Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチド
ＨＬＡ結合モチーフを配列中に含み，かつ，Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）患者で検出される抗体により認識されることを特徴とするＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドが開示される。本発明のペプチドはＣ型肝炎ウイルスの診断およびＣ型肝炎の治療，ならびに予後の予測に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
この発明は，Ｃ型肝炎ウイルス感染の診断およびＣ型肝炎の治療に有用な，Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ペプチドに関するものである。
さらに詳細には，この発明は，ＨＣＶペプチド，ＨＣＶペプチドを含むポリペプチド，ＨＣＶペプチドもしくは前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド，またはそれらを認識する抗体もしくは抗体類似活性物質，前記ヌクレオチドを含有するベクター，ＨＣＶペプチドもしくは前記ポリペプチドを用いて細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する誘導方法，あるいはＨＣＶペプチド，前記ポリペプチド，前記ヌクレオチドもしくは前記抗体・抗体類似活性物質を使用したＣ型肝炎ウイルスの検出方法，Ｃ型肝炎の診断，予防もしくは治療方法，および予後の予測方法，ならびにそれらを含むＣ型肝炎治療用医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
ウイルス性肝炎には，主としてウイルスが経口感染するＡ型肝炎と血液を介して感染するＢ型肝炎の他に，主に輸血などで感染するＣ型肝炎などがある。そのＣ型肝炎は，慢性化して肝硬変や肝癌に移行する割合が非常に高い疾患の１つである。
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は，フラビウイルス科に属する１本鎖ＲＮＡウイルスであり，日本に２００万人以上，世界中では１億７０００万人もＣ型肝炎ウイルス感染者がいると言われている。
このＣ型肝炎に対しては，インターフェロンとリバビリン併用療法が行われているが，３〜４割の患者に対してのみ有効であり，大半の患者に対しては現在有効な治療法がないのが実状である。したがって，安全で有効かつ簡単な上に，低コストの診断ならびに治療ツールを緊急に開発することへの強い社会的要請がある。
細胞性ならびに液性免疫応答の両者はＨＣＶ感染を抑制するのに主要な役割を果たしていることを示す証拠がある（ＷＯ８９／０４６６９）。過去１０余年にわたって高い免疫原性のＨＣＶペプチドを見い出す研究が数多くなされ，細胞性または液性免疫応答を誘導することができる数多くのＨＣＶペプチドが見出されてきた（Ｈｕｎｚｉｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１ Ｄｅｃ；３８（６）：４７５−８４）。しかしながら，これらのペプチドのいずれも臨床的に有効ではなく，その結果，現在でも予防的にも治療的にも有効な免疫治療の手段がないのが実状である。このことは，主にこれらのペプチドの免疫原性が弱いことに基づいていると考えられる。
また，本発明者らは，いくつかの細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）により認識される抗原ペプチドが，インビトロでもインビボでも細胞性免疫応答および液性免疫応答の両方を導き出す能力を有していることをすでに報告している（Ｇｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００２ Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；２５（５）：４３９−４４，Ｍｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１ Ｄｅｃ；７（１２）：３９５０−６２，Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００３ Ｊｕｌ−Ａｕｇ；２６（４）：３５７−６６，Ｍｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．２００３ Ｊｕｎ；９４（６）：５４８−５６）。
さらに，細胞性ならびに液性免疫応答の両者によって認識されるＨＣＶペプチドは，細胞性免疫応答だけによって認識されるものよりも免疫原性が高いと考えられる。
かかる社会的要請に応えるための１つの新しいアプローチとして，細胞性免疫応答ならびに液性免疫応答の両者を誘導することができるＨＣＶペプチドが，液性免疫応答だけを有するペプチドに比べて，より一層高い免疫原性を有しているとの一連の知見が蓄積されてきているので，かかるペプチドを特定するというアプローチを挙げることができる。
そこで，かかるペプチドを同定するとともに，ＨＣＶ感染を抑制するための新規な治療および診断ツールとしての候補となるかどうかを調べることは，有益であると考えられる。
したがって，本発明者らは，ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識されるペプチドと反応性を有するＩｇＧがＨＣＶ感染患者の血清中から検出できるかどうかを調べた結果，いくつかのＣＴＬエピトープに特異的なＩｇＧが，異なるＨＬＡクラスＩタイプや異なるＨＣＶゲノタイプには関係なく、ＨＣＶ感染患者の大多数に検出されることを見出した。さらに，この結果から，かかるペプチドが，ペプチドをベースとする予防および治療用の新しいツールを提供することができることを見出して，この発明を完成するに到った。
したがって，この発明は，細胞性免疫応答ならびに液性免疫応答によって認識され，かつ免疫原性が高いことを特徴とするＨＣＶペプチドを提供することを目的とする。
【発明の開示】
上記課題を解決するために，この発明は，ＨＬＡ結合モチーフを配列中に含み，かつＣ型肝炎ウイルス感染患者の血中抗体により認識されるＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドを提供する。
この発明は，その好ましい態様として，配列表の配列番号１〜８、１６、２０および３８のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有するＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，該ペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性をもつアミノ酸配列を有するＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，およびＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識性をさらに有するＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドを提供する。
この発明の別の形態は，該Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドを含むポリペプチドを提供する。この形態の発明は，その好ましい態様として，該ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性をもつアミノ酸配列を有するポリペプチド，およびＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識性をさらに有するポリペプチドを提供する。
また，この発明の別の形態は，該Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドまたは該ポリペプチドをコードするヌクレオチドを提供する。
この発明のさらに別の形態は，該Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドまたは該ポリペプチドを免疫学的に認識することができる抗体および抗体類似活性物質を提供する。
この発明は，さらに別の形態として，上記のヌクレオチドを含有するベクターを提供する。
また，この発明のさらに別の形態は，該Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチド，該ポリペプチドをコードする該ヌクレオチドを用いて細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する誘導方法を提供する。
この発明は，さらに別の形態として，上記のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，ポリペプチド，ヌクレオチド，または抗体もしくは抗体類似活性物質を使用する，Ｃ型肝炎ウイルスの検出方法を提供する。
また，この発明の別の形態は，上記のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，ポリペプチド，ヌクレオチド，または抗体もしくは抗体類似活性物質を使用する，Ｃ型肝炎などのＨＣＶ感染関連疾患の診断方法を提供する。
さらに，別の形態として，この発明は，上記Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチド，ポリペプチド，ヌクレオチド，または抗体もしくは抗体類似活性物質を使用する，Ｃ型肝炎などのＨＣＶ感染関連疾患の治療方法を提供する。
この発明は，さらに別の形態として，上記のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，ポリペプチド，ヌクレオチド，または抗体もしくは抗体類似活性物質を有効成分として含む医薬組成物を提供する。また，その好ましい態様として，該医薬組成物がＣ型肝炎ウイルスワクチンである医薬組成物が提供される。
さらに，別の形態として，この発明は，上記Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチド，ポリペプチド，ヌクレオチド，または抗体もしくは抗体類似活性物質を使用する，Ｃ型肝炎などのＨＣＶ感染関連疾患の予後の予測方法を提供する。
この発明は，さらに別の形態として，上記のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，ポリペプチド，ヌクレオチド，または抗体もしくは抗体類似活性物質を含む，Ｃ型肝炎を診断または予後を予測するためのキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
図１は，本発明において，ＥＬＩＳＡ法によるＨＣＶ感染患者の血中ＩｇＧ測定結果を示すグラフである。
図２は，本発明において，ＥＬＩＳＡ法によるＨＣＶ感染患者の血中ＩｇＧ測定結果を示すグラフである。
図３は，本発明において，図１に示した患者血清中のＣ−３５ペプチド反応性抗体の代表例の吸収・溶出実験結果を示すグラフである。
図４は，本発明におけるＨＣＶ由来のＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチド６種（Ｎｏ３，１２，１３，２５，３２，３８）のＣＴＬ誘導結果を示すグラフである。
図５は，本発明におけるＨＣＶ由来のＨＬＡ−Ａ２結合性ペプチド（Ｎｏ４０からＮｏ５７）のＣＴＬ誘導結果を示すグラフである。
図６は，本発明において，５１Ｃｒ遊離試験によるペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害活性の代表的結果を示すグラフである。
図７は，本発明において，５１Ｃｒ遊離試験によるペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害活性の代表的結果を示すグラフである。
図８は，本発明において，抗ＣＤ８モノクローナル抗体を用いた抑制試験によるペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害性のＨＬＡクラスＩ拘束性を確認したグラフである。
図９は，ＨＣＶ感染患者血清における抗ペプチドＩｇＧの検出を示すグラフである。
図１０は，ＨＣＶ感染患者血清における抗ペプチドＩｇＧの検出を示すグラフである。
図１１は，ＨＣＶ感染患者血清中の抗ペプチドＩｇＧの特異性を調べる吸着試験の結果を示すグラフである。
図１２は，ＨＣＶ感染患者血清中の抗ペプチドＩｇＧの特異性を調べる溶出試験の結果を示すグラフである。
図１３は，ペプチド刺激ＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ産生を示すグラフである。
図１４は，ペプチド刺激ＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ産生を示すグラフである。
図１５は，ペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害性を示すグラフである。
図１６は，ペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害性を示すグラフである。
図１７は，ＮＳ５Ａを発現する細胞に対するペプチド刺激ＰＢＭＣのＣＴＬ活性を示すグラフである。
図１８は，ＮＳ５Ａを発現する細胞に対するペプチド刺激ＰＢＭＣのＣＴＬ活性を示すグラフである。
図１９は，ＮＳ５Ａを発現する細胞に対するペプチド刺激ＰＢＭＣのＣＴＬ活性を示すグラフである。
図２０は，抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧ活性の特異性を示すグラフである。
図２１は，抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧによる細胞増殖阻害のアッセイの結果を示すグラフである。
図２２は，抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧのＡＤＣＣ活性のアッセイの結果を示すグラフである。
図２３は，種々の疾患における抗Ｃ−３５抗体および抗ＮＳ５Ａ−２１３２抗体の検出を示すグラフである。
図２４は，抗ペプチド抗体のＨＬＡまたはＨＣＶゲノタイプ拘束性を示すグラフである。
図２５は，抗ペプチド抗体のＨＬＡまたはＨＣＶゲノタイプ拘束性を示すグラフである。
図２６は，患者血清における抗ＮＳ５Ａ−２１３２抗体の測定の結果を示すグラフである。
図２７は，患者血清における抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧの測定の結果を示すグラフである。
図２８は，患者血清における抗ＮＳ５Ａ抗体のレベルおよびＨＣＶ ＲＮＡレベルを示すグラフである。
図２９は，コホート研究における抗Ｃ−３５抗体および抗ＮＳ５Ａ−２１３２抗体の検出を示すグラフである。
図３０は，コホート研究における抗ＮＳ５Ａ−２１３２抗体の検出を示すグラフである。
図３１は，本発明において，ルミネックス法によるＨＣＶ感染患者の血中ＩｇＧ測定結果を示すグラフである。
図３２は，本発明において，ルミネックス法によるＨＣＶ感染患者の血中ＩｇＧ測定結果を示すグラフである。
図３３は，本発明のペプチドを用いるＣ型肝炎の治療の経過を示す。
図３４は，本発明のペプチドを用いるＣ型肝炎の治療の経過を示す。
発明の詳細な説明
この発明に係るＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドは，ＨＬＡ結合モチーフを配列中に含み，かつＣ型肝炎ウイルス感染患者の血中抗体により認識されるＨＣＶペプチドである。
また，この発明に係るＨＣＶペプチドは，ＨＬＡ結合モチーフ，つまりＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフをその配列中に含んでいる。さらに，このＨＣＶペプチドは，細胞性免疫応答および液性免疫応答によって認識されるとともに，免疫原性が高いことを特徴としている。
かかるＨＣＶペプチドとしては，例えば，下記の表１および表３に挙げられるペプチドが含まれる。本発明において特に好ましいＨＣＶペプチドの１つは，以下のアミノ酸配列を有するＨＬＡ−Ａ２結合性モチーフを有するペプチド：
である。ＨＣＶ感染患者においては，このペプチドに対するペプチド反応性ＩｇＧ抗体の検出率およびＨＣＶ感染症特異性が，それぞれ９３％と１００％と非常に高い。また本発明において特に好ましい別のＨＣＶペプチドは，以下のアミノ酸配列を有するＨＬＡ−Ａ２４結合性モチーフを有するペプチド：
である。特に，ＮＳ５Ａ−２１３２は，ＨＬＡ−Ａ２４陽性の多くの患者において，細胞性免疫および液性免疫の両方を誘導することができる。
この発明に係るＨＣＶペプチドは，該ペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％，好ましくは８０％以上，さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するペプチドであってもよい。
また，この発明に係るＨＣＶペプチドは，ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による認識性を有するペプチドをさらに含んでいてもよい。細胞内で製造された抗原タンパクが細胞内で分解されたペプチドからなる，このＨＬＡに結合可能な抗原ペプチドには，ＨＬＡのタイプごとにその配列にモチーフがあり，細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）はこの抗原ペプチドとＨＬＡとの複合体を認識してＨＣＶ感染細胞を傷害する。
この発明に係るポリペプチドは，上記のようなこの発明のペプチドのアミノ酸配列をそのアミノ酸配列中に含有しており，そのアミノ酸の総数は特に限定されるものではない。また，この発明のポリペプチドにおいて，このペプチドを構成するアミノ酸を超える残りのアミノ酸は，該ペプチドのアミノ酸のＮ−末端側および／またはＣ−末端側に，あるいはそれらの両側に位置している。したがって，このポリペプチドは，上記ペプチドの機能ならびに作用と実質的に同様の機能と作用を有している。なお，本明細書において，「ペプチド」と単に記載した場合でも，特に断りのない場合には，「ポリペプチド」をも包含して理解すべきものとする。
上記のようにして決定されたアミノ酸配列を有するペプチドは，通常の化学的合成法，タンパク分子の酵素的分解法，目的のアミノ酸配列をコードする塩基配列を発現するように形質転換した宿主を用いた遺伝子組換え技術などにより得ることができる。
目的とする該ペプチドを化学的合成法で製造する場合には，通常のペプチド化学においてそれ自体公知の慣用されている手法によって製造することができ，例えば，ペプチド合成機を使用して，固相合成法により合成することができる。このようにして得られた粗ペプチドは，タンパク質化学において通常使用されている精製方法，例えば，塩析法，限外ろ過法，逆相クロマトグラフィー法，イオン交換クロマトグラフィー法，アフィニティークロマトグラフィー法などによって精製することができる。
一方，所望の該ペプチドを遺伝子組換え技術で生産する場合には，例えば，上記により合成した目的のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を適当な発現ベクターに組込み，この発現ベクターを用いて微生物や動物細胞を形質転換して，得られた形質転換体を培養することによって，所望の該ペプチドを得ることができる。使用できる発現ベクターとしては，当該技術分野において公知であるプラスミド，ウイルスベクターなどを用いることができる。
このペプチド生産技術における発現ベクターを用いた宿主細胞の形質転換方法としては，それ自体公知の方法，例えば，塩化カルシウム法，リン酸カルシウム共沈殿法，ＤＥＡＥデキストラン法，リポフェクチン法，エレクトロポレーション法などが使用でき，使用する宿主細胞に基づいて適宜選択するのがよい。得られたペプチドの精製は，培養した培地から回収した細胞抽出液もしくは培養上清から上記精製法により行うことができる。
この発明の別の形態の１つとしてのヌクレオチドは，上記のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドまたは上記のポリペプチドを含有するオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドを含んでいて，リボヌクレオチドあるいはデオキシヌクレオチドを含んでいる。また，該ヌクレオチドは，当該分野で既知の方法によって改変されていてもよい。該ヌクレオチドの改変には，例えば，公知の標識，メチル化，「ｃａｐｓ」，アナログによる天然ヌクレオチド１つ以上の置換，ヌクレオチド内改変などが含まれる。ヌクレオチド内改変には，例えば，非イオン性改変（例えば，メチルリン酸，リン酸トリエステル，ホスホアミデートなど），イオン性改変（例えば，ホスホロチオエート，ホスホロジチオエートなど），例えばタンパク質（例えば，ヌクレアーゼ，毒素，抗体，シグナルペプチドなど）のようなペンダント部分を含む改変，キレート剤（例えば，金属，ホウ素など）による改変などが挙げられる。
上記のヌクレオチド配列は，ＨＣＶのゲノム中にコードされているＨＣＶ抗原のペプチドおよびポリペプチド配列を提供することを可能にし，また診断試験やワクチンの成分として，有用なペプチドを提供することができる。
この発明のヌクレオチドが得られると，ＨＣＶ感染関連疾患を診断するのに有用な，または血液中もしくは血液製剤中のＨＣＶ感染をスクリーニングするのに有用なヌクレオチドプローブならびにペプチドの構築が可能となる。このヌクレオチド配列から，例えば２４個ないし３０個のヌクレオチドあるいはそれより長いＤＮＡオリゴマーを合成することが可能である。このヌクレオチドは，被験者の血清中のＨＣＶ ＲＮＡを検出するための，また血液もしくは血液製剤中のＨＣＶの存在をスクリーニングするためのプローブとしても使用することができる。
また，このヌクレオチド配列は，ＨＣＶに対する抗体の存在を診断する試薬としても有用なＨＣＶ特異的ペプチドの設計ならびに生産を可能にする。さらに，この配列に由来する精製ペプチドに対する抗体は，ＨＣＶ感染者ならびにＨＣＶ感染血液製剤中のＨＣＶ抗原を検出するためにも使用することができる。
この発明の別の形態の１つとしての抗体は，該Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチド，該ポリペプチドに反応性を有するキメラ抗体，改変抗体，一価抗体，Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）２，Ｆａｂ’，単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）タンパク質ならびに単一ドメイン抗体が含まれる。また，この抗体は，該ペプチドまたは該ポリペプチドを免疫学的に認識することができる。
この発明の別の形態の１つとしてのベクターは，該ヌクレオチドを含有していて，選択された宿主細胞を形質転換し得る構築物であって，該宿主中で異種のコード配列を発現させることができる。この発現ベクターは，クローニングベクターあるいは組み込み用ベクターの何れであってもよい。
クローニングベクターとしては，例えば，プラスミド，ウイルス（例えば，アデノウイルスベクター）などが使用される。また該クローニングベクターは，宿主細胞を形質転換することができ，かつ，細胞内でヌクレオチドの複製を行う能力を有しているレプリコン（例えば，プラスミド，クロモソーム，ウイルス，コスミドなど）である。
他方，組み込み用ベクターは，宿主細胞中ではレプリコンとしては働かないが，宿主を安定に形質転換するために，宿主中のレプリコン（典型的には，クロモソーム）に駐留物を組み込む能力を有するベクターである。
この発明の別の形態の１つとして，該ペプチドを用いることによってＨＣＶ細胞を標的にする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する誘導方法が含まれる。この発明の誘導方法は，例えば，ＨＬＡ−Ａ２を発現している細胞に該ペプチドを添加してＨＬＡ−Ａ２上に提示させ，このペプチドをＨＬＡ−Ａ２により提示した細胞でＴ細胞を刺激し，このＴ細胞をＣＴＬに誘導することからなっているのがよい。この方法において使用するＨＬＡ−Ａ２発現細胞は，ＨＣＶ患者の血液から採取したものでよいが，非ＨＬＡ−Ａ２発現細胞にＨＬＡ−Ａ２をコードする遺伝子を導入して作成することもできる。したがって，この発明に係る該ペプチドは，ＨＣＶの検出ならびに診断のために使用することができるばかりではなく，Ｃ型肝炎ウイルス関連疾患のワクチンなどの医薬組成物として有用である。
また，このようにして誘導されたＣＴＬは，ＨＣＶ感染細胞を標的にして該ＨＣＶ感染細胞を攻撃するので，該ペプチドと同様に，細胞療法などの医薬組成物としても使用することができる。
さらに，この発明の別の形態である該Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチド，ポリペプチド，ヌクレオチドおよび／または抗体・抗体類似活性物質は，ＨＣＶ感染を検出・診断するのに有用である。
ＨＣＶの検出ならびにＨＣＶ関連疾患の診断は，例えば，該ペプチドをコードする核酸配列との相互作用および／または反応性を利用して，該ペプチドの存在の検出，相応する核酸配列存在量の検出，該ペプチドの個体中での生体分布の決定および／または個体由来の検体中の存在量の決定などによって行うことができる。つまり，ＨＣＶの検出ならびにＨＣＶ関連疾患の診断は，該ペプチドをマーカーとして検定することによって行うことができる。また，その測定は，それ自体公知の測定手法で行うことができ，かかる測定方法としては，例えば，抗原抗体反応系，酵素反応系，ＰＣＲ反応系などを利用した方法が挙げられる。
ＨＣＶ関連疾患の治療効果の確認および予後の予測は，ＨＣＶ関連疾患に罹患している被験者において，該ペプチドに対する反応性を有する抗体の血中濃度をモニターすることによって行うことができる。特に好ましくは，被験者の血中の抗Ｃ−３５ＩｇＧまたは抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧのレベルを測定する。
この発明のさらに別の形態である医薬組成物としては，例えば，ワクチンが挙げられる。ワクチンは，Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチド，ポリペプチドおよび／またはヌクレオチドからなっていて，医薬的に許容される補助剤および／または担体を適宜含有していてもよい。補助剤としては，免疫応答を強化し得るアジュバント，例えばフロイントの不完全アジュバント，水酸化アルミニウムゲルなどを使用することができる。また，担体としては，例えば，ＰＢＳ，蒸留水などの希釈剤，生理食塩水などを使用することができる。
この発明の医薬組成物は，その使用形態に応じて，例えば，経口，静脈投与や皮下投与などの非経口または経皮経路で投与することができる。その剤形としては，例えば，錠剤，顆粒剤，ソフトカプセル剤，ハードカプセル剤，液剤，油剤，乳化剤などが挙げられる。かかる医薬組成物の投与量は，投与する患者の症状などにより，適宜変動し得るが，一般的には，成人に対して１日当たり，該ペプチド量として０．１〜１０ｍｇであるのがよく，投与間隔としては数日もしくは数ヶ月に１回投与するのがよい。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００３−３３０２５８号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
【実施例】
この発明を実施例によりさらに詳細に説明する。ただし，これらの実施例はこの発明をより具体的に説明するために例示的に示したものであり，この発明は以下の実施例により限定されるものではない。
なお，以下の実施例において使用したアミノ酸の略語は次の通りである。
Ａはアラニン，Ｃはシステイン，Ｄはアスパラギン酸，Ｅはグルタミン酸，Ｆはフェニルアラニン，Ｇはグリシン，Ｈはヒスチジン，Ｉはイソロイシン，Ｋはリジン，Ｌはロイシン，Ｍはメチオニン，Ｐはプロリン，Ｒはアルギニン，Ｓはセリン，Ｔはトレオニン，Ｖはバリン，Ｙはチロシンをそれぞれ意味する。
［実施例１］：ＨＣＶ感染患者の血清におけるＨＣＶペプチドと反応性を有するＩｇＧの検出
ペプチド
ＨＣＶゲノタイプ１ｂタンパク質の保存領域からのＨＬＡ−Ａ２結合性モチーフまたはＨＬＡ−Ａ２４結合性モチーフを有する合成ペプチドを使用した（表１）。ネガティブコントロールとして，ＨＬＡ−Ａ２結合性モチーフを有するＨＩＶ由来ペプチドを使用した。これらのペプチドはいずれも市販品を使用し，その純度は逆相高圧液体クロマトグラフィーで分析したところ９０％以上であった。
ＥＬＩＳＡ
血清中のペプチド特異的ＩｇＧはＥＬＩＳＡによって測定した。まず，各ペプチドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し，−８０℃で保存した。ペプチドを，クロスリンカーとしてのジサクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）を含む０．１Ｍ炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム溶液で希釈した。ＥＬＩＳＡプレートにペプチド２０μｇ／ウェルで４℃で一夜反応させて結合させた。ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し，プレートをブロックエース（登録商標）でブロックして４℃で一夜放置した。血漿または血清サンプルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅで１００倍，２００倍および４００倍にそれぞれ希釈し，得られたサンプルを各ウェル当り１００μｌずつ添加した。サンプルを３７℃で２時間培養した後，プレートをＰＢＳＴで９回洗浄し，１０００倍希釈ウサギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）を各ウェル当り１００μｌ添加して３７℃で２時間培養した。さらに，ＰＢＳＴで９回洗浄した後，１００倍希釈マウス抗ウサギＩｇＧと共有結合させた西洋ワサビパーオキシダーゼ・デキストランポリマーを各ウェル当り１００μｌ添加し，プレートを室温で４０分間培養した。プレートを洗浄した後，テトラメチルベンジジン基質溶液を各ウェル当り１００μｌ添加し，２．０Ｍリン酸を添加して反応を停止させた。カットオフ値を，健常者の光密度コントロールの平均±３ＳＤとして算出した。
ペプチド特異的ＩｇＧの吸収ならびに溶出
各ウェル当り１００μｌの血漿または血清サンプルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（登録商標）で希釈し，プレートのウェル中に固定したペプチド（各ウェル当り２０μｇ）に３７℃で２時間吸収させた。この操作を３回繰り返した後，上清中のペプチド特異的ＩｇＧレベルをＥＬＩＳＡで測定した。初回の吸着でペプチド固定プレートに結合させた抗体を，各ウェル当り３０μｌの５Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭクエン酸バッファ（ｐＨ３．０）（１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（ｐＨ７．５）で中和した）によって溶出し，溶出した分画中のペプチド特異的ＩｇＧレベルをＥＬＩＳＡで測定した。
ペプチド特異的ＣＴＬアッセイ
ペプチド特異的ＣＴＬの検出に使用する方法は当該技術分野において慣用されている方法である。ＰＢＭＣをウェル当たり１ｘ１０５個の細胞になるようにＵ底型９６ウェルマイクロカルチャープレートの各ウェルに入れ，１０μＭのペプチドとともに２００μｌの培地中で培養した。この培地の組成は，４５％ＲＰＭＩ−１６４０と，４５％ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）と，１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）と，１００Ｕ／ｍｌのインターロイキン２（ＩＬ−２）と，１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液と，からなっている。培養３日目，６日日，そして９日目にそれぞれ培地半分を除いて，対応するペプチド（２０μｇ／ｍｌ）を含んだ新しい培地と入れ替えた。培養１２日日に，培養した細胞を採取し，対応するペプチドまたはネガティブコントロールとしてのＨＩＶペプチドのいずれかを予め付着させたＣＩＲ−Ａ２４０２細胞またはＴ２に応答するインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の産生能を試験した。各ペプチドに対して４個のウェルを使用し，アッセイは２回行った。ＨＩＶペプチドに応答するバックグラウンドＩＦＮ−γ産生は得られたデータ値から差し引いた。抑制アッセイには，ペプチド反応性ＣＴＬは，ＣＤ８単離キットを用いて精製し，そのペプチド特異的ＩＦＮ−γ産生を，２０μｇ／ｍｌの抗ＨＬＡクラスＩ（Ｗ６／３２，ＩｇＧ２ａ）モノクローナル抗体，抗ＣＤ８（Ｎｕ−Ｔｓ／ｃ，ＩｇＧ２ａ）モノクローナル抗体または抗ＨＬＡクラスＩＩ（Ｈ−ＤＲ−１，ＩｇＧ２ａ）モノクローナル抗体のいずれかの存在下において測定した。バックグラウンドＩＦＮ−γ産生は得られたデータ値から控除した。
統計
値は平均＋／−ＳＤとして示している。統計的分析は，マン・ウィットニー Ｕ検定（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ）試験およびカイ２乗試験を用いて行った。Ｐ＜０．０５値は統計学的に有意であると考えられる。
ＨＣＶペプチドに対する抗体の検出
ＨＣＶ感染患者１２名と健常者（ＨＤ）１０名の血清について６２種類の各ペプチドに対して反応するＩｇＧレベルを測定した（表１）。各ペプチドに対する抗体の陽性率を表１に示した。その結果，ＨＣＶ感染患者の血中ＩｇＧと高率に反応し，かつ健常人血清とはほとんど反応しないペプチドが複数見い出された。
例えば，Ｎｏ３のＮＳ５Ａ−２１３２（ＨＣＶのＮＳ５Ａタンパクの２１３２番から２１４０番に相当，以下同様に省略する），Ｎｏ１１（ＮＳ３−１２６６），Ｎｏ１２（Ｅ２−４８８），Ｎｏ１３（Ｅ１−２１３），Ｎｏ２２（ＮＳ２−９４７），Ｎｏ２５（ＮＳ３−１０８１），Ｎｏ３２（Ｃ−１７６），Ｎｏ３８（Ｃ−１７３），Ｎｏ４０（Ｃ−３５），Ｎｏ６２（ＮＳ５Ｂ−２９９０）などが挙げられる。代表的なＥＬＩＳＡ法によるＨＣＶ感染患者の血中ＩｇＧ測定結果を図１および図２に示す。
図１に示した患者血清ではＣ−３５に対するＩｇＧ抗体が検出された。
図２の（Ａ）−（Ｄ）に示した４名の患者血清中にはそれぞれＮＳ５Ａ−２１３２（Ａ），ＮＳ３−１０８１（Ｂ），Ｅ２−４８８およびＥ１−２１３（Ｃ），Ｃ−１７６およびＣ−１７３（Ｄ）反応性ＩｇＧ抗体が検出された。これらのペプチド反応性抗体のペプチド特異性は，吸収ならびに溶出試験によって確認した。
図１に示した患者血清中のＣ−３５ペプチド反応性抗体の吸収・溶出実験結果を代表例として図３に示す。この抗体はＣ−３５により吸収されたが，無関係なペプチドであるＮＳ５Ａ−２２５２によっては吸収されなかった（図３上段）。さらにこの抗体はＣ−３５吸着画分より溶出された（図３下段）。
表１の中でもＣ−３５ペプチド反応性抗体はＨＣＶ感染者では１００％，一方，健常人では０％と，ＨＣＶ特異性が高かった。ＨＣＶのＣ−３５ペプチドの配列は種々のウイルス，たとえばＨＩＶ−１のｔｅｔタンパク（５４−５８番のアミノ酸配列）やｅｎｖタンパク（５−９，１５８−１６２，７１７−７２７のアミノ酸配列）と部分的に相同性を示した。また，ＨＴＬＶ−Ｉの種々のタンパク（ｐｏｌ ７２４−７５５，ｒｅｘ ５−９，ｒｅｘ ３１０−３１３，ｔａｘ ７０−７４など）とも相同性を示した。そこで，Ｃ−３５ペプチド反応性抗体をＨＣＶ感染症関連疾患６０例（慢性Ｃ型肝炎２２例，肝硬変２０例，肝癌１８例），Ｂ型肝炎ウイルス感染者２４例，Ｂ型肝炎ウイルスワクチン接種者１０例，健常人２７例，自己免疫疾患患者２２例，ＨＴＬＶ−Ｉ感染者１０例，およびＨＩＶ感染者３例，計１５６例について２重盲検法で調べた。その結果を表２に示す。この結果より，Ｃ−３５ペプチド反応性抗体のＨＣＶ特異性および検出率はそれぞれ８８．５％および９３．３％であった。
ペプチド特異的ＣＴＬ活性の誘発
ＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチド６種（Ｎｏ３，１２，１３，２５，３２，３８）およびＨＬＡ−Ａ２結合ペプチド１８種（Ｎｏ４０からＮｏ５７まで）をＨＬＡ−Ａ２４もしくはＨＬＡ−Ａ２陽性のＨＣＶ感染患者各５名の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）と培養した。コントロールとして該ＰＢＭＣをＨＩＶペプチドと培養した。そして，それらの培養ＰＢＭＣについて，対応するペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞またはＴ２細胞に応答するＩＦＮ−γ産生能を調べた。その結果，ＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチド６種（Ｎｏ３，１２，１３，２５，３２，３８）は，ＨＬＡ−Ａ２４陽性ＨＣＶ患者１０名のＰＢＭＣからＣＴＬを誘導することができた（図４）。また，ＨＬＡ−Ａ２４結合性ペプチドによる（Ｂ）ＨＣＶ由来のＨＬＡ−Ａ２結合性ペプチド（Ｎｏ４０からＮｏ５７）によるＨＬＡ−Ａ２陽性ＨＣＶ患者５名のＰＢＭＣからＣＴＬを誘導することができた（図５）。
さらに，ペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害活性は５１Ｃｒ遊離試験によって確認した。その代表的結果を図６、および図７に示す。
図６は，ＨＣＶ由来のＨＬＡ−Ａ２４結合性ペプチド（Ｎｏ３，１２，１３，２５，３２，３８）によりＨＬＡ−Ａ２４陽性ＨＣＶ患者ＰＢＭＣから誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す。誘導ペプチドを付着させたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞（図中ではＣ１ＲＡ２４０２と表示）に対する細胞傷害作用はコントロールのＨＩＶペプチドを付着させたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞（図中ではＣ１ＲＡ２４０２ＨＩＶと表示）に比べ有意に高かった。
図７は，ＨＣＶ由来のＨＬＡ−Ａ２結合性ペプチド（Ｎｏ４０，４１）によりＨＬＡ−Ａ２陽性ＨＣＶ患者末梢血ＰＢＭＣから誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す。誘導ペプチドを付着させたＴ２細胞（図中ではＴ２と表示）に対する細胞傷害作用はコントロールのＨＩＶペプチドを付着させたＴ２細胞（図中ではＴ２ＨＩＶと表示）に比べ有意に高かった。
その結果，これらのＰＢＭＣは，対応するペプチド（ネガティブコントロールとしてのＨＩＶペプチド以外）を予め装填したＣ１Ｒ−Ａ２４０２およびＴ２細胞に対して有意差レベルの細胞傷害性を示した。
この細胞傷害性のＨＬＡクラスＩ拘束性は抗ＣＤ８モノクローナル抗体を用いた抑制試験によって確認した（図８）。図８は，ＣＴＬ活性の抗ＣＤ８抗体による抑制の代表例を示す。ＨＣＶ由来のＨＬＡ−Ａ２結合性ペプチド（Ｎｏ４０）によりＨＬＡ−Ａ２陽性ＨＣＶ患者ＰＢＭＣから誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性は抗ＣＤ８抗体により抑制されたが，抗ＣＤ４やコントロールの抗ＣＤ１４抗体では抑制されなかった。
［実施例２］：ＨＬＡ−Ａ２４陽性ＨＣＶ感染患者の血清におけるＨＣＶペプチドと反応性を有するＩｇＧの検出
被験者
さらに広範に，ＨＬＡ−Ａ２４陽性のＨＣＶ感染患者において，ＨＣＶペプチドと反応性を有するＩｇＧの検出を行った。６０名のＨＣＶ１ｂ＋患者は，第２世代または第３世代イムノアッセイ試験により判定して，抗ＨＣＶ抗体（Ａｂ）についてセロポジティブであった。患者の血清中のＨＣＶのゲノタイプはＲＴ−ＰＣＲにより判定した。血清サンプリングの際の患者の診断は，生化学的分析，超音波検査，コンピュータ連動断層撮影，および組織学的所見により行った。診断の結果は以下のとおりである：慢性肝炎（ＣＨ，ｎ＝２４），肝硬変（ＬＣ，ｎ＝１８），および肝細胞癌（ＨＣＣ，ｎ＝１８）。陰性対照としては，正常な肝機能を有し，肝炎ウイルスの病歴を有しない２０名の健康なドナー（ＨＤ）からの血清サンプルを用いた。
ペプチドおよびペプチド反応性抗体の測定
ＨＣＶ１ｂタンパク質のよく保存された領域に由来し，ＨＬＡ−Ａ２４分子との高い結合スコア（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）に基づいて選択された４４種の合成ペプチドを用いた。陰性対照としてはＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフを有するＨＩＶ由来ペプチド（ＲＹＬＲＤＱＱＬＬＧＩ（配列番号６３））を用いた。結合スコアおよび配列を表３に示す。血清ＩｇＧに対するペプチドの反応性についてのスクリーニング用には，ＢｉｏＳｙｎｔｅｈｓｉｓ（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）またはＳｙｎＰｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）からこれらの脱塩等級（＞７０％）ペプチドを購入した。その後の実験には精製したペプチド（＞９０％）を用いた。ペプチド特異的ＩｇＧの血漿レベルは，酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。血漿サンプルにおける抗ペプチドＩｇＧの特異性の試験は，ペプチド反応性ＩｇＧの吸収および溶出により行った。
ペプチド特異的ＣＴＬのアッセイ
ペプチド特異的ＣＴＬ前駆体細胞の検出に用いた方法はＨｉｄａら（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２００２；５１：２１９−２２８）に記載されるとおりである。阻害試験のためには，２０μｇ／ｍｌの抗ＨＬＡクラスＩ（Ｗ６／３２，ＩｇＧ２ａ），抗ＣＤ８（Ｎｕ−Ｔｓ／ｃ，ＩｇＧ２ａ），抗ＣＤ４（Ｎｕ−Ｔｈ／ｉ，ＩｇＧ１ｂ），および抗ＨＬＡ−クラスＩＩ（Ｈ−ＤＲ−１，ＩｇＧ）モノクローナル抗体を用いた。
ＮＳ５Ａ遺伝子でトランスフェクションした細胞に対するペプチド刺激ＰＢＭＣのＣＴＬ活性
ＮＳ５Ａ，ＨＬＡ−Ａ２４０２，およびＨＬＡ−Ａ２６０１のｃＤＮＡは，それぞれＨｕｈ７（ＮＮＵ５０−１）細胞，Ｃ１Ｒ−Ａ２４０２細胞，およびＫＥ４−ＣＴＬ細胞からＲＴ−ＰＣＲにより得て，発現ベクターｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にクローニングした。Ｈｕｈ７（ＮＮＵ５０−１）細胞株は，ＨＣＶ１ｂに感染した細胞株に由来するレプリコン細胞であり，ＮＳ３からＮＳ５Ｂのタンパク質を発現する（Ｋｉｓｈｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２００２；２９３：９９３−９９９）。次に，１００ｎｇのＮＳ５Ａ，ＨＬＡ−Ａ２４０２またはＮＳ５Ａ，およびＨＬＡ−Ａ２６０１ｃＤＮＡ（陰性対照として）を，０．６μｌのＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含む１００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で混合し，３０分間インキュベートした。次に混合物１００μｌをＣＯＳ−７細胞（１×１０４細胞）に加え，これを６時間インキュベートした。２０％ＦＣＳを含む１００μｌのＲＰＭＩ−１６４０培地を混合物に加え，ＣＯＳ−７細胞を２日間培養し，ＮＳ５Ａ ２１３２−２１４０刺激ＰＢＭＣ（２ｘ１０５細胞／ウェル）を加えた。１８時間インキュベートした後，１００μｌの上清を取り出し，ＩＦＮ−γ濃度を３ウェルのアッセイでＥＬＩＳＡにより測定した。安定なトランスフェクタント細胞株を作製するために，ｐＣＲ３．１−ＮＳ５ＡまたはｐＣＲ３．１−ＨＬＡ−Ａ３１０１（陰性対照）のいずれかを，Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲＡＤ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を用いて，Ｃ１Ｒ−Ａ２４０２細胞にエレクトロポレーションによりトランスフェクションした。これらの細胞をゲネテシン（Ｇ４１８）の存在下で３０−４０日間培養し，ゲネテシン耐性細胞を回収した。トランスフェクタント中のＮＳ５Ａタンパク質の発現は，抗ＮＳ５ポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いるウエスタンブロット分析により行った。
増殖阻害および抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
Ｈｕｈ７細胞株を，平底９６ウェルマイクロカルチャープレートのウェル中で種々の血清の存在下で２４，４８，および７２時間インキュベートした。インキュベート後，細胞計数キット−８（１０μｌ／ウェル）（Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｊａｐａｎ）でＨｕｈ７細胞を数えた。ＡＤＣＣアッセイのためには，ＨＬＡ−Ａ２４陽性のＨＤから新たに単離したＰＢＭＣを，種々の患者またはＨＤ（陰性対照として）からの非働化血清（５６℃，３０分間）を含む１０％ＦＣＳおよびＲＰＭＩ−１６４０培地で１．５時間プレインキュベートした。Ｃ１Ｒ−Ａ２４０２細胞およびＣ１Ｒ細胞（陰性対照として）をＮＳ５Ａ ２１３２−２１４０ペプチド（１０μＭ）とともに２時間インキュベートし，Ｎａ２５１ＣｒＯ４で１．５時間放射性標識し，洗浄し，標的細胞として用いた。ペプチド刺激ＰＢＭＣを，９６Ｕ底マイクロカルチャープレートのウェル中で，４０，２０，および１０対１のエフェクター対標的細胞（Ｅ／Ｔ）比で，標的細胞とともにインキュベートした。３７℃で６時間インキュベートした後，無細胞上清を回収してＡＤＣＣ活性を測定した（Ｓｈｏｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００４；９０：１５６３−１５７１）。
統計学
統計学的分析は，スチューデントｔ検定およびマン・ウィットニー Ｕ検定を用いて行った。Ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意とした。
ＨＣＶ−ペプチドに対する液性応答の検出
ペプチドに対する液性応答をスクリーニングするために，ＨＣＶ−１ｂに感染した１２名の患者の血漿において，４４種のペプチドに対するそれぞれのＩｇＧ反応性のレベルを測定した。１０名のＨＤの血漿を陰性対照として用いた。ペプチド反応性ＩｇＧのレベルは，連続希釈した血漿サンプルについてＥＬＩＳＡにより測定し、各サンプルの吸光度（ＯＤ）値を示した。１：１００の血漿希釈でのこれらのペプチドのカットオフ値を０．１８ＯＤ｛１０名のＨＤの平均（０．０８）＋２ＳＤ（０．０５ｘ２）｝とした。ＮＳ５Ａ−２１３２，Ｃ−１７６，Ｅ２−４８８，Ｅ１−２１３，Ｃ−１７３，およびＮＳ３−１０８１ペプチドに対する有意なレベル（１：１００の血清希釈で＞０．１８ＯＤ）のＩｇＧ反応性は，１２名の患者の血漿中，それぞれ１２，１１，１０，９，８，および５名で検出できた（図９）。予測されたように，これらのペプチドのいずれも，１０名のＨＤからの血漿に対しては反応性を有していなかった。ペプチド特異的ＩｇＧに対するペプチドの反応性を表３にまとめる。
９０％以上の純度を有する上述の６種の各ペプチド，ならびに陰性対照ペプチドを，６０名のＨＣＶ１ｂ＋患者（ＣＨ，ｎ＝２４；ＬＣ，ｎ＝１８；およびＨＣＣ，ｎ＝１８）ならびに２０名のＨＤの血清からの各血清サンプルに対する反応性について試験した（図１０）。
これらの各サンプルについて１００：１希釈の値をプロットした。ＩｇＧ（ＯＤ値）の平均±ＳＤは以下のとおりであった：ＮＳ５Ａ−２１３２（０．４８±０．３６），Ｅ２−４８８（０．１８±０．１９），Ｅ１−２１３（０．１０±０．２１），ＮＳ３−１０８１（０．０３６±０．１４），Ｃ−１７６（０．０９±０．１４）およびＣ−１７３（０．０４±０．１３）。＊はマン・ウィットニー Ｕ検定によるＰ＜０．０５を示す。ＮＳ５Ａ−２１３２，Ｅ２−４８８，Ｅ１−２１３，またはＣ−１７３に対して反応性を有するＩｇＧの平均レベルは，ＨＤのものより統計学的に有意に高かったが，ＮＳ３−１０８１またはＣ−１７６の場合にはそうではなかった。ＮＳ５Ａ−２１３２，Ｅ２−４８８，Ｅ１−２１３，Ｃ−１７３，ＮＳ３−１０８１０，およびＣ−１７６ペプチドに対して有意なレベルの反応性を示すＩｇＧ（１：１００の血清希釈において＞０．１０１ ＯＤ）が，試験した６０名の患者の血漿のそれぞれ５７（９５％），４４（７３％），２８（４７％），２３（３８％），２１（３５％），および１７（２８％）において検出できた。これに対し，２０名のＨＤの血清はすべて，有意なレベルのＩｇＧは検出できなかった（図１０）。
次に，これらの各ペプチドに反応性を有するＩｇＧのペプチド特異性を，吸収および溶出試験により確認した。各血清サンプルを，対応するペプチドまたは無関係なペプチド（ＨＩＶ；陰性対照として用いる）のいずれかに，３７℃で３回吸収させ，ＥＬＩＳＡによりペプチド特異的ＩｇＧを測定した（図１１）。溶出試験では，第１回の吸収の後にペプチド固定化プレートに結合したＩｇＧ分子を対応するペプチドまたは無関係なペプチドで溶出した後に，ＥＬＩＳＡにより溶出画分中のペプチド特異的ＩｇＧのレベルを測定した。代表的結果について３回の測定のＯＤ値の平均±ＳＤが図示される（図１２）。＊は両側スチューデントｔ検定によりＰ＜０．０５を示す。
予測されたように，６種のペプチドに対する各ＩｇＧはすべて対応するペプチドにより吸収されたが，無関係なペプチド（ＨＩＶペプチド）により吸収されなかった。さらに，このＩｇＧは，対応するペプチドによって結合画分から溶出されたが，無関係なペプチドによっては溶出されなかった。これらの結果を合わせると，各ペプチドに反応性を有するＩｇＧはＨＣＶ１ｂ由来ペプチドに対して特異的であることが示唆される。
ペプチド特異的細胞性応答の誘導
ＨＣＶ１ｂに感染しているＨＬＡ−Ａ２４陽性の患者（ｎ＝１２，６名のＣＨ，３名のＬＣ，３名のＨＣＣ）およびＨＣＶに感染していないＨＬＡ−Ａ２４陽性のＨＤ（ｎ＝５）からのＰＢＭＣを，６種の各ペプチド（純度＞９０％）または対照ＨＩＶペプチドとともに１３日間培養し，対応するペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞に応答したＩＦＮ産生について調べた。ＨＬＡ−Ａ２４陽性ＨＣＶ１ｂ＋の患者（ｎ＝１２）およびＨＤ（ｎ＝５）からのＰＢＭＣを６種のペプチドで，４つのウェル（１５ｘ１０４／ウェル）で刺激した。培養の第１４日に，各ウェルからのペプチド刺激ＰＢＭＣ（８０−１２０ｘ１０４／ウェル）を別々に回収し，等量に４つに分割した。そのうち２つを，対応するペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞に応答してＩＦＮ−γを産生する能力について別々に試験した。残りの２つは，陰性対照ペプチド（ＨＩＶ）を用いた細胞で試験した。ＨＩＶペプチド（＜５０ｐｇ／ｍｌ）に応答して産生されたＩＦＮ−γをバックグラウンドとして差し引いた。＊は両側スチューデントｔ検定によりＰ＜０．０５を示す。
Ｃ−１７３，Ｃ−１７６，Ｅ１−２１３，Ｅ２−４８８，ＮＳ３−１０８１，およびＮＳ５Ａ−２１３２のＨＣＶペプチドは，１２名の患者のそれぞれ１，３，４，６，２，および７名（図１３，１４），および５名のＨＤのそれぞれ０，０，１，１，１，および１名から，有意なレベル（ｐ＜０．０５）のＩＦＮ−γ産生を誘導した（データ示さず）。これらの６種のペプチドのうち，ＮＳ５Ａ−２１３２ペプチドは，１２名の患者の７名からのＰＢＭＣおよび試験した６０名のＨＣＶ１ｂ＋患者の５７名の血清において，細胞性免疫および液性免疫により認識された。
これらのペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害性を，６時間の５１Ｃｒ遊離アッセイにより確認した（図１５）。ＩＦＮ−γ産生アッセイ（上述）によりポジティブの応答を示すペプチド刺激ＰＢＭＣを，インビトロでＩＬ−２のみで培養して増殖させた。次に，標準的な６時間の５１Ｃｒ遊離アッセイにより，対応するペプチドまたはＨＩＶペプチド（陰性対照）でパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞に対する細胞傷害性について，３つの異なるＥ／Ｔ細胞比で試験した。代表的な結果を図示する。値は特異的溶解の％の平均±ＳＤで表す。＊は両側スチューデントｔ検定によりＰ＜０．０５を示す。ＮＳ５Ａ−２１３２，Ｅ２−４８８，またはＥ１−２１３ペプチドで刺激したＰＢＭＣは，対応するペプチドを予め負荷したＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞に対して有意なレベルの細胞傷害性を示したが，ＨＩＶペプチドでは示さなかった（図１５）。
図１５に示される実験において用いたペプチド刺激ＰＢＭＣを，２０μｇ／ｍｌの抗ＨＬＡ−クラスＩ（Ｗ６／３２，ＩｇＧ２ａ），抗ＨＬＡ−クラスＩＩ（Ｈ−ＤＲ−１，ＩｇＧ２ａ），抗ＣＤ８（Ｎｕ−Ｔｓ／ｃ，ＩｇＧ２ａ），および抗ＣＤ４（Ｎｕ−Ｔｈ／ｉ，ＩｇＧ１）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の存在下で，対応するペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞に対する細胞傷害性について試験した。抗ＣＤ１４（ＪＭＬ−Ｈ１４，ＩｇＧ２ａ）ｍＡｂを陰性対照として用いた。３つの異なるＥ／Ｔ比で６時間の５１Ｃｒ遊離アッセイを行った。値は特異的傷害の％の平均±ＳＤで表す（図１６）。＊は両側スチューデントｔ検定によりＰ＜０．０５を表す。
３種のペプチドのそれぞれでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞に対する細胞傷害性は，抗ＨＬＡ−クラスＩ（Ｗ６／３２）またはＣＤ８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）により阻害されたが，試験した他のｍＡｂのいずれによっても阻害されなかった。このことは，ペプチド特異的細胞傷害性が，主としてＣＤ８＋Ｔ細胞によりＨＬＡ−クラスＩ拘束性で媒介されることを示す（図１６）。これに対し，残りの３種のペプチド（Ｃ−１７３，Ｃ−１７６，またはＮＳ３−１０８１）で刺激したＰＢＭＣではそのような細胞傷害性は検出できなかった（データ示さず）。
次に，ＮＳ５ＡおよびＨＬＡ−Ａ２４０１遺伝子で一過性にコトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞を標的細胞として用いることにより，ＮＳ５Ａ−２１３２ペプチド刺激ＰＢＭＣが自然にプロセスされて生じたペプチドを認識するか否かを調べた。陰性対照としては，ＮＳ５ＡおよびＨＬＡ−Ａ２６０１遺伝子で一過性にコトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞を用いた。患者＃１および＃２からのＮＳ５Ａ−２１３２ペプチド刺激ＰＢＭＣが，ＮＳ５ＡおよびＨＬＡ−Ａ２４０１遺伝子で一過性にコトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞を標的細胞として認識してＩＦＮ−γを産生する活性について試験した。陰性対照としては，ＮＳ５ＡおよびＨＬＡ−Ａ２６０１遺伝子で一過性でコトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞を用いた。値は，Ｅ／Ｔ比２０：１での３回のアッセイにおけるＩＦＮ−γ産生の％の平均±ＳＤを表す（図１７）。＊は両側スチューデントｔ検定によりＰ＜０．０５を示す。
予測されたように，ＣＴＬ活性を示した（図１３）患者＃１および＃２からのペプチド刺激ＰＢＭＣは，ＮＳ５ＡおよびＨＬＡ−Ａ２４０１遺伝子でコトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞を認識して，有意な量のＩＦＮ−γを産生した（図１７）。これに対し，これらのＰＢＭＣは，陰性対照として用いたＮＳ５ＡおよびＨＬＡ−Ａ２６０１遺伝子を有するＣＯＳ−７細胞には反応しなかった。また，ＣＴＬ活性を示さなかった他の２名の患者（＃３および＃４）からのペプチド刺激ＰＢＭＣも，ＮＳ５ＡおよびＨＬＡ−Ａ２４０１遺伝子でコトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞の認識により有意な量のＩＦＮ−γを産生しなかった（データ示さず）。
次に，ＮＳ５Ａ遺伝子で安定にトランスフェクトし標的細胞として用いたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞に対する細胞傷害性を試験した。ＮＳ５Ａ遺伝子で安定にトランスフェクトしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞におけるＨＬＡ−Ａ２４分子の発現，およびＨＬＡ−Ａ３１遺伝子（陰性対照）で安定にトランスフェクトしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞におけるＨＬＡ−Ａ３１分子の発現を，ＦＡＣＳｃａｎを用いるフローサイトメトリー分析により確認した（図１８）。
次に，ＮＳ５Ａ遺伝子で安定にトランスフェクトしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞を標的細胞とする細胞傷害性を６時間の５１Ｃｒ遊離アッセイにより試験した。陰性対照遺伝子（ＨＬＡ−Ａ３１０１）で安定にトランスフェクトしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞を陰性対照として用い，ＮＳ５Ａ−２１３２ペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞を陽性対照として用いた。３つの異なるＥ／Ｔ比で６時間の５１Ｃｒ遊離アッセイを行った。値は特異的溶解の％の平均±ＳＤで表す。＊は両側スチューデントｔ検定によりＰ＜０．０５を示す。ＮＳ５Ａ−２１３２ペプチドで刺激したＰＢＭＣは，陰性対照遺伝子でトランスフェクトしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞に対する細胞傷害性と比較して，ＮＳ５Ａ遺伝子でトランスフェクトしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞，および対応するペプチドで予めパルスしたトランスフェクトしていないＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞の両方に対して，より高いレベルの細胞傷害性を示した（図１９）。これらの結果は，ＮＳ５Ａ−２１３２ペプチド刺激ＰＢＭＣがＨＣＶ１ｂ＋細胞のＨＬＡ−Ａ２４０２分子上の自然にプロセスされて生じたペプチドを首尾よく認識したことを示唆する。
抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧについてのさらなる研究
抗ペプチドＩｇＧの生物学的役割の可能性をさらによく理解するために，吸収および溶出アッセイにより，抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧが全ＮＳ５タンパク質を認識するか否かを調べた。ＮＳ５Ａ−２１３２およびＨＩＶペプチドをそれぞれ陽性対照および陰性対照として用いた（吸収試験および溶出試験の詳細は上述を参照）。その結果，抗ペプチドＩｇＧは，全ＮＳ５タンパク質では吸収も溶出もされなかった（図２０）。このことは，このペプチドＩｇＧは全ＮＳ５タンパク質とは反応しなかったことを示唆する。
次に，Ｈｕｈ７細胞を，患者血清（血清が高レベルの抗ＮＳ５Ａ−２１３２活性を有する２名のＨＣＶ１ｂ＋患者からの血清）の存在下で３日間までインキュベートした。陰性対照としては，２名のＨＤからの血清およびＦＣＳを用いた。生存可能なＨｕｈ７（ＮＮＵ５０−１）細胞の数を細胞計数キット８（１０μｌ／ウェル）で数え，３回のアッセイの平均値を示す。試験した血清はいずれも，これらの培養条件下ではＨｕｈ７（ＮＮＵ５０−１）細胞の増殖を阻害しなかった（図２１）。また，抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧがＡＤＣＣ活性を媒介する能力を有するか否かを調べた。ＨＬＡ−Ａ２４陽性のＨＤから新たに単離したＰＢＭＣを，上述の４種の非働化血清の存在下で，このペプチドで予めパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞に対する細胞傷害性について試験した。しかし，これらの条件では試験した血清のいずれもＡＤＣＣ活性を示さなかった（図２２）。
［実施例３］．ＨＣＶ感染者の予後の予測
被験者
血清は，１９９５年から２００２年のコホート研究における，ＨＣＶ関連疾患を有する３３名の患者から得た。３３名の患者のフォローアップ調査の結果は表４に示される。慢性肝炎（ＣＨ，ｎ＝６８），肝硬変（ＬＣ，ｎ＝４３），および肝細胞癌（ＨＣＣ，ｎ＝５２）を有する患者の血清も分析に用いた。これらの患者は，最初の血清サンプリングの際に，生化学および組織学的所見，超音波検査，およびコンピュータ連動断層撮影により診断した。抗ＨＣＶ抗体は，化学発光酵素イムノアッセイ（ＣＬＥＩＡ）キット（Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ ＩＩ ＨＣＶ，Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）により，または第２世代もしくは第３世代酵素イムノアッセイ試験（ＳＲＬ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）により測定した。血清中のＨＣＶ−ＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲ（ＳＲＬ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて検出した。ＨＣＶゲノタイプは，患者の血清中のＨＣＶをＲＴ−ＰＣＲ（ＳＲＬ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で直接シークエンシングすることにより決定した。ＨＣＶ感染していない被験者からも血清を得た。これは，自己免疫疾患を有する２４名の被験者（全身性エリテマトーデスを有する６名の患者，ベーチェット病を有する１名の患者およびアトピー性皮膚炎を有する１７名の患者），Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の１７症例（ＨＢＶ表面抗原にポジティブ），ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を有する３名の患者，およびヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプＩ（ＨＴＬＶ−１）感染を有する１０症例を含む。陰性対照として，ＨＢＶの肝炎ウイルスまたはワクチン接種の履歴を有さず，正常な肝機能を有する３７名からの血清を試験した。
ペプチド
純度９０％以上の次の２つのペプチドは，ＢＩＯＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）から購入した；ＨＣＶ１ｂコアタンパク質３５−４４（ＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ（配列番号１）；ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬ活性を誘導することができる），およびＨＣＶ１ｂＮＳ５Ａタンパク質２１３２−２１４０（ＲＹＡＰＡＣＫＰＬ（配列番号２）；ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬ活性を誘導することができる）。陰性対照としては，ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフ（ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ（配列番号６４））およびＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフ（ＲＹＬＲＤＱＱＬＬＧＩ（配列番号６３））を有するＨＩＶ由来ペプチドを用いた。
ペプチドに反応性を有する抗体の測定
ペプチド特異的ＩｇＧのレベルは，酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。簡単には，各ペプチドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し，−２０℃で保存した。化学架橋剤であるジサクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）（ＰＩＥＲＣＥ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を含む０．１Ｍ炭酸バッファで希釈したペプチド（２０μｇ／ウェル）をＥＬＩＳＡプレートに結合させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）でウェルを３回洗浄した。プレートをＢｌｏｃｋ Ａｃｅ（Ｙｕｋｉｊｉｒｕｓｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で４℃で一晩ブロッキングした。血清サンプルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＢｌｏｃｋＡｃｅで１００倍，２００倍，４００倍に希釈し，１００μｌ／ウェルのサンプルを各ウェルに加えた。３７℃で２時間インキュベートした後，プレートをＰＢＳＴで９回洗浄し，１００μｌ／ウェルの１０００倍希釈ウサギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）とともに３７℃で２時間インキュベートした。９回洗浄した後，１００μｌ／ウェルの１：１００希釈抗ウサギＩｇＧ結合西洋ワサビパーオキシダーゼ・デキストランポリマー（Ｅｎ Ｖｉｓｉｏｎ，ＤＡＫＯ）を各ウェルに加え，プレートを室温で４０分間インキュベートした。洗浄した後，１００μｌ／ウェルのテトラメチルベンチジン基質溶液（ＫＰＬ，Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ，ＵＫ）を加え，１．０Ｍのリン酸を加えることにより反応を停止させた。
統計学
統計学的分析は，χ２を検定を用いて行った。ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意であるとした。
交叉反応性，ＨＬＡ拘束性，およびゲノタイプ拘束性
ＨＣＶ１ｂ由来ペプチドに対して反応性を有する２つの抗体の交叉反応性を調べた。６０名のＨＣＶ患者，およびコホート研究に含まれていない患者（ＣＨ，ｎ＝２２，ＬＣ，ｎ＝２１，およびＨＣＣ，ｎ＝１７）の血清を，コアの３５−４４（Ｃ−３５）およびＮＳ５Ａの２１３２−２１４０（ＮＳ５Ａ−２１３２）のペプチドに対する反応性について調べた。自己免疫疾患を有する２４名の被験者，ＨＢＶ感染の１７症例およびＨＴＬＶ−１感染の１０症例からも血清を入手した。３７名のＨＤからの血清を陰性対照として用いた。連続希釈した血清サンプルのペプチド反応性ＩｇＧのレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。各サンプルの吸光度（ＯＤ）の値を示した。１００：１の血清希釈でのＯＤの代表的な結果を示す。カットオフ値は０．０９３（ＨＤからのＯＤの平均＋２ＳＤ）に設定した。統計学的分析はχ２検定を用いて実施した。ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意とした。
その結果，ＨＣＶ陽性患者の５６／６０（９３．３％）において有意なレベルの抗Ｃ−３５ＩｇＧが検出され，３群（ＣＨ，ＬＣ，およびＨＣＣ患者）の間でＩｇＧレベルには有意な差がなかった（図２３）。ＨＴＬＶ−１患者を除き，他の群からの血清は抗Ｃ−３５抗体にポジティブではなかった。ＨＴＬＶ−１＋被験者の８／１０症例の血清において，低いが有意なレベルの抗Ｃ−３５ＩｇＧが検出された。患者の４５／６０（７５％）で有意なレベルの抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧが検出された。ＩｇＧレベルは，３群の間では，ＣＨ患者では高く，ＬＣでは中程度であり，ＨＣＣ患者では低かった（ｐ＜０．０５ｖｓＣＨ）（図２３）。他の群からの血清についても，試験した症例の大部分で抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧがポジティブであった。さらに，３／３７のＨＤの血清は抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧがポジティブであった。
次に，ＨＣＶ関連疾患を有する２９名の患者で，ＨＬＡ−クラスＩＡ表現型と，抗Ｃ−３５ＩｇＧまたは抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧのレベルとの間の相関を調べた。ＨＬＡ−クラスＩＡ表現型は標準的な血清学的方法により決定した。９名の患者はＨＬＡ−Ａ２陽性，１３名の患者はＡ２４陽性，および残りの７名の患者はＡ２陰性，Ａ２４陰性であった。抗Ｃ−３５および抗ＮＡ５Ａ ２１３２は，標準的ＥＬＩＳＡにより測定し，各患者の１００：１の血清希釈でのＯＤ値を図示した。いずれの抗体も，ＨＬＡ−クラスＩＡ表現型の相違にかかわらず，ＨＣＶ感染患者の大部分で検出された（図２４）。
次に，ＨＣＶ−１ｂ（ｎ＝２９），ＨＣＶ−２ａ（ｎ＝１６）およびＨＣＶ−２ｂ感染（ｎ＝３）を有する患者において，ＨＣＶゲノタイプと，抗Ｃ−３５ＩｇＧまたは抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧのレベルとの間の相関を二重盲検法で調べた。ＨＣＶゲノタイプは，患者の血清中のＨＣＶを直接シークエンスすることにより決定した。すべての被験者の１００：１希釈での結果を図２５に示す。抗Ｃ−３５および抗ＮＡ５Ａ ２１３２は，標準的なＥＬＩＳＡにより測定し，各患者の１００：１の血清希釈でのＯＤ値を図示した。カットオフ値は０．０９３（ＨＤからのＯＤの平均＋２ＳＤ）に設定した。
抗Ｃ−３５抗体は，それぞれ，２６／３０のＨＣＶ−１ｂ，１５／１５のＨＣＶ−２ａ，および３／３のＨＣＶ−２ｂ感染患者で検出された。同様に，抗ＮＳ５Ａ−２１３２抗体は，それぞれ，２３／３０のＨＶＣ１ｂ，１０／１６のＨＣＶ−２ａ，および３／３のＨＣＶ−２ｂ感染患者からの血清中で検出された（図２５）。これらの結果は，ＨＣＶ陽性患者においては，ＨＬＡ−クラスＩＡサブタイプの相違およびＨＣＶゲノタイプの相違にかかわらず，抗Ｃ−３５抗体および抗ＮＳ５Ａ−２１３２抗体の両方が検出されたことを示す。
以上の結果は，抗ＮＳ５Ａ−２１３２抗体のレベルはＨＣＶ感染個体の予後と相関するが，抗Ｃ−３５抗体は相関しないことを示唆する。
次に，ＣＨ（ｎ＝２４），ＬＣ（ｎ＝２２），ＨＣＣ（ｎ＝２６），ＨＤ（ｎ＝９）の血清を新たに用意し，抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧのレベルを測定した（図２６）。ＣＨ，ＬＣ，ＨＣＣおよびＨＤ群の平均±ＳＤはそれぞれ０．５１±０．２４，０．２７±０．２０，０．２６±０．２３，０．０８±０．０７であった。ＬＣおよびＨＣＣ患者における抗ＮＳ５Ａ−２１３２抗体のレベルはＣＨ患者より有意に低かったが（ｐ＜０．０５），ＨＤより高かった。これらの結果を標準的な第３世代アッセイにより測定した結果と比較するために，すべての血清について，市販のキット（第３世代アッセイ，ＳＲＬ）を用いて抗ＨＣＶ抗体のレベルを測定した。レベルは指数として示される（左カラム）。指数で示される抗ＨＣＶのレベルと抗ＮＳ５Ａ−２１３２のレベルとの間の相関は，右カラムに示される。第３世代アッセイにより測定した抗ＨＣＶ抗体のレベルは３群の間で有意に相違しなかった（ＣＨ；１０±２．７，ＬＣ；１１±１．４，ＨＣＣ；１１±１．１）（図２７）。さらに，これらの血清について，市販のキット（ＳＲＬ，Ｊａｐａｎ）を用いてＨＣＶ ＲＮＡレベルを測定した。ＨＣＣ患者のＨＣＶ ＲＮＡレベル（３６０±２６９．６）は，ＣＨ患者（６１０±３４７．３）またはＬＣ患者（６１０±２４６．４）より低かった（ｐ＜０．０５）（図２８）。しかし，抗ＮＳ５Ａ抗体のレベルとＨＣＶ ＲＮＡレベルとの間には明らかな相関はなかった（図２８）。
コホート研究の結果
抗ＮＳ５Ａ−２１３２抗体とＨＣＶ陽性患者の予後との相関を個々のレベルでさらに調べるために，１９９０年から２００２年に行われた，ＨＣＶに感染している住人を毎年スクリーニングするコホート研究からのサンプルについて２つの抗体の血清レベルを調べた。この研究のためには，１９９５年および２００２年に同じ個体から２回採取した３３名の患者からの合計６６の血清を用いた。１９９５年の時点におけるこれらの３３名の患者の診断は，ＣＨ（ｎ＝１７），ＬＣ（ｎ＝１），無症候性キャリア（ＡＳＣ）（ｎ＝４），およびＨＣＶ感染の過去の病歴（自然回復した個体）（ｎ＝１１）であり，２００２年の時点では，ＣＨ（ｎ＝１３），ＬＣ（ｎ＝４），ＨＣＣ（ｎ＝２），無症候性キャリア（ＡＳＣ）（ｎ＝１），およびＨＣＶ感染の過去の病歴（ｎ＝１３）であった。すなわち，７年間の間に，２６名の患者では疾患の進行が観察されなかったが，残りの７名の患者では進行が観察された（表４）。１９９５年および２００２年に１００：１の血清希釈で測定した各患者における抗Ｃ−３５抗体および抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧのＯＤ値を図２９に示す。予測されたように，３３症例の大部分においては，疾患の状態にかかわらず，１９９５年に測定した抗Ｃ−３５抗体のレベルと２００２年に測定したレベルとはほぼ等しかった。これに対し，１９９５年に測定した抗ＮＳ５Ａ抗体のレベルは，疾患が進行した７名の患者すべてにおいては２００２年に測定したときに減少していた。一方，疾患が進行しなかった２５症例の大部分において２００２年で測定した値とほぼ等しかった。疾患が進行した７名の患者の血清中の１９９５年の時点における抗ＮＳ５Ａ−２１３２抗体の中央値±ＳＤ（０．６７±０．１３）は，２００２年に測定した値（０．２７±０．１１）より有意に高かった（ｐ＜０．０５）。
次に，３３名の被験者を５つの群（ＣＨ，ＬＣ，ＨＣＣ，ＨＣＶ感染の過去の病歴［回復した個体］，およびＡＳＣ）に分け，２００２年における１００：１の血清希釈での２つの抗体のレベルをプロットした（図３０）。統計学的分析は，χ２検定を用いて行った。ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意とした。抗Ｃ−３５抗体のレベルは，ＣＨ，ＬＣ，およびＨＣＣではいずれも高く，治癒した個体では非常に低くなるか検出できなくなった。一方，抗ＮＳ５Ａ−２１３２抗体のレベルはＣＨ，回復した個体およびＡＳＣで高く，ＬＣで中程度であり，ＨＣＣ患者で最も低かった（ｐ＜０．０５ｖｓＣＨ）。
［実施例４］：ルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）法によるＨＬＡ−Ａ２４＋ＨＣＶ感染患者の血清におけるＨＣＶペプチドと反応性を有するＩｇＧの検出
ＥＬＩＳＡ法より感度が高いと考えられるルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）法を用いて、実施例１と同様にして、ＨＬＡ−Ａ２４＋ＨＣＶ感染患者の血清におけるＨＣＶペプチドと反応性を有するＩｇＧの検出を行った。
ペプチドの微小ビーズへの結合
ペプチドを、製造者の指示に従って各蛍光色素の含有量を識別コード（以下、カラーコード）化した微小ビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ社製、ｘＭＡＰ Ｍｕｌｔｉ−Ａｎａｌｙｔｅ ＣＯＯＨ Ｂｅａｄｓ）にそれぞれ次のようにして結合した。フィルタープレートの各ウェルにカラーコード化した未調製の微小ビーズを１００μｌずつ入れて吸引し、その後洗浄用緩衝液（リン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４±０．１）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（０．０５％ｖ／ｖ））で２回洗浄し各ウェルを同時に吸引した。次に０．１Ｍ ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ７．０）５０μｌを入れ、ＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩）（１ｍｇ／ｍｌ／０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０））を各ウェル１０μｌずつ添加した。数百μｌのペプチド（１ｍｇ／ｍｌ，０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０）をこの洗浄した微小ビーズと各ウェル内で混合した。その後ペプチドと混合した微小ビーズを、暗所で２０分間、室温で反応させた後、さらにＥＤＣ（１ｍｇ／ｍｌ／０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０））を各ウェル１０μｌずつ添加し、暗所で、２０分間室温で反応させる操作を２回繰り返した。余剰液を吸引後、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を各ウェル１００μｌずつ添加し、暗所で、１５分間室温で反応させた。次に、各ウェルのビーズを上記洗浄用緩衝液で３回洗浄し、ブロックエース（登録商標）に０．０５％アジ化ナトリウムを入れて調整した保存用溶液で回収した。
微小ビーズミックスの調製
各ウェルの微小ビーズを調製するときは、上記のようにカラーコード化した微小ビーズにペプチドを結合させて得たビーズ溶液をフィルタープレートの各ウェル当たり微小ビーズが約５０００個になるように入れて（各ウェル当たりビーズ１種類約１μｌ）調製する。また、このように調製した微小ビーズを１０種類等量で混ぜて、上記洗浄用緩衝液（ＰＢＳ、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（０．０５％ｖ／ｖ））で総量が約２５μｌになるように希釈してビーズミックスを調製した。
サンプルの調製
血清を使用した。血清を反応用緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４±０．１）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（０．０５％ｖ／ｖ）、牛胎児血清アルブミン（ＢＳＡ）１０ｍｇ／ｍｌ）を用いて１００〜１０００倍希釈した血清希釈液をそれぞれ１００μｌ調製した。
抗ペプチド抗体測定
ビオチン化二次抗体としては、ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ガンマ鎖特異的）を上記反応用緩衝液で希釈して使用した。蛍光色素標識ストレプトアビジンとしては、ＰＥ（フィコエリスリン）で標識したストレプトアビジン（ＳＲＰＥ）１ｍｇ／ｍｌを上記反応用緩衝液で２０μｌに希釈（１／５０希釈）して使用した。
フィルタープレートの各ウェルに上記洗浄用緩衝液を１００μｌ入れ、続いて吸引除去した。この洗浄操作を２回行った。次に、各ウェルに上記ビーズミックスを２５μｌ入れた９６ウェルのフィルタープレートを該洗浄用緩衝液で２回洗浄した。洗浄後、全てのウェルに上記サンプルをそれぞれ１００μｌ入れた。次にフィルタープレートにカバーをして暗所で、２時間室温でプレートシェーカー（３００ｒｐｍ）を用いて振とうした後、吸引した。続いて、各ウェルに上記洗浄用緩衝液をそれぞれ１００μｌ入れ、吸引除去した。この洗浄操作を３回行った。
次に、各ウェルにビオチン化二次抗体としてビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ガンマ鎖特異的）をそれぞれ１００μｌ入れ、フィルタープレートにカバーをして暗所で１時間室温でプレートシェーカー（３００ｒｐｍ）を用いて振とうした。その後、吸引して、各ウェルに上記洗浄用緩衝液をそれぞれ１００μｌ入れ、吸引除去した。この洗浄操作を３回行った。
続いて、各ウェルにＳＲＰＥをそれぞれ１００μｌ入れて、フィルタープレートにカバーをして暗所で３０分間室温でプレートシェーカー（３００ｒｐｍ）を用いて振とうした。その後、吸引して、各ウェルに上記洗浄用緩衝液をそれぞれ１００μｌ入れ、吸引除去した。この洗浄操作を３回行った。その後、各ウェルに該洗浄用緩衝液をそれぞれ１００μｌ入れて、プレートシェーカー（３００ｒｐｍ）を用いて２〜３分間振とうした後、得られたサンプル５０μｌを蛍光フローメトリーシステムで測定した。結果を図３１および３２、および表５に示す。
［実施例５］：Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドワクチンを用いるＨＣＶ感染の治療
ＨＬＡ−Ａ２陽性またはＨＬＡ−Ａ２４陽性のＨＣＶ感染者において，本発明のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドを用いたワクチンの抗ウイルス効果を調べた。被験者はいずれも，ＨＣＶ１ｂに感染しており，インターフェロン＋リバビリンによる治療に応答しなかった患者である。Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドＣ−３５，ＮＳ５Ａ−２１３２，Ｅ２−４８８，Ｅ１−２１３およびＮＳ３−１０８１はＧＭＰ適合下に合成し，精製し，凍結乾燥粉末として保存した。Ｃ−３５，ＮＳ５Ａ−２１３２，Ｅ２−４８８およびＮＳ３−１０８１のペプチドは，少量のＤＭＳＯに溶解（１ｍｇ／１０〜２５μｌ）し，Ｅ１−２１３は７％炭酸水素ナトリウム注射液（メイロン）に溶解（１ｍｇ／１５μｌ）した。これらをそれぞれ注射用生理食塩水で希釈（１〜２ｍｇ／ｍｌ）し，０．２２μｍのフィルタを通して滅菌した。この溶液を等量のアジュバント（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１）と混合して，エマルジョン注射剤を得た。このうちＨＬＡ−Ａ２陽性の被験者３名にはＣ−３５注射剤を，ＨＬＡ−Ａ２４陽性の被験者５名にはＮＳ５Ａ−２１３２注射剤を投与した。投与は，２週間ごとに，１回あたり０．３ｍｇのペプチドを含むエマルジョンを側腹部に注射することにより行った。ＨＣＶ ＲＮＡの量およびＧＯＴ，ＧＰＴ，γ−ＧＴＰ，ＡＦＰの値を継続的にモニターした。
結果を図３３および図３４に示す。これらの図から明らかなように，試験したほとんどの被験者において，ワクチン投与開始後ＨＣＶ ＲＮＡの量が顕著に低下しており，本発明のペプチドが抗ＨＣＶワクチンとして有効であることが実証された。
産業上の利用性
この発明に係るＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドは，ＨＬＡ結合モチーフをその配列中に含んでいて，Ｃ型肝炎ウイルスに反応する抗体により認識されるとともに，さらにＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識性を有している。
したがって，この発明のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドは，ＨＣＶ感染に起因する疾患に対して有効なワクチンとなり得る。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【技術分野】
この発明は，Ｃ型肝炎ウイルス感染の診断およびＣ型肝炎の治療に有用な，Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ペプチドに関するものである。
さらに詳細には，この発明は，ＨＣＶペプチド，ＨＣＶペプチドを含むポリペプチド，ＨＣＶペプチドもしくは前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド，またはそれらを認識する抗体もしくは抗体類似活性物質，前記ヌクレオチドを含有するベクター，ＨＣＶペプチドもしくは前記ポリペプチドを用いて細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する誘導方法，あるいはＨＣＶペプチド，前記ポリペプチド，前記ヌクレオチドもしくは前記抗体・抗体類似活性物質を使用したＣ型肝炎ウイルスの検出方法，Ｃ型肝炎の診断，予防もしくは治療方法，および予後の予測方法，ならびにそれらを含むＣ型肝炎治療用医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
ウイルス性肝炎には，主としてウイルスが経口感染するＡ型肝炎と血液を介して感染するＢ型肝炎の他に，主に輸血などで感染するＣ型肝炎などがある。そのＣ型肝炎は，慢性化して肝硬変や肝癌に移行する割合が非常に高い疾患の１つである。
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は，フラビウイルス科に属する１本鎖ＲＮＡウイルスであり，日本に２００万人以上，世界中では１億７０００万人もＣ型肝炎ウイルス感染者がいると言われている。
このＣ型肝炎に対しては，インターフェロンとリバビリン併用療法が行われているが，３〜４割の患者に対してのみ有効であり，大半の患者に対しては現在有効な治療法がないのが実状である。したがって，安全で有効かつ簡単な上に，低コストの診断ならびに治療ツールを緊急に開発することへの強い社会的要請がある。
細胞性ならびに液性免疫応答の両者はＨＣＶ感染を抑制するのに主要な役割を果たしていることを示す証拠がある（ＷＯ８９／０４６６９）。過去１０余年にわたって高い免疫原性のＨＣＶペプチドを見い出す研究が数多くなされ，細胞性または液性免疫応答を誘導することができる数多くのＨＣＶペプチドが見出されてきた（Ｈｕｎｚｉｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１ Ｄｅｃ；３８（６）：４７５−８４）。しかしながら，これらのペプチドのいずれも臨床的に有効ではなく，その結果，現在でも予防的にも治療的にも有効な免疫治療の手段がないのが実状である。このことは，主にこれらのペプチドの免疫原性が弱いことに基づいていると考えられる。
また，本発明者らは，いくつかの細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）により認識される抗原ペプチドが，インビトロでもインビボでも細胞性免疫応答および液性免疫応答の両方を導き出す能力を有していることをすでに報告している（Ｇｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００２ Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；２５（５）：４３９−４４，Ｍｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１ Ｄｅｃ；７（１２）：３９５０−６２，Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００３ Ｊｕｌ−Ａｕｇ；２６（４）：３５７−６６，Ｍｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．２００３ Ｊｕｎ；９４（６）：５４８−５６）。
さらに，細胞性ならびに液性免疫応答の両者によって認識されるＨＣＶペプチドは，細胞性免疫応答だけによって認識されるものよりも免疫原性が高いと考えられる。
かかる社会的要請に応えるための１つの新しいアプローチとして，細胞性免疫応答ならびに液性免疫応答の両者を誘導することができるＨＣＶペプチドが，液性免疫応答だけを有するペプチドに比べて，より一層高い免疫原性を有しているとの一連の知見が蓄積されてきているので，かかるペプチドを特定するというアプローチを挙げることができる。
そこで，かかるペプチドを同定するとともに，ＨＣＶ感染を抑制するための新規な治療および診断ツールとしての候補となるかどうかを調べることは，有益であると考えられる。
したがって，本発明者らは，ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識されるペプチドと反応性を有するＩｇＧがＨＣＶ感染患者の血清中から検出できるかどうかを調べた結果，いくつかのＣＴＬエピトープに特異的なＩｇＧが，異なるＨＬＡクラスＩタイプや異なるＨＣＶゲノタイプには関係なく、ＨＣＶ感染患者の大多数に検出されることを見出した。さらに，この結果から，かかるペプチドが，ペプチドをベースとする予防および治療用の新しいツールを提供することができることを見出して，この発明を完成するに到った。
したがって，この発明は，細胞性免疫応答ならびに液性免疫応答によって認識され，かつ免疫原性が高いことを特徴とするＨＣＶペプチドを提供することを目的とする。
【発明の開示】
上記課題を解決するために，この発明は，ＨＬＡ結合モチーフを配列中に含み，かつＣ型肝炎ウイルス感染患者の血中抗体により認識されるＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドを提供する。
この発明は，その好ましい態様として，配列表の配列番号１〜８、１６、２０および３８のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有するＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，該ペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性をもつアミノ酸配列を有するＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，およびＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識性をさらに有するＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドを提供する。
この発明の別の形態は，該Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドを含むポリペプチドを提供する。この形態の発明は，その好ましい態様として，該ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性をもつアミノ酸配列を有するポリペプチド，およびＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識性をさらに有するポリペプチドを提供する。
また，この発明の別の形態は，該Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドまたは該ポリペプチドをコードするヌクレオチドを提供する。
この発明のさらに別の形態は，該Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドまたは該ポリペプチドを免疫学的に認識することができる抗体および抗体類似活性物質を提供する。
この発明は，さらに別の形態として，上記のヌクレオチドを含有するベクターを提供する。
また，この発明のさらに別の形態は，該Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチド，該ポリペプチドをコードする該ヌクレオチドを用いて細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する誘導方法を提供する。
この発明は，さらに別の形態として，上記のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，ポリペプチド，ヌクレオチド，または抗体もしくは抗体類似活性物質を使用する，Ｃ型肝炎ウイルスの検出方法を提供する。
また，この発明の別の形態は，上記のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，ポリペプチド，ヌクレオチド，または抗体もしくは抗体類似活性物質を使用する，Ｃ型肝炎などのＨＣＶ感染関連疾患の診断方法を提供する。
さらに，別の形態として，この発明は，上記Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチド，ポリペプチド，ヌクレオチド，または抗体もしくは抗体類似活性物質を使用する，Ｃ型肝炎などのＨＣＶ感染関連疾患の治療方法を提供する。
この発明は，さらに別の形態として，上記のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，ポリペプチド，ヌクレオチド，または抗体もしくは抗体類似活性物質を有効成分として含む医薬組成物を提供する。また，その好ましい態様として，該医薬組成物がＣ型肝炎ウイルスワクチンである医薬組成物が提供される。
さらに，別の形態として，この発明は，上記Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチド，ポリペプチド，ヌクレオチド，または抗体もしくは抗体類似活性物質を使用する，Ｃ型肝炎などのＨＣＶ感染関連疾患の予後の予測方法を提供する。
この発明は，さらに別の形態として，上記のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，ポリペプチド，ヌクレオチド，または抗体もしくは抗体類似活性物質を含む，Ｃ型肝炎を診断または予後を予測するためのキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
図１は，本発明において，ＥＬＩＳＡ法によるＨＣＶ感染患者の血中ＩｇＧ測定結果を示すグラフである。
図２は，本発明において，ＥＬＩＳＡ法によるＨＣＶ感染患者の血中ＩｇＧ測定結果を示すグラフである。
図３は，本発明において，図１に示した患者血清中のＣ−３５ペプチド反応性抗体の代表例の吸収・溶出実験結果を示すグラフである。
図４は，本発明におけるＨＣＶ由来のＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチド６種（Ｎｏ３，１２，１３，２５，３２，３８）のＣＴＬ誘導結果を示すグラフである。
図５は，本発明におけるＨＣＶ由来のＨＬＡ−Ａ２結合性ペプチド（Ｎｏ４０からＮｏ５７）のＣＴＬ誘導結果を示すグラフである。
図６は，本発明において，５１Ｃｒ遊離試験によるペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害活性の代表的結果を示すグラフである。
図７は，本発明において，５１Ｃｒ遊離試験によるペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害活性の代表的結果を示すグラフである。
図８は，本発明において，抗ＣＤ８モノクローナル抗体を用いた抑制試験によるペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害性のＨＬＡクラスＩ拘束性を確認したグラフである。
図９は，ＨＣＶ感染患者血清における抗ペプチドＩｇＧの検出を示すグラフである。
図１０は，ＨＣＶ感染患者血清における抗ペプチドＩｇＧの検出を示すグラフである。
図１１は，ＨＣＶ感染患者血清中の抗ペプチドＩｇＧの特異性を調べる吸着試験の結果を示すグラフである。
図１２は，ＨＣＶ感染患者血清中の抗ペプチドＩｇＧの特異性を調べる溶出試験の結果を示すグラフである。
図１３は，ペプチド刺激ＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ産生を示すグラフである。
図１４は，ペプチド刺激ＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ産生を示すグラフである。
図１５は，ペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害性を示すグラフである。
図１６は，ペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害性を示すグラフである。
図１７は，ＮＳ５Ａを発現する細胞に対するペプチド刺激ＰＢＭＣのＣＴＬ活性を示すグラフである。
図１８は，ＮＳ５Ａを発現する細胞に対するペプチド刺激ＰＢＭＣのＣＴＬ活性を示すグラフである。
図１９は，ＮＳ５Ａを発現する細胞に対するペプチド刺激ＰＢＭＣのＣＴＬ活性を示すグラフである。
図２０は，抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧ活性の特異性を示すグラフである。
図２１は，抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧによる細胞増殖阻害のアッセイの結果を示すグラフである。
図２２は，抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧのＡＤＣＣ活性のアッセイの結果を示すグラフである。
図２３は，種々の疾患における抗Ｃ−３５抗体および抗ＮＳ５Ａ−２１３２抗体の検出を示すグラフである。
図２４は，抗ペプチド抗体のＨＬＡまたはＨＣＶゲノタイプ拘束性を示すグラフである。
図２５は，抗ペプチド抗体のＨＬＡまたはＨＣＶゲノタイプ拘束性を示すグラフである。
図２６は，患者血清における抗ＮＳ５Ａ−２１３２抗体の測定の結果を示すグラフである。
図２７は，患者血清における抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧの測定の結果を示すグラフである。
図２８は，患者血清における抗ＮＳ５Ａ抗体のレベルおよびＨＣＶ ＲＮＡレベルを示すグラフである。
図２９は，コホート研究における抗Ｃ−３５抗体および抗ＮＳ５Ａ−２１３２抗体の検出を示すグラフである。
図３０は，コホート研究における抗ＮＳ５Ａ−２１３２抗体の検出を示すグラフである。
図３１は，本発明において，ルミネックス法によるＨＣＶ感染患者の血中ＩｇＧ測定結果を示すグラフである。
図３２は，本発明において，ルミネックス法によるＨＣＶ感染患者の血中ＩｇＧ測定結果を示すグラフである。
図３３は，本発明のペプチドを用いるＣ型肝炎の治療の経過を示す。
図３４は，本発明のペプチドを用いるＣ型肝炎の治療の経過を示す。
発明の詳細な説明
この発明に係るＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドは，ＨＬＡ結合モチーフを配列中に含み，かつＣ型肝炎ウイルス感染患者の血中抗体により認識されるＨＣＶペプチドである。
また，この発明に係るＨＣＶペプチドは，ＨＬＡ結合モチーフ，つまりＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフをその配列中に含んでいる。さらに，このＨＣＶペプチドは，細胞性免疫応答および液性免疫応答によって認識されるとともに，免疫原性が高いことを特徴としている。
かかるＨＣＶペプチドとしては，例えば，下記の表１および表３に挙げられるペプチドが含まれる。本発明において特に好ましいＨＣＶペプチドの１つは，以下のアミノ酸配列を有するＨＬＡ−Ａ２結合性モチーフを有するペプチド：
である。ＨＣＶ感染患者においては，このペプチドに対するペプチド反応性ＩｇＧ抗体の検出率およびＨＣＶ感染症特異性が，それぞれ９３％と１００％と非常に高い。また本発明において特に好ましい別のＨＣＶペプチドは，以下のアミノ酸配列を有するＨＬＡ−Ａ２４結合性モチーフを有するペプチド：
である。特に，ＮＳ５Ａ−２１３２は，ＨＬＡ−Ａ２４陽性の多くの患者において，細胞性免疫および液性免疫の両方を誘導することができる。
この発明に係るＨＣＶペプチドは，該ペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％，好ましくは８０％以上，さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するペプチドであってもよい。
また，この発明に係るＨＣＶペプチドは，ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による認識性を有するペプチドをさらに含んでいてもよい。細胞内で製造された抗原タンパクが細胞内で分解されたペプチドからなる，このＨＬＡに結合可能な抗原ペプチドには，ＨＬＡのタイプごとにその配列にモチーフがあり，細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）はこの抗原ペプチドとＨＬＡとの複合体を認識してＨＣＶ感染細胞を傷害する。
この発明に係るポリペプチドは，上記のようなこの発明のペプチドのアミノ酸配列をそのアミノ酸配列中に含有しており，そのアミノ酸の総数は特に限定されるものではない。また，この発明のポリペプチドにおいて，このペプチドを構成するアミノ酸を超える残りのアミノ酸は，該ペプチドのアミノ酸のＮ−末端側および／またはＣ−末端側に，あるいはそれらの両側に位置している。したがって，このポリペプチドは，上記ペプチドの機能ならびに作用と実質的に同様の機能と作用を有している。なお，本明細書において，「ペプチド」と単に記載した場合でも，特に断りのない場合には，「ポリペプチド」をも包含して理解すべきものとする。
上記のようにして決定されたアミノ酸配列を有するペプチドは，通常の化学的合成法，タンパク分子の酵素的分解法，目的のアミノ酸配列をコードする塩基配列を発現するように形質転換した宿主を用いた遺伝子組換え技術などにより得ることができる。
目的とする該ペプチドを化学的合成法で製造する場合には，通常のペプチド化学においてそれ自体公知の慣用されている手法によって製造することができ，例えば，ペプチド合成機を使用して，固相合成法により合成することができる。このようにして得られた粗ペプチドは，タンパク質化学において通常使用されている精製方法，例えば，塩析法，限外ろ過法，逆相クロマトグラフィー法，イオン交換クロマトグラフィー法，アフィニティークロマトグラフィー法などによって精製することができる。
一方，所望の該ペプチドを遺伝子組換え技術で生産する場合には，例えば，上記により合成した目的のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を適当な発現ベクターに組込み，この発現ベクターを用いて微生物や動物細胞を形質転換して，得られた形質転換体を培養することによって，所望の該ペプチドを得ることができる。使用できる発現ベクターとしては，当該技術分野において公知であるプラスミド，ウイルスベクターなどを用いることができる。
このペプチド生産技術における発現ベクターを用いた宿主細胞の形質転換方法としては，それ自体公知の方法，例えば，塩化カルシウム法，リン酸カルシウム共沈殿法，ＤＥＡＥデキストラン法，リポフェクチン法，エレクトロポレーション法などが使用でき，使用する宿主細胞に基づいて適宜選択するのがよい。得られたペプチドの精製は，培養した培地から回収した細胞抽出液もしくは培養上清から上記精製法により行うことができる。
この発明の別の形態の１つとしてのヌクレオチドは，上記のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドまたは上記のポリペプチドを含有するオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドを含んでいて，リボヌクレオチドあるいはデオキシヌクレオチドを含んでいる。また，該ヌクレオチドは，当該分野で既知の方法によって改変されていてもよい。該ヌクレオチドの改変には，例えば，公知の標識，メチル化，「ｃａｐｓ」，アナログによる天然ヌクレオチド１つ以上の置換，ヌクレオチド内改変などが含まれる。ヌクレオチド内改変には，例えば，非イオン性改変（例えば，メチルリン酸，リン酸トリエステル，ホスホアミデートなど），イオン性改変（例えば，ホスホロチオエート，ホスホロジチオエートなど），例えばタンパク質（例えば，ヌクレアーゼ，毒素，抗体，シグナルペプチドなど）のようなペンダント部分を含む改変，キレート剤（例えば，金属，ホウ素など）による改変などが挙げられる。
上記のヌクレオチド配列は，ＨＣＶのゲノム中にコードされているＨＣＶ抗原のペプチドおよびポリペプチド配列を提供することを可能にし，また診断試験やワクチンの成分として，有用なペプチドを提供することができる。
この発明のヌクレオチドが得られると，ＨＣＶ感染関連疾患を診断するのに有用な，または血液中もしくは血液製剤中のＨＣＶ感染をスクリーニングするのに有用なヌクレオチドプローブならびにペプチドの構築が可能となる。このヌクレオチド配列から，例えば２４個ないし３０個のヌクレオチドあるいはそれより長いＤＮＡオリゴマーを合成することが可能である。このヌクレオチドは，被験者の血清中のＨＣＶ ＲＮＡを検出するための，また血液もしくは血液製剤中のＨＣＶの存在をスクリーニングするためのプローブとしても使用することができる。
また，このヌクレオチド配列は，ＨＣＶに対する抗体の存在を診断する試薬としても有用なＨＣＶ特異的ペプチドの設計ならびに生産を可能にする。さらに，この配列に由来する精製ペプチドに対する抗体は，ＨＣＶ感染者ならびにＨＣＶ感染血液製剤中のＨＣＶ抗原を検出するためにも使用することができる。
この発明の別の形態の１つとしての抗体は，該Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチド，該ポリペプチドに反応性を有するキメラ抗体，改変抗体，一価抗体，Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）２，Ｆａｂ’，単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）タンパク質ならびに単一ドメイン抗体が含まれる。また，この抗体は，該ペプチドまたは該ポリペプチドを免疫学的に認識することができる。
この発明の別の形態の１つとしてのベクターは，該ヌクレオチドを含有していて，選択された宿主細胞を形質転換し得る構築物であって，該宿主中で異種のコード配列を発現させることができる。この発現ベクターは，クローニングベクターあるいは組み込み用ベクターの何れであってもよい。
クローニングベクターとしては，例えば，プラスミド，ウイルス（例えば，アデノウイルスベクター）などが使用される。また該クローニングベクターは，宿主細胞を形質転換することができ，かつ，細胞内でヌクレオチドの複製を行う能力を有しているレプリコン（例えば，プラスミド，クロモソーム，ウイルス，コスミドなど）である。
他方，組み込み用ベクターは，宿主細胞中ではレプリコンとしては働かないが，宿主を安定に形質転換するために，宿主中のレプリコン（典型的には，クロモソーム）に駐留物を組み込む能力を有するベクターである。
この発明の別の形態の１つとして，該ペプチドを用いることによってＨＣＶ細胞を標的にする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する誘導方法が含まれる。この発明の誘導方法は，例えば，ＨＬＡ−Ａ２を発現している細胞に該ペプチドを添加してＨＬＡ−Ａ２上に提示させ，このペプチドをＨＬＡ−Ａ２により提示した細胞でＴ細胞を刺激し，このＴ細胞をＣＴＬに誘導することからなっているのがよい。この方法において使用するＨＬＡ−Ａ２発現細胞は，ＨＣＶ患者の血液から採取したものでよいが，非ＨＬＡ−Ａ２発現細胞にＨＬＡ−Ａ２をコードする遺伝子を導入して作成することもできる。したがって，この発明に係る該ペプチドは，ＨＣＶの検出ならびに診断のために使用することができるばかりではなく，Ｃ型肝炎ウイルス関連疾患のワクチンなどの医薬組成物として有用である。
また，このようにして誘導されたＣＴＬは，ＨＣＶ感染細胞を標的にして該ＨＣＶ感染細胞を攻撃するので，該ペプチドと同様に，細胞療法などの医薬組成物としても使用することができる。
さらに，この発明の別の形態である該Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチド，ポリペプチド，ヌクレオチドおよび／または抗体・抗体類似活性物質は，ＨＣＶ感染を検出・診断するのに有用である。
ＨＣＶの検出ならびにＨＣＶ関連疾患の診断は，例えば，該ペプチドをコードする核酸配列との相互作用および／または反応性を利用して，該ペプチドの存在の検出，相応する核酸配列存在量の検出，該ペプチドの個体中での生体分布の決定および／または個体由来の検体中の存在量の決定などによって行うことができる。つまり，ＨＣＶの検出ならびにＨＣＶ関連疾患の診断は，該ペプチドをマーカーとして検定することによって行うことができる。また，その測定は，それ自体公知の測定手法で行うことができ，かかる測定方法としては，例えば，抗原抗体反応系，酵素反応系，ＰＣＲ反応系などを利用した方法が挙げられる。
ＨＣＶ関連疾患の治療効果の確認および予後の予測は，ＨＣＶ関連疾患に罹患している被験者において，該ペプチドに対する反応性を有する抗体の血中濃度をモニターすることによって行うことができる。特に好ましくは，被験者の血中の抗Ｃ−３５ＩｇＧまたは抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧのレベルを測定する。
この発明のさらに別の形態である医薬組成物としては，例えば，ワクチンが挙げられる。ワクチンは，Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチド，ポリペプチドおよび／またはヌクレオチドからなっていて，医薬的に許容される補助剤および／または担体を適宜含有していてもよい。補助剤としては，免疫応答を強化し得るアジュバント，例えばフロイントの不完全アジュバント，水酸化アルミニウムゲルなどを使用することができる。また，担体としては，例えば，ＰＢＳ，蒸留水などの希釈剤，生理食塩水などを使用することができる。
この発明の医薬組成物は，その使用形態に応じて，例えば，経口，静脈投与や皮下投与などの非経口または経皮経路で投与することができる。その剤形としては，例えば，錠剤，顆粒剤，ソフトカプセル剤，ハードカプセル剤，液剤，油剤，乳化剤などが挙げられる。かかる医薬組成物の投与量は，投与する患者の症状などにより，適宜変動し得るが，一般的には，成人に対して１日当たり，該ペプチド量として０．１〜１０ｍｇであるのがよく，投与間隔としては数日もしくは数ヶ月に１回投与するのがよい。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００３−３３０２５８号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
【実施例】
この発明を実施例によりさらに詳細に説明する。ただし，これらの実施例はこの発明をより具体的に説明するために例示的に示したものであり，この発明は以下の実施例により限定されるものではない。
なお，以下の実施例において使用したアミノ酸の略語は次の通りである。
Ａはアラニン，Ｃはシステイン，Ｄはアスパラギン酸，Ｅはグルタミン酸，Ｆはフェニルアラニン，Ｇはグリシン，Ｈはヒスチジン，Ｉはイソロイシン，Ｋはリジン，Ｌはロイシン，Ｍはメチオニン，Ｐはプロリン，Ｒはアルギニン，Ｓはセリン，Ｔはトレオニン，Ｖはバリン，Ｙはチロシンをそれぞれ意味する。
［実施例１］：ＨＣＶ感染患者の血清におけるＨＣＶペプチドと反応性を有するＩｇＧの検出
ペプチド
ＨＣＶゲノタイプ１ｂタンパク質の保存領域からのＨＬＡ−Ａ２結合性モチーフまたはＨＬＡ−Ａ２４結合性モチーフを有する合成ペプチドを使用した（表１）。ネガティブコントロールとして，ＨＬＡ−Ａ２結合性モチーフを有するＨＩＶ由来ペプチドを使用した。これらのペプチドはいずれも市販品を使用し，その純度は逆相高圧液体クロマトグラフィーで分析したところ９０％以上であった。
ＥＬＩＳＡ
血清中のペプチド特異的ＩｇＧはＥＬＩＳＡによって測定した。まず，各ペプチドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し，−８０℃で保存した。ペプチドを，クロスリンカーとしてのジサクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）を含む０．１Ｍ炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム溶液で希釈した。ＥＬＩＳＡプレートにペプチド２０μｇ／ウェルで４℃で一夜反応させて結合させた。ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し，プレートをブロックエース（登録商標）でブロックして４℃で一夜放置した。血漿または血清サンプルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅで１００倍，２００倍および４００倍にそれぞれ希釈し，得られたサンプルを各ウェル当り１００μｌずつ添加した。サンプルを３７℃で２時間培養した後，プレートをＰＢＳＴで９回洗浄し，１０００倍希釈ウサギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）を各ウェル当り１００μｌ添加して３７℃で２時間培養した。さらに，ＰＢＳＴで９回洗浄した後，１００倍希釈マウス抗ウサギＩｇＧと共有結合させた西洋ワサビパーオキシダーゼ・デキストランポリマーを各ウェル当り１００μｌ添加し，プレートを室温で４０分間培養した。プレートを洗浄した後，テトラメチルベンジジン基質溶液を各ウェル当り１００μｌ添加し，２．０Ｍリン酸を添加して反応を停止させた。カットオフ値を，健常者の光密度コントロールの平均±３ＳＤとして算出した。
ペプチド特異的ＩｇＧの吸収ならびに溶出
各ウェル当り１００μｌの血漿または血清サンプルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（登録商標）で希釈し，プレートのウェル中に固定したペプチド（各ウェル当り２０μｇ）に３７℃で２時間吸収させた。この操作を３回繰り返した後，上清中のペプチド特異的ＩｇＧレベルをＥＬＩＳＡで測定した。初回の吸着でペプチド固定プレートに結合させた抗体を，各ウェル当り３０μｌの５Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭクエン酸バッファ（ｐＨ３．０）（１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（ｐＨ７．５）で中和した）によって溶出し，溶出した分画中のペプチド特異的ＩｇＧレベルをＥＬＩＳＡで測定した。
ペプチド特異的ＣＴＬアッセイ
ペプチド特異的ＣＴＬの検出に使用する方法は当該技術分野において慣用されている方法である。ＰＢＭＣをウェル当たり１ｘ１０５個の細胞になるようにＵ底型９６ウェルマイクロカルチャープレートの各ウェルに入れ，１０μＭのペプチドとともに２００μｌの培地中で培養した。この培地の組成は，４５％ＲＰＭＩ−１６４０と，４５％ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）と，１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）と，１００Ｕ／ｍｌのインターロイキン２（ＩＬ−２）と，１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液と，からなっている。培養３日目，６日日，そして９日目にそれぞれ培地半分を除いて，対応するペプチド（２０μｇ／ｍｌ）を含んだ新しい培地と入れ替えた。培養１２日日に，培養した細胞を採取し，対応するペプチドまたはネガティブコントロールとしてのＨＩＶペプチドのいずれかを予め付着させたＣＩＲ−Ａ２４０２細胞またはＴ２に応答するインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の産生能を試験した。各ペプチドに対して４個のウェルを使用し，アッセイは２回行った。ＨＩＶペプチドに応答するバックグラウンドＩＦＮ−γ産生は得られたデータ値から差し引いた。抑制アッセイには，ペプチド反応性ＣＴＬは，ＣＤ８単離キットを用いて精製し，そのペプチド特異的ＩＦＮ−γ産生を，２０μｇ／ｍｌの抗ＨＬＡクラスＩ（Ｗ６／３２，ＩｇＧ２ａ）モノクローナル抗体，抗ＣＤ８（Ｎｕ−Ｔｓ／ｃ，ＩｇＧ２ａ）モノクローナル抗体または抗ＨＬＡクラスＩＩ（Ｈ−ＤＲ−１，ＩｇＧ２ａ）モノクローナル抗体のいずれかの存在下において測定した。バックグラウンドＩＦＮ−γ産生は得られたデータ値から控除した。
統計
値は平均＋／−ＳＤとして示している。統計的分析は，マン・ウィットニー Ｕ検定（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ）試験およびカイ２乗試験を用いて行った。Ｐ＜０．０５値は統計学的に有意であると考えられる。
ＨＣＶペプチドに対する抗体の検出
ＨＣＶ感染患者１２名と健常者（ＨＤ）１０名の血清について６２種類の各ペプチドに対して反応するＩｇＧレベルを測定した（表１）。各ペプチドに対する抗体の陽性率を表１に示した。その結果，ＨＣＶ感染患者の血中ＩｇＧと高率に反応し，かつ健常人血清とはほとんど反応しないペプチドが複数見い出された。
例えば，Ｎｏ３のＮＳ５Ａ−２１３２（ＨＣＶのＮＳ５Ａタンパクの２１３２番から２１４０番に相当，以下同様に省略する），Ｎｏ１１（ＮＳ３−１２６６），Ｎｏ１２（Ｅ２−４８８），Ｎｏ１３（Ｅ１−２１３），Ｎｏ２２（ＮＳ２−９４７），Ｎｏ２５（ＮＳ３−１０８１），Ｎｏ３２（Ｃ−１７６），Ｎｏ３８（Ｃ−１７３），Ｎｏ４０（Ｃ−３５），Ｎｏ６２（ＮＳ５Ｂ−２９９０）などが挙げられる。代表的なＥＬＩＳＡ法によるＨＣＶ感染患者の血中ＩｇＧ測定結果を図１および図２に示す。
図１に示した患者血清ではＣ−３５に対するＩｇＧ抗体が検出された。
図２の（Ａ）−（Ｄ）に示した４名の患者血清中にはそれぞれＮＳ５Ａ−２１３２（Ａ），ＮＳ３−１０８１（Ｂ），Ｅ２−４８８およびＥ１−２１３（Ｃ），Ｃ−１７６およびＣ−１７３（Ｄ）反応性ＩｇＧ抗体が検出された。これらのペプチド反応性抗体のペプチド特異性は，吸収ならびに溶出試験によって確認した。
図１に示した患者血清中のＣ−３５ペプチド反応性抗体の吸収・溶出実験結果を代表例として図３に示す。この抗体はＣ−３５により吸収されたが，無関係なペプチドであるＮＳ５Ａ−２２５２によっては吸収されなかった（図３上段）。さらにこの抗体はＣ−３５吸着画分より溶出された（図３下段）。
表１の中でもＣ−３５ペプチド反応性抗体はＨＣＶ感染者では１００％，一方，健常人では０％と，ＨＣＶ特異性が高かった。ＨＣＶのＣ−３５ペプチドの配列は種々のウイルス，たとえばＨＩＶ−１のｔｅｔタンパク（５４−５８番のアミノ酸配列）やｅｎｖタンパク（５−９，１５８−１６２，７１７−７２７のアミノ酸配列）と部分的に相同性を示した。また，ＨＴＬＶ−Ｉの種々のタンパク（ｐｏｌ ７２４−７５５，ｒｅｘ ５−９，ｒｅｘ ３１０−３１３，ｔａｘ ７０−７４など）とも相同性を示した。そこで，Ｃ−３５ペプチド反応性抗体をＨＣＶ感染症関連疾患６０例（慢性Ｃ型肝炎２２例，肝硬変２０例，肝癌１８例），Ｂ型肝炎ウイルス感染者２４例，Ｂ型肝炎ウイルスワクチン接種者１０例，健常人２７例，自己免疫疾患患者２２例，ＨＴＬＶ−Ｉ感染者１０例，およびＨＩＶ感染者３例，計１５６例について２重盲検法で調べた。その結果を表２に示す。この結果より，Ｃ−３５ペプチド反応性抗体のＨＣＶ特異性および検出率はそれぞれ８８．５％および９３．３％であった。
ペプチド特異的ＣＴＬ活性の誘発
ＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチド６種（Ｎｏ３，１２，１３，２５，３２，３８）およびＨＬＡ−Ａ２結合ペプチド１８種（Ｎｏ４０からＮｏ５７まで）をＨＬＡ−Ａ２４もしくはＨＬＡ−Ａ２陽性のＨＣＶ感染患者各５名の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）と培養した。コントロールとして該ＰＢＭＣをＨＩＶペプチドと培養した。そして，それらの培養ＰＢＭＣについて，対応するペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞またはＴ２細胞に応答するＩＦＮ−γ産生能を調べた。その結果，ＨＬＡ−Ａ２４結合ペプチド６種（Ｎｏ３，１２，１３，２５，３２，３８）は，ＨＬＡ−Ａ２４陽性ＨＣＶ患者１０名のＰＢＭＣからＣＴＬを誘導することができた（図４）。また，ＨＬＡ−Ａ２４結合性ペプチドによる（Ｂ）ＨＣＶ由来のＨＬＡ−Ａ２結合性ペプチド（Ｎｏ４０からＮｏ５７）によるＨＬＡ−Ａ２陽性ＨＣＶ患者５名のＰＢＭＣからＣＴＬを誘導することができた（図５）。
さらに，ペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害活性は５１Ｃｒ遊離試験によって確認した。その代表的結果を図６、および図７に示す。
図６は，ＨＣＶ由来のＨＬＡ−Ａ２４結合性ペプチド（Ｎｏ３，１２，１３，２５，３２，３８）によりＨＬＡ−Ａ２４陽性ＨＣＶ患者ＰＢＭＣから誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す。誘導ペプチドを付着させたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞（図中ではＣ１ＲＡ２４０２と表示）に対する細胞傷害作用はコントロールのＨＩＶペプチドを付着させたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞（図中ではＣ１ＲＡ２４０２ＨＩＶと表示）に比べ有意に高かった。
図７は，ＨＣＶ由来のＨＬＡ−Ａ２結合性ペプチド（Ｎｏ４０，４１）によりＨＬＡ−Ａ２陽性ＨＣＶ患者末梢血ＰＢＭＣから誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示す。誘導ペプチドを付着させたＴ２細胞（図中ではＴ２と表示）に対する細胞傷害作用はコントロールのＨＩＶペプチドを付着させたＴ２細胞（図中ではＴ２ＨＩＶと表示）に比べ有意に高かった。
その結果，これらのＰＢＭＣは，対応するペプチド（ネガティブコントロールとしてのＨＩＶペプチド以外）を予め装填したＣ１Ｒ−Ａ２４０２およびＴ２細胞に対して有意差レベルの細胞傷害性を示した。
この細胞傷害性のＨＬＡクラスＩ拘束性は抗ＣＤ８モノクローナル抗体を用いた抑制試験によって確認した（図８）。図８は，ＣＴＬ活性の抗ＣＤ８抗体による抑制の代表例を示す。ＨＣＶ由来のＨＬＡ−Ａ２結合性ペプチド（Ｎｏ４０）によりＨＬＡ−Ａ２陽性ＨＣＶ患者ＰＢＭＣから誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性は抗ＣＤ８抗体により抑制されたが，抗ＣＤ４やコントロールの抗ＣＤ１４抗体では抑制されなかった。
［実施例２］：ＨＬＡ−Ａ２４陽性ＨＣＶ感染患者の血清におけるＨＣＶペプチドと反応性を有するＩｇＧの検出
被験者
さらに広範に，ＨＬＡ−Ａ２４陽性のＨＣＶ感染患者において，ＨＣＶペプチドと反応性を有するＩｇＧの検出を行った。６０名のＨＣＶ１ｂ＋患者は，第２世代または第３世代イムノアッセイ試験により判定して，抗ＨＣＶ抗体（Ａｂ）についてセロポジティブであった。患者の血清中のＨＣＶのゲノタイプはＲＴ−ＰＣＲにより判定した。血清サンプリングの際の患者の診断は，生化学的分析，超音波検査，コンピュータ連動断層撮影，および組織学的所見により行った。診断の結果は以下のとおりである：慢性肝炎（ＣＨ，ｎ＝２４），肝硬変（ＬＣ，ｎ＝１８），および肝細胞癌（ＨＣＣ，ｎ＝１８）。陰性対照としては，正常な肝機能を有し，肝炎ウイルスの病歴を有しない２０名の健康なドナー（ＨＤ）からの血清サンプルを用いた。
ペプチドおよびペプチド反応性抗体の測定
ＨＣＶ１ｂタンパク質のよく保存された領域に由来し，ＨＬＡ−Ａ２４分子との高い結合スコア（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）に基づいて選択された４４種の合成ペプチドを用いた。陰性対照としてはＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフを有するＨＩＶ由来ペプチド（ＲＹＬＲＤＱＱＬＬＧＩ（配列番号６３））を用いた。結合スコアおよび配列を表３に示す。血清ＩｇＧに対するペプチドの反応性についてのスクリーニング用には，ＢｉｏＳｙｎｔｅｈｓｉｓ（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）またはＳｙｎＰｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）からこれらの脱塩等級（＞７０％）ペプチドを購入した。その後の実験には精製したペプチド（＞９０％）を用いた。ペプチド特異的ＩｇＧの血漿レベルは，酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。血漿サンプルにおける抗ペプチドＩｇＧの特異性の試験は，ペプチド反応性ＩｇＧの吸収および溶出により行った。
ペプチド特異的ＣＴＬのアッセイ
ペプチド特異的ＣＴＬ前駆体細胞の検出に用いた方法はＨｉｄａら（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２００２；５１：２１９−２２８）に記載されるとおりである。阻害試験のためには，２０μｇ／ｍｌの抗ＨＬＡクラスＩ（Ｗ６／３２，ＩｇＧ２ａ），抗ＣＤ８（Ｎｕ−Ｔｓ／ｃ，ＩｇＧ２ａ），抗ＣＤ４（Ｎｕ−Ｔｈ／ｉ，ＩｇＧ１ｂ），および抗ＨＬＡ−クラスＩＩ（Ｈ−ＤＲ−１，ＩｇＧ）モノクローナル抗体を用いた。
ＮＳ５Ａ遺伝子でトランスフェクションした細胞に対するペプチド刺激ＰＢＭＣのＣＴＬ活性
ＮＳ５Ａ，ＨＬＡ−Ａ２４０２，およびＨＬＡ−Ａ２６０１のｃＤＮＡは，それぞれＨｕｈ７（ＮＮＵ５０−１）細胞，Ｃ１Ｒ−Ａ２４０２細胞，およびＫＥ４−ＣＴＬ細胞からＲＴ−ＰＣＲにより得て，発現ベクターｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にクローニングした。Ｈｕｈ７（ＮＮＵ５０−１）細胞株は，ＨＣＶ１ｂに感染した細胞株に由来するレプリコン細胞であり，ＮＳ３からＮＳ５Ｂのタンパク質を発現する（Ｋｉｓｈｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２００２；２９３：９９３−９９９）。次に，１００ｎｇのＮＳ５Ａ，ＨＬＡ−Ａ２４０２またはＮＳ５Ａ，およびＨＬＡ−Ａ２６０１ｃＤＮＡ（陰性対照として）を，０．６μｌのＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含む１００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で混合し，３０分間インキュベートした。次に混合物１００μｌをＣＯＳ−７細胞（１×１０４細胞）に加え，これを６時間インキュベートした。２０％ＦＣＳを含む１００μｌのＲＰＭＩ−１６４０培地を混合物に加え，ＣＯＳ−７細胞を２日間培養し，ＮＳ５Ａ ２１３２−２１４０刺激ＰＢＭＣ（２ｘ１０５細胞／ウェル）を加えた。１８時間インキュベートした後，１００μｌの上清を取り出し，ＩＦＮ−γ濃度を３ウェルのアッセイでＥＬＩＳＡにより測定した。安定なトランスフェクタント細胞株を作製するために，ｐＣＲ３．１−ＮＳ５ＡまたはｐＣＲ３．１−ＨＬＡ−Ａ３１０１（陰性対照）のいずれかを，Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲＡＤ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を用いて，Ｃ１Ｒ−Ａ２４０２細胞にエレクトロポレーションによりトランスフェクションした。これらの細胞をゲネテシン（Ｇ４１８）の存在下で３０−４０日間培養し，ゲネテシン耐性細胞を回収した。トランスフェクタント中のＮＳ５Ａタンパク質の発現は，抗ＮＳ５ポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いるウエスタンブロット分析により行った。
増殖阻害および抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
Ｈｕｈ７細胞株を，平底９６ウェルマイクロカルチャープレートのウェル中で種々の血清の存在下で２４，４８，および７２時間インキュベートした。インキュベート後，細胞計数キット−８（１０μｌ／ウェル）（Ｄｏｊｉｎｄｏ，Ｊａｐａｎ）でＨｕｈ７細胞を数えた。ＡＤＣＣアッセイのためには，ＨＬＡ−Ａ２４陽性のＨＤから新たに単離したＰＢＭＣを，種々の患者またはＨＤ（陰性対照として）からの非働化血清（５６℃，３０分間）を含む１０％ＦＣＳおよびＲＰＭＩ−１６４０培地で１．５時間プレインキュベートした。Ｃ１Ｒ−Ａ２４０２細胞およびＣ１Ｒ細胞（陰性対照として）をＮＳ５Ａ ２１３２−２１４０ペプチド（１０μＭ）とともに２時間インキュベートし，Ｎａ２５１ＣｒＯ４で１．５時間放射性標識し，洗浄し，標的細胞として用いた。ペプチド刺激ＰＢＭＣを，９６Ｕ底マイクロカルチャープレートのウェル中で，４０，２０，および１０対１のエフェクター対標的細胞（Ｅ／Ｔ）比で，標的細胞とともにインキュベートした。３７℃で６時間インキュベートした後，無細胞上清を回収してＡＤＣＣ活性を測定した（Ｓｈｏｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００４；９０：１５６３−１５７１）。
統計学
統計学的分析は，スチューデントｔ検定およびマン・ウィットニー Ｕ検定を用いて行った。Ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意とした。
ＨＣＶ−ペプチドに対する液性応答の検出
ペプチドに対する液性応答をスクリーニングするために，ＨＣＶ−１ｂに感染した１２名の患者の血漿において，４４種のペプチドに対するそれぞれのＩｇＧ反応性のレベルを測定した。１０名のＨＤの血漿を陰性対照として用いた。ペプチド反応性ＩｇＧのレベルは，連続希釈した血漿サンプルについてＥＬＩＳＡにより測定し、各サンプルの吸光度（ＯＤ）値を示した。１：１００の血漿希釈でのこれらのペプチドのカットオフ値を０．１８ＯＤ｛１０名のＨＤの平均（０．０８）＋２ＳＤ（０．０５ｘ２）｝とした。ＮＳ５Ａ−２１３２，Ｃ−１７６，Ｅ２−４８８，Ｅ１−２１３，Ｃ−１７３，およびＮＳ３−１０８１ペプチドに対する有意なレベル（１：１００の血清希釈で＞０．１８ＯＤ）のＩｇＧ反応性は，１２名の患者の血漿中，それぞれ１２，１１，１０，９，８，および５名で検出できた（図９）。予測されたように，これらのペプチドのいずれも，１０名のＨＤからの血漿に対しては反応性を有していなかった。ペプチド特異的ＩｇＧに対するペプチドの反応性を表３にまとめる。
９０％以上の純度を有する上述の６種の各ペプチド，ならびに陰性対照ペプチドを，６０名のＨＣＶ１ｂ＋患者（ＣＨ，ｎ＝２４；ＬＣ，ｎ＝１８；およびＨＣＣ，ｎ＝１８）ならびに２０名のＨＤの血清からの各血清サンプルに対する反応性について試験した（図１０）。
これらの各サンプルについて１００：１希釈の値をプロットした。ＩｇＧ（ＯＤ値）の平均±ＳＤは以下のとおりであった：ＮＳ５Ａ−２１３２（０．４８±０．３６），Ｅ２−４８８（０．１８±０．１９），Ｅ１−２１３（０．１０±０．２１），ＮＳ３−１０８１（０．０３６±０．１４），Ｃ−１７６（０．０９±０．１４）およびＣ−１７３（０．０４±０．１３）。＊はマン・ウィットニー Ｕ検定によるＰ＜０．０５を示す。ＮＳ５Ａ−２１３２，Ｅ２−４８８，Ｅ１−２１３，またはＣ−１７３に対して反応性を有するＩｇＧの平均レベルは，ＨＤのものより統計学的に有意に高かったが，ＮＳ３−１０８１またはＣ−１７６の場合にはそうではなかった。ＮＳ５Ａ−２１３２，Ｅ２−４８８，Ｅ１−２１３，Ｃ−１７３，ＮＳ３−１０８１０，およびＣ−１７６ペプチドに対して有意なレベルの反応性を示すＩｇＧ（１：１００の血清希釈において＞０．１０１ ＯＤ）が，試験した６０名の患者の血漿のそれぞれ５７（９５％），４４（７３％），２８（４７％），２３（３８％），２１（３５％），および１７（２８％）において検出できた。これに対し，２０名のＨＤの血清はすべて，有意なレベルのＩｇＧは検出できなかった（図１０）。
次に，これらの各ペプチドに反応性を有するＩｇＧのペプチド特異性を，吸収および溶出試験により確認した。各血清サンプルを，対応するペプチドまたは無関係なペプチド（ＨＩＶ；陰性対照として用いる）のいずれかに，３７℃で３回吸収させ，ＥＬＩＳＡによりペプチド特異的ＩｇＧを測定した（図１１）。溶出試験では，第１回の吸収の後にペプチド固定化プレートに結合したＩｇＧ分子を対応するペプチドまたは無関係なペプチドで溶出した後に，ＥＬＩＳＡにより溶出画分中のペプチド特異的ＩｇＧのレベルを測定した。代表的結果について３回の測定のＯＤ値の平均±ＳＤが図示される（図１２）。＊は両側スチューデントｔ検定によりＰ＜０．０５を示す。
予測されたように，６種のペプチドに対する各ＩｇＧはすべて対応するペプチドにより吸収されたが，無関係なペプチド（ＨＩＶペプチド）により吸収されなかった。さらに，このＩｇＧは，対応するペプチドによって結合画分から溶出されたが，無関係なペプチドによっては溶出されなかった。これらの結果を合わせると，各ペプチドに反応性を有するＩｇＧはＨＣＶ１ｂ由来ペプチドに対して特異的であることが示唆される。
ペプチド特異的細胞性応答の誘導
ＨＣＶ１ｂに感染しているＨＬＡ−Ａ２４陽性の患者（ｎ＝１２，６名のＣＨ，３名のＬＣ，３名のＨＣＣ）およびＨＣＶに感染していないＨＬＡ−Ａ２４陽性のＨＤ（ｎ＝５）からのＰＢＭＣを，６種の各ペプチド（純度＞９０％）または対照ＨＩＶペプチドとともに１３日間培養し，対応するペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞に応答したＩＦＮ産生について調べた。ＨＬＡ−Ａ２４陽性ＨＣＶ１ｂ＋の患者（ｎ＝１２）およびＨＤ（ｎ＝５）からのＰＢＭＣを６種のペプチドで，４つのウェル（１５ｘ１０４／ウェル）で刺激した。培養の第１４日に，各ウェルからのペプチド刺激ＰＢＭＣ（８０−１２０ｘ１０４／ウェル）を別々に回収し，等量に４つに分割した。そのうち２つを，対応するペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞に応答してＩＦＮ−γを産生する能力について別々に試験した。残りの２つは，陰性対照ペプチド（ＨＩＶ）を用いた細胞で試験した。ＨＩＶペプチド（＜５０ｐｇ／ｍｌ）に応答して産生されたＩＦＮ−γをバックグラウンドとして差し引いた。＊は両側スチューデントｔ検定によりＰ＜０．０５を示す。
Ｃ−１７３，Ｃ−１７６，Ｅ１−２１３，Ｅ２−４８８，ＮＳ３−１０８１，およびＮＳ５Ａ−２１３２のＨＣＶペプチドは，１２名の患者のそれぞれ１，３，４，６，２，および７名（図１３，１４），および５名のＨＤのそれぞれ０，０，１，１，１，および１名から，有意なレベル（ｐ＜０．０５）のＩＦＮ−γ産生を誘導した（データ示さず）。これらの６種のペプチドのうち，ＮＳ５Ａ−２１３２ペプチドは，１２名の患者の７名からのＰＢＭＣおよび試験した６０名のＨＣＶ１ｂ＋患者の５７名の血清において，細胞性免疫および液性免疫により認識された。
これらのペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害性を，６時間の５１Ｃｒ遊離アッセイにより確認した（図１５）。ＩＦＮ−γ産生アッセイ（上述）によりポジティブの応答を示すペプチド刺激ＰＢＭＣを，インビトロでＩＬ−２のみで培養して増殖させた。次に，標準的な６時間の５１Ｃｒ遊離アッセイにより，対応するペプチドまたはＨＩＶペプチド（陰性対照）でパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞に対する細胞傷害性について，３つの異なるＥ／Ｔ細胞比で試験した。代表的な結果を図示する。値は特異的溶解の％の平均±ＳＤで表す。＊は両側スチューデントｔ検定によりＰ＜０．０５を示す。ＮＳ５Ａ−２１３２，Ｅ２−４８８，またはＥ１−２１３ペプチドで刺激したＰＢＭＣは，対応するペプチドを予め負荷したＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞に対して有意なレベルの細胞傷害性を示したが，ＨＩＶペプチドでは示さなかった（図１５）。
図１５に示される実験において用いたペプチド刺激ＰＢＭＣを，２０μｇ／ｍｌの抗ＨＬＡ−クラスＩ（Ｗ６／３２，ＩｇＧ２ａ），抗ＨＬＡ−クラスＩＩ（Ｈ−ＤＲ−１，ＩｇＧ２ａ），抗ＣＤ８（Ｎｕ−Ｔｓ／ｃ，ＩｇＧ２ａ），および抗ＣＤ４（Ｎｕ−Ｔｈ／ｉ，ＩｇＧ１）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の存在下で，対応するペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞に対する細胞傷害性について試験した。抗ＣＤ１４（ＪＭＬ−Ｈ１４，ＩｇＧ２ａ）ｍＡｂを陰性対照として用いた。３つの異なるＥ／Ｔ比で６時間の５１Ｃｒ遊離アッセイを行った。値は特異的傷害の％の平均±ＳＤで表す（図１６）。＊は両側スチューデントｔ検定によりＰ＜０．０５を表す。
３種のペプチドのそれぞれでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞に対する細胞傷害性は，抗ＨＬＡ−クラスＩ（Ｗ６／３２）またはＣＤ８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）により阻害されたが，試験した他のｍＡｂのいずれによっても阻害されなかった。このことは，ペプチド特異的細胞傷害性が，主としてＣＤ８＋Ｔ細胞によりＨＬＡ−クラスＩ拘束性で媒介されることを示す（図１６）。これに対し，残りの３種のペプチド（Ｃ−１７３，Ｃ−１７６，またはＮＳ３−１０８１）で刺激したＰＢＭＣではそのような細胞傷害性は検出できなかった（データ示さず）。
次に，ＮＳ５ＡおよびＨＬＡ−Ａ２４０１遺伝子で一過性にコトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞を標的細胞として用いることにより，ＮＳ５Ａ−２１３２ペプチド刺激ＰＢＭＣが自然にプロセスされて生じたペプチドを認識するか否かを調べた。陰性対照としては，ＮＳ５ＡおよびＨＬＡ−Ａ２６０１遺伝子で一過性にコトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞を用いた。患者＃１および＃２からのＮＳ５Ａ−２１３２ペプチド刺激ＰＢＭＣが，ＮＳ５ＡおよびＨＬＡ−Ａ２４０１遺伝子で一過性にコトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞を標的細胞として認識してＩＦＮ−γを産生する活性について試験した。陰性対照としては，ＮＳ５ＡおよびＨＬＡ−Ａ２６０１遺伝子で一過性でコトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞を用いた。値は，Ｅ／Ｔ比２０：１での３回のアッセイにおけるＩＦＮ−γ産生の％の平均±ＳＤを表す（図１７）。＊は両側スチューデントｔ検定によりＰ＜０．０５を示す。
予測されたように，ＣＴＬ活性を示した（図１３）患者＃１および＃２からのペプチド刺激ＰＢＭＣは，ＮＳ５ＡおよびＨＬＡ−Ａ２４０１遺伝子でコトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞を認識して，有意な量のＩＦＮ−γを産生した（図１７）。これに対し，これらのＰＢＭＣは，陰性対照として用いたＮＳ５ＡおよびＨＬＡ−Ａ２６０１遺伝子を有するＣＯＳ−７細胞には反応しなかった。また，ＣＴＬ活性を示さなかった他の２名の患者（＃３および＃４）からのペプチド刺激ＰＢＭＣも，ＮＳ５ＡおよびＨＬＡ−Ａ２４０１遺伝子でコトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞の認識により有意な量のＩＦＮ−γを産生しなかった（データ示さず）。
次に，ＮＳ５Ａ遺伝子で安定にトランスフェクトし標的細胞として用いたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞に対する細胞傷害性を試験した。ＮＳ５Ａ遺伝子で安定にトランスフェクトしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞におけるＨＬＡ−Ａ２４分子の発現，およびＨＬＡ−Ａ３１遺伝子（陰性対照）で安定にトランスフェクトしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞におけるＨＬＡ−Ａ３１分子の発現を，ＦＡＣＳｃａｎを用いるフローサイトメトリー分析により確認した（図１８）。
次に，ＮＳ５Ａ遺伝子で安定にトランスフェクトしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞を標的細胞とする細胞傷害性を６時間の５１Ｃｒ遊離アッセイにより試験した。陰性対照遺伝子（ＨＬＡ−Ａ３１０１）で安定にトランスフェクトしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞を陰性対照として用い，ＮＳ５Ａ−２１３２ペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞を陽性対照として用いた。３つの異なるＥ／Ｔ比で６時間の５１Ｃｒ遊離アッセイを行った。値は特異的溶解の％の平均±ＳＤで表す。＊は両側スチューデントｔ検定によりＰ＜０．０５を示す。ＮＳ５Ａ−２１３２ペプチドで刺激したＰＢＭＣは，陰性対照遺伝子でトランスフェクトしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞に対する細胞傷害性と比較して，ＮＳ５Ａ遺伝子でトランスフェクトしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞，および対応するペプチドで予めパルスしたトランスフェクトしていないＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞の両方に対して，より高いレベルの細胞傷害性を示した（図１９）。これらの結果は，ＮＳ５Ａ−２１３２ペプチド刺激ＰＢＭＣがＨＣＶ１ｂ＋細胞のＨＬＡ−Ａ２４０２分子上の自然にプロセスされて生じたペプチドを首尾よく認識したことを示唆する。
抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧについてのさらなる研究
抗ペプチドＩｇＧの生物学的役割の可能性をさらによく理解するために，吸収および溶出アッセイにより，抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧが全ＮＳ５タンパク質を認識するか否かを調べた。ＮＳ５Ａ−２１３２およびＨＩＶペプチドをそれぞれ陽性対照および陰性対照として用いた（吸収試験および溶出試験の詳細は上述を参照）。その結果，抗ペプチドＩｇＧは，全ＮＳ５タンパク質では吸収も溶出もされなかった（図２０）。このことは，このペプチドＩｇＧは全ＮＳ５タンパク質とは反応しなかったことを示唆する。
次に，Ｈｕｈ７細胞を，患者血清（血清が高レベルの抗ＮＳ５Ａ−２１３２活性を有する２名のＨＣＶ１ｂ＋患者からの血清）の存在下で３日間までインキュベートした。陰性対照としては，２名のＨＤからの血清およびＦＣＳを用いた。生存可能なＨｕｈ７（ＮＮＵ５０−１）細胞の数を細胞計数キット８（１０μｌ／ウェル）で数え，３回のアッセイの平均値を示す。試験した血清はいずれも，これらの培養条件下ではＨｕｈ７（ＮＮＵ５０−１）細胞の増殖を阻害しなかった（図２１）。また，抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧがＡＤＣＣ活性を媒介する能力を有するか否かを調べた。ＨＬＡ−Ａ２４陽性のＨＤから新たに単離したＰＢＭＣを，上述の４種の非働化血清の存在下で，このペプチドで予めパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４０２細胞に対する細胞傷害性について試験した。しかし，これらの条件では試験した血清のいずれもＡＤＣＣ活性を示さなかった（図２２）。
［実施例３］．ＨＣＶ感染者の予後の予測
被験者
血清は，１９９５年から２００２年のコホート研究における，ＨＣＶ関連疾患を有する３３名の患者から得た。３３名の患者のフォローアップ調査の結果は表４に示される。慢性肝炎（ＣＨ，ｎ＝６８），肝硬変（ＬＣ，ｎ＝４３），および肝細胞癌（ＨＣＣ，ｎ＝５２）を有する患者の血清も分析に用いた。これらの患者は，最初の血清サンプリングの際に，生化学および組織学的所見，超音波検査，およびコンピュータ連動断層撮影により診断した。抗ＨＣＶ抗体は，化学発光酵素イムノアッセイ（ＣＬＥＩＡ）キット（Ｌｕｍｉｐｕｌｓｅ ＩＩ ＨＣＶ，Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）により，または第２世代もしくは第３世代酵素イムノアッセイ試験（ＳＲＬ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）により測定した。血清中のＨＣＶ−ＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲ（ＳＲＬ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて検出した。ＨＣＶゲノタイプは，患者の血清中のＨＣＶをＲＴ−ＰＣＲ（ＳＲＬ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で直接シークエンシングすることにより決定した。ＨＣＶ感染していない被験者からも血清を得た。これは，自己免疫疾患を有する２４名の被験者（全身性エリテマトーデスを有する６名の患者，ベーチェット病を有する１名の患者およびアトピー性皮膚炎を有する１７名の患者），Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の１７症例（ＨＢＶ表面抗原にポジティブ），ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を有する３名の患者，およびヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプＩ（ＨＴＬＶ−１）感染を有する１０症例を含む。陰性対照として，ＨＢＶの肝炎ウイルスまたはワクチン接種の履歴を有さず，正常な肝機能を有する３７名からの血清を試験した。
ペプチド
純度９０％以上の次の２つのペプチドは，ＢＩＯＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）から購入した；ＨＣＶ１ｂコアタンパク質３５−４４（ＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ（配列番号１）；ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬ活性を誘導することができる），およびＨＣＶ１ｂＮＳ５Ａタンパク質２１３２−２１４０（ＲＹＡＰＡＣＫＰＬ（配列番号２）；ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬ活性を誘導することができる）。陰性対照としては，ＨＬＡ−Ａ２結合モチーフ（ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ（配列番号６４））およびＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフ（ＲＹＬＲＤＱＱＬＬＧＩ（配列番号６３））を有するＨＩＶ由来ペプチドを用いた。
ペプチドに反応性を有する抗体の測定
ペプチド特異的ＩｇＧのレベルは，酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。簡単には，各ペプチドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し，−２０℃で保存した。化学架橋剤であるジサクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）（ＰＩＥＲＣＥ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を含む０．１Ｍ炭酸バッファで希釈したペプチド（２０μｇ／ウェル）をＥＬＩＳＡプレートに結合させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）でウェルを３回洗浄した。プレートをＢｌｏｃｋ Ａｃｅ（Ｙｕｋｉｊｉｒｕｓｈｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で４℃で一晩ブロッキングした。血清サンプルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−ＢｌｏｃｋＡｃｅで１００倍，２００倍，４００倍に希釈し，１００μｌ／ウェルのサンプルを各ウェルに加えた。３７℃で２時間インキュベートした後，プレートをＰＢＳＴで９回洗浄し，１００μｌ／ウェルの１０００倍希釈ウサギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）とともに３７℃で２時間インキュベートした。９回洗浄した後，１００μｌ／ウェルの１：１００希釈抗ウサギＩｇＧ結合西洋ワサビパーオキシダーゼ・デキストランポリマー（Ｅｎ Ｖｉｓｉｏｎ，ＤＡＫＯ）を各ウェルに加え，プレートを室温で４０分間インキュベートした。洗浄した後，１００μｌ／ウェルのテトラメチルベンチジン基質溶液（ＫＰＬ，Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ，ＵＫ）を加え，１．０Ｍのリン酸を加えることにより反応を停止させた。
統計学
統計学的分析は，χ２を検定を用いて行った。ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意であるとした。
交叉反応性，ＨＬＡ拘束性，およびゲノタイプ拘束性
ＨＣＶ１ｂ由来ペプチドに対して反応性を有する２つの抗体の交叉反応性を調べた。６０名のＨＣＶ患者，およびコホート研究に含まれていない患者（ＣＨ，ｎ＝２２，ＬＣ，ｎ＝２１，およびＨＣＣ，ｎ＝１７）の血清を，コアの３５−４４（Ｃ−３５）およびＮＳ５Ａの２１３２−２１４０（ＮＳ５Ａ−２１３２）のペプチドに対する反応性について調べた。自己免疫疾患を有する２４名の被験者，ＨＢＶ感染の１７症例およびＨＴＬＶ−１感染の１０症例からも血清を入手した。３７名のＨＤからの血清を陰性対照として用いた。連続希釈した血清サンプルのペプチド反応性ＩｇＧのレベルをＥＬＩＳＡにより測定した。各サンプルの吸光度（ＯＤ）の値を示した。１００：１の血清希釈でのＯＤの代表的な結果を示す。カットオフ値は０．０９３（ＨＤからのＯＤの平均＋２ＳＤ）に設定した。統計学的分析はχ２検定を用いて実施した。ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意とした。
その結果，ＨＣＶ陽性患者の５６／６０（９３．３％）において有意なレベルの抗Ｃ−３５ＩｇＧが検出され，３群（ＣＨ，ＬＣ，およびＨＣＣ患者）の間でＩｇＧレベルには有意な差がなかった（図２３）。ＨＴＬＶ−１患者を除き，他の群からの血清は抗Ｃ−３５抗体にポジティブではなかった。ＨＴＬＶ−１＋被験者の８／１０症例の血清において，低いが有意なレベルの抗Ｃ−３５ＩｇＧが検出された。患者の４５／６０（７５％）で有意なレベルの抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧが検出された。ＩｇＧレベルは，３群の間では，ＣＨ患者では高く，ＬＣでは中程度であり，ＨＣＣ患者では低かった（ｐ＜０．０５ｖｓＣＨ）（図２３）。他の群からの血清についても，試験した症例の大部分で抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧがポジティブであった。さらに，３／３７のＨＤの血清は抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧがポジティブであった。
次に，ＨＣＶ関連疾患を有する２９名の患者で，ＨＬＡ−クラスＩＡ表現型と，抗Ｃ−３５ＩｇＧまたは抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧのレベルとの間の相関を調べた。ＨＬＡ−クラスＩＡ表現型は標準的な血清学的方法により決定した。９名の患者はＨＬＡ−Ａ２陽性，１３名の患者はＡ２４陽性，および残りの７名の患者はＡ２陰性，Ａ２４陰性であった。抗Ｃ−３５および抗ＮＡ５Ａ ２１３２は，標準的ＥＬＩＳＡにより測定し，各患者の１００：１の血清希釈でのＯＤ値を図示した。いずれの抗体も，ＨＬＡ−クラスＩＡ表現型の相違にかかわらず，ＨＣＶ感染患者の大部分で検出された（図２４）。
次に，ＨＣＶ−１ｂ（ｎ＝２９），ＨＣＶ−２ａ（ｎ＝１６）およびＨＣＶ−２ｂ感染（ｎ＝３）を有する患者において，ＨＣＶゲノタイプと，抗Ｃ−３５ＩｇＧまたは抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧのレベルとの間の相関を二重盲検法で調べた。ＨＣＶゲノタイプは，患者の血清中のＨＣＶを直接シークエンスすることにより決定した。すべての被験者の１００：１希釈での結果を図２５に示す。抗Ｃ−３５および抗ＮＡ５Ａ ２１３２は，標準的なＥＬＩＳＡにより測定し，各患者の１００：１の血清希釈でのＯＤ値を図示した。カットオフ値は０．０９３（ＨＤからのＯＤの平均＋２ＳＤ）に設定した。
抗Ｃ−３５抗体は，それぞれ，２６／３０のＨＣＶ−１ｂ，１５／１５のＨＣＶ−２ａ，および３／３のＨＣＶ−２ｂ感染患者で検出された。同様に，抗ＮＳ５Ａ−２１３２抗体は，それぞれ，２３／３０のＨＶＣ１ｂ，１０／１６のＨＣＶ−２ａ，および３／３のＨＣＶ−２ｂ感染患者からの血清中で検出された（図２５）。これらの結果は，ＨＣＶ陽性患者においては，ＨＬＡ−クラスＩＡサブタイプの相違およびＨＣＶゲノタイプの相違にかかわらず，抗Ｃ−３５抗体および抗ＮＳ５Ａ−２１３２抗体の両方が検出されたことを示す。
以上の結果は，抗ＮＳ５Ａ−２１３２抗体のレベルはＨＣＶ感染個体の予後と相関するが，抗Ｃ−３５抗体は相関しないことを示唆する。
次に，ＣＨ（ｎ＝２４），ＬＣ（ｎ＝２２），ＨＣＣ（ｎ＝２６），ＨＤ（ｎ＝９）の血清を新たに用意し，抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧのレベルを測定した（図２６）。ＣＨ，ＬＣ，ＨＣＣおよびＨＤ群の平均±ＳＤはそれぞれ０．５１±０．２４，０．２７±０．２０，０．２６±０．２３，０．０８±０．０７であった。ＬＣおよびＨＣＣ患者における抗ＮＳ５Ａ−２１３２抗体のレベルはＣＨ患者より有意に低かったが（ｐ＜０．０５），ＨＤより高かった。これらの結果を標準的な第３世代アッセイにより測定した結果と比較するために，すべての血清について，市販のキット（第３世代アッセイ，ＳＲＬ）を用いて抗ＨＣＶ抗体のレベルを測定した。レベルは指数として示される（左カラム）。指数で示される抗ＨＣＶのレベルと抗ＮＳ５Ａ−２１３２のレベルとの間の相関は，右カラムに示される。第３世代アッセイにより測定した抗ＨＣＶ抗体のレベルは３群の間で有意に相違しなかった（ＣＨ；１０±２．７，ＬＣ；１１±１．４，ＨＣＣ；１１±１．１）（図２７）。さらに，これらの血清について，市販のキット（ＳＲＬ，Ｊａｐａｎ）を用いてＨＣＶ ＲＮＡレベルを測定した。ＨＣＣ患者のＨＣＶ ＲＮＡレベル（３６０±２６９．６）は，ＣＨ患者（６１０±３４７．３）またはＬＣ患者（６１０±２４６．４）より低かった（ｐ＜０．０５）（図２８）。しかし，抗ＮＳ５Ａ抗体のレベルとＨＣＶ ＲＮＡレベルとの間には明らかな相関はなかった（図２８）。
コホート研究の結果
抗ＮＳ５Ａ−２１３２抗体とＨＣＶ陽性患者の予後との相関を個々のレベルでさらに調べるために，１９９０年から２００２年に行われた，ＨＣＶに感染している住人を毎年スクリーニングするコホート研究からのサンプルについて２つの抗体の血清レベルを調べた。この研究のためには，１９９５年および２００２年に同じ個体から２回採取した３３名の患者からの合計６６の血清を用いた。１９９５年の時点におけるこれらの３３名の患者の診断は，ＣＨ（ｎ＝１７），ＬＣ（ｎ＝１），無症候性キャリア（ＡＳＣ）（ｎ＝４），およびＨＣＶ感染の過去の病歴（自然回復した個体）（ｎ＝１１）であり，２００２年の時点では，ＣＨ（ｎ＝１３），ＬＣ（ｎ＝４），ＨＣＣ（ｎ＝２），無症候性キャリア（ＡＳＣ）（ｎ＝１），およびＨＣＶ感染の過去の病歴（ｎ＝１３）であった。すなわち，７年間の間に，２６名の患者では疾患の進行が観察されなかったが，残りの７名の患者では進行が観察された（表４）。１９９５年および２００２年に１００：１の血清希釈で測定した各患者における抗Ｃ−３５抗体および抗ＮＳ５Ａ−２１３２ＩｇＧのＯＤ値を図２９に示す。予測されたように，３３症例の大部分においては，疾患の状態にかかわらず，１９９５年に測定した抗Ｃ−３５抗体のレベルと２００２年に測定したレベルとはほぼ等しかった。これに対し，１９９５年に測定した抗ＮＳ５Ａ抗体のレベルは，疾患が進行した７名の患者すべてにおいては２００２年に測定したときに減少していた。一方，疾患が進行しなかった２５症例の大部分において２００２年で測定した値とほぼ等しかった。疾患が進行した７名の患者の血清中の１９９５年の時点における抗ＮＳ５Ａ−２１３２抗体の中央値±ＳＤ（０．６７±０．１３）は，２００２年に測定した値（０．２７±０．１１）より有意に高かった（ｐ＜０．０５）。
次に，３３名の被験者を５つの群（ＣＨ，ＬＣ，ＨＣＣ，ＨＣＶ感染の過去の病歴［回復した個体］，およびＡＳＣ）に分け，２００２年における１００：１の血清希釈での２つの抗体のレベルをプロットした（図３０）。統計学的分析は，χ２検定を用いて行った。ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意とした。抗Ｃ−３５抗体のレベルは，ＣＨ，ＬＣ，およびＨＣＣではいずれも高く，治癒した個体では非常に低くなるか検出できなくなった。一方，抗ＮＳ５Ａ−２１３２抗体のレベルはＣＨ，回復した個体およびＡＳＣで高く，ＬＣで中程度であり，ＨＣＣ患者で最も低かった（ｐ＜０．０５ｖｓＣＨ）。
［実施例４］：ルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）法によるＨＬＡ−Ａ２４＋ＨＣＶ感染患者の血清におけるＨＣＶペプチドと反応性を有するＩｇＧの検出
ＥＬＩＳＡ法より感度が高いと考えられるルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）法を用いて、実施例１と同様にして、ＨＬＡ−Ａ２４＋ＨＣＶ感染患者の血清におけるＨＣＶペプチドと反応性を有するＩｇＧの検出を行った。
ペプチドの微小ビーズへの結合
ペプチドを、製造者の指示に従って各蛍光色素の含有量を識別コード（以下、カラーコード）化した微小ビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ社製、ｘＭＡＰ Ｍｕｌｔｉ−Ａｎａｌｙｔｅ ＣＯＯＨ Ｂｅａｄｓ）にそれぞれ次のようにして結合した。フィルタープレートの各ウェルにカラーコード化した未調製の微小ビーズを１００μｌずつ入れて吸引し、その後洗浄用緩衝液（リン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４±０．１）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（０．０５％ｖ／ｖ））で２回洗浄し各ウェルを同時に吸引した。次に０．１Ｍ ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ７．０）５０μｌを入れ、ＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩）（１ｍｇ／ｍｌ／０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０））を各ウェル１０μｌずつ添加した。数百μｌのペプチド（１ｍｇ／ｍｌ，０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０）をこの洗浄した微小ビーズと各ウェル内で混合した。その後ペプチドと混合した微小ビーズを、暗所で２０分間、室温で反応させた後、さらにＥＤＣ（１ｍｇ／ｍｌ／０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０））を各ウェル１０μｌずつ添加し、暗所で、２０分間室温で反応させる操作を２回繰り返した。余剰液を吸引後、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を各ウェル１００μｌずつ添加し、暗所で、１５分間室温で反応させた。次に、各ウェルのビーズを上記洗浄用緩衝液で３回洗浄し、ブロックエース（登録商標）に０．０５％アジ化ナトリウムを入れて調整した保存用溶液で回収した。
微小ビーズミックスの調製
各ウェルの微小ビーズを調製するときは、上記のようにカラーコード化した微小ビーズにペプチドを結合させて得たビーズ溶液をフィルタープレートの各ウェル当たり微小ビーズが約５０００個になるように入れて（各ウェル当たりビーズ１種類約１μｌ）調製する。また、このように調製した微小ビーズを１０種類等量で混ぜて、上記洗浄用緩衝液（ＰＢＳ、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（０．０５％ｖ／ｖ））で総量が約２５μｌになるように希釈してビーズミックスを調製した。
サンプルの調製
血清を使用した。血清を反応用緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４±０．１）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（０．０５％ｖ／ｖ）、牛胎児血清アルブミン（ＢＳＡ）１０ｍｇ／ｍｌ）を用いて１００〜１０００倍希釈した血清希釈液をそれぞれ１００μｌ調製した。
抗ペプチド抗体測定
ビオチン化二次抗体としては、ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ガンマ鎖特異的）を上記反応用緩衝液で希釈して使用した。蛍光色素標識ストレプトアビジンとしては、ＰＥ（フィコエリスリン）で標識したストレプトアビジン（ＳＲＰＥ）１ｍｇ／ｍｌを上記反応用緩衝液で２０μｌに希釈（１／５０希釈）して使用した。
フィルタープレートの各ウェルに上記洗浄用緩衝液を１００μｌ入れ、続いて吸引除去した。この洗浄操作を２回行った。次に、各ウェルに上記ビーズミックスを２５μｌ入れた９６ウェルのフィルタープレートを該洗浄用緩衝液で２回洗浄した。洗浄後、全てのウェルに上記サンプルをそれぞれ１００μｌ入れた。次にフィルタープレートにカバーをして暗所で、２時間室温でプレートシェーカー（３００ｒｐｍ）を用いて振とうした後、吸引した。続いて、各ウェルに上記洗浄用緩衝液をそれぞれ１００μｌ入れ、吸引除去した。この洗浄操作を３回行った。
次に、各ウェルにビオチン化二次抗体としてビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ガンマ鎖特異的）をそれぞれ１００μｌ入れ、フィルタープレートにカバーをして暗所で１時間室温でプレートシェーカー（３００ｒｐｍ）を用いて振とうした。その後、吸引して、各ウェルに上記洗浄用緩衝液をそれぞれ１００μｌ入れ、吸引除去した。この洗浄操作を３回行った。
続いて、各ウェルにＳＲＰＥをそれぞれ１００μｌ入れて、フィルタープレートにカバーをして暗所で３０分間室温でプレートシェーカー（３００ｒｐｍ）を用いて振とうした。その後、吸引して、各ウェルに上記洗浄用緩衝液をそれぞれ１００μｌ入れ、吸引除去した。この洗浄操作を３回行った。その後、各ウェルに該洗浄用緩衝液をそれぞれ１００μｌ入れて、プレートシェーカー（３００ｒｐｍ）を用いて２〜３分間振とうした後、得られたサンプル５０μｌを蛍光フローメトリーシステムで測定した。結果を図３１および３２、および表５に示す。
［実施例５］：Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドワクチンを用いるＨＣＶ感染の治療
ＨＬＡ−Ａ２陽性またはＨＬＡ−Ａ２４陽性のＨＣＶ感染者において，本発明のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドを用いたワクチンの抗ウイルス効果を調べた。被験者はいずれも，ＨＣＶ１ｂに感染しており，インターフェロン＋リバビリンによる治療に応答しなかった患者である。Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドＣ−３５，ＮＳ５Ａ−２１３２，Ｅ２−４８８，Ｅ１−２１３およびＮＳ３−１０８１はＧＭＰ適合下に合成し，精製し，凍結乾燥粉末として保存した。Ｃ−３５，ＮＳ５Ａ−２１３２，Ｅ２−４８８およびＮＳ３−１０８１のペプチドは，少量のＤＭＳＯに溶解（１ｍｇ／１０〜２５μｌ）し，Ｅ１−２１３は７％炭酸水素ナトリウム注射液（メイロン）に溶解（１ｍｇ／１５μｌ）した。これらをそれぞれ注射用生理食塩水で希釈（１〜２ｍｇ／ｍｌ）し，０．２２μｍのフィルタを通して滅菌した。この溶液を等量のアジュバント（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１）と混合して，エマルジョン注射剤を得た。このうちＨＬＡ−Ａ２陽性の被験者３名にはＣ−３５注射剤を，ＨＬＡ−Ａ２４陽性の被験者５名にはＮＳ５Ａ−２１３２注射剤を投与した。投与は，２週間ごとに，１回あたり０．３ｍｇのペプチドを含むエマルジョンを側腹部に注射することにより行った。ＨＣＶ ＲＮＡの量およびＧＯＴ，ＧＰＴ，γ−ＧＴＰ，ＡＦＰの値を継続的にモニターした。
結果を図３３および図３４に示す。これらの図から明らかなように，試験したほとんどの被験者において，ワクチン投与開始後ＨＣＶ ＲＮＡの量が顕著に低下しており，本発明のペプチドが抗ＨＣＶワクチンとして有効であることが実証された。
産業上の利用性
この発明に係るＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドは，ＨＬＡ結合モチーフをその配列中に含んでいて，Ｃ型肝炎ウイルスに反応する抗体により認識されるとともに，さらにＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識性を有している。
したがって，この発明のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドは，ＨＣＶ感染に起因する疾患に対して有効なワクチンとなり得る。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＬＡ結合モチーフを配列中に含み，かつ，Ｃ型肝炎ウイルス患者で検出される抗体により認識されることを特徴とするＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが配列番号１〜８、１６、２０および３８のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド。
【請求項３】
配列番号１〜８、１６、２０および３８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性をもつアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１または２に記載のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド。
【請求項４】
ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識性をさらに有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドを含むことを特徴とするポリペプチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性をもつアミノ酸配列を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項７】
ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識性をさらに有することを特徴とする請求項５または６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，または請求項５〜７のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードすること，またはこれらに対して相補的な配列を有することを特徴とするヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，または請求項５〜７のいずれか１つに記載のポリペプチドを認識することを特徴とする抗体または抗体類似活性物質。
【請求項１０】
請求項８に記載のヌクレオチドを含有することを特徴とするベクター。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，または請求項５〜７のいずれか１つに記載のポリペプチドを用いて細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，請求項５〜７のいずれか１つに記載のポリペプチド，請求項８に記載のヌクレオチド，または請求項９に記載の抗体もしくは抗体類似活性物質を使用することを特徴とする肝炎ウイルスの検出方法。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，請求項５〜７のいずれか１つに記載のポリペプチド，請求項８に記載のヌクレオチド，あるいは請求項９に記載の抗体または抗体類似活性物質を使用することを特徴とするＣ型肝炎ウイルス感染症の診断方法。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，請求項５〜７のいずれか１つに記載のポリペプチド，請求項８に記載のヌクレオチド，あるいは請求項９に記載の抗体または抗体類似活性物質を使用することを特徴とするＣ型肝炎ウイルス感染症の予防または治療方法。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，請求項５〜７のいずれか１つに記載のポリペプチド，請求項８に記載のヌクレオチド，あるいは請求項９に記載の抗体または抗体類似活性物質を有効成分として含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１６】
医薬組成物がＣ型肝炎ウイルスワクチンであることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，請求項５〜７のいずれか１つに記載のポリペプチド，請求項８に記載のヌクレオチド，あるいは請求項９に記載の抗体または抗体類似活性物質を使用することを特徴とするＣ型肝炎ウイルス感染症の予後の予測方法。
【請求項１８】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，請求項５〜７のいずれか１つに記載のポリペプチド，請求項８に記載のヌクレオチド，あるいは請求項９に記載の抗体または抗体類似活性物質を含むことを特徴とするＣ型肝炎ウイルス感染症を診断または予後を予測するためのキット。
【請求項１】
ＨＬＡ結合モチーフを配列中に含み，かつ，Ｃ型肝炎ウイルス患者で検出される抗体により認識されることを特徴とするＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが配列番号１〜８、１６、２０および３８のいずれか１つで表されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド。
【請求項３】
配列番号１〜８、１６、２０および３８のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性をもつアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１または２に記載のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド。
【請求項４】
ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識性をさらに有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つに記載のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドを含むことを特徴とするポリペプチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性をもつアミノ酸配列を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項７】
ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞による認識性をさらに有することを特徴とする請求項５または６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，または請求項５〜７のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードすること，またはこれらに対して相補的な配列を有することを特徴とするヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，または請求項５〜７のいずれか１つに記載のポリペプチドを認識することを特徴とする抗体または抗体類似活性物質。
【請求項１０】
請求項８に記載のヌクレオチドを含有することを特徴とするベクター。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，または請求項５〜７のいずれか１つに記載のポリペプチドを用いて細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することを特徴とする細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，請求項５〜７のいずれか１つに記載のポリペプチド，請求項８に記載のヌクレオチド，または請求項９に記載の抗体もしくは抗体類似活性物質を使用することを特徴とする肝炎ウイルスの検出方法。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，請求項５〜７のいずれか１つに記載のポリペプチド，請求項８に記載のヌクレオチド，あるいは請求項９に記載の抗体または抗体類似活性物質を使用することを特徴とするＣ型肝炎ウイルス感染症の診断方法。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，請求項５〜７のいずれか１つに記載のポリペプチド，請求項８に記載のヌクレオチド，あるいは請求項９に記載の抗体または抗体類似活性物質を使用することを特徴とするＣ型肝炎ウイルス感染症の予防または治療方法。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，請求項５〜７のいずれか１つに記載のポリペプチド，請求項８に記載のヌクレオチド，あるいは請求項９に記載の抗体または抗体類似活性物質を有効成分として含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１６】
医薬組成物がＣ型肝炎ウイルスワクチンであることを特徴とする請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，請求項５〜７のいずれか１つに記載のポリペプチド，請求項８に記載のヌクレオチド，あるいは請求項９に記載の抗体または抗体類似活性物質を使用することを特徴とするＣ型肝炎ウイルス感染症の予後の予測方法。
【請求項１８】
請求項１〜４のいずれか１つに記載のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド，請求項５〜７のいずれか１つに記載のポリペプチド，請求項８に記載のヌクレオチド，あるいは請求項９に記載の抗体または抗体類似活性物質を含むことを特徴とするＣ型肝炎ウイルス感染症を診断または予後を予測するためのキット。
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２８５０３
【国際公開日】平成１７年３月３１日（２００５．３．３１）
【発行日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１４１４７（Ｐ２００５−５１４１４７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１４３１２
【国際出願日】平成１６年９月２２日（２００４．９．２２）
【出願人】（３０４０５８２４０）株式会社グリーンペプタイド (10)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年３月３１日（２００５．３．３１）
【発行日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１４３１２
【国際出願日】平成１６年９月２２日（２００４．９．２２）
【出願人】（３０４０５８２４０）株式会社グリーンペプタイド (10)
【Ｆターム（参考）】
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