本発明は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、特にＣＸＣＲ４及びＣＸＣＲ７に（本明細書で規定されるように）指向性を有するアミノ酸配列、並びにこのようなアミノ酸配列を１つ又は複数含むか、又はこれから本質的に成る、化合物又は構築物、特にタンパク質及びポリペプチド（本明細書中でそれぞれ、「本発明のアミノ酸配列」、「本発明の化合物」及び「本発明のポリペプチド」とも称される）に関する。さらに本発明は、膜貫通タンパク質、特に天然立体構造が他の「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」系では再現することができない多重膜貫通タンパク質（例えば一般的にＧＰＣＲ）に指向性を有するアミノ酸配列を作製する新規の方法を提供している。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＸＣＲ４（配列番号２５４）と特異的に結合する１つ又は複数のナノボディ、及び可能性としては血清タンパク質と特異的に結合する１つ又は複数のナノボディを含むポリペプチドであって、
ヒトＣＸＣＲ４と特異的に結合する該ナノボディ（単数又は複数）が、
ａ）生きた状態でかつ細胞表面で該ヒトＣＸＣＲ４を発現する細胞全体を、ラマに免疫付与する工程と、
ｂ）ヒトＣＸＣＲ４との結合に関して選択する工程と、
ｃ）任意で該選択工程において、洗浄剤を用いずにＰＢＳ等のバッファーで穏やかに洗浄する工程とを少なくとも含む方法により生成され、並びに
ａ）該ポリペプチドが、競合結合アッセイでヒトＣＸＣＲ４と結合する場合、高濃度（１００ｎＭ以上）でヒトＣＸＣＬ１２（配列番号２６７）の５０％超、より好ましくは６０％超、さらにより好ましくは７０％超、さらにより好ましくは８０％超、さらにより好ましくは９０％超、最も好ましくは９５％超を置換する、及び／又は
ｂ）該ポリペプチドが、１００ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下、より好ましくは１ｎＭ以下、及び最も好ましくは０．１ｎＭ以下の濃度でヒトＣＸＣＲ４に対するヒトＣＸＣＬ１２の化学誘因物質の効果を完全にアンタゴナイズする、
並びに該ポリペプチドがナノボディを２つ以上含む場合、該ポリペプチドが任意でペプチドリンカーをさらに１つ又は複数含む、ポリペプチド。
【請求項２】
ヒトＣＸＣＲ４と特異的に結合するナノボディを２つ以上含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ヒトＣＸＣＲ４と特異的に結合する２つのナノボディを含む、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
少なくとも１つのナノボディが４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的に成り、ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号１４２、配列番号１４３のアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１４２、配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１４２、配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ又は１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、かつ
ＣＤＲ２が、
ｄ）配列番号１７４、配列番号１７５のアミノ酸配列；
ｅ）配列番号１７４、配列番号１７５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
ｆ）配列番号１７４、配列番号１７５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ又は１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、かつ
ＣＤＲ３が、
ｇ）配列番号２０６、配列番号２０７のアミノ酸配列；
ｈ）配列番号２０６、配列番号２０７のアミノ酸配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
ｉ）配列番号２０６、配列番号２０７のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ又は１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ヒトＣＸＣＲ４と特異的に結合する該２つのナノボディが４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的に成り、ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号１４２、配列番号１４３のアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１４２、配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１４２、配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ又は１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、かつ
ＣＤＲ２が、
ｄ）配列番号１７４、配列番号１７５のアミノ酸配列；
ｅ）配列番号１７４、配列番号１７５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
ｆ）配列番号１７４、配列番号１７５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ又は１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、かつ
ＣＤＲ３が、
ｇ）配列番号２０６、配列番号２０７のアミノ酸配列；
ｈ）配列番号２０６、配列番号２０７のアミノ酸配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
ｉ）配列番号２０６、配列番号２０７のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ又は１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ヒトＣＸＣＲ４と特異的に結合するナノボディの１つが４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的に成り、ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号１４２のアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１４２のアミノ酸配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１４２のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ又は１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、かつ
ＣＤＲ２が、
ｄ）配列番号１７４のアミノ酸配列；
ｅ）配列番号１７４のアミノ酸配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
ｆ）配列番号１７４のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ又は１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、かつ
ＣＤＲ３が、
ｇ）配列番号２０６のアミノ酸配列；
ｈ）配列番号２０６のアミノ酸配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
ｉ）配列番号２０６のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ又は１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、
ヒトＣＸＣＲ４と特異的に結合する別のナノボディが４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的に成り、ＣＤＲ１が、
ｊ）配列番号１４３のアミノ酸配列；
ｋ）配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
ｌ）配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ又は１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、かつ
ＣＤＲ２が、
ｍ）配列番号１７５のアミノ酸配列；
ｎ）配列番号１７５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
ｏ）配列番号１７５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ又は１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、かつ
ＣＤＲ３が、
ｐ）配列番号２０７のアミノ酸配列；
ｑ）配列番号２０７のアミノ酸配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
ｒ）配列番号２０７のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ又は１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ナノボディが、配列番号２３８、配列番号２３９のアミノ酸配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するナノボディから成る群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
配列番号２６１〜配列番号２６４、好ましくは配列番号２６３、配列番号２６４のアミノ酸配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドから成る群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的に成るナノボディであって、ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号１４２、配列番号１４３のアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１４２、配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１４２、配列番号１４３のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ又は１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、かつ
ＣＤＲ２が、
ｄ）配列番号１７４、配列番号１７５のアミノ酸配列；
ｅ）配列番号１７４、配列番号１７５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
ｆ）配列番号１７４、配列番号１７５のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ又は１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択され、かつ
ＣＤＲ３が、
ｇ）配列番号２０６、配列番号２０７のアミノ酸配列；
ｈ）配列番号２０６、配列番号２０７のアミノ酸配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列；
ｉ）配列番号２０６、配列番号２０７のアミノ酸配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ又は１つのアミノ酸差異を有するアミノ酸配列から成る群から選択される、ナノボディ。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド又はナノボディをコードする、核酸又はヌクレオチド配列。
【請求項１１】
好適な状況下で請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド又はナノボディを発現することが可能である宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド又はナノボディを含む薬学的組成物。
【請求項１３】
少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤、及び／又はアジュバントをさらに含み、任意で１つ又は複数のさらなる薬学的に活性のあるポリペプチド及び／又は化合物を含む、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
ａ）アミノ酸配列をコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリを準備する工程と、
ｂ）ヒトＣＸＣＲ４と結合することができ、及び／又はヒトＣＸＣＲ４に対する親和性を有し、並びに、ヒトＣＸＣＲ４が交差遮断されるか又は請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド若しくはナノボディを交差遮断する、アミノ酸配列をコードする核酸配列に関して、核酸配列の前記セット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程と、
ｃ）前記核酸配列を単離し、その後前記アミノ酸配列を発現する工程とを少なくとも含む、ヒトＣＸＣＲ４（配列番号２５４）に指向性を有するアミノ酸配列をスクリーニングする方法。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリペプチド又はナノボディを、治療を必要とする被験体に薬学的に活性のある量投与することを含む、癌又はＡＩＤＳを治療するための方法／使用。

【図１】

【図２】

【図３−１】

【図３−２】

【図３−３】

【図３−４】

【図３−５】

【図４】

【図５】

【図６】

【図８】

【図１０】

【図１１】

【図７】

【図９】

【公表番号】特表２０１１−５２３５５０（Ｐ２０１１−５２３５５０Ａ）
【公表日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０８９４９（Ｐ２０１１−５０８９４９）
【出願日】平成２１年５月１８日（２００９．５．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５６０２６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３８５１９
【国際公開日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【出願人】（５０５１６６２２５）アブリンクス　エン．ヴェー． (28)
【Ｆターム（参考）】