ＤＮＡを定量又は検出する方法

【課題】簡便にＤＮＡを定量又は検出する方法を提供する。
【解決手段】検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法であって、（１）目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを検体中から取得する第一工程、（２）第一工程で取得した目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡをＤＮＡメチル化酵素で処理する第二工程、（３）第二工程で取得したＤＮＡメチル化酵素で処理された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡから、目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡを取得し、該一本鎖メチル化ＤＮＡに検出オリゴヌクレオチドを結合させて被検ＤＮＡ複合体を取得する第三工程、（４）第三工程で取得した被検ＤＮＡ複合体に固定化メチル化ＤＮＡ抗体を結合させて検出複合体を取得する第四工程等を有することを特徴とする方法。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する方法であって、
（１）目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを検体中から取得する第一工程、
（２）第一工程で取得した目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡをＤＮＡメチル化酵素で処理する第二工程、
（３）第二工程で取得したＤＮＡメチル化酵素で処理された目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡから、目的とするＤＮＡ領域を有する一本鎖メチル化ＤＮＡを取得し、該一本鎖メチル化ＤＮＡに検出オリゴヌクレオチドを結合させて被検ＤＮＡ複合体を取得する第三工程、
（４）第三工程で取得した被検ＤＮＡ複合体に固定化メチル化ＤＮＡ抗体を結合させて検出複合体を取得する第四工程、
（５）第四工程で得られた検出複合体に含まれる検出オリゴヌクレオチドをその識別機能により定量又は検出することにより、前記一本鎖ＤＮＡ中の目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡを定量又は検出する第五工程、
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
第三工程で被検ＤＮＡ複合体を取得する際にカウンターオリゴヌクレオチドを添加する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固定化メチル化ＤＮＡ抗体がメチルシトシン抗体である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＤＮＡメチル化酵素がシトシンメチル化酵素又はＳｓｓＩメチラーゼである請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、ＲＮＡから逆転写酵素により生成されたＤＮＡにおける目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡである請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
検体が、下記のいずれかの生物由来検体である請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液又は組織溶解液
（ｂ）哺乳動物由来の血液、体液、糞尿、体分泌物、細胞溶解液及び組織溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＤＮＡ
（ｃ）哺乳動物由来の組織、細胞、組織溶解液及び細胞溶解液からなる群より選ばれる一から抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ
（ｅ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＤＮＡ
（ｆ）細菌、真菌又はウイルスから抽出されたＲＮＡを鋳型として作製されたＤＮＡ
【請求項７】
第一工程で取得した前記目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチド、又は予め精製されてなるＤＮＡである請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
検出オリゴヌクレオチドの識別機能が、下記のいずれかの識別機能である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）ＦＩＴＣの蛍光検出
（ｂ）ＦＩＴＣ抗体による検出
【請求項９】
検出オリゴヌクレオチドが、ヒトゲノム中の反復配列、重複遺伝子又は偽遺伝子の塩基配列若しくはその一部と相補的に結合し得る塩基配列からなる請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ヒトゲノム中の反復配列がLINE又はSINEである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
検出オリゴヌクレオチドが、以下に示されるいずれかの塩基配列と相補的に結合し得る塩基配列からなる請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（１）配列番号３７で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２）配列番号３７で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）配列番号３９で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（４）配列番号３９で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
【請求項１２】
検出オリゴヌクレオチドが、以下に示されるいずれかの塩基配列からなる請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（１）配列番号３８で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（２）配列番号３８で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（３）配列番号４０で示される塩基配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
（４）配列番号４０で示される塩基配列の相補配列又はそれと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列
【請求項１３】
第一工程において検体中からＤＮＡを取得するためのＤＮＡ抽出操作において用いられる溶液中のナトリウム塩の濃度が、１００ｍＭ以下１０００ｍＭ以下である請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
第一工程において検体中からＤＮＡを取得するためのＤＮＡ抽出操作において用いられる溶液中のナトリウム塩の濃度が、１００ｍＭ以下２００ｍＭ以下である請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
癌患者由来の検体を選抜する方法であり、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法により被験者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果と、同方法により健常者由来の検体を用いて定量又は検出されたＤＮＡの定量結果または検出結果との差異が有意であれば、被験者由来の検体を癌患者由来の検体として評価し、当該評価の結果に基づき癌患者由来の検体を特定する工程を含む方法。
【請求項１６】
検体が、哺乳動物由来の血清である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
目的とするＤＮＡ領域を有するＤＮＡが、哺乳動物由来の血清中の目的とするＤＮＡ領域を有する遊離ＤＮＡである請求項１５〜１６のいずれか一項に記載の方法。

【図１】