ＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンド、及びその合成方法
【課題】ＣＸＣＲ４に対するより強力なアンタゴニストとしてのＣＸＣＲ４リガンド、その合成方法、及び該ＣＸＣＲ４リガンドからなるがん細胞検出用プローブ、或いは、該ＣＸＣＲ４リガンドを有効成分とするがんの転移抑制剤を提供すること。
【解決手段】一価型ＣＸＣＲ４リガンドに、複数の一価型ＣＸＣＲ４リガンドをテンプレート化合物を介しての結合するための結合部位を導入した一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体を合成する工程、複数本の等価なリンカー構造を持つテンプレート化合物を合成する工程、及び、該テンプレート化合物と、該一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体とを結合することにより、一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体がテンプレート化合物を介して結合した多価型ＣＸＣＲ４リガンドを合成する工程によりＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドを合成する。本発明の多価型ＣＸＣＲ４リガンドは、強力なアンタゴニスト活性を有し、高感度のがん細胞検出用プローブや、がんの転移をより強力に抑制し得るがんの転移抑制剤を提供する。
【解決手段】一価型ＣＸＣＲ４リガンドに、複数の一価型ＣＸＣＲ４リガンドをテンプレート化合物を介しての結合するための結合部位を導入した一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体を合成する工程、複数本の等価なリンカー構造を持つテンプレート化合物を合成する工程、及び、該テンプレート化合物と、該一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体とを結合することにより、一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体がテンプレート化合物を介して結合した多価型ＣＸＣＲ４リガンドを合成する工程によりＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドを合成する。本発明の多価型ＣＸＣＲ４リガンドは、強力なアンタゴニスト活性を有し、高感度のがん細胞検出用プローブや、がんの転移をより強力に抑制し得るがんの転移抑制剤を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４多量体を高感度に認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンド、その合成方法、及び該多価型ＣＸＣＲ４リガンドを標識してなるがん細胞検出用プローブ、更には、該多価型標識ＣＸＣＲ４リガンドを有効成分とするがんの転移抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４は、ケモカインであるstromal cell derived factor 1α（ＳＤＦ−１α）（ＣＸＣＬ１２とも呼ばれる）を内因性リガンドとする７回膜貫通Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）である。ＣＸＣＲ４は、胎生期の血管新生、心形成、神経細胞の分化などの発生に関与する一方、乳がん等の固形がんの転移、ＨＩＶ感染、白血病、関節リュウマチなど種々の難治性疾患の病態メカニズムに寄与している事が報告されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献９）。更に、ＣＸＣＲ４は、メラノーマ、乳がん、卵巣がん、肺がん、リンパ腫、前立腺がん、すい臓がん、腎臓がん、甲状腺がん、星状細胞腫、脳腫瘍、結腸がん、口腔扁平上皮がん、頸部がん、神経芽細胞腫、横紋筋腫等のがん細胞に高発現しており（非特許文献４）、がん転移の方向性を決定していることも明らかにされている（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００３】
また、ＣＸＣＲ４は、他のＧＰＣＲと同様に多量体化することが知られており（非特許文献５参照）、ＣＸＣＲ４の二量体化はがん転移に関わることが示唆されている（非特許文献６参照）。そして、特許文献１には、ＣＸＣＲ４アンタゴニストが腫瘍の転移を阻害又は減少させる作用を有していることに着目して、ＣＸＣＲ４アンタゴニストを患者に投与することによって、がんを治療又は予防する方法や、腫瘍の転移を予防する方法が記載されている。
【０００４】
また、本発明者らは、これまでに、カブトガニの自己防御ペプチドpolyphemusin IIを基にして、そのアミノ酸数を減少させていき、アミノ酸残基数が１４であるペプチド性ＣＸＣＲ４アンタゴニストＴ１４０（図１左の「１」）を創出した（非特許文献７）。本発明者らは、このＴ１４０についてさらに構造活性相関研究を行い、ＣＸＣＲ４に対する結合活性に必須な４個のアミノ酸（Arg2、Nal3、Tyr5、Arg14）を同定した。次いで、これら４残基にGlyをスペーサーとして導入した環状ペンタペプチドライブラリーを構築し、このライブラリーの中から、高いＣＸＣＲ４アンタゴニスト活性を有するFC131（図１右の「２」）の創出に成功した（非特許文献８）。
【０００５】
更に、本発明者らは、Ｔ１４０の官能基を改変して最適化することによって、ＣＸＣＲ４に対するより強力なアンタゴニストであるAc-TZ14011の創出に成功した（非特許文献９）。そして、本発明者らは、そのAc-TZ14011のD-Lysの部分をTAMRAで蛍光標識してTAMRA-Ac-TZ14011を作製し、更に、このTAMRA-Ac-TZ14011のＣＸＣＲ４に対する結合活性を、SDF-1α（ＣＸＣＲ４の内因性リガンド）との競合アッセイにより測定した。また、膜上のＣＸＣＲ４にTAMRA-Ac-TZ14011を結合させた後、共焦点顕微鏡で観察して、ＣＸＣＲ４のイメージングを行なった。
【０００６】
しかし、ＣＸＣＲ４のイメージングをより高感度で行ったり、がんの転移をより強力に抑制するためには、ＣＸＣＲ４に対するより強力なアンタゴニストが求められる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００６−５２４２４２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】L. A. Liotta et al., Nature, 410, 24 (2001)
【非特許文献２】A. Muller, et al., Nature, 410, 50 (2001)
【非特許文献３】J. Wang, et al., J. Biol. Chem., 10, 1074 (2001)
【非特許文献４】F. Balkwill Semin., et al., Cancer Biol., 14, 171 (2004)
【非特許文献５】G. J. Babcock, et al., J. Biol. Chem., 278, 3378 (2003)
【非特許文献６】J. Wang, et al., Mol. Cancer. Ther., 5, 2474 (2006)
【非特許文献７】H. Tamamura, N. Fujii, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 253, 877 (1998)
【非特許文献８】H. Tamamura, N. Fujii, et al., J. Med. Chem., 48, 380 (2005)
【非特許文献９】W. Nomura, et al., bioconjugate chem., 19, 1917 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＣＸＣＲ４のリガンドにより、ＣＸＣＲ４のイメージングをより高感度で行ったり、或いは、ＣＸＣＲ４のリガンドを用いて、がんの転移をより強力に抑制するためには、ＣＸＣＲ４に対するより強力なアンタゴニストが求められる。そこで、該要求を満たし、更には、該アンタゴニストの利用を図るために、本発明の課題は、ＣＸＣＲ４のイメージングをより高感度で行ったり、がんの転移をより強力に抑制し得る、ＣＸＣＲ４に対するより強力なアンタゴニストとしてのＣＸＣＲ４リガンド、その合成方法、及び該ＣＸＣＲ４リガンドからなるがん細胞検出用プローブ、或いは、該ＣＸＣＲ４リガンドを有効成分とするがんの転移抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、がん転移の方向性の決定に関し、ＣＸＣＲ４の多量体化とＣＸＣＲ４リガンドのアンタゴニスト活性との関係について、そのメカニズム等を鋭意検討する中で、ＣＸＣＲ４リガンドを、特定のリンカー化合物としてのテンプレート化合物を介して結合し、多価型ＣＸＣＲ４リガンドとすることにより、ＣＸＣＲ４の多量体をより強力に認識し、ＣＸＣＲ４に対するより強力なアンタゴニストとしての活性を得ることができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明者らは、がん転移の方向性の決定に関し、ＣＸＣＲ４の多量体化とＣＸＣＲ４リガンドとのアンタゴニスト活性のメカニズムについて、鋭意検討する中で、二分子のＣＸＣＲ４リガンドを様々な長さのリンカーで結合して種々の二価体リガンド（以下、「二価型ＣＸＣＲ４リガンド」という）を創製し、これらの二価型ＣＸＣＲ４リガンドのＣＸＣＲ４結合活性を[125I]-SDF-1αを用いた競合阻害アッセイにより評価したところ、リンカーの長さが５．５〜６．５ｎｍの二価型リガンドのＩＣ５０値が特に低いこと、すなわち、リンカー長が前述の範囲のときに、二価型ＣＸＣＲ４リガンドのＣＸＣＲ４に対する結合活性が特に高いことを見い出した。このことは、前述の範囲のリンカー長を有する二価型ＣＸＣＲ４リガンドが、ＣＸＣＲ４二量体を認識し、ＣＸＣＲ４二量体に対してより強力に結合することによるものと推定された（図２）。
【００１２】
すなわち、メカニズム的には、二価型ＣＸＣＲ４リガンドが、ＣＸＣＲ４二量体に対して、複数のリガンド結合部位で結合することにより、相乗的な結合活性を示して、より強力に結合することにより、高いアンタゴニスト活性を示しているものと推測される。
【００１３】
また、本発明者らは、該ＣＸＣＲ４二量体を認識する二価型ＣＸＣＲ４リガンドを蛍光標識して得られた蛍光標識二価型ＣＸＣＲ４リガンドを用いて、ヒトＴ細胞株に発現するＣＸＣＲ４二量体について蛍光イメージングを行ない、標識二価型ＣＸＣＲ４リガンドにより、ヒト細胞上のＣＸＣＲ４二量体を高感度に検出し得ることを見い出した。
【００１４】
更に、本発明においては、二価型ＣＸＣＲ４リガンドに続いて、本発明におけるリンカー化合物を用いて、三価型ＣＸＣＲ４リガンド、四価型ＣＸＣＲ４リガンドのような多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成を行った。本発明の多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成に際しては、テンプレート化合物のリンカーの長さを適宜調整して、多価型ＣＸＣＲ４リガンドのＣＸＣＲ４多量体への複数の結合部位間における距離を調整することができる。
【００１５】
すなわち具体的には本発明は、（１）一価型ＣＸＣＲ４リガンドに、複数の一価型ＣＸＣＲ４リガンドをテンプレート化合物を介して結合するための結合部位を導入した一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体を合成する工程、複数本の等価なリンカー構造を持つテンプレート化合物を合成する工程、及び、該テンプレート化合物と、該一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体とを結合することにより、一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体がテンプレート化合物を介して結合した多価型ＣＸＣＲ４リガンドを合成する工程からなることを特徴とするＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法や、（２）一価型ＣＸＣＲ４リガンドの誘導体を合成する工程が、一価型ＣＸＣＲ４リガンドに、テンプレート化合物と結合するために必要なシステインを導入するものであることを特徴とする上記（１）に記載のＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法や、（３）一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体が、下記一般式（１）で表される化合物又はその塩であることを特徴とする上記（２）に記載のＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法や、
【００１６】
【化１】
【００１７】
（４）複数本の等価なリンカー構造を持つテンプレート化合物が、２本の等価なリンカー構造を持つ下記一般式（２）又は（３）で表される化合物又はその塩であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載のＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法や、
【００１８】
【化２】
（但し、ｎは整数を表す。）
【００１９】
【化３】
（但し、ｍは整数を表す。）
【００２０】
（５）上記（４）に記載の一般式（２）又は（３）で表される化合物において、ｎが１０〜２６の範囲内の整数であり、ｍが４〜１７の範囲内の整数であることを特徴とする上記（４）に記載のＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法や、（６）複数本の等価なリンカー構造を持つテンプレート化合物が、３本の等価なリンカー構造を持つ下記一般式（４）で表される化合物又はその塩であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載のＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法や、
【００２１】
【化４】
【００２２】
（７）複数本の等価なリンカー構造を持つテンプレート化合物が、４本の等価なリンカー構造を持つ下記一般式（５）又は（６）で表される化合物又はその塩であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載のＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法からなる。
【００２３】
【化５】
【００２４】
【化６】
【００２５】
また本発明は、（８）上記（１）〜（７）のいずれかに記載の多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法によって合成されたＣＸＣＲ４多量体を高感度に認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドや、（９）ＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドが、２本の等価なリンカー構造を持つ下記一般式（２）又は（３）で表される化合物又はその塩からなるテンプレート化合物によって結合された２価型ＣＸＣＲ４リガンドであることを特徴とする上記（８）に記載のＣＸＣＲ４多量体を高感度に認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドや、
【００２６】
【化７】
（但し、ｎは整数を表す。）
【００２７】
【化８】
（但し、ｍは整数を表す。）
【００２８】
（１０）２本の等価なリンカー構造を持つ上記（９）に記載の一般式（２）又は（３）で表される化合物又はその塩からなるテンプレート化合物において、ｎが１０〜２６の範囲内の整数であり、ｍが４〜１７の範囲内の整数であることを特徴とする上記（９）に記載のＣＸＣＲ４多量体を高感度に認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドや、（１１）ＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドが、３本の等価なリンカー構造を持つ下記一般式（４）で表される化合物又はその塩からなるテンプレート化合物によって結合された３価型ＣＸＣＲ４リガンドであることを特徴とする上記（８）に記載のＣＸＣＲ４多量体を高感度に認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドや、
【００２９】
【化９】
【００３０】
（１２）ＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドが、４本の等価なリンカー構造を持つ下記一般式（５）又は（６）で表される化合物又はその塩からなるテンプレート化合物によって結合された４価型ＣＸＣＲ４リガンドであることを特徴とする上記（８）に記載のＣＸＣＲ４多量体を高感度に認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドからなる。
【００３１】
【化１０】
【００３２】
【化１１】
【００３３】
さらに本発明は、（１３）上記（８）〜（１２）のいずれかに記載の多価型ＣＸＣＲ４リガンドを、標識化合物で標識してなるがん細胞検出用プローブからなる。
【００３４】
また本発明は、（１４）上記（８）〜（１２）のいずれかに記載の多価型ＣＸＣＲ４リガンドを有効成分とするがんの転移抑制剤からなる。
【発明の効果】
【００３５】
本発明により、ＣＸＣＲ４多量体を認識し、ＣＸＣＲ４多量体に対してより安定した結合活性を有する多価型ＣＸＣＲ４リガンドを提供することができ、ＣＸＣＲ４に対するより強力なアンタゴニストを提供することができる。該多価型ＣＸＣＲ４リガンドの提供により、がん細胞検出プローブや、がんの転移抑制剤の提供が可能となる。本発明のがん細胞検出プローブは、がん細胞に発現するＣＸＣＲ４多量体に対して優れた結合活性を有するため、がん細胞を高感度で検出することができる。また、本発明の多価型ＣＸＣＲ４リガンドは、ガンの転移に関わるＣＸＣＲ４多量体を、より強力に認識し、したがって、がんの転移を効果的に抑制することができるため、がん転移抑制剤として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＣＸＣＲ４リガンドの構造を示す図である。
【図２】がん細胞選択式プローブの模式図である。
【図３】二価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成スキームを示す図である。
【図４】各種の二価型ＣＸＣＲ４リガンド、及び、該ＣＸＣＲ４リガンドのＣＸＣＲ４への結合活性の評価を示す図である。
【図５】二価型ＣＸＣＲ４リガンドについてのＣＸＣＲ４レセプター結合アッセイの結果を示す図である。図５左；ＰＰリンカーを持つテンプレート化合物を用いて合成した二価型ＣＸＣＲ４リガンドについてのＣＸＣＲ４レセプター結合アッセイの結果を示す図である。図５右；ＰＰ−ＰＥＧリンカーを持つテンプレート化合物を用いて合成した二価型ＣＸＣＲ４リガンドについてのＣＸＣＲ４レセプター結合アッセイの結果を示す図である。
【図６】ＣＸＣＲ４二量体におけるリガンド結合部位同士間の推定距離を示す図である。図６左；二価型ＣＸＣＲ４リガンドのＩＣ５０（ｎＭ）と、該リガンドのリンカー長の長さ（ｎｍ）との関係を示す図である。図６右；ＣＸＣＲ４の二量体におけるリガンド結合部位同士間の推定距離を示す図である。
【図７】TAMRA-18Pro-FC131二量体でＨｅｌａ細胞を染色したものを蛍光観察又は微分干渉観察した図である。
【図８】TAMRA-6PP-FC131単量体及びAC6PP-FC131単量体でＨｅｌａ細胞を染色したものを蛍光観察又は微分干渉観察した図である。
【図９】三価型テンプレート化合物の合成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、一価型ＣＸＣＲ４リガンドに、複数の一価型ＣＸＣＲ４リガンドをテンプレート化合物を介して結合するための結合部位を導入した一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体（以下、単に「一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体」とも表示する。）を合成する工程、複数本の等価なリンカー構造を持つテンプレート化合物（以下、単に「本発明のテンプレート化合物」とも表示する。）を合成する工程、及び、該テンプレート化合物と、該一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体とを結合することにより、一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体がテンプレート化合物を介して結合した多価型ＣＸＣＲ４リガンドを合成する工程からなることを特徴とするＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンド（以下、「本発明の多価型ＣＸＣＲ４リガンド」とも表示する。）の合成方法（以下、単に「本発明の多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法」とも表示する。）からなる。
【００３８】
上記の一価型ＣＸＣＲ４リガンドとしては、一量体のＣＸＣＲ４に対するリガンドである限り特に制限されず、アゴニストであってもアンタゴニストであってもよいが、がんの転移を抑制する場合は、アンタゴニストである必要がある。一価型ＣＸＣＲ４アンタゴニストとしては、以下の一般式（７）で表されるT140や、一般式（８）で表されるFC131を好適に例示することができる。
【００３９】
【化１２】
【００４０】
【化１３】
【００４１】
また、上記の「複数の一価型ＣＸＣＲ４リガンドをテンプレート化合物を介して結合するための結合部位」としては、一価型ＣＸＣＲリガンドを本発明のテンプレート化合物に結合させ得る結合部位である限り特に制限されないが、Cys（システイン）残基を好適に例示することができる。
【００４２】
本発明における一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体の好ましい例として、FC131（一価型ＣＸＣＲ４リガンド）にD-Cys残基を導入したD-Cys-FC131を好適に例示することができる。このD-Cys-FC131の構造式は上記一般式（１）で表される。
【００４３】
本発明における、一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体を合成する工程において、一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体を合成する方法としては、一価型ＣＸＣＲ４リガンドに、前述の結合部位を導入する方法である限り特に制限されないが、一価型ＣＸＣＲ４リガンドの特定の基又は原子を、上記結合部位となり得る置換基（好ましくはCys残基）で置換する方法（Angew. Chem. Int. Ed., 42(28), 3251-3253 (2003)参照）を好適に例示することができる。一価型ＣＸＣＲ４リガンドは、公知のものを適宜合成することができ、例えばFC131は、Angew. Chem. Int. Ed., 42(28), 3251-3253 (2003)記載の合成方法により合成することができ、T140は、Biochem. Biophys. Res. Commun., 253(3), 877-882 (1998)やBioorg. Med. Chem., 6(2), 231-238 (1998)に記載の合成方法により合成することができる。
【００４４】
複数本の等価なリンカー構造を持つテンプレート化合物を合成する工程における本発明のテンプレート化合物としては、複数本の等価なリンカー構造を持ち、かつ、一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体と結合することにより、本発明の多価型ＣＸＣＲ４リガンドを合成し得る化合物である限り特に制限されないが、２本の等価なリンカー構造を持つ上記一般式（２）又は（３）で表される化合物又はその塩や、３本の等価なリンカー構造を持つ上記一般式（４）で表される化合物又はその塩や、４本の等価なリンカー構造を持つ上記一般式（５）又は（６）で表される化合物又はその塩を好適に例示することができ、中でも、２本の等価なリンカー構造を持つ上記一般式（２）又は（３）で表される化合物又はその塩を特に好適に例示することができる。また、一般式（２）におけるｎとしては、１０〜２６の範囲内の整数を好適に例示することができ、１７〜１９の範囲内の整数をより好適に例示することができ、一般式（３）におけるｍとしては、４〜１７の範囲内の整数を好適に例示することができ、８〜１３の範囲内の整数をより好適に例示することができる。なお、上記に例示される本発明のペプチド性テンプレート化合物を合成するには、Fmoc solid-phase peptide synthesis（ＳＰＰＳ）を用いることができる（Hirokazu Tamamura et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry 6 (1998)1033-1041や、"Solid phase peptide synthesis - a practical approach" by E Atherton & R C Sheppard IPI PRESS参照）。すなわち、固相合成法により、主鎖アミノ基の保護基である９−fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc)基の選択的脱保護と縮合反応の操作を繰り返し、最後に樹脂からの脱樹脂、脱保護を行なうことにより、目的とするペプチド性テンプレートか化合物を合成することができる。
【００４５】
本発明のテンプレート化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩などの塩の形態であってもよい。例えば、酸付加塩としては、塩酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩などの鉱酸塩や、シュウ酸塩、若しくは酒石酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。また、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、若しくはカルシウム塩などの金属塩や、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩若しくはエタノールアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。また、本発明のテンプレート化合物は、本発明に用い得る限り、１又は２個以上の任意の置換基を有していてもよい。２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。本発明に用い得る限り、置換基の存在位置は限定されず、置換可能な任意の部位に存在することができる。置換基の種類は特に限定されない。
【００４６】
本発明のテンプレート化合物と、本発明の一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体とを結合することにより、一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体がテンプレート化合物を介して結合した多価型ＣＸＣＲ４リガンドを合成する工程においては、本発明のテンプレート化合物と、本発明の一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体とを、phosphate buffer中で攪拌することにより、複数本の等価なリンカー構造を持つ本発明のテンプレート化合物と、本発明の一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体とを結合させ、これにより、一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体がテンプレート化合物を介して結合した多価型ＣＸＣＲ４リガンドを合成することができる（図３参照）。
【００４７】
本発明の合成方法によって合成し得る多価型ＣＸＣＲ４リガンドは、ＣＸＣＲ４多量体を認識し、また、一価型ＣＸＣＲ４リガンドがＣＸＣＲ４単量体と結合するよりも、より強力にＣＸＣＲ４多量体に結合することができる。本発明の多価型ＣＸＣＲ４リガンドは、ＣＸＣＲ４多量体との間に、より多くの結合部位を生じ得るからである。そのため、本発明の多価型ＣＸＣＲ４リガンドは、がん細胞に発現するＣＸＣＲ４により強く結合することによって、がん細胞をより高感度で検出することが可能ながん細胞検出プローブとして用いることができる。
【００４８】
本発明におけるがん細胞検出プローブとしては、本発明における多価型ＣＸＣＲ４リガンドを標識化合物で標識したものである限り特に制限されないが、検出が容易であることから、標識化合物としては蛍光標識化合物を好適に例示することができ、中でもRhodamineやFluoresceinをより好適に例示することができる。
【００４９】
また、本発明の多価型ＣＸＣＲ４リガンドが、多価型ＣＸＣＲ４に対するアンタゴニスト（以下、「本発明の多価型ＣＸＣＲ４アンタゴニスト」とも表示する。）である場合は、該アンタゴニストをがんの転移抑制剤として用いることができる。ＣＸＣＲ４アンタゴニストが腫瘍の転移を阻害又は減少させる作用を有していることは、背景技術の特許文献１に記載されている。
【００５０】
本発明のがんの転移抑制剤を調製するには、アンタゴニスト（好ましくはペプチド性のアンタゴニスト）を有効成分とした薬剤において通常採用される製剤の形態、或いは、補助剤、添加剤を用いることができる。
【実施例１】
【００５１】
［二価型ＣＸＣＲ４リガンドの設計、及び、合成スキーム］
ＣＸＣＲ４二量体はその詳細な構造が明らかになっていないため、ＣＸＣＲ４間の距離の推定は困難である。そのため、本発明のテンプレート化合物における最適なリンカー長を検討する必要があるが、結合間距離が固定されていないリンカーでは正確な検討を行うことが出来ない。そこで、構造安定性の高いpolyproline helix 2 構造を有するＰＰリンカーに着目した。ＰＰリンカーはその結合距離が明らかにされており（３残基＝９Å）、分子メジャーとして用いられている。そのため、異なる鎖長をもつＰＰリンカーを合成・検討することで、ＣＸＣＲ４二量体間の距離をより正確に特定できると考えた。更にＰＰリンカーの検討に加え、ＣＸＣＲ４におけるFC131の結合ポケットの深さも考慮し、柔軟な構造を有するpolyethylene glycol リンカーを、ＰＰリンカーの末端に修飾したＰＰ−ＰＥＧリンカーも併せて検討した（図４参照）。また、これらリンカー部の合成に関してはFmoc固相合成法を用いた（図３参照）。ＣＸＣＲ４アンタゴニストFC131はリンカー導入を行うための反応点を持たないことから、スペーサー部位のGlyをD-Cysで置換した誘導体D-Cys FC131を設計・合成し、リンカーとのコンジュゲートを行った。以上の設計、及び、合成スキームに基づいて、まずは、テンプレート化合物の合成を試みた。
【実施例２】
【００５２】
［テンプレート化合物の合成］
１．Ｄ−システイン負荷２−クロロトリチル樹脂の調製
Ｄ−システイン負荷２−クロロトリチル樹脂（1.4mmol/g）を、CH2Cl2/DMF（10.00mL）中において、Fmoc-D-Cys-OH（0.88mmol）及びN,N-diisopropylethylamine（DIPEA）（1.75mmol）で１．５時間処理した。処理後の上記樹脂をDMF及びCH2Cl2で洗浄し、その樹脂を真空乾燥した。その樹脂におけるＤ−システインの負荷の程度は、ピペリジンで処理したサンプル、すなわち、Fmoc-D-Cys-(2-Cl)-Trt-resin（0.45mmol/g）の290nmでの紫外線吸収を測定することによって決定した。
【００５３】
２．Fmoc固相合成法によるペプチドの合成
保護されたペプチド樹脂は、0.5mmolスケールにて手作業で構築した。Fmoc-アミノ酸は、DMF（1.0mL）中において、0.039mL（0.25mmol）の1,3-diisopropylcarbodiimide（DIPCI）、及び、38 mg（0.25 mmol）のN-hydroxybenzotriazole hydrate（HOBt・H2O）を用いて、１．５時間カップリングさせた。Tetramethylrhodamine単位をカップリングさせるために、93mg（0.25mmol）のHATU及び34mg（0.25mmol)の1-hydroxy-7-azabenzotriazole（HOAt）を、DIPCI/HOBtの代わりに使用した。20% (v/v) のpiperidine-DMFで１５分間処理して、Fmoc基を脱保護した。
【００５４】
このFmoc固相合成法により、図４記載の各種テンプレート化合物を合成した。なお、図４のLinker名における“Prox”とは、一般式（２）におけるｎがＸである化合物を表し、“PEG-Proy-PEG”とは、一般式（３）におけるｎがＹである化合物を表す。また、PEG-Acとは、図４右のPEGにアセチルとFC131単量体が結合した化合物を表し、Ac-Pro6とは、一般式（２）の括弧内のプロリンが６分子連結した化合物にアセチルとFC131単量体が結合した化合物を表す。
【実施例３】
【００５５】
［FC131誘導体の合成］
一価型ＣＸＣＲ４リガンドとしてFC131を用意した。このFC131に、Angew. Chem. Int. Ed., 42(28), 3251-3253 (2003)記載の方法を適用することによって、FC131の水素原子をD-Cys残基で置換し、FC131誘導体（D-Cys-FC131；一般式（１）参照）を合成した。
【実施例４】
【００５６】
［二価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成］
ｐＨ７．８のPhosphate bufferに、実施例２で合成したテンプレート化合物と、実施例３で合成したFC131誘導体とを溶解し、この溶液を攪拌した。これにより、１分子のテンプレート化合物に、２分子のFC131誘導体が結合した二価型ＣＸＣＲ４リガンドを合成した。
【実施例５】
【００５７】
［ＣＸＣＲ４レセプター結合アッセイ］
実施例４において合成した各種の二価型ＣＸＣＲ４リガンドについて、ＣＸＣＲ４結合活性の評価を試みた。この評価は、ＣＸＣＲ４の公知のリガンドである[125I]-SDF-1αを用いた競合阻害アッセイにより行なった。具体的には、以下の方法を用いた。
【００５８】
まず、細胞膜上でＣＸＣＲ４を発現する細胞として、ヒトＴ細胞株であるJurkat細胞を用意した。加熱して不活性化したウシ胎仔血清を10%含むRPMI 1640培地で、前述のJurkat細胞を培養した。培養したJurkat細胞を採取し、1000rpmで５分間遠心分離した。回収した細胞をRPMI buffer (20mM HEPES, 0.5% ウシ血清アルブミン)に再懸濁し、シリコンでコートされたチューブにその再懸濁液を120μL（5.0×105 cells）入れた。冷却したＳＤＦ−１溶液（最終濃度1μM）、及び、様々な濃度の試験化合物の10% DMSO溶液を１チューブ当たりそれぞれ15μLずつ前述のチューブ内に添加し、次いで、0.05nMの[125I]-SDF-1α（Perkin-Elmer Life Sciences社製）を、１チューブ当たり15μLずつ添加した。それらのチューブを氷上で１時間インキュベーションした後、オイル（dibutyl phthalate : olive oil = 4 : 1 (v/v)）を１チューブ当たり500μL/wellずつ添加し、次いで、14,000 rpmで２分間遠心分離した。チューブ内の水層と有機層を除去し、チューブの底部を切断した後、その底部をRadioimmunoassay（RIA）チューブに配置し、γ-counterによってcount per minute（CPM）を計測した。FC131アナログの[125I]-SDF-1αに対する結合の阻害率（％）は、以下の等式によって算出した。
阻害率（％）＝（Et−Ea）／（Et−Ec）×100
Et：試験化合物が不存在の場合の放射線の量
Ec：試験化合物として冷却したSDF-1αを存在させた場合の放射線の量
Ea：試験化合物を存在させた場合の放射線の量
【００５９】
ＰＰリンカーを持つテンプレート化合物を用いて合成した二価型ＣＸＣＲ４リガンドについての結果を図５左に示し、ＰＰ−ＰＥＧリンカーを持つテンプレート化合物を用いて合成した二価型ＣＸＣＲ４リガンドについての結果を図５右に示す。また、これらの結果を元に、算出したＩＣ５０（ｎＭ）を図４に示す。また、図４のＩＣ５０値（ｎＭ）を縦軸に、リンカー部分の長さ（linker length（ｎｍ））を横軸にとってグラフ化した図を図６左に示す。図６左の結果から分かるように、二価型ＣＸＣＲ４リガンドの結合活性は、二価型ＣＸＣＲ４リガンドにおけるリンカーの長さに依存するような増減を示した。例えば、Pro18リンカーを持つテンプレート化合物に、２分子のFC131が結合した18PP-FC131二量体では、Ac-Pro6リンカーを持つテンプレート化合物に、１分子のFC131が結合したAC6PP-FC131単量体の６倍という高いＣＸＣＲ４結合活性を示した。また、PEG-Pro12-PEGリンカーを持つテンプレート化合物に、２分子のFC131が結合した12PP PEG-FC131二量体では、PEG-Acリンカーを持つテンプレート化合物に、１分子のFC131が結合したPEG AC-FC131単量体の２０倍という高いＣＸＣＲ４結合活性を示した。このように、ＰＰリンカー及びＰＥＧリンカーのいずれを用いた場合も、リンカー長が５．５−６．５ｎｍのときに、二価型ＣＸＣＲ４リガンドのＣＸＣＲ４結合活性が著しく上昇した。このことから、二価型ＣＸＣＲ４リガンドにおいて、FC131とテンプレート化合物とが結合している部位同士間の距離は５．５−６．５ｎｍであること、及び、ＣＸＣＲ４の二量体におけるリガンド結合部位同士間の距離も５．５−６．５ｎｍであること（図６右）が考えられた。また、ＣＸＣＲ４等を含むＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、通常、アゴニスト依存的に二量体化すると考えられているが、FC131はＣＸＣＲ４のアンタゴニストであるにもかかわらず、二価型の状態でＣＸＣＲ４への結合活性が相乗的に上昇した。このことは、ＣＸＣＲ４が細胞に多量体として存在する事を示唆するものであり、ＣＸＣＲ４等のＧＰＣＲの二量体化機構に対する新たな知見を提供するものと考えられる。
【実施例６】
【００６０】
［共焦点顕微鏡システムを用いた蛍光イメージ解析］
本発明の二価型ＣＸＣＲ４リガンドが、ＣＸＣＲ４に特異的に結合するかどうかを確認するために、共焦点顕微鏡システムを用いた蛍光イメージ解析を行なった。具体的には以下の方法で行なった。
【００６１】
まず、本発明の二価型ＣＸＣＲ４リガンドとして、18Pro-FC131二量体を用意し、コントロールの一価型ＣＸＣＲ４リガンドとして、6PP-FC131単量体及びAC6PP-FC131単量体を用意した。これらの３種類のＣＸＣＲ４リガンドをそれぞれ蛍光色素（TAMRA）で標識し、TAMRA-18Pro-FC131二量体、TAMRA-6PP-FC131単量体、及びTAMRA-AC6PP-FC131単量体を作製した。
【００６２】
ＣＸＣＲ４−ＧＦＰ融合タンパク質を安定発現する又はしないＨｅｌａ細胞を、10%のウシ胎仔血清（FBS）を補充したDMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）を含む直径1.4cmのガラス底培養皿に、１皿当たり5×104 cellsずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２条件下で２日間インキュベートした後、ガラス底培養皿から培地を除去し、残った細胞を、20mM HEPES（pH7.4）を含むDMEMで３回洗浄した。上記の３種類の蛍光標識ＣＸＣＲ４リガンドをそれぞれのガラス底培養皿に添加し、その混合物を１５分間室温でインキュベートした。次いで、ガラス底培養皿から培地を除去し、フェノールレッドを含まないDMEMで細胞を３回洗浄した。洗浄した各細胞をLSM 510 laser-scanning confocal microscope (Zeiss GmbH社製, Oberkochen, Germany)で観察した。その結果を図７及び図８に示す。図７の４つのパネルは、TAMRA-18Pro-FC131二量体を２５ｎＭとなるようにガラス底培養皿に添加したものの観察結果であり、図８の４つのパネルは、TAMRA-6PP-FC131単量体及びAC6PP-FC131単量体の両方をそれぞれ２５ｎＭとなるようにガラス底培養皿に添加したものの観察結果である。図７及び図８のそれぞれ４つのパネルのうち、左上のパネルはＧＦＰの緑色を検出したパネルであり、右上のパネルは微分干渉により対象を観察したパネルであり、左下のパネルはTAMRAの赤色を検出したパネルであり、右下のパネルは、左上のパネルと右上のパネルと左下のパネルとを重ね合わせたパネルである。
【００６３】
図７及び図８の結果から分かるように、一価型ＣＸＣＲ４リガンド（TAMRA-6PP-FC131単量体及びAC6PP-FC131単量体）はＣＸＣＲ４に結合しなかったものの、二価型ＣＸＣＲ４リガンド（TAMRA-18Pro-FC131二量体）は、ＣＸＣＲ４に特異的に結合していることが確認された（図７左下パネル、及び、図８左下パネル参照）。また、これらの蛍光イメージ解析の結果から、本発明の二価型ＣＸＣＲ４リガンドは、がん細胞を高感度で検出し得るがん細胞検出プローブとして用い得ることが示された。
【実施例７】
【００６４】
［三価型テンプレート化合物、及び、四価型テンプレート化合物の合成］
図９に示される化合物及び反応を利用して、上記の一般式（４）に示される三価型のテンプレート化合物を合成した。また、上記の一般式（５）や（６）に示される四価型のテンプレート化合物を合成した。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明の多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法によれば、一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体やテンプレート化合物を用いて、一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体がテンプレート化合物を介して結合した多価型ＣＸＣＲ４リガンドを得ることができる。本発明の多価型ＣＸＣＲ４リガンドは、がん細胞に発現するＣＸＣＲ４多量体に対して優れた結合活性を有するため、がん細胞の高感度検出の分野に有用である。また、本発明の多価型ＣＸＣＲ４リガンドが多価型ＣＸＣＲ４アンタゴニストである場合は、がんの転移を効果的に抑制することができるため、がん転移抑制剤の分野に有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４多量体を高感度に認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンド、その合成方法、及び該多価型ＣＸＣＲ４リガンドを標識してなるがん細胞検出用プローブ、更には、該多価型標識ＣＸＣＲ４リガンドを有効成分とするがんの転移抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４は、ケモカインであるstromal cell derived factor 1α（ＳＤＦ−１α）（ＣＸＣＬ１２とも呼ばれる）を内因性リガンドとする７回膜貫通Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）である。ＣＸＣＲ４は、胎生期の血管新生、心形成、神経細胞の分化などの発生に関与する一方、乳がん等の固形がんの転移、ＨＩＶ感染、白血病、関節リュウマチなど種々の難治性疾患の病態メカニズムに寄与している事が報告されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献９）。更に、ＣＸＣＲ４は、メラノーマ、乳がん、卵巣がん、肺がん、リンパ腫、前立腺がん、すい臓がん、腎臓がん、甲状腺がん、星状細胞腫、脳腫瘍、結腸がん、口腔扁平上皮がん、頸部がん、神経芽細胞腫、横紋筋腫等のがん細胞に高発現しており（非特許文献４）、がん転移の方向性を決定していることも明らかにされている（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００３】
また、ＣＸＣＲ４は、他のＧＰＣＲと同様に多量体化することが知られており（非特許文献５参照）、ＣＸＣＲ４の二量体化はがん転移に関わることが示唆されている（非特許文献６参照）。そして、特許文献１には、ＣＸＣＲ４アンタゴニストが腫瘍の転移を阻害又は減少させる作用を有していることに着目して、ＣＸＣＲ４アンタゴニストを患者に投与することによって、がんを治療又は予防する方法や、腫瘍の転移を予防する方法が記載されている。
【０００４】
また、本発明者らは、これまでに、カブトガニの自己防御ペプチドpolyphemusin IIを基にして、そのアミノ酸数を減少させていき、アミノ酸残基数が１４であるペプチド性ＣＸＣＲ４アンタゴニストＴ１４０（図１左の「１」）を創出した（非特許文献７）。本発明者らは、このＴ１４０についてさらに構造活性相関研究を行い、ＣＸＣＲ４に対する結合活性に必須な４個のアミノ酸（Arg2、Nal3、Tyr5、Arg14）を同定した。次いで、これら４残基にGlyをスペーサーとして導入した環状ペンタペプチドライブラリーを構築し、このライブラリーの中から、高いＣＸＣＲ４アンタゴニスト活性を有するFC131（図１右の「２」）の創出に成功した（非特許文献８）。
【０００５】
更に、本発明者らは、Ｔ１４０の官能基を改変して最適化することによって、ＣＸＣＲ４に対するより強力なアンタゴニストであるAc-TZ14011の創出に成功した（非特許文献９）。そして、本発明者らは、そのAc-TZ14011のD-Lysの部分をTAMRAで蛍光標識してTAMRA-Ac-TZ14011を作製し、更に、このTAMRA-Ac-TZ14011のＣＸＣＲ４に対する結合活性を、SDF-1α（ＣＸＣＲ４の内因性リガンド）との競合アッセイにより測定した。また、膜上のＣＸＣＲ４にTAMRA-Ac-TZ14011を結合させた後、共焦点顕微鏡で観察して、ＣＸＣＲ４のイメージングを行なった。
【０００６】
しかし、ＣＸＣＲ４のイメージングをより高感度で行ったり、がんの転移をより強力に抑制するためには、ＣＸＣＲ４に対するより強力なアンタゴニストが求められる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００６−５２４２４２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】L. A. Liotta et al., Nature, 410, 24 (2001)
【非特許文献２】A. Muller, et al., Nature, 410, 50 (2001)
【非特許文献３】J. Wang, et al., J. Biol. Chem., 10, 1074 (2001)
【非特許文献４】F. Balkwill Semin., et al., Cancer Biol., 14, 171 (2004)
【非特許文献５】G. J. Babcock, et al., J. Biol. Chem., 278, 3378 (2003)
【非特許文献６】J. Wang, et al., Mol. Cancer. Ther., 5, 2474 (2006)
【非特許文献７】H. Tamamura, N. Fujii, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 253, 877 (1998)
【非特許文献８】H. Tamamura, N. Fujii, et al., J. Med. Chem., 48, 380 (2005)
【非特許文献９】W. Nomura, et al., bioconjugate chem., 19, 1917 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＣＸＣＲ４のリガンドにより、ＣＸＣＲ４のイメージングをより高感度で行ったり、或いは、ＣＸＣＲ４のリガンドを用いて、がんの転移をより強力に抑制するためには、ＣＸＣＲ４に対するより強力なアンタゴニストが求められる。そこで、該要求を満たし、更には、該アンタゴニストの利用を図るために、本発明の課題は、ＣＸＣＲ４のイメージングをより高感度で行ったり、がんの転移をより強力に抑制し得る、ＣＸＣＲ４に対するより強力なアンタゴニストとしてのＣＸＣＲ４リガンド、その合成方法、及び該ＣＸＣＲ４リガンドからなるがん細胞検出用プローブ、或いは、該ＣＸＣＲ４リガンドを有効成分とするがんの転移抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、がん転移の方向性の決定に関し、ＣＸＣＲ４の多量体化とＣＸＣＲ４リガンドのアンタゴニスト活性との関係について、そのメカニズム等を鋭意検討する中で、ＣＸＣＲ４リガンドを、特定のリンカー化合物としてのテンプレート化合物を介して結合し、多価型ＣＸＣＲ４リガンドとすることにより、ＣＸＣＲ４の多量体をより強力に認識し、ＣＸＣＲ４に対するより強力なアンタゴニストとしての活性を得ることができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明者らは、がん転移の方向性の決定に関し、ＣＸＣＲ４の多量体化とＣＸＣＲ４リガンドとのアンタゴニスト活性のメカニズムについて、鋭意検討する中で、二分子のＣＸＣＲ４リガンドを様々な長さのリンカーで結合して種々の二価体リガンド（以下、「二価型ＣＸＣＲ４リガンド」という）を創製し、これらの二価型ＣＸＣＲ４リガンドのＣＸＣＲ４結合活性を[125I]-SDF-1αを用いた競合阻害アッセイにより評価したところ、リンカーの長さが５．５〜６．５ｎｍの二価型リガンドのＩＣ５０値が特に低いこと、すなわち、リンカー長が前述の範囲のときに、二価型ＣＸＣＲ４リガンドのＣＸＣＲ４に対する結合活性が特に高いことを見い出した。このことは、前述の範囲のリンカー長を有する二価型ＣＸＣＲ４リガンドが、ＣＸＣＲ４二量体を認識し、ＣＸＣＲ４二量体に対してより強力に結合することによるものと推定された（図２）。
【００１２】
すなわち、メカニズム的には、二価型ＣＸＣＲ４リガンドが、ＣＸＣＲ４二量体に対して、複数のリガンド結合部位で結合することにより、相乗的な結合活性を示して、より強力に結合することにより、高いアンタゴニスト活性を示しているものと推測される。
【００１３】
また、本発明者らは、該ＣＸＣＲ４二量体を認識する二価型ＣＸＣＲ４リガンドを蛍光標識して得られた蛍光標識二価型ＣＸＣＲ４リガンドを用いて、ヒトＴ細胞株に発現するＣＸＣＲ４二量体について蛍光イメージングを行ない、標識二価型ＣＸＣＲ４リガンドにより、ヒト細胞上のＣＸＣＲ４二量体を高感度に検出し得ることを見い出した。
【００１４】
更に、本発明においては、二価型ＣＸＣＲ４リガンドに続いて、本発明におけるリンカー化合物を用いて、三価型ＣＸＣＲ４リガンド、四価型ＣＸＣＲ４リガンドのような多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成を行った。本発明の多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成に際しては、テンプレート化合物のリンカーの長さを適宜調整して、多価型ＣＸＣＲ４リガンドのＣＸＣＲ４多量体への複数の結合部位間における距離を調整することができる。
【００１５】
すなわち具体的には本発明は、（１）一価型ＣＸＣＲ４リガンドに、複数の一価型ＣＸＣＲ４リガンドをテンプレート化合物を介して結合するための結合部位を導入した一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体を合成する工程、複数本の等価なリンカー構造を持つテンプレート化合物を合成する工程、及び、該テンプレート化合物と、該一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体とを結合することにより、一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体がテンプレート化合物を介して結合した多価型ＣＸＣＲ４リガンドを合成する工程からなることを特徴とするＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法や、（２）一価型ＣＸＣＲ４リガンドの誘導体を合成する工程が、一価型ＣＸＣＲ４リガンドに、テンプレート化合物と結合するために必要なシステインを導入するものであることを特徴とする上記（１）に記載のＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法や、（３）一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体が、下記一般式（１）で表される化合物又はその塩であることを特徴とする上記（２）に記載のＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法や、
【００１６】
【化１】
【００１７】
（４）複数本の等価なリンカー構造を持つテンプレート化合物が、２本の等価なリンカー構造を持つ下記一般式（２）又は（３）で表される化合物又はその塩であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載のＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法や、
【００１８】
【化２】
（但し、ｎは整数を表す。）
【００１９】
【化３】
（但し、ｍは整数を表す。）
【００２０】
（５）上記（４）に記載の一般式（２）又は（３）で表される化合物において、ｎが１０〜２６の範囲内の整数であり、ｍが４〜１７の範囲内の整数であることを特徴とする上記（４）に記載のＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法や、（６）複数本の等価なリンカー構造を持つテンプレート化合物が、３本の等価なリンカー構造を持つ下記一般式（４）で表される化合物又はその塩であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載のＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法や、
【００２１】
【化４】
【００２２】
（７）複数本の等価なリンカー構造を持つテンプレート化合物が、４本の等価なリンカー構造を持つ下記一般式（５）又は（６）で表される化合物又はその塩であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載のＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法からなる。
【００２３】
【化５】
【００２４】
【化６】
【００２５】
また本発明は、（８）上記（１）〜（７）のいずれかに記載の多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法によって合成されたＣＸＣＲ４多量体を高感度に認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドや、（９）ＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドが、２本の等価なリンカー構造を持つ下記一般式（２）又は（３）で表される化合物又はその塩からなるテンプレート化合物によって結合された２価型ＣＸＣＲ４リガンドであることを特徴とする上記（８）に記載のＣＸＣＲ４多量体を高感度に認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドや、
【００２６】
【化７】
（但し、ｎは整数を表す。）
【００２７】
【化８】
（但し、ｍは整数を表す。）
【００２８】
（１０）２本の等価なリンカー構造を持つ上記（９）に記載の一般式（２）又は（３）で表される化合物又はその塩からなるテンプレート化合物において、ｎが１０〜２６の範囲内の整数であり、ｍが４〜１７の範囲内の整数であることを特徴とする上記（９）に記載のＣＸＣＲ４多量体を高感度に認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドや、（１１）ＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドが、３本の等価なリンカー構造を持つ下記一般式（４）で表される化合物又はその塩からなるテンプレート化合物によって結合された３価型ＣＸＣＲ４リガンドであることを特徴とする上記（８）に記載のＣＸＣＲ４多量体を高感度に認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドや、
【００２９】
【化９】
【００３０】
（１２）ＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドが、４本の等価なリンカー構造を持つ下記一般式（５）又は（６）で表される化合物又はその塩からなるテンプレート化合物によって結合された４価型ＣＸＣＲ４リガンドであることを特徴とする上記（８）に記載のＣＸＣＲ４多量体を高感度に認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドからなる。
【００３１】
【化１０】
【００３２】
【化１１】
【００３３】
さらに本発明は、（１３）上記（８）〜（１２）のいずれかに記載の多価型ＣＸＣＲ４リガンドを、標識化合物で標識してなるがん細胞検出用プローブからなる。
【００３４】
また本発明は、（１４）上記（８）〜（１２）のいずれかに記載の多価型ＣＸＣＲ４リガンドを有効成分とするがんの転移抑制剤からなる。
【発明の効果】
【００３５】
本発明により、ＣＸＣＲ４多量体を認識し、ＣＸＣＲ４多量体に対してより安定した結合活性を有する多価型ＣＸＣＲ４リガンドを提供することができ、ＣＸＣＲ４に対するより強力なアンタゴニストを提供することができる。該多価型ＣＸＣＲ４リガンドの提供により、がん細胞検出プローブや、がんの転移抑制剤の提供が可能となる。本発明のがん細胞検出プローブは、がん細胞に発現するＣＸＣＲ４多量体に対して優れた結合活性を有するため、がん細胞を高感度で検出することができる。また、本発明の多価型ＣＸＣＲ４リガンドは、ガンの転移に関わるＣＸＣＲ４多量体を、より強力に認識し、したがって、がんの転移を効果的に抑制することができるため、がん転移抑制剤として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＣＸＣＲ４リガンドの構造を示す図である。
【図２】がん細胞選択式プローブの模式図である。
【図３】二価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成スキームを示す図である。
【図４】各種の二価型ＣＸＣＲ４リガンド、及び、該ＣＸＣＲ４リガンドのＣＸＣＲ４への結合活性の評価を示す図である。
【図５】二価型ＣＸＣＲ４リガンドについてのＣＸＣＲ４レセプター結合アッセイの結果を示す図である。図５左；ＰＰリンカーを持つテンプレート化合物を用いて合成した二価型ＣＸＣＲ４リガンドについてのＣＸＣＲ４レセプター結合アッセイの結果を示す図である。図５右；ＰＰ−ＰＥＧリンカーを持つテンプレート化合物を用いて合成した二価型ＣＸＣＲ４リガンドについてのＣＸＣＲ４レセプター結合アッセイの結果を示す図である。
【図６】ＣＸＣＲ４二量体におけるリガンド結合部位同士間の推定距離を示す図である。図６左；二価型ＣＸＣＲ４リガンドのＩＣ５０（ｎＭ）と、該リガンドのリンカー長の長さ（ｎｍ）との関係を示す図である。図６右；ＣＸＣＲ４の二量体におけるリガンド結合部位同士間の推定距離を示す図である。
【図７】TAMRA-18Pro-FC131二量体でＨｅｌａ細胞を染色したものを蛍光観察又は微分干渉観察した図である。
【図８】TAMRA-6PP-FC131単量体及びAC6PP-FC131単量体でＨｅｌａ細胞を染色したものを蛍光観察又は微分干渉観察した図である。
【図９】三価型テンプレート化合物の合成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、一価型ＣＸＣＲ４リガンドに、複数の一価型ＣＸＣＲ４リガンドをテンプレート化合物を介して結合するための結合部位を導入した一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体（以下、単に「一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体」とも表示する。）を合成する工程、複数本の等価なリンカー構造を持つテンプレート化合物（以下、単に「本発明のテンプレート化合物」とも表示する。）を合成する工程、及び、該テンプレート化合物と、該一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体とを結合することにより、一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体がテンプレート化合物を介して結合した多価型ＣＸＣＲ４リガンドを合成する工程からなることを特徴とするＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンド（以下、「本発明の多価型ＣＸＣＲ４リガンド」とも表示する。）の合成方法（以下、単に「本発明の多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法」とも表示する。）からなる。
【００３８】
上記の一価型ＣＸＣＲ４リガンドとしては、一量体のＣＸＣＲ４に対するリガンドである限り特に制限されず、アゴニストであってもアンタゴニストであってもよいが、がんの転移を抑制する場合は、アンタゴニストである必要がある。一価型ＣＸＣＲ４アンタゴニストとしては、以下の一般式（７）で表されるT140や、一般式（８）で表されるFC131を好適に例示することができる。
【００３９】
【化１２】
【００４０】
【化１３】
【００４１】
また、上記の「複数の一価型ＣＸＣＲ４リガンドをテンプレート化合物を介して結合するための結合部位」としては、一価型ＣＸＣＲリガンドを本発明のテンプレート化合物に結合させ得る結合部位である限り特に制限されないが、Cys（システイン）残基を好適に例示することができる。
【００４２】
本発明における一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体の好ましい例として、FC131（一価型ＣＸＣＲ４リガンド）にD-Cys残基を導入したD-Cys-FC131を好適に例示することができる。このD-Cys-FC131の構造式は上記一般式（１）で表される。
【００４３】
本発明における、一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体を合成する工程において、一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体を合成する方法としては、一価型ＣＸＣＲ４リガンドに、前述の結合部位を導入する方法である限り特に制限されないが、一価型ＣＸＣＲ４リガンドの特定の基又は原子を、上記結合部位となり得る置換基（好ましくはCys残基）で置換する方法（Angew. Chem. Int. Ed., 42(28), 3251-3253 (2003)参照）を好適に例示することができる。一価型ＣＸＣＲ４リガンドは、公知のものを適宜合成することができ、例えばFC131は、Angew. Chem. Int. Ed., 42(28), 3251-3253 (2003)記載の合成方法により合成することができ、T140は、Biochem. Biophys. Res. Commun., 253(3), 877-882 (1998)やBioorg. Med. Chem., 6(2), 231-238 (1998)に記載の合成方法により合成することができる。
【００４４】
複数本の等価なリンカー構造を持つテンプレート化合物を合成する工程における本発明のテンプレート化合物としては、複数本の等価なリンカー構造を持ち、かつ、一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体と結合することにより、本発明の多価型ＣＸＣＲ４リガンドを合成し得る化合物である限り特に制限されないが、２本の等価なリンカー構造を持つ上記一般式（２）又は（３）で表される化合物又はその塩や、３本の等価なリンカー構造を持つ上記一般式（４）で表される化合物又はその塩や、４本の等価なリンカー構造を持つ上記一般式（５）又は（６）で表される化合物又はその塩を好適に例示することができ、中でも、２本の等価なリンカー構造を持つ上記一般式（２）又は（３）で表される化合物又はその塩を特に好適に例示することができる。また、一般式（２）におけるｎとしては、１０〜２６の範囲内の整数を好適に例示することができ、１７〜１９の範囲内の整数をより好適に例示することができ、一般式（３）におけるｍとしては、４〜１７の範囲内の整数を好適に例示することができ、８〜１３の範囲内の整数をより好適に例示することができる。なお、上記に例示される本発明のペプチド性テンプレート化合物を合成するには、Fmoc solid-phase peptide synthesis（ＳＰＰＳ）を用いることができる（Hirokazu Tamamura et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry 6 (1998)1033-1041や、"Solid phase peptide synthesis - a practical approach" by E Atherton & R C Sheppard IPI PRESS参照）。すなわち、固相合成法により、主鎖アミノ基の保護基である９−fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc)基の選択的脱保護と縮合反応の操作を繰り返し、最後に樹脂からの脱樹脂、脱保護を行なうことにより、目的とするペプチド性テンプレートか化合物を合成することができる。
【００４５】
本発明のテンプレート化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩などの塩の形態であってもよい。例えば、酸付加塩としては、塩酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩などの鉱酸塩や、シュウ酸塩、若しくは酒石酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。また、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、若しくはカルシウム塩などの金属塩や、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩若しくはエタノールアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。また、本発明のテンプレート化合物は、本発明に用い得る限り、１又は２個以上の任意の置換基を有していてもよい。２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。本発明に用い得る限り、置換基の存在位置は限定されず、置換可能な任意の部位に存在することができる。置換基の種類は特に限定されない。
【００４６】
本発明のテンプレート化合物と、本発明の一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体とを結合することにより、一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体がテンプレート化合物を介して結合した多価型ＣＸＣＲ４リガンドを合成する工程においては、本発明のテンプレート化合物と、本発明の一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体とを、phosphate buffer中で攪拌することにより、複数本の等価なリンカー構造を持つ本発明のテンプレート化合物と、本発明の一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体とを結合させ、これにより、一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体がテンプレート化合物を介して結合した多価型ＣＸＣＲ４リガンドを合成することができる（図３参照）。
【００４７】
本発明の合成方法によって合成し得る多価型ＣＸＣＲ４リガンドは、ＣＸＣＲ４多量体を認識し、また、一価型ＣＸＣＲ４リガンドがＣＸＣＲ４単量体と結合するよりも、より強力にＣＸＣＲ４多量体に結合することができる。本発明の多価型ＣＸＣＲ４リガンドは、ＣＸＣＲ４多量体との間に、より多くの結合部位を生じ得るからである。そのため、本発明の多価型ＣＸＣＲ４リガンドは、がん細胞に発現するＣＸＣＲ４により強く結合することによって、がん細胞をより高感度で検出することが可能ながん細胞検出プローブとして用いることができる。
【００４８】
本発明におけるがん細胞検出プローブとしては、本発明における多価型ＣＸＣＲ４リガンドを標識化合物で標識したものである限り特に制限されないが、検出が容易であることから、標識化合物としては蛍光標識化合物を好適に例示することができ、中でもRhodamineやFluoresceinをより好適に例示することができる。
【００４９】
また、本発明の多価型ＣＸＣＲ４リガンドが、多価型ＣＸＣＲ４に対するアンタゴニスト（以下、「本発明の多価型ＣＸＣＲ４アンタゴニスト」とも表示する。）である場合は、該アンタゴニストをがんの転移抑制剤として用いることができる。ＣＸＣＲ４アンタゴニストが腫瘍の転移を阻害又は減少させる作用を有していることは、背景技術の特許文献１に記載されている。
【００５０】
本発明のがんの転移抑制剤を調製するには、アンタゴニスト（好ましくはペプチド性のアンタゴニスト）を有効成分とした薬剤において通常採用される製剤の形態、或いは、補助剤、添加剤を用いることができる。
【実施例１】
【００５１】
［二価型ＣＸＣＲ４リガンドの設計、及び、合成スキーム］
ＣＸＣＲ４二量体はその詳細な構造が明らかになっていないため、ＣＸＣＲ４間の距離の推定は困難である。そのため、本発明のテンプレート化合物における最適なリンカー長を検討する必要があるが、結合間距離が固定されていないリンカーでは正確な検討を行うことが出来ない。そこで、構造安定性の高いpolyproline helix 2 構造を有するＰＰリンカーに着目した。ＰＰリンカーはその結合距離が明らかにされており（３残基＝９Å）、分子メジャーとして用いられている。そのため、異なる鎖長をもつＰＰリンカーを合成・検討することで、ＣＸＣＲ４二量体間の距離をより正確に特定できると考えた。更にＰＰリンカーの検討に加え、ＣＸＣＲ４におけるFC131の結合ポケットの深さも考慮し、柔軟な構造を有するpolyethylene glycol リンカーを、ＰＰリンカーの末端に修飾したＰＰ−ＰＥＧリンカーも併せて検討した（図４参照）。また、これらリンカー部の合成に関してはFmoc固相合成法を用いた（図３参照）。ＣＸＣＲ４アンタゴニストFC131はリンカー導入を行うための反応点を持たないことから、スペーサー部位のGlyをD-Cysで置換した誘導体D-Cys FC131を設計・合成し、リンカーとのコンジュゲートを行った。以上の設計、及び、合成スキームに基づいて、まずは、テンプレート化合物の合成を試みた。
【実施例２】
【００５２】
［テンプレート化合物の合成］
１．Ｄ−システイン負荷２−クロロトリチル樹脂の調製
Ｄ−システイン負荷２−クロロトリチル樹脂（1.4mmol/g）を、CH2Cl2/DMF（10.00mL）中において、Fmoc-D-Cys-OH（0.88mmol）及びN,N-diisopropylethylamine（DIPEA）（1.75mmol）で１．５時間処理した。処理後の上記樹脂をDMF及びCH2Cl2で洗浄し、その樹脂を真空乾燥した。その樹脂におけるＤ−システインの負荷の程度は、ピペリジンで処理したサンプル、すなわち、Fmoc-D-Cys-(2-Cl)-Trt-resin（0.45mmol/g）の290nmでの紫外線吸収を測定することによって決定した。
【００５３】
２．Fmoc固相合成法によるペプチドの合成
保護されたペプチド樹脂は、0.5mmolスケールにて手作業で構築した。Fmoc-アミノ酸は、DMF（1.0mL）中において、0.039mL（0.25mmol）の1,3-diisopropylcarbodiimide（DIPCI）、及び、38 mg（0.25 mmol）のN-hydroxybenzotriazole hydrate（HOBt・H2O）を用いて、１．５時間カップリングさせた。Tetramethylrhodamine単位をカップリングさせるために、93mg（0.25mmol）のHATU及び34mg（0.25mmol)の1-hydroxy-7-azabenzotriazole（HOAt）を、DIPCI/HOBtの代わりに使用した。20% (v/v) のpiperidine-DMFで１５分間処理して、Fmoc基を脱保護した。
【００５４】
このFmoc固相合成法により、図４記載の各種テンプレート化合物を合成した。なお、図４のLinker名における“Prox”とは、一般式（２）におけるｎがＸである化合物を表し、“PEG-Proy-PEG”とは、一般式（３）におけるｎがＹである化合物を表す。また、PEG-Acとは、図４右のPEGにアセチルとFC131単量体が結合した化合物を表し、Ac-Pro6とは、一般式（２）の括弧内のプロリンが６分子連結した化合物にアセチルとFC131単量体が結合した化合物を表す。
【実施例３】
【００５５】
［FC131誘導体の合成］
一価型ＣＸＣＲ４リガンドとしてFC131を用意した。このFC131に、Angew. Chem. Int. Ed., 42(28), 3251-3253 (2003)記載の方法を適用することによって、FC131の水素原子をD-Cys残基で置換し、FC131誘導体（D-Cys-FC131；一般式（１）参照）を合成した。
【実施例４】
【００５６】
［二価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成］
ｐＨ７．８のPhosphate bufferに、実施例２で合成したテンプレート化合物と、実施例３で合成したFC131誘導体とを溶解し、この溶液を攪拌した。これにより、１分子のテンプレート化合物に、２分子のFC131誘導体が結合した二価型ＣＸＣＲ４リガンドを合成した。
【実施例５】
【００５７】
［ＣＸＣＲ４レセプター結合アッセイ］
実施例４において合成した各種の二価型ＣＸＣＲ４リガンドについて、ＣＸＣＲ４結合活性の評価を試みた。この評価は、ＣＸＣＲ４の公知のリガンドである[125I]-SDF-1αを用いた競合阻害アッセイにより行なった。具体的には、以下の方法を用いた。
【００５８】
まず、細胞膜上でＣＸＣＲ４を発現する細胞として、ヒトＴ細胞株であるJurkat細胞を用意した。加熱して不活性化したウシ胎仔血清を10%含むRPMI 1640培地で、前述のJurkat細胞を培養した。培養したJurkat細胞を採取し、1000rpmで５分間遠心分離した。回収した細胞をRPMI buffer (20mM HEPES, 0.5% ウシ血清アルブミン)に再懸濁し、シリコンでコートされたチューブにその再懸濁液を120μL（5.0×105 cells）入れた。冷却したＳＤＦ−１溶液（最終濃度1μM）、及び、様々な濃度の試験化合物の10% DMSO溶液を１チューブ当たりそれぞれ15μLずつ前述のチューブ内に添加し、次いで、0.05nMの[125I]-SDF-1α（Perkin-Elmer Life Sciences社製）を、１チューブ当たり15μLずつ添加した。それらのチューブを氷上で１時間インキュベーションした後、オイル（dibutyl phthalate : olive oil = 4 : 1 (v/v)）を１チューブ当たり500μL/wellずつ添加し、次いで、14,000 rpmで２分間遠心分離した。チューブ内の水層と有機層を除去し、チューブの底部を切断した後、その底部をRadioimmunoassay（RIA）チューブに配置し、γ-counterによってcount per minute（CPM）を計測した。FC131アナログの[125I]-SDF-1αに対する結合の阻害率（％）は、以下の等式によって算出した。
阻害率（％）＝（Et−Ea）／（Et−Ec）×100
Et：試験化合物が不存在の場合の放射線の量
Ec：試験化合物として冷却したSDF-1αを存在させた場合の放射線の量
Ea：試験化合物を存在させた場合の放射線の量
【００５９】
ＰＰリンカーを持つテンプレート化合物を用いて合成した二価型ＣＸＣＲ４リガンドについての結果を図５左に示し、ＰＰ−ＰＥＧリンカーを持つテンプレート化合物を用いて合成した二価型ＣＸＣＲ４リガンドについての結果を図５右に示す。また、これらの結果を元に、算出したＩＣ５０（ｎＭ）を図４に示す。また、図４のＩＣ５０値（ｎＭ）を縦軸に、リンカー部分の長さ（linker length（ｎｍ））を横軸にとってグラフ化した図を図６左に示す。図６左の結果から分かるように、二価型ＣＸＣＲ４リガンドの結合活性は、二価型ＣＸＣＲ４リガンドにおけるリンカーの長さに依存するような増減を示した。例えば、Pro18リンカーを持つテンプレート化合物に、２分子のFC131が結合した18PP-FC131二量体では、Ac-Pro6リンカーを持つテンプレート化合物に、１分子のFC131が結合したAC6PP-FC131単量体の６倍という高いＣＸＣＲ４結合活性を示した。また、PEG-Pro12-PEGリンカーを持つテンプレート化合物に、２分子のFC131が結合した12PP PEG-FC131二量体では、PEG-Acリンカーを持つテンプレート化合物に、１分子のFC131が結合したPEG AC-FC131単量体の２０倍という高いＣＸＣＲ４結合活性を示した。このように、ＰＰリンカー及びＰＥＧリンカーのいずれを用いた場合も、リンカー長が５．５−６．５ｎｍのときに、二価型ＣＸＣＲ４リガンドのＣＸＣＲ４結合活性が著しく上昇した。このことから、二価型ＣＸＣＲ４リガンドにおいて、FC131とテンプレート化合物とが結合している部位同士間の距離は５．５−６．５ｎｍであること、及び、ＣＸＣＲ４の二量体におけるリガンド結合部位同士間の距離も５．５−６．５ｎｍであること（図６右）が考えられた。また、ＣＸＣＲ４等を含むＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、通常、アゴニスト依存的に二量体化すると考えられているが、FC131はＣＸＣＲ４のアンタゴニストであるにもかかわらず、二価型の状態でＣＸＣＲ４への結合活性が相乗的に上昇した。このことは、ＣＸＣＲ４が細胞に多量体として存在する事を示唆するものであり、ＣＸＣＲ４等のＧＰＣＲの二量体化機構に対する新たな知見を提供するものと考えられる。
【実施例６】
【００６０】
［共焦点顕微鏡システムを用いた蛍光イメージ解析］
本発明の二価型ＣＸＣＲ４リガンドが、ＣＸＣＲ４に特異的に結合するかどうかを確認するために、共焦点顕微鏡システムを用いた蛍光イメージ解析を行なった。具体的には以下の方法で行なった。
【００６１】
まず、本発明の二価型ＣＸＣＲ４リガンドとして、18Pro-FC131二量体を用意し、コントロールの一価型ＣＸＣＲ４リガンドとして、6PP-FC131単量体及びAC6PP-FC131単量体を用意した。これらの３種類のＣＸＣＲ４リガンドをそれぞれ蛍光色素（TAMRA）で標識し、TAMRA-18Pro-FC131二量体、TAMRA-6PP-FC131単量体、及びTAMRA-AC6PP-FC131単量体を作製した。
【００６２】
ＣＸＣＲ４−ＧＦＰ融合タンパク質を安定発現する又はしないＨｅｌａ細胞を、10%のウシ胎仔血清（FBS）を補充したDMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）を含む直径1.4cmのガラス底培養皿に、１皿当たり5×104 cellsずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ２条件下で２日間インキュベートした後、ガラス底培養皿から培地を除去し、残った細胞を、20mM HEPES（pH7.4）を含むDMEMで３回洗浄した。上記の３種類の蛍光標識ＣＸＣＲ４リガンドをそれぞれのガラス底培養皿に添加し、その混合物を１５分間室温でインキュベートした。次いで、ガラス底培養皿から培地を除去し、フェノールレッドを含まないDMEMで細胞を３回洗浄した。洗浄した各細胞をLSM 510 laser-scanning confocal microscope (Zeiss GmbH社製, Oberkochen, Germany)で観察した。その結果を図７及び図８に示す。図７の４つのパネルは、TAMRA-18Pro-FC131二量体を２５ｎＭとなるようにガラス底培養皿に添加したものの観察結果であり、図８の４つのパネルは、TAMRA-6PP-FC131単量体及びAC6PP-FC131単量体の両方をそれぞれ２５ｎＭとなるようにガラス底培養皿に添加したものの観察結果である。図７及び図８のそれぞれ４つのパネルのうち、左上のパネルはＧＦＰの緑色を検出したパネルであり、右上のパネルは微分干渉により対象を観察したパネルであり、左下のパネルはTAMRAの赤色を検出したパネルであり、右下のパネルは、左上のパネルと右上のパネルと左下のパネルとを重ね合わせたパネルである。
【００６３】
図７及び図８の結果から分かるように、一価型ＣＸＣＲ４リガンド（TAMRA-6PP-FC131単量体及びAC6PP-FC131単量体）はＣＸＣＲ４に結合しなかったものの、二価型ＣＸＣＲ４リガンド（TAMRA-18Pro-FC131二量体）は、ＣＸＣＲ４に特異的に結合していることが確認された（図７左下パネル、及び、図８左下パネル参照）。また、これらの蛍光イメージ解析の結果から、本発明の二価型ＣＸＣＲ４リガンドは、がん細胞を高感度で検出し得るがん細胞検出プローブとして用い得ることが示された。
【実施例７】
【００６４】
［三価型テンプレート化合物、及び、四価型テンプレート化合物の合成］
図９に示される化合物及び反応を利用して、上記の一般式（４）に示される三価型のテンプレート化合物を合成した。また、上記の一般式（５）や（６）に示される四価型のテンプレート化合物を合成した。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明の多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法によれば、一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体やテンプレート化合物を用いて、一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体がテンプレート化合物を介して結合した多価型ＣＸＣＲ４リガンドを得ることができる。本発明の多価型ＣＸＣＲ４リガンドは、がん細胞に発現するＣＸＣＲ４多量体に対して優れた結合活性を有するため、がん細胞の高感度検出の分野に有用である。また、本発明の多価型ＣＸＣＲ４リガンドが多価型ＣＸＣＲ４アンタゴニストである場合は、がんの転移を効果的に抑制することができるため、がん転移抑制剤の分野に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一価型ＣＸＣＲ４リガンドに、複数の一価型ＣＸＣＲ４リガンドをテンプレート化合物を介して結合するための結合部位を導入した一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体を合成する工程、複数本の等価なリンカー構造を持つテンプレート化合物を合成する工程、及び、該テンプレート化合物と、該一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体とを結合することにより、一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体がテンプレート化合物を介して結合した多価型ＣＸＣＲ４リガンドを合成する工程からなることを特徴とするＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法。
【請求項２】
一価型ＣＸＣＲ４リガンドの誘導体を合成する工程が、一価型ＣＸＣＲ４リガンドに、テンプレート化合物と結合するために必要なシステインを導入するものであることを特徴とする請求項１に記載のＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法。
【請求項３】
一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体が、下記一般式（１）で表される化合物又はその塩であることを特徴とする請求項２に記載のＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法。
【化１】
【請求項４】
複数本の等価なリンカー構造を持つテンプレート化合物が、２本の等価なリンカー構造を持つ下記一般式（２）又は（３）で表される化合物又はその塩であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法。
【化２】
（但し、ｎは整数を表す。）
【化３】
（但し、ｍは整数を表す。）
【請求項５】
請求項４に記載の一般式（２）又は（３）で表される化合物において、ｎが１０〜２６の範囲内の整数であり、ｍが４〜１７の範囲内の整数であることを特徴とする請求項４に記載のＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法。
【請求項６】
複数本の等価なリンカー構造を持つテンプレート化合物が、３本の等価なリンカー構造を持つ下記一般式（４）で表される化合物又はその塩であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法。
【化４】
【請求項７】
複数本の等価なリンカー構造を持つテンプレート化合物が、４本の等価なリンカー構造を持つ下記一般式（５）又は（６）で表される化合物又はその塩であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法。
【化５】
【化６】
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法によって合成されたＣＸＣＲ４多量体を高感度に認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンド。
【請求項９】
ＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドが、２本の等価なリンカー構造を持つ下記一般式（２）又は（３）で表される化合物又はその塩からなるテンプレート化合物によって結合された２価型ＣＸＣＲ４リガンドであることを特徴とする請求項８に記載のＣＸＣＲ４多量体を高感度に認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンド。
【化７】
（但し、ｎは整数を表す。）
【化８】
（但し、ｍは整数を表す。）
【請求項１０】
２本の等価なリンカー構造を持つ請求項９に記載の一般式（２）又は（３）で表される化合物又はその塩からなるテンプレート化合物において、ｎが１０〜２６の範囲内の整数であり、ｍが４〜１７の範囲内の整数であることを特徴とする請求項９に記載のＣＸＣＲ４多量体を高感度に認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンド。
【請求項１１】
ＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドが、３本の等価なリンカー構造を持つ下記一般式（４）で表される化合物又はその塩からなるテンプレート化合物によって結合された３価型ＣＸＣＲ４リガンドであることを特徴とする請求項８に記載のＣＸＣＲ４多量体を高感度に認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンド。
【化９】
【請求項１２】
ＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドが、４本の等価なリンカー構造を持つ下記一般式（５）又は（６）で表される化合物又はその塩からなるテンプレート化合物によって結合された４価型ＣＸＣＲ４リガンドであることを特徴とする請求項８に記載のＣＸＣＲ４多量体を高感度に認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンド。
【化１０】
【化１１】
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれかに記載の多価型ＣＸＣＲ４リガンドを、標識化合物で標識してなるがん細胞検出用プローブ。
【請求項１４】
請求項８〜１２のいずれかに記載の多価型ＣＸＣＲ４リガンドを有効成分とするがんの転移抑制剤。
【請求項１】
一価型ＣＸＣＲ４リガンドに、複数の一価型ＣＸＣＲ４リガンドをテンプレート化合物を介して結合するための結合部位を導入した一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体を合成する工程、複数本の等価なリンカー構造を持つテンプレート化合物を合成する工程、及び、該テンプレート化合物と、該一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体とを結合することにより、一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体がテンプレート化合物を介して結合した多価型ＣＸＣＲ４リガンドを合成する工程からなることを特徴とするＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法。
【請求項２】
一価型ＣＸＣＲ４リガンドの誘導体を合成する工程が、一価型ＣＸＣＲ４リガンドに、テンプレート化合物と結合するために必要なシステインを導入するものであることを特徴とする請求項１に記載のＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法。
【請求項３】
一価型ＣＸＣＲ４リガンド誘導体が、下記一般式（１）で表される化合物又はその塩であることを特徴とする請求項２に記載のＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法。
【化１】
【請求項４】
複数本の等価なリンカー構造を持つテンプレート化合物が、２本の等価なリンカー構造を持つ下記一般式（２）又は（３）で表される化合物又はその塩であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法。
【化２】
（但し、ｎは整数を表す。）
【化３】
（但し、ｍは整数を表す。）
【請求項５】
請求項４に記載の一般式（２）又は（３）で表される化合物において、ｎが１０〜２６の範囲内の整数であり、ｍが４〜１７の範囲内の整数であることを特徴とする請求項４に記載のＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法。
【請求項６】
複数本の等価なリンカー構造を持つテンプレート化合物が、３本の等価なリンカー構造を持つ下記一般式（４）で表される化合物又はその塩であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法。
【化４】
【請求項７】
複数本の等価なリンカー構造を持つテンプレート化合物が、４本の等価なリンカー構造を持つ下記一般式（５）又は（６）で表される化合物又はその塩であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法。
【化５】
【化６】
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の多価型ＣＸＣＲ４リガンドの合成方法によって合成されたＣＸＣＲ４多量体を高感度に認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンド。
【請求項９】
ＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドが、２本の等価なリンカー構造を持つ下記一般式（２）又は（３）で表される化合物又はその塩からなるテンプレート化合物によって結合された２価型ＣＸＣＲ４リガンドであることを特徴とする請求項８に記載のＣＸＣＲ４多量体を高感度に認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンド。
【化７】
（但し、ｎは整数を表す。）
【化８】
（但し、ｍは整数を表す。）
【請求項１０】
２本の等価なリンカー構造を持つ請求項９に記載の一般式（２）又は（３）で表される化合物又はその塩からなるテンプレート化合物において、ｎが１０〜２６の範囲内の整数であり、ｍが４〜１７の範囲内の整数であることを特徴とする請求項９に記載のＣＸＣＲ４多量体を高感度に認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンド。
【請求項１１】
ＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドが、３本の等価なリンカー構造を持つ下記一般式（４）で表される化合物又はその塩からなるテンプレート化合物によって結合された３価型ＣＸＣＲ４リガンドであることを特徴とする請求項８に記載のＣＸＣＲ４多量体を高感度に認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンド。
【化９】
【請求項１２】
ＣＸＣＲ４多量体を認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンドが、４本の等価なリンカー構造を持つ下記一般式（５）又は（６）で表される化合物又はその塩からなるテンプレート化合物によって結合された４価型ＣＸＣＲ４リガンドであることを特徴とする請求項８に記載のＣＸＣＲ４多量体を高感度に認識する多価型ＣＸＣＲ４リガンド。
【化１０】
【化１１】
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれかに記載の多価型ＣＸＣＲ４リガンドを、標識化合物で標識してなるがん細胞検出用プローブ。
【請求項１４】
請求項８〜１２のいずれかに記載の多価型ＣＸＣＲ４リガンドを有効成分とするがんの転移抑制剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１１−１２０３５（Ｐ２０１１−１２０３５Ａ）
【公開日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１５９７７１（Ｐ２００９−１５９７７１）
【出願日】平成２１年７月６日（２００９．７．６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成２０年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構委託研究（健康安心イノベーションプログラム「分子イメージング機器研究開発プロジェクト／新規悪性腫瘍分子プローブの基盤技術開発／分子プローブ要素技術の開発」）、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月６日（２００９．７．６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成２０年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構委託研究（健康安心イノベーションプログラム「分子イメージング機器研究開発プロジェクト／新規悪性腫瘍分子プローブの基盤技術開発／分子プローブ要素技術の開発」）、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【Ｆターム（参考）】
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