスを屠殺し、血液、心臓、脾臓、肝臓、腎臓、筋肉および脳中に含まれる放射活性を、γ−カウンター（Ｃａｎｂｅｒｒａ Ｐａｃｋａｒｄ，Ｒｕｅｓｓｅｌｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定し、注射用量／ｇ 組織のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）として表した。
【０１８８】
（肝臓から抽出した後の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドの安定性評価）
肝臓における上記ペプチド安定性を決定するために、１３１Ｉ標識したＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ミリストイル（Ｄ）を、皮下注射の２４時間後に肝臓１葉から抽出した。その目的のために、１ｇ 凍結肝臓組織あたり１ｍｌ 水を、上記サンプルに添加した。均質化した後、等容積のアセトニトリルを添加し、上記均質化を反復した。遠心分離（４０００×ｇで２×１０分）後、この溶液を、逆相ＨＰＬＣカラム上で分離し、その各画分の放射活性を、γカウンターで定量した。
【０１８９】
前述の説明において、特許請求の範囲においておよび／もしくは添付の図面において開示される特徴は、別個に、およびこれらの任意の組み合わせの両方において、本発明をその多様な形態において実現するために必須であり得る。
【０１９０】
参考文献
【０１９１】
【化４−１】
【０１９２】
【化４−２】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサス配列に由来し、Ｎ末端が好ましくはアシル化され、そして必要に応じてＣ末端が改変されている、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドに関する。これらＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、非常に効率的なＨＢＶ侵入インヒビター、ならびにＨＤＶ侵入インヒビターであり、従って、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染の阻害、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶの一次感染の予防、ならびに（慢性）Ｂ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎の処置に適している。本発明はさらに、これらＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドを含む、薬学的組成物およびワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
今日、約２０億もの人々が、ＨＢＶの血清学的マーカーを有している。そのうちの約４億人が、ＨＢＶに慢性的に感染している。疾病管理予防センター（ＣＤＣ）によれば、慢性ＨＢＶ感染者のうちの１５〜２５％は、適切な処置を受けなければ、１０年以内に肝細胞癌（ＨＣＣ）を発症させる傾向がある（１）。ＨＢＶ関連ＨＣＣは、予後不良であり、従って、ＨＢＶは、世界保健機関（ＷＨＯ）によって、もっとも重要な天然に存在するヒトの発癌物質として分類された。予防的ワクチンの存在にも関わらず、感染数は、世界人口の増加および経済的に困窮した国々における予防の限界に起因して、来るべき１０年間において上昇する。
【０００３】
先進国において、ＨＢＶは、非経口経路を介して主に伝染する。実際に感染した、免疫能のある固体のうちの９０〜９５％は、このウイルスを一掃し、それによって、寿命の長さの免疫防御を得る。彼らのうちの約５〜１０％は、慢性Ｂ型肝炎を発症させる（ドイツにおいて３００，０００〜５００，０００人）。対照的に、非常に蔓延した地域（特に、中央アフリカおよび東アジア）においては、伝染の主な態様は、母から子への垂直感染である。不運なことに、完全に免疫能があるわけではない子供の感染は、この疾患について、９０〜９８％の慢性経過をたどる。Ｂ型肝炎関連ＨＣＣは、従って、これらの国々においてもっとも一般的な悪性疾患である。
【０００４】
慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の処置について現在承認されている治療レジメンは、すでに確立された感染の後にウイルス・ゲノムの複製工程に対処する（ラミブジン、アデフォビル、エンテカビル）か、または免疫系のモジュレーターとして作用する（インターフェロンα）かのいずれかである。不運なことに、上記患者のうちのわずか１０〜２５％が、このような治療に対して持続したウイルス学的応答を残しているに過ぎず、これは、とりわけ、ヌクレオチド（ヌクレオシド）耐性変異体の素早い選択を示している。予防的ワクチンの利用可能性にもかかわらず、その結果、これまで影響を受けていない複製工程（例えば、ウイルス侵入）を標的とする新規な治療剤を開発することは、最も重要である。
【０００５】
ウイルス侵入の特異的阻害は、急性および慢性感染を制御しかつ最終的に排除するための魅力的な治療概念である。ＨＩＶについては、ウイルス侵入への介入は、３６アミノ酸（Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標））からなるｇｐ４１タンパク質由来ペプチドによって首尾よく達成されてきた。このペプチドは、ウイルス膜と細胞膜との融合を妨げる（２）。
【０００６】
予防的ワクチンおよび逆転写酵素（ＲＴ）インヒビターの利用可能性にもかかわらず、ＨＢＶ感染の人数および全世界でのＨＢＶ関連の死亡数（現在では約５００，０００人／年）は、増加しつつある。原発性肝臓癌の約２／３は、持続性のＨＢＶ感染に特徴がある（３）。
【０００７】
現在の処置は、２つのストラテジーを追求する：（ｉ）インターフェロン（ＩＦＮα）処置は、ＨＢＶに対する免疫応答を調節し、直接的な抗ウイルス効果を示す。このことは、上記ウイルスの根絶なしに、処置した患者のうちの約３０％において、長期の臨床的利益をもたらす；（ｉｉ）ウイルス逆転写酵素インヒビターの投与は、ウイルス複製を抑制し、１年間の処置の後に、顕著な生化学的かつ組織学的改善が付随する。しかし、長期の処置は、耐性ウイルス株の出現と関連している（４）。
【０００８】
ＨＢＶは、哺乳動物およびトリの小さなエンベロープに包まれたＤＮＡウイルスファミリーのプロトタイプである（５）。上記ＨＢＶエンベロープは、Ｌ−（大）、Ｍ−（中）およびＳ−（小）といわれる３つのタンパク質を包んでいる（図１Ａを参照のこと）。これらは、４つの膜貫通領域とＣ末端のＳドメインを共有している。上記Ｍ−タンパク質およびＬ−タンパク質は、５５アミノ酸（ｐｒｅＳ２）、および遺伝子型に依存して、１０７アミノ酸もしくは１１８アミノ酸（ｐｒｅＳ１）のさらなるＮ末端伸長を有している（図１Ｂを参照のこと）。ビリオンにおいて、Ｌ、ＭおよびＳの化学量論比は、約１：１：４である一方で、より豊富に分泌される非感染性サブウイルス粒子（ＳＶＰ）は、ほぼもっぱらＳ−タンパク質および極微量のＬ−タンパク質を含む（６）。合成の間に、上記ＬのｐｒｅＳ１ドメインは、ミリストイル化され、ＥＲを介して場所を変えられる。この改変は、ＨＢＶ感染性にとって必須である（７，８）。
【０００９】
ＨＢＶ感染の初期事象の研究は、制限されてきた。なぜなら、細胞培養系も、小動物モデルも、近年まで利用可能でなかったからである（９）（非特許文献１）。上記ＨＢＶ感受性細胞株ＨｅｐａＲＧの開発は、ＨＢＶ侵入の体系的調査を促進し、エンベロープタンパク質由来侵入インヒビターの発見をもたらした（１０）（非特許文献２）。
【００１０】
さらに、今日までに、サテライトウイルソイドが肝細胞への侵入のためにＨＢＶエンベロープタンパク質を利用するＨＤＶ感染の有効な治療は存在しない（１５，１７，２０）（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。ＨＤＶ感染に対する有効な治療を提供することが当該分野では必要である。
【００１１】
従って、本発明は、先行技術において存在する場合、ＨＢＶ感染および他のＨＢＶ関連疾患の阻害、予防および／もしくは処置のための方法および手段を改善することを目的とし、従って、本発明の目的は、ＨＢＶ感染およびＨＢＶ関連疾患の標的とされかつ効率的な阻害、予防および／もしくは処置を可能にする改善された方法および手段を提供することである。
【００１２】
さらなる本発明の目的は、ＨＤＶ感染およびＨＤＶ関連疾患の上記感染、予防および／もしくは処置のための方法および手段を提供することである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｇｌｅｂｅ， Ｄ．およびＵｒｂａｎ， Ｓ． Ｖｉｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｈｅｐａｄｎａｖｉｒａｌ ｅｎｔｒｙ． Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ（２００７）１３， ２２−３８
【非特許文献２】Ｇｒｉｐｏｎ， Ｐ．ら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｂｙ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ（２００２）９９， １５６５５−１５６６０
【非特許文献３】Ｅｎｇｅｌｋｅ， Ｍ．ら、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ａｎｄ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｄｅｌｔａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ． Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（２００６）４３， ７５０−７６０
【非特許文献４】Ｂａｒｒｅｒａ， Ａ．、Ｇｕｅｒｒａ， Ｂ．、Ｎｏｔｖａｌｌ， Ｌ．およびＬａｎｆｏｒｄ， Ｒ．Ｅ． Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｐｒｅ−Ｓ１ ｄｏｍａｉｎ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ（２００５）７９， ９７８６−９７９８
【非特許文献５】Ｔａｙｌｏｒ， Ｊ．Ｍ． Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｄｅｌｔａ ｖｉｒｕｓ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００６）３４４， ７１−７６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明によれば、この目的は、ＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドを提供することによって解決される。
【００１５】
上記疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、以下の一般式：
Ｈｍ−Ｐ−Ｒｎ，
を有し、
Ｐは、上記ｐｒｅＳ由来ペプチドであり、ＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサス配列のアミノ酸配列もしくはその改変体を含む。
【００１６】
Ｈは、上記ｐｒｅＳ由来ペプチド Ｐの疎水性改変であり、上記疎水性改変は、ＰのＮ末端のものであり、疎水性部分のアシル化および付加から選択される；ここでｍは、少なくとも１である。
【００１７】
Ｒは、必要に応じて、上記ｐｒｅＳ由来ペプチド ＰのＣ末端改変である（すなわち、ｎは、０もしくは少なくとも１である）。
【００１８】
本発明によれば、この目的は、本明細書に定義される少なくとも１個のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド、ならびに必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアおよび／もしくは賦形剤を含む薬学的組成物を提供することによって、さらに解決される。
【００１９】
本発明によれば、この目的は、上記ＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドおよび／もしくは疾患の診断、予防および／もしくは処置のための、本発明のそれぞれの薬学的組成物を提供することによってさらに解決される。
【００２０】
本発明によれば、この目的は、上記ＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド、またはＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染の阻害のための；ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶの一次感染の予防のための、および／もしくはＢ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎の処置のための、本発明の薬学的組成物を提供することによって、さらに解決される。
【００２１】
本発明によれば、この目的は、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染の阻害のための；ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶの一次感染の予防のための、ならびに／または（慢性）Ｂ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎の処置のための、医薬の製造のために上記ＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは本発明の薬学的組成物を使用することによって、さらに解決される。
【００２２】
本発明によれば、この目的は、ＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは本発明の薬学的組成物を利用することによる、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染を阻害するための方法；ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶの一次感染を阻害するための方法、および／もしくは（慢性）Ｂ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎を処置するための方法によって、さらに解決される。
【００２３】
本発明によれば、この目的は、本明細書で定義される少なくとも１つのＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド、ならびに必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアおよび／もしくは賦形剤を含むワクチン組成物を提供することによって、さらに解決される。
【００２４】
以下の実施例および図面は、本発明を例示するが、本発明に対する限定ではない。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ＨＢＶ粒子、ならびにＨＢＶ Ｌ−タンパク質、Ｍ−タンパク質およびＳ−タンパク質の模式図である。（Ａ）部分的二本鎖ＤＮＡは、末端タンパク質（ＴＰ）、逆転写酵素（ＲＴ）およびＲＮａｓｅＨからなるウイルスポリメラーゼ複合体と供給結合している。そのゲノムは、１２０個のコアタンパク質ダイマーから作られる二十面体の殻によって包まれている。上記３個のＨＢＶ表面タンパク質Ｌ−、Ｍ−およびＳ−は、ＥＲ由来脂質二重層へと埋め込まれる。上記Ｌ−タンパク質およびＭ−タンパク質は、膜アンカーとして働く完全Ｓドメインを含む。（Ｂ）上記３個のＨＢＶ表面タンパク質Ｌ、ＭおよびＳのドメイン構造。上記Ｌ−タンパク質は、Ｎ末端がミリストイル化された１０７個アミノ酸のｐｒｅＳ１−ドメイン、５５個アミノ酸のｐｒｅＳ２−ドメイン、および４回膜貫通セグメント（Ｉ〜ＩＶ）を含むＳ−ドメインを含む。
【図２】図２は、ＨＢＶ ｐｒｅＳ１コンセンサス配列である。一番上：そのｐｒｅＳ１、ｐｒｅＳ２およびＳ−ドメインを有する上記ＨＢＶ Ｌ−タンパク質が示される。そのＮ末端は、ミリストイル化されている。下のアラインメントは、アミノ酸２〜５０を含む、コンセンサス配列（コンセンサス）および８個のＨＢＶ 遺伝子型（Ａ〜Ｈ）、ならびにウーリーモンキーＨＢＶ（ＷＭＨＢＶ） ｐｒｅＳ配列を示す。上記遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、ＧおよびＨは、それらのＮ末端において１１個のさらなるアミノ酸を有し、遺伝子型Ｆは、１０個のさらなるアミノ酸残基を有することに注意のこと。一番下において、既知の機能的サブドメインが示される。ＨＢＶ 遺伝子型Ｃとは、ＨＢＶ 遺伝子型Ｃ Ｑ４６Ｋをいうことにも注意のこと。
【図３】図３は、上記２つの遺伝子型ＣおよびＤのミリストイル化およびステアロイル化したＨＢＶｐｒｅＳ由来ペプチドの比較感染阻害アッセイである。ＨｅｐａＲＧ細胞を、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ミリストイル（Ｄ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ミリストイル（Ｃ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／（−１１）−４８ミリストイル（Ｃ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｃ）およびＨＢＶｐｒｅＳ／（−１１）−４８ステアロイル（Ｃ）の非存在（０ｎＭ）下、およびこれらの１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭおよび２０００ｎＭの存在下で、いずれかに感染させた。感染性接種物（遺伝子型ＤのＨＢＶ）および上記ペプチドを、一晩インキュベートした。洗浄後、細胞を、さらに１２日間にわたって維持して、ウイルス遺伝子発現を可能にした。８〜１２日目の細胞培養上清を採取し、市販の定量的ＥＬＩＳＡを使用して、分泌ＨＢＳＡｇについて分析した。それぞれの不完全感染からのＨＢｓＡｇ値を、１００％に設定し、感染阻害の程度を、不完全感染の％単位で与える。ここで（Ｃ）もしくは遺伝子型Ｃは、ＨＢＶ 遺伝子型Ｃ Ｑ４６Ｋをいう。
【図４】図４は、コンセンサス配列を有する、ミリストイル化およびステアロイル化したＨＢＶｐｒｅＳ由来ペプチドの感染阻害アッセイである。ＨｅｐａＲＧ細胞を、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ミリストイル（コンセンサス）およびＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（コンセンサス）の非存在（０ｎＭ）下、もしくはこれらの０．１２５ｎＭ；０．２５ｎＭ；０．５ｎＭ；０．７５ｎＭおよび１ｎＭの存在下のいずれかで、感染させた。感染性接種物（遺伝子型ＤのＨＢＶ）および上記ペプチドを、一晩インキュベートした。洗浄後、細胞を、さらに１２日間にわたって維持して、ウイルス遺伝子発現を可能にした。８〜１２日目の細胞培養上清を採取し、市販の定量的ＥＬＩＳＡを使用して、分泌ＨＢＳＡｇについて分析した。それぞれの不完全感染からのＨＢｓＡｇ値を、１００％に設定し、感染阻害の程度を、不完全感染の％単位で与える。
【図５】図５は、遺伝子型ＤのＣ末端が欠失したステアロイル化ＨＢＶｐｒｅＳ由来ペプチドの比較感染阻害アッセイである。ＨｅｐａＲＧ細胞を、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｄ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−１５ステアロイル（Ｄ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−２１ステアロイル（Ｄ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−２６ステアロイル（Ｄ）およびＨＢＶｐｒｅＳ／２−３３ステアロイル（Ｄ）の非存在（０ｎＭ）下、ならびにこれらの１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎＭの存在下のいずれかで、感染させた。感染性接種物（遺伝子型ＤのＨＢＶ）および上記ペプチドを一晩インキュベートした。洗浄後、細胞を、さらに１２日間にわたって維持して、ウイルス遺伝子発現を可能にした。８〜１２日目の細胞培養上清を採取し、市販の定量的ＥＬＩＳＡを使用して、分泌ＨＢＳＡｇについて分析した。それぞれの不完全感染からのＨＢｓＡｇ値を、１００％に設定し、感染阻害の程度を、不完全感染の％単位で与える。
【図６】図６は、遺伝子型ＤのＮ末端およびＣ末端が欠失したステアロイル化ＨＢＶｐｒｅＳ由来ペプチドの比較感染阻害アッセイである。ＨｅｐａＲＧ細胞を、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｄ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−３３ステアロイル（Ｄ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／５−３３ステアロイル（Ｄ）、およびＨＢＶｐｒｅＳ／５−４８ステアロイル（Ｄ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／９−３３ステアロイル（Ｄ）およびＨＢＶｐｒｅＳ／９−４８ステアロイル（Ｄ）の非存在（０ｎＭ）下、もしくはこれらの１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎＭの存在下のいずれかで、感染させた。感染性接種物（遺伝子型ＤのＨＢＶ）および上記ペプチドを一晩インキュベートした。洗浄後、細胞を、さらに１２日間にわたって維持して、ウイルス遺伝子発現を可能にした。８〜１２日目の細胞培養上清を採取し、市販の定量的ＥＬＩＳＡを使用して、分泌ＨＢＳＡｇについて分析した。それぞれの不完全感染からのＨＢｓＡｇ値を、１００％に設定し、感染阻害の程度を、不完全感染の％単位で与える。
【図７】図７は、遺伝子型Ｄの内部変異したステアロイル化ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ペプチドの比較感染阻害アッセイである。ＨｅｐａＲＧ細胞を、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｄ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｄ−ＡＳ１１−１５）（Ｄ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ａｌａ１１−１５）（Ｄ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Δ１７−２１）（Ｄ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ａｌａ１７−２１）（Ｄ）およびＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ａｌａ２−９）（Ｄ）の非存在（０ｎＭ）下、もしくはこれらの１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎＭの存在下のいずれかで、感染させた。感染性接種物（遺伝子型ＤのＨＢＶ）および上記ペプチドを一晩インキュベートした。洗浄後、細胞を、さらに１２日間にわたって維持して、ウイルス遺伝子発現を可能にした。８〜１２日目の細胞培養上清を採取し、市販の定量的ＥＬＩＳＡを使用して、分泌ＨＢＳＡｇについて分析した。それぞれの不完全感染からのＨＢｓＡｇ値を、１００％に設定し、感染阻害の程度を、不完全感染の％単位で与える。
【図８】図８は、遺伝子型Ｄの内部変異したステアロイル化ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ペプチドの比較感染阻害アッセイである。ＨｅｐａＲＧ細胞を、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（レトロインベルゾ）（Ｄ）およびＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ａｌａ２１，２３，２９，３０）（Ｄ）の非存在（０ｎＭ）下、もしくはこれらの１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎＭの存在下のいずれかで、感染させた。感染性接種物（遺伝子型ＤのＨＢＶ）および上記ペプチドを一晩インキュベートした。洗浄後、細胞を、さらに１２日間にわたって維持して、ウイルス遺伝子発現を可能にした。８〜１２日目の細胞培養上清を採取し、市販の定量的ＥＬＩＳＡを使用して、分泌ＨＢＳＡｇについて分析した。それぞれの不完全感染からのＨＢｓＡｇ値を、１００％に設定し、感染阻害の程度を、不完全感染の％単位で与える。
【図９】図９は、遺伝子型Ｄの内部変異したステアロイル化ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ペプチドのさらなる比較感染阻害アッセイである。ＨｅｐａＲＧ細胞を、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ａｌａ１８）（Ｄ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Δ１１−１５）（Ｄ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｓｅｒ１３）（Ｄ）およびＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ａｒｇ１１）（Ｄ）の非存在（０ｎＭ）、もしくはこれらの１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎＭの存在下のいずれかで、感染させた。感染性接種物（遺伝子型ＤのＨＢＶ）および上記ペプチドを一晩インキュベートした。洗浄後、細胞を、さらに１２日間にわたって維持して、ウイルス遺伝子発現を可能にした。８〜１２日目の細胞培養上清を採取し、市販の定量的ＥＬＩＳＡを使用して、分泌ＨＢＳＡｇについて分析した。それぞれの不完全感染からのＨＢｓＡｇ値を、１００％に設定し、感染阻害の程度を、不完全感染の％単位で与える。
【図１０】図１０は、本発明において使用される遺伝子型Ｄのステアロイル化ＨＢＶｐｒｅＳ由来ペプチドである。
【図１１】図１１は、本発明の疎水性改変ｐｒｅＳペプチドがインビボ肝臓向性を示すことを示す。Ａ マウスにおけるＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ Ｔｙｒステアロイル（Ｄ）の生体分布。Ｂ マウスにおけるＨＢＶｐｒｅＳ／５−４８ Ｄ−Ｔｙｒステアロイル（Ｄ）の生体分布。Ｃ マウスにおけるＨＢＶｐｒｅＳ／２−３３−Ｄ Ｔｙｒステアロイル（Ｄ）の生体分布。
【図１２】図１２は、Ｍｙｒｃｌｕｄｅｘ ＢによるＨｅｐａＲＧ細胞に対するＨＢＶ感染、アシル化の効果である。Ｍｙｒｃｌｕｄｅｘ Ｂとは、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８（Ｃ）（ここで（Ｃ）とは、ＨＢＶ 遺伝子型Ｃ Ｑ４６Ｋをいう）をいう。ステアロイル化およびミリストイル化したＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８（Ｃ）、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ミリストイル（Ｃ）およびＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｃ）を比較する、競合アッセイ。試験した濃度は、完全な競合を有しないように、１ｎＭ未満であった。示されるのは、ＨＢｅＡｇ測定値（接種後７〜１４日目）である。図３〜９に示される実験と同じ反応および感染条件。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（本発明の好ましい実施形態の説明）
本発明が以下により詳細に記載される前に、本発明が本明細書に記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されないことが理解されるきである。なぜなら、これらは変化し得るからである。本明細書で使用される用語法が、記載されている特定の実施形態のみを目的とし、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図しないこともまた、理解されるべきである。別段定義されなければ、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の目的のために、本明細書で引用されるすべての参考文献は、それらの全体が本明細書に参考として援用される。
【００２７】
（ＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド）
上記で概説されるように、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドを提供する。
【００２８】
ＨＢＶのエンベロープは、Ｌ（大）、Ｍ（中）およびＳ（小）といわれる３つのタンパク質を包んでいる（図１Ａを参照のこと）。それらは、４つの膜貫通領域とＣ末端のＳドメインを共有している。上記Ｍ−タンパク質およびＬ−タンパク質は、５５アミノ酸、および遺伝子型に依存して、１０７アミノ酸もしくは１１８アミノ酸（ｐｒｅＳ２およびｐｒｅＳ１）のさらなるＮ末端伸長を有している（図１Ｂを参照のこと）。
【００２９】
従って、表現、本発明に従うＨＢＶの「ｐｒｅＳ由来」ペプチドとは、ＨＢＶ（ｐｒｅＳ１）のＬ−タンパク質のＮ末端伸長、好ましくは、上記種および遺伝子型Ａ〜Ｈの、ならびにウーリーモンキー（ＷＭＨＢＶ）、チンパンジーおよびゴリラＢ型肝炎ウイルスのコンセンサス配列に対応するアミノ酸配列を有するペプチドをいうが、その改変体（好ましくは、Ｎ末端および／もしくはＣ末端が短縮された改変体、アミノ酸置換改変体）をもいう。
【００３０】
配列番号１は、上記種および遺伝子型Ａ〜Ｈ、ならびにウーリーモンキー（ＷＭＨＢＶ）のＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサスアミノ酸配列を示す。
【００３１】
アミノ酸２〜４８を示す、上記ＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサス配列（コンセンサス）および上記８つのＨＢＶ 遺伝子型（Ａ〜Ｈ）、ならびにウーリーモンキーＨＢＶ（ＷＭＨＢＶ）ｐｒｅＳ配列を示す、図２におけるアラインメントを参照のこと。遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨは、それらのＮ末端において最大１１個までのさらなるアミノ酸を有することに注意のこと。
【００３２】
本願内の上記ＨＢＶ「遺伝子型Ｃ」のアミノ酸配列は、４６位（以下に記載されるような番号に従って）が、Ｇｅｎｂａｎｋ配列におけるようなＧｌｎ（Ｑ）の代わりに、本発明の遺伝子型ＣにおいてＬｙｓ（Ｋ）であることを除いて、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢＶ０２８５０．１に示されるように、上記ＨＢＶ 遺伝子型Ｃに対応するかもしくはこれと同一である人工配列をいう；本願のＨＢＶ 遺伝子型Ｃ配列はまた、「ＨＢＶ 遺伝子型Ｃ Ｑ４６Ｋ」といわれ得る。配列番号４、１２、２１〜２７をまた参照のこと。
【００３３】
図２はまた、上記ＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサス配列のアミノ酸残基の番号付けを示す。この番号付けは、本明細書全体を通して言及される。
【００３４】
アミノ酸残基番号１は、遺伝子型Ｄ（以前は、サブタイプａｙｗと記載されていた。配列番号５もまた参照のこと）のメチオニン（Ｍｅｔ１）であるのに対して、アミノ酸残基番号（−１１）は、遺伝子型Ｃ（配列番号４）のメチオニン（Ｍｅｔ（−１１））である。インビボで、それぞれ、Ｍｅｔ１もしくはＭｅｔ（−１１）は、細胞のメチオニルアミノペプチダーゼによって切断され、ミリストイル−ＣｏＡから、それぞれ、アミノ酸残基番号２のグリシン（Ｇｌｙ２）もしくはアミノ酸残基番号（−１０）グリシン（Ｇｌｙ（−１０））へのＮ−ミリストイルトランスフェラーゼによるミリストイル残基のその後の転移によって、改変される。遺伝子型Ｄの上記Ｎ末端アミノ酸残基は、天然のアミノ酸グリシン（Ｇｌｙ２）であり、Ｌの基礎をなすオープンリーディングフレーム（もしくは、例えば、遺伝子型ＣについてはＧｌｙ（−１０））のコドンからのそれぞれの番号付けに従って、２に番号付けされる。
【００３５】
上記ＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサス配列はまた、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨの上記さらなるＮ末端アミノ酸（「−」位において示される）を含む。従って、ＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサス配列のうちのすべてにおいて、（−１１）〜４８位が含まれる。
【００３６】
従って、配列番号１におけるアミノ酸の上記の番号付けと実際の列挙との間には差異が存在する。例えば、
Ｍｅｔ（−１１）、残基番号（−１１）は、配列番号１においてアミノ酸残基１として列挙され；
Ｇｌｙ（−１０）、残基番号（−１０）は、配列番号１においてアミノ酸残基２として列挙され；
Ｍｅｔ １、残基番号１は、配列番号１においてアミノ酸残基１２として列挙され；
Ｇｌｙ ２、残基番号２は、配列番号１においてアミノ酸残基１３として列挙され；
Ｇｌｙ ４８、残基番号４８は、配列番号１においてアミノ酸残基５８として列挙される。
【００３７】
【化１−１】
【００３８】
【化１−２】
本発明に従うＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、以下の式を有する：
Ｈｍ−Ｐ−Ｒｎ，
ここで
Ｐは、上記ｐｒｅＳ由来ペプチドであり；
Ｈは、Ｐの疎水性改変であり；
Ｒは、ＰのＣ末端改変であり；
ｍは、少なくとも１であり；
ｎは、０もしくは少なくとも１である。
【００３９】
本発明に従うＨＢＶのｐｒｅＳ由来ペプチド、Ｐは、以下を含む：
−配列番号１に示されるような上記ＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサス配列のアミノ酸配列、もしくは
−その改変体。
【００４０】
「改変体」は、好ましくは、Ｎ末端および／もしくはＣ末端が短縮された改変体、アミノ酸置換もしくは欠失改変体、または長くされた改変体である。改変体は、改変アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはペプチド模倣物、またはペプチド骨格／構造を模倣し得るさらなる化合物を含むアミノ酸配列をさらに含む。
【００４１】
好ましくは、改変体は、配列番号１のＮ末端および／もしくはＣ末端が短縮された改変体；アミノ酸置換もしくは欠失改変体；改変アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはペプチド模倣物、またはペプチド骨格／構造を模倣し得るさらなる化合物を含む改変体から選択される。
【００４２】
本発明によれば、疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドの改変体は、配列番号１の少なくとも１０個もしくは２０個連続するアミノ酸を含み、そして配列番号１の１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個以上のアミノ酸もしくはその改変体からなり得る。
【００４３】
Ｎ末端および／もしくはＣ末端が短縮された改変体は、好ましくは、配列番号１の少なくとも４８個連続するアミノ酸（好ましくは、残基２〜４８）、より好ましくは、配列番号１の少なくとも１７個連続するアミノ酸（好ましくは、残基５〜２１）または配列番号１の少なくとも２０個連続するアミノ酸（好ましくは、残基２〜２１）を含む。
【００４４】
用語「改変体」はまた、ヘパドナウイルス属の異なるウイルス種、株もしくはサブタイプ（例えば、ＨＢＶ株α１、ＨＢＶ株ＬＳＨ（チンパンジー分離株）、ウーリーモンキーＨＢＶ（ＷＭＨＢＶ）、または上記ＨＢＶ 遺伝子型Ａ〜Ｈからなる群より選択される株、ならびに本明細書で定義される上記ＨＢＶ 遺伝子型Ｃ、Ｑ４６Ｋ（例えば、配列番号４））において見いだされる相同な配列をいう。
【００４５】
用語「改変体」はまた、配列番号１もしくは本明細書で開示される任意の他のアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは、７０％、より好ましくは、８０％、さらにより好ましくは、９０％もしくは９５％の配列同一性を示す相同な配列をいう。
【００４６】
従って、本発明に従う、好ましい疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドにおいて、Ｐは、異なるウイルス種、株もしくはサブタイプの（好ましくは、上記ＨＢＶの遺伝子型のもしくはウーリーモンキーＨＢＶ（ＷＭＨＢＶ）の、またはこれらの改変体の）アミノ酸配列を有する、配列番号１の改変体を含む。
【００４７】
好ましくは、Ｐは、配列番号２〜１０から選択されるアミノ酸配列もしくはこれらの改変体（図２もまた参照のこと）を含み得る。
【００４８】
好ましい実施形態において、本発明に従う疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドにおいて、Ｐは、以下から選択されるアミノ酸配列を有する配列番号１の改変体を含む：
配列番号１に示されるＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサス配列の
アミノ酸残基２〜２１、
アミノ酸残基５〜２１、
アミノ酸残基５〜１５もしくは
アミノ酸残基９〜１５（［配列番号１５］もまた参照のこと）。
【００４９】
より好ましくは、Ｐは、配列番号１の残基９〜２２におけるアミノ酸置換および／もしくは欠失（例えば、残基１７〜２１を欠失させることによる）を含まない。
【００５０】
より好ましくは、Ｐは、配列番号１の残基９〜１５においてアミノ酸置換および／もしくは欠失を含まない。
【００５１】
より好ましくは、配列モチーフ ＮＰＬＧＦＦＰ［配列番号１５］（配列番号１の残基９〜１５に対応する）は、中断されてもいないし、改変されてもいない（例えば、残基１１〜１５をＤアミノ酸で置換することによって）。
【００５２】
より好ましくは、本発明に従う疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドにおいて、Ｐは、以下から選択されるアミノ酸配列を有する配列番号１の改変体を含む：
上記コンセンサス配列のアミノ酸残基２〜４８ ［配列番号１１］；
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜４８ ［配列番号１２］；
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜２１ ［配列番号１３］；
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基５〜２１ ［配列番号１４］；
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基９〜１５ ［配列番号１５］；
遺伝子型Ｄのアミノ酸残基２〜４８ ［配列番号１６］；
遺伝子型Ｄのアミノ酸残基５〜４８ ［配列番号１７］；
遺伝子型Ｄのアミノ酸残基２〜３３ ［配列番号１８］
遺伝子型Ｄのアミノ酸残基５〜３３ ［配列番号１９］
遺伝子型Ｄのアミノ酸残基２〜２１ ［配列番号２０］；
遺伝子型Ｄのアミノ酸残基９〜１５ ［配列番号１５］。
【００５３】
従って、好ましくは、Ｐは、配列番号１１〜２０から選択されるアミノ酸配列もしくはその改変体を含む。
【００５４】
Ｐの好ましいアミノ酸配列については、以下の表１〜７、図面および実施例を参照のこと。
【００５５】
配列番号１の「改変体」はまた、上記配列が１０μＭ未満の、および好ましくは、１μＭ未満のペプチド濃度でのＨＢＶ感染の７０％阻害を誘発する限りにおいて、アミノ酸欠失、アミノ酸置換（例えば、他のアミノ酸もしくは等配電子体（タンパク質のアミノ酸に対して近い構造的かつ空間的類似性を有する改変アミノ酸）による保存的もしくは比保存的な置換、アミノ酸付加または等配電子体付加）を含む改変体もしくは「アナログ」を含む。
【００５６】
保存的アミノ酸置換は、代表的には、同じクラスのアミノ酸の中での置換をいう。これらクラスとしては、例えば、以下が挙げられる：
−非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびチロシン）；
−塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、およびヒスチジン）；
−酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）；および
−非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、およびシステイン）。
【００５７】
本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、好ましくは、増大した免疫原性特性を有するように改変され得る。このような増大した免疫原性特性とは、例えば、免疫した後に誘発される抗体の範囲を増大させること、または種々のウイルス株による感染を中和し得る抗体の生成を可能にすることをいう。
【００５８】
別の実施形態において、本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、好ましくは、それらの免疫原性特性を低下させるように改変され得る。このような疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、悪影響を回避もしくは制限しながら、インビボでのＨＢＶ感染を阻害するための治療適用において特に有用である。
【００５９】
従って、置換および／もしくは欠失によって改変されるべき好ましい配列モチーフは、上記免疫原性をになう配列（例えば、Ｂ細胞エピトープおよび／もしくはＴ細胞エピトープ、さらには、抗体認識モチーフ）である。
【００６０】
ＨＢＶのＢ細胞エピトープは、好ましくは、配列番号１のアミノ酸残基２０〜２３（モチーフ ＤＰＡＦ）およびアミノ酸残基２６〜３２、上記コンセンサス配列（配列番号１）のモチーフ ＮＳＮＮＰＤＷおよび遺伝子型Ｃ（配列番号４）、もしくは遺伝子型ＤのＮＴＡＮＰＤＷ（配列番号５）である。
【００６１】
好ましい実施形態において、配列番号１のアミノ酸残基２０〜２３は、好ましくは、アミノ酸置換によって改変され、そして／または上記アミノ酸残基２６〜３２は、好ましくは、アミノ酸置換および／もしくは欠失によって改変され得る。
【００６２】
好ましくは、配列番号１のアミノ酸残基２０〜２３（モチーフ ＤＰＡＦ）は、アラニンアミノ酸置換によって、好ましくは、モチーフ ＡＰＡＦへと改変される。
【００６３】
好ましくは、配列番号１のアミノ酸残基２６〜３２は、アラニンアミノ酸置換によって、好ましくは、モチーフ ＮＡＮＡＰＤＷもしくはＮＡＡＡＰＤＷへと改変される。
【００６４】
好ましい実施形態において、Ｐは、配列番号２１〜２８から選択されるアミノ酸配列もしくはこれらの改変体を含む。
【００６５】
以下の表２、表７、ならびにそれぞれの図面および実施例もまた参照のこと。
【００６６】
より好ましい実施形態において、Ｐは、以下から選択されるアミノ酸配列を含む：
配列番号１１ （上記コンセンサス配列の残基２〜４８）、
配列番号１２ （遺伝子型Ｃの残基２〜４８）、
配列番号１３ （遺伝子型Ｃの残基２〜２１）、
配列番号４ （遺伝子型Ｃの残基（−１１）〜４８）、および
配列番号２０ （遺伝子型Ｄの残基２〜２１）。
【００６７】
上記ｐｒｅＳ由来ペプチドＰの疎水性改変（Ｈ）は、ＰのＮ末端にある。
【００６８】
「Ｎ末端の」とは、Ｎ末端（すなわち、それぞれの第１のアミノ酸残基（例えば、Ｇｌｙ ２））における疎水性改変をいうが、Ｎ末端付近（例えば、それぞれのアミノ酸残基（−４）、（−３）、（−２）、（−１）、１、２、または３もしくは４）における疎水性改変も含む。従って、上記疎水性改変は、ＰのＮ末端付近の部位において疎水性部分を結合することによってさらに得られ得る。
【００６９】
本発明のＨＢＶのｐｒｅＳ由来ペプチドの上記疎水性改変は、上記ペプチドに疎水性部分を付加する。
【００７０】
さらに、ｍは、少なくとも１（すなわち、少なくとも１個の疎水性部分もしくは基での改変）である。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態において、ｍは、１、２、３、４もしくはこれ以上である。すなわち、Ｐは、１個より多い疎水性部分もしくは基（例えば、２個）で改変され得る。上記疎水性部分もしくは基は、互いに同じでもあってもよいし、異なっていてもよい。
【００７２】
本発明に従うＨＢＶのｐｒｅＳ由来ペプチドの上記疎水性改変は、以下から選択される：
−アシル化；
−疎水性部分の付加。
【００７３】
アシル化は、好ましくは、カルボン酸、脂肪酸、脂肪族側鎖を有するアミノ酸でのアシル化から選択される。
【００７４】
好ましい脂肪酸は、飽和もしくは不飽和の脂肪酸、分枝状もしくは非分枝状の脂肪酸、好ましくは、８〜２２個の炭素原子（Ｃ８〜Ｃ２２）を有するものである。
【００７５】
より好ましくは、アシル化による上記疎水性改変は、ミリストイル（Ｃ１４）、パルミトイル（Ｃ１６）もしくはステアロイル（Ｃ１８）でのアシル化から選択される。
【００７６】
上記疎水性部分の付加は、好ましくは、コレステロール、コレステロールの誘導体、リン脂質、糖脂質、グリセロールエステル、ステロイド、セラミド、イソプレン誘導体、アダマンタン、ファルネソール、脂肪族基、多環式芳香族化合物（ｐｏｌｙａｒｏｍａｔｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の付加から選択される。
【００７７】
上記疎水性部分の結合は、好ましくは、共有結合によるものであり、これは、カルバメート、アミド、エーテル、ジスルフィド、もしくは当業者の技術範囲内の任意の他の連結を介して達成され得る。
【００７８】
従って、本発明の、疎水性改変された、好ましくは、アシル化ｐｒｅＳ由来ペプチドは、好ましくは、それらのＮ末端親油性もしくは疎水性の基／部分に起因して、リポペプチドである。
【００７９】
好ましい疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドについては、表１および表２もまた参照のこと。
【００８０】
より好ましい本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、以下のものである：
Ｐは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号４、および配列番号２０から選択されるアミノ酸配列を含み、そして
Ｈは、ミリストイル（Ｃ１４）もしくはステアロイル（Ｃ１８）、好ましくは、ステアロイル（Ｃ１８）でのアシル化による疎水性改変である。
【００８１】
従って、より好ましい本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、以下である：
【００８２】
【化２】
ここで（Ｃ）は、ＨＢＶ 遺伝子型Ｃ Ｑ４６Ｋをいう。
【００８３】
（遺伝子型Ｃ配列の好ましい実施形態）
本発明の非常に好ましい実施形態において、本発明に従う疎水性改変ｐｒｅＳペプチドにおいて、Ｐは、遺伝子型Ｃに由来するアミノ酸配列を含む。
【００８４】
遺伝子型Ｃに由来する本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、ＨＢＶ感染を、その対応する遺伝子型Ｄのものより強力に阻害する。図３および表３もまた参照のこと。
【００８５】
上記で議論されるように、本願の範囲内のＨＢＶ 「遺伝子型Ｃ」のアミノ酸配列とは、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢＶ０２８５０．１に示されるように、上記ＨＢＶ 遺伝子型Ｃに対応するかもしくはこれと同一である人工配列である。ただし、４６位（以下に記載されるような番号付けに従う）は、Ｇｅｎｂａｎｋ配列におけるようなＧｌｎ（Ｑ）の代わりに、本発明の上記遺伝子型ＣにおいてＬｙｓ（Ｋ）である；本願のＨＢＶ 遺伝子型Ｃ配列はまた、「ＨＢＶ 遺伝子型Ｃ Ｑ４６Ｋ」といわれ得る。配列番号４、１２、２１〜２７もまた参照のこと。
【００８６】
上記ＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサス配列について上記に記載されるようなものと同じ番号付けが、上記遺伝子型Ｃ配列のアミノ酸残基の番号付けのために使用され（図２もまた参照のこと）。例えば、
Ｍｅｔ （−１１）、残基番号（−１１）は、配列番号４においてアミノ酸残基１として列挙され；
Ｇｌｙ （−１０）、残基番号（−１０）は、配列番号４においてアミノ酸残基２として列挙され；
Ｍｅｔ １、残基番号１は、配列番号４においてアミノ酸残基１２として列挙され；
Ｇｌｙ ２、残基番号２は、配列番号４においてアミノ酸残基１３として列挙され、そして配列番号１２においてアミノ酸残基１として列挙され；
Ｇｌｙ ４８、残基番号４８は、配列番号４においてアミノ酸残基５８として列挙され、そして配列番号１２においてアミノ酸残基４７として列挙される。
【００８７】
配列番号１２ アミノ酸配列（これは、４６位が、Ｇｌｎ（Ｑ）の代わりにＬｙｓ（Ｋ）；Ｑ４６Ｋであることを除いて、ＨＢＶ 遺伝子型Ｃの２〜４８位に対応する）
【００８８】
【化３】
Ｐは、好ましくは、以下から選択され得る：
配列番号１２ （遺伝子型Ｃの残基２〜４８）、
配列番号４ （遺伝子型Ｃの残基（−１１）〜４８）
配列番号１３ （遺伝子型Ｃの残基２〜２１），
配列番号１４ （遺伝子型Ｃの残基５〜２１）、および
配列番号１５ （遺伝子型Ｃの残基９〜１５）。
【００８９】
遺伝子型Ｃ配列の好ましい実施形態において、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、以下の式のものである：
Ｈｍ−Ｐ−Ｒｎ，
ここで、好ましくは、
Ｐは、配列番号１２のアミノ酸配列または少なくとも１０個連続するアミノ酸のこの配列のＮ末端および／もしくはＣ末端が短縮された改変体、またはこれらの改変アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはペプチド模倣物を含む誘導体を含む、ｐｒｅＳ由来ペプチドであり；
Ｈは、上記ｐｒｅＳ由来ペプチド Ｐの疎水性改変であり、上記疎水性改変は、ＰのＮ末端のものあり、かつアシル化および疎水性部分の付加から選択され；
Ｒは、上記ｐｒｅＳ由来ペプチド ＰのＣ末端改変であり；
ｍは、少なくとも１であり；そして
ｎは、０または少なくとも１である。
【００９０】
本発明の好ましいペプチドは、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染の阻害のために、急性ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染の予防のために、ならびに／またはＢ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎の処置のために、特に有効である。
【００９１】
好ましくは、Ｐは、配列番号１２のアミノ酸配列（遺伝子型Ｃの残基２〜４８）を含むか、またはこれからなる。
【００９２】
また、好ましくは、Ｐは、配列番号１２のアミノ酸配列の改変体を含み、ここで改変体は、配列番号１２の少なくとも１０個連続するアミノ酸残基（好ましくは、残基９〜１８）、より好ましくは、１５個もしくは２０個連続するアミノ酸配列を含み、配列番号１２の１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個もしくはこれ以上のアミノ酸残基からなり得る。
【００９３】
好ましくは、Ｐ中に含まれる配列番号１２の連続するアミノ酸残基は、以下から選択される：
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基９〜１５ ［＝配列番号１５］、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜１５、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基９〜１８、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜１８、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜２０、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜２１ ［＝配列番号１３］、
遺伝子型Ｃアミノ酸残基５〜２１ ［＝配列番号１４］、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜２５、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜３０、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜３５、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜４０、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜４５、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜４６、もしくは
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２〜４８ ［＝配列番号１２］。
【００９４】
一実施形態において、Ｐは、配列番号１２のそれぞれ残りのアミノ酸残基、すなわち、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基１６〜４８、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基１９〜４８、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２１〜４８、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２２〜４８、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基２６〜４８、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基３１〜４８、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基３６〜４８、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基４１〜４８、
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基４６〜４８、もしくは
遺伝子型Ｃのアミノ酸残基４７〜４８、
を含み、これらは、配列番号１２のそれぞれのアミノ酸残基に同一であるか、またはそれらの誘導体であるかのいずれかである。
ここで誘導体は、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、改変アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはペプチド模倣物から選択される少なくとも１個の改変を含み、
ここで上記少なくとも１個の改変は、１個、２個、３個、４個、５個もしくはこれ以上の改変である。
【００９５】
好ましいアミノ酸置換は、本明細書に記載されている。
【００９６】
好ましくは、Ｐは、以下から選択されるアミノ酸配列を含む：
−配列番号１２のアミノ酸残基２〜１５、およびこれに隣接して、配列番号１２のアミノ酸残基１６〜４８の誘導体を含むアミノ酸配列；
−配列番号１２のアミノ酸残基２〜２０、およびこれに隣接して、配列番号１２のアミノ酸残基２１〜４８の誘導体を含むアミノ酸配列；
−配列番号１２のアミノ酸残基２〜２５、およびこれに隣接して、配列番号１２のアミノ酸残基２６〜４８の誘導体を含むアミノ酸配列；
−配列番号１２のアミノ酸残基２〜３０、およびこれに隣接して、配列番号１２のアミノ酸残基３１〜４８の誘導体を含むアミノ酸配列；
−配列番号１２のアミノ酸残基２〜３５、およびこれに隣接して、配列番号１２のアミノ酸残基３６〜４８の誘導体を含むアミノ酸配列；
−配列番号１２のアミノ酸残基２〜４０、およびこれに隣接して、配列番号１２のアミノ酸残基４１〜４８の誘導体を含むアミノ酸配列；
−配列番号１２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列；
ここで誘導体は、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、改変アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはペプチド模倣物から選択される少なくとも１個の改変を含み、
ここで上記少なくとも１個の改変は、１個、２個、３個、４個、５個もしくはこれ以上の改変である。
【００９７】
遺伝子型Ｃ配列の好ましい実施形態において：
Ｐは、配列番号１２、またはそれぞれに記載される改変体／誘導体／改変から選択されるアミノ酸配列を含み、
Ｈは、ミリストイル（Ｃ１４）もしくはステアロイル（Ｃ１８）、好ましくは、ミリストイル（Ｃ１４）でのアシル化による疎水性改変である。
【００９８】
ミリストイル化による改変は、その高い安全性（例えば、ステアロイル基の悪影響（先天的免疫応答など）がない）に起因して、インビボおよび医学的適用で好ましい。
【００９９】
従って、本発明のより好ましい疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、
ＨＢＶｐｒｅＳ／（−１１）−４８ミリストイル（Ｃ） ［配列番号４］
ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ミリストイル（Ｃ） ［配列番号１２］
ＨＢＶｐｒｅＳ／２−２１ミリストイル（Ｃ） ［配列番号１３］
ＨＢＶｐｒｅＳ／５−２１ミリストイル（Ｃ） ［配列番号１４］
ＨＢＶｐｒｅＳ／９−１５ミリストイル（Ｃ） ［配列番号１５］、
であり：もっとも好ましくは、
ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ミリストイル（Ｃ） ［配列番号１２］
である。
【０１００】
上記ｐｒｅＳ由来ペプチドＰの上記Ｃ末端改変（Ｒ）は、好ましくは、分解（例えば、インビボでの分解）から保護する部分での改変である。
【０１０１】
「Ｃ末端のもの」は、Ｃ末端（すなわち、それぞれの最後のアミノ酸残基）における改変をいうが、上記Ｃ末端付近（例えば、最後から２番目のアミノ酸残基、最後から４番目のアミノ酸残基しくはそれ以降のアミノ酸残基における改変（例えば、酵素分解（例えば、カルボキシペプチダーゼの作用による）からキャリアを保護する１個のＤアミノ酸の導入）もまた含む。
【０１０２】
当業者は、それぞれの適用に依存して、それぞれの適した部分を選択し得る。
【０１０３】
分解から保護する好ましい部分は、アミド、Ｄ−アミノ酸、改変アミノ酸、環状アミノ酸；天然および合成のポリマー（例えば、ＰＥＧ、ｇｌｙｃａｎｅ）から選択される。
【０１０４】
一実施形態において、Ｐは、ペプチドもしくはタンパク質（好ましくは、アルブミン、ヒトＩｇＧのＦｃドメインから選択される）に融合される。
【０１０５】
上記融合は、好ましくは、ＰのＣ末端のものである。
【０１０６】
さらに、ｎは、０または少なくとも１である（すなわち、Ｃ末端改変（Ｒ）は、選択肢的である）。
【０１０７】
好ましくは、ｎは、１である。
【０１０８】
本発明のさらなる実施形態において、ｎは、１、２、３、４もしくはこれ以上である。すなわち、上記ＰのＣ末端もしくはその付近は、１個より多くの部分もしくは基（例えば、２個）で改変され得る。上記部分もしくは基は、互いに同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【０１０９】
本発明の一実施形態において、Ｈおよび／もしくはＲは、リンカーもしくはスペーサーを介してＰに連結される。
【０１１０】
リンカーもしくはスペーサーは、当業者に公知であり、例えば、ポリアラニン、ポリグリシン、糖質、（ＣＨ２）ｎ基がある。
【０１１１】
当業者は、従って、それぞれの適用に依存して、それぞれの適切なリンカーもしくはスペーサーを選択し得る。
【０１１２】
好ましい実施形態において、本発明に従う疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、標識もしくはタグ（好ましくは、蛍光色素、放射性同位体および造影剤から選択される）を有する。
【０１１３】
好ましい放射性同位体は、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９９ｍＴｃ、１８Ｆ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、１７７Ｌｕである。
【０１１４】
好ましい蛍光色素は、Ａｌｅｘａ色素、ローダミンおよびフルオレセインの誘導体、Ｃｙ−色素である。
【０１１５】
好ましい造影剤は、ガドリニウム（Ｇｄ）錯体、超磁性鉄（Ｆｅ）錯体および粒子、より高い原子番号の原子を含む化合物（すなわち、コンピュータートモグラフィー（ＣＴ）用のヨウ素、マイクロバブルおよびキャリア（例えば、これら造影剤を含むリポソーム）である。
【０１１６】
本発明のペプチドは、当業者に公知の種々の手順によって、一般に、合成化学手順および／もしくは遺伝子操作手順によって、調製され得る。
【０１１７】
合成化学手順としては、より具体的には、固相逐次合成およびブロック合成（１１）が挙げられる。上記固相逐次手順は、確立された自動化方法を使用して（例えば、自動化ペプチド合成器の使用によって）行われ得る。この手順において、α−アミノ保護されたアミノ酸は、樹脂支持体に結合される。上記使用される樹脂支持体は、（ポリ）ペプチドの固相調製のために当該分野で従来から使用されている任意の適切な樹脂（好ましくは、ポリオキシエチレンと共重合化されて、最初に導入されたｏ−編みの保護されたアミノ酸とエステル形成のための部位を提供するポリスチレン）であり得る。この最適化された方法は、本発明者らによって適用され、明確に記載されてきた（例えば、１２を参照のこと）。上記アミノ酸は、１個ずつ（段階的に）導入される。１個のアミノ酸の導入に対応する各合成サイクルは、脱保護工程、連続洗浄抗体、上記アミノ酸の活性化を伴うカップリング工程、およびその後の洗浄工程を包含する。これら工程の各々似続いて、濾過が行われる。カップリングのための反応性薬剤は、（ポリ）ペプチド合成のための伝統的な反応性薬剤（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ヒドロキシベンゾトリアゾール、ベンゾトリアジル−１−イル−オキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、およびジフェニルホスホリルアジド）である。上記樹脂上でのポリペプチドの合成の後に、上記ポリペプチドは、アニソール、エタンジチオールもしくは２−メチルインドールの存在下で、強酸（例えば、トリフルオロ酢酸）で処理することによって、上記樹脂から分離される。次いで、上記化合物は、伝統的な精製技術（特に、ＨＰＬＣ）によって精製される。
【０１１８】
本発明のペプチドはまた、選択的に保護されている（ポリ）ペプチドフラグメントをカップリングすることによって、得られ得、このカップリングは、例えば、溶液中で行われる。
【０１１９】
上記ペプチドはさらに、例えば、当業者に公知の遺伝子操作技術によってさらに生成され得る。真核生物発現系（例えば、バキュロウイルス系）は、特に適している。この手順によれば、タンパク質は、異種タンパク質をコードする核酸配列および調節核酸配列（例えば、プロモーター）を含む組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞において発現される。いくつかの細胞株は、組換えバキュロウイルスでの感染に利用可能である（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手可能な細胞株Ｓｆ−９（ＣＲＬ １７１１））。原核生物発現系（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現はまた、特に適している。
【０１２０】
上記ペプチドへの上記疎水性部分の導入は、当業者に容易に公知である種々の手順（合成および遺伝子操作アプローチが挙げられる）によって達成され得る。
【０１２１】
あるいは、上記ペプチドおよび／もしくは融合ペプチド（すなわち、疎水性改変ペプチド）は、ＣＨＯおよび当該分野で公知であり、かつ通常ワクチンなどを生成するために使用される他の細胞株のような、安定にトランスフェクトした真核生物細胞株によって生成され得る。Ｎ末端の４７個のｐｒｅＳ１アミノ酸が、ミリストイル化タンパク質／ペプチドの分泌を促進するというその本質的な特性に起因して、上記生物学的に活性な疎水性改変ペプチドは、細胞培養上清から抽出され得る。
【０１２２】
（本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドの特徴）
本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、融通の利く肝炎ウイルス侵入インヒビターであり、また、肝臓向性（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｓｍ）／肝臓向性（ｌｉｖｅｒ ｔｒｏｐｉｓｍ）（すなわち、それらは、肝臓を標的とする）を示す。上記肝臓向性は、特に、図１１に示される。
【０１２３】
上記肝臓向性は、本発明者らの対応米国仮特許出願（同日に出願され、その全体が本明細書に参考として援用される、発明の名称「Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｅＳ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ （ＨＢＶ） ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ａｓ ｖｅｈｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｔｏ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ」）においてさらに開示されている。
【０１２４】
本発明のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、インビトロ（例えば、肝細胞へのＨＢＶ粒子の結合および／もしくはインターナリゼーションを防止することによって）またはインビボかのいずれかで、ＨＢＶの非常に適切かつ有効な侵入インヒビターであるが、ＨＤＶについても同様である。
【０１２５】
図面および実施例から認められ得るように、本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、高い阻害活性を有し、すなわち、これらは、非常に低用量において、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染を効率的に阻害する。上記より好ましい実施形態のＩＣ５０値は、０．０１〜５００ｎＭ、好ましくは、０．０２５〜５０ｎＭ、より好ましくは、０．０５〜２５ｎＭの範囲内である。表１もまた参照のこと。
【０１２６】
遺伝子型Ｃに由来する本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、その対応する遺伝子型Ｄのものよりも強力にＨＢＶ感染を阻害する。
【０１２７】
さらに、本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、免疫原性エピトープを含まないが、強い阻害活性をなお示すように、調節され得る（例えば、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−２１ステアロイル）。これは、その配列中に上記免疫原性エピトープを含まないが、約８ｎＭのＩＣ５０をなお有する。
【０１２８】
本発明のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドはまた、ＨＢＶ 遺伝子型ＣおよびＤを交叉予防し得る。なぜなら、遺伝子型Ｃに由来するペプチド（例えば、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−２１ステアロイル（Ｃ）もしくはＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ミリストイル（Ｃ））は、ＨＢＶ遺伝子型Ｄの侵入を阻害し得るからである。
【０１２９】
（薬学的組成物およびワクチン組成物）
上記で概説されるように、本発明は、本明細書で定義される少なくとも１つのＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド、ならびに必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアおよび／もしくは賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。
【０１３０】
本発明に従う薬学的組成物は、以下を含む：
−本明細書で定義される少なくとも１つのＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド；
−本明細書で定義される結合体；および
−必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアおよび／もしくは賦形剤。
【０１３１】
本発明に従う薬学的組成物は、本明細書で記載される使用および方法のすべてに非常によく適している。
【０１３２】
上記で概説されるように、本発明は、本明細書で定義される少なくとも１つのＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド、ならびに必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアおよび／もしくは賦形剤を含むワクチン組成物を提供する。
【０１３３】
本発明に従うワクチン組成物は、本明細書に記載される使用および方法に非常によく適している。
【０１３４】
「薬学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤」とは、本発明に従う薬学的組成物もしくはワクチン組成物がそこでもしくは一緒に処方され得る任意のビヒクルをいう。これは、生理食塩水（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水）を含む。一般に、希釈剤もしくはキャリアは、投与の態様および経路、ならびに標準的な薬学的実務に基づいて選択される。
【０１３５】
（医学的適用）
上記で概説されるように、本発明は、ＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドおよび／もしくは本発明のそれぞれの薬学的組成物の第１の医療用途を提供する。
【０１３６】
従って、本発明に従うＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは薬学的組成物は、疾患の診断、予防および／もしくは処置のために適切であり、従って、そのために提供される。
【０１３７】
上記で概説されるように、本発明は、特定の疾患の診断、予防および／もしくは処置のために、本発明のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドおよび／もしくはそれぞれの薬学的組成物をさらに提供する。
【０１３８】
好ましい実施形態において、本発明のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは薬学的組成物は、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染の阻害ために；ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶの一次感染の予防のために、ならびに／またはＢ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎の処置のために、好ましくは、慢性Ｂ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎の処置のために、提供される。
【０１３９】
好ましい実施形態において、本発明のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは薬学的組成物は、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染の阻害のための；ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶの一次感染の予防のための、ならびに／またはＢ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎の処置のための医薬の製造のために、使用される。
【０１４０】
好ましくは、本発明のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは薬学的組成物は、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染の阻害のために提供される。
【０１４１】
好ましくは、本発明のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは薬学的組成物は、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶの一次感染の予防のために提供される。
【０１４２】
好ましくは、ＨＢＶの任意の遺伝子型のＨＢＶ感染が、阻害されるかもしくは予防される。
【０１４３】
本発明のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、ＨＢＶ 遺伝子型ＣおよびＤを交叉予防し得る。なぜなら遺伝子型Ｃに由来するペプチド（例えば、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−２１ステアロイル（Ｃ）もしくはＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ミリストイル（Ｃ））は、ＨＢＶ 遺伝子型Ｄの侵入を阻害し得るからである。
【０１４４】
好ましい実施形態において、本発明のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは薬学的組成物は、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶの侵入インヒビターとして使用される／提供される。
【０１４５】
好ましくは、本発明のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは薬学的組成物は、Ｂ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎の、特に慢性Ｂ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎の処置のために提供される。
【０１４６】
本発明のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドは、インビトロ（例えば、肝細胞へのＨＢＶ粒子の結合および／もしくはインターナリゼーションを防止することによって）またはインビボのいずれかで、ＨＢＶ、しかしまた、ＨＤＶの非常に適切かつ有効な侵入インヒビターである。
【０１４７】
さらに、本発明は、ＨＢＶによる肝細胞感染のインビトロ阻害のための方法を提供し、上記方法は、上記疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは薬学的組成物を使用する工程を包含する。
【０１４８】
適切な肝細胞としては、ヒト初代肝細胞もしくは肝癌由来細胞株ＨｅｐａＲＧ（２２）（特許出願ＦＲ ０１０９０４４に記載される）、Ｔｕｐａｉａ ｂｅｌａｎｇｅｒｉ由来の肝細胞（２３）が挙げられ、これらはまた、ＨＢＶ感染に感受性である。
【０１４９】
さらに、および上記で概説されるように、本発明は、本発明のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは薬学的組成物を利用することによって、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染を阻害するための方法；ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶの一次感染を予防するための方法、ならびに／または（慢性）Ｂ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎を処置するための方法を提供する。
【０１５０】
（投与経路）
好ましくは、本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは薬学的組成物の投与経路は、皮下、静脈内、経口、経鼻、筋肉内、経皮、吸入可能なもの、坐剤によるものから選択される。
【０１５１】
経鼻投与もしくは適用のための好ましい実施形態は、鼻用スプレーである。
【０１５２】
（治療上有効な量）
本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは薬学的組成物は、それらが上記薬学的組成物で、治療上有効な量の上記疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドを含むように、提供される。
【０１５３】
本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドもしくは薬学的組成物の「治療上有効な量」とは、ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染を阻害するために；ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶの一次感染を予防するために；Ｂ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎を処理するために、そして／あるいはインビボでＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶに対するワクチン接種する、ならびに／またはその侵入を阻害するのに十分である量をいう。
【０１５４】
好ましい、治療上有効な量は、１ｋｇ 体重あたり、１０μｇ〜１ｍｇ、好ましくは、１０μｇ〜１００μｇの範囲内である。
【０１５５】
ワクチンとしての本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドの使用については、上記好ましい治療上有効な量は、１ｋｇ体重あたり、１０μｇ〜１ｍｇの範囲内である。
【０１５６】
約１０ｎＭという、使用される疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドのＩＣ５０値の場合、好ましい治療上有効な量は、約１００μｇ／ｋｇ体重であるか、または患者１名あたり１〜５ｍｇの範囲内である。患者１名あたり１〜５ｍｇの範囲内の上記好ましい治療上有効な量は、１日に１階投与され得るか、または他の実施形態においては、わずか２〜３日ごとに１階投与され得る。
【０１５７】
上記好ましい治療上有効な量は、それぞれの適用、および望ましい阻害、処置もしくはワクチン接種の結果に依存する。
【０１５８】
当業者は、適切な治療上有効な量を決定し得る。
【０１５９】
（ＨＢＶレセプターの同定）
本発明はさらに、ＨＢＶの結合および／もしくは侵入に関与する肝細胞レセプターのインビトロおよび／もしくはインビボでの同定、ならびに／または上記の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドを使用する工程を包含する、上記レセプターの発現の定量のための方法に関する。
【０１６０】
上記肝細胞レセプターは、哺乳動物もしくはそれぞれの動物モデル（好ましくは、マウスもしくはヒト）において同定され得る。
【０１６１】
特に、上記方法は、以下の工程を包含する：
−肝臓生検物もしくは肝細胞と、本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドとを、肝細胞の表面において発現されるレセプターへの上記ペプチドの特異的結合を可能にするに十分な条件下および期間にわたって、接触させる工程；
−レセプターへの上記ペプチドの結合を決定する工程；および
−上記レセプターを同定する工程。
【０１６２】
これは、当業者によって周知の古典的手順に従って達成され得る。例えば、これは、本発明の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドの放射活性標識、酵素標識もしくは経口標識、および適切な方法でのその後の検出を包含し得る。多くの蛍光物質が公知であり、標識として利用され得る。これらとしては、例えば、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＤＩＧＥ標識が挙げられる。酵素標識は、目的の分子（例えば、ポリペプチド）への酵素の結合体化を含み、比色的技術、分光光度的技術、もしくは蛍光分光光度的技術のいずれかによって検出され得る。
【０１６３】
本発明者らは、インビトロおよびインビボでＨＢＶ侵入を効率的にブロックする、ＨＢＶ−ｐｒｅＳ１−表面タンパク質由来リポペプチドを同定した。これら阻害性ペプチドに関する本発明の生体分布研究は、上記ペプチドが、肝臓中に選択的に蓄積され、ここで肝細胞へ結合し、そしておそらく肝細胞へ侵入することを明らかにした。この肝細胞向性は、上記ペプチドのＮ末端アシル化を要し、Ｎ末端の４７個のｐｒｅＳ１アミノ酸内の（すなわち、上記アミノ酸残基２〜２１（もしくは好ましくは、残基９〜１５の最小配列）内の）特定のＨＢＶ ｐｒｅＳ配列モチーフに依存する。このペプチド配列が、形質膜を横断してさらに完全な融合タンパク質の輸送を促進する膜移動シグナル（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）をさらに有する（未発表結果）という本発明者らの観察は、任意の種の薬物を、肝細胞の形質膜へ特異的に送達するか、またはこの細胞へすら選択的に送達するという可能性を開く。
【０１６４】
本発明者らは、ＨＢＶ ｐｒｅＳ１由来リポペプチドが、移植されたｕＰＡ−ＲＡＧ−１マウスモデルにおいて、非常に低用量でＨＢＶ感染を完全に予防し得ることを示した。これらＨＢＶｐｒｅＳ由来侵入インヒビターに関する薬物動態研究はさらに、並外れて高い血清安定性（ｔ１／２ 約６０時間）と合わせて、顕著な肝臓向性、および標的器官における長期の半減期（ｔ１／２ 約２４時間）を示した。Ｎ末端アシル化および上記ペプチドの特定のアミノ酸配列の完全性の両方が、必要である。上記ペプチドは、従って、肝細胞の感染を抑えるために、または肝細胞癌を処置するために、肝臓特異的薬物標的化のための融通の利くベクターとしても使用され得る（同日付で出願された発明の名称「Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｅＳ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ （ＨＢＶ） ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ａｓ ｖｅｈｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｔｏ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ」の本発明者らの対応米国仮特許出願もまた参照のこと）。
【０１６５】
本発明者らは、ＷＭＨＢＶ感染が、インビボでのＨＢＶエンベロープタンパク質由来ペプチドの皮下適用を介して効率的にブロックされ得るという原理をさらに証明した。このことは、急性ＨＢＶ感染の予防および慢性Ｂ型肝炎の治療選択肢のための新たな展望を開く。本発明において使用される上記ｕＰＡ／ＲＡＧ−２／Ｐｆｐマウスは、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞を欠いているので、感受性肝細胞に対する上記ペプチドの直接的阻害効果が評価される。このことは、肝臓におけるアシル化ｐｒｅＳ由来ペプチドの効率的蓄積、続いて、胆管経路をおそらく介するゆっくりとしたクリアランスによって裏付けられる。両方の特性が、非常に低用量かつ低頻度での皮下適用を可能にする。５日以内で０．２ｍｇ／ｋｇ ＨＢＶ／ｐｒｅＳ２−４８ミリストイルの５回の注射が、ＷＭＨＢＶ感染の樹立の予防を生じたと仮定すると、約３０倍以上の活性ペプチドＨＢＶ／ｐｒｅＳ２−４８ステアロイルの連続投与は、７μｇ／ｋｇ未満の用量において、毎日もしくは２日ごとに与えられる場合には約１３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で有効であり得る。マウスにおいて得られた体重あたり、効率的な薬理学的用量が、約１０倍してヒトについて較正されなければならない（１３）ことを考慮に入れると、一人あたりの有効用量は、１００μｇ／日より低いと予測される。
【０１６６】
慢性ＨＢＶ感染の処置のためのヌクレオシド（ヌクレオチド）アナログベースのレジメンは、しばしば、耐性変異体の選択を生じた（４，１４）。このことは、ＨＢＶ複製サイクルの異なる工程に対処する、代替のストラテジーおよび新たな薬物を要求する。ＨＢＶリポペプチドでの侵入阻害は、このようなアプローチを代表する。作用様式に依存して、本発明者らは、任意の種のヌクレオシド（ヌクレオチド）耐性変異体に対する有効性を想定する。さらに、上記ペプチドの活性は、上記ｐｒｅＳ１ドメインにおける保存された配列を要する（１５）ので、上記ペプチドは、任意のＨＢＶ−遺伝子型に対して活性である。ＨＩＶ ｇｐ４１タンパク質を標的とし、従って、分子内代償変異の出現を可能にするＦｕｚｅｏｎ（登録商標）とは対照的に、以前の研究は、アシル化ＨＢＶ−リポペプチドが、細胞成分に対処して、ＨＢＶとそのレセプターとの相互作用を防止することを示す（１６，１７）。従って、耐性変異体の出現は、ありそうにないようである。
【０１６７】
ＨＢＶｐｒｅＳ由来リポペプチドの臨床的適用のための明らかな適応症は、まだ樹立されていないＨＢＶ感染の予防（例えば、曝露後予防、垂直伝播もしくは肝臓移植の再感染の予防）である。しかし、侵入インヒビターはまた、例えば、インターフェロンαもしくはウイルスＲＴのインヒビターとの組み合わせにおいて、慢性的に感染した患者において有効である。ＨＢＶ慢性感染の維持は、一方では、免疫系によって一掃された感染肝細胞の動的ターンオーバーに、および他方では、治癒した細胞／未感染細胞（ｎａｉｖｅ ｃｅｌｌ）の（再）感染に依存し得る（１８）ので、感染の広がりを抑制し、かつ抗ウイルス処置かで耐性株の出現を抑制するために、ｕＰＡキメラ系におけるこのような治療アプローチの効力を評価することは、興味深い（１９）。
【０１６８】
ＨＢＶｐｒｅＳ由来リポペプチドはまた、ＨＤＶ（肝細胞への侵入のためにＨＢＶエンベロープタンパク質を利用するサテライトウイルソイド）のインビトロ感染を阻害する（１５，１７，２０）。今日までに、ＨＤＶ乾癬の有効な治療は存在しなかったので、ｐｒｅＳ由来リポペプチドは、このしばしば複雑化した肝臓疾患の第１の選択的治療を代表する。
【０１６９】
免疫能のある患者におけるＨＢＶｐｒｅＳ由来リポペプチドの適用は、細胞性免疫反応および体液性免疫反応を誘発する。このことは、治療結果にとって有益である。なぜなら、ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８のエピトープを認識する抗体は、インビトロでのＨＢＶ感染を中和することが公知だからである（２１）。さらに、天然の感染におけるウイルス排除は、ＨＢＶｐｒｅＳ特異的免疫の連続的確立を要することが推測された。従って、ウイルス侵入の直接的介入に加えて、上記ペプチドによるｐｒｅＳ特異的免疫応答の刺激は、細胞溶解性もしくは非細胞溶解性免疫反応を介して、特に、ＩＦＮαと組み合わせて、ウイルス排除に寄与し得る。
【０１７０】
【表１−１】
【０１７１】
【表１−２】
ミリストイルとは、上記Ｎ末端のミリストイル化をいう；
パルミトイルとは、Ｎ末端のパルミトイル化をいう；
ステアロイルとは、Ｎ末端のステアロイル化をいう；
（Ｃ）とは、遺伝子型Ｃ（配列番号４におけるように、Ｑ４６Ｋを有する）をいう；
（Ｄ）とは、遺伝子型Ｄをいう；
＊ペプチドは、図に示される；
＊＊最小配列。
【０１７２】
【表２】
ミリストイルとは、Ｎ末端のミリストイル化をいう；
ステアロイルとは、Ｎ末端のステアロイル化をいう；
（Ｃ）とは、遺伝子型Ｃ（配列番号４におけるように、Ｑ４６Ｋを有する）をいう；
（Ｄ）とは、遺伝子型Ｄをいう。
【０１７３】
【表３】
図３もまた参照のこと。
ここで（Ｃ）とは、ＨＢＶ 遺伝子型Ｃ Ｑ４６Ｋをいう。
【０１７４】
【表４】
図４もまた、参照のこと。
【０１７５】
【表５】
図５もまた、参照のこと。
【０１７６】
【表６】
図６もまた、参照のこと。
【０１７７】
【表７】
図７もまた参照のこと。
【０１７８】
【表８】
配列番号１６のレトロインベルゾアミノ酸配列は、Ｃ末端からＮ末端の方向。
図８もまた参照のこと。
【０１７９】
【表９】
図９もまた参照のこと。
【実施例】
【０１８０】
（方法）
（ＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドの合成）
合成を、例えば、（１６）に記載されるように行った。
【０１８１】
（細胞株および初代細胞培養物）
ＨｅｐａＲＧ細胞を、ウイリアムのＥ培地（１０％ ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００ユニット／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、５μｇ／ｍｌ インスリンおよび５×１０−５Ｍ ヒドロコルチゾンヘミスクシネートを補充）中で増殖させた（１６）。細胞を、２週間ごとにトリプシン処理によって１／５を継代した。感染の２〜３週間前に、細胞分化を、２％ ＤＭＳＯを維持培地に添加することによって誘導した。上記培地を、２〜３日ごとに交換した。
【０１８２】
（感染競合アッセイ）
感染性接種物として、制限なしの供給および一定の品質があるので、ＨｅｐＧ２クローン２．２．１５（２３）細胞の５０倍濃縮した培養培地を使用した。これを、新たに集めた上清から、６％ ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００の存在下でウイルス粒子を沈殿させることによって調製した。そのペレットを、２５％ ＦＣＳを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で懸濁した。アリコートを、−８０℃において保存した。分化したＨｅｐａＲＧ細胞もしくはＰＨＨを、２０時間にわたって３７℃において、４％ ＰＥＧ ８０００（Ｓｉｇｍａ）を補充した培養培地中で１０倍希釈した上記濃縮した感染源とともにインキュベートした。上記インキュベーションの最後に、細胞を、上記培養培地で３回洗浄し、２％ ＤＭＳＯおよび５×１０−５Ｍ ヒドロコルチゾンヘミスクシネートの存在下で維持し、示された時間において採取した。
【０１８３】
競合実験を、１２ウェルプレートにおいて行った。約１×１０６細胞を最初に、３０分間にわたって、化学的に合成したＨＢＶ由来ペプチドとともに予備インキュベートし、続いて、細胞と、ペプチドおよびウイルスとを２０時間にわたって同時インキュベートした。すべての競合シリーズを、少なくとも２回行い、１つの代表的実験の結果を、各場合において示す（図３〜７を参照のこと）。
【０１８４】
ＨｅｐａＲＧ細胞を、以下の非存在（０ｎＭ）下もしくは存在下でいずれかに感染させた：
−以下を１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭ、および２０００ｎＭ
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ミリストイル（Ｄ）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ミリストイル（Ｃ）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／（−１１）−４８ミリストイル（Ｃ）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｃ）および
・ＨＢＶｐｒｅＳ／（−１１）−４８ステアロイル（Ｃ）；または
−以下を０．１２５ｎＭ；０．２５ｎＭ；０．５ｎＭ；０．７５ｎＭおよび１ｎＭ
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ミリストイル（コンセンサス）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ ステアロイル（コンセンサス）、
−以下を１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭおよび１０００ｎＭ
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｄ）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−１５ステアロイル（Ｄ）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−２１ステアロイル（Ｄ）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−２６ステアロイル（Ｄ）および
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−３３ステアロイル（Ｄ）；または
−以下を１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎＭ
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｄ），
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−３３ステアロイル（Ｄ），
・ＨＢＶｐｒｅＳ／５−３３ステアロイル（Ｄ），
・ＨＢＶｐｒｅＳ／５−４８ステアロイル（Ｄ），
・ＨＢＶｐｒｅＳ／９−３３ステアロイル（Ｄ）および
・ＨＢＶｐｒｅＳ／９−４８ステアロイル（Ｄ）；または
−以下を１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎＭ
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｄ）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｄ−ＡＳ１１−１５）（Ｄ）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ａｌａ１１−１５）（Ｄ）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Δ１７−２１）（Ｄ）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ａｌａ１７−２１）（Ｄ）；または
−以下を１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎＭ
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（レトロインベルソ）（Ｄ）および
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ａｌａ２１，２３，２９，３０）（Ｄ）；または
−以下を１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎＭ
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ａｌａ１８）（Ｄ）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Δ１１−１５）（Ｄ）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｓｅｒ１３）（Ｄ）、
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ａｒｇ１１）（Ｄ）；または
−以下を５０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２５０ｎＭ、および１０００ｐＭ（０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．２５ｎＭ、および１ｎＭ）
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ミリストイル（Ｃ）および
・ＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ステアロイル（Ｃ）、
ここで（Ｃ）とは、ＨＢＶ 遺伝子型Ｃ Ｑ４６Ｋをいう。
【０１８５】
感染性接種物（遺伝子型ＤのＨＢＶ）および上記ペプチドを一晩インキュベートした。洗浄後、細胞を、さらに１２日間にわたって維持して、ウイルス遺伝子発現を可能にした。８〜１２日目の細胞培養上清を採取し、市販の定量的ＥＬＩＳＡを使用して、分泌ＨＢＳＡｇについて分析した。それぞれの不完全感染からのＨＢｓＡｇ値を、１００％に設定し、感染阻害の程度を、不完全感染の％単位で与える。
【０１８６】
結果を、図３〜９および図１２、同様に、表３〜９に示す。
【０１８７】
（疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドの生体分布）
上記疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドの生体分布を、雄性ＮＭＲＩマウスにおいて研究した。すべての実験を、ドイツ法に従って行った。Ｃ末端においてさらなるＴｙｒ−残基を含む上記ペプチドを、１３１Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で、クロラミン−Ｔ法によって標識し、ＨＰＬＣによって精製した。上記標識ペプチドを、５０％ ＤＭＳＯ中の溶液の注射によって皮下注射した。選択した時間において、マウスを屠殺し、血液、心臓、脾臓、肝臓、腎臓、筋肉および脳中に含まれる放射活性を、γ−カウンター（Ｃａｎｂｅｒｒａ Ｐａｃｋａｒｄ，Ｒｕｅｓｓｅｌｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定し、注射用量／ｇ 組織のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）として表した。
【０１８８】
（肝臓から抽出した後の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドの安定性評価）
肝臓における上記ペプチド安定性を決定するために、１３１Ｉ標識したＨＢＶｐｒｅＳ／２−４８ミリストイル（Ｄ）を、皮下注射の２４時間後に肝臓１葉から抽出した。その目的のために、１ｇ 凍結肝臓組織あたり１ｍｌ 水を、上記サンプルに添加した。均質化した後、等容積のアセトニトリルを添加し、上記均質化を反復した。遠心分離（４０００×ｇで２×１０分）後、この溶液を、逆相ＨＰＬＣカラム上で分離し、その各画分の放射活性を、γカウンターで定量した。
【０１８９】
前述の説明において、特許請求の範囲においておよび／もしくは添付の図面において開示される特徴は、別個に、およびこれらの任意の組み合わせの両方において、本発明をその多様な形態において実現するために必須であり得る。
【０１９０】
参考文献
【０１９１】
【化４−１】
【０１９２】
【化４−２】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド：
Ｈｍ−Ｐ−Ｒｎ，
であって、ここで
Ｐは、以下：
配列番号１に示される該ＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサス配列もしくはその改変体のアミノ酸配列
を含む該ｐｒｅＳ由来ペプチドであって、
ここで改変体は、好ましくは、配列番号１の少なくとも１７個連続するアミノ酸のＮ末端および／もしくはＣ末端が短縮された改変体；アミノ酸置換もしくは欠失改変体；改変アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはペプチド模倣物を含む改変体；から選択され、
Ｈは、該ｐｒｅＳ由来ペプチド Ｐの疎水性改変であり、該疎水性改変は、ＰのＮ末端のものでありかつ
好ましくは、カルボン酸、脂肪酸、Ｃ８〜Ｃ２２脂肪酸、親油性側鎖を有するアミノ酸でのアシル化、および
コレステロール、コレステロールの誘導体、リン脂質、糖脂質、グリセロールエステル、ステロイド、セラミド、イソプレン誘導体、アダマンタン、ファルネソール、脂肪族基、多環式芳香族化合物から選択される疎水性部分の付加
から選択され、
ｍは、少なくとも１であり、
Ｒは、該ｐｒｅＳ由来ペプチド ＰのＣ末端の改変であり、該Ｃ末端の改変は、
好ましくは、アミド、Ｄ−アミノ酸、改変アミノ酸、環式アミノ酸；天然および合成のポリマー（例えば、ＰＥＧ）、ｇｌｙｃａｎｅから選択される分解から保護するための部分、
であり、
ｎは、０もしくは少なくとも１である、
疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項２】
Ｈは、ミリストイル（Ｃ１４）、パルミトイル（Ｃ１６）もしくはステアロイル（Ｃ１８）でのアシル化から選択されるアシル化による疎水性改変である、請求項１に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項３】
Ｈおよび／もしくはＲは、リンカーもしくはスペーサーを介してＰに連結されている、請求項１または２に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項４】
Ｐは、配列番号１の少なくとも２０個連続するアミノ酸のＮ末端および／もしくはＣ末端が短縮された改変体を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項５】
Ｐは、配列番号１に示されるＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサス配列の、アミノ酸残基２〜２１、残基５〜２１、残基５〜１５もしくは残基９〜１５から選択されるアミノ酸配列を有する配列番号１の改変体を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項６】
Ｐは、配列番号１の残基９〜１５、好ましくは、配列番号１の残基９〜２２におけるアミノ酸置換および／もしくは欠失を含まない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項７】
Ｐは、異なるウイルス種、株もしくはサブタイプの、好ましくは、ＨＢＶもしくはウーリーモンキーＨＢＶ（ＷＭＨＢＶ）またはこれらの改変体の遺伝子型のアミノ酸配列を有する、配列番号１の改変体を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項８】
Ｐは、配列番号２〜１０から選択されるアミノ酸配列もしくはこれらの改変体を含む、請求項７に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項９】
Ｐは、配列番号１１〜２０から選択されるアミノ酸配列もしくはこれらの改変体を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項１０】
配列番号１のアミノ酸残基２０〜２３は、好ましくは、アミノ酸置換によって改変されているか、そして／もしくはアミノ酸残基２６〜３２は、好ましくは、アミノ酸置換によって改変されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項１１】
配列番号１のアミノ酸残基２０〜２３は、好ましくは、モチーフＡＰＡＦへのアラニンアミノ酸置換によって改変されている、請求項１０に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項１２】
配列番号１のアミノ酸残基２６〜３２は、好ましくは、モチーフＮＡＮＡＰＤＷもしくはＮＡＡＡＰＤＷへのアラニンアミノ酸置換によって改変されている、請求項１０または１１に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項１３】
Ｐは、配列番号２１〜２８から選択されるアミノ酸配列もしくはその改変体を含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項１４】
Ｐは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号４および配列番号２０から選択されるアミノ酸配列、好ましくは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項１５】
Ｈは、ミリストイル（Ｃ１４）もしくはステアロイル（Ｃ１８）、好ましくは、ステアロイル（Ｃ１８）でのアシル化による疎水性改変である、請求項１４に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項１６】
Ｐは、配列番号１２の少なくとも１０個連続するアミノ酸残基、好ましくは、配列番号１２の少なくとも１５個もしくは２０個連続するアミノ酸残基を含み、
より好ましくは、Ｐ中に含まれる配列番号１２の該連続するアミノ酸残基は、配列番号１２のアミノ酸残基９〜１５、アミノ酸残基２〜１５、アミノ酸残基９〜１８、アミノ酸残基２〜１８、アミノ酸残基２〜２０、アミノ酸残基２〜２１、アミノ酸残基５〜２１、アミノ酸残基２〜２５、アミノ酸残基２〜３０、アミノ酸残基２〜３５、アミノ酸残基２〜４０、アミノ酸残基２〜４５およびアミノ酸残基２〜４６から選択される、
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項１７】
Ｐは、
−配列番号１２のアミノ酸残基２〜１５、およびこれに隣接して、配列番号１２のアミノ酸残基１６〜４８の誘導体を含むアミノ酸配列；
−配列番号１２のアミノ酸残基２〜２０、およびこれに隣接して、配列番号１２のアミノ酸残基２１〜４８の誘導体を含むアミノ酸配列；
−配列番号１２のアミノ酸残基２〜２５、およびこれに隣接して、配列番号１２のアミノ酸残基２６〜４８の誘導体を含むアミノ酸配列；
−配列番号１２のアミノ酸残基２〜３０、およびこれに隣接して、配列番号１２のアミノ酸残基３１〜４８の誘導体を含むアミノ酸配列；
−配列番号１２のアミノ酸残基２〜３５、およびこれに隣接して、配列番号１２のアミノ酸残基３６〜４８の誘導体を含むアミノ酸配列；
−配列番号１２のアミノ酸残基２〜４０、およびこれに隣接して、配列番号１２のアミノ酸残基４１〜４８の誘導体を含むアミノ酸配列；ならびに
−配列番号１２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列；
から選択されるアミノ酸配列を含み、
ここで誘導体は、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、改変アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはペプチド模倣物から選択される少なくとも１個の改変を含み、
ここで該少なくとも１個の改変は、１個、２個、３個、４個、５個もしくはそれより多い改変である、
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項１８】
Ｐは、配列番号１２のアミノ酸配列または少なくとも１０個連続するアミノ酸のこの配列のＮ末端および／もしくはＣ末端が短縮された改変体、あるいは改変アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはペプチド模倣物を含むこれらの改変体を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項１９】
Ｈは、ミリストイル（Ｃ１４）もしくはステアロイル（Ｃ１８）、好ましくは、ミリストイル（Ｃ１４）でのアシル化による疎水性改変である、請求項１６または１９に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項２０】
好ましくは、蛍光色素、放射性同位体および造影剤から選択される標識を保持する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項２１】
好ましくは、アルブミンおよびヒトＩｇＧのＦｃドメインから選択される、ペプチドもしくはタンパク質に融合される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項２２】
請求項１または２１のいずれか１項に記載のＨＢＶの少なくとも１個の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド、ならびに必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアおよび／もしくは賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項２３】
疾患の診断、予防および／もしくは処置のための、請求項１または２１のいずれか１項に記載のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド、あるいは請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染の阻害のための、請求項１または２１のいずれか１項に記載のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド、あるいは請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶの一次感染の予防のための、請求項１または２１のいずれか１項に記載のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド、あるいは請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
任意の遺伝子型のＨＢＶのＨＢＶ感染は、阻害されるかもしくは予防される、請求項２４または２５に記載の、ＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドまたは薬学的組成物。
【請求項２７】
ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ侵入インヒビターとしての、請求項２４または２５に記載のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドまたは薬学的組成物。
【請求項２８】
Ｂ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎、特に、慢性Ｂ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎の処置のための、請求項１または２１のいずれか１項に記載のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド、あるいは請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
治療上有効な量の、請求項１または２０のいずれか１項に記載のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド、あるいは請求項２１に記載の薬学的組成物を含む、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドまたは薬学的組成物。
【請求項３０】
前記治療上有効な量は、１０μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ 体重、好ましくは、１０μｇ〜１００μｇの範囲である、請求項２９に記載のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドまたは薬学的組成物。
【請求項３１】
投与経路は、皮下、静脈内、経口、経鼻、筋肉内、経皮、吸入、坐剤によるものから選択される、請求項２９または３０に記載のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドまたは薬学的組成物。
【請求項３２】
ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染の阻害のための；ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶの一次感染の予防のための、ならびに／あるいはＢ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎の処置のための、医薬の製造のための、請求項１または２１のいずれか１項に記載のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドあるいは請求項２２に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項３３】
請求項１または２１のいずれか１項に記載の、少なくとも１つのＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド、ならびに必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアおよび／もしくは賦形剤を含む、ワクチン組成物。
【請求項３４】
請求項１または２１のいずれか１項に記載の、少なくとも１つのＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドを、治療上有効な量において含む、請求項３３に記載のワクチン組成物。
【請求項１】
以下の式のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド：
Ｈｍ−Ｐ−Ｒｎ，
であって、ここで
Ｐは、以下：
配列番号１に示される該ＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサス配列もしくはその改変体のアミノ酸配列
を含む該ｐｒｅＳ由来ペプチドであって、
ここで改変体は、好ましくは、配列番号１の少なくとも１７個連続するアミノ酸のＮ末端および／もしくはＣ末端が短縮された改変体；アミノ酸置換もしくは欠失改変体；改変アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはペプチド模倣物を含む改変体；から選択され、
Ｈは、該ｐｒｅＳ由来ペプチド Ｐの疎水性改変であり、該疎水性改変は、ＰのＮ末端のものでありかつ
好ましくは、カルボン酸、脂肪酸、Ｃ８〜Ｃ２２脂肪酸、親油性側鎖を有するアミノ酸でのアシル化、および
コレステロール、コレステロールの誘導体、リン脂質、糖脂質、グリセロールエステル、ステロイド、セラミド、イソプレン誘導体、アダマンタン、ファルネソール、脂肪族基、多環式芳香族化合物から選択される疎水性部分の付加
から選択され、
ｍは、少なくとも１であり、
Ｒは、該ｐｒｅＳ由来ペプチド ＰのＣ末端の改変であり、該Ｃ末端の改変は、
好ましくは、アミド、Ｄ−アミノ酸、改変アミノ酸、環式アミノ酸；天然および合成のポリマー（例えば、ＰＥＧ）、ｇｌｙｃａｎｅから選択される分解から保護するための部分、
であり、
ｎは、０もしくは少なくとも１である、
疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項２】
Ｈは、ミリストイル（Ｃ１４）、パルミトイル（Ｃ１６）もしくはステアロイル（Ｃ１８）でのアシル化から選択されるアシル化による疎水性改変である、請求項１に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項３】
Ｈおよび／もしくはＲは、リンカーもしくはスペーサーを介してＰに連結されている、請求項１または２に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項４】
Ｐは、配列番号１の少なくとも２０個連続するアミノ酸のＮ末端および／もしくはＣ末端が短縮された改変体を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項５】
Ｐは、配列番号１に示されるＨＢＶ ｐｒｅＳコンセンサス配列の、アミノ酸残基２〜２１、残基５〜２１、残基５〜１５もしくは残基９〜１５から選択されるアミノ酸配列を有する配列番号１の改変体を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項６】
Ｐは、配列番号１の残基９〜１５、好ましくは、配列番号１の残基９〜２２におけるアミノ酸置換および／もしくは欠失を含まない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項７】
Ｐは、異なるウイルス種、株もしくはサブタイプの、好ましくは、ＨＢＶもしくはウーリーモンキーＨＢＶ（ＷＭＨＢＶ）またはこれらの改変体の遺伝子型のアミノ酸配列を有する、配列番号１の改変体を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項８】
Ｐは、配列番号２〜１０から選択されるアミノ酸配列もしくはこれらの改変体を含む、請求項７に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項９】
Ｐは、配列番号１１〜２０から選択されるアミノ酸配列もしくはこれらの改変体を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項１０】
配列番号１のアミノ酸残基２０〜２３は、好ましくは、アミノ酸置換によって改変されているか、そして／もしくはアミノ酸残基２６〜３２は、好ましくは、アミノ酸置換によって改変されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項１１】
配列番号１のアミノ酸残基２０〜２３は、好ましくは、モチーフＡＰＡＦへのアラニンアミノ酸置換によって改変されている、請求項１０に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項１２】
配列番号１のアミノ酸残基２６〜３２は、好ましくは、モチーフＮＡＮＡＰＤＷもしくはＮＡＡＡＰＤＷへのアラニンアミノ酸置換によって改変されている、請求項１０または１１に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項１３】
Ｐは、配列番号２１〜２８から選択されるアミノ酸配列もしくはその改変体を含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項１４】
Ｐは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号４および配列番号２０から選択されるアミノ酸配列、好ましくは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項１５】
Ｈは、ミリストイル（Ｃ１４）もしくはステアロイル（Ｃ１８）、好ましくは、ステアロイル（Ｃ１８）でのアシル化による疎水性改変である、請求項１４に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項１６】
Ｐは、配列番号１２の少なくとも１０個連続するアミノ酸残基、好ましくは、配列番号１２の少なくとも１５個もしくは２０個連続するアミノ酸残基を含み、
より好ましくは、Ｐ中に含まれる配列番号１２の該連続するアミノ酸残基は、配列番号１２のアミノ酸残基９〜１５、アミノ酸残基２〜１５、アミノ酸残基９〜１８、アミノ酸残基２〜１８、アミノ酸残基２〜２０、アミノ酸残基２〜２１、アミノ酸残基５〜２１、アミノ酸残基２〜２５、アミノ酸残基２〜３０、アミノ酸残基２〜３５、アミノ酸残基２〜４０、アミノ酸残基２〜４５およびアミノ酸残基２〜４６から選択される、
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項１７】
Ｐは、
−配列番号１２のアミノ酸残基２〜１５、およびこれに隣接して、配列番号１２のアミノ酸残基１６〜４８の誘導体を含むアミノ酸配列；
−配列番号１２のアミノ酸残基２〜２０、およびこれに隣接して、配列番号１２のアミノ酸残基２１〜４８の誘導体を含むアミノ酸配列；
−配列番号１２のアミノ酸残基２〜２５、およびこれに隣接して、配列番号１２のアミノ酸残基２６〜４８の誘導体を含むアミノ酸配列；
−配列番号１２のアミノ酸残基２〜３０、およびこれに隣接して、配列番号１２のアミノ酸残基３１〜４８の誘導体を含むアミノ酸配列；
−配列番号１２のアミノ酸残基２〜３５、およびこれに隣接して、配列番号１２のアミノ酸残基３６〜４８の誘導体を含むアミノ酸配列；
−配列番号１２のアミノ酸残基２〜４０、およびこれに隣接して、配列番号１２のアミノ酸残基４１〜４８の誘導体を含むアミノ酸配列；ならびに
−配列番号１２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列；
から選択されるアミノ酸配列を含み、
ここで誘導体は、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、改変アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはペプチド模倣物から選択される少なくとも１個の改変を含み、
ここで該少なくとも１個の改変は、１個、２個、３個、４個、５個もしくはそれより多い改変である、
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項１８】
Ｐは、配列番号１２のアミノ酸配列または少なくとも１０個連続するアミノ酸のこの配列のＮ末端および／もしくはＣ末端が短縮された改変体、あるいは改変アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはペプチド模倣物を含むこれらの改変体を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項１９】
Ｈは、ミリストイル（Ｃ１４）もしくはステアロイル（Ｃ１８）、好ましくは、ミリストイル（Ｃ１４）でのアシル化による疎水性改変である、請求項１６または１９に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項２０】
好ましくは、蛍光色素、放射性同位体および造影剤から選択される標識を保持する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項２１】
好ましくは、アルブミンおよびヒトＩｇＧのＦｃドメインから選択される、ペプチドもしくはタンパク質に融合される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド。
【請求項２２】
請求項１または２１のいずれか１項に記載のＨＢＶの少なくとも１個の疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド、ならびに必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアおよび／もしくは賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項２３】
疾患の診断、予防および／もしくは処置のための、請求項１または２１のいずれか１項に記載のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド、あるいは請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染の阻害のための、請求項１または２１のいずれか１項に記載のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド、あるいは請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶの一次感染の予防のための、請求項１または２１のいずれか１項に記載のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド、あるいは請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
任意の遺伝子型のＨＢＶのＨＢＶ感染は、阻害されるかもしくは予防される、請求項２４または２５に記載の、ＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドまたは薬学的組成物。
【請求項２７】
ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ侵入インヒビターとしての、請求項２４または２５に記載のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドまたは薬学的組成物。
【請求項２８】
Ｂ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎、特に、慢性Ｂ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎の処置のための、請求項１または２１のいずれか１項に記載のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド、あるいは請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
治療上有効な量の、請求項１または２０のいずれか１項に記載のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド、あるいは請求項２１に記載の薬学的組成物を含む、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドまたは薬学的組成物。
【請求項３０】
前記治療上有効な量は、１０μｇ〜１ｍｇ／ｋｇ 体重、好ましくは、１０μｇ〜１００μｇの範囲である、請求項２９に記載のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドまたは薬学的組成物。
【請求項３１】
投与経路は、皮下、静脈内、経口、経鼻、筋肉内、経皮、吸入、坐剤によるものから選択される、請求項２９または３０に記載のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドまたは薬学的組成物。
【請求項３２】
ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶ感染の阻害のための；ＨＢＶおよび／もしくはＨＤＶの一次感染の予防のための、ならびに／あるいはＢ型肝炎および／もしくはＤ型肝炎の処置のための、医薬の製造のための、請求項１または２１のいずれか１項に記載のＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドあるいは請求項２２に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項３３】
請求項１または２１のいずれか１項に記載の、少なくとも１つのＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチド、ならびに必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアおよび／もしくは賦形剤を含む、ワクチン組成物。
【請求項３４】
請求項１または２１のいずれか１項に記載の、少なくとも１つのＨＢＶの疎水性改変ｐｒｅＳ由来ペプチドを、治療上有効な量において含む、請求項３３に記載のワクチン組成物。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１０】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１０】
【公表番号】特表２０１１−５１００３５（Ｐ２０１１−５１００３５Ａ）
【公表日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４３４４０（Ｐ２０１０−５４３４４０）
【出願日】平成２１年１月２６日（２００９．１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０００４７６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０９２６１１
【国際公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【出願人】（５１０２００９５６）ルプレヒト−カールス−ウニベルジタート ハイデルベルク (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月２６日（２００９．１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０００４７６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０９２６１１
【国際公開日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【出願人】（５１０２００９５６）ルプレヒト−カールス−ウニベルジタート ハイデルベルク (1)
【Ｆターム（参考）】
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