ＤＩＧ−３殺虫性ＣＲＹトキシン
ＤＩＧ−３Ｃｒｙトキシン、このトキシンをコードするポリヌクレオチド、およびこのトキシンを産生する遺伝子導入植物は、害虫を防除するのに有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、参照により本明細書に明確に組み込まれる、２００９年４月１７日に出願の米国特許仮出願第６１／１７０１８９号に対して利益を主張する。
【０００２】
本発明は、新規な殺虫性Ｃｒｙトキシン、および昆虫を防除するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)(Ｂ．ｔ．)は、δ−エンドトキシンまたはＣｒｙタンパク質として知られる農薬結晶タンパク質を産生する土壌伝播性細菌である。Ｃｒｙタンパク質は、感受性のある昆虫の中腸細胞に作用することによって機能する経口の中毒性物質である。δ−エンドトキシンの広範なリストが、http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.html.に維持され、定期的に更新されている。
【０００４】
ユーロピアンコーンボーラー（European corn borer）（ＥＣＢ）、オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）（Ｈｕｂｎｅｒ）は、米国およびカナダの全域にわたってトウモロコシに最も損害を与える害虫であり、穀物収量の損失および昆虫管理用の費用により、１年に推定で１０億ドルの収入低下をもたらす（Ｗｉｔｋｏｗｓｋｉら、２００２年）。Ｃｒｙタンパク質、最も顕著にはＣｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１ＡｃまたはＣｒｙ１Ｆをコードする遺伝子を発現する遺伝子導入トウモロコシは、ＥＣＢに対して商業的レベルの効力を提供する。
【０００５】
ＥＣＢ耐性遺伝子導入トウモロコシが成功したにもかかわらず、耐性昆虫集団の発生の可能性により、ＥＣＢ防除におけるＣｒｙタンパク質の長期耐用性がおびやかされ、ＥＣＢおよびその他の有害生物を防除するための新規なＣｒｙタンパク質を発見および開発する必要性が生じる。Ｂ．ｔ．Ｃｒｙタンパク質に対する昆虫の耐性は、いくつかの機構を介して発生する可能性がある（Ｈｅｃｋｅｌら、２００７年；ＰｉｇｏｔｔおよびＥｌｌａｒ、２００７年）。Ｃｒｙタンパク質に対する多数のクラスの受容体タンパク質が、昆虫内で確認され、多数の例が各受容体クラス内に存在する。特定のＣｒｙタンパク質に対する耐性は、例えば、受容体タンパク質のカドヘリン領域のトキシン結合部分内での突然変異によって発生する可能性がある。耐性のさらなる手段は、プロトキシンを処理するプロテアーゼによって媒介される可能性がある。したがって、鱗翅目（Lepidoptera）の種におけるＣｒｙトキシンに対する耐性は、少なくとも４つの異なる主要耐性遺伝子によって複雑な遺伝子的根拠を有する。Ｃｒｙタンパク質に対して耐性である鱗翅目昆虫は、コナガ（Plutella xylostella）種（Ｔａｂａｓｈｎｉｋ、１９９４年）、キンウワバ（Trichoplusia ni）種（ＪａｎｍａａｔおよびＭｙｅｒｓ、２００３、２００５年）、およびオオタバコガ（Helicoverpa zeae）種（Ｔａｂａｓｈｎｉｋら、２００８年）の中の分野で発生した。新規で効力の高いＣｒｙタンパク質の開発は、ＥＣＢおよびその他の害虫を管理するためのさらなるツールを提供するであろう。遺伝子導入トウモロコシ中で組み合わせて作られる異なる作用機序を有するＣｒｙタンパク質は、ＥＣＢ昆虫の耐性の発生を防ぎ、害虫防除のためのＢ．ｔ．技術の長期有用性を保護するであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、本明細書中でＤＩＧ−３と呼ばれるトキシンおよびＤＩＧ−３の変異体を含む殺虫性Ｃｒｙトキシン、これらのトキシンをコードする核酸、該トキシンを使用して有害生物を規制する方法、遺伝子導入宿主細胞中でトキシンを産生させる方法、および該トキシンを産生する遺伝子導入植物を提供する。野生型ＤＩＧ−３トキシンの予想されるアミノ酸配列を、配列番号２に示す。
【０００７】
実施例１に記載のように、ＤＩＧ−３タンパク質をコードする核酸は、Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣによってＰＳ４６Ｌと内部的に呼ばれるＢ．ｔ．株から単離された。完全長コード領域に関する核酸配列を決定し、その核酸配列から完全長タンパク質配列を推定した。ＤＩＧ−３トキシンは、Ｃｒｙ１ＢＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＭ９３４９６）およびその他のＢ．チューリンゲンシス（B.thuringiensis）のＣｒｙ１Ｂ型タンパク質に対していくらかの類似性を有する（http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.html）。
【０００８】
ＤＩＧ−３トキシンの殺虫活性のある変異体も、本明細書中で説明され、集約的にＤＩＧ−３トキシンと呼ぶ。
【０００９】
ＤＩＧ−３トキシンは、また、その他の害虫を防除するためのＲＮＡｉの方法と組み合わせて使用することができる。例えば、コーンルートワーム（corn rootworm）中の必須遺伝子、または害虫中の必須遺伝子を抑制するために、ＤＩＧ−３を、遺伝子導入植物中で、ｄｓＲＮＡと組み合わせて使用することができる。このような標的遺伝子としては、例えば、液胞型ＡＴＰアーゼ、ＡＲＦ−１、Ａｃｔ４２Ａ、ＣＨＤ３、ＥＦ−１α、およびＴＦＩＩＢが挙げられる。適切な標的遺伝子の例は、国際公開第２００７／０３５６５０号中に開示されているような液胞型ＡＴＰアーゼである。
【００１０】
本明細書中で報告する驚くべき発見は、ＤＩＧ−３トキシンが、Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａトキシンに対して耐性であるユーロピアンコーンボーラー（European corn borer）およびダイアモンドバックモス（diamond back moth）の各集団に対して活性であることである。したがって、ＤＩＧ−３トキシンは、鱗翅目の有害生物の規制に使用するには理想的な候補である。該トキシンは、単独で、または耐性昆虫集団の発生を抑制するために、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ａｃなどのその他のＣｒｙトキシンと組み合わせて使用することができる。
【００１１】
配列番号２の殺虫活性のあるフラグメント、およびこのようなフラグメントをコードするヌクレオチドは、本発明の別の態様である。
【００１２】
一実施形態において、本発明は、
（ａ）配列番号２の残基１１３〜６４３のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２の残基１１３〜６４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号２によってコードされるトキシンの発現または活性に不都合な影響を及ぼさない２０個までのアミノ酸の置換、欠失または修飾を有する、配列番号２の残基１１３〜６４３のアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるコアトキシンセグメントを含む、単離されたＤＩＧ−３トキシンポリペプチドを提供する。
【００１３】
一実施形態において、本発明は、
（ａ）配列番号２の残基７３〜６４３のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２の残基７３〜６４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号２によってコードされるトキシンの発現または活性に不都合な影響を及ぼさない２０個までのアミノ酸の置換、欠失または修飾を有する、配列番号２の残基７３〜６４３のアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるコアトキシンセグメントを含む、単離されたＤＩＧ−３トキシンポリペプチドを提供する。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、
（ａ）配列番号２の残基１〜６４３のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２の残基１〜６４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号２によってコードされるトキシンの発現または活性に不都合な影響を及ぼさない２０個までのアミノ酸の置換、欠失または修飾を有する、配列番号２の残基１〜６４３のアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるＤＩＧ−３コアトキシンセグメントを含む、単離されたＤＩＧ−３トキシンポリペプチドを提供する。
【００１５】
「単離された」とは、本出願人らによれば、ポリペプチドまたはＤＮＡ分子が、人の手によってそれらの本来の環境から取り出され、異なる環境に置かれていることを意味する。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、ＤＩＧ−３トキシンを含む植物を提供する。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、有害生物集団を規制する方法であって、前記集団を農薬上有効な量のＤＩＧ−３トキシンと接触させることを含む方法を提供する。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、ＤＩＧ−３トキシンをコードする単離された核酸を提供する。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）由来でなく植物中での発現を駆動する能力のあるプロモーターに作動可能に連結された、ＤＩＧ−３トキシンをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物を提供する。本発明は、また、そのゲノム中に安定的に組み込まれたＤＮＡ構築物を含む遺伝子導入植物、および有害生物から植物を保護する方法であって、前記植物中に該構築物を導入することを含む方法を提供する。
【００２０】
配列の簡単な説明
配列番号１は、完全長ＤＩＧ−３トキシンをコードするＤＮＡ配列である（３７７１個のヌクレオチド）。
【００２１】
配列番号２は、完全長ＤＩＧ−３タンパク質配列である（１２５６個のアミノ酸）。
【００２２】
配列番号３は、植物に対して最適化された完全長ＤＩＧ−３ＤＮＡ配列である（３７７１個のヌクレオチド）。
【００２３】
配列番号４は、Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントである（５４５個のアミノ酸）。
【００２４】
配列番号５は、キメラトキシン：ＤＩＧ−３コアトキシンセグメント／Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントである（１１８８個のアミノ酸）。
【００２５】
配列番号６は、双子葉植物に対して最適化された、Ｃｒｙ１ＡｂプロトキシンセグメントをコードするＤＮＡ配列である（１６３５のヌクレオチド）。
【００２６】
配列番号７は、トウモロコシに対して最適化された、Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントをコードする、ＤＮＡ配列である（１６３５のヌクレオチド）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
ＤＩＧ−３トキシン、および殺虫活性のある変異体。
配列番号２の完全長ＤＩＧ−３トキシンに加えて、本発明は、殺虫活性のある変異体も包含する。用語「変異体」とは、本出願人らによれば、フラグメント、特定の欠失および挿入突然変異体、ならびに特定の融合タンパク質を包含することを意図する。ＤＩＧ−３は、典型的な３ドメイン型Ｃｒｙトキシンである。本発明に包含されるＤＩＧ−３トキシンの変異体を説明する前置きとして、概括的に３ドメイン型Ｃｒｙトキシン、とりわけＤＩＧ−３タンパク質トキシンの構成を簡単に概観することが有用であろう。
【００２８】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のδ−エンドトキシン結晶タンパク質分子の大部分は、２つの機能性セグメントから構成されている。プロテアーゼ耐性コアトキシンは第１セグメントであり、タンパク分子の最初の約半分に相当する。約１３０ｋＤａの完全なプロトキシン分子は、昆虫消化管中のプロテアーゼによって、耐性なコアセグメントへと迅速にプロセッシングされる。このプロセッシングによって除去されるセグメントを、本明細書中で「プロトキシンセグメント」と呼ぶ。プロトキシンセグメントは、トキシン結晶の形成に関与すると考えられる（Ａｒｖｉｄｓｏｎら、１９８９）。プロトキシンセグメントは、かくして、トキシン分子のプロテアーゼプロセッシングを低減させることによりコアが昆虫に到達するのを制限することによって（Ｈａｉｄｅｒら、１９８６）、またはトキシンの溶解性を低下させることによって（Ａｒｏｎｓｏｎら、１９９１）、トキシンに対する一部の昆虫の特異性を運ぶようである。Ｂ．ｔ．トキシンは、特定のクラス内でさえも、コアトキシンセグメントからプロトキシンセグメントへの移行についての長さおよび正確な配置においてある程度変動する。コアトキシンセグメントからプロトキシンセグメントへの移行は、典型的には、完全長トキシンのうちの約５０％〜約６０％で起こることになる。配列番号２は、完全長ＤＩＧ−３ポリペプチドの１２５６アミノ酸の配列を開示し、その中のＮ末端の６４３個のアミノ酸が、ＤＩＧ−３のコアトキシンセグメントを含む。配列番号１の５’末端の１９２９個のヌクレオチドが、コアトキシンセグメントのためのコード領域を含む。
【００２９】
Ｃｒｙ１Ａａ１、Ｃｒｙ２Ａａ１、Ｃｒｙ３Ａａ１、Ｃｒｙ３Ｂｂ１、Ｃｒｙ４Ａａ、Ｃｒｙ４ＢａおよびＣｒｙ８Ｅａ１についての三次元結晶構造が決定されている。コアトキシンに関するこれらの構造は、著しく類似しており、後述の特徴を有する３つの異なるドメインから構成される（ｄｅ Ｍａａｇｄら、２００３年で概説されている）。
【００３０】
ドメインＩは、７つのα−へリックスの束であり、α−へリックス５は、６つの両親媒性へリックスで取り囲まれている。このドメインは、細孔形成に関連し、溶血毒およびコリシンを含む他の細孔生成タンパク質と相同性を有している。ＤＩＧ−３タンパク質のドメインＩは、配列番号２のアミノ酸残基５６〜２７８を含む。
【００３１】
ドメインＩＩは、β−プリズム中に一緒に詰められた３つの逆並行βシートによって形成されている。このドメインのループは、昆虫の中腸受容体に結合する上で重要な役割を演じる。Ｃｒｙ１Ａタンパク質において、ドメインＩＩのβシートの頂端で表面に露出されたループは、鱗翅目類のカドヘリン受容体に結合するのに関与する。Ｃｒｙ３ＡａのドメインＩＩのループは、レプチノタルサ・デセムリネアタ（Leptinotarsa decemlineata）（Ｓａｙ）（コロラドポテトビートル（Colorado potato beetle））の膜結合型メタロプロテアーゼに類似の方式で結合する（Ｏｃｈｏａ−Ｃａｍｐｕｚａｎｏら、２００７）。ドメインＩＩは、卵黄およびジャカリンを含めた特定の炭水化物結合性タンパク質と相同性を有する。ＤＩＧ−３タンパク質のドメインＩＩは配列番号２のアミノ酸残基２８３〜４９３を含む。
【００３２】
ドメインＩＩＩは、２つの逆平行βシートのβサンドイッチである。このドメインは、構造上、グルカナーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、シアリダーゼなどのタンパク質の炭水化物結合ドメインと関係する。ドメインＩＩＩは、特定のクラスの受容体タンパク質に結合し、おそらくは第２のクラスの受容体（その例が、Ｃｒｙ１Ａタンパク質の場合のアミノペプチダーゼおよびアルカリホスファターゼである）と相互作用するオリゴマー性トキシンプレ細孔の挿入に関係する（ＰｉｇｏｔｔおよびＥｌｌａｒ、２００７）。さらに、類似のＣｒｙドメインＩＩＩ受容体が鞘翅目で確認されている。保存されたＢ．ｔ．配列のブロック２および３は、それぞれドメイン２のＮ末端およびＣ末端の近くに位置する。それゆえ、これらの保存された配列のブロック２および３は、３つの機能性ドメイン間の概算の境界領域である。これらの領域の保存されたＤＮＡおよびタンパク質の相同性は、組み換えＢ．ｔ．トキシンを遺伝子操作するために活用されている（米国特許第６０９０９３１号、国際公開第９１／０１０８７号、国際公開第９５／０６７３０号、国際公開第１９９８／０２２５９５号）。ＤＩＧ−３タンパク質のドメインＩＩＩは、配列番号２のアミノ酸残基５０３〜６４１を含む。
【００３３】
ドメインＩのα−へリックス１は、受容体に結合した後、除去されることが報告されている。Ａｒｏｎｓｏｎら（１９９９）は、ＢＢＭＶに結合したＣｒｙ１Ａｃが、α−へリックス１の直後の残基５９で始まるプロテイナーゼＫによる開裂から保護されることを立証し、Ｃｒｙ１Ａｂについて同様の結果が述べられている。Ｇｏｍｅｚら（２００２）は、ＢＢＭＶ受容体に結合して形成されるＣｒｙ１Ａｂオリゴマーが、ドメインＩのα−へリックス１部分を欠くことを見出した。また、Ｓｏｂｅｒｏｎら（２００７）は、三次元Ｃｒｙ構造上のα−へリックス１を包含するほぼ６０個のアミノ酸を欠くＣｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１ＡｃのＮ末端欠失突然変異体が、カドヘリン結合の不在下で、分子量約６０ｋＤａのモノマーをプレ細孔に組み立てる能力があることを示した。これらのＮ末端欠失突然変異体は、Ｃｒｙ耐性の昆虫幼生に対して活性であると報告された。さらに、Ｄｉａｚ−Ｍｅｎｄｏｚａら（２００７）は、地中海コーンボーラー（Mediterranean corn borer）（Sesamia nonagrioides）に対する活性を保持している４３ｋＤａおよび４６ｋＤａのＣｒｙ１Ａｂフラグメントを発表した。これらのフラグメントは、アミノ酸残基１１６〜４２３を含むことが立証されたが、正確なアミノ酸配列は解明されておらず、これらのタンパク質分解性フラグメントの活性の機構は未知である。Ｇｏｍｅｚら（２００２）、Ｓｏｂｅｒｏｎら（２００７）およびＤｉａｚ−Ｍｅｎｄｏｚａら（２００７）の結果は、Ｃｒｙ１ＡｂのＮ末端からの３６個のアミノ酸の欠失が殺虫活性の喪失をもたらしたことを報告したＨｏｆｔｅら（１９８６）の結果と対照的である。
【００３４】
本発明者らは、ＤＩＧ−３トキシンのドメインＩ中の、α−へリックス１、α−へリックス２Ａ、α−へリックス２Ｂ、およびα−へリックス３の始まりと終わり、ならびにそれらの間のスペーサー領域の位置を、ＤＩＧ−３タンパク質の配列をその構造が既知であるＣｒｙ８Ｅａ１についてのタンパク質配列と比較することによって推定した。これらの位置を表１に記す。
【表１】
【００３５】
ＤＩＧ−３のアミノ末端欠失変異体。
本発明は、その一態様において、殺虫活性を改善し、昆虫による耐性の発生を回避するために、α−へリックス１、α−へリックス２Ａ、およびα−へリックス２Ｂのすべてまたは一部が欠失したＤＩＧ−３変異体を提供する。これらの改変は、改善された標的有害生物の範囲、効力、および耐虫性の管理などの改善された特性を備えたＤＩＧ−３変異体を提供するために行われた。本発明の一部の実施形態において、対象とする改変は、昆虫の中毒につながるプロトキシン活性化および細孔形成の有効性に影響を及ぼす可能性がある。より具体的には、改善された特性を備えたＤＩＧ−３変異体を提供するために、ＤＩＧ−３タンパク質のＮ末端をコードする核酸配列の一部を除去する段階的欠失が記述される。その欠失は、ドメインＩのα−へリックス１のすべて、およびα−へリックス２のすべてまたは一部を、α−へリックス３〜７の構造的完全性を維持しながら除去する。したがって、本発明は一部としては、より有効な細孔形成のためのドメイン１のα−へリックス構成部分を遺伝子操作することによってなされるＣｒｙタンパク質の有効性の改善に関する。より具体的には、本発明は一部としては、Ｃｒｙ１タンパク質のドメインＩ中のα−へリックス１およびα−へリックス２に対する推定上の二次的な構造相同性を備えた領域中にＮ末端欠失を有するように設計された、改善されたＤＩＧ−３タンパク質に関する。
【００３６】
ＤＩＧ−３トキシンの殺虫特性を改善するための欠失は、予想されるα−へリックス２Ａの開始点の前に始まることができ、かつα−へリックス２Ｂの終結点の後に終わることができるが、好ましくはα−へリックス３中に延びることはない。
【００３７】
Ｎ末端欠失変異体のためのコード配列の設計において、メチオニンをコードするＡＴＧ開始コドンは、欠失変異体をコードするように設計されたヌクレオチド配列の５’末端で挿入される。遺伝子導入植物中で使用するために設計された配列の場合、Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ（１９９７）の「Ｎ末端則」に従うことが有益である可能性がある。一部のアミノ酸は、タンパク質のＮ末端残基として提示されると真核細胞中でのタンパク質の不安定性および分解の一因となることが教示されている。例えば、酵母および哺乳動物細胞中での観察から集められたデータは、Ｎ末端を不安定化するアミノ酸は、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅおよび可能性としてはＰであることを示している。タンパク質の分解機構の詳細は、生物間で多少異なる可能性があるが、上で観察されるＮ末端を不安定化するアミノ酸の同一性が保存されていることは、類似の機構が植物細胞中で機能できることを示唆している。例えば、Ｗｏｒｌｅｙら（１９９８）は、植物において、Ｎ末端則は、塩基性および芳香族残基を包含することを見出した。主題のＢ．ｔ．殺虫性タンパク質のα−へリックス３の開始点近くでの植物プロテアーゼによるタンパク質分解性の開裂は、不安定化Ｎ末端アミノ酸を露出する可能性があることがあり得る。このようなプロセシングは、開裂されたタンパク質を急速な崩壊に導き、Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質の蓄積を、有効な昆虫防除に不十分なレベルまでに制限する可能性がある。したがって、不安定安化アミノ酸の１つで始まるＮ末端欠失変異体の場合、本出願人らは、翻訳開始メチオニンと不安定化アミノ酸との間にＧ（グリシン）アミノ酸を指定するコドンを付加することを選択する。
【００３８】
実施例２は、本発明によるＤＩＧ−３のアミノ末端欠失変異体の具体例を与える。毒性を保持するさらなる有用なフラグメントは、完全長の可溶化結晶タンパク質のトリプシンまたはキモトリプシン消化によって同定することができる。毒性ＤＩＧ−３タンパク質フラグメントのさらなる例は、ＤＩＧ−３コード領域のフラグメントによってコードすることができる。昆虫に活性なＤＩＧ−３変異体は、大部分が、短いＮ末端切断、および長いＣ末端切断を有することになる。最も短い毒性フラグメントのＮ末端終端は、当技術分野で日常的に利用可能な技術によるトリプシンまたはキモトリプシンで処理された可溶性結晶タンパク質のＮ末端アミノ酸配列決定によって好都合に決定される。
【００３９】
キメラトキシン。別のＣｒｙトキシンのプロトキシンセグメントに融合された１つのＣｒｙトキシンのコアトキシンセグメントを利用するキメラタンパク質が、以前に報告されている。ＤＩＧ−３変異体は、コアトキシンセグメントの終端を越えたいくつかの箇所で異種プロトキシンセグメントに融合されたＤＩＧ−３トキシンのＮ末端コアトキシンセグメントを含むトキシン（完全長であっても、前記のＮ末端欠失を有してもよい）を包含する。異種プロトキシンセグメントへの移行は、ほぼ本来のコアトキシン／プロトキシン結合点で起こることができ、あるいは代替的に、本来のプロトキシンの一部（コアトキシンセグメントを越えて延びる）を、下流中で起こる異種プロトキシンへの移行を伴って保持することができる。例として、本発明のキメラトキシンは、ＤＩＧ−３の完全長コアトキシンセグメント（アミノ酸１〜６４３）および異種プロトキシンセグメント（アミノ酸６４３〜Ｃ末端）を有する。好ましい実施形態において、異種プロトキシンセグメントは、配列番号５に示したような、Ｃｒｙ１Ａｂδ−エンドトキシンから誘導される。
【００４０】
配列番号４は、本発明のＤＩＧ−３変異体で有用なＣｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントの５４５個のアミノ酸の配列を開示する。本発明のキメラトキシン中に含めることが最も重要である、このプロトキシンセグメントの末尾の約１００〜１５０個のアミノ酸が注目される。
【００４１】
プロテアーゼ感受性変異体。
昆虫の消化管内プロテアーゼは、典型的には、飼料のタンパク質から必要なアミノ酸を得ることにおいて昆虫を助けることで機能する。最も理解されている昆虫の消化性プロテアーゼは、とりわけ鱗翅目種中で最も一般的であると思われるセリンプロテアーゼである（ＥｎｇｌｅｍａｎｎおよびＧｅｒａｅｒｔｓ、１９８０）。鞘翅目昆虫は、鱗翅目の消化管に比べてより中性〜酸性である消化管を有する。鞘翅目の幼虫および成虫の大部分、例えば、コロラドポテトビートル（Colorado potato beetle）は、わずかに酸性の中腸を有し、システインプロテアーゼが、重要なタンパク質分解活性を提供する（ＷｏｌｆｓｏｎおよびＭｕｒｄｏｃｋ，１９９０）。より正確には、ＴｈｉｅおよびＨｏｕｓｅｍａｎ（１９９０）は、コロラドポテトビートル（Colorado potato beetle）中にシステインプロテアーゼ、カテプシンＢ様、およびカテプシンＨ様、ならびにアスパルチルプロテアーゼ、カテプシンＤ様を確認し、特徴付けた。Ｇｉｌｌｉｋｉｎら（１９９２）は、ウェスターンコーンルートワーム（western corn rootworm）幼虫の消化管中でのタンパク質分解活性を特徴付け、主としてシステインプロテアーゼを見出した。米国特許第７２３０１６７号には、カテプシンＧに帰せられるプロテアーゼ活性が、ウェスターンコーンルートワーム（western corn rootworm）中に存在することが開示されている。昆虫消化管プロテアーゼの多様性および異なる活性レベルは、特定のＢ．ｔ．トキシンに対する昆虫の感受性に影響を及ぼす可能性がある。
【００４２】
本発明の別の実施形態において、プロテアーゼの開裂部位は、特定の害虫の感受性幼虫の中腸内でのタンパク質プロセシングに影響を及ぼすように所望の位置で遺伝子操作することができる。これらのプロテアーゼ開裂部位は、化学的遺伝子合成またはスプライス重複ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎら、１９８９）などの方法で導入することができる。例えば、セリンプロテアーゼ認識配列は、感受性幼虫の中腸内で、所望の欠失点においてタンパク質プロセシングを実施するように、Ｃｒｙタンパク質構造中の特定部位で任意選択により挿入することができる。このような方式で利用できるセリンプロテアーゼには、トリプシンまたはトリプシン様酵素、キモトリプシン、エラスターゼなどの、鱗翅目中腸セリンプロテアーゼが含まれる（Ｃｈｒｉｓｔｅｌｌｅｒら、１９９２）。さらに、未分画幼虫中腸プロテアーゼ標本で作り出されるＣｒｙタンパク質消化産物を配列決定することによって、または刷子縁膜小胞への結合によって経験的に同定される欠失部位を、タンパク質活性化をもたらすように遺伝子操作することができる。遺伝子欠失によって、またはプロテアーゼ開裂部位の導入によって作り出される改変Ｃｒｙタンパク質は、オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）、ジアトラエ・グランジオセラ（Diatraea grandiosella）、ヘリコベルパ・ジア（Helicoverpa zea）、アグロチス・イプシロン（Agrotis ipsilon）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）、スポドプテラ・イクシグア（Spodoptera exigua）、ジアトラエ・サッカラリス（Diatraea saccharalis）、ロクサグロチス・アルビコスタ（Loxagrotis albicosta）、およびその他の標的有害生物を含む、鱗翅目有害生物に対して改善された活性を有する。
【００４３】
トリプシン、キモトリプシン、およびカテプシンＧ様プロテアーゼなどの鞘翅目セリンプロテアーゼ、カテプシン（Ｂ様、Ｌ様、Ｏ様、およびＫ様プロテアーゼ）などの鞘翅目システインプロテアーゼ（Ｋｏｉｗａら、２０００；およびＢｏｗｎら、２００４）、ＡＤＡＭ１０などの鞘翅目メタロプロテアーゼ（Ｏｃｈｏａ−Ｃａｍｐｕｚａｎｏら、２００７）、ならびにカテプシンＤ様およびＥ様、ペプシン、プラスメプシンならびにキモシンなどの鞘翅目アスパラギン酸プロテアーゼを、特定害虫の感受性幼虫の中腸内でのＣｒｙタンパク質のプロセシングに影響を及ぼすように、所望のプロセシング部位で適切な認識配列を遺伝子操作することによってさらに利用することができる。
【００４４】
このようなプロテアーゼ開裂部位を導入するのに好ましい位置は、α−へリックス２Ｂとα−へリックス３との間の「スペーサー」領域内に、例えば、完全長ＤＩＧ−３タンパク質のアミノ酸１０９〜１１３内に存在する可能性がある（配列番号２および表１）。遺伝子欠失によって、またはプロテアーゼ開裂部位の導入によって作り出される改変Ｃｒｙタンパク質は、限定はされないが、ウェスターンコーンルートワーム（western corn rootworm）、サザンコーンルートワーム（southern corn root worm）、ノーザンコーンルートワーム（northern corn rootworm）などを含む害虫に対して改善された活性を有する。
【００４５】
ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端残基を含むアミノ酸の配列決定を可能にする種々の技術が存在する。例えば、自動化されたエドマン分解法を逐次方式で使用して、３０アミノ酸残基までのＮ末端アミノ酸配列を残基につき９８％の正確さで決定することができる。さらに、ポリペプチドのカルボキシ終端を含むアミノ酸配列の決定も可能である（Ｂａｉｌｅｙら、１９９２；米国特許第６０４６０５３号）。したがって、一部の実施形態において、例えば昆虫の消化管から調製されたプロテアーゼによるタンパク質分解処理によって活性化されたＢ．ｔ．Ｃｒｙタンパク質を特徴付けることができ、活性化されたトキシンフラグメントのＮ末端またはＣ末端アミノ酸を確認することができる。昆虫、植物または微生物プロテアーゼによるより大きな変異体タンパク質のタンパク質分解開裂を可能にするまたは排除するためのコード配列中の適切な位置でのプロテアーゼプロセシング部位の導入または排除によって作られるＤＩＧ−３変異体は、本発明の範囲に包含される。このような操作の最終結果は、無傷の（完全長）トキシンタンパク質と同様またはより良好な活性を有するトキシンフラグメント分子の生成であると理解される。
【００４６】
ＤＩＧ−３トキシンのドメイン。
ＤＩＧ−３トキシンの分離ドメイン（および、このようなドメインに９０％、９５％または９７％同一である変異体）は、有害生物への増大された毒性範囲、改善された有効性、または増大されたタンパク質安定性を備えた新規トキシンを提供するために、他のＣｒｙトキシンからのドメインとの組合せを形成する上で有用であると予想される。ＤＩＧ−３タンパク質のドメインＩは、配列番号２のアミノ酸残基５６〜２７８からなる。ＤＩＧ−３タンパク質のドメインＩＩは、配列番号２のアミノ酸残基２８３〜４９３からなる。ＤＩＧ−３タンパク質のドメインＩＩＩは、配列番号２のアミノ酸残基５０３〜６４１からなる。ドメインの取替えまたはシャッフリングは、変更したδ−エンドトキシンタンパク質を作り出すための機構である。ドメインＩＩおよびＩＩＩは、δ−エンドトキシンタンパク質間で取替えることができ、改善された農薬活性または標的範囲を備えたハイブリッドトキシンまたはキメラトキシンをもたらす。ドメインＩＩは、受容体結合に関連し、ＤＩＧ−３のドメインＩＩは、他のＣｒｙ１Ｂトキシンから極めて逸脱している。ドメインＩＩＩは、特定クラスの受容体タンパク質に結合し、恐らく、オリゴマートキシンプレ細孔の挿入に関与する。他のトキシン中での一部のドメインＩＩＩの置換は、スポドプテラ・エクシグア（Spodoptera exigua）に対して優れた毒性を生じることが示され（ｄｅ Ｍａａｇｄら、１９９６）、Ｃｒｙトキシンドメイン取替えの設計に関する指針が存在する（Ｋｎｉｇｈｔら、２００４）。
【００４７】
組み換えタンパク質を作り出し、それらを農薬活性について試験するための方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｎａｉｍｏｖら、２００１；ｄｅ Ｍａａｇｄら、１９９６；Ｇｅら、１９９１；Ｓｃｈｎｅｐｆら、１９９０；Ｒａｎｇら、１９９９を参照されたい）。Ｃｒｙ１ＡおよびＣｒｙ３Ａタンパク質からのドメインＩは、膜中に細孔を挿入および形成する能力について研究された。ドメインＩのα−へリックス４およびα−へリックス５は、膜内挿入および細孔形成において重要な役割を演じ（Ｗａｌｔｅｒｓら、１９９３；Ｇａｚｉｔら、１９９８；Ｎｕｎｅｚ−Ｖａｌｄｅｚら、２００１）、他のα−へリックスを、傘の骨のように膜表面に接触させるように提案された（Ｂｒａｖｏら、２００７；Ｇａｚｉｔら、１９９８）。
【００４８】
限られた数のアミノ酸の欠失、置換、または付加することによって創り出されるＤＩＧ−３変異体。配列番号２のアミノ酸配列に対するアミノ酸の欠失、置換、および付加は、逐次的方式で容易に行うことができ、このような変更の殺虫活性に対する効果は、バイオアッセイで試験することができる。変化の数が数の上で限られているなら、このような試験は、不合理な実験を必要としない。本発明は、コアトキシンセグメント（配列番号２のアミノ酸１〜６４３、または配列番号２のアミノ酸７３〜６４３）の殺虫活性のある変異体を包含し、その中で、１０個まで、１５個まで、または２０個までの独立なアミノ酸の付加、欠失、または置換がなされている。
【００４９】
本発明は、配列番号２のアミノ酸１〜６４３に、あるいは配列番号２のアミノ酸７３〜６４３に９０％、９５％または９７％同一であるコアトキシンセグメントを有するＤＩＧ−３変異体を包含する。
【００５０】
変異体は、ランダムな突然変異をもたらすことによって調製することができ、あるいは変異体を設計することができる。設計された突然変異体の場合には、アミノ酸の同一性が、生物学的活性を占めるトキシンの重要な領域中で維持される場合、または最終的に生物学的活性を担う三次元配置の決定に関与する場合、天然のトキシンに類似の活性を備えた変異体を作り出す確率が高くなる。また、置換が保存的である場合にも、活性を保持する確率が高い。アミノ酸は、次のクラス、すなわち、非極性、未帯電極性、塩基性、および酸性に分けることができる。あるクラスのアミノ酸を、同一タイプの別のアミノ酸で置き換える保存的置換は、変異体の生物学的活性を著しく変える可能性が最も少ない。表２に各クラスに属するアミノ酸の例を列挙する。
【表２】
【００５１】
一部の例において、非保存的置換も行うことができる。これらの置換が、トキシンの生物学的活性を有意には損なってはならないことが重要な要素である。変異体は、突然変異誘発のためアミノ酸配列が異なるポリペプチドを包含する。本発明に包含される変異体タンパク質は、生物学的に活性であり、すなわち、それらは、天然タンパク質の所望される生物学的活性を有し続ける、すなわち、殺虫活性を保持する。
【００５２】
また、配列レベルを異にするが、同様のまたは類似の総合的に必須な三次元構造、表面電荷分布などを有する変異体タンパク質も設計することができる。例えば、米国特許第７０５８５１５号；Ｌａｒｓｏｎら、２００２；Ｓｔｅｍｍｅｒ、１９９４ａ、１９９４ｂ、１９９５；およびＣｒａｍｅｒｉら、１９９６ａ、１９９６ｂ、１９９７を参照されたい。
【００５３】
核酸。
ＤＩＧ−３トキシンをコードする単離核酸は、本発明の一態様である。これは、配列番号２、および配列番号５をコードする核酸、ならびにその相補配列と、配列番号２の殺虫性変異体をコードするその他の核酸を包含する。遺伝子コードの冗長性のため、種々の異なるＤＮＡ配列が、本明細書に開示のアミノ酸配列をコードすることができる。同一または本質的に同一のトキシンをコードするこれらの代替的ＤＮＡ配列を創り出すことは、十分に当業者の技量内である。
【００５４】
遺伝子合成。
本明細書に記載の改善されたＣｒｙタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、当技術分野で周知の種々の方法によって調製することができる。例えば、合成遺伝子セグメントおよび合成遺伝子は、亜リン酸トリエステルおよびホスホラミダイト化学物質（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、１９８７）によって調製することができ、必要に応じて、ＤＮＡ合成を実施するためにコマーシャルベンダーを利用可能である。完全長ＤＩＧ−３タンパク質をコードする配列は、例えば、制限断片のライゲーションまたは重複オリゴヌクレオチドのポリメラーゼ連鎖反応の組立てを含む、種々の方法で組み立てることができる（ＳｔｅｗａｒｔおよびＢｕｒｇｉｎ、２００５）。さらに、末端欠失をコードする配列は、部位特異的末端オリコヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅によって調製することができる。
【００５５】
ＤＩＧ−３トキシンをコードする核酸は、例えば、いくつかの商業的供給業者のいずれかによって現在実施されている方法による合成的構築によって調製することができる（例えば、米国特許第７４８２１１９号参照）。これらの核酸またはその部分もしくは変異体は、また、例を挙げれば、例えば米国特許第５３８０８３１号の遺伝子シンセサイザーおよび設計方法を使用して、合成的に構築することができる。別法として、合成または天然に存在する遺伝子の変形形態を、点突然変異を生じさせるための標準的な分子生物学的技術を使用して容易に構築することができる。これらの遺伝子のフラグメントは、また、市販のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを使用して標準的手順により調製することができる。例えば、Ｂａｌ３１などの酵素または部位特異的突然変異誘発を利用して、これらの遺伝子の終端からヌクレオチドを規則正しく切り離すことができる。また、活性トキシンフラグメントをコードする遺伝子フラグメントを、種々の制限酵素を使用して得ることができる。
【００５６】
ＤＩＧ−３トキシンのためのアミノ酸配列が得られると、意図した宿主によって優先されるコドンを使用してコード配列を逆翻訳し、次いで問題を引き起こす可能性のある配列を除去し、非コード読み取り枠中の長いオープンコード配列を除去するための周期的終止コドンをもたらすために代替のコドンを使用して配列を改良することによって、コード配列を設計することができる。
【００５７】
配列同一性の定量。
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を測定するため、配列を最適な比較目的のために整列させる。２つの配列間のパーセント同一性は、配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、パーセント同一性＝同一位置の数／位置の総数（例えば、重複位置）×１００）。一実施形態において、２つの配列は、同じ長さである。２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを許容するまたはしない後記技術に類似した技術を使用して測定することができる。パーセント同一性の計算では、典型的には、正確な一致を計数する。
【００５８】
２つの配列間のパーセント同一性の測定は、数学的アルゴリズムを使用して完了できる。このようなアルゴリズムの非限定的例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）の例であり、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）において修正され、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸ各プログラム中に組み込まれる。ＢＬＡＳＴサーチは、核酸またはタンパク質データベース中の問い合わせ配列に相同（類似）する配列を同定するのに好都合に使用することができる。ＢＬＡＳＴＮサーチは、本発明の特許請求される核酸分子に対して相同性を有するヌクレオチド配列を同定するために実施することができる（スコア＝１００、ワード長＝１２）。ＢＬＡＳＴＸサーチは、本発明の特許請求される殺虫性タンパク質分子に対して相同性を有するアミノ酸配列を同定するために実施することができる（スコア＝５０、ワード長＝３）。
【００５９】
ギャップ付きＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）は、比較の目的でギャップのあるアラインメントを得るのに利用できる。別法として、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔは、分子間の遠隔関係を検出する反復サーチを実施するのに使用することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）。ＢＬＡＳＴ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔ各プログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーターを使用することができる。www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。
【００６０】
配列を比較するために利用される数学的アルゴリズムの非限定的例が、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４）。ＣｌｕｓｔａｌＷは、配列を比較し、アミノ酸またはＤＮＡ配列の全体を整列し、これによってアミノ酸配列全体またはヌクレオチド配列全体の配列保存に関するデータを提供することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩプログラムスイート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）のＡＬＩＧＮＸモジュールなどの、市販ＤＮＡ／アミノ酸解析ソフトウェアパッケージ中で使用されている。アミノ酸配列をＡＬＩＧＮＸで整列する場合には、２つの配列間のパーセントアミノ酸類似性（コンセンサス）または同一性を評価するために、１０のギャップオープンペナルティ、０．１のギャップ伸張ペナルティ、およびｂｌｏｓｕｍ６３ｍｔ２比較マトリックスでのデフォルト設定を好都合に使用することができる。ＤＮＡ配列をＡＬＩＧＮＸで整列する場合には、２つの配列間のパーセント同一性を評価するために、１５のギャップオープンペナルティ、６．６のギャップ伸張ペナルティ、およびｓｗｇａｐｄｎａｍｔ比較マトリックスでのデフォルト設定を好都合に使用することができる。
【００６１】
配列比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的例が、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）の例である。このようなアルゴリズムは、ｗＥＭＢＯＳＳ配列整列ソフトウェアパッケージ（http://emboss.sourceforge.net/で利用可能）の一部であるｗＳＴＲＥＴＣＨＥＲプログラム中に組み込まれている。ｗＳＴＲＥＴＣＨＥＲは、線形空間を使用する標準的な動的プログラミングアルゴリズムの修正形態を使用して、２つの配列の最適な大域的アラインメントを計算する。アラインメントを計算するのに使用される置換マトリックス、ギャップ挿入ペナルティ、およびギャップ伸張ペナルティを指定することができる。ヌクレオチド配列を比較するためにｗＳＴＲＥＴＣＨＥＲプログラムを利用する場合には、１６のギャップオープンペナルティおよび４のギャップ伸張ペナルティを、スコアリングマトリックスファイルＥＤＮＡＦＵＬＬと共に使用することができる。アミノ酸配列を比較するために使用する場合には、１２のギャップオープンペナルティおよび２のギャップ伸張ペナルティを、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスファイルと共に使用することができる。
【００６２】
配列比較のために利用される数学的アルゴリズムのさらなる非限定的例は、配列アラインメントソフトウェアパッケージＧＡＰバージョン１０およびｗＮＥＥＤＬＥ（http://emboss.sourceforge.net/）中に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）の例である。ＧＡＰバージョン１０は、次のパラメーターを使用して配列の同一性または類似性を測定するのに使用することができ、ヌクレオチド配列の場合、％同一性および％類似性は、５０のギャップウェイトおよび３の長さウェイト、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用して検索される。アミノ酸の配列比較の場合、％同一性または％類似性は、８のギャップウェイトおよび２の長さウェイト、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングプログラムを使用して測定される。
【００６３】
ｗＮＥＥＤＬＥは、２つの入力配列を読み取り、それらの全長に沿って最適アラインメント（ギャップを含む）を検索し、それらの最適な大域的配列アラインメントをファイルに書き込む。アルゴリズムは、すべての可能なアラインメントを探索し、それぞれの可能な残基またはヌクレオチドの一致に関する値を含むスコアリングマトリックスを使用して最良のものを選択する。ｗＮＥＥＤＬＥは、最大の可能なスコアを有するアラインメントを検索し、ここで、アラインメントのスコアは、（スコアリングマトリックスから得られる一致の合計）−（整列された配列中のオープンペナルティおよび伸張ギャップから生じるペナルティ）に等しい。置換マトリックス、ギャップオープンペナルティおよび伸張ペナルティは、ユーザー指定である。アミノ酸配列を比較する場合には、１０のデフォルトギャップオープンペナルティ、０．５のギャップ伸張ペナルティ、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスを使用する。ｗＮＥＥＤＬＥを使用してＤＮＡ配列を比較する場合には、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップ伸張ペナルティ、およびＥＤＮＡＦＵＬＬ比較マトリックスを使用する。
【００６４】
同等のプログラムも使用することができる。「同等のプログラム」とは、問題の任意の２つの配列に関して、ＡＬＩＧＮＸ ｗＮＥＥＤＬＥ、またはｗＳＴＲＥＴＣＨＥＲによって作り出される対応するアラインメントに比較した場合に、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の一致および同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを作り出す任意の配列比較プログラムを意図する。％同一性は、報告される整列領域にわたる２つの配列（長さ中の任意のギャップを含む）間の同じ一致のパーセンテージであり、％類似性は、報告される整列領域にわたる２つの配列（長さ中の任意のギャップを含む）間の一致のパーセンテージである。
【００６５】
アラインメントは、目視によって手動で実施することもできる。
【００６６】
組換え宿主。
本発明のトキシンをコードする遺伝子は、広範な種類の微生物または植物宿主中に導入することができる。トキシン遺伝子の発現は、直接的または間接的に、農薬タンパク質の細胞内産生および維持をもたらす。適切な微生物宿主、例えば、シュードモナス（Pseudomonas）の場合、該微生物を、それらが増殖し、取り込まれる有害生物の環境に適用することができる。結果は、有害生物の規制である。別法として、トキシン遺伝子を宿す微生物を、トキシンの活性を延長し、かつ細胞を安定化する条件下で処理することができる。毒性活性を維持している処理細胞を、次いで、標的有害生物の環境に適用することができる。
【００６７】
Ｂ．ｔ．トキシン遺伝子が適当なベクターを介して微生物宿主中に導入され、前記宿主が生存状態で環境に適用される場合、特定の宿主微生物を使用することが必須である。目的の１種または複数の作物の「植物圏」（葉面、葉圏、根圏、および／または根面）を占拠することが知られている微生物宿主が選択される。これらの微生物は、特定の環境（作物およびその他の昆虫生息地）中で野生型土着微生物と首尾よく競合する能力があり、ポリペプチド農薬を発現する遺伝子の安定な維持および発現を提供し、望ましくは環境での分解および不活性化からの農薬の改善された保護を提供するように選択される。
【００６８】
多数の微生物が、広範な種類の重要作物の葉面（植物の葉の表面）および／または根圏（植物の根を取り囲む土壌）に存在することが知られている。これらの微生物には、細菌、藻類、および真菌が含まれる。とりわけ有益なのは、細菌、例えば、シュードモナス（Pseudomonas）、エルウィニア（Erwinia）、セラチア（Serratia）、クレブシエラ（Klebsiella）、キサントモナス（Xanthomonas）、ストレプトミセス（Streptomyces）、リゾビウム（Rhizobium）、シノリゾビウム（Sinorhizobium）、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）、メチロフィリウス（Methylophilius）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、アセトバクター（Acetobacter）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、アルスロバクター（Arthrobacter）、アゾトバクター（Azotobacter）、ロイコノストック（Leuconostoc）、およびアルカリゲネス（Alcaligenes）属；真菌とりわけ酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、クリベロマイセス（Kluyveromyces）、スポロボロマイセス（Sporobolomyces）、ロドトルラ（Rhodotorula）、およびアウレオバシジウム（Aureobasidium）属などの微生物である。とりわけ有益なのは、シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）、ロドシュードモナス・スフェロイデス（Rhodopseudomonas spheroides）、キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、シノリゾビウム・メリロチ（Sinorhizobium meliloti）（以前にはリゾビウム・メリロチ（Rhizobium meliloti））、アルカリゲネス・ユートロフス（Alcaligenes eutrophus）、およびアゾトバクター・ビネランジ（Azotobacter vinelandii）などの植物圏細菌種；ならびにロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）、Ｒ．グルチニス（R.glutinis）、Ｒ．マリナ（R.marina）、Ｒ．アウランティアカ（R.aurantiaca）、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、Ｃ．ジフルエンス（C.diffluens）、Ｃ．ラウレンティ（C.laurentii）、サッカロミセス・ロセイ（Saccharomyces rosei）、Ｓ．プレトリエンシス（S.Pretoriensis）、Ｓ．セレビシエ（S.cerevisiae）、スポロボロマイセス・ロセウス（Sporobolomyces roseus）、Ｓ．オドルス（S.odorus）、クリベロマイセス・ベロナエ（Kluyveromyces veronae）、およびアウレオバシジウム・ポルランス（Aureobasidium pollulans）などの植物圏酵母種である。とりわけ有益なのは、有色微生物である。
【００６９】
害虫の防除方法。
昆虫が、遺伝子導入植物の発現、製剤化されたタンパク質組成物（群）、噴霧可能なタンパク質組成物（群）、ベイトマトリックス、またはその他の送達システムを介して送達された有効量のトキシンと接触すると、結果は、典型的には昆虫の死亡であり、あるいは昆虫は、トキシンを昆虫にとって利用可能にする供給源を餌にしない。
【００７０】
対象とするタンパク質トキシンは、種々の方式で標的昆虫に接触するように「適用」または提供できる。例えば、遺伝子導入植物（ここで、タンパク質は、植物によって産生され、植物中に存在する）を使用することができ、それは当技術分野で周知である。トキシン遺伝子の発現は、また、根、葉などの植物の特定組織中で選択的に達成することができる。これは、例えば、組織特異的プロモーターの使用を介して達成できる。スプレー式適用は、もう１つの例であり、これも当技術分野で周知である。対象とするタンパク質は、所望の最終用途向けに適切に製剤化され、次いで、蔓延が発見される前に、標的昆虫が発見された後に、前および後の双方などに、保護すべき植物上に、および／または植物の周りに／植物の付近に噴霧（そうでなければ適用）することができる。例えば、ベイト顆粒も使用することができ、当技術分野で周知である。
【００７１】
遺伝子導入植物
対象とするタンパク質は、任意のタイプの植物を鱗翅目昆虫による損傷から実際に保護するために使用することができる。このような植物の非限定的例には、ごく一部の例を挙げれば、トウモロコシ、ヒマワリ、ダイズ、ワタ、カノーラ、イネ、モロコシ、コムギ、オオムギ、野菜、観賞植物、コショウ（トウガラシを含む）、サトウダイコン、果実、および芝生が含まれる。植物を形質転換する方法は、当技術分野で周知であり、例示となる形質転換法は、実施例中に記載される。
【００７２】
本発明の好ましい実施形態は、対象とする殺虫性タンパク質またはその変異体をコードする遺伝子での植物の形質転換である。形質転換された植物は、形質転換された植物の細胞における対象とする殺虫性タンパク質またはその変異体の防除量の存在によって、昆虫標的有害生物による攻撃に耐性がある。Ｂ．ｔ．殺虫性トキシンの殺虫特性をコードする遺伝子材料を、特定の害虫によって食される植物のゲノム中に組み込むことによって、成虫または幼虫は、食用植物の摂取後に死亡するであろう。単子葉および双子葉各類の多数のメンバーが、形質転換されている。遺伝子導入農耕作物、ならびに果実および野菜は、商業的に重要である。このような作物には、限定はされないが、トウモロコシ、イネ、ダイズ、カノーラ、ヒマワリ、アルファルファ、モロコシ、コムギ、ワタ、ピーナツ、トマト、ジャガイモなどが含まれる。外来遺伝子材料を植物細胞中に導入するための、および導入された遺伝子を安定的に維持し発現する植物を得るためのいくつかの技術が存在する。このような技術には、ミクロ粒子上に被覆された遺伝子材料の直接的な細胞中への促進（米国特許第４９４５０５０号および米国特許第５１４１１３１号）が含まれる。アグロバクテリウム（Agrobacterium）技術を使用して植物を形質転換することができ、米国特許第５１７７０１０号、米国特許第５１０４３１０号、欧州特許出願公開第０１３１６２４号、欧州特許出願公開第１２０５１６号、欧州特許出願公開第１５９４１８号、欧州特許出願公開第１７６１１２号、米国特許第５１４９６４５号、米国特許第５４６９９７６号、米国特許第５４６４７６３号、米国特許第４９４０８３８号、米国特許第４６９３９７６号、欧州特許出願公開第１１６７１８号、欧州特許出願公開第２９０７９９号、欧州特許出願公開第３２０５００号、欧州特許出願公開第６０４６６２号、欧州特許出願公開６２７７５２号、欧州特許出願公開第０２６７１５９号、欧州特許出願公開第０２９２４３５号、米国特許第５２３１０１９号、米国特許第５４６３１７４号、米国特許第４７６２７８５号、米国特許第５００４８６３号、および米国特許第５１５９１３５号を参照されたい。その他の形質転換技術には、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）技術が含まれ、米国特許第５３０２５２３号および米国特許第５４６４７６５号を参照されたい。また、エレクトロポレーション技術を使用して植物を形質転換しており、国際公開第８７／０６６１４号、米国特許第５４７２８６９号、米国特許第５３８４２５３号、国際公開第９２／０９６９６号、および国際公開第９３／２１３３５号を参照されたい。これらの形質転換の特許および刊行物はすべて、参照により組み込まれる。植物を形質転換するための多数の技術に加えて、外来遺伝子と接触させる組織のタイプも変更できる。このような組織には、限定はされないが、胚形成組織、カルス組織Ｉ型およびＩＩ型、胚軸、分裂組織などが含まれる。ほとんどすべての植物組織を、当業者の技術範囲内の適切な技術を使用して、脱分化中に形質転換することができる。
【００７３】
ＤＩＧ−３トキシンをコードする遺伝子を、上で開示した、当技術分野で周知の種々の技術を使用して、植物細胞中に挿入することができる。例えば、形質転換される微生物細胞の選択を可能にするマーカーおよび大腸菌（Escherichia coli）中で機能する複製系を含む多数のクローニングベクターを、外来遺伝子を調製および改変して高等植物中に導入するために利用できる。このような操作には、例えば、意図した用途のために望まれるような、突然変異の挿入、切り詰め、付加、または置換が含まれ得る。ベクターは、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ系、Ｍ１３ｍｐ系、ｐＡＣＹＣ１８４などを含む。したがって、Ｃｒｙタンパク質または変異体をコードする配列を、ベクター中に適切な制限酵素部位で挿入することができる。得られるプラスミドは、大腸菌（E.coli）細胞の形質転換のために使用され、その細胞を、適切な栄養培地中で培養し、次いで、収集、溶菌して、有効な量のプラスミドを回収する。配列解析、制限酵素フラグメント解析、電気泳動、およびその他の生化学−分子生物学的方法が、解析の方法として一般に実施される。各操作の後、使用するＤＮＡ配列を、開裂させ、次のＤＮＡ配列に連結することができる。操作された各ＤＮＡ配列を、同じまたは他のプラスミド中でクローン化することができる。
【００７４】
植物細胞の形質転換のためにＴ−ＤＮＡを含むベクターを使用することは、徹底的に研究され、欧州特許第１２０５１６号；ＬｅｅおよびＧｅｌｖｉｎ、２００８；Ｆｒａｌｅｙら、１９８６；およびＡｎら、１９８５中に十分に記載されており、その分野で十分に確立されている。
【００７５】
挿入されるＤＮＡが植物ゲノム中に組み込まれると、それは、後の世代を通して比較的安定である。植物細胞を形質転換するのに使用されるベクターは、通常、形質転換された植物細胞に、とりわけビアラホス、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、またはヒグロマイシンなどの除草剤または抗生物質に対する耐性を付与するタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子を含む。個別に採用される選択マーカー遺伝子は、したがって、挿入されるＤＮＡを含まない細胞の増殖を選別化合物によって抑制しながら、形質転換された細胞の選択を可能にすることになる。
【００７６】
多数の技術が、宿主植物細胞中にＤＮＡを挿入するために利用可能である。それらの技術には、形質転換因子としてのアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）によって送達されるＴ−ＤＮＡを用いる形質転換が含まれる。さらに、植物プロトプラストの、送達されるべきＤＮＡを含むリポソームとの融合、ＤＮＡの直接注入、遺伝子銃形質転換（微粒子衝突）、またはエレクトロポレーション、ならびにその他の可能な方法を採用することができる。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態において、植物は、タンパク質コード領域のコドン使用頻度が植物に対して最適化されている遺伝子で形質転換される。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５３８０８３１号を参照されたい。また、有利には、切り詰められたトキシンをコードしている植物が使用される。切り詰められたトキシンは、典型的には、完全長トキシンの約５５％〜約８０％をコードしている。植物中で使用するための合成Ｂ．ｔ．遺伝子を創り出す方法は、当技術分野で公知である（Ｓｔｅｗａｒｔ、２００７）。
【００７８】
形質転換技術にかかわらず、遺伝子は、ベクター中に植物プロモーターを含めることによって植物細胞中でＢ．ｔ．殺虫性トキシン遺伝子および変異体を発現するように適合された遺伝子移入ベクター中に好ましくは組み込まれる。植物プロモーターに加えて、種々の供給源からのプロモーターを、各植物細胞で効率的に使用して外来遺伝子を発現することができる。例えば、オクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、およびマンノピンシンターゼプロモーターなどの細菌起源のプロモーターを使用することができる。例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓおよび１９Ｓ各プロモーター、キャサバベインモザイクウイルスからのプロモーターなどの植物ウイルス起源のプロモーターを使用することができる。植物プロモーターには、限定はされないが、リブロース−１，６−ビスホスフェート（ＲＵＢＰ）カルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓｕ）、β−コングリシニンプロモーター、ファセオリンプロモーター、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、熱ショックプロモーター、ＡＤＦ（アクチン解重合因子）プロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、および組織特異的プロモーターが含まれる。プロモーターは、また、転写効率を改善できる特定のエンハンサー配列エレメントを含むことができる。典型的なエンハンサーには、限定はされないが、ＡＤＨ１−イントロン１およびＡＤＨ１−イントロン６が含まれる。構成プロモーターを使用することもできる。構成的プロモーターは、ほとんどすべての細胞型中で、およびほとんどすべての時点で連続的な遺伝子発現を指令する（例えば、アクチン、ユビキチン、ＣａＭＶ３５Ｓ）。組織特異的プロモーターは、葉または種子など、特定の細胞または組織型中での遺伝子発現を担い（例えば、ゼイン、オレオシン、ナピン、ＡＣＰ（アシル担体タンパク質）プロモーター）、これらのプロモーターを使用することもできる。植物発育の特定段階で活性であるプロモーター、および特定の植物組織および器官中で活性であるプロモーターを使用することもできる。このようなプロモーターの例には、限定はされないが、根特異的、花粉特異的、胚特異的、コーンシルク特異的、ワタ繊維特異的、種子胚乳特異的、師部特異的であるプロモーターなどが含まれる。
【００７９】
特定の状況下では、誘導性プロモーターを使用することが望ましいことがある。誘導性プロモーターは、物理的刺激（例えば、熱ショック遺伝子）、光（例えば、ＲＵＢＰカルボキシラーゼ）、ホルモン（例えば、グルココルチコイド）、抗生物質（例えば、テトラサイクリン）、代謝産物、およびストレス（例えば、欠乏）などの特定のシグナルに応答した遺伝子発現を担う。５’非翻訳リーダー配列、ＲＮＡ転写終結配列、およびポリ−アデニレート付加シグナル配列などの、植物中で機能するその他の望ましい転写エレメントおよび翻訳エレメントを使用することができる。多数の植物特異的遺伝子移入ベクターが、当技術分野で知られている。
【００８０】
昆虫耐性（ＩＲ）形質を含む遺伝子導入作物は、コーン植物およびワタ植物において北米全体で普及しており、これらの形質の利用は、世界的に拡大している。ＩＲと除草剤耐性（ＨＴ）を組み合わせた市販の形質転換作物が、多数の種子会社によって開発されてきた。これらには、Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質によって付与されるＩＲ形質と、スルホニルウレア類、イミダゾリノン類、トリアゾロピリミジン、スルホンアニリド類などのアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）阻害剤；ビアロホス、グルホシネートなどのグルタミンシンターゼ（ＧＳ）阻害剤；メソトリオン、イソキサフルトールなどの４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤；グリホサートなどの５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）阻害剤；およびハロキシホップ、キザロホップ、ジクロホップなどのアセチル−補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）阻害剤に対する耐性などのＨＴ形質との組合せが含まれる。形質転換で準備されたタンパク質が、植物に、フェノキシ酸系除草剤およびピリジルオキシ酢酸オーキシン系除草剤（国際公開第２００７／０５３４８２号を参照されたい）、またはフェノキシ酸系除草剤、およびアリールオキシフェノキシプロピオン酸系除草剤（国際公開第２００５／１０７４３７号を参照されたい）などの除草剤の化学クラスに対する耐性を提供する、その他の例が知られている。ＩＲ形質を介して複数の有害生物の問題を防除する能力は、価値ある商品構想であり、この製品構想の便益は、昆虫規制形質および雑草規制形質が同一植物中で組み合わされる場合に、増強される。さらに、改善された価値は、本発明のタンパク質などのＢ．ｔ．殺虫性タンパク質によって付与されるＩＲ形質と、前述のような１種または複数のさらなるＨＴ形質と、さらには１種または複数のさらなる移入形質（例えば、Ｂ．ｔ．由来またはその他の殺虫性タンパク質によって付与されるその他の昆虫耐性、ＲＮＡｉなどの機構によって付与される昆虫耐性、線虫耐性、病気耐性、ストレス寛容性、改善された窒素利用性など）または産出される形質（例えば、高い油脂流量、健康的な油脂組成、栄養改善など）との、単一植物での組合せを介して得ることができる。このような組合せは、通常的な育種（育種の積み重ね）を介して、または共同的に複数の遺伝子の同時導入を含む新規な形質転換事象（分子の積み重ね）として得ることができる。作物植物における害虫および改善された雑草防除を扱う能力が利益に含まれ、その能力は生産者および／または消費者に二次的利益を提供する。したがって、本発明は、任意の数の農学的問題を柔軟かつ高い費用効果で制御する能力を有する改善された作物品質の完全な農学的パッケージを提供するために、その他の形質と組み合わせて使用することができる。
【００８１】
標的有害生物
本発明のＤＩＧ−３トキシンは、鱗翅目昆虫の規制で使用するのにとりわけ適している。鱗翅目は、毎年極めて大きな総額の損害をもたらす、農業、園芸、および家庭の有害生物の重要な群である。この昆虫目は、葉および根を摂食する幼虫および成虫を包含する。鱗翅目害虫には、限定はされないが、以下がが含まれる：アコロイア・グリセラ（Achoroia grisella）、アクレリス・グロベラナ（Acleris gloverana）、アクレリス・バリアナ（Acleris variana）、アドキソフィエス・オラナ（Adoxophyes orana）、アグロチス・イプシロン（Agrotis ipsilon）（ブラックカットワーム）、アラバマ・アルギラセア（Alabama argillacea）、アルソフィラ・ポメタリア（Alsophila pometaria）、アメロイス・トランシテラ（Amyelois transitella）、アナガスタ・クエニエラ（Anagasta kuehniella）、アナルシア・リネアテラ（Anarsia lineatella）、アニソタ・セナトリア（Anisota senatoria）、アンテラエア・ペルニイ（Antheraea pernyi）、アンチカルシア・ゲマタリス（Anticarsia gemmatalis）、アルキプス（Archips）種、アルギロタエニア（Argyrotaenia）種、アテチス・ミンダラ（Athetis mindara）、ボンビクス・モリ（Bombyx mori）、ブクラトリックス・ツルベリエラ（Bucculatrix thurberiella）、カドラ・カウテラ（Cadra cautella）、コリストネウラ（Choristoneura）種、コチルス・ホスペス（Cochylls hospes）、コリアス・ユリセマ（Colias eurytheme）、コルシラ・セファロニカ（Corcyra cephalonica）、シディア・ラチフェレナス（Cydia latiferreanus）、シディア・ポモネラ（Cydia pomonella）、ダタナ・インテゲリマ（Datana integerrima）、デンドロリムス・シベリカス（Dendrolimus sibericus）、デスミア・フェネラリス（Desmia feneralis）、ジアファニア・ヒアリナタ（Diaphania hyalinata）、ジアファニア・ニチダリス（Diaphania nitidalis）、ジアトラエ・グランジオセラ（Diatraea grandiosella）（サウスウェスターンコーンボーラー）、ジアトラエ・サッカラリス（Diatraea saccharalis）（シュガーケインボーラー）、エノモス・サブシグナリア（Ennomos subsignaria）、エオレウマ・ロフチニ（Eoreuma loftini）、エスフェスチア・エルテラ（Esphestia elutella）、エラニス・チラリア（Erannis tilaria）、エスチグメネ・アクレア（Estigmene acrea）、エウリア・サルブリコラ（Eulia salubricola）、エウポコエリア・アンビグエラ（Eupocoellia ambiguella）、エウポエシリア・アンビグエラ（Eupoecilia ambiguella）、エウプロクチス・クリソロエア（Euproctis chrysorrhoea）、エウゾア・メソリア（Euxoa messoria）、ガレリア・メロネラ（Galleria mellonella）、グラホリタ・モレスタ（Grapholita molesta）、ハリシナ・アメリカナ（Harrisina americana）、ヘリコベルパ・サブフレクサ（Helicoverpa subflexa）、ヘリコベルパ・ゼア（Helicoverpa zea）（コーンイアーワーム）、ヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）（タバコバッドワーム）、ヘミロイカ・オリビア（Hemileuca oliviae）、ホモエオソマ・エレクテルム（Homoeosoma electellum）（サンフラワーヘッドモス）、ヒファンチア・クネア（Hyphantia cunea）、ケイフェリア・リコペルシセラ（Keiferia lycopersicella）、ランブジナ・フィセラリア・フィセラリア（Lambdina fiscellaria fiscellaria）、ランブジナ・フィセラリア・ルグブロサ（Lambdina fiscellaria lugubrosa）、ロイコーマ・サリシス（Leucoma salicis）、ロベシア・ボトラナ（Lobesia botrana）、ロクサグロチス・アルビコスタ（Loxagrotis albicosta）（ウェスターンビーンカットワーム）、ロクソステジ・スチクチカリス（Loxostege sticticalis）、リマントリア・ジスパル（Lymantria dispar）、マカラ・チリサリス（Macalla thyrisalis）、マラコソマ（Malacosoma）種、マメストラ・ブラシカエ（Mamestra brassicae）、マメストラ・コンフィグラタ（Mamestra configurata）（バーサアーミーワーム）、マンデュカ・キンクエマクラタ（Manduca quinquemaculata）、マンデュカ・セクスタ（Manduca sexta）（タバコホルンワーム）、マルカ・テスツラリス（Maruca testulalis）、メランクラ・ピクタ（Melanchra picta）、オペロフテラ・ブルマタ（Operophtera brumata）、オリジア（Orgyia）種、オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）（ユーロピアンコーンボーラー）、パレアクリタ・ベルナタ（Paleacrita vernata）、パピアペマ・ネブリス（Papiapema nebris）（コモンストークボーラー）、パピリオ・クレスホンテス（Papilio cresphontes）、ペクチノホラ・ゴシピエラ（Pectinophora gossypiella）、フィリガニジア・カリフォルニカ（Phryganidia californica）、フィロノリクテル・ブランカルデラ（Phyllonorycter blancardella）、ピエリス・ナピ（Pieris napi）、ピエリス・ラパエ（Pieris rapae）、プラチペナ・スカブラ（Plathypena scabra）、プラチノタ・フロエンダナ（Platynota flouendana）、プラチノタ・スツルタナ（Platynota stultana）、プラチプチリア・カルヅイダクチラ（Platyptilia carduidactyla）、プロジア・インテルプンクテラ（Plodia interpunctella）、プルテラ・キシロステラ（Plutella xylostella）（ダイアモンドバックモス）、ポンティア・プロトダイス（Pontia protodice）、シューダレチア・ユニプンクタ（Pseudaletia unipuncta）（アーミーワーム）、シュードプラシア・インクルデンス（Pseudoplasia includens）、ラチプルシア・ヌ（Rachiplusia nu）（アルゼンチンルーパー）、サブロデス・アエグロタタ（Sabulodes aegrotata）、シズラ・コンシナ（Schizura concinna）、シトトロガ・セレアレラ（Sitotroga cerealella）、スピロンタ・オセラナ（Spilonta ocellana）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（フォールアーミーワーム）、スポドプテラ・エクシグア（Spodoptera exigua）（ビートアーミーワーム）、タウルンストポエア・ピチオカンパ（Thaurnstopoea pityocampa）、エンソラ・ビセリエラ（Ensola bisselliella）、トリコプルシア・ヒ（Trichoplusia hi）、ウデア・ルビガリス（Udea rubigalis）、キシロミゲス・クリアイルス（Xylomyges curiails）、およびイポノメウタ・パデラ（Yponomeuta padella）。
【００８２】
作物植物の鞘翅目有害生物を規制するためのＤＩＧ−３の使用も想定される。一部の実施形態において、Ｃｒｙタンパク質は、限定はされないが、例えば、ジアブロチカ・ウンデシンプンクタタ・ホワルジ（Diabrotica undecimpunctata howardi）（サザンコーンルートワーム）、ジアブロチカ・ロンジコルニス・バルベリ（Diabrotica longicornis barberi）（ノーザンコーンルートワーム）およびジアブロチカ・ベルギフェラ（Diabrotica virgifera）（ウェスターンコーンルートワーム）などのルートワーム、ならびにシクロセファラ・ボレアリス（Cyclocephala borealis）（ノーザンマスクドコガネムシ）、シクロセファラ・イマクラテ（Cyclocephala immaculate）（サザンマスクドコガネムシ）、およびポピリア・ジャポニカ（Popillia japonica）（ジャパニーズビートル）の幼虫などの地虫が含まれる害虫の規制向けに、経済的に導入できる。
【００８３】
限定はされないが、根こぶ線虫（Meloidogyne icognita）およびダイズ嚢胞線虫（Heterodera glycines）を含む寄生線虫を規制するためのＤＩＧ−３トキシンの使用も想定される。
【００８４】
ＤＩＧ−３トキシンの抗体検出
抗トキシン抗体。
本明細書に開示のトキシンに対する、または同等のトキシンまたはこれらのトキシンのフラグメントに対する抗体は、本技術分野の標準的手順を使用して容易に調製することができる。このような抗体は、ＤＩＧ−３トキシンの存在を検出するのに有用である。
【００８５】
Ｂ．ｔ．殺虫性トキシンが単離されたら、該トキシンに特異的な抗体を、当技術分野で周知である通常の方法によって生じさせることができる。選択した宿主への数週間または数ヶ月にわたる反復注入は、免疫応答を誘発し、かなりの抗Ｂ．ｔ．トキシン血清価をもたらす。好ましい宿主は哺乳動物種であり、より好ましい種は、ウサギ、ヤギ、ヒツジおよびマウスである。このような免疫化された動物から採取した血液を、確立された方法で処理して、Ｂ．ｔ．殺虫性トキシンと反応性のある抗血清（ポリクロナール抗体）を得ることができる。次いで、抗血清を、当技術分野で既知の技術によるトキシンへの吸着によってアフィニティー精製することができる。アフィニティー精製された抗血清を、当技術分野で既知の手順を使用して抗血清内の免疫グロブリン画分を単離することによってさらに精製することができる。得られる材料は、Ｂ．ｔ．殺虫性トキシンと反応性のある免疫グロブリンの異種集団となる。
【００８６】
抗Ｂ．ｔ．トキシンの抗体は、また、免疫原性担体に複合されたＢ．ｔ．殺虫性トキシンの合成ペプチドフラグメントからなる半合成免疫原を調製することによって作り出すことができる。ペプチドフラグメントを作製するのに有用な多数のスキームおよび装置が、当技術分野で周知である。ウシ血清アルブミンまたはスカシ貝ヘモシアニンなどの多くの適切な免疫原性担体も、当技術分野で周知であり、免疫原と担体タンパク質とをカップリングするための技術も同様である。半合成免疫原が構築されると、Ｂ．ｔ．殺虫性トキシンフラグメントに特異的な抗体の調製手順は、天然Ｂ．ｔ．トキシンと反応性のある抗体を調製するのに使用されるものと同じである。
【００８７】
抗Ｂ．ｔ．トキシンのモノクロナール抗体（ＭＡｂ）は、精製されたＢ．ｔ．殺虫性トキシンを使用して容易に調製される。ＭＡｂの産生方法は、２０年にわたって実施されており、当業者に周知である。アジュバント中の精製Ｂ．ｔ．殺虫性トキシンの腹腔内または皮下反復注入は、ほとんどの動物で免疫応答を誘発する。過免疫のＢ−リンパ球を、動物から取り出し、無限培養可能な適切な融合パートナー細胞株と融合する。そのＢ−リンパ球が過免疫であり、ＭＡｂの産生で使用される可能性のある好ましい動物は、哺乳動物である。より好ましい動物は、ラットおよびマウスであり、最も好ましいのは、ＢＡＬＢ／ｃマウス系統である。
【００８８】
多数の哺乳動物細胞株が、ハイブリドーマの産生に適した融合パートナーである。多くのこのような株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州）および商業的供給業者から入手可能である。好ましい融合パートナー細胞株は、マウスの骨髄腫に由来し、ＨＬ−１（登録商標）フレンドリー骨髄腫−６５３細胞株（Ｖｅｎｔｒｅｘ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、メイン州）が最も好ましい。融合したら、得られるハイブリドーマを、選択増殖培地中で１〜２週間培養する。２種の周知の選択系が、未融合骨髄腫細胞または骨髄腫細胞間の融合物を混合ハイブリドーマ培養物から除去するために利用することができる。選択系の選択は、免疫されるマウスの系統、および使用される骨髄腫融合パートナーに依存する。ＴａｇｇａｒｔおよびＳａｍｌｏｆｆ（１９８３）によって発表されたＡＡＴ選択系を使用することができるが、Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ（１９６４）によって発表されたＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択系が、好ましいマウス系統および前述の融合パートナーとのその適合性のため、好ましい。使用済み増殖培地を、免疫特異的ＭＡｂ分泌についてスクリーニングする。酵素結合性免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法が、この目的に最も適しているが、大規模なスクリーニング用に適合されたラジオイムノアッセイも許容される。関連性のないまたはあまり所望されない培養物の著しい数を連続的に削減するように設計された複数のスクリーニングを実施することができる。Ｂ．ｔ．殺虫性トキシンと反応性のあるＭＡｂを分泌する培養物を、既知のＢ．ｔ．殺虫性トキシンとの交差反応性についてスクリーニングすることができる。好ましいＢ．ｔ．殺虫性トキシンに優先的に結合するＭＡｂは、市販のアッセイを使用してアイソタイプに分けられる。好ましいＭＡｂは、ＩｇＧクラスに属し、より高度に好ましいＭＡｂはＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａサブアイソタイプに属する。
【００８９】
好ましいＭＡｂを分泌するハイブリドーマ培養物を数回サブクローニングして、単クローン性および安定性を確立することができる。真核生物の非接着性細胞培養物をサブクローニングするための周知の方法は、限界希釈法、軟質アガロースおよび蛍光活性化細胞ソーティング技術を包含する。各サブクローニングの後、生じた培養物を、好ましくは、抗体分泌およびアイソタイプについて再アッセイして、安定な好ましいＭＡｂ分泌培養物が確立されたことを確実にする。
【００９０】
抗Ｂ．ｔ．トキシン抗体は、特許請求された本発明のＢ．ｔ．殺虫性トキシン、およびその変異体またはフラグメントを検出する種々の方法において有用である。レポーティング基（reporting group）で標識された抗体を使用して、多様な環境中での抗原の存在を確認することができることは広く知られている。放射性同位体で標識された抗体は、卓越した正確さおよび感度で、多様な生物学的流体中での抗原の存在を確認するためのラジオイムノアッセイにおいて数十年の間使用されてきた。より最近になって、酵素で標識された抗体が、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて放射能標識化抗体の代替として使用されている。さらに、本発明のＢ．ｔ．殺虫性トキシンに対して免疫反応性のある抗体を、ポリスチレンウェルなどの固定化基材または粒子に結合させ、Ｂ．ｔ．トキシンが試験サンプル中に存在するかどうかを判定するための免疫アッセイで使用することができる。
【００９１】
核酸プローブを使用する検出
本発明のトキシンおよび遺伝子を同定するためのさらなる方法は、オリゴヌクレオチドプローブの使用による。これらのプローブは、ヌクレオチド配列を検出できる。これらの配列を、適切な放射性標識によって検出可能にすることができ、あるいは例えば米国特許第６２６８１３２号中に記載のように本質的に蛍光性にすることができる。当技術分野で周知のように、プローブ分子および核酸サンプルが、２つの分子間で強力な塩基対形成結合を形成することによってハイブリッドを形成すると、プローブおよびサンプルが実質的に配列相同性を有することを、合理的に想定することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、例えばＫｅｌｌｅｒおよびＭａｎａｋ（１９９３）に記載のような当技術分野で周知の技術によってストリンジェントな条件下で実施される。プローブの検出は、ハイブリダイゼーションが起こったかどうかを既知の方式で判定する手段を提供する。このようなプローブ分析は、本発明のトキシンコード遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。本発明によるプローブとして使用されるヌクレオチドセグメントは、ＤＮＡシンセサイザーおよび標準的手順を使用して合成することができる。これらのヌクレオチド配列はまた、本発明の遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーとして使用することができる。
【００９２】
核酸のハイブリダイゼーション
分子生物学の当業者にとって周知であるように、２つの核酸の類似性は、それらのハイブリダイズする傾向によって特徴付けることができる。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、プローブがその標的配列に他の配列に比べて検出可能なより大きな程度まで（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍超）ハイブリダイズ（アニール）する条件を指すと解釈される。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、環境により異なる。ハイブリダイゼーション条件および／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することによって、プローブに対して１００％相補的である標的配列を同定することができる（相同プロービング）。別法として、ストリンジェンシーの条件を、配列中の一部の不一致を認めるように調節して、より低度の類似性を検出することができる（非相同プロービング）。一般に、プローブは、約１０００未満のヌクレオチド長、好ましくは５００未満のヌクレオチド長である。
【００９３】
典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．３で約１．５Ｍ未満のＮａイオン、典型的には約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（またはその他の塩）であり、温度は、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）で少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、５０を超えるヌクレオチド）で少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件は、また、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加で達成することができる。典型的な低ストリンジェンシー条件には、３７℃の３０％〜３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液でのハイブリダイゼーション、および５０℃〜５５℃での１Ｘ〜２Ｘ ＳＳＣ（２０Ｘ ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中での洗浄が含まれる。典型的な中等度のストリンジェンシー条件には、３７℃での、４０％〜４５％のホルムアミド、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および５５℃〜６０℃での０．５Ｘ〜１Ｘ ＳＳＣ中での洗浄が含まれる。典型的な高ストリンジェンシー条件には、３７℃での５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および６０℃〜６５℃での０．１Ｘ ＳＳＣ中での洗浄が含まれる。任意選択で、洗浄緩衝液は、約０．１％〜約１％のＳＤＳを含むことができる。ハイブリダイゼーションの継続時間は、一般に、約２４時間未満、通常、約４〜約１２時間である。
【００９４】
特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、決定的因子は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの場合、熱融解温度（Ｔｍ）は、（規定のイオン強度およびｐＨの下で）相補性標的配列の５０％が、完全に一致したプローブにハイブリダイズする温度である。Ｔｍは、各１％の不一致に対し約１℃低下し、したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション条件、および／または洗浄条件を調節して、所望の同一性をもつ配列のアニーリングを促進することができる。例えば、９０％を超える同一性を備えた配列を求めるなら、Ｔｍを１０℃下げることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列およびその相補配列に対するＴｍに比べて約５℃低いように選択される。しかし、高ストリンジェント条件は、Ｔｍに比べて１℃、２℃、３℃または４℃より低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ、中等度にストリンジェントな条件は、Ｔｍに比べて６℃、７℃、８℃、９℃または１０℃より低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ、低ストリンジェントな条件は、Ｔｍに比べて１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃または２０℃より低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる。
【００９５】
Ｔｍ（℃）は、実験的に測定することができ、あるいは計算によって近似することができる。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの場合、Ｔｍは、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌの式（１９８４）で近似することができる：
Ｔｍ（℃）＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ；
ここで、Ｍは一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ホルムアミドはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、Ｌは塩基対中のハイブリッドの長さである。
【００９６】
別法として、Ｔｍは、次式によって記述される（Ｂｅｌｔｚら、１９８３）。
Ｔｍ（℃）＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルムアミド）−６００／Ｌ
ここで、［Ｎａ＋］はナトリウムイオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ホルムアミドはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、Ｌは塩基対中のハイブリッドの長さである。
【００９７】
これらの式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、および所望のＴｍを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーの変更が本質的に記述されることを理解するであろう。所望の不一致度が、４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴｍをもたらすなら、より高い温度を使用できるように、ＳＳＣ濃度を高めることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションへの完璧な指針が、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９５）の論文中に認められる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）の論文も参照されたい。
【００９８】
サザンブロット上に固定化されたＤＮＡの放射能標識化された遺伝子特異的プローブとのハイブリダイゼーションは、標準的な方法によって実施することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上）。ポリヌクレオチドプローブを標識化するのに使用される放射性同位体としては、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃ、または３Ｈを挙げることができる。放射性同位体のポリヌクレオチドプローブ分子中への組み込みは、分子生物学の分野の当業者にとって周知であるいくつかの方法のいずれかによって行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上を参照されたい）。
【００９９】
一般に、ハイブリダイゼーションおよびそれに続く洗浄は、特許請求されるトキシンコード遺伝子に対して相同性を有する標的配列の検出を可能にする厳密な条件下で実施することができる。二本鎖ＤＮＡ遺伝子プローブの場合、ハイブリダイゼーションは、６Ｘ ＳＳＰＥ、５Ｘデンハート液、０．１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ変性ＤＮＡ中、ＤＮＡハイブリッドのＴｍより２０〜２５℃低い温度で一夜実施することができる［２０Ｘ ＳＳＰＥは３Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ ＮａＨＰＯ４、および０．０２Ｍ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩）であり；１００Ｘデンハート液は、２０ｇ／Ｌポリビニルピロリドン，２０ｇ／Ｌ Ｆｉｃｏｌｌタイプ４００、および２０ｇ／Ｌウシ血清アルブミン（フラクションＶ）である］。
【０１００】
洗浄は、典型的には、次のように実施することができる：
１Ｘ ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１５分間、２回（低ストリンジェンシーの洗浄）。
０．２Ｘ ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、Ｔｍ−２０℃で１５分間、１回（中等度のストリンジェンシーの洗浄）。
【０１０１】
オリゴヌクレオチドプローブの場合、ハイブリダイゼーションは、６Ｘ ＳＳＰＥ、５Ｘデンハート液、０．１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ変性ＤＮＡ中、ハイブリッドのＴｍより１０℃〜２０℃低い温度で一夜実施することができる。オリゴヌクレオチドプローブのためのＴｍは、次式によって決定することができる（Ｓｕｇｇｓら、１９８１）。
Ｔｍ（℃）＝２（Ｔ／Ａ塩基対の数）＋４（Ｇ／Ｃ塩基対の数）
【０１０２】
洗浄は、典型的には、次のように実施することができる：
１Ｘ ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１５分間、２回（低ストリンジェンシーの洗浄）。
１Ｘ ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、ハイブリダイゼーション温度で１５分間、１回（中等度のストリンジェンシーの洗浄）。
【０１０３】
ハイブリダイゼーション用プローブ分子、およびプローブと標的分子との間で形成されるハイブリッド分子を、放射能標識化以外の手段によって検出できるようにすることができる。このような代替方法は、本発明の範囲に包含されると解釈される。
【０１０４】
本明細書中で言及または引用されるすべての特許、特許出願、仮出願、および刊行物は、参照によりその全体で、それらが本明細書の明確な教示と矛盾しない程度まで本明細書に組み込まれる。特別に指摘または暗示しない限り、不定冠詞（ａ、ａｎ）および定冠詞（ｔｈｅ）は、本明細書中で使用する場合、「少なくとも１つ」を意味する。本明細書中で用語「遺伝子材料」を使用することによって、すべての遺伝子、核酸、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含することを意味する。
【０１０５】
ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびプライマーのヌクレオチド残基の名称について、およびタンパク質のアミノ酸残基の名称については、標準的なＩＵＰＡＣの省略形を、本文書を通して採用する。核酸配列は、標準的な５’から３’の方向で示され、タンパク質配列は、標準的なアミノ（Ｎ）末端からカルボキシ（Ｃ）末端の方向で示される。
【０１０６】
以下は、本発明を実施するための手順を例示する実施例である。本明細書に記載の実施例および実施形態は、単に例示目的のためであること、およびそれらを考慮した種々の改変形態または変更形態が当業者に対して示唆され、本出願の精神および範囲内、ならびに添付の特許請求の範囲内に包含されることを理解されたい。これらの実施例を、限定と解釈すべきでない。特記しない限り、パーセンテージは、すべて重量によるものであり、溶媒混合物の比率は、すべて容積による。温度は、すべて摂氏温度である。
【実施例１】
【０１０７】
ＤＩＧ−３トキシンをコードする遺伝子の単離
本明細書中でＤＩＧ−３と称する殺虫性Ｃｒｙタンパク質をコードする核酸を、Ｂ．ｔ．株ＰＳ４６ＬのゲノムＤＮＡから、配列番号１の塩基１２８６〜１３１１にハイブリダイズする縮重順方向プライマー、および配列番号１の塩基２４８０〜２４９９の相補配列にハイブリダイズするミスマッチの逆方向プライマーを使用するＰＣＲによって単離した。このプライマー対を使用して、配列番号１のヌクレオチド１２８６〜２４９９に対応する１２１４ｂｐのフラグメントを増幅した。この配列を、Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ（商標）ユニバーサルキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、カリフォルニア州）から構成される方法を使用するゲノムウォーキングを開始するためのアンカーポイントとして使用した。ＤＩＧ−３コード領域にまたがるフラグメントの核酸配列を決定した。配列番号１は、完全長ＤＩＧ−３タンパク質をコードする３７７１ｂｐのヌクレオチド配列である。配列番号２は、配列番号１に由来する完全長ＤＩＧ−３タンパク質のアミノ酸配列である。バチルス（Bacillus）種において、配列番号１のその領域などのタンパク質コード領域は、翻訳すればアミノ酸メチオニンを表すＴＴＧコドンで始まることができることに留意されたい。
【実施例２】
【０１０８】
ＤＩＧ−３からドメインＩのα−へリックスの欠失
ＤＩＧ−３トキシンの殺虫特性を改善するために逐次的、段階的欠失を行い、そのそれぞれがＤＩＧ−３タンパク質のＮ末端部分を欠失させる。該欠失は、α−へリックス３からα−へリックス７までの構造的完全性を維持しながら、ドメインＩのα−へリックス１の一部または全部、およびα−へリックス２の一部または全部を除去する。
【０１０９】
欠失は、次のように設計した。この実施例は、完全長ＤＩＧ−３タンパク質をコードする完全長キメラＤＮＡ配列、例えば、配列番号１、および配列番号２をそれぞれ利用して、６７の特定変異体を伴う設計原理を例示する。この例は、配列番号５のキメラ配列（Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントに融合されるＤＩＧ−３コアトキシンセグメントをコードするＤＮＡ）を利用して、さらなる６７の特定変異体を提供する。当業者は、ＤＩＧ−３タンパク質のすべてまたはＮ末端部分をコードするその他のＤＮＡ配列を、同様に操作して、所望の結果を達成できることを認識するであろう。最初の欠失変異体のコード配列を考案するために、α−へリックス２Ａの始まり近くのプロリン残基用のコドン（すなわち、配列番号２の完全長ＤＩＧ−３タンパク質のためのＰ７３）までα−へリックス１をコードする塩基のすべてを除去する。これによって、配列番号１の塩基１〜２１６の除去は、配列番号２のアミノ酸１〜７２のためのコード配列を除去する。開始点（すなわち、完全長タンパク質のアミノ酸７３に対応するコドンの前）での翻訳開始ＡＴＧ（メチオニン）コドンの再導入は、１１８５のアミノ酸を含む欠失変異体ＤＩＧ−３タンパク質（すなわち、メチオニン＋完全長ＤＩＧ−３タンパク質のアミノ酸７３〜１２５６）をコードする３５５５塩基のオープンリーディングフレームを含む欠失変異体のコード配列を提供する。配列番号２の完全長ＤＩＧ−３タンパク質の残基７３〜１１２に対応する単一アミノ酸のためのさらなるコドンを除去する逐次的、段階的欠失は、α−へリックス２Ａおよびα−へリックス２Ｂの一部またはすべてを欠く変異体を提供する。したがって、第２の設計された欠失変異体のコード配列は、配列番号１の塩基１〜２１９の除去を必要とし、それによってアミノ酸１〜７３のためのコード配列を除去する。機能性オープンリーディングフレームの修復は、残りのコード配列の開始点に翻訳開始メチオニンコドンを再導入することによって再び完了され、これによって、１１８４個のアミノ酸を含む欠失変異体ＤＩＧ−３タンパク質（すなわち、メチオニン＋完全長ＤＩＧ−３タンパク質のアミノ酸７４〜１２５６）をコードする３５５２塩基のオープンリーディングフレームを有する第２の欠失変異体のコード配列を提供する。最後に設計される欠失変異体のコード配列は、配列番号１の塩基１〜３３６の除去を必要とし、これによって、アミノ酸１〜１１２のためのコード配列を除去し、翻訳開始メチオニンコドンの再導入後に、１１４５アミノ酸の欠失変異体ＤＩＧ−３タンパク質（すなわち、メチオニン＋完全長ＤＩＧ−３タンパク質のアミノ酸１１３〜１２５６）をコードする３４３５塩基のオープンリーディングフレームを有する欠失変異体コード配列を提供する。例示されるように、欠失配列の除去後にイニシエーターメチオニンコドンを、残りのコード配列の最初に付加して、機能性オープンリーディングフレームを再生させる。また、先に記載したように、欠失配列の除去によって全長タンパク質の残りの部分のＮ末端に前述の不安定決定性アミノ酸の１つが露出されたままである場合、メチオニンコドンとその不安定決定性アミノ酸のコドンとの間に、さらなるグリシンコドンを付加できる。
【０１１０】
表３に、前記のストラテジーにより設計された特定変異体を記載する。
【表３】
【表４】
【表５】
【０１１１】
表３に記載のトキシンをコードする核酸は、前に述べたとおり、植物中での発現を意図した合成遺伝子に関する一般的原理により設計される。
【実施例３】
【０１１２】
ＤＩＧ−３Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質のためのコード配列の植物最適化バージョンの設計
植物のコドンバイアスを有するＤＮＡ配列を設計、合成して、遺伝子導入単子葉植物および遺伝子導入双子葉植物中でＤＩＧ−３タンパク質を産生させた。トウモロコシ（Zea mays L.）用のコドン使用頻度表を、ＧｅｎＢａｎｋに寄託された配列から得られる７０６のタンパク質コード配列（ＣＤ）から計算した。タバコ（Nicotiana tabacum、１２６８ＣＤ）、カノーラ（Brassica napus、５３０ＣＤ）、ワタ（Gossypium hirsutum、１９７ＣＤ）、およびダイズ（Glycine max、約１０００ＣＤ）用のコドン使用頻度表を、ウェブサイト、http://www.kazusa.or.jp/codon/のデータからダウンロードした。適切な加重平均相対量の、トウモロコシおよび双子葉双方のデータセットに共通な高度に使用されるコドンを含むバイアス付きコドンセットを、どちらかの植物タイプ中のアミノ酸に関する全コドン使用の約１０％未満で使用される任意の冗長なコドンを除外した後に計算した。ＤＩＧ−３タンパク質をコードする植物最適化配列を引き出すため、得られるＤＮＡ配列が植物最適化コドンバイアス表の全コドン組成を有するように、実験的に決定したＤＩＧ−３ ＤＮＡ配列へのコドン置換を行った。配列のさらに洗練させて、望ましくない制限酵素認識部位、潜在的植物イントロンスプライス部位、Ａ／Ｔ残基またはＣ／Ｇ残基のロングラン、および植物細胞におけるコード領域のＲＮＡ安定性、転写、または翻訳を妨害する可能性のあるその他のモチーフを排除した。所望の制限酵素認識部位を導入し、かつ長い内部オープンリーディングフレーム（＋１以外のフレーム）を排除するために、その他の変更を行った。これらの変更は、すべて、植物用バイアス付きコドン組成を維持する制約内で行われた。設計された配列の合成は、商業的供給業者によって実施された（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、カリフォルニア州）。
【０１１３】
合成遺伝子の作製に関するさらなる指針は、例えば、国際公開第９７／１３４０２号および米国特許第５３８０８３１号中に見出すことができる。
【０１１４】
完全長ＤＩＧ−３トキシンをコードする植物最適化ＤＮＡ配列を、配列番号３に示す。Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントをコードする双子葉最適化ＤＮＡ配列を、配列番号６として開示する。Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントをコードするトウモロコシ最適化ＤＮＡ配列を、配列番号７として開示する。
【実施例４】
【０１１５】
ＤＩＧ−３殺虫性トキシンをコードする発現プラスミドの構築および細菌宿主中での発現
標準的なクローニング法を使用して、植物最適化コード領域中にコードされる完全長ＤＩＧ−３タンパク質を産生するように遺伝子操作されたシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）発現プラスミドを構築した。制限酵素エンドヌクレアーゼを、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、マサチューセッツ州）から入手し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＤＮＡのライゲーションに使用した。プラスミドの調製は、供給業者の説明書に従って、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）Ｘｔｒａキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ Ｉｎｃ、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ペンシルベニア州）またはＰｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して実施した。ＤＮＡフラグメントは、アガローストリスアセテートゲル電気泳動の後に、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）−ＤＡカートリッジ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、マサチューセッツ州）を使用して精製した。
【０１１６】
基本的なクローニング戦略は、ＤＩＧ−３トキシンのコード配列（ＣＤＳ）をｐＤＯＷ１１６９中にＳｐｅＩおよびＸｈｏＩ各制限酵素部位でサブクローニングすることを必要とし、それによって、その配列は、ＰｔａｃプロモーターおよびプラスミドｐＫＫ２２３−３（ＰＬ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ウィスコンシン州）由来のｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターの発現調節下に置かれる。ｐＤＯＷ１１６９は、ＲＳＦ１０１０起源の複製、ｐｙｒＦ遺伝子、およびその中にタンパク質コード領域を含むＤＮＡフラグメントを導入できる制限酵素認識部位の前方にリボソーム結合部位を有する中程度のコピー数のプラスミドである（米国特許出願公開第２００８／０１９３９７４号）。ｐＤＡＢ４１７１と呼ばれる発現プラスミドを、エレクトロポレーションによってＤＣ４５４（突然変異ΔｐｙｒＦおよびｌｓｃ：：ｌａｃＩＱＩを有する野生型に近いＰ．フルオレセンス（P.fluorescens）株）またはその誘導体中に形質転換し、ＳＯＣ−ダイズ加水分解産物培地中で回収し、選択培地（ウラシルを欠くＭ９グルコース寒天、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上）上に播種する。微生物操作の詳細は、参照により本明細書に組み込まれるＳｑｕｉｒｅｓら（２００４）、米国特許出願公開第２００６／０００８８７７号、米国特許出願公開第２００８／０１９３９７４号、および米国特許出願公開第２００８／００５８２６２号で利用可能である。コロニーを、まずＰＣＲでスクリーニングし、次いで、陽性クローンをミニプレッププラスミドＤＮＡの制限酵素消化によって分析した。インサートを含む選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを、Ｂｉｇ Ｄｙｅ（登録商標）ターミネーター、バージョン３．１を供給業者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の推奨するように使用することによって、または商業的配列決定業者（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、アラバマ州）との契約によって配列決定した。配列データを、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ミシガン州）を使用して組み立て、解析した。
【０１１７】
振盪フラスコ中での増殖および発現の解析。
特徴付けおよび昆虫でのバイオアッセイのためのＤＩＧ−３トキシンの製造は、発現構築物（例えば、クローンＤＰ２８２６）を収容する振盪フラスコ中で増殖したＰ．フルオレセンス（P.fluorescens）株によって達成された。１％グルコースおよび微量元素を補足したＭ９培地中で増殖された種培養物を使用して、５％グリセロールを含む５０ｍＬの規定された最小培地（Ｔｅｋｎｏｖａ カタログ番号３Ｄ７４２６Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、カリフォルニア州）に播種した。振盪しながらの３０℃で２４時間の初期インキュベーションの後に、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって、Ｐｔａｃプロモーターを介するＤＩＧ−３トキシン遺伝子の発現を誘導した。培養物を、誘導の時点、および誘導後の異なる時点でサンプリングした。細胞密度を、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）によって測定した。例えば、Ｈｕａｎｇら（２００７）および米国特許出願公開第２００６／０００８８７７号中に記載のように、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）の増殖に適したその他の培養培地も利用することができる。
【０１１８】
振盪フラスコ中のサンプルの細胞分画およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
各サンプリングの時点で、サンプルの細胞密度を、ＯＤ６００＝２０に調節し、１ｍＬのアリコートを１４０００ｘｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを−８０℃で凍結した。凍結された振盪フラスコ内細胞ペレットサンプルからの可溶性画分および不溶性画分を、ＥａｓｙＬｙｓｅ（商標）細菌タンパク質抽出溶液（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）を使用して調製した。各細胞ペレットを、１ｍＬのＥａｓｙＬｙｓｅ（商標）溶液に再懸濁し、さらに溶解緩衝液中に１：４で希釈し、振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。この溶解物を、４℃、１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を可溶性画分として回収した。次いで、ペレット（不溶性画分）を等容積のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）に再懸濁した。
【０１１９】
サンプルを、β−メルカプトエタノールを含む２Ｘ Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上）と１：１で混合し、５分間煮沸した後、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＸＴ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ１２％ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）にロードした。推奨されたＸＴ ＭＯＰＳ緩衝液中で電気泳動を実施した。ゲルを、製造業者（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のプロトコールに従ってＢｉｏ−Ｓａｆｅクーマシー染色液で染色し、Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ Ｉｍａｇｉｎｇシステム（Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ、カリフォルニア州）を使用して画像化した。
【０１２０】
封入体の調製。
Ｃｒｙタンパク質封入体（ＩＢ）の調製は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分光測定法）によって立証されるように、不溶性Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質を産生するＰ．フルオレセンス（P.fluorescens）発酵物からの細胞で実施した。Ｐ．フルオレセンス（P.fluorescens）発酵のペレットを、３７℃の水浴中で解凍した。細胞を、溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）二ナトリウム塩、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、５ｍＬ／Ｌの細菌プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐ８４６５ Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）を使用直前に添加した）中に２５％ｗ／ｖまで再懸濁した。細胞を、最低に設定した携帯型ホモジナイザー（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅａｒｏｒ、ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、オクラホマ州）を使用して懸濁した。細胞懸濁液にリゾチーム（２５ｍｇのＳｉｇｍａ Ｌ７６５１，ニワトリ卵白由来）を、金属スパチュラで混合して添加し、懸濁液を室温で１時間インキュベートした。懸濁液を、氷上で１５分間冷却し、次いでＢｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ２５０（１分の持続期間を２回、動作周期５０％、出力３０％）を使用して超音波処理した。細胞溶解物を顕微鏡法でチェックした。必要な場合、さらなる２５ｍｇのリゾチームを添加し、インキュベーションおよび超音波処理を繰り返した。細胞溶解物を顕微鏡法で確認したら、この溶解物を１１５００ｘｇで２５分間（４℃）遠心分離して、ＩＢペレットを形成し、上清を廃棄した。ＩＢペレットを、１００ｍＬの溶解緩衝液で再懸濁し、携帯型ミキサーでホモジナイズし、上記のように遠心分離した。上清が無色になり、かつＩＢペレットが堅くオフホワイトになるまで、ＩＢペレットを再懸濁（５０ｍＬの溶菌緩衝液中に）、ホモジナイズ、超音波処理、および遠心分離によって反復洗浄した。最終洗浄では、ＩＢペレットを、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む滅菌濾過（０．２２μｍ）蒸留水中に再懸濁し、遠心分離した。最終ペレットを、２ｍＭＥＤＴＡを含む滅菌濾過蒸留水中に再懸濁し、１ｍＬアリコートに−８０℃で貯蔵した。
【０１２１】
ＩＢ調製物中のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および定量を、ＩＢペレットの１ｍＬアリコートを解凍すること、および滅菌濾過蒸留水で１：２０に希釈することによって実施した。希釈されたサンプルを、次いで、４Ｘ還元サンプル緩衝液［２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、４０％グリセロール（ｖ／ｖ）、０．４％ブロモフェノールブルー（ｗ／ｖ）、８％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）、および８％β−メルカプトエタノール（ｖ／ｖ）］と共に煮沸し、１Ｘ Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳ緩衝液（ＢｉｏＲａｄ）で展開される、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシン、１２＋２ウェルゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードした。ゲルを、２００ボルトで６０分間展開し、次いでクーマシーブルー（４５％メタノール、１０％酢酸中の５０％Ｇ−２５０／５０％Ｒ−２５０）で染色し、蒸留水中の７％酢酸、５％メタノールで脱染した。標的バンドの定量は、該バンドの濃度測定値を、標準曲線を作出するために同一ゲル上で展開されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）サンプルに対比して行った。
【０１２２】
封入体の可溶化。
ＰｆクローンＤＰ２８２６からの封入体懸濁液（３２ｍｇ／ｍＬのＤＩＧ−３タンパク質を含む）６ｍＬを、最高に設定したＥｐｐｅｎｄｏｒｆモデル５４１５Ｃ微量遠心管で遠心分離（ほぼ１４０００ｘｇ）して封入体をペレットにした。貯蔵緩衝液上清を除去し、５０ｍＬコニカル管中、２５ｍＬの１００ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１）で置き換えた。封入体を、ピペットを使用して再懸濁し、ボルテックスして完全に混合した。この遠心管を、静かに揺れる台上に４℃で一夜載せ、標的タンパク質を抽出した。抽出物を、４℃、３００００ｘｇで３０分間遠心分離し、生じた上清を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５再生セルロース遠心フィルター装置（３００００の分子量カットオフ）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して５分の１に濃縮した。次いで、サンプル緩衝液を、使い捨てのＰＤ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）を使用して１０ｍＭ ＣＡＰＳ［３−（シクロヘキサミノ）１−プロパンスルホン酸］、ｐＨ１０に変更した。
【０１２３】
ゲル電気泳動。
電気泳動のために、濃縮された抽出物を、還元剤として５ｍＭのジチオトレイトールを含むＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１：５０に希釈することによって調製し、９５℃で４分間加熱した。サンプルを、０．２〜２μｇ／レーンの範囲の５つのＢＳＡ標準（標準曲線の作出のため）と並んで、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲルの二つ組みのレーンにロードした。ＭＯＰＳ ＳＤＳ展開緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、トラッキングダイがゲルの底部に到達するまで、２００Ｖの電圧を印加した。ゲルを、４５％メタノール、１０％酢酸中の０．２％クーマシーブルーＧ−２５０で染色し、まず４５％メタノール、１０％酢酸で簡単に、次いで７％酢酸、５％メタノールで、バックグラウンドが透明になるまで十分に脱染した。脱染に続いて、ゲルを、Ｂｉｏｒａｄ Ｆｌｕｏｒ−Ｓ ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒでスキャンした。装置のＱｕａｎｔｉｔｉｙ Ｏｎｅ ｖ．４．５．２ソフトウェアを使用して、バックグラウンドを差し引いたタンパク質バンド量を取得し、ＢＳＡ標準曲線を作成し、その曲線を使用して、ストック液中のＤＩＧ−３タンパク質の濃度を計算した。
【実施例５】
【０１２４】
シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）中で産生された改変ＤＩＧ−３タンパク質の殺虫活性
ＤＩＧ−３Ｂ．ｔ．殺虫性トキシンは、ユーロピアンコーンボーラー（European corn borer）（ＥＣＢ；Ostrinia nubilalis（Hubner））、cｒｙ１Ｆ耐性ＥＣＢ（ｒＥＣＢ）、ダイアモンドバックモス（diamondback moth）（ＤＢＭ；Plutella xylostella（Linnaeus））、cｒｙ１Ａ耐性ＤＢＭ（ｒＤＢＭ）、コーンイアーワーム（corn earworm）（ＣＥＷ；Helicoverpa zea（Boddie））、ブラックカットワーム（black cutworm）（ＢＣＷ；Agrotis ipsilon（Hufnagel））、タバコバッドワーム（tabocco budworm）（ＴＢＷ；Heliothis virescens）（Fabricius））、およびキャベツルーパー（cabbage looper）（ＣＬ；Trichoplusia ni）（Hubner））を含む鱗翅目種に対して活性であることを実証した。ＤＩＧ−３タンパク質は、フォールアームワーム（fall armworm）（ＦＡＷ、Spodoptera frugiperda）、Ｃｒｙ１Ｆ耐性ＦＡＷ（ｒＦＡＷ）、およびウェスターンコーンルートワーム（western corn rootworm）（ＷＣＲ；Diabrotica virgifera virgifera ルコント）に対する活性についても試験された。
【０１２５】
サンプルの調製およびバイオアッセイ。
１０ｍＭ ＣＡＰＳ（ｐＨ１０）中の封入体調製物を、１０ｍＭ ＣＡＰＳ（ｐＨ１０）で適切に希釈し、すべてのバイオアッセイに、この緩衝液からなる対照処理を含めた。この対照処理は、死亡率または成長阻害に関するバックグラウンドのチェックとして役立つ。
【０１２６】
ＢｉｏＲａｄ画像化システム（Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ ソフトウェア、バージョン４．５．２を備えたＦｌｕｏｒ−Ｓ ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ）を使用して測定されるゲルデンシトメトリー用の標準曲線を作成するためＢＳＡを使用するゲル電気泳動によって、バイオアッセイ緩衝液中のタンパク質濃度を推定した。ゲルマトリックス中のタンパク質を、クーマシーブルーをベースにした染色液で染色し、読取り前に脱染した。
【０１２７】
精製されたタンパク質を、殺虫活性について、人工昆虫飼料の新生鱗翅目幼虫を用いて実施するバイオアッセイにおいて試験した。ＢＣＷ、ＣＥＷ、ＣＬ、ＤＢＭ、ｒＤＢＭ、ＥＣＢ、ＦＡＷ、およびＴＢＷの幼虫を、商業的昆虫飼育場（Ｂｅｎｚｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｉｓｌｅ、ペンシルベニア州）によって養育されたコロニーから入手した卵から孵化させた。ＷＣＲ卵は、Ｃｒｏｐ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ、ミネソタ州）から入手した。ｒＥＣＢおよびｒＦＡＷの幼虫は、所有コロニー（Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、インディアナ州）から集めた卵から孵化させた。
【０１２８】
バイオアッセイは、昆虫バイオアッセイ用に特別に設計された１２８ウェルのプラスチックトレー（Ｃ−Ｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐｉｔｍａｎ、ニュージャージー州）中で実施した。各ウェルには、１．０ｍＬの多種用鱗翅目飼料（Ｓｏｕｔｈｌａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｌａｋｅ Ｖｉｌｌａｇｅ、アーカンサス州）を入れた。各ウェルの１．５ｃｍ２の飼料表面にピペットでタンパク質サンプルの４０μＬのアリコートを加えた（２６．７μＬ／ｃｍ２）。飼料の濃度は、ウェル中の表面積の平方センチメートル（ｃｍ２）当たりのＤＩＧ−３タンパク質の量（ｎｇ）として計算した。処理されるトレーを、飼料表面上の液体が蒸発するかまたは飼料中に吸収されるまで換気フード中に保持した。
【０１２９】
孵化の数時間以内に、個々の幼虫を湿らせたラクダ毛ブラシで拾い上げ、ウェル毎に１幼虫を処理された飼料上に置いた。次いで、寄生されたウェルを、透明プラスチックの粘着シート（Ｃ−Ｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐｉｔｍａｎ、ニュージャージー州）で密封し、ガス交換を可能にするために穴を開けた。バイオアッセイトレーを、調節された環境条件（２８℃、相対湿度約４０％、明：暗＝１６：８）下に５日間保持した後、各タンパク質サンプルに晒された昆虫の総数、死亡昆虫数、および生残昆虫の重量を記録した。各処理について、パーセント死亡率およびパーセント成長阻害を計算した。成長阻害（ＧＩ）は、次の通り計算した：
ＧＩ＝［１−（ＴＷＩＴ／ＴＮＩＴ）／（ＴＷＩＢＣ／ＴＮＩＢＣ）］
ここで、ＴＷＩＴは、その処理における昆虫の総重量であり、
ＴＮＩＴは、その処理における昆虫の総数であり、
ＴＷＩＢＣは、バックグラウンドチェック（緩衝液対照）における昆虫の総重量であり、
ＴＮＩＢＣは、バックグラウンドチェック（緩衝液対照）における昆虫の総数である。
【０１３０】
ＧＩ５０を、ＧＩ値が５０％となる、飼料中のＤＩＧ−３タンパク質濃度であるように定めた。ＬＣ５０（５０％致死濃度）を、試験昆虫の５０％が死滅する飼料中のＤＩＧ−３タンパク質濃度として記録した。ＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳ、Ｃａｒｙ、ノースカロライナ州）を使用して統計解析（一方向ＡＮＯＶＡ）を行った。
【０１３１】
表６に、ユーロピアンコーンボーラー（European corn borer）およびＣｒｙ１Ｆ耐性ユーロピアンコーンボーラー（European corn borer）（ｒＥＣＢ）に対するＤＩＧ−３タンパク質のバイオアッセイ試験の結果を示す。試験昆虫ｒＥＣＢが、野生型昆虫ＥＣＢと同様、ＤＩＧ−３タンパク質の作用に対して感受性を持つことは、予想外の驚くべき発見である。
【表６】
【０１３２】
表７に、鱗翅目および鞘翅目有害生物（ＷＣＲ）の広範な範囲についてのバイオアッセイの結果を示す。ＤＩＧ−３タンパク質は、ダイアモンドバックモス（diamondback moth）およびｒＤＢＭに対して予想外の驚くべき活性を有した。さらに、ＤＩＧ−３Ｃｒｙタンパク質は、いくつかのその他の鱗翅目昆虫の成長を規制する上で有効である。
【表７】
*GI=成長阻害、P-値=検定統計量、df=自由度、α(アルファ)レベル0.05=検定有意性のレベル
【実施例６】
【０１３３】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）の形質転換
バイナリー植物形質転換および発現プラスミドの構築では、標準的なクローニング法を使用する。制限酵素エンドヌクレアーゼおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼは、ＮＥＢから入手する。プラスミド調製を、製造業者の説明書に従って、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）プラスミド調製キットまたはＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）ＡＸ Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉキット（双方ともＭａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ製）を使用して実施する。ＤＮＡフラグメントを、ゲル単離の後にＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キットまたはＱＩＡＥＸ ＩＩ（登録商標）ゲル抽出キット（双方ともＱｉａｇｅｎ製）を使用して精製する。
【０１３４】
天然もしくは改変された形態のＤＩＧ−３タンパク質またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡフラグメントは、商業的供給業者（例えば、ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、カリフォルニア州）によって合成され、標準的なプラスミドベクター中のクローニングされたフラグメントとして供給されることができ、あるいは適切なヌクレオチド配列を含むその他の構築物の標準的な分子生物学的操作によって得ることができる。ＤＩＧ−３コード領域に対する内部の固有の制限酵素部位を確認することができ、ＤＩＧ−３コード領域の制限酵素部位間の配列を含むＤＮＡフラグメントを合成することができ、このようなそれぞれのフラグメントは、特定の欠失、挿入またはその他のＤＩＧ−３変形形態をコードする。改変されたＤＩＧ−３フラグメントをコードするＤＮＡフラグメントを、他のＤＩＧ−３コード領域フラグメントまたは他のＣｒｙコード領域フラグメントに、適切な制限酵素部位で連結して、所望の完全長ＤＩＧ−３タンパク質、欠失または変異体ＤＩＧ−３タンパク質、または融合タンパク質をコードするコード領域を得ることができる。例えば、最初のＤＩＧ−３コード領域の開始点の適切な制限酵素認識部位、およびＤＩＧ−３コード領域に対して内部の第２制限酵素部位を確認することができる。この最初のＤＩＧ−３コード領域のこれらの制限酵素部位での開裂は、最初のＤＩＧ−３コード領域の一部を含むＤＮＡフラグメントを作り出す。別のＤＩＧ−３コード領域または他のＣｒｙコード領域に特異的な類似の適合性のある制限酵素部位によって挟まれた第２のＤＮＡフラグメントを、最初のＤＮＡ制限酵素フラグメントと組み合わせて使用して、変異体または融合クローンを構築することができる。
【０１３５】
非限定的例において、基本的なクローニング戦略は、完全長または改変ＤＩＧ−３コード配列（ＣＤＳ）を植物発現プラスミド中にＮｃｏＩおよびＳａｃＩ各制限酵素部位でサブクローニングすることでよい。植物発現エレメント（例えば、植物で発現可能なプロモーター、３’末端転写終結、およびポリアデニレート付加決定子など）の調節下で適切なＤＩＧ−３コード領域を含んで得られる植物発現カセットは、例えば、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）技術または標準的な制限酵素フラグメントクローニング法を利用して、バイナリーベクタープラスミド中にサブクローンされる。Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）技術を利用するなら、例えば、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、完全長および改変遺伝子植物発現カセットをバイナリー植物形質転換プラスミド中に再結合することができる。大腸菌（E.coli）およびアグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞中にプラスミドが存在するなら、抗生物質スペクチノマイシンに対する耐性を付与する細菌遺伝子を収容するバイナリー植物形質転換ベクターを採用するのが便利である。また、所望の宿主植物中で機能性である植物で発現可能で選択可能なマーカー遺伝子を含むバイナリーベクタープラスミドを採用するのが便利である。植物で発現可能で選択可能なマーカー遺伝子の例としては、限定はされないが、抗生物質カナマイシン、ネオマイシンおよびＧ４１８に対する耐性を付与する、トランスポゾンＴｎ５のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ａｐｈＩＩ）、ならびにグリホサート、ヒグロマイシン、メトトレキセート、ホスフィノトリシン（ビアラホス）、イミダゾリノン、スルホニルウレア、およびトリアゾロピリミジン系除草剤、例えば、クロロスルフロン、ブロモキシニル、ダラポンなどに対する耐性または寛容性をコードするそれらの遺伝子をコードするものが含まれる。
【０１３６】
アグロバクテリウム・ツムファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株Ｚ７０７Ｓ（Ｚ７０７のストレプトマイシン耐性誘導体；Ｈｅｐｂｕｒｎら、１９８５）のエレクトロコンピテント細胞を調製し、エレクトロポレーションを利用して形質転換する（ＷｅｉｇｅｌおよびＧｌａｚｅｂｒｏｏｋ、２００２）。エレクトロポレーションの後、キュベットに１ｍＬのＹＥＰブロス（ｇ／Ｌ：酵母エキス、１０；ペプトン、１０；ＮａＣｌ、５）を添加し、細胞−ＹＥＰ懸濁液を１５ｍＬの培養管に移し、水浴中、絶えず撹拌しながら２８℃で４時間インキュベートする。細胞を、スペクチノマイシン（２００μｇ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（２５０μｇ／ｍＬ）を含むＹＥＰ＋寒天（２５ｇ／Ｌ）上に播種し、プレートを２８℃で２〜４日間インキュベートする。十分に分離された単一コロニーを選択し、前と同様、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンを含む新鮮なＹＥＰ＋寒天平板上にストリークし、２８℃で１〜３日間インキュベートする。
【０１３７】
バイナリー植物形質転換ベクター中のＤＩＧ−３遺伝子インサートの存在は、選択されたアグロバクテリウム（Agrobacterium）コロニーから調製された鋳型プラスミドＤＮＡを含むベクター特異的プライマーを使用するＰＣＲ分析によって実施される。前と同様、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンを含むＹＥＰ中で増殖された１５ｍＬの一夜培養物の４ｍＬアリコートからの細胞ペレットを、Qiagen Spin（登録商標）Mini Prepsを使用して製造業者の説明書により抽出する。対照として、アグロバクテリウム（Agrobacterium）のエレクトロポレーション形質転換で使用されるバイナリーベクターからのプラスミドＤＮＡを含める。ＰＣＲ反応は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを０．５Ｘの濃度で、製造業者の説明書により使用して完成させる。ＰＣＲ反応は、次の条件、すなわち、ステップ１）９４℃で３分間、ステップ２）９４℃で４５秒間、ステップ３）５５℃で３０秒間、ステップ４）７２℃で、予想される産生物の長さｋｂにつき１分間、ステップ５）ステップ２へと２９回、ステップ６）７２℃で１０分間、でプログラムされたＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｅｌｔｉｅｒサーマルサイクラー中で実施される。反応物は、サイクリングの後、４℃で維持される。増幅産物を、アガロースゲル電気泳動（例えば、０．７％〜１％アガロース、ｗ／ｖ）で分析し、エチジウムブロミド染色で可視化する。ＰＣＲ産物がプラスミド対照と同一であるコロニーを選択する。
【０１３８】
別法として、ＤＩＧ−３遺伝子インサートを含むバイナリー植物形質転換ベクターのプラスミド構築を、アグロバクテリウム（Agrobacterium）操作の当業者にとって周知の標準的な分子生物学的方法によって、候補アグロバクテリウム（Agrobacterium）分離株から調製されたプラスミドＤＮＡを制限酵素消化フィンガープリントマッピングによって実施する。
【０１３９】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換法を介して形質転換された植物を得る当業者は、Ｚ７０７Ｓ以外のその他のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株を有利に使用することができ、株の選択が、形質転換されるべき宿主植物種の個性に依存する可能性があることを理解するであろう。
【実施例７】
【０１４０】
双子葉植物におけるＤＩＧ−３Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質および変異体の産生
アラビドプシス（Arabidopsis）の形質転換。
アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）Ｃｏｌ−０１を、フローラルディップ法（ＷｅｉｇｅｌおよびＧｌａｚｅｂｒｏｏｋ、２００２）を使用して形質転換する。選択されたアグロバクテリウム（Agrobacterium）コロニーを使用して、選択に適した抗生物質を含むＹＥＰブロスの１ｍＬ〜１５ｍＬ培養物に接種する。培養物を、２２０ｒｐｍで絶えず撹拌しながら２８℃で一夜インキュベートする。各培養物を使用して、選択に適した抗生物質を含むＹＥＰブロスの２つの培養物５００ｍＬに接種し、新たな培養物を、絶えず撹拌しながら２８℃で一夜インキュベートする。細胞を、ほぼ８７００ｘｇ、室温で１０分間ペレット化し、生じる上清液を廃棄する。細胞ペレットを、１／２ｘのＭｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）／ＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇｏｌｄ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）、１０％（ｗ／ｖ）ショ糖、０．０４４μＭベンジルアミノプリン（ＤＭＳＯ中の１ｍｇ／ｍＬ原液の１０μＬ／Ｌ）および３００μＬ／Ｌ Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ−７７を含む５００ｍＬの浸透媒体中に徐々に再懸濁させる。ほぼ１月齢の植物を、最も新しい花房のを確実に覆うよう注意して、培地中に１５秒間浸漬する。次いで、植物を、それらの側面に横たえさせ、２４時間覆い（透明または不透明）、水で洗浄し、直立させる。植物を、１６時間の明／８時間の暗の光周期で、２２℃で育成する。浸漬からほぼ４週間後に、種子を収穫する。
【０１４１】
アラビドプシス（Arabidopsis）の育成および選別。
新たに収穫したＴ１種子を、乾燥剤の存在下に室温で少なくとも７日間乾燥させる。種子を、０．１％寒天／水（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液に懸濁し、次いで、４℃で２日間土の層間で保存する。植付けに備えるため、１０．５インチｘ２１インチの発芽トレー（Ｔ．Ｏ．Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｃｌｅａｒｗａｔｅｒ、ミネソタ州）中のＳｕｎｓｈｉｎｅ ＭｉｘＬＰ５（Ｓｕｎ Ｇｒｏ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｃ．、Ｂｅｌｌｅｖｕｅ、ワシントン州）を微細なバーミキュライトで覆い、Ｈｏａｇｌａｎｄ溶液（ＨｏａｇｌａｎｄおよびＡｒｎｏｎ、１９５０）で湿るまで潅水し、次いで２４時間排水したままにする。土層間に保存した種子を、バーミキュライト上に播種し、加湿ドーム（ＫＯＲＤ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｒａｍａｌｅａ、オンタリオ州、カナダ）で７日間覆う。種子を発芽させ、植物を、Ｃｏｎｖｉｒｏｎ（モデルＣＭＰ４０３０またはＣＭＰ３２４４；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｗｉｎｎｉｐｅｇ、マニトバ州、カナダ）中で、１２０〜１５０μｍｏｌ／ｍ２秒の光強度の長日条件下（明１６時間／暗８時間）に一定の温度（２２℃）および湿度（４０〜５０％）下で育成する。植物は、初期にはＨｏａｇｌａｎｄ溶液、その後は脱イオン水で潅水して土壌を濡らすことなく湿らせて保持する。
【０１４２】
播種の５〜６日後にドームを取り去り、形質転換されていない種子から発芽した植物を死滅させるため、植物に化学選別剤を噴霧する。例えば、バイナリー植物形質転換ベクターによって提供される、植物で発現可能で選択可能なマーカー遺伝子が、ｐａｔ遺伝子またはｂａｒ遺伝子（Ｗｅｈｒｍａｎｎら、１９９６）である場合、形質転換された植物を、Ｆｉｎａｌｅ（５．７８％グルホシネートアンモニウム、Ｆａｒｎａｍ Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｐｈｏｅｎｉｘ、アリゾナ州）の１０００Ｘ溶液で噴霧することによって選別することができる。それに続く２回の噴霧は、５〜７日の間隔で実施される。生き残り（盛んに生育している植物）を、最終噴霧の７〜１０日後に識別し、Ｓｕｎｓｈｉｎｅ Ｍｉｘ ＬＰ５で調製されたポット中に移植する。移植された植物を、加湿ドームで３〜４日間覆い、前記の生育条件下でＣｏｎｖｉｒｏｎ中に配置する。
【０１４３】
双子葉植物の形質転換に関わる当業者は、その他の植物で発現可能で選択可能なマーカー遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）を使用する場合に形質転換植物のその他の選別方法を利用できることを理解するであろう。
【０１４４】
遺伝子導入アラビドプシス（Arabidopsis）の昆虫でのバイオアッセイ
改変されたＣｒｙタンパク質を発現する遺伝子導入アラビドプシス（Arabidopsis）系は、人工飼料オーバーレイアッセイにおいて感受性昆虫種に対して活性であることが立証される。遺伝子導入および非導入アラビドプシス（Arabidopsis）系から抽出されたタンパク質を適切な方法で定量し、タンパク質濃度を正規化するようにサンプル量を調節する。バイオアッセイは前記のように人工飼料で実施される。非遺伝子導入アラビドプシス（Arabidopsis）および／または緩衝液および水を、バックグラウンドチェック処理としてアッセイ中に含める。
【実施例８】
【０１４５】
スーパーバイナリーベクターを作製するためのアグロバクテリウム（Agrobacterium）の形質転換
アグロバクテリウム（Agrobacterium）スーパーバイナリー系は、単子葉植物宿主の形質転換に便利に使用される。スーパーバイナリーベクターを構築および検証するための方法は、十分に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる（日本たばこ産業（東京、日本）から入手可能なプラスミドｐＳＢ１用操作マニュアル、バージョン３．１）。標準的な分子生物学および微生物学の方法を使用して、スーバーバイナリープラスミドを作製する。スーパーバイナリープラスミドの構造の確認／検証は、バイナリーベクターについて前に記載したような方法を使用して行われ、プラスミドｐＳＢ１用操作マニュアル中に提案されているように修正することができる。
【実施例９】
【０１４６】
単子葉植物におけるＤＩＧ−３Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質および変異体の作製
トウモロコシのアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換。
Ｈｉｇｈ ＩＩ Ｆ１クロスからの種子（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、１９９１）を、９５％Ｍｅｔｒｏ−Ｍｉｘ３６０無土壌育成培地（Ｓｕｎ Ｇｒｏ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ、Ｂｅｌｌｅｖｕｅ、ワシントン州）と５％粘度／ローム土壌との混合物を含む５ガロンポット中に播種する。植物を、１６：８時間の明：暗光周期による高圧ナトリウムランプおよびメタルハライドランプの組合せを使用して温室中で育成する。形質転換用の未成熟Ｆ２胚を得るために、制御された同胞受粉を実施する。未成熟胚を、胚がほぼ１．０〜２．０ｍｍの大きさである受粉後８〜１０日目に隔離する。
【０１４７】
感染および共培養。
トウモロコシの穂を、液体石鹸でこすり洗いすること、７０％エタノールに２分間浸漬すること、次いで２０％市販漂白剤（０．１％次亜塩素酸ナトリウム）に３０分間浸漬することによって表面滅菌した後、滅菌水ですすぎ洗う。スーパーバイナリーベクターを含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞の懸濁液を、１００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン、１０ｍｇ／Ｌテトラサイクリン、および２５０ｍｇ／Ｌストレプトマイシンを含むＹＥＰ固体培地上にて２８℃で２〜３日間増殖させた細菌の１〜２ループを、１００μＭアセトシリンゴンを含む５ｍＬの液体感染培地（ＬＳ基本培地（ＬｉｎｓｍａｉｅｒおよびＳｋｏｏｇ、１９６５）、Ｎ６ビタミン（Ｃｈｕら、１９７５）、１．５ｍｇ／Ｌ ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、６８．５ｇ／Ｌ ショ糖、３６．０ｇ／Ｌ グルコース、６ｍＭ Ｌ−プロリン、ｐＨ５．２）中に移すことによって調製する。溶液を、均一な懸濁が達成されるまでボルテックスし、紫色フィルターを備えたクレット−サマーソン比色計を使用して、約２００Ｋｌｅｔｔ単位の最終密度まで、または５５０ｎｍでほぼ０．４の光学密度まで調節する。未成熟胚を、２ｍＬの感染培地を含むミクロ遠心管中に直接単離する。培地を除去し、２００Ｋｌｅｔｔ単位の密度を有する１ｍＬのアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液で置き換え、アグロバクテリウム（Agrobacterium）および胚溶液を、室温で５分間インキュベートし、次いで、共培養培地（ＬＳ基本培地、Ｎ６ビタミン、１．５ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、３０．０ｇ／Ｌ ショ糖、６ｍＭ Ｌ−プロリン、０．８５ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ３、１００μＭ アセトシリンゴン、３．０ｇ／Ｌ ジェランガム（ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．、Ｌｅｎｅｘａ、カンザス州）、ｐＨ５．８）に、暗条件下に２５℃で５日間移す。
【０１４８】
共培養の後、胚を選択培地に移し、その後、ほぼ８週間の過程にわたって、形質転換された分離株が得られる。植物で発現可能なｐａｔまたはｂａｒ選別マーカー遺伝子を含むスーパーバイナリープラスミドで形質転換されたトウモロコシ組織の選別のために、ＬＳをベースにした培地（ＬＳ基本培地、Ｎ６ビタミン、１．５ｍｇ／Ｌ２，４−Ｄ、０．５ｇ／Ｌ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸一水和物；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌａｂｒ．）、３０．０ｇ／Ｌ ショ糖、６ｍＭ Ｌ−プロリン、１．０ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌ セフォタキシム、２．５ｇ／Ｌ ジェランガム、ｐＨ５．７）を、ビアラホス（Ｇｏｌｄ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に使用する。胚を、３ｍｇ／Ｌ ビアラホスを含む選択培地に、胚形成分離株が得られるまで移す。回収された分離株を、再生およびさらなる分析のために、２週間間隔で新たな選択培地へ移すことによって大きくする。
【０１４９】
トウモロコシの形質転換に関わる当業者は、その他の植物で発現可能で選択可能なマーカー遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）を使用する場合に形質転換植物のその他の選別方法が利用可能であることを理解するであろう。
【０１５０】
再生および種子生産。
再生のため、培養物を、「２８」誘導培地（ＭＳ塩およびビタミン、３０ｇ／Ｌ ショ糖、５ｍｇ／Ｌ ベンジルアミノプリン、０．２５ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、３ｍｇ／Ｌ ビアラホス、２５０ｍｇ／Ｌ セフォタキシン、２．５ｇ／Ｌ ジェランガム、ｐＨ５．７）に低い明条件（１４μＥｍ−２ｓ−１）下に１週間、次いで高い明条件（ほぼ８９μＥｍ−２ｓ−１）下に１週間移す。続いて、組織を、「３６」再生培地（植物成長調節剤を欠くことを除いて誘導培地と同様）に移す。小植物が高さ３〜５ｃｍまで生長したら、それらを、ＳＨＧＡ培地（Ｓｃｈｅｎｋ−Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ塩、およびビタミン（１９７２）；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌａｂｒ．）、１．０ｇ／Ｌ ｍｙｏ−イノシトール、１０ｇ／Ｌ ショ糖、および２．０ｇ／Ｌ ジェランガム、ｐＨ５．８）を含むガラス培養管に移し、さらなる成長、ならびに茎および根の発育を可能にした。植物を、本明細書中で前に記載したと同様の土壌混合物に移植し、温室中で開花まで育成する。種子生産のための調節された受粉を実施する。
【実施例１０】
【０１５１】
遺伝子導入トウモロコシのバイオアッセイ
植物細胞中で産生されるＤＩＧ−３タンパク質および変異体の生物活性を、通常のバイオアッセイ法（例えば、Ｈｕａｎｇら、２００６を参照されたい）によって立証する。例えば、ＤＩＧ−３トキシンを産生する植物に由来する種々の植物組織または組織片を、調節された給餌環境中で標的昆虫に給餌することによって、有効性を立証することができる。別法として、本明細書中で前に記載したように、ＤＩＧ−３トキシンを産生する植物から得られる種々の植物組織からタンパク質抽出物を調製し、抽出されたタンパク質を人工飼料でのバイオアッセイに組み込むことができる。このような給餌アッセイの結果を、ＤＩＧ−３タンパク質または変異体を産生しない宿主植物からの適切な対照組織、またはその他の対照サンプルを採用する、同様に実施されるバイオアッセイに比較すべきであることを理解されたい。
【０１５２】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、参照により本明細書に明確に組み込まれる、２００９年４月１７日に出願の米国特許仮出願第６１／１７０１８９号に対して利益を主張する。
【０００２】
本発明は、新規な殺虫性Ｃｒｙトキシン、および昆虫を防除するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)(Ｂ．ｔ．)は、δ−エンドトキシンまたはＣｒｙタンパク質として知られる農薬結晶タンパク質を産生する土壌伝播性細菌である。Ｃｒｙタンパク質は、感受性のある昆虫の中腸細胞に作用することによって機能する経口の中毒性物質である。δ−エンドトキシンの広範なリストが、http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.html.に維持され、定期的に更新されている。
【０００４】
ユーロピアンコーンボーラー（European corn borer）（ＥＣＢ）、オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）（Ｈｕｂｎｅｒ）は、米国およびカナダの全域にわたってトウモロコシに最も損害を与える害虫であり、穀物収量の損失および昆虫管理用の費用により、１年に推定で１０億ドルの収入低下をもたらす（Ｗｉｔｋｏｗｓｋｉら、２００２年）。Ｃｒｙタンパク質、最も顕著にはＣｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１ＡｃまたはＣｒｙ１Ｆをコードする遺伝子を発現する遺伝子導入トウモロコシは、ＥＣＢに対して商業的レベルの効力を提供する。
【０００５】
ＥＣＢ耐性遺伝子導入トウモロコシが成功したにもかかわらず、耐性昆虫集団の発生の可能性により、ＥＣＢ防除におけるＣｒｙタンパク質の長期耐用性がおびやかされ、ＥＣＢおよびその他の有害生物を防除するための新規なＣｒｙタンパク質を発見および開発する必要性が生じる。Ｂ．ｔ．Ｃｒｙタンパク質に対する昆虫の耐性は、いくつかの機構を介して発生する可能性がある（Ｈｅｃｋｅｌら、２００７年；ＰｉｇｏｔｔおよびＥｌｌａｒ、２００７年）。Ｃｒｙタンパク質に対する多数のクラスの受容体タンパク質が、昆虫内で確認され、多数の例が各受容体クラス内に存在する。特定のＣｒｙタンパク質に対する耐性は、例えば、受容体タンパク質のカドヘリン領域のトキシン結合部分内での突然変異によって発生する可能性がある。耐性のさらなる手段は、プロトキシンを処理するプロテアーゼによって媒介される可能性がある。したがって、鱗翅目（Lepidoptera）の種におけるＣｒｙトキシンに対する耐性は、少なくとも４つの異なる主要耐性遺伝子によって複雑な遺伝子的根拠を有する。Ｃｒｙタンパク質に対して耐性である鱗翅目昆虫は、コナガ（Plutella xylostella）種（Ｔａｂａｓｈｎｉｋ、１９９４年）、キンウワバ（Trichoplusia ni）種（ＪａｎｍａａｔおよびＭｙｅｒｓ、２００３、２００５年）、およびオオタバコガ（Helicoverpa zeae）種（Ｔａｂａｓｈｎｉｋら、２００８年）の中の分野で発生した。新規で効力の高いＣｒｙタンパク質の開発は、ＥＣＢおよびその他の害虫を管理するためのさらなるツールを提供するであろう。遺伝子導入トウモロコシ中で組み合わせて作られる異なる作用機序を有するＣｒｙタンパク質は、ＥＣＢ昆虫の耐性の発生を防ぎ、害虫防除のためのＢ．ｔ．技術の長期有用性を保護するであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、本明細書中でＤＩＧ−３と呼ばれるトキシンおよびＤＩＧ−３の変異体を含む殺虫性Ｃｒｙトキシン、これらのトキシンをコードする核酸、該トキシンを使用して有害生物を規制する方法、遺伝子導入宿主細胞中でトキシンを産生させる方法、および該トキシンを産生する遺伝子導入植物を提供する。野生型ＤＩＧ−３トキシンの予想されるアミノ酸配列を、配列番号２に示す。
【０００７】
実施例１に記載のように、ＤＩＧ−３タンパク質をコードする核酸は、Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣによってＰＳ４６Ｌと内部的に呼ばれるＢ．ｔ．株から単離された。完全長コード領域に関する核酸配列を決定し、その核酸配列から完全長タンパク質配列を推定した。ＤＩＧ−３トキシンは、Ｃｒｙ１ＢＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＭ９３４９６）およびその他のＢ．チューリンゲンシス（B.thuringiensis）のＣｒｙ１Ｂ型タンパク質に対していくらかの類似性を有する（http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.html）。
【０００８】
ＤＩＧ−３トキシンの殺虫活性のある変異体も、本明細書中で説明され、集約的にＤＩＧ−３トキシンと呼ぶ。
【０００９】
ＤＩＧ−３トキシンは、また、その他の害虫を防除するためのＲＮＡｉの方法と組み合わせて使用することができる。例えば、コーンルートワーム（corn rootworm）中の必須遺伝子、または害虫中の必須遺伝子を抑制するために、ＤＩＧ−３を、遺伝子導入植物中で、ｄｓＲＮＡと組み合わせて使用することができる。このような標的遺伝子としては、例えば、液胞型ＡＴＰアーゼ、ＡＲＦ−１、Ａｃｔ４２Ａ、ＣＨＤ３、ＥＦ−１α、およびＴＦＩＩＢが挙げられる。適切な標的遺伝子の例は、国際公開第２００７／０３５６５０号中に開示されているような液胞型ＡＴＰアーゼである。
【００１０】
本明細書中で報告する驚くべき発見は、ＤＩＧ−３トキシンが、Ｃｒｙ１ＦおよびＣｒｙ１Ａトキシンに対して耐性であるユーロピアンコーンボーラー（European corn borer）およびダイアモンドバックモス（diamond back moth）の各集団に対して活性であることである。したがって、ＤＩＧ−３トキシンは、鱗翅目の有害生物の規制に使用するには理想的な候補である。該トキシンは、単独で、または耐性昆虫集団の発生を抑制するために、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１Ａｃなどのその他のＣｒｙトキシンと組み合わせて使用することができる。
【００１１】
配列番号２の殺虫活性のあるフラグメント、およびこのようなフラグメントをコードするヌクレオチドは、本発明の別の態様である。
【００１２】
一実施形態において、本発明は、
（ａ）配列番号２の残基１１３〜６４３のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２の残基１１３〜６４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号２によってコードされるトキシンの発現または活性に不都合な影響を及ぼさない２０個までのアミノ酸の置換、欠失または修飾を有する、配列番号２の残基１１３〜６４３のアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるコアトキシンセグメントを含む、単離されたＤＩＧ−３トキシンポリペプチドを提供する。
【００１３】
一実施形態において、本発明は、
（ａ）配列番号２の残基７３〜６４３のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２の残基７３〜６４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号２によってコードされるトキシンの発現または活性に不都合な影響を及ぼさない２０個までのアミノ酸の置換、欠失または修飾を有する、配列番号２の残基７３〜６４３のアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるコアトキシンセグメントを含む、単離されたＤＩＧ−３トキシンポリペプチドを提供する。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、
（ａ）配列番号２の残基１〜６４３のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２の残基１〜６４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号２によってコードされるトキシンの発現または活性に不都合な影響を及ぼさない２０個までのアミノ酸の置換、欠失または修飾を有する、配列番号２の残基１〜６４３のアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるＤＩＧ−３コアトキシンセグメントを含む、単離されたＤＩＧ−３トキシンポリペプチドを提供する。
【００１５】
「単離された」とは、本出願人らによれば、ポリペプチドまたはＤＮＡ分子が、人の手によってそれらの本来の環境から取り出され、異なる環境に置かれていることを意味する。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、ＤＩＧ−３トキシンを含む植物を提供する。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、有害生物集団を規制する方法であって、前記集団を農薬上有効な量のＤＩＧ−３トキシンと接触させることを含む方法を提供する。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、ＤＩＧ−３トキシンをコードする単離された核酸を提供する。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）由来でなく植物中での発現を駆動する能力のあるプロモーターに作動可能に連結された、ＤＩＧ−３トキシンをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物を提供する。本発明は、また、そのゲノム中に安定的に組み込まれたＤＮＡ構築物を含む遺伝子導入植物、および有害生物から植物を保護する方法であって、前記植物中に該構築物を導入することを含む方法を提供する。
【００２０】
配列の簡単な説明
配列番号１は、完全長ＤＩＧ−３トキシンをコードするＤＮＡ配列である（３７７１個のヌクレオチド）。
【００２１】
配列番号２は、完全長ＤＩＧ−３タンパク質配列である（１２５６個のアミノ酸）。
【００２２】
配列番号３は、植物に対して最適化された完全長ＤＩＧ−３ＤＮＡ配列である（３７７１個のヌクレオチド）。
【００２３】
配列番号４は、Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントである（５４５個のアミノ酸）。
【００２４】
配列番号５は、キメラトキシン：ＤＩＧ−３コアトキシンセグメント／Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントである（１１８８個のアミノ酸）。
【００２５】
配列番号６は、双子葉植物に対して最適化された、Ｃｒｙ１ＡｂプロトキシンセグメントをコードするＤＮＡ配列である（１６３５のヌクレオチド）。
【００２６】
配列番号７は、トウモロコシに対して最適化された、Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントをコードする、ＤＮＡ配列である（１６３５のヌクレオチド）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
ＤＩＧ−３トキシン、および殺虫活性のある変異体。
配列番号２の完全長ＤＩＧ−３トキシンに加えて、本発明は、殺虫活性のある変異体も包含する。用語「変異体」とは、本出願人らによれば、フラグメント、特定の欠失および挿入突然変異体、ならびに特定の融合タンパク質を包含することを意図する。ＤＩＧ−３は、典型的な３ドメイン型Ｃｒｙトキシンである。本発明に包含されるＤＩＧ−３トキシンの変異体を説明する前置きとして、概括的に３ドメイン型Ｃｒｙトキシン、とりわけＤＩＧ−３タンパク質トキシンの構成を簡単に概観することが有用であろう。
【００２８】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）のδ−エンドトキシン結晶タンパク質分子の大部分は、２つの機能性セグメントから構成されている。プロテアーゼ耐性コアトキシンは第１セグメントであり、タンパク分子の最初の約半分に相当する。約１３０ｋＤａの完全なプロトキシン分子は、昆虫消化管中のプロテアーゼによって、耐性なコアセグメントへと迅速にプロセッシングされる。このプロセッシングによって除去されるセグメントを、本明細書中で「プロトキシンセグメント」と呼ぶ。プロトキシンセグメントは、トキシン結晶の形成に関与すると考えられる（Ａｒｖｉｄｓｏｎら、１９８９）。プロトキシンセグメントは、かくして、トキシン分子のプロテアーゼプロセッシングを低減させることによりコアが昆虫に到達するのを制限することによって（Ｈａｉｄｅｒら、１９８６）、またはトキシンの溶解性を低下させることによって（Ａｒｏｎｓｏｎら、１９９１）、トキシンに対する一部の昆虫の特異性を運ぶようである。Ｂ．ｔ．トキシンは、特定のクラス内でさえも、コアトキシンセグメントからプロトキシンセグメントへの移行についての長さおよび正確な配置においてある程度変動する。コアトキシンセグメントからプロトキシンセグメントへの移行は、典型的には、完全長トキシンのうちの約５０％〜約６０％で起こることになる。配列番号２は、完全長ＤＩＧ−３ポリペプチドの１２５６アミノ酸の配列を開示し、その中のＮ末端の６４３個のアミノ酸が、ＤＩＧ−３のコアトキシンセグメントを含む。配列番号１の５’末端の１９２９個のヌクレオチドが、コアトキシンセグメントのためのコード領域を含む。
【００２９】
Ｃｒｙ１Ａａ１、Ｃｒｙ２Ａａ１、Ｃｒｙ３Ａａ１、Ｃｒｙ３Ｂｂ１、Ｃｒｙ４Ａａ、Ｃｒｙ４ＢａおよびＣｒｙ８Ｅａ１についての三次元結晶構造が決定されている。コアトキシンに関するこれらの構造は、著しく類似しており、後述の特徴を有する３つの異なるドメインから構成される（ｄｅ Ｍａａｇｄら、２００３年で概説されている）。
【００３０】
ドメインＩは、７つのα−へリックスの束であり、α−へリックス５は、６つの両親媒性へリックスで取り囲まれている。このドメインは、細孔形成に関連し、溶血毒およびコリシンを含む他の細孔生成タンパク質と相同性を有している。ＤＩＧ−３タンパク質のドメインＩは、配列番号２のアミノ酸残基５６〜２７８を含む。
【００３１】
ドメインＩＩは、β−プリズム中に一緒に詰められた３つの逆並行βシートによって形成されている。このドメインのループは、昆虫の中腸受容体に結合する上で重要な役割を演じる。Ｃｒｙ１Ａタンパク質において、ドメインＩＩのβシートの頂端で表面に露出されたループは、鱗翅目類のカドヘリン受容体に結合するのに関与する。Ｃｒｙ３ＡａのドメインＩＩのループは、レプチノタルサ・デセムリネアタ（Leptinotarsa decemlineata）（Ｓａｙ）（コロラドポテトビートル（Colorado potato beetle））の膜結合型メタロプロテアーゼに類似の方式で結合する（Ｏｃｈｏａ−Ｃａｍｐｕｚａｎｏら、２００７）。ドメインＩＩは、卵黄およびジャカリンを含めた特定の炭水化物結合性タンパク質と相同性を有する。ＤＩＧ−３タンパク質のドメインＩＩは配列番号２のアミノ酸残基２８３〜４９３を含む。
【００３２】
ドメインＩＩＩは、２つの逆平行βシートのβサンドイッチである。このドメインは、構造上、グルカナーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、シアリダーゼなどのタンパク質の炭水化物結合ドメインと関係する。ドメインＩＩＩは、特定のクラスの受容体タンパク質に結合し、おそらくは第２のクラスの受容体（その例が、Ｃｒｙ１Ａタンパク質の場合のアミノペプチダーゼおよびアルカリホスファターゼである）と相互作用するオリゴマー性トキシンプレ細孔の挿入に関係する（ＰｉｇｏｔｔおよびＥｌｌａｒ、２００７）。さらに、類似のＣｒｙドメインＩＩＩ受容体が鞘翅目で確認されている。保存されたＢ．ｔ．配列のブロック２および３は、それぞれドメイン２のＮ末端およびＣ末端の近くに位置する。それゆえ、これらの保存された配列のブロック２および３は、３つの機能性ドメイン間の概算の境界領域である。これらの領域の保存されたＤＮＡおよびタンパク質の相同性は、組み換えＢ．ｔ．トキシンを遺伝子操作するために活用されている（米国特許第６０９０９３１号、国際公開第９１／０１０８７号、国際公開第９５／０６７３０号、国際公開第１９９８／０２２５９５号）。ＤＩＧ−３タンパク質のドメインＩＩＩは、配列番号２のアミノ酸残基５０３〜６４１を含む。
【００３３】
ドメインＩのα−へリックス１は、受容体に結合した後、除去されることが報告されている。Ａｒｏｎｓｏｎら（１９９９）は、ＢＢＭＶに結合したＣｒｙ１Ａｃが、α−へリックス１の直後の残基５９で始まるプロテイナーゼＫによる開裂から保護されることを立証し、Ｃｒｙ１Ａｂについて同様の結果が述べられている。Ｇｏｍｅｚら（２００２）は、ＢＢＭＶ受容体に結合して形成されるＣｒｙ１Ａｂオリゴマーが、ドメインＩのα−へリックス１部分を欠くことを見出した。また、Ｓｏｂｅｒｏｎら（２００７）は、三次元Ｃｒｙ構造上のα−へリックス１を包含するほぼ６０個のアミノ酸を欠くＣｒｙ１ＡｂおよびＣｒｙ１ＡｃのＮ末端欠失突然変異体が、カドヘリン結合の不在下で、分子量約６０ｋＤａのモノマーをプレ細孔に組み立てる能力があることを示した。これらのＮ末端欠失突然変異体は、Ｃｒｙ耐性の昆虫幼生に対して活性であると報告された。さらに、Ｄｉａｚ−Ｍｅｎｄｏｚａら（２００７）は、地中海コーンボーラー（Mediterranean corn borer）（Sesamia nonagrioides）に対する活性を保持している４３ｋＤａおよび４６ｋＤａのＣｒｙ１Ａｂフラグメントを発表した。これらのフラグメントは、アミノ酸残基１１６〜４２３を含むことが立証されたが、正確なアミノ酸配列は解明されておらず、これらのタンパク質分解性フラグメントの活性の機構は未知である。Ｇｏｍｅｚら（２００２）、Ｓｏｂｅｒｏｎら（２００７）およびＤｉａｚ−Ｍｅｎｄｏｚａら（２００７）の結果は、Ｃｒｙ１ＡｂのＮ末端からの３６個のアミノ酸の欠失が殺虫活性の喪失をもたらしたことを報告したＨｏｆｔｅら（１９８６）の結果と対照的である。
【００３４】
本発明者らは、ＤＩＧ−３トキシンのドメインＩ中の、α−へリックス１、α−へリックス２Ａ、α−へリックス２Ｂ、およびα−へリックス３の始まりと終わり、ならびにそれらの間のスペーサー領域の位置を、ＤＩＧ−３タンパク質の配列をその構造が既知であるＣｒｙ８Ｅａ１についてのタンパク質配列と比較することによって推定した。これらの位置を表１に記す。
【表１】
【００３５】
ＤＩＧ−３のアミノ末端欠失変異体。
本発明は、その一態様において、殺虫活性を改善し、昆虫による耐性の発生を回避するために、α−へリックス１、α−へリックス２Ａ、およびα−へリックス２Ｂのすべてまたは一部が欠失したＤＩＧ−３変異体を提供する。これらの改変は、改善された標的有害生物の範囲、効力、および耐虫性の管理などの改善された特性を備えたＤＩＧ−３変異体を提供するために行われた。本発明の一部の実施形態において、対象とする改変は、昆虫の中毒につながるプロトキシン活性化および細孔形成の有効性に影響を及ぼす可能性がある。より具体的には、改善された特性を備えたＤＩＧ−３変異体を提供するために、ＤＩＧ−３タンパク質のＮ末端をコードする核酸配列の一部を除去する段階的欠失が記述される。その欠失は、ドメインＩのα−へリックス１のすべて、およびα−へリックス２のすべてまたは一部を、α−へリックス３〜７の構造的完全性を維持しながら除去する。したがって、本発明は一部としては、より有効な細孔形成のためのドメイン１のα−へリックス構成部分を遺伝子操作することによってなされるＣｒｙタンパク質の有効性の改善に関する。より具体的には、本発明は一部としては、Ｃｒｙ１タンパク質のドメインＩ中のα−へリックス１およびα−へリックス２に対する推定上の二次的な構造相同性を備えた領域中にＮ末端欠失を有するように設計された、改善されたＤＩＧ−３タンパク質に関する。
【００３６】
ＤＩＧ−３トキシンの殺虫特性を改善するための欠失は、予想されるα−へリックス２Ａの開始点の前に始まることができ、かつα−へリックス２Ｂの終結点の後に終わることができるが、好ましくはα−へリックス３中に延びることはない。
【００３７】
Ｎ末端欠失変異体のためのコード配列の設計において、メチオニンをコードするＡＴＧ開始コドンは、欠失変異体をコードするように設計されたヌクレオチド配列の５’末端で挿入される。遺伝子導入植物中で使用するために設計された配列の場合、Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ（１９９７）の「Ｎ末端則」に従うことが有益である可能性がある。一部のアミノ酸は、タンパク質のＮ末端残基として提示されると真核細胞中でのタンパク質の不安定性および分解の一因となることが教示されている。例えば、酵母および哺乳動物細胞中での観察から集められたデータは、Ｎ末端を不安定化するアミノ酸は、Ｆ、Ｌ、Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅおよび可能性としてはＰであることを示している。タンパク質の分解機構の詳細は、生物間で多少異なる可能性があるが、上で観察されるＮ末端を不安定化するアミノ酸の同一性が保存されていることは、類似の機構が植物細胞中で機能できることを示唆している。例えば、Ｗｏｒｌｅｙら（１９９８）は、植物において、Ｎ末端則は、塩基性および芳香族残基を包含することを見出した。主題のＢ．ｔ．殺虫性タンパク質のα−へリックス３の開始点近くでの植物プロテアーゼによるタンパク質分解性の開裂は、不安定化Ｎ末端アミノ酸を露出する可能性があることがあり得る。このようなプロセシングは、開裂されたタンパク質を急速な崩壊に導き、Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質の蓄積を、有効な昆虫防除に不十分なレベルまでに制限する可能性がある。したがって、不安定安化アミノ酸の１つで始まるＮ末端欠失変異体の場合、本出願人らは、翻訳開始メチオニンと不安定化アミノ酸との間にＧ（グリシン）アミノ酸を指定するコドンを付加することを選択する。
【００３８】
実施例２は、本発明によるＤＩＧ−３のアミノ末端欠失変異体の具体例を与える。毒性を保持するさらなる有用なフラグメントは、完全長の可溶化結晶タンパク質のトリプシンまたはキモトリプシン消化によって同定することができる。毒性ＤＩＧ−３タンパク質フラグメントのさらなる例は、ＤＩＧ−３コード領域のフラグメントによってコードすることができる。昆虫に活性なＤＩＧ−３変異体は、大部分が、短いＮ末端切断、および長いＣ末端切断を有することになる。最も短い毒性フラグメントのＮ末端終端は、当技術分野で日常的に利用可能な技術によるトリプシンまたはキモトリプシンで処理された可溶性結晶タンパク質のＮ末端アミノ酸配列決定によって好都合に決定される。
【００３９】
キメラトキシン。別のＣｒｙトキシンのプロトキシンセグメントに融合された１つのＣｒｙトキシンのコアトキシンセグメントを利用するキメラタンパク質が、以前に報告されている。ＤＩＧ−３変異体は、コアトキシンセグメントの終端を越えたいくつかの箇所で異種プロトキシンセグメントに融合されたＤＩＧ−３トキシンのＮ末端コアトキシンセグメントを含むトキシン（完全長であっても、前記のＮ末端欠失を有してもよい）を包含する。異種プロトキシンセグメントへの移行は、ほぼ本来のコアトキシン／プロトキシン結合点で起こることができ、あるいは代替的に、本来のプロトキシンの一部（コアトキシンセグメントを越えて延びる）を、下流中で起こる異種プロトキシンへの移行を伴って保持することができる。例として、本発明のキメラトキシンは、ＤＩＧ−３の完全長コアトキシンセグメント（アミノ酸１〜６４３）および異種プロトキシンセグメント（アミノ酸６４３〜Ｃ末端）を有する。好ましい実施形態において、異種プロトキシンセグメントは、配列番号５に示したような、Ｃｒｙ１Ａｂδ−エンドトキシンから誘導される。
【００４０】
配列番号４は、本発明のＤＩＧ−３変異体で有用なＣｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントの５４５個のアミノ酸の配列を開示する。本発明のキメラトキシン中に含めることが最も重要である、このプロトキシンセグメントの末尾の約１００〜１５０個のアミノ酸が注目される。
【００４１】
プロテアーゼ感受性変異体。
昆虫の消化管内プロテアーゼは、典型的には、飼料のタンパク質から必要なアミノ酸を得ることにおいて昆虫を助けることで機能する。最も理解されている昆虫の消化性プロテアーゼは、とりわけ鱗翅目種中で最も一般的であると思われるセリンプロテアーゼである（ＥｎｇｌｅｍａｎｎおよびＧｅｒａｅｒｔｓ、１９８０）。鞘翅目昆虫は、鱗翅目の消化管に比べてより中性〜酸性である消化管を有する。鞘翅目の幼虫および成虫の大部分、例えば、コロラドポテトビートル（Colorado potato beetle）は、わずかに酸性の中腸を有し、システインプロテアーゼが、重要なタンパク質分解活性を提供する（ＷｏｌｆｓｏｎおよびＭｕｒｄｏｃｋ，１９９０）。より正確には、ＴｈｉｅおよびＨｏｕｓｅｍａｎ（１９９０）は、コロラドポテトビートル（Colorado potato beetle）中にシステインプロテアーゼ、カテプシンＢ様、およびカテプシンＨ様、ならびにアスパルチルプロテアーゼ、カテプシンＤ様を確認し、特徴付けた。Ｇｉｌｌｉｋｉｎら（１９９２）は、ウェスターンコーンルートワーム（western corn rootworm）幼虫の消化管中でのタンパク質分解活性を特徴付け、主としてシステインプロテアーゼを見出した。米国特許第７２３０１６７号には、カテプシンＧに帰せられるプロテアーゼ活性が、ウェスターンコーンルートワーム（western corn rootworm）中に存在することが開示されている。昆虫消化管プロテアーゼの多様性および異なる活性レベルは、特定のＢ．ｔ．トキシンに対する昆虫の感受性に影響を及ぼす可能性がある。
【００４２】
本発明の別の実施形態において、プロテアーゼの開裂部位は、特定の害虫の感受性幼虫の中腸内でのタンパク質プロセシングに影響を及ぼすように所望の位置で遺伝子操作することができる。これらのプロテアーゼ開裂部位は、化学的遺伝子合成またはスプライス重複ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎら、１９８９）などの方法で導入することができる。例えば、セリンプロテアーゼ認識配列は、感受性幼虫の中腸内で、所望の欠失点においてタンパク質プロセシングを実施するように、Ｃｒｙタンパク質構造中の特定部位で任意選択により挿入することができる。このような方式で利用できるセリンプロテアーゼには、トリプシンまたはトリプシン様酵素、キモトリプシン、エラスターゼなどの、鱗翅目中腸セリンプロテアーゼが含まれる（Ｃｈｒｉｓｔｅｌｌｅｒら、１９９２）。さらに、未分画幼虫中腸プロテアーゼ標本で作り出されるＣｒｙタンパク質消化産物を配列決定することによって、または刷子縁膜小胞への結合によって経験的に同定される欠失部位を、タンパク質活性化をもたらすように遺伝子操作することができる。遺伝子欠失によって、またはプロテアーゼ開裂部位の導入によって作り出される改変Ｃｒｙタンパク質は、オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）、ジアトラエ・グランジオセラ（Diatraea grandiosella）、ヘリコベルパ・ジア（Helicoverpa zea）、アグロチス・イプシロン（Agrotis ipsilon）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）、スポドプテラ・イクシグア（Spodoptera exigua）、ジアトラエ・サッカラリス（Diatraea saccharalis）、ロクサグロチス・アルビコスタ（Loxagrotis albicosta）、およびその他の標的有害生物を含む、鱗翅目有害生物に対して改善された活性を有する。
【００４３】
トリプシン、キモトリプシン、およびカテプシンＧ様プロテアーゼなどの鞘翅目セリンプロテアーゼ、カテプシン（Ｂ様、Ｌ様、Ｏ様、およびＫ様プロテアーゼ）などの鞘翅目システインプロテアーゼ（Ｋｏｉｗａら、２０００；およびＢｏｗｎら、２００４）、ＡＤＡＭ１０などの鞘翅目メタロプロテアーゼ（Ｏｃｈｏａ−Ｃａｍｐｕｚａｎｏら、２００７）、ならびにカテプシンＤ様およびＥ様、ペプシン、プラスメプシンならびにキモシンなどの鞘翅目アスパラギン酸プロテアーゼを、特定害虫の感受性幼虫の中腸内でのＣｒｙタンパク質のプロセシングに影響を及ぼすように、所望のプロセシング部位で適切な認識配列を遺伝子操作することによってさらに利用することができる。
【００４４】
このようなプロテアーゼ開裂部位を導入するのに好ましい位置は、α−へリックス２Ｂとα−へリックス３との間の「スペーサー」領域内に、例えば、完全長ＤＩＧ−３タンパク質のアミノ酸１０９〜１１３内に存在する可能性がある（配列番号２および表１）。遺伝子欠失によって、またはプロテアーゼ開裂部位の導入によって作り出される改変Ｃｒｙタンパク質は、限定はされないが、ウェスターンコーンルートワーム（western corn rootworm）、サザンコーンルートワーム（southern corn root worm）、ノーザンコーンルートワーム（northern corn rootworm）などを含む害虫に対して改善された活性を有する。
【００４５】
ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端残基を含むアミノ酸の配列決定を可能にする種々の技術が存在する。例えば、自動化されたエドマン分解法を逐次方式で使用して、３０アミノ酸残基までのＮ末端アミノ酸配列を残基につき９８％の正確さで決定することができる。さらに、ポリペプチドのカルボキシ終端を含むアミノ酸配列の決定も可能である（Ｂａｉｌｅｙら、１９９２；米国特許第６０４６０５３号）。したがって、一部の実施形態において、例えば昆虫の消化管から調製されたプロテアーゼによるタンパク質分解処理によって活性化されたＢ．ｔ．Ｃｒｙタンパク質を特徴付けることができ、活性化されたトキシンフラグメントのＮ末端またはＣ末端アミノ酸を確認することができる。昆虫、植物または微生物プロテアーゼによるより大きな変異体タンパク質のタンパク質分解開裂を可能にするまたは排除するためのコード配列中の適切な位置でのプロテアーゼプロセシング部位の導入または排除によって作られるＤＩＧ−３変異体は、本発明の範囲に包含される。このような操作の最終結果は、無傷の（完全長）トキシンタンパク質と同様またはより良好な活性を有するトキシンフラグメント分子の生成であると理解される。
【００４６】
ＤＩＧ−３トキシンのドメイン。
ＤＩＧ−３トキシンの分離ドメイン（および、このようなドメインに９０％、９５％または９７％同一である変異体）は、有害生物への増大された毒性範囲、改善された有効性、または増大されたタンパク質安定性を備えた新規トキシンを提供するために、他のＣｒｙトキシンからのドメインとの組合せを形成する上で有用であると予想される。ＤＩＧ−３タンパク質のドメインＩは、配列番号２のアミノ酸残基５６〜２７８からなる。ＤＩＧ−３タンパク質のドメインＩＩは、配列番号２のアミノ酸残基２８３〜４９３からなる。ＤＩＧ−３タンパク質のドメインＩＩＩは、配列番号２のアミノ酸残基５０３〜６４１からなる。ドメインの取替えまたはシャッフリングは、変更したδ−エンドトキシンタンパク質を作り出すための機構である。ドメインＩＩおよびＩＩＩは、δ−エンドトキシンタンパク質間で取替えることができ、改善された農薬活性または標的範囲を備えたハイブリッドトキシンまたはキメラトキシンをもたらす。ドメインＩＩは、受容体結合に関連し、ＤＩＧ−３のドメインＩＩは、他のＣｒｙ１Ｂトキシンから極めて逸脱している。ドメインＩＩＩは、特定クラスの受容体タンパク質に結合し、恐らく、オリゴマートキシンプレ細孔の挿入に関与する。他のトキシン中での一部のドメインＩＩＩの置換は、スポドプテラ・エクシグア（Spodoptera exigua）に対して優れた毒性を生じることが示され（ｄｅ Ｍａａｇｄら、１９９６）、Ｃｒｙトキシンドメイン取替えの設計に関する指針が存在する（Ｋｎｉｇｈｔら、２００４）。
【００４７】
組み換えタンパク質を作り出し、それらを農薬活性について試験するための方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｎａｉｍｏｖら、２００１；ｄｅ Ｍａａｇｄら、１９９６；Ｇｅら、１９９１；Ｓｃｈｎｅｐｆら、１９９０；Ｒａｎｇら、１９９９を参照されたい）。Ｃｒｙ１ＡおよびＣｒｙ３Ａタンパク質からのドメインＩは、膜中に細孔を挿入および形成する能力について研究された。ドメインＩのα−へリックス４およびα−へリックス５は、膜内挿入および細孔形成において重要な役割を演じ（Ｗａｌｔｅｒｓら、１９９３；Ｇａｚｉｔら、１９９８；Ｎｕｎｅｚ−Ｖａｌｄｅｚら、２００１）、他のα−へリックスを、傘の骨のように膜表面に接触させるように提案された（Ｂｒａｖｏら、２００７；Ｇａｚｉｔら、１９９８）。
【００４８】
限られた数のアミノ酸の欠失、置換、または付加することによって創り出されるＤＩＧ−３変異体。配列番号２のアミノ酸配列に対するアミノ酸の欠失、置換、および付加は、逐次的方式で容易に行うことができ、このような変更の殺虫活性に対する効果は、バイオアッセイで試験することができる。変化の数が数の上で限られているなら、このような試験は、不合理な実験を必要としない。本発明は、コアトキシンセグメント（配列番号２のアミノ酸１〜６４３、または配列番号２のアミノ酸７３〜６４３）の殺虫活性のある変異体を包含し、その中で、１０個まで、１５個まで、または２０個までの独立なアミノ酸の付加、欠失、または置換がなされている。
【００４９】
本発明は、配列番号２のアミノ酸１〜６４３に、あるいは配列番号２のアミノ酸７３〜６４３に９０％、９５％または９７％同一であるコアトキシンセグメントを有するＤＩＧ−３変異体を包含する。
【００５０】
変異体は、ランダムな突然変異をもたらすことによって調製することができ、あるいは変異体を設計することができる。設計された突然変異体の場合には、アミノ酸の同一性が、生物学的活性を占めるトキシンの重要な領域中で維持される場合、または最終的に生物学的活性を担う三次元配置の決定に関与する場合、天然のトキシンに類似の活性を備えた変異体を作り出す確率が高くなる。また、置換が保存的である場合にも、活性を保持する確率が高い。アミノ酸は、次のクラス、すなわち、非極性、未帯電極性、塩基性、および酸性に分けることができる。あるクラスのアミノ酸を、同一タイプの別のアミノ酸で置き換える保存的置換は、変異体の生物学的活性を著しく変える可能性が最も少ない。表２に各クラスに属するアミノ酸の例を列挙する。
【表２】
【００５１】
一部の例において、非保存的置換も行うことができる。これらの置換が、トキシンの生物学的活性を有意には損なってはならないことが重要な要素である。変異体は、突然変異誘発のためアミノ酸配列が異なるポリペプチドを包含する。本発明に包含される変異体タンパク質は、生物学的に活性であり、すなわち、それらは、天然タンパク質の所望される生物学的活性を有し続ける、すなわち、殺虫活性を保持する。
【００５２】
また、配列レベルを異にするが、同様のまたは類似の総合的に必須な三次元構造、表面電荷分布などを有する変異体タンパク質も設計することができる。例えば、米国特許第７０５８５１５号；Ｌａｒｓｏｎら、２００２；Ｓｔｅｍｍｅｒ、１９９４ａ、１９９４ｂ、１９９５；およびＣｒａｍｅｒｉら、１９９６ａ、１９９６ｂ、１９９７を参照されたい。
【００５３】
核酸。
ＤＩＧ−３トキシンをコードする単離核酸は、本発明の一態様である。これは、配列番号２、および配列番号５をコードする核酸、ならびにその相補配列と、配列番号２の殺虫性変異体をコードするその他の核酸を包含する。遺伝子コードの冗長性のため、種々の異なるＤＮＡ配列が、本明細書に開示のアミノ酸配列をコードすることができる。同一または本質的に同一のトキシンをコードするこれらの代替的ＤＮＡ配列を創り出すことは、十分に当業者の技量内である。
【００５４】
遺伝子合成。
本明細書に記載の改善されたＣｒｙタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、当技術分野で周知の種々の方法によって調製することができる。例えば、合成遺伝子セグメントおよび合成遺伝子は、亜リン酸トリエステルおよびホスホラミダイト化学物質（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、１９８７）によって調製することができ、必要に応じて、ＤＮＡ合成を実施するためにコマーシャルベンダーを利用可能である。完全長ＤＩＧ−３タンパク質をコードする配列は、例えば、制限断片のライゲーションまたは重複オリゴヌクレオチドのポリメラーゼ連鎖反応の組立てを含む、種々の方法で組み立てることができる（ＳｔｅｗａｒｔおよびＢｕｒｇｉｎ、２００５）。さらに、末端欠失をコードする配列は、部位特異的末端オリコヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅によって調製することができる。
【００５５】
ＤＩＧ−３トキシンをコードする核酸は、例えば、いくつかの商業的供給業者のいずれかによって現在実施されている方法による合成的構築によって調製することができる（例えば、米国特許第７４８２１１９号参照）。これらの核酸またはその部分もしくは変異体は、また、例を挙げれば、例えば米国特許第５３８０８３１号の遺伝子シンセサイザーおよび設計方法を使用して、合成的に構築することができる。別法として、合成または天然に存在する遺伝子の変形形態を、点突然変異を生じさせるための標準的な分子生物学的技術を使用して容易に構築することができる。これらの遺伝子のフラグメントは、また、市販のエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを使用して標準的手順により調製することができる。例えば、Ｂａｌ３１などの酵素または部位特異的突然変異誘発を利用して、これらの遺伝子の終端からヌクレオチドを規則正しく切り離すことができる。また、活性トキシンフラグメントをコードする遺伝子フラグメントを、種々の制限酵素を使用して得ることができる。
【００５６】
ＤＩＧ−３トキシンのためのアミノ酸配列が得られると、意図した宿主によって優先されるコドンを使用してコード配列を逆翻訳し、次いで問題を引き起こす可能性のある配列を除去し、非コード読み取り枠中の長いオープンコード配列を除去するための周期的終止コドンをもたらすために代替のコドンを使用して配列を改良することによって、コード配列を設計することができる。
【００５７】
配列同一性の定量。
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を測定するため、配列を最適な比較目的のために整列させる。２つの配列間のパーセント同一性は、配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、パーセント同一性＝同一位置の数／位置の総数（例えば、重複位置）×１００）。一実施形態において、２つの配列は、同じ長さである。２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを許容するまたはしない後記技術に類似した技術を使用して測定することができる。パーセント同一性の計算では、典型的には、正確な一致を計数する。
【００５８】
２つの配列間のパーセント同一性の測定は、数学的アルゴリズムを使用して完了できる。このようなアルゴリズムの非限定的例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）の例であり、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）において修正され、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸ各プログラム中に組み込まれる。ＢＬＡＳＴサーチは、核酸またはタンパク質データベース中の問い合わせ配列に相同（類似）する配列を同定するのに好都合に使用することができる。ＢＬＡＳＴＮサーチは、本発明の特許請求される核酸分子に対して相同性を有するヌクレオチド配列を同定するために実施することができる（スコア＝１００、ワード長＝１２）。ＢＬＡＳＴＸサーチは、本発明の特許請求される殺虫性タンパク質分子に対して相同性を有するアミノ酸配列を同定するために実施することができる（スコア＝５０、ワード長＝３）。
【００５９】
ギャップ付きＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）は、比較の目的でギャップのあるアラインメントを得るのに利用できる。別法として、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔは、分子間の遠隔関係を検出する反復サーチを実施するのに使用することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）。ＢＬＡＳＴ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔ各プログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーターを使用することができる。www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。
【００６０】
配列を比較するために利用される数学的アルゴリズムの非限定的例が、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４）。ＣｌｕｓｔａｌＷは、配列を比較し、アミノ酸またはＤＮＡ配列の全体を整列し、これによってアミノ酸配列全体またはヌクレオチド配列全体の配列保存に関するデータを提供することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩプログラムスイート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）のＡＬＩＧＮＸモジュールなどの、市販ＤＮＡ／アミノ酸解析ソフトウェアパッケージ中で使用されている。アミノ酸配列をＡＬＩＧＮＸで整列する場合には、２つの配列間のパーセントアミノ酸類似性（コンセンサス）または同一性を評価するために、１０のギャップオープンペナルティ、０．１のギャップ伸張ペナルティ、およびｂｌｏｓｕｍ６３ｍｔ２比較マトリックスでのデフォルト設定を好都合に使用することができる。ＤＮＡ配列をＡＬＩＧＮＸで整列する場合には、２つの配列間のパーセント同一性を評価するために、１５のギャップオープンペナルティ、６．６のギャップ伸張ペナルティ、およびｓｗｇａｐｄｎａｍｔ比較マトリックスでのデフォルト設定を好都合に使用することができる。
【００６１】
配列比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の非限定的例が、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）の例である。このようなアルゴリズムは、ｗＥＭＢＯＳＳ配列整列ソフトウェアパッケージ（http://emboss.sourceforge.net/で利用可能）の一部であるｗＳＴＲＥＴＣＨＥＲプログラム中に組み込まれている。ｗＳＴＲＥＴＣＨＥＲは、線形空間を使用する標準的な動的プログラミングアルゴリズムの修正形態を使用して、２つの配列の最適な大域的アラインメントを計算する。アラインメントを計算するのに使用される置換マトリックス、ギャップ挿入ペナルティ、およびギャップ伸張ペナルティを指定することができる。ヌクレオチド配列を比較するためにｗＳＴＲＥＴＣＨＥＲプログラムを利用する場合には、１６のギャップオープンペナルティおよび４のギャップ伸張ペナルティを、スコアリングマトリックスファイルＥＤＮＡＦＵＬＬと共に使用することができる。アミノ酸配列を比較するために使用する場合には、１２のギャップオープンペナルティおよび２のギャップ伸張ペナルティを、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスファイルと共に使用することができる。
【００６２】
配列比較のために利用される数学的アルゴリズムのさらなる非限定的例は、配列アラインメントソフトウェアパッケージＧＡＰバージョン１０およびｗＮＥＥＤＬＥ（http://emboss.sourceforge.net/）中に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）の例である。ＧＡＰバージョン１０は、次のパラメーターを使用して配列の同一性または類似性を測定するのに使用することができ、ヌクレオチド配列の場合、％同一性および％類似性は、５０のギャップウェイトおよび３の長さウェイト、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用して検索される。アミノ酸の配列比較の場合、％同一性または％類似性は、８のギャップウェイトおよび２の長さウェイト、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングプログラムを使用して測定される。
【００６３】
ｗＮＥＥＤＬＥは、２つの入力配列を読み取り、それらの全長に沿って最適アラインメント（ギャップを含む）を検索し、それらの最適な大域的配列アラインメントをファイルに書き込む。アルゴリズムは、すべての可能なアラインメントを探索し、それぞれの可能な残基またはヌクレオチドの一致に関する値を含むスコアリングマトリックスを使用して最良のものを選択する。ｗＮＥＥＤＬＥは、最大の可能なスコアを有するアラインメントを検索し、ここで、アラインメントのスコアは、（スコアリングマトリックスから得られる一致の合計）−（整列された配列中のオープンペナルティおよび伸張ギャップから生じるペナルティ）に等しい。置換マトリックス、ギャップオープンペナルティおよび伸張ペナルティは、ユーザー指定である。アミノ酸配列を比較する場合には、１０のデフォルトギャップオープンペナルティ、０．５のギャップ伸張ペナルティ、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスを使用する。ｗＮＥＥＤＬＥを使用してＤＮＡ配列を比較する場合には、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップ伸張ペナルティ、およびＥＤＮＡＦＵＬＬ比較マトリックスを使用する。
【００６４】
同等のプログラムも使用することができる。「同等のプログラム」とは、問題の任意の２つの配列に関して、ＡＬＩＧＮＸ ｗＮＥＥＤＬＥ、またはｗＳＴＲＥＴＣＨＥＲによって作り出される対応するアラインメントに比較した場合に、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の一致および同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを作り出す任意の配列比較プログラムを意図する。％同一性は、報告される整列領域にわたる２つの配列（長さ中の任意のギャップを含む）間の同じ一致のパーセンテージであり、％類似性は、報告される整列領域にわたる２つの配列（長さ中の任意のギャップを含む）間の一致のパーセンテージである。
【００６５】
アラインメントは、目視によって手動で実施することもできる。
【００６６】
組換え宿主。
本発明のトキシンをコードする遺伝子は、広範な種類の微生物または植物宿主中に導入することができる。トキシン遺伝子の発現は、直接的または間接的に、農薬タンパク質の細胞内産生および維持をもたらす。適切な微生物宿主、例えば、シュードモナス（Pseudomonas）の場合、該微生物を、それらが増殖し、取り込まれる有害生物の環境に適用することができる。結果は、有害生物の規制である。別法として、トキシン遺伝子を宿す微生物を、トキシンの活性を延長し、かつ細胞を安定化する条件下で処理することができる。毒性活性を維持している処理細胞を、次いで、標的有害生物の環境に適用することができる。
【００６７】
Ｂ．ｔ．トキシン遺伝子が適当なベクターを介して微生物宿主中に導入され、前記宿主が生存状態で環境に適用される場合、特定の宿主微生物を使用することが必須である。目的の１種または複数の作物の「植物圏」（葉面、葉圏、根圏、および／または根面）を占拠することが知られている微生物宿主が選択される。これらの微生物は、特定の環境（作物およびその他の昆虫生息地）中で野生型土着微生物と首尾よく競合する能力があり、ポリペプチド農薬を発現する遺伝子の安定な維持および発現を提供し、望ましくは環境での分解および不活性化からの農薬の改善された保護を提供するように選択される。
【００６８】
多数の微生物が、広範な種類の重要作物の葉面（植物の葉の表面）および／または根圏（植物の根を取り囲む土壌）に存在することが知られている。これらの微生物には、細菌、藻類、および真菌が含まれる。とりわけ有益なのは、細菌、例えば、シュードモナス（Pseudomonas）、エルウィニア（Erwinia）、セラチア（Serratia）、クレブシエラ（Klebsiella）、キサントモナス（Xanthomonas）、ストレプトミセス（Streptomyces）、リゾビウム（Rhizobium）、シノリゾビウム（Sinorhizobium）、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）、メチロフィリウス（Methylophilius）、アグロバクテリウム（Agrobacterium）、アセトバクター（Acetobacter）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、アルスロバクター（Arthrobacter）、アゾトバクター（Azotobacter）、ロイコノストック（Leuconostoc）、およびアルカリゲネス（Alcaligenes）属；真菌とりわけ酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、クリベロマイセス（Kluyveromyces）、スポロボロマイセス（Sporobolomyces）、ロドトルラ（Rhodotorula）、およびアウレオバシジウム（Aureobasidium）属などの微生物である。とりわけ有益なのは、シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、セラチア・マルセセンス（Serratia marcescens）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）、ロドシュードモナス・スフェロイデス（Rhodopseudomonas spheroides）、キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）、シノリゾビウム・メリロチ（Sinorhizobium meliloti）（以前にはリゾビウム・メリロチ（Rhizobium meliloti））、アルカリゲネス・ユートロフス（Alcaligenes eutrophus）、およびアゾトバクター・ビネランジ（Azotobacter vinelandii）などの植物圏細菌種；ならびにロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）、Ｒ．グルチニス（R.glutinis）、Ｒ．マリナ（R.marina）、Ｒ．アウランティアカ（R.aurantiaca）、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、Ｃ．ジフルエンス（C.diffluens）、Ｃ．ラウレンティ（C.laurentii）、サッカロミセス・ロセイ（Saccharomyces rosei）、Ｓ．プレトリエンシス（S.Pretoriensis）、Ｓ．セレビシエ（S.cerevisiae）、スポロボロマイセス・ロセウス（Sporobolomyces roseus）、Ｓ．オドルス（S.odorus）、クリベロマイセス・ベロナエ（Kluyveromyces veronae）、およびアウレオバシジウム・ポルランス（Aureobasidium pollulans）などの植物圏酵母種である。とりわけ有益なのは、有色微生物である。
【００６９】
害虫の防除方法。
昆虫が、遺伝子導入植物の発現、製剤化されたタンパク質組成物（群）、噴霧可能なタンパク質組成物（群）、ベイトマトリックス、またはその他の送達システムを介して送達された有効量のトキシンと接触すると、結果は、典型的には昆虫の死亡であり、あるいは昆虫は、トキシンを昆虫にとって利用可能にする供給源を餌にしない。
【００７０】
対象とするタンパク質トキシンは、種々の方式で標的昆虫に接触するように「適用」または提供できる。例えば、遺伝子導入植物（ここで、タンパク質は、植物によって産生され、植物中に存在する）を使用することができ、それは当技術分野で周知である。トキシン遺伝子の発現は、また、根、葉などの植物の特定組織中で選択的に達成することができる。これは、例えば、組織特異的プロモーターの使用を介して達成できる。スプレー式適用は、もう１つの例であり、これも当技術分野で周知である。対象とするタンパク質は、所望の最終用途向けに適切に製剤化され、次いで、蔓延が発見される前に、標的昆虫が発見された後に、前および後の双方などに、保護すべき植物上に、および／または植物の周りに／植物の付近に噴霧（そうでなければ適用）することができる。例えば、ベイト顆粒も使用することができ、当技術分野で周知である。
【００７１】
遺伝子導入植物
対象とするタンパク質は、任意のタイプの植物を鱗翅目昆虫による損傷から実際に保護するために使用することができる。このような植物の非限定的例には、ごく一部の例を挙げれば、トウモロコシ、ヒマワリ、ダイズ、ワタ、カノーラ、イネ、モロコシ、コムギ、オオムギ、野菜、観賞植物、コショウ（トウガラシを含む）、サトウダイコン、果実、および芝生が含まれる。植物を形質転換する方法は、当技術分野で周知であり、例示となる形質転換法は、実施例中に記載される。
【００７２】
本発明の好ましい実施形態は、対象とする殺虫性タンパク質またはその変異体をコードする遺伝子での植物の形質転換である。形質転換された植物は、形質転換された植物の細胞における対象とする殺虫性タンパク質またはその変異体の防除量の存在によって、昆虫標的有害生物による攻撃に耐性がある。Ｂ．ｔ．殺虫性トキシンの殺虫特性をコードする遺伝子材料を、特定の害虫によって食される植物のゲノム中に組み込むことによって、成虫または幼虫は、食用植物の摂取後に死亡するであろう。単子葉および双子葉各類の多数のメンバーが、形質転換されている。遺伝子導入農耕作物、ならびに果実および野菜は、商業的に重要である。このような作物には、限定はされないが、トウモロコシ、イネ、ダイズ、カノーラ、ヒマワリ、アルファルファ、モロコシ、コムギ、ワタ、ピーナツ、トマト、ジャガイモなどが含まれる。外来遺伝子材料を植物細胞中に導入するための、および導入された遺伝子を安定的に維持し発現する植物を得るためのいくつかの技術が存在する。このような技術には、ミクロ粒子上に被覆された遺伝子材料の直接的な細胞中への促進（米国特許第４９４５０５０号および米国特許第５１４１１３１号）が含まれる。アグロバクテリウム（Agrobacterium）技術を使用して植物を形質転換することができ、米国特許第５１７７０１０号、米国特許第５１０４３１０号、欧州特許出願公開第０１３１６２４号、欧州特許出願公開第１２０５１６号、欧州特許出願公開第１５９４１８号、欧州特許出願公開第１７６１１２号、米国特許第５１４９６４５号、米国特許第５４６９９７６号、米国特許第５４６４７６３号、米国特許第４９４０８３８号、米国特許第４６９３９７６号、欧州特許出願公開第１１６７１８号、欧州特許出願公開第２９０７９９号、欧州特許出願公開第３２０５００号、欧州特許出願公開第６０４６６２号、欧州特許出願公開６２７７５２号、欧州特許出願公開第０２６７１５９号、欧州特許出願公開第０２９２４３５号、米国特許第５２３１０１９号、米国特許第５４６３１７４号、米国特許第４７６２７８５号、米国特許第５００４８６３号、および米国特許第５１５９１３５号を参照されたい。その他の形質転換技術には、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標）技術が含まれ、米国特許第５３０２５２３号および米国特許第５４６４７６５号を参照されたい。また、エレクトロポレーション技術を使用して植物を形質転換しており、国際公開第８７／０６６１４号、米国特許第５４７２８６９号、米国特許第５３８４２５３号、国際公開第９２／０９６９６号、および国際公開第９３／２１３３５号を参照されたい。これらの形質転換の特許および刊行物はすべて、参照により組み込まれる。植物を形質転換するための多数の技術に加えて、外来遺伝子と接触させる組織のタイプも変更できる。このような組織には、限定はされないが、胚形成組織、カルス組織Ｉ型およびＩＩ型、胚軸、分裂組織などが含まれる。ほとんどすべての植物組織を、当業者の技術範囲内の適切な技術を使用して、脱分化中に形質転換することができる。
【００７３】
ＤＩＧ−３トキシンをコードする遺伝子を、上で開示した、当技術分野で周知の種々の技術を使用して、植物細胞中に挿入することができる。例えば、形質転換される微生物細胞の選択を可能にするマーカーおよび大腸菌（Escherichia coli）中で機能する複製系を含む多数のクローニングベクターを、外来遺伝子を調製および改変して高等植物中に導入するために利用できる。このような操作には、例えば、意図した用途のために望まれるような、突然変異の挿入、切り詰め、付加、または置換が含まれ得る。ベクターは、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ系、Ｍ１３ｍｐ系、ｐＡＣＹＣ１８４などを含む。したがって、Ｃｒｙタンパク質または変異体をコードする配列を、ベクター中に適切な制限酵素部位で挿入することができる。得られるプラスミドは、大腸菌（E.coli）細胞の形質転換のために使用され、その細胞を、適切な栄養培地中で培養し、次いで、収集、溶菌して、有効な量のプラスミドを回収する。配列解析、制限酵素フラグメント解析、電気泳動、およびその他の生化学−分子生物学的方法が、解析の方法として一般に実施される。各操作の後、使用するＤＮＡ配列を、開裂させ、次のＤＮＡ配列に連結することができる。操作された各ＤＮＡ配列を、同じまたは他のプラスミド中でクローン化することができる。
【００７４】
植物細胞の形質転換のためにＴ−ＤＮＡを含むベクターを使用することは、徹底的に研究され、欧州特許第１２０５１６号；ＬｅｅおよびＧｅｌｖｉｎ、２００８；Ｆｒａｌｅｙら、１９８６；およびＡｎら、１９８５中に十分に記載されており、その分野で十分に確立されている。
【００７５】
挿入されるＤＮＡが植物ゲノム中に組み込まれると、それは、後の世代を通して比較的安定である。植物細胞を形質転換するのに使用されるベクターは、通常、形質転換された植物細胞に、とりわけビアラホス、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、またはヒグロマイシンなどの除草剤または抗生物質に対する耐性を付与するタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子を含む。個別に採用される選択マーカー遺伝子は、したがって、挿入されるＤＮＡを含まない細胞の増殖を選別化合物によって抑制しながら、形質転換された細胞の選択を可能にすることになる。
【００７６】
多数の技術が、宿主植物細胞中にＤＮＡを挿入するために利用可能である。それらの技術には、形質転換因子としてのアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）によって送達されるＴ−ＤＮＡを用いる形質転換が含まれる。さらに、植物プロトプラストの、送達されるべきＤＮＡを含むリポソームとの融合、ＤＮＡの直接注入、遺伝子銃形質転換（微粒子衝突）、またはエレクトロポレーション、ならびにその他の可能な方法を採用することができる。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態において、植物は、タンパク質コード領域のコドン使用頻度が植物に対して最適化されている遺伝子で形質転換される。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５３８０８３１号を参照されたい。また、有利には、切り詰められたトキシンをコードしている植物が使用される。切り詰められたトキシンは、典型的には、完全長トキシンの約５５％〜約８０％をコードしている。植物中で使用するための合成Ｂ．ｔ．遺伝子を創り出す方法は、当技術分野で公知である（Ｓｔｅｗａｒｔ、２００７）。
【００７８】
形質転換技術にかかわらず、遺伝子は、ベクター中に植物プロモーターを含めることによって植物細胞中でＢ．ｔ．殺虫性トキシン遺伝子および変異体を発現するように適合された遺伝子移入ベクター中に好ましくは組み込まれる。植物プロモーターに加えて、種々の供給源からのプロモーターを、各植物細胞で効率的に使用して外来遺伝子を発現することができる。例えば、オクトピンシンターゼプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、およびマンノピンシンターゼプロモーターなどの細菌起源のプロモーターを使用することができる。例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓおよび１９Ｓ各プロモーター、キャサバベインモザイクウイルスからのプロモーターなどの植物ウイルス起源のプロモーターを使用することができる。植物プロモーターには、限定はされないが、リブロース−１，６−ビスホスフェート（ＲＵＢＰ）カルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓｕ）、β−コングリシニンプロモーター、ファセオリンプロモーター、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、熱ショックプロモーター、ＡＤＦ（アクチン解重合因子）プロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、および組織特異的プロモーターが含まれる。プロモーターは、また、転写効率を改善できる特定のエンハンサー配列エレメントを含むことができる。典型的なエンハンサーには、限定はされないが、ＡＤＨ１−イントロン１およびＡＤＨ１−イントロン６が含まれる。構成プロモーターを使用することもできる。構成的プロモーターは、ほとんどすべての細胞型中で、およびほとんどすべての時点で連続的な遺伝子発現を指令する（例えば、アクチン、ユビキチン、ＣａＭＶ３５Ｓ）。組織特異的プロモーターは、葉または種子など、特定の細胞または組織型中での遺伝子発現を担い（例えば、ゼイン、オレオシン、ナピン、ＡＣＰ（アシル担体タンパク質）プロモーター）、これらのプロモーターを使用することもできる。植物発育の特定段階で活性であるプロモーター、および特定の植物組織および器官中で活性であるプロモーターを使用することもできる。このようなプロモーターの例には、限定はされないが、根特異的、花粉特異的、胚特異的、コーンシルク特異的、ワタ繊維特異的、種子胚乳特異的、師部特異的であるプロモーターなどが含まれる。
【００７９】
特定の状況下では、誘導性プロモーターを使用することが望ましいことがある。誘導性プロモーターは、物理的刺激（例えば、熱ショック遺伝子）、光（例えば、ＲＵＢＰカルボキシラーゼ）、ホルモン（例えば、グルココルチコイド）、抗生物質（例えば、テトラサイクリン）、代謝産物、およびストレス（例えば、欠乏）などの特定のシグナルに応答した遺伝子発現を担う。５’非翻訳リーダー配列、ＲＮＡ転写終結配列、およびポリ−アデニレート付加シグナル配列などの、植物中で機能するその他の望ましい転写エレメントおよび翻訳エレメントを使用することができる。多数の植物特異的遺伝子移入ベクターが、当技術分野で知られている。
【００８０】
昆虫耐性（ＩＲ）形質を含む遺伝子導入作物は、コーン植物およびワタ植物において北米全体で普及しており、これらの形質の利用は、世界的に拡大している。ＩＲと除草剤耐性（ＨＴ）を組み合わせた市販の形質転換作物が、多数の種子会社によって開発されてきた。これらには、Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質によって付与されるＩＲ形質と、スルホニルウレア類、イミダゾリノン類、トリアゾロピリミジン、スルホンアニリド類などのアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）阻害剤；ビアロホス、グルホシネートなどのグルタミンシンターゼ（ＧＳ）阻害剤；メソトリオン、イソキサフルトールなどの４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤；グリホサートなどの５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）阻害剤；およびハロキシホップ、キザロホップ、ジクロホップなどのアセチル−補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣアーゼ）阻害剤に対する耐性などのＨＴ形質との組合せが含まれる。形質転換で準備されたタンパク質が、植物に、フェノキシ酸系除草剤およびピリジルオキシ酢酸オーキシン系除草剤（国際公開第２００７／０５３４８２号を参照されたい）、またはフェノキシ酸系除草剤、およびアリールオキシフェノキシプロピオン酸系除草剤（国際公開第２００５／１０７４３７号を参照されたい）などの除草剤の化学クラスに対する耐性を提供する、その他の例が知られている。ＩＲ形質を介して複数の有害生物の問題を防除する能力は、価値ある商品構想であり、この製品構想の便益は、昆虫規制形質および雑草規制形質が同一植物中で組み合わされる場合に、増強される。さらに、改善された価値は、本発明のタンパク質などのＢ．ｔ．殺虫性タンパク質によって付与されるＩＲ形質と、前述のような１種または複数のさらなるＨＴ形質と、さらには１種または複数のさらなる移入形質（例えば、Ｂ．ｔ．由来またはその他の殺虫性タンパク質によって付与されるその他の昆虫耐性、ＲＮＡｉなどの機構によって付与される昆虫耐性、線虫耐性、病気耐性、ストレス寛容性、改善された窒素利用性など）または産出される形質（例えば、高い油脂流量、健康的な油脂組成、栄養改善など）との、単一植物での組合せを介して得ることができる。このような組合せは、通常的な育種（育種の積み重ね）を介して、または共同的に複数の遺伝子の同時導入を含む新規な形質転換事象（分子の積み重ね）として得ることができる。作物植物における害虫および改善された雑草防除を扱う能力が利益に含まれ、その能力は生産者および／または消費者に二次的利益を提供する。したがって、本発明は、任意の数の農学的問題を柔軟かつ高い費用効果で制御する能力を有する改善された作物品質の完全な農学的パッケージを提供するために、その他の形質と組み合わせて使用することができる。
【００８１】
標的有害生物
本発明のＤＩＧ−３トキシンは、鱗翅目昆虫の規制で使用するのにとりわけ適している。鱗翅目は、毎年極めて大きな総額の損害をもたらす、農業、園芸、および家庭の有害生物の重要な群である。この昆虫目は、葉および根を摂食する幼虫および成虫を包含する。鱗翅目害虫には、限定はされないが、以下がが含まれる：アコロイア・グリセラ（Achoroia grisella）、アクレリス・グロベラナ（Acleris gloverana）、アクレリス・バリアナ（Acleris variana）、アドキソフィエス・オラナ（Adoxophyes orana）、アグロチス・イプシロン（Agrotis ipsilon）（ブラックカットワーム）、アラバマ・アルギラセア（Alabama argillacea）、アルソフィラ・ポメタリア（Alsophila pometaria）、アメロイス・トランシテラ（Amyelois transitella）、アナガスタ・クエニエラ（Anagasta kuehniella）、アナルシア・リネアテラ（Anarsia lineatella）、アニソタ・セナトリア（Anisota senatoria）、アンテラエア・ペルニイ（Antheraea pernyi）、アンチカルシア・ゲマタリス（Anticarsia gemmatalis）、アルキプス（Archips）種、アルギロタエニア（Argyrotaenia）種、アテチス・ミンダラ（Athetis mindara）、ボンビクス・モリ（Bombyx mori）、ブクラトリックス・ツルベリエラ（Bucculatrix thurberiella）、カドラ・カウテラ（Cadra cautella）、コリストネウラ（Choristoneura）種、コチルス・ホスペス（Cochylls hospes）、コリアス・ユリセマ（Colias eurytheme）、コルシラ・セファロニカ（Corcyra cephalonica）、シディア・ラチフェレナス（Cydia latiferreanus）、シディア・ポモネラ（Cydia pomonella）、ダタナ・インテゲリマ（Datana integerrima）、デンドロリムス・シベリカス（Dendrolimus sibericus）、デスミア・フェネラリス（Desmia feneralis）、ジアファニア・ヒアリナタ（Diaphania hyalinata）、ジアファニア・ニチダリス（Diaphania nitidalis）、ジアトラエ・グランジオセラ（Diatraea grandiosella）（サウスウェスターンコーンボーラー）、ジアトラエ・サッカラリス（Diatraea saccharalis）（シュガーケインボーラー）、エノモス・サブシグナリア（Ennomos subsignaria）、エオレウマ・ロフチニ（Eoreuma loftini）、エスフェスチア・エルテラ（Esphestia elutella）、エラニス・チラリア（Erannis tilaria）、エスチグメネ・アクレア（Estigmene acrea）、エウリア・サルブリコラ（Eulia salubricola）、エウポコエリア・アンビグエラ（Eupocoellia ambiguella）、エウポエシリア・アンビグエラ（Eupoecilia ambiguella）、エウプロクチス・クリソロエア（Euproctis chrysorrhoea）、エウゾア・メソリア（Euxoa messoria）、ガレリア・メロネラ（Galleria mellonella）、グラホリタ・モレスタ（Grapholita molesta）、ハリシナ・アメリカナ（Harrisina americana）、ヘリコベルパ・サブフレクサ（Helicoverpa subflexa）、ヘリコベルパ・ゼア（Helicoverpa zea）（コーンイアーワーム）、ヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）（タバコバッドワーム）、ヘミロイカ・オリビア（Hemileuca oliviae）、ホモエオソマ・エレクテルム（Homoeosoma electellum）（サンフラワーヘッドモス）、ヒファンチア・クネア（Hyphantia cunea）、ケイフェリア・リコペルシセラ（Keiferia lycopersicella）、ランブジナ・フィセラリア・フィセラリア（Lambdina fiscellaria fiscellaria）、ランブジナ・フィセラリア・ルグブロサ（Lambdina fiscellaria lugubrosa）、ロイコーマ・サリシス（Leucoma salicis）、ロベシア・ボトラナ（Lobesia botrana）、ロクサグロチス・アルビコスタ（Loxagrotis albicosta）（ウェスターンビーンカットワーム）、ロクソステジ・スチクチカリス（Loxostege sticticalis）、リマントリア・ジスパル（Lymantria dispar）、マカラ・チリサリス（Macalla thyrisalis）、マラコソマ（Malacosoma）種、マメストラ・ブラシカエ（Mamestra brassicae）、マメストラ・コンフィグラタ（Mamestra configurata）（バーサアーミーワーム）、マンデュカ・キンクエマクラタ（Manduca quinquemaculata）、マンデュカ・セクスタ（Manduca sexta）（タバコホルンワーム）、マルカ・テスツラリス（Maruca testulalis）、メランクラ・ピクタ（Melanchra picta）、オペロフテラ・ブルマタ（Operophtera brumata）、オリジア（Orgyia）種、オストリニア・ヌビラリス（Ostrinia nubilalis）（ユーロピアンコーンボーラー）、パレアクリタ・ベルナタ（Paleacrita vernata）、パピアペマ・ネブリス（Papiapema nebris）（コモンストークボーラー）、パピリオ・クレスホンテス（Papilio cresphontes）、ペクチノホラ・ゴシピエラ（Pectinophora gossypiella）、フィリガニジア・カリフォルニカ（Phryganidia californica）、フィロノリクテル・ブランカルデラ（Phyllonorycter blancardella）、ピエリス・ナピ（Pieris napi）、ピエリス・ラパエ（Pieris rapae）、プラチペナ・スカブラ（Plathypena scabra）、プラチノタ・フロエンダナ（Platynota flouendana）、プラチノタ・スツルタナ（Platynota stultana）、プラチプチリア・カルヅイダクチラ（Platyptilia carduidactyla）、プロジア・インテルプンクテラ（Plodia interpunctella）、プルテラ・キシロステラ（Plutella xylostella）（ダイアモンドバックモス）、ポンティア・プロトダイス（Pontia protodice）、シューダレチア・ユニプンクタ（Pseudaletia unipuncta）（アーミーワーム）、シュードプラシア・インクルデンス（Pseudoplasia includens）、ラチプルシア・ヌ（Rachiplusia nu）（アルゼンチンルーパー）、サブロデス・アエグロタタ（Sabulodes aegrotata）、シズラ・コンシナ（Schizura concinna）、シトトロガ・セレアレラ（Sitotroga cerealella）、スピロンタ・オセラナ（Spilonta ocellana）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（フォールアーミーワーム）、スポドプテラ・エクシグア（Spodoptera exigua）（ビートアーミーワーム）、タウルンストポエア・ピチオカンパ（Thaurnstopoea pityocampa）、エンソラ・ビセリエラ（Ensola bisselliella）、トリコプルシア・ヒ（Trichoplusia hi）、ウデア・ルビガリス（Udea rubigalis）、キシロミゲス・クリアイルス（Xylomyges curiails）、およびイポノメウタ・パデラ（Yponomeuta padella）。
【００８２】
作物植物の鞘翅目有害生物を規制するためのＤＩＧ−３の使用も想定される。一部の実施形態において、Ｃｒｙタンパク質は、限定はされないが、例えば、ジアブロチカ・ウンデシンプンクタタ・ホワルジ（Diabrotica undecimpunctata howardi）（サザンコーンルートワーム）、ジアブロチカ・ロンジコルニス・バルベリ（Diabrotica longicornis barberi）（ノーザンコーンルートワーム）およびジアブロチカ・ベルギフェラ（Diabrotica virgifera）（ウェスターンコーンルートワーム）などのルートワーム、ならびにシクロセファラ・ボレアリス（Cyclocephala borealis）（ノーザンマスクドコガネムシ）、シクロセファラ・イマクラテ（Cyclocephala immaculate）（サザンマスクドコガネムシ）、およびポピリア・ジャポニカ（Popillia japonica）（ジャパニーズビートル）の幼虫などの地虫が含まれる害虫の規制向けに、経済的に導入できる。
【００８３】
限定はされないが、根こぶ線虫（Meloidogyne icognita）およびダイズ嚢胞線虫（Heterodera glycines）を含む寄生線虫を規制するためのＤＩＧ−３トキシンの使用も想定される。
【００８４】
ＤＩＧ−３トキシンの抗体検出
抗トキシン抗体。
本明細書に開示のトキシンに対する、または同等のトキシンまたはこれらのトキシンのフラグメントに対する抗体は、本技術分野の標準的手順を使用して容易に調製することができる。このような抗体は、ＤＩＧ−３トキシンの存在を検出するのに有用である。
【００８５】
Ｂ．ｔ．殺虫性トキシンが単離されたら、該トキシンに特異的な抗体を、当技術分野で周知である通常の方法によって生じさせることができる。選択した宿主への数週間または数ヶ月にわたる反復注入は、免疫応答を誘発し、かなりの抗Ｂ．ｔ．トキシン血清価をもたらす。好ましい宿主は哺乳動物種であり、より好ましい種は、ウサギ、ヤギ、ヒツジおよびマウスである。このような免疫化された動物から採取した血液を、確立された方法で処理して、Ｂ．ｔ．殺虫性トキシンと反応性のある抗血清（ポリクロナール抗体）を得ることができる。次いで、抗血清を、当技術分野で既知の技術によるトキシンへの吸着によってアフィニティー精製することができる。アフィニティー精製された抗血清を、当技術分野で既知の手順を使用して抗血清内の免疫グロブリン画分を単離することによってさらに精製することができる。得られる材料は、Ｂ．ｔ．殺虫性トキシンと反応性のある免疫グロブリンの異種集団となる。
【００８６】
抗Ｂ．ｔ．トキシンの抗体は、また、免疫原性担体に複合されたＢ．ｔ．殺虫性トキシンの合成ペプチドフラグメントからなる半合成免疫原を調製することによって作り出すことができる。ペプチドフラグメントを作製するのに有用な多数のスキームおよび装置が、当技術分野で周知である。ウシ血清アルブミンまたはスカシ貝ヘモシアニンなどの多くの適切な免疫原性担体も、当技術分野で周知であり、免疫原と担体タンパク質とをカップリングするための技術も同様である。半合成免疫原が構築されると、Ｂ．ｔ．殺虫性トキシンフラグメントに特異的な抗体の調製手順は、天然Ｂ．ｔ．トキシンと反応性のある抗体を調製するのに使用されるものと同じである。
【００８７】
抗Ｂ．ｔ．トキシンのモノクロナール抗体（ＭＡｂ）は、精製されたＢ．ｔ．殺虫性トキシンを使用して容易に調製される。ＭＡｂの産生方法は、２０年にわたって実施されており、当業者に周知である。アジュバント中の精製Ｂ．ｔ．殺虫性トキシンの腹腔内または皮下反復注入は、ほとんどの動物で免疫応答を誘発する。過免疫のＢ−リンパ球を、動物から取り出し、無限培養可能な適切な融合パートナー細胞株と融合する。そのＢ−リンパ球が過免疫であり、ＭＡｂの産生で使用される可能性のある好ましい動物は、哺乳動物である。より好ましい動物は、ラットおよびマウスであり、最も好ましいのは、ＢＡＬＢ／ｃマウス系統である。
【００８８】
多数の哺乳動物細胞株が、ハイブリドーマの産生に適した融合パートナーである。多くのこのような株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州）および商業的供給業者から入手可能である。好ましい融合パートナー細胞株は、マウスの骨髄腫に由来し、ＨＬ−１（登録商標）フレンドリー骨髄腫−６５３細胞株（Ｖｅｎｔｒｅｘ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、メイン州）が最も好ましい。融合したら、得られるハイブリドーマを、選択増殖培地中で１〜２週間培養する。２種の周知の選択系が、未融合骨髄腫細胞または骨髄腫細胞間の融合物を混合ハイブリドーマ培養物から除去するために利用することができる。選択系の選択は、免疫されるマウスの系統、および使用される骨髄腫融合パートナーに依存する。ＴａｇｇａｒｔおよびＳａｍｌｏｆｆ（１９８３）によって発表されたＡＡＴ選択系を使用することができるが、Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ（１９６４）によって発表されたＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択系が、好ましいマウス系統および前述の融合パートナーとのその適合性のため、好ましい。使用済み増殖培地を、免疫特異的ＭＡｂ分泌についてスクリーニングする。酵素結合性免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法が、この目的に最も適しているが、大規模なスクリーニング用に適合されたラジオイムノアッセイも許容される。関連性のないまたはあまり所望されない培養物の著しい数を連続的に削減するように設計された複数のスクリーニングを実施することができる。Ｂ．ｔ．殺虫性トキシンと反応性のあるＭＡｂを分泌する培養物を、既知のＢ．ｔ．殺虫性トキシンとの交差反応性についてスクリーニングすることができる。好ましいＢ．ｔ．殺虫性トキシンに優先的に結合するＭＡｂは、市販のアッセイを使用してアイソタイプに分けられる。好ましいＭＡｂは、ＩｇＧクラスに属し、より高度に好ましいＭＡｂはＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａサブアイソタイプに属する。
【００８９】
好ましいＭＡｂを分泌するハイブリドーマ培養物を数回サブクローニングして、単クローン性および安定性を確立することができる。真核生物の非接着性細胞培養物をサブクローニングするための周知の方法は、限界希釈法、軟質アガロースおよび蛍光活性化細胞ソーティング技術を包含する。各サブクローニングの後、生じた培養物を、好ましくは、抗体分泌およびアイソタイプについて再アッセイして、安定な好ましいＭＡｂ分泌培養物が確立されたことを確実にする。
【００９０】
抗Ｂ．ｔ．トキシン抗体は、特許請求された本発明のＢ．ｔ．殺虫性トキシン、およびその変異体またはフラグメントを検出する種々の方法において有用である。レポーティング基（reporting group）で標識された抗体を使用して、多様な環境中での抗原の存在を確認することができることは広く知られている。放射性同位体で標識された抗体は、卓越した正確さおよび感度で、多様な生物学的流体中での抗原の存在を確認するためのラジオイムノアッセイにおいて数十年の間使用されてきた。より最近になって、酵素で標識された抗体が、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて放射能標識化抗体の代替として使用されている。さらに、本発明のＢ．ｔ．殺虫性トキシンに対して免疫反応性のある抗体を、ポリスチレンウェルなどの固定化基材または粒子に結合させ、Ｂ．ｔ．トキシンが試験サンプル中に存在するかどうかを判定するための免疫アッセイで使用することができる。
【００９１】
核酸プローブを使用する検出
本発明のトキシンおよび遺伝子を同定するためのさらなる方法は、オリゴヌクレオチドプローブの使用による。これらのプローブは、ヌクレオチド配列を検出できる。これらの配列を、適切な放射性標識によって検出可能にすることができ、あるいは例えば米国特許第６２６８１３２号中に記載のように本質的に蛍光性にすることができる。当技術分野で周知のように、プローブ分子および核酸サンプルが、２つの分子間で強力な塩基対形成結合を形成することによってハイブリッドを形成すると、プローブおよびサンプルが実質的に配列相同性を有することを、合理的に想定することができる。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、例えばＫｅｌｌｅｒおよびＭａｎａｋ（１９９３）に記載のような当技術分野で周知の技術によってストリンジェントな条件下で実施される。プローブの検出は、ハイブリダイゼーションが起こったかどうかを既知の方式で判定する手段を提供する。このようなプローブ分析は、本発明のトキシンコード遺伝子を同定するための迅速な方法を提供する。本発明によるプローブとして使用されるヌクレオチドセグメントは、ＤＮＡシンセサイザーおよび標準的手順を使用して合成することができる。これらのヌクレオチド配列はまた、本発明の遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーとして使用することができる。
【００９２】
核酸のハイブリダイゼーション
分子生物学の当業者にとって周知であるように、２つの核酸の類似性は、それらのハイブリダイズする傾向によって特徴付けることができる。本明細書中で使用する場合、「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、プローブがその標的配列に他の配列に比べて検出可能なより大きな程度まで（例えば、バックグラウンドの少なくとも２倍超）ハイブリダイズ（アニール）する条件を指すと解釈される。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、環境により異なる。ハイブリダイゼーション条件および／または洗浄条件のストリンジェンシーを制御することによって、プローブに対して１００％相補的である標的配列を同定することができる（相同プロービング）。別法として、ストリンジェンシーの条件を、配列中の一部の不一致を認めるように調節して、より低度の類似性を検出することができる（非相同プロービング）。一般に、プローブは、約１０００未満のヌクレオチド長、好ましくは５００未満のヌクレオチド長である。
【００９３】
典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．３で約１．５Ｍ未満のＮａイオン、典型的には約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（またはその他の塩）であり、温度は、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）で少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、５０を超えるヌクレオチド）で少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件は、また、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加で達成することができる。典型的な低ストリンジェンシー条件には、３７℃の３０％〜３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液でのハイブリダイゼーション、および５０℃〜５５℃での１Ｘ〜２Ｘ ＳＳＣ（２０Ｘ ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中での洗浄が含まれる。典型的な中等度のストリンジェンシー条件には、３７℃での、４０％〜４５％のホルムアミド、１．０Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および５５℃〜６０℃での０．５Ｘ〜１Ｘ ＳＳＣ中での洗浄が含まれる。典型的な高ストリンジェンシー条件には、３７℃での５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および６０℃〜６５℃での０．１Ｘ ＳＳＣ中での洗浄が含まれる。任意選択で、洗浄緩衝液は、約０．１％〜約１％のＳＤＳを含むことができる。ハイブリダイゼーションの継続時間は、一般に、約２４時間未満、通常、約４〜約１２時間である。
【００９４】
特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、決定的因子は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの場合、熱融解温度（Ｔｍ）は、（規定のイオン強度およびｐＨの下で）相補性標的配列の５０％が、完全に一致したプローブにハイブリダイズする温度である。Ｔｍは、各１％の不一致に対し約１℃低下し、したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション条件、および／または洗浄条件を調節して、所望の同一性をもつ配列のアニーリングを促進することができる。例えば、９０％を超える同一性を備えた配列を求めるなら、Ｔｍを１０℃下げることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列およびその相補配列に対するＴｍに比べて約５℃低いように選択される。しかし、高ストリンジェント条件は、Ｔｍに比べて１℃、２℃、３℃または４℃より低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ、中等度にストリンジェントな条件は、Ｔｍに比べて６℃、７℃、８℃、９℃または１０℃より低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ、低ストリンジェントな条件は、Ｔｍに比べて１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃または２０℃より低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる。
【００９５】
Ｔｍ（℃）は、実験的に測定することができ、あるいは計算によって近似することができる。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの場合、Ｔｍは、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌの式（１９８４）で近似することができる：
Ｔｍ（℃）＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルムアミド）−５００／Ｌ；
ここで、Ｍは一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ホルムアミドはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、Ｌは塩基対中のハイブリッドの長さである。
【００９６】
別法として、Ｔｍは、次式によって記述される（Ｂｅｌｔｚら、１９８３）。
Ｔｍ（℃）＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルムアミド）−６００／Ｌ
ここで、［Ｎａ＋］はナトリウムイオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ホルムアミドはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、Ｌは塩基対中のハイブリッドの長さである。
【００９７】
これらの式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、および所望のＴｍを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーの変更が本質的に記述されることを理解するであろう。所望の不一致度が、４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴｍをもたらすなら、より高い温度を使用できるように、ＳＳＣ濃度を高めることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションへの完璧な指針が、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９５）の論文中に認められる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）の論文も参照されたい。
【００９８】
サザンブロット上に固定化されたＤＮＡの放射能標識化された遺伝子特異的プローブとのハイブリダイゼーションは、標準的な方法によって実施することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上）。ポリヌクレオチドプローブを標識化するのに使用される放射性同位体としては、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃ、または３Ｈを挙げることができる。放射性同位体のポリヌクレオチドプローブ分子中への組み込みは、分子生物学の分野の当業者にとって周知であるいくつかの方法のいずれかによって行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上を参照されたい）。
【００９９】
一般に、ハイブリダイゼーションおよびそれに続く洗浄は、特許請求されるトキシンコード遺伝子に対して相同性を有する標的配列の検出を可能にする厳密な条件下で実施することができる。二本鎖ＤＮＡ遺伝子プローブの場合、ハイブリダイゼーションは、６Ｘ ＳＳＰＥ、５Ｘデンハート液、０．１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ変性ＤＮＡ中、ＤＮＡハイブリッドのＴｍより２０〜２５℃低い温度で一夜実施することができる［２０Ｘ ＳＳＰＥは３Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ ＮａＨＰＯ４、および０．０２Ｍ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩）であり；１００Ｘデンハート液は、２０ｇ／Ｌポリビニルピロリドン，２０ｇ／Ｌ Ｆｉｃｏｌｌタイプ４００、および２０ｇ／Ｌウシ血清アルブミン（フラクションＶ）である］。
【０１００】
洗浄は、典型的には、次のように実施することができる：
１Ｘ ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１５分間、２回（低ストリンジェンシーの洗浄）。
０．２Ｘ ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、Ｔｍ−２０℃で１５分間、１回（中等度のストリンジェンシーの洗浄）。
【０１０１】
オリゴヌクレオチドプローブの場合、ハイブリダイゼーションは、６Ｘ ＳＳＰＥ、５Ｘデンハート液、０．１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ変性ＤＮＡ中、ハイブリッドのＴｍより１０℃〜２０℃低い温度で一夜実施することができる。オリゴヌクレオチドプローブのためのＴｍは、次式によって決定することができる（Ｓｕｇｇｓら、１９８１）。
Ｔｍ（℃）＝２（Ｔ／Ａ塩基対の数）＋４（Ｇ／Ｃ塩基対の数）
【０１０２】
洗浄は、典型的には、次のように実施することができる：
１Ｘ ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１５分間、２回（低ストリンジェンシーの洗浄）。
１Ｘ ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、ハイブリダイゼーション温度で１５分間、１回（中等度のストリンジェンシーの洗浄）。
【０１０３】
ハイブリダイゼーション用プローブ分子、およびプローブと標的分子との間で形成されるハイブリッド分子を、放射能標識化以外の手段によって検出できるようにすることができる。このような代替方法は、本発明の範囲に包含されると解釈される。
【０１０４】
本明細書中で言及または引用されるすべての特許、特許出願、仮出願、および刊行物は、参照によりその全体で、それらが本明細書の明確な教示と矛盾しない程度まで本明細書に組み込まれる。特別に指摘または暗示しない限り、不定冠詞（ａ、ａｎ）および定冠詞（ｔｈｅ）は、本明細書中で使用する場合、「少なくとも１つ」を意味する。本明細書中で用語「遺伝子材料」を使用することによって、すべての遺伝子、核酸、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含することを意味する。
【０１０５】
ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびプライマーのヌクレオチド残基の名称について、およびタンパク質のアミノ酸残基の名称については、標準的なＩＵＰＡＣの省略形を、本文書を通して採用する。核酸配列は、標準的な５’から３’の方向で示され、タンパク質配列は、標準的なアミノ（Ｎ）末端からカルボキシ（Ｃ）末端の方向で示される。
【０１０６】
以下は、本発明を実施するための手順を例示する実施例である。本明細書に記載の実施例および実施形態は、単に例示目的のためであること、およびそれらを考慮した種々の改変形態または変更形態が当業者に対して示唆され、本出願の精神および範囲内、ならびに添付の特許請求の範囲内に包含されることを理解されたい。これらの実施例を、限定と解釈すべきでない。特記しない限り、パーセンテージは、すべて重量によるものであり、溶媒混合物の比率は、すべて容積による。温度は、すべて摂氏温度である。
【実施例１】
【０１０７】
ＤＩＧ−３トキシンをコードする遺伝子の単離
本明細書中でＤＩＧ−３と称する殺虫性Ｃｒｙタンパク質をコードする核酸を、Ｂ．ｔ．株ＰＳ４６ＬのゲノムＤＮＡから、配列番号１の塩基１２８６〜１３１１にハイブリダイズする縮重順方向プライマー、および配列番号１の塩基２４８０〜２４９９の相補配列にハイブリダイズするミスマッチの逆方向プライマーを使用するＰＣＲによって単離した。このプライマー対を使用して、配列番号１のヌクレオチド１２８６〜２４９９に対応する１２１４ｂｐのフラグメントを増幅した。この配列を、Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ（商標）ユニバーサルキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、カリフォルニア州）から構成される方法を使用するゲノムウォーキングを開始するためのアンカーポイントとして使用した。ＤＩＧ−３コード領域にまたがるフラグメントの核酸配列を決定した。配列番号１は、完全長ＤＩＧ−３タンパク質をコードする３７７１ｂｐのヌクレオチド配列である。配列番号２は、配列番号１に由来する完全長ＤＩＧ−３タンパク質のアミノ酸配列である。バチルス（Bacillus）種において、配列番号１のその領域などのタンパク質コード領域は、翻訳すればアミノ酸メチオニンを表すＴＴＧコドンで始まることができることに留意されたい。
【実施例２】
【０１０８】
ＤＩＧ−３からドメインＩのα−へリックスの欠失
ＤＩＧ−３トキシンの殺虫特性を改善するために逐次的、段階的欠失を行い、そのそれぞれがＤＩＧ−３タンパク質のＮ末端部分を欠失させる。該欠失は、α−へリックス３からα−へリックス７までの構造的完全性を維持しながら、ドメインＩのα−へリックス１の一部または全部、およびα−へリックス２の一部または全部を除去する。
【０１０９】
欠失は、次のように設計した。この実施例は、完全長ＤＩＧ−３タンパク質をコードする完全長キメラＤＮＡ配列、例えば、配列番号１、および配列番号２をそれぞれ利用して、６７の特定変異体を伴う設計原理を例示する。この例は、配列番号５のキメラ配列（Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントに融合されるＤＩＧ−３コアトキシンセグメントをコードするＤＮＡ）を利用して、さらなる６７の特定変異体を提供する。当業者は、ＤＩＧ−３タンパク質のすべてまたはＮ末端部分をコードするその他のＤＮＡ配列を、同様に操作して、所望の結果を達成できることを認識するであろう。最初の欠失変異体のコード配列を考案するために、α−へリックス２Ａの始まり近くのプロリン残基用のコドン（すなわち、配列番号２の完全長ＤＩＧ−３タンパク質のためのＰ７３）までα−へリックス１をコードする塩基のすべてを除去する。これによって、配列番号１の塩基１〜２１６の除去は、配列番号２のアミノ酸１〜７２のためのコード配列を除去する。開始点（すなわち、完全長タンパク質のアミノ酸７３に対応するコドンの前）での翻訳開始ＡＴＧ（メチオニン）コドンの再導入は、１１８５のアミノ酸を含む欠失変異体ＤＩＧ−３タンパク質（すなわち、メチオニン＋完全長ＤＩＧ−３タンパク質のアミノ酸７３〜１２５６）をコードする３５５５塩基のオープンリーディングフレームを含む欠失変異体のコード配列を提供する。配列番号２の完全長ＤＩＧ−３タンパク質の残基７３〜１１２に対応する単一アミノ酸のためのさらなるコドンを除去する逐次的、段階的欠失は、α−へリックス２Ａおよびα−へリックス２Ｂの一部またはすべてを欠く変異体を提供する。したがって、第２の設計された欠失変異体のコード配列は、配列番号１の塩基１〜２１９の除去を必要とし、それによってアミノ酸１〜７３のためのコード配列を除去する。機能性オープンリーディングフレームの修復は、残りのコード配列の開始点に翻訳開始メチオニンコドンを再導入することによって再び完了され、これによって、１１８４個のアミノ酸を含む欠失変異体ＤＩＧ−３タンパク質（すなわち、メチオニン＋完全長ＤＩＧ−３タンパク質のアミノ酸７４〜１２５６）をコードする３５５２塩基のオープンリーディングフレームを有する第２の欠失変異体のコード配列を提供する。最後に設計される欠失変異体のコード配列は、配列番号１の塩基１〜３３６の除去を必要とし、これによって、アミノ酸１〜１１２のためのコード配列を除去し、翻訳開始メチオニンコドンの再導入後に、１１４５アミノ酸の欠失変異体ＤＩＧ−３タンパク質（すなわち、メチオニン＋完全長ＤＩＧ−３タンパク質のアミノ酸１１３〜１２５６）をコードする３４３５塩基のオープンリーディングフレームを有する欠失変異体コード配列を提供する。例示されるように、欠失配列の除去後にイニシエーターメチオニンコドンを、残りのコード配列の最初に付加して、機能性オープンリーディングフレームを再生させる。また、先に記載したように、欠失配列の除去によって全長タンパク質の残りの部分のＮ末端に前述の不安定決定性アミノ酸の１つが露出されたままである場合、メチオニンコドンとその不安定決定性アミノ酸のコドンとの間に、さらなるグリシンコドンを付加できる。
【０１１０】
表３に、前記のストラテジーにより設計された特定変異体を記載する。
【表３】
【表４】
【表５】
【０１１１】
表３に記載のトキシンをコードする核酸は、前に述べたとおり、植物中での発現を意図した合成遺伝子に関する一般的原理により設計される。
【実施例３】
【０１１２】
ＤＩＧ−３Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質のためのコード配列の植物最適化バージョンの設計
植物のコドンバイアスを有するＤＮＡ配列を設計、合成して、遺伝子導入単子葉植物および遺伝子導入双子葉植物中でＤＩＧ−３タンパク質を産生させた。トウモロコシ（Zea mays L.）用のコドン使用頻度表を、ＧｅｎＢａｎｋに寄託された配列から得られる７０６のタンパク質コード配列（ＣＤ）から計算した。タバコ（Nicotiana tabacum、１２６８ＣＤ）、カノーラ（Brassica napus、５３０ＣＤ）、ワタ（Gossypium hirsutum、１９７ＣＤ）、およびダイズ（Glycine max、約１０００ＣＤ）用のコドン使用頻度表を、ウェブサイト、http://www.kazusa.or.jp/codon/のデータからダウンロードした。適切な加重平均相対量の、トウモロコシおよび双子葉双方のデータセットに共通な高度に使用されるコドンを含むバイアス付きコドンセットを、どちらかの植物タイプ中のアミノ酸に関する全コドン使用の約１０％未満で使用される任意の冗長なコドンを除外した後に計算した。ＤＩＧ−３タンパク質をコードする植物最適化配列を引き出すため、得られるＤＮＡ配列が植物最適化コドンバイアス表の全コドン組成を有するように、実験的に決定したＤＩＧ−３ ＤＮＡ配列へのコドン置換を行った。配列のさらに洗練させて、望ましくない制限酵素認識部位、潜在的植物イントロンスプライス部位、Ａ／Ｔ残基またはＣ／Ｇ残基のロングラン、および植物細胞におけるコード領域のＲＮＡ安定性、転写、または翻訳を妨害する可能性のあるその他のモチーフを排除した。所望の制限酵素認識部位を導入し、かつ長い内部オープンリーディングフレーム（＋１以外のフレーム）を排除するために、その他の変更を行った。これらの変更は、すべて、植物用バイアス付きコドン組成を維持する制約内で行われた。設計された配列の合成は、商業的供給業者によって実施された（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、カリフォルニア州）。
【０１１３】
合成遺伝子の作製に関するさらなる指針は、例えば、国際公開第９７／１３４０２号および米国特許第５３８０８３１号中に見出すことができる。
【０１１４】
完全長ＤＩＧ−３トキシンをコードする植物最適化ＤＮＡ配列を、配列番号３に示す。Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントをコードする双子葉最適化ＤＮＡ配列を、配列番号６として開示する。Ｃｒｙ１Ａｂプロトキシンセグメントをコードするトウモロコシ最適化ＤＮＡ配列を、配列番号７として開示する。
【実施例４】
【０１１５】
ＤＩＧ−３殺虫性トキシンをコードする発現プラスミドの構築および細菌宿主中での発現
標準的なクローニング法を使用して、植物最適化コード領域中にコードされる完全長ＤＩＧ−３タンパク質を産生するように遺伝子操作されたシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）発現プラスミドを構築した。制限酵素エンドヌクレアーゼを、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、マサチューセッツ州）から入手し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＤＮＡのライゲーションに使用した。プラスミドの調製は、供給業者の説明書に従って、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）Ｘｔｒａキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ Ｉｎｃ、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ペンシルベニア州）またはＰｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して実施した。ＤＮＡフラグメントは、アガローストリスアセテートゲル電気泳動の後に、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）−ＤＡカートリッジ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、マサチューセッツ州）を使用して精製した。
【０１１６】
基本的なクローニング戦略は、ＤＩＧ−３トキシンのコード配列（ＣＤＳ）をｐＤＯＷ１１６９中にＳｐｅＩおよびＸｈｏＩ各制限酵素部位でサブクローニングすることを必要とし、それによって、その配列は、ＰｔａｃプロモーターおよびプラスミドｐＫＫ２２３−３（ＰＬ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ウィスコンシン州）由来のｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーターの発現調節下に置かれる。ｐＤＯＷ１１６９は、ＲＳＦ１０１０起源の複製、ｐｙｒＦ遺伝子、およびその中にタンパク質コード領域を含むＤＮＡフラグメントを導入できる制限酵素認識部位の前方にリボソーム結合部位を有する中程度のコピー数のプラスミドである（米国特許出願公開第２００８／０１９３９７４号）。ｐＤＡＢ４１７１と呼ばれる発現プラスミドを、エレクトロポレーションによってＤＣ４５４（突然変異ΔｐｙｒＦおよびｌｓｃ：：ｌａｃＩＱＩを有する野生型に近いＰ．フルオレセンス（P.fluorescens）株）またはその誘導体中に形質転換し、ＳＯＣ−ダイズ加水分解産物培地中で回収し、選択培地（ウラシルを欠くＭ９グルコース寒天、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上）上に播種する。微生物操作の詳細は、参照により本明細書に組み込まれるＳｑｕｉｒｅｓら（２００４）、米国特許出願公開第２００６／０００８８７７号、米国特許出願公開第２００８／０１９３９７４号、および米国特許出願公開第２００８／００５８２６２号で利用可能である。コロニーを、まずＰＣＲでスクリーニングし、次いで、陽性クローンをミニプレッププラスミドＤＮＡの制限酵素消化によって分析した。インサートを含む選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを、Ｂｉｇ Ｄｙｅ（登録商標）ターミネーター、バージョン３．１を供給業者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の推奨するように使用することによって、または商業的配列決定業者（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、アラバマ州）との契約によって配列決定した。配列データを、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ミシガン州）を使用して組み立て、解析した。
【０１１７】
振盪フラスコ中での増殖および発現の解析。
特徴付けおよび昆虫でのバイオアッセイのためのＤＩＧ−３トキシンの製造は、発現構築物（例えば、クローンＤＰ２８２６）を収容する振盪フラスコ中で増殖したＰ．フルオレセンス（P.fluorescens）株によって達成された。１％グルコースおよび微量元素を補足したＭ９培地中で増殖された種培養物を使用して、５％グリセロールを含む５０ｍＬの規定された最小培地（Ｔｅｋｎｏｖａ カタログ番号３Ｄ７４２６Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ、カリフォルニア州）に播種した。振盪しながらの３０℃で２４時間の初期インキュベーションの後に、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって、Ｐｔａｃプロモーターを介するＤＩＧ−３トキシン遺伝子の発現を誘導した。培養物を、誘導の時点、および誘導後の異なる時点でサンプリングした。細胞密度を、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ６００）によって測定した。例えば、Ｈｕａｎｇら（２００７）および米国特許出願公開第２００６／０００８８７７号中に記載のように、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）の増殖に適したその他の培養培地も利用することができる。
【０１１８】
振盪フラスコ中のサンプルの細胞分画およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
各サンプリングの時点で、サンプルの細胞密度を、ＯＤ６００＝２０に調節し、１ｍＬのアリコートを１４０００ｘｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを−８０℃で凍結した。凍結された振盪フラスコ内細胞ペレットサンプルからの可溶性画分および不溶性画分を、ＥａｓｙＬｙｓｅ（商標）細菌タンパク質抽出溶液（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）を使用して調製した。各細胞ペレットを、１ｍＬのＥａｓｙＬｙｓｅ（商標）溶液に再懸濁し、さらに溶解緩衝液中に１：４で希釈し、振盪しながら室温で３０分間インキュベートした。この溶解物を、４℃、１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を可溶性画分として回収した。次いで、ペレット（不溶性画分）を等容積のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ；１１．９ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）に再懸濁した。
【０１１９】
サンプルを、β−メルカプトエタノールを含む２Ｘ Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上）と１：１で混合し、５分間煮沸した後、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＸＴ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ１２％ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）にロードした。推奨されたＸＴ ＭＯＰＳ緩衝液中で電気泳動を実施した。ゲルを、製造業者（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のプロトコールに従ってＢｉｏ−Ｓａｆｅクーマシー染色液で染色し、Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ Ｉｍａｇｉｎｇシステム（Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ、カリフォルニア州）を使用して画像化した。
【０１２０】
封入体の調製。
Ｃｒｙタンパク質封入体（ＩＢ）の調製は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分光測定法）によって立証されるように、不溶性Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質を産生するＰ．フルオレセンス（P.fluorescens）発酵物からの細胞で実施した。Ｐ．フルオレセンス（P.fluorescens）発酵のペレットを、３７℃の水浴中で解凍した。細胞を、溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）二ナトリウム塩、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、および５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、５ｍＬ／Ｌの細菌プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐ８４６５ Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）を使用直前に添加した）中に２５％ｗ／ｖまで再懸濁した。細胞を、最低に設定した携帯型ホモジナイザー（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅａｒｏｒ、ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．、Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ、オクラホマ州）を使用して懸濁した。細胞懸濁液にリゾチーム（２５ｍｇのＳｉｇｍａ Ｌ７６５１，ニワトリ卵白由来）を、金属スパチュラで混合して添加し、懸濁液を室温で１時間インキュベートした。懸濁液を、氷上で１５分間冷却し、次いでＢｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ２５０（１分の持続期間を２回、動作周期５０％、出力３０％）を使用して超音波処理した。細胞溶解物を顕微鏡法でチェックした。必要な場合、さらなる２５ｍｇのリゾチームを添加し、インキュベーションおよび超音波処理を繰り返した。細胞溶解物を顕微鏡法で確認したら、この溶解物を１１５００ｘｇで２５分間（４℃）遠心分離して、ＩＢペレットを形成し、上清を廃棄した。ＩＢペレットを、１００ｍＬの溶解緩衝液で再懸濁し、携帯型ミキサーでホモジナイズし、上記のように遠心分離した。上清が無色になり、かつＩＢペレットが堅くオフホワイトになるまで、ＩＢペレットを再懸濁（５０ｍＬの溶菌緩衝液中に）、ホモジナイズ、超音波処理、および遠心分離によって反復洗浄した。最終洗浄では、ＩＢペレットを、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む滅菌濾過（０．２２μｍ）蒸留水中に再懸濁し、遠心分離した。最終ペレットを、２ｍＭＥＤＴＡを含む滅菌濾過蒸留水中に再懸濁し、１ｍＬアリコートに−８０℃で貯蔵した。
【０１２１】
ＩＢ調製物中のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および定量を、ＩＢペレットの１ｍＬアリコートを解凍すること、および滅菌濾過蒸留水で１：２０に希釈することによって実施した。希釈されたサンプルを、次いで、４Ｘ還元サンプル緩衝液［２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、４０％グリセロール（ｖ／ｖ）、０．４％ブロモフェノールブルー（ｗ／ｖ）、８％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）、および８％β−メルカプトエタノール（ｖ／ｖ）］と共に煮沸し、１Ｘ Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳ緩衝液（ＢｉｏＲａｄ）で展開される、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシン、１２＋２ウェルゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードした。ゲルを、２００ボルトで６０分間展開し、次いでクーマシーブルー（４５％メタノール、１０％酢酸中の５０％Ｇ−２５０／５０％Ｒ−２５０）で染色し、蒸留水中の７％酢酸、５％メタノールで脱染した。標的バンドの定量は、該バンドの濃度測定値を、標準曲線を作出するために同一ゲル上で展開されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）サンプルに対比して行った。
【０１２２】
封入体の可溶化。
ＰｆクローンＤＰ２８２６からの封入体懸濁液（３２ｍｇ／ｍＬのＤＩＧ−３タンパク質を含む）６ｍＬを、最高に設定したＥｐｐｅｎｄｏｒｆモデル５４１５Ｃ微量遠心管で遠心分離（ほぼ１４０００ｘｇ）して封入体をペレットにした。貯蔵緩衝液上清を除去し、５０ｍＬコニカル管中、２５ｍＬの１００ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１１）で置き換えた。封入体を、ピペットを使用して再懸濁し、ボルテックスして完全に混合した。この遠心管を、静かに揺れる台上に４℃で一夜載せ、標的タンパク質を抽出した。抽出物を、４℃、３００００ｘｇで３０分間遠心分離し、生じた上清を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５再生セルロース遠心フィルター装置（３００００の分子量カットオフ）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して５分の１に濃縮した。次いで、サンプル緩衝液を、使い捨てのＰＤ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）を使用して１０ｍＭ ＣＡＰＳ［３−（シクロヘキサミノ）１−プロパンスルホン酸］、ｐＨ１０に変更した。
【０１２３】
ゲル電気泳動。
電気泳動のために、濃縮された抽出物を、還元剤として５ｍＭのジチオトレイトールを含むＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１：５０に希釈することによって調製し、９５℃で４分間加熱した。サンプルを、０．２〜２μｇ／レーンの範囲の５つのＢＳＡ標準（標準曲線の作出のため）と並んで、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲルの二つ組みのレーンにロードした。ＭＯＰＳ ＳＤＳ展開緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、トラッキングダイがゲルの底部に到達するまで、２００Ｖの電圧を印加した。ゲルを、４５％メタノール、１０％酢酸中の０．２％クーマシーブルーＧ−２５０で染色し、まず４５％メタノール、１０％酢酸で簡単に、次いで７％酢酸、５％メタノールで、バックグラウンドが透明になるまで十分に脱染した。脱染に続いて、ゲルを、Ｂｉｏｒａｄ Ｆｌｕｏｒ−Ｓ ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒでスキャンした。装置のＱｕａｎｔｉｔｉｙ Ｏｎｅ ｖ．４．５．２ソフトウェアを使用して、バックグラウンドを差し引いたタンパク質バンド量を取得し、ＢＳＡ標準曲線を作成し、その曲線を使用して、ストック液中のＤＩＧ−３タンパク質の濃度を計算した。
【実施例５】
【０１２４】
シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）中で産生された改変ＤＩＧ−３タンパク質の殺虫活性
ＤＩＧ−３Ｂ．ｔ．殺虫性トキシンは、ユーロピアンコーンボーラー（European corn borer）（ＥＣＢ；Ostrinia nubilalis（Hubner））、cｒｙ１Ｆ耐性ＥＣＢ（ｒＥＣＢ）、ダイアモンドバックモス（diamondback moth）（ＤＢＭ；Plutella xylostella（Linnaeus））、cｒｙ１Ａ耐性ＤＢＭ（ｒＤＢＭ）、コーンイアーワーム（corn earworm）（ＣＥＷ；Helicoverpa zea（Boddie））、ブラックカットワーム（black cutworm）（ＢＣＷ；Agrotis ipsilon（Hufnagel））、タバコバッドワーム（tabocco budworm）（ＴＢＷ；Heliothis virescens）（Fabricius））、およびキャベツルーパー（cabbage looper）（ＣＬ；Trichoplusia ni）（Hubner））を含む鱗翅目種に対して活性であることを実証した。ＤＩＧ−３タンパク質は、フォールアームワーム（fall armworm）（ＦＡＷ、Spodoptera frugiperda）、Ｃｒｙ１Ｆ耐性ＦＡＷ（ｒＦＡＷ）、およびウェスターンコーンルートワーム（western corn rootworm）（ＷＣＲ；Diabrotica virgifera virgifera ルコント）に対する活性についても試験された。
【０１２５】
サンプルの調製およびバイオアッセイ。
１０ｍＭ ＣＡＰＳ（ｐＨ１０）中の封入体調製物を、１０ｍＭ ＣＡＰＳ（ｐＨ１０）で適切に希釈し、すべてのバイオアッセイに、この緩衝液からなる対照処理を含めた。この対照処理は、死亡率または成長阻害に関するバックグラウンドのチェックとして役立つ。
【０１２６】
ＢｉｏＲａｄ画像化システム（Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ ソフトウェア、バージョン４．５．２を備えたＦｌｕｏｒ−Ｓ ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ）を使用して測定されるゲルデンシトメトリー用の標準曲線を作成するためＢＳＡを使用するゲル電気泳動によって、バイオアッセイ緩衝液中のタンパク質濃度を推定した。ゲルマトリックス中のタンパク質を、クーマシーブルーをベースにした染色液で染色し、読取り前に脱染した。
【０１２７】
精製されたタンパク質を、殺虫活性について、人工昆虫飼料の新生鱗翅目幼虫を用いて実施するバイオアッセイにおいて試験した。ＢＣＷ、ＣＥＷ、ＣＬ、ＤＢＭ、ｒＤＢＭ、ＥＣＢ、ＦＡＷ、およびＴＢＷの幼虫を、商業的昆虫飼育場（Ｂｅｎｚｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｉｓｌｅ、ペンシルベニア州）によって養育されたコロニーから入手した卵から孵化させた。ＷＣＲ卵は、Ｃｒｏｐ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ、ミネソタ州）から入手した。ｒＥＣＢおよびｒＦＡＷの幼虫は、所有コロニー（Ｄｏｗ ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、インディアナ州）から集めた卵から孵化させた。
【０１２８】
バイオアッセイは、昆虫バイオアッセイ用に特別に設計された１２８ウェルのプラスチックトレー（Ｃ−Ｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐｉｔｍａｎ、ニュージャージー州）中で実施した。各ウェルには、１．０ｍＬの多種用鱗翅目飼料（Ｓｏｕｔｈｌａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｌａｋｅ Ｖｉｌｌａｇｅ、アーカンサス州）を入れた。各ウェルの１．５ｃｍ２の飼料表面にピペットでタンパク質サンプルの４０μＬのアリコートを加えた（２６．７μＬ／ｃｍ２）。飼料の濃度は、ウェル中の表面積の平方センチメートル（ｃｍ２）当たりのＤＩＧ−３タンパク質の量（ｎｇ）として計算した。処理されるトレーを、飼料表面上の液体が蒸発するかまたは飼料中に吸収されるまで換気フード中に保持した。
【０１２９】
孵化の数時間以内に、個々の幼虫を湿らせたラクダ毛ブラシで拾い上げ、ウェル毎に１幼虫を処理された飼料上に置いた。次いで、寄生されたウェルを、透明プラスチックの粘着シート（Ｃ−Ｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐｉｔｍａｎ、ニュージャージー州）で密封し、ガス交換を可能にするために穴を開けた。バイオアッセイトレーを、調節された環境条件（２８℃、相対湿度約４０％、明：暗＝１６：８）下に５日間保持した後、各タンパク質サンプルに晒された昆虫の総数、死亡昆虫数、および生残昆虫の重量を記録した。各処理について、パーセント死亡率およびパーセント成長阻害を計算した。成長阻害（ＧＩ）は、次の通り計算した：
ＧＩ＝［１−（ＴＷＩＴ／ＴＮＩＴ）／（ＴＷＩＢＣ／ＴＮＩＢＣ）］
ここで、ＴＷＩＴは、その処理における昆虫の総重量であり、
ＴＮＩＴは、その処理における昆虫の総数であり、
ＴＷＩＢＣは、バックグラウンドチェック（緩衝液対照）における昆虫の総重量であり、
ＴＮＩＢＣは、バックグラウンドチェック（緩衝液対照）における昆虫の総数である。
【０１３０】
ＧＩ５０を、ＧＩ値が５０％となる、飼料中のＤＩＧ−３タンパク質濃度であるように定めた。ＬＣ５０（５０％致死濃度）を、試験昆虫の５０％が死滅する飼料中のＤＩＧ−３タンパク質濃度として記録した。ＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳ、Ｃａｒｙ、ノースカロライナ州）を使用して統計解析（一方向ＡＮＯＶＡ）を行った。
【０１３１】
表６に、ユーロピアンコーンボーラー（European corn borer）およびＣｒｙ１Ｆ耐性ユーロピアンコーンボーラー（European corn borer）（ｒＥＣＢ）に対するＤＩＧ−３タンパク質のバイオアッセイ試験の結果を示す。試験昆虫ｒＥＣＢが、野生型昆虫ＥＣＢと同様、ＤＩＧ−３タンパク質の作用に対して感受性を持つことは、予想外の驚くべき発見である。
【表６】
【０１３２】
表７に、鱗翅目および鞘翅目有害生物（ＷＣＲ）の広範な範囲についてのバイオアッセイの結果を示す。ＤＩＧ−３タンパク質は、ダイアモンドバックモス（diamondback moth）およびｒＤＢＭに対して予想外の驚くべき活性を有した。さらに、ＤＩＧ−３Ｃｒｙタンパク質は、いくつかのその他の鱗翅目昆虫の成長を規制する上で有効である。
【表７】
*GI=成長阻害、P-値=検定統計量、df=自由度、α(アルファ)レベル0.05=検定有意性のレベル
【実施例６】
【０１３３】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）の形質転換
バイナリー植物形質転換および発現プラスミドの構築では、標準的なクローニング法を使用する。制限酵素エンドヌクレアーゼおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼは、ＮＥＢから入手する。プラスミド調製を、製造業者の説明書に従って、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）プラスミド調製キットまたはＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）ＡＸ Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉキット（双方ともＭａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ製）を使用して実施する。ＤＮＡフラグメントを、ゲル単離の後にＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キットまたはＱＩＡＥＸ ＩＩ（登録商標）ゲル抽出キット（双方ともＱｉａｇｅｎ製）を使用して精製する。
【０１３４】
天然もしくは改変された形態のＤＩＧ−３タンパク質またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡフラグメントは、商業的供給業者（例えば、ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、カリフォルニア州）によって合成され、標準的なプラスミドベクター中のクローニングされたフラグメントとして供給されることができ、あるいは適切なヌクレオチド配列を含むその他の構築物の標準的な分子生物学的操作によって得ることができる。ＤＩＧ−３コード領域に対する内部の固有の制限酵素部位を確認することができ、ＤＩＧ−３コード領域の制限酵素部位間の配列を含むＤＮＡフラグメントを合成することができ、このようなそれぞれのフラグメントは、特定の欠失、挿入またはその他のＤＩＧ−３変形形態をコードする。改変されたＤＩＧ−３フラグメントをコードするＤＮＡフラグメントを、他のＤＩＧ−３コード領域フラグメントまたは他のＣｒｙコード領域フラグメントに、適切な制限酵素部位で連結して、所望の完全長ＤＩＧ−３タンパク質、欠失または変異体ＤＩＧ−３タンパク質、または融合タンパク質をコードするコード領域を得ることができる。例えば、最初のＤＩＧ−３コード領域の開始点の適切な制限酵素認識部位、およびＤＩＧ−３コード領域に対して内部の第２制限酵素部位を確認することができる。この最初のＤＩＧ−３コード領域のこれらの制限酵素部位での開裂は、最初のＤＩＧ−３コード領域の一部を含むＤＮＡフラグメントを作り出す。別のＤＩＧ−３コード領域または他のＣｒｙコード領域に特異的な類似の適合性のある制限酵素部位によって挟まれた第２のＤＮＡフラグメントを、最初のＤＮＡ制限酵素フラグメントと組み合わせて使用して、変異体または融合クローンを構築することができる。
【０１３５】
非限定的例において、基本的なクローニング戦略は、完全長または改変ＤＩＧ−３コード配列（ＣＤＳ）を植物発現プラスミド中にＮｃｏＩおよびＳａｃＩ各制限酵素部位でサブクローニングすることでよい。植物発現エレメント（例えば、植物で発現可能なプロモーター、３’末端転写終結、およびポリアデニレート付加決定子など）の調節下で適切なＤＩＧ−３コード領域を含んで得られる植物発現カセットは、例えば、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）技術または標準的な制限酵素フラグメントクローニング法を利用して、バイナリーベクタープラスミド中にサブクローンされる。Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）技術を利用するなら、例えば、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、完全長および改変遺伝子植物発現カセットをバイナリー植物形質転換プラスミド中に再結合することができる。大腸菌（E.coli）およびアグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞中にプラスミドが存在するなら、抗生物質スペクチノマイシンに対する耐性を付与する細菌遺伝子を収容するバイナリー植物形質転換ベクターを採用するのが便利である。また、所望の宿主植物中で機能性である植物で発現可能で選択可能なマーカー遺伝子を含むバイナリーベクタープラスミドを採用するのが便利である。植物で発現可能で選択可能なマーカー遺伝子の例としては、限定はされないが、抗生物質カナマイシン、ネオマイシンおよびＧ４１８に対する耐性を付与する、トランスポゾンＴｎ５のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ａｐｈＩＩ）、ならびにグリホサート、ヒグロマイシン、メトトレキセート、ホスフィノトリシン（ビアラホス）、イミダゾリノン、スルホニルウレア、およびトリアゾロピリミジン系除草剤、例えば、クロロスルフロン、ブロモキシニル、ダラポンなどに対する耐性または寛容性をコードするそれらの遺伝子をコードするものが含まれる。
【０１３６】
アグロバクテリウム・ツムファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株Ｚ７０７Ｓ（Ｚ７０７のストレプトマイシン耐性誘導体；Ｈｅｐｂｕｒｎら、１９８５）のエレクトロコンピテント細胞を調製し、エレクトロポレーションを利用して形質転換する（ＷｅｉｇｅｌおよびＧｌａｚｅｂｒｏｏｋ、２００２）。エレクトロポレーションの後、キュベットに１ｍＬのＹＥＰブロス（ｇ／Ｌ：酵母エキス、１０；ペプトン、１０；ＮａＣｌ、５）を添加し、細胞−ＹＥＰ懸濁液を１５ｍＬの培養管に移し、水浴中、絶えず撹拌しながら２８℃で４時間インキュベートする。細胞を、スペクチノマイシン（２００μｇ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（２５０μｇ／ｍＬ）を含むＹＥＰ＋寒天（２５ｇ／Ｌ）上に播種し、プレートを２８℃で２〜４日間インキュベートする。十分に分離された単一コロニーを選択し、前と同様、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンを含む新鮮なＹＥＰ＋寒天平板上にストリークし、２８℃で１〜３日間インキュベートする。
【０１３７】
バイナリー植物形質転換ベクター中のＤＩＧ−３遺伝子インサートの存在は、選択されたアグロバクテリウム（Agrobacterium）コロニーから調製された鋳型プラスミドＤＮＡを含むベクター特異的プライマーを使用するＰＣＲ分析によって実施される。前と同様、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンを含むＹＥＰ中で増殖された１５ｍＬの一夜培養物の４ｍＬアリコートからの細胞ペレットを、Qiagen Spin（登録商標）Mini Prepsを使用して製造業者の説明書により抽出する。対照として、アグロバクテリウム（Agrobacterium）のエレクトロポレーション形質転換で使用されるバイナリーベクターからのプラスミドＤＮＡを含める。ＰＣＲ反応は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを０．５Ｘの濃度で、製造業者の説明書により使用して完成させる。ＰＣＲ反応は、次の条件、すなわち、ステップ１）９４℃で３分間、ステップ２）９４℃で４５秒間、ステップ３）５５℃で３０秒間、ステップ４）７２℃で、予想される産生物の長さｋｂにつき１分間、ステップ５）ステップ２へと２９回、ステップ６）７２℃で１０分間、でプログラムされたＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｅｌｔｉｅｒサーマルサイクラー中で実施される。反応物は、サイクリングの後、４℃で維持される。増幅産物を、アガロースゲル電気泳動（例えば、０．７％〜１％アガロース、ｗ／ｖ）で分析し、エチジウムブロミド染色で可視化する。ＰＣＲ産物がプラスミド対照と同一であるコロニーを選択する。
【０１３８】
別法として、ＤＩＧ−３遺伝子インサートを含むバイナリー植物形質転換ベクターのプラスミド構築を、アグロバクテリウム（Agrobacterium）操作の当業者にとって周知の標準的な分子生物学的方法によって、候補アグロバクテリウム（Agrobacterium）分離株から調製されたプラスミドＤＮＡを制限酵素消化フィンガープリントマッピングによって実施する。
【０１３９】
アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換法を介して形質転換された植物を得る当業者は、Ｚ７０７Ｓ以外のその他のアグロバクテリウム（Agrobacterium）株を有利に使用することができ、株の選択が、形質転換されるべき宿主植物種の個性に依存する可能性があることを理解するであろう。
【実施例７】
【０１４０】
双子葉植物におけるＤＩＧ−３Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質および変異体の産生
アラビドプシス（Arabidopsis）の形質転換。
アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）Ｃｏｌ−０１を、フローラルディップ法（ＷｅｉｇｅｌおよびＧｌａｚｅｂｒｏｏｋ、２００２）を使用して形質転換する。選択されたアグロバクテリウム（Agrobacterium）コロニーを使用して、選択に適した抗生物質を含むＹＥＰブロスの１ｍＬ〜１５ｍＬ培養物に接種する。培養物を、２２０ｒｐｍで絶えず撹拌しながら２８℃で一夜インキュベートする。各培養物を使用して、選択に適した抗生物質を含むＹＥＰブロスの２つの培養物５００ｍＬに接種し、新たな培養物を、絶えず撹拌しながら２８℃で一夜インキュベートする。細胞を、ほぼ８７００ｘｇ、室温で１０分間ペレット化し、生じる上清液を廃棄する。細胞ペレットを、１／２ｘのＭｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）／ＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇｏｌｄ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）、１０％（ｗ／ｖ）ショ糖、０．０４４μＭベンジルアミノプリン（ＤＭＳＯ中の１ｍｇ／ｍＬ原液の１０μＬ／Ｌ）および３００μＬ／Ｌ Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ−７７を含む５００ｍＬの浸透媒体中に徐々に再懸濁させる。ほぼ１月齢の植物を、最も新しい花房のを確実に覆うよう注意して、培地中に１５秒間浸漬する。次いで、植物を、それらの側面に横たえさせ、２４時間覆い（透明または不透明）、水で洗浄し、直立させる。植物を、１６時間の明／８時間の暗の光周期で、２２℃で育成する。浸漬からほぼ４週間後に、種子を収穫する。
【０１４１】
アラビドプシス（Arabidopsis）の育成および選別。
新たに収穫したＴ１種子を、乾燥剤の存在下に室温で少なくとも７日間乾燥させる。種子を、０．１％寒天／水（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液に懸濁し、次いで、４℃で２日間土の層間で保存する。植付けに備えるため、１０．５インチｘ２１インチの発芽トレー（Ｔ．Ｏ．Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｃｌｅａｒｗａｔｅｒ、ミネソタ州）中のＳｕｎｓｈｉｎｅ ＭｉｘＬＰ５（Ｓｕｎ Ｇｒｏ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｃ．、Ｂｅｌｌｅｖｕｅ、ワシントン州）を微細なバーミキュライトで覆い、Ｈｏａｇｌａｎｄ溶液（ＨｏａｇｌａｎｄおよびＡｒｎｏｎ、１９５０）で湿るまで潅水し、次いで２４時間排水したままにする。土層間に保存した種子を、バーミキュライト上に播種し、加湿ドーム（ＫＯＲＤ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｒａｍａｌｅａ、オンタリオ州、カナダ）で７日間覆う。種子を発芽させ、植物を、Ｃｏｎｖｉｒｏｎ（モデルＣＭＰ４０３０またはＣＭＰ３２４４；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｗｉｎｎｉｐｅｇ、マニトバ州、カナダ）中で、１２０〜１５０μｍｏｌ／ｍ２秒の光強度の長日条件下（明１６時間／暗８時間）に一定の温度（２２℃）および湿度（４０〜５０％）下で育成する。植物は、初期にはＨｏａｇｌａｎｄ溶液、その後は脱イオン水で潅水して土壌を濡らすことなく湿らせて保持する。
【０１４２】
播種の５〜６日後にドームを取り去り、形質転換されていない種子から発芽した植物を死滅させるため、植物に化学選別剤を噴霧する。例えば、バイナリー植物形質転換ベクターによって提供される、植物で発現可能で選択可能なマーカー遺伝子が、ｐａｔ遺伝子またはｂａｒ遺伝子（Ｗｅｈｒｍａｎｎら、１９９６）である場合、形質転換された植物を、Ｆｉｎａｌｅ（５．７８％グルホシネートアンモニウム、Ｆａｒｎａｍ Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｐｈｏｅｎｉｘ、アリゾナ州）の１０００Ｘ溶液で噴霧することによって選別することができる。それに続く２回の噴霧は、５〜７日の間隔で実施される。生き残り（盛んに生育している植物）を、最終噴霧の７〜１０日後に識別し、Ｓｕｎｓｈｉｎｅ Ｍｉｘ ＬＰ５で調製されたポット中に移植する。移植された植物を、加湿ドームで３〜４日間覆い、前記の生育条件下でＣｏｎｖｉｒｏｎ中に配置する。
【０１４３】
双子葉植物の形質転換に関わる当業者は、その他の植物で発現可能で選択可能なマーカー遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）を使用する場合に形質転換植物のその他の選別方法を利用できることを理解するであろう。
【０１４４】
遺伝子導入アラビドプシス（Arabidopsis）の昆虫でのバイオアッセイ
改変されたＣｒｙタンパク質を発現する遺伝子導入アラビドプシス（Arabidopsis）系は、人工飼料オーバーレイアッセイにおいて感受性昆虫種に対して活性であることが立証される。遺伝子導入および非導入アラビドプシス（Arabidopsis）系から抽出されたタンパク質を適切な方法で定量し、タンパク質濃度を正規化するようにサンプル量を調節する。バイオアッセイは前記のように人工飼料で実施される。非遺伝子導入アラビドプシス（Arabidopsis）および／または緩衝液および水を、バックグラウンドチェック処理としてアッセイ中に含める。
【実施例８】
【０１４５】
スーパーバイナリーベクターを作製するためのアグロバクテリウム（Agrobacterium）の形質転換
アグロバクテリウム（Agrobacterium）スーパーバイナリー系は、単子葉植物宿主の形質転換に便利に使用される。スーパーバイナリーベクターを構築および検証するための方法は、十分に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる（日本たばこ産業（東京、日本）から入手可能なプラスミドｐＳＢ１用操作マニュアル、バージョン３．１）。標準的な分子生物学および微生物学の方法を使用して、スーバーバイナリープラスミドを作製する。スーパーバイナリープラスミドの構造の確認／検証は、バイナリーベクターについて前に記載したような方法を使用して行われ、プラスミドｐＳＢ１用操作マニュアル中に提案されているように修正することができる。
【実施例９】
【０１４６】
単子葉植物におけるＤＩＧ−３Ｂ．ｔ．殺虫性タンパク質および変異体の作製
トウモロコシのアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換。
Ｈｉｇｈ ＩＩ Ｆ１クロスからの種子（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、１９９１）を、９５％Ｍｅｔｒｏ−Ｍｉｘ３６０無土壌育成培地（Ｓｕｎ Ｇｒｏ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ、Ｂｅｌｌｅｖｕｅ、ワシントン州）と５％粘度／ローム土壌との混合物を含む５ガロンポット中に播種する。植物を、１６：８時間の明：暗光周期による高圧ナトリウムランプおよびメタルハライドランプの組合せを使用して温室中で育成する。形質転換用の未成熟Ｆ２胚を得るために、制御された同胞受粉を実施する。未成熟胚を、胚がほぼ１．０〜２．０ｍｍの大きさである受粉後８〜１０日目に隔離する。
【０１４７】
感染および共培養。
トウモロコシの穂を、液体石鹸でこすり洗いすること、７０％エタノールに２分間浸漬すること、次いで２０％市販漂白剤（０．１％次亜塩素酸ナトリウム）に３０分間浸漬することによって表面滅菌した後、滅菌水ですすぎ洗う。スーパーバイナリーベクターを含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞の懸濁液を、１００ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン、１０ｍｇ／Ｌテトラサイクリン、および２５０ｍｇ／Ｌストレプトマイシンを含むＹＥＰ固体培地上にて２８℃で２〜３日間増殖させた細菌の１〜２ループを、１００μＭアセトシリンゴンを含む５ｍＬの液体感染培地（ＬＳ基本培地（ＬｉｎｓｍａｉｅｒおよびＳｋｏｏｇ、１９６５）、Ｎ６ビタミン（Ｃｈｕら、１９７５）、１．５ｍｇ／Ｌ ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、６８．５ｇ／Ｌ ショ糖、３６．０ｇ／Ｌ グルコース、６ｍＭ Ｌ−プロリン、ｐＨ５．２）中に移すことによって調製する。溶液を、均一な懸濁が達成されるまでボルテックスし、紫色フィルターを備えたクレット−サマーソン比色計を使用して、約２００Ｋｌｅｔｔ単位の最終密度まで、または５５０ｎｍでほぼ０．４の光学密度まで調節する。未成熟胚を、２ｍＬの感染培地を含むミクロ遠心管中に直接単離する。培地を除去し、２００Ｋｌｅｔｔ単位の密度を有する１ｍＬのアグロバクテリウム（Agrobacterium）溶液で置き換え、アグロバクテリウム（Agrobacterium）および胚溶液を、室温で５分間インキュベートし、次いで、共培養培地（ＬＳ基本培地、Ｎ６ビタミン、１．５ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、３０．０ｇ／Ｌ ショ糖、６ｍＭ Ｌ−プロリン、０．８５ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ３、１００μＭ アセトシリンゴン、３．０ｇ／Ｌ ジェランガム（ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．、Ｌｅｎｅｘａ、カンザス州）、ｐＨ５．８）に、暗条件下に２５℃で５日間移す。
【０１４８】
共培養の後、胚を選択培地に移し、その後、ほぼ８週間の過程にわたって、形質転換された分離株が得られる。植物で発現可能なｐａｔまたはｂａｒ選別マーカー遺伝子を含むスーパーバイナリープラスミドで形質転換されたトウモロコシ組織の選別のために、ＬＳをベースにした培地（ＬＳ基本培地、Ｎ６ビタミン、１．５ｍｇ／Ｌ２，４−Ｄ、０．５ｇ／Ｌ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸一水和物；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌａｂｒ．）、３０．０ｇ／Ｌ ショ糖、６ｍＭ Ｌ−プロリン、１．０ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ３、２５０ｍｇ／Ｌ セフォタキシム、２．５ｇ／Ｌ ジェランガム、ｐＨ５．７）を、ビアラホス（Ｇｏｌｄ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に使用する。胚を、３ｍｇ／Ｌ ビアラホスを含む選択培地に、胚形成分離株が得られるまで移す。回収された分離株を、再生およびさらなる分析のために、２週間間隔で新たな選択培地へ移すことによって大きくする。
【０１４９】
トウモロコシの形質転換に関わる当業者は、その他の植物で発現可能で選択可能なマーカー遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）を使用する場合に形質転換植物のその他の選別方法が利用可能であることを理解するであろう。
【０１５０】
再生および種子生産。
再生のため、培養物を、「２８」誘導培地（ＭＳ塩およびビタミン、３０ｇ／Ｌ ショ糖、５ｍｇ／Ｌ ベンジルアミノプリン、０．２５ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、３ｍｇ／Ｌ ビアラホス、２５０ｍｇ／Ｌ セフォタキシン、２．５ｇ／Ｌ ジェランガム、ｐＨ５．７）に低い明条件（１４μＥｍ−２ｓ−１）下に１週間、次いで高い明条件（ほぼ８９μＥｍ−２ｓ−１）下に１週間移す。続いて、組織を、「３６」再生培地（植物成長調節剤を欠くことを除いて誘導培地と同様）に移す。小植物が高さ３〜５ｃｍまで生長したら、それらを、ＳＨＧＡ培地（Ｓｃｈｅｎｋ−Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ塩、およびビタミン（１９７２）；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌａｂｒ．）、１．０ｇ／Ｌ ｍｙｏ−イノシトール、１０ｇ／Ｌ ショ糖、および２．０ｇ／Ｌ ジェランガム、ｐＨ５．８）を含むガラス培養管に移し、さらなる成長、ならびに茎および根の発育を可能にした。植物を、本明細書中で前に記載したと同様の土壌混合物に移植し、温室中で開花まで育成する。種子生産のための調節された受粉を実施する。
【実施例１０】
【０１５１】
遺伝子導入トウモロコシのバイオアッセイ
植物細胞中で産生されるＤＩＧ−３タンパク質および変異体の生物活性を、通常のバイオアッセイ法（例えば、Ｈｕａｎｇら、２００６を参照されたい）によって立証する。例えば、ＤＩＧ−３トキシンを産生する植物に由来する種々の植物組織または組織片を、調節された給餌環境中で標的昆虫に給餌することによって、有効性を立証することができる。別法として、本明細書中で前に記載したように、ＤＩＧ−３トキシンを産生する植物から得られる種々の植物組織からタンパク質抽出物を調製し、抽出されたタンパク質を人工飼料でのバイオアッセイに組み込むことができる。このような給餌アッセイの結果を、ＤＩＧ−３タンパク質または変異体を産生しない宿主植物からの適切な対照組織、またはその他の対照サンプルを採用する、同様に実施されるバイオアッセイに比較すべきであることを理解されたい。
【０１５２】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２の残基１１３〜６４３のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２の残基１１３〜６４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号２によってコードされるトキシンの発現または活性に有害な影響を及ぼさない２０個までのアミノ酸の置換、欠失、または修飾を含む、配列番号２の残基１１３〜６４３のアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるコアトキシンセグメント、または殺虫活性のあるそのフラグメントを含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
（ａ）配列番号２の残基７３〜６４３のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２の残基７３〜６４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号２によってコードされるトキシンの発現または活性に有害な影響を及ぼさない２０個までのアミノ酸の置換、欠失、または修飾を含む、配列番号２の残基７３〜６４３のアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるコアトキシンセグメント、または殺虫活性のあるそのフラグメントを含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
（ａ）配列番号２の残基１〜６４３のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２の残基１〜６４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号２によってコードされるトキシンの発現または活性に有害な影響を及ぼさない２０個までのアミノ酸の置換、欠失、または修飾を含む、配列番号２の残基１〜６４３のアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるコアトキシンセグメント、または殺虫活性のあるそのフラグメントを含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチドを含む植物。
【請求項５】
有害生物集団を防除する方法であって、前記集団を農薬上有効な量の請求項１に記載のポリペプチドと接触させることを含む方法。
【請求項７】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項８】
配列番号１または配列番号３の請求項７に記載の単離された核酸。
【請求項９】
配列番号２または配列番号５の請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）に由来しないプロモーターに作動可能に連結され、植物中で発現を駆動できる、請求項１に記載のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物。
【請求項１１】
ゲノム中に安定的に組み込まれた請求項１０に記載のＤＮＡ構築体を含む遺伝子導入植物。
【請求項１２】
植物を有害生物から保護する方法であって、前記植物中に請求項１０に記載の構築物を導入することを含む方法。
【請求項１３】
ユーロピアンコーンボーラー（European corn borer）に対する活性を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１】
（ａ）配列番号２の残基１１３〜６４３のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２の残基１１３〜６４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号２によってコードされるトキシンの発現または活性に有害な影響を及ぼさない２０個までのアミノ酸の置換、欠失、または修飾を含む、配列番号２の残基１１３〜６４３のアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるコアトキシンセグメント、または殺虫活性のあるそのフラグメントを含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
（ａ）配列番号２の残基７３〜６４３のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２の残基７３〜６４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号２によってコードされるトキシンの発現または活性に有害な影響を及ぼさない２０個までのアミノ酸の置換、欠失、または修飾を含む、配列番号２の残基７３〜６４３のアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるコアトキシンセグメント、または殺虫活性のあるそのフラグメントを含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
（ａ）配列番号２の残基１〜６４３のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２の残基１〜６４３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号２によってコードされるトキシンの発現または活性に有害な影響を及ぼさない２０個までのアミノ酸の置換、欠失、または修飾を含む、配列番号２の残基１〜６４３のアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択されるコアトキシンセグメント、または殺虫活性のあるそのフラグメントを含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチドを含む植物。
【請求項５】
有害生物集団を防除する方法であって、前記集団を農薬上有効な量の請求項１に記載のポリペプチドと接触させることを含む方法。
【請求項７】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項８】
配列番号１または配列番号３の請求項７に記載の単離された核酸。
【請求項９】
配列番号２または配列番号５の請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）に由来しないプロモーターに作動可能に連結され、植物中で発現を駆動できる、請求項１に記載のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物。
【請求項１１】
ゲノム中に安定的に組み込まれた請求項１０に記載のＤＮＡ構築体を含む遺伝子導入植物。
【請求項１２】
植物を有害生物から保護する方法であって、前記植物中に請求項１０に記載の構築物を導入することを含む方法。
【請求項１３】
ユーロピアンコーンボーラー（European corn borer）に対する活性を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【公表番号】特表２０１２−５２４０８６（Ｐ２０１２−５２４０８６Ａ）
【公表日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０６０５０（Ｐ２０１２−５０６０５０）
【出願日】平成２２年３月２４日（２０１０．３．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２８３８１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２０４５２
【国際公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【出願人】（５０１０３５３０９）ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー (197)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１０月１１日（２０１２．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２４日（２０１０．３．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２８３８１
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１２０４５２
【国際公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【出願人】（５０１０３５３０９）ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー (197)
【Ｆターム（参考）】
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