ＢＡＣＥ１抑制性抗体
本発明は、ＢＡＣＥ１に対する特異性を有する抗体に関する。より詳しくは、本発明は、ＢＡＣＥ１に結合しＢＡＣＥ１の活性を抑制しうるモノクローナル抗体、およびこれらの抗体の製造方法を提供する。該抗体は研究および医学的用途に使用されうる。具体的な用途はアルツハイマー病の治療のためのＢＡＣＥ１特異的抗体の使用を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＢＡＣＥ１に対する特異性を有する抗体に関する。より詳しくは、本発明は、ＢＡＣＥ１に結合しＢＡＣＥ１の活性を抑制しうるモノクローナル抗体、およびこれらの抗体の製造方法を提供する。該抗体は研究および医学的用途に使用されうる。具体的な用途はアルツハイマー病の治療のためのＢＡＣＥ１特異的抗体の使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（「ＡＤ」）は、世界中で数百万人の高齢患者を冒す破壊的な神経変性疾患であり、養護施設への入所の最も一般的な原因である。ＡＤは、記憶、定位、認知機能、判断および情緒安定性の進行性喪失により臨床的に特徴づけられる。加齢と共に、ＡＤの発症リスクは指数関数的に増加して、８５歳までに、該集団の約２０〜４０％が罹患する。記憶および認知機能は、軽度ないし中等度の障害の診断から最初の５年以内に急速に悪化し、疾患合併症による死亡が、避けられない結末である。ＡＤの確定診断は、患者からの脳組織の組織病理学的検査に基づいて、死後にはじめて可能となる。
【０００３】
ＡＤの２つの組織学的特徴は、共にＡＤ患者の大脳皮質内の、過リン酸化タウタンパク質の神経原線維タングルの、およびタンパク質性アミロイドプラークの生成である。該アミロイドプラークは、主に、ベータ−アミロイド（β−アミロイド、アミロイドベーターまたはＡベータとも称される）と称される３７〜４３アミノ酸のペプチドから構成される。Ａベータペプチドは、ベータアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰとも称される）と称される１型内在性膜タンパク質から２つの連続的タンパク質分解事象により誘導されることが現在明らかである。まず、ＡＰＰは、ベータ−セクレターゼ（膜結合アスパルチルプロテアーゼＢＡＣＥ１）と称される特異的タンパク質分解酵素により膜貫通アルファヘリックスのＮ末端の部位で加水分解される。この切断事象の可溶性Ｎ末端産物は膜から拡散し、Ｃ９９と称される膜結合Ｃ末端切断産物を後に残す。ついでタンパク質Ｃ９９は、ガンマ−セクレターゼと称される特異的タンパク質分解酵素により膜貫通アルファヘリックス内で更に加水分解される。この第２切断事象はＡベータペプチドを遊離し、膜結合「スタブ（ｓｔｕｂ）」を残す。このようにして生成したＡベータペプチドは細胞から細胞外マトリックス内に分泌され、その場所において、それは、ＡＤに関連したアミロイドプラークを最終的に形成する。
【０００４】
過去１００年間の精力的な研究にもかかわらず、ＡＤ患者の予後は現在もなお、１００年前と全く同じである。なぜなら、利用可能な真の治療法が尚も存在しないからである。２つのタイプの薬物、すなわち、アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）インヒビターおよびメマンチン（Ｍｅｍａｎｔｉｎｅ）が米国食品医薬品局により承認されており、ＡＤを治療するために臨床において現在使用されている。ＡＤ病因に特異的なアミロイドプラークの主要成分であるアミロイドベータペプチドがＡＤ疾患の発生において中心的な役割を果たしているという豊富な証拠が当技術分野に存在する（Ｈａｒｄｙら．２００２，Ｇｏｌｄｅら．２００６）。したがって、Ａβを低下させるための最も好ましい方法の１つは、γ−およびβ−セクレターゼインヒビターによりその産生を減少させることである。１つの方法はガンマ−セクレターゼインヒビターの開発であったが、ガンマ−セクレターゼは少なくとも３０種のタンパク質のタンパク質分解プロセッシングに関与しているため、そのようなインヒビターは、しばしば、重大な副作用を引き起こす（Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒら，２００３）。さらにもう１つの魅力的な方法はβ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ１）インヒビターの開発である。なぜなら、ＢＡＣＥ１ノックアウトマウスは生存可能であり、明らかな病的表現型を有さないからである（例えば、Ｒｏｂｅｒｄｓら，２００１、Ｏｈｎｏら，２００４、Ｏｈｎｏら，２００６）。
【０００５】
ＢＡＣＥ１はメマプシン２およびＡｓｐ２とも称され、５０１アミノ酸の１型膜結合型アスパルチルプロテアーゼであり、それはペプシンファミリーの真核生物アスパラギン酸プロテアーゼと相当な構造的特徴を共有する（例えば、Ｈｕｓｓａｉｎら，１９９９、Ｌｉｎら，２０００）。他のアスパラギン酸プロテアーゼと同様に、ＢＡＣＥ１はＮ末端シグナルペプチド（残基１−２１）およびプロ−ペプチド（２２−４５）を有する。該２１アミノ酸シグナルペプチドは該プロテアーゼをＥＲへ移動させ、その場所において該シグナルペプチドは切断除去され、ついでＢＡＣＥ１はその場所から細胞表面へと導かれる。トランス−ゴルジネットワーク（ＴＧＮ）を通過した後、ＢＡＣＥ１の一部は細胞表面に標的化され、その場所からそれは初期エンドソーム区画内にインターナリゼーションされる。ついでＢＡＣＥ１は細胞表面への直接的再循環経路に進入し、あるいは、リソソームまたはＴＧＮに行くことになる後期エンドソーム小胞に標的化される。ＴＧＮにおいては、それは細胞膜へ再輸送されうるであろう。成熟ＢＡＣＥ１は、その長い半減期および速い再循環速度を考慮すると、その寿命中に細胞表面、エンドソーム系およびＴＧＮの間を複数回にわたって循環しうる（例えば、Ｈｕｓｅら，２０００、Ｗａｈｌｅら，２００５）。β−部位におけるＡＰＰのＢＡＣＥ１媒介性切断は初期エンドソームにおいて生じ、この場所においては、その酵素活性のためには酸性環境が最適である。しかし、いわゆるシュウェディッシュ（Ｓｃｈｗｅｄｉｓｈ）突然変異を含有するＡＰＰが細胞基質として用いられた場合、β−切断はＥＲおよびＴＧＮにおいて優先的に生じた（Ｔｈｉｎａｋａｒａｎら，１９９６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Hardy，J．and Selkoe，D．J．（2002）The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease：progress and problems on the road to therapeutics．Science，297（5580）：353-6．
【非特許文献２】Golde TE， Dickson D，Hutton M．（2006）．Filling the gaps in the abeta cascade hypothesis of Alzheimer’s disease．Curr Alzheimer’s Res，3：421-430．
【非特許文献３】De strooper B （2003）：Aph-1，Pen-2，and Nicastrin with Presenilin generate an active γ−secretase complex．Neuron，38：9-12．
【非特許文献４】Roberds SL，Anderson J，Basi G，Bienkowski MJ，Branstetter DG，Chen KS，Freedman SB，Frigon NL，Games D，Hu K，et al（2001）：BACE knockout mice are healthy despite lacking the primary β−secretase activity in brain：implications for Alzheimer’s disease therapeutics．Hum Mol Genet，10：1317-1324．
【非特許文献５】Ohno M，Sametsky EA，Younkin LH，Oakley H，Younkin SG，Citron M，Vassar R，Disterhoft JF（2004）：BACE1 Deficiency Rescues Memory Deficits and Cholinergic Dysfunction in a Mouse Model of Alzheimer’s Disease．Neuron，41：27-33．
【非特許文献６】Ohno M，Chang L，Tseng W，Oakley H，Citron M，Klein WL，Vassar R，Disterhoft JF（2006）：Temporal memory deficits in Alzheimer’s mouse models：rescue by genetic deletion of BACE1．Eur J Neurosci，23：251-260．
【非特許文献７】Hussain I，Powell D，Howlett DR，Tew DG，Meek TD，Chapman C，Gloger IS，Murphy KE，Southan CD，Ryan DM，et al （1999）：Identification of a novel aspartic protease（Asp 2）as β−Secretase．Mol Cell Neurosci，14：419-427．
【非特許文献８】Lin X，Koelsch G，Wu S，Downs D，Dashti A，Tang J （2000）：Human aspartic protease memapsin 2 cleaves the β−secretase site of β-amyloid precursor protein．Proc Natl Acad Sci USA，97：1456-1460．
【非特許文献９】Huse JT，Pijak DS，Leslie GJ，Lee VM，Doms RW．（2000）Maturation and endosomal targeting of β−site amyloid precursor protein−cleaving enzyme．The Alzheimer’s disease β−secretase．J Biol Chem，275：33729-33737．
【非特許文献１０】Wahle，T．，Prager，K．，Raffler，N．，Haass，C．，Famulok，M． and Walter，J．（2005）GGA proteins regulate retrograde transport of BACE1 from endosomes to the trans-Golgi network．Mol．Cell．Neurosci．
【非特許文献１１】Thinakaran G，Teplow DB，Siman R，Greenberg B，Sisodia SS．（1996）Metabolism of the’Swedish’amyloid precursor protein variant in neuro2a（N2a）cells．Evidence that cleavage at the’beta-secretase’site occurs in the golgi apparatus．J Biol Chem．271：9390-9397
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＢＡＣＥ１はＡＤの治療のための確立された主要薬物標的となっているが、ＢＡＣＥ１に対する有効なインヒビター薬の開発は依然としてかなりの難題である。多大な努力がＢＡＣＥ１に対する小分子インヒビター薬の論理的設計に寄与しているが、ＢＡＣＥ１活性部位の大きな且つ適合しない性質、ならびに高い効力および他のアスパラギン酸プロテアーゼに対する高い選択性を有する血液脳関門（ＢＢＢ）透過薬を開発する必要性のため、その進歩は困難に直面している。したがって、ＡＤに対する可能な療法としてＢＡＣＥ１を標的とする代替的アプローチが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概括
本発明の第１の態様は、ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうることにより特徴づけられる単離された抗ＢＡＣＥ抗体に関する。
【０００９】
１つの実施形態においては、該抗体はＢＡＣＥ１のエクトドメインに対するものである。
【００１０】
特定の実施形態においては、該抗体は更に、アクセッション番号ＬＭＢＰ ６８７１ＣＢまたはＬＭＢＰ ６８７２ＣＢまたはＬＭＢＰ ６８７３ＣＢを有するハイブリドーマ細胞系により分泌されることにより特徴づけられる。もう１つの特定の実施形態においては、該抗体は更に、ヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体であることにより特徴づけられる。
【００１１】
本発明の第２の態様は、ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうることにより特徴づけられる、該抗体の活性フラグメントに関する。
【００１２】
本発明のもう１つの態様は、アクセッション番号ＬＭＢＰ ６８７１ＣＢまたはＬＭＢＰ ６８７２ＣＢまたはＬＭＢＰ ６８７３ＣＢを有するハイブリドーマ細胞系に関する。
【００１３】
本発明の抑制性抗ＢＡＣＥ１抗体は、医薬として、特に、アルツハイマー病の予防または治療を要する対象におけるアルツハイマー病を予防または治療するための多数の用途において有用である。より詳しくは、本発明の抑制性抗ＢＡＣＥ１抗体は、アミロイドベーターペプチドおよび／またはアミロイドベータ前駆体タンパク質の生成の予防および／または軽減において使用されうる。
【００１４】
本発明は更に、本発明の抗体または活性フラグメントと少なくとも１つの医薬上許容される担体、アジュバント（補助剤）または希釈剤とを含む医薬組成物に関する。
【００１５】
最後に、本発明はまた、
（ｉ）非ヒト動物をＢＡＣＥ１で免疫化し、
（ｉｉ）ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうる抗体に関して複数のハイブリドーマ系をスクリーニングし、
（ｉｉｉ）該抗体を産生するハイブリドーマを単離することを含む、ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうる抗体の製造方法を含む。
【００１６】
１つの実施形態においては、前記方法の工程（ｉ）における免疫化は、ＢＡＣＥ１のエクトドメインを使用して行われる。もう１つの実施形態においては、前記の複数のハイブリドーマ系のスクリーニングは、細胞に基づくスクリーニング方法および／または無細胞スクリーニングアッセイにおいてＢＡＣＥ１の抑制活性を測定することによる機能性スクリーニングである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】（Ａ）ＢＡＣＥ１抑制性ｍＡｂに関するハイブリドーマスクリーニングの概要図。更なる分析のために３つの候補体を選択した。ｍｃａ−ＦＲＥＴアッセイスクリーニングからｍＡｂ ５Ｇ７および１４Ｆ１０を特定し、細胞アッセイスクリーニングからｍＡｂ １Ａ１１を特定した。（Ｂ）ＢＡＣＣＥ１ ＭＢＰ−Ｃ１２５ＳｗｅアッセイにおけるｍＡｂ ５Ｇ７、１４Ｆ１０および１Ａ１１によるＢＡＣＥ１の抑制。基質は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）とＳｗｅｄｉｓｈ二重突然変異を含有するヒトＡＰＰのカルボキシ末端の１２５アミノ酸との融合タンパク質である。それらの３つのｍＡｂのＩＣ５０は０，４７ｎＭ（５Ｇ７）、０．４６ｎＭ（１４Ｆ１０）および０．７６ｎＭ（１Ａ１１）である。
【図２】ｍｃａＦＲＥＴアッセイにおけるＢＡＣＥ１活性のモジュレーション。基質は小さなＦＲＥＴペプチドＭＣＡ−ＳＥＶＥＮＬＤＡＥＦＲＫ（Ｄｎｐ）−ＲＲＲＲ−ＮＨ２である。それらの３つのｍＡｂのＩＣ５０（またはＥＣ５０）は０．０６ｎＭ（５Ｇ７）、１．６ｎＭ（１４Ｆ１０）および０．３８ｎＭ（１Ａ１１）である。
【図３】ＭＡｂ １Ａ１１はＳＨ−ＳＹ５Ｙ／ＡＰＰｗｔ細胞におけるＢＡＣＥ１活性を抑制する。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ／ＡＰＰｗｔ細胞を３００ｎＭ Ｍａｂ １Ａ１１、５Ｇ７および１４Ｆ１０（ＰＢＳに溶解されたもの）で処理した。ＰＢＳを陰性対照として使用し、化合物ＢＡＣＥ１インヒビターを陽性対照（ＣＴ＋）として使用した。２４時間の処理の後、順化培地からのＡβおよびｓＡＰＰβをウエスタンブロットにより分析した。ＭＡｂ １１処理はＡβおよびｓＡＰＰβの生成を減少させた。
【図４】ＭＡｂ １Ａ１１はマウス初代培養ニューロンにおけるＢＡＣＥ１活性を抑制する。初代培養ニューロンをセムリキ森林ウイルスによりヒトＡＰＰｗｔで形質導入し、１００ｎＭ ＭＡｂ １Ａ１１、ＭＡｂ ５Ｇ７およびＭＡｂ １４Ｆ１０（ＰＢＳに溶解されたもの）で処理した。ＰＢＳを陰性対照として使用し、化合物ＢＡＣＥ１インヒビターを陽性対照として使用した。２４時間の処理の後、順化培地および細胞抽出物をウエスタンブロットにより分析した。ＭＡｂ １１処理はＡβ、ｓＡＰＰβおよびＣＴＦβの生成を抑制した。
【図５】マウス初代培養ニューロンにおけるＢＡＣＥ１活性に対するＭＡＢ １Ａ１１の用量依存性抑制効果。マウス初代培養ニューロンをセムリキ森林ウイルスによりヒトＡＰＰｗｔで形質導入し、０．０３１ｎＭ〜１００ｎＭの希釈度範囲のＭＡｂ １Ａ１１で処理した。ニューロンを３５Ｓ−メチオニン標識で６時間にわたり代謝標識した。ＡＰＰ Ｃ末端ポリクローナル抗体でのＩＰの後、細胞抽出物からの完全長ＡＰＰおよびＣＴＦを蛍りん光体イメージングで検出した。順化培地からのＡβおよびｓＡＰＰβを直接ウエスタンブロットにより分析した（Ａ）。ＢＡＣＥ１活性の抑制に関してＣＴＦβレベルを定量した（Ｂ）。
【図６】ＭＡｂ １Ａ１１の抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）はマウス初代培養ニューロンにおけるＢＡＣＥ１１活性を抑制する。初代培養ニューロンをセムリキ森林ウイルスによりヒトＡＰＰｗｔで形質導入し、ＭＡｂ １Ａ１１、ＭＡｂ ５Ｇ７およびＭＡｂ １４Ｆ１０（ＰＢＳに溶解されたもの）から作製された２００ｎＭ Ｆａｂで処理した。２４時間の処理の後、順化培地および細胞抽出物をウエスタンブロットにより分析した。ＭＡｂ １１のＦａｂはＡβ、ｓＡＰＰβおよびＣＴＦβの生成を強力に抑制した。
【図７】ＭＡｂ １Ａ１１の立体空間的投与はＢＡＣＥ１活性をインビボで抑制する。野生型マウスの右半球の皮質および海馬に１μｌのＭＡｂ １Ａ１１（ＰＢＳに４μｇ／μｌで溶解）を立体空間的に注射した。対照として、ＰＢＳを左半球の皮質および海馬に注射した。注射の２４時間後、該マウスを犠死させ、脳サンプルをウエスタンブロットにより分析した。ＭＡｂ １Ａ１１は海馬および皮質の両方におけるＣＴＦβの生成を抑制した。
【図８】ＭＡｂ １Ａ１１および５Ｇ７でのＨＥＫ−ＢＡＣＥ１細胞の免疫蛍光染色。Ａ．４％ パラホルムアルデヒドで固定され、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で透過性にされた細胞の染色。Ｂ．４℃における生細胞の表面染色。
【図９】ウエスタンブロットにおけるＢＡＣＥ１欠失突然変異体でのＭＡｂ １Ａ１１の免疫活性。（Ａ）完全長免疫原ＢＡＣＥ４６−４６０（１＃）および欠失突然変異体（２＃〜９＃）に関するスキーム。ここで用いられているアミノ酸の番号づけは、図１４に示されている完全ヒトＢＡＣＥ１タンパク質のアミノ酸配列に対応している。（Ｂ）抗ＧＳＴ抗体はこれらの組換えタンパク質の全てを認識する。（Ｃ）欠失突然変異体１＃（ＢＡＣＥ４６−４６０）、４＃（ＢＡＣＥ２４０−４６０）および８＃（ＢＡＣＥ３１４−４６０）は免疫反応性であるが、該欠失体の残りの全てはＭＡｂ １Ａ１１に対する免疫反応性を有さない。
【図１０】ＢＡＣＥ１触媒ドメイン残基３１４−４４６（この図におけるＳｅｒ２５３−Ａｓｎ３８５）のＣ末端の三次元構造。この図を作成するためにＰＤＢファイル２ｇ９４を使用した。ループＤ上の残基３３２−３３４およびループＦ上の残基３７６−３７９は黒色のリボンで表されており、残りの残基は灰色のリボンで表されている。
【図１１】ループＦ上のアミノ酸３７６−３７９の突然変異誘発（ｍｕｔ３７６−９ ＳＱＤＤからＷＡＡＡへ）およびループＤ上のアミノ酸３３２−３３４の突然変異誘発（ｍｕｔ３３２−４ ＱＡＧからＡＧＡへ）はウエスタンブロットにおけるＢＡＣＥ１に対するＭＡｂ １Ａ１１の免疫反応性を喪失させる。抗ＧＳＴ抗体は野生型およびｍｕｔ３７６−９突然変異体ＢＡＣＥ１（Ａ）またはｍｕｔ３３２−４突然変異体ＢＡＣＥ１（Ｂ）を認識するが、ＭＡｂ１Ａ１１は野生型ＢＡＣＥ１しか認識しない。
【図１２】ループＦ上のアミノ酸３７６−３７９の突然変異誘発（ｍｕｔ３７６−９ ＳＱＤＤからＷＡＡＡへ）およびループＤ上のアミノ酸３３２−３３４の突然変異誘発（ｍｕｔ３３２−４ ＱＡＧからＡＧＡへ）は免疫沈降におけるＢＡＣＥ１に対するＭＡｂ １Ａ１１の免疫反応性を喪失させる。ＢＡＣＥ１の野生型および突然変異形態を哺乳類細胞内で発現させ、細胞抽出物を免疫沈降に使用した。免疫沈降物を、抗ＢＡＣＥ１モノクローナル抗体１０Ｂ８を使用するウエスタンブロットで検出した。同様の量の野生型およびｍｕｔ３７６−９突然変異体ＢＡＣＥ１（Ａ）またはｍｕｔ３３２−４突然変異体ＢＡＣＥ１（Ｂ）を免疫沈降のための投入物質として使用した。ＭＡｂ １Ａ１１は野生型ＢＡＣＥ１だけに結合し、ｍｕｔ３７６突然変異体ＢＡＣＥ１（Ａ）にもｍｕｔ３３２−４突然変異体ＢＡＣＥ１（Ｂ）にも結合しなかった。ＢＡＣＥ１上のコンホメーションエピトープを認識するもう１つのＭＡｂ ５Ｇ７を陽性対照として使用した。
【図１３】ＢＡＣＥ１ ｍｕｔ３７６−９およびｍｕｔ３３２−４は細胞アッセイにおいて活性である。野生型ＡＰＰで安定に発現されたＨＥＫ２９３細胞を突然変異体または野生型ＢＡＣＥ１で一過性にトランスフェクトした。未トランスフェクト化（ＮＴ）細胞を陰性対照として使用した。ｓＡＰＰβをＢＡＣＥ１活性に関する読出しとして検出した。未トランスフェクト化細胞と比較して、突然変異体ＢＡＣＥ１、ｍｕｔ３７６−９（Ａ）およびｍｕｔ３３２−４（Ｂ）でトランスフェクトされた細胞はより高いレベルのｓＡＰＰβを生成した。このことは、該突然変異体がＢＡＣＥ１活性において尚も活性であることを示唆している。野生型ＢＡＣＥ１と比較して、ＢＡＣＥ１の突然変異形態は、ＢＡＣＥ１レベルに対するｓＡＰＰβレベルの比による評価において同様のレベルの酵素活性を示した。
【図１４】ヒトＢＡＣＥ１タンパク質のアミノ酸配列（アミノ酸１−５０１；配列番号１）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
定義
「抗原」なる語は、抗体のような免疫グロブリンが有するアフィニティーおよび特異性の対象である構造体、多くの場合はポリペプチドまたはタンパク質を意味する。「抗原決定基」、「抗原標的」および「エピトープ」なる語は全て、抗原上の、または抗体のような免疫グロブリンが有するアフィニティーおよび特異性の対象である抗原性構造体上の、特異的結合部位を意味する。
【００１９】
「コンホメーションエピトープ」なる語は、抗体に厳密にフィット（嵌合）し結合することを可能にする、抗原の三次元表面特性を有するエピトープを意味する。例外は直鎖状エピトープであり、これは、タンパク質の３Ｄ形状（三次構造）ではなくアミノ酸配列（一次構造）により決定される。
【００２０】
「抗体」なる語は、抗原または抗原決定基に対するアフィニティーを有するタンパク質またはポリペプチドを意味する。そのような抗体は、一般に、４本の鎖、すなわち、２本の重鎖および２本の軽鎖から構成され、したがって四量体である。その例外は、重鎖二量体から構成され軽鎖を欠くが尚も広範な抗原結合レパトワを有するラクダ抗体である。抗体は、通常、可変領域および定常領域の両方を有し、この場合、可変領域は大抵は該抗体の特異性の決定をもたらし、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００２１】
「特異性」なる語は、抗体のような免疫グロブリンが１つの抗原標的に、別の抗原標的と比べて優先的に結合する能力を意味し、必ずしも、高いアフィニティーを示唆するものではない。
【００２２】
「アフィニティー」は、抗原および抗体の平衡を、それらの結合により形成される複合体が存在する方向へ移動させるように、抗体のような免疫グロブリンが抗原に結合する度合を意味する。したがって、抗原および抗体が比較的等しい濃度で合されている場合、高いアフィニティーの抗体は、生じる複合体の濃度を増加させる方向へ該平衡を移動させるように、利用可能な抗原に結合するであろう。
【００２３】
「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」なる語は、Ｈ（重）鎖またはＬ（軽）鎖の可変領域内の可変ループ（それぞれＶＨおよびＶＬとも略称される）を意味し、抗原標的に特異的に結合しうるアミノ酸配列を含有する。これらのＣＤＲ領域は特定の抗原決定基構造に対する該抗体の基本的な特異性をもたらす。そのような領域は「超可変領域」とも称される。ＣＤＲは可変領域内の不連続的なアミノ酸伸長に相当するが、種には無関係に、可変重鎖および軽鎖領域内のこれらの決定的なアミノ酸配列の位置は該可変鎖のアミノ酸配列内の類似位置を有することが判明している。全ての正規（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）抗体の重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、３つのＣＤＲ領域（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３と称される）を有し、それぞれは、それぞれの軽（Ｌ）鎖および重（Ｈ）鎖に関するその他のものに対して不連続的である。受け入れられているＣＤＲはＫａｂａｔら（１９９１）に記載されている。「対象」なる語はヒトおよび他の哺乳動物を意味する。
【００２４】
発明の範囲
ＢＡＣＥ１はアルツハイマー病（ＡＤ）治療のための確立された主要薬物標的となっているが、ＢＡＣＥ１に対する有効なインヒビター薬の開発は依然としてかなりの難題である。多くの労力はＢＡＣＥ１インヒビターの論理的設計に集中している。しかし、有効なＢＡＣＥ１インヒビター薬の出現は遅々たるものである。ＡＤに対する可能な療法としてのＢＡＣＥ１を標的とする代替的アプローチが現われることが必要とされている。
【００２５】
本発明においては、ＢＡＣＥ１に対する特異性を有するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の作製により、ＢＡＣＥ１の活性の代替的インヒビターを開発した。ハイブリドーマスクリーニングにおいて機能性アッセイ（ＢＡＣＥ１ ＦＲＥＴアッセイおよび細胞に基づく活性アッセイ）を適用することにより、ＢＡＣＥ１に対するｍＡｂインヒビターが成功裏に得られた。本発明のスクリーニング法は、ＢＡＣＥ１または他の類似プロテアーゼに関するｍＡｂモジュレータースクリーニングに実施可能であることが実証されている。特に、ＢＡＣＥ１活性を抑制しうるこれらのＢＡＣＥ１特異的モノクローナル抗体はアルツハイマー病の予防および／または治療に使用されうる。限定的なものではないが一例としては、酵素アッセイ、培養ニューロン、およびＣ５７ＢＬ６マウスの海馬／皮質への立体空間的投与によりインビボにおいて、ｍＡｂ １Ａ１１はＢＡＣＥ１活性を抑制することが示された（実施例２〜６）。ｍＡｂ １Ａ１１は、非常に選択的（結合エピトープはＢＡＣＥ１の特有の構造体上に存在する−実施例７を参照されたい）、かつ非常に強力（ニューロン培養においてＩＣ５０ 〜４ｎＭ−実施例４を参照されたい）な薬物候補であると考えられている。
【００２６】
したがって、本発明の第１の態様は、ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうることにより特徴づけられる単離された抗ＢＡＣＥ１抗体に関する。
【００２７】
「活性の抑制」は活性の「ダウンレギュレーション」と同意義であると理解される。一般に、抑制は、ＢＡＣＥ１の活性が少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または更には９６％、９７％、９８％、９９％または更には１００％抑制されることを意味する。ＢＡＣＥ１の抑制は、本明細書中に実施例において更に詳細に記載されているとおりに決定されうる。該抑制性抗体はＢＡＣＥ２または他のアスパラギン酸プロテアーゼの活性を抑制しない、すなわち言い換えると、ＢＡＣＥ２または他のアスパラギン酸プロテアーゼに比べ選択的であることは明らかなはずである。
【００２８】
もう１つの実施形態においては、該抗体は更に、アクセッション番号ＬＭＢＰ ６８７１ＣＢまたはＬＭＢＰ ６８７２ＣＢまたはＬＭＢＰ ６８７３ＣＢを有するハイブリドーマ細胞系により分泌されることにより特徴づけられる。
【００２９】
特定の実施形態においては、該抗体はＢＡＣＥ１のエクトドメインに特異的に結合する。より詳しくは、該抗体は、ＢＡＣＥ１エピトープ、特にＢＡＣＥ１コンホメーションエピトープ、より詳しくはＢＡＣＥ１コンホメーションエピトープへの結合に関して特異的である。限定的なものではないが一例としては、該コンホメーションエピトープは、ループＤおよびＦの組合せ、より詳しくは、ループＤの残基３３２−３３４（ＱＡＧ）とループＦの残基３７６−３７９（ＳＱＤＤ；配列番号１１）との組合せを含みうる。ループＤおよびＦはＨｏｎｇら（２０００）に記載されている。
【００３０】
特定の実施形態としては、該抗体は、ヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体であることにより更に特徴づけられる。
【００３１】
ポリペプチド治療用物質、特に、抗体に基づく治療用物質は、薬物としての相当な潜在性を有する。なぜなら、それらはそれらの標的に対する非常に優れた特異性および低い固有毒性を有するからである。特に、モノクローナル抗体の特徴、例えば高いアフィニティー、高い選択性、ならびに治療用運搬のためのタンパク質操作に適した特有の構造および機能ドメインは、それらを潜在的な薬物候補にする。ＢＡＣＥ１は細胞表面を介して輸送されると報告されている（背景の節も参照されたい）。ＢＡＣＥ１抑制性モノクローナル抗体はＢＡＣＥ１を細胞表面に標的化することが可能であり、インターナリゼーションされてエンドサイトーシス経路におけるＡβ生成を抑制しうる。
【００３２】
しかし、治療上有用な標的に対して得られた抗体は、投与の際のヒト個体における望ましくない免疫反応を回避するために、それをヒトの治療のために調製するためには、追加的な修飾を要することが当業者に公知である。該修飾過程は一般に「ヒト化」と称される。ヒト以外の種において産生された抗体は、該抗体をヒトにおいて治療上有用にするためにはヒト化を要することが、当業者に公知である（（１）ＣＤＲグラフティング：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ：ＵＳ６１８０３７０，ＵＳ５６９３７６１；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ ＵＳ６０５４２９７；Ｃｅｌｌｔｅｃｈ：ＥＰ６２６３９０，ＵＳ５８５９２０５；（２）ベニアリング（Ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）：Ｘｏｍａ：ＵＳ５８６９６１９，ＵＳ５７６６８８６，ＵＳ５８２１１２３）。抗体のヒト化は組換えＤＮＡ技術を含み、ＨおよびＬ鎖をコードするげっ歯類および／またはヒトゲノムＤＮＡ配列の一部から、あるいはＨおよびＬ鎖をコードするｃＤＮＡクローンから出発する。非ヒト抗体のヒト化のための技術は当業者に公知であり、これらは現在の技術水準の一部を構成する。非ヒト哺乳類抗体または動物抗体はヒト化されうる（例えば、ＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ １９９３を参照されたい）。本発明の抗体またはモノクローナル抗体は、例えば、げっ歯類抗体またはげっ歯類モノクローナル抗体のヒト化形態でありうる。
【００３３】
本発明のもう１つの態様は、本発明の抗ＢＡＣＥ１抗体を抑制する活性フラグメントに関する。
【００３４】
「活性フラグメント」なる語は、それ自体が抗原決定基またはエピトープに対して高いアフィニティーを有する、抗体の一部を意味し、そのような特異性をもたらす１以上のＣＤＲを含有する。非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、ｓｃＦｖ、重−軽鎖二量体、ナノボディ、ドメイン抗体、および一本鎖構造体、例えば完全軽鎖または完全重鎖が含まれる。本発明を考慮した場合の該フラグメントの「活性」のための追加的要件は、該フラグメントがＢＡＣＥ１活性を抑制しうることである。本発明の抗体またはそれらの活性フラグメントは適当な標識により標識されることが可能であり、該標識は、例えば酵素型、比色型、化学発光型、蛍光型または放射能型のものでありうる。
【００３５】
本発明のもう１つの態様は、本発明の抑制性抗ＢＡＣＥ１抗体を分泌する、アクセッション番号ＬＭＢＰ ６８７１ＣＢまたはＬＭＢＰ ６８７２ＣＢまたはＬＭＢＰ ６８７３ＣＢを有するハイブリドーマ細胞系に関する。
【００３６】
本発明の抑制性抗ＢＡＣＥ１抗体は、医薬として、特に、アルツハイマー病の予防または治療を要する対象におけるアルツハイマー病を予防または治療するための多数の用途において有用である。さらにもう１つの実施形態においては、該抗体は、ＢＡＣＥ１の過剰発現に関連した疾患を治療するための医薬の製造に使用されうる。ＢＡＣＥ１の過剰発現が生じる疾患の一例はアルツハイマー病である。特定の実施形態においては、本発明の抗体またはその活性フラグメントはアミロイドベータペプチド（Ａβ）および／またはアミロイドベータ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の生成の予防および／または軽減において使用されうる。
【００３７】
一般に、「治療的有効量」、「治療的有効用量」および「有効量」は、所望の結果（ＢＡＣＥ１結合の抑制；アルツハイマー病の治療または予防）を達成するのに必要な量を意味する。効力および従って「有効量」は、本発明において使用されるＢＡＣＥ１結合を抑制する抗体によって様々となりうる、と当業者は認識するであろう。当業者は該抗体の効力を容易に評価することが可能である。「医薬上許容される」は、生物学的にもその他においても有害でない物質に関して用いられ、すなわち、該物質は、望ましくない生物学的効果を及ぼしたり、含有されている医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な様態で相互作用することなく、該化合物と共に個体に投与されうる。
【００３８】
「治療するための医薬」なる語は、本明細書に記載されている疾患を治療または予防するための、前記の抗体と医薬上許容される担体または賦形剤（それらの両方の用語は互換的に用いられうる）とを含む組成物に関するものである。前記の抗体またはその医薬上許容される塩の投与は、経口、吸入または非経口投与によるものでありうる。特定の実施形態においては、該抗体は鞘内または脳室内投与により運搬される。該活性化合物は単独で投与されることが可能であり、あるいは好ましくは、医薬組成物として製剤化されうる。該抗体により認識される抗原を発現するアルツハイマー病を治療するのに有効な量は、通常の要因、例えば、治療される障害の性質および重症度ならびに該哺乳動物の体重に左右される。しかし、単位用量は、通常、抗体またはその医薬上許容される塩０．０１から５０ｍｇ、例えば、０．０１から１０ｍｇ、または０．０５から２ｍｇである。単位用量は、合計１日量が通常、０．０００１から１ｍｇ／ｋｇの範囲となるよう、通常、１日１回または２回以上、例えば、１日２、３または４回、より通常は、１日１から３回投与される。例えば、７０ｋｇの成人に対する適当な合計１日量は０．０１から５０ｍｇ、例えば、０．０１から１０ｍｇ、またはより通常は０．０５から１０ｍｇである。該化合物またはその医薬上許容される塩は、単位投与組成物、例えば、単位投与経口、非経口または吸入組成物の形態で投与されることが非常に好ましい。そのような組成物は混合により製造され、適切には、経口、吸入または非経口投与に適合化され、したがって、錠剤、カプセル剤、経口液体製剤、散剤、顆粒剤、ロゼンジ、還元（再構成）可能な散剤、注射可能および注入可能な溶液もしくは懸濁液、または坐剤またはエアロゾル剤の形態でありうる。経口投与用の錠剤およびカプセル剤は、通常、単位用量で提供され、通常の賦形剤、例えば結合剤、充填剤、希釈剤、打錠剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、香味剤および湿潤剤を含有する。錠剤は、当技術分野におけるよく知られた方法によりコーティングされうる。使用される適当な充填剤には、セルロース、マンニトール、ラクトースおよび他の同様の物質が含まれる。適当な崩壊剤には、デンプン、ポリビニルピロリドンおよびデンプン誘導体、例えばデンプングリコール酸ナトリウムが含まれる。適当な滑沢剤には、例えば、ステアリン酸マグネシウムが含まれる。適当な医薬上許容される湿潤剤には、ラウリル硫酸ナトリウムが含まれる。これらの固体経口組成物は、混合、充填、打錠などの通常の方法により製造されうる。多量の充填剤を使用する組成物の全体にわたって活性物質を分配させるために、反復混合操作が用いられうる。そのような操作は、勿論、当技術分野における常套手段である。経口液体製剤は、例えば、水性または油性の懸濁剤、溶液剤（水剤）、乳剤（エマルション）、シロップ剤またはエリキシル剤の形態であることが可能であり、あるいは使用前に水または他の適当なビヒクルで還元するための乾燥製品として提供されうる。そのような液体製剤は、通常の添加剤、例えば懸濁化剤、例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲルまたは硬化食用脂肪、乳化剤、例えばレシチン、ソルビタンモノオレアートまたはアカシア；非水性ビヒクル（これには食用油が含まれる）、例えばアーモンド油、分別化ヤシ油、油性エステル、例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはエチルアルコールのエステル；保存剤、例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸、そして所望により、通常の香味剤または着色剤を含有しうる。経口製剤には、通常の徐放製剤、例えば、腸溶コーティングを有する錠剤または顆粒剤も含まれる。好ましくは、吸入用の組成物は、気道への投与用に、嗅剤またはエアロゾル剤または溶液剤（ネブライザー用のもの）として、あるいは吹送法用の微細散剤として、単独で又は不活性担体、例えばラクトースと組合せて提供される。そのような場合、活性化合物の粒子は、適切には、５０ミクロン未満、好ましくは１０ミクロン未満、例えば１から５ミクロン、例えば２から５ミクロンの直径を有する。好ましい吸入用量は０．０５から２ｍｇ、例えば０．０５から０．５ｍｇ、０．１から１ｍｇ、または０．５から２ｍｇの範囲である。非経口投与の場合には、本発明の化合物と無菌ビヒクルとを含有する流体単位用量形態を製造する。該活性化合物は、該ビヒクルおよび濃度に応じて、懸濁または溶解されうる。非経口溶液は、通常、該化合物をビヒクルに溶解し、滅菌濾過した後で適当なバイアルまたはアンプル内に充填し密封することにより製造される。有利には、補助剤、例えば局所麻酔薬、保存剤および緩衝剤も該ビヒクルに溶解される。安定性を増強するために、バイアル内への充填後、該組成物を凍結し、真空下で水を除去することが可能である。非経口懸濁剤は、該化合物を溶解する代わりにビヒクルに懸濁させエチレンオキシドにさらすことにより滅菌した後で無菌ビヒクルに懸濁させること以外は、実質的に同じ方法で製造される。有利には、該活性化合物の均一な分布を促進させるために、界面活性剤または湿潤剤を該組成物中に含有させる。適当な場合には、少量の気管支拡張薬、例えば交感神経興奮性アミン、例えばイソプレナリン、イソエタリン、サルブタモール、フェニレフリンおよびエフェドリン；キサンチン誘導体、例えばテオフィリンおよびアミノフィリン、ならびにコルチコステロイド、例えばプレドニゾロンおよび副腎刺激剤、例えばＡＣＴＨが含有されうる。慣例のとおり、該組成物には、通常、関係のある医学的治療における使用のための、書面の又は印刷された説明が付属する。
【００３９】
本発明の更にもう１つの実施形態においては、本発明の抗体は、血液脳関門（ＢＢＢ）を越える輸送を可能にするように製剤化されうる（Ｐａｒｄｒｉｇｄｅ ２００７）。本発明の抗体のＢＢＢ輸送は、限定的なものではないが分子トロイ木馬（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｒｏｊａｎ ｈｏｒｓｅ）により達成されうる。現在公知の最も有効なＢＢＢ分子トロイ木馬はヒトインスリン受容体に対するモノクローナル抗体（ＨＩＲｍＡｂ）である。アルツハイマー病に対する、抗体に基づく新規治療法として、ＢＢＢを通過させるために、抗アミロイドベータモノクローナル抗体が操作され、ＨＩＲｍＡｂに融合されている（Ｂｏａｄｏら，２００７）。また、脳への抗体に基づく薬物の運搬を促進させるために、種々の薬物運搬系（例えば、とりわけ、ミクロスフェア、ナノ粒子、ナノゲル）が研究中であり（Ｐａｔｅｌら，２００９）、これらの全ては本発明の実施において使用されうる。
【００４０】
本発明は更に、本発明の抗体または活性フラグメントと少なくとも１つの医薬上許容される担体、アジュバント（補助剤）または希釈剤とを含む医薬組成物に関する。
【００４１】
本発明は更に、その医薬上許容される塩またはその医薬上許容される溶媒和物と、必要に応じて、その医薬上許容される担体とを含む、本明細書に記載されている障害の治療および／または予防において使用するための医薬組成物を提供する。
【００４２】
「担体」または「アジュバント」、特に「医薬上許容される担体」または「医薬上許容されるアジュバント」は、該組成物の投与を受ける個体に有害な抗体の産生をそれ自体は誘導せず、また、防御も惹起しないいずれかの適当な賦形剤、希釈剤、担体および／またはアジュバントである。好ましくは、医薬上許容される担体またはアジュバントは、抗原により惹起される免疫応答を増強する。適当な担体またはアジュバントは、典型的には、以下の非網羅的一覧に含まれる化合物の１以上を含む：大きな遅代謝巨大分子、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体アミノ酸、アミノ酸共重合体および不活性ウイルス粒子。
【００４３】
「希釈剤」、特に「医薬上許容されるビヒクル」には、ビヒクル、例えば水、塩類液（食塩水）、生理的塩類液、グリセロール、エタノールなどが含まれる。補助的物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、保存剤がそのようなビヒクルに含有されうる。
【００４４】
アルツハイマー病に対する本発明の治療方法は、当技術分野で公知のいずれかの他のＡＤ疾患療法、例えばガンマ−セクレターゼインヒビターまたは他のベータ−セクレターゼインヒビターと組合せて使用することも可能であることが、明らかなはずである。
【００４５】
本発明は更に、ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうる抗ＢＡＣＥ１抗体の単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）に関する。該ＣＤＲも、例えば担体、アジュバントまたは希釈剤を更に含む組成物中に含有されうる。該単離ＣＤＲ核酸配列、ならびにそのようなＣＤＲ核酸を含むいずれかのベクターまたは組換え核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはそれらのいずれかのハイブリッド；直鎖状または環状；鎖数には無関係）は、本発明の一部である。そのようなＣＤＲ核酸配列、ベクターまたは組換え核酸を含むいずれかの宿主細胞も同様に、本発明の一部である。
【００４６】
本発明はまた、ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうる抗ＢＡＣＥ１抗体の単離された可変領域に関する。該可変領域も、例えば担体、アジュバントまたは希釈剤を更に含む組成物中に含有されうる。該単離可変領域核酸配列、ならびにそのような可変領域核酸を含むいずれかのベクターまたは組換え核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはそれらのいずれかのハイブリッド；直鎖状または環状；鎖数には無関係）は、本発明の一部である。そのような可変領域核酸配列、ベクターまたは組換え核酸を含むいずれかの宿主細胞も同様に、本発明の一部である。
【００４７】
本発明のもう１つの態様は、前記の少なくとも１つのＣＤＲまたは前記の少なくとも１つの可変領域を含む、ＢＡＣＥ１活性を抑制しうる化合物に関する。そのような化合物はアルツハイマー病の予防および／または治療において使用されうる。該化合物も、例えば担体、アジュバントまたは希釈剤を更に含む組成物中に含有されうる。そのような化合物の非限定的な例はタンパク質アプタマー、および二重特異性抗体またはその活性フラグメントである。
【００４８】
本発明のもう１つの態様は、
（ｉ）非ヒト動物をＢＡＣＥ１で免疫化し、
（ｉｉ）ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうる抗体に関して複数のハイブリドーマ系をスクリーニングすることを含む、ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうる抗体の製造または作製または選択方法を含む。
【００４９】
あるいは、本発明はまた、
（ｉ）非ヒト動物をＢＡＣＥ１で免疫化し、
（ｉｉ）ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうる抗体に関して複数のハイブリドーマ系をスクリーニングし、
（ｉｉｉ）該抗体を産生するハイブリドーマを単離することを含む、ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうる抗体の製造または作製または選択方法を含む。
【００５０】
いずれかの適当な動物、例えば温血動物、特に哺乳動物、例えばウサギ、マウス、ラット、ラクダ、ヒツジ、ウシまたはブタ、あるいは鳥類、例えばニワトリまたはシチメンチョウが、免疫応答の生成に適した当技術分野でよく知られた技術のいずれかを用いて、ＢＡＣＥ１またはその少なくとも一部、断片、抗原決定基またはエピトープで免疫化されうる。動物を免疫化するための方法は当技術分野でよく知られている。当業者により認識されるとおり、免疫原を、免疫応答を増強するためのアジュバントまたはハプテン（例えば、完全または不完全フロイントまたはリピドＡアジュバント）と、あるいは担体、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と混合することが可能である。適当な動物を免疫化し、該抗原に対する免疫応答が該動物により確立されたら、該動物からの抗体産生細胞をスクリーニングして、所望の活性を有する抗体を産生する細胞を特定する。多数の実施形態においては、これらの方法は、免疫化動物の脾臓からの細胞を適当な不死細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を得るハイブリドーマ技術を用いる。これらのハイブリドーマ細胞からの上清をスクリーニングすることが可能であり、標準的な方法（例えば、Ｈａｒｌｏｗら，１９９８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｆｉｒｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９８）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）に従い、陽性クローンを増殖させる。
【００５１】
前記方法の工程（ｉ）の免疫化は、ＢＡＣＥ１またはその少なくとも一部、断片、抗原決定基またはエピトープを使用して行われうる。特に、該免疫化は、ＢＡＣＥ１のエクトドメインを使用して行われうる。工程（ｉｉ）におけるハイブリドーマ系のスクリーニングは、自体公知の１以上のスクリーニング技術を用いて行われうる。好ましい実施形態においては、実施例において非限定的に例示されているとおり、細胞に基づくスクリーニングアッセイおよび／または無細胞スクリーニングアッセイにおいてＢＡＣＥ１の抑制活性を測定することにより機能性スクリーニングを行う。もう１つの好ましい実施形態においては、該抗体はモノクローナル抗体である。
【００５２】
特定の実施形態においては、本発明の抗体は診断アッセイの調製のために使用されうる。ＢＡＣＥ１は、種々の細胞および組織、特に、脳細胞および組織において検出されることが可能であり、この場合、発現の度合はアルツハイマー病の重症度を裏づける。したがって、生物学的サンプルにおけるＢＡＣＥ１発現の局在化および分布をインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で検出する方法を提供する。該方法は、該生物学的サンプルを、本発明の検出可能な抗ＢＡＣＥ１抗体と反応させ、該抗体の局在化および分布を検出する工程を含む。「生物学的サンプル」なる語は、脳細胞および組織（これらに限定されるものではない）を含む細胞および組織を意味する。該用語は更に、体液を意味する。したがって、患者の体液中のＢＡＣＥタンパク質の検出方法を提供する。該方法は、体液を本発明の抗ＢＡＣＥ抗体と反応させ、該反応をモニターする工程を含む。該体液は、例えば血漿、尿、脳脊髄液、胸水または唾液である。該反応のモニターは、検出可能な部分で該抗体を標識することにより、または、検出可能部分を含む第２抗体が特異的に結合しうる固有検出可能部分としてその定常領域を使用して行われうる。ＣＳＦ ＢＡＣＥ１は、例えば、アルツハイマー病に罹患した患者において検出されうる。本発明の好ましい実施形態においては、体液と該抗ＢＡＣＥ１抗体との反応を溶液中で行う。あるいは、体液と該抗ＢＡＣＥ１抗体との反応を、体液中に存在するタンパク質を吸着しうる基質上で行う（全て、抗体に基づく診断の分野でよく知られている）。さらに、本発明においては、生物学的サンプル中のＢＡＣＥ１タンパク質の存在、非存在またはレベルの検出方法を提供する。該方法は以下の工程を含む。第１に、生物学的サンプルからタンパク質を抽出し、それにより複数のタンパク質を得る。該タンパク質抽出物は粗抽出物であることが可能であり、非タンパク質性物質をも含みうる。第２に、該タンパク質を、例えば電気泳動、ゲル濾過などにより、サイズにより分離する。第４に、該サイズ分離タンパク質を抗ＢＡＣＥ１抗体と相互作用させる。最後に、相互作用した抗ＢＡＣＥ１抗体の存在、非存在またはレベルを検出する。ゲル電気泳動の場合、該抗体との相互作用は、典型的には、該サイズ分離タンパク質を固体支持体（膜）上にブロットした後で行われる。
【００５３】
前記抗ＢＡＣＥ１抗体またはその活性フラグメントの製造方法は本発明の肝要な態様を構成する。特に、そのような方法は、
（ｉ）該抗体または抗体フラグメントの組換え発現により、あるいは該抗体または抗体フラグメントの化学合成により、該抗体または抗体フラグメントの粗調製物を得、（ｉｉ）（ｉ）において得られた粗調製物から該抗体または抗体フラグメントを精製する工程を含みうる。あるいは、
（ｉ）該抗体の組換え発現により、あるいは該抗体の化学合成により、該フラグメントを含む抗体の粗調製物を得、
（ｉｉ）（ｉ）において得られた粗調製物から該抗体を精製し、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）において精製された抗体から活性フラグメントを単離する工程を含む方法により、本発明の抗ＢＡＣＥ１抗体を抑制する活性フラグメントが入手または製造されうる。
【００５４】
前記方法においては、組換え発現はハイブリドーマ細胞系における発現に限定されない。
【００５５】
（ｉ）本発明の抑制性抗ＢＡＣＥ１抗体、（ｉｉ）（ｉ）の活性フラグメント、（ｉｉｉ）（ｉ）のＣＤＲアミノ酸配列、（ｉｖ）（ｉ）の可変領域アミノ酸配列、または（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）を含む化合物を含むおよび／または分泌する任意の宿主細胞も同様に、本発明の一部である。
【実施例】
【００５６】
生物寄託
本明細書の全体に記載されているモノクローナル抗体を分泌する以下のハイブリドーマ細胞系はブダペスト条約に従い寄託された。
【００５７】
【表１】
【００５８】
該寄託機関の詳細は以下のとおりである：ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｇｈｅｎｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，‘Ｆｉｅｒｓ−Ｓｃｈｅｌｌ−Ｖａｎ Ｍｏｎｔａｇｕ’ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｐａｒｋ ９２７，Ｂ−９０５２ Ｇｅｎｔ−Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ。
【００５９】
「ＭＡＢ−Ｂ１−１Ａ１１」および「１Ａ１１」なる表記は、本発明の全体において、対象ハイブリドーマ細胞系または該ハイブリドーマ細胞系により分泌されるモノクローナル抗体に関して互換的に用いられる。
【００６０】
「ＭＡＢ−Ｂ１−１４Ｆ１０」および「１４Ｆ１０」なる表記は、本発明の全体において、対象ハイブリドーマ細胞系または該ハイブリドーマ細胞系により分泌されるモノクローナル抗体に関して互換的に用いられる。
【００６１】
「ＭＡＢ−Ｂ１−５Ｇ７」および「５Ｇ７」なる表記は、本発明の全体において、対象ハイブリドーマ細胞系または該ハイブリドーマ細胞系により分泌されるモノクローナル抗体に関して互換的に用いられる。
【００６２】
材料および方法
免疫化およびハイブリドーマの製造
５匹の９週齢ＢＡＣＥ１−／ＢＡＣＥ２−／−マウスに４週間隔で４回の免疫化を行った。それぞれの免疫化はフロイントアジュバントとの１：１混合物中の精製ヒトＢＡＣＥ１エクトドメインタンパク質（アミノ酸４５−４６０；ＨＥＫ２９３細胞培養から産生）の１回の腹腔内注射を含むものであった。第１の免疫化はフロイント完全アジュバントとの１：１混合物中の５０μｇの免疫原を含むものであった。一方、全ての後続の免疫化はフロイント不完全アジュバントとの混合物中の４０μｇの免疫原を使用した。４回目の免疫化の２週間後、各免疫化マウスの血清中のＢＡＣＥ１特異的抗体をＥＬＩＳＡにより力価測定した。最高力価（ＥＬＩＳＡにおいて４０，０００回の希釈の後で検出可能）を示す２匹のマウスをハイブリドーマの作製のために選択した。
【００６３】
血清抗体価が有意に低下した、４回目の免疫化の３ヵ月後に、ハイブリドーマを製造した。３０μｇの免疫原を使用して、尾静脈における１回の静脈内注射からなる１回の最終追加抗原を各マウスに投与した。マウスを犠死させ、脾臓を単離し、骨髄腫細胞と４：１の比で融合させた。合計２億個の脾細胞を集め、５０００万個の骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを得、細胞混合物を、マウス支持細胞層でコーティングされた２７個の９６ウェルプレート内に分割した。細胞を、まず、ハイブリドーマ選択のためにＨＡＴ培地内で２週間培養し、ついで、１５％ ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で補足された通常増殖培地ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への交換の前にＨＡ培地内で更に１週間培養した。該ウェルの９０％以上がハイブリドーマ選択後の細胞増殖を示している。
【００６４】
ＥＬＩＳＡによるハイブリドーマのスクリーニング
抗ＢＡＣＥ１抗体を産生する陽性ハイブリドーマクローンのＥＬＩＳＡスクリーニングを標準的なＥＬＩＳＡプロトコールに従い行った。簡潔に説明すると、９６ウェル塩化ポリビニルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）を１μｇ／ｍｌ 精製ＢＡＣＥ１エクトドメインタンパク質（ＰＢＳ中）で５０μｌ／ウェルで４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳ中の２％ ＢＳＡで室温（ＲＴ）で１時間ブロッキングした後、５０μｌのハイブリドーマ上清を該プレートに加え、２時間温置した。ついで該プレートをＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、ブロッキングバッファー中の１：５０００希釈の抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｉｎｎｏｖａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に室温で１時間温置した。洗浄後、プレートを０．１Ｍ ＮａＡｃ（ｐＨ ４．９）および０．０３％ Ｈ２Ｏ２中の５０μｌの０．２ｍｇ／ｍｌ テトラメチルベンジジン（ｓｉｇｍａ）で２５分間現像した。５０μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えることにより反応を停止させ、ＯＤ４５０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダー上でプレートを読取った。
【００６５】
ｍｃａ−Ｆｒｅｔアッセイによるハイブリドーマのスクリーニング
ハイブリドーマのｍｃａ−Ｆｒｅｔアッセイスクリーニングを、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙにより提供された標準的なプロトコールを幾らか変更したものにより行った。簡潔に説明すると、酵素ＢＡＣＥ１Ｆｃを反応バッファー（５０ｍＭ 酢酸アンモニウム，ｐＨ ４．６，３％ ＢＳＡ，０．７％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中で１μｇ／ｍｌの濃度で希釈し、小さなＦＲＥＴペプチド基質ＭＣＡ−ＳＥＶＥＮＬＤＡＥＦＲＫ（Ｄｎｐ）−ＲＲＲＲ−ＮＨ２を反応バッファー中で１２５μＭの濃度で希釈した。９６ウェル黒色ポリスチレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ）内で２０μｌのハイブリドーマ上清を３０μｌの酵素希釈液および５０μｌの基質希釈液と混合し、該プレートをベースラインシグナルに関してＥｎｖｉｓｉｏｎ（３５５ｎｍ励起、４３０ｎｍ発光、１秒／ウェル）で直ちに読取り、ついで暗所で室温で一晩温置した。翌朝、同じ読取りプロトコールを用いて該プレートを読取った。
【００６６】
免疫蛍光染色によるハイブリドーマのスクリーニング
ＢＡＣＥ１を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を、０．２ｍｇ／ｍｌ ポリ−Ｌ−リシンで予め処理された９６ウェルプレート上で増殖させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、ついで４％ パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で透過性亢進させた。ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中の２％ＦＣＳ，２％ ＢＳＡおよび０．２％ ゼラチン）中で希釈された５％ ヤギ血清で該細胞を４℃で一晩ブロッキングした後、５０μｌのハイブリドーマ上清を各ウェルの細胞に加え、室温で２時間温置した。ついで細胞を洗浄し、ブロッキングバッファー中で１：１０００希釈のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に室温で１時間にわたり更に温置した。洗浄後、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｅｒ １０００（Ａｍｍｅｒｓｈａｍ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により９６ウェルプレートを読取った。
【００６７】
細胞アッセイによるハイブリドーマのスクリーニング
ＡＰＰを安定に発現するＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を９０％コンフルエントまで２４ウェルプレート上で増殖させた。洗浄後、４．５ｇ／Ｌ グルコース、０．１１ｇ／Ｌ ピルビン酸ナトリウムおよび１５％ ＦＣＳで補足された１００μｌの新鮮増殖培地ＤＭＥＭと混合された１００μｌのハイブリドーマ上清で、３７℃、５％ＣＯ２および７０％相対湿度で細胞を処理した。新鮮培地と混合された陰性ハイブリドーマ細胞からの上清を陰性対照として使用した。２４時間の処理の後、順化培地を集め、１３，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、抗体抗ｓＡＰＰβポリクローナル抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ）および６Ｅ１０（Ｓｉｇｎｅｔ）を使用するウエスタンブロットによりｓＡＰＰβおよびｓＡＰＰαに関して上清を分析した。
【００６８】
イソタイプ決定、サブクローニングおよび抗体精製
Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇキット（Ｒｏｃｈｅ）を該製造業者の説明に従い使用して、１Ａ１１、５Ｇ７、１４Ｆ１０および２Ｇ３のイソタイプを１ｇＧ１（１Ａ１１，５Ｇ７）、１ｇＧ２ｂ（１４Ｆ１０）およびＩｇＭ（２Ｇ３）と決定した。ハイブリドーマクローン１Ａ１１、５Ｇ７および１４Ｆ１０を限界希釈により４回サブクローニングした。４ｍＭ グルタミン、４ｇ／Ｌ Ｄ−グルコースおよび１５％ ＦＣＳで補足されたＤＭＥＭ培地を使用してＣｅｌｌｉｎｅＣＬ−１０００バイオリアクター（ＶＷＲ）においてハイブリドーマクローンを３７℃、５％ＣＯ２および７０％相対湿度で培養することにより、抗体産生を行った。該抗体を、プロテインＧセファロース４（Ｓｉｇｍａ）を使用するアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、透析膜ＭＷＣＯ ６０００−８０００ダルトン（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を使用してＰＢＳ中で透析した。それぞれの６〜７日間培養されたバイオリアクターからの抗体の収量は約４〜１０ｍｇであった。抗体のアリコートを液体窒素により急速凍結した後、−７０℃で貯蔵した。
【００６９】
セムリキ森林ウイルス形質導入および代謝標識を用いるｍＡｂのニューロンアッセイ試験
野生型マウス由来の混合皮質ニューロンの初代培養を作製するために、１４日齢の胚の全脳をＨＢＳＳ培地（Ｇｉｂｃｏ）内で解剖し、トリプシン処理し、ポリ−Ｌ−リシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で予めコーティングされたディッシュ（Ｎｕｎｃ）上でプレーティングした。グリア細胞増殖を防ぐためにＢ２７補足物（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）および５μＭ シトシンアラビノシドを含有する神経基礎培地（Ｇｉｂｃｏ）内で培養を維持した。３日間培養された初代ニューロンを、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）を使用してヒトＡＰＰ（ＡＰＰ野生型またはＡＰＰ Ｓｗｅｄｉｓｈ）で形質導入した。１時間のＳＦＶ形質導入の後、該培地を新鮮神経基礎培地と交換し、ついで２時間の形質導入後時間に付した。２時間の形質導入後時間の後、該神経基礎培地を、１００μＣｉ／ｍｌ［３５Ｓ］メチオニン（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）で補足された無メチオニンＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）と交換し、その一方でｍＡｂ（ＰＢＳ中）を該培地に加えた。６時間の代謝標識の後、該順化培地を集め、該細胞を氷冷ＰＢＳ中で洗浄し、完全プロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）で補足されたＩＰバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１％ デオキシコール酸ナトリウムおよび０．１％ ＳＤＳ）中で細胞溶解した。２５μｌのプロテインＧセファロースおよびＡＰＰ Ｃ末端抗体Ｂ６３．９を使用して、４℃で一晩にわたり細胞抽出物を免疫沈降させた。最後に免疫沈降物をＮｕＰａｇｅサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で溶出し、ランニングバッファー（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）中のＭＥＳおよび還元条件下で１０％ アクリルアミドＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で電気泳動した。Ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）およびｌｍａｇＱｕａＮＴ４．１を使用して結果を解析した。抗ｓＡＰＰβポリクローナル抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ）およびＷＯ−２（Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用する直接ウエスタンブロットにより、順化培地からのｓＡＰＰβおよびＡβを分析した。
【００７０】
エピトープマッピングのためのプラスミド構築
全てのＢＡＣＥ１欠失突然変異体を、ヒトＢＡＣＥ１をコードするｃＤＮＡからのＰＣＲ増幅により作製し、ｐＧＥＸ４Ｔベクター内にサブクローニングした。全ての突然変異体をＤＮＡ配列決定により確認した。
【００７１】
部位特異的突然変異誘発
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）を提供されている手順に従い使用して、ループＦのＳＱＤＤ（配列番号１１）からＷＡＡＡ（配列番号１２）（アミノ酸３７６−３７９）への、およびループＤのＱＡＧからＡＧＡ（アミノ酸３３２−３３４）への突然変異誘発を行った。構築物ｐＧＥＸ４Ｔ−ＢＡＣＥ４６−４６０およびｐｃＤＮＡ３−ＢＡＣＥ１−５０１を鋳型として使用した。全ての突然変異体をＤＮＡ配列決定により確認した。
【００７２】
ＧＳＴ融合タンパク質の発現および精製
ｐＧＥＸ４Ｔ−ＢＡＣＥ１欠失突然変異体で形質転換された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ）を対数増殖させ（１００ｍｌ、Ａ６００＝０，８）、０．２ｍＭ ＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ）で３時間誘導した。ついで細胞をペレット化し、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）で補足された１５ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に再懸濁させた。細菌を、回転させながら室温で１５分間溶菌し、ついで２０，０００×ｇ、４℃で３０にわたりペレット化した。上清を３００μｌのグルタチオン−セファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａｎ）と４℃で１時間混合した。温置後、ビーズをＰＢＳで洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ ８．０）中の１０ｍＭ Ｌ−グルタチオン（Ｓｉｇｍａ）でタンパク質を溶出した。
【００７３】
結果
実施例１．ハイブリドーマのスクリーニングからの候補ＢＡＣＥ１ ｍＡｂインヒビターの特定
抗ＢＡＣＥ１モノクローナル抗体を作製するために、精製ヒトＢＡＣＥ１エクトドメインタンパク質（アミノ酸４５−４６０）（配列番号１３）でのＢＡＣＥ１−／−ＢＡＣＥ２−／−マウスの一連の免疫化の後、ハイブリドーマを製造した。９６ウェルプレート上での該細胞のプレーティングの２〜３週間後（このとき、該ウェルのほとんどは＞８０％コンフルエントとなっていた。）に、ハイブリドーマのスクリーニングを開始した。ＢＡＣＥ１ ＦＲＥＴアッセイスクリーニングおよび細胞に基づくアッセイスクリーニングを含む機能性スクリーニングを初期ハイブリドーマスクリーニング段階において適用した（図１Ａを参照されたい）。ハイブリドーマ上清を、まず、固定化ＢＡＣＥエクトドメイン（免疫原）上のＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。このアッセイにおいては、約２４００個中３７７個のハイブリドーマが陽性と評価された（陽性ウェルのＥＬＩＳＡシグナルはバックグラウンドの５から３０倍であった。）。
【００７４】
該ＥＬＩＳＡスクリーニングからの陽性ハイブリドーマを更に、ＢＡＣＥ１ ｍｃａ−Ｆｒｅｔアッセイにおいて試験した。試験した３７７個のウェルのうちの６個（２Ｇ３、５Ｇ７、２Ｇ６、１０Ｇ１、１４Ｆ１０、１７Ｂ１２）のウェルからの上清がＦｒｅｔアッセイにおいてＢＡＣＥ１活性を抑制した。ハイブリドーマ（２Ｇ６、１０Ｇ１、１７Ｂ１２）は、おそらく非分泌性ハイブリドーマの早期過剰増殖のため、更なるアッセイにおいて増殖もせず陰性にもならなかった。したがって、それらは更なる分析に利用できなかった。更なる特徴づけのための潜在的候補ＢＡＣＥ１インヒビターとして、残りのウェル（２Ｇ３、５Ｇ７、１４Ｆ１０）を選択した。２Ｇ３はＩｇＭであることが判明し、したがって更なる特徴づけを行わなかった。
【００７５】
ｍｃａ−Ｆｒｅｔアッセイスクリーニングと並行して、ＢＡＣＥ１を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞の免疫蛍光染色を用いて該ハイブリドーマ上清をスクリーニングした。ＥＬＩＳＡスクリーニングにおいて最高シグナルを示したハイブリドーマの９６個のウェルを試験し、それらのうちの２５個のウェルが免疫蛍光染色においてＢＡＣＥ１に対する強力な免疫反応性を示した。
【００７６】
ＥＬＩＳＡおよび免疫蛍光染色の両方において最良シグナルを示したハイブリドーマの２５個のウェルを細胞アッセイにより更にスクリーニングして、それらがＢＡＣＥ１活性を抑制するかどうかを調べた。ＡＰＰを安定に発現するＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をハイブリドーマ上清で２４時間処理し、順化培地からのｓＡＰＰβをＢＡＣＥ活性の読出しとして分析した。この細胞アッセイにおいては、ウェル１Ａ１１からの上清はｓＡＰＰβの生成を減少させた。したがって、１Ａ１１をＢＡＣＥ１抑制のための候補の１つとして選択した。
【００７７】
要約すると、ＢＡＣＥ１ ｍＡｂインヒビターの回収の成功はｍＡｂインヒビターのスクリーニングにおけるこの方法の実施可能性を実証した。
【００７８】
実施例２．ｍＡｂ １Ａ１１、５Ｇ７および１４Ｆ１０は酵素アッセイにおいてＢＡＣＥ１活性をモジュレーションする
３つの候補ＢＡＣＥ１インヒビター１Ａ１１、５Ｇ７および１４Ｆ１０を、まず、大きな基質であるＡＰＰｓｗｅのＣ末端の１２５アミノ酸配列を基質として使用するＭＢＰ−ＥＬＩＳＡにより特徴づけした。このＭＢＰ−ＥＬＩＳＡアッセイにおいては、全３個のｍＡｂはＢＡＣＥ１活性を完全に抑制しうる（図１Ｂ）。５Ｇ７、１４Ｆ１０および１Ａ１１のＩＣ５０は、それぞれ、０．４７ｎＭ、０．４６ｎＭまたは０．７６ｎＭである。本発明者らはまた、小さなＦＲＥＴペプチドを基質として使用するｍｃａ−Ｆｒｅｔアッセイにおいて、それらの３つのｍＡｂを試験した（図２）。このアッセイにおいては、５Ｇ７および１４Ｆ１０は、それぞれ０．０６ｎＭおよび１．６ｎＭ（１４Ｆ１０）のＩＣ５０で、ＢＡＣＥ１活性を完全に抑制しうる。意外なことに、該細胞アッセイから回収されたＢＡＣＥ１インヒビターである１Ａ１１はＢＡＣＥ１活性を刺激した。
【００７９】
それらの２つの酵素アッセイからの結果は、ｍＡｂ １Ａ１１がＢＡＣＥ１−大基質相互作用（ＢＡＣＥ１−ＡＰＰ）に対する立体的インヒビターであることを示唆している。
【００８０】
実施例３．ｍＡｂ １Ａ１１はヒト神経芽細胞腫細胞においてＢＡＣＥ１を抑制する
３つの候補ｍＡｂインヒビター５Ｇ７、１４Ｆ１０および１Ａ１１を細胞アッセイにおいて試験した。野生型ＡＰＰを安定に発現するＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を６ウェルプレート内で９０％のコンフルエンシーまで培養し、３００ｎＭ ｍＡｂと共に２４時間培養した。ＰＢＳを陰性対照として使用し（ｍＡｂをＰＢＳに溶解させた。）、ＰＢＳ中で１μＭに希釈されたＢＡＣＥ１インヒビター化合物ＩＩＩ（Ｍｅｒｃｋ Ｃｏｍｐａｎｙ）を陽性対照として使用した。２４時間の処理の後、順化培地からのＡβ、ｓＡＰＰβおよびｓＡＰＰαをウエスタンブロットにより分析した。図３に示されているとおり、１Ａ１１ ｍＡｂはＡβおよびｓＡＰＰβの生成を抑制したが、５Ｇ７および１４Ｆ１０処理は細胞ＢＡＣＥ１活性に対する抑制効果を示さなかった。
【００８１】
実施例４．ｍＡｂ １Ａ１１は培養ニューロンにおいてＡＰＰｗｔのＢＡＣＥ１切断を有意に抑制する
ｍＡｂ ５Ｇ７、１４Ｆ１０および１Ａ１１を初代ニューロン培養において更に試験した。３日間培養されたマウス初代ニューロンをセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）によりヒトＡＰＰｗｔで形質導入し、３００ｎＭ ｍＡｂ（ＰＢＳ中）で２４時間処理した。ＰＢＳを陰性対照として使用し、１μＭ ＢＡＣＥ１インヒビター化合物ＩＩＩ（Ｍｅｒｃｋ Ｃｏｍｐａｎｙ）を陽性対照として使用した。２４時間の処理の後、順化培地からのＡβ、ｓＡＰＰβおよびｓＡＰＰαを、細胞ライセートからの完全長ＡＰＰ、ＣＴＦβおよびＣＴＦαと共に、ウエスタンブロットにより分析した。図４に示されているとおり、１Ａ１１処理はＡβ、ｓＡＰＰβおよびＣＴＦβの生成を有意に減少させたが、α−セクレターゼ切断産物であるＣＴＦαおよびｓＡＰＰαは増加した。残りの２つのｍＡｂである５Ｇ７および１４Ｆ１０はＡＰＰｗｔのＢＡＣＥ１切断に対する抑制効果を示さなかった。
【００８２】
ＳＦＶ−ヒトＡＰＰｗｔで形質導入され、３５Ｓ−メチオニン代謝標識により６時間にわたって代謝標識された前記ニューロンを使用して、ｍＡｂ １Ａ１１に関する用量反応曲線を確定した。ＡＰＰ Ｃ末端ポリクローナル抗体での免疫沈降の後、細胞ライセートからの完全長ＡＰＰおよびＣＴＦをホスホルイメージングで検出した。順化培地からのＡβおよびｓＡＰＰβを直接ウエスタンブロットにより分析した。ＣＴＦβレベルをＢＡＣＥ１活性に関して定量した。図５に示されているとおり、１Ａ１１は１００ｎＭの濃度で＞９０％のＢＡＣＥ１活性を抑制することが可能であり、このアッセイにおける見掛けＩＣ５０は３，７ｎＭと推定された。
【００８３】
ＢＡＣＥ１は、その長い寿命において、細胞表面を介して輸送され、細胞表面、エンドソームおよびＴＮＧを数周循環することが示されている（Ｈｕｓｅら，２０００，Ｗａｈｌｅら，２００５）。しかし、ＢＡＣＥ１のどのくらいの割合が細胞表面輸送に付されるのかは不明であり、したがって、細胞表面ＢＡＣＥ１を標的化することが、主要細胞ＢＡＣＥ１活性を阻止するのに十分な程度に有効かどうかは、推測の域を出なかった。前記結果は、ＢＡＣＥ１のエクトドメインに特異的なＢＡＣＥ１抑制性ｍＡｂが、細胞表面ＢＡＣＥ１への結合を介して同時インターナリゼーションされる可能性があることを示している。さらに、前記ニューロン培養アッセイにおいて示されているとおり、細胞表面ＢＡＣＥ１を標的化することは、主要細胞ＢＡＣＥ１活性を阻止するのに有効である。
【００８４】
実施例５．１Ａ１１の抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）は培養ニューロンにおいてＢＡＣＥ１を抑制する
５Ｇ７、１４Ｆ１０および１Ａ１１の３つのｍＡｂからの抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）を、Ｆａｂ調製キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を該製造業者の説明に従い使用して作製した。作製されたＦａｂの純度をＮｕＰＡＧＥゲル上で青色染色により試験した。ニューロンアッセイにおいて該Ｆａｂを試験するために、３日間培養されたマウス初代ニューロンを、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）を使用してヒトＡＰＰｗｔで形質導入し、２００ｎＭ Ｆａｂ（ＰＢＳ中）で処理した。２４時間の処理の後、順化培地からのＡβ、ｓＡＰＰβおよびｓＡＰＰαを、細胞ライセートからの完全長ＡＰＰ、ＣＴＦβおよびＣＴＦαと共に、ウエスタンブロットにより分析した。図６に示されているとおり、１Ａ１１ Ｆａｂは、Ａβ、ｓＡＰＰβおよびＣＴＦβの生成を減少させているため、ＢＡＣＥ１活性を抑制したが、５Ｇ７Ｆａｂおよび１４Ｆ１０ＦａｂはＢＡＣＥ１活性に対する抑制効果を示さなかった。
【００８５】
実施例６．ｍＡｂ １Ａ１１の立体空間的注射は野生型マウスにおいてＢＡＣＥ１活性を抑制する
野生型マウスの脳内への立体空間的注射により、ｍＡｂ １Ａ１１の活性をインビボで試験した。簡潔に説明すると、３月齢の野生型マウスの脳内に立体空間座標（ブレグマ −２．４６ｍｍ；外側 ＋／−２．６ｍｍ；腹側 −２．５ｍｍ）においてｍＡｂ １Ａ１１を投与した。ｍＡｂサンプルを４μｇの用量（合計体積１μｌ）で右脳内に注射し、対照として１μｌのＰＢＳを左脳内に注射した。注射の２４時間後、マウスを犠死させて脳を解剖した。注射部位を含む脳薄片（〜１．５ｍｍの厚さ）を海馬および皮質に関して更に解剖した。脳サンプルをＣＴＦβに関してウエスタンブロットにより分析した。図７に示されているとおり、１Ａ１１の投与はＣＴＦβの生成を減少させた。このことは、該ｍＡｂが野生型マウス脳においてＢＡＣＥ１活性を抑制しうることを示唆している。
【００８６】
実施例７．ＢＡＣＥ１を抑制するモノクローナル抗体のエピトープマッピング
興味深いことに、５Ｇ７および１４Ｆ１０の２つの候補ＢＡＣＥ１インヒビターは、無細胞アッセイにおいては強力な活性を示すが、細胞アッセイにおいてはＢＡＣＥ１に対する抑制効果を示さないことが示された。本発明者らは、５Ｇ７が、細胞表面に露出したＢＡＣＥ１には結合しないことを見出した。免疫蛍光染色（図８）により示されているとおり、５Ｇ７は天然条件下では細胞表面ＢＡＣＥ１に結合しなかった。５Ｇ７は、ＢＡＣＥ１を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞の順化培地からの遊離ＢＡＣＥ１を免疫沈降させるが、膜結合完全長ＢＡＣＥ１を免疫沈降させず、一方、１Ａ１１はＢＡＣＥ１の両方の形態を免疫沈降させることを、免疫沈降実験は示した。これらの結果は、５Ｇ７結合のためのエピトープが膜結合ＢＡＣＥ１上では利用可能でないことを示唆している。これはＢＡＣＥの複雑な構造に起因すると考えられ、例えば、結合部位を含むタンパク質の結合、または膜により引き起こされる立体障害によるものであると考えられうるであろう。これを更に例証するために、５Ｇ７がＢＡＣＥ１エクトドメインの表面上の別のコンホメーションエピトープに結合することが、エピトープマッピングにより示された（Ｋ２９９、Ｅ３０３およびＱ３８６を含むこのエピトープ内の幾つかの残基に対する抗体反応性が突然変異誘発により確認された。）。このエピトープは、他のタンパク質と結合することが可能であるため、細胞表面においては「接近不可能」であると推定される。
【００８７】
ＭＡｂ １Ａ１１の結合性エピトープを決定するために、Ｎ末端融合ＧＳＴタグを有する一連のＢＡＣＥ１欠失突然変異体を作製し、細菌培養から精製した。該ＢＡＣＥ１欠失突然変異体に対するＭＡｂ １Ａ１１の免疫反応性をウエスタンブロットにより試験した。図９に示されているとおり、ＭＡｂ １Ａ１１と反応する最短欠失突然変異体は、完全長免疫原ＢＡＣＥ ４６−４６０［配列番号２］に類似した免疫反応性を有するＢＡＣＥ ３１４−４６０［配列番号９］である。これは、ＭＡｂ １Ａ１１の結合性エピトープが完全にＢＡＣＥ ３１４−４６０［配列番号９］内に位置していることを示している。
【００８８】
さらに、ＭＡｂ １Ａ１１に対する結合性エピトープは直鎖状エピトープではないことが示された。図９に示されているとおり、ＭＡｂ １Ａ１１はＢＡＣＥ３１４−４６０［配列番号９］とは反応するが、ＢＡＣＥ３２９−４６０［配列番号１０］とは反応しない。該エピトープが直鎖状である場合、それは少なくとも部分的にＢＡＣＥ３１４−３２９（１５アミノ酸）［配列番号１４］内に局在化しているはずである。直鎖状エピトープの長さは、通常、１５アミノ酸以内であることを考慮すると、直鎖状である場合のＭＡｂ １Ａ１１の完全エピトープはＢＡＣＥ３１４−３４４［配列番号１５］内に位置するはずである。しかし、ＢＡＣＥ３１４−３４４［配列番号１１５］内のエピトープを含む３つの欠失突然変異体ＢＡＣＥ４６−３４９［配列番号８］、ＢＡＣＥ４６−３６４［配列番号７］およびＢＡＣＥ４６−３９０［配列番号１６］は全て、ＭＡｂ １Ａ１１に対する免疫反応において陰性であった。その矛盾した結果は、ＭＡｂ １Ａ１１のエピトープが直鎖状ではなく、コンホメーションエピトープであることを示唆している。コンホメーションエピトープもウエスタンブロットにより検出されうることが既に報告されており、これは、おそらく、膜への該タンパク質の輸送の途中または後のエピトープの再生によるものであり（Ｚｈｏｕら，２００７）、これは、コンホメーションエピトープを有するＭＡｂ １Ａ１１がウエスタンブロットにおいてＢＡＣＥ１と尚も反応する理由を説明しうるであろう。
【００８９】
ＭＡｂ １Ａ１１結合のコンホメーションエピトープを決定するために、本発明者らはＢＡＣＥ１触媒ドメイン残基３１４−４４６のＣ末端の３Ｄ構造を示した（図１０）。該構造のＮ末端付近に、本発明者らは、互いに接近しておりＢＡＣＥ１上の潜在的コンホメーションエピトープに相当する２つの突出ループＤおよびＦを見出した。ループＤおよびＦはＨｏｎｇら（２０００）に記載されている。これらの露出突出ループは非常に免疫原性であることが公知である。ここでは、本発明者らは、ＭＡｂ １Ａ１１のエピトープがループＤおよびＦに位置するかどうかを試験した。ループＤ上の３つのアミノ酸の突然変異誘発（アミノ酸３３２−３３４のＱＡＧからＡＧＡへ）およびループＦ上の４つのアミノ酸の突然変異誘発（アミノ酸３７６−３７９ ＳＱＤＤ［配列番号１１］からＷＡＡＡ［配列番号１２］へ）をＢＡＣＥ４６−４６０［配列番号２］から別々に行い、ウエスタンブロットにより試験した。図１１に示されているとおり、どちらの突然変異体もＭＡｂ １Ａ１１との免疫反応性を、野生型ＢＡＣＥ４６−４６０［配列番号２］と比較して検出不可能なレベルにまで低下させた。このことは、これらのアミノ酸が抗体結合に寄与することを示唆している。
【００９０】
該エピトープを更に実証するために、哺乳類発現ベクター上で完全長ＢＡＣＥ１（１−５０１）の同一突然変異誘発を行い、ＨＥＫ２９３細胞においてＢＡＣＥ１の突然変異体を発現させた。突然変異体ＢＡＣＥ１または野生型ＢＡＣＥ１を含有する細胞抽出物を、ＭＡｂ １Ａ１１を使用する免疫沈降によりアッセイした。図１２に示されているとおり、哺乳類細胞から作製されたＢＡＣＥ１のどちらの突然変異体も、ＭＡｂ１Ａ１１に対する免疫反応性を、野生型ＢＡＣＥ１と比較して検出不可能なレベルにまで低下させた。また、該突然変異誘発がタンパク質全体のフォールディングにおける変化を引き起こさないことを示すために、ＢＡＣＥ１の２つの突然変異体の細胞活性を試験した。図１３に示されているとおり、どちらの突然変異体も、βおよびβ’部位におけるＡＰＰのプロセシングにおいて尚も活性であり、このことは、これらの突然変異体が適切にフォールディングしていることを示唆している。
【００９１】
最後に、ループＤ上の残基３３２−３３４またはループＦ上の残基３７６−３７９の突然変異誘発は、ＢＡＣＥ１タンパク質のフォールディングを変化させることなく、ウエスタンブロットおよび免疫沈降アッセイの両方において、ＭＡｂ １Ａ１１結合を完全に阻止した。このことは、ＭＡｂ １Ａ１１が、ループＤおよびＦの組合せを含むコンホメーションエピトープに結合することを示している。興味深いことに、ループＦおよびループＤはＢＡＣＥ１上の特有の構造として既に記載されており（Ｈｏｎｇら，２０００）、これらはペプシンファミリーの他のアスパラギン酸プロテアーゼにおいては提示されていない。該構造を共有するペプシンファミリーからの唯一の例外は、ＢＡＣＥ１の最も近いモログであるＢＡＣＥ２である。該ループ構造はＢＡＣＥ１とＢＡＣＥ２とで類似しているが、ループＦおよびループＤ上のアミノ酸配列が異なる。さらに、酵素データは、ｍＡｂ １Ａ１１がＢＡＣＥ２と交差反応しないことを証明した。治療上の観点からは、ＭＡｂ １Ａ１１は、ＢＡＣＥ１の特有の構造に結合するため、ＢＡＣＥ２および他のアスパラギン酸プロテアーゼに比べ非常に選択的である。
【００９２】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＢＡＣＥ１に対する特異性を有する抗体に関する。より詳しくは、本発明は、ＢＡＣＥ１に結合しＢＡＣＥ１の活性を抑制しうるモノクローナル抗体、およびこれらの抗体の製造方法を提供する。該抗体は研究および医学的用途に使用されうる。具体的な用途はアルツハイマー病の治療のためのＢＡＣＥ１特異的抗体の使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（「ＡＤ」）は、世界中で数百万人の高齢患者を冒す破壊的な神経変性疾患であり、養護施設への入所の最も一般的な原因である。ＡＤは、記憶、定位、認知機能、判断および情緒安定性の進行性喪失により臨床的に特徴づけられる。加齢と共に、ＡＤの発症リスクは指数関数的に増加して、８５歳までに、該集団の約２０〜４０％が罹患する。記憶および認知機能は、軽度ないし中等度の障害の診断から最初の５年以内に急速に悪化し、疾患合併症による死亡が、避けられない結末である。ＡＤの確定診断は、患者からの脳組織の組織病理学的検査に基づいて、死後にはじめて可能となる。
【０００３】
ＡＤの２つの組織学的特徴は、共にＡＤ患者の大脳皮質内の、過リン酸化タウタンパク質の神経原線維タングルの、およびタンパク質性アミロイドプラークの生成である。該アミロイドプラークは、主に、ベータ−アミロイド（β−アミロイド、アミロイドベーターまたはＡベータとも称される）と称される３７〜４３アミノ酸のペプチドから構成される。Ａベータペプチドは、ベータアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰとも称される）と称される１型内在性膜タンパク質から２つの連続的タンパク質分解事象により誘導されることが現在明らかである。まず、ＡＰＰは、ベータ−セクレターゼ（膜結合アスパルチルプロテアーゼＢＡＣＥ１）と称される特異的タンパク質分解酵素により膜貫通アルファヘリックスのＮ末端の部位で加水分解される。この切断事象の可溶性Ｎ末端産物は膜から拡散し、Ｃ９９と称される膜結合Ｃ末端切断産物を後に残す。ついでタンパク質Ｃ９９は、ガンマ−セクレターゼと称される特異的タンパク質分解酵素により膜貫通アルファヘリックス内で更に加水分解される。この第２切断事象はＡベータペプチドを遊離し、膜結合「スタブ（ｓｔｕｂ）」を残す。このようにして生成したＡベータペプチドは細胞から細胞外マトリックス内に分泌され、その場所において、それは、ＡＤに関連したアミロイドプラークを最終的に形成する。
【０００４】
過去１００年間の精力的な研究にもかかわらず、ＡＤ患者の予後は現在もなお、１００年前と全く同じである。なぜなら、利用可能な真の治療法が尚も存在しないからである。２つのタイプの薬物、すなわち、アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）インヒビターおよびメマンチン（Ｍｅｍａｎｔｉｎｅ）が米国食品医薬品局により承認されており、ＡＤを治療するために臨床において現在使用されている。ＡＤ病因に特異的なアミロイドプラークの主要成分であるアミロイドベータペプチドがＡＤ疾患の発生において中心的な役割を果たしているという豊富な証拠が当技術分野に存在する（Ｈａｒｄｙら．２００２，Ｇｏｌｄｅら．２００６）。したがって、Ａβを低下させるための最も好ましい方法の１つは、γ−およびβ−セクレターゼインヒビターによりその産生を減少させることである。１つの方法はガンマ−セクレターゼインヒビターの開発であったが、ガンマ−セクレターゼは少なくとも３０種のタンパク質のタンパク質分解プロセッシングに関与しているため、そのようなインヒビターは、しばしば、重大な副作用を引き起こす（Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒら，２００３）。さらにもう１つの魅力的な方法はβ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ１）インヒビターの開発である。なぜなら、ＢＡＣＥ１ノックアウトマウスは生存可能であり、明らかな病的表現型を有さないからである（例えば、Ｒｏｂｅｒｄｓら，２００１、Ｏｈｎｏら，２００４、Ｏｈｎｏら，２００６）。
【０００５】
ＢＡＣＥ１はメマプシン２およびＡｓｐ２とも称され、５０１アミノ酸の１型膜結合型アスパルチルプロテアーゼであり、それはペプシンファミリーの真核生物アスパラギン酸プロテアーゼと相当な構造的特徴を共有する（例えば、Ｈｕｓｓａｉｎら，１９９９、Ｌｉｎら，２０００）。他のアスパラギン酸プロテアーゼと同様に、ＢＡＣＥ１はＮ末端シグナルペプチド（残基１−２１）およびプロ−ペプチド（２２−４５）を有する。該２１アミノ酸シグナルペプチドは該プロテアーゼをＥＲへ移動させ、その場所において該シグナルペプチドは切断除去され、ついでＢＡＣＥ１はその場所から細胞表面へと導かれる。トランス−ゴルジネットワーク（ＴＧＮ）を通過した後、ＢＡＣＥ１の一部は細胞表面に標的化され、その場所からそれは初期エンドソーム区画内にインターナリゼーションされる。ついでＢＡＣＥ１は細胞表面への直接的再循環経路に進入し、あるいは、リソソームまたはＴＧＮに行くことになる後期エンドソーム小胞に標的化される。ＴＧＮにおいては、それは細胞膜へ再輸送されうるであろう。成熟ＢＡＣＥ１は、その長い半減期および速い再循環速度を考慮すると、その寿命中に細胞表面、エンドソーム系およびＴＧＮの間を複数回にわたって循環しうる（例えば、Ｈｕｓｅら，２０００、Ｗａｈｌｅら，２００５）。β−部位におけるＡＰＰのＢＡＣＥ１媒介性切断は初期エンドソームにおいて生じ、この場所においては、その酵素活性のためには酸性環境が最適である。しかし、いわゆるシュウェディッシュ（Ｓｃｈｗｅｄｉｓｈ）突然変異を含有するＡＰＰが細胞基質として用いられた場合、β−切断はＥＲおよびＴＧＮにおいて優先的に生じた（Ｔｈｉｎａｋａｒａｎら，１９９６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Hardy，J．and Selkoe，D．J．（2002）The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease：progress and problems on the road to therapeutics．Science，297（5580）：353-6．
【非特許文献２】Golde TE， Dickson D，Hutton M．（2006）．Filling the gaps in the abeta cascade hypothesis of Alzheimer’s disease．Curr Alzheimer’s Res，3：421-430．
【非特許文献３】De strooper B （2003）：Aph-1，Pen-2，and Nicastrin with Presenilin generate an active γ−secretase complex．Neuron，38：9-12．
【非特許文献４】Roberds SL，Anderson J，Basi G，Bienkowski MJ，Branstetter DG，Chen KS，Freedman SB，Frigon NL，Games D，Hu K，et al（2001）：BACE knockout mice are healthy despite lacking the primary β−secretase activity in brain：implications for Alzheimer’s disease therapeutics．Hum Mol Genet，10：1317-1324．
【非特許文献５】Ohno M，Sametsky EA，Younkin LH，Oakley H，Younkin SG，Citron M，Vassar R，Disterhoft JF（2004）：BACE1 Deficiency Rescues Memory Deficits and Cholinergic Dysfunction in a Mouse Model of Alzheimer’s Disease．Neuron，41：27-33．
【非特許文献６】Ohno M，Chang L，Tseng W，Oakley H，Citron M，Klein WL，Vassar R，Disterhoft JF（2006）：Temporal memory deficits in Alzheimer’s mouse models：rescue by genetic deletion of BACE1．Eur J Neurosci，23：251-260．
【非特許文献７】Hussain I，Powell D，Howlett DR，Tew DG，Meek TD，Chapman C，Gloger IS，Murphy KE，Southan CD，Ryan DM，et al （1999）：Identification of a novel aspartic protease（Asp 2）as β−Secretase．Mol Cell Neurosci，14：419-427．
【非特許文献８】Lin X，Koelsch G，Wu S，Downs D，Dashti A，Tang J （2000）：Human aspartic protease memapsin 2 cleaves the β−secretase site of β-amyloid precursor protein．Proc Natl Acad Sci USA，97：1456-1460．
【非特許文献９】Huse JT，Pijak DS，Leslie GJ，Lee VM，Doms RW．（2000）Maturation and endosomal targeting of β−site amyloid precursor protein−cleaving enzyme．The Alzheimer’s disease β−secretase．J Biol Chem，275：33729-33737．
【非特許文献１０】Wahle，T．，Prager，K．，Raffler，N．，Haass，C．，Famulok，M． and Walter，J．（2005）GGA proteins regulate retrograde transport of BACE1 from endosomes to the trans-Golgi network．Mol．Cell．Neurosci．
【非特許文献１１】Thinakaran G，Teplow DB，Siman R，Greenberg B，Sisodia SS．（1996）Metabolism of the’Swedish’amyloid precursor protein variant in neuro2a（N2a）cells．Evidence that cleavage at the’beta-secretase’site occurs in the golgi apparatus．J Biol Chem．271：9390-9397
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＢＡＣＥ１はＡＤの治療のための確立された主要薬物標的となっているが、ＢＡＣＥ１に対する有効なインヒビター薬の開発は依然としてかなりの難題である。多大な努力がＢＡＣＥ１に対する小分子インヒビター薬の論理的設計に寄与しているが、ＢＡＣＥ１活性部位の大きな且つ適合しない性質、ならびに高い効力および他のアスパラギン酸プロテアーゼに対する高い選択性を有する血液脳関門（ＢＢＢ）透過薬を開発する必要性のため、その進歩は困難に直面している。したがって、ＡＤに対する可能な療法としてＢＡＣＥ１を標的とする代替的アプローチが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概括
本発明の第１の態様は、ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうることにより特徴づけられる単離された抗ＢＡＣＥ抗体に関する。
【０００９】
１つの実施形態においては、該抗体はＢＡＣＥ１のエクトドメインに対するものである。
【００１０】
特定の実施形態においては、該抗体は更に、アクセッション番号ＬＭＢＰ ６８７１ＣＢまたはＬＭＢＰ ６８７２ＣＢまたはＬＭＢＰ ６８７３ＣＢを有するハイブリドーマ細胞系により分泌されることにより特徴づけられる。もう１つの特定の実施形態においては、該抗体は更に、ヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体であることにより特徴づけられる。
【００１１】
本発明の第２の態様は、ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうることにより特徴づけられる、該抗体の活性フラグメントに関する。
【００１２】
本発明のもう１つの態様は、アクセッション番号ＬＭＢＰ ６８７１ＣＢまたはＬＭＢＰ ６８７２ＣＢまたはＬＭＢＰ ６８７３ＣＢを有するハイブリドーマ細胞系に関する。
【００１３】
本発明の抑制性抗ＢＡＣＥ１抗体は、医薬として、特に、アルツハイマー病の予防または治療を要する対象におけるアルツハイマー病を予防または治療するための多数の用途において有用である。より詳しくは、本発明の抑制性抗ＢＡＣＥ１抗体は、アミロイドベーターペプチドおよび／またはアミロイドベータ前駆体タンパク質の生成の予防および／または軽減において使用されうる。
【００１４】
本発明は更に、本発明の抗体または活性フラグメントと少なくとも１つの医薬上許容される担体、アジュバント（補助剤）または希釈剤とを含む医薬組成物に関する。
【００１５】
最後に、本発明はまた、
（ｉ）非ヒト動物をＢＡＣＥ１で免疫化し、
（ｉｉ）ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうる抗体に関して複数のハイブリドーマ系をスクリーニングし、
（ｉｉｉ）該抗体を産生するハイブリドーマを単離することを含む、ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうる抗体の製造方法を含む。
【００１６】
１つの実施形態においては、前記方法の工程（ｉ）における免疫化は、ＢＡＣＥ１のエクトドメインを使用して行われる。もう１つの実施形態においては、前記の複数のハイブリドーマ系のスクリーニングは、細胞に基づくスクリーニング方法および／または無細胞スクリーニングアッセイにおいてＢＡＣＥ１の抑制活性を測定することによる機能性スクリーニングである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】（Ａ）ＢＡＣＥ１抑制性ｍＡｂに関するハイブリドーマスクリーニングの概要図。更なる分析のために３つの候補体を選択した。ｍｃａ−ＦＲＥＴアッセイスクリーニングからｍＡｂ ５Ｇ７および１４Ｆ１０を特定し、細胞アッセイスクリーニングからｍＡｂ １Ａ１１を特定した。（Ｂ）ＢＡＣＣＥ１ ＭＢＰ−Ｃ１２５ＳｗｅアッセイにおけるｍＡｂ ５Ｇ７、１４Ｆ１０および１Ａ１１によるＢＡＣＥ１の抑制。基質は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）とＳｗｅｄｉｓｈ二重突然変異を含有するヒトＡＰＰのカルボキシ末端の１２５アミノ酸との融合タンパク質である。それらの３つのｍＡｂのＩＣ５０は０，４７ｎＭ（５Ｇ７）、０．４６ｎＭ（１４Ｆ１０）および０．７６ｎＭ（１Ａ１１）である。
【図２】ｍｃａＦＲＥＴアッセイにおけるＢＡＣＥ１活性のモジュレーション。基質は小さなＦＲＥＴペプチドＭＣＡ−ＳＥＶＥＮＬＤＡＥＦＲＫ（Ｄｎｐ）−ＲＲＲＲ−ＮＨ２である。それらの３つのｍＡｂのＩＣ５０（またはＥＣ５０）は０．０６ｎＭ（５Ｇ７）、１．６ｎＭ（１４Ｆ１０）および０．３８ｎＭ（１Ａ１１）である。
【図３】ＭＡｂ １Ａ１１はＳＨ−ＳＹ５Ｙ／ＡＰＰｗｔ細胞におけるＢＡＣＥ１活性を抑制する。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ／ＡＰＰｗｔ細胞を３００ｎＭ Ｍａｂ １Ａ１１、５Ｇ７および１４Ｆ１０（ＰＢＳに溶解されたもの）で処理した。ＰＢＳを陰性対照として使用し、化合物ＢＡＣＥ１インヒビターを陽性対照（ＣＴ＋）として使用した。２４時間の処理の後、順化培地からのＡβおよびｓＡＰＰβをウエスタンブロットにより分析した。ＭＡｂ １１処理はＡβおよびｓＡＰＰβの生成を減少させた。
【図４】ＭＡｂ １Ａ１１はマウス初代培養ニューロンにおけるＢＡＣＥ１活性を抑制する。初代培養ニューロンをセムリキ森林ウイルスによりヒトＡＰＰｗｔで形質導入し、１００ｎＭ ＭＡｂ １Ａ１１、ＭＡｂ ５Ｇ７およびＭＡｂ １４Ｆ１０（ＰＢＳに溶解されたもの）で処理した。ＰＢＳを陰性対照として使用し、化合物ＢＡＣＥ１インヒビターを陽性対照として使用した。２４時間の処理の後、順化培地および細胞抽出物をウエスタンブロットにより分析した。ＭＡｂ １１処理はＡβ、ｓＡＰＰβおよびＣＴＦβの生成を抑制した。
【図５】マウス初代培養ニューロンにおけるＢＡＣＥ１活性に対するＭＡＢ １Ａ１１の用量依存性抑制効果。マウス初代培養ニューロンをセムリキ森林ウイルスによりヒトＡＰＰｗｔで形質導入し、０．０３１ｎＭ〜１００ｎＭの希釈度範囲のＭＡｂ １Ａ１１で処理した。ニューロンを３５Ｓ−メチオニン標識で６時間にわたり代謝標識した。ＡＰＰ Ｃ末端ポリクローナル抗体でのＩＰの後、細胞抽出物からの完全長ＡＰＰおよびＣＴＦを蛍りん光体イメージングで検出した。順化培地からのＡβおよびｓＡＰＰβを直接ウエスタンブロットにより分析した（Ａ）。ＢＡＣＥ１活性の抑制に関してＣＴＦβレベルを定量した（Ｂ）。
【図６】ＭＡｂ １Ａ１１の抗原結合性フラグメント（Ｆａｂ）はマウス初代培養ニューロンにおけるＢＡＣＥ１１活性を抑制する。初代培養ニューロンをセムリキ森林ウイルスによりヒトＡＰＰｗｔで形質導入し、ＭＡｂ １Ａ１１、ＭＡｂ ５Ｇ７およびＭＡｂ １４Ｆ１０（ＰＢＳに溶解されたもの）から作製された２００ｎＭ Ｆａｂで処理した。２４時間の処理の後、順化培地および細胞抽出物をウエスタンブロットにより分析した。ＭＡｂ １１のＦａｂはＡβ、ｓＡＰＰβおよびＣＴＦβの生成を強力に抑制した。
【図７】ＭＡｂ １Ａ１１の立体空間的投与はＢＡＣＥ１活性をインビボで抑制する。野生型マウスの右半球の皮質および海馬に１μｌのＭＡｂ １Ａ１１（ＰＢＳに４μｇ／μｌで溶解）を立体空間的に注射した。対照として、ＰＢＳを左半球の皮質および海馬に注射した。注射の２４時間後、該マウスを犠死させ、脳サンプルをウエスタンブロットにより分析した。ＭＡｂ １Ａ１１は海馬および皮質の両方におけるＣＴＦβの生成を抑制した。
【図８】ＭＡｂ １Ａ１１および５Ｇ７でのＨＥＫ−ＢＡＣＥ１細胞の免疫蛍光染色。Ａ．４％ パラホルムアルデヒドで固定され、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で透過性にされた細胞の染色。Ｂ．４℃における生細胞の表面染色。
【図９】ウエスタンブロットにおけるＢＡＣＥ１欠失突然変異体でのＭＡｂ １Ａ１１の免疫活性。（Ａ）完全長免疫原ＢＡＣＥ４６−４６０（１＃）および欠失突然変異体（２＃〜９＃）に関するスキーム。ここで用いられているアミノ酸の番号づけは、図１４に示されている完全ヒトＢＡＣＥ１タンパク質のアミノ酸配列に対応している。（Ｂ）抗ＧＳＴ抗体はこれらの組換えタンパク質の全てを認識する。（Ｃ）欠失突然変異体１＃（ＢＡＣＥ４６−４６０）、４＃（ＢＡＣＥ２４０−４６０）および８＃（ＢＡＣＥ３１４−４６０）は免疫反応性であるが、該欠失体の残りの全てはＭＡｂ １Ａ１１に対する免疫反応性を有さない。
【図１０】ＢＡＣＥ１触媒ドメイン残基３１４−４４６（この図におけるＳｅｒ２５３−Ａｓｎ３８５）のＣ末端の三次元構造。この図を作成するためにＰＤＢファイル２ｇ９４を使用した。ループＤ上の残基３３２−３３４およびループＦ上の残基３７６−３７９は黒色のリボンで表されており、残りの残基は灰色のリボンで表されている。
【図１１】ループＦ上のアミノ酸３７６−３７９の突然変異誘発（ｍｕｔ３７６−９ ＳＱＤＤからＷＡＡＡへ）およびループＤ上のアミノ酸３３２−３３４の突然変異誘発（ｍｕｔ３３２−４ ＱＡＧからＡＧＡへ）はウエスタンブロットにおけるＢＡＣＥ１に対するＭＡｂ １Ａ１１の免疫反応性を喪失させる。抗ＧＳＴ抗体は野生型およびｍｕｔ３７６−９突然変異体ＢＡＣＥ１（Ａ）またはｍｕｔ３３２−４突然変異体ＢＡＣＥ１（Ｂ）を認識するが、ＭＡｂ１Ａ１１は野生型ＢＡＣＥ１しか認識しない。
【図１２】ループＦ上のアミノ酸３７６−３７９の突然変異誘発（ｍｕｔ３７６−９ ＳＱＤＤからＷＡＡＡへ）およびループＤ上のアミノ酸３３２−３３４の突然変異誘発（ｍｕｔ３３２−４ ＱＡＧからＡＧＡへ）は免疫沈降におけるＢＡＣＥ１に対するＭＡｂ １Ａ１１の免疫反応性を喪失させる。ＢＡＣＥ１の野生型および突然変異形態を哺乳類細胞内で発現させ、細胞抽出物を免疫沈降に使用した。免疫沈降物を、抗ＢＡＣＥ１モノクローナル抗体１０Ｂ８を使用するウエスタンブロットで検出した。同様の量の野生型およびｍｕｔ３７６−９突然変異体ＢＡＣＥ１（Ａ）またはｍｕｔ３３２−４突然変異体ＢＡＣＥ１（Ｂ）を免疫沈降のための投入物質として使用した。ＭＡｂ １Ａ１１は野生型ＢＡＣＥ１だけに結合し、ｍｕｔ３７６突然変異体ＢＡＣＥ１（Ａ）にもｍｕｔ３３２−４突然変異体ＢＡＣＥ１（Ｂ）にも結合しなかった。ＢＡＣＥ１上のコンホメーションエピトープを認識するもう１つのＭＡｂ ５Ｇ７を陽性対照として使用した。
【図１３】ＢＡＣＥ１ ｍｕｔ３７６−９およびｍｕｔ３３２−４は細胞アッセイにおいて活性である。野生型ＡＰＰで安定に発現されたＨＥＫ２９３細胞を突然変異体または野生型ＢＡＣＥ１で一過性にトランスフェクトした。未トランスフェクト化（ＮＴ）細胞を陰性対照として使用した。ｓＡＰＰβをＢＡＣＥ１活性に関する読出しとして検出した。未トランスフェクト化細胞と比較して、突然変異体ＢＡＣＥ１、ｍｕｔ３７６−９（Ａ）およびｍｕｔ３３２−４（Ｂ）でトランスフェクトされた細胞はより高いレベルのｓＡＰＰβを生成した。このことは、該突然変異体がＢＡＣＥ１活性において尚も活性であることを示唆している。野生型ＢＡＣＥ１と比較して、ＢＡＣＥ１の突然変異形態は、ＢＡＣＥ１レベルに対するｓＡＰＰβレベルの比による評価において同様のレベルの酵素活性を示した。
【図１４】ヒトＢＡＣＥ１タンパク質のアミノ酸配列（アミノ酸１−５０１；配列番号１）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
定義
「抗原」なる語は、抗体のような免疫グロブリンが有するアフィニティーおよび特異性の対象である構造体、多くの場合はポリペプチドまたはタンパク質を意味する。「抗原決定基」、「抗原標的」および「エピトープ」なる語は全て、抗原上の、または抗体のような免疫グロブリンが有するアフィニティーおよび特異性の対象である抗原性構造体上の、特異的結合部位を意味する。
【００１９】
「コンホメーションエピトープ」なる語は、抗体に厳密にフィット（嵌合）し結合することを可能にする、抗原の三次元表面特性を有するエピトープを意味する。例外は直鎖状エピトープであり、これは、タンパク質の３Ｄ形状（三次構造）ではなくアミノ酸配列（一次構造）により決定される。
【００２０】
「抗体」なる語は、抗原または抗原決定基に対するアフィニティーを有するタンパク質またはポリペプチドを意味する。そのような抗体は、一般に、４本の鎖、すなわち、２本の重鎖および２本の軽鎖から構成され、したがって四量体である。その例外は、重鎖二量体から構成され軽鎖を欠くが尚も広範な抗原結合レパトワを有するラクダ抗体である。抗体は、通常、可変領域および定常領域の両方を有し、この場合、可変領域は大抵は該抗体の特異性の決定をもたらし、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００２１】
「特異性」なる語は、抗体のような免疫グロブリンが１つの抗原標的に、別の抗原標的と比べて優先的に結合する能力を意味し、必ずしも、高いアフィニティーを示唆するものではない。
【００２２】
「アフィニティー」は、抗原および抗体の平衡を、それらの結合により形成される複合体が存在する方向へ移動させるように、抗体のような免疫グロブリンが抗原に結合する度合を意味する。したがって、抗原および抗体が比較的等しい濃度で合されている場合、高いアフィニティーの抗体は、生じる複合体の濃度を増加させる方向へ該平衡を移動させるように、利用可能な抗原に結合するであろう。
【００２３】
「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」なる語は、Ｈ（重）鎖またはＬ（軽）鎖の可変領域内の可変ループ（それぞれＶＨおよびＶＬとも略称される）を意味し、抗原標的に特異的に結合しうるアミノ酸配列を含有する。これらのＣＤＲ領域は特定の抗原決定基構造に対する該抗体の基本的な特異性をもたらす。そのような領域は「超可変領域」とも称される。ＣＤＲは可変領域内の不連続的なアミノ酸伸長に相当するが、種には無関係に、可変重鎖および軽鎖領域内のこれらの決定的なアミノ酸配列の位置は該可変鎖のアミノ酸配列内の類似位置を有することが判明している。全ての正規（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）抗体の重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、３つのＣＤＲ領域（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３と称される）を有し、それぞれは、それぞれの軽（Ｌ）鎖および重（Ｈ）鎖に関するその他のものに対して不連続的である。受け入れられているＣＤＲはＫａｂａｔら（１９９１）に記載されている。「対象」なる語はヒトおよび他の哺乳動物を意味する。
【００２４】
発明の範囲
ＢＡＣＥ１はアルツハイマー病（ＡＤ）治療のための確立された主要薬物標的となっているが、ＢＡＣＥ１に対する有効なインヒビター薬の開発は依然としてかなりの難題である。多くの労力はＢＡＣＥ１インヒビターの論理的設計に集中している。しかし、有効なＢＡＣＥ１インヒビター薬の出現は遅々たるものである。ＡＤに対する可能な療法としてのＢＡＣＥ１を標的とする代替的アプローチが現われることが必要とされている。
【００２５】
本発明においては、ＢＡＣＥ１に対する特異性を有するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の作製により、ＢＡＣＥ１の活性の代替的インヒビターを開発した。ハイブリドーマスクリーニングにおいて機能性アッセイ（ＢＡＣＥ１ ＦＲＥＴアッセイおよび細胞に基づく活性アッセイ）を適用することにより、ＢＡＣＥ１に対するｍＡｂインヒビターが成功裏に得られた。本発明のスクリーニング法は、ＢＡＣＥ１または他の類似プロテアーゼに関するｍＡｂモジュレータースクリーニングに実施可能であることが実証されている。特に、ＢＡＣＥ１活性を抑制しうるこれらのＢＡＣＥ１特異的モノクローナル抗体はアルツハイマー病の予防および／または治療に使用されうる。限定的なものではないが一例としては、酵素アッセイ、培養ニューロン、およびＣ５７ＢＬ６マウスの海馬／皮質への立体空間的投与によりインビボにおいて、ｍＡｂ １Ａ１１はＢＡＣＥ１活性を抑制することが示された（実施例２〜６）。ｍＡｂ １Ａ１１は、非常に選択的（結合エピトープはＢＡＣＥ１の特有の構造体上に存在する−実施例７を参照されたい）、かつ非常に強力（ニューロン培養においてＩＣ５０ 〜４ｎＭ−実施例４を参照されたい）な薬物候補であると考えられている。
【００２６】
したがって、本発明の第１の態様は、ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうることにより特徴づけられる単離された抗ＢＡＣＥ１抗体に関する。
【００２７】
「活性の抑制」は活性の「ダウンレギュレーション」と同意義であると理解される。一般に、抑制は、ＢＡＣＥ１の活性が少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または更には９６％、９７％、９８％、９９％または更には１００％抑制されることを意味する。ＢＡＣＥ１の抑制は、本明細書中に実施例において更に詳細に記載されているとおりに決定されうる。該抑制性抗体はＢＡＣＥ２または他のアスパラギン酸プロテアーゼの活性を抑制しない、すなわち言い換えると、ＢＡＣＥ２または他のアスパラギン酸プロテアーゼに比べ選択的であることは明らかなはずである。
【００２８】
もう１つの実施形態においては、該抗体は更に、アクセッション番号ＬＭＢＰ ６８７１ＣＢまたはＬＭＢＰ ６８７２ＣＢまたはＬＭＢＰ ６８７３ＣＢを有するハイブリドーマ細胞系により分泌されることにより特徴づけられる。
【００２９】
特定の実施形態においては、該抗体はＢＡＣＥ１のエクトドメインに特異的に結合する。より詳しくは、該抗体は、ＢＡＣＥ１エピトープ、特にＢＡＣＥ１コンホメーションエピトープ、より詳しくはＢＡＣＥ１コンホメーションエピトープへの結合に関して特異的である。限定的なものではないが一例としては、該コンホメーションエピトープは、ループＤおよびＦの組合せ、より詳しくは、ループＤの残基３３２−３３４（ＱＡＧ）とループＦの残基３７６−３７９（ＳＱＤＤ；配列番号１１）との組合せを含みうる。ループＤおよびＦはＨｏｎｇら（２０００）に記載されている。
【００３０】
特定の実施形態としては、該抗体は、ヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体であることにより更に特徴づけられる。
【００３１】
ポリペプチド治療用物質、特に、抗体に基づく治療用物質は、薬物としての相当な潜在性を有する。なぜなら、それらはそれらの標的に対する非常に優れた特異性および低い固有毒性を有するからである。特に、モノクローナル抗体の特徴、例えば高いアフィニティー、高い選択性、ならびに治療用運搬のためのタンパク質操作に適した特有の構造および機能ドメインは、それらを潜在的な薬物候補にする。ＢＡＣＥ１は細胞表面を介して輸送されると報告されている（背景の節も参照されたい）。ＢＡＣＥ１抑制性モノクローナル抗体はＢＡＣＥ１を細胞表面に標的化することが可能であり、インターナリゼーションされてエンドサイトーシス経路におけるＡβ生成を抑制しうる。
【００３２】
しかし、治療上有用な標的に対して得られた抗体は、投与の際のヒト個体における望ましくない免疫反応を回避するために、それをヒトの治療のために調製するためには、追加的な修飾を要することが当業者に公知である。該修飾過程は一般に「ヒト化」と称される。ヒト以外の種において産生された抗体は、該抗体をヒトにおいて治療上有用にするためにはヒト化を要することが、当業者に公知である（（１）ＣＤＲグラフティング：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ：ＵＳ６１８０３７０，ＵＳ５６９３７６１；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ ＵＳ６０５４２９７；Ｃｅｌｌｔｅｃｈ：ＥＰ６２６３９０，ＵＳ５８５９２０５；（２）ベニアリング（Ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）：Ｘｏｍａ：ＵＳ５８６９６１９，ＵＳ５７６６８８６，ＵＳ５８２１１２３）。抗体のヒト化は組換えＤＮＡ技術を含み、ＨおよびＬ鎖をコードするげっ歯類および／またはヒトゲノムＤＮＡ配列の一部から、あるいはＨおよびＬ鎖をコードするｃＤＮＡクローンから出発する。非ヒト抗体のヒト化のための技術は当業者に公知であり、これらは現在の技術水準の一部を構成する。非ヒト哺乳類抗体または動物抗体はヒト化されうる（例えば、ＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ １９９３を参照されたい）。本発明の抗体またはモノクローナル抗体は、例えば、げっ歯類抗体またはげっ歯類モノクローナル抗体のヒト化形態でありうる。
【００３３】
本発明のもう１つの態様は、本発明の抗ＢＡＣＥ１抗体を抑制する活性フラグメントに関する。
【００３４】
「活性フラグメント」なる語は、それ自体が抗原決定基またはエピトープに対して高いアフィニティーを有する、抗体の一部を意味し、そのような特異性をもたらす１以上のＣＤＲを含有する。非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、ｓｃＦｖ、重−軽鎖二量体、ナノボディ、ドメイン抗体、および一本鎖構造体、例えば完全軽鎖または完全重鎖が含まれる。本発明を考慮した場合の該フラグメントの「活性」のための追加的要件は、該フラグメントがＢＡＣＥ１活性を抑制しうることである。本発明の抗体またはそれらの活性フラグメントは適当な標識により標識されることが可能であり、該標識は、例えば酵素型、比色型、化学発光型、蛍光型または放射能型のものでありうる。
【００３５】
本発明のもう１つの態様は、本発明の抑制性抗ＢＡＣＥ１抗体を分泌する、アクセッション番号ＬＭＢＰ ６８７１ＣＢまたはＬＭＢＰ ６８７２ＣＢまたはＬＭＢＰ ６８７３ＣＢを有するハイブリドーマ細胞系に関する。
【００３６】
本発明の抑制性抗ＢＡＣＥ１抗体は、医薬として、特に、アルツハイマー病の予防または治療を要する対象におけるアルツハイマー病を予防または治療するための多数の用途において有用である。さらにもう１つの実施形態においては、該抗体は、ＢＡＣＥ１の過剰発現に関連した疾患を治療するための医薬の製造に使用されうる。ＢＡＣＥ１の過剰発現が生じる疾患の一例はアルツハイマー病である。特定の実施形態においては、本発明の抗体またはその活性フラグメントはアミロイドベータペプチド（Ａβ）および／またはアミロイドベータ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の生成の予防および／または軽減において使用されうる。
【００３７】
一般に、「治療的有効量」、「治療的有効用量」および「有効量」は、所望の結果（ＢＡＣＥ１結合の抑制；アルツハイマー病の治療または予防）を達成するのに必要な量を意味する。効力および従って「有効量」は、本発明において使用されるＢＡＣＥ１結合を抑制する抗体によって様々となりうる、と当業者は認識するであろう。当業者は該抗体の効力を容易に評価することが可能である。「医薬上許容される」は、生物学的にもその他においても有害でない物質に関して用いられ、すなわち、該物質は、望ましくない生物学的効果を及ぼしたり、含有されている医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な様態で相互作用することなく、該化合物と共に個体に投与されうる。
【００３８】
「治療するための医薬」なる語は、本明細書に記載されている疾患を治療または予防するための、前記の抗体と医薬上許容される担体または賦形剤（それらの両方の用語は互換的に用いられうる）とを含む組成物に関するものである。前記の抗体またはその医薬上許容される塩の投与は、経口、吸入または非経口投与によるものでありうる。特定の実施形態においては、該抗体は鞘内または脳室内投与により運搬される。該活性化合物は単独で投与されることが可能であり、あるいは好ましくは、医薬組成物として製剤化されうる。該抗体により認識される抗原を発現するアルツハイマー病を治療するのに有効な量は、通常の要因、例えば、治療される障害の性質および重症度ならびに該哺乳動物の体重に左右される。しかし、単位用量は、通常、抗体またはその医薬上許容される塩０．０１から５０ｍｇ、例えば、０．０１から１０ｍｇ、または０．０５から２ｍｇである。単位用量は、合計１日量が通常、０．０００１から１ｍｇ／ｋｇの範囲となるよう、通常、１日１回または２回以上、例えば、１日２、３または４回、より通常は、１日１から３回投与される。例えば、７０ｋｇの成人に対する適当な合計１日量は０．０１から５０ｍｇ、例えば、０．０１から１０ｍｇ、またはより通常は０．０５から１０ｍｇである。該化合物またはその医薬上許容される塩は、単位投与組成物、例えば、単位投与経口、非経口または吸入組成物の形態で投与されることが非常に好ましい。そのような組成物は混合により製造され、適切には、経口、吸入または非経口投与に適合化され、したがって、錠剤、カプセル剤、経口液体製剤、散剤、顆粒剤、ロゼンジ、還元（再構成）可能な散剤、注射可能および注入可能な溶液もしくは懸濁液、または坐剤またはエアロゾル剤の形態でありうる。経口投与用の錠剤およびカプセル剤は、通常、単位用量で提供され、通常の賦形剤、例えば結合剤、充填剤、希釈剤、打錠剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、香味剤および湿潤剤を含有する。錠剤は、当技術分野におけるよく知られた方法によりコーティングされうる。使用される適当な充填剤には、セルロース、マンニトール、ラクトースおよび他の同様の物質が含まれる。適当な崩壊剤には、デンプン、ポリビニルピロリドンおよびデンプン誘導体、例えばデンプングリコール酸ナトリウムが含まれる。適当な滑沢剤には、例えば、ステアリン酸マグネシウムが含まれる。適当な医薬上許容される湿潤剤には、ラウリル硫酸ナトリウムが含まれる。これらの固体経口組成物は、混合、充填、打錠などの通常の方法により製造されうる。多量の充填剤を使用する組成物の全体にわたって活性物質を分配させるために、反復混合操作が用いられうる。そのような操作は、勿論、当技術分野における常套手段である。経口液体製剤は、例えば、水性または油性の懸濁剤、溶液剤（水剤）、乳剤（エマルション）、シロップ剤またはエリキシル剤の形態であることが可能であり、あるいは使用前に水または他の適当なビヒクルで還元するための乾燥製品として提供されうる。そのような液体製剤は、通常の添加剤、例えば懸濁化剤、例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲルまたは硬化食用脂肪、乳化剤、例えばレシチン、ソルビタンモノオレアートまたはアカシア；非水性ビヒクル（これには食用油が含まれる）、例えばアーモンド油、分別化ヤシ油、油性エステル、例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはエチルアルコールのエステル；保存剤、例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸、そして所望により、通常の香味剤または着色剤を含有しうる。経口製剤には、通常の徐放製剤、例えば、腸溶コーティングを有する錠剤または顆粒剤も含まれる。好ましくは、吸入用の組成物は、気道への投与用に、嗅剤またはエアロゾル剤または溶液剤（ネブライザー用のもの）として、あるいは吹送法用の微細散剤として、単独で又は不活性担体、例えばラクトースと組合せて提供される。そのような場合、活性化合物の粒子は、適切には、５０ミクロン未満、好ましくは１０ミクロン未満、例えば１から５ミクロン、例えば２から５ミクロンの直径を有する。好ましい吸入用量は０．０５から２ｍｇ、例えば０．０５から０．５ｍｇ、０．１から１ｍｇ、または０．５から２ｍｇの範囲である。非経口投与の場合には、本発明の化合物と無菌ビヒクルとを含有する流体単位用量形態を製造する。該活性化合物は、該ビヒクルおよび濃度に応じて、懸濁または溶解されうる。非経口溶液は、通常、該化合物をビヒクルに溶解し、滅菌濾過した後で適当なバイアルまたはアンプル内に充填し密封することにより製造される。有利には、補助剤、例えば局所麻酔薬、保存剤および緩衝剤も該ビヒクルに溶解される。安定性を増強するために、バイアル内への充填後、該組成物を凍結し、真空下で水を除去することが可能である。非経口懸濁剤は、該化合物を溶解する代わりにビヒクルに懸濁させエチレンオキシドにさらすことにより滅菌した後で無菌ビヒクルに懸濁させること以外は、実質的に同じ方法で製造される。有利には、該活性化合物の均一な分布を促進させるために、界面活性剤または湿潤剤を該組成物中に含有させる。適当な場合には、少量の気管支拡張薬、例えば交感神経興奮性アミン、例えばイソプレナリン、イソエタリン、サルブタモール、フェニレフリンおよびエフェドリン；キサンチン誘導体、例えばテオフィリンおよびアミノフィリン、ならびにコルチコステロイド、例えばプレドニゾロンおよび副腎刺激剤、例えばＡＣＴＨが含有されうる。慣例のとおり、該組成物には、通常、関係のある医学的治療における使用のための、書面の又は印刷された説明が付属する。
【００３９】
本発明の更にもう１つの実施形態においては、本発明の抗体は、血液脳関門（ＢＢＢ）を越える輸送を可能にするように製剤化されうる（Ｐａｒｄｒｉｇｄｅ ２００７）。本発明の抗体のＢＢＢ輸送は、限定的なものではないが分子トロイ木馬（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｒｏｊａｎ ｈｏｒｓｅ）により達成されうる。現在公知の最も有効なＢＢＢ分子トロイ木馬はヒトインスリン受容体に対するモノクローナル抗体（ＨＩＲｍＡｂ）である。アルツハイマー病に対する、抗体に基づく新規治療法として、ＢＢＢを通過させるために、抗アミロイドベータモノクローナル抗体が操作され、ＨＩＲｍＡｂに融合されている（Ｂｏａｄｏら，２００７）。また、脳への抗体に基づく薬物の運搬を促進させるために、種々の薬物運搬系（例えば、とりわけ、ミクロスフェア、ナノ粒子、ナノゲル）が研究中であり（Ｐａｔｅｌら，２００９）、これらの全ては本発明の実施において使用されうる。
【００４０】
本発明は更に、本発明の抗体または活性フラグメントと少なくとも１つの医薬上許容される担体、アジュバント（補助剤）または希釈剤とを含む医薬組成物に関する。
【００４１】
本発明は更に、その医薬上許容される塩またはその医薬上許容される溶媒和物と、必要に応じて、その医薬上許容される担体とを含む、本明細書に記載されている障害の治療および／または予防において使用するための医薬組成物を提供する。
【００４２】
「担体」または「アジュバント」、特に「医薬上許容される担体」または「医薬上許容されるアジュバント」は、該組成物の投与を受ける個体に有害な抗体の産生をそれ自体は誘導せず、また、防御も惹起しないいずれかの適当な賦形剤、希釈剤、担体および／またはアジュバントである。好ましくは、医薬上許容される担体またはアジュバントは、抗原により惹起される免疫応答を増強する。適当な担体またはアジュバントは、典型的には、以下の非網羅的一覧に含まれる化合物の１以上を含む：大きな遅代謝巨大分子、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体アミノ酸、アミノ酸共重合体および不活性ウイルス粒子。
【００４３】
「希釈剤」、特に「医薬上許容されるビヒクル」には、ビヒクル、例えば水、塩類液（食塩水）、生理的塩類液、グリセロール、エタノールなどが含まれる。補助的物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、保存剤がそのようなビヒクルに含有されうる。
【００４４】
アルツハイマー病に対する本発明の治療方法は、当技術分野で公知のいずれかの他のＡＤ疾患療法、例えばガンマ−セクレターゼインヒビターまたは他のベータ−セクレターゼインヒビターと組合せて使用することも可能であることが、明らかなはずである。
【００４５】
本発明は更に、ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうる抗ＢＡＣＥ１抗体の単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）に関する。該ＣＤＲも、例えば担体、アジュバントまたは希釈剤を更に含む組成物中に含有されうる。該単離ＣＤＲ核酸配列、ならびにそのようなＣＤＲ核酸を含むいずれかのベクターまたは組換え核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはそれらのいずれかのハイブリッド；直鎖状または環状；鎖数には無関係）は、本発明の一部である。そのようなＣＤＲ核酸配列、ベクターまたは組換え核酸を含むいずれかの宿主細胞も同様に、本発明の一部である。
【００４６】
本発明はまた、ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうる抗ＢＡＣＥ１抗体の単離された可変領域に関する。該可変領域も、例えば担体、アジュバントまたは希釈剤を更に含む組成物中に含有されうる。該単離可変領域核酸配列、ならびにそのような可変領域核酸を含むいずれかのベクターまたは組換え核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはそれらのいずれかのハイブリッド；直鎖状または環状；鎖数には無関係）は、本発明の一部である。そのような可変領域核酸配列、ベクターまたは組換え核酸を含むいずれかの宿主細胞も同様に、本発明の一部である。
【００４７】
本発明のもう１つの態様は、前記の少なくとも１つのＣＤＲまたは前記の少なくとも１つの可変領域を含む、ＢＡＣＥ１活性を抑制しうる化合物に関する。そのような化合物はアルツハイマー病の予防および／または治療において使用されうる。該化合物も、例えば担体、アジュバントまたは希釈剤を更に含む組成物中に含有されうる。そのような化合物の非限定的な例はタンパク質アプタマー、および二重特異性抗体またはその活性フラグメントである。
【００４８】
本発明のもう１つの態様は、
（ｉ）非ヒト動物をＢＡＣＥ１で免疫化し、
（ｉｉ）ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうる抗体に関して複数のハイブリドーマ系をスクリーニングすることを含む、ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうる抗体の製造または作製または選択方法を含む。
【００４９】
あるいは、本発明はまた、
（ｉ）非ヒト動物をＢＡＣＥ１で免疫化し、
（ｉｉ）ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうる抗体に関して複数のハイブリドーマ系をスクリーニングし、
（ｉｉｉ）該抗体を産生するハイブリドーマを単離することを含む、ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうる抗体の製造または作製または選択方法を含む。
【００５０】
いずれかの適当な動物、例えば温血動物、特に哺乳動物、例えばウサギ、マウス、ラット、ラクダ、ヒツジ、ウシまたはブタ、あるいは鳥類、例えばニワトリまたはシチメンチョウが、免疫応答の生成に適した当技術分野でよく知られた技術のいずれかを用いて、ＢＡＣＥ１またはその少なくとも一部、断片、抗原決定基またはエピトープで免疫化されうる。動物を免疫化するための方法は当技術分野でよく知られている。当業者により認識されるとおり、免疫原を、免疫応答を増強するためのアジュバントまたはハプテン（例えば、完全または不完全フロイントまたはリピドＡアジュバント）と、あるいは担体、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と混合することが可能である。適当な動物を免疫化し、該抗原に対する免疫応答が該動物により確立されたら、該動物からの抗体産生細胞をスクリーニングして、所望の活性を有する抗体を産生する細胞を特定する。多数の実施形態においては、これらの方法は、免疫化動物の脾臓からの細胞を適当な不死細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を得るハイブリドーマ技術を用いる。これらのハイブリドーマ細胞からの上清をスクリーニングすることが可能であり、標準的な方法（例えば、Ｈａｒｌｏｗら，１９９８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｆｉｒｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９８）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）に従い、陽性クローンを増殖させる。
【００５１】
前記方法の工程（ｉ）の免疫化は、ＢＡＣＥ１またはその少なくとも一部、断片、抗原決定基またはエピトープを使用して行われうる。特に、該免疫化は、ＢＡＣＥ１のエクトドメインを使用して行われうる。工程（ｉｉ）におけるハイブリドーマ系のスクリーニングは、自体公知の１以上のスクリーニング技術を用いて行われうる。好ましい実施形態においては、実施例において非限定的に例示されているとおり、細胞に基づくスクリーニングアッセイおよび／または無細胞スクリーニングアッセイにおいてＢＡＣＥ１の抑制活性を測定することにより機能性スクリーニングを行う。もう１つの好ましい実施形態においては、該抗体はモノクローナル抗体である。
【００５２】
特定の実施形態においては、本発明の抗体は診断アッセイの調製のために使用されうる。ＢＡＣＥ１は、種々の細胞および組織、特に、脳細胞および組織において検出されることが可能であり、この場合、発現の度合はアルツハイマー病の重症度を裏づける。したがって、生物学的サンプルにおけるＢＡＣＥ１発現の局在化および分布をインシトゥ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で検出する方法を提供する。該方法は、該生物学的サンプルを、本発明の検出可能な抗ＢＡＣＥ１抗体と反応させ、該抗体の局在化および分布を検出する工程を含む。「生物学的サンプル」なる語は、脳細胞および組織（これらに限定されるものではない）を含む細胞および組織を意味する。該用語は更に、体液を意味する。したがって、患者の体液中のＢＡＣＥタンパク質の検出方法を提供する。該方法は、体液を本発明の抗ＢＡＣＥ抗体と反応させ、該反応をモニターする工程を含む。該体液は、例えば血漿、尿、脳脊髄液、胸水または唾液である。該反応のモニターは、検出可能な部分で該抗体を標識することにより、または、検出可能部分を含む第２抗体が特異的に結合しうる固有検出可能部分としてその定常領域を使用して行われうる。ＣＳＦ ＢＡＣＥ１は、例えば、アルツハイマー病に罹患した患者において検出されうる。本発明の好ましい実施形態においては、体液と該抗ＢＡＣＥ１抗体との反応を溶液中で行う。あるいは、体液と該抗ＢＡＣＥ１抗体との反応を、体液中に存在するタンパク質を吸着しうる基質上で行う（全て、抗体に基づく診断の分野でよく知られている）。さらに、本発明においては、生物学的サンプル中のＢＡＣＥ１タンパク質の存在、非存在またはレベルの検出方法を提供する。該方法は以下の工程を含む。第１に、生物学的サンプルからタンパク質を抽出し、それにより複数のタンパク質を得る。該タンパク質抽出物は粗抽出物であることが可能であり、非タンパク質性物質をも含みうる。第２に、該タンパク質を、例えば電気泳動、ゲル濾過などにより、サイズにより分離する。第４に、該サイズ分離タンパク質を抗ＢＡＣＥ１抗体と相互作用させる。最後に、相互作用した抗ＢＡＣＥ１抗体の存在、非存在またはレベルを検出する。ゲル電気泳動の場合、該抗体との相互作用は、典型的には、該サイズ分離タンパク質を固体支持体（膜）上にブロットした後で行われる。
【００５３】
前記抗ＢＡＣＥ１抗体またはその活性フラグメントの製造方法は本発明の肝要な態様を構成する。特に、そのような方法は、
（ｉ）該抗体または抗体フラグメントの組換え発現により、あるいは該抗体または抗体フラグメントの化学合成により、該抗体または抗体フラグメントの粗調製物を得、（ｉｉ）（ｉ）において得られた粗調製物から該抗体または抗体フラグメントを精製する工程を含みうる。あるいは、
（ｉ）該抗体の組換え発現により、あるいは該抗体の化学合成により、該フラグメントを含む抗体の粗調製物を得、
（ｉｉ）（ｉ）において得られた粗調製物から該抗体を精製し、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）において精製された抗体から活性フラグメントを単離する工程を含む方法により、本発明の抗ＢＡＣＥ１抗体を抑制する活性フラグメントが入手または製造されうる。
【００５４】
前記方法においては、組換え発現はハイブリドーマ細胞系における発現に限定されない。
【００５５】
（ｉ）本発明の抑制性抗ＢＡＣＥ１抗体、（ｉｉ）（ｉ）の活性フラグメント、（ｉｉｉ）（ｉ）のＣＤＲアミノ酸配列、（ｉｖ）（ｉ）の可変領域アミノ酸配列、または（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）を含む化合物を含むおよび／または分泌する任意の宿主細胞も同様に、本発明の一部である。
【実施例】
【００５６】
生物寄託
本明細書の全体に記載されているモノクローナル抗体を分泌する以下のハイブリドーマ細胞系はブダペスト条約に従い寄託された。
【００５７】
【表１】
【００５８】
該寄託機関の詳細は以下のとおりである：ＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｇｈｅｎｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，‘Ｆｉｅｒｓ−Ｓｃｈｅｌｌ−Ｖａｎ Ｍｏｎｔａｇｕ’ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｐａｒｋ ９２７，Ｂ−９０５２ Ｇｅｎｔ−Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ。
【００５９】
「ＭＡＢ−Ｂ１−１Ａ１１」および「１Ａ１１」なる表記は、本発明の全体において、対象ハイブリドーマ細胞系または該ハイブリドーマ細胞系により分泌されるモノクローナル抗体に関して互換的に用いられる。
【００６０】
「ＭＡＢ−Ｂ１−１４Ｆ１０」および「１４Ｆ１０」なる表記は、本発明の全体において、対象ハイブリドーマ細胞系または該ハイブリドーマ細胞系により分泌されるモノクローナル抗体に関して互換的に用いられる。
【００６１】
「ＭＡＢ−Ｂ１−５Ｇ７」および「５Ｇ７」なる表記は、本発明の全体において、対象ハイブリドーマ細胞系または該ハイブリドーマ細胞系により分泌されるモノクローナル抗体に関して互換的に用いられる。
【００６２】
材料および方法
免疫化およびハイブリドーマの製造
５匹の９週齢ＢＡＣＥ１−／ＢＡＣＥ２−／−マウスに４週間隔で４回の免疫化を行った。それぞれの免疫化はフロイントアジュバントとの１：１混合物中の精製ヒトＢＡＣＥ１エクトドメインタンパク質（アミノ酸４５−４６０；ＨＥＫ２９３細胞培養から産生）の１回の腹腔内注射を含むものであった。第１の免疫化はフロイント完全アジュバントとの１：１混合物中の５０μｇの免疫原を含むものであった。一方、全ての後続の免疫化はフロイント不完全アジュバントとの混合物中の４０μｇの免疫原を使用した。４回目の免疫化の２週間後、各免疫化マウスの血清中のＢＡＣＥ１特異的抗体をＥＬＩＳＡにより力価測定した。最高力価（ＥＬＩＳＡにおいて４０，０００回の希釈の後で検出可能）を示す２匹のマウスをハイブリドーマの作製のために選択した。
【００６３】
血清抗体価が有意に低下した、４回目の免疫化の３ヵ月後に、ハイブリドーマを製造した。３０μｇの免疫原を使用して、尾静脈における１回の静脈内注射からなる１回の最終追加抗原を各マウスに投与した。マウスを犠死させ、脾臓を単離し、骨髄腫細胞と４：１の比で融合させた。合計２億個の脾細胞を集め、５０００万個の骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを得、細胞混合物を、マウス支持細胞層でコーティングされた２７個の９６ウェルプレート内に分割した。細胞を、まず、ハイブリドーマ選択のためにＨＡＴ培地内で２週間培養し、ついで、１５％ ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で補足された通常増殖培地ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への交換の前にＨＡ培地内で更に１週間培養した。該ウェルの９０％以上がハイブリドーマ選択後の細胞増殖を示している。
【００６４】
ＥＬＩＳＡによるハイブリドーマのスクリーニング
抗ＢＡＣＥ１抗体を産生する陽性ハイブリドーマクローンのＥＬＩＳＡスクリーニングを標準的なＥＬＩＳＡプロトコールに従い行った。簡潔に説明すると、９６ウェル塩化ポリビニルプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）を１μｇ／ｍｌ 精製ＢＡＣＥ１エクトドメインタンパク質（ＰＢＳ中）で５０μｌ／ウェルで４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳ中の２％ ＢＳＡで室温（ＲＴ）で１時間ブロッキングした後、５０μｌのハイブリドーマ上清を該プレートに加え、２時間温置した。ついで該プレートをＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、ブロッキングバッファー中の１：５０００希釈の抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｉｎｎｏｖａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に室温で１時間温置した。洗浄後、プレートを０．１Ｍ ＮａＡｃ（ｐＨ ４．９）および０．０３％ Ｈ２Ｏ２中の５０μｌの０．２ｍｇ／ｍｌ テトラメチルベンジジン（ｓｉｇｍａ）で２５分間現像した。５０μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えることにより反応を停止させ、ＯＤ４５０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダー上でプレートを読取った。
【００６５】
ｍｃａ−Ｆｒｅｔアッセイによるハイブリドーマのスクリーニング
ハイブリドーマのｍｃａ−Ｆｒｅｔアッセイスクリーニングを、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙにより提供された標準的なプロトコールを幾らか変更したものにより行った。簡潔に説明すると、酵素ＢＡＣＥ１Ｆｃを反応バッファー（５０ｍＭ 酢酸アンモニウム，ｐＨ ４．６，３％ ＢＳＡ，０．７％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中で１μｇ／ｍｌの濃度で希釈し、小さなＦＲＥＴペプチド基質ＭＣＡ−ＳＥＶＥＮＬＤＡＥＦＲＫ（Ｄｎｐ）−ＲＲＲＲ−ＮＨ２を反応バッファー中で１２５μＭの濃度で希釈した。９６ウェル黒色ポリスチレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ）内で２０μｌのハイブリドーマ上清を３０μｌの酵素希釈液および５０μｌの基質希釈液と混合し、該プレートをベースラインシグナルに関してＥｎｖｉｓｉｏｎ（３５５ｎｍ励起、４３０ｎｍ発光、１秒／ウェル）で直ちに読取り、ついで暗所で室温で一晩温置した。翌朝、同じ読取りプロトコールを用いて該プレートを読取った。
【００６６】
免疫蛍光染色によるハイブリドーマのスクリーニング
ＢＡＣＥ１を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を、０．２ｍｇ／ｍｌ ポリ−Ｌ−リシンで予め処理された９６ウェルプレート上で増殖させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、ついで４％ パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で透過性亢進させた。ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中の２％ＦＣＳ，２％ ＢＳＡおよび０．２％ ゼラチン）中で希釈された５％ ヤギ血清で該細胞を４℃で一晩ブロッキングした後、５０μｌのハイブリドーマ上清を各ウェルの細胞に加え、室温で２時間温置した。ついで細胞を洗浄し、ブロッキングバッファー中で１：１０００希釈のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に室温で１時間にわたり更に温置した。洗浄後、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｅｒ １０００（Ａｍｍｅｒｓｈａｍ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により９６ウェルプレートを読取った。
【００６７】
細胞アッセイによるハイブリドーマのスクリーニング
ＡＰＰを安定に発現するＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を９０％コンフルエントまで２４ウェルプレート上で増殖させた。洗浄後、４．５ｇ／Ｌ グルコース、０．１１ｇ／Ｌ ピルビン酸ナトリウムおよび１５％ ＦＣＳで補足された１００μｌの新鮮増殖培地ＤＭＥＭと混合された１００μｌのハイブリドーマ上清で、３７℃、５％ＣＯ２および７０％相対湿度で細胞を処理した。新鮮培地と混合された陰性ハイブリドーマ細胞からの上清を陰性対照として使用した。２４時間の処理の後、順化培地を集め、１３，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、抗体抗ｓＡＰＰβポリクローナル抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ）および６Ｅ１０（Ｓｉｇｎｅｔ）を使用するウエスタンブロットによりｓＡＰＰβおよびｓＡＰＰαに関して上清を分析した。
【００６８】
イソタイプ決定、サブクローニングおよび抗体精製
Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇキット（Ｒｏｃｈｅ）を該製造業者の説明に従い使用して、１Ａ１１、５Ｇ７、１４Ｆ１０および２Ｇ３のイソタイプを１ｇＧ１（１Ａ１１，５Ｇ７）、１ｇＧ２ｂ（１４Ｆ１０）およびＩｇＭ（２Ｇ３）と決定した。ハイブリドーマクローン１Ａ１１、５Ｇ７および１４Ｆ１０を限界希釈により４回サブクローニングした。４ｍＭ グルタミン、４ｇ／Ｌ Ｄ−グルコースおよび１５％ ＦＣＳで補足されたＤＭＥＭ培地を使用してＣｅｌｌｉｎｅＣＬ−１０００バイオリアクター（ＶＷＲ）においてハイブリドーマクローンを３７℃、５％ＣＯ２および７０％相対湿度で培養することにより、抗体産生を行った。該抗体を、プロテインＧセファロース４（Ｓｉｇｍａ）を使用するアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、透析膜ＭＷＣＯ ６０００−８０００ダルトン（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）を使用してＰＢＳ中で透析した。それぞれの６〜７日間培養されたバイオリアクターからの抗体の収量は約４〜１０ｍｇであった。抗体のアリコートを液体窒素により急速凍結した後、−７０℃で貯蔵した。
【００６９】
セムリキ森林ウイルス形質導入および代謝標識を用いるｍＡｂのニューロンアッセイ試験
野生型マウス由来の混合皮質ニューロンの初代培養を作製するために、１４日齢の胚の全脳をＨＢＳＳ培地（Ｇｉｂｃｏ）内で解剖し、トリプシン処理し、ポリ−Ｌ−リシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で予めコーティングされたディッシュ（Ｎｕｎｃ）上でプレーティングした。グリア細胞増殖を防ぐためにＢ２７補足物（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）および５μＭ シトシンアラビノシドを含有する神経基礎培地（Ｇｉｂｃｏ）内で培養を維持した。３日間培養された初代ニューロンを、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）を使用してヒトＡＰＰ（ＡＰＰ野生型またはＡＰＰ Ｓｗｅｄｉｓｈ）で形質導入した。１時間のＳＦＶ形質導入の後、該培地を新鮮神経基礎培地と交換し、ついで２時間の形質導入後時間に付した。２時間の形質導入後時間の後、該神経基礎培地を、１００μＣｉ／ｍｌ［３５Ｓ］メチオニン（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）で補足された無メチオニンＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）と交換し、その一方でｍＡｂ（ＰＢＳ中）を該培地に加えた。６時間の代謝標識の後、該順化培地を集め、該細胞を氷冷ＰＢＳ中で洗浄し、完全プロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）で補足されたＩＰバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１％ デオキシコール酸ナトリウムおよび０．１％ ＳＤＳ）中で細胞溶解した。２５μｌのプロテインＧセファロースおよびＡＰＰ Ｃ末端抗体Ｂ６３．９を使用して、４℃で一晩にわたり細胞抽出物を免疫沈降させた。最後に免疫沈降物をＮｕＰａｇｅサンプルバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で溶出し、ランニングバッファー（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）中のＭＥＳおよび還元条件下で１０％ アクリルアミドＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で電気泳動した。Ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）およびｌｍａｇＱｕａＮＴ４．１を使用して結果を解析した。抗ｓＡＰＰβポリクローナル抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ）およびＷＯ−２（Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用する直接ウエスタンブロットにより、順化培地からのｓＡＰＰβおよびＡβを分析した。
【００７０】
エピトープマッピングのためのプラスミド構築
全てのＢＡＣＥ１欠失突然変異体を、ヒトＢＡＣＥ１をコードするｃＤＮＡからのＰＣＲ増幅により作製し、ｐＧＥＸ４Ｔベクター内にサブクローニングした。全ての突然変異体をＤＮＡ配列決定により確認した。
【００７１】
部位特異的突然変異誘発
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）を提供されている手順に従い使用して、ループＦのＳＱＤＤ（配列番号１１）からＷＡＡＡ（配列番号１２）（アミノ酸３７６−３７９）への、およびループＤのＱＡＧからＡＧＡ（アミノ酸３３２−３３４）への突然変異誘発を行った。構築物ｐＧＥＸ４Ｔ−ＢＡＣＥ４６−４６０およびｐｃＤＮＡ３−ＢＡＣＥ１−５０１を鋳型として使用した。全ての突然変異体をＤＮＡ配列決定により確認した。
【００７２】
ＧＳＴ融合タンパク質の発現および精製
ｐＧＥＸ４Ｔ−ＢＡＣＥ１欠失突然変異体で形質転換された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ）を対数増殖させ（１００ｍｌ、Ａ６００＝０，８）、０．２ｍＭ ＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ）で３時間誘導した。ついで細胞をペレット化し、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）で補足された１５ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に再懸濁させた。細菌を、回転させながら室温で１５分間溶菌し、ついで２０，０００×ｇ、４℃で３０にわたりペレット化した。上清を３００μｌのグルタチオン−セファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａｎ）と４℃で１時間混合した。温置後、ビーズをＰＢＳで洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ ８．０）中の１０ｍＭ Ｌ−グルタチオン（Ｓｉｇｍａ）でタンパク質を溶出した。
【００７３】
結果
実施例１．ハイブリドーマのスクリーニングからの候補ＢＡＣＥ１ ｍＡｂインヒビターの特定
抗ＢＡＣＥ１モノクローナル抗体を作製するために、精製ヒトＢＡＣＥ１エクトドメインタンパク質（アミノ酸４５−４６０）（配列番号１３）でのＢＡＣＥ１−／−ＢＡＣＥ２−／−マウスの一連の免疫化の後、ハイブリドーマを製造した。９６ウェルプレート上での該細胞のプレーティングの２〜３週間後（このとき、該ウェルのほとんどは＞８０％コンフルエントとなっていた。）に、ハイブリドーマのスクリーニングを開始した。ＢＡＣＥ１ ＦＲＥＴアッセイスクリーニングおよび細胞に基づくアッセイスクリーニングを含む機能性スクリーニングを初期ハイブリドーマスクリーニング段階において適用した（図１Ａを参照されたい）。ハイブリドーマ上清を、まず、固定化ＢＡＣＥエクトドメイン（免疫原）上のＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。このアッセイにおいては、約２４００個中３７７個のハイブリドーマが陽性と評価された（陽性ウェルのＥＬＩＳＡシグナルはバックグラウンドの５から３０倍であった。）。
【００７４】
該ＥＬＩＳＡスクリーニングからの陽性ハイブリドーマを更に、ＢＡＣＥ１ ｍｃａ−Ｆｒｅｔアッセイにおいて試験した。試験した３７７個のウェルのうちの６個（２Ｇ３、５Ｇ７、２Ｇ６、１０Ｇ１、１４Ｆ１０、１７Ｂ１２）のウェルからの上清がＦｒｅｔアッセイにおいてＢＡＣＥ１活性を抑制した。ハイブリドーマ（２Ｇ６、１０Ｇ１、１７Ｂ１２）は、おそらく非分泌性ハイブリドーマの早期過剰増殖のため、更なるアッセイにおいて増殖もせず陰性にもならなかった。したがって、それらは更なる分析に利用できなかった。更なる特徴づけのための潜在的候補ＢＡＣＥ１インヒビターとして、残りのウェル（２Ｇ３、５Ｇ７、１４Ｆ１０）を選択した。２Ｇ３はＩｇＭであることが判明し、したがって更なる特徴づけを行わなかった。
【００７５】
ｍｃａ−Ｆｒｅｔアッセイスクリーニングと並行して、ＢＡＣＥ１を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞の免疫蛍光染色を用いて該ハイブリドーマ上清をスクリーニングした。ＥＬＩＳＡスクリーニングにおいて最高シグナルを示したハイブリドーマの９６個のウェルを試験し、それらのうちの２５個のウェルが免疫蛍光染色においてＢＡＣＥ１に対する強力な免疫反応性を示した。
【００７６】
ＥＬＩＳＡおよび免疫蛍光染色の両方において最良シグナルを示したハイブリドーマの２５個のウェルを細胞アッセイにより更にスクリーニングして、それらがＢＡＣＥ１活性を抑制するかどうかを調べた。ＡＰＰを安定に発現するＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をハイブリドーマ上清で２４時間処理し、順化培地からのｓＡＰＰβをＢＡＣＥ活性の読出しとして分析した。この細胞アッセイにおいては、ウェル１Ａ１１からの上清はｓＡＰＰβの生成を減少させた。したがって、１Ａ１１をＢＡＣＥ１抑制のための候補の１つとして選択した。
【００７７】
要約すると、ＢＡＣＥ１ ｍＡｂインヒビターの回収の成功はｍＡｂインヒビターのスクリーニングにおけるこの方法の実施可能性を実証した。
【００７８】
実施例２．ｍＡｂ １Ａ１１、５Ｇ７および１４Ｆ１０は酵素アッセイにおいてＢＡＣＥ１活性をモジュレーションする
３つの候補ＢＡＣＥ１インヒビター１Ａ１１、５Ｇ７および１４Ｆ１０を、まず、大きな基質であるＡＰＰｓｗｅのＣ末端の１２５アミノ酸配列を基質として使用するＭＢＰ−ＥＬＩＳＡにより特徴づけした。このＭＢＰ−ＥＬＩＳＡアッセイにおいては、全３個のｍＡｂはＢＡＣＥ１活性を完全に抑制しうる（図１Ｂ）。５Ｇ７、１４Ｆ１０および１Ａ１１のＩＣ５０は、それぞれ、０．４７ｎＭ、０．４６ｎＭまたは０．７６ｎＭである。本発明者らはまた、小さなＦＲＥＴペプチドを基質として使用するｍｃａ−Ｆｒｅｔアッセイにおいて、それらの３つのｍＡｂを試験した（図２）。このアッセイにおいては、５Ｇ７および１４Ｆ１０は、それぞれ０．０６ｎＭおよび１．６ｎＭ（１４Ｆ１０）のＩＣ５０で、ＢＡＣＥ１活性を完全に抑制しうる。意外なことに、該細胞アッセイから回収されたＢＡＣＥ１インヒビターである１Ａ１１はＢＡＣＥ１活性を刺激した。
【００７９】
それらの２つの酵素アッセイからの結果は、ｍＡｂ １Ａ１１がＢＡＣＥ１−大基質相互作用（ＢＡＣＥ１−ＡＰＰ）に対する立体的インヒビターであることを示唆している。
【００８０】
実施例３．ｍＡｂ １Ａ１１はヒト神経芽細胞腫細胞においてＢＡＣＥ１を抑制する
３つの候補ｍＡｂインヒビター５Ｇ７、１４Ｆ１０および１Ａ１１を細胞アッセイにおいて試験した。野生型ＡＰＰを安定に発現するＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を６ウェルプレート内で９０％のコンフルエンシーまで培養し、３００ｎＭ ｍＡｂと共に２４時間培養した。ＰＢＳを陰性対照として使用し（ｍＡｂをＰＢＳに溶解させた。）、ＰＢＳ中で１μＭに希釈されたＢＡＣＥ１インヒビター化合物ＩＩＩ（Ｍｅｒｃｋ Ｃｏｍｐａｎｙ）を陽性対照として使用した。２４時間の処理の後、順化培地からのＡβ、ｓＡＰＰβおよびｓＡＰＰαをウエスタンブロットにより分析した。図３に示されているとおり、１Ａ１１ ｍＡｂはＡβおよびｓＡＰＰβの生成を抑制したが、５Ｇ７および１４Ｆ１０処理は細胞ＢＡＣＥ１活性に対する抑制効果を示さなかった。
【００８１】
実施例４．ｍＡｂ １Ａ１１は培養ニューロンにおいてＡＰＰｗｔのＢＡＣＥ１切断を有意に抑制する
ｍＡｂ ５Ｇ７、１４Ｆ１０および１Ａ１１を初代ニューロン培養において更に試験した。３日間培養されたマウス初代ニューロンをセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）によりヒトＡＰＰｗｔで形質導入し、３００ｎＭ ｍＡｂ（ＰＢＳ中）で２４時間処理した。ＰＢＳを陰性対照として使用し、１μＭ ＢＡＣＥ１インヒビター化合物ＩＩＩ（Ｍｅｒｃｋ Ｃｏｍｐａｎｙ）を陽性対照として使用した。２４時間の処理の後、順化培地からのＡβ、ｓＡＰＰβおよびｓＡＰＰαを、細胞ライセートからの完全長ＡＰＰ、ＣＴＦβおよびＣＴＦαと共に、ウエスタンブロットにより分析した。図４に示されているとおり、１Ａ１１処理はＡβ、ｓＡＰＰβおよびＣＴＦβの生成を有意に減少させたが、α−セクレターゼ切断産物であるＣＴＦαおよびｓＡＰＰαは増加した。残りの２つのｍＡｂである５Ｇ７および１４Ｆ１０はＡＰＰｗｔのＢＡＣＥ１切断に対する抑制効果を示さなかった。
【００８２】
ＳＦＶ−ヒトＡＰＰｗｔで形質導入され、３５Ｓ−メチオニン代謝標識により６時間にわたって代謝標識された前記ニューロンを使用して、ｍＡｂ １Ａ１１に関する用量反応曲線を確定した。ＡＰＰ Ｃ末端ポリクローナル抗体での免疫沈降の後、細胞ライセートからの完全長ＡＰＰおよびＣＴＦをホスホルイメージングで検出した。順化培地からのＡβおよびｓＡＰＰβを直接ウエスタンブロットにより分析した。ＣＴＦβレベルをＢＡＣＥ１活性に関して定量した。図５に示されているとおり、１Ａ１１は１００ｎＭの濃度で＞９０％のＢＡＣＥ１活性を抑制することが可能であり、このアッセイにおける見掛けＩＣ５０は３，７ｎＭと推定された。
【００８３】
ＢＡＣＥ１は、その長い寿命において、細胞表面を介して輸送され、細胞表面、エンドソームおよびＴＮＧを数周循環することが示されている（Ｈｕｓｅら，２０００，Ｗａｈｌｅら，２００５）。しかし、ＢＡＣＥ１のどのくらいの割合が細胞表面輸送に付されるのかは不明であり、したがって、細胞表面ＢＡＣＥ１を標的化することが、主要細胞ＢＡＣＥ１活性を阻止するのに十分な程度に有効かどうかは、推測の域を出なかった。前記結果は、ＢＡＣＥ１のエクトドメインに特異的なＢＡＣＥ１抑制性ｍＡｂが、細胞表面ＢＡＣＥ１への結合を介して同時インターナリゼーションされる可能性があることを示している。さらに、前記ニューロン培養アッセイにおいて示されているとおり、細胞表面ＢＡＣＥ１を標的化することは、主要細胞ＢＡＣＥ１活性を阻止するのに有効である。
【００８４】
実施例５．１Ａ１１の抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）は培養ニューロンにおいてＢＡＣＥ１を抑制する
５Ｇ７、１４Ｆ１０および１Ａ１１の３つのｍＡｂからの抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）を、Ｆａｂ調製キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を該製造業者の説明に従い使用して作製した。作製されたＦａｂの純度をＮｕＰＡＧＥゲル上で青色染色により試験した。ニューロンアッセイにおいて該Ｆａｂを試験するために、３日間培養されたマウス初代ニューロンを、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）を使用してヒトＡＰＰｗｔで形質導入し、２００ｎＭ Ｆａｂ（ＰＢＳ中）で処理した。２４時間の処理の後、順化培地からのＡβ、ｓＡＰＰβおよびｓＡＰＰαを、細胞ライセートからの完全長ＡＰＰ、ＣＴＦβおよびＣＴＦαと共に、ウエスタンブロットにより分析した。図６に示されているとおり、１Ａ１１ Ｆａｂは、Ａβ、ｓＡＰＰβおよびＣＴＦβの生成を減少させているため、ＢＡＣＥ１活性を抑制したが、５Ｇ７Ｆａｂおよび１４Ｆ１０ＦａｂはＢＡＣＥ１活性に対する抑制効果を示さなかった。
【００８５】
実施例６．ｍＡｂ １Ａ１１の立体空間的注射は野生型マウスにおいてＢＡＣＥ１活性を抑制する
野生型マウスの脳内への立体空間的注射により、ｍＡｂ １Ａ１１の活性をインビボで試験した。簡潔に説明すると、３月齢の野生型マウスの脳内に立体空間座標（ブレグマ −２．４６ｍｍ；外側 ＋／−２．６ｍｍ；腹側 −２．５ｍｍ）においてｍＡｂ １Ａ１１を投与した。ｍＡｂサンプルを４μｇの用量（合計体積１μｌ）で右脳内に注射し、対照として１μｌのＰＢＳを左脳内に注射した。注射の２４時間後、マウスを犠死させて脳を解剖した。注射部位を含む脳薄片（〜１．５ｍｍの厚さ）を海馬および皮質に関して更に解剖した。脳サンプルをＣＴＦβに関してウエスタンブロットにより分析した。図７に示されているとおり、１Ａ１１の投与はＣＴＦβの生成を減少させた。このことは、該ｍＡｂが野生型マウス脳においてＢＡＣＥ１活性を抑制しうることを示唆している。
【００８６】
実施例７．ＢＡＣＥ１を抑制するモノクローナル抗体のエピトープマッピング
興味深いことに、５Ｇ７および１４Ｆ１０の２つの候補ＢＡＣＥ１インヒビターは、無細胞アッセイにおいては強力な活性を示すが、細胞アッセイにおいてはＢＡＣＥ１に対する抑制効果を示さないことが示された。本発明者らは、５Ｇ７が、細胞表面に露出したＢＡＣＥ１には結合しないことを見出した。免疫蛍光染色（図８）により示されているとおり、５Ｇ７は天然条件下では細胞表面ＢＡＣＥ１に結合しなかった。５Ｇ７は、ＢＡＣＥ１を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞の順化培地からの遊離ＢＡＣＥ１を免疫沈降させるが、膜結合完全長ＢＡＣＥ１を免疫沈降させず、一方、１Ａ１１はＢＡＣＥ１の両方の形態を免疫沈降させることを、免疫沈降実験は示した。これらの結果は、５Ｇ７結合のためのエピトープが膜結合ＢＡＣＥ１上では利用可能でないことを示唆している。これはＢＡＣＥの複雑な構造に起因すると考えられ、例えば、結合部位を含むタンパク質の結合、または膜により引き起こされる立体障害によるものであると考えられうるであろう。これを更に例証するために、５Ｇ７がＢＡＣＥ１エクトドメインの表面上の別のコンホメーションエピトープに結合することが、エピトープマッピングにより示された（Ｋ２９９、Ｅ３０３およびＱ３８６を含むこのエピトープ内の幾つかの残基に対する抗体反応性が突然変異誘発により確認された。）。このエピトープは、他のタンパク質と結合することが可能であるため、細胞表面においては「接近不可能」であると推定される。
【００８７】
ＭＡｂ １Ａ１１の結合性エピトープを決定するために、Ｎ末端融合ＧＳＴタグを有する一連のＢＡＣＥ１欠失突然変異体を作製し、細菌培養から精製した。該ＢＡＣＥ１欠失突然変異体に対するＭＡｂ １Ａ１１の免疫反応性をウエスタンブロットにより試験した。図９に示されているとおり、ＭＡｂ １Ａ１１と反応する最短欠失突然変異体は、完全長免疫原ＢＡＣＥ ４６−４６０［配列番号２］に類似した免疫反応性を有するＢＡＣＥ ３１４−４６０［配列番号９］である。これは、ＭＡｂ １Ａ１１の結合性エピトープが完全にＢＡＣＥ ３１４−４６０［配列番号９］内に位置していることを示している。
【００８８】
さらに、ＭＡｂ １Ａ１１に対する結合性エピトープは直鎖状エピトープではないことが示された。図９に示されているとおり、ＭＡｂ １Ａ１１はＢＡＣＥ３１４−４６０［配列番号９］とは反応するが、ＢＡＣＥ３２９−４６０［配列番号１０］とは反応しない。該エピトープが直鎖状である場合、それは少なくとも部分的にＢＡＣＥ３１４−３２９（１５アミノ酸）［配列番号１４］内に局在化しているはずである。直鎖状エピトープの長さは、通常、１５アミノ酸以内であることを考慮すると、直鎖状である場合のＭＡｂ １Ａ１１の完全エピトープはＢＡＣＥ３１４−３４４［配列番号１５］内に位置するはずである。しかし、ＢＡＣＥ３１４−３４４［配列番号１１５］内のエピトープを含む３つの欠失突然変異体ＢＡＣＥ４６−３４９［配列番号８］、ＢＡＣＥ４６−３６４［配列番号７］およびＢＡＣＥ４６−３９０［配列番号１６］は全て、ＭＡｂ １Ａ１１に対する免疫反応において陰性であった。その矛盾した結果は、ＭＡｂ １Ａ１１のエピトープが直鎖状ではなく、コンホメーションエピトープであることを示唆している。コンホメーションエピトープもウエスタンブロットにより検出されうることが既に報告されており、これは、おそらく、膜への該タンパク質の輸送の途中または後のエピトープの再生によるものであり（Ｚｈｏｕら，２００７）、これは、コンホメーションエピトープを有するＭＡｂ １Ａ１１がウエスタンブロットにおいてＢＡＣＥ１と尚も反応する理由を説明しうるであろう。
【００８９】
ＭＡｂ １Ａ１１結合のコンホメーションエピトープを決定するために、本発明者らはＢＡＣＥ１触媒ドメイン残基３１４−４４６のＣ末端の３Ｄ構造を示した（図１０）。該構造のＮ末端付近に、本発明者らは、互いに接近しておりＢＡＣＥ１上の潜在的コンホメーションエピトープに相当する２つの突出ループＤおよびＦを見出した。ループＤおよびＦはＨｏｎｇら（２０００）に記載されている。これらの露出突出ループは非常に免疫原性であることが公知である。ここでは、本発明者らは、ＭＡｂ １Ａ１１のエピトープがループＤおよびＦに位置するかどうかを試験した。ループＤ上の３つのアミノ酸の突然変異誘発（アミノ酸３３２−３３４のＱＡＧからＡＧＡへ）およびループＦ上の４つのアミノ酸の突然変異誘発（アミノ酸３７６−３７９ ＳＱＤＤ［配列番号１１］からＷＡＡＡ［配列番号１２］へ）をＢＡＣＥ４６−４６０［配列番号２］から別々に行い、ウエスタンブロットにより試験した。図１１に示されているとおり、どちらの突然変異体もＭＡｂ １Ａ１１との免疫反応性を、野生型ＢＡＣＥ４６−４６０［配列番号２］と比較して検出不可能なレベルにまで低下させた。このことは、これらのアミノ酸が抗体結合に寄与することを示唆している。
【００９０】
該エピトープを更に実証するために、哺乳類発現ベクター上で完全長ＢＡＣＥ１（１−５０１）の同一突然変異誘発を行い、ＨＥＫ２９３細胞においてＢＡＣＥ１の突然変異体を発現させた。突然変異体ＢＡＣＥ１または野生型ＢＡＣＥ１を含有する細胞抽出物を、ＭＡｂ １Ａ１１を使用する免疫沈降によりアッセイした。図１２に示されているとおり、哺乳類細胞から作製されたＢＡＣＥ１のどちらの突然変異体も、ＭＡｂ１Ａ１１に対する免疫反応性を、野生型ＢＡＣＥ１と比較して検出不可能なレベルにまで低下させた。また、該突然変異誘発がタンパク質全体のフォールディングにおける変化を引き起こさないことを示すために、ＢＡＣＥ１の２つの突然変異体の細胞活性を試験した。図１３に示されているとおり、どちらの突然変異体も、βおよびβ’部位におけるＡＰＰのプロセシングにおいて尚も活性であり、このことは、これらの突然変異体が適切にフォールディングしていることを示唆している。
【００９１】
最後に、ループＤ上の残基３３２−３３４またはループＦ上の残基３７６−３７９の突然変異誘発は、ＢＡＣＥ１タンパク質のフォールディングを変化させることなく、ウエスタンブロットおよび免疫沈降アッセイの両方において、ＭＡｂ １Ａ１１結合を完全に阻止した。このことは、ＭＡｂ １Ａ１１が、ループＤおよびＦの組合せを含むコンホメーションエピトープに結合することを示している。興味深いことに、ループＦおよびループＤはＢＡＣＥ１上の特有の構造として既に記載されており（Ｈｏｎｇら，２０００）、これらはペプシンファミリーの他のアスパラギン酸プロテアーゼにおいては提示されていない。該構造を共有するペプシンファミリーからの唯一の例外は、ＢＡＣＥ１の最も近いモログであるＢＡＣＥ２である。該ループ構造はＢＡＣＥ１とＢＡＣＥ２とで類似しているが、ループＦおよびループＤ上のアミノ酸配列が異なる。さらに、酵素データは、ｍＡｂ １Ａ１１がＢＡＣＥ２と交差反応しないことを証明した。治療上の観点からは、ＭＡｂ １Ａ１１は、ＢＡＣＥ１の特有の構造に結合するため、ＢＡＣＥ２および他のアスパラギン酸プロテアーゼに比べ非常に選択的である。
【００９２】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうることにより特徴づけられる単離された抗ＢＡＣＥ１抗体。
【請求項２】
ＢＡＣＥ１のエクトドメインに対する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
アクセッション番号ＬＭＢＰ ６８７１ＣＢまたはＬＭＢＰ ６８７２ＣＢまたはＬＭＢＰ ６８７３ＣＢを有するハイブリドーマ細胞系により分泌されることにより更に特徴づけられる、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
ヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体であることにより更に特徴づけられる、請求項１から３のいずれかに記載の抗体。
【請求項５】
ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうることにより特徴づけられる、請求項１から４のいずれかに記載の抗体の活性フラグメント。
【請求項６】
アクセッション番号ＬＭＢＰ ６８７１ＣＢまたはＬＭＢＰ ６８７２ＣＢまたはＬＭＢＰ ６８７３ＣＢを有するハイブリドーマ細胞系。
【請求項７】
医薬として使用するための、請求項１から４のいずれかに記載の抗体または請求項５に記載の活性フラグメント。
【請求項８】
アミロイドベータペプチドおよび／またはアミロイドベータ前駆体タンパク質の生成の予防および／または軽減において使用するための、請求項１から４のいずれかに記載の抗体または請求項５に記載の活性フラグメント。
【請求項９】
アルツハイマー病の予防および／または治療において使用するための、請求項１から４のいずれかに記載の抗体または請求項５に記載の活性フラグメント。
【請求項１０】
請求項１から４のいずれかに記載の抗体または請求項５に記載の活性フラグメントと少なくとも１つの医薬上許容される担体、アジュバントまたは希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項１１】
アルツハイマー病を予防および／または治療するための医薬の製造のための、請求項１から４のいずれかに記載の抗体または請求項５に記載の活性フラグメントまたは請求項１０記載の医薬組成物の使用。
【請求項１２】
（ｉ）非ヒト動物をＢＡＣＥ１で免疫化し、
（ｉｉ）ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうる抗体に関して複数のハイブリドーマ系をスクリーニングすることを含む、ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうる抗体の製造方法。
【請求項１３】
該抗体を産生するハイブリドーマ系を単離する工程を更に含む、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
工程（ｉ）において、ＢＡＣＥ１のエクトドメインを使用して該免疫化を行う、請求項１２または１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
該スクリーニングが、細胞に基づくスクリーニングアッセイおよび／または無細胞スクリーニングアッセイにおいてＢＡＣＥ１の抑制活性を測定することによる機能性スクリーニングである、請求項１２から１４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１】
ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうることにより特徴づけられる単離された抗ＢＡＣＥ１抗体。
【請求項２】
ＢＡＣＥ１のエクトドメインに対する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
アクセッション番号ＬＭＢＰ ６８７１ＣＢまたはＬＭＢＰ ６８７２ＣＢまたはＬＭＢＰ ６８７３ＣＢを有するハイブリドーマ細胞系により分泌されることにより更に特徴づけられる、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
ヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体であることにより更に特徴づけられる、請求項１から３のいずれかに記載の抗体。
【請求項５】
ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうることにより特徴づけられる、請求項１から４のいずれかに記載の抗体の活性フラグメント。
【請求項６】
アクセッション番号ＬＭＢＰ ６８７１ＣＢまたはＬＭＢＰ ６８７２ＣＢまたはＬＭＢＰ ６８７３ＣＢを有するハイブリドーマ細胞系。
【請求項７】
医薬として使用するための、請求項１から４のいずれかに記載の抗体または請求項５に記載の活性フラグメント。
【請求項８】
アミロイドベータペプチドおよび／またはアミロイドベータ前駆体タンパク質の生成の予防および／または軽減において使用するための、請求項１から４のいずれかに記載の抗体または請求項５に記載の活性フラグメント。
【請求項９】
アルツハイマー病の予防および／または治療において使用するための、請求項１から４のいずれかに記載の抗体または請求項５に記載の活性フラグメント。
【請求項１０】
請求項１から４のいずれかに記載の抗体または請求項５に記載の活性フラグメントと少なくとも１つの医薬上許容される担体、アジュバントまたは希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項１１】
アルツハイマー病を予防および／または治療するための医薬の製造のための、請求項１から４のいずれかに記載の抗体または請求項５に記載の活性フラグメントまたは請求項１０記載の医薬組成物の使用。
【請求項１２】
（ｉ）非ヒト動物をＢＡＣＥ１で免疫化し、
（ｉｉ）ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうる抗体に関して複数のハイブリドーマ系をスクリーニングすることを含む、ＢＡＣＥ１の活性を抑制しうる抗体の製造方法。
【請求項１３】
該抗体を産生するハイブリドーマ系を単離する工程を更に含む、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
工程（ｉ）において、ＢＡＣＥ１のエクトドメインを使用して該免疫化を行う、請求項１２または１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
該スクリーニングが、細胞に基づくスクリーニングアッセイおよび／または無細胞スクリーニングアッセイにおいてＢＡＣＥ１の抑制活性を測定することによる機能性スクリーニングである、請求項１２から１４のいずれかに記載の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１２−５３０１０５（Ｐ２０１２−５３０１０５Ａ）
【公表日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１５４６５（Ｐ２０１２−５１５４６５）
【出願日】平成２２年６月１５日（２０１０．６．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５８４０３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４６０５８
【国際公開日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【出願人】（５０９３３３９３３）
【出願人】（５１１３０４４５３）カソリーケ・ユニベルシタイト・ルーベン・カー・ユー・ルーベン・エル・エン・デー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月１５日（２０１０．６．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５８４０３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４６０５８
【国際公開日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【出願人】（５０９３３３９３３）
【出願人】（５１１３０４４５３）カソリーケ・ユニベルシタイト・ルーベン・カー・ユー・ルーベン・エル・エン・デー (1)
【Ｆターム（参考）】
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