ＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法
【課題】従来のＤＮＡ損傷検出の方法とはことなり、安価で迅速、一度に大量処理ができ、信頼性も高いＤＮＡ損傷検出の方法を提供する。
【解決手段】げっ歯類の卵巣細胞を、少なくとも付着性細胞用の培地に動物由来血清を配合した培地を用いて培養し、培養したげっ歯類の卵巣細胞からＮＡＤを抽出する。そして、酵素サイクリング法を利用し、アルコール脱水素酵素を添加し、ＮＡＤの量を吸光度で測定することによりＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法である。
【解決手段】げっ歯類の卵巣細胞を、少なくとも付着性細胞用の培地に動物由来血清を配合した培地を用いて培養し、培養したげっ歯類の卵巣細胞からＮＡＤを抽出する。そして、酵素サイクリング法を利用し、アルコール脱水素酵素を添加し、ＮＡＤの量を吸光度で測定することによりＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞のＤＮＡが損傷した際に、損傷に応答して、核内に存在するポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の活性が著しく上昇するに伴い、その基質である、ＮＡＤの減少を定量的に測定することでＤＮＡの損傷状態や、ＤＮＡの損傷やＤＮＡ修復に影響を及ぼす物質や作用を定量的に測定して評価する方法、並びにその適用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生物体は、常に酸化ストレスを受けている。酸化ストレスは、生体内で生成する活性酸素種の酸化損傷力と生体内の抗酸化システムの抗酸化ポテンシャルとの差として定義される。そして、現在までに酸化ストレスは様々な疾病に関与している事が報告されている。
【０００３】
酸化ストレスの原因の一つに紫外線があり、ＤＮＡ損傷を引き起こす際の紫外線の作用として、直接作用と間接作用の２種類に分けられる。直接作用は、ＤＮＡの吸収領域である２６０ｎｍの光が直接ＤＮＡの塩基を励起し、シクロブタン型ピリミジン二量体（ＣＰＤ）やピリミジン（６−４）ピリミジノン光産物（６−４ＰＰ）などの光産物を生成する。間接作用は、２８０〜３２０ｎｍの光によってＤＮＡ障害を与える。２８０〜３２０ｎｍの光を吸収する生体成分として主に、トリプトファン、チロシンなどがあり、そのタンパク質の芳香族側鎖に損傷をあたえる。
【０００４】
また、活性酸素によるＤＮＡ損傷もある。
活性酸素のひとつであるまたヒドロキシラジカルは非常に強い酸化還元電位を持っているので、ほとんど全ての塩基を非特異的に損傷し、多様な塩基の分解生成物を産生する。また糖とも反応し、ＤＮＡ鎖の糖−リン酸結合を切断する。生体内で生成する活性酸素群は、本来、エネルギー生産、侵入異物攻撃、不要な細胞の処理、細胞情報伝達などに際して生産される有用なものだが、生体内の抗酸化システムで捕捉しきれない余剰な活性酸素群が生じる場合、生体の構造や機能を担っている脂質、蛋白質、酵素や、遺伝情報を担う遺伝子ＤＮＡを酸化し損傷を与え、生体の構造や機能を乱し、病気を引き起こし、老化が早まり、がんや生活習慣病となる原因である。また、これらの生活習慣病になることで酸化ストレスが増幅されるという悪循環が起き、さらに疾病・老化が進行することになる。このような活性酸素が引き起こす疾病としてはがん、生活習慣病（心不全、高血圧、脳卒中、糖尿病、動脈硬化、アルツハイマー病）、免疫関連疾患（リウマチ、自己免疫疾患、炎症）などが挙げられる。
【０００５】
そこで現在は、これ等の疾病の治療として、低分子抗酸化剤（例えばα−トコフェロール、ユビキノン、Ｎ−アセチルシステイン、グルタチオン）を用いることが知られている（例えば、特許文献１参照。）。抗酸化活性を有する低分子ペプチドを用いることも知られている（例えば、特許文献２参照。）。これ等のように活性酸素を消去する抗酸化物質の研究が数多く行われている。
【０００６】
また、ＤＮＡは放射線、紫外線、環境中の変異原、更には体内の代謝産物や活性酸素などにより、たえず損傷を受けている。これらの損傷が残存すれば、細胞死、突然変異、ひいては老化やがん化、遺伝病発症などを引き起こす。
そのような事態を避けるために生物は、ＤＮＡ損傷から生体を守り遺伝情報を正確に次世代へ伝えるために、ＤＮＡ損傷を修復するさまざまな機構を進化の過程で獲得してきた。それらの修復機構は、塩基除去修復、ヌクレオチド除去修復、ミスマッチ修復、相同組換え修復、末端結合修復などが挙げられる。
【０００７】
また、アルキル化損傷は、ヒトの場合はＯ６−メチルグアニンＤＮＡメチルトラスフェラーゼがグアニンの６位からアルキル基を取り除くといった特異的なものや、シクロブチルダイマーは、光回復と呼ばれる光依存性の直接的な修復系で修復を受ける。また、このような修復作用を促進する成分の開発も行われている。例えば、ケフラン−ケフィア成分の添加により、紫外線照射によって細胞内で発生した活性酸素量が減少し、アポトーシスが顕著に抑制されたとの報告がされている。同報告においてはさらに、ケフラン−ケフィア成分の添加により経時的にチミンダイマー量が減少したことから、ケフラン−ケフィア成分が活性酸素消去作用だけでなく、ＤＮＡの修復機構を増強することが判明している。
【０００８】
このようにＤＮＡを損傷する、物理的作用や物質を評価する方法は、新規物質、化学薬品や食品などの変異原試験などにも用いられているだけでなく、ＤＮＡの損傷を防止する物質や損傷したＤＮＡの修復を促す物質の探索にもその評価する方法は、盛んに用いられており、非常に重要な技術である。
【０００９】
ＤＮＡ損傷検出の方法は幾つか知られている。例えばコメットアッセイ（シングルセルゲルアッセイ）法がある。コメットアッセイは、細胞懸濁液（または、核の懸濁液）にアガロースを加え、スライドグラス中で寒天ゲルを形成させ、これをＳＤＳ、サルコシル硫酸などの界面活性剤で処理することにより，細胞の可溶化、核蛋白質の溶解を行った後に、電気泳動にかけ、ＤＮＡ部分を染色してＤＮＡ損傷がある条件では、核ＤＮＡが彗星のように尾を引くことを利用して、ＤＮＡ損傷を評価する方法である。
【００１０】
しかしこの方法は、ＤＮＡの二本鎖を一本鎖にする必要があり、そのためアルカリ処理やタンパク溶解や電気泳動といった多くの処理が必要である。これらの実験方法は非常に煩雑であり、時間もかかる。さらに８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）測定法は、遺伝子ＤＮＡ中のグアニン塩基は活性酸素の作用により酸化損傷を受け、この８位の炭素が酸化されることにより、８−ヒドロキシ−デオキシグアノシン（以後８−ＯＨｄＧと略す）が生成されることに基づく。遺伝子ＤＮＡが修復される過程で８−ＯＨｄＧは、細胞外に排出され、さらに血液を経て尿中に排泄されるため、この８−ＯＨｄＧを測定するものである。
【００１１】
また８−ＯＨｄＧは比較的安定な物質で、生体内で代謝や分解されることなく尿中に速やかに排泄されることから、活性酸素による生体損傷を鋭敏に反映するＤＮＡの酸化損傷を示す最もよい指標と考えられるが、８−ＯＨｄＧ量を測定する試薬が高額であり、汎用していない。ＤＮＡ巻き戻し法は、アルカリ溶液中で２本鎖ＤＮＡが一本鎖になる時に、ＤＮＡ損傷がある条件では速やかに短い一本鎖になる性質を利用したＤＮＡ損傷を評価する方法である。この方法も、特殊な操作を必要とする上に、多検体を処理する場合に問題があり、ＤＮＡ損傷検出の方法として満足すべきこのではなかった。
【特許文献１】アメリカ合衆国特許第６１８７７４３号公報、
【特許文献２】アメリカ合衆国特許第５６８３９８２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者は、従来のＤＮＡ損傷検出の方法とは異なり、安価で迅速、一度に大量処理ができ、信頼性も高いＤＮＡ損傷検出の方法を提供することを課題とした。
本発明者はポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ−１）がＤＮＡ損傷時に損傷部位に集まり、損傷の度合いによって修復、アポトーシス、ネクローシスを調節していることに着目し本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、ＤＮＡ損傷時に損傷部位に集まったＰＡＲＰ−１はＮＡＤを基質として、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリマーを素早くＤＮＡ損傷部位に結合させ、その他のＤＮＡ修復タンパク質と相互作用する。ＤＮＡ損傷が大きい場合、細胞内のＮＡＤ量は大きく減少する。そこで、ＤＮＡ損傷部位にＰＡＲＰ−１が結合し、ＮＡＤを基質としてＤＮＡ修復をスタートさせる現象を利用し、細胞内のＮＡＤ量をＮＡＤ酵素サイクリング法で定量することで細胞が受けた損傷を検出するといった原理を利用している。
この新規ＤＮＡ損傷検出法と従来の検出法との違いとしては、本検出法は短時間で、実験手順も簡便で、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度を測定することにより、一度に大量に正確にＤＮＡ損傷を定量できる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するために請求項１の本発明は、酵素サイクリング法を利用しＮＡＤの量を吸光度で測定することによりＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法である。
【００１５】
請求項１の本発明では、酵素サイクリング法を利用しＮＡＤの量を吸光度で測定することによりＤＮＡの損傷量を定量的に測定することができるため、一度に９６検体以上のサンプルを、素早く、安価に、同時に測定することができ、自動化も可能な方法であることから、ＤＮＡ損傷検出を非常に効率的に行うことが出来る。したがって、本発明のＤＮＡ損傷検出法を用いると、多くの天然物や化合物から、ＤＮＡの修復作用のある物質やＤＮＡの保護作用のある物質を、容易かつ迅速に選定することができ、選定試験方法として優れている。
【００１６】
請求項２の本発明は、下記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の工程を含む請求項１記載のＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法である。
（ａ）げっ歯類の卵巣細胞を、少なくとも付着性細胞用の培地に動物由来血清を配合した培地を用いて培養し、培養したげっ歯類の卵巣細胞の培養液からげっ歯類の卵巣細胞を取り出し、洗浄を行う。
（ｂ）洗浄後のげっ歯類の卵巣細胞からＮＡＤを抽出するために酸液に浸漬し、さらに一定時間静置する。浸漬後、浸漬液をアルカリ水により中和する。中和後の浸漬液を遠心分離により上清を分取しＮＡＤ測定用サンプルとする。
（ｃ）少なくとも緩衝液に溶解したホルマゾン系の色素にエタノールを配合した発色液に、上記（ｂ）の工程で調整したＮＡＤ測定用サンプルを混合したものに、酵素サイクリング法を利用し、アルコール脱水素酵素を添加し、さらに一定時間静置した後、波長５５０〜５７０ｎｍにて吸光度を測定する。
【００１７】
請求項２の本発明では、（ａ）の工程では、げっ歯類の卵巣細胞を、少なくとも付着性細胞用の培地に動物由来血清を配合した培地を用いて培養し、培養したげっ歯類の卵巣細胞の培養液からげっ歯類の卵巣細胞を取り出し、洗浄を行う。このため、ＤＮＡの損傷を評価する細胞を容易に培養することができる。動物由来血清は、細胞の生育に必要な各種微量成分を幅広く含むため、細胞の良好な成生育が得られる。げっ歯類の卵巣細胞を使用したため、増殖が速くまた、取扱も容易である。
【００１８】
（ｂ）の工程では、洗浄後のげっ歯類の卵巣細胞からＮＡＤを抽出するために酸液に浸漬し、さらに一定時間静置する。浸漬後、浸漬液をアルカリ水により中和する。中和後の浸漬液を遠心分離により上清を分取しＮＡＤ測定用サンプルとする。このため、ＮＡＤを分解する酵素を失活させて、ＮＡＤを安定に抽出することができる。
【００１９】
（ｃ）の工程では、少なくとも緩衝液に溶解したホルマゾン系の色素にエタノールを配合した発色液に、上記（ｂ）の工程で調整したＮＡＤ測定用サンプルを混合したものに酵素サイクリング法を利用して、アルコール脱水素酵素を添加、さらに一定時間静置した後、波長５５０〜５７０ｎｍにて吸光度を測定する。このため、微量のＮＡＤを増幅して、酵素サイクリングを使用してＮＡＤの量を測定することができ、波長５５０〜５７０ｎｍにてＮＡＤの量に対する吸光度を測定するため、測定が早く、容易にできる。
【００２０】
請求項３の本発明は、動物由来血清は、ウシ胎児血清であり、げっ歯類の卵巣細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法である。
【００２１】
請求項３の本発明では、動物由来血清は、ウシ胎児血清であり、げっ歯類の卵巣細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるため、培養が容易であり、倍加時間が短く、無血清培養も可能である。
【００２２】
請求項４の本発明は、（ａ）の工程で、培地にストレプトマイシンとペニシリンを添加するＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法である。
【００２３】
請求項４の本発明では、（ａ）の工程で、培地にストレプトマイシンとペニシリンを添加するため、細菌の繁殖を防止して、供試細胞の培養をすることができる。
【００２４】
請求項５の本発明は、（ｂ）の工程で、酸液は、過塩素酸であり、アルカリ水により中和は、水酸化カリウムとリン酸緩衝液の混合物を使用するＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法である。
【００２５】
請求項５の本発明では、（ｂ）の工程で、酸液は、過塩素酸であり、アルカリ水により中和は、水酸化カリウムとリン酸緩衝液の混合物を使用するため、アルカリに不安定なＮＡＤを安定して抽出することができる。
【００２６】
請求項６の本発明は、（ｃ）の工程で、アルコール脱水素酵素は、アルコールデヒドロゲナーゼであり、ホルマゾン系の色素にエタノールを配合した発色液は、ナトリウム・バイシン緩衝液（Ｎａ ・Ｂｉｃｉｎｅ）、ＭＴＴ（３（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ ｔｈｉａｚｏｌｙｌ ｂｌｕｅ）、フェナジンエトサルフェート（Ｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ ）、エチレンジアミン四酢酸、ウシ血清アルブミンの混合液であるＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法である。
【００２７】
請求項６の本発明では、（ｃ）の工程で、アルコール脱水素酵素は、アルコールデヒドロゲナーゼであり、ホルマゾン系の色素にエタノールを配合した発色液は、ナトリウム・バイシン緩衝液（Ｎａ・Ｂｉｃｉｎｅ）、ＭＴＴ（３（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ ｔｈｉａｚｏｌｙｌ ｂｌｕｅ）、フェナジンエトサルフェート（Ｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）、エチレンジアミン四酢酸、ウシ血清アルブミンの混合液である。このため、酵素サイクリング法により、ＮＡＤの濃度を増幅し、確実に発色させ、ＮＡＤの微量な差を迅速に、確実に測定することができる。また、常温操作が可能であり、発色の経時変化が少ない。
【００２８】
請求項７の本発明は、吸光度は、５５０〜５７０ｎｍの波長をマクロプレートリーダーで測定するＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法である。
【００２９】
請求項７の本発明では、吸光度は、５５０〜５７０ｎｍの波長をマクロプレートリーダーで測定するため、測定が容易で、早く、多数の検体を同時に測定することができる。また、マイクロプレートリーダーのため、人為的誤差がなく再現性に優れている。
【００３０】
請求項８の本発明は、動物細胞のＤＮＡに対する物理的又は化学的処理の影響を評価するために、酵素サイクリング法を利用しＮＡＤの量を吸光度で測定することによりＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法である。
【００３１】
請求項８の本発明では、本発明を使用して、動物細胞のＤＮＡに対する物理的又は化学的処理の影響を評価するため、動物細胞のＤＮＡについて、物理的又は化学的処理の影響の評価を多数の検体に対して素早く行うことができる。蛍光試薬を使用しないため、試薬の経時変化やロットブレがなく、再現性が優れ微量差を比較することができる。
【００３２】
請求項９の本発明は、動物細胞のＤＮＡの修復系を調節し得る物質をスクリーニングするために、酵素サイクリング法を利用しＮＡＤの量を吸光度で測定するＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法である。
【００３３】
請求項９の本発明では、動物細胞のＤＮＡの修復系を調節し得る物質をスクリーニングするために、酵素サイクリング法を利用しＮＡＤの量を吸光度で測定するため、動物細胞のＤＮＡの修復系を調節し得る多数の物質を、素早く、確実にスクリーニングすることができる。
【発明の効果】
【００３４】
本発明のＤＮＡ損傷検出法を用いると、一度に９６検体以上のサンプルを、安価に同時に測定することができ、自動化も可能な方法であることから、ＤＮＡ損傷検出が非常に効率的に行うことが出来る。したがって、本発明のＤＮＡ損傷検出法を用いると、多くの天然物や化合物から、ＤＮＡの修復作用のある物質やＤＮＡの保護作用のある物質を、容易かつ迅速に選定することができ、選定試験方法として優れている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
酵素サイクリング法を利用したＤＮＡの定量的測定方法は、次の通りである。
まず、供試細胞を培養する工程は次の通りである。
培地として、Ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ ａｌｐｈａ ｍｅｄｉｕｍ αＭＥＭ培地（最少培地）を使用し、その培地に対して、終濃度５％となるように動物由来血清としてウシ胎児血清を添加し、さらに１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、２ｍＭグルタミンを添加する。その添加した培地を使用して、培養するげっ歯類の卵巣細胞としてチャイニーズハムスター卵巣細胞を３７℃で５％濃度の炭酸ガス（ＣＯ２）のインキュベーター内で培養する。増殖が活発な、対数増殖期に維持して培養したチャイニーズハムスター卵巣細胞を供試細胞とする。
その後、培養液からチャイニーズハムスター卵巣細胞を取出し洗浄を行う。
供試細胞の培養では、ＤＮＡ損傷を評価する細胞として、チャイニーズハムスター卵巣細胞を用いることができる。この場合は、倍加時間が短く、培養が比較的容易であり、無血清培養も可能であるなどのメリットがあるためである。
【００３６】
次に、ＮＡＤ測定用サンプルを作成する工程は次の通りである。
まず、チャイニーズハムスター卵巣細胞の培養液を捨て、十分に水気を取り除き、氷冷したカルシュウムイオンとマグネシュウムイオンを含まないリン酸緩衝生理的食塩水にて２回洗浄した後、０．５Ｍ過塩素酸を２００μｌ添加し、氷上で１５分間放置した。
その後、反応液を中和させるために１Ｍ水酸化カリウムと０．３３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を１００μｌ添加し、氷上で１５分間放置した。そして、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心後、上清を回収し、これをＮＡＤ測定用サンプルとした。
【００３７】
ＮＡＤ測定用サンプルを作成する工程では、供試細胞を洗浄する必要がある。特にＮＡＤが熱やアルカリに不安定なため、氷冷しながら抽出する必要があり、さらに細胞が死滅、もしくは破砕されると、ＮＡＤを分解する酵素が作用し始め、分解が急速に進行する点を留意して、その酵素を失活させるためにも、酸性である過塩素酸による抽出を行う必要がある。
【００３８】
つぎに、細胞内ＮＡＤ量の測定の工程について説明する。
バイシン緩衝液（Ｂｉｃｉｎｅ）、ＭＴＴ（３（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ ｔｈｉａｚｏｌｙｌ ｂｌｕｅ）、フェナジンエトサルフェート（Ｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）、エチレンジアミン四酢酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、エタノール（Ｅｔｈａｎｏｌ）の混合液に対して、ＮＡＤ測定用サンプルを作成する工程で調製したＮＡＤ測定用サンプルを添加し、３７℃、５分間プレインキュベーションした。
【００３９】
続いて、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ） （オリエンタル酵母社より購入）を添加し、３７℃にて２０分間インキュベーションした後、マイクロプレートリーダーを使用して、後述するホルマザンの５５０〜５７０ｎｍの吸光度を測定することでＮＡＤを定量することができる。今回の測定では５５０ｎｍの吸光度を測定した。５５０ｎｍの吸光度を測定するにあたり、７００ｎｍの吸光度を測定することにより、ゼロ点の補正の比較データとした。
【００４０】
この微量なＮＡＤ量（数十〜数百ｐｍｏｌ程度）の変化を測定するために、酵素サイクリング法を用いた。この方法では、図１に示すように、まずエタノールをアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）によりアセトアルデヒドにする際に、ＮＡＤがＮＡＤＨに還元される。さらにフェナジンエトサルフェート（ＰＥＳ：ｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）を介してＭＴＴを還元し、紫色のホルマザンが形成される。これと同時にＮＡＤＨはＮＡＤに再び酸化される。ＭＴＴの還元速度（発色体の形成）は、ＮＡＤの還元速度に依存するので、このサイクルがｎ回繰り返されると、もとのＮＡＤ量に対して化学量論的に、ｎ倍の生成物であるホルマザンが得られることになる。さらにこのホルマザンの吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定することにより、従来より多量のサンプルを迅速に測定することが可能となった。
【００４１】
細胞内ＮＡＤ量の測定の工程では、上記の酵素サイクリング法を用いて細胞内ＮＡＤ量を測定するが、細胞内のＮＡＤの濃度は薄く、そのままでは測定できず、微量の差を比較することが困難であるが、酵素サイクリング法によりＮＡＤをリサイクルすることにより、ＮＡＤの量に対応する生成物であるＭＴＴ・Ｈの量を増幅し、より正確に微量な差を測定することができるようになった。
上記のように、この増幅されたＭＴＴ・Ｈの量をマイクロプレートリーダーを使用して、５５０〜５７０ｎｍの吸光度を測定することでＮＡＤを定量的に、正確に、微量な差を測定することができる。
【００４２】
さらに、動物細胞のＤＮＡに対して、物理的又は化学的処理をすることにより損傷を与える影響を評価するために、本発明を使用すると、動物細胞のＤＮＡに物理的又は化学的処理の影響をあたえる物質を評価することができる。
具体的には、過酸化水素の影響を評価する場合は、チャイニーズハムスター卵巣細胞を培養した後に、チャイニーズハムスター卵巣細胞は種々の細胞密度（５．０ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌから２．０ｘ１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の状態で過酸化水素終濃度０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭとなるように添加し、炭酸ガス（ＣＯ２）インキュベーター内で一定時間培養する。
【００４３】
また、紫外線（ＵＶＢ）照射の影響を評価する場合は、チャイニーズハムスター卵巣細胞は種々の細胞密度（５．０ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌから２．０ｘ１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の状態でウェルプレートのふたを開けて、１００Ｊ／ｍ２と２００Ｊ／ｍ２になるように紫外線を照射し、炭酸ガス（ＣＯ２）インキュベーター内で一定時間培養することにより、物理的又は化学的処理の影響を評価することができる。
【００４４】
さらに、動物細胞のＤＮＡの修復系を調節し得る物質をスクリーニングするために、本発明を使用すると、ＤＮＡの修復系に対して影響を及ぼす物質を特定することができる。
【００４５】
本発明のＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法は、ＤＮＡの修復プロフィールを確立する、修復関連疾患を診断する、所与の生物学的媒質の修復能力に対する物理的又は化学的処理の影響を評価する、生物学的媒質の修復系を調節し得る物質をスクリーニングする、新規物質に対する発癌性の評価（リスク・アセスメント）等の目的で使用できる。
【実施例】
【００４６】
次に、本発明の実施例について説明する。
本発明の実施例に使用するものは以下の通りである。
げっ歯類の卵巣細胞として、チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、ＣＨＯ細胞という。）を使用し、培地として、αＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ ａｌｐｈａ ｍｅｄｉｕｍ）（ＧＩＢＣＯ社）製試薬）を使用した。
【００４７】
上記培地に添加するものは以下のものである。
ウシ胎児血清（バイオウエスト社（Ｂｉｏｗｅｓｔ社）製試薬）
１００ Ｕ／ｍｌペニシリン（シグマ社製試薬）
１００ Ｕ（マイクロ）ｇ／ｍｌストレプトマイシン（シグマ社製試薬）
２ｍＭグルタミン（ナカライ社製試薬）
【００４８】
ＤＮＡの損傷量を測定するため、ＤＮＡ損傷剤を使用し、実験的にＤＮＡを損傷させて測定したが、そのＤＮＡ損傷剤は次のものである。
過酸化水素（ナカライ社製試薬）
ニトロソグアニジン（ナカライ社製試薬）
【００４９】
抗酸化剤として、次のものを使用した。
Ｎ−アセチルシステイン（ナカライ社製試薬）
【００５０】
さらに、以下の試薬を使用した。
アルコールデヒドロゲナーゼ（オリエンタル酵母社製試薬）
０．１ Ｍピロリン酸 緩衝液（ナカライ社製試薬）
１０ μｇ／ｍｌ ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製試薬）
エタノール（ナカライ社製試薬）
リン酸緩衝生理的食塩水（ナカライ社製試薬）
水酸化カリウム（ナカライ社製試薬 特級）
０．３３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ ７．２）（ナカライ社製試薬 特級）
０．５Ｍナトリウムバイシン（Ｎａ・Ｂｉｃｉｎｅ）（ｐＨ7.8）（ナカライ社製試薬）
５ｍＭ ＭＴＴ（３（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ ｔｈｉａｚｏｌｙｌ ｂｌｕｅ）（ナカライ社製試薬）
２０ｍＭフェナジンエトサルフェート（Ｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）（ナカライ社製試薬）
５０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）（ナカライ社製試薬 特級）
ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）（ナカライ社製試薬）
【００５１】
殺菌剤として、次のものを使用した。
メチルパラベン（和光純薬社製試薬 特級）
エチルパラベン（和光純薬社製試薬 特級）
ブチルパラベン（和光純薬社製試薬 特級）
プロピルパラベン（和光純薬社製試薬 特級）
フェノキシエタノール（和光純薬社製試薬 特級）
【００５２】
実施例１として、チャイニーズハムスター卵巣細胞内のＮＡＤ含有量の測定をした。
供試細胞の培養は次の通りである。
細胞はＣＨＯ細胞をαＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ ａｌｐｈａ ｍｅｄｉｕｍ）（ＧＩＢＣＯ社製）に、５％ウシ胎児血清、１００ Ｕ（マイクロ）ｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、２ｍＭグルタミンを添加したものを用いて、３７℃ ５％炭酸ガス（ＣＯ２）インキュベーター内で増殖が活発な、対数増殖期に維持して培養した。なお、上記のとおりＤＮＡ損傷剤を使用し、実験的にＤＮＡを損傷させて測定した。
【００５３】
次に、ＮＡＤの抽出を以下のように行った。
ＤＮＡ損傷を誘導した細胞の培養液を捨て、十分に水気を取り除き、氷冷したリン酸緩衝生理的食塩水にて２回洗浄した後、０．５Ｍ過塩素酸を２００μｌ添加し、氷上で１５分間放置した。その後、反応液を中和させるために１Ｍ水酸化カリウムと０．３３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ ７．２）を１００μｌ添加し、氷上で１５分間放置した。そして、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心後、上清を回収し、これをＮＡＤ測定用サンプルとした。
【００５４】
つぎに、酵素サイクリング法を用いて、以下のように、細胞内のＮＡＤ量を測定した。
９６穴プレートに、以下に示す反応混合物を１００μｌ入れ、これに対して、調製したＮＡＤ測定用サンプルを５０μｌ添加し、３７℃、５分間プレインキュベーションした。続いて、終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌとなるように２０μｌのアルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（オリエンタル酵母社より購入）を添加し、３７℃にて２０分間インキュベーションした後、マイクロプレートリーダー（ＭＰＲ−Ａ４ｉ，東ソー株式会社）を用いて、プレートの５５０ｎｍ（対照波長：７００ｎｍ）の吸光度を測定した。
【００５５】
上記で使用した反応混合物は、以下のものである。
０．５Ｍ ナトリウムバイシン（ＮａＢｉｃｉｎｅ）緩衝液（ｐＨ７．８）２０μｌ
５ｍＭ ＭＴＴ １０μｌ
２０ｍＭ フェナジンエトサルフェート（ＰＥＳ） １０μｌ
５０ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）１０μｌ
１０ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） １０μｌ
エタノールと超純水 ４０μｌ
全量 １００μｌ
【００５６】
酵素サイクリング法により生成したホルマザンの吸光度値に相関するＮＡＤの絶対量を求めるために、検量線を作成した。以下に示す各試薬をミクロセルに順次入れて混和し、５５０ｎｍの波長で吸光度のゼロ合わせをした。続いてアルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（原液）を１０μｌずつ入れて混和し、５５０ｎｍの波長で吸光度の最高値を測定し、図2に示すように、検量線を作成した。縦軸が吸光度、横軸がＮＡＤの濃度（μｇ／ｍｌ）である。
吸光度のゼロ合わせをするための対照液は、０．１Ｍピロリン酸緩衝液５００μｌ、超純水１０００μｌとエタノール１０μｌであり、吸光度測定のサンプルは、０．１Ｍピロリン酸緩衝液５００μｌ、ＮＡＤ１０μｇ／ｍｌとエタノール１０μｌである。
【００５７】
上記の反応組成は、検量線を作成するにあたって使用するＮＡＤを、ホルマザンに酵素的に変換することにより、その特異的な吸収（５５０ｎｍ）を利用して、モル吸光係数から濃度検定するためである。そのＮＡＤを用いて、下記の表１と図２に示す、種々の濃度のＮＡＤを作成し、酵素サイクリング法に従い、測定を行った。
【表１】
図２に示すように、ＮＡＤ量と吸光度は相関があり、本発明のＮＡＤ酵素サイクリング法にて、良好に増感されたことが判る。
【００５８】
実施例２〜５について、酸化損傷誘導物質の評価を過酸化水素にて行った。ＣＨＯ細胞を過酸化水素（終濃度０．０５ｍＭ〜０．４ｍＭ）で各時間（０〜６０分）処理後、ＮＡＤを抽出し、そのサンプルをＮＡＤ酵素サイクリング法により細胞内のＮＡＤ含有量を測定し、各濃度の過酸化水素処理における細胞内のＮＡＤ量の結果を表２に示した。
【表２】
実施例２〜５に示すように、過酸化水素の量及び接触時間に伴いＮＡＤの量が減っていることから、本発明の方法は、酸化力の強さと、ＮＡＤの減少に相関があることがわかり、ＤＮＡが過酸化水素により損傷されたことを定量的に評価できることが判る。
【００５９】
実施例６〜７は、実施例１に従い、表３に示すように、ＤＮＡ損傷成分としてＵＶＢ照射の評価を行った。ＣＨＯ細胞は種々の細胞密度（５．０ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ， ２．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の状態でウェルプレートのふたを開けて、２００Ｊ／ｍ２になるように照射し、炭酸ガス（ＣＯ２）インキュベーター内で２〜３時間培養した。
【表３】
実施例６〜７にて、ＵＶの照射量と、ＮＡＤの減少に一次関数的な関係があることが得られたことから、ＤＮＡの損傷量が定量できることが判る。実施例２〜７の結果より、ＤＮＡの損傷が物理的および化学的どちらの作用においても、本発明の方法で測定できることが判る。
【００６０】
実施例８〜１１については、実施例１に従い、ＤＮＡ損傷成分としてニトロソグアニジンの評価を行った。ＣＨＯ細胞は種々の細胞密度（５．０ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ， ２．０ｘ１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の状態で終濃度０．０２ｍＭ〜０．２ｍＭとなるようにニトロソグアニジンを添加し、炭酸ガス（ＣＯ２）インキュベーター内で一定時間培養した。その結果を表４に示す。
【表４】
実施例８〜１１の結果より、ニトロソグアニジンの添加量と、ＮＡＤ量の減少量に相関があることから、酸化作用によるＤＮＡ損傷で無く、ニトロソグアニジンによるアルキル化作用によるＤＮＡ損傷も、測定できることが判明した。
【００６１】
実施例１２〜１５については、実施例１に従い、ＤＮＡ損傷防止剤としてＮ−アセチルシステインの効果を測定した。ＣＨＯ細胞をＮ−アセチルシステイン（終濃度１０ｍＭ）で１時間処理し、種々濃度の過酸化水素（終濃度０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭ）で１５分処理し、一定時間培養後、ＮＡＤを抽出し、ＮＡＤ酵素サイクリング法にて細胞内のＮＡＤ含有量を測定した。その結果を表５に示す。
【表５】
実施例１２〜１５において、比較例５に示すように、過酸化水素０．１Ｍの酸化処理を行うと、ＮＡＤ量は、２．１１から１．５８に減少する。しかし、予め、ＤＮＡの損傷を防止する物質である、Ｎ−アセチルシステイン処理を行うと、ＮＡＤの減少は１．８６に留まっている。従って、本発明の方法により、Ｎ−アセチルシステインのＤＮＡの損傷を防止作用が測定できることがわかる。更に、過酸化水素濃度が上昇するとＮ−アセチルシステインの作用が弱くなることも測定できることが判る。
【００６２】
実施例１６〜１９については、殺菌剤は、動物細胞にも影響を与えると考えられているため、その影響について実施例１に従い測定した。各殺菌剤は、ジメチルスルフオキシドにて希釈し、培地量に対して、１／１００量になるように添加した。その結果を表６に示す。
【表６】
実施例１６〜１９の結果より、実施例１８のブチルパラベンがＤＮＡへの影響が大きいことが判明した。殺菌剤のような、似たような作用を持つ化学物質でも、その構造の違いによりＤＮＡへの影響を測定できることが判った。これにより、新規化学物質の変異原性を測定することも可能であることが判る。
【００６３】
実施例２０〜２７については、皮膚常在菌によるＤＮＡ修復促進物質分泌の確認を実施した。特開２００５−３０４３６３号公報にて、皮膚常在菌にトリプトファン、チロシン、ヒスチジン、システイン、フェニルアラニン及びシスチンよりなる群から選ばれた１種類以上のアミノ酸と金属塩を共存させることにより、皮膚常在菌による抗酸化物質の分泌が促進されることが公開されている。
【００６４】
今回、実施例１に従い、この抗酸化物質のＤＮＡの損傷防止作用について確認した。
皮膚常在菌分離法として、固体培地を１５人（男性５人、女性１０人、年齢２０〜６０歳）の顔に直接押し付けた後、３０℃、２日間培養を行った。培地上に出現したコロニーを釣菌し、菌種の異なる常在菌を７菌株（ＳＫＡ２０、ＳＫＡ３０、ＳＫＡ３１、ＳＫＡ３６、ＳＫＡ４８、ＳＫＡ５９、ＳＫＡ６１）分離した。常在菌７菌株を固体培地に一白金耳接種した後、３０℃、２４時間静置培養を行う。次に、液体培地に各アミノ酸の添加合計２．０ｇ、およびＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏを５ｍｇ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏを０．５ｍｇ添加した培地に前記固体培地より一白金耳を接種し、３０℃、２日間静置培養を行う。更に上記７菌株は１８０ｒｐｍにて振盪培養を行う。培養３日後の培養液（約１００ｍｌ）を、ロータリーエバポレーターにて、５０℃でほぼ乾固に近い状態まで濃縮した後、２０ｍｌのエタノールで一晩抽出後３ｍｌに濃縮し、０．４５μでろ過し供試検体とした。エタノール抽出を行うことにより、培地中に含まれる塩類の影響を排除した。
【００６５】
液体培地として、以下の成分を有する関東化学株式会社製の試薬を使用する。
培地１０００ｍｌ当たり、グルコースを１０ｇ、イーストエキストラクトを５．０ｇ、リン酸水素２カリウムを０．５ｇ、リン酸２水素カリウムを１．５ｇ、硫酸マグネシウム・７Ｈ２Ｏを０．２ｇ、水酸化ナトリウムを０．１ｇ、硝酸カリウムを０．１ｇ、パラアミノ安息香酸（Ｐ−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）を２０μｇ、イノシトール（Ｉｎｏｓｉｔｏｌ）を０．２ｍｇ、ビタミンＨ（ＶｉｔａｍｉｎＨ）を２μｇ、ニコチン酸（Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ）を４０μｇ、ビタミンＢ１２（Ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ１２）を０．５μｇ、ビタミンＢ１（ＶｉｔａｍｉｎＢ１）を４０μｇ、パントテン酸カルシウム（Ｃａ−Ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ）を０．４ｍｇ、ビタミンＢ２（ＶｉｔａｍｉｎＢ２）を４０μｇ、ビタミンＢ６（ＶｉｔａｍｉｎＢ６）４０μｇを含み、ｐＨ７．２にて用いる液体培地である。
アミノ酸は、ヒスチジン、システイン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシンから選択し配合した。
【００６６】
固体培地として以下の成分を有する関東化学株式会社製の試薬を使用する。
培地１００ｍｌ当たりグルコースを１．０ｇ、イーストエキストラクトを２．５ｇ、ペプトンを５．０ｇ、寒天を２．０ｇを含み、ｐＨ＝７．０にて用いる固体培地である。
ＣＨＯ細胞をＳＫＡ２０菌株の培養液由来の供試検体１００μｌにて１時間処理し、更に過酸化水素（終濃度０．１ｍＭ）で１時間処理後、ＮＡＤを抽出し、ＮＡＤ酵素サイクリング法にて細胞内のＮＡＤ含有量を測定した。
結果を表７に示す。
【表７】
【００６７】
ＳＫＡ２０菌株に替えて、ＳＫＡ３０、ＳＫＡ３１、ＳＫＡ３６、ＳＫＡ４８、ＳＫＡ５９、ＳＫＡ６１菌株を用いた場合のＮＡＤ含有量結果を表8に示す。
【表８】
培養液に添加したアミノ酸は、ヒスチジン、システイン、トリプトファン、チロシンの等重量混合したものである。
実施例２０〜２７の結果により、微生物が分泌した未同定の物質で作用機構も判明していない物質でも、ＤＮＡ損傷を防止する作用があることが判る。これにより、天然物から、細胞やＤＮＡに良い作用がある物質を選定することができることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明の実施形態における酵素サイクルを示す模式図である。
【図２】本発明の実施形態における吸光度とＮＡＤの量との関係を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞のＤＮＡが損傷した際に、損傷に応答して、核内に存在するポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の活性が著しく上昇するに伴い、その基質である、ＮＡＤの減少を定量的に測定することでＤＮＡの損傷状態や、ＤＮＡの損傷やＤＮＡ修復に影響を及ぼす物質や作用を定量的に測定して評価する方法、並びにその適用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生物体は、常に酸化ストレスを受けている。酸化ストレスは、生体内で生成する活性酸素種の酸化損傷力と生体内の抗酸化システムの抗酸化ポテンシャルとの差として定義される。そして、現在までに酸化ストレスは様々な疾病に関与している事が報告されている。
【０００３】
酸化ストレスの原因の一つに紫外線があり、ＤＮＡ損傷を引き起こす際の紫外線の作用として、直接作用と間接作用の２種類に分けられる。直接作用は、ＤＮＡの吸収領域である２６０ｎｍの光が直接ＤＮＡの塩基を励起し、シクロブタン型ピリミジン二量体（ＣＰＤ）やピリミジン（６−４）ピリミジノン光産物（６−４ＰＰ）などの光産物を生成する。間接作用は、２８０〜３２０ｎｍの光によってＤＮＡ障害を与える。２８０〜３２０ｎｍの光を吸収する生体成分として主に、トリプトファン、チロシンなどがあり、そのタンパク質の芳香族側鎖に損傷をあたえる。
【０００４】
また、活性酸素によるＤＮＡ損傷もある。
活性酸素のひとつであるまたヒドロキシラジカルは非常に強い酸化還元電位を持っているので、ほとんど全ての塩基を非特異的に損傷し、多様な塩基の分解生成物を産生する。また糖とも反応し、ＤＮＡ鎖の糖−リン酸結合を切断する。生体内で生成する活性酸素群は、本来、エネルギー生産、侵入異物攻撃、不要な細胞の処理、細胞情報伝達などに際して生産される有用なものだが、生体内の抗酸化システムで捕捉しきれない余剰な活性酸素群が生じる場合、生体の構造や機能を担っている脂質、蛋白質、酵素や、遺伝情報を担う遺伝子ＤＮＡを酸化し損傷を与え、生体の構造や機能を乱し、病気を引き起こし、老化が早まり、がんや生活習慣病となる原因である。また、これらの生活習慣病になることで酸化ストレスが増幅されるという悪循環が起き、さらに疾病・老化が進行することになる。このような活性酸素が引き起こす疾病としてはがん、生活習慣病（心不全、高血圧、脳卒中、糖尿病、動脈硬化、アルツハイマー病）、免疫関連疾患（リウマチ、自己免疫疾患、炎症）などが挙げられる。
【０００５】
そこで現在は、これ等の疾病の治療として、低分子抗酸化剤（例えばα−トコフェロール、ユビキノン、Ｎ−アセチルシステイン、グルタチオン）を用いることが知られている（例えば、特許文献１参照。）。抗酸化活性を有する低分子ペプチドを用いることも知られている（例えば、特許文献２参照。）。これ等のように活性酸素を消去する抗酸化物質の研究が数多く行われている。
【０００６】
また、ＤＮＡは放射線、紫外線、環境中の変異原、更には体内の代謝産物や活性酸素などにより、たえず損傷を受けている。これらの損傷が残存すれば、細胞死、突然変異、ひいては老化やがん化、遺伝病発症などを引き起こす。
そのような事態を避けるために生物は、ＤＮＡ損傷から生体を守り遺伝情報を正確に次世代へ伝えるために、ＤＮＡ損傷を修復するさまざまな機構を進化の過程で獲得してきた。それらの修復機構は、塩基除去修復、ヌクレオチド除去修復、ミスマッチ修復、相同組換え修復、末端結合修復などが挙げられる。
【０００７】
また、アルキル化損傷は、ヒトの場合はＯ６−メチルグアニンＤＮＡメチルトラスフェラーゼがグアニンの６位からアルキル基を取り除くといった特異的なものや、シクロブチルダイマーは、光回復と呼ばれる光依存性の直接的な修復系で修復を受ける。また、このような修復作用を促進する成分の開発も行われている。例えば、ケフラン−ケフィア成分の添加により、紫外線照射によって細胞内で発生した活性酸素量が減少し、アポトーシスが顕著に抑制されたとの報告がされている。同報告においてはさらに、ケフラン−ケフィア成分の添加により経時的にチミンダイマー量が減少したことから、ケフラン−ケフィア成分が活性酸素消去作用だけでなく、ＤＮＡの修復機構を増強することが判明している。
【０００８】
このようにＤＮＡを損傷する、物理的作用や物質を評価する方法は、新規物質、化学薬品や食品などの変異原試験などにも用いられているだけでなく、ＤＮＡの損傷を防止する物質や損傷したＤＮＡの修復を促す物質の探索にもその評価する方法は、盛んに用いられており、非常に重要な技術である。
【０００９】
ＤＮＡ損傷検出の方法は幾つか知られている。例えばコメットアッセイ（シングルセルゲルアッセイ）法がある。コメットアッセイは、細胞懸濁液（または、核の懸濁液）にアガロースを加え、スライドグラス中で寒天ゲルを形成させ、これをＳＤＳ、サルコシル硫酸などの界面活性剤で処理することにより，細胞の可溶化、核蛋白質の溶解を行った後に、電気泳動にかけ、ＤＮＡ部分を染色してＤＮＡ損傷がある条件では、核ＤＮＡが彗星のように尾を引くことを利用して、ＤＮＡ損傷を評価する方法である。
【００１０】
しかしこの方法は、ＤＮＡの二本鎖を一本鎖にする必要があり、そのためアルカリ処理やタンパク溶解や電気泳動といった多くの処理が必要である。これらの実験方法は非常に煩雑であり、時間もかかる。さらに８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）測定法は、遺伝子ＤＮＡ中のグアニン塩基は活性酸素の作用により酸化損傷を受け、この８位の炭素が酸化されることにより、８−ヒドロキシ−デオキシグアノシン（以後８−ＯＨｄＧと略す）が生成されることに基づく。遺伝子ＤＮＡが修復される過程で８−ＯＨｄＧは、細胞外に排出され、さらに血液を経て尿中に排泄されるため、この８−ＯＨｄＧを測定するものである。
【００１１】
また８−ＯＨｄＧは比較的安定な物質で、生体内で代謝や分解されることなく尿中に速やかに排泄されることから、活性酸素による生体損傷を鋭敏に反映するＤＮＡの酸化損傷を示す最もよい指標と考えられるが、８−ＯＨｄＧ量を測定する試薬が高額であり、汎用していない。ＤＮＡ巻き戻し法は、アルカリ溶液中で２本鎖ＤＮＡが一本鎖になる時に、ＤＮＡ損傷がある条件では速やかに短い一本鎖になる性質を利用したＤＮＡ損傷を評価する方法である。この方法も、特殊な操作を必要とする上に、多検体を処理する場合に問題があり、ＤＮＡ損傷検出の方法として満足すべきこのではなかった。
【特許文献１】アメリカ合衆国特許第６１８７７４３号公報、
【特許文献２】アメリカ合衆国特許第５６８３９８２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者は、従来のＤＮＡ損傷検出の方法とは異なり、安価で迅速、一度に大量処理ができ、信頼性も高いＤＮＡ損傷検出の方法を提供することを課題とした。
本発明者はポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ−１）がＤＮＡ損傷時に損傷部位に集まり、損傷の度合いによって修復、アポトーシス、ネクローシスを調節していることに着目し本発明を完成させた。
【００１３】
すなわち、ＤＮＡ損傷時に損傷部位に集まったＰＡＲＰ−１はＮＡＤを基質として、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリマーを素早くＤＮＡ損傷部位に結合させ、その他のＤＮＡ修復タンパク質と相互作用する。ＤＮＡ損傷が大きい場合、細胞内のＮＡＤ量は大きく減少する。そこで、ＤＮＡ損傷部位にＰＡＲＰ−１が結合し、ＮＡＤを基質としてＤＮＡ修復をスタートさせる現象を利用し、細胞内のＮＡＤ量をＮＡＤ酵素サイクリング法で定量することで細胞が受けた損傷を検出するといった原理を利用している。
この新規ＤＮＡ損傷検出法と従来の検出法との違いとしては、本検出法は短時間で、実験手順も簡便で、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度を測定することにより、一度に大量に正確にＤＮＡ損傷を定量できる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するために請求項１の本発明は、酵素サイクリング法を利用しＮＡＤの量を吸光度で測定することによりＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法である。
【００１５】
請求項１の本発明では、酵素サイクリング法を利用しＮＡＤの量を吸光度で測定することによりＤＮＡの損傷量を定量的に測定することができるため、一度に９６検体以上のサンプルを、素早く、安価に、同時に測定することができ、自動化も可能な方法であることから、ＤＮＡ損傷検出を非常に効率的に行うことが出来る。したがって、本発明のＤＮＡ損傷検出法を用いると、多くの天然物や化合物から、ＤＮＡの修復作用のある物質やＤＮＡの保護作用のある物質を、容易かつ迅速に選定することができ、選定試験方法として優れている。
【００１６】
請求項２の本発明は、下記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の工程を含む請求項１記載のＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法である。
（ａ）げっ歯類の卵巣細胞を、少なくとも付着性細胞用の培地に動物由来血清を配合した培地を用いて培養し、培養したげっ歯類の卵巣細胞の培養液からげっ歯類の卵巣細胞を取り出し、洗浄を行う。
（ｂ）洗浄後のげっ歯類の卵巣細胞からＮＡＤを抽出するために酸液に浸漬し、さらに一定時間静置する。浸漬後、浸漬液をアルカリ水により中和する。中和後の浸漬液を遠心分離により上清を分取しＮＡＤ測定用サンプルとする。
（ｃ）少なくとも緩衝液に溶解したホルマゾン系の色素にエタノールを配合した発色液に、上記（ｂ）の工程で調整したＮＡＤ測定用サンプルを混合したものに、酵素サイクリング法を利用し、アルコール脱水素酵素を添加し、さらに一定時間静置した後、波長５５０〜５７０ｎｍにて吸光度を測定する。
【００１７】
請求項２の本発明では、（ａ）の工程では、げっ歯類の卵巣細胞を、少なくとも付着性細胞用の培地に動物由来血清を配合した培地を用いて培養し、培養したげっ歯類の卵巣細胞の培養液からげっ歯類の卵巣細胞を取り出し、洗浄を行う。このため、ＤＮＡの損傷を評価する細胞を容易に培養することができる。動物由来血清は、細胞の生育に必要な各種微量成分を幅広く含むため、細胞の良好な成生育が得られる。げっ歯類の卵巣細胞を使用したため、増殖が速くまた、取扱も容易である。
【００１８】
（ｂ）の工程では、洗浄後のげっ歯類の卵巣細胞からＮＡＤを抽出するために酸液に浸漬し、さらに一定時間静置する。浸漬後、浸漬液をアルカリ水により中和する。中和後の浸漬液を遠心分離により上清を分取しＮＡＤ測定用サンプルとする。このため、ＮＡＤを分解する酵素を失活させて、ＮＡＤを安定に抽出することができる。
【００１９】
（ｃ）の工程では、少なくとも緩衝液に溶解したホルマゾン系の色素にエタノールを配合した発色液に、上記（ｂ）の工程で調整したＮＡＤ測定用サンプルを混合したものに酵素サイクリング法を利用して、アルコール脱水素酵素を添加、さらに一定時間静置した後、波長５５０〜５７０ｎｍにて吸光度を測定する。このため、微量のＮＡＤを増幅して、酵素サイクリングを使用してＮＡＤの量を測定することができ、波長５５０〜５７０ｎｍにてＮＡＤの量に対する吸光度を測定するため、測定が早く、容易にできる。
【００２０】
請求項３の本発明は、動物由来血清は、ウシ胎児血清であり、げっ歯類の卵巣細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法である。
【００２１】
請求項３の本発明では、動物由来血清は、ウシ胎児血清であり、げっ歯類の卵巣細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるため、培養が容易であり、倍加時間が短く、無血清培養も可能である。
【００２２】
請求項４の本発明は、（ａ）の工程で、培地にストレプトマイシンとペニシリンを添加するＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法である。
【００２３】
請求項４の本発明では、（ａ）の工程で、培地にストレプトマイシンとペニシリンを添加するため、細菌の繁殖を防止して、供試細胞の培養をすることができる。
【００２４】
請求項５の本発明は、（ｂ）の工程で、酸液は、過塩素酸であり、アルカリ水により中和は、水酸化カリウムとリン酸緩衝液の混合物を使用するＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法である。
【００２５】
請求項５の本発明では、（ｂ）の工程で、酸液は、過塩素酸であり、アルカリ水により中和は、水酸化カリウムとリン酸緩衝液の混合物を使用するため、アルカリに不安定なＮＡＤを安定して抽出することができる。
【００２６】
請求項６の本発明は、（ｃ）の工程で、アルコール脱水素酵素は、アルコールデヒドロゲナーゼであり、ホルマゾン系の色素にエタノールを配合した発色液は、ナトリウム・バイシン緩衝液（Ｎａ ・Ｂｉｃｉｎｅ）、ＭＴＴ（３（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ ｔｈｉａｚｏｌｙｌ ｂｌｕｅ）、フェナジンエトサルフェート（Ｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ ）、エチレンジアミン四酢酸、ウシ血清アルブミンの混合液であるＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法である。
【００２７】
請求項６の本発明では、（ｃ）の工程で、アルコール脱水素酵素は、アルコールデヒドロゲナーゼであり、ホルマゾン系の色素にエタノールを配合した発色液は、ナトリウム・バイシン緩衝液（Ｎａ・Ｂｉｃｉｎｅ）、ＭＴＴ（３（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ ｔｈｉａｚｏｌｙｌ ｂｌｕｅ）、フェナジンエトサルフェート（Ｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）、エチレンジアミン四酢酸、ウシ血清アルブミンの混合液である。このため、酵素サイクリング法により、ＮＡＤの濃度を増幅し、確実に発色させ、ＮＡＤの微量な差を迅速に、確実に測定することができる。また、常温操作が可能であり、発色の経時変化が少ない。
【００２８】
請求項７の本発明は、吸光度は、５５０〜５７０ｎｍの波長をマクロプレートリーダーで測定するＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法である。
【００２９】
請求項７の本発明では、吸光度は、５５０〜５７０ｎｍの波長をマクロプレートリーダーで測定するため、測定が容易で、早く、多数の検体を同時に測定することができる。また、マイクロプレートリーダーのため、人為的誤差がなく再現性に優れている。
【００３０】
請求項８の本発明は、動物細胞のＤＮＡに対する物理的又は化学的処理の影響を評価するために、酵素サイクリング法を利用しＮＡＤの量を吸光度で測定することによりＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法である。
【００３１】
請求項８の本発明では、本発明を使用して、動物細胞のＤＮＡに対する物理的又は化学的処理の影響を評価するため、動物細胞のＤＮＡについて、物理的又は化学的処理の影響の評価を多数の検体に対して素早く行うことができる。蛍光試薬を使用しないため、試薬の経時変化やロットブレがなく、再現性が優れ微量差を比較することができる。
【００３２】
請求項９の本発明は、動物細胞のＤＮＡの修復系を調節し得る物質をスクリーニングするために、酵素サイクリング法を利用しＮＡＤの量を吸光度で測定するＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法である。
【００３３】
請求項９の本発明では、動物細胞のＤＮＡの修復系を調節し得る物質をスクリーニングするために、酵素サイクリング法を利用しＮＡＤの量を吸光度で測定するため、動物細胞のＤＮＡの修復系を調節し得る多数の物質を、素早く、確実にスクリーニングすることができる。
【発明の効果】
【００３４】
本発明のＤＮＡ損傷検出法を用いると、一度に９６検体以上のサンプルを、安価に同時に測定することができ、自動化も可能な方法であることから、ＤＮＡ損傷検出が非常に効率的に行うことが出来る。したがって、本発明のＤＮＡ損傷検出法を用いると、多くの天然物や化合物から、ＤＮＡの修復作用のある物質やＤＮＡの保護作用のある物質を、容易かつ迅速に選定することができ、選定試験方法として優れている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
酵素サイクリング法を利用したＤＮＡの定量的測定方法は、次の通りである。
まず、供試細胞を培養する工程は次の通りである。
培地として、Ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ ａｌｐｈａ ｍｅｄｉｕｍ αＭＥＭ培地（最少培地）を使用し、その培地に対して、終濃度５％となるように動物由来血清としてウシ胎児血清を添加し、さらに１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、２ｍＭグルタミンを添加する。その添加した培地を使用して、培養するげっ歯類の卵巣細胞としてチャイニーズハムスター卵巣細胞を３７℃で５％濃度の炭酸ガス（ＣＯ２）のインキュベーター内で培養する。増殖が活発な、対数増殖期に維持して培養したチャイニーズハムスター卵巣細胞を供試細胞とする。
その後、培養液からチャイニーズハムスター卵巣細胞を取出し洗浄を行う。
供試細胞の培養では、ＤＮＡ損傷を評価する細胞として、チャイニーズハムスター卵巣細胞を用いることができる。この場合は、倍加時間が短く、培養が比較的容易であり、無血清培養も可能であるなどのメリットがあるためである。
【００３６】
次に、ＮＡＤ測定用サンプルを作成する工程は次の通りである。
まず、チャイニーズハムスター卵巣細胞の培養液を捨て、十分に水気を取り除き、氷冷したカルシュウムイオンとマグネシュウムイオンを含まないリン酸緩衝生理的食塩水にて２回洗浄した後、０．５Ｍ過塩素酸を２００μｌ添加し、氷上で１５分間放置した。
その後、反応液を中和させるために１Ｍ水酸化カリウムと０．３３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を１００μｌ添加し、氷上で１５分間放置した。そして、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心後、上清を回収し、これをＮＡＤ測定用サンプルとした。
【００３７】
ＮＡＤ測定用サンプルを作成する工程では、供試細胞を洗浄する必要がある。特にＮＡＤが熱やアルカリに不安定なため、氷冷しながら抽出する必要があり、さらに細胞が死滅、もしくは破砕されると、ＮＡＤを分解する酵素が作用し始め、分解が急速に進行する点を留意して、その酵素を失活させるためにも、酸性である過塩素酸による抽出を行う必要がある。
【００３８】
つぎに、細胞内ＮＡＤ量の測定の工程について説明する。
バイシン緩衝液（Ｂｉｃｉｎｅ）、ＭＴＴ（３（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ ｔｈｉａｚｏｌｙｌ ｂｌｕｅ）、フェナジンエトサルフェート（Ｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）、エチレンジアミン四酢酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、エタノール（Ｅｔｈａｎｏｌ）の混合液に対して、ＮＡＤ測定用サンプルを作成する工程で調製したＮＡＤ測定用サンプルを添加し、３７℃、５分間プレインキュベーションした。
【００３９】
続いて、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ） （オリエンタル酵母社より購入）を添加し、３７℃にて２０分間インキュベーションした後、マイクロプレートリーダーを使用して、後述するホルマザンの５５０〜５７０ｎｍの吸光度を測定することでＮＡＤを定量することができる。今回の測定では５５０ｎｍの吸光度を測定した。５５０ｎｍの吸光度を測定するにあたり、７００ｎｍの吸光度を測定することにより、ゼロ点の補正の比較データとした。
【００４０】
この微量なＮＡＤ量（数十〜数百ｐｍｏｌ程度）の変化を測定するために、酵素サイクリング法を用いた。この方法では、図１に示すように、まずエタノールをアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）によりアセトアルデヒドにする際に、ＮＡＤがＮＡＤＨに還元される。さらにフェナジンエトサルフェート（ＰＥＳ：ｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）を介してＭＴＴを還元し、紫色のホルマザンが形成される。これと同時にＮＡＤＨはＮＡＤに再び酸化される。ＭＴＴの還元速度（発色体の形成）は、ＮＡＤの還元速度に依存するので、このサイクルがｎ回繰り返されると、もとのＮＡＤ量に対して化学量論的に、ｎ倍の生成物であるホルマザンが得られることになる。さらにこのホルマザンの吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定することにより、従来より多量のサンプルを迅速に測定することが可能となった。
【００４１】
細胞内ＮＡＤ量の測定の工程では、上記の酵素サイクリング法を用いて細胞内ＮＡＤ量を測定するが、細胞内のＮＡＤの濃度は薄く、そのままでは測定できず、微量の差を比較することが困難であるが、酵素サイクリング法によりＮＡＤをリサイクルすることにより、ＮＡＤの量に対応する生成物であるＭＴＴ・Ｈの量を増幅し、より正確に微量な差を測定することができるようになった。
上記のように、この増幅されたＭＴＴ・Ｈの量をマイクロプレートリーダーを使用して、５５０〜５７０ｎｍの吸光度を測定することでＮＡＤを定量的に、正確に、微量な差を測定することができる。
【００４２】
さらに、動物細胞のＤＮＡに対して、物理的又は化学的処理をすることにより損傷を与える影響を評価するために、本発明を使用すると、動物細胞のＤＮＡに物理的又は化学的処理の影響をあたえる物質を評価することができる。
具体的には、過酸化水素の影響を評価する場合は、チャイニーズハムスター卵巣細胞を培養した後に、チャイニーズハムスター卵巣細胞は種々の細胞密度（５．０ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌから２．０ｘ１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の状態で過酸化水素終濃度０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭとなるように添加し、炭酸ガス（ＣＯ２）インキュベーター内で一定時間培養する。
【００４３】
また、紫外線（ＵＶＢ）照射の影響を評価する場合は、チャイニーズハムスター卵巣細胞は種々の細胞密度（５．０ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌから２．０ｘ１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の状態でウェルプレートのふたを開けて、１００Ｊ／ｍ２と２００Ｊ／ｍ２になるように紫外線を照射し、炭酸ガス（ＣＯ２）インキュベーター内で一定時間培養することにより、物理的又は化学的処理の影響を評価することができる。
【００４４】
さらに、動物細胞のＤＮＡの修復系を調節し得る物質をスクリーニングするために、本発明を使用すると、ＤＮＡの修復系に対して影響を及ぼす物質を特定することができる。
【００４５】
本発明のＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法は、ＤＮＡの修復プロフィールを確立する、修復関連疾患を診断する、所与の生物学的媒質の修復能力に対する物理的又は化学的処理の影響を評価する、生物学的媒質の修復系を調節し得る物質をスクリーニングする、新規物質に対する発癌性の評価（リスク・アセスメント）等の目的で使用できる。
【実施例】
【００４６】
次に、本発明の実施例について説明する。
本発明の実施例に使用するものは以下の通りである。
げっ歯類の卵巣細胞として、チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、ＣＨＯ細胞という。）を使用し、培地として、αＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ ａｌｐｈａ ｍｅｄｉｕｍ）（ＧＩＢＣＯ社）製試薬）を使用した。
【００４７】
上記培地に添加するものは以下のものである。
ウシ胎児血清（バイオウエスト社（Ｂｉｏｗｅｓｔ社）製試薬）
１００ Ｕ／ｍｌペニシリン（シグマ社製試薬）
１００ Ｕ（マイクロ）ｇ／ｍｌストレプトマイシン（シグマ社製試薬）
２ｍＭグルタミン（ナカライ社製試薬）
【００４８】
ＤＮＡの損傷量を測定するため、ＤＮＡ損傷剤を使用し、実験的にＤＮＡを損傷させて測定したが、そのＤＮＡ損傷剤は次のものである。
過酸化水素（ナカライ社製試薬）
ニトロソグアニジン（ナカライ社製試薬）
【００４９】
抗酸化剤として、次のものを使用した。
Ｎ−アセチルシステイン（ナカライ社製試薬）
【００５０】
さらに、以下の試薬を使用した。
アルコールデヒドロゲナーゼ（オリエンタル酵母社製試薬）
０．１ Ｍピロリン酸 緩衝液（ナカライ社製試薬）
１０ μｇ／ｍｌ ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製試薬）
エタノール（ナカライ社製試薬）
リン酸緩衝生理的食塩水（ナカライ社製試薬）
水酸化カリウム（ナカライ社製試薬 特級）
０．３３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ ７．２）（ナカライ社製試薬 特級）
０．５Ｍナトリウムバイシン（Ｎａ・Ｂｉｃｉｎｅ）（ｐＨ7.8）（ナカライ社製試薬）
５ｍＭ ＭＴＴ（３（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ ｔｈｉａｚｏｌｙｌ ｂｌｕｅ）（ナカライ社製試薬）
２０ｍＭフェナジンエトサルフェート（Ｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）（ナカライ社製試薬）
５０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）（ナカライ社製試薬 特級）
ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）（ナカライ社製試薬）
【００５１】
殺菌剤として、次のものを使用した。
メチルパラベン（和光純薬社製試薬 特級）
エチルパラベン（和光純薬社製試薬 特級）
ブチルパラベン（和光純薬社製試薬 特級）
プロピルパラベン（和光純薬社製試薬 特級）
フェノキシエタノール（和光純薬社製試薬 特級）
【００５２】
実施例１として、チャイニーズハムスター卵巣細胞内のＮＡＤ含有量の測定をした。
供試細胞の培養は次の通りである。
細胞はＣＨＯ細胞をαＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ ａｌｐｈａ ｍｅｄｉｕｍ）（ＧＩＢＣＯ社製）に、５％ウシ胎児血清、１００ Ｕ（マイクロ）ｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、２ｍＭグルタミンを添加したものを用いて、３７℃ ５％炭酸ガス（ＣＯ２）インキュベーター内で増殖が活発な、対数増殖期に維持して培養した。なお、上記のとおりＤＮＡ損傷剤を使用し、実験的にＤＮＡを損傷させて測定した。
【００５３】
次に、ＮＡＤの抽出を以下のように行った。
ＤＮＡ損傷を誘導した細胞の培養液を捨て、十分に水気を取り除き、氷冷したリン酸緩衝生理的食塩水にて２回洗浄した後、０．５Ｍ過塩素酸を２００μｌ添加し、氷上で１５分間放置した。その後、反応液を中和させるために１Ｍ水酸化カリウムと０．３３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ ７．２）を１００μｌ添加し、氷上で１５分間放置した。そして、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心後、上清を回収し、これをＮＡＤ測定用サンプルとした。
【００５４】
つぎに、酵素サイクリング法を用いて、以下のように、細胞内のＮＡＤ量を測定した。
９６穴プレートに、以下に示す反応混合物を１００μｌ入れ、これに対して、調製したＮＡＤ測定用サンプルを５０μｌ添加し、３７℃、５分間プレインキュベーションした。続いて、終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌとなるように２０μｌのアルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（オリエンタル酵母社より購入）を添加し、３７℃にて２０分間インキュベーションした後、マイクロプレートリーダー（ＭＰＲ−Ａ４ｉ，東ソー株式会社）を用いて、プレートの５５０ｎｍ（対照波長：７００ｎｍ）の吸光度を測定した。
【００５５】
上記で使用した反応混合物は、以下のものである。
０．５Ｍ ナトリウムバイシン（ＮａＢｉｃｉｎｅ）緩衝液（ｐＨ７．８）２０μｌ
５ｍＭ ＭＴＴ １０μｌ
２０ｍＭ フェナジンエトサルフェート（ＰＥＳ） １０μｌ
５０ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）１０μｌ
１０ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） １０μｌ
エタノールと超純水 ４０μｌ
全量 １００μｌ
【００５６】
酵素サイクリング法により生成したホルマザンの吸光度値に相関するＮＡＤの絶対量を求めるために、検量線を作成した。以下に示す各試薬をミクロセルに順次入れて混和し、５５０ｎｍの波長で吸光度のゼロ合わせをした。続いてアルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（原液）を１０μｌずつ入れて混和し、５５０ｎｍの波長で吸光度の最高値を測定し、図2に示すように、検量線を作成した。縦軸が吸光度、横軸がＮＡＤの濃度（μｇ／ｍｌ）である。
吸光度のゼロ合わせをするための対照液は、０．１Ｍピロリン酸緩衝液５００μｌ、超純水１０００μｌとエタノール１０μｌであり、吸光度測定のサンプルは、０．１Ｍピロリン酸緩衝液５００μｌ、ＮＡＤ１０μｇ／ｍｌとエタノール１０μｌである。
【００５７】
上記の反応組成は、検量線を作成するにあたって使用するＮＡＤを、ホルマザンに酵素的に変換することにより、その特異的な吸収（５５０ｎｍ）を利用して、モル吸光係数から濃度検定するためである。そのＮＡＤを用いて、下記の表１と図２に示す、種々の濃度のＮＡＤを作成し、酵素サイクリング法に従い、測定を行った。
【表１】
図２に示すように、ＮＡＤ量と吸光度は相関があり、本発明のＮＡＤ酵素サイクリング法にて、良好に増感されたことが判る。
【００５８】
実施例２〜５について、酸化損傷誘導物質の評価を過酸化水素にて行った。ＣＨＯ細胞を過酸化水素（終濃度０．０５ｍＭ〜０．４ｍＭ）で各時間（０〜６０分）処理後、ＮＡＤを抽出し、そのサンプルをＮＡＤ酵素サイクリング法により細胞内のＮＡＤ含有量を測定し、各濃度の過酸化水素処理における細胞内のＮＡＤ量の結果を表２に示した。
【表２】
実施例２〜５に示すように、過酸化水素の量及び接触時間に伴いＮＡＤの量が減っていることから、本発明の方法は、酸化力の強さと、ＮＡＤの減少に相関があることがわかり、ＤＮＡが過酸化水素により損傷されたことを定量的に評価できることが判る。
【００５９】
実施例６〜７は、実施例１に従い、表３に示すように、ＤＮＡ損傷成分としてＵＶＢ照射の評価を行った。ＣＨＯ細胞は種々の細胞密度（５．０ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ， ２．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の状態でウェルプレートのふたを開けて、２００Ｊ／ｍ２になるように照射し、炭酸ガス（ＣＯ２）インキュベーター内で２〜３時間培養した。
【表３】
実施例６〜７にて、ＵＶの照射量と、ＮＡＤの減少に一次関数的な関係があることが得られたことから、ＤＮＡの損傷量が定量できることが判る。実施例２〜７の結果より、ＤＮＡの損傷が物理的および化学的どちらの作用においても、本発明の方法で測定できることが判る。
【００６０】
実施例８〜１１については、実施例１に従い、ＤＮＡ損傷成分としてニトロソグアニジンの評価を行った。ＣＨＯ細胞は種々の細胞密度（５．０ｘ１０４ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ， ２．０ｘ１０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）の状態で終濃度０．０２ｍＭ〜０．２ｍＭとなるようにニトロソグアニジンを添加し、炭酸ガス（ＣＯ２）インキュベーター内で一定時間培養した。その結果を表４に示す。
【表４】
実施例８〜１１の結果より、ニトロソグアニジンの添加量と、ＮＡＤ量の減少量に相関があることから、酸化作用によるＤＮＡ損傷で無く、ニトロソグアニジンによるアルキル化作用によるＤＮＡ損傷も、測定できることが判明した。
【００６１】
実施例１２〜１５については、実施例１に従い、ＤＮＡ損傷防止剤としてＮ−アセチルシステインの効果を測定した。ＣＨＯ細胞をＮ−アセチルシステイン（終濃度１０ｍＭ）で１時間処理し、種々濃度の過酸化水素（終濃度０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭ）で１５分処理し、一定時間培養後、ＮＡＤを抽出し、ＮＡＤ酵素サイクリング法にて細胞内のＮＡＤ含有量を測定した。その結果を表５に示す。
【表５】
実施例１２〜１５において、比較例５に示すように、過酸化水素０．１Ｍの酸化処理を行うと、ＮＡＤ量は、２．１１から１．５８に減少する。しかし、予め、ＤＮＡの損傷を防止する物質である、Ｎ−アセチルシステイン処理を行うと、ＮＡＤの減少は１．８６に留まっている。従って、本発明の方法により、Ｎ−アセチルシステインのＤＮＡの損傷を防止作用が測定できることがわかる。更に、過酸化水素濃度が上昇するとＮ−アセチルシステインの作用が弱くなることも測定できることが判る。
【００６２】
実施例１６〜１９については、殺菌剤は、動物細胞にも影響を与えると考えられているため、その影響について実施例１に従い測定した。各殺菌剤は、ジメチルスルフオキシドにて希釈し、培地量に対して、１／１００量になるように添加した。その結果を表６に示す。
【表６】
実施例１６〜１９の結果より、実施例１８のブチルパラベンがＤＮＡへの影響が大きいことが判明した。殺菌剤のような、似たような作用を持つ化学物質でも、その構造の違いによりＤＮＡへの影響を測定できることが判った。これにより、新規化学物質の変異原性を測定することも可能であることが判る。
【００６３】
実施例２０〜２７については、皮膚常在菌によるＤＮＡ修復促進物質分泌の確認を実施した。特開２００５−３０４３６３号公報にて、皮膚常在菌にトリプトファン、チロシン、ヒスチジン、システイン、フェニルアラニン及びシスチンよりなる群から選ばれた１種類以上のアミノ酸と金属塩を共存させることにより、皮膚常在菌による抗酸化物質の分泌が促進されることが公開されている。
【００６４】
今回、実施例１に従い、この抗酸化物質のＤＮＡの損傷防止作用について確認した。
皮膚常在菌分離法として、固体培地を１５人（男性５人、女性１０人、年齢２０〜６０歳）の顔に直接押し付けた後、３０℃、２日間培養を行った。培地上に出現したコロニーを釣菌し、菌種の異なる常在菌を７菌株（ＳＫＡ２０、ＳＫＡ３０、ＳＫＡ３１、ＳＫＡ３６、ＳＫＡ４８、ＳＫＡ５９、ＳＫＡ６１）分離した。常在菌７菌株を固体培地に一白金耳接種した後、３０℃、２４時間静置培養を行う。次に、液体培地に各アミノ酸の添加合計２．０ｇ、およびＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏを５ｍｇ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏを０．５ｍｇ添加した培地に前記固体培地より一白金耳を接種し、３０℃、２日間静置培養を行う。更に上記７菌株は１８０ｒｐｍにて振盪培養を行う。培養３日後の培養液（約１００ｍｌ）を、ロータリーエバポレーターにて、５０℃でほぼ乾固に近い状態まで濃縮した後、２０ｍｌのエタノールで一晩抽出後３ｍｌに濃縮し、０．４５μでろ過し供試検体とした。エタノール抽出を行うことにより、培地中に含まれる塩類の影響を排除した。
【００６５】
液体培地として、以下の成分を有する関東化学株式会社製の試薬を使用する。
培地１０００ｍｌ当たり、グルコースを１０ｇ、イーストエキストラクトを５．０ｇ、リン酸水素２カリウムを０．５ｇ、リン酸２水素カリウムを１．５ｇ、硫酸マグネシウム・７Ｈ２Ｏを０．２ｇ、水酸化ナトリウムを０．１ｇ、硝酸カリウムを０．１ｇ、パラアミノ安息香酸（Ｐ−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）を２０μｇ、イノシトール（Ｉｎｏｓｉｔｏｌ）を０．２ｍｇ、ビタミンＨ（ＶｉｔａｍｉｎＨ）を２μｇ、ニコチン酸（Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ）を４０μｇ、ビタミンＢ１２（Ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ１２）を０．５μｇ、ビタミンＢ１（ＶｉｔａｍｉｎＢ１）を４０μｇ、パントテン酸カルシウム（Ｃａ−Ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ）を０．４ｍｇ、ビタミンＢ２（ＶｉｔａｍｉｎＢ２）を４０μｇ、ビタミンＢ６（ＶｉｔａｍｉｎＢ６）４０μｇを含み、ｐＨ７．２にて用いる液体培地である。
アミノ酸は、ヒスチジン、システイン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシンから選択し配合した。
【００６６】
固体培地として以下の成分を有する関東化学株式会社製の試薬を使用する。
培地１００ｍｌ当たりグルコースを１．０ｇ、イーストエキストラクトを２．５ｇ、ペプトンを５．０ｇ、寒天を２．０ｇを含み、ｐＨ＝７．０にて用いる固体培地である。
ＣＨＯ細胞をＳＫＡ２０菌株の培養液由来の供試検体１００μｌにて１時間処理し、更に過酸化水素（終濃度０．１ｍＭ）で１時間処理後、ＮＡＤを抽出し、ＮＡＤ酵素サイクリング法にて細胞内のＮＡＤ含有量を測定した。
結果を表７に示す。
【表７】
【００６７】
ＳＫＡ２０菌株に替えて、ＳＫＡ３０、ＳＫＡ３１、ＳＫＡ３６、ＳＫＡ４８、ＳＫＡ５９、ＳＫＡ６１菌株を用いた場合のＮＡＤ含有量結果を表8に示す。
【表８】
培養液に添加したアミノ酸は、ヒスチジン、システイン、トリプトファン、チロシンの等重量混合したものである。
実施例２０〜２７の結果により、微生物が分泌した未同定の物質で作用機構も判明していない物質でも、ＤＮＡ損傷を防止する作用があることが判る。これにより、天然物から、細胞やＤＮＡに良い作用がある物質を選定することができることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明の実施形態における酵素サイクルを示す模式図である。
【図２】本発明の実施形態における吸光度とＮＡＤの量との関係を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素サイクリング法を利用しＮＡＤの量を吸光度で測定することによりＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法。
【請求項２】
下記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の工程を含む請求項１記載のＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法。
（ａ）げっ歯類の卵巣細胞を、少なくとも付着性細胞用の培地に動物由来血清を配合した培地を用いて培養し、培養したげっ歯類の卵巣細胞の培養液からげっ歯類の卵巣細胞を取り出し、洗浄を行う。
（ｂ）洗浄後のげっ歯類の卵巣細胞からＮＡＤを抽出するために酸液に浸漬し、さらに一定時間静置する。浸漬後、浸漬液をアルカリ水により中和する。中和後の浸漬液を遠心分離により上清を分取しＮＡＤ測定用サンプルとする。
（ｃ）少なくとも緩衝液に溶解したホルマゾン系の色素にエタノールを配合した発色液に、上記（ｂ）の工程で調整したＮＡＤ測定用サンプルを混合したものに、酵素サイクリング法を利用し、アルコール脱水素酵素を添加し、さらに一定時間静置した後、波長５５０〜５７０ｎｍにて吸光度を測定する。
【請求項３】
上記動物由来血清は、ウシ胎児血清であり、上記げっ歯類の卵巣細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項２に記載のＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法。
【請求項４】
上記（ａ）の工程で、上記培地にストレプトマイシンとペニシリンを添加する請求項２又は請求項３に記載のＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法。
【請求項５】
上記（ｂ）の工程で、上記酸液は、過塩素酸であり、アルカリ水により中和は、水酸化カリウムとリン酸緩衝液の混合物を使用する請求項２乃至請求項４のいずれか１項に記載のＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法。
【請求項６】
上記（ｃ）の工程で、アルコール脱水素酵素は、アルコールデヒドロゲナーゼであり、ホルマゾン系の色素にエタノールを配合した発色液は、ナトリウム・バイシン緩衝液（Ｎａ ・Ｂｉｃｉｎｅ）、ＭＴＴ（３（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ ｔｈｉａｚｏｌｙｌ ｂｌｕｅ）、フェナジンエトサルフェート（Ｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ ）、エチレンジアミン四酢酸、 ウシ血清アルブミンの混合液である請求項２乃至請求項５のいずれか１項に記載のＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法。
【請求項７】
上記吸光度は、５５０〜５７０ｎｍの波長をマクロプレートリーダーで測定する請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載のＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法。
【請求項８】
動物細胞のＤＮＡに対する物理的又は化学的処理の影響を評価するために、酵素サイクリング法を利用しＮＡＤの量を吸光度で測定する請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載のＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法。
【請求項９】
動物細胞のＤＮＡの修復系を調節し得る物質をスクリーニングするために、酵素サイクリング法を利用しＮＡＤの量を吸光度で測定する請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載ＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法。
【請求項１】
酵素サイクリング法を利用しＮＡＤの量を吸光度で測定することによりＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法。
【請求項２】
下記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の工程を含む請求項１記載のＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法。
（ａ）げっ歯類の卵巣細胞を、少なくとも付着性細胞用の培地に動物由来血清を配合した培地を用いて培養し、培養したげっ歯類の卵巣細胞の培養液からげっ歯類の卵巣細胞を取り出し、洗浄を行う。
（ｂ）洗浄後のげっ歯類の卵巣細胞からＮＡＤを抽出するために酸液に浸漬し、さらに一定時間静置する。浸漬後、浸漬液をアルカリ水により中和する。中和後の浸漬液を遠心分離により上清を分取しＮＡＤ測定用サンプルとする。
（ｃ）少なくとも緩衝液に溶解したホルマゾン系の色素にエタノールを配合した発色液に、上記（ｂ）の工程で調整したＮＡＤ測定用サンプルを混合したものに、酵素サイクリング法を利用し、アルコール脱水素酵素を添加し、さらに一定時間静置した後、波長５５０〜５７０ｎｍにて吸光度を測定する。
【請求項３】
上記動物由来血清は、ウシ胎児血清であり、上記げっ歯類の卵巣細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項２に記載のＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法。
【請求項４】
上記（ａ）の工程で、上記培地にストレプトマイシンとペニシリンを添加する請求項２又は請求項３に記載のＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法。
【請求項５】
上記（ｂ）の工程で、上記酸液は、過塩素酸であり、アルカリ水により中和は、水酸化カリウムとリン酸緩衝液の混合物を使用する請求項２乃至請求項４のいずれか１項に記載のＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法。
【請求項６】
上記（ｃ）の工程で、アルコール脱水素酵素は、アルコールデヒドロゲナーゼであり、ホルマゾン系の色素にエタノールを配合した発色液は、ナトリウム・バイシン緩衝液（Ｎａ ・Ｂｉｃｉｎｅ）、ＭＴＴ（３（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ ｔｈｉａｚｏｌｙｌ ｂｌｕｅ）、フェナジンエトサルフェート（Ｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ ）、エチレンジアミン四酢酸、 ウシ血清アルブミンの混合液である請求項２乃至請求項５のいずれか１項に記載のＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法。
【請求項７】
上記吸光度は、５５０〜５７０ｎｍの波長をマクロプレートリーダーで測定する請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載のＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法。
【請求項８】
動物細胞のＤＮＡに対する物理的又は化学的処理の影響を評価するために、酵素サイクリング法を利用しＮＡＤの量を吸光度で測定する請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載のＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法。
【請求項９】
動物細胞のＤＮＡの修復系を調節し得る物質をスクリーニングするために、酵素サイクリング法を利用しＮＡＤの量を吸光度で測定する請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載ＤＮＡの損傷量を定量的に測定する方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−２２３３５（Ｐ２０１０−２２３３５Ａ）
【公開日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１９１１５６（Ｐ２００８−１９１１５６）
【出願日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 〔研究集会名〕 日本農芸化学会２００８年度大会 〔主催者名〕 社団法人日本農芸化学会 〔開催日〕 平成２０年３月２８日
【出願人】（３０４０２６６９６）国立大学法人三重大学 (270)
【出願人】（０００２３４１６６）伯東株式会社 (135)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 〔研究集会名〕 日本農芸化学会２００８年度大会 〔主催者名〕 社団法人日本農芸化学会 〔開催日〕 平成２０年３月２８日
【出願人】（３０４０２６６９６）国立大学法人三重大学 (270)
【出願人】（０００２３４１６６）伯東株式会社 (135)
【Ｆターム（参考）】
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